JPH05505944A - 修飾肝細胞およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ７．感染性組み換えレトロウイルスが下記からなる群から選択される請求項６の 形質導入肝細胞： （１）　ｐＬＪ （２１　９ＥＭ （４１　ｐＬＴＲ−ＬＤＬＲ （５１　ｐＢＡ　−ＬＤＬＲ （６）　ｐＨ４　−ＬＤＬＲ （７１　ｐＴＫ　−ＬＤＬＲ ８．本賞的にヒト肝細胞にレトロウイルスヘクターによって形質導入された組み 込まれた遺伝物質を含む移植可能な形質導入ヒト肝細胞からなる、目的とするポ リペプチドまたは蛋白質を個体に放出するための治療用組成物。 ９，組み込まれた遺伝物質がホルモン、レセブター、酵素または薬物をコードし ている請求項８の治療用組成物。 １０．組み込まれた遺伝物質をインビボで発現する形質導入肝細胞を製造する芳 法であって、下記からなる方法： ａ）培養肝細胞を、目的とする遺伝物質からなる組み換えゲノムを有する感染性 組み換えレトロウイルスを含有する培地と接触させ：およびｂ）この培養肝細胞 および上記感染性組み換えレトロウイルスを含存する培地を、該肝細胞が組み換 えレトロウイルスに惑染するのに適当な条件下に維持し、それによって形質導入 肝細胞を製造する。 比噛乳類において目的とする組み込まれた遺伝物質を発現する形質導入肝細胞を 移植する方法であって、以下の段階からなる方法：ａ）培養肝細胞を、目的とす る遺伝物質からなる組み換えゲノムを有する感染性組み換えレトロウイルスを含 有する培地と接触させ；ｂ）この培養肝細胞および上記感染性組み換えレトロウ イルスを含有する培地を、該肝細胞が組み換えレトロウイルスに感染するのに適 当な条件下に維持し、それによって形質導入肝細胞を製造し；およびＣ）上記ｂ ）において製造された修飾肝細胞を補乳類に形質導入する。 １２．蛋白質またはポリペプチドの異常産生の結果である肝機能障害を治療する 方法であって、その異常産生が上記障害の原因である蛋白質またはポリペプチド をコードしている遺伝物質からなる形質導入肝細胞を、該蛋白質またはポリベブ チドの肝細胞における発現に適当な条件下に肝臓に導入することからなる方法。 １３８個体に、ホルモン、レセプター、酵素または薬物を与える方法であって、 ホルモン、レセプター、酵素または薬物をコードしている遺伝物質で肝細胞に形 質導入し、この形質導入肝細胞を個体に導入することからなる方法。 １４、肝細胞によって正常に発現された蛋白質またはポリペプチドを、該蛋白質 またはポリペプチドの発現が異常である個体に与える方法であって、以下の段階 からなる方法： ａ）　ｌ）上記蛋白質またはポリペプチドをコードしている遺伝物質；２）両栄 養性レトロウィルスから得られたＬＴＲ配列、ｔＲＮＡ結合部位およびＰｓｉパ ッケージング部位；および ３）真核生物由来の少なくとも１つのプロモーター；からなる組み換えゲノムを 有する組み換えレトロウィルスによって肝細胞に形質導入し；そして ｂ）形質導入肝細胞を個体に導入する。 １５、目的とする遺伝物質を組み込まれている形ｆ導入肝細胞であって、該細胞 は該遺伝物質によってコードされている目的とする蛋白質またはポリペプチドを 乙Ｚ臣ボで発現でき、該遺伝物質は、α−５ＧＣおよびＭＦＧからなる群より選 択されるレトロウィルスベクターからなる形質導入肝細胞。 １６、目的とする遺伝物質が以下からなる群から選択される請求項１５の形質導 入肝細胞： 正常肝細胞において存在し発現されるＤＮＡ　。 正常な場合肝細胞で生しないＤＮＡ　。 正常な場合肝細胞で生じるが生物学的に有意なレベルでは発現されないＤＮＡ　 ；および 肝細胞において発現され得るように修飾できる開Ａ。 １７、　少なくとも１つの選択マーカーをコードしている［ｌＮＡをさらに含む 請求項１６の形質導入肝細胞。 １８、目的とする遺４ａ賞が、治療上価値のある、ホルモン、レセプター、酵素 およびポリペプチドからなる群から選択された蛋白質またはポリペプチドをコー ド胞が組み換えレトロウィルスに感染するのに適当な条件下に維持し、それによ って形質導入肝細胞を製造する。 ２１、肝細胞の感染が±ｙｅ上三で生じる請求項２０の方法。 ２２、肝細胞の感染がインビボで生じる請求項２０の方法。 ２３、体に蛋白質またはポリペプチドを与える方法であって、以下の段階からな るｂ）該形質導入肝細胞を体に導入するか、あるいは該形質導入肝細胞を体の表 面に布する。 明　細　書 およびその　゛ びホワイトヘッドバイオメディカル研究所（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ　Ｉｎ５ｔｉｔ ｕｔｅ　ｏ　ｆ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ）の支援を受けた。 を介して輸送される栄養物を他の生体細胞の使用のために処理する主な部位とし バク質類の脂質構成要素類の合成に関与している酵素類は、肝細胞膜中に出願す 肝細胞で、それらに導入されたすなわち取り込まれた目的とする遺伝物質（ＤＮ Ａな問題の遺伝物質を含有するウィルスを用いることによってまたはその他の手 段は：１）正常肝細胞中に存在し生物学的に有効なレベルで発現される遺伝物質 でても正常肝細胞中に存在するが、しかし上記細胞中において生物学的有効レベ ルで発現されない遺伝物質。 ることかできる；このＤＮＡは、問題の遺伝子（すなわち、肝細胞中における発 現伝物！（すなわち、目的とする遺伝物質および適宜選択マーカーをコードする 遺現される。この目的のために特に有用であるのは、両栄養性宿主域を有しかつ 肝細胞中に組み込まれることになる問題の遺伝物質を含むレトロウィルスベクタ ーである。 レトロウイルスヘクターは、問題のポリペプチドまたはタンパク質をコードする 遺伝物質および優性選択マーカーをコードする遺伝物質を含んだ遺伝物質で肝細 胞類を安定に形質導入するために用いられてきた０問題のポリペプチドをコード するＤＮＡおよび優性選択マーカーをコードする開Ａを含む遺伝物質は、培養肝 細胞中に導入されてきた。それらが組み込まれた肝細胞類による遺伝物質の発現 も、同様に明らかとされてきた。 肝細胞類が含有する組み込まれた遺伝物質を発現する形質導入肝細胞類の移植方 法も、同様に、本発明の課題である。本発明の形質導入肝細胞類は、たとえば、 後天的または先天的の肝細胞（肝）機能障害の予防および治療において有用なポ リペプチド類またはタンパク［１？の運搬に用いられる。たとえば、それらは、 先天性低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬＲ）欠損の治療に使用でき、こ のレセプターは肝細胞中で合成され、および、過アンモニア血症を起こす先天性 オルニチントランスカルバミラーゼ（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ　ｔｒａｎｓｃａｒｂ ａｌｙａｓｅ）　（ＯＴＣ）欠損を治療するために使用できる。 本発明の肝細胞は、肝細胞機能異常を治療することができる手段として有用であ る。すなわち、肝細胞類中で正常に合成されてはいるがその量が適当でないタン パク質またはペプチドの過剰産生または過小産生を補償するために選択された目 的とする遺伝物質で肝細胞を形質導入できる。一方、それらは、適当量で産生さ れてはいるが機能上欠陥がある。（例　異常構造またはアミノ酸改変）タンパク 質またはポリペプチドをコードする問題の遺伝物質で形質導入できる。 本文で記載のエクスビボで修飾される肝細胞は個体から入手でき、修飾され、移 植またはグラフト移植によって前記個体に戻すことができ、または、ドナー（す なわち、最終宿主以外の起Ｓ）から入手でき、修飾され、移植またはグラフト移 植によって再度宿主に戻すことができる。 本発明の操作の重要な利点として、前記の遺伝子工学産生肝細胞を用いて、タン パク質またはペプチドが正常に産生される際の手段と本質的に同一の手段によっ てこのタンパク質またはペプチドを治療上所望の量で提供でき、自家移植の場合 においては免疫反応および移植片拒絶の危険がほとんどないことが挙げられる。 さらに、個体に投与する前にポリペプチドを高価で（かつしばしばコスト高の） 精製に供する必要がなく、このことは、通常、単離ペプチドについて必要である 。 本発明によって改変された肝細胞は、正常に産生されるようなポリペプチドを産 生ずる。 遺伝子類はレトロウイルスヘクターを用いて肝細胞中に導入できるので、それら はレトロウイルスヘクターに制御される（従う）；このような場合、問題の遺伝 子は、レトロウィルスプロモーターから転写される。プロモーターは、ＲＮＡ合 成を開始させＲＮＡポリメラーゼ分子類によって認識される特定のヌクレオチド 配列である。また、（前記組換えレトロウィル中に組み込まれたプロモーターに 加えて）追加のプロモーター要素を有するレトロウィルスベクター類も問題の遺 伝物質の転写を担っており、これも使用できる。たとえば、外的因子またはキュ ー（きっかけ）によって改変された付加プロモーターを有する構築体も使用でき 、この外的因子またはキューを活性化することによって、改変された肝細胞類に よって産生されるポリペプチドのレベルを制御することが可能となる。たとえば 、熱衝撃タンパク質類は、温度によってプロモーターが制御される遺伝子類によ ってコードされるタンパク質類である。金属含有タンパク質であるメタロチオネ インをコードする遺伝子のプロモーターは、カドミウム（Ｃｃｌ”）イオン類に 応答性である。また、外的キュー類によって影響を受けるこのプロモーターまた は別のプロモーターの組み込みは、また、前記工学産生肝細胞によるポリペプチ ドの産生を制御可能である。 凹皿Ω囚単ｌ説朋 第１図は、野生型マウス白血病ウィルス（レトロウィルス性）ゲノムの略図であ る。 第２図は、本発明で有用なレトロウィルスベクター類の略図であり、それぞれが 、組換えゲノムを有している。第２ａ図は、ｑである；第２ｂ図は、ｐＥｍであ る；第２ｃ図は、ｐＨ＋である。 第３図は、ヒトＬＤＬＲ発現ベクター類の略図である。それぞれが、ＬＤＬＲ発 現を促進する異なる転写要素を有している：　ＬＴＲ−ＬＤＬＲ、ウィルスの長 い末端（ｔｅｒ＋ｗ）反復配列類（ＬＴＲ）　；　ＢＡ−ＬＤＬＲ、ニワトリヘ ータ・アクチン遺伝子（Ｂ＾）由来プロモーター；Ｈ４〜ＬＤＬＲ、ヒトヒスト ンＨ４遺伝子（Ｈ４）由来プロモーター；　ＴＫ−ＬＤＬＲ。 単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）由来プロモーター。 第４図はサザンブロントの３日間暴露であり、ラット肝細胞培養物中におけるプ ロウィルスの組み込みに及ぼす細胞外マトリックスおよび感染時間の効果を示し ている。 第５図は、ラント肝細胞の形質導入培養物およびＮＩＨ３Ｔ３中におけるヘータ ・ガラクトシダーゼの細胞化学部位を示しくパネルＡ−Ｆ）、および、ラット肝 細胞培養物の肝特異的細胞化学および免疫細胞化学株類を示している（パネルＧ −Ｋ）。 第６図は、形質導入ウサギ肝細胞のサザン分析結果を示している。 第７図は、形質導入ウサギ肝細胞のノーザン分析結果を示している。 第８図は、形質導入ラット肝細胞によるヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴ）り産生お よび対照肝細胞類によるラントアルブミン産生をグラフで示したものである。 第９図は使用したレトロウイルスヘクターの略図であり、形質導入−ＨＨＬ肝細 胞類のインビトロ特性解析を示している。 パネルＡニレトロウィルスベクター、このベクタークローニングに使用した戦略 的手段は、”メソッズ（Ｍｅｔｈｏｄｓ）“に記載されている。適切なプローブ 類の産生に関与するベクター配列類は、ベクターの下の領域で膨張する。組換え 転写体中ウィルス配列類に相補性のＲＮＡプローブを示しである；１７２ｂｐの 転写体を、ＲＮａｓｅによる消化から保護しなければならない。５′および３’ ＰＣＲオリゴヌクレオチド類は、ヒ）　ＬＤＬレセプターｃＤＮＡ配列類、およ び隣接ウィルス配列類から、それぞれ、示したように誘導されている；　４９５ ｂｐ断片は、これらのオリゴヌクレオチド類によって増幅される。 パネルＢ：サザンプロット分析、総細胞ＤＮ＾を単離し、”　Ｍｅｔｈｏｄｓ” 記載のようにプロウィルス配列を解析した（１０μｇ／レーン）。模擬感染肝細 胞由来ＤＮＡプラスＬＴＲ−ＬＤＬＲプラスミド１．２５ｐｇ、レーアＰｌａｓ ｍｉｄ”　；模擬感染肝細胞由来ＤＮＡ、レーン”Ｍｏｃｋ”　；　ＬＴＲ−Ｌ ＤＬＲウィルス怒染肝細胞由来ＤＮＡ　、　レーン°　Ｉｎｆｅｃｔｅｄ“　。 パネルＣビＭｅｔｈｏｄｓ　”記載のように、ｌ？ＮＡプロント解析を総細胞Ｒ ＮＡについて行った。試料は、ＨｅｐＧ２（５μｇ）およびＬＴＲ−ＬＤＬＲウ ィルス（５，１および０．２μｇ）感染肝細胞から由来した。　ＨｅｐＧ２細胞 類をリポタンパク質欠失血清を含有する壇地中で増殖させ、ＲＮＡを採取した。 第１０図は、Ｗ）ＩＩ（Ｌウサギにおけるコレステロール代謝に及ぼす肝細胞移 植の効果を示している。 ドナー肝細胞類は、’　Ｍｅｔｈｏｄｓ”に記載のように−ＨＨＬウサギ中に移 植された。 総血清コレステロールを前処理レベル％として示し、移植を第０日に行ったとし てその後の時間の関数として測定した。データを各動物についてプロットした。 パネルＡ　：　ＷＨＨＬ肝細胞類は、動物２匹に移植した。 パネルＢ　：　ＷｉｌＨＬ肝細胞類は、動物３匹に移植した。 パネルＣ：模擬悪染ＷＨＨＬ肝細胞類は、ＷＨＨＬ宿主６匹に移植した。 パネルＤ　：　ＬＴＲ−ＬＤＬＲ感染−）ＩＨＬ肝細胞類は、宿主７匹に移植し た。 第１１図は、ＰＣＨによるプロウィルスＤＮＡ配列類の肝細胞解析結果を示して いる。 総細胞ＤＮＡは肝細胞および肝組織から単離し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて プロウィルス配列類を解析した。肝細胞ＤＮＡは、模擬感染（２００ｎｇ）およ びＬＴＲ−ＬＤＬＲ感染肝細胞類（２００，２０，２および０．２ｎｇ）由来で あった。各組織由来の肝ＤＮ＾は別々の機会に単離したが、同一の結果を得た； 代表的アッセイを示しである。試料は、対照−曲Ｌウサギ（模擬）および移植後 １０分、２４時間、および１９日後に移植宿主から採取された肝由来のものであ った。 第１２図は、ＰＮａｓｅ防御アッセイの結果を示した。 総細胞ＲＮ＾試料は、２個の標識ＲＮＡプローブ類（３Ｚ−ｅｎνおよび４Ｚ− ｒＬＤＬＲ）とハイブリダイズさせ、ＲＮａｓｅ　Ａによる消化に対する防御を 分析した。これらには：レーンＡ　：　ｔＲＮＡ　（１００μｇ）プラスウィル スプロジューサー（１００ｎｇ）　；レーアＢ　：ＷＨＨＬ　（１００ｌ！ｇ） プラスウィルスプロジューサー（１００ｎｇ）　；レーンＣ：鏝ＦＩＨＬ対照（ １００μｇ）ｉレーンＤ　：　ＷＨＩＲＬ対照（２５０μｇ）；レーンＥ　：　 ＷＨＩ（Ｌｉ２分（１００μｇ）；レーンＦ　：　ＩＩＨ）１１１０分（２５０ μｇ）；Ｉｚ−７Ｇニ一聞Ｌ２４時間（１００ｐｇ）　；レしン上ニー聞Ｌ２４ 時間（２５０μｇ）；レーン１：１９日　（１００μｇ）；およびレーン５フ１ ９日　（２５０μｇ）ｅ 分子量標準類をｂｐで測定し、左端に示した。全長および防１ＲＮＡプローブ類 、３Ｚ−ｅｎｖおよび４Ｚ−ｒＬＤＬＲの位置は、右端に示した。各バンドの放 射能は、ヘータノエンスキャナー（Ｂｅｔａｇｅｎ　５ｃａｎｎｅｒ）　（Ｂｅ ｔａｇｅｎ社）によって測定した。内在性ノｓ１７ドの放射能に対するウィルス 特異的バンドの放射能の比を、％として各レーンの下に示した。 第１３図は、移植宿主からの肝のインサイチューハイプリダイゼーシジン結果を 示している。 肝のクライオスタット切片を、・Ｍｅ　ｔｈｏｄｓ・記載のようにしてウィルス 特異的ＲＮＡプローブとハイブリダイズさせた。これらの組織は、ＬＴＲ−ＬＤ ＬＩ？形質導入肝細胞移植２４時間後のＷＨＨＬウサギによる移植２４時間後の ＷＨＨＬウサギから由来した。スライドをヘマトキシリンによって対比染色した 。 パネルＡおよびＢ：移植細胞の門脈周囲分布を示した部位の明所（Ａ）および暗 所（Ｂ）　、　Ｐ、Ｖ、は、門脈欠陥およびおそらく胆管であるものを示してい る。 暗所で明らかに陽性である細胞は、暗所では矢印によって示した（倍率−７０× ）。 パネルおよびＤ：移植肝細胞を高出力拡大（Ｘ２５０）によって、明所（Ｃ）お よび暗所（Ｄ）上で可視化した。 第１４図は、レトロウィルスベクター門ＦＧの略図である。 第１５図は、レトロウィルスベクターα−５ＧＣの略図である。 発肌Ω謀栂ユ説朋 本発明は、目的とする遺伝的物質を肝細胞中に導入する効果的方法および目的と する遺伝物質を含有する肝細胞の移植方法の開発に基づいている。レトロウィル スベクターのような目的とする遺伝物質を含有する適当なベクターを用いてまた はその他の手段を用いて、このような遺伝物質を肝細胞中に導入し、そこで発現 させることが可能である。特に、目的とするＤＮＡが効率的かつ安定に成熟培養 肝細胞類中に導入でき、その後、これらは、形質導入肝細胞がグラフト移植また は移植可能であることを示すことが実証されてきた。さらに、このようなベクタ ーを用いて目的とする遺伝物質をインビボで肝細胞類中に導入でき、したがって 、形質導入肝細胞の移植またはグラフト移植の必要が回避される。 下記は、本発明の方法を使用して、エクスビボで形質導入されかつ宿主中にグラ フト移植または移植される肝細胞の単離を説明したものである；エクスビポまた はインビボのいずれかで目的とする遺伝物質を肝細胞中に導入するに際して存用 なヘタター類の単離を説明したものである；および肝細胞類の形質導入する本発 明の詳細な説明したものである。 旺梃胞Ω単離 培養成熟肝細胞は、本発明の方法の１１１様において、形質導入されその後宿王 中にグラフト移植または移植される。肝細胞は、この態様におし１て、宿主（す なわち、この形質導入肝細胞を受けることになる個体）からまたはドナーから公 知の技術を用いて得られる。一般に、これには、肝の全部または１部を摘出して 、これからコラゲナーゼ溶液のインサイチュ−潅流によってこの肝細胞を除去す ることが含まれる。たとえば、そのままの（未処理）肝から肝細胞を単離する場 合において、肝をでるかまたは肝に入る静脈にカテーテルを挿入し、コラゲナー ゼ溶液を還流して、肝細胞類を放出させる。肝生検の場合には結果として切開ま たは露出表面が出現することになるが、開放または切開表面上において血管に小 カテーテル（またはカテーテル類）を挿入する。コラゲナーゼ溶液をこのカテー テル挿入血管に還流させると、肝細胞が放出される。