FI113476B - Menetelmä yhdistelmäretroviruksen valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä yhdistelmäretroviruksen valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI113476B
FI113476B FI904647A FI904647A FI113476B FI 113476 B FI113476 B FI 113476B FI 904647 A FI904647 A FI 904647A FI 904647 A FI904647 A FI 904647A FI 113476 B FI113476 B FI 113476B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
cells
cell
vector
hiv
gene
Prior art date
Application number
FI904647A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI904647A0 (fi
Inventor
Douglas J Jolly
Harry E Gruber
Paul K Laikind
James G Respress
Original Assignee
Chiron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22620165&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI113476(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Chiron Corp filed Critical Chiron Corp
Publication of FI904647A0 publication Critical patent/FI904647A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI113476B publication Critical patent/FI113476B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/217—IFN-gamma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70514—CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)

Description

1 1347c:
Menetelmä yhdistelmäretrovlruksen valmistamiseksi Tämä keksintö koskee yleisesti menetelmää retroviruksen, ja eri-5 tyisemmin yhdistelmäretroviruksen valmistamiseksi, joka virus pystyy toimittamaan vektorirakenteita vastaanottavaisiin kohdesoluihin. Nämä vektorirakenteet on tyypillisesti suunniteltu ilmentämään toivottuja proteiineja kohdesoluissa, esimerkiksi proteiineja, jotka herättävät immunogeenista toimintaa 10 tai jotka ovat ehdollisesti vaikuttavia määrätyissä soluympäris-töissä.
Vaikka bakteerisairaudet ovat yleensä helposti käsiteltävissä antibiooteilla, on olemassa hyvin harvoja tehokkaita käsittelyjä tai ehkäiseviä toimenpiteitä monille virus-, syöpä-, ja muille 15 sairauksille, jotka eivät ole bakteerien aiheuttamia mukaan lukien perinnölliset sairaudet. Näitä sairauksia on perinteisesti yritetty hoitaa käyttämällä kemiallisia lääkkeitä. Yleensä näiltä lääkkeiltä on puuttunut erityisyys, ne ovat osoittaneet korkeaa yleismyrkyllisyyttä ja ovat täten olleet hoidollisesti 20 tehottomia.
* ’*· Toinen klassinen tekniikka, jolla hoidetaan lukuisia muiden kuin bakteerien aiheuttamia sairauksia, sisältää immuunivasteen : tuomisen esiin tautia aiheuttavalle vaikuttimelle, kuten viruk- selle, antamalla vaikuttimen tarttumatonta muotoa, kuten ta-,···, 25 pettua virusta, sillä tavalla antamalla tautia aiheuttavasta vaikuttimesta antigeenejä, jotka toimisivat immunologisina * piristysaineina. Uudempi lähestyminen virussairauksien hoitamisessa, kuten immuunikadon (AIDS) ja sukulaissairauksien, sisäl- : .· tää solujen, jotka ovat alttiita HIV-tartunnalle, reseptorien 30 estämisen viruksen vaippaproteiinien yhdistelmällä, joka on saatu tai muodostettu. Esimerkiksi Lifson ym. (Science 232: 1123-1127, 1986) osoittivat, että vasta-aineet CD4 (T4) -resep- * · ;* toreille estivät solujen yhteen sulautumista (syncytiaa) infek- * · ·’,'· toituneiden ja infektoimattomien CD4:ää esittävien solujen 35 välillä in vitro. McDouqal ym. (Science 231: 382-385, 1986) ovat • « - esittäneet samanlaisen CD4-estovaikutuksen käyttämällä monoklo- 11347/-' 2 naalisia vasta-aineita. Vaihtoehtoisesti Pert ym. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_3: 9254-9258, 1986) ovat selostaneet synteettisten polypeptidien käyttöä sitomaan T4-reseptoreja ja estämään ihmisen T-solujen HIV-tartunnan, kun taas Lifson ym. (J. Exp.
5 Med. 164: 2101, 1986) ovat selostaneet sekä syncytian että virus/T4-solufuusion estämisen käyttämällä lektiiniä, joka vuorovaikuttaa viruksen vaippaglykoproteiinin kanssa, siten estäen CD4-reseptoreja vastaanottamasta sitä.
Neljäs äskettäin esitetty tekniikka tautia aiheuttavan RNA-.ta 10 transkriboivan vaikuttimen, kuten viruksen, estämistä varten on vastamerkitys-RNA:n tarjoaminen, joka täydentää ainakin osan transkriboidusta RNA:sta, ja sitoutuu siihen estääkseen translaation (To et ai., Mol. Cell. Biol. 6: 758, 1986).
Kuitenkin yllä selitettyjen tekniikoiden suurin puute on, että 15 ne eivät helposti valvo aikaa, paikkaa ja laajuutta, johon lääkettä, antigeeniä, estäjävaikutintä tai vastamerkitys-RNA:ta käytetään hyväksi. Erityisesti, koska yllä olevat tekniikat vaativat hoitovaikuttimen ulkoa aiheutuvaa käyttöön ottoa (se on, ulkoa aiheutuva näytteelle in vitro- tilanteessa), ne eivät 20 ole heti herkästi reagoivia tautia aiheuttavan vaikuttimen läs-j '1· näololle. Esimerkiksi voi olla toivottavaa, että immunologinen *:1 piristysaine ilmenee lisääntyneessä määrin välittömästi tautia : aiheuttavan vaikuttimen tartunnan jälkeen. Lisäksi vastamerki- tys-RNA:n tapauksessa vaadittaisiin suuria määriä hyödyllistä ,··. 25 hoitoa varten eläimessä, jota nykyisten tekniikoiden mukaan !!! hoidettaisiin huolimatta paikasta, jossa sitä itse asiassa » · · * · » ‘ tarvittaisiin, se on, tautia aiheuttavan vaikuttimen tartutta missa soluissa.
t · · · • |
Vaihtoehdoksi ulkoa aiheutuvalle käyttöönotolle, on esitetty 30 tekniikoita sisäsyntyisestä tuotettavia hoitovaikuttimia varten.
• · ·
Erityisemmin on tutkittu proteiineja, jotka ilmenevät virusvek-toreista, jotka perustuvat DNA-viruksiin, kuten adenovirukseen, : simian-virus 40:een, härän papillooma-, ja lehmänrokkoviruksiin.
,1§ ] Esimerkiksi Panicali ym. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8C>: 5364, 35 1983) veivät influenssaviruksen hemagglutiniini- ja hepatiitti 11347c 3 B:n pinta-antigeenit lehmänrokkogenomiin ja tartuttivat eläimiä tällaisista yhdistelmägeeneistä tuotetuilla viruksilla. Tartunnan jälkeen eläimet saivat immuniteetin sekä lehmänrokkoviruk-selle että hepatiitti B -antigeenille.
5 Kuitenkin lukuisia vaikeuksia on kohdattu tähän päivään mennessä DNA-viruksiin perustuvien virusvektoreiden kanssa. Näihin vaikeuksiin kuuluvat (a) muiden virusproteiinien tuotanto, joka saattaa johtaa taudin syntymiseen tai toivotun proteiinin tukahduttamiseen; (b) vektori pystyy hallitsemattomasti replikoitu-10 maan isännässä; ja tällaisen hallitsemattoman replikaation tautia aiheuttava vaikutus; (c) villityyppisen viruksen läsnäolo, joka saattaa johtaa viremiaan; ja (d) ilmenemisen lyhytaikainen luonne näissä järjestelmissä. Nämä vaikeudet ovat itse asiassa sulkeneet pois DNA-viruksiin perustuvien virusvektoreiden käytön 15 virus-, syöpä- ja muiden sairauksien, jotka eivät ole bakteerien aiheuttamia, hoidossa mukaan lukien perinnölliset sairaudet.
Johtuen retrovirusten ilmenemisen pitkäaikaisesta luonteesta tartutetuissa kohdesoluissa, retroviruksia on ehdotettu hyödylliseksi välineeksi perinnöllisten sairauksien hoitoa varten 20 (esimerkiksi, katso F. Ledley, The Journal of Pediatrics 110:1, • · • '·· 1987). Kuitenkin lukuisten ongelmien vuoksi retrovirusten käyt- *.’· töä perinnöllisten sairauksien hoidossa ei ole yritetty. Täl- ; laiset ongelmat koskevat (a) ilmeistä tarvetta tartuttaa suuri määrä soluja vaikeapääsyisissä kudoksissa (esim. aivoissa) ,- (b) ,···, 25 tarvetta aiheuttaa näitä vektoreita ilmenemään hyvin valvotulla ::: ja pysyvällä tavalla; (c) kloonattujen geenien puutetta; (d) • * · palautumatonta vauriota kudokselle ja elimille johtuen aineenvaihdunnallisista poikkeavuuksista; ja (e) muiden osittain te- : hokkaiden hoitojen saatavuutta tietyissä tapauksissa.
« » ( 30 Perinnöllisten sairauksien lisäksi muut tutkijat ovat tutkineet • « · sairauksien, jotka eivät ole perinnöllisiä, hoitoa käyttämällä retrovirusvektoreita (katso esimerkiksi EP 243,204 - Cetus .·. : Corporation; Sanford, J. Theor. Biol. 130:469, 1988; Tellier et | ai., Nature 318:414, 1985; ja Bolognesi et ai.. Cancer Res.
'· " 35 45:4700, 1985) .
4 1 1347c'
Tellier ym. esittivät T-solukloonien suojelemista ilmeisesti tartuttamalla kantasolut "puutteellisella" HIV:llä, jolla on genomi, joka voisi ilmentää HIV-RNA:n vastamerkitys-RNA:ta. Bolognesi ym. ovat esittäneet HIV-kannan, joka ei ole virulent-5 ti, kehittämisen tartuttamaan kantasoluja siten, että niistä syntyneet T4-solut kantaisivat viruksen muotoa, joka estää tai hidastaa toisen viruksen lisääntymistä ja joka ei ole virulentti ja siten suojelee näitä soluja virulentin HIV:n tartunnalta. Kuitenkin esiintyisi, että molemmissa edellä mainituissa artik-10 keleissä käytetyt "heikennetyt" tai "puutteelliset" HIV-virukset voisivat lisääntyä (se on, eivät ole puutteellisia replikaation suhteen) siten, että tulokseksi syntyneet virukset voisivat tartuttaa muita soluja siten, että on mahdollista, että riski kasvaa, että viruksen geenijaksot yhdistyisivät uudelleen 15 soluissa jo olevien HIV- tai muiden jaksojen kanssa, mikä johtaisi viruksen heikentymisen menetykseen. Ei-ei-replikoituvat muodot edellyttäisivät puutteellista auttajaa tai pakkauslinjaa HIV:tä varten. Kuitenkin, koska HIV-geenien ilmenemisen valvonta on monimutkaista, tällaisia soluja ei ole tähän päivään mennessä 20 rakennettu. Lisäksi, koska infektoiva heikennetty tai puutteellinen virus ei ole kimeerinen (retrovirus "ei ole kimeerinen", ; kun sen vektori on suurin piirtein samasta retrovirus-laj ista) , * » · vaikka ne olisi tehty replikaation suhteen puutteellisiksi esi-merkiksi poistamalla niiden genomista olennainen aines, on silti • < * 25 olemassa merkittävä mahdollisuus, että puutteellinen virus yh-···! distyy uudelleen isäntäsoluissa seuraavaksi tuotettujen infek- toivien virusten kanssa.
• i a ► » ·
Vaikka Sanford (J. Theor. Biol. 130:469, 1988) on myös esittänyt , geneettisen hoitokeinon käyttämistä HIV:lie, hän mainitsee 30 erikseen, että mahdollisuuden vuoksi, joka on olemassa sille, että saadaan aikaan uusia virulentteja viruksia siten, että ;Y; luonnon AIDS-virus ja hoidolliset anti-HIV-geenejä kantavat retrovirusvektorit yhdistyvät geneettisesti uudelleen, retrovi-• > rusgeeniterapia AIDSia varten ei saata olla järkevää. Samoin ’! 35 kuin McCormick & Kriegler (EP 243,204 A2) ovat esittäneet ret- *.’·· rovirusvektoreiden käyttämistä toimittamaan geenejä proteii- 113476 5 neille, kuten kasvainkuoliotekijälle (TNF), heidän selittämänsä tekniikat kärsivät lukuisista huonoista puolista.
