CN112375759B - 一种与鸡肝脏脂质沉积相关的miRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与鸡肝脏脂质沉积相关的miRNA及其应用，本发明通过构建鸡脂肪肝综合征早期病理模型，并采用miRNAs‑mRNA联合分析，发现了miR‑146a在调控鸡肝脏脂质沉积中的应用，并提供了其前体pri‑miR‑146a。miR‑146a可通过调控靶基因脂肪酸合酶基因FASN的表达，调控肝脏脂肪沉积，可用于制备治疗鸡脂肪肝综合征药物或鸡脂肪肝诊断试剂盒，为鸡脂肪肝综合征的诊断与治疗提供了新的靶点，同时也可作为分子标记进行辅助育种或改善鸡肉品质。同时本发明提供的基于pri‑miR‑146a核心启动子区的荧光素酶报告载体，为鸡脂肪肝综合征的治疗药物提供了新的筛选方法。

Description

一种与鸡肝脏脂质沉积相关的miRNA及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种与鸡肝脏脂质沉积相关的miRNA及其应用。
背景技术
脂肪是能量储存的主要形式，在家禽生产中，脂肪对维持生命、生长和生产是非常重要的。禽类和哺乳动物不同，肝脏是其合成脂肪的主要器官，肝脏中合成的甘油三酯以极低密度脂蛋白的形式通过血液转运到各个组织被利用或储存，因此，肝脏在机体能量代谢平衡中起重要作用。但随着我国养鸡产业集约化养殖的发展，脂类代谢紊乱无论是对肉鸡还是蛋鸡，都成了其生产中面临的亟待解决的重要问题。
在家禽养殖过程中，多种因素，如遗传、饲料、管理、环境等，易造成肝脏脂质异常沉积并逐渐导致肝细胞脂肪变性坏死，引起脂肪肝综合征(Fatty liver syndrome,FLS)。该病是现代化规模养鸡中常见的营养代谢性疾病之一，可导致饲料利用率和产蛋性能降低，严重可造成死亡，给家禽养殖业造成严重经济损失。对于肉鸡，脂类代谢紊乱易造成体脂尤其是腹部脂肪的过多沉积，影响鸡肉品质、降低饲料利用率和经济效益。而在蛋鸡生产过程中，蛋鸡为满足蛋黄脂质沉积的需要，肝脏脂类代谢强度大，因此更易发生FLS。蛋鸡脂肪肝综合征是笼养蛋鸡死淘的主要原因之一。值得注意的是，肝脏脂质沉积异常并不表现明显的临床症状，例如脂肪肝综合征在导致蛋鸡死亡前不易被发现。因此，建立完备的诊断和防治手段是缓解该病发生率，提高生产性能的重要保障。
Micro RNA(miRNA)是一类长度约20-24nt的非编码单链小分子RNA，可通过与靶基因mRNA的3’UTR互补结合以对靶基因进行转录后调控，在发育、免疫、细胞周期控制、新陈代谢以及病毒和细菌疾病中扮演重要角色。miRNAs在肝脏脂类代谢调节中具有重要作用，到目前为止，多种miRNAs被证实参与了肝脏脂类代谢的调控，如miR-122,miR-370,miR-378/378*,miR-34a以及miR-33等，关于miR-146a功能的研究主要集中于炎症等相关通路，而关于miR-146a在肝脏脂肪合成调控中的功能和应用尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与鸡肝脏脂质沉积相关的miRNA，即miR-146a及其前体pri-miR-146a，其可通过调控靶基因脂肪酸合酶基因FASN的表达，调控肝脏脂肪沉积，因此可用于制备治疗鸡脂肪肝综合征药物或鸡脂肪肝诊断试剂盒，也可作为分子标记进行辅助育种或改善鸡肉品质；同时本发明还提供了pri-miR-146a的核心启动子区序列，可用于构建荧光素酶报告载体以检测miR-146a的转录活性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供了一种miRNA在调控鸡肝脏脂质沉积中的应用，其中所述miRNA为miR-146a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过高能低蛋白日粮诱导蛋鸡脂肪肝综合征早期病理模型，并通过miRNAs-mRNA联合分析及靶基因预测与验证，显示miRNAs在脂质异常沉积肝脏中差异表达，并通过细胞水平验证提示miR-146a在鸡肝脏脂肪酸合成中发挥重要作用。
进一步的，所述miR-146a的靶基因为脂肪酸合酶基因。miR-146a以脂肪酸合酶基因(FASN)为靶基因，可调控脂肪酸的合成进而调控鸡肝脏脂质沉积。
本发明还提供了如SEQ ID NO.1所示的miR-146a在制备治疗鸡脂肪肝综合征药物中的应用。可将miR-146a mimics或基于miR-146a构建的过表达载体作为药物或添加剂，用于调控鸡肝脏脂质沉积，进而治疗鸡脂肪肝综合征，并且对miR-146a mimics进行的保护碱基修饰以及对针对miR-146a前体设计的过表达载体均包含在本发明的保护范围内。