いったん除去または単離さ れると、肝細胞は、トランスフェクションに適した条件下（例　適当な培地中、 合致した温度でなど）で接種されかつ保持される。 たとえば、高含量のラット肝細胞培養物とこれらの細胞類を長期にわたり培養し て保持するために、数種の方法が記載されている。Ｋｏｃｈ、　Ｋ、Ｓ、および ＨｌＬ、　Ｌｅｆｆｅｒｔ、Ａｎｎａｌｓ　Ｎ　Ｙ　Ａｃａｄｅｍ　ｏｆ　５ｃ ｉｅｎｃｅｓ　、　３４Ｌ：　１１１−１２７　（１９８０）　G Ｍｃｇｏｗａｎ、　Ｊ　、Ａ、ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　 Ｐｈ　５ｉｏｌｏ　：　３５３−３６３（１９８１）　；Ｂ１５ｓｅｌｌ　、Ｄ ９Ｍ、およびＰ、　Ｓ、　Ｇｕｚｅｌｉａｎ、　Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅｍｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　３４９　：　８５− ８９（１９８１）　：およびＥｎａｔ、　Ｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｓ　ｏｆ　 ｔｈｅ　Ｎａ狽■ ｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ　８　：１４１１− １４１５　（１９８４）＊上記方法類を用し１て本発明の方法によって形質導入 されるべき肝細胞を単離しかつ保持する。肝細胞は、また、下記および実施例１ に説明したＢａｒｒｙおよびＦｒ１ｅｎｄ開発の操作を変形したものをＬｅｆｆ ｅｒｔ　、　Ｈ，Ｌ、ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　５　：５ ３６−５４４　（１９７９）にＬｅｆｆｅｒｔによって記載された潅流混合物を 用いて調製できる。これらの教示は、本文で参考として引用している。 レ　ロウイルスへり　− 遺伝子制御のようなプロセス類の分子的側面を研究するための肝細胞培養物の限 界のひとつとして、効率的遺伝子移入技術類がこれまでなかったことが挙げられ る。トランスフェクションの従来方法は、非効率的でありかつ細胞毒性である。 Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ　、　Ｒ，Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ 　Ｂｉｏｉｏ江、旦：　７１６−３１８　（１９８６）。下L に述べるように、組換えレトロウィルス類はこれらの問題を克服するために使用 されてきた。結果として、現在、効率的にかつ安定に肝細胞１次培養物を複製欠 損レトロウィルス類によって形質導入することが可能である。このような複製欠 損レトロウィルス類は、問題の遺伝物質を培養肝細胞中に導入するために用いら れてきた。形質導入は効率的であり、かつ、目的とする遺伝物質を発現させ（す なわち、コードされたタンパク質またはポリペプチドを生産し）移植される能力 を保持している肝細胞を産生ずる。 レトロウィルス類は、ＲＮＡウィルスである；すなわち、このウィルスゲノムは １２ＮＡである。しかし、このゲノムＲＮ＾はＤＮＡ中間体に逆転写され、これ は、感染細胞の染色体ＤＮＡ中に極めて効率的に組み込まれる。この組み込まれ たＤＮＡ中間体は、プロライスルといわれる。第１図に示したように、このレト ロウィルスゲノムおよびプロウィルスＯＮ＾は、３個の遺伝子を存している；眩 紅２５２ｐおよびｅｎｖであり、これらには、２個の長い末端反復（ＬＴＲ）配 列類が隣接している。註り遺伝子は、内的構造（ヌクレオカプシド）タンパク質 類をコードする；匹り遺伝子は、ＩＩＮＡ特異的ＤＮＡポリメラーゼをコードす る；およびｅｎｖ遺伝子は、ウィルスエンベロー１タンパクｉ＊をコードする。 この５′および３’ＬＴＲ１［は、ウィルス粒子ＲＮＡ　１１の転写およびポリ アデニル化を促進するように作用する。 ５’ＬＴＲに隣接して、ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合部位）および ウィルスＩ？ＮＡの粒子中へ効率的カプシド化（Ｐｓｉ部位）のために必要な配 列類である。 ＭｕｌｌＬｇａｎＲ，Ｃ，、Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉ　ｕｌａｔｉ ｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍ、Ｉｎｏ■ ｙｅ　ＣＭｉ著）　、１５５−１７３（１９８３）　；　Ｍａｎｎら、釦１Ｌぶ Ｌ　：　１５３−１５９（１９８３）　；　Ｃｏｎｅ、Ｒ。 Ｄ、およびＲ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ 　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｅｓ竪ＬＪＩ　：　６３ ４９−６３５３　（１９８４）　。 カプシド化（または、レトロウィルスＲＮＡの感染性ウィルス粒子へのＲノケー ジング）のために必要な配列類がこのウィルスゲノムに欠失していれば、この結 果、ゲノムＲＮ＾のカプシド化を防御するｃｉｓ欠損となる。しかし、生成した 変異体は、それでもなおかつ全てのウィルス粒子タンパク質類の合成を指運する ことができる。Ｍｕｌｌｉｇａｎおよび共同研究者らは、これらのＰｓｉ配列類 を欠損したレトロウィルスゲノム類ならびに染色体に安定に組み込まれた変異体 を含有する細胞株について記載している。　Ｍｕｌｌｉｇａｎ　Ｒ，Ｃ０、Ｅｘ 　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉ　ｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆＧｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅ ｓｓｉｏｎ　Ｍ、Ｉｎｏｕｙｅ　（ｋＩＡ著）　、１５５４７３（１９８３）　 ；　Ｍａｎｎ、　Ｒ，、ｇｉｌｌ。 ３３　：　１５３−１５９　（１９８３）　；　Ｃｏｎｅ、　Ｒ，Ｄ、およびＲ ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｓ　ｏｆ−ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎ ａｌ　Ａｃａｄｅｗ　ｏｆ　５ｃｔｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ　：　６３４９−６３５ ３（１９８４）　＊　これらのモ１行物類の教示は、本文で参考として引用して いる。 Ｍｕｌｌｉｇａｎおよび共同研究者らによって記載されたＰｓｉ細胞株は、ＮＩ Ｈ３Ｔ３繊維芽細胞をエコトロピックモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）マウス白血病 ウィルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）クローンであるｐＭＯＶ−Ｐｓｉによって移入する ことによって作製された。　ｐＭＯＶ−Ｐｓｉよ全てのウィルス遺伝子産物類を 発現するが、ライｌレスゲノムのカプシド化に必要なこのＰｓｉ配列を欠損して いる。ｐＭＯシーＰｓｉは、エコトロピックウィルスエンベロー１タンパク質を 発現し、これは、マウス（および近緑げつ歯ＩＩ）細胞上にのみ存在するレセプ ターを認識する。 もうひとつの細胞株は、Ｐｓｉ　ａ霧株であり、Ｐｓｉ−２Ｉｌノ＜７ケ一ジン グ細胞株である。これらのＰｓｉ−ａ■細胞株類は改変ｐＭＯＶ−Ｐｓｉゲノム を含有しており、この中で、エコトロピックエンベローブ糖タンパク質は、アム ホトロピンクウイルス４０７０Ａから由来するエンベロープ配列類と置換されて いる。　Ｈａｒｔｌｅｙ、Ｊ、Ｗ、およびＷ、Ｐ、　Ｒｏｗｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ 　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏ　、　１９：　１９−２５　（１９７６）＊その結果、そ れらは、広範囲の哺乳類宿主、アムホトロピック宿主域による組換えウィルス産 生に有用であるｓ　Ｐｓｉ　ａｄＢ胞株は作製に使用したレトロウィルスは、ア ムホトロビノク宿主域を有しており、ヒト細胞の感染に使用できる。もしこの組 換えゲノムがプサイパフケージング配列を育しているならば、Ｐｓｉ−ａ翔細胞 株は、組換えレトロウィルスゲノム類を感染性レトロウィルス粒子中にパッケー ジング可能である。Ｃ０ｎｅ、　Ｒ，およびＲ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ　Ｐｒｏｃｅ ｅｄｉｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｓ　ｏｆ　Ｓｃｉｅ ｎｃ■ しｙ速よ舅　６３４９−６３５３（１９８４）。 レトロウィルスゲノムは、ＣｏｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎによって修飾されて おり、新規遺伝子類を細胞中に導入可能なベクターとして使用される。第２図に 示したように、ｇ郊ｊ曵［、およびｅｎｖ遺伝子類は全て除去され、それらの位 置にネオ遺伝子が挿入されている。このネオ遺伝子は、優性選択マーカーとして 作用する。組換えゲノムの一部となったままのレトロウィルスゲノムは、ＬＴＲ 類、ｔＲＮＡ結合部位、およびプサイパンケージング部位を有している。　Ｃｅ ｐｋｏ、Ｃ，釦旦３７　：　１０５３−１０６２（１９８４）。 本発明の形質導入肝細胞産生に使用される追加のベクター構築体を第２図に示し 、下記で説明する。 ｐＶ、Ｌ　−ｅ　このベクターの特徴は、Ｋｏｒｓａｎ、　Ａ、Ｊ、ら、　Ｐｒ ｏｃｅｅｄ’ｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉヤ１」すβ」Ｌ回」すＬ四も−じ虹 、揖：　２１５０（１９８７）によって記載されている。このベクターは、問題 の遺伝子とネオ遺伝子のような優性選択マーカーの両方を発現可能である。問題 の遺伝子は、直接方向において５’ＬＴＲに対してまさしく遠位であるＢａｍＲ Ｉ　／５ｅａｌ／５ａｌｌクローニング部位にクローニングさ娠一方、ネオ遺伝 子は、内在プロモーター（５１１４０由来）に対して遠位に位置しており、これ は、前記クローニング部位よりも３′に近く位置している（前記クローニング部 位の３′にある）。吐りからの転写は、２個の部位で開始される：１）問題の遺 伝子の発現に関与する５’ＬＴｌ？および２）ヱオ遺伝子発現に関与する内在の ＳＶ４０プロモーター。吐との構造を第２ａ図に示した。 ベクターＰＬＪは、第２ａ図に示した。匹りにおいて、問題の遺伝物質は、５’ ＬＴｌｉの直後に挿入されている。この遺伝物質の発現はＬＴＲから転写されヘ ネオ遺伝子の発現は内内在ＳＶ４０プロモーターから転写される。 吐１゜この単純なベクターにおいて、野生型ウィルスの眩り匹し、およびｅｎｖ のための全コード配列類は問題の遺伝子と置換されており、これは発現された唯 一の遺伝子である。ｐＥＭベクターの要素を下記の示した。５′隣接領域、５’ ＬＴＲおよび４００ｂｐの接触配列（Ｂａｓ＋Ｈ１部位まで）は、ｐＺＩｐ由来 である；しかじ、３′ＬＴＩ？から１５０ｂｐだけ上流のＣｌａｌ部位は、合成 りａ＠ＦＩＩ　リンカ−頻に連結され、ベクター中に存在するＢａｍＨＩクロー ニング部位のもうひとつの半分を形成する。ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ［［Ｉ　／ ＥｃｏＲＩ断片は、プラスミド骨格を形成する。このベクターは、ｈ０１０ｎｅ ｙマウス白血病ウィルス由来株からクローニングされた配列類から由来する。 同族のベクターは、骨髄増殖性肉腫ウィルスから由来する。ｐＥＨの構造を第２ ｂ図に示した。 吐しこのベクターは、内部プロモータから出された単一遺伝子を発現可能である 。ＰＩｌｌの構造を第２ｃ図に示した。これらのベクター類の構築を下記に要約 した。５′隣接領域、５’ＬＴＲおよび１４００ｂρの接触配列ｊ邦領域中のＸ ｈｏ部位まで）を含むベクターの５′部分は、野生型モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ ）マウス白血病ウィルス転写株からクローニングされた配列から由来する。５ｈ ｉｎｎｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ、　２９３　：　５４３（１９８１）。この２者 の差異は、ｇａｇ遺伝子のＡＴＧに直接隣接しているＮｇＪＪ（制限部位に【■ リンカーがクローニングされていることである。３′隣接領域、３′ＬＴＲおよ び３′接触配列（ｅｎｖコード領域中のＣｌａｌ部位まで）を含むベクターの３ ′部分は、９ＺＩＰ由来である。しかし、改変が２個ある；　ｌ　）　Ｃｌａｌ 部位がＢａｓ＋ＨＩに連結されていることおよび２）エンハンサ−を含む３’Ｌ Ｔｌ？中の小配列（Ｐｖｕ■からＸｂａｌまで）を欠損していることである。前 記ベクターの５′および３′部分を数種のプロモーターのひとつが橋渡ししてい る；それぞれが、Ｘｈｏｌ／ｉ１．ａｍＨＩ断片上に含まれ、かつ、それぞれが 、はとんどの組織において高レベルの構造的発現を可能であることである。これ らのプロモーター類には、ニワトリ由来へ一層アクチン（Ｃｈｏｕｄｏｒｙ、　 Ｐ、■、ら、Ｃ３Ｈ５ｙｓｐｏｓｉａ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｉｏ 　＋Ｌ、１．１０４７（１９８６）、およびヒト由来単純ヘルペスウィルス、ヒ ストンＨ４由来のチミジンキナーゼ（Ｈａｎｌｅｙ、　Ｓ、　Ｍ、　ら、Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕ　ａｒ　５　：　３８０（１９８５）　）　 ）が含まれる。ベクター骨格は、ＰＢＲ３２２由来Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　／Ｅｃｏ ＲＩ断片である。 目的とする遺伝子は、直接方向において、前記内部プロモーターのちょうど下流 のＢａｍＨＩ部位にクローニングされる。 選択マーカーを有さないベクター類も、目的とする遺伝物質による内皮細胞薄形 質導入に使用できる。このようなベクター類は、基本的に、先に記載したベクタ ー類を単純化したものであり、これらの中に上記のようなマーカーがある。ベク ターｐＥＭを第２ｂ図に示した；示したように、このベクターの主要素は、５′ および３’ＬＴＲと、この２個のＬＴＲ類の間に挿入された問題の遺伝物質であ る。 のエクスビボ　に　なレトロウィルスヘク　−培養肝細胞中へ目的とする遺伝物 質を導入し生物学的に有意な置のコードされたタンパク質またはポリペプチドを 発現するために適した組換えレトロウィルス類をさらに４種、第３図に示し、ヒ トＬＤＬＲ遺伝子を特に参考とした。ヒトＬＤＬＲを遺伝子を含めたこれらのベ クター類を用いて肝細胞を効率的に形質導入し、次に、正常内在性レベルと等し いレベルのＬＤＬＲを発現させた。これらのベクター類は、ＬＤＬＩ＋遺伝子を 参考として例示されるが、しかし、問題のヌクレオチド配列は全て、レトロウィ ルス中に組み込まれかつ肝細胞中に導入できる。 示したように、各ベクターは、遺伝子発現を促進するために使用した転写要素類 が異なっている。これらについては、実施例■において詳しく述べである。簡単 に述べると、ベクターＬＴＲ−ＬＤＬＲにおいて、転写が５’ＬＴＲにおいて始 まり、その結果、単一全長ウィルス転写体でこの場合Ｌ［ｌＬＲを発現するもの が生成する。 残りのベクター中において、ＬＤＬＲの発現は、プロウィルス転写単位に対して 内部に位置する転写制御配列類から開始される転写によって促進される。 これら後者のベクター類のそれぞれは、転写に関与する転写要素が異なっている ；　ＢＡ−Ｌｌ）ＬＲは、ニワトリベータ・アクチン遺伝子由来プロモーターを 含有している；　１１４−　ＬＤＬＲは、ヒトヒストンＨ４遺伝子由来プロモー ターを含有している；およびＴＫ−ＬＤＬＲは、単純ヘルペスウィルス由来チミ ジンキナーゼ遺伝子由来プロモーターを含有している。前記３種のベクター類の それぞれは、また、組換えプロウィルスの逆転写および組み込みの後に起こるウ ィルス転写の量を減少させるために、３　’　ＬＴＲ中に位置したウィルス転写 エンハンサ−配列類の欠失を有している。４種のベクターの全てのと）　ＬＤＬ Ｒコード配列類は、全長ヒトＬＤＬＲｃＤＮＡ挿入物から誘導された。 実施例■で記載したように、これらのベクター類を肝細胞形質導入に際し使用す ることで、形質導入細胞中のウィルス特異的ＬＤＬＲＲＮＡ０量が内在性レベル を超えることになった（５０−１００　ｘ）　、　Ｌかし、産生された機能的レ セプターの量は、はとんどのベクター類について正常内在性レベル未満かまたは それと等しく、これはおそらく、ＲＮＡプロセシングまたは輸送が不十分である ことまたは翻訳効率の低下によるのであろうか、肝細胞修飾のエクスビポ法につ いての潜在的問題は単離された総肝細胞類の一部のみがグラフト化可能であるこ とにあるので、高レベルのコードされたタンパク譬（ここでは、ＩＪＩＬＩ？） を発現させる追加のレトロウィルスベクター類は有用であろう。このようなベク ター類は、たとえば、有用量の前記コードタンパク質の産生に必要な移植細胞類 の数を減少させる手段として、を用であることができる。たとえば、各ベクター は、プロウィルス転写単位に対して内的である特定転写制御配列類を含有可能で ある。これによって、問題のヌクレオチド配列転写の程度を変化させることがで きるようになる。ここで特に問題であるのは、肝細胞中で高レベルで発現された 遺伝子由来の転写要素類である（例　α−フェトプロティン、アルブミン）。 問題のキメラヌクレオチド配列の翻訳効率を高めるため、前記ベクター類によっ て産生されたＲＮＡ　＠、（例　翻訳が一層可能なＩｔ）ＩＡ　１！を産生させ ることによって）、特性解析が十分である遺伝子由来５′および３′非翻訳選択 配列類（例ヒトレトロウィルスのＲＩＪ−５８１域）または問題のヌクレオチド 配列のそのままの５′および３′配列嬉も、使用したレトロウィルスベクター類 中に含まれることができる。 極めて高レベルのコードタンパク質（例　ＬＤＬＲ）の構造的産生の結果細胞毒 性が出現することもあるので、このベクター中に転写媒介最終産物抑制を付与す る問題のヌクレオチド配列由来ベクター配列類を含めることも適しているのあろ う。 