Lyhyesti ilmaistuna tämä keksintö tarjoaa menetelmän yhdistel-märetroviruksen valmistamiseksi, jossa viruksessa on vektorira-5 kenne, joka pystyy ehkäisemään, estämään, vakauttamaan tai kumoamaan tarttuvia, syöpä-, auto-immuuni- tai immuunisairauk-sia. Tällaisiin sairauksiin kuuluvat HIV-tartunta, melanooma, sokeritauti, siirrännäisen hyijintäreaktio, Alzheimerin tauti ja sydäntauti.
10 Hakemuksessa esitetään menetelmiä, joilla (a) herätetään joko humoraalinen tai soluvälitteinen erityisimmuunivaste antigeenille tai tautia aiheuttavalle antigeenille; (b) tautia aiheuttavan vaikuttimen, kuten viruksen, toiminnan estäminen; ja (c) vaikuttimen ja isäntäsolureseptorin vuorovaikutuksen estäminen 15 käyttämällä yhdistelmäretroviruksia.
Hakemuksessa esitetään myös menetelmä erityisimmuunivasteen herättämiseksi, mikä sisältää alttiiden kohdesolujen infektoi- misen yhdistelmäretroviruksilla, joissa on vektorirakenne, joka ohjaa antigeenin tai sen muutetun muodon ilmenemistä infektoi- ;·. 20 duissa kohdesoluissa. Kun on määrä herättää immuunivaste tautia • < * aiheuttavalle antigeenille, yhdistelmäretrovirus suunnitellaan "‘I mieluummin ilmentämään antigeenin muutettua muotoa, joka herät- * * * tää immuunivasteen ja jonka taudinaiheuttamiskyky on vähentynyt » · « verrattuna alkuperäiseen antigeeniin. Immuunivaste voidaan myös ’...· 25 saada aikaan siirtämällä sopivaan immuunisoluun (kuten T-imuso- V · luun) geeni erityis-T-solureseptoria varten, joka tunnistaa mielenkiinnon kohteena olevan antigeenin sopivan MHC-molekyylin !*'; yhteydessä tai immunoglobuliinia varten, joka tunnistaa mielen- • · kiinnon kohteena olevan antigeenin.
;V: 30 HIV-tartunnan aiheuttaman sairauden erityisessä tapauksessa, kun
toivotaan immuniteetin piristystä, yhdistelmäretroviruksen / _ genomista synnytetty antigeeni on muodossa, joka tuo esiin HLA
Ί luokkaan I ja/tai luokkaan II rajoitetun immuunivasteen. HIV:n vaippa-antigeenin tapauksessa esimerkiksi antigeeni valitaan 11347c 6 ryhmästä, johon kuuluvat gp 160, gp 120 ja gp 41, jotka on muutettu siten, että niiden taudinaiheuttamiskyky on vähentynyt. Erityisesti valittua antigeeniä muutetaan siten, että syncytian mahdollisuus vähenee. Antigeenit muista HIV-geeneistä, kuten 5 gag, pol, vif, nef jne., saattavat myös antaa suojaa erityisissä tapauksissa.
Hakemuksessa esitetään myös menetelmät sairaudelle välttämättömän tautia aiheuttavan vaikuttimen toiminnan estämiseksi. Tällaisia sairauksia ovat virustartuntojen aiheuttamat, syövät tai 10 immunologiset poikkeavuudet. Tällainen esto suoritetaan keinoilla, joihin kuuluvat lievittävän lääkkeen ilmeneminen, joka on myrkyllistä sairastuneelle solulle, lievittävän lääkkeen ilmeneminen, joka valikoivasti estää tautia aiheuttavien geenien ilmenemistä tai vaikutuksia ilmentämällä vastamerkitys-RNA:ta, 15 tai liittämällä jakso tautia aiheuttavaan genomiin siten, että sen toiminta saatetaan sekaisin.
Edelleen hakemuksessa esitetään yhdistelmäretroviruksen genome-ja, jotka ilmentävät tautia aiheuttavan vaikuttimen puutteellista rakenneproteiinia, mikä johtaa tautia aiheuttavan vaikuttimen 20 kokoamisen estämiseen, esim. viruksen puutteellisen rakennepro-I ’·· teiinin ilmeneminen johtaa viruksen kokoamisen estämiseen.
Kun yhdistelmäretroviruksen genomin sisältävien solujen on määrä tuottaa myrkyllistä lievittävää lääkettä, sitä voidaan tuottaa joko soluissa olevista esiasteista tai lisäksi ulkoa aiheutuvasti * · 25 tarjoamalla myrkyllisen vaikuttimen esiastetta. Jälkimmäisessä V ’ tapauksessa virusrakenne koodaa tuotetta, joka muuttaa esiasteen myrkylliseksi vaikuttimeksi. Molemmissa tapauksissa myrkyllinen vaikutin rajoittuisi vain soluihin, jotka sisältävät virusraken-teen ja toisen vaikuttimen, joka liittyy tautia aiheuttavaan 30 tilaan. Esimerkiksi toinen vaikutin saattaisi olla proteiini, » · joka on tuotettu solussa olevan tautia aiheuttavan virusgenomin transkription ja translaation avulla. Erityisyys tautia aiheut-: tavalle tilalle voidaan myös saavuttaa tai sitä voidaan enemmän
t · I
| lisätä yhdistelmäretrovirusten pääsyn hyökkäyksellä solujen » * * ' ' 35 kimppuun, joita tautia aiheuttava tila on kohdannut. Pitäisi 113476 7 ymmärtää edellä mainitussa pohdinnassa, ja koko tässä hakemuksessa, että kun viitataan virusrakennelmaan, joka "ilmentää" tai "tuottaa" mitä tahansa ainetta solussa, tai sen kaltaisessa, tämä itse asiassa viittaa virus-RNA:n käänteistranskription tuloksena 5 solussa syntyneen proviruksen toimintaan.
Läheisesti yhteen kuuluvan näkökohdan mukaan hakemuksessa esitetään myös menetelmiä epämieluisan tai vahingollisen immuunivasteen vähentämiseksi tai poistamiseksi. Immuniteetin tukahduttaminen, kun se on tarkoituksenmukaista, voidaan saada aikaan 10 immuniteettia tukahduttavien geenien, kuten adenoviruksen E3- geenin, ilmenemisen pommittamisella. Hakemuksessa esitetään myös menetelmät, joilla estetään virusten ja solujen vuorovaikutus, eri solujen vaikutus toisiinsa, tai solujen ja tekijöiden vuorovaikutus. Menetelmät yleensä sisältävät alttiiden solujen 15 tartuttamisen puutteellisesti replikoivalla yhdistelmäretro-vi-ruksella, joka ohjaa estoaineksen ilmenemistä tartutetuissa soluissa. Estoaines pystyy sitomaan solureseptoria (mieluummin isäntäsolureseptoria) joko, kun reseptori on solun sisällä tai solun pinnalla, tai vaihtoehtoisesti sitomalla vaikutinta.
20 Molemmissa tapauksissa vuorovaikutus estetään.
• ’·♦ Huolimatta keinoista, joilla yhdistelmäretrovirus käyttää immu- t t'\‘ nogeenista tai ehkäisevää toimintaansa, kuten yllä on selitetty, : on suosittua, että retroviruksen genomi on replikaation suhteen puutteellinen" (se ei pysty repiikoitumaan soluissa, jotka se on 25 tartuttanut) . Täten on vain yksi tartunnan vaihe joko in vitro • t tai in vivo käytössä, sillä tavalla huomattavasti vähennetään • · 1 insertiomutageneesin mahdollisuutta. Mieluummin, jotta autettaisiin tässä tarkoituksessa, yhdistelmäretrovirukselta puuttuu : .1 ainakin yksi gag, pol tai envgeeneistä. Lisäksi yhdistelmävirus- 3 0 vektori on mieluummin kimeerinen (se on, geeni, jonka on määrä tuottaa toivottua tulosta, on eri lähteestä kuin muu retrovi- * I t rus) . Kimeerinen rakenne lisäksi vähentää rekombinaatiotapahtu- * · • · * · · • i » * · * » » · 11347c 8 mien mahdollisuutta soluissa, jotka on infektoitu yhdistelmä-retroviruksella, mikä voisi tuottaa genomin, joka voi synnyttää viruksia.
Hakemuksessa esitetään yhdistelmäretrovirukset, jotka ovat 5 hyödyllisiä yllä olevien menetelmien toteuttamisessa yhtä hyvin kuin muiden hoidollisten geenien toimittamisessa. Tämä keksintö tarjoaa myös menetelmän tällaisten yhdistelmäretrovirusten tuottamiseksi, joiden genomi on pakattu kuoreen ja vaippaan, mieluummin käyttämällä pakkaussolua. Pakkaussolut varustetaan 10 viruksen proteiinia koodaavilla jaksoilla, mieluummin kahden plasmidin muodossa, jotka tuottavat kaikki elinkykyisten retro-virusten tuottamiseksi tarvittavat proteiinit, viruksen RNA-rakenteella, jossa on toivottu geeni yhdessä pakkaussignaalin kanssa, joka ohjaa RNA:n pakkausta retroviruksiin.
| 15 Hakemuksessa esitetään myös lukuisia tekniikoita yhdistelmä- j retrovirusten tuottamiseksi, jotka tekniikat voivat helpottaa: i) korkeampien tiittereiden tuotantoa pakkaussoluista; ii) vektorirakenteiden pakkausta keinoilla, jotka eivät sisällä 20 pakkaussolujen käyttöä; ; '*· iii) yhdistelmäretrovirusten tuotantoa, joilla voidaan pommittaa _ esivalikoituja solulinjoja; ja ; iv) provirusrakenteen liittämistä esivalikoituun kohtaan tai .kohtiin solun genomissa.
25 Eräs tekniikka korkeiden tiittereiden tuottamiseksi pakkausso- V · luista käyttää hyväkseen monien tekijöiden löytöä, jotka voivat rajoittaa tiitteriä pakkaussolusta, eräs rajoittavin on pakkaus - i'·’: proteiinien ilmenemisen taso, nimittäin gag-, pol- ja env-prote- • » iinien yhtä hyvin kuin retrovirusvektorin RNA:n ilmenemisen taso • ’ i 30 provirusvektorista. Tämä tekniikka sallii pakkaussolujen valinnan, * i * *·’·’ joilla on edellä mainittujen pakkausproteiinien ja vektorirakenne- ·,,,· RNA:n ilmenemisen korkeammat tasot (se on, tuottavat korkeampia ,·, : konsentraatioita) . Erityisemmin tämä tekniikka sallii pak- • i • » * t % * » » • · 113476 9 kaussolujen valinnan, jotka tuottavat tässä viitatun "päävaikuttimen" korkeampia tasoja, joka on joko pakkauspro-teiini (esim. gag-, pol- tai env-proteiinit) tai mielenkiinnon kohteena oleva geeni, joka pitää kuljettaa kohdesolujen 5 genomiin (tyypillisesti vektorirakenne). Tämä toteutetaan antamalla pakkaussoluissa geeniä ("päägeeniä") kantava genomi, joka ilmentää päävaikutinta pakkaussoluissa yhdessä valikoivan geenin kanssa, mieluummin 3'-suuntaan päägeenis-tä. Valikoiva geeni ilmentää valikoivaa proteiinia pakkaus-10 soluissa, mieluummin muutoin solumyrkylliselle lääkkeelle vastustuskykyä antavaa proteiinia. Solut saatetaan sitten valikoivan vaikuttimen, mieluummin solumyrkyllisen lääkkeen, vaikutuksen alaisiksi, mikä mahdollistaa kriittisellä tasolla valikoivaa proteiinia ilmentävien solujen identifioinnin 15 (se on, solumyrkyllisen lääkkeen tapauksessa, tappamalla ne solut, jotka eivät tuota hengissä pysymiseen vaadittavaa vastustuskykyproteiinin tasoa).