本发明还提供了如SEQ ID NO.1所示的miR-146a的前体，所述前体为pri-miR-146a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本领域技术人员熟知，miRNAs在体内转录为pri-miRNAs后，先加工剪切为pre-miRNAs，最后再剪切为行使功能的成熟miRNAs。其中pri-miR-146a转录水平的调控直接影响miR-146a的表达水平，进而影响miR-146a对于鸡肝脏脂质沉积的调控。因此，本发明通过RACE技术获得了miR-146a的前体pri-miR-146a的序列。
本发明还提供了如SEQ ID NO.1所示的miR-146a和/或SEQ ID NO.2所示的pri-miR-146a在制备鸡脂肪肝诊断试剂盒中的应用，所述诊断试剂盒中包括用于检测miR-146a和/或pri-miR-146a表达量的检测试剂。通过检测待测样品中miR-146a和/或pri-miR-146a的表达量，可判断待测鸡是否患有脂肪肝。
进一步的，所述诊断试剂盒中包括：如SEQ ID NO.6-7所示的miR-146a定量引物和/或如SEQ ID NO.8-9所示的pri-miR-146a定量引物。
进一步的，采用所述诊断试剂盒检测miR-146a和/或pri-miR-146a表达量的方法包括：
提取鸡肝脏总RNA，通过加入如SEQ ID NO.4所示的LOOP引物和如SEQ ID NO.5所示的引物进行反转录反应，接着采用如SEQ ID NO.6-7所示的miR-146a定量引物检测miR-146a的表达量；和/或
提取鸡肝脏总RNA，通过加入随机引物进行反转录反应，接着采用如SEQ ID NO.8-9所示的pri-miR-146a定量引物检测pri-miR-146a的表达量。
本发明还提供了一种荧光素酶报告载体，其特征在于，所述载体中包含如SEQ IDNO.3所示的pri-miR-146a核心启动子区。
进一步的，如SEQ ID NO.3所示的pri-miR-146a核心启动子区序列的制备方法包括：
(1)根据扩增得到的pri-miR-146a的5’-UTR序列，在Genebank等数据库中检索并向前延伸2000bp序列；
(2)通过设计引物扩增不同片段长度的启动子区域，将扩增PCR产物双酶切后连入双荧光素酶报告载体pGL3中；
(3)提取质粒并转染入培养的鸡原代肝细胞系，转染24h后检测细胞荧光强度，确定pri-miR-146a核心启动子区及其序列。
本发明还提供了上述荧光素酶报告载体在检测miR-146a转录活性中的应用。该荧光素酶报告载体可用于外源药物制剂、转录因子等对miR-146a转录活性调控的检测筛选。
本发明还提供了如SEQ ID NO.1所示的miR-146a和/或SEQ ID NO.2所示的pri-miR-146a作为分子标记在鸡肝脏脂质沉积性状辅助选择和/或改善鸡肉品质的应用。以miR-146a和/或pri-miR-146a作为分子标记，通过检测其表达情况，以用于辅助筛选不存在脂质沉积性状的鸡，以提高经济效益，同时可通过调控miR-146a和/或pri-miR-146a的表达情况，调节鸡肝脏脂质含量，进而改善鸡肉品质。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明利用miRNA-mRNA联合分析，筛选到在调控鸡肝脏脂肪沉积中起重要作用的miR-146a，其以脂肪酸合酶FASN为靶基因，在鸡肝脏的脂肪酸合成中发挥重要作用，调控鸡肝脏脂质沉积，不仅可用于改善肉鸡的品质，并且miR-146a mimics或基于miR-146a构建的过表达载体可用于制备治疗鸡脂肪肝综合征的药物，为鸡脂肪肝综合征的治疗提供了新靶点。
(2)本发明还通过RACE技术获得了miR-146a的前体pri-miR-146a的序列，并设计了针对miR-146a和/或pri-miR-146a的定量引物，用于定量检测样本中miR-146a和/或pri-miR-146a的表达量并制备鸡脂肪肝诊断试剂盒，为鸡脂肪肝综合征的诊断提供了新靶点。
(3)本发明还提供了pri-miR-146a的核心启动子区序列，并基于该序列构建了荧光素酶报告载体，可用于药物或转录因子等对miR-146a转录活性调控的检测筛选，以筛选得到以miR-146a为靶点治疗鸡脂肪肝综合征的有效制剂，为鸡脂肪肝综合征的治疗提供了新的筛选方法。
附图说明
图1为本发明实施例1中miRNAs-mRNA联合分析及靶基因预测与验证结果图，其中图A为试验组(HE)和对照组(LE)的肝脏中甘油三酯(TG)含量；图B为miRNAs高通量测序结果；图C为HE和LE的肝脏中miR-146a的表达情况；图D为HE和LE的肝脏中FASN的表达情况；
图2为本发明实施例2中miR-146a对FASN基因表达的调控检测结果，其中图A为miR-146a与FASN基因预测的两个3’-UTR结合位点；图B为含有miR-146a mimics和阴性对照NC分别连接至双荧光素酶报告载体pmirGLO-FASN并转染鸡肝癌细胞系LMH后的细胞荧光强度结果；
