KR102200612B1

KR102200612B1 - 항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마 제거용 dna 구조체

Info

Publication number: KR102200612B1
Application number: KR1020200052865A
Authority: KR
Inventors: 남궁우
Original assignee: 네이처바이오팜(주)
Priority date: 2020-04-29
Filing date: 2020-04-29
Publication date: 2021-02-01
Also published as: WO2021221311A1

Abstract

본 발명은 항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마(teratoma) 제거용 DNA 구조체 및 상기 DNA 구조체를 이용하여 미분화 세포를 제거하여 테라토마 형성을 원천적으로 차단하는 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 분화세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터 및 상기 프로모터에 연결된 항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마 제거용 DNA 구조체 및 상기 DNA 구조체를 이용하여 미분화 세포를 제거하여 테라토마 형성을 차단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 테라토마 형성의 원인이 되는 미분화 줄기세포만을 선택적 사멸함으로써, 분화된 심근세포에는 전혀 영향을 미치지 않으면서 분화세포의 생존능 및 기능은 그대로 유지시킬 수 있으므로, 세포 치료제로 적용 시 종양 형성 가능성을 제거하여 안정성이 확보되는 효과를 나타낸다.

Description

항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마 제거용 DNA 구조체{DNA structure for removing teratoma comprising antibiotic resistance gene}

본 발명은 항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마 제거용 DNA 구조체 및 상기 DNA 구조체를 이용하여 미분화 세포를 제거하여 테라토마(teratoma) 형성을 차단하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 분화세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터 및 상기 프로모터에 연결된 항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마 제거용 DNA 구조체 및 상기 DNA 구조체를 이용하여 미분화 세포를 제거하여 테라토마 형성을 차단하는 방법에 관한 것이다.

배아줄기세포는 배아의 발생과정에서 추출한 세포로서 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 지녔으나 아직 분화되지 않은 세포이다. 이러한 미분화 상태에서 적절한 조건을 맞춰주면 다양한 조직 세포로 분화가 가능하다. 배아줄기세포(Embryonic stem cells, ES cells)는 난자와 정자가 결합하여 수정란이 된 후, 하나의 세포로 시작한 수정란은 세포분열을 통해 여러 개의 세포로 이루어진 배반포가 된다. 배반포의 안쪽에는 내세포괴라고 하는 세포들의 덩어리가 있는데, 이 세포들은 세포분열과 분화를 거쳐 배아를 형성하고, 배아는 임신기간을 거치면서 하나의 개체로 발생하게 된다. 이 과정에서 내세포괴의 세포들이 혈액, 뼈, 피부, 간 등 한 개체에 있는 모든 조직의 세포로 분화하게 된다. 때문에 배아 단계에서 추출한 줄기세포는 뼈, 간, 심장 등 장기로 발전할 수 있는 만능세포라고 불린다. 따라서, 이 내세포괴의 세포를 배반포로부터 분리하여 배양하면 분화는 일어나지 않지만 분화 능력은 여전히 가지는 배아줄기세포가 되는 것이다.

한편, 역분화줄기세포는 분화가 끝난 세포를 분화 이전 단계로 되돌린 세포로써, 완전히 자란 체세포에 역분화 관련 유전자를 주입해 배아줄기세포처럼 세포 생성초기의 만능세포 단계로 되돌려진 세포이다. 역분화줄기세포는 모든 조직으로 발전시킬 수 있는 측면에서 배아줄기세포와 유사하지만 수정란에서 발생하고 있는 배아를 파괴해야만 줄기세포를 얻을 수 있는 기존 배아줄기세포 연구의 윤리적인 문제를 한 번에 해결했다는 점에서 큰 의미를 갖는다. 또한 환자의 체세포를 줄기세포로 전환시키므로 면역 거부 반응 문제가 없는 장점이 있다.

그러나, 역분화줄기세포와 배아줄기세포는 모두 치료제로 활용하는 데에 기형종(테라토마, teratoma)의 발생이라는 공통된 위험이 있다. 이러한 기형종의 발생은 줄기세포의 치료제로서 실용화를 막는 주요 원인이다. 기존에는 기형종의 예방을 위하여 세포분류기(cell sorter)로 기형종의 위험이 있는 미분화된 세포로부터 안전한 단계의 분화된 세포만을 분리하는 방법을 사용하는 방법이 발전하였으나, 기계의 에러률이 있으며 또한 이렇게 분리된 세포는 조직세포로의 착상이 어려운 문제도 있었다.

대한민국 등록특허 10-1588110호

본 발명의 하나의 목적은 분화세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터 및 상기 프로모터에 연결된 항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마(teratoma) 제거용 DNA 구조체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 테라토마(teratoma) 제거용 DNA 구조체가 형질 도입된, 테라토마 형성이 차단된 전능성 줄기세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 DNA 구조체를 전능성 줄기세포에 형질도입하는 단계; (b) 상기 a 단계에서 형질도입된 전능성 줄기세포를 심근세포(cardiomyocyte)로 분화시키는 단계; 및 (c) 상기 b 단계에서 분화시킨 세포에 항생제를 처리하여 미분화 줄기세포만을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는 미분화 세포를 제거하여 테라토마(teratoma) 형성을 원천적으로 제거하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 분화세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터 및 상기 프로모터에 연결된 항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마(teratoma) 제거용 DNA 구조체를 제공한다.

특정 기능적 세포로의 분화 유도 후 잔류된 배아줄기세포로부터의 테라토마(teratoma) 형성은 세포 치료에 있어서 대중화를 막는 가장 중요한 기술적 장벽으로 작용해 왔다.

본 발명은 분화 종료 후 잔존하는 미분화 줄기세포만을 선택적으로 제거할 수 있어서, 분화 종료 후 잔존하는 미분화 줄기세포에 의한 테라토마(teratoma) 형성을 원천적으로 제거할 수 있다.