Mieluummin yllä lyhyesti selitetyssä tekniikassa sekä 20 valikoivan että päägeenin ilmenemistä valvoo sama promoottori. Tässä suhteessa voi olla parempi käyttää hyödyksi retroviruksen 5’-LTR:ää. Jotta yhdistelmäretroviruksen tiitteri pakkaussoluista tehtäisiin suurimmaksi mahdolliseksi, tätä tekniikkaa käytetään ensin pakkaussolujen valit-: 25 semiseksi, jotka ilmentävät kaikkien tarvittavien pakkausproteiinien korkeita tasoja, ja sitten sitä käytetään .··. niiden solujen valitsemiseksi, jotka toivotulla provirus- rakenteella transfektoimisen jälkeen tuottavat yhdistelmäretroviruksen korkeimpia tiittereitä.
30 Käytetään myös tekniikoita vektorirakenteiden pakkaamiseksi keinoilla, jotka eivät sisällä pakkaussolujen käyttöä. Nämä tekniikat käyttävät DNA-viruksia kuten baculovirusta, adeno-: virusta tai lehmärokkovirusta, mieluummin adenovirusta.
35 Näiden virusten tunnetaan ilmentävän suhteellisen suuria proteiinien tasoja ulkosyntyisistä geeneistä, joita niissä . . käytetään. Tällaisia DNA-virusvektoreita varten voidaan tuottaa yhdistelmä-DNA-viruksia yhdistelemällä uudelleen in /·: vivo kudosviljelmässä virus-DNA:ta ja plasmideja, joissa on 40 retroviruksen tai retrovirusvektorin geenejä. Tuloksena 10 1 1347(' olevat DNA-virusvektorit, joissa on joko retroviruksen proteiineja tai retrovirusvektorin RNA:ta koodaavia jaksoja, puhdistetaan korkean tiitterin stokeiksi. Vaihtoehtoisesti rakennelmat voidaan rakentaa in vitro ja myöhemmin transfek-5 toida soluihin, jotka tarjoavat DNA-vektoreista puuttuvat virustoiminnat trans-asemassa eli virustoimintoja on eri genomeissa. Huolimatta tuotantomenetelmästä, voidaan valmistaa korkean tiitterin (107:stä 1011:een yksikköä/ml) stok-keja, jotka alttiiden solujen tartuttamisen jälkeen aiheut-10 tavat retroviruksen proteiinien (kuten gag:n, pol:n ja env:n) tai RNA-retroviruksen genomeiden, tai molempien korkeaa ilmenemistä. Soluviljelmän solujen tartuttaminen näillä stokeilla yksin tai yhdistelmässä johtaa retrovirus-vektoreiden suureen tuotantoon, jos stokeissa on viruksen 15 proteiinia ja virusvektorin geenejä. Kun tätä tekniikkaa käytetään adenoviruksen tai muun nisäkäsvektorin kanssa, käytetään primaarisoluja (esim. kudosviljelyistä tai rokotteiden tuotantoon käytettyjä WI38-soluja) yhdistelmäretrovi-rusvektoreiden tuottamiseksi.
20
Vaihtoehtona yllä mainitulle tekniikalle yhdistelmäretrovirukset tuotetaan ensin kehittämällä gag/pol- ja env-proteiinit solulinjasta, joka on infektoitu sopivalla yhdistelmä-DNA-viruksella samanlaisella tavalla : 25 kuin edeltävissä tekniikoissa paitsi, että solulin jaa ei .;· infektoida vektorirakenteen sisältävällä DNA-viruksella.
.···. Myöhemmin proteiinit puhdistetaan ja yhdistetään toivotun in vitro tehdyn virusvektori-RNA:n, siirtäjä-RNA:n (tRNA), liposomien ja solu-uutteen kanssa, jotta jalostettaisiin 30 env-proteiini liposomeihin siten, että tuotetaan virusvek-tori-RNA:n sisältäviä yhdistelmäretroviruksia. Tällä tekniikalla saattaa olla tarpeellista jalostaa env-proteiini liposomeihin ennen kuin ne yhdistetään lopun edellä mainitun ,· seoksen kanssa. Gag/pol- ja env-proteiinit voidaan myös 35 tehdä plasmidin ohjaaman transfektion jälkeen eukaryoot-tisoluissa, hiivassa tai bakteereissa.
,,, Tekniikka yhdistelmäretrovirusten tuottamiseksi, joilla ; ·. voidaan pommittaa esivalikoituja solulinjoja, käyttää hyväk- 40 seen env-geenin sisältäviä yhdistelmäretroviruksia, jotka 11 1 13 4 7 r koostuvat ensimmäisen retrovirusfenotyypin solulimaosasta ja solun ulkopuolisesta sitomisosasta, joka on ulkosyntyinen ensimmäiselle retrovirusfenotyypille. Sitomisosa on toisesta virusfenotyypistä tai toisesta proteiinista, jolla on toivo-5 tut sitomisominaisuudet, joka valikoidaan ilmennettäväksi peptidinä, joka sitoutuu toivottuun kohteeseen.
Tekniikat retrovirusgenomin liittämiseksi erityispaikkaan kohdesolun DNArssa sisältävät homologisen rekombinaation 10 käytön, tai vaihtoehtoisesti muutetun integraasi-entsyymin käytön, joka tunnistaa erityispaikan kohdesolun genomissa. Tällainen erityispaikkaan liittäminen sallii geenien liittämisen kohdesolujen DNA:n kohtiin, mikä rajoittaa inser-tiomutageneesin mahdollisuudet mahdollisimman pieniksi, 15 saattaa muiden jaksojen interferenssin DNArhan vähimmilleen, ja sallii jaksojen liittämisen erityiskohdepaikkoihin siten, että vähennetään tai poistetaan epämieluisan geenin ilmeneminen (kuten viruksen geenin) kohdesolun DNA:ssa.
20 Arvostetaan sitä, että mitä tahansa yllä selitettyä tekniikkaa voidaan käyttää muista riippumatta erityisissä tilanteissa, tai voidaan käyttää yhdessä yhden tai useamman jäljelle jääneen tekniikan kanssa.
; 25 Nämä ja muut tämän keksinnön näkökohdat tulevat selvästi j ilmi viittaamalla seuraavaan yksityiskohtaiseen selitykseen ja liitettyihin piirroksiin.
> « i » '
Kuvio 1 kuvaa kolmea eri vektoriperhettä, joita käytetään 30 HIV-env:n tuottamiseksi ja joilla saattaa olla tai ei ole liitettynä valikoivaa SV-Neo-kasettia.
Kuvio 2 valaisee HIV env -ilmenemistasoja, jotka nähdään esitetyillä vektoreilla transfektoitujen ihmisen Sup Tl -35 solujen uutteiden HIV env -radioimmuunierityissaostusten polyakryyliamidigeelielektroforeesissa. Merkitsijät ilmoite-.. taan kilodaltoneina, gp 160 ja gp 120 merkitsevät sopivia proteiineja, ja 517+tat on positiivinen kontrolli (HIV LTR panee env:n transkription liikkeelle tat:n läsnäollessa).
40 11347t 12
Kuvio 3 kuvaa protokollaa T-solujen tappamisen analysoimiseksi, mikä on aiheutettu hiirille, joihin on ruiskutettu syngeenisiä kasvainsoluja, jotka ilmentävät HIV env:ä (vektori on pAF/env-SV-Neo).
5
Kuvio 4 kuvaa graafisesti kuvion 3 koeprotokollan tuloksia. Erityistappaminen nähdään yläosan kaaviokuvassa, jossa on BC10MEenv-29-tappaminen verrattuna B/C10ME:n tappamisen vastustuskykyyn.
10
Kuvio 5 kuvaa vektoria, joka on suunniteltu ilmentämään sCD4:ää.
Kuvio 6 valaisee TKl-vektorin (ei SV-Neo:a) ja TK3-vektorin 15 (on SV-Neo) sisältävien plasmidien rakennetta.
Kuvio 7 valaisee KTVIHAX-vektorin sisältävän plasmidin rakennetta.
20 Kuvio 8 valaisee KTVIH5-vektorin (ei SV-Neo:a) ja KTVIH Neo -vektorin (on SV-Neo) sisältävien plasmidien rakennetta.
Kuvio 9 valaisee MHMTK-Neo-vektorin sisältävän plasmidin rakennetta.
'· 25
Kuvio 10 valaisee tat-his-vektorin (tat merkityksellisessä , ·, asennossa) tai atat-vektorin (tat vastamerkitysasennossa) ,·. sisältävien plasmidien rakennetta.
30 Kuvio 11 kuvaa graafisesti tathis-vektorilla (5 kloonia, TH1-5) infektoitujen PA 317 -solujen suosivaa tappamista verrattuna PA 137 -kontrolliin, kolmella esitetyllä ehdollisesti kuolettavalla vektorilla tartuttamisen ja :,*· acyclovirrllä käsittelyn jälkeen.
35
Kuvio 12 kuvaa HIV:n indusoitavia merkitsijä/selostaja-. . geenejä, kuten alkaalista fosfataasia (AP), sisältävän virusvektorin rakennetta.
40 Kuvio 13 kuvaa HIV:n indusoitavan merkitsijä/selostaja- 13 113476 geenin rakennetta, joka on plasmidissa, joka voidaan trans-fektoida soluihin.
Kuvio 14 kuvaa graafisesti Sup Tl-solujen HIV-tartunnan 5 ajankulkua, kun Sup Tl-soluissa on AP-merkitsijä kuviossa 13 HIV:n kanssa eri AZT:n konsentraatioilla. HIV-tartunnan taso mitattiin ottamalla supernatantista pieniä eriä.
Kuvio 15 kuvaa graafisesti saman kokeen tuloksia kuin 10 kuviossa 14 paitsi, että ddC on HIV:n inhibiittorina.
Kuvio 16 valaisee diagrammin muodossa henkiin jäävien solujen määrää fleomysiinivalinnan jälkeen, kun solut on trans-fektoitu plasmidilla, joka ilmentää fleomysiinivastustus-15 kykygeeniä (PRG) suoraan promoottorista (oikealla) ja toisella plasmidilla, joka ilmentää PRG:tä koodaavan jakson kanssa, joka on sen ja promoottorin välissä.
Kuvio 17 kuvaa neljää plasmidia, jotka on suunniteltu il-20 mentämään retroviruksen proteiineja nisäkässoluissa. pSVgp ja pRSVenv transfektoidaan yhdessä valikoivan merkitsijän kanssa, kun taas pSVgp-DHFR ja pRSVenv-fleo ovat samanarvoisia plasmideja, joiden valikoiva merkitsijä on viruksen proteiinia koodaavista alueista 3'-suuntaan.
25 • % ·· Kuvio 18 kuvaa HIV-env:n ja MLV-env:n yhteen sulautumisen · · kolmea paikkaa molempien koodaavien jaksojen paikkaohjatun mutageneesin jälkeen, jolloin saadaan aikaan uusia yhteen sopivia restriktioentsyymikohtia. N-terminaaliset jaksot 30 ovat vasemmalla molemmissa tapauksissa. Numerointi on nukleotidien numeroiden mukaan. ST, SR, SE ovat tat:n, rev:n ja env.n aloituksia, kun taas TT, TR, ja TE ovat vastaavia s i ♦ lopetuskohtia.
35 Kuvio 19 kuvaa korvaamista 5' LTRrssä heterologisella promoottorilla/tehostejaksolla, joka voidaan yhdistää joko . . Sac I-, Bsst II- tai muuhun paikkaan alueella.
Kuvio 20 valaisee edustavaa menetelmää viruksen proteiinia 40 tai vektori-RNA:ta ilmentävien siirtogeenisten hiirien • I · i4 1 1347(: risteyttämiseksi .