图3为本发明实施例3中miR-146a过表达对细胞模型脂质沉积的影响结果图，其中图A为转染了miR-146a mimics的肝细胞，图B为阴性对照NC；
图4为本发明实施例3中miR-146a过表达对细胞TG含量和FASN表达情况的影响，其中图A为TG含量，图B为FASN表达情况。
图5为本发明实施例4中包含pri-miR-146a核心启动子区的荧光素酶报告载体的确认与应用结果图，其中图A为连接有5个不同启动子区域的荧光素酶报告载体和空载体pGL3在鸡原代肝细胞中的相对荧光强度；图B为连接有5个不同启动子区域的荧光素酶报告载体及空载体pGL3在L02细胞中的相对荧光强度；图C为待测药物厚朴酚对荧光素酶报告载体pGL3-pri-miR146a相对荧光强度的影响；图D为待测药物厚朴酚对细胞中miR-146a表达情况的影响；图E为待测药物厚朴酚对细胞中TG含量的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1miRNAs-mRNA联合分析及靶基因预测与验证
本发明选用了180只300日龄蛋鸡，试验分为试验组和对照组，其分别饲喂不同能量水平的日粮，其中对照组能量水平为11.86MJ/kg(LE组)，试验组能量水平13.10MJ/kg(HE组)，试验21天后，每组水平选择6只鸡屠宰，采集肝脏组织样品。
通过常规的甘油三酯检测试剂盒检测分析肝脏中甘油三酯(TG)水平，检测结果如附图1的图A所示，其中试验组(HE组)的肝脏甘油三酯(TG)水平显著高于对照组(LE组)，即本发明成功构建得到了鸡脂肪肝综合征早期病理模型。
提取肝脏组织的RNA进行miRNAs高通量测序，结果如附图1的图B所示，根据高通量测序结果，在LE组和HE组，miR-146a为差异表达的miRNAs，且miR-146a在HE组的表达量相比于LE组下降了2.05倍。
其中miR-146a的序列为：ugagaacugaauuccauggguu
进一步，提取肝脏组织RNA，采用如SEQ ID NO.4所示的LOOP引物和如SEQ ID NO.5所示的U6下游引物进行反转录反应得到cDNA，并以SEQ ID NO.6-7所示的miR-146a定量引物，通过常规qRT-PCR检测miR-146a的表达量，测定结果如附图1的图C所示；同时以SEQ IDNO.10-11所示的FASN定量引物，通过qRT-PCR检测FASN的表达量，测定结果如附图1的图D所示。结果显示，miR-146a在HE组肝脏中的表达相比于LE组显著下调，同时其靶基因FASN在HE组肝脏中的表达相比于LE组显著上调。
其中，(1)反转录所用的LOOP引物和U6下游引物具体为：
LOOP引物：
CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAACCCAT(SEQ ID NO.4所示)
U6下游引物：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO.5所示)；
(2)miR-146a定量引物具体为：
上游引物：CTGGTAGGTGAGAACTGAATTCC(SEQ ID NO.6所示)
下游引物：TCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC(SEQ ID NO.7所示)；
(3)FASN定量引物具体为：
上游引物：CCTGCGTGCTATGCTTGCC(SEQ ID NO.10所示)
下游引物：GCGACATTACCCATTTCCTGA(SEQ ID NO.11所示)
实施例2miR-146a对FASN基因表达的调控
通过TargetScan和miRanda等靶基因预测网站分析，推测FASN基因(Gene ID:396061)为miR-146a的靶基因，且FASN基因的3’UTR区域有两个miR-146a结合位点，两个预测结合位点如附图2的图A所示。
构建包含预测靶结合位点序列的双荧光素酶报告载体pmirGLO-FASN，具体通过以下步骤制备：
根据FASN基因3’UTR设计相应的引物并加入酶切位点，以肝脏提取RNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增；将PCR产物纯化后，利用加入的酶切位点对应的酶对PCR产物和pmirGLO载体进行双酶切；将双酶切产物割胶纯化后进行连接反应；连接反应后加入感受态细胞转化并将菌液涂板；挑选阳性克隆摇菌后提取质粒，即为所述双荧光素酶报告载体pmirGLO-FASN。
