CN117187249B - 一种牦牛Lnc-MEG8基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种牦牛Lnc‑MEG8基因及其应用，属于基因工程技术领域。所述牦牛Lnc‑MEG8基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明首次发现了Lnc‑MEG8基因在牦牛成肌细胞增殖和成肌分化的调控作用，为深入了解牛肌肉发育机制提供重要依据，为优质牦牛新品种的快速培育和肉质改良提供理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种牦牛Lnc-MEG8基因及其应用。
背景技术
牦牛肉因其鲜美的肉质、丰富的营养物质、富含多种氨基酸以及高蛋白低脂肪的优点成为备受大众喜爱的绿色食品。但其特殊的生存环境和长达7个月的枯草期，使其生长和增重出现波浪式消长，从而影响经济价值和使用价值。家畜的生长速度和产肉性能都与骨骼肌生长发育密切相关，随着第二代测序技术的快速发展，高通量、快速和低成本的测序一次能对几十万到几百万条DNA分子进行测序，使得基因组或转录组测序变得方便易行。转录组测序是基因功能及结构研究的基础，可解决新基因的深入挖掘、低丰度转录本发现、转录图谱的绘制、基因家族鉴定及进化分析等各方面的问题，已被广泛应用于生物学、医学及农学等众多领域。因此，利用新技术手段鉴定影响牦牛生长性状的主效基因对牦牛产业的健康发展显得尤为重要。
发明人前期研究发现，影响骨骼肌发育的关键基因RTL1在Avs.E(成年牛组vs.胎牛组)和Mvs.E(六月龄牛组vs.胎牛组)比较组中同时存在一个顺式调节LncRNA(XR_314844.1-MEG8)，且胎牛组RTL1和MEG8的表达量高于其他两个发育阶段的水平，推测该LncRNA的调控模式在胚胎期的牦牛骨骼肌发育中起着关键作用。近年来，越来越多的研究表明，长链非编码RNA在骨骼肌发育过程中扮演着重要调控者的角色。但又因LncRNA普遍存在的进化保守性低，时空特异性表达，特异性亚细胞定位等特点，MEG8在牦牛骨骼肌发育过程中是否也具有重要调控功能？以及MEG8在调控骨骼肌分化过程中分子机制是什么？本项目围绕这两个疑问，以牦牛骨骼肌成肌细胞为模型，在细胞和分子水平上以期达到以下目的：(1)通过QPCR技术、表达谱分析及细胞核质分离初步探究MEG8的序列特征和表达规律；(2)通过基因功能缺失和获得探究MEG8对牦牛成肌细胞增殖和分化发育的调控作用。综上所述，本研究立足于生产实际和学科前沿，研究结果将丰富和完善牦牛生长发育机制的研究，也可为解决我国地方牦牛生产中的实际问题提供理论基础，推动牦牛的育种和深度开发利用进程。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种牦牛Lnc-MEG8基因及其应用，本发明首次发现了Lnc-MEG8基因在牦牛成肌细胞增殖和成肌分化的调控作用。为深入了解牛肌肉发育机制提供重要依据，为优质牦牛新品种的快速培育和肉质改良提供理论基础。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种牦牛Lnc-MEG8基因，所述牦牛Lnc-MEG8基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了上述技术方案所述的牦牛Lnc-MEG8基因在调控牦牛成肌细胞增殖中的应用。
优选的，过表达牦牛Lnc-MEG8基因抑制牦牛成肌细胞增殖。
优选的，沉默牦牛Lnc-MEG8基因促进牦牛成肌细胞增殖。
本发明还提供了上述技术方案所述的牦牛Lnc-MEG8基因在调控牦牛成肌细胞分化中的应用。
优选的，过表达牦牛Lnc-MEG8基因促进牦牛成肌细胞分化。
优选的，沉默牦牛Lnc-MEG8基因抑制牦牛成肌细胞分化。