I. Immunostimulaatio.
5 Kyky tunnistaa ja puolustautua vieraita taudinaiheuttajia vastaan on keskeistä immuunijärjestelmän toiminnalle. Tämän järjestelmän täytyy pystyä erottamaan immunologisen tunnistuksen avulla "omat vieraista", mikä on olennaista varmistettaessa, että puolustusmekanismit ohjataan hyökkääviä 10 kohti mieluummin kuin isännän kudoksia vastaan.
Immuunijärjestelmän peruspiirteitä ovat erittäin monimuotoiset solupinnan tunnistusrakenteet (reseptorit) ja vaikutta jamekanismit (vasta-aineet ja soluhajottavat solut) hyökkäävien taudinaiheuttajien tuhoamiseksi.
15
Soluhajottavat T-lymfosyytit (CTL) indusoidaan tavallisesti käsiteltyjen tautia aiheuttavien erityispeptidien levittämisen avulla yhdessä MHC luokan I tai luokan II solupin-taproteiinien kanssa. Tämän keksinnön yhden suoritusmuodon 20 mukaan immunogeenisten viruksen määräävien tekijöiden esittäminen sopivien MHC-molekyylien yhteydessä indusoi tehokkaasti optimaaliset CTL-vasteet ilman, että potilas asetetaan alttiiksi taudinaiheuttajalle. Tämä vektorilähes-: tyminen immunostimulaatioon käyttää tehokkaampia keinoja , .·, 25 suo jäävien ja hoidollisten CTL-vasteiden indusoimiseksi, koska vektorin indusoima immuniteetti tyyppi muistuttaa ',!! enemmän luonnollisen tartunnan indusoimaa immuniteettia.
Perustuen useiden virus järjestelmien nykyisiin tietoihin on '·' epätodennäköistä, että ulkoa aiheutuvasti toimitetut, repli- 30 koimattomat virusantigeenit, kuten peptidit ja puhdistetut yhdistelmäproteiinit, käyttävät riittävää ärsykettä indusoimaan optimaalisia luokkaan I rajoittuvia CTL-vasteita.
:Vaihtoehtoisesti valittujen virusproteiinien vektorin toimittama ilmeneminen kohdesoluissa kuten on selitetty • ; 35 tässä keksinnössä käyttää tällaista ärsykettä.
' ' Esimerkiksi HIV-l-tartuntojen tapauksessa potilaat kehit- tävät vasta-aineita, jotka ovat erityisiä suurelle määrälle : viruksen vaippa-alueen määrääviä tekijöitä, joista eräät 40 pystyvät neutralisoimaan viruksen in vitro. Siitä huolimatta 113476 15 sairauden eteneminen jatkuu ja potilaat lopulta kuolevat sairauteen. Alhaisen tason CTL-vasteet infektoituneita potilaiden soluja vastaan (Plata et ai., Nature 328:348-351, 1987) ja HIV:n gag-, pol- tai env-geenejä ilmentävillä 5 yhdistelmälehmärokkovektoreilla infektoituja kohdesoluja vastaan (Walker et ai., Nature328:345-348, 1987; Walker et ai., Science 240:64-66, 1988) on osoitettu joissakin HIV-1 seropositiivisissa potilaissa. Lisäksi on äskettäin esitetty, että sekä hiiren että ihmisen CTL:n voivat indusoida 10 autologiset stimuloidut solut, jotka ilmentävät HIV:n gp 120:ä transfektion kautta (Langlade-Demoyan et ai., J. Immunol. 141;1949, 1988). Parantunut CTL-induktio voisi olla hoidollisesti hyödyllistä ruiskutetuille potilaille ja antaa tehokkaan ehkäisevän hoidon yksilöille olosuhteissa, jotka 15 eivät ole tartunnallisia. HIV-tartunta ei ehkä itse tuota riittävää CTL-vastetta, koska HIV-tartuntaan liittyvät muut ainekset saattavat estää oikeaa immunostimulaatiota. Lisäksi, kun infektoidut solut stimuloivat T-soluja, saattaa olla, että se on vuorovaikutus, joka johtaa stimuloitujen T-20 solujen tartuntaan.
Esimerkki 1 selittää menetelmiä plasmidien rakentamiseksi, jotka pystyvät aiheuttamaan retrovirusvektoreita pakkaus-: soluissa, mikä sitten johtaa HI-viruksen antigeenien il- 25 menemiseen.
;;; Esimerkki 1. HIV:n antigeenejä ilmentävät vektorit.
A. Env:tä ilmentävä vektori (katso kuvio 1): 30 2,7 kb Kpn-Xho I DNA-kappale eristettiin BH10-R3-HIV-proviruskloonista (katso jakso julkaisusta Ratner et ai., Nature 313:277, 1985) ja n. 400 bp Sal-Kpn I DNA-kappale IIIexE7deltaenv:stä (Bal 31 -häviämä nukleotidiin 5496) • · 35 liitettiin SK+-plasmidiin Sal I -kohtaan. Tästä kloonista puhdistettiin 3,1 kb env-DNA-kappale (Xhol-Clal), joka ‘ ’ koodaa myös env-ilmenemiselle olennaista revrä, ja liitet- tiin pAFVXM-retrovirusvektoriin (katso Kriegler et ai., Cell : 38:483, 1984). Tätä vektoria muutettiin siten, että Bglll- 40 kohta vaihdettiin liittämällä liittäjämolekyyli Xhol-kohtaan 11347c 16 helpottamaan HIV:n env:ä koodaavan DNA-kappaleen kloonausta.
Vallitseva valikoiva merkitsijägeeni, joka koostuu SV40:n aikaisesta promoottorista, joka panee 5 neomysiinifosfotransferaasigeenin ilmenemisen liikkeelle, liitettiin vektoriin Clal-kohtaan helpottamaan tartutettujen ja transfektoitujen solulinjojen eristystä.
Xhol-kohta, joka on env-geenistä 5'-suuntaan vektorissa, 10 tarjoaa sopivan paikan lisäpromoottorien liittämiseksi vektorirakenteeseen, kuten RSV-promoottorin, SV40:n aikaisen ja myöhäisen promoottorin, CMV:n hyvin varhaisen (IE) alueen promoottorin, ihmisen beeta-baktiini-promoottorin ja hiiren Moloney SL3-3 promoottorin liittämiseksi.
15
Yksi tällainen promoottori, CMV:n hyvin varhaisen alueen geenin promoottori, 673 bp DNA-kappale Hindi:sta Eagl:een, johtaa env-ilmenemisen kymmenkertaiseen kasvuun ihmisen Sup TI-T-solulinjassa, kun verrataan pAF ENVr SV2 Neo -paren-20 taalirakenteeseen.
B. Gag:ä ilmentävä vektori.
2.5 kb SacI-EcoRV DNA-kappale eristettiin pBH10-R3:sta 25 (katso Ratner et ai., op. cit.) ja liitettiin pUC31:n Sacl-' Sali-kohtaan. pUC31 on saatu pUC19:stä liittämällä XhoI-,
Bglll-, Bsstll- ja Ncol-kohdat polylinkkerin EcoRl- ja Kpnl-kohtien väliin. Kuitenkin tämä rakenne sisälsi HIV:n splice-donori (SD) -kohdan ja täten voisi olla ongelmallinen viruk-30 sen kehittämisessä. SD-kohta poistettiin kloonaamalla 70 bp Rsal-Clal-kappale 2,1 kb Clal-BamHl DNA-kappaleen kanssa SK+:n HincII-BamHl-kohtaan. BamHl-kohta muutettiin Clal-;'"· kohdaksi liittämällä liittäjämolekyyli. Tämä rakenne merkit- tiin SK+ gag proteaasi SD deltaksi.
35 2.5 kb Xhol-Clal DNA-kappale SK+gag proteaasi SD deltasta ’ ' liitettiin pAFVXM-vektorin XhoI/Clal-kohtiin, kuten on juuri yllä selitetty.
40 Nämä plasmidit sijoitettuna sopivaan pakkaussoluun ilmen- 113476 17 sivät retrovirusvektorirakennetta, joka sisältää pakkaussig-naalin. Pakkaussignaali ohjasi vektorirakenteen pakkausta kuoreen ja vaippaan yhdessä kaikkien lisäproteiinien kanssa, joita tarvitaan elinkykyisiä retroviruksia varten. Kuori-, 5 vaippa- ja muut proteiinit tuotetaan mieluummin yhdestä tai useammasta sopivia genomeja sisältävistä plasmideista, jotka on sijoitettu pakkaussoluun. Tällaiset genomit voivat olla provirusrakenteita, joista yksinkertaisessa tapauksessa on deletoitu pelkästään pakkaussignaali. Tämän seurauksena vain 10 vektori pakataan. Sopivan pakkaamisen tai pakkauslinjät, ja tällaisen pakkaamisen toteuttamiseen tarvittavan genomin ovat Miller ym. selittäneet (Mol. Cell. Bio. 6:2895), joka sisällytetään tähän viitteenä. Kuten Miller ym. ovat selittäneet, on parempi, että tehdään lisämuutoksia provirus-15 rakenteelle muita kuin yksinkertainen pakkaussignaalin deleetio, jotta vähennettäisiin pakkaussolulinjassa esiintyvien rekombinaatiotapahtumien mahdollisuuksia, mikä saattaa johtaa virusten tuotantoon, jotka eivät ole replikaation suhteen puutteellisia.
20
On ymmärrettävä, että esimerkki 1 valaisee pelkästään menetelmää HIV:n vaippaglykoproteiinin (gp) tai muun virusantigeenin kehittämiseksi. On myös mahdollista käyttää ; provirusvektorirakennetta, joka ilmentää muutettua HIV:n ’ ! 25 vaippagp:a kohdesoluissa, mikä samalla tavoin stimuloi immuunivastetta, jolla on kuitenkin vähemmän sytopaattisia ·;·: T-soluvaikutuksia. Vaippaglykoproteiineja voidaan sopivasti muuttaa käyttämällä alalla hyvin tunnettuja tekniikkoja, v : esimerkiksi kayttämälä artikkeleita kuten Kowalski et ai., 30 Science 237:1351, 1987), joka sisällytetään tähän viitteenä. Täten provirusrakenne voidaan rakentaa yllä olevan tekniikan avulla, joka kehittää retrovirusrakenteita, jotka ilmentävät tällaista sopivasti muutettua gp:a. Sitten tämä rakenne ,V sijoitetaan pakkaussoluun, kuten on selitetty yllä. Pakkaus- • · 35 solulinjoista tuotettuja tulokseksi syntyneitä yhdistelmäretroviruksia voidaan käyttää in vitro ja in vivo ’·*’· stimuloimaan immuunivastetta infektoimalla alttiit .'· kohdesolut. Arvostetaan, että muut HIV-genomista ilmennetyt ,·, proteiinit, kuten gag, pol, vif, nef, jne., voivat myös 40 tuoda esiin terveellisiä soluvasteita HIV-tartutetuilla 113476 18 yksilöillä. Provirusvektorit, kuten alla selitetyt, suunnitellaan ilmentämään tällaisia proteiineja siten, että edistetään kliinisesti terveellistä immuunivastetta. Tietyille vektoreille voi olla välttämätöntä sisällyttää 5 rev-koodausjaksot yhtä hyvin kuin rev-herkkä aines (Rosen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 85.:2071, 1988).
Seuraava esimerkki osoittaa tämän tyyppisen käsittelyn kykyä tuoda esiin CTL-vasteita hiirissä.
10
Esimerkki 2. Immuunivaste retrovirusvektorin koodaamille antigeeneille.