将miR-146a mimics(miR-146a模拟物)和NC(阴性对照)分别与上述构建的载体和空载体两两配对，共转染鸡肝癌细胞系LMH，24h后收集细胞并采用Luciferase AssaySystem检测细胞荧光强度，根据荧光强度变化情况分析miR-146a与FASN基因3’UTR的靶向调控关系，检测结果如附图2的图B所示，结果显示，与阴性对照NC相比，miR-146a mimics显著降低了含有载体pmirGLO-FASN的细胞的荧光活性，说明miR-146a可抑制FASN的表达，即FASN为miR-146a的候选靶基因。
实施例3miR-146a过表达对细胞模型脂质沉积的影响
选用13胚龄左右健康鸡胚，无菌采集肝脏组织后用灭菌眼科剪剪碎，1％Ⅳ胶原酶37℃消化30min获得肝脏实质细胞，计数后接种于完全培养基中(含10％胎牛血清(PBS)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基)，并于37℃，5％CO2条件下培养，每24h换液一次。待细胞汇合至80％左右时，加入500μM，摩尔比为1:1的油酸和棕榈酸，以诱导肝细胞脂质异常沉积模型；接着换成不含有抗生素的完全培养基培养，利用脂质体Lipofectamine 2000将miR-146a mimics和NC(阴性对照)分别转染入上述脂质异常沉积模型的肝细胞中。培养48h后，采用油红O脂肪染色法观察细胞内脂质沉积，结果如附图3所示，附图3的图A为miR-146a mimics转染肝细胞油红O染色结果，图B为阴性对照NC转染肝细胞油红O染色结果。
进一步，分别收集上述细胞，采用常规的甘油三酯检测试剂盒检测细胞内TG含量，结果如附图4的图A所示；同时利用常规qRT-PCR技术和以SEQ ID NO.10-11所示的FASN定量引物检测FASN基因mRNA的表达水平结果如附图4的图B所示。其中C为空白对照、NC+FFA为脂肪酸诱导后转染阴性对照NC，miR-146a mimic+FFA为脂肪酸诱导后转染miR-146a mimic。
结果显示，脂肪酸诱导后细胞中被油红O染成红色的脂滴明显增加，而与转染入阴性对照的NC相比，转染了miR-146a mimics的肝细胞中的脂滴数量和TG含量均显著降低，说明miR-146a mimics，即过表达miR-146a可显著降低肝细胞内脂质沉积。同时，脂肪酸诱导得到的肝细胞脂质异常沉积模型，其中脂肪酸合酶基因FASN表达显著上调，而过表达miR-146a可显著FASN基因的表达，因此，miR-146a可通过靶向调控FASN基因的表达，调控肝细胞脂质沉积。实施例4包含pri-miR-146a核心启动子区的荧光素酶报告载体的构建及应用
(1)pri-miR-146a转录起始位点确认
通过在mirbases数据库检索获得如SEQ ID NO.1所示的miR-146a的成熟序列，根据该序列设计RACE引物(SEQ ID NO.12-13)：
mir-146a外侧：5'GAAATATCCAAGCTGAAGAACTGAGC 3'
mir-146a内侧：5'GATTCAATTACAACCCATGGAATTC 3'
提取鸡肝脏组织RNA，取RNA样品1μL，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，EB染色10min后用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带检测RNA完整性；对RNA进行去磷酸化处理得到CIAP-treated RNA。使用Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)去掉mRNA的5′帽子结构，保留一个磷酸基团；进行5’RACE adaptor连接后进行反转录反应；反转录结束后根据上述设计的RACE引物进行5’RACE反应；对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认扩增片段大小后进行割胶回收，随后将回收产物进行T-载体克隆并测序确认，得到鸡pri-miR-146a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
提取鸡肝脏总RNA，通过加入随机引物进行反转录反应，接着采用如SEQ ID NO.8-9所示的pri-miR-146a定量引物，采用常规qRT-PCR技术，可用于检测样品中pri-miR-146a的表达量，并诊断待测样本鸡肝脏中是否存在是否脂质沉积，因此可用于制备鸡脂肪肝诊断试剂盒。
(2)pri-miR-146a核心启动子区的荧光素酶报告载体的构建