たとえば、ＬＤＬＲ遺伝子の場合、ステロールによって転写媒介最終産物抑制を 付与する配列（ステロイド応答性要素といわれる）は、このベクターに含まれる ことができる。 のインビボ　のか　のレトロウィルスベ　−ベクター類、特に組換えレトロウィ ルスベクター類を使用して、肝細胞細胞を、インビボで形質導入することが同様 に可能である。たとえば、このＬＤＬＲ遺伝子が肝細胞をターゲットとするため のひとつの戦略的手段は、アシアログリコプロティン（ＡＳＧＰ）レセプターの 肝細胞上での存在を基盤とすることができる。特に肝細胞中で発現されるこのレ セプターは、それらの末端ジアール酸を除去され、そによって最後から２番目の ガラクトース残基を露出させる塘タンパク賀の組み込みおよび同化に関与してい る。環タンパク質・レセプター複合体は、レセプター媒介エンドサイト−シスに よって内在化される。アノアミグリコプロティン被覆小胞は、肝に種々の生体活 性物質をインビボで特異的にｉ！搬するために使用されてきた。　Ａｉｔｉｅ、 Ａ、Ｄ、ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａ　Ａｃａｄ ｅＩｓ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ。 」旦Ｌ」ｕ：　５９２３−５９２７（１９８０）　；　Ｆｉｕｍｗ、　Ｌ、ら、 ＦＥ８Ｓ＋、＝　−、（１３：４７−５１（１９７９）；Ｈｉｌｄｅｎｂｒａｎ ｄｔ、　Ｇ、Ｒ９およびＮ、Ｎ、静ｏｎｓｏｎ、胆ｌ　：　４９９−５０２（１ ９８０）　。 たとえば、遺伝子の運搬を肝細胞を標的とするためのひとつの手段は、存在する レトロウィルス類を修飾してＡＳＧＰレセプター類のためのりガント類としてそ れらを調製することを基本としている。マウス白血病ウィルス由来のこのエンベ ロープタンパク質は、高含量のジアール酸を複合糖タンパク質である。ウィルス の内在化は、ウィルスエンベロープと細胞表面レセプターとの特異的相互作用に 引き続き、このウィルス／レセプター複合体のレセプター媒介エンドサイト−シ ス修飾ウィルス粒子が出現してかつ用いられるならば、可能である。たとえばエ ンベロープタンパク質からそのジアール酸が除去されているウィルスを使用し、 そラクトース残基類を有する糖タンパク譬をコードする遺伝的改変エンベロープ 遺る。さらに、レクチン耐性選択系を使用し、末端ジアール酸類をＮ−結合鎖類 に付加できないウィルスプロデューサー系統の変異体を単離することができる。 これらの系統から産生されたウィルスは、前記ＡＳＧＰレセプターに当然結合す るはずである。これらの修飾ウィルス粒子によるＡＳＧＰ発現細胞の形質導入を 、インビト；　よびＣ，Ｈ，Ｗｕ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　［１ｉｏｌｏ　１ｃ ａｌ　Ｃｈｅ＋＋＋１ｓｔｒ　、２６２　：　４４２９−４４３２（１X８７） にＷｕ によって最近述べられた。−Ｕは、アジアロオロソムコイド（ＡＳＱＲ）と称さ れるＡｓＧＰレセプターのリガンドにｐＳＶ２ＣＡＴプラスミドを結合させ、Ｈ ＥＰ　Ｇ２細胞中におい））　てＡＳＧＰレセプターによる結合物の組み込みお よびＣＡＴ活性の発現を実証した。この結合物をう７）に投与した後、特異的で はあるが一過性のＣＡＴ発現が肝ホモジネート中で明らかとなった。この方法を 改変して組換えレトロウィルスベクターまたはエピゾームベクターをインビボで 肝細胞中に導入できる方法を作製できる。 この運搬系の効率および特異性は、たとえば、産物の直接解析によってその場で 検出できる前記産物を安定に発現する１個の発現ベクターをトランスファーする ことによって評価できる（例　ベータ・ガラクトシダーゼ）。 インビボターゲット化の利用が成功するためには、トランスファ遺伝子が安定に 発現されることが必要である。インビボにおけるＡＳＧＰレセプターによる組み 込みを可能とするように改変されたレトロウィルス類による肝細胞の形質導入に は、このプロウィルスのゲノムＤＮＡ中への組み込みを必要とするであろう、し かし、体止肝における組み込みはまれである。レトロウィルス組み込みの効率は 、部分肝切除後に宿主をウィルスに曝すことによって向上させることができる。 この間、残留肝細胞は、急激な増殖を受ける。しかし、これは、臨床上は実際的 ではないであろう。この問題を回避するためのひとつの方法は、二重鎖ＤＮ＾環 の形態でエピゾームとしてその存続が促進されるようにこのレトロウィルスベク ターを改変することである。これは、プラスミド複製に必要なエプスタインバー ウィルスのシス（ｏｒｉＰ）およびトランス（ＥＢＮＡ）配列をレトロウィルス ベクター中へ組み込むことによって実行できる。また、真核（例　マウス）ゲノ ムから単離された（自ロウイルス組み込みを防御する長い末端反復の反転反復内 部において配列の欠損を有するベクター類も使用されるであろう。 肝細胞のインビボ修飾において使用するために特に関心が寄せられるのは、レト ロウィルスベクター類ｈｐｃ　（ＡＴＣＣｎｏ、　６８７５４）およびａ−３Ｇ Ｃ（ＡＴＣＫ　ｎｏ、８７５５）である。これらのベクター類を使用して、イン ビボで使用した際に選択圧の必要を避けうる十分高い力価を存する＆ＩＩＷＡえ ウィルスを産生する。　ＭＦＧおよびα−３ＧＣについては、１９９１年１０月 ３１日出願のＰＣＴ出願、ＰＣＴ　／ＩＪＳ９１１０８１２１に詳細に述べろ目 的とする遺伝物質は、下記および寛施例中で記載したように、培養肝細胞中へ組 み込まれかつ結果として生成した遺伝子工学産生肝細胞中で発現される。 記載の方法によって肝細胞中へ組み込ませることができる遺伝物質は：１）正常 肝細胞中に存在し生物学的に有効なレベル（それがコードするポリペプチドの正 常生理学的効果をもたらすために十分なレベル）で発現される遺伝物質であるが 、問題の遺伝物質を本発明の方法によってそれらに安定にトランスファーさせる 以前においては、肝細胞中に存在はするが正常量未満で発現される；２）正常ル で発現されない遺伝物ｆ、遺伝物質（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が存在するが正常量 未満で発現される肝細胞類を、本文で遺伝的障害肝細胞と称する。 肝細胞に組み込まれかつそれによって発現される遺伝物質は、また、選択マーカ ーをコードする遺伝物質を適宜含むことができ、それによって、目的とする遺（ Ｆ勿質を含有し発現させる細胞類を識別しかつ選択することが可能となる。 したがって、本発明の培養肝細胞中に導入されたＤＮＡまたはＲＮＡは、目的と す込みＤＮＡ　、組み込みＩ？Ｎ＾）と称される０組み込み遺伝物質含有肝細胞 は、形質導入肝細胞と称される；それらは、問題のＤＮＡまたはＲＮＡを発現さ せ、コードされたタンパク質またはポリペプチドを産生ずる。 １−１［［に記載のように肝細胞中に４７１？上三で組み込まれる。先に記載の ようにして単離された肝細胞をマトリックス物質に集密以下（ｓｕｂｆｌｕｅｎ ｔ）の密度で接種し、かつ、Ｅｎａ　ｔらによって述べられているようなホルモ ン規定培地に保持する。 それらの教示は、本文で参考として引用しである。Ｅｎａｔ、　Ｒ，ら、Ｐｒｏ ｃｅｅｄｉｎｓ　ｏｆ止１！■坦娃」９包肚」Ｌとに匹凹工竪紅工狙：　１４１ １−１４１５（１９８４）。必要に応しに対して、それらを組換えゲノムを有す るウィルスに暴露して組換えレトロライモーター配列からなる；いくつかの場合 において、それは、また、選択マーカーように採取して、ポリブレン（ｐｏｌｙ ｂｒｅｎｅ）　（Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して、肝細胞類培養し選択マーカーが ヒスであるならば、ヒスチジノールを含有するがヒスチジンを全く含まない培地 ）中に分散させる。 このネオ遺伝子は、トランスポゾンＴｎ５由来の細菌遺伝子であり、これは、菌 （もしそれが存在しないならば、細胞はＧ４１８存在下で死滅する６）この結果 、この遺伝子の哺乳類細胞中における存在を、６４１８含有培地中で細胞を培養 することによって、知ることができる。 ネオ遺伝子を有する組換えレトロウィルスベクター類は、また、クローニング部 位を有している。この結果、問題の遺伝物質はヘタター中に導入でき、肝細胞類 中に組み込まれ、この組換えレトロウィルスによって形質導入された肝細胞（＆ ［ｌみ込み遺伝物質含有肝細胞と称される）によって発現される。釦鰭［クロー ニング部位において、間通の遺伝物質を挿入することが可能である。上記にも述 べたように、肝細胞は、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）由来ベータ・ガラクトシダーゼ をコードする遺伝子によって形質導入されている。形質導入効率は、実施例■に 記載のように評価した。ベータ・ガラクトシダーゼ遺伝子の発現も同様に評価し 、その詳細を実施例■に述べである。 たとえば、ヘルパーを全く含まないアムホトロピンクプロデューサーを、１０％ 仔牛血清（Ｇ３）添加ダルベツコイーグル（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　・ｓ　Ｅａｇｌ ｅ）培地（ＤＭＥ）中で集密密度となるまで組織培養で増殖させる。新鮮培地を 添加して、その後、この培地を採取する。使用済みの培地（または、ウィルスス トック）をろ過し、離脱したプロデューサー細胞を除去し、細胞感染にすぐに使 用するかまたは後日使用するまで保存する（例　−７０’　Ｃで）。 培地を肝細胞（宿主肝細胞）の集密以下のプレートから除去して、ポリブレン（ Ａｌｄｒｉｃｈ）含有ウィルスストンクとすぐに交換する。その後、これを除去 して新鮮培地と交換する。したがって、使用した培地はウィルス性上漬であり、 感染性ウィルスの組換えゲノムは問題のＤＮＡを含む、この感染操作の結果、目 的とする遺伝子産物をコードするＤＮＡおよび適宜、選択マーカーを発現する肝 細胞が生しる。 １！！様において、肝細胞をＰｓｉ　ａＩＩ細胞中で産生された感染ウィルスを 含有する培地に曝す；この感染性ウィルスは、目的とする遺伝物質を有する組換 えゲノムを含有する。１例では、組換えゲノムは、タンパク質またはポリペプチ ド（例低密度すポタンパク譬類；オルニチントランスカルバミラーゼ（ｏｒｎｉ ｔｈｉｎｅ　ｔｒａｎｓｃａｒｂａ　Ｉｙａｓｅ）　）および適宜、優性選択マ ーカーをコードする遺伝子（例　ネオマイシン耐性をコードするネオ）を含む。 この結果、肝細胞を形質導入する−−−すなわち、目的とする遺伝物！（目的と するポリペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ）および適宜ネオ遺伝子 が安定に肝細胞類中に導入される。この形質導入肝細胞類は、コードされたタン パク質またはポリペプチドを発現し、かつもしネオ遺伝子が存在すれば、それを 発現し、結果として、選択表現型を有する細胞が生成する。 本発明の１態様を実施例において詳細に説明する。簡単に述べれば、肝細胞は、 Ｌｅｆｆｅｒｔの潅流混合物によってＢｅｒｒｙおよびＦｒ１ｅｎｄの方法を修 正したものを使用して、調製した。　Ｂｅｒｒｙ＋Ｍ、Ｎ、ら、Ｊ　Ｃｅ１ｌ　 Ｂｉｏ＋、　：　５０６−５２０（１９８９）　；　Ｌｅｆｆｅｒｔ、　Ｈ，Ｌ 、ら、勿ぶｒｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｓｏｌ、　５８　：　５３６−６４４（１９７９ ）　、生成した肝細胞を密度３−４Ｘ１０’細胞／Ｃ１１”で１０％ウシ胎児血 清添加ホルモン規定培地中のプライマリア（Ｐｒｉ層ａｒｉａ）プレート培養基 板上に接種した。培地を新鮮ホルモン規定培地と交換し、その後、定期的に交換 した。　ＢＡＧウィルスのヘルパーを全く含まないアムホトロビックプロデュー サーを培養したｌＯ％仔牛血清添加ＤＭＥ培地を採取して、使用済み培地を得た 。肝細胞感染条件は、大腸菌」ｌ１ｕベータ・ガラクトシダーゼをコードする高 力価両栄養性ウィルスであるＢＡＧを使用して、最適化した。このプロデューサ ーは、大腸菌Ｊ匹姓ｕからベータ・ガラクトシダーゼおよび菌ネオ遺伝子を同時 発現した。使用済み培地をろ過し、離脱したプロデューサー細胞類を除去し、肝 細胞感染のためウィルスストックとして使用した。 細胞は、肝細胞（宿主肝細胞）の集密以下のプレートから培地を除去し、それを ウィルスストックとして交換することによって、感染させた。このようにして、 肝細胞培養物をおよそ１２時間感染させた０問題のＤＮＡ（すなわち、ベータ・ ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ）を含有する肝細胞類およびネオ遺伝子を 抗生物質Ｇ４１８含を培地で培養することによって単離した。感染によって組換 えレトロウィルスが効果的に導入されたものを形質導入肝細胞と称し、これは、 ベータ・ガラクトシダーゼを産生じ、かつネオマイシン耐性である。ベータ・ガ ラクトシダーゼ遺伝子を有してベータ・ガラクトシダーゼを産生ずる組換えレト ロウィルスで形質導入した肝細胞の能力を４”ｙｅ上三で評価した。この評価に ついては、実施例ｍで述べた。 う、ト肝細胞類も同様、ヒト副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ）コード遺伝子で形質 導入し、このコードされたホルモンを発現することが示されている。これについ ては、実施例■に述べ、結果を第９図に示した。 結果として、形質導入肝細胞が正常では肝細胞によって分泌されないポリペプチ ド（ベータ・ガラクトシダーゼ）を分泌することが明らかとなった。同様の手法 を用いて、コードされた産物が産生されるように肝細胞中にいかなる遺伝物質を も導入してこの組み込み遺伝物質の発現を評価することができる。 たとえば、組換えゲノムがヒトＬＤＬＲコード１）ＮＡを含む感染性ウィルス含 有培地にＪＩ露された結果として、肝細胞が形質導入されている。このことは、 実施例■に詳細に述べた。肝細胞は４種のＬＤＬＲウィルス調製物（それぞれが 、第５図に示したベクター類のひとつを含む）によって感染され、その後、遺伝 子トランスファーおよびＬＤＬＲ発現を解析した。 同一ベクターを本発明の方法に用いて、目的とするいかなるヌクレオチド配列ま たは遺伝子を培養肝細胞に導入できる。これとは別に、その他のベクターも目的 とする遺伝物質を培養肝細胞中に導入する他の手段として使用できる。 先に説明したように、また目的とする遺伝物質をインビボで肝細胞に導入するこ とも可能である。先に述べたように、ゲノムが問題の遺伝物質を含む組換えレト ロウィルスが肝細胞を標的とし、その結果、個体への導入後、（例　静注による ）、し１−ロウイルスが特異的に肝細胞に組み込まれる結果となるであろう。い ったん肝細胞に組み込まれると、この組換えレトロウィルスゲノムが発現され、 目的とする遺伝物質によってコードされたタンパク質またはポリペプチドが結果 として産生されるであろう、目的とする遺伝物質導入に使用したうイルスが、宿 主染色体類へのプロウィルス組込みが起こらないように（例　自家複製配列類ま たはＡＲ３と称される配列組み込みによって）修飾されているのが好適である。 その結果、複製がエピゾーム中で起こるであろう。 ボ嘗ペブチ′コーパ　−にお番る　マーカーの１個のベクターは、目的とする遺 伝物質に加えて、選択マーカーをコードする遺伝物質を含むことができ、その存 在によって７、目的とする遺伝物質によって形質導入された細胞を識別選択が可 能となる。先にも述べかつ実施例■にも述べたように、このようなマーカーのひ とつである７オ遺伝子は、この目的のために使用されている。また、ネオ遺伝子 以外の優性選択マーカーを遺伝物質の肝細胞中への導入のために使用することも 可能である。たとえば、Ｈｉｓ　Ｄ遺伝子は、この目的のために使用できる。こ のＨｉｓ　Ｄ遺伝子は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔ　ｈｉｍｕ■」由来の菌遺伝 子であり、ヒスチジノールをヒスチジンに変換するポリペプチドであるヒスチジ ノールデヒドロゲナーゼをコードする。ヒスチジンは、必須ミアノ酸である；ヒ スチジノールは、ヒスチジンのアルコール同族体であり、適切な代謝条件下でヒ スチジンに交換できる。もし細胞類が、ヒスチジノール含をヒスチジン欠失培地 で増殖するならば、このＨｉｓ　Ｄ遺伝子を有する細胞は、ヒスチジノールをヒ スチジンに交換できる。ヒスチジンはそれらの機能にとって必須であるので、こ のＨｉｓ　Ｄ遺伝子を有する（および、したがって、ヒスチジン産生可能である ）細胞は生存し、この遺伝子を欠失しているものは、生存しないであろう。 このＨｉｓ　Ｄ遺伝子を有するレトロウィルスを用いて、ケラチン細胞を感染さ せた。、Ｈｉｓ　Ｄ遺伝子含有ケラチン細胞は、これらの細胞をヒスチジン欠失 ヒスチジノール含有培地で増殖させることによって選択された。予想通り、Ｈｉ ｓ　Ｄ遺伝子ををするケラチン細胞はコロニーを形成し、集密となるまで増殖し た；この遺伝ＤＮＡを含有する繊維芽細胞を選択する際に有用である。 本研究の結果、独立した優性選択マーカー類（例　ネオ遺伝子およびＨｉｓ　Ｄ 遺伝子）を用いて１種を超える新規遺伝物質を肝細胞類に導入することも可能で ある。たとえば２つの異なるサブユニットを有する遺伝子産物の場合、別々の優 性選択マーカー類を使用して、この２つのサブユニットをコードする遺伝情報を 導入することができる。さらに、活性となるため特異的に切断されるかまたは処 理される必要がある遺伝子産物の場合、２個以上の優性選択マーカーを使用する ことができる。必要な処理酵素をコードする遺伝子をこのような処理を必要とす るポリペプチドをコードする遺伝子と共に導入することができる。これによって 、肝細胞は、ポリペプチドホルモンを処理可能となる。 口　の゛　−の　への　のための　のビーイ　ルまた、レトロウィルス以外のビ ーイクルを用いて肝細胞を遺伝子工学的に処理するかまたは修飾することが可能 である。問題の遺伝情報は、上記細胞中においてこの新規遺伝物質を発現できる いがなるウィルスによっても導入できる。たとえば、ＳＶ４０は、単純ヘルペス ウィルス、アデノウィルスおよびヒトパピローマウィルスをこの目的のために使 用できる。ＯＮ＾ウィルス類も同様、本発明の方法にしたがって、問題の遺伝物 質ならびに選択マーカーコード遺伝子を肝細胞類中に導入するために使用できる 。 形！１人肝預胞Ω柊植 組み込み遺伝物質を発現する肝細胞を組織培養容器中で集密となるまで増殖させ る；培養容器から取り出し；体中に導入する。これは、たとえば、外科的に行う ことができる。