CN110846338B - 一种利用激活rna构建高效表达载体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用激活RNA构建高效表达载体的方法，所述方法利用带近端增强子的OCT4基因启动子为靶启动子，通过体外重组技术，在所述靶启动子之前插入MAR序列，在所述靶启动子下游插入一个表达靶向所述靶启动子的特异小激活RNA（SaRNA）的shRNA表达框，构建第二表达载体pOCT4‑M‑SaRNA，第二表达载体在转染细胞32天以后，由OCT4启动子启动的EGFP表达量仍能持续稳定地高效表达，表达量显著高于商业载体pEGFP‑C1；本发明所述方法构建的表达载体可以应用于抗体及蛋白药物的工业化生产领域或基因治疗，提高生产效率，降低生产成本，具有良好的社会效益和经济效益。

Description

一种利用激活RNA构建高效表达载体的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及用于重组抗体或蛋白药物生产等的表达载体及其构建方法，尤其涉及一种基于MAR序列和激活RNA相互作用构建高效表达载体的方法。

背景技术

重组抗体和蛋白药物是近年来临床上常使用的特效药，但由于其昂贵的价格，限制了其广泛的应用。在重组抗体及蛋白药物的成本构成中，生产效率低是重要因素。而在重组抗体及蛋白药物繁杂的生产环节中，载体是否能高效稳定地表达是影响生产效率的关键技术之一。影响高效表达的因素很多，主要因素仍然是转基因表达中的位置效应和沉默效应。沉默效应往往导致转到动物细胞表达的载体很难实现持续高效生产，以致重组抗体及蛋白药物生产效率难以提高；位置效应是由于重组基因插入到异染色体附近而导致的转录异常，位置效应常导致沉默效应，而转基因沉默效应与染色质重塑、表观遗传修饰等因素相关。

克服转基因沉默效应有很多方法，但效果不尽相同，在工业上也未形成有效标准。研究指出，染色质结构调控元件在克服位置效应方面效果显著。启动子受特定的调控元件调控，具有克服位置效应的能力，其中核基质序列（Matrix attachment regions ，MARs)是最早认为能将基因组在拓朴结构上分隔为不同结构域的DNA元件（Phi-Van L, 1996）。真核染色质组织成染色质结构域需要由核内蛋白质组成的核基质（MAR，又称核骨架）来介导，由核基质分支的蛋白纤维提供DNA环（loop）形成支撑结构。这些独立的DNA环附着在核基质或核骨架上，能将转基因与周围的基因组的负面作用隔绝开（绝缘功能），因此能克服转基因位置效应(Seibler,et al,2005； McKnight, et al, 1992)，能增强基因转录效率(Bode,et al, 2000)；核基质序列还能通过阻碍DNA甲基化支持组蛋白乙酰化维持长期的高转录水平(Dang, et al, 2000；Kurre，et al,2003)，克服转基因沉默效应。

另一方面，RNA也是调控基因表达的有效手段。RNA调控主要包括RNA干扰(RNAi)和RNA激活（RNAa）。RNA干扰是指siRNA(双链小RNA)能够通过作用于基因的mRNA或3`UTR区特异性地沉默靶基因的表达；RNA激活则是针对基因的启动子进行靶向作用，进而通过影响转录调控机构或表观遗传调控机制增加基因表达。这种针对基因启动子起激活作用的小RNA称为小激活RNA(saRNA)。

在现有的技术方案中，小激活RNA主要作为一种潜在的分子药物，用于激活体内特殊基因的表达上调进而改变体内生理或体外分子效应。但是激活RNA用于提高重组蛋白或药物表达载体表达能力的解决方案未见报道。更为重要的是，虽然激活RNA与MAR都能单独作用于优化重组蛋白表达载体中外源基因表达框的启动子启动效率，但是二者共同作用于某一类型的启动子以提高启动子启动效率进而提高表达载体表达能力的技术或应用也未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对目前存在的重组抗体及蛋白药物表达载体表达效率低的问题，提供一种利用激活RNA构建高效表达载体的方法，通过MAR序列与激活RNA作用于特定的启动子构建持续稳定的高效表达载体，满足工业上的生产和推广使用，降低重组抗体及蛋白药物的成本。

为了解决以上所述技术问题，本发明所述方法采用的技术方案为：利用激活RNA构建高效表达载体的方法，包括以下步骤：

（1）选择带近端增强子的人OCT4基因启动子为靶启动子，所述靶启动子的基因序列从转录起始位点到增强子之间的序列低于1.5kb；用所述靶启动子替换pEGFP-C1载体上的CMV启动子，构建中间载体Ⅰ即pOCT4载体；