Hiiren kasvainsolulinja (B/C10ME) (H~2d) infektoitiin pAF
15 envr SV40 Neo -vektorirakenteella, joka koodaa HIV:n env:ä. Sitten käytetään hyväksi yhtä kloonattua HIV-env:ä ilmentävää solulinjaa (B/C10ME-29) stimuloimaan erityistä HIV-env-CTLrää syngeenisissä (se on MHC-identtinen) Balb/c (H-2d) -hiirissä. Hiiret immunisoitiin ruiskuttamalla vatsakalvon 20 sisään B/C10ME-29-soluja (4 x 107 solua) ja tämä toistettiin 7-14 päivää myöhemmin. Näistä immunisoiduista hiiristä valmistettiin reagoivat pernasolususpensiot ja soluja vil-·.. jeltiin in vitro 4 päivää mitomysiini-C:llä käsiteltyjen joko B/C10ME-29- tai B/C10ME-solujen läsnäollessa, kun , ,·. 25 stimulaattori:reagoija-solusuhde oli 1:50 (kuvio 3). Vaikut- tajasolut kerättiin viljelmistä, laskettiin ja sekoitettiin radioaktiivisella 51Cr:lla leimattujen kohdesolujen kanssa (se on B/C10MEenv-29 tai B/C10ME) eri vaikutta ja: kohde (E:T)
t ( I
’·' -solusuhteissa standardi-5 1 Cr-vapauttamiskokeessa, joka 30 kesti 4-5 tuntia. Inkubaation jälkeen mikrotiitterimaljät sentrifugoitiin, poistettiin 100 μΐ viljelmäsupernatanttia, ja hajotetuista soluista vapautuneen radioaktiivisen leiman : * määrä määritettiin Beckman gamma-spektrometrissä. Kohdesolu- :Y jen hajoaminen laskettiin: 35 % kohdellajoaminen = Exp CPM-SR CPM/MR CPM-SR CPM x 100, jossa koeluku minuutissa (Exp CPM) esittää vaikuttajia plus [ kohteita; spontaani vapautus (SR) CPM esittää vain kohteita; ja enimmäisvapautus (MR) CPM esittää kohteita 1 M HCl:n läsnäollessa.
40 1 1347 f 19
Tulokset (kuvio 4) valaisevat, että CTL-vaikuttajät indusoitiin, mikä erityisesti hajotti HIV-env:ä ilmentäviä koh-desoluja (B/C10MEenv-29) merkittävästi tehokkaammin kuin B/C10ME-kohteita. Kontrollisoluilla (B/C10ME), jotka eivät 5 ilmentäneet HIV-env:ä, in vitro uudelleen stimuloidut esikä-sitellyt pernasolut eivät osoittaneet merkittävää CTL-ak-tiivisuutta B/C10MEenv-29- eikä B/C10ME-kohteille, erityisesti alhaisilla E:T-solusuhteilla. Luonnollisista immunisoimattomista Balb/c-hiiristä saadut pernasolut, jotka 10 stimuloitiin uudelleen in vitro B/C10MEenv-29:llä, eivät kehittäneet CTL:ää, täten esitetään in vivo -esikäsittelyn ja tehosteruiskeen merkitys. Tämä koe on toistettu ja on saatu samanlaisia tuloksia.
15 Toisessa kokeessa vaikuttajasolut, jotka oli saatu Balb/c-hiiristä, jotka oli immunisoitu, tehosteruiskutettu ja stimuloitu uudelleen in vitro erilaisella H-2d HIV-env:ä ilmentävällä kasvainsolukloonilla (L33-41), joka oli infek-toitu samalla pAF envr SV40 Neo (HlV-env) -vektorirakenteel-20 la, pystyivät hajottamaan B/C10MEenv-29-kohdesoluja. Tämä tarjoaa lisätukea, että näissä hiirissä kehittynyt CTL erityisesti tunnistaa HIV-env:n ilmentyvän muodon mieluummin kuin yksinkertaisesti ainutlaatuisen kasvainsoluantigeenin näissä soluissa. Tämä tulos myös tukee, että kaksi kasvain-, ,·. 25 solulinjaa tarjoavat vektorin toimittamaan antigeenin samal- la tavalla.
; * * Tämän immunostimulantin sovellutuksen toteuttaminen ihmisiin » > vaatii, että (1) mielenkiinnon kohteena olevaa antigeeniä 30 koodaava geeni toimitetaan soluihin, (2) antigeeniä ilmennetään sopivissa soluissa, ja (3) MHC-rajoittamisvaatimuk-set, se on luokan I ja luokan II antigeenin vuorovaikutus, , ' on täytetty. Vektorin valmistukset tehdään kasvattamalla i · ; tuottajasoluja normaalissa elatusaineessa, pesemällä solut * 35 PBS:llä ja 10 mg/ml ihmisen seerumin albumiinilla (HSA), sitten kasvattamalla soluja 8-16 tuntia PBSissä, jossa on HSA:ta. Saadut tiitterit ovat tyypillisesti 104:stä 106:een ml:ssa riippuen vektorista, pakkauslinjasta tai erityisestä tuottajalinjakloonista. Vektorisupernatantit suodatetaan, 40 jotta poistetaan solut ja konsentroidaan 100-kertaisiksi 11347c 20 suodattamalla 100 000- tai 300 000-läpäisevien Amicon-suodattimien läpi (Wolff et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 8_4:3344, 1987). 100 000 tai 300 000 pallon muotoiset proteiinit läpäisevät, mutta 99% virusvektoreista jää kuten 5 infektiiviset partikkelit. Stokit voidaan säilyttää pakastamalla, koska ne menettävät noin 50% infektiivisistä yksiköistä pakastettaessa ja sulatettaessa. Suorin toimitus sisältää sopivan geenin sisältävän vektorin antamisen yksilölle ja luottamuksen vektorin kykyyn tehokkaasti pommit-10 taa sopivia soluja, jotka sitten voivat aloittaa immuunivasteen stimulaation. Annos olisi 105-106 infektiivistä yksik-köä/kg ruumiin painoa. Kuitenkin käytännöllisempi aloittamistapa saattaa sisältää potilaan ulompien veren valkosolujen (PBL), fibroblastien tai jokaisesta yksilöstä 15 saatujen muiden solujen ruumiin ulkopuolisen käsittelyn vektorilla. PBL:ä voitaisiin ylläpitää viljelmässä käyttämällä mitogeeneja (fytohemagglutiniinia) tai lymfokiiniä (esim. IL-2:a). Tämän tyyppinen aloittamistapa sallii ohjatun vektoritartunnan, antigeeniä esittävän solupopulaation 20 ilmenemisen ja levittäytymisen tarkkailun ennen ruiskuttamista, ja vektoria ilmentävien solujen palauttamisen kullekin kuuluvalle potilaalle. Muun tyyppisiä soluja ·,. voitaisiin myös kasvattaa elimistön ulkopuolella, vektori liittää, ja palauttaa solut potilaaseen. Vain kohtalainen 1 » » , 25 määrä infektoituja soluja (10s-106/kg ruumiin painoa) on välttämätöntä voimakkaiden immuunivasteiden tuomiseksi « » '!!! esiin.
> t · ·
Hoidon erilainen muoto on retrovirusvektoreita tekevien 30 tuottajalinjojen istutus. Nämä voivat olla immunologisesti yhteensopimattomia klassisia tuottajasolulinjoja tai potilaan omia soluja, joita on kasvatettu elimistön ulkopuolella, käsitelty ja palautettu (katso alla olevaa VI Vaih- * · ;V toehtoiset virusvektorin pakkaustekniikat). Siirrännäisten ‘ ’ 35 molemmilla tyypeillä (105 -106 /kg ruumiin painoa) olisi * * » · rajoitettu elinaika potilaassa, mutta ne johtaisivat siihen, että retrovirusvektorit infektoivat suuren määrän (107-1010) • » : ” soluja niiden läheisyydessä ruumiissa.
t 40 Joka tapauksessa hoidon onnistuminen voidaan määrittää 11347ΐ 21 ottamalla pieni määrä verta ja mittaamalla CTL-vaste käyttämällä kohteina yksilön omia soluja, jotka on tartutettu vektorilla, mikä johtaa env:n ilmenemiseen.
5 Kun halutaan stimuloida MHC luokkaan I tai luokkaan II rajoittuvaa immuunivastetta taudinaiheuttajille, mukaan lukien tautia aiheuttavat virukset muut kuin HIV, tällaisiin retroviruksiin liittyvien vaippa- tai muiden antigeenien sopivia muotoja, jotka stimuloivat immuunivastetta, voivat 10 alan ammattimiehet ottaa selville. Yleensä voidaan helposti valita tautia aiheuttaviin vaikuttimiin liittyvien antigeenien sopivia muotoja, jotka stimuloivat immuunivastetta näille tautia aiheuttaville vaikuttimille.
15 Vaihtoehtoinen aloittamistapa halutun immuunivasteen kehittämisessä on toimittaa tiettyä antigeeniä varten olevan T-solureseptorin geeni sopivaan soluun, kuten T-soluun. Toinen mahdollinen vastaanottaja on NK-solut, joiden solumyrkyl-linen immuunivaste ei ole MHC-rajoittunut. Erityinen im-20 munoglobuliinigeeni voisi samalla tavoin olla hyödyllinen, jos se toimitettaisiin B-soluun.
*. II. Tukkimisvaikuttimet.
» • » ,·. 25 Moniin tartuntatauteihin, syöpiin, autoimmuunitauteihin ja \ muihin sairauksiin sisältyy virusten ja solujen, solujen ja » tekijöiden vuorovaikutus tai solujen vaikutus toisiinsa.
* ·
Virustartunnoissa virukset yleensä tunkeutuvat soluihin t i alttiiden solujen pinnalla olevien reseptorien kautta.
30 Syövissä solut eivät reagoi tarkoituksenmukaisesti tai lainkaan muiden solujen tai tekijöiden signaaleille. Autoimmuunisairaudessa ei ole tarkoituksenmukaista "omien" merkit-sijoiden tunnistamista. Tässä keksinnössä tällaiset i · * ,vuorovaikutukset saatetaan estää tuottamalla in vivo molem-‘ ’ 35 pien vuorovaikutusosakkaiden analogia.
ttia I I » Tämä tukkimistoiminta saattaa tapahtua solun sisällä, solukalvolla tai solun ulkopuolella. Viruksen tai erityises-ti tukkimisvaikuttimen geenin sisältävän retrovirusvektorin 40 tukkimistoimintaa voidaan ohjata joko alttiin solun sisältä 11347c 22 tai erittämällä tukkimisproteiinin versiota, jotta paikallisesti estettäisiin tautia aiheuttava vuorovaikutus.
HIV:n tapauksessa vuorovaikutuksen kaksi vaikutinta ovat gp 5 120/gp 41 -vaippaproteiini ja CD4-reseptorimolekyyli. Täten sopiva estäjä olisi vektorirakenne, joka ilmentää joko HIV env -analogia, joka estää HIV:n tunkeutumisen ilman, että aiheuttaa tautia aiheuttavia vaikutuksia, tai CD4-resep-torianalogia. CD4-analogi eritettäisiin ja toimisi 10 suojaamalla naapurisoluja, kun taas gp 120/gp 41 eritetään tai tuotetaan vain solun sisällä siten, että se suojaa vain vektorin sisältävää solua. Saattaa olla hyödyllistä lisätä ihmisen immunoglobuliinin raskaita ketjuja tai CD:n muita aineosia, jotta lisätään pysyvyyttä. Tällaista 15 hybridiliukoista CD4:ää koodaavan retrovirusvektorin antaminen isännälle johtaa pysyvän hybridimolekyylin jatkuvaan toimitukseen.
HIV-env:n ilmenemiseen johtavia vektoreita voidaan myös 20 rakentaa, kuten on selitetty yllä. Alan ammattimiehelle on ilmeistä, mitkä osat pystyvät estämään viruksen adsorption ilman tahallisia tautia aiheuttavia sivuvaikutuksia (Willey et ai., J. Virol. 62:139, 1988; Fisher et ai., Science 233:655, 1986). Seuraava esimerkki selittää CD4-vektorin 25 rakentamisen, josta tehtiin infektiiviset vektorit.
Esimerkki 3. sCD4-vektori.