본 발명에서 DNA 구조체는 테라토마(teratoma) 제거용도로, 분화세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터 및 상기 프로모터에 연결된 항생제 저항성 유전자를 포함한다.

본 발명에서 프로모터는 분화세포에서 특이적으로 발현 또는 활성화되는 것을 특징으로 한다. 구체적으로 상기 프로모터는 심근세포(cardiomyocyte)에서 특이적으로 활성화되는 프로모터일 수 있다.

본 발명에서 상기 심근세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프로모터 일수 있다. 본 발명에서 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프로모터는 Moloney murine 백혈병 바이러스(MoMuLV)에서 유래한 5'-LTR 및 extended packaging signal(MMLTR-EPS)의 프로모터이다.

본 발명의 일 실시예에서 줄기세포의 심근세포로의 분화를 확인하기 위하여 알파 마이오신 헤비체인 유전자(α-myosin heavy chain gene, α-MHC) 프로모터에 의해 구동되는 녹색 형광단백질(EGFP) 유전자를 형질 도입한 경우, 심근세포에서 녹색 형광단백질(EGFP)가 특이적으로 발현하고, 미분화 세포에서 녹색 형광단백질(EGFP)가 발현되지 않음을 확인하였으며(도 3 및 도 4), α-MHC 프로모터에 의해 녹색 형광단백질(EGFP)를 발현하는 영구 줄기세포주에 MMLTR-EPS의 프로모터에 의해 구동되는 DsRed 유전자를 삽입한 후, 형질 도입된 줄기세포에서 형광분석한 결과, α-MHC 프로모터에 의한 녹색 형광단백질(EGFP)과 MMLTR-EPS의 프로모터에 의한 적색(DsRed) 형광이 검출되지 않음을 확인하였다(도 3). 반면 심근세포로 분화시켜 형광 분석한 결과, 심근세포에서 α-MHC 프로모터에 의한 녹색 형광단백질(EGFP)과 MMLTR-EPS의 프로모터에 의한 적색(DsRed) 형광이 모두 검출됨을 확인하였다(도 5).

즉, MMLTR-EPS의 프로모터가 심근세포(cardiomyocyte)에서 특이적으로 발현 또는 활성화 됨을 확인하였다.

본 발명에서 항생제 저항성 유전자는 네오마이신(Neomycin, G418), 푸로마이신(Puromycin) 및 히그로마이신(Hygromycin)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 항생제에 대한 저항성 유전자 일수 있다.

본 발명에서 항생제 유전자는 구체적으로 푸로마이신(Puromycin) 또는 히그로마이신(Hygromycin) 저항성 유전자일 수 있으며, 더욱 구체적으로 서열번호 2의 히그로마이신(Hygromycin) 저항성 유전자 또는 서열번호 3의 푸로마이신(Puromycin) 저항성 유전자일 수 있다. 상기 DNA 구조체는 염색체의 특정 위치에 안정적으로 삽입이 가능하다.

본 발명의 일 실시예에서 유전자를 도입한 세포들 중에서, 게놈(genome)상 DNA(original 세포의 DNA)의 구조유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자 영역에서 도입된 유전자로 인한 영향이 없는 세포(cell)를 유전자 검사로 선별하고, 5회 이상 계대 배양하여 안정적으로 삽입된 형질 도입 세포 주를 확보하였다.

본 발명에서 분화세포는 전능성 줄기세포의 분화를 유도하여 분화된 세포로 구체적으로 심근세포일 수 있다.

본 발명에서 전능성 줄기세포는 배아줄기세포, 역분화줄기세포, 배아생식세포, 배아종양세포 및 성체줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 MMLTR-EPS 프로모터 의존적 Puromycin(항생제) 저항성 유전자 발현용 DNA 구조체를 이용하여 전능성 줄기세포를 분화시킨 심근세포(cardiomyocyte)에 영향을 주지 않고, 테라토마(teratoma)를 유발하는 미분화 줄기세포만을 선택적으로 제거할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 DNA 구조체는 테라토마(teratoma) 제거용으로 활용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로, 상기 테라토마(teratoma) 제거용 DNA 구조체가 형질 도입된, 테라토마 형성이 차단된 전능성 줄기세포를 제공한다.

본 발명에서 DNA 구조체에 관한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 테라토마 형성이 차단된 전능성 줄기세포는 심근세포로 분화시 DNA 구조체의 형질도입에 의해 심근세포 특이적으로 항생제 저항성 유전자를 발현하는 것을 특징으로 한다. 따라서 심근세포 분화 후 항생제를 포함하는 배지로 배양하여 미분화 세포만을 선택적으로 제거할 수 있다.

즉, 본 발명의 전능성 줄기세포는 심근세포 분화 후 항생제를 이용하여 테라토마를 형성의 위험이 있는 미분화 세포를 선택적으로 제거하여 테라토마(teratoma) 형성을 차단 또는 테라토마(teratoma)를 제거하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 항생제 저항성 유전자에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 일 실시예에서 안정적으로 유전자가 도입된 세포를 선별하고자 형질 도입한 세포에서 게놈 유전자를 분리하고, 게놈(genome)상 DNA(original 세포의 DNA)의 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자를 분석하여 상기 10kb 이내 영역에 DNA 구조체에 의해 도입된 유전자가 없는 세포를 선별하였다. 즉, DNA 구조체에 의해 도입된 유전자로 인한 영향이 없는 세포(cell)를 선별하였다.

상기, 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb은 구조유전자의 프로모터 및 인핸서를 포함한다. 바람직하게는 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 2kb 이내의 유전자 영역에서 유전자 분석을 수행하여, 도입 유전자에 의한 영향이 없는 세포를 선별할 수 있다.

