KR101207576B1

KR101207576B1 - 이중 프로모터를 포함하는 리포터 시스템 및 이를 이용한 배아줄기세포의 심근계 분화 탐지 방법

Info

Publication number: KR101207576B1
Application number: KR1020090109924A
Authority: KR
Inventors: 조이숙; 김민정; 손미영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-11-13
Filing date: 2009-11-13
Publication date: 2012-12-03
Also published as: KR20110053103A

Abstract

본 발명은 Nkx2.5 프로모터와 MLC2V 프로모터를 이용한 단일 또는 이중 프로모터 전사 활성 검출을 위한 리포터 시스템을 이용하여 다분화능 줄기세포로부터 심근계(cardiac lineage) 세포로의 분화 여부를 탐지하는 방법에 관한 것으로, 상기 프로모터 활성 검출을 위한 조성물, 상기 조성물을 포함하는 프로모터 활성 검출용 키트, 상기 프로모터 활성을 조절하는 분화 조절제, 및 상기 분화 조절 후보 물질을 검색하는 방법에 관한 것이다.

Nkx2.5 프로모터, MLC2v 프로모터, 형광발색 리포터 시스템, 인간 배아줄기세포, 분화, 심근계세포

Description

이중 프로모터를 포함하는 리포터 시스템 및 이를 이용한 배아줄기세포의 심근계 분화 탐지 방법 {Reporter system comprising dual promoter and methods for analyzing the differentiation of embryonic stem cells into cardiac lineage}

본 발명은 Nkx2.5 프로모터와 MLC2V 프로모터를 이용한 단일 또는 이중 프로모터 전사 활성 검출을 위한 리포터 시스템을 이용하여 다분화능 줄기세포로부터 심근계(cardiac lineage) 세포로의 분화 여부를 탐지하는 방법에 관한 것으로, 상기 프로모터 활성 검출을 위한 조성물, 상기 조성물을 포함하는 프로모터 활성 검출용 키트, 상기 프로모터 활성을 조절하는 분화 조절제 및 상기 분화 조절 후보 물질을 검색하는 방법에 관한 것이다.

심장 질환은 동서양을 막론하고 세계에서 가장 심각한 질환 중 하나이다. 미국의 경우 약 5명당 한명 꼴로 심장 관련 질환을 겪고 있는 것으로 보고되고 있으며(National Health and Nutrition Examination Survey III, 1988-94, Center of Disease Control and the American Heart Association), 가까운 일본의 경우에도 일본인의 사망 원인 중 2위를 차지하고 있을 정도이다. 심장은 개체의 생명을 유지하기 위한 혈액의 공급 및 순환에 가장 중심에 있는 기관임에도 불구하고, 이의 회 복 또는 재생에 필요한 심근세포는 출생 후에는 그 분열 기능을 상실하게 된다. 따라서 심근경색과 같은 심근세포의 이상이 오는 경우, 생명활동에 치명적인 결과 내지 사망을 야기하게 된다.

최근, 심장 관련 질환의 예방 및 치료에 인간배아줄기세포 및 인간배아줄기세포에서 분화 유래한 심근세포의 잠재적 활용 가능성이 매우 높이 부각되고 있다. 인간배아줄기세포 유래 심근세포는 심장질환을 치유하기 위한 세포치료제 및 신약 개발의 중요한 자원으로 인간배아줄기세포의 특성을 이용하여 질적, 양적 성능이 우수한 심근세포 자원을 수득하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있는 실정이다.

구체적으로 다분화능을 가진 줄기세포로부터 심근세포로 유도하는 다양한 방법이 개발되고 있으며, 그 예로 생쥐 배아줄기세포 (mouse embryonic stem cells; mESCs)를 백혈병 저해 인자(leukemia inhibitory factor: LIF) 등의 분화 억제 인자가 결핍된 배양조건에서 부유 배양 (suspension culture)하여 배양체(embryoid body: EB)라고 하는 초기 배아와 유사한 구조체 형태로 배양한 후 EB를 부유 또는 접착 상태로 지속적으로 배양하면, 자립 박동성을 가지는 심근세포가 발생되는 것으로 알려져 있다 (Methods in Molecular Medicine, 140, 1543-1894).

또한, 인간 배아줄기세포 (human embryonic stem cells; hESCs)의 배양 조건을 조절함으로써 심근세포로의 분화 유도가 가능함이 보고되고 있다 (Kehat et al., J. Clin. Invest. 108:407, 2001; Klug et al., J. Clin. Invest. 98:216, 1996; Chunhui et al., 91:508, 2002; Jang J et al., Stem Cells. 11:2782-90. 2008; Rust W et al., Regen Med. 4(2):225-37, 2009.). 이들 연구 결과에 따르면, HESCs로부터 분화 유도된 심근세포는 자립 박동 기능을 가질 뿐만 아니라, 미오신 중쇄(heavy chain)/경쇄(light chain), a-액티닌, 트로포닌 I, 심방성 이뇨 펩티드(artial natriuretic peptide; ANP), GATA-4, Nkx2.5, MEF-2c 등의 심근-특이 단백질 및 유전자 발현이 유도되고, 미세 해부학적 관찰 및 전기 생리학적 해석상 태생기의 미성숙한 심근세포의 형질을 유지하고 있음이 확인되었다.

한편, 상기와 같이 심근세포로의 분화 유도 방법이 다양하게 제시되고 있지만, 이러한 다능성 줄기세포로부터 유래된 심근세포를 세포 이식 치료나 신약개발 등에 적용하기 위해서는 아직 해결되어야 할 문제점들이 남아 있다. 특히, 현재의 분화 유도 기술은 아직, 심근세포외에 혈구계, 혈관계, 신경계, 장관계 세포 등, 다른 종류의 세포가 혼재된 형태로 분화가 유도 된다는 것이다. 이들 분화된 세포에서 심근세포가 차지하는 비율이 그다지 높지 않으며, 전체의 5 - 20% 정도에 지나지 않는다 (Passier et al. STEM CELLS, 23:772-780, 2005). 때문에, 분화유도 효율을 증가시킴으로써 순도 높은 심근세포를 확보할 수 있는 기술 개발이 절실히 요구되며 이를 위해서는 성능이 우수한 신규 분화 인자 또는 물질의 발굴이 매우 중요하다.

지금까지의 연구결과를 살펴보면, 생쥐 배아줄기세포 등 서로 다른 종에서 양성활성을 가진 분화 분자표적 및 분화 유도 물질을 인간배아줄기세포에 활용하였을 때, 대부분의 경우 음성 활성을 가지거나 활성을 나타낸다고 하여도 그 활성 정도가 매우 저조하여 인간배아줄기세포를 활용하기 위한 기술개발에서의 이용가치가 저조한 편이다. 때문에, 인간배아줄기세포의 신경계 분화 유도 상태, 정도를 정성, 정량적으로 분석할 수 있는 기술 개발에 대한 요구가 급증하고 있다.

따라서 본 발명자들은, 다분화능 세포, 구체적으로는 인간배아줄기세포가 자연적으로 심근세포로 분화할 때 인위적인 조작 없이 분화에 따라 발현되는 특이적 단백질의 종류 및 그 양상을 파악하여, 해당 단백질의 발현으로부터 분화 여부 및 분화에서의 시기를 규명하고자 예의 노력한 결과, 인간배아줄기세포에서 심근세포로 분화하는 경우, 그 분화 초기에 있어서 Nkx2.5 프로모터를 포함하는 다운스트림 유전자의 전사가 활성화되며, 분화 후기에 있어서는 MLC2v 프로모터를 포함하는 다운스트림 리포터 유전자의 전사가 활성화됨으로 확인하였다. 따라서 상기 두 프로모터의 활성을 이용하여 이를 마커로 사용하는 경우, 민감도와 특이도 면에서 성능이 우수한 형태로 심근세포로의 분화여부를 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 구체적인 발현 시기까지 탐지할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 Nkx2.5 프로모터와 MLC2V 프로모터를 이용한 단일 또는 이중 프로모터 전사 활성 검출을 위한 리포터 시스템을 이용하여, 배아줄기세포로부터 심근계 세포로의 분화 여부를 탐지하기 위한 프로모터 활성 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 배아줄기세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터의 활성수준을 확인하여 배아줄기세포로부터 심근계 세포로의 분화 여부를 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터의 활성을 증가 또는 감소시킴으로써 배아줄기세포로부터 심근계 세포로의 분화를 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 배아줄기세포에 심근계 세포로의 분화를 조절할 것으로 예상되는 후보 물질을 처리하는 단계; 및 배아줄기세포에서 Nkx2.5 프로모 터 및 MLC2v 프로모터 다운스트림 유전자의 전사 활성 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 배아줄기세포로부터 심근계세포로의 분화 조절 후보 물질 및 분자표적을 탐색하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 Nkx2.5 프로모터 및MLC2v 프로모터의 활성을 측정하는 제제를 포함하는, 배아줄기세포로부터 심근계세포로의 분화 여부를 탐지하기 위한 프로모터 활성 검출용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 심근계 세포로 분화되는 세포는 다분화능 또는 전분화능(multipotent or pluripotent) 세포일 수 있으며, 바람직하게는 전분화능 줄기세포이다. 더욱 바람직하게 전분화능 세포는 배아줄기세포(ESCs)일 수 있으며, 상기 배아줄기세포는 야생형 배아줄기세포 또는 유전적으로 변형된 배아줄기세포를 모두 포함한다. 또한 본 발명의 다분화능 또는 전분화능의 세포는 인간, 영장류, 설치류 및 조류 등으로부터 유래할 수 있고, 구체적으로는 인간(human), 원숭이(monkeys), 돼지(pigs), 말(horses), 소(cows), 양(sheeps), 개(dogs), 고양이(cats), 생쥐(mice), 토끼(rabbits) 등의 모든 동물로부터 유래할 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래이다.