.... 1. 1,7 kb Eco Rl-Hind III-DNA-kappale pMV7.T4:stä (Maddon et 30 ai., Cell 47_:333, 1986) liitettiin SK+ :n Hinc II -kohdan v : tylppään päähän.
2. Yleispätevä translaation lopetus jakso, joka sisältää Xba I -kohdan, liitettiin CD4-kappaleen Nhe I -kohtaan.
35 ^ 3. 1,7 kb Xho I-Cla I -kappale irrotettiin ja kloonattiin . pXFVXM:n Xho I - Cla I -kohtaan. Näitä vektoriplasmideja voidaan käyttää infektiivisten vektoreiden kehittämisessä, 1 :·*: kuten on selitetty esimerkissä 1.
40 1 1347ί' 23 Tällaiset infektiiviset estäjävektorit laitettuna ihmisen T-solulinjoihin viljelmissä voivat estää HIV-tartuntojen leviämisen. Infektiivisten retrovirusvektorituotteiden valmistus, konsentraatio ja säilytys on kuten 5 immunostimulantille. Hoidon linja olisi myös sama noin 10-kertaisesti suuremmilla annoksilla. Toinen linja, jota voidaan käyttää, on luuytimen imeminen pois, infektoiminen retrovirusvektorilla ja tämän tartutetun ytimen palauttaminen potilaaseen (Gruber et ai., Science 230:1057, 1985).
10 Koska ytimen kahdentuminen monistaa vektorin ilmenemistä solunjakautumisen avulla, voidaan käyttää immunostimulantin rajoissa olevia annoksia (10s-106/kg ruumiin painoa).
Joka tapauksessa hoidon tehokkuus voidaan määrittää mit- 15 taamalla taudin etenemisen tavallisia merkkejä, mukaan lukien vasta-ainetaso, viruksen antigeenituotanto, infek-tiiviset HIV-tasot tai tartuntojen, jotka eivät ole erityisiä, tasot.
20 III. Lievittävien lääkkeiden ilmeneminen.
Tekniikoita, jotka ovat samanlaisia kuin yllä selitetyt, voidaan käyttää yhdistelmäretrovirusten tuottamiseksi, joilla on vektorirakenteita, jotka ohjaavat vaikuttimen (tai 25 "lievittävän lääkkeen") ilmenemistä, joka pystyy estämään tautia aiheuttavan vaikuttimen tai geenin toimintaa. Tässä *'*! keksinnössä "pystyy estämään toiminnan" tarkoittaa, että *; lievittävä lääke joko suoraan estää toiminnan tai epäsuorasti ti estää toiminnan, esimerkiksi muuttamalla soluissa oleva '···' 30 vaikutin muodosta, joka ei normaalisti estäisi tautia ·.' ' aiheuttavan vaikuttimen toimintaa, muodoksi, joka estää.
Virussairauksien täälaisten toimintojen esimerkkeihin kuuluvat adsorptio, replikaatio, geenin ilmeneminen, kokoaminen ja viruksen poistuminen infektoiduista soluista.
35 Syöpäsairauksien tällaisten toimintojen esimerkkeihin kuuluvat solunjakautuminen, alttius ulkoisille signaaleille · (esim. kosketusesto) ja antisyöpägeeniproteiinien tuotannon puute.
40 24 1 1347c (i) Lievittävät estäjälääkkeet.
Tämän keksinnön yhden näkökohdan mukaan vektorirakenne ohjaa vastamerkitys-RNA:n (tai komplementaarisen RNA:n) 5 ilmenemistä tautia aiheuttavan viruksen RNArksi, kuten HIV:n (tai tautia aiheuttavan geenin, kuten syöpägeenin), jotta sillä tavalla estäisi sen replikaation tai taudinaiheuttamiskyvyn. Tällainen ilmeneminen voi joko olla pääasiallisesti jatkuvaa tai vastavaikutuksessa solussa olevalle 10 toiselle vaikuttimelle, joka liittyy tautia aiheuttavaan tilaan ("tunnistava vaikutin"). Vaihtoehtoisesti ilmeneminen saattaa olla erityistä tietylle kudokselle johtuen joko vektorin tunkeutumisen pommittamisesta tai erityisistä kudoksen valvontajaksoista, jotka ovat vektorissa.
15
Yhden suoritusmuodon mukaan retroviruksia, jotka ilmentävät RNA:ta, joka on komplementaarista tautia aiheuttaville avaingeenitranskripteille (esimerkiksi viruksen geenituote tai aktivoitu solun syöpägeeni), voidaan käyttää estämään 20 tämän transkriptin translaatiota proteiiniksi, kuten HIV:n tat-proteiinin translaation estämiseksi. Koska tämän proteiinin ilmeneminen on olennainen viruksen kahdentumiselle, olisivat vektorin sisältävät solut vastustuskykyisiä HIV:n kahdentumiselle.
25 : Toisen suoritusmuodon mukaan, kun tautia aiheuttava vaikutin ·. on yksijuosteinen virus, jolla on pakkaussignaali, ilmen- ·, netään viruksen pakkaussignaalille komplementaarista RNA:ta ! (esim. HIV:n pakkaussignaalille, kun lievittävä lääke oh- ; 30 jataan HIV:tä vastaan) siten, että näiden molekyylien yhdis tyminen viruksen pakkaussignaalin kanssa, retrovirusten tapauksessa, estää varsisilmukan muodostuksen tai tRNA-alukkeen sitoutumisen, jota tarvitaan, jotta retroviruksen RNA-genomin pakkaus kuoreen tai kahdentuminen tapahtuisi 35 oikein.
• I
’ ! Kolmannen suoritusmuodon mukaan voi tulla käyttöön retrovirusvektori, joka ilmentää proteiinia, joka häiritsee ’ ' tautia aiheuttavaa tilaa. HIV:n tapauksessa yksi esimerkki 40 on mutantti tat-proteiini, jolta puuttuu kyky poikittaisak- 113476 25 tivoida ilmenemistä HIV:n LTR:stä ja joka estää tat-proteii-nin normaalia toimintaa (poikittaisvallitsevalla tavalla). Tällainen mutantti on tunnistettu HTLV II:n tat-proteiiniksi ("XII Leu3"-mutantti; katso Wachsman et ai., Science 5 235:674, 1987). Mutantti tat-poikittaisrepressorin pitäisi estää replikaatiota hyvin kuten on esitetty analogiselle mutanttirepressorille HSV-l:ssä (Friedmann et ai., Nature 335:452, 1988).
10 Tällainen transkription repressoriproteiini voidaan valita kudosviljelmään käyttämällä mitä tahansa viruksen transkription erityispromoottoria, jonka ilmenemistä stimuloi viruksen transaktivoiva erityisproteiini (kuten on selitetty yllä). HIV:n erityistapauksessa HIV:n tat-proteiinia ja 15 HIV:n promoottorin liikkeelle panemaa HSVTK-geeniä ilmentävä solulinja kuolee, kun läsnä on ACV:tä. Kuitenkin, jos sarja mutatoituja tat-geenejä otetaan järjestelmän käyttöön, sopivia ominaisuuksia omaava mutantti (se on ehkäisee transkription HIV:n promoottorista, kun läsnä on villityyppinen 20 tat) kasvaa ja valitaan. Mutanttigeeni voidaan sitten eristää uudelleen näistä soluista. Solulinjaa, joka sisältää useita kopioita ehdollisesti kuolettavasta vektori/tat-järjestelmästä, voidaan käyttää varmistamaan, että henkiin jääneitä soluklooneja eivät ole aiheuttaneet sisäsyntyiset 25 mutaatiot näissä geeneissä. Sitten sarja satunnaisesti : mutagenisoituja tat-geenejä viedään näiden solujen sisään käyttämällä "pelastavaa" retrovirusvektoria (se on vektori, ' joka ilmentää mutantti tat-proteiinia ja sisältää bakteerin !! replikaation aloituskohdan ja lääkevastustuskykymerkitsijän 30 kasvua ja valintaa varten bakteereissa) . Tämä sallii suuren '·’' määrän satunnaisia mutaatioita arvioitavaksi ja sallii halutun mutanttisolulinjän helpon myöhemmin tapahtuvan molekulaarisen kloonauksen. Tätä menetelmää voidaan käyttää mutaatioiden tunnistamiseksi ja hyväksi käyttämistä varten 35 eri viruksen transkription aktivaattori/viruspromoottori- :Y järjestelmissä mahdollisia antivirushoitoja varten.
Neljännen suoritusmuodon mukaan HSVTK-geenituotetta käytetään tehokkaammin mahdollisten antiviraalisten nuk-40 leosidianalogien, kuten AZT:n tai ddC:n aineenvaihduntaan.
11347c 26 HSVTK-geeniä ilmennetään konstitutiivisen makrofagin tai erityisen T-solun promoottorin valvonnan alaisuudessa ja se viedään näiden solutyyppien sisään. Solun mekanismien täytyy aineenvaihdunnan aikana muuttaa AZT (ja muut 5 antivirusnukleosidit) nukleotiditrifosfaattimuotoon, jotta erityisesti estettäisiin retroviruksen käänteistranskrip-taasia ja täten HIV:n kahdentumista (Furman et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:8333-8337, 1986). HSVTK:n konstitutiivinen ilmeneminen (nukleotidi ja nukleotidifos-10 faattikinaasi), jolla on hyvin laaja substraattierityisyys) johtaa näiden lääkkeiden tehokkaampaan muuttamiseen niiden biologisesti aktiiviseksi nukleotiditrifosfaattimuodoksi aineenvaihdunnan aikana. AZT- tai ddC-hoito on sillä tavalla tehokkaampaa, sallien alhaisemmat annokset, vähemmän yleistä 15 myrkyllisyyttä, ja suurempaa voimaa tuotteliasta tartuntaa vastaan. Lisänukleosidianalogit, joiden nukleotiditrifos-faattimuodot esittävät valikoivuutta retroviruksen käänteis-transkriptaasille, mutta niitä ei fosforyloida solun nukleotidi- ja nukleotidikinaasien substraattierityisyyden 20 tuloksena, tehdään tehokkaammiksi. Tämän menetelmän selitys ilmaistaan esimerkissä 4.
Esimerkki 4. Vektorit, jotka on suunniteltu tehostamaan AZT:n ja analogien antivirusvaikutusta.
; , 25 : I. Kaikki seuraavat retrovirusvektorit perustuvat ”N2"- . vektoriin (katso Keeler et ai., Nature 318:149-154, 1985).
Siis 5' ja 3' Eco Rl LTR-kappaleet (2,8 ja 1,0 kb, * Ύ vastaavasti) kloonattiin alussa plasmideihin, jotka sisälsi- 30 vät polylinkkereitä (SK+ :aan, jolloin saatiin pN2R5Ä+/=A; pUC31:een, jolloin saatiin p31N2R5Ä+/-A ja p31N2R3Ä+/-A helpottamaan vektorin rakentamista). Yhdessä tapauksessa 1,2 kb Cla Ι/Eco Rl 5' LTR-kappale kloonattiin SK+-vektorin samoihin kohtiin, jolloin saatiin pN2C. Toisessa tapauksessa : 35 5' LTR, joka sisälsi splice-donorijakson 6 bp deleetion, * j * ;Y kloonattiin 1,8 kb Eco Rl-kappaleena pUC31:een (p31N25del- ' ‘ taÄ+A). HSV-l:n tymidiinikinaasigeenin koodaava alue ja transkription lopetussignaalit eristettiin 1,8 kb Bgl II/PvuII-kappaleena 322TK-plasmidista (HSVTK:n 3,5 kb Bam 40 Hl-kappale kloonattuna pBR322:n Bam Hl:een) ja kloonattiin 11347c 27
Bgl ΙΙ/Sma I-pilkottuun pUC31:een (pUCTK). Rakenteita varten, jotka vaativat terminaattorisignaalien häviämän, pUCTK pilkottiin Sma I:llä ja Bam Hiillä. Jäljelle jääneet koodaa-vat jaksot ja liimautuva Bam Hl -uloke muodostettiin uudel-5 leen kaksijuosteisen oligonukleotidin kanssa, joka oli tehty seuraavista oligomeereista: 5’ GAG AGA TGG GGG AGG CTA ACT GAG 3’ ja 5’ GAT CCT CAG TTA GCC TCC CCC ATC TCT C 3' muodostaen pTK delta A -rakenteen.