本发明的有益效果为：
本发明首次发现了Lnc-MEG8基因在牦牛成肌细胞增殖和成肌分化的调控作用。为深入了解牛肌肉发育机制提供重要依据，为优质牦牛新品种的快速培育和肉质改良提供理论基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为原代骨骼肌成肌细胞的诱导分化及lnc-MEG8在随着分化过程中的表达情况；
图2为lnc-MEG8不同时期的核质分离及不同组织表达分布；
图3为过表达MEG8后肌分化标志基因MyF5、MyoG表达及蛋白丰度变；
图4为干扰MEG8后肌分化标志基因MyF5、MyoG表达及蛋白丰度变化；
图5为干扰/过表达MEG8后肌分化MEG8-Fish在各组的变化；
图6为免疫荧光检测干扰/过表达MEG8后MyoG和MyF5原位水平的表达；
图7为CCK8、Edu和流式细胞仪测定MEG8对牦牛成肌细胞增殖影响。
具体实施方式
本发明提供了一种牦牛Lnc-MEG8基因，所述牦牛Lnc-MEG8基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
GACCTCGGCTCCCGTGTTGCCAGGATCTGACCTCCCCTAGTTGAAAACAGCCTCGTGTTCCCCTGGGCCGAGGGGCAGCTCCAGAGGACTGGCTGAGTGCTCCGCGGCACTGGGACCGTTGTGAAGATCAGATGGGACATTGTACGCGAAGGCATGCTGCGGACACTACATGCCTGGGCAAGAGCGTGGAGGCCCCAGAGTGGGTCTGACGACACTGTTGATGAAGATCTTGGCTGTGACCTCTGTGGGAAATGAGCCATGGACCAACCAATATTCAACATACCTAATCTGATTTACTCATCACCAGTGATGACGATCTTGTCTGTCACTTCTGTGGATAGAAAGCAACGGGACTCATAGCAAGGGCAATTAAATAGAAGAAGCACCCAAAATGATCGAAGTTGAATATGAATTTTGTATGAATTATGGATGTGAACTGATCACGCATGTTCTCCGAGGTCCATTATAAAAGGAGGTTTTGTTCCTGGAATTTCATGATTGAGTTGTTATTCATGGATCAATTAATAAGTAAATACAGAAAGAAAAATGTGTCTGGATCGATGATGAGTTCCATGGGGTATCTGAAACAGGAGTTTTGATTAAACCCATAAGTGATTCTGAGGTCCATC。
本发明还提供了上述技术方案所述的牦牛Lnc-MEG8基因在调控牦牛成肌细胞增殖中的应用。在本发明中，过表达牦牛Lnc-MEG8基因优选抑制牦牛成肌细胞增殖。在本发明中，沉默牦牛Lnc-MEG8基因优选促进牦牛成肌细胞增殖。
本发明还提供了上述技术方案所述的牦牛Lnc-MEG8基因在调控牦牛成肌细胞分化中的应用。在本发明中，过表达牦牛Lnc-MEG8基因优选促进牦牛成肌细胞分化。在本发明中，沉默牦牛Lnc-MEG8基因优选抑制牦牛成肌细胞分化。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1实验方法
1.1慢病毒介导的Lnc-MEG8过表达载体的构建