아울러 5회 이상의 계대배양을 통하여 안정적으로 세포 주(cell line)를 확보하여 사용하였다.

본 발명에서 구조 유전자(structural gene)는 조절인자가 아닌 다른 RNA나 단백질 산물을 암호화하는 유전자이다.

본 발명의 테라토마 형성이 차단된 전능성 줄기세포는 상기 DNA 구조체가 전능성 줄기세포의 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자 영역에 영향을 주지 않는 것을 특징으로 한다.

즉, 본 발명의 테라토마 형성이 차단된 전능성 줄기세포는 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자 영역에 형질도입한 DNA 구조체 유전자가 삽입되지 않은 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 전능성 줄기세포는 상기 DNA 구조체의 유전자가 인트론(intron) 영역에 삽입된 것일 수 있다. 따라서 줄기세포의 유전자 발현에는 영향을 주지 않으며 안정적으로 DNA 구조체의 유전자가 도입된 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 다른 양태로, (a) 상기 DNA 구조체를 전능성 줄기세포에 형질도입하는 단계; (b) 상기 a 단계에서 형질도입된 전능성 줄기세포를 심근세포(cardiomyocyte)로 분화시키는 단계; 및 (c) 상기 b 단계에서 분화시킨 세포에 항생제를 처리하여 미분화 줄기세포만을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는, 테라토마(teratoma) 형성 차단방법을 제공한다.

본 발명에서 DNA 구조체를 전능성 줄기세포에 형질도입하는 단계는 전능성 줄기세포에 분화세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터 및 상기 프로모터에 연결된 항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마(teratoma) 제거용 DNA 구조체를 형질 도입하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 DNA 구조체에 관한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 분화시키는 단계는 전능성 줄기세포를 화학적 또는 물리적 자극을 이용하여 심근세포를 분화시키는 것을 의미하며, 구체적으로 백혈병억제인자(leukemia inhibitory factor, LIF)가 없는 배지(분화배지)로 배양하여 분화시키는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 제거하는 단계는 네오마이신(Neomycin, G418), 푸로마이신(Puromycin) 및 히그로마이신(Hygromycin)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 항생제를 처리하여 미분화 세포를 선택적으로 제거하는 것으로, 심근세포에서 특이적인 프로모터와 연결된 항생제 저항성 유전자가 발현되어 분화된 심근세포는 항생제의 영향을 받지 않으며, 미분화 세포만 특이적으로 제거(사멸)되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서, 테라토마(teratoma) 형성을 차단하는 방법은 분화 종료 후 잔존하는 미분화 세포가 테라토마(teratoma) 형성을 유도 할 수 있는 바, 분화 종료 후 잔존하는 미분화 세포를 100% 제거하여 테라토마(teratoma) 자체의 형성을 원천적으로 차단하거나 테라토마(teratoma) 자체를 제거할 수 있다.

전술한 실시예에서 안정적으로 유전자가 도입된 세포를 선별하고자 형질 도입한 세포에서 게놈 유전자를 분리하고, 게놈(genome)상 DNA(original 세포의 DNA)의 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자 영역에서 도입된 유전자로 인한 영향이 없는 세포(cell)를 유전자 검사로 선별하였다.

따라서, 본 발명의 테라토마(teratoma) 형성 차단방법은 a 단계 이후 상기 형질 도입된 세포에서 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자 영역의 유전자를 분석하여, 도입된 유전자로 인한 영향이 없는 세포(cell)를 유전자 검사로 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 선별하는 단계는 바람직하게는 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 2kb 이내의 유전자 영역의 유전자를 분석하는 것일 수 있다.

본 발명은 테라토마 형성의 원인이 되는 미분화 줄기세포만을 선택적 사멸함으로써, 분화된 심근세포에는 전혀 영향을 미치지 않으면서 분화세포의 생존능 및 기능은 그대로 유지시킬 수 있으므로, 세포 치료제로 적용 시 종양 형성 가능성을 차단하고, 안정성이 확보되는 효과를 나타낸다.

즉, 본 발명은 전능성 줄기세포를 적당한 환경, 조건과 기간에 따라 무한대로 생산 및 분화시킬 수 있으며, 분화된 시점에서는 약물이 포함된 배지로 전환하여 배양하는 것만으로 미분화된 세포만을 선택적으로 완전히 제거할 수 있다. 미분화된 세포가 완전히 제거되므로 테라토마의 위험으로부터 안전하게 치료제로 사용할 수 있는 효과를 가져온다.

