JPH11507230A - 細胞の不死化及び脱不死化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞の条件不死化の方法及び組成物が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞の不死化及び脱不死化発明の分野 本発明は、細胞の不死化及び脱不死化方法及び組成物に関し、特に、遺伝子治 療に応用される方法に関する。背景 遺伝子の欠失を修正するために又は疾病を治療するために外来核酸を細胞に加 える遺伝子治療は、急速に発展している分野である。よく行われる遺伝子治療は 、外来核酸のベクターとして患者の細胞を使用する。即ち、細胞を患者から取出 し、遺伝子操作し、患者へ再び導入するものである。例えば、米国特許第 5,399 ,346号を参照されたい。 この方法についての問題点は、取出した細胞がたいてい培養内で有限寿命があ りそれ以後の遺伝子操作ができないことである。従って、取出された細胞系はし ばしばがん遺伝子のような不死化遺伝子でトランスフォームされる。これにより 細胞の無限の発育及び増殖が可能である。しかしながら、がん遺伝子を患者に導 入することが望ましくないために、がん遺伝子を含む不死化細胞は移植候補とし て不適切である。 従って、本発明の目的は、生体外で発育及び不滅化され、次に、脱不死化する ように誘導され、即ち、がん遺伝子を除去するように誘導され、その後、患者や 動物に導入される不死化細胞系の生成方法及び組成物を提供することである。発明の要約 上記の目的によれば、本発明は、細胞ゲノムにおいて不死化遺伝子に隣接する レコンビナーゼ標的部位を含む単離した不死化細胞を提供する。その標的部位は 、レコンビナーゼと接触する場合に不死化遺伝子の切除を仲介することができる 。 態様においては、不死化細胞は正又は負の選択マーカー遺伝子とすることがで きる選択マーカー遺伝子を含む外来核酸を更に含んでいる。細胞は、ＳＴＯＰ（ 又は停止）部位、及び追加の選択マーカー遺伝子を含むこともできる。 他の態様においては、前記不死化細胞ゲノムにおいて不死化遺伝子に隣接する レコンビナーゼ標的部位を含む不死化細胞の生成方法が提供される。その方法は 、ａ）第一レコンビナーゼ標的部位；ｂ）不死化遺伝子；及びｃ）第二レコンビ ナーゼ標的部位を含む外来核酸で細胞をトランスフォームし、レコンビナーゼの 存在しないときには前記外来核酸が前記細胞ゲノムに取込まれている工程を含む 。外来核酸は、選択マーカー遺伝子を少なくとも１種含むことができる。 更に、前記不死化細胞ゲノムにおいて不死化遺伝子に隣接するレコンビナーゼ 標的部位を含む外来核酸を含有する不死化細胞を脱不死化する方法が提供される 。その方法は、前記レコンビナーゼ標的部位と、前記レコンビナーゼ標的部位を 認識することができるレコンビナーゼとを接触させる工程を含んでいる。 本発明の別の態様は、不死化細胞を脱不死化する方法が提供される。その方法 は、第一レコンビナーゼ標的部位；不死化遺伝子；負の選択マーカー遺伝子；及 び第二レコンビナーゼ標的部位を含む外来核酸を取込む工程を含んでいる。外来 核酸は、レコンビナーゼ標的部位間の配列の切除が不死化遺伝子と負の選択マー カーを切除するような向きに切除可能不死化遺伝子を含む不死化細胞を生じるよ うに細胞ゲノムに取込まれる。その方法は、更に、レコンビナーゼ標的部位と、 前記レコンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼとを接触させて前記不死 化遺伝子と前記負の選択マーカー遺伝子が切除される工程を含んでいる。適切な 負の選択薬剤の存在下に細胞を培養することにより、切除した不死化遺伝子と負 の選択遺伝子をもたない細胞が選択される。 更に、不死化細胞を脱不死化する方法が提供される。その方法は、第一レコン ビナーゼ標的部位；不死化遺伝子；正の選択マーカー遺伝子；及び第二レコンビ ナーゼ標的部位を含む外来核酸を取込む工程を含んでいる。核酸は、レコンビナ ーゼ標的部位間の配列の切除が不死化遺伝子を切除して選択マーカーの発現をも たらすような向きに切除可能不死化遺伝子を含む不死化細胞を生じるように細胞 ゲノムに取込まれる。その方法は、更に、前記レコンビナーゼ標的部位と、前記 レコンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼとを接触させて前記不死化遺 伝子を切除する工程を提供する。次に、正の選択薬剤を用いて細胞を単離する。 選択マーカーを発現しない細胞は選択されない。図面の簡単な説明 図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ及び図１Ｄは、条件不死化のための４種のベクターを 示す設計図である。ＲＴＳはレコンビナーゼ標的部位である。ＭＰＣＳは多重ポ リリンカークローニング部位であり、不死化遺伝子が挿入される。ＳＴＯＰは翻 訳又は転写停止配列である。ＬＴＲはウイルス長末端反復である。ＳＶ４０はＳ Ｖ４０由来のプロモーターである。 図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ及び２Ｅは、好適実施態様を示す図である。図２（ Ａ）及び図２（Ｂ）は同じ基本的ベクターの２つの代替的設計である。両ベクタ ーにおいては、ＲＴＳ、即ち、ｌｏｘＰ部位又はＦＲＴ部位が隣接した多重ポリ リンカークローニング部位（ＭＰＣＳ）に不死化遺伝子（例えば、ｖ−ｍｙｃ） が挿入される。ＭＰＣＳの下流に、下流選択マーカー（アルカリホスファターゼ 、薬剤選択マーカー、細胞表面タンパク質、緑色蛍光タンパク質、ｌａｃＺ等） の翻訳を防止するように設計されたTGACTGACCTGAのような“ＳＴＯＰ”配列があ る。また、細胞の初期不死化を選択する異種薬剤選択マーカー、例えば、ヒスチ ジノール、ネオマイシン、ヒゴマイシン等がある。薬剤選択マーカーは、ウイル スＬＴＲ及びＳＶエンハンサーのような内部プロモーター−エンハンサーによる がん遺伝子経由して（２Ａ）又はその逆に（２Ｂ）進められる。図２Ｃは、実施 例に用いられるｒｅｔｍｙｃｇａｌベクターであり；使用した不死化遺伝子はｖ −ｍｙｃとし、第二選択可能マーカーはｌａｃＺとし、第一選択可能マーカーは ヒスチノールとした。図２Ｄはｒｅｔｔｋｎｅｗ．ａｐベクターであり、不死化 遺伝子はｖ−ｍｙｃとし、内部プロモーターはｔｋとし、第一選択マーカーはｎ ｅｏとし、第二選択マーカーはアルカリホスファターゼとした。図２Ｅはｒｅｔ ．ＩＮＳ．ａｐベクターであり、不死化遺伝子はｖ−ｍｙｃとし、ＩＲＥＳは内 部リボソーム侵入部位であり、第一選択マーカーはｎｅｏとし、第二選択マーカ ーはアルカリホスファターゼとした。 図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃは、全細胞が脱不死化したことを確かめるために負 の選択マーカーを用いた不死化／脱不死化構築物を示す図である。図３Ａは、ト ランスフォーメーションの選択マーカーとして不死化遺伝子を用いる。また、負 の選択薬剤へ曝露することを用いるクローン分析もトランスフォーメーションの マーカーとして役立つものである。図３Ｂは、トランスフォーメーションのマー カーとして正の選択マーカーを用いる。正及び負の選択マーカー遺伝子は、どの 順序に位置してもよい。図３Ｃは、誘導プロモーターの制御下でレコンビナーゼ を加える。正の選択遺伝子を加えることもできる。また、これらの遺伝子はどの 順序に位置してもよい。レコンビナーゼ以外の遺伝子の転写用プロモーターは、 様々な位置に置かれるので示されていない。 図４及び図４Ｂは、２種類の異なるレコンビナーゼ及びＴＲＳの使用を示す図 である。図４Ａは、不死化遺伝子及び第一選択マーカー遺伝子の発現を可能にし 、第二選択マーカー遺伝子は２つのＲＴＳ１間の切除まで発現されない。