본 발명의 심근세포로의 분화 여부를 검출하는데 이용될 수 있는 핵산 서열은 배아줄기세포로부터 심근세포로 분화되는 세포에서 유의적으로 활성이 증가하는 핵산으로서, 바람직하게는 특히 구체적인 분화 시기에 따라 특이적으로 그 활성이 유의적으로 증가하는 핵산이다. 바람직하게는 Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터이며, 상기 프로모터 서열은 NCBI를 통해 또는 당업계에 알려진 유전자 은행을 통해 용이하게 확보할 수 있다. 구체적으로 인간의 Nkx2.5 프로모터는 NK2 transcription factor related, locus 5(Drosophila)의 약칭으로 명명되는 유전자인 Nkx2.5의 프로모터 부위로서, 상기 유전자는 CSX, CSX1, CHNG5, NKX2E, NKX2.5, NKX4-1 또는 NKX2-5라고도 명명된다. Nkx2.5 유전자 및 그의 프로모터는 염색체 5q34에 위치하고 있으며, 유전자 서열은 NC_000005.8로 정의되어 있다.

MLC2v 프로모터는 CMH10, DKFZp779C0562, MYL2 또는 MLC2라고도 명명되는 유전자의 프로모터 부위로서, MLC2는 myosin, light chain 2, regulatory, cardiac, slow의 약자로, 심장 마이오신 베타 (cardiac myosin beta) 중쇄(heavy chain)와 결합하는 조절 경쇄(regulatory light chain)를 코딩하는 것으로 알려져 있다. MLC2v 및 이의 프로모터는 염색체 상의 12q24.11에 위치하고 있으며, 유전자 서열은 NC_000012.10으로 정의되어 있다.

본 발명에서 사용되는 프로모터는 상기 프로모터를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물을 포함하는 개념으로, 인위적인 변형에 의해 뉴클레오타이드의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution), 삽입(insertion) 또는 이들의 조합(combination)에 의해 변형된 변이체(variants), 또는 동일한 작용을 수행하는 상기 폴리뉴클레오티드의 작용성 단편(fragments)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 프로모터 다운스트림 유전자는 Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터 각각과 작동 가능하도록 연결된 유전자로서, 상기 프로모터의 활성을 측정할 수 있는 유전자이면 제한 없이 사용될 수 있고, 상기 활성이 유지되는 한 일부 서열이 변형, 결실 치환, 삽입된 유전자를 모두 포함한다. 바람직하게 상기 유전자는 리포터 유전자이다.

또한, 본 발명의 상기 프로모터에 의해 코딩되는 단백질은, 본 발명의 프로모터 다운스트림(downstrean)에 위치한 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드로서, 배아줄기세포로부터 심근세포로의 분화 여부를 확인하는데 사용할 수 있는 한 천연의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 다른 잔기로 치환, 결실 및/또는 첨가되어 다양하게 변형된 형태일 수 있다. 바람직하게 상기 단백질은 리포터 단백질이다.

Nkx2.5 및 MLC2v는 심근-특이적인 마커 유전자로서 알려져 있고, 이들 각각을 이용하여 일부 심근분화 연구에 이용되고 있다는 사실이 보고된 바 있다. 그러나, 이들 두 유전자의 프로모터 영역의 활성을 동시에 이용함으로써, 분화를 탐지하는 방법 또는 구체적인 분화의 시기를 탐지하는 방법에 대해서는 알려진 바 없다. 본 발명은 상기 유전자 중 어느 하나의 단일 프로모터만을 사용하여 심근세포 분화를 모니터링하는 방법과는 달리, 본 발명의 두 프로모터를 동시에 사용함으로 써 비로서 달성될 수 있는 분화 탐지 방법(배아줄기세포로부터 심근세포로의 분화 여부 및 분화된 세포가 초기인지 또는 후기인지에 대한 구체적인 분화 정도에 관한 정보를 제공)이다.

본 발명에서는 종래 기술과는 용도와 효과에 있어서 현저히 개선된 인간배아줄기세포 심근 분화 단일 어세이 시스템을 제공하고자 노력한 결과, 다분화능 줄기세포, 구체적으로는 인간배아줄기세포의 초기, 후기 심근분화 진행 단계를 탐색할 수 있는 이중 프로모터 리포터 시스템을 개발하는데 성공하였고, 각각의 초기 분화 마커 유전자 Nkx2.5 프로모터 및 후기 분화 마커 유전자 MLC2v 프로모터가 배아줄기세포가 심근세포로 분화하는데 있어서 그 활성이 증가할 뿐만 아니라, 특히 상기 두 프로모터의 활성은 심근계 세포로 분화하는데 있어서 특이적 단계에서 활성이 증가함을 확인하였다. 본 발명자들은 본 발명의 상기 두 프로모터 및 이의 다운스트림에 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 측정함으로써, 심근계 세포로의 분화에 있어서 초기 마커(early marker) 및 후기 마커(late marker)로 이용할 수 있음을 확인하였다. 특히, 심근계 세포로의 분화여부 판단에 있어 높은 민감도, 정확도 및 특이도를 가지고 판단할 수 있는 이러한 효과는 상기 두 마커를 함께 사용하는 경우, 각각의 단일 마커를 사용하는 경우보다 효과적이다. 구체적으로, 줄기세포로부터 심근세포로 분화하는 과정에서 상기 각 프로모터의 활성 여부에 따라 현재의 분화 정도를 판단할 수 있고, 이를 이용하여 분화의 정도를 판단하여 분화시기에 따른 심근세포를 구분하여 이용할 수 있다. Nkx2.5 프로모터는 심근계 세포 분화에 있어서 초기에 그 활성이 증가되는 바, 초기 마커로 사용할 수 있다. 따라서 배아줄기세포로부터 적절한 배양 조건 및 배양 방법을 이용하여 분화가 진행되는 경우, 해당 세포에서 Nkx2.5 프로모터의 활성 증가 여부를 확인함으로써 심근전구세포로의 분화가 진행되었는지를 판단할 수 있게 된다. 또한 Nkx2.5 프로모터의 활성이 증가하였으나, MLC2v 프로모터의 활성이 증가하지 않은 경우, 해당 세포가 심근세포의 초기 단계(심근전구세포)까지는 분화하였지만, 아직 후기 단계까지는 이르지 못하였음을 직접적으로 확인할 수 있다. 이후 MLC2v 프로모터의 활성 증가를 확인함으로써 해당 세포가 심근세포로까지 분화가 진행되었음을 판단할 수 있게 된다. 바람직하게, 본 발명은 초기 마커로서 Nkx2.5 프로모터의 활성을, 후기 마커로서 MLC2v 프로모터의 활성을 확인함으로써 다분화능세포로부터 심근세포를 성공적인 분화를 판단하는 척도로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 해당 분화가 진행됨에 있어서 그 분화단계를 구체적으로 판단할 수 있어, 분화 시기와 상태에 따른 세포를 확인, 분리 및 이용하는데 효과적인 마커로 사용될 수 있다.

