CN110511903A - 一种miR-21-5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法及其应用 - Google Patents

一种miR-21-5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种miR‑21‑5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法及其应用，属于生物技术领域，筛选在母猪中显著高表达的miR‑21‑5p并推测其参与母猪的繁殖过程，并利用生物信息学技术确定Smad7基因为miR‑21‑5p调控的靶基因。本发明以母猪为研究对象，研究miR‑21‑5p和Smad7对pGCs凋亡的影响，以期阐明miR‑21‑5p和Smad7对卵泡发育的调控作用，并检测miR‑21‑5p对Smad7的调控作用，为提高母猪产仔率提供了有力的科研借鉴。本发明还公开了所述miR‑21‑5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法在提高母猪产仔率过程中的应用。

Description

一种miR-21-5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研 究方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种miR-21-5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法及其应用。
背景技术
近年来，大量的研究学者主要对卵泡发育的形成过程以及发育阶段关注较多，在哺乳动物的生殖系统中，卵泡是其主要功能单元。在雌性的生殖周期内，卵泡的生长发育过程贯穿了神经调节、内分泌调节以及各种不同的神经组织之间的相互协调。卵泡成熟的过程十分复杂，而且耗费的时间很长，如此才会成功受精以及发育成胚胎的可能性。卵泡的发育过程按卵泡的发育过程划分为初级阶段、次级阶段以及成熟阶段；也可按形态结构来进行划分为原始阶段、窦前阶段、窦状阶段、成熟阶段。许多卵泡在发育初期就进入了闭锁阶段，只有极少的卵泡在青春期时受到性激素诱发，才会逐渐发育形成为窦状卵泡。在雌性到达生育期之后，成熟的卵泡数量决定着雌激素的分泌量，同时卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)和黄体生长素(luteinizing hormone，LH)有利于卵泡的成熟和卵母细胞的生长发育。
繁殖性状是母猪产业的重要经济性状之一，研究母猪繁殖性状的调控基因及其作用机制，对提高母猪繁殖性能具有重要意义。卵巢是雌性动物的主要生殖器官，卵泡是卵巢的基本功能单位，所以分析探讨卵巢GCs的发育和凋亡机理，对于增加母猪的生产能力拥有着非常关键的影响。
miRNA是一类内源性、长度约为22个核苷酸的非编码小单链RNA分子，其参与各种重要细胞生理和病理过程，包括细胞增殖、分化、凋亡和激素生物的合成。张晓东等在山羊卵巢系统中检测分析到大量的miRNA，同时试验得出了这些miRNA具有很高的保守性。黄龙利用高通量测序技术测定高、低产约克夏母猪卵巢的差异表达miRNA，发现有8个miRNA可能影响到母猪产仔数。Yao等研究发现，miR-224通过TGF-β信号通路靶向抑制Smad4基因，从而促进GCs增殖和卵巢雌激素分泌。Chen等试验发现，miR-22通过靶向SIRT1抑制小鼠卵巢GCs凋亡。Fu等通过体内敲除miR-21，发现小鼠GCs凋亡率增加，进一步研究，发现miR-21过表达通过靶向PDCD4和PTEN基因抑制小鼠卵巢GCs的凋亡。Smad7是TGF-β和BMP家族的信号传导拮抗剂。Smad7可通过去甲肾上腺素的介导来调节大鼠GCs的凋亡。miR-181b通过TGF-β信号与TGFBR1启动子的结合，使Smad7表达量下降，从而抑制猪GCs的凋亡。然而，miR-21-5p和Smad7调控卵巢内部机理的研究鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种miR-21-5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法及其应用，筛选在母猪中显著高表达的miR-21-5p并推测其参与母猪的繁殖过程，并利用生物信息学技术确定Smad7基因为miR-21-5p调控的靶基因。本发明以母猪为研究对象，研究miR-21-5p和Smad7对pGCs凋亡的影响，以期阐明miR-21-5p和Smad7对卵泡发育的调控作用，并检测miR-21-5p对Smad7的调控作用，为提高母猪产仔率提供了有力的科研借鉴。
其具体技术方案为：
一种miR-21-5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法，包括以下步骤：
步骤1、猪卵巢颗粒细胞培养
(1)采样：提取猪卵巢的组织样本，用PBS缓冲液消毒灭菌处理，之后运回试验室进行试验研究；
(2)清洗样品：首先采用75％酒精进行消毒清洗卵巢组织，同时将部分的卵巢放于固定液中，便于切片制作；
(3)收取卵泡液：用10ml的针管吸取卵泡液，放入DMEM高糖培养液中；
(4)离心：将上述(3)中的混合液放置于10ml离心管中，放入离心机中，转速：1000r/min，时间：10min，离心后弃去上清液；
(5)接种：采用DMEM完全培养基(85％DMEM高糖培养液+14％胎牛血清+1％双抗)重悬细胞，CO2培养箱中培养；
(6)去除杂质：培养24h后，用PBS缓冲液清洗杂质，细胞换液，继续培养。
步骤2、化学合成miRNA模拟物和siRNA
根据miRBase和GenBank数据库提供的猪miR-21-5p和Smad7的序列信息，体外化学合成miRNA模拟物、抑制剂和siRNA。合成的RNA小片段由苏州吉玛基因股份有限公司设计合成。合成序列如SEQ：ID：NO：1-SEQ：ID：NO：8所示；