ＲＴＳ １切除時に第二選択マーカー遺伝子が発現され、脱不死化細胞の選択を可能にす る。移植前に、ＲＴＳ２を認識するレコンビナーゼに曝露すると第二選択マーカ ーが切除され、外来核酸を最少にする。図４Ｂは、外来遺伝子が含まれ、例えば 、治療剤をコード化している以外は同じ図である。従って、細胞が移植されて外 来遺伝子が発現され、少し後で細胞を第二レコンビナーゼに曝露して外来遺伝子 を除去する。 図５は、選択マーカー遺伝子のまん中にＲＴＳを入れることによりＳＴＯＰ部 位の使用を避ける条件不死化構築物を示す図である。ＲＴＳは、切除時にＲＴＳ の１つがゲノムに残るようにエキソンに含まれなければならない。その構築物で 細胞をトランスフォームすると不死化遺伝子と第一選択マーカー遺伝子が第二プ ロモーターを用いて転写される。次に、第一選択マーカーに基づいて不死化細胞 が選択される。ＲＴＳを認識するレコンビナーゼに曝露すると不死化遺伝子と第 一選択マーカーがＲＴＳ部位の１つと共に切除される。第二選択マーカーが転写 され、宿主細胞の細胞組織によって認識されるＲＮＡスプライスシグナルの結果 として第二ＲＴＳが除去される。これにより、第二選択マーカー遺伝子を転写さ せることができる。 図６Ａ及び図６Ｂは、誘導プロモーターとレコンビナーゼ遺伝子の使用を示す 図である。図６Ａ及び図６Ｂは、誘導プロモーターの制御下のレコンビナーゼ遺 伝子を含む以外は図１Ｃに示される構築物に対応する。図６Ａは、切除後のゲノ ムにレコンビナーゼ遺伝子が残る構築物を示し、図６Ｂは、レコンビナーゼ遺伝 子を消失する構築物を示す。発明の詳細な説明 本発明は、細胞の条件不死化方法及び組成物に関する。本明細書における“条 件不死化”とは、細胞を不死化し、少し後で脱不死化することができる過程を意 味する。従って、ある条件下では細胞が不死化され、下記の異なる条件下では細 胞はもはや不死化されず、正常な老化パターンに戻り、もはや細胞培養内で無限 に発育及び増殖しない。 当業者に理解される本明細書における“不死化”とは、細胞が不死化遺伝子で トランスフォームされて不死化遺伝子の発現が培養内でかなり無限に発育及び増 殖する能力を与えることを意味する。 本明細書における“不死化遺伝子”とは、細胞の老化機構を克服して細胞がか なり無限に継代培養することができる遺伝子を意味する。不死化遺伝子は当該技 術において周知である。不死化遺伝子は、通常は、使用される細胞に対して外来 であり、細胞ゲノムに組込まれる。不死化する遺伝子の例としては、（１）ｖ− ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、Ｔ抗原及びユーイング肉腫がん遺伝子のような核がん遺伝 子(Fredericksenら,（1988）Neuron 1:439-448; Bartlett，P.ら（1988）Proc ． Natl．Acad．Sci．USA 85:3255-3259，Snyder，E.Y．ら（1992）Cell 68:33-51) 、（２）ｂｃｒ−ａｂｌ及びニューロフィブロミンのような細胞質がん遺伝子(S olomon，E.ら（1991）Science 254:1153-1160)、（３）ｎｅｕ及びｒｅｔのよう な膜がん遺伝子(Aaronson，A.S.A（1991）Science 254:1153-1161、（４）変異 体ｐ５３及び変異体Ｒｂ（網膜芽腫）のような腫瘍サプレッサー遺伝子の優性突 然変異(Weinberg，R.A．（1991）Science 254:1138-1146)、及び（５）負のNotc h 優性遺伝子のような他の不死化遺伝子(Coffman，C.R.ら,(1993)Cell 23:659-6 71); （５）成長因子；（６）成長因子レセプター；及び（７）Ｂｃ１２のよう な抗細胞死遺伝子が挙げられる。特に好ましいがん遺伝子としてはｖ−ｍｙｃ及 びＳＶ４０Ｔ抗原が挙げられる。 本明細書における“脱不死化”とは、不死化細胞の不死化遺伝子の全部又は一 部が細胞のゲノムから物理的に切除され、細胞が正常な老化サイクルに戻ること ができ、もはや培養内で無限に発育及び増殖しない過程を意味する。脱不死化細 胞は、条件不死化構築物の全部又は一部が切除されたものである。従って、本明 細書における開示と共に当業者に理解される様々な条件不死化構築物が作成され 、種々の量の外来核酸が細胞ゲノム内に残ることになる。好適実施態様において は、不死化遺伝子の全部が脱不死化細胞から除去される。 本発明の条件不死化及び脱不死化方法は、部位特異的レコンビナーゼ系を用い て達成される。数種の系が既知であり、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅレ コンビナーゼ、及びサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由 来のＦＬＰ(“ｆｌｉｐ”)レコンビナーゼが含まれる。Ｃｒｅ系はＣｒｅレコン ビナーゼを用い、これは３８ｋＤａタンパク質、とｌｏｘＰと呼ばれる２つの３ ４塩基対レコンビナーゼ標的部位（ＲＴＳ）である。組換えは、同じ分子上の直 接反復ｌｏｘＰ部位間で起こり介在ＤＮＡセグメントを切除することができる。 Sauer ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:5166(1988); Sauerら，Nuc．Acids Res．17:147(1989); Lakso ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:6232; Hoessら ，J．Mol．Biol．181:351-362(1985); Abremskiら，Cell 32:1301(1983); Stern berg ら，J．Mol．Biol．150:467-486（1981）; Orban ら，Proc．Natl．Acad． Sci．USA 89:6861（1992）を参照されたい。ＦＬＰ系は、ＦＬＰタンパク質と２ つのＦＬＰ組換え標的部位（当該技術においてＦＲＴと呼ばれ、本明細書におい てはＲＴＳと示される）を用い、これは２つの１３逆方向塩基対反復と８塩基対 スペーサーからなるものである（例えば、O'Gorman，Science 251:1351(1991); Jayaram，PNAS USA 82:5875-5879(1985); Senecofら，PNAS USA 82:7270(1985); Gronostajski ら，J．Biol．Chem．260:12320（1985）参照）。これらの全ての 文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。 本明細書における“レコンビナーゼ標的部位”(ＲＴＳ)は、介在配列を切除す るためにレコンビナーゼによって認識される核酸配列を意味する。２つのＲＴＳ が切除に必要であることは理解されるべきである。従って、ｃｒｅレコンビナー ゼが用いられる場合、各ＲＴＳはｌｏｘＰ部位を含み、ｌｏｘＰ部位が用いられ る場合、対応するレコンビナーゼはｃｒｅレコンビナーゼである。即ち、レコン ビナーゼはＲＴＳに対応するか又はこれを認識しなければならない。ＦＬＰレコ ンビナーゼが用いられる場合、各ＲＴＳはＦＬＰ組換え標的部位（ＦＲＴ）を含 み、ＦＲＴ部位が用いられる場合、対応するレコンビナーゼはＦＬＰレコンビナ ーゼである。 これらのレコンビナーゼ系を用いて、適切なレコンビナーゼに曝露すると宿主 細胞に挿入された不死化遺伝子が切除される。従って、条件不死化構築物は、不 死化遺伝子の発現をもたらす向きに細胞に挿入される。全ての実施態様について 、宿主細胞は核酸を発現してはならず、好ましくは、本発明の外来核酸を加える 前に適切なレコンビナーゼをコード化する核酸を含まない。