10
Diagnostisia tarkoituksia varten oligot suunniteltiin tuhoamaan Sma I -kohta kun taas säilyttämään sen Ava I -kohta muuttamatta transloitua proteiinia.
15 HIVin 0,6 kb promoottorijaksot kloonattiin Dra I/Hind II -kappaleena pCV-l:stä (katso Arya et ai., Science 229:69-73, 1985) Hinc II/Hind III -pilkottuun SK*:aan (SKHL).
A. TK-1- ja TK-3-retrovirusvektoreiden rakentaminen (katso 20 kuvio 6).
1. 5 kb Xho I/Hind III 5' LTR ja plasmidijaksot eristettiin p31N2R5(+):stä.
25 2. HSVTK-koodausjaksot, joilta puuttui transkription * '· lopetusjaksot, eristettiin 1,2 kb Xho Ι/Bam Hl -kappaleena pTKdeltaAista.
• I » t 3. 3' LTR-jaksot eristettiin 1,0 kb Bam Hl/Hind III-kap-30 paleena pN2R3(-):sta.
4. Vaiheiden 1-3 kappaleet sekoitettiin, liitettiin, transformoitiin bakteereihin, ja yksittäiset kloonit tunnistettiin restriktioentsyymianalyysin avulla (TK-1).
35 V 5. TK-3 rakennettiin linearisoimalla TK-1 Bam Hiillä, täyt tämällä 5'-uloke ja liittämällä tylppäpäinen 5’-täytetty Clal-kappale, joka sisälsi bakteerin lac UV5-promoottorin, , , SV40:n varhaisen alueen promoottorin, plus Tn 5in Neor- - > i ;,,, 40 geenin. Kanamysiinille vastustuskykyiset kloonit eristettiin 11347(: 28 ja yksittäisistä klooneista seulottiin restriktioentsyymianalyysin avulla ne, joissa geeni oli oikein päin.
5 Näitä rakenteita käytettiin infektiivisten yhdistelmävek-toreiden kehittämisessä yhdessä pakkaussolulinjan, kuten PA317:n, kanssa kuten on selitetty yllä.
Näiden retrovirusvektoreiden antaminen ihmisen T-soluille ja 10 makrofagi/monosyytti-solulinjoille voi lisätä niiden vastustuskykyä HIV:lie, kun läsnä on AZT:tä ja ddC:tä, verrattuna samoihin soluihin, joita ei ole käsitelty retrovirusvek-toreilla.
15 Retrovirusvektorituotteiden valmistus, konsentraatio ja säilytys olisi kuten on selitetty yllä. Hoito olisi kuten on aikaisemmin selitetty, mutta potilaiden solujen ex corpore - hoito tähtäisi infektoimattomia mahdollisesti alttiita T- soluja tai monosyyttejä varten. Suosittu menetelmä alttiin 20 solun pommittamiseksi on vektoreiden käyttäminen, joissa on HIV:n env tai hybridi-env (katso osa VIII Erityiset solulin- jaretrovirukset, alla), ohjaamaan vektoreiden adsorptiota CD4+-soluihin. Normaaleilla aikuisilla on noin 5 x 109 T4- solua kokonaisverimäärässään ja suunnilleen sama määrä ί ’ 25 monosyyttejä.
* : :’· Hoidon suosittu menetelmä olisi leukoforeesi, jolloin noin * * · • 20% yksilön PBL:stä voidaan poistaa milloin tahansa ja I 4 * * käsitellä niitä in vitro. Täten noin 2 x 109 solua » ' * » · ,·,* 30 käsiteltäisiin ja korvattaisiin. Koska nykyiset maksimitiit- < * terit ovat noin 10®/ml, tämä vaatisi 2:sta 20:een litraa aloitusvirussupernatanttia. Suoritettaisiin toistettuja käsittelyjä. Vaihtoehtoisesti käsiteltäisiin luuydin ja sallittaisiin monistaa vaikutus, kuten on selitetty yllä.
i « I
... 35 Hoito AZTillä olisi alemmilla tasoilla kuin normaalisti, jotta vältettäisiin myrkylliset sivuvaikutukset, mutta silti » » tehokkaasti estettäisiin HIV:n leviäminen. Hoidon kulku seuraisi kuten on selitetty estäjän suhteen.
40 Viidennen suoritusmuodon mukaan lievittävien estäjälääkkei- t < i» 11347ί 29 den tuotanto sisältää puutteellisesti häiritsevien viruksen rakenneproteiinien ilmenemisen, jotka estävät viruksen kokoamista. Vektorit koodaisivat puutteellista gag:a, pol:a, env:ä tai muita viruksen proteiineja tai peptidejä, ja nämä 5 estäisivät vallitsevalla tavalla viruksien kokoamisen. Tämä tapahtuu, koska viruksen normaalien alayksiköiden vuorovaikutusta häiritsee vuorovaikutus puutteellisten alayksiköiden kanssa.
10 Kuudes tällainen suoritusmuoto sisältää estävien peptidien ilmenemisen, jotka ovat erityisiä viruksen proteaasille. Viruksen proteaasi pilkkoo viruksen gag- ja gag/pol-proteii-nit lukuisiksi pienemmiksi peptideiksi. Tämän pilkkomisen epäonnistuminen johtaa kaikissa tapauksissa infektiivisten 15 retrovirusten tuotannon täydelliseen estämiseen. HIV- proteaasin tunnetaan olevan aspartyyliproteaasi, ja peptidien, jotka on tehty proteiinien tai analogien aminohapoista, tunnetaan estävän aspartyyliproteaaseja. HIV:tä estävät vektorit ilmentävät yhtä tai useaa tällaisien 20 peptidiestäjien fuusioituja kopioita.
Seitsemäs suoritusmuoto sisältää supressorigeenien toimituksen, jotka deletoituna tai ilmenemättöminä solutyypissä johtavat kasvaimien syntyyn tässä solutyypissä. Deletoidun 25 geenin käyttöön ottaminen uudelleen virusvektorin avulla johtaa näissä soluissa kasvainilmiasun paluuseen. Esimerkkeinä tällaisista syövistä ovat retinoblastooma ja Wilmsin kasvain. Koska pahanlaatuisuutta voidaan pitää solun ;;; loppuerilaistumisen estona verrattuna solun kasvuun, 30 retroviruksen toimituksen ja geenituotteiden ilmenemisen, ‘ mikä johtaa kasvaimen erilaistumiseen, pitäisi myös yleensä johtaa paluuseen.
Kahdeksannen suoritusmuodon mukaan retrovirusrakenne tarjoaa 35 hoidollisen vaikutuksen liittymällä virukseen, syöpägeeniin, tai tautia aiheuttavaan geeniin, sillä tavalla estäen • ; toimintaa, joka tarvitaan taudin syntyyn. Tämä suoritusmuoto vaatii retroviruksen liittymisen ohjaamisen erityispaikkaan ' ' genomissa homologisen rekombinaation avulla, integraasin 40 muuttelun, tai muita menetelmiä (selitetty alla).
30 H347f (ii) Ehdolliset myrkylliset lievittävät lääkkeet.
Toinen aloittamistapa tautia aiheuttavan vaikuttimen estämi-5 seksi on ilmentää lievittävää lääkettä, joka on myrkyllinen solulle, joka ilmentää tautia aiheuttavaa tilaa. Tässä tapauksessa lievittävän lääkkeen ilmenemistä provirusvek-torista pitäisi jonkun solun sisäisen signaalin rajoittaa, joka tunnistaa tautia aiheuttavan tilan, jotta vältettäisiin 10 tautia aiheuttamattomien solujen tuhoaminen. Tätä solutyyp-pierityisyyttä voidaan myös verrata tartunnan tasoon pommittamalla vektorin sisältävää yhdistelmäretrovirusta soluihin, joilla on tautia aiheuttava tila tai ne ovat alttiita sille.
15 Tämän menetelmän yhden suoritusmuodon mukaan yhdistelmäretroviruksella (mieluummin, mutta ei välttämättä, yhdistelmä-MLV-retroviruksella) on vektorirakenne, joka sisältää solumyrkyilleen geenin (kuten risiinin) ilmennettynä tapausspesifisestä promoottorista, kuten 20 solunjakautumiskierrosta riippuvaisesta promoottorista (esim. ihmissolun tymidiinikinaasin tai transferriiniresep-torin promoottorista), joka on aktiivinen transkription aikana vain nopeasti jakautuvissa soluissa, kuten kasvaimissa. Tällä tavalla provirusrakenteen tuottama solumyrkyllinen 25 vaikutin tuhoaa suosivasti nopeasti jakautuvia soluja, jotka sisältävät tekijöitä, jotka pystyvät aktivoimaan transkrip-: tion näistä promoottoreista.
,···, Toisen suoritusmuodon mukaan solumyrkyllistä vaikutinta V··' 30 tuottava geeni on tietylle kudokselle erityisen promoottorin valvonnan alaisuudessa, jolloin kudoserityisyys sopii yhteen kasvaimen alkuperän kanssa. Koska virusvektori suosivasti liittyy jakautuvien solujen genomiin (esimerkiksi normaalit maksasolut eivät jakaudu, kun taas hepatokarsinoomasolut 35 jakautuvat) , nämä kaksi erityisyystasoa (viruksen : : liittyminen/jakautuminen ja tietylle kudokselle erityinen transkription säätely) johtavat kasvainsolujen suosivaan tappamiseen. Lisäksi tapausspesifiset ja tietylle kudokselle , . erityiset promoottoriainekset voidaan keinotekoisesti yh- : _· 40 distää siten, että solumyrkyllistä geenituotetta ilmennetään 31 1 1347;:' vain solutyypeissä, jotka täyttävät molemmat tunnusmerkit (esim. yllä olevassa esimerkissä yhdistetyt promoottoriainekset ovat toimivia vain nopeasti jakautuvissa maksasoluissa). Transkription valvonta-aineksia voidaan myös 5 monistaa, jotta lisättäisiin solutyyppierityisyyden vakuuttavuutta. Näiden transkription promoottori/tehostaja-ainek-sien ei välttämättä tarvitse olla sisäisenä promoottorina (viruksen LTR:ien välissä) vaan ne voidaan lisätä tai transkription valvonta-ainekset voidaan korvata viruksen 10 LTRiissä, jotka ovat itse transkription promoottoreja, siten, että tietylle tilalle erityinen transkription ilmeneminen tapahtuu heti muutetusta viruksen LTRistä. Tässä tapauksessa joko tarvitsee matkia maksimi-ilmenemistilaa retrovirusta pakkaavissa solulinjoissa (esim. muuttamalla 15 kasvuolosuhteita, järjestämällä tarpeelliset ilmenemisen transsäätelijät tai käyttämällä sopivaa solulinjaa pakkaus-linjan kantalinjana), tai LTR-muuttelu rajoittuu 3' LTR:n U3-alueeseen, jotta saadaan maksimaaliset yhdistelmävirus-tiitterit. Jälkimmäisessä tapauksessa yhden tartunta/liit-20 tyminen-kierroksen jälkeen 3' LTR U3 on nyt myös 5' LTR U3 antaen halutun tietylle kudokselle erityisen ilmenemisen.