步骤3、pGCs的转染
(1)将待接种pGCs放在6孔板上，培养24h，更换无双抗培养液，培养6h；
(2)将10μL miR-21-5p mimics、miR-21-5p mimics-NC、miR-21-5p inhibitor、miR-21-5p inhibitor-NC和Smad7-siRNA-NC/288/536/1055分别溶于300μL opti-mem无血清培养基中，混匀，室温静置10min；
(3)将10μL lipo3000溶于300μL opti-mem无血清培养基中，混匀，室温放置5min；
(4)将(2)与(3)的试管溶液混合并静置30min；
(5)6孔板的溶液用opti-mem无血清培养液更换，然后把混合溶液加入6孔板中，培养6h，用DMEM高糖培养基继续培养。
步骤4、qRT-PCR检测
(1)RNA提取
(2)反转录
根据TaKaRa反转录试剂盒说明书，构建反转录体系；
(3)设计引物
引物设计由苏州吉玛基因股份有限公司负责合成；合成的引物序列如SEQ：ID：NO：9-SEQ：ID：NO：10所示；
(4)确定最适Tm值
根据设计引物的退火温度，设置退火温度范围，反应条件如下：
取12μL反应产物，凝胶电泳30min，寻找条带中最清晰，则其的温度就是退火温度即最适Tm值；
(5)qRT-PCR
根据说明书构建反应体系。反应条件设置为：变性条件下95℃60sec，延伸条件下95℃10sec，最适Tm值60sec，总共进行30次。以GAPDH作为内参，每个样品设置3个重复；
(6)结果处理
采用法计算相对表达量，进行3次重复试验，使用SPSS 21.0对数据结果进行研究分析，并进行显著性检验。
步骤5、细胞凋亡检测
参照细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)的操作说明书，具体操作步骤如下：pGCs培养和转染参照步骤1和步骤3；
(1)GCs接种6孔板，将mimics NC、miR-21-5p mimics、inhibitor NC、miR-21-5pinhibitor、Smad7-siRNA-NC和Smad7-siRNA-1055分别转染到GCs中，DMEM高糖培养基培养24h；
(2)吸取细胞液用缓冲液清洗一次，然后加入胰酶进行消化，再加入DMEM高糖培养基，吹打混匀，放入离心机进行离心，转速：1200r/min，时间：8min；
(3)弃掉上清，用1ml PBS缓冲液重悬细胞并计数，数量不少于1×105，放入离心机进行离心，转速：1200r/min，时间：8min，然后收集细胞；
(4)加入500μL的1×Binding buffer洗涤细胞一次，然后离心，转速：1200r/min，时间：8min，弃去上清液，再加入500μL 1×Binding buffer重悬细胞；
(5)加入10μL的Annexin V-FITC，吹打混匀，室温静置20min；
(6)加入15μL的PI染液，混匀，在冰盒中静置10min；
(7)用流式细胞仪进行检测；
(8)试验重复3次，对3次试验的细胞凋亡率(细胞凋亡率＝早期细胞凋亡率+晚期细胞凋亡率)用SPSS 22.0分析显著性差异(**P<0.01，*P<0.05)。
步骤6、细胞周期检测
参照细胞周期检测试剂盒(合肥知恩生物技术有限公司)的操作说明书，具体操作步骤如下：pGCs培养和转染参照步骤1和步骤3；
(1)细胞消化后用PBS洗涤一次，离心1200r/min，8min，去上清，加入1mL的75％乙醇固定于-20℃；
(2)取固定好的细胞进行离心，转速：1200r/min，时间：8min，用PBS洗涤一次，1200r/min，8min；
(3)加入100μL的RNAase(100μg/mL)重悬细胞，37℃，30min；
(4)加入400μL的PI(50μg/mL)染液，置4℃，30min，上机检测；
(5)试验重复3次，对3次试验的细胞周期。细胞增殖指数(PI)＝(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100％。用SPSS 22.0分析显著性差异(**P<0.01，*P<0.05)。
步骤7、细胞增殖检测
参照MTT检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)的操作说明书，具体操作步骤如下：pGCs培养和转染参照步骤1和步骤3；
(1)将接种细胞放在96孔板，每孔添加150μL的opti-mem无血清培养液；
(2)设置空白组和调零组，每间隔12h进行转染一次。
(3)每孔添加20μL的MTT溶液，混匀，37℃的CO2箱中培养6h；
(4)弃去孔内溶液，在每孔中添加200μL的DMSO溶液，摇晃10min，使结晶充分溶解；
(5)使用多功能酶标仪进行酶联免疫检测分析(OD：490nm)；
(6)试验重复3次，对3次试验的细胞增殖率用SPSS 22.0分析显著性差异(**P<0.01，*P<0.05)。
步骤8、雌二醇和孕酮含量检测
pGCs转染后收取细胞培养液中的上清部分，在-20℃冰箱里储存，用于检测pGCs中E2和P的含量。采用武汉基因美公司生产的ELISA检测试剂盒，检测E2和P的浓度，具体操作步骤参照试剂盒说明书进行。
步骤9、构建靶基因双荧光素酶报告载体
首先采用生物信息学方法，依靠miR-21-5p 5'端的第2-8位碱基与目的基因的3'UTR区序列之间碱基互补配对的原则，运用RNAhybrid 2.1.2软件，对miR-21-5p和目的基因的结合位点进行预测。
利用全基因合成的方法合成Smad7基因3'UTR的野生序列和包含3'UTR突变位点的序列。同时，在这两个序列的5'端和3'端分别加装酶切位点酶切位点sgfI(GCGATCGC)和XhoI(CTCGAG)，二者的序列如SEQ：ID：NO：11-SEQ：ID：NO：12所示；
随后，把合成的两个序列克隆到pmiR-RB-REPORTTM载体中。经过广州市锐博生物科技有限公司的测序后，确定获得了正确的重组载体。