在10cm培养皿中培养293T细胞，待其贴壁后进行转染。接下来，准备质粒溶液，包括Opti-MEM和Lipofectamine 3000混合一起，以及Opti-MEM、pLVX-IRES-puro(货号BR025，丰晖生物)、P3000、psPAX2质粒和pMD2.G质粒混合一起。然后，混合上述两种溶液并在室温下静置15分钟。将混合好的溶液加入293T细胞的培养液中，并在37℃、5％CO2的培养箱中继续培养。培养6小时后，去除含有转染混合物的培养基并加入新鲜细胞培养基，继续在37℃、5％CO2的培养箱中培养。转染后48小时，收集病毒上清，经过0.45微米滤器过滤，分装并存放在-80℃冰箱中。然后进行病毒感染实验。根据实验计划，将细胞接种于6孔板中，并在37℃、5％CO2的培养箱中培养。取出-80℃保存的病毒，在冰上缓慢融化。将准备好的培养基中加入准确体积的病毒。吸取细胞中的培养基并加入含病毒的培养基中，混匀后放入培养箱中培养48小时。最后进行WB和RT-PCR检测是否成功构建过表达载体。
1.2慢病毒介导的Lnc-MEG8干扰载体的构建
试验中，委托第三方公司合成了干扰序列，并将其连接到慢病毒载体pLVX-shRNA1(货号BR004，丰晖生物)上，该载体被广泛用于RNA干扰实验。为了实现连接，选择了BamHI和EcoRI作为限制性内切酶位点。首先，从资源库中选择合适的干扰序列SEQ ID No.2：ccgGGATCAATTAATAAGTAAATAttcaagagaTATTTACTTATTAATTGATCCttttt，并将其提交给第三方公司进行合成。同时，购买了pLVX-shRNA1慢病毒载体(货号BR004，丰晖生物)，通过对该载体进行质粒提取，获得了高质量的DNA，并确认其完整性和正确性。接下来，在pLVX-shRNA1载体的BamHI和EcoRI限制性内切酶位点上进行酶切，并将经过酶切的载体与合成的干扰序列连接。验证连接产物的正确性后，将其转化到宿主细胞中，并通过PCR、测序或消化酶切等方法进行验证。最后，将验证的连接质粒DNA转染到目标细胞中，并进行腺病毒包装和扩增。整个过程我们严格遵守了实验室的安全操作规程，并符合生物安全级别相应的操作和处置要求。
1.3RT-PCR与Westernblot
(1)cDNA文库的构建
用Trizol法提取肌细胞内的总RNA，经琼脂糖凝胶电泳及酶标仪吸光度检测RNA质量和浓度后，利用RNA反转录试剂盒PrimeScript TM RTreagent Kit with gDNAEraser(TaKaRa)将总RNA反转录为cDNA。反转录程序为：第一步37℃，15min；第二步为85℃，5s；之后便可置于4℃或-20℃保存。
(2)RT-PCR
本实施例使用TB Green TM Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus,TaKaRa，北京)荧光定量试剂盒对蛋白编码基因进行实时定量检测。反应体系为： PremixExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus，2×)，10μL；PCR上游引物(10μM)，0.8μL；PCR下游引物(10μM)，0.8μL；ROX Reference DyeⅡ(50×)，0.4μL；cDNA溶液，2μL；灭菌蒸馏水，6μL，引物序列见表1。PCR反应在7500Real Time PCR System(AppliedBiosystems)仪器上进行。该实验以GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCT方法对蛋白编码基因的RNA相对表达量进行计算。
表1引物序列
(3)WB蛋白印迹
本发明采用传统细胞裂解法提取细胞内总蛋白，并使用BCA法测定蛋白浓度(有关提取细胞中总蛋白的方法以及用BCA法测蛋白浓度的详细实验步骤请参见附录)。将10μg蛋白在12％SDS-PAGE胶上进行凝胶电泳，之后使用半干转膜仪将蛋白转移至PVDF膜上。膜经洗涤、脱脂牛奶封闭后，用稀释的一抗在4℃下孵育过夜，之后用二抗继续将蛋白孵育2小时。最终，在化学发光液的作用下，HRP底物与二抗标记的HRP发生反应，然后使用BIO-RADChemiDoc XRS+成像系统对蛋白印迹条带进行检测和灰度分析。
1.4流式细胞术检测细胞周期
