WO2021221311A1 - 항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마 제거용 dna 구조체 - Google Patents

항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마 제거용 dna 구조체 Download PDF

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남궁우
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네이처바이오팜(주)
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    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a teratoma removal DNA construct including an antibiotic resistance gene and a method for blocking teratoma formation by removing undifferentiated cells using the DNA construct. More specifically, the present invention provides a teratoma removal DNA construct comprising a promoter specifically activated in differentiated cells and an antibiotic resistance gene linked to the promoter, and by removing undifferentiated cells using the DNA construct to block teratoma formation it's about how
  • Embryonic stem cells are cells extracted during embryonic development and have the ability to differentiate into cells of all tissues, but are not yet differentiated. In this undifferentiated state, if appropriate conditions are met, differentiation into various tissue cells is possible.
  • Embryonic stem cells combine with an egg and sperm to become a fertilized egg, and then the fertilized egg, which starts as a single cell, becomes a blastocyst composed of several cells through cell division. Inside the blastocyst, there is a mass of cells called the inner cell mass. These cells undergo cell division and differentiation to form an embryo, and the embryo develops as a single individual through the gestation period.
  • the cells of the inner cell mass are differentiated into cells of all tissues in an individual, such as blood, bone, skin, and liver. Therefore, stem cells extracted at the embryonic stage are called pluripotent cells that can develop into organs such as bones, liver, and heart. Therefore, when the cells of this inner cell mass are separated from the blastocyst and cultured, differentiation does not occur, but it becomes an embryonic stem cell which still has differentiation ability.
  • retrodifferentiated stem cells are cells that return cells that have been differentiated to their pre-differentiation stage. They are cells that have been restored to the pluripotent cell stage in the early stage of cell generation like embryonic stem cells by injecting dedifferentiation-related genes into fully grown somatic cells. Irdifferentiated stem cells are similar to embryonic stem cells in that they can be developed into any tissue, but they have solved the ethical problem of existing embryonic stem cell research in which stem cells can be obtained only by destroying the embryo that is occurring in a fertilized egg. It is of great significance in that In addition, since the patient's somatic cells are converted into stem cells, there is no problem of immune rejection.
  • both dedifferentiated stem cells and embryonic stem cells are used as therapeutic agents, but there is a common risk of the occurrence of teratoma.
  • the occurrence of these teratomas is a major cause of preventing the commercialization of stem cells as therapeutic agents.
  • Conventionally, for the prevention of teratoma a method of separating only differentiated cells at a safe stage from undifferentiated cells at risk of teratoma with a cell sorter has been developed, but there is a mechanical error rate and also The isolated cells also had a problem in that implantation into tissue cells was difficult.
  • One object of the present invention is to provide a teratoma removal DNA construct comprising a promoter specifically activated in differentiated cells and an antibiotic resistance gene linked to the promoter.
  • Another object of the present invention is to provide a totipotent stem cell in which the teratoma removal DNA construct is transduced, teratoma formation is blocked.
  • Another object of the present invention comprises the steps of (a) transducing the DNA construct into totipotent stem cells; (b) differentiating the totipotent stem cells transduced in step a into cardiomyocytes; And (c) treating the cells differentiated in step b with antibiotics to selectively remove only undifferentiated stem cells to provide a method for fundamentally eliminating teratoma formation by removing undifferentiated cells.
  • Another object of the present invention comprises the steps of (a) transducing the DNA construct into totipotent stem cells; (b) differentiating the totipotent stem cells transduced in step a into cardiomyocytes; And (c) treating the cells differentiated in step b with antibiotics to selectively remove only undifferentiated stem cells, providing a method for producing pluripotent stem cells capable of blocking teratoma formation will do
  • the present invention provides a teratoma removal DNA construct comprising a promoter specifically activated in differentiated cells and an antibiotic resistance gene linked to the promoter.
  • the differentiated cell is a cardiomyocyte, and the promoter may be the MMLTR-EPS promoter of SEQ ID NO: 1 that is specifically activated in cardiomyocytes.
  • the antibiotic may be one or more selected from the group consisting of neomycin (Neomycin, G418), puromycin (Puromycin) and hygromycin (Hygromycin).
  • the present invention provides a teratoma-removing DNA construct transduced with, teratoma formation-blocked totipotent stem cells.
  • the DNA construct may not affect the structural gene of the totipotent stem cell and the gene region within 10 kb of the upstream or 5'-flanking region based on the start codon (1+) of the structural gene. have.
  • the present invention comprises the steps of (a) transducing the DNA construct into totipotent stem cells; (b) differentiating the totipotent stem cells transduced in step a into cardiomyocytes; And (c) treating the cells differentiated in step b with an antibiotic to selectively remove only undifferentiated stem cells, providing a method for blocking teratoma formation.
  • the totipotent stem cells may be at least one selected from the group consisting of embryonic stem cells, dedifferentiated stem cells, embryonic germ cells, embryonic tumor cells, and adult stem cells.
  • the antibiotic may be one or more selected from the group consisting of neomycin (Neomycin, G418), puromycin (Puromycin) and hygromycin (Hygromycin).
  • the undifferentiated stem cells may be cells that are not differentiated by differentiation induction.
  • the method may further include selecting cells that are not affected by the introduced gene by genetic testing.
  • the present invention comprises the steps of (a) transducing the DNA construct into totipotent stem cells; (b) differentiating the totipotent stem cells transduced in step a into cardiomyocytes; And (c) treating the cells differentiated in step b with antibiotics to selectively remove only undifferentiated stem cells, providing a method for producing pluripotent stem cells capable of blocking teratoma formation do.
  • the present invention selectively kills only undifferentiated stem cells that cause teratoma formation, so that the viability and function of differentiated cells can be maintained without affecting the differentiated cardiomyocytes at all. It shows the effect of blocking and securing stability.
  • the present invention can produce and differentiate totipotent stem cells indefinitely according to the appropriate environment, conditions and period, and at the time of differentiation, only undifferentiated cells are selectively and completely removed only by converting to a medium containing a drug and culturing. can do. Because undifferentiated cells are completely removed, it has the effect of being safe from the risk of teratoma and using it as a therapeutic agent.
  • ⁇ -MHC ⁇ -myosin heavy chain gene
  • Figure 2 is a pLIB vector containing a promoter driven by 5'-LTR and extended packaging signal (MMLTR-EPS) about 1.5 kb derived from Moloney murine leukemia virus (MoMuLV) in embryonic stem cells (ES) of Example 1. It is a schematic diagram of the introduction process.
  • MMLTR-EPS extended packaging signal
  • FIG. 3 is a fluorescence microscope (wavelength: 488, 580 nm) photograph of the transduced embryonic stem cells.
  • ES embryonic stem cells
  • FIG. 4 is an optical microscope and a fluorescence microscope photograph at a wavelength of 488 nm (green) of cells differentiated into cardiomyocytes.
  • A is an optical micrograph of cells differentiated into cardiomyocytes and undifferentiated cells coexist, and B is a fluorescence micrograph of the same position as A.
  • C is also an optical microscope in which cells differentiated into cardiomyocytes of different batches and undifferentiated cells coexist, and D is a fluorescence micrograph of the same position as in C.
  • FIG. ⁇ -MHC alpha myosin heavy chain gene
  • EGFP green
  • Non-differentiated cells are still undifferentiated cells.
  • FIG. 5A is an optical micrograph of partially differentiated cardiomyocytes of cells differentiated into cardiomyocytes
  • B is a fluorescence microscopy (green; 488 nm) photograph of the same position as A.
  • FIG. C is a fluorescence microscope (red; 580 nm) photograph of the same position as A and B.
  • D is a merged photo of the fluorescence micrographs of B (green) and C (red).
  • EGFP green expressed by the ⁇ -MHC promoter
  • DsRed red expressed by the MMLTR-EPS promoter by differentiation into cardiomyocytes in D are expressed at the same location (cell) and yellow (green + red) It was confirmed that it is displayed as .
  • FIG. 6 shows two recombinant vectors prepared by cloning a puromycin or hygromycin resistance gene in place of the DsRed (Red) gene in the MMLTR-EPS promoter of about 1.5 kb.
  • nkwES 7 is an embryonic stem cell (nkwES) transduced with a DNA construct containing a puromycin resistance gene linked to an MMLTR-EPS promoter of about 1.5 kb to cardiomyocyte differentiation and puromycin (Puromycin) treatment. It is the result of confirming the death of undifferentiated cells from 0 to 12 days after.
  • the present invention relates to a method for blocking teratoma formation by removing these undifferentiated cells that are a risk of teratoma. More specifically, by permanently introducing a DNA-structure that selectively regulates the expression of antibiotic resistance genes using a promoter that is specifically activated in differentiated cells into a safe region on the genome DNA of totipotent stem cells, The gene is reprogrammed, and the cell retains the ability to survive in a specific drug environment by means of the introduced gene. This gene does not work in an undifferentiated state, but is designed to be expressed only when it is differentiated into a specific cell.
  • the present invention provides a teratoma removal DNA construct comprising a promoter specifically activated in differentiated cells and an antibiotic resistance gene linked to the promoter.