步骤10、双荧光素酶报告系统检测
双荧光素酶报告基因活性检测参照广州市锐博生物科技有限公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒，具体操作步骤如下：
293T细胞培养
(1)DMEM完全培养基配制：85％DMEM高糖培养液+14％胎牛血清+1％双抗；
(2)293T细胞复苏：从液氮罐中取出装有293T细胞的冻存管，快速放置于的37℃的恒温水浴锅中，使冻存管内的293T细胞融化之后，送到细胞间离心，设置转速1200r/min，时间8min，弃掉上清液，并加入DMEM完全培养基，混匀后用移液枪吸取适量293T细胞移入培养皿中，吹打混匀后，放入37℃的恒温箱中；
(3)293T细胞传代：待培养皿中的293T细胞的密度达到85％，弃去培养液，并使用PBS缓冲溶液清洗1次，之后加入1ml的胰酶，放入37℃的恒温箱中消2min，再加入3ml的DMEM完全培养基终止消化，用移液枪吸取混合液至10ml离心管中，1200r/min离心8min，弃去上清液，再加入DMEM完全培养基，重新悬浮293T细胞，转移至24孔板内，最后放入37℃的CO2培养箱中继续培养。
293T细胞转染
按照转染步骤进行：
(1)转染前换成不含有双抗的培养液进行培养；
(2)每个孔转染方式如下：
A将1μg的质粒和100pmol的miR-21-5p mimics、mimics-NC溶于60μL的opti-mem无血清培养液中，静置8min；
B将3μL的转染试剂溶于60μL的opti-mem无血清培养液中，静置8min；
C将A液和B液混合，静置15min；
(3)静置后，倒去细胞培养液，并加入500μL的opti-mem无血清培养液；
(4)加入每孔中，放入37℃的CO2培养箱中培养5h，最后将opti-mem无血清培养液换成DMEM完全培养基再次进行培养24h。
荧光素酶检测
(1)裂解细胞：细胞培养24h之后，弃去培养液，用PBS缓冲溶液清洗2次，每次10min，再加入细胞裂解液150μL，摇晃振荡反应20min，用移液枪吹打，充分裂解细胞，然后置于离心机中，转速：1200r/min，时间：8min，吸取上清液备用；
(2)将荧光素酶试剂和缓冲液溶解到试管中，并达到室温，萤光素酶检测底物置于冰盒上备用；
(3)每个样品需150μL，取适量海肾萤光素酶检测缓冲液，按照l：150加入海肾萤光素酶检测底物(150×)配制成海肾萤光素酶检测工作液；
(4)开启多功能酶标仪，测定间隔设为3sec，测定时间设为12sec；
(5)每个样品取100μL进行检测；
(6)加入150μL海肾萤光素酶检测工作液，用移液枪吹打均匀，之后测定相对荧光值；
(7)用萤火虫萤光素酶为内参，不同样品间的荧光活性＝海肾萤光素酶的相对荧光值÷萤火虫萤光素酶的相对荧光值。
步骤11、Western blot
(1)蛋白提取
(2)Western blot
(3)结果处理
图片使用Photoshop CS6软件进行裁剪，灰度用Quantity One v4.6.6软件进行分析，数据用SPSS 22.0分析显著性差异(**P<0.01，*P<0.05)。
进一步，步骤4中，RNA提取具体为：
A用PBS缓冲溶液清洗2次，每次10min，每孔pGCs加入1mL TRLzol试剂，用移液枪吹打混匀，转移溶液至2mL离心管，室温静置10min；
B向离心管内加入氯仿，摇晃振荡，室温静置10min，然后放入离心机进行离心，转速：1200r/min，时间：8min；
C吸取400μL的上清液移入新的离心管中，加入400μL的异丙醇，摇晃振荡，室温静置15min，然后放入离心机进行离心，转速：1200r/min，时间：8min；
D弃去上清液，加入1mL75％乙醇，摇晃均匀，然后放入离心机进行离心，转速：1200r/min，时间：8min；
E弃去上清液，等乙醇挥发后加入100μL Nuclease-free水，用移液枪吹打混匀，测定RNA浓度与纯度，-80℃冰箱保存。
进一步，步骤11中，蛋白提取具体为：
A首先将RIPA裂解液与PMSF进行混匀，并室温静置10min；
B再用PBS缓冲溶液清洗细胞2次，每次10min；
C然后将A中的溶液加入到经过B处理的细胞中；
D将其放置在冰板上，静置30min；
E然后将混合液放入离心机进行离心，转速：1200r/min，时间：8min；
F取上清溶液，-80℃冰箱保存。
进一步，步骤13中，Western blot具体为：
A变性：用缓冲液清洗蛋白，并使用沸水进行处理5min；
B制胶：对经过A处理之后的试样进行制胶；
C上样：制胶后倒入缓冲液中，每孔20μL蛋白样品，Marker的上样量为5μL。
D电泳：先80V电泳0.5h，换120V电泳至Marker完全分开，停止电泳；
E切胶：切取目标蛋白周围的胶；
F转膜：使用转膜夹转移到槽内，并采用TBST缓冲液清洗2次，每次10min；
G封闭：封闭液对其进行封闭；并使用TBST缓冲液清洗2次，每次10min；
H添加一抗：加入一抗溶液，室温孵育，并使用TBST缓冲液清洗2次，每次10min；
I添加二抗：加入二抗溶液，室温孵育，并使用缓冲液进行清洗处理；
J照胶：将A液和B液均匀滴在PVDF膜；并对其显影拍照。
本发明所述miR-21-5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法在提高母猪产仔率过程中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明检测了miR-21-5p和Smad7对体外pGCs增殖、凋亡、雌二醇和孕酮分泌的影响，并证明了miR-21-5p和Smad7之间的靶向关系。本发明报道的经验数据可为母猪的生殖机理和繁殖力提供参考。
附图说明
图1是本发明miR-21-5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞凋亡的分子机制研究方法的流程示意图；