（2）在所述中间载体Ⅰ的外源基因表达框下游MluI酶切位点插入针对所述靶启动子的表达激活RNA基因的shRNA基因表达框，构建第一表达载体pOCT4-SaRNA；针对所述靶启动子的表达激活RNA基因的shRNA基因表达框的序列见表一；所述第一表达载体经验证能使EGFP基因表达量持续稳定高效表达。

进一步，本发明所述方法，在所述中间载体Ⅰ的外源基因表达框之前Ase I酶切位点插入MAR序列片段，构建中间载体Ⅱ；在所述中间载体Ⅱ的外源基因表达框下游MluI酶切位点插入针对所述靶启动子的表达激活RNA基因的shRNA基因表达框，构建第二表达载体即pOCT4-M-SaRNA；所述第二表达载体经验证能使EGFP基因表达量持续稳定高效表达。

进一步，本发明所述方法，构建中间载体Ⅰ步骤中，用带AgeI和AseI双酶切位点引物扩增所述靶启动子序列，所述引物为：

OCT4＃正向引物：TAGTTATTAAT(Ase I)AGACCCAGGAGACTCAAAG

OCT4＃反向引物：TGGCGACCGGT(Age I)AGCGCTAGTGATTACCCAAGA。

作为优选，本发明所述MAR序列为HUBB-LCR序列。

本发明选择带近端增强子的人源OCT4基因启动子为靶启动子，在该靶启动子之前插入MAR序列（如HUBB-LCR序列），同时在MAR序列作用的靶启动子（OCT4）及其表达框之后，插入一个针对OCT4基因启动子的表达激活RNA基因的shRNA基因表达框（特异小激活RNA表达框）,该表达框表达的shRNA经过体内酶的剪切后，能产生针对靶启动子的激活小RNA。如此构建的表达载体转染到293细胞或CHO细胞，能在培养32天后使EGFP基因表达量高于MAR单独调控或只用激活小RNA激活时的EGFP表达量。

本发明所述方法构建的高效表达载体，第二表达载体持续稳定高效表达效果最为显著，其主要作用机理为：MAR与带近端增强子的启动子相互作用时，MAR调节的带近端增强子的启动子通过染色质重塑机制，改变启动子上的组蛋白修饰，使其更有利于RNA激活，从而激活高效表达（第二表达载体的表达量高于单独用MAR或单独用RNA激活达到的效果）；也可以解释为，将MAR和RNA共同作用于同一带近端增强子的启动子时，由于两者都具有改变靶向区域表观修饰和激活基因表达的效果，因此二者共同作用于同一带近端增强子的启动子能获得更高效率的表达。推测其原理是二者从不同机制上对靶启动子的表观修饰进行干预，从而在克服带近端增强子的启动子上的表观沉默效应功能上出现叠加，最终获得高于二者单独作用时的载体及商业载体的表达（在32天以上仍能持续稳定表达），最大限度满足工业上的生产应用。

本发明的有益效果：

1、本发明对人OCT4启动子的全长及大小不同的序列进行了筛选，获得带近端增强子特点的人OCT4基因启动子，即所述靶启动子。

2、本发明所述方法构建的第一表达载体和第二表达载体转染哺乳动物细胞后,通过表达效率的检测试验，表达外源EGFP基因的表达量均有较好的表现，而以第二表达载体pOCT4-M-SaRNA最为显著，其表达外源EGFP基因的表达量显著高于商业载体pEGFP-C1的对EGFP基因的表达量，同时高于MAR序列单独作用于OCT4启动子时或SaRNA单独作用于OCT4启动子时的表达量，并在连续培养32天以上仍能稳定表达，即能持续稳定高效表达，满足了工业生产的需求，降低药物价格，方便推广应用，具有良好的社会效益和经济效益。