  • the present invention can selectively remove only the undifferentiated stem cells remaining after the end of differentiation, so that teratoma formation by the undifferentiated stem cells remaining after the end of differentiation can be fundamentally eliminated.
  • the DNA construct includes a promoter specifically activated in differentiated cells and an antibiotic resistance gene linked to the promoter for the purpose of removing teratoma.
  • the promoter is characterized in that it is specifically expressed or activated in differentiated cells.
  • the promoter may be a promoter that is specifically activated in cardiomyocytes.
  • the promoter specifically activated in the cardiomyocyte may be a promoter consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the promoter consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is a promoter of 5'-LTR and extended packaging signal (MMLTR-EPS) derived from Moloney murine leukemia virus (MoMuLV).
  • the green fluorescent protein (EGFP) gene driven by the ⁇ -myosin heavy chain gene ( ⁇ -MHC) promoter When transduced, it was confirmed that green fluorescent protein (EGFP) was specifically expressed in cardiomyocytes and that green fluorescent protein (EGFP) was not expressed in undifferentiated cells ( FIGS. 3 and 4 ), and the ⁇ -MHC promoter After inserting the DsRed gene driven by the MMLTR-EPS promoter into a permanent stem cell line expressing green fluorescent protein (EGFP) by It was confirmed that red (DsRed) fluorescence by the promoters of (EGFP) and MMLTR-EPS was not detected (FIG. 3).
  • ⁇ -MHC ⁇ -myosin heavy chain gene
  • the antibiotic resistance gene may be a resistance gene against one or more antibiotics selected from the group consisting of neomycin (Neomycin, G418), puromycin, and hygromycin.
  • the antibiotic gene may specifically be a puromycin or hygromycin resistance gene, and more specifically, a hygromycin resistance gene of SEQ ID NO: 2 or puromycin of SEQ ID NO: 3 ) may be a resistance gene.
  • the DNA construct can be stably inserted into a specific position of a chromosome.
  • the upstream region (structural gene) of the genome (DNA of the original cell) and the start codon (1+) of the structural gene are selected by genetic test and subcultured 5 or more times to secure a stably inserted transduced cell line did.
  • the differentiated cell is a cell differentiated by inducing the differentiation of totipotent stem cells, and specifically, may be a cardiomyocyte.
  • the totipotent stem cells may be one or more selected from the group consisting of embryonic stem cells, dedifferentiated stem cells, embryonic germ cells, embryonic tumor cells, and adult stem cells.
  • the MMLTR-EPS promoter-dependent Puromycin (antibiotic) resistance gene expression DNA construct is used to induce teratoma without affecting cardiomyocytes differentiated from totipotent stem cells. It was confirmed that only stem cells can be selectively removed. Therefore, the DNA construct of the present invention can be utilized for teratoma removal.
  • a teratoma-removing DNA construct transduced with, teratoma formation-blocked totipotent stem cells.
  • the present invention comprises the steps of (a) transducing the DNA construct into totipotent stem cells; (b) differentiating the totipotent stem cells transduced in step a into cardiomyocytes; And (c) treating the cells differentiated in step b with antibiotics to selectively remove only undifferentiated stem cells, providing a method for producing pluripotent stem cells capable of blocking teratoma formation do.
  • the teratoma formation-blocked totipotent stem cells of the present invention are characterized in that they express an antibiotic resistance gene specifically in cardiomyocytes by transduction of a DNA construct upon differentiation into cardiomyocytes. Therefore, only undifferentiated cells can be selectively removed by culturing in a medium containing antibiotics after differentiation of cardiomyocytes.
  • the totipotent stem cells of the present invention block teratoma formation or remove teratoma by selectively removing undifferentiated cells that are at risk of teratoma formation using antibiotics after cardiomyocyte differentiation. .
  • a genomic gene is separated from the transduced cells, and a structural gene and a structural gene of DNA in the genome (DNA of the original cell)
  • a structural gene and a structural gene of DNA in the genome DNA of the original cell
  • the 10 kb of the upstream region includes the promoter and enhancer of the structural gene.
  • genetic analysis is performed in the gene region within 2 kb of the upstream or 5'-flanking region based on the start codon (1+) of the structural gene to select cells that are not affected by the transgene.
  • cell lines were stably secured and used through subcultures of 5 or more times.
  • a structural gene is a gene encoding an RNA or protein product other than a regulatory factor.
  • the teratoma formation-blocked totipotent stem cell of the present invention has the DNA construct upstream or 5'-flanking region based on the structural gene of the totipotent stem cell and the start codon (1+) of the structural gene. It is characterized in that it does not affect the gene region within 10 kb of
  • the totipotent stem cell in which teratoma formation of the present invention is blocked is a structural gene and a gene region within 10 kb of an upstream or 5'-flanking region based on the start codon (1+) of the structural gene. It is characterized in that the transduced DNA construct gene is not inserted.
  • the totipotent stem cell may be one in which the gene of the DNA construct is inserted into an intron region. Therefore, it may be a stem cell into which the gene of the DNA construct is stably introduced without affecting the gene expression of the stem cell.
  • step b transducing the DNA construct into totipotent stem cells;
  • step a differentiating the totipotent stem cells transduced in step a into cardiomyocytes;
  • step b treating the cells differentiated in step b with an antibiotic to selectively remove only undifferentiated stem cells, providing a method for blocking teratoma formation.
  • the step of transducing the DNA construct into the totipotent stem cells is a teratoma removal DNA construct comprising a promoter specifically activated in differentiated cells and an antibiotic resistance gene linked to the promoter into the totipotent stem cells. characterized in that
  • Differentiation in the present invention refers to differentiating the totipotent stem cells into cardiomyocytes using a chemical or physical stimulus, specifically culturing in a medium (differentiation medium) without leukemia inhibitory factor (LIF) to differentiate may be, but is not limited thereto.
  • a medium differentiate medium
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • the removing step in the present invention is to selectively remove undifferentiated cells by treating one or more antibiotics selected from the group consisting of neomycin (Neomycin, G418), puromycin and hygromycin, myocardial Cardiomyocytes differentiated by the expression of an antibiotic resistance gene linked to a specific promoter in the cell are not affected by antibiotics, and only undifferentiated cells are specifically removed (dead).
  • antibiotics selected from the group consisting of neomycin (Neomycin, G418), puromycin and hygromycin
  • myocardial Cardiomyocytes differentiated by the expression of an antibiotic resistance gene linked to a specific promoter in the cell are not affected by antibiotics, and only undifferentiated cells are specifically removed (dead).
  • the undifferentiated cells remaining after the end of differentiation can induce teratoma formation. It is possible to fundamentally block the formation of itself or to remove the teratoma itself.
  • a genomic gene is separated from the transduced cells, and the structural gene of the DNA (DNA of the original cell) in the genome and the start of the structural gene Based on the codon (1+), cells that are not affected by the gene introduced in the gene region within 10 kb of the upstream or 5'-flanking region were selected by genetic test.
  • cell lines were stably secured and used through subcultures of 5 or more times.
  • the 10 kb of the upstream region includes the promoter and enhancer of the structural gene.
  • genetic analysis is performed in the gene region within 2 kb of the upstream or 5'-flanking region based on the start codon (1+) of the structural gene to select cells that are not affected by the transgene.
  • the teratoma formation blocking method of the present invention is a structural gene (structural gene) and an upstream region (upstream or 5'-flanking) based on the start codon (1+) of the structural gene in the transduced cell after step a.
  • the method may further include analyzing a gene of a gene region within 10 kb of the region), and selecting cells that are not affected by the introduced gene by a genetic test.
  • the step of selecting is to analyze the gene of the gene region within 2 kb of the upstream or 5'-flanking region based on the structural gene and the start codon (1+) of the structural gene.
  • Example 1 Culturing of embryonic stem cells and construction of a permanent cell line into which the EGFP gene linked to the ⁇ -myosin heavy chain gene ( ⁇ -MHC) promoter is introduced
  • the alpha myosin heavy chain gene ( ⁇ -myosin heavy chain gene, ⁇ -MHC) is in a resting state in undifferentiated cells, and the promoter operates only when differentiated into cardiomyocytes.
  • the embryonic stem cells transformed with the EGFP (green) DNA construct (Example 1-1) dependent on the ⁇ -MHC (alpha myosinheavychain gene) promoter were differentiated into cardiomyocytes, and then EGFP in the differentiated cardiomyocytes.
  • the production of (green) fluorescent protein was analyzed ( FIGS. 4 and 5 ).
  • Alpha myosin heavy chain gene ( ⁇ -myosin heavy chain gene, ⁇ -MHC) is a gene that is specifically activated only in differentiated cardiomyocytes.
  • a DNA construct (FIG. 1) having a green fluorescent protein (EGFP) gene driven by the ⁇ -MHC promoter was prepared to confirm the differentiation of cardiomyocytes.
  • EGFP green fluorescent protein
  • Alpha myosin heavy chain gene ( ⁇ -myosin heavy chain gene) promoter (SEQ ID NO: 4) is alpha myosin heavy chain gene ( ⁇ -myosin heavy chain gene) promoter-specific forward primer (5'-TATGAGCTCGTCCACTCAAACTCTTATGGGGG-3', SEQ ID NO: 5) and reverse primer (5'-TTAGTCGACGGATCCTGCAAGGTCACACAAG-3', SEQ ID NO: 6) and Pfu enzyme (DNA polymerase) were added and amplified with a PCR (Polymerase chain reaction) device.