图2是本发明miR-21-5p对猪卵巢颗粒细胞凋亡率的影响；
A:流式细胞术检测结果；B:细胞凋亡率显著性分析；
图3是本发明miR-21-5p对猪卵巢颗粒细胞周期的影响；
A:流式细胞术检测结果；B:细胞周期的显著性分析；
图4是本发明miR-21-5p对猪卵巢颗粒细胞增殖率的影响；
图5是本发明miR-21-5p对猪卵巢颗粒细胞中E2和P含量的影响；
A:E2含量；B:P含量；
图6是本发明miR-21-5p靶基因RNAhybrid预测结果；
图7是本发明双荧光素酶报告载体构建相关图；
A:野生型片段电泳图；B:突变型片段电泳图；C:酶切凝胶电泳图(M:DNA Marker；1:野生型重组质粒双酶切片段；2:突变型重组质粒双酶切片段)；D:miR-21-5p与Smad7野生型和突变型之间的对比图；
图8是本发明相对荧光素酶表达活性；
图9是本发明Smad7基因mRNA相对表达量；
图10是本发明Smad7基因蛋白表达量；
图11是本发明Smad7-siRNA mRNA相对表达量；
图12是本发明Smad7-siRNA-1055对猪卵巢颗粒细胞凋亡率的影响；
A:流式细胞术检测结果；B:细胞凋亡率显著性分析；
图13是本发明Smad7-siRNA-1055对猪卵巢颗粒细胞周期的影响；
A:流式细胞术检测结果；B:细胞周期的显著性分析；
图14是本发明Smad7-siRNA-1055对GCs增殖率的影响；
图15是本发明Smad7-siRNA-1055对猪卵巢颗粒细胞中E2和P含量的影响
A:E2含量；B:P含量。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
由附图1可知，首先运用流式细胞仪、MTT比色法、ELISA法分别检测miR-21-5p对GCs功能的影响；然后通过生物信息学、构建双荧光素酶报告基因、qRT-PCR和Western blot技术验证miR-21-5p对Smad7的负调控作用；最后运用流式细胞仪、MTT比色法、ELISA法分别检测Smad7对GCs功能的影响。
细胞转染后，利用流式细胞仪，检测其对GCs凋亡的影响，细胞凋亡率＝UR区凋亡率+LR区凋亡率。由附图2A可知，与mimics NC组相比，转染miR-21-5p mimics组后，细胞凋亡率由6.74±0.06％减少到4.61±0.19％；与inhibitor NC组相比，转染miR-21-5pinhibitor组之后，细胞凋亡率由7.42±0.11％增加到11.92±0.70％。将试验数据进行显著性分析，如附图2B，我们可以得出，过表达miR-21-5p能够极显著抑制pGCs凋亡(P＜0.01)，而miR-21-5p inhibitor能够极显著促进pGCs凋亡(P＜0.01)。
细胞转染后，利用流式细胞仪，检测miRNA对pGCs周期的影响。由附图3A/B可知，与mimics NC组相比，转染miR-21-5p mimics组能够显著提高S期的细胞比率(P＜0.01)和细胞增殖指数(P＜0.05)；与inhibitor NC组相比，转染miR-21-5p inhibitor组能够极显著提高G0/G1期细胞比率(P＜0.01)，能够显著降低S期、G2/M期细胞比率(P＜0.05)和细胞增殖指数(P＜0.01)。结果表明miR-21-5p能促进细胞从G0期向S期转化，加快细胞周期的进展，从而促进pGCs的增殖和DNA合成。
细胞转染后，通过MTT比色法，检测miR-21-5p对GCs增殖的影响。由附图4分析可知，与mimics NC组相比，转染miR-21-5p mimics组后，细胞活力由0.67±0.01上升到0.81±0.01，其能够极显著提高细胞活力(P＜0.01)；与inhibitor NC组相比，转染miR-21-5pinhibitor组后，细胞活力由0.66±0.02下降到0.49±0.01，其能够极显著降低细胞活力(P＜0.01)。结果表明：miR-21-5p可以提高pGCs活力，从而促进pGCs增殖。
细胞转染后，收集细胞培养液上清，酶联免疫法(ELISA)检测所收集培养液中E2和P的含量。由附图5A分析可知，与mimics NC组相比，转染miR-21-5p mimics组后，E2含量由20.31±1.34pg/ml上升到25.18±0.36pg/ml，其显著提高了细胞中E2含量(P＜0.05)；与inhibitor NC组相比，转染miR-21-5p inhibitor组后，E2含量由21.47±1.27pg/ml下降到17.76±0.13pg/ml，其显著降低了细胞中P含量(P＜0.05)。由附图5B分析可知，与mimicsNC相比，转染miR-21-5p mimics组后，P含量由22.14±0.73pmol/L下降到17.09±0.70pmol/L，其显著降低了细胞中P含量(P＜0.05)；与inhibitor NC组相比，转染miR-21-5p inhibitor组后，P含量由20.64±0.80pmol/L上升到25.71±0.46pmol/L，其显著提高了细胞中P含量(P＜0.05)。结果表明：miR-21-5p能够提高pGCs中E2含量和降低P含量。
首先用miRBase数据库查找猪的miR-21-5p序列，然后再用NCBI查找猪的Smad73'-UTR的序列，最后利用RNAhybrid 2.1.2软件预测二者序列结合位点(附图6)。
人工合成的Smad7 3'UTR的野生型片段和突变型片段结果如附图7A/B，可见两条目的片段条带清晰，单一特异，大小(650bp)与预期的基本一致，确定合成的两条片段为Smad7基因3'UTR区的野生型序列和突变型序列。之后将两条序列分别连接到pmiR-RB-REPORTTM载体上，经过双酶切(附图7C)和测序比对鉴定，成功构建了野生型载体和突变型载体，命名为Smad7-WT和Smad7-MUT。载体序列如附图7D。