附图说明

图1为中间载体ⅠpOCT4的结构示意图；

图2为中间载体Ⅱ pOCT4-LCR的结构示意图；

图3为第一表达载体pOCT4-SaRNA的结构示意图；

图4为第二表达载体pOCT4-M-SaRNA的结构示意图；

图5A为转染14天第二表达载体pOCT4-M-SaRNA的哺乳动物细胞荧光照片；

图5B为转染32天第二表达载体pOCT4-M-SaRNA的哺乳动物细胞荧光照片；

图6为重组的载体pOCT4-LCR、pOCT4-SaRNA和pOCT4-M-SaRNA与商业载体pEGFP-C1的荧光强度测试结果对比图；

图7为ELISA分析测试重组的载体pOCT4、pOCT4-LCR、pOCT4-SaRNA和pOCT4-M-SaRNA与商业载体pEGFP-C1中EGFP蛋白表达量的对比图（注：*为构建的载体与pEGFP-C1相比较，表达量差异显著，p<0.05；** 为第二表达载体与其他所有载体相比，表达量差异显著，p<0.01）；

图8为用qRT-PCR定量法检测重组载体pOCT4、pOCT4-LCR、pOCT4-SaRNA和pOCT4-M-SaRNA与商业载体pEGFP-C1时EGFP基因表达量的对比图（注：*为构建的载体与pEGFP-C1相比较，表达量差异显著，p<0.05）；

图9为实施例中所述HUBB-LCR序列；

图10为所述带近端增强子的人OCT4基因启动子序列，该序列从转录起始位点到增强子之间的序列低于1.5kb。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明所述利用激活RNA构建高效表达载体的方法包括以下步骤：

（1）选择带近端增强子的人OCT4基因启动子为靶启动子，所述靶启动子的基因序列从转录起始位点到增强子之间的序列低于1.5kb；用所述靶启动子替换pEGFP-C1载体上的CMV启动子，构建中间载体Ⅰ即pOCT4载体；

（2）在所述中间载体Ⅰ的外源基因表达框下游MluI酶切位点插入针对所述靶启动子的表达激活RNA基因的shRNA基因表达框，构建第一表达载体pOCT4-SaRNA；针对所述靶启动子的表达激活RNA基因的shRNA基因表达框的序列见表一；所述第一表达载体经验证能使EGFP基因表达量持续稳定高效表达。

进一步，本发明所述方法，在所述中间载体Ⅰ的外源基因表达框之前Ase I酶切位点插入MAR序列片段，构建中间载体Ⅱ；在所述中间载体Ⅱ的外源基因表达框下游MluI酶切位点插入针对所述靶启动子的表达激活RNA基因的shRNA基因表达框，构建第二表达载体即pOCT4-M-SaRNA；所述第二表达载体经验证能使EGFP基因表达量持续稳定高效表达。

进一步，本发明所述方法，构建中间载体Ⅰ步骤中，用带AgeI和AseI双酶切位点引物扩增所述靶启动子序列，所述引物为：

OCT4＃正向引物：TAGTTATTAAT(Ase I)AGACCCAGGAGACTCAAAG

OCT4＃反向引物：TGGCGACCGGT(Age I)AGCGCTAGTGATTACCCAAGA。

作为优选，本发明所述MAR序列为HUBB-LCR序列。

实施例：下面举例说明构建本发明所述高效表达载体的方法，本发明所述持续高效表达是指，第二表达载体pOCT4-M-SaRNA转入CHO细胞中，培养32天后，进行荧光强度分析、定量PCR分析和ELISA分析，将分析结果与商业载体pEGFP-C1相比，所述第二表达载体pOCT4-M-SaRNA表达外源EGFP蛋白的表达量显著高于商业载体pEGFP-C1的表达量，且在32天以上仍能持续稳定表达。

构建载体的方法步骤如下：

§1 用带近端增强子的人OCT4基因启动子替换pEGFP-C1载体上的CMV启动子，构建中间载体Ⅰ

§1.1筛选的OCT4基因启动子序列克隆

通过人OCT4基因启动子扩增，扩增引物为：

OCT4＃正向引物：TAGTTATTAAT(Ase I)AGACCCAGGAGACTCAAAG

OCT4＃反向引物：TGGCGACCGGT(Age I)AGCGCTAGTGATTACCCAAGA

利用高保真TAQ酶，50μL体系进行PCR扩增,扩增条件为：95℃ 5分钟；95℃ 30秒，49℃ 30秒，72℃ 45秒，重复25个循环；72℃ 5分钟，常温保存。扩增出来的序列即为带近端增强子的人OCT4基因启动子序列，该序列从转录起始位点到增强子之间的序列低于1.5kb，其DNA序列见图10。

pEGFP-C1载体是目前商业上常用的表达效果较好的载体，本发明所述方法将筛选出的带近端增强子的人OCT4基因启动子（即靶启动子）用于连接到载体，替换pEGFP-C1载体上的CMV启动子，构建中间载体Ⅰ。