본 발명의 "Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터의 활성을 측정하는 제제"는 Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터의 활성을 측정할 수 있는 제제이면 제한 없이 사용될 수 있으며, 바람직하게 상기 제제는 본 발명의 프로모터와 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자이다. 상기 Nkx2.5 프로모터 및 그의 다운스트림에 위치하는 리포터 유전자, 및 MLC2v 프로모터 및 그의 다운스트림에 위치하는 리포터 유전자는 세포에 유전체를 전달할 수 있는 구조물의 형태로 제조되어 배아줄기세포에 형 질 전환될 수 있으며, 바람직하게 상기 구조물은 벡터이다. 본 발명의 벡터는 당업자의 필요에 따라 적절한 형태로 제작될 수 있으며, 상기 두 프로모터 및 다운스트림 유전자를 하나의 벡터로, 또는 하나의 벡터로 제조할 수 있다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명의 "작동 가능하게 연결된"이란, 본 발명의 프로모터 서열의 다운스트림에 유전자가 연결될 때, 해당 유전자의 발현이 가능한 형태로 연결되는 것을 의미하며, 상기 목적을 달성하기 위하여 임의의 서열이 추가로 포함될 수 있다. 상기 임의의 서열을 예로 들면, 오퍼레이터(operator) 서열, 인프레임(in frame)을 위한 서열 등이 있으며, 또한 본 발명의 유전자 이외에 인핸서 (enhancer)와 같은 시스 요소 (cis element), 스플라이싱 시그널 (splicing signal), 폴리 A 추가 시그널 (poly A addition signal), 선택 마커 (selection marker), 라이보좀 결합 서열 (ribosome binding sequence, SD sequence) 등을 추가로 포함할 수 있다. 선택 마커의 예로, 클로람페니콜 저항 유전자, 암피실린 저항 유전자, 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase), 네오마이신 저항 유전자 등이 사용될 수 있으나, 상기 예들에 의해 작동 가능하도록 연결되기 위한 추가적 구성요소가 제한되는 것은 아니다.

바람직하게 본 발명의 벡터는 Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터 각각의 다운스트림에 리포터 유전자를 포함하며, 더욱 바람직하게 상기 벡터는 Nkx2.5 프로모터-EGFP로 구성된 벡터로서 도 2a 좌측의 개열지도(pLenti6-Nkx2.5-EGFP)일 수 있고, MLC2v 프로모터-DsRed로 구성된 벡터로서 도 2a 우측의 개열지도 (pLenti6-MLC2v-DsRed)로 표시될 수 있다.

또한 상기 리포터 유전자는 그 업스트림(upstream)의 프로모터 활성에 따라 유전자가 발현되어 세포 내에서 그 발현 여부를 확인할 수 있는 유전자이면 제한 없이 사용될 수 있고, 바람직하게 리포터 유전자는 발색을 나타낼 수 있는 모든 리포터 유전자를 포함한다. 리포터 유전자의 예로는 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP), 및 증강된 남색 형광 단백질(ECFP) 및 레닐라 루시퍼라제(Renila luciferase), 적색 형광 단백질(DsRed)등을 포함하나 상기 예에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서는 구체적으로, 본 발명의 상기 두 프로모터 및 상기 프로모터 각각의 다운스트림(downstream)에 이의 발현을 검출할 수 있는 리포터 유전자를 클 로닝하여, 이를 배아줄기세포에 형질감염(transfection)시킨 결과, 심근세포 분화 초기 단계 및 후기 단계에 있어 각각 특이적으로 두 리포터 유전자에 의한 형광 발색을 나타내는 것을 확인하였다. 또한 이러한 프로모터의 과발현 활성이, 해당 세포 내의 Nkx2.5 및 MLC2v 발현량과 비례하여 증가한 것인지 확인한 결과, 세포 내 Nkx2.5 및 MLC2v의 발현이 증가하였음을 확인하였고, 상기 발현 수준이 이미 심근세포로 알려진 세포에서 발현되는 단백질(Nkx2.5, MLC2A, α-MHC, β-MHC, Isl1, Tbx20, ANP, GATA4 및 MEF2C)의 발현 증가 정도와 유사한 수준임을 고려할 때, 본 발명의 상기 두 프로모터의 활성 측정은 배아줄기세포로부터 심근세포로의 분화를 탐지하는데 효과적인 마커로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 구체적인 분화 시기까지 결정할 수 있는 마커로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

또한 이러한 효과는 상기 두 프로모터 및 상기 각 프로모터의 다운스트림에 작동 가능하게 연결된 유전자를 함께 사용하는 경우, 어느 한 프로모터 및 다운스트림 유전자만을 사용하는 경우보다 심근세포로의 분화여부 판단에 있어 높은 민감도, 정확도 및 특이도를 가질 수 있고, 각 프로모터의 활성이 분화의 단계 중 전기 및 후기에서 특이적으로 증가함을 고려할 때, 구체적인 분화시기에 따른 정보를 연구하거나 이를 산업적으로 이용하는데 효과적인 마커로 사용할 수 있다. 즉, Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터를 동시에 병용마커(또는 이중마커)로 사용함으로써 높은 특이성, 정확도를 확보할 수 있으며, 분화 시기에 대한 탐지가 가능하고, 탐지 효율도 높일 수 있음을 확인하였다.

다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 배아줄기세포에 관한 것이다. 보다 상세하게 본 발명의 배아줄기세포는 Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터, 및 상기 각 프로모터의 다운스트림에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 벡터를 형질전환 시킴으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 벡터를 배아줄기세포에 도입하는 방법은, 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들면 염화칼슘 (CaCl₂) 및 열 쇼크 (heat shock)를 이용한 방법, 전기천공법 (electroporation), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스터 (Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 및 PEG (polyethylenglycol)를 이용한 침전법, 자연 도입 방법 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 벡터를 도입하는 방법이 제한되는 것은 아니다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터의 활성 수준을 확인하여 배아줄기세포로부터 심근세포로의 분화 여부를 탐지하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 프로모터의 활성 수준 확인은 특정 유전자의 발현 정도를 측정하 는 공지의 방법들을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 마커 유전자의 프로모터 활성에 의한 다운스트림 유전자의 발현 정도를 면역염색법 또는 유세포 분석방법을 이용하여 측정하거나, 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 또는 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR)을 이용하여 유전자 수준의 발현 정도를 측정할 수 있다. 또한 본 발명의 프로모터의 다운스트림 유전자들에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준 확인은 다운스트림 유전자가 발색을 수반하는 리포터 유전자인 경우, 해당 유전자의 발현을 형광 강도 측정과 같은 발색 여부 및 발색량을 측정함으로써 확인할 수 있다.

바람직하게 상기 방법은, (a) 분화유도물질을 이용하여 배아줄기세포로부터 심근세포로 분화를 유도하는 단계; (b) 배아줄기세포 및 분화가 유도되었다고 예상되는 줄기세포의 핵산 시료 또는 단백질 시료를 얻는 단계; (c) 상기 핵산 시료 또는 단백질 시료 중, Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터 다운스트림 유전자의 mRNA 전사량 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)의 유전자의 전사량 또는 상기 단백질의 발현량이 증가되었을 때, 배아줄기세포가 심근세포로 분화된 것으로 판정하는 단계를 포함하는 방법을 수행함으로써, 분화 유도 배양 후 심근세포로의 분화 유도 여부, 분화 단계, 및 분화 정도를 결정할 수 있다.

구체적으로, 상기 (a) 단계에서 심근세포로의 분화 유도 단계는 당업계에서 사용되는 심근세포로의 분화 방법이 제한 없이 사용될 수 있으며, 당업자의 선택에 따라 적절한 분화 유도 물질을 첨가하고 배양 조건을 설정함으로써 달성될 수 있다. 바람직하게 상기 방법은 심근분화배양배지(Cardiomyocyte differentiation medium; CDM)를 이용하여 배아줄기세포가 EB를 형성할 수 있도록 배양한 후, 다시 CM 배지로 옮겨 심근세포로의 분화를 유도할 수 있으나, 상기 방법에 의해 분화유도 방법이 제한되는 것은 아니다. 이와 같이 처음에 CDM 배지를 사용하여 EB를 유도하는 경우, 초기부터 심근세포로의 분화가 유도되기 때문에 초기(early) 마커인 Nkx2.5 프로모터 활성에 의한 형광(발색)을 나타내게 되고(약 2 내지 5일), 이후 CDM 배지를 이용하여 배양하는 경우, 계속적인 심근세포로의 분화 결과로서, 배양 후 3 내지 4주 후에는 후기 마커인 MLC2v 프로모터 활성에 의한 형광을 나타내게 된다.

상기 단계 (c)에서 유전자의 mRNA 전사량 측정은 본 발명의 프로모터의 다운스트림 유전자의 전사 수준을 측정함으로써 수행될 수 있으며, 중합효소연쇄반응(PCR), 실시간 중합효소연쇄반응 (Real time PCR) 및 전기영동법을 통하여 수행할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 다운스트림 유전자가 심근세포로 분화된 세포 특이적으로 전사 수준이 유의적으로 증가함을 확인할 수 있으며, 본 발명의 구체적 실시예에서는 본 발명의 마커 유전자의 발현 수준을 확인하기 위하여, RT-PCR을 수행하였고, 그 결과 본 발명의 심근세포 특이 마커 유전자(Nkx2.5, MLC2A, α-MHC, β-MHC, Isl1, Tbx20, ANP, GATA4 및 MEF2C)는 심근세포로 분화된 세포에서만 특이 적으로 증가함을 확인하였다.

또한, 본 발명의 배아줄기세포로부터 심근세포로의 분화 여부를 단백질 수준에서 탐지하는 방법은 본 발명의 프로모터의 다운스트림에 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현 여부로 확인할 수 있다. 특히 상기 다운스트림 유전자가 리포터 유전자로서 발색 및 형광에 관여하는 유전자인 경우, 형광 현미경 관찰법 및 유세포 분석법(Flow cytometric analysis) 등의 방법을 이용할 수 있다.