成肌细胞在生长培养基中培养至密度为70％-80％时，将细胞传代培养至6孔细胞培养板中。待成肌细胞生长至密度为60％时，对细胞分别转染OE-2A、OE-NC、sh-2A、sh-NC四种病毒。转染48h后收集细胞，利用One Step Cell Cycle Straining Kit(联科生物，杭州)对细胞膜进行通透。接下来利用PI对细胞核进行染色15min。最后用流式细胞仪检测不同处理下细胞中DNA的含量。细胞计数通量为20000个。
1.5EdU染色
为了检测细胞的增殖情况，本实施例采用5-ethynyl-2-deoxyuridine(EdU)对细胞DNA进行荧光标记，检测细胞增殖情况。本实施例使用的试剂盒为EdUImaging Kit(Invitrogen)。首先，将成肌细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞密度为60％时，对细胞进行OE-2A、OE-NC处理。48h后，将细胞培养基换成含有10μM EdU的生长培养基并培养细胞1h。随后用3.7％的多聚甲醛固定细胞20min，用0.5％Triton X-100(Sigma)对细胞膜通透20min。接下来先用Alexa/>594azide标记细胞核，再用DAPI标记细胞核，最后在倒置荧光显微镜下观察细胞核染色情况。
2实验结果
2.1原代成肌细胞的分离、培养及诱导分化，lnc-MEG8表达水平测定
本实施例成功分离得到牦牛原代骨骼肌成肌细胞。如图1所示，初始分离的成肌细胞形态良好，呈明显的长梭形。在分化培养基的诱导下，成肌细胞在第六天就开始分化形成明显的肌管。到第八天，大部分成肌细胞已完全分化融合为成熟的肌管。通过Qpcr结果发现lncMEG8随着骨骼肌分化天数的增加表达量逐渐降低，以上研究结果说明本研究分离得到的骨骼肌成肌细胞具有非常强的成肌分化潜能为了分析lnc-MEG8细胞核质分布情况，分别收集处于增殖阶段的肌细胞(Myoblast)和处于分化阶段的肌管细胞(Myotube)。经细胞核质RNA分离后，分别检测lnc-MEG8在Myoblast和Myotube中的mRNA表达水平，其中以NEAT1和GAPDH分别为细胞核和细胞质特异表达的对照基因。图3中中AqRT-PCR结果显示，lnc-MEG8在细胞增殖阶段在细胞核与细胞质中都有分布。但随着成肌分化的过程发生，lnc-MEG8在细胞质中的含量逐渐增加，由Myoblast细胞质占比约64％降低至Myotube细胞中的52％(图2A-B)。
为了了解lnc-MEG8在牦牛的不同组织中的表达特征，我们从成年牦牛体内收集心、脾、肺、肾、背最长肌和皮下脂肪组织。经组织表达谱分析发现，lnc-MEG8在肾脏、脂肪和肌肉中表达量较高，这些结果说明lnc-MEG8在维持骨骼肌生长的过程中起到比较重要的作用(图2中C)。
2.2lnc-MEG8对成肌细胞分化的影响
为了检测慢病毒介导的lnc-MEG8过表达和干扰效率，本实施例首先利用原代骨骼肌成肌细胞筛选24h后收集细胞总RNA和总蛋白，分别在mRNA检测慢病毒的表达效率。结果显示，lnc-MEG8基因mRNA的表达水平在过表达实验中较对照组提高了10倍左右(图3中A)，而在干扰实验中较对照组降低了5倍左右(图4中A)。Fish原位杂交结果也与Qpcr结果呈现一致(图5中A和图5中B)。本实施例构建的慢病毒介导的lnc-MEG8过表达/干扰载体有效地提高/降低了lnc-MEG8的表达效率，能为后续实施例提供良好的实验材料。
与对照组相比，过表达MEG8后，成肌细胞中分化标志基因MyoG和MyF5的mRNA表达水平明显降低，然而，沉默MEG8后，成肌细胞中MyoG和MyF5的mRNA表达水平明显升高。Westernblot检测感染48h后，MEG8、MyoG和MyF5蛋白的表达水平。结果显示，与对照组相比，过表达MEG8后，成肌细胞中MyoG和MyF5的蛋白表达水平明显降低(图3)，然而，沉默Lnc4047，成肌细胞中MyoG和MyF5的蛋白表达水平明显升高(图4)。