§1.2将pEGFP-C1载体用AgeI和AseI双酶切去除,胶回收不含CMV的大片段。

§1.3将上述步骤§1.1中获得的OCT4基因启动子的PCR产物经凝胶回收后也同步用AgeI和AseI双酶切。

§1.4连接

连接体系（10μL）：含T4 DNA连接酶的连接混合液5μL，pEGFP-C1双酶切大片段0.5μL，双酶切OCT4启动子PCR产物4.5μL，反应条件：16℃ 连接1h(连接试剂盒来自大连美仑生物技术有限公司)。

§1.5转化

提前备好冰块，取感受态细胞（冰水混合状态）100μL加入到以上步骤§1.4连接体系中，冰浴30分钟；转42℃水浴90秒；转冰浴1-2分钟；加LB培养基，37℃水浴45分钟；离心机最大离心转速1秒，弃大部分上清液后，混匀后涂布于有IPTG和X-gal的培养基，37℃过夜培养。

§1.6 筛选、质粒提取、送生物公司检测

通过菌落PCR筛选出菌落在37℃用试管进行液体培（含卡那青霉素），再经三角瓶过夜扩大培养，利用质粒小量抽提试剂盒提取质粒DNA；经AseⅠ酶切鉴定后，电泳观察酶切结果。将阳性克隆质粒送生物公司进行测序，确认OCT4启动子替换正确，获得重组载体pOCT4（即中间载体I）。其结构示意图参见图1。

§2 在载体pOCT4的Ase I酶切位点插入MAR序列（本实施例以HUBB-LCR片段为例进行说明），构建中间载体Ⅱ

§2.1人工合成HUBB-LCR序列

HUBB-LCR片段来自Genebank（编号为NG_052895），HUBB-LCR序列参见图9。

§2.2 载体酶切 在载体pOCT4的AseⅠ位点进行单酶切

酶切载体纯化：

（1）向载体酶切体系离心管中加入50μL 膜结合液并混匀；

（2）移液至吸附柱中，吸附柱置于集液管中；

（3）离心机转速13,000转/分钟，舍弃集液管中的液体；

（4）加700μl 膜洗脱液，离心13,000转/分钟，弃集液管中液体；

（5）重复步骤(4)一次；

（6）弃集液管中液体，离心1分钟；

（7）将吸附柱移至1.5ml离心管中；

（8）加入50μl 无核酸酶的去离子水到吸附柱中，室温静置1min，离心1min；收集离心产物。

§2.3平端化：对酶切后的pOCT4载体进行平端化处理

将酶切过的pOCT4质粒（即pOCT4载体）进行平端化：

pOCT4质粒5μl，10×缓冲液 1μl,3μl无菌水于70℃保温5分钟，加入0.5μl T4DNA聚合酶,轻柔混合，37℃反应5min后，进行乙醇沉淀。

§2.4去磷酸化

对单酶切后的产物去磷酸化，去磷酸化能将5’端突出的磷酸基团消化掉，使质粒载体自身不能形成闭合的环状结构。

平端化后pOCT4载体9μg

碱性磷酸酶缓冲液 (10X) 15μl

细菌碱性磷酸酶 (1U/μl) 2μl

补充无核酸酶的去离子水至150μl，在65℃水浴锅中反应30分钟后，进行纯化；

（1）取与去磷酸化酶切产物等体积的膜结合液加入离心管中，混匀；

（2）用移液枪移至吸附柱内，室温静置3-5分钟，离心一分钟；

（3）取收集管中液体重新加至吸附柱中，重新离心1分钟,去废液；

（4）加700ul膜洗脱液,离心一分钟，去废液；

（5）加500ul膜洗脱液离心4分钟，去废液；

（6）再空柱离心一分钟后，将吸附柱移到新离心管中；

（7）加50ul无核酸酶的去离子水于柱中心膜上，室温静置3-5min，离心1min；取收集管中液体加到吸附柱中，再次离心，产物保存于4℃。

§2.5连接 用与前述载体pOCT4连接相同的方法，将HUBB-LCR序列与步骤§2.4去磷酸化后的切酶片段连接。

§2.6转化 与前述载体pOCT4转化的方法相同。

§2.7 筛选、质粒提取、送生物公司检测

用上述与中间载体Ⅰ（载体pOCT4）相同的方法，通过菌落PCR筛选，提取质粒DNA，经AseⅠ酶切鉴定后，电泳观察酶切结果，将阳性克隆质粒送生物公司进行测序，确认HUBB-LCR片段替换正确，即获得中间载体Ⅱ，命名为pOCT4-LCR，其结构示意图参见图2。