利用Primer软件，根据上述扩增得到的pri-miR-146a的5’-UTR序列，在Genbank等数据库中检索并向前延伸2000bp序列；通过设计不同上游引物扩增不同片段长度的启动子区域，下游引物为同一引物，位于pri-miR-146a-5p转录起始位点附近。分别扩增得到了5个启动子区域，分别是L1(约2000bp)，L2(约1500bp)，L3(约1200bp)，L4(约1000bp)，L5(约500bp)，将扩增的PCR产物利用加入的酶切位点并双酶切后连入双荧光素酶报告载体pGL3中，构建不同长度的调控区域缺失片段(从上游进行逐步删除)pGL3-basic载体，将构建的质粒分别与pRL-CMV质粒共转染入培养的及原代肝细胞和L02细胞，48h后检测相对荧光强度(相对荧光值＝目的基因荧光值/对照基因荧光值)，以确定核心启动子区，检测结果如附图5的图A和图B所示，图A为连接有不同启动子区域的载体及空载体在鸡原代肝细胞中的相对荧光强度，图B为连接有不同启动子区域的载体及空载体在L02细胞中的相对荧光强度。根据测定结果，其中连接有启动子区域L4的载体在鸡原代肝细胞和L02细胞中的相对荧光强度均最强，因此确定其为核心启动子区，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
(3)pri-miR-146a核心启动子区的荧光素酶报告载体的应用
基于上述pri-miR-146a核心启动子区，按照常规方法构建荧光素酶报告载体pGL3-pri-miR146a，同时培养鸡原代肝细胞，当细胞细胞汇合至80％左右时，加入500μM，摩尔比为1:1的油酸和棕榈酸，以诱导肝细胞脂质异常沉积模型，接着将上述荧光素酶报告载体pGL3-pri-miR146a转染入细胞，培养24h后，加入待筛选药物厚朴酚，继续培养24h并检测细胞的相对荧光强度，测定结果如附图5的图C所示。同时，提取细胞RNA，反转录后检测细胞miR-146a表达水平，测定结果如附图5的图D所示，并收集细胞检测细胞中TG含量，测定结果如附图5的图E所示。
根据测定结果显示，待测药物厚朴酚可显著增加pri-miR-146a核心启动子的相对荧光强度；与该结果一致的，厚朴酚显著提高了miR-146a的表达，并降低了细胞中的TG含量。即pri-miR-146a核心启动子的相对荧光强度检测结果与细胞中miR-146a的表达水平以及细胞中TG含量的检测结果一致，因此包含有pri-miR-146a核心启动子区的荧光素酶报告载体可用于外源药物制剂或转录因子等对miR-146a转录活性调控的检测筛选，以筛选到以miR-146a为靶点治疗鸡脂肪肝综合征的有效药物和活性成分，这为鸡脂肪肝综合征的治疗提供了新的筛选方法。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种与鸡肝脏脂质沉积相关的miRNA及其应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 1
ugagaacuga auuccauggg uu 22
<210> 2
<211> 2240
<212> DNA
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 2
cttatcccta tgaaattctc aaacaaaggc ttccttgaaa gtgctgagtg ttgtattgtt 60
tatactcctt agctataaat ttcatttttt attaccagcg attctgctat gtgttaggac 120
accttctggc tatgaatgtg gcctcctctg tgccaaaaga aaacataaaa tagcctgttt 180
ctcaatatat atgtcctcaa gccattattt tgcatctgac ctatggtctg gatagagttg 240
ctttggctgc agtgaagatt tccctcttct gttttacagc acctggagga aagccaagca 300
ccggggagag agagcagagg atgagatagt gctgcacatc agaacggcct tgaaacgaat 360
gtcgtgtatc ctcagctttg agaactgaat tccatgggtt gtaattgaat cctttgtcag 420
acccatgggg ctcagttctt cagcttggat atttctgtct tcacatacac gggagatcaa 480
agaagcactt gatcatgcgc tgactcttcc ggattctgat agcagcaaat aggaaagaga 540
aagaataact gatgtgaatc actctgacag ggaggtttca ctgcaaagac caggctctct 600
catgtcgagt agctgcgcag tgattgagcc tctccgtggc tgatagtctg tccctgcatt 660
gctgctcgct ggttaattca actctcctct cagttttatc gaagttacat atcaagtgct 720
gagatgatgc tgactgattt atgcttccca aaaattgtgt ggtgctgctg aatgtggctc 780