少し後で、介在不死 化遺伝子を切除するためにレコンビナーゼが発現し、レコンビナーゼ標的部位に 接触する。 好ましくは、成功した不死化及び脱不死化を検出又は選択するために選択マー カー遺伝子が用いられる。例えば、第一選択マーカーの発現は成功した不死化の 検出を可能にする。即ち、不死化遺伝子が細胞ゲノムに組込まれた場合にマーカ ー遺伝子が発現する。第一選択マーカー遺伝子と好ましくは異なる第二選択マー カーの発現は、下記に詳細に記載されるように不死化遺伝子の切除を意味する。 これらの選択マーカーは、正或いは負の選択マーカーとすることができる。当該 技術において既知の“選択マーカー遺伝子”又は等価物は遺伝子を含む細胞の選 択又は検出を可能にする遺伝子を意味する。“正の選択”は、正の選択マーカー を含む細胞のみが正の選択薬剤に曝露すると生存するか又は標識又は検出される 過程を意味する。例えば、薬剤耐性は正の共通選択マーカーであり、薬剤耐性遺 伝子を含む細胞は薬剤を含む培地上で発育し、耐性遺伝子を含まない細胞は死滅 する。適切な薬剤耐性遺伝子は、特に、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ネオ マイシン耐性、ヒグロマイシン耐性及びピューロマイシン耐性である。他の正の 選択マーカー遺伝子としては、細胞の選別又はふるい分けを可能にする遺伝子が 含まれる。これらの遺伝子は、特に、アルカリホスファターゼ遺伝子、緑色蛍光 タンパク質の遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、及びＣＤ８のような表面マーカーが挙げ られる。実施態様においては、下記に記載されるように、不死化遺伝子自体が正 の選択マーカーとして働くことができる。 他の実施態様においては、負の選択マーカーが用いられる。“負の選択”は、 負の選択マーカーでトランスフェクトした細胞が負の選択マーカーを含む細胞を 死滅する適切な負の選択薬剤に曝露されると死滅する過程を意味する。例えば、 単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子を含む細胞は ガンシクロビル（ＧＡＮＣ^s）に感受性がある。同様に、Ｇｐｔ遺伝子を含む細 胞は６−チオキサンチンに感受性がある。負の選択マーカー遺伝子が条件不死化 構築物に適切に配置された場合には脱不死化された細胞を単離するために用いら れる。即ち、負の選択マーカーは、不死化遺伝子で発現し、不死化遺伝子がなお 存在する場合には細胞は死滅する。 一般に、条件不死化−脱不死化ベクターと技術は次のように進行する。不死化 に用いられる遺伝子構築は、外来核酸でまずトランスフォームすることにより不 死化が得られるようにつくられる。細胞が発育及び増殖され、上記のように他の 遺伝子が加えられる。細胞が幹細胞である場合には、所望されるならば不死化細 胞が分化される。次に、移植前に又は少し後で細胞を操作して不死化遺伝子を切 除する。即ち、細胞を脱不死化する。 好適実施態様においては、不死化遺伝子を細胞に導入するクローニングベクタ ーは、不死化遺伝子、選択マーカー、プロモーター及びＲＴＳがゲノムに同時に 組込まれるように構築される。即ち、ＤＮＡのゲノムへの組込みは脱不死化を促 進しないことを必要とする。また、不死化遺伝子は、相同組換えベクターの構築 が更に必要とした配列を導入させることを可能にするフランキング配列が十分な ゲノムに導入される。 好適実施態様においては、脱不死化は、下記のようにレコンビナーゼをコード 化する外来核酸を細胞に導入するする結果として起こる。 実施態様においては、本発明は、条件的に不死化した細胞系を提供する。その 細胞系は、下記の様々な異なった条件不死化構築物を含む核酸を含有する。その 不死化細胞系は、少なくとも１種の細胞を本発明の構築物を含む核酸でトランス フォームすることによりつくられる。 その条件的に不死化した細胞系は、下記の種々の脱不死化方法に用いられる。 他の実施態様においては、細胞系は、細胞系の細胞ゲノムにおいて不死化遺伝 子を隣接するレコンビナーゼ標的部位を含む核酸を含んでいる。その標的部位は 、ＲＴＳがレコンビナーゼと接触する場合にＲＴＳが不死化遺伝子の切除を仲介 す ることができるような向きでなければならない。即ち、ＲＴＳを認識するレコン ビナーゼが存在しないときには不死化遺伝子は細胞ゲノムに取込まれ発現して不 死化細胞系を生成する。ＲＴＳを対応するレコンビナーゼに曝露する場合にはＲ ＴＳ間の配列の切除が起こる。その配列は不死化遺伝子を含むので、切除により 遺伝子の消失、即ち脱不死化が得られる。 別の実施態様においては、図３Ａに概略されるように、本発明は、第一レコン ビナーゼ標的部位、不死化遺伝子、負の選択マーカー遺伝子、及び第二レコンビ ナーゼ標的部位を含む核酸を含有する不死化細胞系を提供する。上記のように、 ＲＴＳを認識するレコンビナーゼの存在しないときには不死化遺伝子は細胞のゲ ノムに取込まれ発現して不死化細胞系を生成する。ＲＴＳをレコンビナーゼと接 触させる場合にはＲＴＳは不死化遺伝子の切除を仲介することができる。好適実 施態様においては、不死化遺伝子及び負の選択マーカー遺伝子はＲＴＳが隣接し する。従って、トランスフォーメーション時に不死化遺伝子及び負の選択マーカ ーが発現し、不死化又は負の選択マーカーの発現に基づいてトランスフォームし た細胞が選択される。ＲＴＳを認識するレコンビナーゼに曝露又は接触すると不 死化遺伝子及び負の選択マーカーが切除され、負の選択薬剤に曝露することによ り脱不死化細胞が選択される。即ち、脱不死化細胞が生存し、不死化遺伝子及び 負の選択マーカー遺伝子を含む細胞が死滅する。 他の実施態様においては、本発明は、第一レコンビナーゼ標的部位、不死化遺 伝子、選択マーカー遺伝子、及び第二レコンビナーゼ標的部位を含む核酸を含有 する不死化細胞系を提供する。上記のように、ＲＴＳを認識するレコンビナーゼ の存在しないときには不死化遺伝子が細胞ゲノムに取込まれ発現して不死化細胞 系を生成する。ＲＴＳがレコンビナーゼと接触する場合にはＲＴＳは不死化遺伝 子の切除を仲介することができる。実施態様においては、レコンビナーゼの存在 しないときには不死化遺伝子は発現するが選択マーカー遺伝子は発現しないよう な構築物の向きが好ましい。これは、図１及び図４に示されるようにＳＴＯＰ部 位を構築物に加えることにより行われることが好ましいが、図５に示されるよう にイントロン内の選択マーカーのまん中にＲＴＳの１つを含むことにより達成さ れる。ＲＴＳを認識するレコンビナーゼに曝露すると介在配列が切除され、不死 化遺伝子及び選択マーカー遺伝子の発現の消失が生じ、脱不死化細胞の選択を可 能にする。また、構築物の向きは、トランスフォーメーション時に不死化遺伝子 及び選択遺伝子が発現するようにし、不死化の選択を可能にする。ＲＴＳを認識 するレコンビナーゼに曝露すると不死化遺伝子及び選択遺伝子が切除され、得ら れた細胞は選択遺伝子の消失により脱不死化が選択される。 別の実施態様においては、本発明は、第一レコンビナーゼ標的部位、不死化遺 伝子、第一選択マーカー遺伝子、第二レコンビナーゼ標的部位、及び第二選択マ ーカー遺伝子を含む核酸を含有する不死化細胞系を提供する。その実施態様にお いては、構築物の向きは、トランスフォーメーション時に不死化遺伝子及び第一 選択マーカー遺伝子が発現しかつ第二選択マーカー遺伝子が発現しないようにす る。これは、ＳＴＯＰ部位を構築物に加えることにより達成されることが好まし いが上記のように別の方法でも行われる。ＲＴＳを認識するレコンビナーゼに曝 露又は接触すると不死化遺伝子及び第一選択マーカー遺伝子が切除され、第二選 択マーカーが発現する。これにより、第二選択マーカー遺伝子に基づいて脱不死 化細胞の選択が可能である。 Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ或いはＦＬＰ／ＦＲＴレコンビナーゼ系を含む好ましいレト ロウイルスクローニングベクターを用いる数種の特定の実施態様が図面に示され る。種々の構築により不死化細胞が生成され、引き続き脱不死化されるが、その 数種だけが図面に示されていることを当業者は認識するであろう。 好適実施態様においては、条件不死化構築物は図１及び図２に示される通りで ある。まず、第一プロモーターと第一選択マーカー；第二プロモーター；レコン ビナーゼ標的部位（ＲＴＳ）が隣接した多重ポリリンカークローニング部位（Ｍ ＰＣＳ）；及び第二選択マーカーを含むクローニングベクターが構築される。不 死化遺伝子、通常はがん遺伝子は、第二選択マーカーの発現を防止する任意のＳ ＴＯＰ配列と共にＭＰＣＳに挿入される。TGACTGACCTGAのようなＳＴＯＰ配列が 当該技術において既知である。従って、レコンビナーゼの存在しないときは第二 プロモーターを用いて不死化遺伝子が発現し、第一プロモーターを用いて第一選 択マーカーが発現する。これにより、トランスフォームした不死化細胞の選択が 可能であるがＳＴＯＰ配列が第二マーカーの発現を防止する。従って、不死化 細胞がクローン化及び発育し、所望されれば追加の遺伝子が加えられる。脱不死 化については、当該技術において周知の技術を用いて適切なレコンビナーゼの発 現（好ましくは一時的）が達成される。これにより、レコンビナーゼ標的部位、 不死化遺伝子を含むＭＰＣＳ、及びＳＴＯＰ配列の切除が得られる。従って、第 二選択マーカー遺伝子がそこで発現し、そのマーカー遺伝子に基づいて脱不死化 細胞が選択される。 図１Ａでは、第一選択マーカーが第一プロモーターによって（又はＬＴＲの内 部プロモーターから）翻訳され、第二プロモーターを経由してＭＰＣＳに挿入さ れた不死化遺伝子に至る。レコンビナーゼの存在しないときはＳＴＯＰ配列が第 二選択マーカーの翻訳を防止する。レコンビナーゼに曝露すると不死化遺伝子及 びＳＴＯＰ配列が切除され、第二選択マーカーが第二プロモーターから進むこと を可能にする。図１Ｂでは、不死化遺伝子の翻訳は内部ＬＴＲプロモーターを経 由して進み、第一選択マーカーはＳＶ４０プロモーター又は等価物によって翻訳 されるが、ＳＴＯＰ配列が第二選択マーカーの翻訳を防止する。レコンビナーゼ に曝露すると不死化遺伝子及びＳＴＯＰ配列が切除され、第二選択マーカーの翻 訳を可能にする。図１Ｃでは、第一選択マーカー及び不死化遺伝子は第一プロモ ーター或いはＬＴＲプロモーターによって翻訳されるが、ＳＴＯＰ配列が第二選 択マーカーの翻訳を防止する。レコンビナーゼに曝露すると不死化遺伝子及びＳ ＴＯＰ配列が切除され、プロモーター又はＬＴＲによって第二選択マーカーの翻 訳を可能にする。図１Ｄでは、緑色蛍光タンパク質及び不死化遺伝子の翻訳がＬ ＴＲプロモーター（又は他のプロモーター）によって起こる。緑色蛍光タンパク 質は選択マーカーとして働く。レコンビナーゼに曝露すると不死化遺伝子及び緑 色蛍光タンパク質コード配列が切除される。従って、細胞はまず緑色蛍光タンパ ク質の存在によって選択され、次に、不在によって選択される。 ＲＴＳは、多くの方法でレコンビナーゼに曝露又は接触する。本明細書におい て“ＲＴＳを認識するレコンビナーゼに曝露する”又は“接触する”とは、ＲＴ Ｓ間の配列の切除を可能にする方法でレコンビナーゼタンパク質がＲＴＳと相互 作用しなければならないことを意味する。一般に、ＲＴＳを含む細胞内にレコン ビナーゼタンパク質が存在することが必要とされることの全てである。これ は、下記のように条件不死化構築物を含む細胞においてレコンビナーゼコード化 遺伝子を発現することにより行われる。 好適実施態様においては、たいてい部位特異的組換えが迅速で効率がよいので レコンビナーゼの発現は一時的である。一時的発現は、当該技術において周知の 様々な方法で達成され、リン酸カルシウム沈降によるプラスミドＤＮＡのトラン スフェクション、電気穿孔法、リポフェクション又は他の物理化学的方法、レト ロウイルスベクターを用いる導入、又はアデノウイルスのような他の組換えウイ ルスベクターからの発現が含まれるがこれらに限定されない。高発現効率が共通 であるのでアデノウイルスが特に好ましい。 他の実施態様においては、レコンビナーゼをコード化する遺伝子は、誘導プロ モーターの制御下に配列され、不死化／脱不死化構築物の一部である。通常は、 図面に示された実施態様のいずれかにおいてレコンビナーゼ遺伝子に作用可能に 結合された誘導プロモーターが含まれる。そのタイプの構築物は、図６及び図３ Ｃに概略される。図６Ａは図１Ｃに対応し、ゲノムに残る誘導プロモーター／レ コンビナーゼ遺伝子が加えらる。図６Ｂは、レコンビナーゼが切除される場合の 図１Ｃに対応する。ＲＴＳ間の配列の切除を引き起こすのに少量のレコンビナー ゼだけが必要であるので、未成熟組換えを避けるために堅く調節されたプロモー ターを使用することが望ましい。レコンビナーゼを隣接する転写停止シグナルも 望ましい。不死化遺伝子、好ましくはレコンビナーゼ遺伝子の組換え及び切除は 、適切な誘導条件が与えられると起こる。 好適実施態様においては、負の選択マーカー、又は正と負の選択マーカーの組 合わせが用いられる。負の選択マーカーは、不死化細胞が移植されないように防 止するために特に有効である。例えば、負の選択マーカーは、不死化遺伝子と共 に発現される。脱不死化後、細胞は、不死化遺伝子に密接に結合されるＨＳＶ− ｔｋ遺伝子をなお含有する細胞を死滅するＧＡＮＣのような負の選択薬剤に曝露 される。個々の例は図３に示される。図３Ａでは、ＲＴＳは不死化遺伝子と負の 選択遺伝子を隣接する。上記のように、不死化遺伝子は第一選択マーカーとして 働く。また、負の選択遺伝子を含むクローナルコロニーは、負の選択マーカーを 用いることにより同定される。即ち、クローナルコロニーは負の選択遺伝子を含 む親コロニーを同定するために用いられる。不死化遺伝子と負の選択遺伝子の発 現を進めるために用いられるプロモーターは、第１ＲＴＳの両側に配置される。 レコンビナーゼと接触する場合、不死化遺伝子と負の選択遺伝子が切除され、細 胞が脱不死化する。残存する不死化細胞は、推定上の脱不死化細胞を負の選択薬 剤に曝露することにより死滅させることができる。単純ヘルペスウイルスチミジ ンキナーゼ遺伝子の場合には、細胞はＧＡＮＣに曝露される。これにより、残存 する不死化細胞が減少しかつ潜在的に消失し、細胞が移植に用いられる場合に望 ましい。細胞ゲノム内に外来核酸が残っているとしても非常に少ないのでその構 築物は特に好ましく、移植に望ましい。図３Ｂでは、不死化細胞を選択するため に正の選択遺伝子が構築物に含まれる。図３Ｃでは、誘導プロモーターの制御下 にレコンビナーゼが含まれ遺伝子操作の必要がない以外は図３Ａと同じ系である 。 好適実施態様においては、種々の構築物について上記で概略されたように脱不 死化前に選択マーカーの翻訳を防止するためにＳＴＯＰ部位が用いられる。また 、図５に示されるように、選択マーカー遺伝子のまん中にＲＴＳを入れることに より機能性選択マーカーの発現を防止することが可能である。その方法は、残存 するヌクレオチドがたぶんフレームシフト突然変異を引き起して非機能性選択マ ーカーを生じるのでレコンビナーゼによってＲＴＳの一方及びｍＲＮＡプロセシ ングによってもう一方を正確に切除することによるものである。 他の実施態様においては、１セットを超えるＲＴＳが用いられる。これは、同 じレコンビナーゼによって認識される追加のＲＴＳセットを用いて又は異なるレ コンビナーゼによって認識されるＲＴＳを用いて行われる。 同じレコンビナーゼのＲＴＳセットを用いる場合、２つのＲＴＳ間の切除が所 望の又は測定可能な結果を得るような構築を設計するのに注意しなければならな い。