この場合、目的とするヌクレオチド配列を発現可能な形質導入肝 細胞で構成された組織を体中にグラフト移植または移植する。たとえば、肝に接 触させて腹腔内に位買させることができまたは肝玉にまたは肝に近接して移植す ることができる。一方、形質導入肝細胞含を組織を微細担体ビーズに付着させ、 これらを（例　注入によって）宿主の腹膜腔に導入することができる。この手法 は、アルブミン合成欠損ラット系統（Ｎａｇａｓｅ　無アルブミン血症うット頻 ）への移植および移植動物血清中のアルブミンが中等度レベルであることの実証 によって成功したことが示されている。遺伝的修飾肝細胞の肝への直接注入も可 能である。 形質導入肝細胞は個体中にいったん度されると、目的とする遺伝物質によってコ ードされたホルモン、酵素または薬物を連続的に供給する。このようにして供給 されたホルモン、酵素または薬物の量は、必要に応じて（倒　産生を制御または 影響を及ぼす外来性キューすなわち因子を用いることによって、グラフトの大き さまたは体中に導入された繊維芽細胞の量を制御することによって、または前記 グラフトを摘出することによって）修飾または制御することができる。 遺伝的修飾肝細胞を、ＬＤＬレセプター機能を欠失している一曲Ｌラットに移植 した。実施例■に述べたように、そして、家族性高コレステロール血症の動物系 統を用いて、遺伝的欠失肝細胞中に正常ＬＤＬレセプター遺伝子を導入して、こ れらを宿主に移植する新しい治療方法を開発した。ホモ接合型の家族性高コレス テロール血症は、命に関わる障害で効果的治療法が皆無である。　（Ｇｏｌｄｓ ｔｅｉｎ、Ｊ、Ｌ。 およびＭ、Ｓ、　Ｂｒｏｗｎ　、、Ｔｈｅ　Ｍｅｔｈａｂｏｌｉｃ　Ｂａ５ｉｓ 　ｏｆ　Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ、５ｃｒｉｖ■■ Ｃ，Ｒ，、Ｂｅａｕｄｅｕｔ、　Ａ、Ｌ、　Ｓｌｙ、Ｗ、　Ｓ、およびＶａｌｌ ｅ　Ｄ、著、（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌ１社）　、１２１５−１２５０頁（１９８ ９））　、実施例■に記載の１略的手段では、動物から肝細胞を単離して、これ らの細胞中に機能性ＬＤＬセレプター遺伝子を−（７二上三で形ｆｉ人し、かつ 、同一種（ｔｙｐｅ）の別の動物にこの遺伝的修飾細胞を移植することを伴う。 入　゛　〜　る′　−・　の　゛、 本発明は、遺伝子工学産生肝細胞が目的とする遺伝子産Ｔｈ（例　ポリペプチド またはタンパクＸ）を生物学的に有意な量で産生ずるように遺伝子工学で肝細胞 を処理可能とする。このようにして形成された肝細胞は、連続的薬物デリバリ− 系として作用し、（例　接種、注入等によって）必要物質の定期的投与を必要と する現在の処方に取って代わることができる。 肝細胞への目的とする遺伝物質の組み込みは、先天性疾患の治療および後天性疾 患の治療において特に貴重であろう。先天性疾患の場合、本手法を用いて個体肝 細胞が正常に産生ずることができないタンパク質またはポリペプチドをコードす るＤＮＡを含有する遺伝的修飾肝細胞を提供する。たとえば、これを用いて尿素 回路障害を治療することもできるであろう。本発明の肝細胞は、また、肝によっ て正常産生される産物（例　ＬＤＬレセプター）が産生されないかまたは産生さ れるが量が十分でない遺伝的疾患の治療にも用いることができる。欠失または産 生が適切でない物質をコードするＤＮＡによって形質導入された肝細胞を用いて 、それを十分量産生させることもできる。この場合、形質導入肝細胞はＬＤＬレ セプターを産生し、したがって、１次遺伝的欠損が低密度リポタンパク質類レセ プターの発現またはｍ能異常である先天性疾、曇としての家族性高コレステロー ル血症の予防または治療手段を提供するであろう。これは、血清コレステロール の上昇と冠動脈疾患の早期発症をもたらす、この形質導入肝細胞を用いて、十分 量のＬＤＬレセプターを産生じ、原疾患を克服する。 また、遺伝子工学処理肝細胞を使用することによって治療が付与される後天性疾 患もある。たとえば、肝障害関連の凝固異常を治療する際に、上記細胞を使用す ることができる。この場合、その中に１個異常の凝固因子をコードする遺伝子を 組み込んだ肝細胞は、出血につながるようなこれらの因子類の後天的障害を治療 するであろう。また、ウィルス肝炎、特にＢ型肝炎または非Ａ非Ｂ肝炎を遺伝子 トランスファーによって治療することも可能である。たとえば、本発明の方法を 用いて、アンチセンス遺伝子をコードする遺伝子を肝細胞中に導入してウィルス 復製を阻害することもできるであろう。この場合、構造肝炎遺伝子を逆または反 対方向に含むヘクターを肝細胞に導入して、その結果、正常配向を有するアンチ センス遺伝子を形質導入肝細胞で産生ずることができるであろう。 本発明を下記の実施例によって説明するが、これらは、いかなる意味でも限定す るものと見なしてはならない。 の　立 Ｌｅｆｆｅｒｔによる潅流混合物を用いて、Ｂｅｒｒｙ及びＦｒ１ｅｎｄの方法 によってラット肝細胞を調製した。　Ｂｅｒｒｙ＋Ｍ、Ｎ、ａｎｄ　Ｄ、Ｓ、　 Ｆｒ１ｅｎｄ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。 ｇｙ、４３：　５０６−５２０（１９６９）　；Ｌｅｆｆｅｒｔ、Ｈ８Ｌ、　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｗｏｌｏｇ凵A５８ ：　５３６−５４４（１９７９）参照。肝細胞源として体重２００から２５０ｇ の雄性５ｐｒａｑｕｅ　［ｌａｗｌｅｙラットを用いた。数種類のマトリックス 基質のうちの１つの上で、１０％ウシ胎児血清を補充したホルモン規定培地（ｈ ｏｒｓｏｎａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｍｅｄｉａ）中に４ｘｌＯ’細胞／ｃｔ ｘ”の密度で細胞を播いた。　Ｅｎａｔ＋　Ｒ，ｃｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃｅｅｄ ｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｓｙ　ｏｆ　５ｃｉｅ ｎｃｅｓ、ＵＳＡ、　８１　：　１４１１−１４１５（１９８４）参照。４時間 後に培地を新しいホルモン規定培地に変えて、次いでこれを実験期間の２４時間 毎に変えた。以下の基質を用いた＝１）組織培養プラスチイック−Ｆａｌｃｏｎ 社のプライマリア（Ｐｒｉｍａｒｉａ）プレートをそれ以上の調製を行わずに用 いた；２）タイプ１コラーゲンラツト尾部の１から調製したタイプ１コラーゲン でコーティングした１０ｃＩＩＭｉ織培養皿、　Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ、 Ｇ　ａｎｄ　Ｈ，Ｐｉｔｏｔ、Ｅｘｐ、Ｃｃｌｌｕｌａｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 ９４：　７Ｏ−７８（P９７５） 参照、Ｎ単に述べると、コラーゲンを０．１％酢酸中に可溶化しく　３　ｍｇ／ ａｌｌ）　、これをプレートに適用しく　１　ｍ　ｌ　／１０ｃｍプレート）、 次いでこれを４７１４ｆｆ蒸気にさらして、風乾し、ガンマ線照射（１０，００ ０ｒａｄ）によって滅菌して、培地で水和した；ラミニン−Ｃｏｌｌａｂｏｒａ ｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ社（マサチューセッツ州、ウォルサム）から購入し た精製ラミニンを製造者の指示に従ってＡｌｌ織培養プレートに適用した；４） タイプ■コラーゲンー精製タイプ■コラーゲンでコーティングした１　０ｃｍ皿 はり。 Ｍ、　Ｒｅ１ｄ博士（アルハート・アインシュタイン医科大学）から恵与された 。 「　ウィルス札ｌｒ　と　の感仇 ＢＡＧウィルスのヘルパーを含まない両栄養性プロデューサーはＣ，Ｃｅｐｋｏ 博士（バーバード）から恵与された。このプロデューサーを作成するために用い るレトロウイルスヘクターはＣｅｐｋｏ及びその共同研究者によって記述されて いる。 Ｐｒ１ｃｅ＋　Ｊ　、　、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏ ｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、ｌｌ５`、８４　：　１５ ６− １６０（１９８７）参照。これは大腸菌からのヘーターガラクトシダーゼと、原 核生物にはネオマイシン耐性を、そして真核生物にはＧ４１８耐性を付与するバ クテリア遺伝子（ｎｅｃ）とを同時発現した。このプロデューサーを１０％ウシ 血清を補充したダルベンコの改変イーグル培地中で維持した。濃縮しないウィル スストックを調製し、Ｍａｎｎの方法により滴定した。Ｍａｎｎ、　Ｒ，ｇｉｌ ｌ、　３３：　１５３−１５９（１９８３）参照。滴定は１−４　Ｘ　１０’　 ｃｆｕ　／ｍｌの範囲であった。ポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｃ　：　Ａｌｄ ｒｉｃｈ社）８ｌｇ／ｍｌを含むウィルスストックで肝細胞培養物を１２時間感 染させた（ウィルスストック５　ｍｌ／　１０ｃｍ肝細胞プレート）、ウィルス にさらす時間と肝細胞を播いたマトリック基質に間して形質導入効率を最適化し た。 ／　六二の 形質導入の効率は最初、プロウィルスの組込みを直接測定することによって評価 した。 丈里ヱ光折 肝細胞の形１ｒ導入した培養物から高分子量の細胞性ＤＮＡを上記した方法によ って単離した。　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ■ ｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｎ、Ｙ、（１９Ｂ２j参照。 少量（７，５μｇ）を制限エンドヌクレアーゼＫｐｎｌで消化した。　Ｋｐｎｌ はプロウィルスの長い末端反復（ＬＴＲ）中に認識部位を有するので、その結果 、組込みの部位に無関係に、各組込まれたプロウィルスは６．９Ｋｂの制限断片 を含むことになる。 この制限断片を１％アガロースゲル中の電気泳動で解析し、プロウィルスに特有 の配列（すなわち、ｎｅｏ遺伝子）に相補的なプローブと標準的手法を用いるサ ザン法によって分析した。　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、門ｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕ ａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌ（ａｒｂ盾秩AＮ、’ｙ’。 （１９８２）参照、ランダムプライマー法を用いて”　Ｐ−ｄＣＴＰで高特異的 活性に標識したネオマイシン遺伝子のＲａｍ）ＩＩ　／Ｈｉｎｄｌｕ断片をプロ ーブとしてプロットした。　Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、Ａ、Ｐ、　ａｎｄ　Ｂ、νｏｇ ｅｌｓｔｅｉｎ、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｓｉｓｔｒｙ、１３２：　６　１３　 （１９８３）参照、オートラジオグラフ上で得られるバンドの強度は細胞集団に 組込まれたプロウィルスの数に比例する。 図４は、肝細胞培養物中へのプロウィルスの組込みに対する、使用した細胞外マ トリックス及び感染時間の影響を示す。パネルＡは数種類のマトリックス基質（ タイプ１コラーゲン、ラミニン、タイプ■コラーゲン、及び組織培養プラスティ ック）のうちの１つでコーティングした１０ｃｍのプレート上で培養し、第４． ２．３．４又は５日目に感染させた単一コラゲナーゼ潅流がら単離した肝細胞の サザンプロットを示す、新鮮なウィルスストック調製物を用いて感染を行い、感 染を開始した４８時間後に組込まれたプロウィルスのコピー数をプレートから分 析した。 ３日間暴露したサザンブコントを示す、各レーンには単一バンドが観察され、こ のバンドを含むオートラジオグラフの領域を示す。レーンｌ−５は、細胞を感染 させた日数を示す。上部の４つのバンドは異なる形態のマトリックス上で培養し た肝細胞を表す：Ｃｏ１１−タイプ■コラーゲン、Ｌａ１１−ラミニン、Ｃｏｌ 　ＩＶ−タイプ■コラーゲン、及びＴＣＰ−組織培養プラスチイノク、底部のバ ンドは、肝細胞培養物を感染するのに用いたのと同しウィルスストックで感染さ せたＮｌ８３Ｔ３細胞の同様な分析を示す。 各マ）ＩＪノクス基質上の肝細胞は形質導入への感受性に関して一貫したパター ンを示した；プロウィルスの組込みは、１日間にはほとんど検出できないが、２ 又は３日目に最大まで増加し、次いで５日目までには低レベルに減少した０本質 的にはマトリックスとは関係なく、最大のプロウィルス組込みは、組織培養プラ スティック上での細胞では培養物を２日目に感染させたとき、あるいはタイプｌ コラーゲン、ラミニン、タイプ１コラーゲン上での細胞では３日目に感染させた ときに起こった。 肝細胞を感染させるのに用いたのと同じウィルスストンクでＮＩＨ３Ｔ３細胞を 感染した（図１、パネルＡ）、サザン分析はウィルスストンクの力価にほとんど 差がないことを示した；プロウィルスの概算コピー数は０．５から０．７コピー ／細胞の範囲であった。このコピー数の概算はサンプルと既知の量の標準プラス ミドとの比較（図４、パネルＢ）及びＮｌ１１３Ｔ３細胞が少４倍体であるとい う仮定に基づいている。 既知の量の標準プラスミドを存するサンプルは、各種！（２μｇ及び１０ｐｇ） の精製ＢＡＧプラスミドと非感染ＮＩＨ３Ｔ３　ＤＮＡ７．５μｇとを混合する ことによって作成した。分析では単一バンドを示し、これはパネルＡに示すバン ドと共に移動した。 パネルＡ及びＢからデータは同しサザンブロノトの３日暴露から得た。ＮＩＨ３ Ｔ３ＤＮＡ７．５μｇ中の２μｇ及び１０ｐｇのプラスミドはそれぞれ約０．３ 及び１．２プロウイルスコピー／細胞と相関する。最大限に感染された肝細胞（ 例えば、図４、Ｌａｗ、レーン３）におけるプロウィルス組込み体の概算コピー 数は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の［ｌＮＡ含量が肝細胞のＤＮＡ含量に等しいと仮定す ると、約０．　２コピー／細胞である。 培養中の肝細胞の大多数は４倍体又は８倍体のいずれかであるので、この仮定は おそらく正しい、　Ｔｏｍｉｔａ、　Ｙ、　、εｘｏ、ｃｅｌＩ　Ｒｅｓ、　、 １３５　：　３６３−３７０（１９８１）参照。 ・び　パ 肝臓に特異的な一連の細胞化学的及び免疫細胞化学的染色法を用いて、肝細胞培 養物の細胞組成を明らかにした。すべての分析はタイプｌコラーゲン上に播いた 肝細胞の３日培養物を用いて実施した。 ＢＡＧウィルスで感染した細胞は構造的に高レベルの細胞質ベーターガラクトシ ダーゼを生産する。Ｐｒｅｃｅ＋　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ 、ＵＳＡ、８４　：　１５６−１６０（１９８７）参照、ベーターガラクトシダ ーゼの活性は、感染細胞中に青色沈澱物を形成する基質５−ブロモ−４−クロロ −３インドリル−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いてその場で検出した。　Ｐｒ１ｃ ｅ、　Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃｅｅｄｕｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏ ｎａｌ　Ａｃａｄａｗｙ　ｏｆ　５ｃｊｅｒ＋ｃｅｓ、ＵＳＡ、８４　：　１５ ６−１６６（１９８V）参照。 ベーターガラクトシダーゼのための細胞化学的染色法によって、感染肝細胞の二 重培養物のレトロウィルス形質導入（及び発現）をその場で分析した。Ｐｒ１ｃ ｅ。 Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ 　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃ：ｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ＋８４@：　１５６ −１６０（１９８７）参照。この手法ではウィルス指示性ベーターガラクトシダ ーゼを発現する細胞を特異的にラベルし、内因性ベーターガラクトシダーゼは検 出されない。 図５（パ朽レノ＼−Ｄ’）は、肝細胞及びＮ１１（３Ｔ３細胞の形質導入された 培養物中ごこおけるベーターガラクトンダーゼ活性の細胞化学的局在化を示す。 パネルＡ−Ｄはタイプｌコラ−ケン上に播き、かつ１．２．３．４又は５日目（ それぞれパネルａ−ｅ）に感染した肝細胞培養物を示す。パネルｆは３日目に肝 細胞を感染するのに用いたのと同しウィルスストックで感染しておいたＮｒ）１ ３Ｔ３細胞の集団を示す。 その結果は、ラベルされた細胞がしばしば２つの組になって見られることを示し ており、おそらくこれは分裂細胞中に感染して組み込まれ、２個の娘細胞にラベ ルが入ったことを示している。さらに、染色の強度によって判断したところ、ベ ーターガラクトシダーゼの発現には極めてバラツキがあるのに、ラベルされた一 対の細胞の間では一貫している傾向を有する（例えば、パネルＣを見られたい） 。 細胞化学的に測定したところ、形質導入の効率は、サザン分析で示したのと同様 に、培養時間に同じように依存することを示した。ラベルした細胞の割合は、１ 日間に感染した培養物における１％以下から、３日目に感染した約２５％まで増 加したが、続く２日間（４及び５日目）に感染した培養物では形質導入の効率が 劇的に減少しだ。 ３日目に肝細胞を感染するのに用いたのと同じウィルスストックで感染したＮＩ Ｈ３Ｔ３細胞を同様に分析したところ、約５０％の細胞がラベルされたことを示 した。 これはサザンブロノト分析に基づいた形質導入の概算効率と一致する（図４、パ ネルＡ）。 プロティンＡ　（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓからのもの）と 結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ活性を検出するため のｐＨ７，４におけるジアミノベンジジン細胞化学を用いて、υＤＰ−グルクロ ノジルトランスフェラーゼ及びアシアログリコブロティンリセブターの免疫細胞 化学的局在化を培養皿中で実施した。