测序比对成功后，将菌液提取质粒，把miR-21-5p mimics和mimics NC分别与质粒转染至293T细胞中，培养24h回收293T细胞，检测Smad7-3'UTR双荧光素酶报告基因载体及突变载体的荧光素酶活性。由附图8得出结果，转染miR-21-5p mimics后，相比较Smad7突变型，Smad7野生型载体的荧光素酶活性极显著降低(P<0.01)；转染mimics NC后，野生型载体和突变型载体之间的荧光素酶活性没有显著差异。根据试验结果初步鉴定Smad7是miR-21-5p的靶基因，并且通过结合3'UTR区来抑制Smad7表达。
细胞转染后，提取RNA，以GAPDH为内参，通过实时定量PCR检测Smad7mRNA在pGCs中的表达量。qRT-PCR结果(附图9)表明，转染miR-21-5p mimics后Smad7的mRNA表达量极显著低于mimics NC组(P<0.01)。而转染miR-21-5p inhibit后Smad7的mRNA表达量极显著高于inhibitor NC组(P<0.01)。结果表明miR-21-5p对Smad7基因的mRNA表达量起负调控作用。
Western blot检测Smad7蛋白的表达量，以GAPDH为内参做差异分析，结果(附图10)发现转染miR-21-5p mimics后Smad7蛋白的表达量极显著低于mimics NC组(P<0.01)；转染miR-21-5p inhibitor后蛋白水平极显著高于inhibitor NC组(P<0.01)。结果表明miR-21-5p对Smad7的蛋白表达量起负调控作用。
本发明采用合成Smad7靶基因小干扰RNA片段，用于细胞水平研究干扰靶基因对GCs功能的实验。首先合成Smad7靶基因各3个小干扰RNA片段和阴性对照，在GCs中转染各个小片段，来确定是否能到干扰的效率。qRT-PCR检测如附图11所示，转染浓度8nmol/LSmad7-siRNA-288/536/1055/NC后，相对于siRNA-NC对照组，Smad7-siRNA-1055干扰效率最好(P＜0.01)，所以选择Smad7-siRNA-1055用于后续研究。
将Smad7-siRNA-NC和Smad7-siRNA-1055转染pGCs中，利用流式细胞仪，检测Smad7-siRNA对pGCs凋亡的影响。通过附图12A可知，与Smad7-siRNA-NC组相比，转染Smad7-siRNA-1055后，细胞凋亡率由10.89％±0.10减少到7.55±0.52％。将试验数据进行显著性分析，如附图12B，我们可以得出，Smad7-siRNA能够抑制pGCs凋亡。
细胞转染后，利用流式细胞仪，检测Smad7-siRNA对pGCs周期的影响。由附图13A/B可知，与Smad7-siRNA-NC组相比，转染Smad7-siRNA-1055组能够极显著提高S期的细胞比率和细胞增殖指数(P＜0.01)，降低G0/G1期的细胞比率(P＜0.01)。结果表明miR-21-5p能促进细胞从G0期向S期转化，加快细胞周期的进展，从而促进GCs增殖和DNA合成。
细胞转染后，通过MTT比色法，检测Smad7-siRNA对GCs增殖的影响。由附图14分析可知，与Smad7-siRNA-NC组相比，转染Smad7-siRNA-1055组后，细胞活力由0.52±0.02上升到0.75±0.01，其能够极显著提高细胞活力(P＜0.01)。结果表明：Smad7-siRNA可以提高pGCs的活力，从而促进pGCs增殖。
细胞转染后，收集细胞培养液上清，酶联免疫法(ELISA)检测所收集培养液中E2和P的含量。由附图15A/B分析可知，与Smad7-siRNA-NC组相比，转染Smad7-siRNA-1055组后，E2含量由47.48±1.24pg/ml上升到59.95±1.78pg/ml，P含量由34.22±0.41pmol/L下降到26.51±1.24pmol/L，其显著提高了GCs中E2含量(P＜0.05)，显著降低了GCs中P含量(P＜0.05)。结果表明：Smad7-siRNA可提高pGCs中E2含量和降低P含量。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 一种miR-21-5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uucuccgaac gugucacgut tacgugacac guucggagaa tt 42
<210> 2
<211> 44
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uagcuuauca gacugauguu gaaacaucag ucugauaagc uauu 44
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caguacuuuu guguaguaca a 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ucaacaucag ucugauaagc ua 22
<210> 5
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uucuccgaac gugucacgut tacgugacac guucggagaa tt 42
<210> 6
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcacucggug cuuaagaaat tuuucuuaag caccgagugc tt 42
<210> 7
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcugugaauc uuacgggaat tuucccguaa gauucacagc tt 42
<210> 8
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggacgcuguu gguacacaat tuuguguacc aacagcgucc tt 42