使用免疫荧光检测过表达/沉默MEG8后MyoG和MyF5蛋白水平的变化，结果显示，与对照组相比，过表达MEG8后，成肌细胞中MyoG和MyF5的蛋白表达水平明显降低，然而，沉默MEG8后，成肌细胞中MyoG和MyF5的蛋白表达水平明显升高，表明MEG8能够抑制成肌细胞的分化(图6)。
2.3lnc-MEG8对成肌细胞增殖的影响
使用CCK-8检测MEG8对成肌细胞增殖的影响，检测结果显示，与对照组相比，过表达MEG8能够促进成肌细胞的增殖，而沉默MEG8能够减少成肌细胞的增殖能力(图7中的A,C,G)。Edu细胞增殖实验结果显示，与对照组相比，过表达MEG8后，细胞的增殖量明显降低，而沉默MEG8后，细胞的增殖量明显升高，表明MEG8能够促进细胞增殖(图7中的D,E,F)。
细胞周期是表征细胞增殖情况的一个重要指标。细胞发育的不同时期(G0、G1、S、G2期)，因DNA含量的差异可以用荧光染料碘化丙啶(PI)进行着色后，通过流式细胞仪加以区分。使用流式细胞术检测过表达/沉默MEG8后细胞周期的变化。结果显示，与对照组相比，过表达MEG8使处于S期的细胞数量明显增加，而沉默MEG8使处于S期的细胞数量明显减少(图7中的C)。
3实验小结
lnc-MEG8的表达随着骨骼肌分化天数的增加而降低，表明分离的骨骼肌成肌细胞具有很强的肌原性分化潜能。最后，在成肌细胞和肌管细胞中分析了lnc-MEG8在细胞核和细胞质中的分布，发现随着细胞向肌管分化，细胞质中lnc-MEG8的含量增加。经组织表达谱分析发现，lnc-MEG8在肾脏、脂肪和肌肉中表达量较高，这些结果说明lnc-MEG8在维持骨骼肌生长的过程中起到比较重要的作用。
该实施例使用慢病毒介导的lnc-MEG8过表达和干扰载体在原代骨骼肌成肌细胞中进行了实验。结果表明，lnc-MEG8基因的mRNA表达在过表达实验中增加，而在干扰实验中减少。此外，在过表达MEG8时，MyoG和MyF5的mRNA和蛋白表达水平降低，而在沉默MEG8时，MyoG和MyF5的表达水平升高。免疫荧光检测结果也支持了这些发现，表明MEG8可以抑制成肌细胞的分化。
lnc-MEG8对成肌细胞增殖具有影响。过表达MEG8可以促进成肌细胞的增殖，而沉默MEG8则减少了增殖能力。Edu细胞增殖实验结果也显示了相似的趋势。此外，过表达MEG8还导致处于S期的细胞数量增加，而沉默MEG8则减少了处于S期的细胞数量。这些结果表明MEG8在调控成肌细胞增殖和细胞周期中发挥着重要作用。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (6)
1.牦牛Lnc-MEG8基因在调控牦牛成肌细胞增殖中的应用；所述牦牛Lnc-MEG8基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，过表达牦牛Lnc-MEG8基因促进牦牛成肌细胞增殖。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，沉默牦牛Lnc-MEG8基因抑制牦牛成肌细胞增殖。
4.牦牛Lnc-MEG8基因在调控牦牛成肌细胞分化中的应用；所述牦牛Lnc-MEG8基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，过表达牦牛Lnc-MEG8基因抑制牦牛成肌细胞分化。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，沉默牦牛Lnc-MEG8基因促进牦牛成肌细胞分化。
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