§3构建第一表达载体pOCT4-SaRNA

§3.1在构建所得的中间载体Ⅰ（pOCT4载体）的外源基因表达框下游MluI酶切位点插入针对所述靶启动子的表达激活RNA基因的shRNA基因表达框（即特异小激活RNA表达框），构建第一表达载体pOCT4-SaRNA；所述特异小激活RNA表达框的序列见表一。

§3.2筛选、质粒提取、送生物公司检测

通过菌落PCR筛选，提取质粒DNA，经AseⅠ酶切鉴定后，电泳观察酶切结果，将阳性克隆质粒送生物公司进行测序，确认特异小激活RNA表达框连接正确，即获得第一表达载体，命名为pOCT4-SaRNA载体；其结构示意图参见图3。

§4构建第二表达载体pOCT4-M-SaRNA

§4.1 在以上构建所得的中间载体Ⅱ的外源基因表达框下游MluI酶切位点插入针对所述靶启动子的表达激活RNA基因的shRNA基因表达框（即特异小激活RNA表达框），获得第二表达载体即pOCT4-M-SaRNA，所述特异小激活RNA表达框序列与构建第一表达载体的相同，见表一。

§4.2筛选、质粒提取、送生物公司检测

通过菌落PCR筛选，提取质粒DNA，经AseⅠ酶切鉴定后，电泳观察酶切结果，将阳性克隆质粒送生物公司进行测序，确认特异小激活RNA表达框连接正确，即获得第二表达载体pOCT4-M-SaRNA，其结构示意图参见图4。

§5表达载体高效表达的验证

将以上构建所得的载体pOCT4、pOCT4-LCR、pOCT4-SaRNA和pOCT4-M-SaRNA分别进行荧光强度分析、定量PCR分析和ELISA分析，进行验证，具体方法为：

§5.1大提质粒（用Promega公司试剂盒）

（1）取50ml的离心管做好标记，将含有上述表达载体质粒的培养菌液倒入其中多次离心（4000g/min,10min），弃上清，留沉淀；

（2）加入10ml solutionⅠ震荡∕吹打混匀；

（3）加入10ml solutionⅡ在2-3min内轻轻的上下翻转8-10次；

（4）再加入5ml 预冷的N3 buffer，轻轻翻转10次，得到裂解液；

（5）准备注射器，拔出活塞，在出口处装上帽子后，将裂解液倒入枪管中；

（6）取下帽子，下面放新的离心管，轻轻插入活塞，通过注射收集液体；

（7）测量液体体积，加入液体体积1/10体积的ETR solution，翻转10次；

（8）将其插入冰中冰浴10min，在冰浴过程中，翻转混匀几次，液体由浑浊变得澄清；

（9）放入42℃水浴锅中水浴5min，液体由澄清变得浑浊；

（10）4000g离心5min，管底会有一层蓝色物质出现，将上层清液转入新的离心管中，加入上层清液体积的1/2体积的无水乙醇，轻轻翻转6-7次，室温静置1-2min，得到清液；

（11）柱平衡：取出HiBind DNA Maxi columns（装有吸附柱的绿色离心管）加入3mlGPS Buffer，室温静置4min，4000g离心3min，倒废液；

（12）将清液转入HiBind柱中，4000g离心3min，倒废液；

（13）重复上一步骤，直至清液全部过滤；

（14）向柱中加入10ml HBC Buffer，4000g离心3min，倒废液；

（15）向柱中加入15ml DNA Wash Buffer，4000g离心3min，倒废液；

（16）向柱中加入10ml DNA Wash Buffer，4000g离心3min，倒废液；

（17）空柱4000g离心10min，将吸附柱放入新的离心管中，加入3ml Endo-freeElution Buffer(无内毒素洗脱液)，室温静置5min；

（18）4000g离心5min，将液体再次移入柱中，静置5min，4000g离心5min；

（19）将收集到的DNA分装到1.5ml离心管中，做好标记。

§5.2 转染

细胞准备：电转前1-2天，将细胞转至T75细胞培养瓶，至转化前细胞汇合度约50-70%，此时细胞数约为2×10⁷，而每次电转约需10⁶个；2.5-10 ml PBS缓冲液缓慢冲洗细胞，吸出PBS，用0.4ml 0.25%Trypsin-EDTA胰酶消化液消化细胞，加入2.6ml含血清的培养基，中和胰酶；离心收集细胞，用1ml HEPES Buffer重悬液重悬细胞，使之密度为2.5×10⁶个/ml。