<210> 9
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggaaaggcc atcaccatct atggtcgtga agacaccagt 40
<210> 10
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggaggagaag acgagagtgg agctgactct tgttgtccga 40
<210> 11
<211> 760
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agcggcatgg atagacaccc tgctgcttgc gccagcgcca ggatcaacgt ctaattctag 60
gcgatcgcgt catttttttt ttccttcctc tcgtcgttct tgtttatgtt atgttttgtt 120
ttgttctttg agaaatagct tatgaaaaga attgttggtt tttttttttt ttttttttcc 180
tcttcggggc gggttggggc gggggcaggg gtgggcagtg gtaaggttgg cagaacaccc 240
agatctgaaa aggggaagca aaaatcagtg ccaccaaaca cagtgtaaat ggggagcagg 300
ccccaacctt ggggtcatcg tagcccttag tagggcttat gtgtgagtga gtgtgtgcgc 360
gtgtgtgagt gtagatgggg gaggcggtgt gctctgtgtt gttaactacg aatgctccca 420
agctgtgtct ctagcccctt gcacctgcgc agtggggcag caggtctccc agcagctgcc 480
agcagcaagg ttgtgtcccc agcctgtgga agcccccctg cccctcgcca ccccttccta 540
ggacattggc ctgtccgcag gcttcttcga agcagctcta caagaagccg aaccagaacc 600
tatttcccat gctgtctcac tcgcccccgc cccctccagc cacctccctg ccatcgtcct 660
ttctcttttg gccacctgct cctctcgagc ccgggaattc gtttaaacct agagcggccg 720
ctggccgcaa taaaatatct ttattttcat tacatctgtg 760
<210> 12
<211> 760
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgggggtggc gcaggatcac gtctaattct aggcgatcgc gtcatttttt ttttccttcc 60
tctcgtcgtt cttgtttatg ttatgttttg ttttgttctt tgagaaatag cttatgaaaa 120
gaattgttgg tttttttttt tttttttttt cctcttcggg gcgggttggg gcgggggcag 180
gggtgggcag tggtaaggtt ggcagaacac ccagatctga aaaggggaag caaaaatcag 240
tgccaccaaa cacagtgtaa atggggagca ggccccaacc ttggggtcat cgtagccctt 300
agtagggctt atgtgtgagt gagtgtgtgc gcgtgtgtga gtgtagatgg gggaggcggt 360
gtgctctgtg ttgttaacta cgaatgctcc caagctgtgt ctctagcccc ttgcacctgc 420
gcagtggggc agcaggtctc ccagcagctg ccagcagcaa ggttgtgtcc ccagcctgtg 480
gaagcccccc tgcccctcgc caccccttcc tagctgtaac ccctgtccgc aggcttcttc 540
gaagcagctc tacaagaagc cgaaccagaa cctatttccc atgctgtctc actcgccccc 600
gccccctcca gccacctccc tgccatcgtc ctttctcttt tggccacctg ctcctctcga 660
gcccgggaat tcgtttaaac ctagagcggc cgctggccgc aataaaatat ctttattttc 720
attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtga ggatctaaat 760

Claims (5)

1.一种miR-21-5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、猪卵巢颗粒细胞培养
(1)采样：提取猪卵巢的组织样本，用PBS缓冲液消毒灭菌处理，之后运回试验室进行试验研究；
(2)清洗样品：首先采用75％酒精进行消毒清洗卵巢组织，同时将部分的卵巢放于固定液中，便于切片制作；
(3)收取卵泡液：用10ml的针管吸取卵泡液，放入DMEM高糖培养液中；
(4)离心：将上述(3)中的混合液放置于10ml离心管中，放入离心机中，转速：1000r/min，时间：10min，离心后弃去上清液；
(5)接种：采用DMEM完全培养基，培养基成分为：85％DMEM高糖培养液+14％胎牛血清+1％双抗，重悬细胞，CO2培养箱中培养；