Ｎｏｖｉｋｏｆｆ、Ｐ、Ｍ、　ｅｔ　ａｔ 、、ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、９７　：　１５５９− １５６５（１９８３）参照、ランドのＵＤＰ−グリクロノジルトランスフェラー ゼへの単一特異的１ｇＧをウサギ抗血清から精製した。　Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら は肝臓中におけるＵＤＰ−グリクロノジルトランスフェラーゼの分析を測定する ために免疫細胞化学的手法を用いた。 この膜結合性酵素は肝細胞にのみ存在し、小胞体及び核層に局在する。　Ｃｈｏ ｗｄｈｕｒｙ＋Ｊ、Ｒ，ａｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ 　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、　、ＵＳＡ、８２　：　２９９０−２９９S （１９８５）参［！ｑ。ラノ゛トアシアログリコプロテインリセプターに対する 単一特異的抗体はＲ，５Ｌｏｃｋｅｒｔ博士（アルハート・アインンエタイン医 科大学）から恵埠された。免疫細胞化学的実験ための対照には、免疫前のウサギ 抗血清に細胞を暴露し、次いで特異的ウサギ抗体に用いたのと同し処置を施した ものを含む、　ｕｏｐ−グルクロノジルトランスフェラーゼに対する単一特異的 ポリクローナル抗体を用いた培養肝細胞の免疫細胞化学的分析は、細胞の９５％ 以上で反応生成物が細胞質塊中及び核の周囲に分布していることを示しており　 （図４、バフルＣ）、この反応部位はそれぞれ小胞体及び核エンヘローブに対応 する。免疫前のウサギＩｇＧで実施した実験では見られなかった。　（図５、パ ネル１）。 アジアログ１コブローインＩセプ　− このよく記載されたりセブターは肝細胞で特異的に発現する。ラストの肝臓にお ける免疫細胞化学的分析では、このリセプターは類洞を隔てる原形質膜の領域に 局在し、光学顕微鏡下ではりセプターは肝細胞の頻洞面に沿って肝細胞の周囲に 観察される。Ｇｅｎｚｅ、Ｊ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｃ ｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、２２　：　８６７−８７０（１９Ｂ２）　； ｌ’１ａｔｓｕｕｒａ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１ ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、２５@：　８６４−８７ ５（１９８２）参照。培養ではアシアログリコプロテインリセプターのレベルは 減少するが、それでも肝細胞の３日間培養物の事実上すべての細胞中に見られた ９反応生成物は肝細胞周囲の集魚領域に濃い線として観察される（図４、パネル Ｈ１ここでは単一特異的ウサギ抗体を用いる局在化の結果を示す）。この特徴的 な染色は対照（免疫前）ウサギ血清を用いる実験では観察されない（図５、パネ ル１）。 グルコース−−ホスフ　−ゼ この解糖酵素は肝細胞の細胞化学的マーカーとしてよく認識されている。この酵 素は肝臓セクションの事実上すべての肝細胞に検出される。しかしながら、酵素 活性には顕著な領域的バラツキがあり、最大活性は門脈周囲頓域に見られる。 ５ａｓｓｅ、Ｄ、　、”肝臓代謝の制御及び細胞内−及び細胞間区画化”、Ｔｈ ｕｒｍａｎ、Ｒ。 Ｇ、　、Ｋａｕｆｍａｎ、Ｆ、　Ｃ，及びＪｕｎｇｅｒｍａｎｎ、　Ｋ、　Ｖｉ ａ集（Ｐｌｅｎｕｓ　Ｐｒｃｓｓ、　ＮＹＣ）　ｐｐ。 ５７−８６　（１９８６）。 グルコース−６−ホスファターゼ活性は、リン酸鉛酵素細胞化学的手法によって ３日目の肝細胞培養物で検出した。Ｗａｃｈｓｔｅｉｎ＋Ｍ、　ａｎｄ　Ｅ、　 Ｍｅｉｓｅｌ、Ｊ、　ｌｉｓｔｏｃｈｅｍ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　、４　：　５ ９２（１９５６）参照。 ９５％以上の細胞で特徴的な褐色／里色の細胞′ｆ染色が観察された（図３、パ 翠ルＪ）、予期した通り、酵素活性には顕著な細胞−細胞間のバラツキがあった 、繊維芽細胞のような非実質的細胞の純粋培養物には活性が観察されなかった。 ベルオキシソーム 肝細胞培養物中のベルオキシソームの分布を見るために、Ｎｏｖｉｋｏｆｆらの 方法を用いた。　Ｎｏｖｉｋｏｆｆ、　Ａ、　Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｈｉｓｔｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｃｍｉｓｔｒｙ、　２O　： １００６−１０２３　（１９７２）参照、これらの小さな細胞質構造（直径約０ ．５ミクロン）は肝細胞（肝臓の関係において）に特異的に観察され、カタラー ゼの細胞化学的染色によって見ることができる。ＤｅＤｕｖｅ、　Ｃ，ｅｔ　ａ ｌ、、Ｐｈｙｓｉｏ、Ｒｃｖ、　、４６　：　３２３−３５７（１９６６）。 試験した培養物の９５％以上の細胞が多数のカタラーゼポジティブなベルオキシ ソームを示し、これは細胞質に無秩序に分布する点様の構造として現れた（図５ 、パネルＫ）。非実質的細胞（例えば、繊維芽細胞）の純粋培養物を分析したと ころ、ベルオキシソームは検出されなかった。 ■　しいＬＤＬＲへのレトロ　イルスー　゛−−゛及び肚風胞辺怒染 新生のニューシーラント（ＮＺＷ）ウサギ及び−１１１１Ｌウサギ（体重５０− ８０ｇの３−５日齢）を肝細胞の源として用いた。ＷＨＨＬウサギを用いる以前 の研究のほとんどにおいて、ＮＺ−ウサギが対照として用いられてきた。新生の ＷＨ）ＩＬウサギは、同型接合欠失性のオス及びメスの交配から得らり、　Ｋｎ ａｐｋａｌｉ±（＋１［）から恵与された。２つの同腹子から得られる４匹の− ＨＨＬウサギ（ウサギ２匹／同ＩＩｍ）をこの研究に用いた（ＷＨＨＬ　１−４ と命名）。新生ＮＺ−ウサギはＰｉｎｅ　Ａｃｒｅｓ　Ｒａｂｂｉ　ｔｒｙ（バ ーモント州、ウェストブラットボロ）から購入した。Ｌｅｆｆｅｒｔの潅流混合 物を用いて、Ｂｅｒｒｙ及びＦｒ１ｅｎｄの方法によって肝細胞を調製した。　 Ｂｅｒｒｙ、Ｍ、　Ｎ、　ａｎｄ　Ｄ、Ｓ。 Ｆｒ１ｅｎｄ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３　：　 ５０６−５２０（１９６９）　；　Ｌｅｆｆｅｒｔ、Ｈ，ＬA　ｅｔ　Ｇ １３、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｓｏｌｏｇｙ、５８　：　５３６−５４ ４（１９７９）参照、成獣マウス肝細胞の調製に用いたＣ１ａｙｔｏｎ及びＤａ ｒｎｅｌｌの方法でコラゲナーゼ潅流を逆方向で実施した。 Ｃ１ａｙｔｏｎ、Ｄ、Ｆ、　ａｎｄ　Ｊ、Ｅ、　Ｄａｒｎｅｌｌ、Ｊｒ、　、Ｍ ｏ１ｅｃｕｌｌａｒ−Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、３　：　P５ ２２−１５６１　（１９８３）。プライマリアブレート（ファルコン社）上で、 １０％ウソ胎児血清を補充したホルモン規定培地中に３−４ｘｌＯ“細胞／ｃｍ ”の密度で細胞を播いた。４−６時間後に培地を新しいホルモン規定培地に変え て、次いでこれを実施期間０２４時間毎に変えた。Ｅｎａｔ、　Ｒ，ｅｔ　ａｔ 、、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ 　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、ＩＪＳＡ、　８１　：　１４１１−１４１５（１９ ８４）参照。 ボリフ゛レン（８μｇ／ｍりを含むウィルスストンク（５ｍｌ／１０ｃｍブレー ト）で肝細胞培養物を１２時間感染させた。　ｉｉｌ［ＩＬないウィルススト− ／りは上記のプロデューサー細胞から調製した。 」操汲μｍ勤」１折 高分子量のゲノムＤＮＡを単離してプロウィルス配列の組込みを分析した。全細 胞ＲＮＡをグアニジンチオシアネート法を用いて調製し、ホルムアルデヒド／ア ガロースゲル中で分画し、そしてニトロセルロースペーパーに移し取った。Ｃｈ ｉｒｇｗｉｎ、Ｊ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８　 ：　５２９４−５２９９（１９８０）　、ランダムプライマー法を用いて”Ｐ− ｄＣＴＰで高特異的活性に標識した１、９ｋｂ　０）ＬＤＥ、ＲｃＤＮＡ断片（ ９ＴＺ■のＨｉｎｄ［［［からＥｃｏＲＩの断片）をプローブとしてノーザン及 びサザンプロットを行った。　Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、　Ａ、Ｐ、　ａｎｄ　Ｂ、　 Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１３２　：　６−１３（ １９８４）。ノーザンプロットを切り出し、ヒトガンマアクチンのｃＤＮＡプロ ーブ（ｐｉ（Ｆ−１のＨｉｎｄＩＩ［からＢａｗｌ　Ｉの断片）を用いて再度行 った。Ｇｕｎｎｉｎｇ＋Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ１ｌ　 Ｂｉｏｌｏｇｙ、３　：　７８７−７９５（１９８３）。 裡胞化学的分析 ＢＡＧウィルスで感染した肝細胞培養物を用いて、形質導入細胞の細胞質に青色 沈Ｂ物を形成する細胞化学的染色法によってウィルス指示性のベーターガラクト シダーゼの発現を分析した。　Ｐｒ１ｃｅ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃｅ ｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉ ｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、　８４７１５６４６０（１９Ｂ７＞参照、リン酸鉛酵素の 細胞化学的方法によってグルコース−６−ホスフェート活性を検出した。−ａｃ ｈｓｔｅｉｎ、　Ｍ。 ａｎｄ　Ｍｅｉｓｅｌ、　Ｊ、　ＨｉｓｔｏｃｈｅｔＣｙｔｏｃｈｅｍ、　、４ 　：　５９２（１９５６）　＠培養物を蛍光標識ＬＤＬ又はアセチル化ＩＤＬ　 （ＡｃＬＤＬ）　（１，１′ジオクタデシル−３，３，３’、３’テトラメチル インドカルバシアニンバークロレート−これ以後Ｏｆ＋と略称する一１０μｇ／ ｍｌで標ｔｉ：マサチェーセッッ州スタウトン、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃ ｈ、社より入手）を含むホルモン規定培地中で６−８時間インキュベートし、次 いでリン酸緩衝液で３＠リンスし、０．５％ゲルタールアルデヒドを含むリン酸 緩衝液中で固定化することによって、培養物中のＬＤＬＲ又はＡｃＬＤＬに対す るリセブターの存在を分析した。　Ｐｉｔｏｓ、Ｒ，Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、Ａｒ ｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ｌ　：　１７７−１８５（１９８１）　＊　Ｖ ｏｙ狽＝B Ｊ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ、９９　：　８１（１９８４）＊蛍光試薬の取り込みはＬｅｉｔｚの倒立蛍 光顕微鏡を用いてその場で観察した。 則し分解Ωヱヱ土工 Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｂａ５ｕ及びＢｒｏｗｎの方法を用いて、３５ｍｍの皿に 播いた肝細胞の５日間培養物０）”ｓＩ　−Ｌ、ＤＬ　（１０１Ｉｇ／ｓｌ、０ ．１５　ｕｃｊ／ｕ　ｇ、　７サチｓ−セｙ’７州スタウトン、Ｂｉｏｍｅｄｉ ｃａｌ　Ｔｅｃｈ、社より入手）の分解をアッセイした。Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、 　Ｊ。 Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｗｏｌｏｇｙ、　９８　 ：　２４１−２６０（１９８３）　。 ヒ　ＬＤＬＩＩ　コー゛　る　′し　ロウイルスの４種の異なるレトロウィルス ベクターを試験した；これらのベクターのプロウィルス成分を図３に示した。各 ベクターはＬＤＬＲの発現を指示するのに用いる転写要素が異なる：　ＬＴＲ− ＬＤＬＲ−ウィルスの長い末端反復配列（ＬＴ＋？）　、　ＢＡ−ＬＤＬＲは２ ６６から＋１まで伸びるニワトリヘーターアクチン遺伝子（ＢＡ）の２６７ｂｐ セグメントを含むＨ４−ＬＤＬＲは−６９６から＋８まで伸びるヒストンＨ４遺 伝子（Ｈ４）の７０４ｂｐセグメントを含む、　ＴＫ−ＬＤＬＲは−２００から ＋５６まで伸びるヘルペスシンプレンクスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ 丁Ｋ）の２５６ｂｐセグメントを含む。ＬＴＲ−ＬＤＬＲのプラスミド配列は、 ＤＯＩのＢａａｌｌ　ＩからＣ１ａｌまでの７．２にｂ断片から次の修飾によっ て得た；　３　’　Ｍｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルス（ＮＯ−ＭＬＶ）　Ｌ ＴＲのＮｈｅｌからＣｌａｌ部位まで伸びる配列（ヌクレオチド７８４６から８ １１３）を、骨髄増殖性サルコーマウィルスのＬＴＲからの相同配列で置換した （図中、黒い部分で表示）　、　Ｋｏｒｍａｎ＋　Ａ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌｌ、Ｐ ｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ 　５ｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、　８４　：　２１５O−２１５４ （１９８７）；　Ｖａｎ　Ｂｅｖｅｒｅｎ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、ＲＮＡ　Ｔｕｓ ｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ　（第２版）Ｗｅ４ｓｓｌＲ，ｅｔ　≠撃潤A −集）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈｏｒｂｏｒ　Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ、ｐｐ、 ７６６−７８３（１９８５）　；　５ｔａｃｅｙ、Ａ、　ｅ煤@ａｌ、、 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５０　：　７２５−７３２（１９８ ４）参照。 プラスミドＢＡ−ＬＤＬＲ，ＨＥ−ＬＤＬＲ及びＴＫ−ＬＤＬＲ骨格構造（ヌク レオチド７６７４におけるＣｌａｌ部位に隣接するプロウィルス配列とともに、 ５’−ＬＴ［ｌ、隣接マウスゲノムＤＮＡ　、　ｐＢＲ３２２配列、及び３’［ 、ＴＲを含む）は、３’ＬＴｌｉ（ヌクレオチド７９３３のＰｖｕ　ｎ部位から ヌクレオチド８１１１のＸｂａ　１部位まで）のウィルス増強要素を含む配列が 削除された点（図中、逆三角形で示す）以外は、Ｄｏｔに由来した。これは、逆 転写後のウィルス転写及び組換えプロウィルスの岨込みの量を減少するために行 った。これらのベクターはまた５’−ＬＴＲと内部プロモーターとの間に付加的 な門ｏ−ＭＬＶ配列Ａを含む。この付加的配列は、ヌクレオチド６２４のｌ１ａ ｃｌ［１部位にＳａｃ　ＩＩリンカ−を挿入した点板外は、野生型Ｍｏ−ＭＬＶ 　（０５の境界にあるヌクレオチド１４６からヌクレオチド１５６０にある［コ ーディング領域中のχｈａ１部位まで）から由来した（この付加的配列は図中の 区で示す）、それぞれの場合において、ＬＤＬＲコーディング配列は全長ＬＤＬ ＲｃＤＮＡ挿入物（Ｄ、　Ｒｕ５ｓｅｌｌ、Ｊ、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ及びＭ、　 Ｂｒｏｗｎ博士より恵与された）を含むプラスミドｐＴＺＩの２．６ｋｂのＨ４ ｎｄｌ［［断片から由来した。　Ｓ、Ｄ、　はドナーサイトを示し、各ベクター の下の矢印は転写開始部位を示す。 ベクターＢＡ−ＬＤＬＩ？５Ｈ４−ＬＤＬＲ及びＴに−ＬＤＬＲのためのウィル ス生産性細胞系は、ρ５Ｖ２−Ｎｃｏを存する特定のプラスミドＤＡＮを上記の 両栄養性バフケージング細胞系Ｐｓｉ　−Ｃｒｉｐ中にトランスフェクションす ることによって得られた。Ｃｏｎｅ、　Ｒ。 Ｄ、　ａｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏ ｌｏｇｙ＋　７　：　８８７−８９７（１９８７）　；　Ｍ奄撃撃奄■≠氏B Ｒ，Ｃ，ａｎｄ　Ｐ、　Ｂｅｒｇ、５ｃｉｅｎｃｅ、　２０９　：　１４２２− １４２７（１９８０）参照、　Ｐｓｉ−Ｃｒｏｐは、細胞にＰｓｉ−ａｍ＋の機 能（例えば、眩Ｌ」虹、及びｅｎｖ）を２成分で提供するＰｓｉ−３ｍパッケー ジ細胞系の修飾型である。すなわち、脛紅」ユ機能は１つの組み込まれたプロウ ィルスの形で提供され、またｅｎｖ　＊能は別のプロウィルスから生産される。 宿主領域は両栄養性である。 細胞のうちＧ４１８耐性コロニーを拡大して、正しいプロウィルス構造を伝達す るウィルスを生産しているか試験した。これは、プロデューサー細胞から上清を 回収し、ＮＩ）１３Ｔ３細胞を感染させ、そして感染細胞集団の組み込まれたプ ロウィルスをサザン分析によって調べることによって実施した。 ２段階手法を用いて、ＬＴＲ−ＬＤＬＲベクターの高力価の両栄養性プロデュー サーを得た。まず、上記のＰｓｉ　２株パフケージ細胞系中にＬＴＲ−ＬＤＬＲ とｐ５ν２−Ｎｅｏとを同時トランスフェクションすることによって高力価のエ コトロピンクプロデューサーを作成した。　Ｍａｎｎ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ １ｌ、３３　：　１５３−１５９（１９８３）　、次いでＰｓｉ　−Ｃｒｉｐ細 胞をＰｓｉ−２株プロデューサーから回収したウィルスで感染させ、１Ｏｃｓの プレート上にクローン密度で播いた０個々のクローンを単離して上記の高力価の 両栄養性ウィルスを生産しているか分析した。受容菌細胞に最大数のプロウィル スコピーを伝達するウィルス生産性の細胞系を本研究の目的に選択した。すべて のウィルス生産性細胞系は、ヘルパーウィルスの存在を試験する目的に使用する 前に４−６ｓ間培養した。