§5.3电击转化

（1）设置电转程序280V 20ms；

（2）将质粒加入电击杯（20ug）；

（3）向电击杯中加入1×10⁶个细胞，约400ul,颠倒混匀；

（4）将电击杯放入电击槽，脉冲电击一次，电击后电击杯置冰上5min；

（5）将电击后的细胞吸到含0.8ml培养基的12孔板中；

（6）轻轻晃动12孔板，混匀细胞，放入CO2恒温培养箱中培养。

§5.4 G418筛选

（1）转染后培养：转染后培养24小时或者更长时间，待细胞密度增至50%-70%汇合时；

（2）加G418：去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养；

（3）换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3-5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选10-14天后，可见有抗性的克隆出现；

（4）单克隆鉴定：利用有限稀释法获得的单克隆细胞，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。

§5.5定量检测标记蛋白EGFP表达量

在重组载体pOCT4、pOCT4-LCR、pOCT4-SaRNA和pOCT4-M-SaRNA中，其表达框上增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为标记蛋白，通过分析标记蛋白或基因的表达量来观察载体表达的效率。

§5.6荧光强度分析

利用荧光显微镜，统一拍照参数为10倍焦距、绿光、蓝光和白光强度均为70%，每孔从不同角度随机拍摄4张照片，并用ImageJ软件进行荧光强度分析。对比分析结果见图6。

§5.7 qRT-PCR分析

（1）提取细胞总RNA

用Trizol试剂进行RNA提取并用Promega公司逆转录试剂盒进行逆转录为cDNA。

（2）定量PCR

实验所需要的PCR反应体系为20 ul，内参用GAPDH,引物均分别用EGFP和GAPDH基因的通用检测引物。将配制好的样品和内参在罗式定量PCR仪上各做3个重复。使用2^－△△CT方法分析基因表达相对变化。

对比分析结果见图8。

§5.8 ELISA（酶联免疫）

（1）包被:在96孔聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml用0.05M PH7.6的碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml的抗体液（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔），4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟（简称洗涤，下同）；

(2)加样:加0.1ml稀释的待检样品于已包被的反应孔中，做好标记，置于37℃孵育1小时，然后洗涤；

(3)加酶标抗体:于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤；

(4)加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟；

(5)终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml；

(6)结果判定:在酶标仪将波长调为450nm，以空白对照孔调零后测各孔OD值。

对比分析结果见图7。

§5.9表达载体的表达效率评价

（1）OCT4基因启动子描述

OCT4基因启动子片段截取自POU5F1（ENSG00000204531）基因的5`UTR区域约1200bp长度，包含近端增强子、近端启动子区域和转录起始位点。构建入表达载体中的pOCT4质粒即是用带近端增强子的人源OCT4基因启动子替换商业载体pEGFP-C1中表达外源基因的CMV启动子。所得pOCT4质粒（中间载体Ⅰ）在转染CHO细胞32天后经qRT-PCR、ELISA表达量综合分析表明,pOCT4质粒在CHO细胞中启动下游EGFP蛋白的表达量与商业载体pEGFP-C1相当。

（2）带HUBB-LCR的质粒pOCT4-LCR（中间载体Ⅱ）

用qRT-PCR,ELISA分析结果表明，用HUBB-LCR序列调控后的靶启动子即pOCT4-LCR质粒，经转化CHO细胞后EGFP蛋白的表达量与pOCT4质粒没有显著差异（参见附图7-8），表明HUBB-LCR单独作用于OCT4启动子时，对启动子的激活作用不显著。

（3）含针对所述靶启动子的特异小激活RNA表达框的质粒pOCT4-SaRNA（第一表达载体）

用qRT-PCR、ELISA分析测试分析结果表明，带针对所述靶启动子的特异小激活RNA表达框的第一表达载体pOCT4-SaRNA的EGFP表达量显著高于质粒pOCT4，表明激活RNA对OCT4启动子的激活作用在pOCT4-SARNA质粒中得以发挥，构建入质粒中的针对所述靶启动子的特异小激活RNA表达框功能正常且发挥激活效应（参见附图7-8）。