또한 상기 리포터 유전자에 의해 발색의 정도가 증가하는 경우, 해당 세포가 심근세포로 성공적으로 분화하였는지 확인하기 위하여, 본래 세포가 심근세포로 분화함으로써 발현이 증가하는 단백질의 발현 증가 여부를 추가로 확인할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 리포터 유전자의 발색에 의해 심근세포로 분화하였다고 판단한 세포에 대해 면역화학(immunocytochemistry)을 실시한 결과, 리포터 유전자의 발색으로부터 심근세포라고 판단된 거의 모든 세포에서 심근세포 마커인 cTnT 과 a-actinin 이 발현되고 있음을 확인하였다(실시예 7). 이는, 어느 한 유전자의 발현 여부만을 확인하여, 분화 여부 및 정도를 확인한 종래의 방법과 비교하여, 분화의 시기에 따라 높은 특이도 및 정확도를 가진 선별이 가능함을 의미하며, 본 발명의 리포터 시스템을 이용하는 경우, 별도의 단백질 발현 확인 과정이 불요하다는 것을 의미한다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터의 다운스트림에 위치한 유전자의 발현을 증가 또는 감소시킴으로써 배아줄기세포로부터 심근세포로의 분화를 조절하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 효과적인 심근세포로의 분화 유도를 위해 유전자 발현율을 높이는 방법은 세포 내에서 유전자 발현율을 높일 수 있는 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 상기 유전자들을 포함하는 벡터를 제작하고, 이들을 세포에 형질도입시켜 이들 유전자의 발현율을 높일 수 있다.

또한, 본 발명에서 심근세포로의 분화를 저지하기 위해 유전자 발현율을 낮추는 방법은 세포 내에서 유전자를 결실시키거나 유전자 변이를 통해 유전자 기능을 상실시킬 수 있는 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 상기 유전자들에 대한 shRNA(small hairpin RNA) 또는 siRNA를 디자인 할 수 있고, 이들을 세포에 형질 도입시켜 이들 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.

상기와 같은 조절방법을 사용하는 경우, 리포터 시스템 도입에 의한 프로모터뿐만 아니라, 본래 줄기세포가 함유하고 있는 프로모터의 활성까지 조절할 수 있게 되어, 궁극적으로는 배아줄기세포의 분화의 촉진 또는 억제를 가능하게 한다.

본 발명에서 분화 유도를 위한 조절제로는 상기 유전자의 발현율을 높일 수 있는 분자, 바람직하게는 상기 유전자를 과발현시킬 수 있는 벡터를 포함할 수 있 으며, 분화 저지를 위한 조절제로는 상기 유전자의 발현율을 낮출 수 있는 분자, 바람직하게는 상기 유전자에 대한 siRNA 또는 shRNA 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로모터는 심근세포로 분화시키기 위한 분화조절인자와 매우 밀접한 관련성이 있는 것으로 보이며, 따라서 이들의 억제인자 또는 촉진인자를 이용하여 효율적이고 간편하게 분화를 증가 또는 억제시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 심근세포로의 분화 조절제는 심근경색, 허혈성 심질환, 울혈성 심부전, 비대성 심근증, 확장형 심근증, 심근염 또는 만성 심부전과 같은 심근 재생 또는 심장 질환 치료용으로 사용될 수 있으며, 상기 예에 의해 본 발명의 심근세포 또는 심근 세포로의 분화 조절제가 이용될 수 있는 질환이 제한되는 것은 아니다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 배아줄기세포에 심근세포로의 분화를 조절할 것으로 예상되는 후보 물질을 처리하는 단계; 및 배아줄기세포에서 Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터 다운스트림 유전자의 전사 활성 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 배아줄기세포로부터 심근세포로의 분화 초기 또는 후기 조절 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "후보 물질"은 심근세포로의 분화 유도 시 세포 내에서 유의하게 일어나는 유전자 발현량의 변화를 간접적 또는 직접적으로 억제 또는 유도할 수 있을 것으로 예상되는 모든 물질을 의미한다. 상기 후보 물질 스크리닝에 의해 선별된 분화 조절 물질은 분화 초기에 그 활성이 증가되는 Nkx2.5 프로모터 및 분화 후기에 그 활성이 증가되는 MLC2v 프로모터의 활성을 더욱 증가시킴으로써 분화를 유도하거나 그 활성을 감소시킴으로써 분화를 억제하도록 조절할 수 있다.

따라서, 분화 조절 후보 물질의 존재 및 부재 하에서의 심근세포에 대한 본 발명의 프로모터의 활성을 해당 프로모터의 다운스트림 유전자의 발현량 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 배아줄기세포로부터 심근세포로의 분화를 조절할 수 있고, 나아가 분화 조절 인자를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터, 및 이의 다운스트림에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자를 이용하는 경우, 배아줄기세포로부터 심근계 세포로 분화되는 분화유도 상태, 정도, 시기 등을 단일 리포터 에세이 방법을 이용하여 빠르고 정확하게 탐지할 수 있어, 심근계 세포를 효과적으로 선별할 수 있고, 심근 재생을 필요로 하는 질환 또는 그 밖의 심장 질환을 겪는 개체와 같이, 이를 필요로 하는 환자에게 제공하기 위한 효과적인 수단을 제공한다. 또한 본 발명의 프로모터 및 그의 다운스트림 유전자 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 억제 또는 촉진시킴으로써, 심근계 세포로의 분화를 조절할 수 있는 후보물질 및 분자표적을 탐색하는데 이용할 수 있고, 상기 방법으로 선택된 후보물질을 심근계 세포로의 분화를 조절하는 분화조절제로 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 인간 배아줄기세포 배양

본 발명에서 인간 배아줄기세포 (Human embryonic stem cells; hESCs)는 13.5일령 CF1 마우스 태아 (mouse fetus)로부터 얻은 MEF(mouse embryonic fibroblast)를 피더 세포(feeder cell)로 사용하여 배양하였다. 피더 세포는 10% FBS (Gibco), 0.1 mM β-머캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산이 포함되어 있는 DMEM (high glucose, Invitrogen)에서 배양 한 후 유사분열(mitosis)을 중지 시키기 위해 3000 rad 감마 방사선을 조사하였다. 그 후, 0.1% 젤라틴(gelatin)으로 코팅된 60mm 배양접시에 3 x 10⁵ 의 농도로 감마 방사선을 조사한 MEF 피더 세포를 씨딩(seeding)하였다. 피더 세포를 씨딩한 다음날 hESCs를 씨딩하였으며, hESCs 배지 (DMEM(Dulbecco's modified Eagle`s medium)/F12(Gibco, Rockville, MD, USA), 20% 넉아웃 (Knockout) SR(Gibco), 0.1 mM의 β-머캅토에탄올 (mercaptoethanol)(Sigma, St Luis, MO, USA), 2 mM의 글루타민(glutamine) (Gibco), 0.1 mM의 비필수 아미노산(Gibco), 100 U/㎖의 페니실린(penicillin)-스트렙토마이신(streptomycin)(Gibco), 4 ng/㎖의 bFGF (Invitrogen))에서 배양하였다. 매일 배양액을 교체하며 배양하였으며, 5-7일 동안 배양 된 hESCs를 tissue chopper (Mickle Engineering)를 이용하여 250x250 mm 크기로 자른 후, 1 ㎎/㎖의 콜라겐 분해효소(collagenase) Ⅳ(Gibco)를 이용한 효소적 (enzymatic) 방식으로 계대배양 하였다.