ヒトＬＤＬリセプターのための遺伝子を発現する両栄 養性ウィルスを生産する、７−３５と命名されたＮｌ８３Ｔ３細胞系を、ブダペ スト条約の下に、１９８８年２月３日、寄託番号ＣＲＬ９６３５で、メリーラン ド州ロックビルにあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託し た。 のしＤＬＲの−　び 感染実験に使用された細胞は上記の３兎のＮＺＷウサギおよび４兎のＷＨＨＬウ サギから単離した肝細胞であった。コラゲナーゼパーフユージタン（ｐｅｒｆ　 ｕｓ　１ｏｎ）は規則的に４Ｏ−８０Ｘ１０”細胞／動物を９０％以上の生存率 で生産した。サブコンフルエン）　（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な密度で撒か れた細胞は、撤積６時間後に視覚化した時、皿の約２０％を覆う凝集物（５−２ ０細胞／凝集物）を形成した。実施された最初の培養物は培養３６時間後に増殖 を示し、３または４日までにコンフルエントに達した。 培養物の細胞性成分を証明するために、５日間培養されたモック感染−聞り肝細 胞が何種類の方法で分析された。第一に、細胞は上記のごとくグルコース−６− ホスファターゼについて染色さａＳ培養物中の肝細胞の数を測定した。グルコー ス−６−ホスファターゼは肝臓区分および肝細胞培養物中での肝細胞に関する特 異的マーカーである。９５％以上の細胞が肝細胞の特徴である褐色の細胞質染色 を有した。繊維芽細胞および内皮細胞の純粋なカルチャーには染色は検出されな かった。 さらに、培養物は内皮細胞およびり、ブファー細胞の存在について分析された、 何故ならばこれらの非実質細胞は元の肝臓に豊富にあり、初期培養物を汚染する 可能性があるからである。洞様毛細血管および毛細管内皮細胞はクップファー細 胞と同様に、ＡｃＬＤＬに関する高水準のレセプターを発現し、これらの選択的 Ｄｉｌ−＾ｃＬＤＬ取り込みにより混合培養物中で同定されることができる。培 養された肝細胞の０ｉｌ−ＡｃＬＤＬ取り込みに関する分析は、５０細胞中の約 １個が蛍光を発することを示した。肝細胞カルチャー中のまれな汚染細胞による Ｄｉｌ−ＡｃＬＤＬ取り込みは、ウシ大動脈由来の内皮細胞の純粋第二カルチャ ー中に観察されるものと等しかった。 肝細胞の感染に関する条件を至適化するために、ξＤ旦のベータガラクトシダー ゼをコードする高力価の両栄養性ウィルス（ＢＡＧ）を使用した。　ＲＡＧウィ ルスによって形質導入された細胞を、細胞の細胞質を青く染める単純な細胞化学 的反応によって検出した。−曲り肝細胞の至適形質導入は、細胞がサブコンフル エントな密度で撤か娠初期撤積後３６時間ウィルスにさらされた時に達成された 。マトリックス基質は形質導入の効率に影響しなかった。 感染についての条件を至適化して、培養物に撒積２日後にＮ床および−ＨＨＬ肝 細胞を、４種の異なるＬＤＬＲウィルス調製物で感染させ、５日に遺伝子転写お よびＬＤＬＲ発現を分析した０組み替えプロウィルス配列の、感染肝細胞から単 離された細胞性ＤＮＡ中への統合は、サザンプロット分析により検出した（図６ ）、形質導入された肝細胞からのＤＮＡを扛り上で消化し、ＬＤＬＲｃＤＮ＾を プローブとして使用するサザン法により分析した。紅り土はＬＴＲ配列中に単一 の認識部位を有する；最終的に各統合プロウィルスは統合部位にかかわりなく共 通の制限断片を産するべきである。細胞ラインを効率的に生産する各ウィルスは 、ＮＺ−およびＷＨＨＬの両方のウサギからの肝細胞中の再配列無しでプロウィ ルス配列を伝達した。統合プロウィルスの相対コピー数は、最大である）１４− ＬＤＬＲウィルスで感染させた培養物についての１−２コピー／細胞から、最低 であるＬＴＲ−ＬＤＬＲウィルスで感染させた培養物についての０．１から０． ２コピー／細胞まで変化した。この感染効率は、同しウィルス調製物でマウスの 繊維芽細胞を感染させて達成したものの約５０％であった。 図６に検出されたウィルス性ＤＮＡが肝細胞ＤＮＡに統合されたことを示すため にさらに実験を行った。形質導入肝細胞からＤＮＡをヒ虹旺（プロウィルス性Ｄ ＮＡ中に一つの部位を有する制限酵素）で消化し、ＬＤＬＲプローブを使用する サザン分析に供した。もしウィルス性ＤＮＡが統合されたプロウィルスとして存 在するのであれば、判別し得るＥｃｏ　Ｒ１断片の検出されないはずである、な ぜならばこれらの断片の外側境界は、ＤＮＡ周辺領域に位置し、それゆえにヘテ ロジイニアスだからである。事実、この分析を行った時にＥｃｏ　ＲＩ断片：ま 検出されず、ウィルス性ＤＮＡの大部分が肝細胞染色体ＤＮＡに統合されたこと を示唆する。 形質導入した培養物はノーザン分析（図７）によって第一にＬＤＬＲ発現を分析 された。モンク新鮮培養物Ｃ図７）では見かけ上の分子量サイズが３．５Ｋｂと 等しいところで弱いバンドが検出された。このハンドは、おそらく内生のしＤＬ ＲＲＮ八　を表すのであろうが、Ｍｌ（ＨＬ培養物においてＮＺ−培養物におけ るよりも一貫してより強かった。　ＢＡ　−Ｌ［ｌＬＲ、Ｈ４−Ｌｌ）ＬＲおよ びＴＫ−ＬＤＬＲで感染した培養物中のこの優勢なＲＮＡ種は、内部プロモータ ーで開始される転写物であった。これらＲＮＡの相対的生産量は以下のヘタター 依存性様式で一貫して変化する。　８Ａ　−ＬＤＬＲＪ１４−　ＬＤＬＲＴＫ− ＬＤＬＩ？推定される内生シグナル、予想されたように、これらベクターのＬＴ ＩＩＩから開始されるごくわずかな転写が検出され、これは開始プラスミドの３ ’ＬＴｌｌに存在するエンハンサ−の欠損が、プロウィルスの肝細胞への移動中 に５’ＬＴＲに転移したからである。　ＬＴＲ−ＬＤＬＲウィルスで感染させた 培養物は一つの大変強いバンドを生産し、転写がＬＴＲで開始したことを表した 。すべてのプロットは、細長い形に切られ、ヒトガンマ−アクションｃＤＮＡプ ローブで再び釣り上げられ、添加した種々のＲＮＡ量の検査とした。ガンマ−ア クシランバンドの強さにおいて検出できる変動は無く、等量の非分解ＲＮＡが添 加されたことを示唆した。 外生ＬＤＬＲの生化学的活性をＬＤＬの取り込みを視覚化することにより１ｎｓ ｉｔｕで評価した；肝細胞の形質導入された培養物はＤｉｌ−ＬＤＬでインキュ ベートされ、蛍光顕微鏡で観察された。モンク感染させたＮＺ−ウサギは均一の 高水準蛍光をすべての細胞で表した；モック感染させた一冊り肝細胞は、ごくわ ずかな蛍光を表した。 ＬＴＲ−ＬＤＬＲウィルスで感染させた−８１（Ｌ肝細胞は最大量のＬＤＬ取り 込みを細胞の約２０％で有し、高水準の蛍光を表した。ＢＡ−ＬＤＬＲ感染−Ｈ ｌ（Ｌ肝細胞は、中程度の活性をもつ細胞集団を立証した；　８４−ＬＤＬＲ感 染Ｗ）ＩＨＬ肝細胞は、実質的にすべての細胞で低水準の活性を示した。　ＴＫ −ＬＤＬＲｉ染細胞中のＬＤＬＩｉ活性は辛うじてバックグラウンドを超えた。 このＬＤＬＲに関する１ｎｓｉｔｕアンセイに基づく形質導入効率の推定はサザ ン分析により測定された効率と一致する（例えば、ＬＴＲ−ＬＤＬＲウィルスで 感染させたＷＨ）ＩＬ肝細胞は、細胞の約２０％で蛍光を表し、一方すザン分析 では、約０．２に等しい統合されたプロウィルス性配列のコピー数を検出した） 。 形質導入した肝細胞はまた、発現されたヒトＬＤＬＩ？の量を定量する試みとし て＋ｚｓ１−ＬＤＬの分解についても分析された。これらのデータは表にまとめ られている。 ＬＤＬＲの活性はＬＴＲ−ＬＤＬＲウィルスで感染させた肝細胞で最も高かった ；ＮＺ−ウサギ由来の肝細胞はＬＤＬ望活性において、七ツク怒染細胞の１７０ ｎｇ／ｓ＋ｇ／　５時間から形質導入細胞の２７４ｎｇ／ｍｇ１５時間へと上昇 を示し、一方−Ｈｌ（’［ウサギ由来の細胞は活性について、モノク怒染細胞の ３３０−４０ｎ／５ｇ１５時間から：形質導入細胞の１５５（ＷＨＩ（Ｌ）およ び８４　（Ｗ）ＩＨＬ３）ｎｇ／ｍｇ１５時間へと上昇を示した。形質導入され た実際の１ｉＢ胞故について修正した時、ＬＴＩＩ−ＬＤＬＲ形質導入肝細胞に おけるＬＤＬＲ−７ｉ性の水準は、約７００ｎｇ／ｍｇ／Ｓ時間である（ＮＺ− ウサギ中の内生レセプターの活性よりも４倍大きい）。 Ｄｚｒｅｒｚａｋ　Ｅ、Ａ、　ｅｔａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３３１　：　３５− ４１（１９８７）　、内部プロモーター（即ちＢＡ　−ＬＤＬＲ，）１４−　Ｌ ＤＬＲおよびＴＸ−ＬＩＩＬＲ）によって駆動された転写からのＬＤＬＲを発現 するウィルスで感染させた肝細胞は、”　Ｉ（ＤＬ分解において、無しから中程 度の上昇を表した。 表１ 形質導入肝細胞１における”’　Ｉ−ＬＤＬ分解の定量分析上ツク　１７０±８ ３−　３８±５３ Ｂ＾−ＬＤＬＲ２０１±１０　−　４２±３Ｈ４−ＬＤＬＲ１９４±９　３０’ 　４７±３ＴＫ−ＬＤＬＲ１８８±１７　−　４４±８ＬＴＲ−ＬＤＬＲ２７４ 立６　１５５’　８４±１３１　分解速度も、５唯過剰の非標識ＬＤＬの存在下 で測定した。 このような条件の下では、ＮＺ−肝細胞（七ンク感染および形質導入）は５０か ら６０ｎｇ／ｓｇ／　５時間の範囲の分解速度を有し、一方１１１１（ｌ（Ｌ肝 細胞は１０から２０ｎｇ／霞ｇ１５時間の範囲の分解速度を有した。 ２　分析は一兎のＮＷＺウサギおよび二兎の一曲し兎の選択培養物について行わ れ３　平均ｎ−Ｉ　Ｓ、Ｄ、（Ｎ−３は−）ＩＨＬ　３およびＩｆ−４はＮＺＷ 　）を表す。 ４　囃−測定 実施例ｙ−遺伝約ｇ　した　のウサギへの方法 動物　使用したＷＨ）ＩＬラビットはボモザイガス（ｂｏｎ＋ｏｚｙｇｏｕｓ） 　ＬＤＬレセブ９−欠損ウサギをかけ合わせることから派生したもので、３つの 源がら得たコ国立衛生研究所のクナプカ博士（Ｏｒ、Ｋｎａｐｋａ）、ニューヨ ーク大学のマーレフ博士（Ｄｒ、　Ｍａｈｔａｎ）、および我々の飼育コロニー からである。野生型ＮＺ−ウサギは、ペンシルバニア州デンバーのダッチランド 農場（Ｄｕｔｃｈｌａｎｄ　Ｆａｒｍｓ）から購入した。すべてのウサギはプリ ナラボラトリーウサギ飼育（Ｐｕｒｉｎａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｒａｂｂｉ ｔ　ｃｈｏｗ）で維持された０個々の動物は全血清コレステロールにおいて、肝 細胞移植前２週間の間２％以下の変量を表した。加えてベースライン前処！血清 コレステロール水準は、二つの主な実験群の間で、区別がつかなかった：モソク 怒染させた細胞（５３９土４６■／ｄ１．平均±ｌ　Ｓ、Ｄ、、Ｎ＝６）または ＬＴＲ−ＬＤＬＲ感染細胞（５４３±４８糟ｇ／ｄｌ、平均±ｌ　Ｓ、Ｄ、、Ｎ ＝７）を移植されたーＨＨＬ受容体。 組換えｙ上三立ヱ匹ス 両栄養性ウィルスを生産するレトロウィルスベクターはすでに説明し、図９に図 示した。このベクターは、野生型モロニープロイルス（ＭｏＩｏｎｅｙ　ｐｒｏ ν１ｒｕｓ）に由来し、この中の配列であるｎ、ｔ、７３９のＰｓｔ　１部位と ｎ、ｔ、７６７４のΩａ１部位の間が欠損し、Ｒａｍ　８１リンカ−に交換され ている。　（番号に間しては、Ｖａｎ　ＢｅｖｅｒｅｎＣｅｔ、ａｌ、　、のｒ ＲＮＡＩｌｌ瘍ウィルスＪ　つＷｅｉｓｓ　Ｒ，、Ｔｅ１ｃｈ　Ｎ、、Ｖａｒｍ ａｓ、Ｈ，、およびＣｏｆｆ１ｎ、Ｊ、　、Ｗ集（コールドスプリングハーバ− ラボラトリ−、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）、第２版７６６− ７８３頁（１９８５）を参照）、ヒトＬＤＬレセプターコード配列はプラスミド ｐＴＺＩの２．６Ｋｂ　）ｆｉｎｄ　ｍ断片から得た（Ｄ、Ｒｕ５ｓｅｌｌ、　 Ｊ、ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＭ、Ｒｒｏｗｎの好意により提供された）、この Ｈｉｎｄ　ｌ１１部位はＢｃｌ　１部位に合成オリゴヌクレオチドで変換され、 この修飾断片はレトロウィルス性ベクターのＢａｇ　旧部位にクローンされた。 我々はこのベクターに関する初期の説明において、３’ＬＴＲのエンハンサ−配 列が骨髄増殖性サルコーマウィルス由来の均一配列に置き換わっていると誤って 述べた（Ｗｉｌｓｏｎ、Ｊ、Ｍ、ｅｔ　ａｔ、、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５　：　４４２１−４４２５（］９８Ｂ））。続く分析 では、ベクターの３′１、ＴＲが七ロ二−エンハンサー配列を含有することを示 した。このベクターがら作られたもとのウィルス生産細胞株は、この実験に先立 ちサブクローンされ復製可能ウィルスが存在しないことを示した６肝細胞単層方 よび怒ゑ ウサギ肝細胞は、べり−およびフレンド（Ｂｅｒｒｙ　ａｎｄ　Ｆｒ１ｅｎｄ） の方法、Ｊ、Ｃｅ１ｌ」胆１４３　：　５０６−５２０（１９６９）を使用して 、レフアートらのパーフュージョン混合物、伽功正１力ｖ避ｏ　１．５９　：　 ５３６−５４４　（１９７９）で調製した。細胞は１０％ウシ胎児血清に補充し たホルモン的に特定された培地中のポリカチオンマトリックス（ブリマリア、フ アシヨン、オクスナード、カリフォルニア州：　Ｐｒｉｍａｒｉａ、　Ｆａｌｃ ｏｎ　、０ｘｎａｒｄ、ＣＡ）上に６．７　ＸＩＯ’／ｃｍｚの密度で撒積され た：４から６時間後、培地を新鮮なホルモン的に特定された培地（Ｅｎａｔ、Ｒ ，ｅｔ　ａｔ、、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８　： 　１４１１−１４１５（１９８４）に交換した。２日後細胞は撤積され、培地は ウィルス生産細胞から新しく収穫された（Ｗｉｌｓｏｎ、Ｊ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ 、、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｊ、ＵＳＡ　８５　：　４４２１−４ ４２５　（１９８８））ウィルス含有培地（ポリブレン８μｇ／ｍ＋を補充）に 交換された。 １２から８時間後細胞は移植のために収穫され、遺伝子発現に関してアッセイさ れた。細胞は０．１％トリプシン中で１０−２０分間、３７°Ｃでインキュベー トすることにより組織カルチャープレートから剥がされた。 肚紐胞往植 動物の開腹、ならびに肝細胞の門靜脈注入は■ベンドパルビタール麻酔法で調製 された。滅菌外科的技術を使用して、腹部は３ｃｍの中央線切開を通して開が娠 空腸のループは外に出さ板上腸間膜静脈のトリブチリ−（ｔｒｉｂｕｔａｒｙ） は固定され結紮糸で固定された。あらかじめ暖められた８つの肝細胞懸濁液（１ ００ユニツトのヘパリンを含有する１０ｍ１容量中の１−２　Ｘ１０＠、Ｉｆ胞 ）を２７ゲイジのバタフライニードル（ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ　ｎｅｅｄｌｅ）を 通して５分間にわたって腸間膜静脈に注入した。 ついでニードルを取り除き、結紮を施すことにより止血を行い、空腸ループを腹 に戻し、二層で腹の切開をｍじた。動物はアモキシリン（ａ＊ｏｘｉｃｉｌｌｉ ｎ　：　５ｍｇ／Ｋｇ　体重量、皮下）を外科手術の日、および術後５日間に８ 〜回受容した。静脈性の試料は引き続き耳の周辺静脈から得られ、説明されるよ うに全コレステロールが分析された（Ｔｒｉｎｄｅｒ、Ｐ、、Ａｎｎａｌｓ　Ｃ ｌ１ｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１２　：　２２６−２２８（１９７４））。選択さ れた血漿試料は、説明されるように個別にリポタンパク質分画に分けられた（Ｒ ａｖｅｌ、　Ｒ，Ｊ　、　ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ、３４　 ：　１３４５−１３５３（１９５５））。 ゛−−゛よび　の　＼ ブロー　バイブ！　゛イゼーシ　ン 高分子ｌＤＮＡを単離し、説明されるようなサザン分析法（Ｗｉｌｓｏｎ、Ｊ、 Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ｌｌ５Ａ　５　：４ ４２１−４４２５（１９８８））により分析した。全細胞ＲＮ＾を調製し、プロ ットハイブリダイゼーション法により分析した（Ｗｉｌｓｏｎ　Ｊ、Ｍ　、　ｅ ｔ　ａｌ８、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　：　４４２１− ４４２５（２９８８）　）　、　ＲＮＡおよびＤＮＡ　ハイブリダイゼーシラン フィルターは、ｆｆ！ｐ−標識ヒトＬ［ｌＬレセプターｃ　ＤＮＡで説明のごと く釣り上げられた（Ｗｔｌｓｏｎ、Ｊ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８　：　４４２１−４４２５　（１９８８））。 ボ１−−ゼ　１Ｐｏｌ　ｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　ｒｉａｃｔｔｏｎ）プロウ ィルス性配列を、肝臓組織から単離したＤＮＡ中でポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ ）を使用して検出した（Ｒｏｔｈ、Ｍ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｂ］ｏｏｄ　７４ 　：　８２２−８８５（１９８９））。この反応に利用したオリゴヌクレオチド は以下の配列を有する：５′プローブーＡＧＧＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＡＣＣＣＧ ＴＡＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣ，および３′プローフ゛−ＧＧＣＴＣＧ丁ＡＣＴＣＴ ＡτＡＧＧＣＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡ　。 ベクター中のこれらの位置は図９、パネルＡに説明される。 ｉポヌ　レアーゼ　ア・セイ １２ＮＡプローブを、以下の様式で構築された転写プラスミド（プロメガ株式会 社）から作った。レトロウィルス性ベクターの中のモロニー配列、ｎ、ｔ、７６ ７４の合成堕畦り部位とｎ、ｔ、７８４６の独虹１部位との間（番号について８ の１）、はｐＧＥＭ−３ｚ（３ｚ−ｅｖｎと呼ばれる）のＢａｍＨＩおよびＸｂ ａ　［部位の間にクローンされた；ＳＰ６プロモーターからの転写は、転写を対 象とするウィルスに特異的なアンチセンスＲＮＡを生成する。このＢａｇ）ｌ　 １からＮｈｅ　Ｉまでの断片を、同じプロモーターからセンスＲ１１＾（４ｚ− ｅｖｎ）を製造するためにρＧＥＭ−４ｚ中にもクローン化した、ウサギＬＤＬ レセプターコード配列に及ぶアンチセンスＩ？Ｎ＾を、ＲＮａｓｅ保護実験の内 部対照おして使用した。