  • PCR Polymerase chain reaction
  • Neomycin resistance gene has resistance to G418 (an aminoglycoside antibiotic that exhibits strong cytotoxicity by inhibiting protein synthesis).
  • ES-D3 Mouse embryonic stem cells ES-D3 (ATCC, CRL-1934) were ordered and used. Stem cells (ES cells) in DMEM medium containing pyruvate, non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, 10% ES for fetal bovine serum (FBS) and leukemia inhibitory factor (LIF) 1000 U / ml Cultured without feeder cells.
  • FBS fetal bovine serum
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • Cultured embryonic stem cells were separated by treatment with 0.25% trypsin-EDTA. The separated cells were harvested by centrifugation at 1,000 ⁇ g, 4°C for 5 minutes. Thereafter, the cells were harvested by centrifugation for 5 minutes after resuspending in PBS (phosphate buffered saline) buffer.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the cells were resuspended in PBS buffer at 1 ⁇ 10 7 cells/ml on ice (0° C.). 0.5 ml of the cell suspension was transferred to an electroporation cuvette (4 mm gap) placed on ice, and mixed with 40 ⁇ g of the DNA construct prepared below (Fig. 1). After that, it was left on ice for 10 minutes and electroporation was performed at 260V and 500 ⁇ F. Thereafter, the cuvette containing the cells and DNA was kept on ice for 10 minutes, and cultured using DMEM medium for culture.
  • G418 200 ⁇ g/ml was added and cultured. Cells into which the gene was introduced formed colonies, and cells to which the gene was not introduced were killed by G418 treatment.
  • Each colony surviving in the G418-containing medium for 2 weeks was transferred to a 96-well plate for growth, and then transferred to a 30 mm 6-well plate for incubation. Finally, the transduced stem cells were proliferated by subculture in a 100 ⁇ 20 mm culture plate.
  • the genomic DNA of the transduced cell was extracted, cut with EcoRI, and separated through electrophoresis.
  • the DNA shown on the gel was collected and PCR was performed to first confirm the introduced gene.
  • Cell lines introduced safely were selected by performing a blast search and comparing the regions introduced into the genomic DNA by identifying the DNA sequence by isolating and cloning the DNA from the cells into which the DNA construct gene was introduced.
  • the upstream region (upstream or 5'- By analyzing the gene within 10 kb of the flanking region), cells having no gene introduced by the DNA construct into the region within 10 kb were selected. That is, cells having no effect due to the gene introduced by the DNA construct were selected.
  • the 10 kb of the upstream region includes the promoter and enhancer of the structural gene.
  • genetic analysis is performed in the gene region within 2 kb of the upstream or 5'-flanking region based on the start codon (1+) of the structural gene to select cells that are not affected by the transgene.
  • an independent cell line was obtained and used through subculture of 5 or more times.
  • embryonic stem cells into which the “DNA construct” has been permanently introduced into the embryonic stem cells were selected to establish a cell line necessary for this experiment.
  • a stable embryonic stem cell line into which EGFP linked to the ⁇ -MHC promoter was introduced was secured, and in Example 2 below, DsRed linked to the MMLTR-EPS promoter ( Red) Cells for gene transduction were used.
  • Example 2 MMLTR-EPS-promoter (promoter, about 1.5 kb) linked to DsRed expression retrovirus-vector construct construction
  • the DsRed (red) fluorescent protein is characterized in that the electrons are excited at a wavelength of 580 nm and then lost energy as they are restored to their original state appears as red fluorescence.
  • the DsRed gene of an MLV-based retroviral vector (pLIB vector) containing 5'-LTR and extended packaging signal (MMLTR-EPS) promoters derived from Moloney murine leukemia virus (MoMuLV) was cloned (FIG. 2). ).
  • pLIB vector is a gene structure (provirus type; inserted into the host genome) of a wild type murine leukemia virus (MLV) 5'-LTR, packaging signal (extended packaging signal) ), DsRed gene and 3'LTR, and genes (gag, pol, env, etc.) expressing the remaining virus proteins (virus capsid protein, envelope, RTase, etc.) permanently introduced.
  • the virus gag, pol, and env are made by the genes permanently introduced into the EcoPac-293 cell line in advance, thereby creating infectious virus particles.
  • the virus particles thus made were centrifuged at 100,000 g to concentrate virions, and the concentrated virions were used to infect host cells (ES cells).
  • ES cell When infecting a host cell (ES cell) with a concentrated virion, only the 5'-LTR, extended packaging signal, and DsRed gene part are delivered to the host cell (ES cell), and the gene (gag) that makes the virus itself , pol, and env (viral capsid protein, envelope, RTase, etc.) remain only in EcoPac-293 cells, so they are not expressed in virus and infected host cells (ES cells), so that a second virus is not produced in the host cells.
  • the gene (gag) that makes the virus itself , pol, and env viral capsid protein, envelope, RTase, etc.
  • retrovirus particles are produced only in virus packaging (producing) cells, and are not produced in the ES-D3 embryonic stem cells obtained in Example 1. do.
  • viral RNA in the form of LTR(R-U5)-promoter-gene-LTR(U3-R) is produced by LTR, but gag, which can package this RNA, This is because the pol and env proteins are not made.
  • Transduced cells were prepared by infecting the cell line of Example 1 with concentrated virions (FIG. 2), and the expression of fluorescent proteins (EGFP and DsRed) in cardiomyocytes after stem cell status and differentiation was analyzed.
  • FOG. 2 concentrated virions
  • EGFP and DsRed fluorescent proteins
  • Example 3 Cardiomyocyte differentiation and removal of undifferentiated cells
  • Example 3-2 it was confirmed that the MMLTR-EPS promoter transduced into stem cells using the viral vector of Example 2 works specifically in cardiomyocytes.
  • a vector for expression of the antibiotic (Puromycin or Hygromycin) resistance gene linked to the MMLTR-EPS promoter was prepared ( FIG. 6 ).
  • a DNA construct expressing an antibiotic resistance gene operated by a cardiomyocyte-specific MMLTR-EPS promoter was prepared. Puromycin (Puromycin) and hygromycin (Hygromycin) resistance genes were inserted by replacing the green fluorescent protein (EGFP) gene in the pEGFP vector used in Example 1, alpha myosin heavy chain gene ( ⁇ -myosin heavy chain gene, The viral promoter (1,472 bp) of MMLTR-EPS of SEQ ID NO: 1 was inserted instead of the ⁇ -MHC) promoter.
  • Puromycin Puromycin
  • Hygromycin hygromycin resistance genes
  • EGFP green fluorescent protein
  • alpha myosin heavy chain gene alpha myosin heavy chain gene
  • the viral promoter (1,472 bp) of MMLTR-EPS of SEQ ID NO: 1 was inserted instead of the ⁇ -MHC) promoter.
  • a PCR machine was used together with pfu DNA polymerase (Stratagene) to clone the antibiotic resistance gene, Puromycin resistance gene (SEQ ID NO: 3), instead of the green fluorescent protein (EGFP) gene in the DNA construct (vector). .
  • the template DNA was first denatured at 95°C for 5 minutes.
  • the PCR reaction was then performed at 94° C. for 30 seconds, 65° C. for 30 seconds, and 72° C. for 2 minutes and repeated for 35 cycles.
  • Puromycin (Puromycin) resistance gene (SEQ ID NO: 3) was amplified using the primer set of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • Reverse primer (SEQ ID NO: 8):
  • the hygromycin resistance gene (SEQ ID NO: 2) was amplified using the primer sets of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10.
  • Reverse primer (SEQ ID NO: 10):
  • the hygromycin (Hygromycin) resistance gene-specific primer was used to amplify by PCR, and was completed by putting it between BsrGI and Not I.
  • the DNA construct containing the Puromycin and Hygromycin resistance genes was introduced into the stem cells by electroporation under the same conditions as in Example 1-2. After that, among the cells into which the gene was introduced, the upstream region (upstream or 5'- Cells that were not affected by the gene introduced in the gene region within 10 kb of the flanking region were selected by genetic testing. In addition, an independent cell line (cell line) was obtained and used through subcultures 5 or more times.
  • 10 kb of the upstream region includes the promoter and enhancer of the structural gene.
  • genetic analysis is performed in the gene region within 2 kb of the upstream or 5'-flanking region based on the start codon (1+) of the structural gene to select cells that are not affected by the transgene.
  • the cells After culturing the embryonic stem cell lines transduced with the DNA constructs of Examples 1 and 2 in a culture medium, to induce differentiation into cardiomyocytes by the suspension differentiation method, the cells were separated with 0.25% trypsin and 0.05% EDTA. did. The separated cells were inoculated in a 35 ⁇ 10 mm culture vessel at a concentration of 20 ⁇ 10 4 cells/ml and suspended in culture for 5 days.
  • a culture vessel 100 ⁇ 20 m, Corning
  • EB embryonic body
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • the green fluorescent protein (EGFP) gene driven by the ⁇ -myosin heavy chain gene ( ⁇ -MHC) promoter of Example 1 was transduced, the green fluorescent protein (EGFP) in cardiomyocytes was Specifically, it was confirmed that green fluorescent protein (EGFP) was not expressed in undifferentiated cells ( FIGS. 3 and 4 ).