（4）激活RNA和MAR序列（此处为HUBB-LCR）相互作用调控OCT4基因启动子（靶启动子）高效表达

用qRT-PCR、ELISA和荧光强度分析测试结果表明，第二表达载体pOCT4-M-SaRNA表达量显著高于第一表达载体pOCT4-SaRNA或中间载体Ⅱ（pOCT4-LCR）即激活RNA或MAR序列任何一个单独作用时的表达量（参见附图6-7），并在32天后仍然维持高表达，表达量在32天后达到商业pEGFP-C1表达量的2.4倍（见附图7），表明小激活RNA与MAR序列共同作用于OCT4启动子（靶启动子），MAR序列促进了激活RNA激活OCT4启动子高效表达。

附图5A、5B分别为第二表达载体pOCT4-M-SaRNA转染哺乳动物14天和32天拍摄的pOCT4-M-SaRNA表达载体的哺乳动物细胞荧光照片，用imageJ软件分析，图片显示转染32天前后，两张照片中荧光强度最强的细胞强度基本一致，说明表达载体已稳定整合到基因组且插入的针对所述靶启动子的特异小激活RNA表达框可持续表达saRNA并发挥激活作用。

以上仅为本发明的部分实施方式，所述MAR序列并不限于HuBB-LCR，所述靶启动子与HuBB-LCR以外的MAR序列相互作用后，进一步用RNA激活均能获得高效表达载体。实施例并非用于限定本发明，本领域技术人员可知，根据本说明书内容可有多种实施方式均能实现本发明所述技术方案，根据本发明所述技术方案作出的简单替换或同质变化，均应落入本发明的保护范围。

<120> 一种利用激活RNA构建高效表达载体的方法

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<141> 2019-11-22

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 315

<212> DNA

<213> shRNA基因表达框序列(shRNA基因表达框序列)

<400> 1

gcaggaagag gctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac aaggctgtta 60

gagagataat tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa aatacgtgac 120

gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt aaaatggact 180

atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat atcttgtgga 240

aaggacgaca tacccgcctt taatcatgac actttttcaa gagaaaagtg tcatgattaa 300

aggcgttttt gggtg 315

<210> 2

<211> 770

<212> DNA

<213> HUBB-LCR序列(HUBB-LCR序列)

<400> 2

ttagtaagac atcaccttgc attttgaaaa tgccatagac tttcaaaatt atttcataca 60

tcggtctttc tttatttcaa gagtccagaa atggcaacat tacctttgat tcaatgtaat 120

ggaaagagct ctttcaagag acagagaaaa gaataattta atttctttcc ccacacctcc 180

ttccctgtct cttaccctat cttccttcct tctaccctcc ccatttctct ctctcatttc 240

tcagaagtat attttgaaag gattcatagc agacagctaa ggctggtttt ttctaagtga 300

agaagtgata ttgagaaggt agggttgcat gagccctttc agttttttag tttatataca 360

tctgtattgt tagaatgttt tataatataa ataaaattat ttctcagtta tatactagct 420

atgtaacctg tggatatttc cttaagtatt acaagctata cttaactcac ttggaaaact 480

caaataaata cctgcttcat agttattaat aaggattaag tgagataatg ccctataaga 540

ttcctattaa taacagataa atacatacac acacacacac attgaaagga ttcttacttt 600

gtgctaggaa ctataataag ttcattgatg cattatatca ttaagttcta atttcaacac 660

tagaaggcag gtattatcta aatttcatac tggatacctc caaactcata aagataatta 720

aattgccttt tgtcatatat ttattcaaaa gggtaactca aactatggct 770

<210> 3

<211> 2001

<212> DNA

<213> 人OCT4基因启动子序列(人OCT4基因启动子序列)