도 1은 심근에서만 특이적으로 발현되는 약 5.4 kb의 알파 마이오신 헤비체인 유전자(α-myosin heavy chain gene, α-MHC) 프로모터를 포함하는 pEGFP-1 재조합 벡터를 배아줄기세포(nkES)에 도입하고 G418로 선별하여 영구세포주를 만드는 과정의 모식도이다.
도 2는 Moloney murine 백혈병 바이러스(MoMuLV)에서 유래한 5'-LTR 및 extended packaging signal (MMLTR-EPS) 약 1.5kb로 구동되는 프로모터를 포함하는 pLIB 벡터를 실시예 1의 배아줄기세포(ES)에 도입하는 과정의 모식도이다.
도 3은 형질 도입한 배아줄기세포의 형광현미경(파장: 488, 580 nm) 사진이다. 복수도 보여주는 사진에서 배아줄기세포(ES)의 형광현미경 사진에는 5.4kb의 α-MHC(alpha myosin heavy chain gene)와 MMLTR-EPS의 프로모터에 기인한 각각의 녹색과 적색이 나타나지 않았다.
도 4는 심근세포(cardiomyocyte)로 분화시킨 세포의 광학 현미경 및 488 nm 파장(녹색)에서의 형광현미경 사진이다. A는 심근세포로 분화된 세포와 미분화의 세포가 공존하는 광학현미경 사진이며, B는 A와 동일한 위치의 형광 현미경 사진이다. C도 역시 다른 배치의 심근세포(cardiomyocyte)로 분화된 세포와 미분화된 세포가 공존하고 있는 광학 현미경이며, D는 C와 동일한 위치의 형광 현미경 사진이다. α-MHC(alpha myosin heavy chain gene)는 심근세포에서만 발현되는 마커로서 세계적으로 인정받는 지표로서, 이에 발현이 의존하는 EGFP(녹색)으로 보이는 세포는 심근세포로 분화된 세포임을 의미하며 녹색이 보이지 않는 세포는 아직 미분화 상태의 세포다.
도 5의 A와 B는 도 4의 C와 D가 각각 동일한 사진이다. 도 5의 A는 심근세포(cardiomyocyte)로 분화시킨 세포의 부분적으로 분화된 심근세포의 광학현미경 사진이며, B는 A와 동일한 위치의 형광 현미경(녹색; 488 nm) 사진이다. C는 A, B와 동일한 위치의형광 현미경(적색; 580 nm)사진이다. D는 B(녹색)와 C(적색)의 형광 현미경 사진을 병합(Merged)한 사진이다. D에서 심근세포(cardiomyocyte)로 분화로 α-MHC 프로모터에 의해 발현된 EGFP(녹색)과 MMLTR-EPS 프로모터에 의해 발현되는 DsRed(적색)이 동일한 위치(세포)에서 발현되어 노란색(녹색+적색)으로 표시됨을 확인하였다.
도 6은 약 1.5kb의 MMLTR-EPS 프로모터에 DsRed(Red) 유전자를 대신하여 푸로마이신(Puromycin) 또는 히그로마이신(Hygromycin) 저항성 유전자를 클로닝하여 제조한 2종의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 7은 약 1.5kb의 MMLTR-EPS 프로모터와 연결된 푸로마이신(Puromycin) 저항성 유전자를 포함하는 DNA 구조체를 형질도입한 배아줄기세포(nkwES)를 심근세포(cardiomyocyte) 분화시키고 푸로마이신(Puromycin) 처리한 후 0일 내지 12일간 미분화 세포의 사멸을 확인한 결과이다.

본 발명은 테라토마의 위험이 되는 이러한 미분화 세포를 제거하여 테라토마 형성을 차단하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 전능성 줄기세포의 게놈(genome) DNA상의 안전한 지역에 분화세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터를 이용하여 선택적으로 항생제 저항성 유전자의 발현을 조절하는 DNA-구조체를 영구적으로 도입함으로써 안전하게 기존의 유전자를 재프로그램하게 되며, 이 세포는 도입된 유전자에 의하여 특정 약물 환경에서 살아남을 수 있는 능력을 보유하게 된다. 이 유전자는 미분화 상태에서는 작동하지 않고 오직 특정 세포로 분화된 상태가 되어야만 발현하도록 설계되어 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 배아줄기세포의 배양 및 알파 마이오신 헤비체인 유전자(α-myosin heavy chain gene, α-MHC) 프로모터와 연결된 EGFP 유전자가 도입된 영구 세포 주 제작

알파 마이오신 헤비체인 유전자(α-myosin heavy chain gene, α-MHC)는 미분화된 세포에서는 휴지상태이며, 오직 심근세포(cardiomyocyte)로 분화된 경우에만 프로모터가 작동한다. 이를 검증하기 위하여 α-MHC(alpha myosinheavychain gene) 프로모터에 의존적인 EGFP(green) DNA 구조체(실시예1-1)로 형질전환된 배아줄기세포를 심근세포를 분화시킨 후, 분화된 심근세포에서 EGFP(green)의 형광 단백질이 생성을 분석하였다(도 4 및 도 5).

분석결과, EGFP(green) 형광 단백질은 심근세포로 분화 되었을 경우에만 발현이 되었으며, 주위에 미분화된 세포에서는 녹색형광(green)이 나타나지 않음을 확인하였다.

1-1. 심근세포에서 특이적으로 프로모터와 연결된 리포터 유전자(녹색 형광단백질, EGFP)가 도입된 DNA 구조체의 제조

알파 마이오신 헤비체인 유전자(α-myosin heavy chain gene, α-MHC)는 분화된 심근세포에서만 특이적으로 활성화되는 유전자이다. 본 발명에서는 심근세포의 분화를 확인하기 위하여 α-MHC 프로모터에 의해 구동되는 녹색 형광단백질(EGFP) 유전자를 가진 DNA 구조체(도 1)를 제작하였다.

알파 마이오신 헤비체인 유전자(α-myosin heavy chain gene) 프로모터(서열번호 4)는 알파 마이오신 헤비체인 유전자(α-myosin heavy chain gene) 프로모터 특이적 전방향 프라이머 (5’-TATGAGCTCGTCCACTCAAACTCTTATGGGGG-3’, 서열번호 5) 및 역방향 프라이머(5’-TTAGTCGACGGATCCTGCAAGGTCACACAAG-3’, 서열번호 6)와 Pfu 효소(DNA 폴리머라아제)를 넣고 PCR(Polymerase chain reaction) 기기로 증폭하였다. 이렇게 증폭된 약 5.4kb(5443bp) α-MHC 프로모터 DNA를 Sac I 및 Sal I 으로 잘라 확인한 후, 이의 단편을 neomycin 저항성 유전자를 포함하는 pEGFP-1 벡터(구조체)에 재조합하여 제작하였다.