  • the transduced stem cells (Example 2) were subjected to fluorescence analysis. As a result, it was confirmed that green fluorescent protein (EGFP) by the ⁇ -MHC promoter and red (DsRed) fluorescence by the MMLTR-EPS promoter were not detected ( FIG. 3 ).
  • the expression of a specific gene is expressed by transcription of the gene by an internal promoter.
  • the MMLTR-EPS promoter does not work in stem cells, and that the MMLTR-EPS promoter operates to express the DsRed (red) fluorescent protein after differentiation into cardiomyocytes. It was confirmed that it was specifically expressed or activated.
  • embryonic stem cells transformed with the MMLTR-EPS promoter-dependent antibiotic resistance gene expression DNA construct prepared. After the prepared cells were differentiated into cardiomyocytes, Puromycin (1 ⁇ g/ml) was treated, and apoptosis of undifferentiated cells was analyzed for 0 to 12 days.
  • the MMLTR-EPS promoter-dependent puromycin resistance gene expression DNA construct is used to selectively remove only undifferentiated stem cells that induce teratoma without affecting cardiomyocytes that have differentiated totipotent stem cells to form teratoma. It was confirmed that it can be fundamentally blocked.

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Abstract

본 발명은 항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마(teratoma) 제거용 DNA 구조체 및 상기 DNA 구조체를 이용하여 미분화 세포를 제거하여 테라토마 형성을 원천적으로 차단하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 분화세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터 및 상기 프로모터에 연결된 항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마 제거용 DNA 구조체 및 상기 DNA 구조체를 이용하여 미분화 세포를 제거하여 테라토마 형성을 차단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 테라토마 형성의 원인이 되는 미분화 줄기세포만을 선택적 사멸함으로써, 분화된 심근세포에는 전혀 영향을 미치지 않으면서 분화세포의 생존능 및 기능은 그대로 유지시킬 수 있으므로, 세포 치료제로 적용 시 종양 형성 가능성을 제거하여 안정성이 확보되는 효과를 나타낸다.

Description

항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마 제거용 DNA 구조체
본 발명은 항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마 제거용 DNA 구조체 및 상기 DNA 구조체를 이용하여 미분화 세포를 제거하여 테라토마(teratoma) 형성을 차단하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 분화세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터 및 상기 프로모터에 연결된 항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마 제거용 DNA 구조체 및 상기 DNA 구조체를 이용하여 미분화 세포를 제거하여 테라토마 형성을 차단하는 방법에 관한 것이다.
배아줄기세포는 배아의 발생과정에서 추출한 세포로서 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 지녔으나 아직 분화되지 않은 세포이다. 이러한 미분화 상태에서 적절한 조건을 맞춰주면 다양한 조직 세포로 분화가 가능하다. 배아줄기세포(Embryonic stem cells, ES cells)는 난자와 정자가 결합하여 수정란이 된 후, 하나의 세포로 시작한 수정란은 세포분열을 통해 여러 개의 세포로 이루어진 배반포가 된다. 배반포의 안쪽에는 내세포괴라고 하는 세포들의 덩어리가 있는데, 이 세포들은 세포분열과 분화를 거쳐 배아를 형성하고, 배아는 임신기간을 거치면서 하나의 개체로 발생하게 된다. 이 과정에서 내세포괴의 세포들이 혈액, 뼈, 피부, 간 등 한 개체에 있는 모든 조직의 세포로 분화하게 된다. 때문에 배아 단계에서 추출한 줄기세포는 뼈, 간, 심장 등 장기로 발전할 수 있는 만능세포라고 불린다. 따라서, 이 내세포괴의 세포를 배반포로부터 분리하여 배양하면 분화는 일어나지 않지만 분화 능력은 여전히 가지는 배아줄기세포가 되는 것이다.
한편, 역분화줄기세포는 분화가 끝난 세포를 분화 이전 단계로 되돌린 세포로써, 완전히 자란 체세포에 역분화 관련 유전자를 주입해 배아줄기세포처럼 세포 생성초기의 만능세포 단계로 되돌려진 세포이다. 역분화줄기세포는 모든 조직으로 발전시킬 수 있는 측면에서 배아줄기세포와 유사하지만 수정란에서 발생하고 있는 배아를 파괴해야만 줄기세포를 얻을 수 있는 기존 배아줄기세포 연구의 윤리적인 문제를 한 번에 해결했다는 점에서 큰 의미를 갖는다. 또한 환자의 체세포를 줄기세포로 전환시키므로 면역 거부 반응 문제가 없는 장점이 있다.
그러나, 역분화줄기세포와 배아줄기세포는 모두 치료제로 활용하는 데에 기형종(테라토마, teratoma)의 발생이라는 공통된 위험이 있다. 이러한 기형종의 발생은 줄기세포의 치료제로서 실용화를 막는 주요 원인이다. 기존에는 기형종의 예방을 위하여 세포분류기(cell sorter)로 기형종의 위험이 있는 미분화된 세포로부터 안전한 단계의 분화된 세포만을 분리하는 방법을 사용하는 방법이 발전하였으나, 기계의 에러률이 있으며 또한 이렇게 분리된 세포는 조직세포로의 착상이 어려운 문제도 있었다.
본 발명의 하나의 목적은 분화세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터 및 상기 프로모터에 연결된 항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마(teratoma) 제거용 DNA 구조체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 테라토마(teratoma) 제거용 DNA 구조체가 형질 도입된, 테라토마 형성이 차단된 전능성 줄기세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 DNA 구조체를 전능성 줄기세포에 형질도입하는 단계; (b) 상기 a 단계에서 형질도입된 전능성 줄기세포를 심근세포(cardiomyocyte)로 분화시키는 단계; 및 (c) 상기 b 단계에서 분화시킨 세포에 항생제를 처리하여 미분화 줄기세포만을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는 미분화 세포를 제거하여 테라토마(teratoma) 형성을 원천적으로 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 DNA 구조체를 전능성 줄기세포에 형질도입하는 단계; (b) 상기 a 단계에서 형질도입된 전능성 줄기세포를 심근세포(cardiomyocyte)로 분화시키는 단계; 및 (c) 상기 b 단계에서 분화시킨 세포에 항생제를 처리하여 미분화 줄기세포만을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는, 테라토마(teratoma) 형성을 차단할 수 있는 다능성(pluripotent) 줄기세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 분화세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터 및 상기 프로모터에 연결된 항생제 저항성 유전자를 포함하는, 테라토마(teratoma) 제거용 DNA 구조체를 제공한다.
상기 분화세포는 심근세포이며, 상기 프로모터는 심근세포(cardiomyocyte)에 특이적으로 활성화되는 서열번호 1의 MMLTR-EPS 프로모터일 수 있다.
상기 항생제는 네오마이신(Neomycin, G418), 푸로마이신(Puromycin) 및 히그로마이신(Hygromycin)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 테라토마(teratoma) 제거용 DNA 구조체가 형질 도입된, 테라토마 형성이 차단된 전능성 줄기세포를 제공한다.
상기 DNA 구조체는 전능성 줄기세포의 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5'-flanking region)의 10kb 이내의 유전자 영역에 영향을 주지 않을 수 있다.
또한, 본 발명은 (a)상기 DNA 구조체를 전능성 줄기세포에 형질도입하는 단계; (b) 상기 a 단계에서 형질도입된 전능성 줄기세포를 심근세포(cardiomyocyte)로 분화시키는 단계; 및 (c) 상기 b 단계에서 분화시킨 세포에 항생제를 처리하여 미분화 줄기세포만을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는, 테라토마(teratoma) 형성 차단방법을 제공한다.
상기 전능성 줄기세포는 배아줄기세포, 역분화줄기세포, 배아생식세포, 배아종양세포 및 성체줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 항생제는 네오마이신(Neomycin, G418), 푸로마이신(Puromycin) 및 히그로마이신(Hygromycin)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 미분화 줄기세포는 분화 유도에 의해 분화되지 않은 세포일 수 있다.
상기 a 단계 이후 상기 형질 도입된 세포에서 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5'-flanking region)의 10kb 이내의 유전자 영역의 유전자를 분석하여, 도입된 유전자로 인한 영향이 없는 세포(cell)를 유전자 검사로 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 DNA 구조체를 전능성 줄기세포에 형질도입하는 단계; (b) 상기 a 단계에서 형질도입된 전능성 줄기세포를 심근세포(cardiomyocyte)로 분화시키는 단계; 및 (c) 상기 b 단계에서 분화시킨 세포에 항생제를 처리하여 미분화 줄기세포만을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는, 테라토마(teratoma) 형성을 차단할 수 있는 다능성(pluripotent) 줄기세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 테라토마 형성의 원인이 되는 미분화 줄기세포만을 선택적 사멸함으로써, 분화된 심근세포에는 전혀 영향을 미치지 않으면서 분화세포의 생존능 및 기능은 그대로 유지시킬 수 있으므로, 세포 치료제로 적용 시 종양 형성 가능성을 차단하고, 안정성이 확보되는 효과를 나타낸다.