<400> 3

atacaccacc tacagtacaa attataatct aaaaacaaga gggtggtgtt gagtggggaa 60

attggggaag gtgttttagg agccactagg aaaatgggca gcagggactc tctggactgg 120

cttgggaaga gcgcttttgg ggaacctgga ggatggcaag ctgagaaaca ctggtgtgga 180

gattccagcc aaatcccagg cctgcccctc cccctcctct gagaggccgt cttcttggca 240

gacagcagag agatgcatga caaaggtgcc gtgatggttc tgtcctgggg attgagatgg 300

ctggggaggg gcctcctcct gttccgaagc atgttcctcc cacccccacc aggccccata 360

atctacctgc cttttgggca gttaaaggcc gagaagtgaa cacagctgca accccactgc 420

cttgtagacc ttccggcaga cctgtggcag gtattgaaat gcacgcatac aattaggctc 480

aaaaagtcta cacagacagg agatgggcac acgaacagag gcaacataag agtgggggaa 540

aagtctcaaa agactcacgg atgccaccaa gatgaagaca gctggccacg ggacacccat 600

ccccttagaa ggcagataga gccactgacc ccagcagaca agcccaggca gggctgagcc 660

tggagcctgc aatgagaagc cttacttaag tcgacagagg tcagcgtgcc cagtccagac 720

ctggccttct ggccttcgaa gctgtgggga gccctggccc agagccccct ctggagcccc 780

cagacttacc ccaggccctc cactgagatc aagttttggg agcagacaga caaacatcat 840

ccctcacaga caggcattcc gttggctatt ctcttgcaaa cagaatcaag cactagacca 900

gcagcatgag cctcaggata ctcaggccag gcccagaaaa acagaccctg aaggggagct 960

tagggcagcc ttcctgcacg cctccacaaa tcactctcca cctcctctgc gtctttctgc 1020

cagccagccc cactaaacaa agcacatccc tcaatctgcc aggctcgggg agggacgcac 1080

gatgaagctg gacgcctgag tcccccagag gaaggaggaa ctagatacct aggtccctgt 1140

ggggggccct tggtgcccgt ctgaggctca gtctttgagg ggattgcaga ggggggttgc 1200

tggagctcct tttagcgtct ctgaagggga ttctgtgtga ggggattggg actggggggt 1260

tggggagcag gaagcagtcc ccaggggagc catccaggcc cattcaaggg ttgagcactt 1320

gtttagggtt agagctgccc cctctgggga ccgggattgt ccagccaagg ccattgtcct 1380

gcccccttcc cccagtccct cccaggcttc tttgaacctg aagtcagata ttttttctcc 1440

acacccccca ccccctggtt ttccccaccc agggcctagg gctggaggcc tgggccaggg 1500

aggtggggga gggagaacgg ggcctaccgt ggtattagat gtctgagttt tggttgagag 1560

gggagcaagg aacctgatgt gcaggttcca tagtggaggg ggcccaaagc gggtgtctta 1620

tcactctgtt tcagcaaagg ttgggaaact gaggcccagt cagtccaaag tctggtccct 1680

tgaaggggaa gtagggacca accccttagt ctgttagatg aggagagtct ggagtctgat 1740

tctggaagac ggaggggtgg ggggatgggg gggtgggggg atatagcacg gaggccttgt 1800

ctggcagtct actcttgaag atggggtgaa atttggcagg ctgggcagat ggtgccaggc 1860

acccaggctg cggggtggct ggatttggcc agtatcggga tgggaatgcc taggattctg 1920

gatggatcgg gggaaggcat aagggagcag ctggccattg tgcttatggc tgttgatgca 1980

ttgagggata gcgccacaca c 2001

Claims (2)

1.一种利用激活RNA构建高效表达载体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）选择带近端增强子的人OCT4基因启动子为靶启动子，所述靶启动子的序列如序列3所示，所述靶启动子的基因序列从转录起始位点到增强子之间的序列低于1.5kb；用所述靶启动子替换pEGFP-C1载体上的CMV启动子，构建中间载体Ⅰ即pOCT4载体；

（2）在所述中间载体Ⅰ的外源基因表达框之前Ase I酶切位点插入MAR序列片段，构建中间载体Ⅱ；在所述中间载体Ⅱ的外源基因表达框下游MluI酶切位点，插入针对所述靶启动子的表达激活RNA基因的shRNA基因表达框，构建所述高效表达载体即pOCT4-M-SaRNA；所述高效表达载体经验证能使EGFP基因表达量持续稳定高效表达； 所述shRNA基因表达框序列如序列1所示；所述MAR序列为HUBB-LCR序列，其序列如序列2所示。

2.根据权利要求1所述利用激活RNA构建高效表达载体的方法，其特征在于，构建中间载体Ⅰ步骤中，用带AgeI和AseI双酶切位点引物扩增所述靶启动子序列，所述引物为：

OCT4＃正向引物：TAGTTATTAATAGACCCAGGAGACTCAAAG

OCT4＃反向引物：TGGCGACCGGTAGCGCTAGTGATTACCCAAGA。

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