또한, Neomycin 저항성 유전자는 G418(단백질 합성의 저해에 의해 강력한 세포독성을 나타내는 아미노배당체계 항생물질의 하나)에 저항성을 가진다.

생쥐의 배아줄기세포 ES-D3(ATCC, CRL-1934)를 주문하여 사용하였다. 줄기세포(ES cell)는 피루베이트, 비필수 아미노산, β-머캅토 에탄올, 10% ES 용 소태아혈청(FBS) 및 백혈병억제인자(leukemia inhibitory factor, LIF) 1000U/㎖ 를 포함하는 DMEM 배지에서 지지세포(feeder cell) 없이 배양하였다.

1-2. DNA 구조체가 형질 도입된 배아줄기세포를 선별

배양된 배아줄기세포를 0.25% 트립신-EDTA를 처리하여 분리하였다. 분리된 세포는 1,000 × g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수확하였다. 이후 PBS(phosphate buffered saline) 완충액으로 재현탁한 후 5분간 원심 분리하여 세포를 수확하였다.

형질 도입을 위해 얼음(0℃)에서 1×10⁷ 세포/㎖로 세포를 다시 PBS 완충액에 현탁하였다. 세포 현탁액 0.5 ㎖를 얼음 위에 놓인 전기천공 큐벳(4mm gap)으로 옮기고, 하기 제조된 DNA 구조체(도 1) 40 μg과 혼합하였다. 그 후 얼음에서 10분간 방치하고 260V, 500 μF로 전기천공(electroporation)을 수행하였다. 그 후, 세포와 DNA를 포함하는 큐벳을 10분 동안 얼음에서 보관하고, 배양용 DMEM 배지를 이용하여 배양하였다.

안정적인 형질도입을 위해 48 시간(약 2세대) 성장시킨 후 G418 (200μg/㎖)를 넣어 배양하였다. 유전자가 도입된 세포는 콜로니를 형성되고 유전자가 도입되지 않은 세포는 G418 처리에 의해 사멸하였다.

2주간 G418이 들어있는 배지에서 살아남은 각각의 콜로니를 96-웰 플레이트로 옮겨 증식시키며, 이후 30 mm 6-웰 플레이트로 옮겨 배양하였다. 최종적으로 100×20 mm 배양 플레이트에 계대 배양하여 형질 도입된 줄기세포를 증식시켰다.

세포 내에 들어간 DNA를 확인하기 위하여 형질 도입된 세포의 게놈(Genomic) DNA를 추출하고 EcoR I으로 잘라 전기영동을 통하여 분리하였다. 겔에 나타난 DNA를 수거하여 PCR을 수행하여 도입된 유전자를 1차 확인하였다.

DNA 구조체 유전자가 도입된 세포에서 유전자 분리 및 크로닝하여 DNA의 서열을 확인하여 genomic DNA에 도입된 지역을 Blast 검색을 수행하여 비교함으로써 안전하게 도입된 세포주를 선별하였다.

구체적으로 유전자를 도입한 세포들 중에서, 게놈(genome)상 DNA(original 세포의 DNA)의 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자를 분석하여 상기 10kb 이내 영역에 DNA 구조체에 의해 도입된 유전자가 없는 세포를 선별하였다. 즉, DNA 구조체에 의해 도입된 유전자로 인한 영향이 없는 세포(cell)를 선별하였다.

아울러 5회 이상의 계대배양을 통하여 독립된 세포 주(cell line)를 확보하여 사용하였다.

이러한 방법으로, 배아줄기세포 내에 “DNA 구조체”가 영구적으로 도입된 배아줄기세포를 선별하여 본 실험에 필요한 세포 주(cell line)를 확립하였다. 이렇게 확립된 세포 주(cell line)를 계대배양을 통하여, α-MHC 프로모터와 연결된 EGFP 도입된 안정적인 배아줄기세포 주(cell line)를 확보하였으며, 하기 실시예 2에서 MMLTR-EPS 프로모터와 연결된 DsRed(Red) 유전자 도입을 위한 세포로 사용하였다.

실시예 2: MMLTR-EPS-프로모터(promoter, 약 1.5kb)와 연결된 DsRed 발현 레트로바이러스-벡터 구조체 제조

MMLTR-EPS 프로모터가 분화된 심근세포(cardiomyocyte)에서 특이적으로 활성화 되는지 확인하고자, 실시예 1에서 확보한 영구 세포 주에 MMLTR-EPS 프로모터와 연결된 DsRed DNA 구조체의 형질 도입하고, 줄기세포(미분화) 및 분화된 심근세포(cardiomyocyte)에서 MMLTR-EPS 프로모터(서열번호 1)에 의한 DsRed의 발현을 분석하였다.

상기 DsRed(빨간색) 형광 단백질이 580 nm의 파장에서 전자들이 들뜬 상태가 되었다가 원상태로 복구 되면서 잃은 에너지가 붉은색의 형광으로 보이는 것을 특징으로 한다.

Moloney 쥐 백혈병 바이러스(murine leukemia virus, MoMuLV)에서 유래한 5'-LTR 및 extended packaging signal(MMLTR-EPS) 프로모터를 포함하는 MLV-based 레트로바이러스 벡터(pLIB 벡터)의 DsRed 유전자를 클로닝 하였다(도 2).

pLIB 벡터(vector)는 와일드 타입(wild type)의 쥐 백혈병바이러스(murine leukemia virus, MLV)의 유전자 구조(provirus type; host genome에 삽입되어 있는 상태)인 5'-LTR, 패키징 시그널(extended packaging signal), DsRed 유전자 및 3’LTR 로 구성되어 있으며, 나머지 바이러스의 단백질(바이러스 캡시드 단백질, 외피, RTase 등)을 발현하는 유전자(gag, pol, env 등)은 EcoPac-293 세포(패키징 세포)에 미리 영구적으로 도입되어 있다. 상기와 같이 바이러스 유전자를 분산함으로써 바이러스(캡시드, capsid)안에는 오직 5'-LTR, extended packaging signal 및 DsRed 유전자만 패키징 되도록 설계하였다.

pLIB 벡터(vector)를 EcoPac-293 패키징 세포 주에 도입하면 EcoPac-293 세포 주에 미리 영구적으로 도입해 놓은 유전자들에 의해 바이러스의 gag, pol, env를 만들기 때문에 감염력 있는 바이러스 입자가 만들어진다.