즉, 본 발명은 전능성 줄기세포를 적당한 환경, 조건과 기간에 따라 무한대로 생산 및 분화시킬 수 있으며, 분화된 시점에서는 약물이 포함된 배지로 전환하여 배양하는 것만으로 미분화된 세포만을 선택적으로 완전히 제거할 수 있다. 미분화된 세포가 완전히 제거되므로 테라토마의 위험으로부터 안전하게 치료제로 사용할 수 있는 효과를 가져온다.
도 1은 심근에서만 특이적으로 발현되는 약 5.4 kb의 알파 마이오신 헤비체인 유전자(α-myosin heavy chain gene, α-MHC) 프로모터를 포함하는 pEGFP-1 재조합 벡터를 배아줄기세포(nkES)에 도입하고 G418로 선별하여 영구세포주를 만드는 과정의 모식도이다.
도 2는 Moloney murine 백혈병 바이러스(MoMuLV)에서 유래한 5'-LTR 및 extended packaging signal (MMLTR-EPS) 약 1.5kb로 구동되는 프로모터를 포함하는 pLIB 벡터를 실시예 1의 배아줄기세포(ES)에 도입하는 과정의 모식도이다.
도 3은 형질 도입한 배아줄기세포의 형광현미경(파장: 488, 580 nm) 사진이다. 복수도 보여주는 사진에서 배아줄기세포(ES)의 형광현미경 사진에는 5.4kb의 α-MHC(alpha myosin heavy chain gene)와 MMLTR-EPS의 프로모터에 기인한 각각의 녹색과 적색이 나타나지 않았다.
도 4는 심근세포(cardiomyocyte)로 분화시킨 세포의 광학 현미경 및 488 nm 파장(녹색)에서의 형광현미경 사진이다. A는 심근세포로 분화된 세포와 미분화의 세포가 공존하는 광학현미경 사진이며, B는 A와 동일한 위치의 형광 현미경 사진이다. C도 역시 다른 배치의 심근세포(cardiomyocyte)로 분화된 세포와 미분화된 세포가 공존하고 있는 광학 현미경이며, D는 C와 동일한 위치의 형광 현미경 사진이다. α-MHC(alpha myosin heavy chain gene)는 심근세포에서만 발현되는 마커로서 세계적으로 인정받는 지표로서, 이에 발현이 의존하는 EGFP(녹색)으로 보이는 세포는 심근세포로 분화된 세포임을 의미하며 녹색이 보이지 않는 세포는 아직 미분화 상태의 세포다.
도 5의 A와 B는 도 4의 C와 D가 각각 동일한 사진이다. 도 5의 A는 심근세포(cardiomyocyte)로 분화시킨 세포의 부분적으로 분화된 심근세포의 광학현미경 사진이며, B는 A와 동일한 위치의 형광 현미경(녹색; 488 nm) 사진이다. C는 A, B와 동일한 위치의형광 현미경(적색; 580 nm)사진이다. D는 B(녹색)와 C(적색)의 형광 현미경 사진을 병합(Merged)한 사진이다. D에서 심근세포(cardiomyocyte)로 분화로 α-MHC 프로모터에 의해 발현된 EGFP(녹색)과 MMLTR-EPS 프로모터에 의해 발현되는 DsRed(적색)이 동일한 위치(세포)에서 발현되어 노란색(녹색+적색)으로 표시됨을 확인하였다.
도 6은 약 1.5kb의 MMLTR-EPS 프로모터에 DsRed(Red) 유전자를 대신하여 푸로마이신(Puromycin) 또는 히그로마이신(Hygromycin) 저항성 유전자를 클로닝하여 제조한 2종의 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 7은 약 1.5kb의 MMLTR-EPS 프로모터와 연결된 푸로마이신(Puromycin) 저항성 유전자를 포함하는 DNA 구조체를 형질도입한 배아줄기세포(nkwES)를 심근세포(cardiomyocyte) 분화시키고 푸로마이신(Puromycin) 처리한 후 0일 내지 12일간 미분화 세포의 사멸을 확인한 결과이다.
본 발명은 테라토마의 위험이 되는 이러한 미분화 세포를 제거하여 테라토마 형성을 차단하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 전능성 줄기세포의 게놈(genome) DNA상의 안전한 지역에 분화세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터를 이용하여 선택적으로 항생제 저항성 유전자의 발현을 조절하는 DNA-구조체를 영구적으로 도입함으로써 안전하게 기존의 유전자를 재프로그램하게 되며, 이 세포는 도입된 유전자에 의하여 특정 약물 환경에서 살아남을 수 있는 능력을 보유하게 된다. 이 유전자는 미분화 상태에서는 작동하지 않고 오직 특정 세포로 분화된 상태가 되어야만 발현하도록 설계되어 있다.
본 발명의 하나의 양태로서, 본 발명은 분화세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터 및 상기 프로모터에 연결된 항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마(teratoma) 제거용 DNA 구조체를 제공한다.
특정 기능적 세포로의 분화 유도 후 잔류된 배아줄기세포로부터의 테라토마(teratoma) 형성은 세포 치료에 있어서 대중화를 막는 가장 중요한 기술적 장벽으로 작용해 왔다.
본 발명은 분화 종료 후 잔존하는 미분화 줄기세포만을 선택적으로 제거할 수 있어서, 분화 종료 후 잔존하는 미분화 줄기세포에 의한 테라토마(teratoma) 형성을 원천적으로 제거할 수 있다.
본 발명에서 DNA 구조체는 테라토마(teratoma) 제거용도로, 분화세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터 및 상기 프로모터에 연결된 항생제 저항성 유전자를 포함한다.
본 발명에서 프로모터는 분화세포에서 특이적으로 발현 또는 활성화되는 것을 특징으로 한다. 구체적으로 상기 프로모터는 심근세포(cardiomyocyte)에서 특이적으로 활성화되는 프로모터일 수 있다.
본 발명에서 상기 심근세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프로모터 일수 있다. 본 발명에서 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프로모터는 Moloney murine 백혈병 바이러스(MoMuLV)에서 유래한 5'-LTR 및 extended packaging signal(MMLTR-EPS)의 프로모터이다.
본 발명의 일 실시예에서 줄기세포의 심근세포로의 분화를 확인하기 위하여 알파 마이오신 헤비체인 유전자(α-myosin heavy chain gene, α-MHC) 프로모터에 의해 구동되는 녹색 형광단백질(EGFP) 유전자를 형질 도입한 경우, 심근세포에서 녹색 형광단백질(EGFP)가 특이적으로 발현하고, 미분화 세포에서 녹색 형광단백질(EGFP)가 발현되지 않음을 확인하였으며(도 3 및 도 4), α-MHC 프로모터에 의해 녹색 형광단백질(EGFP)를 발현하는 영구 줄기세포주에 MMLTR-EPS의 프로모터에 의해 구동되는 DsRed 유전자를 삽입한 후, 형질 도입된 줄기세포에서 형광분석한 결과, α-MHC 프로모터에 의한 녹색 형광단백질(EGFP)과 MMLTR-EPS의 프로모터에 의한 적색(DsRed) 형광이 검출되지 않음을 확인하였다(도 3). 반면 심근세포로 분화시켜 형광 분석한 결과, 심근세포에서 α-MHC 프로모터에 의한 녹색 형광단백질(EGFP)과 MMLTR-EPS의 프로모터에 의한 적색(DsRed) 형광이 모두 검출됨을 확인하였다(도 5).
즉, MMLTR-EPS의 프로모터가 심근세포(cardiomyocyte)에서 특이적으로 발현 또는 활성화 됨을 확인하였다.
본 발명에서 항생제 저항성 유전자는 네오마이신(Neomycin, G418), 푸로마이신(Puromycin) 및 히그로마이신(Hygromycin)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 항생제에 대한 저항성 유전자 일수 있다.
본 발명에서 항생제 유전자는 구체적으로 푸로마이신(Puromycin) 또는 히그로마이신(Hygromycin) 저항성 유전자일 수 있으며, 더욱 구체적으로 서열번호 2의 히그로마이신(Hygromycin) 저항성 유전자 또는 서열번호 3의 푸로마이신(Puromycin) 저항성 유전자일 수 있다. 상기 DNA 구조체는 염색체의 특정 위치에 안정적으로 삽입이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에서 유전자를 도입한 세포들 중에서, 게놈(genome)상 DNA(original 세포의 DNA)의 구조유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자 영역에서 도입된 유전자로 인한 영향이 없는 세포(cell)를 유전자 검사로 선별하고, 5회 이상 계대 배양하여 안정적으로 삽입된 형질 도입 세포 주를 확보하였다.
본 발명에서 분화세포는 전능성 줄기세포의 분화를 유도하여 분화된 세포로 구체적으로 심근세포일 수 있다.