(6)去除杂质：培养24h后，用PBS缓冲液清洗杂质，细胞换液，继续培养；
步骤2、化学合成miRNA模拟物和siRNA
根据miRBase和GenBank数据库提供的猪miR-21-5p和Smad7的序列信息，体外化学合成miRNA模拟物、抑制剂和siRNA；合成的RNA小片段由苏州吉玛基因股份有限公司设计合成；合成序列如SEQ：ID：NO：1-SEQ：ID：NO：8所示；
步骤3、pGCs的转染
(1)将待接种pGCs放在6孔板上，培养24h，更换无双抗培养液，培养6h；
(2)将10μL miR-21-5p mimics、miR-21-5p mimics-NC、miR-21-5p inhibitor、miR-21-5p inhibitor-NC和Smad7-siRNA-NC/288/536/1055分别溶于300μL opti-mem无血清培养基中，混匀，室温静置10min；
(3)将10μL lipo3000溶于300μL opti-mem无血清培养基中，混匀，室温放置5min；
(4)将(2)与(3)的试管溶液混合并静置30min；
(5)6孔板的溶液用opti-mem无血清培养液更换，然后把混合溶液加入6孔板中，培养6h，用DMEM高糖培养基继续培养；
步骤4、qRT-PCR检测
(1)RNA提取
(2)反转录
根据TaKaRa反转录试剂盒说明书，构建反转录体系；
(4)设计引物
引物设计由苏州吉玛基因股份有限公司负责合成；合成的引物序列如SEQ：ID：NO：9-SEQ：ID：NO：10所示；
(4)确定最适Tm值
根据设计引物的退火温度，设置退火温度范围，反应条件如下：
取12μL反应产物，凝胶电泳30min，寻找条带中最清晰，则其的温度就是退火温度即最适Tm值；
(5)qRT-PCR
根据说明书构建反应体系；反应条件设置为：变性条件下95℃ 60sec，延伸条件下95℃10sec，最适Tm值60sec，总共进行30次；以GAPDH作为内参，每个样品设置3个重复；
(6)结果处理
采用法计算相对表达量，进行3次重复试验，使用SPSS 21.0对数据结果进行研究分析，并进行显著性检验；
步骤5、细胞凋亡检测
参照细胞凋亡检测试剂盒的操作说明书，具体操作步骤如下：pGCs培养和转染参照步骤1和步骤3；
(1)GCs接种6孔板，将mimics NC、miR-21-5p mimics、inhibitor NC、miR-21-5pinhibitor、Smad7-siRNA-NC和Smad7-siRNA-1055分别转染到GCs中，DMEM高糖培养基培养24h；
(2)吸取细胞液用缓冲液清洗一次，然后加入胰酶进行消化，再加入DMEM高糖培养基，吹打混匀，放入离心机进行离心，转速：1200r/min，时间：8min；
(3)弃掉上清，用1ml PBS缓冲液重悬细胞并计数，数量不少于1×105，放入离心机进行离心，转速：1200r/min，时间：8min，然后收集细胞；
(4)加入500μL的1×Binding buffer洗涤细胞一次，然后离心，转速：1200r/min，时间：8min，弃去上清液，再加入500μL 1×Binding buffer重悬细胞；
(5)加入10μL的Annexin V-FITC，吹打混匀，室温静置20min；
(6)加入15μL的PI染液，混匀，在冰盒中静置10min；
(7)用流式细胞仪进行检测；
(8)试验重复3次，对3次试验的细胞凋亡率，细胞凋亡率＝早期细胞凋亡率+晚期细胞凋亡率，用SPSS 22.0分析显著性差异；
步骤6、细胞周期检测
参照细胞周期检测试剂盒的操作说明书，具体操作步骤如下：pGCs培养和转染参照步骤1和步骤3；
(1)细胞消化后用PBS洗涤一次，离心1200r/min，8min，去上清，加入1mL的75％乙醇固定于-20℃；
(2)取固定好的细胞进行离心，转速：1200r/min，时间：8min，用PBS洗涤一次，1200r/min，8min；
(3)加入100μL的RNAase重悬细胞，37℃，30min；
(4)加入400μL的PI染液，置4℃，30min，上机检测；
(5)试验重复3次，对3次试验的细胞周期；细胞增殖指数(PI)＝(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100％；用SPSS 22.0分析显著性差异；
步骤7、细胞增殖检测
参照MTT检测试剂盒的操作说明书，具体操作步骤如下：pGCs培养和转染参照步骤1和步骤3；
(1)将接种细胞放在96孔板，每孔添加150μL的opti-mem无血清培养液；
(2)设置空白组和调零组，每间隔12h进行转染一次；
(3)每孔添加20μL的MTT溶液，混匀，37℃的CO2箱中培养6h；
(4)弃去孔内溶液，在每孔中添加200μL的DMSO溶液，摇晃10min，使结晶充分溶解；
(5)使用多功能酶标仪进行酶联免疫检测分析；
(6)试验重复3次，对3次试验的细胞增殖率用SPSS 22.0分析显著性差异；
步骤8、雌二醇和孕酮含量检测
pGCs转染后收取细胞培养液中的上清部分，在-20℃冰箱里储存，用于检测pGCs中E2和P的含量；采用武汉基因美公司生产的ELISA检测试剂盒，检测E2和P的浓度，具体操作步骤参照试剂盒说明书进行；
步骤9、构建靶基因双荧光素酶报告载体
首先采用生物信息学方法，依靠miR-21-5p 5'端的第2-8位碱基与目的基因的3'UTR区序列之间碱基互补配对的原则，运用RNAhybrid 2.1.2软件，对miR-21-5p和目的基因的结合位点进行预测；
利用全基因合成的方法合成Smad7基因3'UTR的野生序列和包含3'UTR突变位点的序列；同时，在这两个序列的5'端和3'端分别加装酶切位点酶切位点sgfI：GCGATCGC和XhoI：CTCGAG，二者的序列如SEQ：ID：NO：11-SEQ：ID：NO：12所示；
随后，把合成的两个序列克隆到pmiR-RB-REPORTTM载体中；经过广州市锐博生物科技有限公司的测序后，确定获得了正确的重组载体；