即ち、２つのＲＴＳ間に切除が起こるので、外来核酸が隣接している１つの ＲＴＳがゲノム内に残ることが可能である。 好適実施態様においては、異なるレコンビナーゼのＲＴＳセットが用いられる 。これは、外来遺伝子がゲノム内に含まれる場合に特に有用である。例えば、図 ４Ａに示された構築物を用いると不死化細胞が第一選択マーカーを用いて選択さ れる。脱不死化については、ＲＴＳ１部位を認識するレコンビナーゼが用いられ 、 脱不死化細胞が第二選択マーカーを用いて選択される。第二選択遺伝子は、脱不 死化時にのみ用いられる第一プロモーター、又は不死化及び脱不死化状態での転 写を可能にするそれ自体のプロモーターを用いて転写される。外来タンパク質を 発現する脱不死化細胞が移植される。少し後で、外来遺伝子産物がもはや必要と しないときに第二レコンビナーゼに曝露することにより第二選択マーカーと外来 遺伝子の切除が得られる。また、外来遺伝子は生体外でのみ必要とされ、その場 合には移植前に第二レコンビナーゼが用いられる。本明細書に記載される他の構 築物についてのように、当業者は本明細書での教示を用いて機能的に類似した種 々の構築物を構築することができる。 付加的な態様においては、２種類のレコンビナーゼを使用して、移植前に外来 核酸の実質的に全てを除去する。例えば、図４Ｂに示される構造物を使用して、 不死化細胞を、第一選択マーカーによって選択する。非不死化に対しては、RTS1 に対応するレコンビナーゼをその構造物に接触させ、第一プロモーターから転写 された第二選択マーカーに基づいて細胞を選択する。細胞は、次いで、移植前に 、RTS2部位を認識する第二のレコンビナーゼと接触して、単−ＲＴＳ部位を除く 全てを除去する。切出し（excision）は非常に効率的であり、クローンコロニー を使用する選択マーカーの喪失を、選択に使用することができる。 一つの態様においては、組換えによって、第一の選択し得るマーカーを切出す 。この方法は、非不死化細胞を移植する場合に好ましく、外来遺伝子を患者に導 入するのを最小化するのに望ましい。 好ましい態様においては、第一の選択マーカーは、薬剤抵抗遺伝子、特に、ヒ スチジノールデヒドロゲナーゼ、ネオマイシン抵抗、ハイグロマイシン抵抗、及 びピューロマイシン抵抗の薬剤抵抗遺伝子である。この態様においては、第二の 選択マーカーは、細胞を分類又はスクリーニングできる遺伝子であり、アルカリ ホスファターゼ遺伝子、緑蛍光タンパク質の遺伝子、lacZ遺伝子、CD8 のような 表面マーカー、第一選択マーカーとして説明した遺伝子の何れかを、第一及び第 二選択マーカーが何れかの単一細胞における異なる遺伝子である限り、含むこと ができる。ある態様においては、形質転換の頻度は、非常に高く、第一又は第二 選択マーカーを除去することができるかもしれない。ただし、非不死化細胞を移 植することを目的とする場合には、発癌遺伝子を含有する細胞が動物中に移植さ れないことを確保することが望まれるので、一般には、少なくとも第二選択マー カーを保持することが好ましい。一つの態様においては、単一の選択マーカー、 例えば、細胞分類(cell sorting)ができる緑蛍光タンパク質のような選択マーカ ーを使用する。この態様においては、マーカーは、不死化遺伝子が導入され、形 質転換細胞が細胞分類によって非形質転換細胞から分離される場合に発現される 。非不死化に際しては、マーカー遺伝子を除去して、細胞を再分類する。非不死 化細胞は、マーカー欠失している。 更なる態様においては、不死化細胞は、表現型によって選択される。例えば、 不死化遺伝子は、かかる遺伝子を含有しない細胞は培地で無限に成長しないので 、第一の選択マーカーとして機能することができ、この基礎に基づけば、かかる 細胞を除去できる。別に、マーカーは、クローン分析を使用して検出することが できる。例えば、HSV-TK遺伝子を使用する場合には、クローンは、ＴＫ活性につ いて分析できる。 ここで使用する用語「遺伝子工学処理細胞(genetically-engineered cell)」 又は「組換え細胞」は、外来（即ち、天然に存在しない）核酸、例えば、ＤＮＡ を導入した細胞を意味する。ここでの「異質」又は「非相同的な」又は「外来」 核酸は、細胞のゲノム中には通常見出されない核酸若しくはそのようなゲノム中 に通常見られない形態の核酸を意味する。従って、発癌遺伝子やレコンビナーゼ 標的部位のような不死化遺伝子は、宿主のゲノム中には通常見られ得ないもので あり、従って、これらの配列を含有する不死化細胞は、遺伝子工学処理されたも のである。ある態様においては、条件(conditionally)不死化細胞を操作して、 １種以上の付加的な外来遺伝子を発現する。このような遺伝子は、ゲノム中に通 常含有され、即ち、相同的であるが認知できる程度には発現されないか、若しく は非相同的であり、即ち、ゲノムに通常見出されない。例えば、相同的な成長因 子遺伝子は、ゲノム内に通常見られない形態で細胞中に導入することができる。 即ち、細胞中で通常見られないレベルで成長因子を発現できるようにするプロモ ーター等の制御配列とともに、又は成長因子を通常発現しない細胞タイプ内に導 入することができる。また、非相同的な遺伝子を導入することができる。従って 、 本発明の条件不死化細胞は、遺伝子工学処理して、１より多くの外来核酸配列を 含むことができる。 本発明の条件不死化構造体又は方法は、また、治療的に有利な付加的な外来遺 伝子を含有してもよい。例えば、成長因子をコードする遺伝子を導入して、移植 細胞の生存を容易としたり、患者の治療を容易化することができる。例えば、神 経成長因子（ＮＧＦ）や、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）、ニューロトロフ ィン−４（ＮＴ４）及び脳由来ニューロトロフィン因子（ＢＤＮＦ）などのニュ ーロトロフィンは有用かもしれない。神経細胞以外の細胞を使用する場合、適切 な外来遺伝子には、例えば、ヒト成長因子や、上皮性成長因子、神経成長因子等 の成長因子；サイトカイン；酵素及び酵素阻害剤；α、β又はγインターフェロ ン等のインターフェロン；凝固因子（因子VIII）；ＡＤＡ；抗細胞死遺伝子；そ の他のタンパク質などをコードするものが挙げられる。 従って、例えば、治療剤をコードする異質ＤＮＡの導入等の生体外操作のため に不死化し、次いで非不死化して、治療剤を発現する遺伝子工学処理細胞を患者 に導入することができる。また、細胞自身が治療剤であり、移植されて、例えば 、パーキンソン病におけるような病気の又は死にかけた細胞を置換する。 一つの態様においては、細胞を、遺伝的に欠陥のある患者から取り出し、本発 明の技術を使用して細胞を再導入する前に、工学処理して、少なくとも訂正され た遺伝子の一つのコピーを含有させる。このように処理できる遺伝的な病気はこ の技術分野において公知である。 不死化遺伝子に加えて、本発明の細胞は、以下で更に詳細に記載するように、 付加的な外来核酸を有する。この外来核酸には、少なくとも２種類のレコンビナ ーゼ標的部位、好ましくは、選択（マーカー）遺伝子、転写終結部位、リンカー 、及び他の上記のような興味のある遺伝子が含まれる。 異質核酸又は外来核酸は、例えば、カルシウムホスフェート媒介トランスフェ クション、ＤＥＡＥ−媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、 レトロウィルス形質転換、アデノウィルス形質転換、ヘルペスウィルス形質転換 、プロトプラスト融合及びリポフェクションを含みかつこれに限定されない、当 該技術分野において公知の各種技術によって導入することができる。 好ましい態様においては、外来ＤＮＡは、レトロウィルストランスフェクショ ンの技術を使用して、細胞に導入する。