실시예 2. Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터 벡터의 제조

<2-1> 렌티 바이러스 벡터 구축

pLenti6-Nkx2.5 프로모터-EGFP 및 pLenti6-MLC2v프로모터-DsRed를 제조하기 위해서, hESCs로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출한 뒤 하기의 프라이머 세트를 이용하여 Nkx2.5 프로모터와 MLC2v 프로모터를 PCR 증폭하였다. Nkx2.5 프로모터 센스 프라이머는 5'- GATCACCCCACTTGCCCTGCC -3' (서열번호 1), Nkx2.5 프로모터 안티센스 프라이머는 5'- GAGCGATGAGCAGTTTCG -3' (서열번호 2)이다. MLC2v 프로모터 센스 프라이머는 5'- GCCACAGTGCCAGCCTTCATGG -3' (서열번호 3), MLC2v 프로모터 안티센스 프라이머는 5'- GTGGAAAGGACCCAGCACTG-3' (서열번호 4)이다. PCR을 수행한 뒤 각각 생성된 978 bp 크기의 Nkx2.5 프로모터와 562bp 크기의 MLC2v 프로모터의 산물을 확보하였고 (도 1), 각각의 산물을 TA 클로닝 방법을 이용하여 pENTR5'-TOPO 벡터(Invitrogen)에 삽입하여 pENTR5'- Nkx2.5와 pENTR5'- MLC2v 를 제조하였다. Nkx2.5 프로모터의 활성을 확인하기 위하여 형광을 발현하는 EGFP 유전자를 가지고 있는 pEGFP-N3 (Clontech) 벡터를 주형으로 센스 프라이머 5'- CAC CAT GGT GAG CAA GGG CGA G-3' (서열번호 5), 안티센스 프라이머 5'- CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG-3' (서열번호 6)를 사용하여 PCR 증폭하였다. 증폭된 EGFP 유전자의 PCR 산물은 pENTR/D-TOPO 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 directional cloning을 위해, CACC 염기서열을 포함하고 있다 (밑줄 친 부분). 생성된 717bp 크기의 산물을 pENTR/D-TOPO 벡터에 삽입하여 pENTR/D-TOPO-EGFP를 제조하였다. MLC2v 프로모터의 활성을 확인하기 위하여 형광을 발현하는 DsRed 유전자를 가지고 있는 pDsRed2 (Clontech) 벡터를 주형으로 센스 프라이머 5'-CAC CAT GGC CTC CTC CGA GAA C-3' (서열번호 7), 안티센스 프라이머 5'-CAG GAA CAG GTG GTG GCG GC-3' (서열번호 8)를 사용하여 PCR 증폭하였다.증폭된 DsRed 유전자의 PCR 산물은 pENTR/D-TOPO 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 directional cloning을 위해, CACC 염기서열을 포함하고 있다 (밑줄 친 부분). 생성된 675bp 크기의 산물을 pENTR/D-TOPO 벡터에 삽입하여 pENTR/D-TOPO-DsRed를 제조하였다. 각각 제조된 벡터를 entry clone으로 하여 게이트웨이 시스템 (Gateway system; Invitrogen)을 이용하여, LR clonase 반응에 의해 pLenti6/R4R2/V5-DEST destination vector에 삽입함으로써 pLenti6-Nkx2.5 프로모터-EGFP와 pLenti6-MLC2V 프로모터-DsRed를 구축하였다 (도 2a).

<2-2> 비바이러스 (non-viral) 플라스미드 (plasmid) 벡터 구축

Nkx2.5 프로모터-EGFP 및 MLC2v 프로모터-EGFP를 제조하기 위해서, hESCs로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출한 뒤 하기의 프라이머 세트를 이용하여 Nkx2.5 프로모터와 MLC2v 프로모터를 PCR 증폭하였다. Nkx2.5 프로모터 센스 프라이머는 5'- GTAGAATTCGATCACCCCACTTGCCCTG-3' (서열번호 9)으로서, 클로닝상의 편의를 위해 EcoRI 제한효소 부위를 삽입하였고 (밑줄 친 부분), Nkx2.5 프로모터 안티센스 프라이머는 5'- GATGGATCCGAGCGATGAGCAGTTTCG-3' (서열번호 10)으로서, BamHI 제한효소 부위를 삽입하였다 (밑줄 친 부분). PCR을 수행한 뒤 생성된 996bp 크기의 산물을 EcoRI 와 BamHI 제한효소로 처리한 뒤 978bp의 Nkx2.5 프로모터 산물을 확보하고, 동일한 제한효소를 처리한 pEGFP-1 벡터 (Clontech)에 삽입하여, pEGFP-1- Nkx2.5 프로모터 벡터를 구축하였다 (도 2b). MLC2v 프로모터 센스 프라이머는 5'- GATAGATCTGCCACAGTGCCAGCCTTCATG -3' (서열번호 11)으로서, 클로닝상의 편의를 위해 BglII 제한효소 부위를 삽입하였고 (밑줄 친 부분), MLC2v 프로모터 안티센스 프라이머는 5'- GAAGTCGACGTGGAAAGGACCCAGCACTG -3' (서열번호 12)으로서, SalI 제한효소 부위를 삽입하였다 (밑줄 친 부분). PCR을 수행한 뒤 생성된 580bp 크기의 산물을 BglII 와 SalI 제한효소로 처리한 뒤 562bp의 MLC2v 프로모터 산물을 확보하고, 동일한 제한효소를 처리한 pEGFP-1 벡터 (Clontech)에 삽입하여, pEGFP-1- MLC2v 프로모터 벡터를 구축하였다 (도 2b).

실시예 3. 심근세포 특이적 프로모터 발현세포주의 구축 및 확인

<3-1> Lipofectamine2000 형질감염 (transfection)을 통한 Nkx2.5 프로모터-EGFP 및 MLC2v 프로모터-EGFP 발현세포주의 구축

상기 실시예 2-2에서 제조한 Nkx2.5 프로모터-EGFP 및 MLC2v 프로모터-EGFP 벡터를 hESCs에 lipofectamine2000 (Gibco)을 이용하여 다음과 같이 형질감염시켰다. 5-7일 동안 배양된 hESCs를 tissue chopper (Mickle Engineering)를 이용하여 250x250 mm 크기로 자른 후, 1 ㎎/㎖의 콜라겐 분해효소 (collagenase) Ⅳ(Gibco)를 처리하여, Matrigel (Becton Dickinson) 이 코팅된 배양접시에서 영양화 배양액 (conditioned medium)으로 배양하였다. 그리고, 플라즈미드 DNA 4.0㎍을 500 ul의 혈청이 없는 Opti-MEM 배지 (Gibco)와 혼합하고, 10 ul의 lipofectamine2000 시약을 500 ul의 혈청없는 Opti-MEM 배지에 넣고, 5분간 상온에 방치하였다. 희석된 플라스미드 용액 500 ul와 희석된 lipofectamine2000 시약 500 ul를 섞고 20분간 상온에 방치하여 플라스미드- lipofectamine2000 복합체를 형성한 다음, 그 1000 ul의 용액을 상기 hESCs가 배양된 배지에 가하고, 살살 흔들어서 혼합한 다음 24시간동안 배양하였다. 도 2b에 나타난 바와 같이, 상기 Nkx2.5 프로모터-EGFP 및 MLC2v 프로모터-EGFP 벡터는 네오마이신에 내성을 나타내는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 유전자(neomycin phosphotransferase gene)를 포함하고 있다. 이를 통해서 상기의 벡터가 세포내로 적절히 형질감염 되는 경우, hESCs는 네오마이신 마커를 가지므로 G-418에 대한 저항성을 가짐으로써 G-418의 독성작용을 피하고 증식하게 된다. 그러므로 다음 날부터, hESC 배지에 제네티신(Geneticine) 200㎍/㎖를 첨가한 배지를 사용하여 배양하였고, 이 후, 배지를 2일마다 갈아주면서 3주간 배양하였고, 3주 경과후, 세포가 원모양의 콜로니(colony)를 형성하게 되면, 이 콜로니를 4-웰 플레이트에 옮겨 주었다. 이후, 35mm, 60mm 배양접시로 옮기며, 세포수를 증가시켰다.

이렇게 하여 분리, 구축된 세포주의 지놈 DNA를 다음과 같은 과정을 통해 분리하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)의 주형으로 사용하였다. 세포주를 수집하 여, 55℃에서 1 M KCl, 1 M MgCl₂, 0.5% Tween 20, 0.5% Nonidet P-40, 2.5 ㎍/mL proteinase K가 들어있는 추출 완충액(extraction buffer)과 함께 1시간 동안 배양했다. 95℃로 10분간 가열하여 proteinase K를 불활성화시킨 후, 지놈 DNA가 포함되어 있는 상층액을 4℃로 보관하였다. 상기 과정에 의해 수득한 지놈 DNA를 주형으로 사용하고, 네오마이신 유전자를 증폭할 수 있는 5'-CGCATGATTGAACAAGATGG-3'(서열번호 13) 및 5'-ATACTTTCTCGGCAGGAGCA-3' (서열번호 14) 프라이머와 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3' (서열번호 15) 및 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3' (서열번호 16) 를 GAPDH 프라이머로 사용하여, Taq 중합효소 (Takara)를 사용하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다: 변성은 94℃에서 30초, 어닐링은 58℃에서 30초, 연장반응은 72℃에서 1분 간으로 하여 총 28 사이클을 수행하였다. 그런 다음, PCR 생성물을 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동하여 Nkx2.5프로모터-EGFP 및 MLC2v프로모터-EGFP 벡터가 동시에 가지고 있는 네오마이신 유전자 영역의 DNA가 합성됨을 확인하였다 (도 3a). 이로부터 상기 방법으로 구축된 세포주가 Nkx2.5 프로모터-EGFP 및 MLC2v 프로모터-EGFP에 의해 형질감염되었음을 확인할 수 있었다.