步骤10、双荧光素酶报告系统检测
双荧光素酶报告基因活性检测参照广州市锐博生物科技有限公司的Dual-LuciferaseReporter Assay System试剂盒，具体操作步骤如下：
293T细胞培养
(1)DMEM完全培养基配制：85％DMEM高糖培养液+14％胎牛血清+1％双抗；
(2)293T细胞复苏：从液氮罐中取出装有293T细胞的冻存管，快速放置于的37℃的恒温水浴锅中，使冻存管内的293T细胞融化之后，送到细胞间离心，设置转速1200r/min，时间8min，弃掉上清液，并加入DMEM完全培养基，混匀后用移液枪吸取适量293T细胞移入培养皿中，吹打混匀后，放入37℃的恒温箱中；
(3)293T细胞传代：待培养皿中的293T细胞的密度达到85％，弃去培养液，并使用PBS缓冲溶液清洗1次，之后加入1ml的胰酶，放入37℃的恒温箱中消2min，再加入3ml的DMEM完全培养基终止消化，用移液枪吸取混合液至10ml离心管中，1200r/min离心8min，弃去上清液，再加入DMEM完全培养基，重新悬浮293T细胞，转移至24孔板内，最后放入37℃的CO2培养箱中继续培养；
293T细胞转染
按照3000转染步骤进行：
(1)转染前换成不含有双抗的培养液进行培养；
(2)每个孔转染方式如下：
A将1μg的质粒和100pmol的miR-21-5p mimics、mimics-NC溶于60μL的opti-mem无血清培养液中，静置8min；
B将3μL的转染试剂溶于60μL的opti-mem无血清培养液中，静置8min；
C将A液和B液混合，静置15min；
(3)静置后，倒去细胞培养液，并加入500μL的opti-mem无血清培养液；
(4)加入每孔中，放入37℃的CO2培养箱中培养5h，最后将opti-mem无血清培养液换成DMEM完全培养基再次进行培养24h；
荧光素酶检测
(1)裂解细胞：细胞培养24h之后，弃去培养液，用PBS缓冲溶液清洗2次，每次10min，再加入细胞裂解液150μL，摇晃振荡反应20min，用移液枪吹打，充分裂解细胞，然后置于离心机中，转速：1200r/min，时间：8min，吸取上清液备用；
(2)将荧光素酶试剂和缓冲液溶解到试管中，并达到室温，萤光素酶检测底物置于冰盒上备用；
(3)每个样品需150μL，取适量海肾萤光素酶检测缓冲液，按照l：150加入海肾萤光素酶检测底物配制成海肾萤光素酶检测工作液；
(4)开启多功能酶标仪，测定间隔设为3sec，测定时间设为12sec；
(5)每个样品取100μL进行检测；
(6)加入150μL海肾萤光素酶检测工作液，用移液枪吹打均匀，之后测定相对荧光值；
(7)用萤火虫萤光素酶为内参，不同样品间的荧光活性＝海肾萤光素酶的相对荧光值÷萤火虫萤光素酶的相对荧光值；
步骤11、Western blot
(1)蛋白提取
(2)Western blot
(3)结果处理
图片使用Photoshop CS6软件进行裁剪，灰度用Quantity One v4.6.6软件进行分析，数据用SPSS 22.0分析显著性差异。
2.根据权利要求1所述的miR-21-5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法，其特征在于，步骤4中，RNA提取具体为：
A用PBS缓冲溶液清洗2次，每次10min，每孔pGCs加入1mL TRLzol试剂，用移液枪吹打混匀，转移溶液至2mL离心管，室温静置10min；
B向离心管内加入氯仿，摇晃振荡，室温静置10min，然后放入离心机进行离心，转速：1200r/min，时间：8min；
C吸取400μL的上清液移入新的离心管中，加入400μL的异丙醇，摇晃振荡，室温静置15min，然后放入离心机进行离心，转速：1200r/min，时间：8min；
D弃去上清液，加入1mL75％乙醇，摇晃均匀，然后放入离心机进行离心，转速：1200r/min，时间：8min；
E弃去上清液，等乙醇挥发后加入100μL Nuclease-free水，用移液枪吹打混匀，测定RNA浓度与纯度，-80℃冰箱保存。
3.根据权利要求1所述的miR-21-5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法，其特征在于，步骤11中，蛋白提取具体为：
A首先将RIPA裂解液与PMSF进行混匀，并室温静置10min；
B再用PBS缓冲溶液清洗细胞2次，每次10min；
C然后将A中的溶液加入到经过B处理的细胞中；
D将其放置在冰板上，静置30min；
E然后将混合液放入离心机进行离心，转速：1200r/min，时间：8min；
F取上清溶液，-80℃冰箱保存。
4.根据权利要求1所述的miR-21-5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法，其特征在于，步骤11中，Western blot具体为：
A变性：用缓冲液清洗蛋白，并使用沸水进行处理5min；
B制胶：对经过A处理之后的试样进行制胶；
C上样：制胶后倒入缓冲液中，每孔20μL蛋白样品，Marker的上样量为5μL；
D电泳：先80V电泳0.5h，换120V电泳至Marker完全分开，停止电泳；
E切胶：切取目标蛋白周围的胶；
F转膜：使用转膜夹转移到槽内，并采用TBST缓冲液清洗2次，每次10min；
G封闭：封闭液对其进行封闭；并使用TBST缓冲液清洗2次，每次10min；
H添加一抗：加入一抗溶液，室温孵育，并使用TBST缓冲液清洗2次，每次10min；
I添加二抗：加入二抗溶液，室温孵育，并使用缓冲液进行清洗处理；
J照胶：将A液和B液均匀滴在PVDF膜；并对其显影拍照。
5.一种权利要求1所述miR-21-5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法在提高母猪产仔率过程中的应用。
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