組換えレトロウィルスを使用して、不死 化遺伝子、選択又はマーカー遺伝子、レコンビナーゼ標的部位及びレコンビナー ゼを導入する。組換えレトロウィルスを細胞株を梱包するのに使用して、高力価 のウィルス粒子（一般に、10⁵〜10⁶pfu/ml）の培養上清を製造する。組換えウィ ルス粒子を使用して、当該技術分野で公知のようにウィルス粒子を含有する培地 で細胞培養体を培養することによって細胞培養体マーカー又はその子孫を感染す る。レトロウィルス感染に続いて、細胞を洗浄し、次いで、標準培地で培養する 。感染細胞は、次いで、異質ＤＮＡの取り込み及び発現について分析する。細胞 は、選択マーカー遺伝子を取り込みかつ発現する細胞について選択する選択条件 に暴露してもよい。 好ましい態様において、クローニングベクターは、レトロウィルスベクターで あり、図面に記載されるような、長い末端繰り返し（ＬＴＲ）を利用する。別の 態様では、伝統的な発現プラスミド、ヘルペスウィルスをベースとするベクター 、並びに当該技術分野の当業者に周知の等価物を利用する。 更に別の態様では、当該技術分野で公知の カルシウムホスフェート媒介トラ ンスフェクションの技術を使用して、異質ＤＮＡを導入する。例えば、本発明の 条件不死化細胞構造物を含有するカルシウムホスフェート沈殿を、WiglerらのPr oc．Natl．Acad．USA 76:1373-1376(1979)の技術を使用して調製する。細胞培養 体を、組織培地皿に確立する。細胞のプレーティング後２４時間後に、約20μg/ mlの異質ＤＮＡを含有するカルシウムホスフェート沈殿を添加する。細胞は20分 間室温で培養する。30μＭのクロロキンを含有する組織カルチャー培地を添加し 、細胞を37℃で一夜培養する。トランスフェクションの後、細胞を選択マーカー 遺伝子を取り込みかつ発現する細胞について選択する選択条件に暴露してもよい 。 上記技術は、特定の細胞について一度より多くの回数実施することができる。 例えば、これらの技術を使用して、レコンビナーゼ部位を有する不死化遺伝子を 導入し、次いで、更に、不死化細胞に外来核酸、例えば、レコンビナーゼをコー ドする発現プラスミドを導入する。 当該技術分野の当業者によって理解されるように、非常に広範な適当なプロモ ーターを本発明で使用することができる。特に有用なプロモーターには、レトロ ウィルスのＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、及び組織又は細胞特異的プロモータ ー、特に、条件不死化する細胞型に特異的なプロモーターが含まれるが、これら に限定されるものではない。 本発明の条件不死化方法を実施するのに使用できる適当な細胞には、本発明の 構造物に使用されるレコンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼを産生し ない何れの細胞型が含まれる。好ましくは、細胞は、それらがレトロウィルスベ クターによって感染され得るように分裂する。好適な細胞は、脊椎動物細胞、好 ましくは、霊長類、ヒツジ、ブタ、牛、犬、猫及びウマのような哺乳動物、更に 好ましくは、ヒト細胞である。特に好ましい細胞は、神経幹細胞、造血性幹細胞 、膵臓幹細胞、肝臓幹細胞、上皮幹細胞、腸幹細胞、骨形成幹細胞及び嗅覚幹細 胞等のあらゆるタイプの幹細胞が挙げられ、特に好ましい幹細胞は、神経クレス ト幹細胞及び造血幹細胞である。好適な非幹細胞には、膵臓島細胞、線維芽細胞 、破骨細胞、骨芽細胞、上皮又は真皮性細胞、内皮細胞、肝細胞、赤芽球、骨格 筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、メラノサイト、リンパ球（Ｂ、Ｔ）、骨髄性細 胞及びグリア細胞等を含む。 好ましい態様において、非不死化細胞の表現型、成長及び寿命は、遺伝子操作 の内同一の細胞型と同一である。即ち、非不死化細胞は、不死化前の出発細胞と 同一である。別の態様では、細胞は変更した特性を有してもよい。 ある場合には、出発細胞が、in vivo で延長した寿命を有することを認識すべ きである。即ち、それらの細胞は、宿主細胞中に存在するかもしれないが、生体 外では無限に成長することはできない。従って、例えば、島細胞は、ヒトにおい て、生存期間生きつづけるものと考えられる。更に、島細胞は、生体外での細胞 カルチャーにおける成長及び増殖にとって依然として不死化が必要であるかもし れない。同様に、神経幹細胞のような幹細胞は、延長した期間持続するかも知れ ず、また、in vivo で限定された自己更新を行うことができるが、細胞カルチャ ーにおいて無限成長及び無限増殖にとって、不死化遺伝子により不死化されなけ ればならない。不死化細胞の無限拡大によって、複数の患者の治療に対する「普 遍的ドナー細胞株」が形成できる。 新しい培地条件に暴露されない限り、不死化細胞株の分裂によって、実質的に 同一の娘細胞が形成されることは理解されるべきである。即ち、定義上、不死化 細胞は、無限再生ができる。例えば、神経クレスト幹細胞のような不死化幹細胞 の細胞分裂によって、２つの神経クレスト幹細胞が形成され、両方とも、同等に 非分化である。ある実験又は生理学的条件に曝されると、これらの幹細胞は、部 分的又は完全な分化を生じる。 当該技術分野の当業者によって理解されるように、不死化細胞株に適当な培地 条件は、細胞型によって変動する。 本発明の条件不死化方法には、当該技術分野の当業者にによって理解されるよ うに、多くの用途がある。 一つの態様において、条件不死化細胞は、幹細胞であり、好ましい態様では、 細胞は、WO94/02593に記載されるような神経クレスト幹細胞及び多分化能神経幹 細胞である。ここで、この文献を参考として明示的に導入する。当該技術分野の 当業者に理解されるように、神経幹細胞は、中枢神経及び末梢神経系のグリア及 びニューロンを形成するものであり、移植又は体内埋植されて、新規なニューロ ン及びグリアを形成する。例えば、急性外傷性自動車障害に対する、脊髄中の運 動ニューロン及びその関連するグリア細胞の置換又はパーキンソン病の治療のた めの、中脳における死滅しつつあるドーパミン作動性ニューロンの置換は、予備 診断研究において追求されている活動的な領域である。遺伝子工学処理された不 死化細胞の移植の第2 の用途は、遺伝子治療である。細胞は、移植前に、喪失し た遺伝子産物を発現するように遺伝子的に修正され、次いで、これらの細胞を特 定の脳の領域に移植することによって、必要とする身体の領域に遺伝子産物を送 達する。かかる遺伝子治療方法の原理の証明は、試験系として、遺伝性ムコ多糖 症を使用する動物モデルにおいて既になされている。 別の態様において、幹細胞以外の細胞を、生体外成長のために不死化し、次い で、生体中に再導入する前に、非不死化することができる。例えば、米国特許第 5,387,237 号明細書は、ブタ膵臓島細胞で充填されたプラスチックシリンダーを 含有するバイオ人工的な膵臓を開示している。これらのブタ膵島細胞を生体外成 長及び増殖のために不死化して、長期にわたって均一化させ、次いで、生体への 導入前に不死化することができる。 例えば、これらの方法は、例えば、米国特許第5,299,346 号明細書に一般的に 記載されているように、生体外遺伝子治療技術に使用することができる。従って 、患者に移植される細胞は、ヒトか動物からに係わらず、条件不死化処理するこ とができ、次いで、移植前に非不死化することができる。一つの態様において、 細胞を、移植使用とする患者から、又は他の態様において、他の患者又は動物か ら取り出す。例えば、米国特許第5,387,237 号明細書に記載されるように、ブタ 膵島細胞を条件不死化し、ヒトへの移植前に、非不死化することができる。 従って、宿主ヒト又は哺乳動物への、幹細胞のような不死化細胞を導入又は移 植する方法が提供される。