<3-2> Lipofectamine 2000 형질감염(transfection)과 Lentivirus-매개 감염을 통한을 통한 Nkx2.5 프로모터-EGFP 와 MLC2v 프로모터-DsRed 동시 발현세포주의 구축

상기 실시예 3-1에서 lipofectamine 2000(Gibco)을 이용하여 형질감염 하여 구축한 Nkx2.5 프로모터-EGFP 세포주에, 상기 실시예 2-1에서 제조한 pLenti6- MLC2v 프로모터-DsRed 벡터를 HEK293T packaging cell line (Invitrogen)에 lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 형질감염(transfection)하였다. 자세하게는 MLC2v 프로모터-DsRed 벡터 DNA 3.0, packaging mix plasmid 6.0을 500 ul의 혈청이 없는 Opti-MEM 배지(Gibco)와 혼합하고, 36 ul의 lipofectamine 2000 시약을 500 ul의 혈청없는 Opti-MEM 배지에 넣고, 5분간 상온에 방치하였다. 희석된 플라스미드 용액 500 ul와 희석된 lipofectamine2000 시약 500 ul를 섞고 20분간 상온에 방치하여 플라스미드- lipofectamine2000 복합체를 형성한 다음, 그 1000 ul의 용액을 상기 HEK293T packaging 세포가 배양된 배지에 가하고, 살살 흔들어서 혼합한 다음 24시간동안 배양하였다. 다음 날 배지를 교환하고 24시간 배양 후부터 상등액(supernatant)을 취하여 0.45um(Millipore)로 필터링 (filtering)을 하여 세포 잔해(cell debris)를 제거하였다. 필터링한 상등액 30ml을 20,000 rpm에서 2시간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 남은 침전물에 HPSS (Gibco) 500ul를 넣어 바이러스를 농축시켰다. 5-7일 동안 배양 된 hESCs을 tissue chopper(Mickle Engineering)를 이용하여 250x250 mm 크기로 자른 후, 1 ㎎/㎖의 콜라겐 분해효소(collagenase) Ⅳ(Gibco)를 처리하여, Matrigel(Becton Dickinson) 이 코팅된 배양접시에서 영양화 배양액(conditioned medium)으로 배양하였다. 다음 날, 농축시킨 바이러스 용액 200ul와 6-8 ㎍/㎖ polybrene(sigma)을 Nkx2.5 프로모터-EGFP 세포주에 첨가하여 24시간 배양 후 배지를 교환해 주었다. 도 2a에 나타난 바와 같이, 상기 pLenti6-MLC2v 프로모터-DsRed 벡터는 블라스티시딘(Blasticidin) 내성유전자를 포함하고 있으므로, 상기의 벡터가 세포내로 적절히 형질감염 되는 경우, 세포주는 블라스티시딘 마커를 가지므로 블라스티시딘에 대한 저항성을 가지게 된다. 그러므로 다음날부터 hESCs 배지에 1㎍/㎖의 블라스티시딘을 첨가하여 선별하였다. 이 후, 배지를 2일마다 갈아주면서 3주간 배양하였고, 3주 경과후, 세포가 원모양의 콜로니(colony)를 형성하게 되면, 이 콜로니를 4-웰 플레이트에 옮겨 주었다. 이후, 35mm, 60mm 배양접시로 옮기며, 세포수를 증가시켰다.

이렇게 하여 분리, 구축된 세포주의 지놈 DNA를 다음과 같은 과정을 통해 분리하여 PCR (Polymerase Chain Reaction)의 주형으로 사용하였다. 세포주를 수집하여, 55℃에서 1 M KCl, 1 M MgCl₂, 0.5% Tween 20, 0.5% Nonidet P-40, 2.5 ㎍/mL proteinase K가 들어있는 추출 완충액(extraction buffer)과 함께 1시간 동안 배양했다. 95℃로 10분간 가열하여 proteinase K를 불활성화시킨 후, 지놈 DNA가 포함되어 있는 상층액을 4℃로 보관하였다. 상기 과정에 의해 수득한 지놈 DNA를 주형으로 사용하고, Nkx2.5 프로모터-EGFP의 형질감염은 이미 상기 실시예 3-1에서 확인하였으므로, MLC2v 프로모터-DsRed의 형질감염을 확인하기 위해서 DsRed 유전자를 증폭할 수 있는 5'-TCCAAGGTGTACGTGAAGCA-3' (서열번호 17) 및 5'-CCCATGGTCTTCTTCTGCAT-3' (서열번호 18) 프라이머와 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3' 및 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3' 를 GAPDH 프라이머로 사용하여, Taq 중합효소 (Takara)를 사용하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다: 변성은 94℃에서 30초, 어닐링은 58℃에서 30초, 연장반응은 72℃에서 1분 간으로 하여 총 28 사이클을 수행하였다. 그런 다음, PCR 생성물을 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동하여 MLC2v 프로모 터-DsRed 벡터가 가지고 있는 DsRed 유전자 영역의 DNA가 합성됨을 확인하였다 (도 3b). 이로부터 상기 방법으로 구축된 세포주가 Nkx2.5 프로모터-EGFP 와 MLC2v 프로모터-DsRed 두 가지 심근세포 마커 프로모터에 의해 형질감염 되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 인간 배아줄기세포로부터 심근세포 (cardiomyocytes)의 제조

6-7일간 배양된 hESCs를 tissue chopper (Mickle Engineering)를 이용하여 500x500 mm 크기로 자른 후, 1 ㎎/㎖ 농도의 콜라게나제(collagenase)를 처리하여 균등한 세포 덩어리로 분리하였다. 분리된 hESCs를 깨어지지 않게 조심하여 박테리아 플레이트(bacteria plate)에 잘 옮겨 CM(cardiomyocytes) 배지 (Knockout-DMEM(Gibco), 20% FBS(Gibco), 0.1 mM의 β-머캅토에탄올(mercaptoethanol, Sigma), 1 mM의 L-글루타민(glutamine, Gibco), 1% 의 비필수 아미노산(Gibco), 100 U/㎖의 페니실린(penicillin)-스트렙토마이신(streptomycin)(Gibco))에서 EB를 형성할 수 있도록 배양하였다. 이때, 매일 배양액과 플레이트를 교체하여 주었다. 심근분화배양배지(Cardiomyocyte differentiation medium; CDM)에서 5일간 배양된 EB를 0.1% 젤라틴으로 코팅된 60mm 배양접시에 부착시키고, 동일한 CDM에서 10일 이상 배양하여 심근세포로 분화시키고 충분히 자라도록 하였다 (2일에 한번씩 배양액 교체). 부착한 후 3일이 지나면 심박동 (beating)이 관찰되었다.

실시예 5. 심근세포 특이적 프로모터 세포주를 이용한 프로모터 활성 조사

<5-1> Nkx2.5 프로모터-EGFP 및 MLC2v 프로모터-EGFP 발현 세포주를 이용한 프로모터 활성 조사

Nkx2.5 프로모터-EGFP 및 MLC2v 프로모터-EGFP 발현 인간 배아줄기세포주를 상기 실시예 4의 방법으로 심근세포로 분화시켰다. 이러한 세포주를 이용하여 심근세포로 분화시키면, Nkx2.5 프로모터와 MLC2v 프로모터에 의해 각각 EGFP(녹색형광)을 발현하는 심근세포가 만들어지게 된다. 이를 형광현미경으로 관찰하여 확인하였다 (도 4a). 그 결과, Nkx2.5 프로모터-EGFP 발현 hESCs를 사용하여 만든 심근세포는 심근세포 분화 배지에서 10일 이상 배양하면 Nkx2.5 프로모터에 의해 EGFP(녹색형광)을 발현하는 심근세포가 만들어졌음을 확인할 수 있었고, 심박동 (beating)도 관찰할 수 있었다 (도 4a, 점선 부분). 하지만, Nkx2.5 프로모터에 의한 EGFP(녹색형광)의 발현은 부착하기 전에 5일 배양된 EB 상태에서부터 확인할 수 있었다. 이는 EB를 형성하는 배지 역시 CDM을 사용하였기 때문에 심근 세포의 초기(early) 마커인 Nkx2.5 프로모터에 의해 EGFP(녹색형광)가 EB상태에서부터 발현되었기 때문에 나타난 결과로 보인다. MLC2v 프로모터-EGFP 발현 hESCs를 사용하여 만든 심근세포는 심근세포 분화 배지에서 10일 이상 배양하면 MLC2v 프로모터에 의해 EGFP(녹색형광)을 발현하는 심근세포가 만들어졌음을 확인할 수 있었고, 심박동 (beating)도 관찰할 수 있었다 (도 4a, 점선 부분).