tgctcccaca tgggaccagc aacaccccag ccctgccaag tctacccact gttggtctgc 840
tgcagcctcc tgtctgggat cactgctgca cagctactgt ttgctctttt ttggccccct 900
tgaggtggac ccattcaagt tgtgggctga aaaagtttgt gtttcttcct tggaagatct 960
gtgttaaagt ttattttctt tcaggcgtca ggaaaataaa atttatggtc ttcaaacacg 1020
taaagaggta taattaccaa cgagatttct acttcattcc tgcaataata acccttccta 1080
aattacattt ttcaaactca gtaaaatgga tcagtcactg atctcatccc tgtggtgcaa 1140
tgctgttaaa agcacaggaa tattaaaatc ccacaggtgc aggaggagcg tgttcagcta 1200
agtagtttaa agctgctgtg tgccttttat tctgaaaatg tatttacact aaaaataatc 1260
agatgtaatc actgttgcct gtggatacag atgtaccttt gtaccgatgt gcttttcata 1320
taaattttat tccagggttt gaagggtttc tttgtggctg tctgaagcat atcatgctgc 1380
ccagttgtga gacgacggat cttggaagga ctcaccagtc ccaccagctc ctgctgggag 1440
atatccatta aacaagaaga aggagaaaca tacacaaacg aaagcgaaat tctgaagttt 1500
catttctgct gtactccctg tcaaggagag ggaattaaat tggaggtgag agttagcaaa 1560
atctgcaaaa gaagagagtg aggtagcagc tgcacagaat gcccgaggcg ggcatctgct 1620
ggcagggctg cagcagccac ctctggggca aagcccagcc tgcaggcact gaggcagcac 1680
aggggatgtg tgtgtgatgg cagcctcaca aggccacgga tgaaatcaag atagcctttg 1740
gtacggcagt tttgcagtcc tatccctaaa gcacagtgtt tgtaacgctg gttttgctca 1800
gcaatctacc ataagttgtg aactaacaat agtactgctg gtgtctagct ggaagtactg 1860
gaatttctag tcagctctta aatccagcct gccctccagc cctctgtgct gaccactctg 1920
tgtgctcttc ctttgctgtg ggctcctgta gtccttttga tcctcccttg cccaacatga 1980
cacagcattc tctttctgga tactcctggg atcttctctt taaaccgccc ggttaatctt 2040
tcaagagcac tcctgcagaa ttaaaattat ttttaacacg tggcttcaaa ccaacgtgcc 2100
ttctgcctgc ctacctgcac agccttgcag tacacacaca gacccctctg cagtctgagc 2160
caggcaatgc tcaggcaccc cagcatgccc aggacctgtg ctgcgattcc cagtgtgccc 2220
ccaggtatgc ggtgtgctgg 2240
<210> 3
<211> 624
<212> DNA
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 3
ggtttgaaaa agctgttgct gattgctgca ggacaggctg tccggagaac aagctttgac 60
atccatgcaa agccccggcc attgcgtggc agtcaccaat gtgctgtggc acatggtgtg 120
gcacaatgtg tggcacaatg gcagtcacca atgggctctg ctgggagggt cagattcctg 180
ccaccactgg gcagccttct gggggtgatt agaatgaatt ggacattttt attggaaatt 240