ウサギＬＤＬレセプタークローンからのＳｍａ　ｌから Ｘｈｏ　Ｉ制限断片（ｎ、　ｔ、２４７５から２５７２）　（Ｙａｍａｍｏｔｏ 　Ｙ、　、ｅｔ　ａｔ、、シ旦猟坦」ハＬ：　１２３０−１２３７（１９８６） j をｐＧＥＭ−４ｚ　（４ｚ−ｒＬＤｌ、Ｒ）のＳ＋ｗａ　ＩとＳａｌ　Ｉとの間 にクローンした。このｃＤＡＮはり、Ｒｕ５ｓｅｌｌにより提供された。転写ベ クターを適当な制限エンドヌクレアーゼＣ３ｚ−ｅｎｖ、ＥｃｏＲＩ　；　４ｚ 　ｅｎｖ　Ｈａｎｄ　ｍ　；および４ｚ−ｒＬＤＬＲ訓ｉｎｄ　ＩＩＩ）で線状 化し、製造元（プロメガ株式会社）の指示に従い転写反応の鋳型として使用した 。ＲＮａｓｅ実験は、Ｍｅｌｏｎ　Ｄ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１　ニア０３５−７０５６（１９８６）に従い 、幾つかのわずかな修飾で全細胞ＲＮＡに関して行った０等量のウィルス性特異 的プローブおよび内部対照プローブが各試料に加えられた。ハイブリダイゼーシ ョンは５５°Ｃで１２時間行い、この間、ＲＮａｓｅ　Ａ消化を３７°Ｃで１時 間行った。生成したバンドの放射性をベタジエンスキャナー（Ｂｅｔａｇｅｎ　 ５ｃａｎｎｅｒ　：ベタジエン株式会社）で定量した。 グイゼーション：神経生物学への応用」（ｉｎ　５ｉｔｕ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａ ｔｉｏｎ　：＾ｐｐｌｉｃａｔｉ。 ｎｓ　ｔｏ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｖａｌｅｎｔｉｎｏ　Ｋ、Ｌ、Ｅｂ ｅｒｗｉｎｅ＋Ｊ、Ｈ，およびＢａｒｃｈａｓ、Ｊ、Ｄ、［W （オフクスホオード大学出版、ニューヨーク）　、１７９−１９７６頁、により 説明された方法を変更して行った。線状化された転写プローブを、ＳＰ６ポリメ ラーゼおよびｔｌＴＰ　（ａ）　［”Ｓ　］　Ｐ（アマジャム）を使用するｉｎ 　ｖｉｔｒｏＥ写反応での鋳型として使用した。放射標識されたＲＮＡプローブ は、単離され、５０％ホルムアミドの存在下で低温槽区分で４５”　Ｃ１１６時 間ハイブリダイズさせた。スライドを高−ストリンジェント条件（ｈｉｇｈ−ｓ ｔｒｉｎｇｅｎｃｙ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で洗浄し、コダックエマルジランＮ ＴＢ−２で被覆して、４週間露光した。 結果 ＷＨ）ＩＬ　へのし　ロ　イルス　゛　−従来の研究においては、新生児−曲し ラビット由来の肝細胞をヒトＬＤＬレセプター遺伝子によって形質導入するため に、組み換えレトロウィルスを用いた（ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ、Ｊ、Ｍ、） ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５　：　４４２１−４ ４２５（１９８８））、{ 発明においては、成人ＷＨＩＩＬラビット由来の肝細胞を感染させるために、同 様の方法を用いた。 本研究において、組み換えうイルスＬＴＲ−ＬＤＬＩＩを用いて成人−ＨＨＬラ ビ、ト肝細胞を感染させた。このウィルスのプロウィルス形は、ＬＤＬレセプタ ーの発現及びウィルスの継代を担う１本の−ＲＮ＾を転写する（ウィルソン（Ｗ ｉｌｓｏｎ、Ｊ、Ｍ、）ら、なｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾　５ 　：　４４２１−４４２５（１９８８））、　ＷＨＨＬラビットの肝細胞をホル モン限定培地中で４８時間維持し、次にＬＴＩ？−ＬＤＬｉ？ウィルスに１２〜 １８時間さらした。感染後、移植用に肝細胞を集め、レトロウィルス形質導入及 びヒトＬＤＬレセプターの発現を分析した。 総細胞ＤＮＡのサザンプロット分析を用いて、遺伝子移入の効率を直接特定した 。 これらの実験によって、感染した肝細胞において、修飾されていないプロウィル スの遺伝子配列の相対コピー数が、１細胞あたり０．１〜０．０５であることが 示された。もう一方のシャーレの肝細胞を用いて、ヒ）　Ｌ［ｌＬレセプター１ １１１１４に比較的特異的なプローブによるＩ？ＮＡ転移プロットによって、ウ ィルス由来の転写産物を分析した。このｃＤＮＡプローブによって、感染したＷ ）ＩＩ（Ｌラビットの肝細胞及びヒトヘパドブラストーマ細胞株ＨｅｐＧ２から 得られたＲＮＡ中に、大量のヒトＬＤＬレセプター転写産物が検出された。レト ロウィルスベクター中では内因性遺伝子の長い３′非翻訳領域が欠失しているた め、レトロウィルス由来の転写産物は内因性のヒト転写産物より実質的に短い、 感染した肝細胞のＬＤＬレセプター１？ＮＡのレベルは、ヒトヘパドブラストー マ細胞系の内因性ＲＮ＾レベルの５〜６倍であった。 令　−／ まず、ウサギ肝細胞の異質遺伝子系移植技術の開発を行った。この系においては 、正常レベルのＬＤＬレセプターを発現している種のウサギ（ＮＺ−ウサギ）が ら肝細胞を単離し、これをＭｌ（）ＩＬウサギの門脈に移植した。被移植ウサギ の総血清コレステロールの変化、及び、場合によっては特定のリボ蛋白質分画の 変化を分析した。供与肝細胞は、成人ＮＺＷウサギ肝臓のｉｎ　５ｉｔｕコラゲ ナーゼ潅流によって得た。ラット動物モデルにおけるこの技術のこれまでの経験 では、注入された細胞の相当数が肝臓のシヌソイドに接種（５ｅｅｄ）された（ パーチル（Ｐａｔｅｌ、Ａ、）らＭｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、ａｎｄ　Ｍｅｄ、（１ ９８９））、　ＮＺ−由来の肝細胞（細胞ｔ〜２ＸＩＯ’個／１匹）を洲ＨＬウ サギの門脈に注入すると、再現性がよく総血清コレステロールが処理前の値から ２５％減少しだ（図１０、パネルＢ）にの効果は移植３日後に最大となり、１０ 日後には血清コレステロールのレベルは実質的に処理前の値に戻った。より多数 の細胞を注入すると、肝臓の分校化及び門脈血管系の充血として現われる象性門 脈圧冗進症がひき起こされた。移植供給体由来の−）１）ＩＬラビット肝細胞（ 細胞１〜２×１０８個１匹）を異質遺伝子型被移植−）１ｔ（Ｌラビットに注入 する実験によって、門脈への肝細胞移植がコレステロール代謝に与える非特異的 な影響を調べた１図９、パネルＢ）、実際には、総コレステロールレベルの穏や かな増加は、手術後１〜２日で認められた。 ・−、に　ｔ−の １匹の１４１１）ＩＬラビットから肝細胞を集め、シャーレで培養し、モーフ感 染又はＬＴＲ−ＬＤＬＲウィルス感染させた。感染後、細胞を集め、被移植ＷＨ ＨＬラビットの門脈を通して移植した（細胞１〜２Ｘ１０”個１匹、これは肝臓 中の総細胞数の約１〜４％に相当する）、この実験は、３匹の供与ラビット及び ７匹の被移植ラビットを用いて繰り返し行った（図１０、パネルＤ）。ＬＴＲ− ＬＤＬＲ感染細胞を移植したラビットは、移植後第２日から第５日に血清コレス テロールレベルの著しい低下を示した（ｐ＜０．００１　、スチューデン）１検 定）、最大の効果は移植後第３日に得られ、このとき総血清コレステロールレベ ルが処理前の７０±３％（平均±ＩＳ、Ｄ、、Ｎ＝７）に低下した。モック感染 曲ｉ化肝細胞の移植（３匹の供与ウサギから６匹の被移植ウサギに移植）におい ては、血清コレステロールの値を処理前の値と比較して、統計的に有意の効果は 得られなかった。（ｐ＜０．６、スチェーデン）１検定）（図１０、パネルＢ） 。スチューデントを検定を用いた比較群と実験群の直接比較は、遺伝子的に修飾 した肝細胞を移植したラビットにおいて、第２日から第６日に統計的に有意の血 清コレステロールの減少（ｐ＜Ｏ，ｏｏｌ　）を示した。　ＬＤＬレセプターの 周知のリガンドであるリボ蛍白質の低下を表２に示す（ＶＬＤＬ、ＩＯＬ及びＬ ＤＬは総コレステロールの全体的な減少に寄与する）。 血しょうリボ蛍白質の分画（ｍｇ／ｄｉ）被移植体　供与体肝細胞　合計　ＶＬ ＤＬ　ＬＯＬ　）ＩＯＬ十（［ｌＬ Ｎｚｗ　正常（対照）　４０　１０　１１　１９ＷＨＨＬ　ＮＺＨ 移植前　６５０　１９５　４３５　２０移植３日後　４８８　１６９　３００　 １９ＨＨＨＬ　ＮＺ賀 移植前　６２０　１９２　４０９　１９移植３日後　４４６　１４１　２８５　 ２０’１ｊＨＨＬ　感染ＮＺＷ 移植前　５１８　１５５　３１５　１Ｂ移Ｍ４日後　３５０　１１８　２１２　 ２０ＷＨＨＬ　！ｆ３染ＮＺＩＩ 移植前　５０５　１５０　３３７　１８移植４日後　３６８　１３０　２１９　 １９遺伝子の移入及び発現の詳細な分子及び細胞の分析を行うために、被移植ウ サギから組織を摘出した。遺伝子的に修飾した肝細胞を用いた移植から１０分、 ２４時間及び１９日後に各動物を安楽死させ、組織を摘出した。 ポリメラーゼ・チェーン・リアクシラン法（図１１）を用い、プロウィルスＤＮ Ａ配列に関して肝臓組織を分析した。これは標準的なハイブリダイゼーション技 術は必要な悪魔を有してぃなかったためである。プロウィルスＤＮＡ配列は、感 染肝細胞を移植し、移植後１０分及び２４時間後に死亡させたウサギで検出され たが、移植から１９日後に摘出した肝臓中ではもはや検出されなかった。肺など のその他の組織から得られたＤＮＡについても同様の分析を行ったが、プロウィ ルスＩ）ＮＡは検出されず、このことはほとんどの肝細胞がシヌソイドに接種さ れていたことを示した。 ＲＮａｓｅプロチクシコン・アンセイ法を用いて、肝臓組織から得られた総細胞 ＲＮＡ中での組み換え転写産物の検出及び定量を行った。組み換えＲＮＡは、ウ ィルスの遺伝子配列の３′非翻訳領域に相補的なアンチセンス・プローブを用い て検出した（図９Ａ）、内因性ラビノ）　ＬＤＬレセプターＲＮ＾に特異的な別 のプローブを、それぞれの分析において内部標準として用いた。ＬＴＲ−ＬＤＬ Ｒ形賞導入賞導入マウス繊維芽細胞たＲＮＡを分析したところ、３Ｚ−ｅｎｖプ ローブ（１７２ｂｐ、図１２、レーン＾）によってプロテクトされたが、４Ｚ− ｒＬＤＬＲプローブによってはプロテクトされなかった。一方、対照咄Ｈしラビ ットのＲＮＡを分析したところ、４Ｚ−ｒＬＤＬＲプローブ（９８ｂｐ、図１２ 、レーンＣ）によって実質的にプロテクトされたが、３Ｚ−ｅｖｎプローブによ ってはプロテクトされなかった。それぞれのプローブは、最初のハイブリダイゼ ーションに用いた総細胞１１ＮＡの量に比例して強度が変化するバンドを形成し た。これらの実験によって、プローブの特異性が確認され、この分析をウィルス 性及び内因性ＬＤＬＲレセプター転写産物の定量に用いることが支持された。ウ ィルス由来のＲＮＡは、遺伝子的に修飾された肝細胞を用いた移植から１０分、 及び２４時間後に摘出した肝ＮＭｉ織において検出された（図１２）、この実験 の定量的な分析は、ウィルス性転写産物は内因性ｒ　ＬＤＬＲの−Ｎ＾の１〜３ ％のレベルで存在することを示った。 さらに、ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンを用いて、細胞レベルでの組み 換え遺伝子発現を調べた（図１３）。ウィルス特異的な配列に相補的なＲＮＡプ ローブは、このヒ１−ＬＤＬレセプター鴎ＲＮＡのｉｎ　５ｉｔｕ検出において 非常に優れた特異性を示した。まず、遺伝子的に修飾された肝細胞による移植の ２４時間後に摘出した肝臓について、アンチセンス・プローブを用いて１ｎｓｉ ｔｕハイブリダイゼーシヨンを行った。約１　／１０００から１１５００の細胞 が高密度サイトプラズマ性粒子を有していた（バックグラウンドの１０〜１００ 倍）。 これらのポジティブの細胞は、肝臓の門脈周囲の領域に単一細胞として分布して いた（図１３Ａ及びＢ）、遺伝子的に修飾した肝細胞の移植から１９日後に分析 した＆Ｉ４＠においては、ハイブリダイゼーションのシグナルはもはや検出され なかった。 この方法の特異性は、対照ＷＨＨＬウサギの肝臓にアンチセンス・プローブをハ イブリダイズさせた場合、又は移植から２４時間後に摘出した被移植ラビットの 肝臓にセンス・プローブをハイブリダイズさせた場合には、ハイブリダイズした ものがバックグラウンドに対して検出されなかったという実験によって支持され た。 特異性及び感度の高い様々の分子的技術を用いて、遺伝子移入及び被移植−ＨＨ Ｌラビ７）における遺伝子発現の効率を調べた。ひとつの重要な疑問は、門脈に 細胞を注入した後の、接種肝細胞の臓器内及び組織内分布である。ＰＣＲ法を用 いて、組、ｌ＠ＤＮＡをプロウィルスのＤＮＡ配列について分析したところ、は とんどの（すべてではないにしても）遺伝子的に修飾された肝細胞は、注入後１ ０分以内に肝臓に接種されていた。肝Ｍ１組織の１ｎｓｉｔｕハイブリダイゼー シゴンは、ウィルスを発現している細胞が門脈周囲に分布していることを示した 。このことは、注入された肝細胞が、門脈血管を層れてすぐにシヌソイドに移っ たことを示唆する。 信鰭できるモデル動物が入手可能であること、及びこれとｉｎ　ｖｉｖｏの遺伝 子発現の感度の高い分析法とを組み合わせて用いることによって、企図されてい る治療法の存効性を精密に評価することができる。　ＷＨＨＬ変異の分子生物学 的基礎及びその結果としての代謝は、広範囲な研究課題であった（ゴールドスタ イン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｊ、Ｌ、）ら、Ｎｅｗ　Ｅｎ　１．Ｊ、Ｍｅｄ　Ｏ ：　２８８−２９６（１９８３）　ｉワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｙ、）、Ａ ｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　６　：　２６１−２６８（１９８０）　；タン ブラ（Ｔａｎｚａｗａ＋に、）ら、ＰＥＢ５　Ｌｅｔｔｒ■■ ｌｌ：８ｌ−８４（１９８０）　ｉキタ（Ｋｉｔａ、Ｔ、）ら、ヒ匹、迫旦、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、１ＩＳＡ　７８　：　２２６８−２２７２（１９８１）　；ビ ルハイマー（Ｂｉｌｈｅｉｍｅｒ、ＤＪ、）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７Ｊ　：３３０５−２２０９（１９８２）’　；キタ（にｉ ｔａ、Ｔ、）ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９　：　 ５６９３|５６９７ （１９８２）　、ビットマｙ（Ｐｉｔｔｍａｎ、Ｒ，Ｃ，）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、２５７　：　７９９４−８０００（１９８２）　G 及びシュナイダ−（Ｓｃｈｎｅｊｄｅｒ、　Ｗ、Ｊ、）　ら、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ 、Ｍｅｄ、　Ｌ：　３５３　：　３６７（１９８３））。 ＬＤＬレセプター遺伝子におけるインフレーム欠失によって、機能障害のレセプ ター分子が発現し、その活性はほとんど検出できない（タンブラ（Ｔａｎｚａｗ ａ、　Ｋ、　）ら、ＦＥＢ５ユ虹句二■８　：８Ｌ−８４（１９８０）　：キタ ｆｆｉ　ｔａ、　Ｔ、）ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｒ、ＵＳＡｌ ｆＪ　：　２２６８−２２７２（１９８１）　；ビルバイア　−（Ｂｉ　１ｈｅ ｉｓｅｒ　Ｄ、’ｐＪ、）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　`ｃａｄ、Ｓ ■」臥］Ｌ：　３３０５−２２０９（１９８２）　；キタ（Ｋｉｔａ、？、）ら 、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ＾７９：５６９３−５６９７（ １９８２）　；ピットマン（ＰｉｔＬｍａｎ、Ｒ，Ｃ，）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、２５７　：　７９９４−８０００（１９８２）　；シェナイダー（Ｓｅ ｈｎｅｉｄｅｒ、　Ｗｊ、）ら、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、　１　：　３５ ３−３６７（１９８３）　；及びヤマモト（Ｙａｍａ＋ｇｏｔｏ＋Ｔ、）ら、５ ｃｉｅｎｃｅ　２３２　：　１２３０−１２３７（１９８６））。レトロウィル ス媒介遺伝子移入によって正常レベルのヒトＬＤしレセプターＲＮ＾を発現する 縁曲Ｌウサギ肝細胞を、少量（成獣ウサギ肝臓の総細胞数の２％）用いた異質遺 伝子型移植によって、遺伝子の置換が達成された。機能的なＬ［ｌＬレセプター 活性の置換は、被移植体の正常細胞の約２％であるべきである。この予測は、移 植から１０分及び２４時間後に摘出した肝臓から得られたＲＮＡの定量的分析に よって、内因性転写産物の１〜３％のレベルの組み換え転写産物が検出されたこ とと非常によく一致する。これはいくぶん少ない量の遺伝子修正であるが、高コ レステロール血症において、処理前のレベルの７０％という、実質的な改善をも たらす、この知見は、残存ＬＤＬレセプター活性のレベルが直接血清コレステロ ールレベル及び冠状動脈疾患の進行に関与しているという、ホモ遺伝子欠損患者 に関するこれまでの研究と整合する（ゴールドスタイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、 Ｊ、Ｌ、）及びブラウン（Ｍ、Ｓ。 Ｂｒｏｗｎ）　ｉ　Ｔｈｅ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　Ｉｎｈｅ ｒｉｔｅｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ、　ｅｄｓ、５ｃｒｉｖｅｒ、b，Ｒ，、Ｂｅａｕ ｄｅｕｔ、Ａ、Ｌ、　、５ｌｙｊ１．Ｓ、＆　Ｖａｌｌｅ、Ｄ、（ＭｃＧｒａｗ −）ｔｉｌｌ、Ｉｎｃ、）、ｐｐ１２１５−１２５０（１９W９）　；ス プレーチャー（Ｓｐｒｅｃｈｅｒ、Ｄ、Ｌ、）　、ら、Ｍｅｔａｂｏ且憇別：　 ２９４−２９９（１９８５））。例えばレセプター陰性の患者（レセプター活性 が対照のく２％）は、レセプター欠損患者（残存レセプター活性が対照のく２％ ）と比べ、より重症の冠状動脈疾患を有し、従来の治療法に対する反応性がより 少ない、このことはまた、レセプター陰性の患者からレセプター欠損状態への機 能的な転換が、代謝的及び臨床的に有効であることを示唆する。 しかし、肝細胞の移植に伴う代謝の改善は永久的なものではないｍ　Ｉｎ　ＶＩ ＶＯにおけるＬＤＬレセプターの機能の明らかな衰退に関しては、２つの説明が 可能である。ひとつは遺伝子に修飾された肝細胞が破壊し、実際に消失するとい うものである。