<5-2> Nkx2.5 프로모터-EGFP와 MLC2v 프로모터-EGFP 동시 발현 세포주를 이용한 프로모터 활성 조사

Nkx2.5 프로모터-EGFP와 MLC2v 프로모터-DsRed 동시 발현 hESCs를 상기 실시예 4의 방법으로 심근세포로 분화시켰다. 이러한 세포주를 이용하여 심근세포로 분화시키면, Nkx2.5 프로모터에 의해 EGFP(녹색형광)을 발현하고, MLC2v 프로모터에 의해 DsRed(적색형광)을 발현하는 심근세포가 만들어지게 된다. 이를 형광현미경으로 관찰하여 확인하였다 (도 4b). 그 결과, EB 형성단계를 포함한 초기 심근세포 분화단계에서부터 Nkx2.5 프로모터-EGFP에 의해 EGFP(녹색형광)이 발현되기 시작하고, EB를 부착 시킨 후 심근세포 분화 배지(Cardiomyocyte differentiation medium; CDM)에서 10일 이상 배양하면 MLC2v 프로모터에 의해 DsRed(적색형광)을 발현하는 심근세포가 만들어졌음을 확인할 수 있었고, 심박동 (beating)도 관찰할 수 있었다 (도 4b, 점선 부분). 이를 통해서, 분화 초기에 있어서 특이적으로 발현되는 Nkx2.5와 분화 후기에 있어서 특이적으로 발현되는 MLC2v 두 마커를 병용마커 및 더블마커로 사용하는 경우, 높은 민감도 및 특이도를 가지고 심근세포로의 분화여부를 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 구체적인 발현 시기 및 분화세포 비율까지 탐지할 수 있음을 확인하였다.

실시예 6. 심근세포 특이적 유전자의 RT-PCR 분석

<6-1> Nkx2.5 프로모터-EGFP 및 MLC2V 프로모터-EGFP 발현 세포주를 이용한 심근세포 특이적 유전자의 RT-PCR 분석

심근세포 특이적 마커 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여, 대조군 hESCs, 이로부터 분화된 인간 심근세포 (hCM, human cardiomyocyte), 그리고 Nkx2.5 프로모터-EGFP 발현 hESCs로부터 분화시킨 인간 심근세포 (hCM-Nkx2.5) 및 MLC2v 프로모터-EGFP 발현 hESCs로부터 분화시킨 인간 심근세포 (hCM-MLC2V)로부터 분리해 낸 전체 RNA 2mg을 주형으로 Superscript kit (Invitrogen)를 이용 42℃, 90분간 반응시켜 역전사(reverse transcription)시켰다. PCR 반응에 사용한 프라이머 세트의 염기서열은 Nkx2.5 센스 프라이머 5'-GGTCTATGAACTGGAGCGGC-3' (서열번호 19) Nkx2.5 안티센스 프라이머 5'-ATAGGCGGGGTAGGCGTTAT-3' (서열번호 20) MLC2A 센스 프라이머 5'-GCTCTTTGGGGAGAAGCTCA-3' (서열번호 21) MLC2A 안티센스 프라이머 5'-CGTCTCCATGGGTGATGATG-3' (서열번호 22) α-MHC 센스 프라이머 5'-GTCATTGCTGAAACCGAGAATG-3' (서열번호 23) α-MHC 안티센스 프라이머 5'-GCAAAGTACTGGATGACACGCT-3' (서열번호 24) β-MHC 센스 프라이머 5'-AGATGGATGCTGACCTGTCC-3' (서열번호 25) β-MHC 안티센스 프라이머 5'- GGTTTTTCCTGTCCTCCTCC-3' (서열번호 26) Isl1 센스 프라이머 5'-GTGGTCTTCTCCGGCTGCTTGTGG-3' (서열번호 27) Isl1 안티센스 프라이머 5'-GGGATCCACTCCACGAAGTA-3' (서열번호 28) Tbx20 센스 프라이머 5'-CTGAGCCACTGATCCCCACCAC-3' (서열번호 29) Tbx20 안티센스 프라이머 5'-CTCAGGATCCACCCCCGAAAAG-3' (서열번호 30) ANP 센스 프라이머 5'-GAACCAGAGGGGAGAGACAGAG-3' (서열번호 31) ANP 안티센스 프라이머 5'-CCCTCAGCTTGCTTTTTAGGAG-3' (서열번호 32) GATA4 센스 프라이머 5'- GGTTCCCAGGCCTCTTGCAATGCGG-3' (서열번호 33) GATA4 안티센스 프라이머 5'-AGTGGCATTGCTGGAGTTACCGCTG-3' (서열번호 34) Mef2c 센스 프라이머 5'-AGATACCCACAACACACCACGCGCC-3' (서열번호 35) Mef2c 안티센스 프라이머 5'-ATCCTTCAGAGAGTCGCATGC-3' (서열번호 36) Oct4 센스 프라이머 이고 5'-GAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTG-3' (서열번호 37) Oct4 안티센스 프라이머 5'-CAGAGGAAAGGACACTGGTCCC-3' (서열번호 38)를 대조군으로 사용한 GAPDH의 증폭은 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3' 및 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3' 를 프라이머로 사용하였다. 본 증폭에 사용한 RT-PCR 반응조건은 94℃에서 5분간 변성(denaturation)을 한 뒤 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초의 PCR 반응을 30번 반복하고, 72℃에서 1분간 중합(polymerization) 반응을 수행하였다. 그 결과, 상기 RT-PCR 산물을 1.5%의 아가로스 젤(agarose gel)에서 전기영동하여, Nkx2.5 프로모터-EGFP 발현 hESCs로부터 분화시킨 인간 심근세포 (hCM-Nkx2.5) 및 MLC2v 프로모터-EGFP 발현 hESCs로부터 분화시킨 인간 심근세포 (hCM-MLC2v)에서 Nkx2.5, MLC2A, α-MHC, β-MHC, Isl1, Tbx20, ANP, GATA4, MEF2C 및 대조군 GAPDH의 발현 여부를 각각 확인 하였다 (도 5a). 본 발명의 방법으로 제조된 세포에서의 상기 분자 마커의 발현을 RT-PCR로 조사한 결과, 대조군 hESCs로부터 분화시킨 인간심근세포와 Nkx2.5 프로모터-EGFP 발현 hESCs로부터 분화시킨 인간 심근세포 (hCM-Nkx2.5) 및 MLC2v 프로모터-EGFP 발현 hESCs로부터 분화시킨 인간 심근세포 (hCM-MLC2v)에서 Nkx2.5, MLC2A, α-MHC, β-MHC, Isl1, Tbx20, ANP, GATA4과 MEF2C 등 심근세포 특이적 마커의 발현이 거의 비슷한 양상으로 발현되고 있음을 확인하였다.

실시예 7. 심근세포의 특이적 단백질의 면역화학(immunocytochemistry) 분석

상기 실시예 4에서 수득된 심근세포(CM)를 0.1% 젤라틴이 코팅된 커버글라스(cover glass)위에 부착시켜 CDM에서 10일 동안 배양한다. 배지를 제거한 후 남아있는 배지 잔여물을 PBS로 세 번 세척하고, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 함유한 PBS로 30분간 고정하였다. PBS로 세 번 세척한 후, 0.1% Triton- X100을 함유한 PBS로 10분간 침투(permeabilization)시키고, 10% NGS (normal goat serum)로 1시간 동안 반응시켜서 블로킹한다. 이후 PBS/0.1%의 BSA/5%의 NGS에 다음과 같은 농도의 항체를 섞어 세포에 처리하고 4℃에서 20시간 동안 반응시켰다. anti-cTnT 항체(R&D, MAB1874, 생쥐 단일클론 IgG)는 1/20로, anti-α-actinin 항체(Sigma, A7811, 생쥐 단일클론 IgG)는 1/200의 농도를 사용하였다. 일차항체 반응이 끝나면 PBS로 세척하고 적당한 이차항체를 세포에 처리하여 상온에서 한 시간 동안 처리하였다. 핵은 DAPI를 사용하여 염색하였다. 모든 반응이 끝나면 마운팅(mounting)하여 형광현미경으로 염색을 확인하고 사진을 찍었다(도 6). 그 결과, 거의 모든 세포에서 심근세포 마커인 cTnT 과 α-actinin 이 발현되고 있음을 확인하였다. 또한 이러한 심근세포 마커가 NKX2.5 프로모터와 MLC2v 프로모터에 의해 각각 발현되는 EGFP(녹색형광)와 동시 발현되고 있음을 확인하였다.

도 1은 Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터의 염기서열을 나타낸 그림이다.

도 2은 Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터를 포함하는 벡터를 도시한 것으로서, 도 2a는 pLenti6-Nkx2.5 프로모터-EGFP 및 pLenti6-MLC2v 프로모터-DsRed 벡터를 도시한 그림이고, 도 2b는 Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터 각각의 다운스트림에 EGFP를 위치하도록 구성한 벡터를 도시한 그림이다.

도 3는 제조된 벡터가 배아줄기세포주에 성공적으로 형질감염 되었는지 여부를 전기영동을 통하여 확인한 결과로서, 도 3a는 Nkx2.5 프로모터-EGFP 및 MLC2v 프로모터-EGFP 각각이 형질감염 되었음을 확인한 사진이고, 도 3b는 Nkx2.5 프로모터-EGFP와 MLC2v 프로모터-EGFP에 의해 동시에 형질감염이 되었음을 확인한 사진이다.