移植技術は、当該技術分野において周知であり、非不 死化細胞で実施することができる。従って、例えば、非不死化細胞を、宿主に移 植して、細胞の治療的可能性を評価したり、神経系の神経性の病気を治療するこ とができる。好ましい態様では、細胞は、幹細胞であり、病気は、末梢神経系の 神経性の病気である。 更に、不死化細胞株を、その細胞の発達、分化及び／又は機能を発揮できる薬 剤をスクリーニングするために使用することができる。これらの薬剤には、小分 子有機薬剤及び成長因子が含まれる。 不死化細胞は、不死化発癌遺伝子が生体への導入に先立って除去され、不死化 遺伝子による腫瘍の潜在的な形成が排除されているので、特に、移植又は体内埋 植に有用である。本発明の方法は、ヒトの治療及び動物用途の両方、例えば、非 ヒト細胞のヒトの使用に適用可能である。従って、本発明の方法及び構造物は、 ヒトや、ブタ、霊長類、マウス又はラット等のげっし類動物、犬、牛及び羊から の細胞で使用することができる。 以下は、例示として提示するものであり、本発明の範囲を限定するものとして 構成するものではない。更に、ここで言及する全ての文献は、参考として明示的 に導入する。 実施例 この実施例では、標準的なモロニーマウス白血病ウィルスレトロウィルスベク ターを使用し、修正した。v-myc 発癌遺伝子を有する標準組換え複製無能力レト ロウィルスベクターを、v-myc コード配列をフランキングするloxP部位を配置し 、かつloxP-v-myc-loxP 配列の下流（3'）側にβ-ガラクトシダーゼコード配列 を配置するように、修正した。更に、実験には、アルカリホスファターゼ、ネオ マイシン抵抗及び緑蛍光タンパク質(GFP)及びGFP の「ヒト化」物（蛍光活性化 細胞分類の使用が可能な、GFP よりも10倍感度の高い緑ランタンタンパク質(GLP )と呼ばれる）の両者を含む付加的な選択マーカーを使用した。これらの修正は 、当該技術分野の当業者にとってよく知られ、制限酵素、消化、連結、PCR 増幅 、細菌形質転換、プラスミド単離及び更なる特性確認を含む標準的な分子生物学 的手法及び配列決定によって実施した。 この修正した組換えレトロウィルス構造物が実際に組換え感染性ウィルス粒子 を産生することができることを確認するために、以下の実験をまず実施した。感 染性複製無能力ウィルス粒子を調製するために、構造物を梱包株BOSC 23 中にト ランスフェクトした。BOSC 23 細胞の過渡的トランスフェクションに続いて、レ トロウィルス粒子を含有する、これらの３日後のトランスフェクション細胞の上 清を集めた。これらの上清中の感染性ウィルスの力価は、10⁵〜10⁶pfu/ml であ った。これらの感染性上清を使用して、NIH 3T3 細胞を感染した。感染後数日の これらの細胞を、鳥v-myc に対する抗体で染色することにより、これらの細胞の 多くが、v-myc 発癌遺伝子を発現したことを確認した。姉妹カルチャーをXgal剤 で固定しかつ染色することによって、ベクターの設計から予測されるように、感 染細胞のいずれも、β-ガラクトシダーゼを発現しなかったことが確認された。 従って、この実験から、(1)構造物が、感染性レトロウィルス中に梱包され得る こと、及び(2)そのベクター中に含まれるv-myc 発癌遺伝子コード配列が転写さ れ、感染細胞においてタンパク質に翻訳され得ることの２つの重要な事柄が見出 された。 cre 酵素をレトロウィルス感染細胞にトランスフェクションすると、v-myc コ ード配列が切出され、β- ガラクトシダーゼ酵素活性が付随的に活性化された。 このことは、レトロウィルス感染細胞を、cre レコンビナーゼがサイトメガロウ ィルスCMV エンハンサーの制御下にある発現構造物によってトランスフェクトす ることによって行った。そのトランスフェクションから24〜48時間後に、細胞は 、Xgal染色のために、固定し、加工した。この染色により、レトロウィルス感染 細胞が、その核内に青色反応生成物によって示されるβ- ガラクトシダーゼ酵素 活性を示すことが分かった。cre コード配列を欠失した同一の発現ベクターでト ランスフェクトしたコントールカルチャーには、β- ガラクトシダーゼ活性は見 出されなかった。cre トランスフェクト細胞を、v-myc 発癌遺伝子に対する抗体 で染色することによって、これらのトランスフェクト細胞が、もはや、cre レコ ンビナーゼによるプロウィルスからの切出しに基づいて予想されるように、v-my c 発癌遺伝子を発現しないことが確認された。 従って、これらの実験によって、cre レコンビナーゼが、哺乳動物細胞ゲノム 中の一体化されたプロウィルスからv-myc 発癌遺伝子配列を切出し得ること、ま た、この発癌遺伝子の切出しによって、このベクターの設計に基づいて予想され るように、下流側のリポーター遺伝子、この場合、β- ガラクトシダーゼの付随 的な活性化が生じることが示された。 このレトロウィルス構造物からのv-myc 発癌遺伝子の発現によって、一次細胞 型を不死化できる機能的v-myc 配列が産生された。このことは、マウス胚線維芽 細胞を使用して行った。線維芽細胞を、標準的操作によって単離し、培養し、次 いで、loxP胚によてフランキングされた修正v-myc 発癌遺伝子をコードし、β- ガラクトシダーゼ遺伝子を下流側に含むレトロウィルスベクターで感染させた。 このベクターを、retmycgal と命名し、図２Ｃに示す。この感染細胞を、６mMヒ スチジンの存在下で培養することにより、選択下に置いた。レトロウィルスベク ターは、また、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する。従って、組み 込まれたプロウィルスを発現する細胞は、６mMヒスチジンの存在の下で生存する が、非感染細胞は死滅する。非感染細胞のコントールプレートは、６mMヒスチジ ンの不存在下において、非感染及び感染細胞の間の成長速度を比較した。約６継 代を含有するカルチャーでの４〜５週間の成長の後、ヒスチジン抵抗性 myc感染 細胞と、非感染細胞との間には、明らかな相違が視認された。この時までに、非 感染コントール線維芽細胞は、老化に到達し、平坦化し、分裂を停止した。これ とは対照的に、retmycgal レトロウィルス構造物で感染した細胞は、培地中にお いて、力強い増殖を示し続けた。これらの細胞のいくつかを、v-myc に対する抗 体で固定化し、染色すると、これらの感染線維芽細胞の核に、鳥v-myc 発癌遺伝 子の豊富な発現が示され、その不死化状態がv-myc 発癌遺伝子の発現によること を確認した。予想されるように、これらの細胞には、β- ガラクトシダーゼ活性 は検出されなかった。 これらの実験は、その系が非常に敏感なので、ネオマイシン薬剤抵抗を第一選 択マーカーとして使用して、行った。 このmyc コード配列は、確立された感染細胞のゲノムから、その細胞へのcre 発現構造物のトランスフェクションによって切出すことができた。一過性感染細 胞の場合に以前に示されたように、myc の切出しによって、付随的に、β- ガラ クトシダーゼ遺伝子の活性化が生じた。CMV cre 構造物のこれらの細胞へのトラ ンスフェクションに続いて、Xgal染色によって、多くの青色細胞を検出すること ができた。従って、これらのデータから、少なくとも６回継代した安定な感染一 次細胞においても、cre レコンビナーゼが、v-myc コード配列を切出し、下流の マーカー、β- ガラクトシダーゼの発現を活性化できることが分かった。更に重 要なことは、これらのデータによって、組み込まれたプロウィルスからのv-myc コード配列の発現が、実際に、予想されるように、これらの一次マウス線維芽細 胞を機能的に不死化できることを示す。 