이렇게 만들어진 바이러스 입자들은 100,000g로 원심분리하여 비리온(virion)을 농축하였으며, 농축된 비리온을 숙주세포(ES 세포)를 감염시키는데 사용하였다.

농축된 비리온으로 숙주세포(ES 세포)을 감염시키는 경우, 5'-LTR, 패키징 시그널(extended packaging signal) 및 DsRed 유전자 부분만을 숙주세포(ES 세포)에 전달되며, 바이러스 자체를 만드는 유전자(gag, pol, env는 바이러스 캡시드 단백질, 외피, RTase 등)는 EcoPac-293 세포에만 남아있기 때문에 바이러스와 감염된 숙주세포(ES 세포)에서는 발현되지 않아 숙주세포에서 제2의 바이러스가 생성되지 않는다.

즉, 본 발명에서 레트로바이러스(retrovirus) 입자(vector 포함)는 바이러스 패키징 세포(virus packaging (producing) cell)에서만 생산되며, 실시예 1에서 획득한 ES-D3 배아줄기세포에서는 만들어지지 않는 것을 특징으로 한다. 그 이유는 타겟 세포(target cell)에서는 LTR에 의해서 LTR(R-U5)-promoter-gene-LTR(U3-R) 의 형태의 viral RNA는 만들어지지만 이 RNA를 패키징(packaging) 할 수 있는 gag, pol, env 단백질이 이 만들어지지 않기 때문이다.

농축된 비리온으로 실시예 1의 세포주를 감염시켜 형질 도입 세포를 제조하고(도 2), 줄기세포 상태와 분화 후 심근세포에서 형광 단백질(EGFP 및 DsRed)의 발현을 분석하였다.

실시예 3: 심근세포 분화 및 미분화 세포의 제거

하기의 실시예 3-2에서, 실시예 2의 바이러스 벡터를 이용하여 줄기세포에 형질 도입한 MMLTR-EPS 프로모터가 심근세포에서 특이적으로 작동함을 확인하였는바, 영구적으로 심근세포 특이적으로 항생제 저항성 유전자를 발현하는 세포주를 제조하기 위해 MMLTR-EPS 프로모터와 연결된 항생제(Puromycin 또는 Hygromycin) 저항성 유전자의 발현용 벡터를 제조하였다(도 6).

3-1. 심근세포에서 특이적으로 프로모터와 연결된 항생제 저항성 유전자가 도입된 DNA 구조체의 제조 및 형질도입

심근세포 특이적인 MMLTR-EPS 프로모터로 작동되는 항생제 저항성 유전자를 발현시키는 DNA 구조체를 제조하였다. 실시예 1에서 사용한 pEGFP 벡터에 녹색 형광단백질(EGFP) 유전자를 대체하여 푸로마이신(Puromycin) 및 히그로마이신(Hygromycin) 저항성 유전자를 삽입하였으며, 알파 마이오신 헤비체인 유전자(α-myosin heavy chain gene, α-MHC) 프로모터를 대신하여 서열번호 1의 MMLTR-EPS의 바이러스 프로모터(1,472bp)를 삽입하였다.

상기 DNA 구조체(벡터)에서 녹색 형광단백질(EGFP) 유전자를 대신하여 항생제 저항성 유전자인 푸로마이신(Puromycin) 저항성 유전자(서열번호 3)를 클로닝하기 위하여 pfu DNA 폴리머라제(Stratagene)와 함께 PCR기를 사용 하였다. 주형 DNA를 먼저 95℃에서 5분 동안 변성 시켰다. 이어서 PCR 반응을 94℃에서 30초 동안, 65℃에서 30초 동안, 및 72℃에서 2분 동안 수행하고 35회 주기로 반복 하였다.

푸로마이신(Puromycin) 저항성 유전자(서열번호 3)를 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였다.

전방향 프라이머(서열번호 7):

5’-GAGCTGTACACTTCTCCACCTTGTCCTATGACCGAGTACAAGCCT ACCGTGCGC-3’

역방향 프라이머(서열번호 8):

5’-GGCGCCAGGTTTTCGTGTCATACACCAGGTTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTG-3’

상기 푸로마이신(Puromycin) 저항성 유전자 특이적 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 증폭한 후 BsrGI과 Not I 사이에 넣어 완성하였다.

또한, 동일 조건으로 히그로마이신(Hygromycin) 저항성 유전자(서열번호 2)를 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였다.

전방향 프라이머(서열번호 9):

5’-GAGCTGTACACTTCTCCACCTTGTCCTATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTG-3’

역방향 프라이머(서열번호 10):

5’-ATTAGCGGCCGCTCTAGATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTG-3’

상기 히그로마이신(Hygromycin) 저항성 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하여 BsrGI과 Not I 사이에 넣어 완성하였다.

각각을 클로닝하여 도 6과 같이 2 종의 DNA 구조체를 제작하였다.