본 발명에서 전능성 줄기세포는 배아줄기세포, 역분화줄기세포, 배아생식세포, 배아종양세포 및 성체줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 MMLTR-EPS 프로모터 의존적 Puromycin(항생제) 저항성 유전자 발현용 DNA 구조체를 이용하여 전능성 줄기세포를 분화시킨 심근세포(cardiomyocyte)에 영향을 주지 않고, 테라토마(teratoma)를 유발하는 미분화 줄기세포만을 선택적으로 제거할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 DNA 구조체는 테라토마(teratoma) 제거용으로 활용할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로, 상기 테라토마(teratoma) 제거용 DNA 구조체가 형질 도입된, 테라토마 형성이 차단된 전능성 줄기세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 다른 양태로 (a) 상기 DNA 구조체를 전능성 줄기세포에 형질도입하는 단계; (b) 상기 a 단계에서 형질도입된 전능성 줄기세포를 심근세포(cardiomyocyte)로 분화시키는 단계; 및 (c) 상기 b 단계에서 분화시킨 세포에 항생제를 처리하여 미분화 줄기세포만을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는, 테라토마(teratoma) 형성을 차단할 수 있는 다능성(pluripotent) 줄기세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 DNA 구조체에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 테라토마 형성이 차단된 전능성 줄기세포는 심근세포로 분화시 DNA 구조체의 형질도입에 의해 심근세포 특이적으로 항생제 저항성 유전자를 발현하는 것을 특징으로 한다. 따라서 심근세포 분화 후 항생제를 포함하는 배지로 배양하여 미분화 세포만을 선택적으로 제거할 수 있다.
즉, 본 발명의 전능성 줄기세포는 심근세포 분화 후 항생제를 이용하여 테라토마를 형성의 위험이 있는 미분화 세포를 선택적으로 제거하여 테라토마(teratoma) 형성을 차단 또는 테라토마(teratoma)를 제거하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 항생제 저항성 유전자에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 일 실시예에서 안정적으로 유전자가 도입된 세포를 선별하고자 형질 도입한 세포에서 게놈 유전자를 분리하고, 게놈(genome)상 DNA(original 세포의 DNA)의 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자를 분석하여 상기 10kb 이내 영역에 DNA 구조체에 의해 도입된 유전자가 없는 세포를 선별하였다. 즉, DNA 구조체에 의해 도입된 유전자로 인한 영향이 없는 세포(cell)를 선별하였다.
상기, 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb은 구조유전자의 프로모터 및 인핸서를 포함한다. 바람직하게는 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 2kb 이내의 유전자 영역에서 유전자 분석을 수행하여, 도입 유전자에 의한 영향이 없는 세포를 선별할 수 있다.
아울러 5회 이상의 계대배양을 통하여 안정적으로 세포 주(cell line)를 확보하여 사용하였다.
본 발명에서 구조 유전자(structural gene)는 조절인자가 아닌 다른 RNA나 단백질 산물을 암호화하는 유전자이다.
본 발명의 테라토마 형성이 차단된 전능성 줄기세포는 상기 DNA 구조체가 전능성 줄기세포의 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자 영역에 영향을 주지 않는 것을 특징으로 한다.
즉, 본 발명의 테라토마 형성이 차단된 전능성 줄기세포는 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자 영역에 형질도입한 DNA 구조체 유전자가 삽입되지 않은 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 전능성 줄기세포는 상기 DNA 구조체의 유전자가 인트론(intron) 영역에 삽입된 것일 수 있다. 따라서 줄기세포의 유전자 발현에는 영향을 주지 않으며 안정적으로 DNA 구조체의 유전자가 도입된 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 다른 양태로, (a) 상기 DNA 구조체를 전능성 줄기세포에 형질도입하는 단계; (b) 상기 a 단계에서 형질도입된 전능성 줄기세포를 심근세포(cardiomyocyte)로 분화시키는 단계; 및 (c) 상기 b 단계에서 분화시킨 세포에 항생제를 처리하여 미분화 줄기세포만을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는, 테라토마(teratoma) 형성 차단방법을 제공한다.
본 발명에서 DNA 구조체를 전능성 줄기세포에 형질도입하는 단계는 전능성 줄기세포에 분화세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터 및 상기 프로모터에 연결된 항생제 저항성 유전자를 포함하는 테라토마(teratoma) 제거용 DNA 구조체를 형질 도입하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 DNA 구조체에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 분화시키는 단계는 전능성 줄기세포를 화학적 또는 물리적 자극을 이용하여 심근세포를 분화시키는 것을 의미하며, 구체적으로 백혈병억제인자(leukemia inhibitory factor, LIF)가 없는 배지(분화배지)로 배양하여 분화시키는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 제거하는 단계는 네오마이신(Neomycin, G418), 푸로마이신(Puromycin) 및 히그로마이신(Hygromycin)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 항생제를 처리하여 미분화 세포를 선택적으로 제거하는 것으로, 심근세포에서 특이적인 프로모터와 연결된 항생제 저항성 유전자가 발현되어 분화된 심근세포는 항생제의 영향을 받지 않으며, 미분화 세포만 특이적으로 제거(사멸)되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서, 테라토마(teratoma) 형성을 차단하는 방법은 분화 종료 후 잔존하는 미분화 세포가 테라토마(teratoma) 형성을 유도 할 수 있는 바, 분화 종료 후 잔존하는 미분화 세포를 100% 제거하여 테라토마(teratoma) 자체의 형성을 원천적으로 차단하거나 테라토마(teratoma) 자체를 제거할 수 있다.
전술한 실시예에서 안정적으로 유전자가 도입된 세포를 선별하고자 형질 도입한 세포에서 게놈 유전자를 분리하고, 게놈(genome)상 DNA(original 세포의 DNA)의 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자 영역에서 도입된 유전자로 인한 영향이 없는 세포(cell)를 유전자 검사로 선별하였다.
아울러 5회 이상의 계대배양을 통하여 안정적으로 세포 주(cell line)를 확보하여 사용하였다.
상기, 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb은 구조유전자의 프로모터 및 인핸서를 포함한다. 바람직하게는 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 2kb 이내의 유전자 영역에서 유전자 분석을 수행하여, 도입 유전자에 의한 영향이 없는 세포를 선별할 수 있다.
따라서, 본 발명의 테라토마(teratoma) 형성 차단방법은 a 단계 이후 상기 형질 도입된 세포에서 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자 영역의 유전자를 분석하여, 도입된 유전자로 인한 영향이 없는 세포(cell)를 유전자 검사로 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 선별하는 단계는 바람직하게는 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 2kb 이내의 유전자 영역의 유전자를 분석하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 배아줄기세포의 배양 및 알파 마이오신 헤비체인 유전자(α-myosin heavy chain gene, α-MHC) 프로모터와 연결된 EGFP 유전자가 도입된 영구 세포 주 제작
알파 마이오신 헤비체인 유전자(α-myosin heavy chain gene, α-MHC)는 미분화된 세포에서는 휴지상태이며, 오직 심근세포(cardiomyocyte)로 분화된 경우에만 프로모터가 작동한다. 이를 검증하기 위하여 α-MHC(alpha myosinheavychain gene) 프로모터에 의존적인 EGFP(green) DNA 구조체(실시예1-1)로 형질전환된 배아줄기세포를 심근세포를 분화시킨 후, 분화된 심근세포에서 EGFP(green)의 형광 단백질이 생성을 분석하였다(도 4 및 도 5).
분석결과, EGFP(green) 형광 단백질은 심근세포로 분화 되었을 경우에만 발현이 되었으며, 주위에 미분화된 세포에서는 녹색형광(green)이 나타나지 않음을 확인하였다.
1-1. 심근세포에서 특이적으로 프로모터와 연결된 리포터 유전자(녹색 형광단백질, EGFP)가 도입된 DNA 구조체의 제조
알파 마이오신 헤비체인 유전자(α-myosin heavy chain gene, α-MHC)는 분화된 심근세포에서만 특이적으로 활성화되는 유전자이다. 본 발명에서는 심근세포의 분화를 확인하기 위하여 α-MHC 프로모터에 의해 구동되는 녹색 형광단백질(EGFP) 유전자를 가진 DNA 구조체(도 1)를 제작하였다.
알파 마이오신 헤비체인 유전자(α-myosin heavy chain gene) 프로모터(서열번호 4)는 알파 마이오신 헤비체인 유전자(α-myosin heavy chain gene) 프로모터 특이적 전방향 프라이머 (5’-TATGAGCTCGTCCACTCAAACTCTTATGGGGG-3’, 서열번호 5) 및 역방향 프라이머(5’-TTAGTCGACGGATCCTGCAAGGTCACACAAG-3’, 서열번호 6)와 Pfu 효소(DNA 폴리머라아제)를 넣고 PCR(Polymerase chain reaction) 기기로 증폭하였다. 이렇게 증폭된 약 5.4kb(5443bp) α-MHC 프로모터 DNA를 Sac I 및 Sal I 으로 잘라 확인한 후, 이의 단편을 neomycin 저항성 유전자를 포함하는 pEGFP-1 벡터(구조체)에 재조합하여 제작하였다.
또한, Neomycin 저항성 유전자는 G418(단백질 합성의 저해에 의해 강력한 세포독성을 나타내는 아미노배당체계 항생물질의 하나)에 저항성을 가진다.
생쥐의 배아줄기세포 ES-D3(ATCC, CRL-1934)를 주문하여 사용하였다. 줄기세포(ES cell)는 피루베이트, 비필수 아미노산, β-머캅토 에탄올, 10% ES 용 소태아혈청(FBS) 및 백혈병억제인자(leukemia inhibitory factor, LIF) 1000U/㎖ 를 포함하는 DMEM 배지에서 지지세포(feeder cell) 없이 배양하였다.