更に、レコンビナーゼの導入に対する従来の方法（即ち、ＤＮＡ媒介遺伝子転 移）によって、５〜10％の細胞が非不死化したのに対して、cre レコンビナーゼ をコードするアデノウィルスベクターの使用によって、ほぼ、５０％の細胞が非 不死化する。 また、WO/94/02593 に従う神経クレスト幹細胞は、neo を第一選択マーカーと して、かつアルカリホスファターゼ遺伝子を第二選択マーカーとして使用して、 同様に不死化する。 要約すると、この実施例によって、retmycgal レトロウィルスベクター及び他 のベクターで感染して不死化できる一次マウス胚線維芽細胞を使用して、これら の不死化細胞を少なくとも６世代にわたって安定に継代し、次いで、これらの細 胞をcre 発現構造物によってトランスフェクションすることによってそのゲノム から発癌遺伝子myc 配列を切出すことによって、その細胞を非不死化できること が証明された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．不死化哺乳動物細胞株であって、不死化遺伝子をフランキングする、少なく とも第一及び第二レコンビナーゼ標的部位を有する外来核酸を前記細胞のゲノム 中に含有し、前記標的部位が、レコンビナーゼと接触した時に、前記不死化遺伝 子の切出しを媒介できることを特徴とする細胞株。 ２．前記外来核酸が更に選択マーカー遺伝子を有する請求項１に記載の細胞株。 ３．前記選択マーカー遺伝子が、負の選択マーカー遺伝子である請求項２に記載 の細胞株。 ４．前記核酸が、更に、停止部位を有する請求項２に記載の細胞株。 ５．前記外来核酸が、更に、第一選択マーカー遺伝子と、第二選択マーカー遺伝 子とを含有する請求項１に記載の細胞株。 ６．前記第二選択マーカー遺伝子が、第一及び第二レコンビナーゼ標的部位の間 にない請求項５に記載の細胞株。 ７．不死化細胞のゲノムにおいて不死化遺伝子をフランキングするレコンビナー ゼ標的部位を含有する不死化細胞を形成する方法であって、 前記方法が、細胞を、 (a)第一レコンビナーゼ部位、 (b)不死化遺伝子、及び (c)第二レコンビナーゼ部位、 を含有する外来核酸で形質転換して、レコンビナーゼの不存在下において、前 記外来核酸を前記細胞のゲノム中に挿入することを特徴とする方法。 ８．前記核酸が、更に、少なくとも一種の選択マーカー遺伝子を含有する請求項 ７に記載の方法。 ９．前記選択マーカー遺伝子が、負のの選択マーカー遺伝子である請求項８に記 載の方法。 10．不死化細胞のゲノム中に不死化遺伝子をフランキングするレコンビナーゼ標 的部位を含有する外来核酸を含有する不死化細胞を非不死化する方法であって、 前記方法が、前記レコンビナーゼ標的部位を、該レコンビナーゼ標的部位を 認識できるレコンビナーゼと接触することを特徴とする方法。 11．前記不死化細胞を前記レコンビナーゼをコードするレコンビナーゼ核酸で形 質転換し、該形質転換細胞を、前記レコンビナーゼが発現し、前記不死化遺伝子 が切出される条件下において維持することによって、前記接触を行う請求項10に 記載の方法。 12．不死化細胞の非不死化方法であって、 (a)(i)第一レコンビナーゼ標的部位、 (ii)不死化遺伝子、 (iii)負の選択マーカー遺伝子、及び (iv)第二レコンビナーゼ標的部位、 を有する外来核酸を、細胞のゲノム中に挿入して、前記レコンビナーゼ標的 部位間の配列の切出しによって、不死化遺伝子及び負の選択マーカーを切出すよ うな配向で切出し得る不死化遺伝子を含有する不死化細胞を製造し、そして (b)前記レコンビナーゼ標的部位を前記不死化標的部位を認識するレコンビナ ーゼと接触して、前記不死化遺伝子及び負の選択マーカー遺伝子を切出す、 ことを特徴とする方法。 13．前記不死化細胞を、前記レコンビナーゼが発現される条件下において前記レ コンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼをコードするベクターで形質転 換することによって前記接触を行う請求項12に記載の方法。 14．前記外来核酸が、更に、前記レコンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナ ーゼの遺伝子を含有し、前記レコンビナーゼ遺伝子が、誘導性プロモーターと作 動可能に連結され、前記不死化細胞を前記レコンビナーゼが発現される条件下で 成長させることによって前記接触を行う請求項12に記載の方法。 15．前記方法が、更に、負の選択マーカー剤の存在下に非不死化細胞を選択する 工程を含有する請求項12に記載の方法。 16．前記外来核酸が、更に正の選択マーカー遺伝子を含有する請求項12に記載の 方法。 17．前記外来核酸が、更に、付加的な外来遺伝子を含有する請求項12に記載の方 法。 18．不死化細胞の非不死化方法であって、 (a)(i)第一レコンビナーゼ標的部位、 (ii)不死化遺伝子、 (iii)選択マーカー遺伝子、及び (iv)第二レコンビナーゼ標的部位、 を有する外来核酸を、細胞のゲノム中に挿入して、前記レコンビナーゼ標的 部位間の配列の切出しによって、不死化遺伝子を切出して、選択マーカーを発現 させ、そして (b)前記レコンビナーゼ標的部位を前記レコンビナーゼ標的部位を認識するレ コンビナーゼと接触して、前記不死化遺伝子を切出す、 ことを特徴とする方法。 19．前記核酸が、更に、停止部位を含有する請求項18に記載の方法。 20．前記不死化細胞を、前記レコンビナーゼが発現される条件下において前記レ コンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼをコードするベクターで形質転 換することによって前記接触を行う請求項18に記載の方法。 21．前記外来核酸が、更に、誘導性プロモーターと作動可能に連結された前記レ コンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼの遺伝子を含有し、前記不死化 細胞を前記レコンビナーゼが発現される条件下で成長させることによって前記接 触を行う請求項18に記載の方法。 22．前記方法が、更に、前記選択マーカー遺伝子を発現する非不死化細胞を選択 する工程を含有する請求項18に記載の方法。 23．不死化細胞の非不死化方法であって、 (a)(i)第一レコンビナーゼ標的部位、 (ii)不死化遺伝子、 (iii)第一選択マーカー遺伝子、 (iv)第二レコンビナーゼ標的部位、及び (iv)第二選択マーカー遺伝子、 を有する外来核酸を、細胞のゲノム中に挿入して、前記不死化遺伝子が発 現される場合に、第一の選択マーカー遺伝子も発現され、前記第二選択マー カー遺伝子は発現されず、前記不死化遺伝子が切出される場合には、前記第二選 択マーカー遺伝子が発現されるような配向で、切出し得る不死化遺伝子を含有す る不死化細胞を製造し、そして (b)前記レコンビナーゼ標的部位を前記レコンビナーゼ標的部位を認識するレ コンビナーゼと接触して、前記不死化遺伝子を切出す、 ことを特徴とする方法。 24．前記不死化細胞を、前記レコンビナーゼが発現される条件下において前記レ コンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナーゼをコードするベクターで形質転 換することによって前記接触を行う請求項23に記載の方法。 25．前記外来核酸が、更に、前記レコンビナーゼ標的部位を認識するレコンビナ ーゼの遺伝子を含有し、前記レコンビナーゼ遺伝子が、誘導性プロモーターと作 動可能に連結され、前記不死化細胞を前記レコンビナーゼが発現される条件の下 で成長させることにより前記接触を行う請求項23に記載の方法。 26．前記核酸が、更に、付加的な外来遺伝子を含有する請求項24に記載の方法。 27．前記外来核酸が、更に、停止部位を含有する請求項24に記載の方法。