도 4은 배아줄기세포가 심근세포로 분화되어 Nkx2.5 및 MLC2v 프로모터가 활성화되는지 여부를 확인한 사진으로서, 도 4a는 Nkx2.5 및 MLC2v 각각에 대해 시기별로 녹색형광이 발색됨을 확인한 사진이다. 도 4b는 Nkx2.5와 MLC2v에 대해 한 세포주 내에서 초기에는 Nkx2.5에 의한 녹색형광이 발색되고, 후기에는 MLC2v에 의해서 적색형광이 발색됨을 확인한 사진이다.

도 5는 배아줄기세포와 심근세포로 분화가 유도된 세포에서 심근세포 마커 유전자 (Nkx2.5, MLC2A, α-MHC, β-MHC, Isl1, Tbx20, ANP, GATA4, MEF2C) 및 대조군 GAPDH의 발현을 확인한 결과이다. 도 5a는 대조군 배아줄기세포와 그로부터 분화된 심근세포, Nkx2.5-리포터 유전자가 포함된 벡터로 형질감염되어 구축된 배아줄기세포(hES-Nkx2.5)와 그로부터 심근세포로 분화 유도된 세포(hCM-Nkx2.5) 및 MLC2v-리포터 유전자가 포함된 벡터로 형질감염되어 구축된 배아줄기세포(hES-MLC2v)와 그로부터 심근세포로 분화 유도된 세포(hCM-MLC2v) 각각에 대한 심근세포 마커 유전자의 발현을 확인한 사진이다. 도 5b는 대조군 배아줄기세포와 그로부터 분화된 심근세포, Nkx2.5-리포터 유전자와 MLC2v-리포터 유전자가 동시에 포함된 벡터로 형질감염 되어 구축된 배아줄기세포(hES-Nkx2.5+MLC2v)와 그로부터 심근세포로 분화 유도된 세포(hCM-Nkx2.5+MLC2v)에 대한 심근세포 마커 유전자의 발현을 확인한 사진이다.

도 6은 심근세포 특이적 단백질(cTnT 및 a-actinin)의 발현을 면역화학분석법을 통하여 확인한 결과이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Reporter system comprising dual promoter and methods for analyzing the differentiation of embryonic stem cells into cardiac lineage <130> PA090179/KR <160> 38 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of Nkx2.5 <400> 1 gatcacccca cttgccctgc c 21 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of Nkx2.5 <400> 2 gagcgatgag cagtttcg 18 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of MLC2v <400> 3 gccacagtgc cagccttcat gg 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of MLC2v <400> 4 gtggaaagga cccagcactg 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of EGFP gene <400> 5 caccatggtg agcaagggcg ag 22 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of EGFP gene <400> 6 cttgtacagc tcgtccatgc cgag 24 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of DsRed gene <400> 7 caccatggcc tcctccgaga ac 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of DsRed gene <400> 8 caggaacagg tggtggcggc 20 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of Nkx2.5 promoter with EcoRI restriction site <400> 9 gtagaattcg atcaccccac ttgccctg 28 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of Nkx2.5 promoter with BamHI restriction site <400> 10 gatggatccg agcgatgagc agtttcg 27 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of MLC2v promoter with BglII restriction site <400> 11 gatagatctg ccacagtgcc agccttcatg 30 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of MLC2v promoter with SalI restriction site <400> 12 gaagtcgacg tggaaaggac ccagcactg 29 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of neomycin gene for amplification <400> 13 cgcatgattg aacaagatgg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of neomycin gene for amplification <400> 14 atactttctc ggcaggagca 20 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of GAPDH <400> 15 gaaggtgaag gtcggagtc 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of GAPDH <400> 16 gaagatggtg atgggatttc 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of DsRed gene for amplification <400> 17 ccaaggtgta cgtgaagca 19 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of DsRed gene for amplification <400> 18 cccatggtct tcttctgcat 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of Nkx2.5 <400> 19 ggtctatgaa ctggagcggc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of Nkx2.5 <400> 20 ataggcgggg taggcgttat 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of MLC2A <400> 21 gctctttggg gagaagctca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of MLC2A <400> 22 cgtctccatg ggtgatgatg 20 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of alpha-MHC <400> 23 gtcattgctg aaaccgagaa tg 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of alpha-MHC <400> 24 gcaaagtact ggatgacacg ct 22 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of beta-MHC <400> 25 agatggatgc tgacctgtcc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of beta-MHC <400> 26 ggtttttcct gtcctcctcc 20 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of Isl1 <400> 27 gtggtcttct ccggctgctt gtgg 24 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of Isl1 <400> 28 gggatccact ccacgaagta 20 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of Tbx20 <400> 29 ctgagccact gatccccacc ac 22 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of Tbx20 <400> 30 ctcaggatcc acccccgaaa ag 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of ANP <400> 31 gaaccagagg ggagagacag ag 22 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of ANP <400> 32 ccctcagctt gctttttagg ag 22 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of GATA4 <400> 33 ggttcccagg cctcttgcaa tgcgg 25 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of GATA4 <400> 34 agtggcattg ctggagttac cgctg 25 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of Mef2c <400> 35 agatacccac aacacaccac gcgcc 25 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of Mef2c <400> 36 atccttcaga gagtcgcatg c 21 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of Oct4 <400> 37 gagaaggatg tggtccgagt gtg 23 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of Oct4 <400> 38 cagaggaaag gacactggtc cc 22

Claims

Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터의 활성을 측정하는 제제를 포함하는, 배아줄기세포로부터 심근세포로의 분화 초기 및 분화 후기 여부를 탐지하기 위한 프로모터 활성 검출용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 배아줄기세포는 인간 유래인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프로모터 활성을 측정하는 제제는 Nkx2.5 프로모터 및 상기 Nkx2.5 프로모터와 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자, 및 MLC2v 프로모터 및 상기 MLC2v 프로모터와 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 벡터인 조성물.
제3항에 있어서, 상기 Nkx2.5 프로모터 및 상기 Nkx2.5 프로모터와 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자는 도 2a의 개열지도로 표시되는 pLenti6-Nkx2.5-EGFP이고, 상기 MLC2v 프로모터 및 상기 MLC2v 프로모터와 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자는 도 2a의 개열지도로 표시되는 pLenti6-MLC2V-DsRed인 조성물.
제3항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백 질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP), 증강된 남색 형광 단백질(ECFP), DsRed 및 레닐라 루시퍼라제(Renila luciferase)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 배아줄기세포.
Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터의 활성 수준을 확인하여 배아줄기세포로부터 심근세포로의 분화 초기 및 분화 후기 여부를 탐지하는 방법.
제7항에 있어서,

(a) 분화유도물질을 이용하여 배아줄기세포로부터 심근세포로 분화를 유도하는 단계;

(b) 배아줄기세포 및 분화가 유도되었다고 예상되는 줄기세포의 핵산 시료 또는 단백질 시료를 얻는 단계;

(c) 상기 핵산 시료 또는 단백질 시료 중, Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터 다운스트림 유전자의 mRNA 전사량 또는 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및

(d) 상기 단계 (c)의 Nkx2.5 프로모터 다운스트림 유전자만의 전사량 또는 단백질 발현량이 증가되는 경우 배아줄기세포가 심근세포로 분화되는 초기로 판정하고, Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터 다운스트림 유전자 모두의 전사량 또는 단백질 발현량이 증가되는 경우 배아줄기세포가 심근세포로 분화되는 후기로 판정하는 단계를 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 유전자의 전사량은 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 또는 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR)으로 확인하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 다운스트림 유전자는 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP), 증강된 남색 형광 단백질(ECFP), DsRed 및 레닐라 루시퍼라제(Renila luciferase)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 단백질의 발현량을 측정하는 단계는 Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터에 의해 발현되는 다운스트림 유전자의 발색 수준을 배아줄기세포의 단백질 시료에서의 발색 수준과 비교하는 단계를 포함하는 것인 방법.
삭제
(a) 배아줄기세포에 심근세포로의 분화를 조절할 것으로 예상되는 후보 물질을 처리하는 단계;

(b) 배아줄기세포에서 Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터 다운스트림 유전자의 전사 활성 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및

(c) Nkx2.5 프로모터 다운스트림 유전자만의 전사 또는 단백질 발현 정도가 증가되는 경우 상기 후보 물질을 분화 초기 조절 물질로 판정하고, Nkx2.5 프로모터 및 MLC2v 프로모터 다운스트림 유전자 모두의 전사 또는 단백질 발현 정도가 증가되는 경우 상기 후보 물질을 분화 후기 조절 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 배아줄기세포로부터 심근세포로의 분화 초기 또는 후기 조절 물질을 스크리닝하는 방법.