1-2. DNA 구조체가 형질 도입된 배아줄기세포를 선별
배양된 배아줄기세포를 0.25% 트립신-EDTA를 처리하여 분리하였다. 분리된 세포는 1,000 × g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수확하였다. 이후 PBS(phosphate buffered saline) 완충액으로 재현탁한 후 5분간 원심 분리하여 세포를 수확하였다.
형질 도입을 위해 얼음(0℃)에서 1×107 세포/㎖로 세포를 다시 PBS 완충액에 현탁하였다. 세포 현탁액 0.5 ㎖를 얼음 위에 놓인 전기천공 큐벳(4mm gap)으로 옮기고, 하기 제조된 DNA 구조체(도 1) 40 μg과 혼합하였다. 그 후 얼음에서 10분간 방치하고 260V, 500 μF로 전기천공(electroporation)을 수행하였다. 그 후, 세포와 DNA를 포함하는 큐벳을 10분 동안 얼음에서 보관하고, 배양용 DMEM 배지를 이용하여 배양하였다.
안정적인 형질도입을 위해 48 시간(약 2세대) 성장시킨 후 G418 (200μg/㎖)를 넣어 배양하였다. 유전자가 도입된 세포는 콜로니를 형성되고 유전자가 도입되지 않은 세포는 G418 처리에 의해 사멸하였다.
2주간 G418이 들어있는 배지에서 살아남은 각각의 콜로니를 96-웰 플레이트로 옮겨 증식시키며, 이후 30 mm 6-웰 플레이트로 옮겨 배양하였다. 최종적으로 100×20 mm 배양 플레이트에 계대 배양하여 형질 도입된 줄기세포를 증식시켰다.
세포 내에 들어간 DNA를 확인하기 위하여 형질 도입된 세포의 게놈(Genomic) DNA를 추출하고 EcoR I으로 잘라 전기영동을 통하여 분리하였다. 겔에 나타난 DNA를 수거하여 PCR을 수행하여 도입된 유전자를 1차 확인하였다.
DNA 구조체 유전자가 도입된 세포에서 유전자 분리 및 크로닝하여 DNA의 서열을 확인하여 genomic DNA에 도입된 지역을 Blast 검색을 수행하여 비교함으로써 안전하게 도입된 세포주를 선별하였다.
구체적으로 유전자를 도입한 세포들 중에서, 게놈(genome)상 DNA(original 세포의 DNA)의 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자를 분석하여 상기 10kb 이내 영역에 DNA 구조체에 의해 도입된 유전자가 없는 세포를 선별하였다. 즉, DNA 구조체에 의해 도입된 유전자로 인한 영향이 없는 세포(cell)를 선별하였다.
상기, 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb은 구조유전자의 프로모터 및 인핸서를 포함한다. 바람직하게는 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 2kb 이내의 유전자 영역에서 유전자 분석을 수행하여, 도입 유전자에 의한 영향이 없는 세포를 선별할 수 있다.
아울러 5회 이상의 계대배양을 통하여 독립된 세포 주(cell line)를 확보하여 사용하였다.
이러한 방법으로, 배아줄기세포 내에 “DNA 구조체”가 영구적으로 도입된 배아줄기세포를 선별하여 본 실험에 필요한 세포 주(cell line)를 확립하였다. 이렇게 확립된 세포 주(cell line)를 계대배양을 통하여, α-MHC 프로모터와 연결된 EGFP 도입된 안정적인 배아줄기세포 주(cell line)를 확보하였으며, 하기 실시예 2에서 MMLTR-EPS 프로모터와 연결된 DsRed(Red) 유전자 도입을 위한 세포로 사용하였다.
실시예 2: MMLTR-EPS-프로모터(promoter, 약 1.5kb)와 연결된 DsRed 발현 레트로바이러스-벡터 구조체 제조
MMLTR-EPS 프로모터가 분화된 심근세포(cardiomyocyte)에서 특이적으로 활성화 되는지 확인하고자, 실시예 1에서 확보한 영구 세포 주에 MMLTR-EPS 프로모터와 연결된 DsRed DNA 구조체의 형질 도입하고, 줄기세포(미분화) 및 분화된 심근세포(cardiomyocyte)에서 MMLTR-EPS 프로모터(서열번호 1)에 의한 DsRed의 발현을 분석하였다.
상기 DsRed(빨간색) 형광 단백질이 580 nm의 파장에서 전자들이 들뜬 상태가 되었다가 원상태로 복구 되면서 잃은 에너지가 붉은색의 형광으로 보이는 것을 특징으로 한다.
Moloney 쥐 백혈병 바이러스(murine leukemia virus, MoMuLV)에서 유래한 5'-LTR 및 extended packaging signal(MMLTR-EPS) 프로모터를 포함하는 MLV-based 레트로바이러스 벡터(pLIB 벡터)의 DsRed 유전자를 클로닝 하였다(도 2).
pLIB 벡터(vector)는 와일드 타입(wild type)의 쥐 백혈병바이러스(murine leukemia virus, MLV)의 유전자 구조(provirus type; host genome에 삽입되어 있는 상태)인 5'-LTR, 패키징 시그널(extended packaging signal), DsRed 유전자 및 3’LTR 로 구성되어 있으며, 나머지 바이러스의 단백질(바이러스 캡시드 단백질, 외피, RTase 등)을 발현하는 유전자(gag, pol, env 등)은 EcoPac-293 세포(패키징 세포)에 미리 영구적으로 도입되어 있다. 상기와 같이 바이러스 유전자를 분산함으로써 바이러스(캡시드, capsid)안에는 오직 5'-LTR, extended packaging signal 및 DsRed 유전자만 패키징 되도록 설계하였다.
pLIB 벡터(vector)를 EcoPac-293 패키징 세포 주에 도입하면 EcoPac-293 세포 주에 미리 영구적으로 도입해 놓은 유전자들에 의해 바이러스의 gag, pol, env를 만들기 때문에 감염력 있는 바이러스 입자가 만들어진다.
이렇게 만들어진 바이러스 입자들은 100,000g로 원심분리하여 비리온(virion)을 농축하였으며, 농축된 비리온을 숙주세포(ES 세포)를 감염시키는데 사용하였다.
농축된 비리온으로 숙주세포(ES 세포)을 감염시키는 경우, 5'-LTR, 패키징 시그널(extended packaging signal) 및 DsRed 유전자 부분만을 숙주세포(ES 세포)에 전달되며, 바이러스 자체를 만드는 유전자(gag, pol, env는 바이러스 캡시드 단백질, 외피, RTase 등)는 EcoPac-293 세포에만 남아있기 때문에 바이러스와 감염된 숙주세포(ES 세포)에서는 발현되지 않아 숙주세포에서 제2의 바이러스가 생성되지 않는다.
즉, 본 발명에서 레트로바이러스(retrovirus) 입자(vector 포함)는 바이러스 패키징 세포(virus packaging (producing) cell)에서만 생산되며, 실시예 1에서 획득한 ES-D3 배아줄기세포에서는 만들어지지 않는 것을 특징으로 한다. 그 이유는 타겟 세포(target cell)에서는 LTR에 의해서 LTR(R-U5)-promoter-gene-LTR(U3-R) 의 형태의 viral RNA는 만들어지지만 이 RNA를 패키징(packaging) 할 수 있는 gag, pol, env 단백질이 이 만들어지지 않기 때문이다.
농축된 비리온으로 실시예 1의 세포주를 감염시켜 형질 도입 세포를 제조하고(도 2), 줄기세포 상태와 분화 후 심근세포에서 형광 단백질(EGFP 및 DsRed)의 발현을 분석하였다.
실시예 3: 심근세포 분화 및 미분화 세포의 제거
하기의 실시예 3-2에서, 실시예 2의 바이러스 벡터를 이용하여 줄기세포에 형질 도입한 MMLTR-EPS 프로모터가 심근세포에서 특이적으로 작동함을 확인하였는바, 영구적으로 심근세포 특이적으로 항생제 저항성 유전자를 발현하는 세포주를 제조하기 위해 MMLTR-EPS 프로모터와 연결된 항생제(Puromycin 또는 Hygromycin) 저항성 유전자의 발현용 벡터를 제조하였다(도 6).
3-1. 심근세포에서 특이적으로 프로모터와 연결된 항생제 저항성 유전자가 도입된 DNA 구조체의 제조 및 형질도입
심근세포 특이적인 MMLTR-EPS 프로모터로 작동되는 항생제 저항성 유전자를 발현시키는 DNA 구조체를 제조하였다. 실시예 1에서 사용한 pEGFP 벡터에 녹색 형광단백질(EGFP) 유전자를 대체하여 푸로마이신(Puromycin) 및 히그로마이신(Hygromycin) 저항성 유전자를 삽입하였으며, 알파 마이오신 헤비체인 유전자(α-myosin heavy chain gene, α-MHC) 프로모터를 대신하여 서열번호 1의 MMLTR-EPS의 바이러스 프로모터(1,472bp)를 삽입하였다.