もうひとつは、細胞は移植されているが組み換え遺伝子の発現が 消滅しているというものである。これらの可能なメカニズムを区別するため、遺 伝子的に修飾された細胞のｉｎ　ｖｉｖｏにおける特異的かつ高感度のマーカー として、宿主にインチグレートしたプロウィルスを用いる実験を行った。代謝改 善の前及び間、被移植体の肝臓でプロウィルスＤＮＡが検出された。総コレステ ロールレベルがヘースラインにまで戻った後には、プロウィルスはもはや肝臓組 織において検出されなかった。このことは、　ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＬＤＬレ セプター機能の衰退において、細胞の消失が重要な因子であることを示唆してい る。移植肝細胞の消失の原因となる特別のメカニズムは明らかではない。我々は 様々なラント及びマウスのモデル動物において、長期の肝細胞の移植をｊテうた めに同様の移植法を用いてきた（パーチル（Ｐａｔｅｌ、Ａ、）　ら、Ｍｏ１ｅ ｃ、Ｂｉｏｌ、　ａｎｄ　Ｍｅｄ、　（１９８９）　；デメトリュ（Ｄｅｍｅｔ ｒｉｏｕ、Ａ、Ａ、）ら、鎖控匹婬邸；　１９９０−１９２２　（１９８６）　 ）。しかし、これらの従来の研究は、同遺伝子型のあるいは類似遺伝子型の供与 体を用いており、これに対して本研究は異質遺伝子型の細胞を用いている。Ｍｌ （Ｃ不適合による移植片排除が、遺伝子的に修飾した細胞の消失に関与している こともあり得る。しかし、肝臓組織を注意深ＸＭｉ織学的に検討したところ、炎 症病巣は認められなかった。その他の説明としては、ＬＤＬレセプターの構造的 な過剰発現による毒性、あるいはヒトＬＤＬレセプター蛋白質に対する免疫学的 な反応による移植片排除などがある。 総括すると、家族性高コレステロール血症の動物モデルであるＷＨＩＩＬラビン トを用いて、正常なＬＤＬレセプターの遺伝子を遺伝子欠損の肝細胞に導入し、 その肝細胞を被移植うビ７）の異所部位に導入するという、新しい治療法の開発 を行った。この介在の結果、この疾患の特徴である、重度の高コレステロール血 症が改善された。高脂血症のさらに完全な長期の正常化は、自己肝細胞に遺伝子 を移入し、この遺伝子をより多く発現させることによって達成することが可能で あろう。 ヒ　バーチロイドホルモンの−・・ト　に番る実施例１に述べた方法に従って、 ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）う・ントから肝細胞を単離した。細胞を１６０ｍｇ のサイトデンクスビーズと共に細菌培養用のシャーレ（１０ｃ−に１ＯＸＩＯ” の密度でまき、１０％ウシ胎児血清を含むホルモン限定培地（ＨＤＭ）で培養し た。９０分後、培地を新鮮なｌ（ＤＭ培地と交換した。第３日に、両栄養性ＰＴ Ｈ産生物（実施例■に述べた方法に従って調製）から得たウィルスの上清をシャ ーレに加えた。１２時間後、細胞を無アルブミン血症ラットに移植した（リン酸 緩衝生理食塩水約５曽）巾約２００ｇを腹膜内に闘）。 次に、様々の時間に血清を取り出し、市販のニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ）ラジオ イムノアッセイ法を用いてヒトＰＴＨを分析した（図８を参照）。血清中のラン トアルブミンは、ウェスタンプロット法を用いて分析した。結果を図８に示す。 実施例■ 匠鉦ユ久２二公構築 ＡＴＣＣ寄託番号６８７５４と同一の特徴をもつＭＦＧベクターはｐＥＭヘクタ ーに由来するが、パフケージング細胞株への組換えゲノムのパンケージングを増 加させる、ＭＭＬＶに由来るす１０３８塩基対の脛り配列および、スプライシン グの受容体配列および転写開始点を含む、ＭＯシー９に由来する３５０塩基対の 配列を含む。Ｎｃｏ　ＩおよびＢａｍ　Ｈｌサイトを含む１８塩基対のオリゴヌ クレオチドがＭＯＶ−９配列の直後に位置して、コンパチブルサイトを利用した 便利な遺伝子の挿入ができるようになっている。聞ＬＶ　ＬＴＲは転写を制御し て、得られるーＲＮＡは本来のｇａｇ転写物の忠実な５′非翻訳部分およびその 直後に挿入した遺伝子のオープンリーディングフレームを含む。？ＩＦＧの詳細 な制限酵素地図を図１４に示す。？ＩＦＧの構築に関する詳細を図１６（ａ）お よび１６　（ｂ）において説明する。 半−ＧＡＧレトロウィルスベクター（半−ＧＡＧはベンダー（Ｂｅｎｄｅｒ）ら 、ＪＪｉｒｏ［，６１：１６３９−１６４６に記述されている）のＸｈｏｌαｄ ｅｌ断片を含む５’ＬＴＲを肚虹り凹ＨＩＨ４ヒストンプロモーター断片ヘライ ゲーシッンすることによってＭＧＦを構築した。 レトロウィルスベクターｐＥＭをＭｄｅ　ＩおよびＢａｙ　ＩＩで消化して、３ ’ＬＴＦｌを含む断片をＨ４に予めライゲージタンしておいた半ＧＡＧ断片にラ イゲーションした。適当な方間の２つのＬＴＲを含み、ベクターのウィルス部分 内にＨ４断片も含む中間体のレトロウィルスベクターを作成するために中間体の ベクターを次にＮｄｅ　Ｉで消化して線状にして、ベクターのｐＲＩ１３２２の 部分中のＮｄｅ　Ｉサイトをポリメラーゼによるフィルインで埋めて、ライゲー ションによって破壊した。ベクターを後にＸｈｏ　Ｅで消化してＸｈｏｌサイト をＮｄｅ　Ｉリンカ−に連結した。ベクターを後にＢ！ＬＩＴで切断してＬＴＲ およびｐＢＲ３２２１Ｗ列の両方を含む大きな断片を精製した。 図１４で説明する環状ベクター、ＭＦＧを作成するためにＸｈｏｌおよびＲａｍ 　Ｈｌサイトをもち、そして次の配列 ＣＴＡＧＡＣＴＧＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＣＣＴＡＧ をもつリンカ−を合成して、切断した中間体のベクターのＲａｍ　Ｈｌサイトお よび（Ｎｄｅ　ｌ末端の隣にスプライソングの受容体サイトを含む）　ｐＭＯＶ ９に由来する堕１／ＸｖａＩ断片の両方にライゲーションした。 ベクター、ＭＦＧを含むプラスミドをアメリカンタイプカルチャーコレクシラン に寄託し、その寄託番号は６８．７５４である。 連結してウィルスのプロモータが制御できるように、抗血友病因子およびヒトｔ ＰＡの遺伝子をＭＦＧ中にライゲーションした。これらの抗血友病因子およびｔ ＰＡを発現する一ＦＧベクターをアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄 託し、その寄託番号はそれぞれ６８７２６および６８７２７である。 実施例■ 工」四例構築 α」匹ベクター（ＡＴＣＣ寄託番号６８７５５）は、ｔＰＡ遺伝子の発現を制御 するためにα−グロブリン遺伝子に由来する転写のプロモーターの配列を利用し ている。プロモーターの要素を含む６００塩基対の断片はさらに、忠実なα−グ ロブリンｍＲＮＡの転写の開始点および５′非翻訳部分の配列を含む。サイトメ ガロウィルスに由来する転写のエンハンサ−を含む３６０塩基対の断片はα−グ ロブリンプロモーターの前に位置して、この要素からの転写を増強させるために 用いている。加えて、ＭＭＬＶエンハンサ−３’ＬＴＲから削る。感染のときに この削除物が５’ＬＴＨに移されて、要素の転写を活性化させる活性を本質的に 不活性化する。αＳＧＣを図１５で詳細に説明している。α−３ＧＣヘクターを 含むプラスミドをアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託し、その寄託 番号は６８　、７５５である。 連結してα−グロブリンプロモーターが制御できるように抗血友病因子およびヒ トｔＰＡ遺伝子をα−３ＧＣ中にライゲーションした。これらの抗血友病因子お よびｔｐ＾を発現するαＳＧＣヘクターをアメリカンタイプカルチャーコレクシ ョンに寄託し、その寄託番号はそれぞれ６８７２８および６８７２９である。 次の例は肝細胞を用い、本発明のレトロウイルスヘクターを用いた例を提供する 。 生幾所ηＡ託 １９９１年１０月３日に出願者は米国メリーランド州ロックビル（Ｒｏｋｖｉ　 １ｉｅ）のアメリカンタイプカルチャーコレクシラン（ＡＴＣＣ）に、本明細書 中で記載した、抗血友病因子の挿入のあるプラスミド？ｌＦＧをＡＴＣＣ寄託番 号６８７２６で、本明細書中で記載した、ｔＰＡの挿入のあるプラスミド１ＦＧ をＡＴＣＣ寄託番号６８７２７で、本明細書中で記載した、抗血友病因子の挿入 のあるプラスミドα−５ＣＣをＡＴＣＣ寄託番号６８７２Ｂで、および本明細書 中で記載した、ｔＰＡの挿入のあるプラスミドα−３ＧＣをＡＴＣＣ番号６８７ ２９で寄託した。 １９９１年１０月９日お出願者は米国メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖ　 ｉ　Ｉ　ｌ　ｅ）のアメリカンタイプカルチャーコレクシタンに、本明細書中で 記載したプラスミド？ｌＦＧをＡＴＣＣ寄託番号６８７５４でおよび本明細書中 で記述したプラスミドα−５ＧＣをＡＴｃｃ番号６８７５５で寄託した。本明細 書中で記載した、ヒトＬＤＬレセプターの遺伝子を発現するアンフォトロピンク ウイルス（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　ｖｉｒｕｓ）を生産する、７−３５と称す る。ＮＩＨ３Ｔ３細胞株を１９８８年２月３日にアメリカンタイプカルチャーコ レクシランに寄託し、そのＡＴＣＣ寄託番号はＣＲＬ９６３５である。これらの 寄託物は、特許の手続きのための微生物の寄託の国際承認に関するブタベスト条 約の規定およびその条件（ブタベスト条約）下での規制の下で行なった。これは 寄託の日付から３０年間の生存力のある培養の維持を保証する。ブタベスト条約 の条件下で、および直接関係のある米国特許の発布に関する自由な利用の可能性 を保証する出願人およびＡＴＣＣ間の合意を条件として生物はＡＴＣＣから入手 できるだろう。寄託された細胞株の入手の可能性を、その特許法に従った任意の 政府の権能の下で承諾する権利の違反行為になるような形で発明を実行する認可 と解釈してはならない。 抱等物 当該分野に熟練した人々は単なる日常の実験で、本明細書中で具体的に記載した 特定の１１様に均等な多くの事物を思い出すまたは確かめることができるだろう 。 そのような均等物を以下の請求の範囲に含ませるつもりである。 ５’ｓｓ　ＡＵＧｇ口ｇ　Ｂ’ｓｓ Ｋｂ ＦＩＧ、４　Ａ。 」　２Ｂ４５ 浄８（内容に変更なし） ＮＺＷ　ＷＨＨＬ ＢＡ　Ｈ４ＴＫ　ＬＴＲ対照　ＢＡ　Ｈ４ＴＫ　ＬＴＲ対照ν９ ］］ 浄書（内容に変更なし） パネル　Ｂ　パネル　Ｃ 浄Ｉ（内容に変更なし） 浄蛋（内容１こ濱ＪＥなし） １．７＜０．１　＜０．１　１．１１．０　１．８３．６　＜０．１　菊、１浄 斎内ざに変更なし） パネルＡ　パネルＣ パネルＢ　パネルＤ ＦＩＧ、　１３ の ■ 浄ｔ、内ざに変更なし） 要約書 導入また組み込まれた目的とする遺伝物質を発現する、一般的に処理されたまた は形質導入された肝細胞、ならびにこの遺伝子操作された肝細胞を製造、移植お よび使用する方法。目的とする遺伝物質は組み換えレトロウィルスのような目的 とする遺伝物質を含むヘクターを使用して、あるいは他の手段で組み込むことが できる。 手続補正書（方式） 平成　５年　を月７３日　図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．インビボで組み込まれた遺伝物質を発現する形質導入肝細胞であって、組み 込まれた遺伝物質が下記からなる目的とする遺伝物質である形質導入肝細胞：ａ ）正常肝細胞においては生物学的に有効なレベルで存在し、該細胞によって生物 学的に有効なレベルで発現されるが、遺伝子欠失肝細胞においては正常量未満し か存在せず、正常量未溝しか発現しない遺伝物質；またはｂ）正常肝細胞に存在 するが、該正常細胞では生物学的に有効なレベルで発現しない遺伝物質。 ２．組み込まれた遺伝物質がホルモン、レセプター、酵素または薬物をコードし ている請求項１の肝細胞。 ３．インビボで組み込まれた遺伝物質を発現するヒト形質導入肝細胞であって、 組み込まれた遺伝物質が下記からなる群から選択されるヒト形質導入肝細胞：ａ ）正常肝細胞においては生物学的に有効なレベルで存在し、該細胞によって生物 学的に有効なレベルで発現されるが、遺伝的欠失肝細胞においては正常量未満し か存在せず、正常量未満しか発現しない遺伝物質；またはｂ）正常肝細胞に存在 するが、そのような細胞においては生物学的に有効なレベルで発現しない遺伝物 質。 ４．組み込まれた遺伝物質がホルモン、レセプター、酵素または薬物をコードし ている請求項３のヒト肝細胞。 ５．遺伝物質がヒト低密度リポ蛋白レセプターをコードする請求項４の肝細胞。 ６．組み込まれた遺伝物質をインビボで発現する形質導入肝細胞であって、該肝 細胞が、組み込まれた遺伝物質からなる組み換えゲノムを有する感染性組み換え レトロウイルスを含有する培地と培養肝細胞とを接触させ；この培養肝細胞およ び上記感染性組み換えレトロウイルスを含有する培地を、組み換えレトロウイル スに肝細胞が感染するのに適当な条件下に維持することによって製造される形質 導入肝細胞。 ７．感染性組み換えレトロウイルスが下記からなる群から選択される請求項６の 形製導入肝細胞： （１）ｐＬＪ （２）ｐＥＭ （３）ｐｌＰ （４）ｐＬＴＲ−ＬＤＬＲ （５）ｐＢＡ−ＬＤＬＲ （６）ｐＨ４−ＬＤＬＲ （７）ｐＴＫ−ＬＤＬＲ ８．本質的にヒト肝細胞にレトロウイルスベクターによって形質導入された組み 込まれた遺伝物質を含む移植可能な形質導入ヒト肝細胞からなる、目的とするポ リペプチドまたは蛋白質を個体に放出するための治療用組成物。 ９．組み込まれた遺伝物質がホルモン、レセプター、酵素または薬物をコードし ている請求項８の治療用組成物。 １０．組み込まれた遺伝物質をインビボで発現する形質導入肝細胞を製造する方 法であって、下記からなる方法： ａ）培養肝細胞を、目的とする遺伝物質からなる組み換えゲノムを有する感染性 組み換えレトロウイルスを含有する培地と接触させ；およびｂ）この培養肝細胞 および上記感染性組み換えレトロウイルスを含有する培地を、該肝細胞が組み換 えレトロウイルスに感染するのに適当な条件下に維持し、それによって形質導入 肝細胞を製造する。 １１．哺乳類において目的とする組み込まれた遺伝物質を発現する形質導入肝細 胞を移植する方法であって、以下の段階からなる方法：ａ）培養肝細胞を、目的 とする遺伝物質からなる組み換えゲノムを有する感染性組み換えレトロウイルス を含有する培地と接触させ；ｂ）この培養肝細胞および上記感染性組み換えレト ロウイルスを含有する培地を、該肝細胞が組み換えレトロウイルスに感染するの に適当な条件下に維持し、それによって形質導入肝細胞を製造し；およびｃ）上 記ｂ）において製造された修飾肝細胞を哺乳類に形質導入する。 １２．蛋白質またはポリペプチドの異常産生の結果である肝機能障害を治療する 方法であって、その異常産生が上記障害の原因である蛋白質またはポリペプチド をコードしている遺伝物質からなる形質導入肝細胞を、該蛋白質またはポリペプ チドの肝細胞における発現に適当な条件下に肝臓に導入することからなる方法。 １３．個体に、ホルモン、レセプター、酵素または薬物を与える方法であって、 ホルモン、レセプター、酵素または薬物をコードしている遺伝物質で肝細胞に形 質導入し、この形質導入肝細胞を個体に導入することからなる方法。 １４．肝細胞によって正常に発現された蛋白質またはポリペプチドを、該蛋白質 またはポリペプチドの発現が異常である個体に与える方法であって、以下の段階 からなる方法： ａ）１）上記蛋白質またはポリペプチドをコードしている遺伝物質；２）両栄養 性レトロウイルスから得られたＬＴＲ配列、ｔＲＮＡ結合部位およびＰｓｉパッ ケージング部位；および ３）真該生物由来の少なくとも１つのプロモーター；からなる組み換えゲノムを 有する組み換えレトロウイルスによって肝細胞に形質導入し；そして ｂ）形質導入肝細胞を個体に導入する。 １５．目的とする遺伝物質を組み込まれている形質導入肝細胞であって、該細胞 は該遺伝物質によってコードされている目的とする蛋白質またはポリペプチドを インビボで発現でき、該遺伝物質は、α−ＳＧＣおよびＭＦＧからなる群より選 択されるレトロウイルスベクターからなる形質導入肝細胞。 １６．目的とする遺伝物質が以下からなる群から選択される請求項１５の形質導 入肝細胞； 正常肝細胞において存在し発現されるＤＮＡ；正常な場合肝細胞で生じないＤＮ Ａ； 正常な場合肝細胞で生じるが生物学的に有意なレベルでは発現されないＤＮＡ； および 肝細胞において発現され得るように修飾できるＤＮＡ。 １７．少なくとも１つの選択マーカーをコードしているＤＮＡをさらに含む請求 項１６の形質導入肝細胞。 １８．目的とする遺伝物質が、治療上価値のある、ホルモン、レセプター、酵素 およびポリペプチドからなる群から選択された蛋白質またはポリペプチドをコー ドしている請求項１６の形質導入肝細胞。 １９．目的とする遺伝物質が、ヒト副甲状腺ホルモン、組織プラスミノーゲン活 性化因子、ファクター、低密度リポプロティンレセプターまたはベーターガラク トシダーゼをコードしている請求項１８の形質導入内皮細胞。 ２０．少なくとも１つの目的とする蛋白質または少なくとも１つの目的とするポ リペプチドをコードしている、組み込まれた目的とする遺伝物質を発現する形質 導入肝細胞を製造する方法であって、下記段階からなる方法；ａ）肝細胞を、目 的とするＤＮＡからなる組み換えゲノムを有する感染性組み換えレトロウイルス を含有する培地と接触させ、該遺伝物質はα−ＳＧＣおよびＭＦＧからなる群よ り選択されるレトロウイルスベクターからなり；ｂ）この肝細胞および上記感染 性組み換えレトロウイルスを含有する培地を、肝細胞が組み換えレトロウイルス に感染するのに適当な条件下に維持し、それによって形質導入肝細胞を製造する 。 ２１．肝細胞の感染がインビトロで生じる請求項２０の方法。 ２２．肝細胞の感染がインビボで生じる請求項２０の方法。 ２３．体に蛋白質またはポリペプチドを与える方法であって、以下の段階からな る方法： ａ）肝細胞をインビトロで、ホルモン、レセプター、酵素および薬物をコードし ている遺伝物質からなる群から選択された遺伝物質で形質導入し、該遺伝物質は α−ＳＧＣおよびＭＦＧからなる群より選択されるレトロウイルスベクターから なり；ｂ）該形質導入肝細胞を体に導入するか、あるいは該形質導入肝細胞を体 の表面に塗布する。 ２４．体に蛋白質またはポリペプチドを与える方法であって、以下の段階からな る方法： ａ）肝細胞をインビトロで組み換えレトロウイルスに感染させ、該組み換えレト ロウイルスはα−ＳＧＣおよびＭＦＧからなる群より選択されるレトロウイルス ベクターからなる組み換えゲノムを有し； ｂ）該形質導入肝細胞を体に導入するか、あるいは該形質導入肝細胞を体の表面 塗布する。