줄기세포에 실시예 1-2과 동일한 조건으로 상기 푸로마이신(Puromycin) 및 히그로마이신(Hygromycin) 저항성 유전자를 포함하는 DNA 구조체를 전기천공(electroporation)을 수행하여 도입하였다. 그 후 유전자를 도입한 세포들 중에서, 게놈(genome)상 DNA(original 세포의 DNA)의 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자 영역에서 도입된 유전자로 인한 영향이 없는 세포(cell)를 유전자 검사로 선별하였다. 아울러 5회 이상의 계대배양을 통하여 독립된 세포 주(cell line)를 확보하여 사용하였다.

상기, 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb은 구조 유전자의 프로모터 및 인핸서를 포함한다. 바람직하게는 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 2kb 이내의 유전자 영역에서 유전자 분석을 수행하여, 도입 유전자에 의한 영향이 없는 세포를 선별할 수 있다.

3-2. 배아줄기세포의 심근세포로의 분화 확인

실시예 1과 2의 DNA 구조체로 형질 도입한 배아줄기세포주를 배양용 배지로 배양한 후, 부유(Suspension) 분화법으로 심근세포로 분화를 유도하고자, 0.25% 트립신 및 0.05% EDTA로 세포를 분리하였다. 분리된 세포를 35 × 10 mm 배양용기에 20 × 10⁴ 세포/㎖의 농도를 접종하여 5일간 부유 배양하였다. 형성된 배아체(embryonic body, EB)를 콜라겐 I으로 코팅한 배양 용기(100 × 20 m, 코닝) Biocoat Collagen I Cellware에서 백혈병억제인자(leukemia inhibitory factor, LIF)가 없는 배지(분화배지)를 사용하여 심근세포로 분화시켰다.

실시예 1의 알파 마이오신 헤비체인 유전자(α-myosin heavy chain gene, α-MHC) 프로모터에 의해 구동되는 녹색 형광단백질(EGFP) 유전자를 형질 도입한 경우, 심근세포에서 녹색 형광단백질(EGFP)가 특이적으로 발현하고, 미분화 세포에서 녹색 형광단백질(EGFP)가 발현되지 않음을 확인하였다(도 3 및 도 4).

또한 α-MHC 프로모터에 의해 녹색 형광단백질(EGFP)를 발현하는 영구 줄기세포주에 MMLTR-EPS의 프로모터에 의해 구동되는 DsRed 유전자를 삽입한 후, 형질 도입된 줄기세포(실시예 2)에서 형광분석한 결과, α-MHC 프로모터에 의한 녹색 형광단백질(EGFP)과 MMLTR-EPS의 프로모터에 의한 적색(DsRed) 형광이 검출되지 않음을 확인하였다(도 3). 반면 심근세포로 분화시킨 형광분석한 결과, 심근세포에서 α-MHC 프로모터에 의한 녹색 형광단백질(EGFP)과 MMLTR-EPS의 프로모터에 의한 적색(DsRed) 형광이 모두 검출됨을 확인하였다(도 5).

특정 유전자의 발현은 내부 프로모터에 의해 유전자가 전사되어 발현된다.

상기 결과를 통해 줄기세포에서는 MMLTR-EPS 프로모터가 작동하지 않으며, 심근세포로 분화하여 MMLTR-EPS 프로모터가 작동하여 DsRed(빨간색) 형광 단백질을 발현됨을 확인하였는바, MMLTR-EPS의 프로모터가 심근세포에서 특이적으로 발현 또는 활성화 됨을 확인하였다.

3-3. 미분화 줄기세포의 제거 확인

심근세포 특이적 항생제(푸로마이신, Puromycin) 저항성 유전자 발현을 통한 미분화 줄기세포의 제거 효과를 확인하고자, MMLTR-EPS 프로모터에 의존적인 항생제 저항성 유전자 발현 DNA 구조체(도 6)로 형질전환된 배아줄기세포 제조하였다. 제조된 세포를 심근세포를 분화시킨 후, Puromycin(1μg/㎖)을 처리하고, 0 내지 12일 동안 미분화 세포의 사멸을 분석하였다.

푸로마이신 처리한 당일(0 일)에는 분화가 진행된 중심부와 그 주위에 많은 수의 미분화 세포들이 관찰된다. 5일이 되면 죽은 세포들이 붙어있는 상태였으나, 미분화된 세포는 사실상 거의 사멸하였고, 12일 이후에도 분화된 세포는 살아있으며 주위의 미분화된 세포들은 완전히 사멸된 것을 확인하였다.