상기 DNA 구조체(벡터)에서 녹색 형광단백질(EGFP) 유전자를 대신하여 항생제 저항성 유전자인 푸로마이신(Puromycin) 저항성 유전자(서열번호 3)를 클로닝하기 위하여 pfu DNA 폴리머라제(Stratagene)와 함께 PCR기를 사용 하였다. 주형 DNA를 먼저 95℃에서 5분 동안 변성 시켰다. 이어서 PCR 반응을 94℃에서 30초 동안, 65℃에서 30초 동안, 및 72℃에서 2분 동안 수행하고 35회 주기로 반복 하였다.
푸로마이신(Puromycin) 저항성 유전자(서열번호 3)를 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였다.
전방향 프라이머(서열번호 7):
5’-GAGCTGTACACTTCTCCACCTTGTCCTATGACCGAGTACAAGCCT ACCGTGCGC-3’
역방향 프라이머(서열번호 8):
5’-GGCGCCAGGTTTTCGTGTCATACACCAGGTTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTG-3’
상기 푸로마이신(Puromycin) 저항성 유전자 특이적 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 증폭한 후 BsrGI과 Not I 사이에 넣어 완성하였다.
또한, 동일 조건으로 히그로마이신(Hygromycin) 저항성 유전자(서열번호 2)를 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였다.
전방향 프라이머(서열번호 9):
5’-GAGCTGTACACTTCTCCACCTTGTCCTATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTG-3’
역방향 프라이머(서열번호 10):
5’-ATTAGCGGCCGCTCTAGATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTG-3’
상기 히그로마이신(Hygromycin) 저항성 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하여 BsrGI과 Not I 사이에 넣어 완성하였다.
각각을 클로닝하여 도 6과 같이 2 종의 DNA 구조체를 제작하였다.
줄기세포에 실시예 1-2과 동일한 조건으로 상기 푸로마이신(Puromycin) 및 히그로마이신(Hygromycin) 저항성 유전자를 포함하는 DNA 구조체를 전기천공(electroporation)을 수행하여 도입하였다. 그 후 유전자를 도입한 세포들 중에서, 게놈(genome)상 DNA(original 세포의 DNA)의 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자 영역에서 도입된 유전자로 인한 영향이 없는 세포(cell)를 유전자 검사로 선별하였다. 아울러 5회 이상의 계대배양을 통하여 독립된 세포 주(cell line)를 확보하여 사용하였다.
상기, 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb은 구조 유전자의 프로모터 및 인핸서를 포함한다. 바람직하게는 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 2kb 이내의 유전자 영역에서 유전자 분석을 수행하여, 도입 유전자에 의한 영향이 없는 세포를 선별할 수 있다.
3-2. 배아줄기세포의 심근세포로의 분화 확인
실시예 1과 2의 DNA 구조체로 형질 도입한 배아줄기세포주를 배양용 배지로 배양한 후, 부유(Suspension) 분화법으로 심근세포로 분화를 유도하고자, 0.25% 트립신 및 0.05% EDTA로 세포를 분리하였다. 분리된 세포를 35 × 10 mm 배양용기에 20 × 104 세포/㎖의 농도를 접종하여 5일간 부유 배양하였다. 형성된 배아체(embryonic body, EB)를 콜라겐 I으로 코팅한 배양 용기(100 × 20 m, 코닝) Biocoat Collagen I Cellware에서 백혈병억제인자(leukemia inhibitory factor, LIF)가 없는 배지(분화배지)를 사용하여 심근세포로 분화시켰다.
실시예 1의 알파 마이오신 헤비체인 유전자(α-myosin heavy chain gene, α-MHC) 프로모터에 의해 구동되는 녹색 형광단백질(EGFP) 유전자를 형질 도입한 경우, 심근세포에서 녹색 형광단백질(EGFP)가 특이적으로 발현하고, 미분화 세포에서 녹색 형광단백질(EGFP)가 발현되지 않음을 확인하였다(도 3 및 도 4).
또한 α-MHC 프로모터에 의해 녹색 형광단백질(EGFP)를 발현하는 영구 줄기세포주에 MMLTR-EPS의 프로모터에 의해 구동되는 DsRed 유전자를 삽입한 후, 형질 도입된 줄기세포(실시예 2)에서 형광분석한 결과, α-MHC 프로모터에 의한 녹색 형광단백질(EGFP)과 MMLTR-EPS의 프로모터에 의한 적색(DsRed) 형광이 검출되지 않음을 확인하였다(도 3). 반면 심근세포로 분화시킨 형광분석한 결과, 심근세포에서 α-MHC 프로모터에 의한 녹색 형광단백질(EGFP)과 MMLTR-EPS의 프로모터에 의한 적색(DsRed) 형광이 모두 검출됨을 확인하였다(도 5).
특정 유전자의 발현은 내부 프로모터에 의해 유전자가 전사되어 발현된다.
상기 결과를 통해 줄기세포에서는 MMLTR-EPS 프로모터가 작동하지 않으며, 심근세포로 분화하여 MMLTR-EPS 프로모터가 작동하여 DsRed(빨간색) 형광 단백질을 발현됨을 확인하였는바, MMLTR-EPS의 프로모터가 심근세포에서 특이적으로 발현 또는 활성화 됨을 확인하였다.
3-3. 미분화 줄기세포의 제거 확인
심근세포 특이적 항생제(푸로마이신, Puromycin) 저항성 유전자 발현을 통한 미분화 줄기세포의 제거 효과를 확인하고자, MMLTR-EPS 프로모터에 의존적인 항생제 저항성 유전자 발현 DNA 구조체(도 6)로 형질전환된 배아줄기세포 제조하였다. 제조된 세포를 심근세포를 분화시킨 후, Puromycin(1μg/㎖)을 처리하고, 0 내지 12일 동안 미분화 세포의 사멸을 분석하였다.
푸로마이신 처리한 당일(0 일)에는 분화가 진행된 중심부와 그 주위에 많은 수의 미분화 세포들이 관찰된다. 5일이 되면 죽은 세포들이 붙어있는 상태였으나, 미분화된 세포는 사실상 거의 사멸하였고, 12일 이후에도 분화된 세포는 살아있으며 주위의 미분화된 세포들은 완전히 사멸된 것을 확인하였다.
즉, MMLTR-EPS 프로모터 의존적 푸로마이신 저항성 유전자 발현용 DNA 구조체를 이용하여 전능성 줄기세포를 분화시킨 심근세포에 영향을 주지 않고, 테라토마(teratoma)를 유발하는 미분화 줄기세포만을 선택적으로 제거하여 테라토마의 형성을 원천적으로 차단할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. 분화세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터 및 상기 프로모터에 연결된 항생제 저항성 유전자를 포함하는, 테라토마(teratoma) 제거용 DNA 구조체.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 분화세포는 심근세포이며, 상기 프로모터는 심근세포(cardiomyocyte)에 특이적으로 활성화되는 서열번호 1의 MMLTR-EPS 프로모터인 것을 특징으로 하는, DNA 구조체.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 항생제는 네오마이신(Neomycin, G418), 푸로마이신(Puromycin) 및 히그로마이신(Hygromycin)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, DNA 구조체.
  4. 제 1항 내지 3항 중 어느 한 항의 테라토마(teratoma) 제거용 DNA 구조체가 형질 도입된, 테라토마 형성이 차단된 전능성 줄기세포.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 DNA 구조체는 전능성 줄기세포의 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자 영역에 영향을 주지 않는 것을 특징으로 하는, 테라토마 형성이 차단된 전능성 줄기세포.
  6. (a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 DNA 구조체를 전능성 줄기세포에 형질도입하는 단계;
    (b) 상기 a 단계에서 형질도입된 전능성 줄기세포를 심근세포(cardiomyocyte)로 분화시키는 단계; 및
    (c) 상기 b 단계에서 분화시킨 세포에 항생제를 처리하여 미분화 줄기세포만을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는,
    테라토마(teratoma) 형성 차단방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 전능성 줄기세포는 배아줄기세포, 역분화줄기세포, 배아생식세포, 배아종양세포 및 성체줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 항생제는 네오마이신(Neomycin, G418), 푸로마이신(Puromycin) 및 히그로마이신(Hygromycin)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 미분화 줄기세포는 분화 유도에 의해 분화되지 않은 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 6항에 있어서,
    a 단계 이후 상기 형질 도입된 세포에서 구조 유전자(structural gene) 및 구조 유전자의 시작코돈(1+)를 기준으로 상류영역(upstream 또는 5’-flanking region)의 10kb 이내의 유전자 영역의 유전자를 분석하여, 도입된 유전자로 인한 영향이 없는 세포(cell)를 유전자 검사로 선별하는 단계를 더 포함하는 방법.
  11. (a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 DNA 구조체를 전능성 줄기세포에 형질도입하는 단계;
    (b) 상기 a 단계에서 형질도입된 전능성 줄기세포를 심근세포(cardiomyocyte)로 분화시키는 단계; 및
    (c) 상기 b 단계에서 분화시킨 세포에 항생제를 처리하여 미분화 줄기세포만을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는,
    테라토마(teratoma) 형성을 차단할 수 있는 다능성(pluripotent) 줄기세포의 제조방법.
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