tggaaatatt tttcagctcg gaatcaaatt actctctcag gggacaacct ataaactcct 300
taaacttcta acattttgtt tctacatttc ataaatatat gcttatttat aatttaagaa 360
aaccagcact agaacaaaat aattcgttct ctttcaacca cgctattaaa tacttttacc 420
taaattttgt ttgtgagggt aaagtgaatg atttaatctg aaccccttca acctccaaat 480
attttacctc agagcaaata tttctttaca ctgatcctga agagactttc cgagacatct 540
catctggagc ataaagaaat aggcttaaac tgttccaaat aaatctgaaa cttttctttt 600
taacggggac accacagatt gcgt 624
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagaacc cat 43
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctggtaggtg agaactgaat tcc 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcaactggtg tcgtggagtc ggc 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcttggatat ttctgtcttc ac 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagggacaga ctatcagcca 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cctgcgtgct atgcttgcc 19
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcgacattac ccatttcctg a 21
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaaatatcca agctgaagaa ctgagc 26
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gattcaatta caacccatgg aattc 25

Claims (9)

1.一种miR-146a过表达载体在制备调控鸡肝脏脂质沉积的药物中的应用，其特征在于，所述miR-146a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-146a的靶基因为脂肪酸合酶基因。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-146a过表达载体在制备治疗鸡脂肪肝综合征药物中的应用。
4.检测如SEQ ID NO.1所示的miR-146a和/或SEQ ID NO.2所示的pri-miR-146a表达量的检测试剂在制备鸡脂肪肝诊断试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述诊断试剂盒中包括：如SEQ ID NO.6-7所示的miR-146a定量引物和/或如SEQ ID NO.8-9所示的pri-miR-146a定量引物。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，采用所述诊断试剂盒检测miR-146a和/或pri-miR-146a表达量的方法包括：
提取鸡肝脏总RNA，通过加入如SEQ ID NO.4所示的LOOP引物和如SEQ ID NO.5所示的引物进行反转录反应，接着采用如SEQ ID NO.6-7所示的miR-146a定量引物检测miR-146a的表达量；和/或
提取鸡肝脏总RNA，通过加入随机引物进行反转录反应，接着采用如SEQ ID NO.8-9所示的pri-miR-146a定量引物检测pri-miR-146a的表达量。
7.一种荧光素酶报告载体，其特征在于，所述载体中包含如SEQ ID NO.3所示的pri-miR-146a核心启动子区。
8.检测如权利要求7所述荧光素酶报告载体的试剂在制备检测miR-146a转录活性的检测试剂盒中的应用。
9.检测如SEQ ID NO.1所示的miR-146a和/或SEQ ID NO.2所示的pri-miR-146a表达量的试剂在制备鸡肝脏脂质沉积性状辅助选择和/或改善鸡肉品质的试剂中的应用。
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