즉, MMLTR-EPS 프로모터 의존적 푸로마이신 저항성 유전자 발현용 DNA 구조체를 이용하여 전능성 줄기세포를 분화시킨 심근세포에 영향을 주지 않고, 테라토마(teratoma)를 유발하는 미분화 줄기세포만을 선택적으로 제거하여 테라토마의 형성을 원천적으로 차단할 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Nature BioPharm. Co., Ltd. <120> DNA structure for removing teratoma comprising antibiotic resistance gene <130> DP20200087 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1472 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMLTR EPS promoter <400> 1 ggtttgaaag accccacccg taggtggcaa gctagcttaa gtaacgccac tttgcaaggc 60 atggaaaaat acataactga gaatagaaaa gttcagatca aggtcaggaa caaagaaaca 120 gctgaatacc aaacaggata tctgtggtaa gcggttcctg ccccggctca gggccaagaa 180 cagatgagac agctgagtga tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc 240 ggctcggggc caagaacaga tggtccccag atgcggtcca gccctcagca gtttctagtg 300 aatcatcaga tgtttccagg gtgccccaag gacctgaaaa tgaccctgta ccttatttga 360 actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tccgctctcc gagctcaata 420 aaagagccca caacccctca ctcggcgcgc cagtcttccg atagactgcg tcgcccgggt 480 acccgtattc ccaataaagc ctcttgctgt ttgcatccga atcgtggtct cgctgttcct 540 tgggagggtc tcctctgagt gattgactac ccacgacggg ggtctttcat ttgggggctc 600 gtccgggatt tggagacccc tgcccaggga ccaccgaccc accaccggga ggtaagctgg 660 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Artificial Sequence <220> <223> Hygromycin resistance gene <400> 2 atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60 agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120 gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180 cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240 ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300 caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 360 gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420 atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480 cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540 ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600 tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660 atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720 tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780 cggctccggg cgtatatgct 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aggggaggtg 4080 gtgtgagacg ctcctgtctc tcctctatct gcccatcggc cctttgggga ggaggaatgt 4140 gcccaaggac taaaaaaagg ccatggagcc agaggggcga gggcaacaga cctttcatgg 4200 gcaaaccttg gggccctgct gtcctcctgt cacctccaga gccaagggat caaaggagga 4260 ggagccagga caggagggaa gtgggaggga gggtcccagc agaggactcc aaatttaggc 4320 agcaggcata tgggatggga tataaagggg ctggagcact gagagctgtc agagatttct 4380 ccaacccagg taagagggag tttcgggtgg gggctcttca cccacaccag acctctcccc 4440 acctagaagg aaactgcctt tcctggaagt ggggttcagg ccggtcagag atctgacagg 4500 gtggccttcc accagcctgg gaagttctca gtggcaggag gtttccacaa gaaacactgg 4560 atgccccttc ccttacgctg tcttctccat cttcctcctg gggatgctcc tccccgtctt 4620 ggtttatctt ggctcttcgt cttcagcaag atttgccctg tgctgtccac tccatctttc 4680 tctactgtct ccgtgccttg ccttgccttc ttgcgtgtcc ttcctttcca cccatttctc 4740 acttcacctt ttctcccctt ctcatttgta ttcatccttc cttccttcct tccttccttc 4800 cttccttcct tccttccttc ctttctccct tccttccttc cttccttcct tccttccttc 4860 cttccttcct gtgtcagagt gctgagaatc acacctgggg ttcccaccct tatgtaaaca 4920 atcttccagt gagccacagc ttcagtgctg ctgggtgctc tcttaccttc ctcaccccct 4980 ggcttgtcct gttccatcct ggtcaggatc tctagattgg tctcccagcc tctgctactc 5040 ctcttcctgc ctgttcctct ctctgtccag ctgcgccact gtggtgcctc gttccagctg 5100 tggtccacat tcttcaggat tctctgaaaa gttaaccagg tgagaatgtt tcccctgtag 5160 acagcagatc acgattctcc cggaagtcag gcttccagcc ctctctttct ctgcccagct 5220 gcccggcact cttagcaaac ctcaggcacc cttaccccac atagacctct gacagagaag 5280 caggcacttt acatggagtc ctggtgggag agccataggc tacggtgtaa aagaggcagg 5340 gaagtggtgg tgtaggaaag tcaggacttc acatagaagc ctagcccaca ccagaaatga 5400 cagacagatc cctcctatct cccccataag agtttgagtc gac 5443 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha myosin heavy chain gene promoter forward primer <400> 5 tatgagctcg tccactcaaa ctcttatggg gg 32 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha myosin heavy chain gene promoter reverse primer <400> 6 ttagtcgacg gatcctgcaa ggtcacacaa g 31 <210> 7 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Puromycin resistance gene forward primer <400> 7 gagctgtaca cttctccacc ttgtcctatg accgagtaca agcctaccgt gcgc 54 <210> 8 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Puromycin resistance gene reverse primer <400> 8 ggcgccaggt tttcgtgtca tacaccaggt tcctttgccc tcggacgagt gctg 54 <210> 9 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hygromycin resistance gene forward primer <400> 9 gagctgtaca cttctccacc ttgtcctatg aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctg 58 <210> 10 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hygromycin resistance gene reverse primer <400> 10 attagcggcc gctctagatt cctttgccct cggacgagtg ctg 43

Claims

심근세포(cardiomyocyte)에 특이적으로 활성화되는 서열번호 1의 MMLTR-EPS 프로모터 및 상기 프로모터에 연결된 항생제 저항성 유전자를 포함하는, 테라토마(teratoma) 제거용 DNA 구조체.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 항생제는 네오마이신(Neomycin, G418), 푸로마이신(Puromycin) 및 히그로마이신(Hygromycin)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, DNA 구조체.
제 1항 또는 제 3항의 테라토마(teratoma) 제거용 DNA 구조체가 형질 도입된, 테라토마 형성이 차단된 전능성 줄기세포.
제 4항에 있어서,
상기 DNA 구조체는 전능성 줄기세포의 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자 영역에 영향을 주지 않는 것을 특징으로 하는, 테라토마 형성이 차단된 전능성 줄기세포.
(a) 제1항 또는 제3항의 DNA 구조체를 전능성 줄기세포에 형질도입하는 단계;
(b) 상기 a 단계에서 형질도입된 전능성 줄기세포를 심근세포(cardiomyocyte)로 분화시키는 단계; 및
(c) 상기 b 단계에서 분화시킨 세포에 항생제를 처리하여 미분화 줄기세포만을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는,
테라토마(teratoma) 형성 차단방법.
제 6항에 있어서,
상기 전능성 줄기세포는 배아줄기세포, 역분화줄기세포, 배아생식세포, 배아종양세포 및 성체줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서,
상기 항생제는 네오마이신(Neomycin, G418), 푸로마이신(Puromycin) 및 히그로마이신(Hygromycin)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서,
상기 미분화 줄기세포는 분화 유도에 의해 분화되지 않은 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서,
a 단계 이후 상기 형질 도입된 세포에서 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자 영역의 유전자를 분석하여, 도입된 유전자로 인한 영향이 없는 세포(cell)를 유전자 검사로 선별하는 단계를 더 포함하는 방법.