Kolmannen suoritusmuodon mukaan provirusvektorirakenne : '.· aktivoidaan samalla tavoin, mutta se ilmentää proteiinia, 25 joka ei ole itse solumyrkyllinen, ja joka jalostaa . _ kohdesoluissa myrkylliseksi yhdisteen tai lääkkeen, joka on vähän tai ei lainkaan solumyrkyllinen ("ehdollisesti kuolet-,···, tava" geenituote) . Erityisesti provirusvektorirakenteessa on , ! herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasigeeni ("HSVTK") 3'- 30 suuntaan ja se on HIV:n promoottorin (jonka tunnetaan olevan hiljainen transkription aikana, paitsi kun HIV:n tat-proteiini aktivoi sen) valvonnan alaisuudessa transkription aikana. HIV:n infektoimissa ihmissoluissa, joissa on provirusvektorirakenne, tat-geenituotteen ilmeneminen : : 35 aiheuttaa lisääntynyttä HSVTK:n tuotantoa. Solut (joko in vitro tai in vivo) sitten asetetaan alttiiksi lääkkeelle kuten acyclovir:lie tai sen analogeille (FIAU, FIAC, DHPG).
. . HSVTK:n (muttei solun tymidiinikinaasin) tunnetaan fosforyloivan näitä lääkkeitä niiden vastaaviksi aktiivisik-40 si nukleotiditrifosfaattimuodoiksi (katso esimerkiksi 32 113476
Schaeffer et al., Nature 272:583, 1978). Acyclovir- ja FIAU-trifosfaatit estävät solun polymeraaseja yleensä, mikä johtaa HSVTKrta ilmentävien solujen erityiseen tuhoamiseen siirtogeenisissä hiirissä (katso Borrelli et ai., Proc.
5 Natl. Acad. Sei. USA 8J5:7572, 1988). Nämä solut, jotka sisältävät yhdistelmävektorin ja ilmentävät HIV:n tat-prote-iinia, tapetaan valikoivasti näiden lääkkeiden erityisillä annoksilla. Lisäksi saadaan aikaan ylimääräinen erityisyys-taso sisällyttämällä vektoriin HIV:n rev-proteiini, herkästi 10 reagoivat CRS/CAR-jaksot. Kun CRS-jakso on läsnä, geenin ilmeneminen lopetetaan, paitsi kun läsnä ovat CAR-jaksot ja rev-proteiini. Esimerkki 5 tarjoaa esimerkin tästä tekniikasta.
15 Esimerkki 5. Vektori, joka ehdollisesti mahdollistaa ACV:n tai sen analogien myrkyllisen toiminnan.
Vektoreiden rakentaminen.
20 A. pKTVIHAXrn rakentaminen (katso kuvio 7).
1. 9,2 kb Asu II/Xho I -kappale eristettiin pN2-vektorin DNA:sta.
25 2. 0,6 kb Xho Ι/Bam Hl -promoottorikappale eristettiin , ,·. pSKHL-plasmidista.
. I * 3. 0,3 kb Bgl II/Acc I- ja 1,5 kb Acc I/Acc I -kappale , ; puhdistettiin pUCTK:sta.
* 30 4. Kappaleet vaiheista 1, 2 ja 3 liitettiin, transformoitiin bakteereihin, ja sopivat Ampr-kloonit, joilla oli annettu rakenne, tunnistettiin restriktioentsyymianalyysin avulla.
* · · i i i 35 B. pKTVIH-5- ja pKTVIH5 Neo -retrovirusvektoreiden raken-' * taminen (katso kuvio 8).
1. 4,5 kb 5’ LTR ja vektori eristettiin Xho Ι/Bam Hl -kappaleena p31N25delta(+)-vektorista.
40 33 1 13 4 7 f- 2. 1,0 kb 3' LTR eristettiin Apa Ι/Bam Hl -kappaleena pN2R3(+)-kappaleesta.
3. 0,6 kb HIV-promoottoriaines eristettiin pSKHL:sta 5 Apa Ι/Eco Rl-kappaleena.
4. HSVTK-koodausjakso ja transkription lopetusjaksot eristettiin 1,8 kb Eco Rl/Sal I-kappaleena pUCTK:sta.
10 5. Kappaleet vaiheista 1-4 yhdistettiin, liitettiin, trans formoitiin bakteereihin, ja kloonit, joilla oli annettu rakenne, tunnistettiin restriktioentsyymianalyysin avulla (pKTVIH-5).
15 6. pKTVIH5 Neo rakennettiin linearisoimalla pKTVIH5 Cla 1:11a; sekoittamalla 1,8 kb Cla I-kappaleen kanssa, joka sisälsi bakteerin lac UV5 -promoottorin, SV40:n varhaisen alueen promoottorin, ja Tn5:n Neor-merkitsijän, liittämällä, transformoimalla bakteereihin ja valitsemalla kanamysiinille 20 vastustuskykyiset. Kloonit, joiden insertti oli osoitetussa orientaatiossa, tunnistettiin restriktioanalyysin avulla.
C. MHMTK Neo -retrovirusvektorin rakentaminen (katso kuvio 9) .
25 1. MHM-l-välivaiheplasmidin rakentaminen: i a) pN2CR5-plasmidi linearisoitiin pilkkomalla osittain Fok ; I:llä, 5'-uloke täytettiin deoksinukleotiditrifosfaateilla 30 käyttämällä Klenow DNA -polymeraasia, ja Hind III -liittäjät liitettiin. Bakteereihin transformoimisen jälkeen klooni, jonka MLV LTR Fok I -kohtaan oli liittynyt Hind III -liit-täjä, tunnistettiin restriktioentsyymianalyysin avulla ·«’’’ (pN2CR5FH) .
: Y 35 b) pN2CR5FH linearisoitiin Nhe I:llä, 5'-uloke täytettiin Klenow-polymeraasilla, pilkottiin Hind III:lla ja 4,3 kb } I ♦ · , kappale, joiden MLV-jaksoissa ei ollut promoottoria, eris- f t » it tettiin.
40 11347r 34 c) 0,5 kb Eco RV/Hind III HIV-promoottorijaksot eristettiin pSKHL:sta.
d) b ja c sekoitettiin, liitettiin, käytettiin bakteereiden 5 transformoimiseen, ja MHM-l:n rakenne varmistettiin restrik- tioentsyymianalyysin avulla.
2. 0,7 kb Eco RV/Bal I -kappale, joka eristettiin MHM-l:stä, kloonattiin I30B~plasmidin Eco RV-kohtaan (muutettu IBI30-10 plasmidi, joka sisältää Bgl II-, Bst II-, Neo I- ja Nde I -lisäkohdat polylinkkerissä). Bakteereihin transformoimisen jälkeen tunnistettiin restriktioentsyymianalyysin avulla kloonit (pMHMB), joissa kappale oli oikein päin.
15 3. pMHMB pilkottiin Apa I:llä ja Xho I:llä ja puhdistettiin geelissä.
4. MHM-1 pilkottiin Apa Ι/Bam Hiillä ja 1,8 kb MHMLTR/leader-jakso puhdistettiin geelissä.
20 5. 2,8 kb Bgl II/Sal I-kappale, joka sisälsi HSVTK-koodausalueen 3'-suuntaan SV40:n varhaisen alueen promoottorista, joka panee Neor:n ilmenemisen liikkeelle, joka oli ·.. otettu pTK-3:sta (katso kuvio 3).
:* 25 6. Vaiheiden 3-5 kappaleet sekoitettiin, liitettiin, käytet- ' * tiin bakteereiden transformoimiseen, ja sopivat kloonit i ! tunnistettiin restriktioentsyymianalyysin avulla.
30 D. Tat- ja anti-tat-ilmenemisvektoreiden rakentaminen (katso kuvio 10).
Näitä vektoreita käytetään vale-HIV:nä koeaktivoimaan : ’ tatista riippuvaisia HSVTK-vektoreita.
;Y 35 1. Hisr pBamHis -ilmenemisvektori linearisoitiin Bam Hiillä ja käsiteltiin vasikan suoliston fosfataasilla.
I t « t $ t 2. pCV-lin Sac I -kohta mutagenisoitiin Bam Hl-kohdaksi ja 40 HIV-tatin 350 bp Bam Hl-koodausalue eristettiin.
' I · 11347f 35 3. Vaiheissa 1 ja 2 puhdistetut kappaleet sekoitettiin, liitettiin, käytettiin bakteereiden transformoimisessa, ja kloonit, joissa tat oli molemmissa orientaatioissa, tunnis-5 tettiin restriktioentsyymianalyysin avulla.
Näitä rakenteita käytettiin infektiivisten yhdistelmävek-toreiden kehittämisessä yhdessä pakkaussolulinjän, kuten PA317:n, kanssa kuten on selitetty yllä.
10 Näiden retrovirusvektoreiden biologiset ominaisuudet selitetään alempana. HIV:n tat-geeni ("tathis"-vektori - - katso kuvio 10) transfektoitiin hiiren PA317-soluihin. Saatiin viisi yksittäistä histidinolille vastustuskykyistä HIV:n 15 tat:a ilmentävää kloonia (TH 1-5). Nämä solut ovat täten kokeellinen malli HIV-tartunnalle. KTVIHAX-, KTVIH5NE0- ja MHMTKNEO-vektorit vietiin myöhemmin infektoimalla näiden tat:a ilmentävien solulinjojen sisään yhtä hyvin kuin niiden kantasolulinjän sisään, jolta puuttui tat. Sitten solujen 20 elinkykyisyys määritettiin HSVTK:lle erityisen solumyrkyl-lisen lääkkeen, acyclovir:n, eri konsentraatioilla. Tiedot ilmoitetaan tässä LD50:nä (lääkekonsentraatio, jolla havaitaan 50% myrkyllisyys). Kantasolulinja, joka sisälsi vektorin, muttei tat:a (infektoimaton HIV-malli) ei osoit-·· 25 tanut selville saatavaa myrkyllisyyttä ACV:llä testatuilla \ konsentraatioilla (katso kuvio 11). Nämä solut täten vaati- vat 100 μΜ ACV:tä tai enemmän myrkyllisyyttä varten. Tämä on totta myös näille soluille, joilta puuttuvat vektorit. Täten vektorit yksin, ACV yksin, tai jopa vektori + ACV (täydet 30 laatikot) eivät ole solumyrkyllisiä. Kuitenkin ACV tappaa tehokkaasti solulinjat, jotka ilmentävät HIV:n tat:a (HIV-tartunnan kokeellinen esittäminen). Tämä on totta kaikille kolmelle testatulle vektorille vaihtelevissa asteissa. Nämä • tiedot osoittavat, että HIV:n infektoimat solut tapetaan :Y 35 ACV:n ja "mahdollistajavektoreiden" läsnä ollessa.
, Samalla tavoin ihmisen T-solulinjojen HIV-tartunta +/- FIAU
osoitti HIV-tartunnan suosivaa estämistä (tappamalla : : soluja). Ensin viljelmiä käsiteltiin vektorilla, sitten 40 haastettiin alhaisen moninaisuuden HIV-infektiolla 4 päivän 11347 36 ajan. Virussupernatantit titrattiin käyttämällä HIV:tä, kuten on selitetty osassa IV.
HIV-infektoitujen solujen tapauksessa ehdollisesti kuolet-5 tavan HSVTK-geenin ilmeneminen tehtiin jopa HIV-spesifisem-mäksi sisällyttämällä cis-toimivia aineksia transkriptiin ("CRS/CAR"), joka vaatii HIV:n lisägeenituotteen, rev:n, optimaalista aktiivisuutta varten (Rosen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85.:2071, 1988). Yleisemmin mRNA:issa olevien 10 cis-aineksien on osoitettu joissakin tapauksissa säätelevän mRNA:n pysyvyyttä tai transloitavuutta. Tämän tyyppisiä jaksoja (se on geenin ilmenemisen transkription jälkeinen säätely) voidaan käyttää vektorin geenin ilmenemisen tapaus- tai kudosspesifiseen säätelyyn. Lisäksi näiden 15 jaksojen multimerisaatio (se on rev-herkät "CRS/CAR"- tai tat-herkät "TAR"-ainekset HIV:tä varten) voisivat johtaa jopa suurempaan erityisyyteen. Pitäisi kiinnittää huomiota, että tämän kaltaisen toimimattoman esiasteen ehdollinen aktivaatio toimivaksi tuotteeksi soluissa voidaan myös saada 20 aikaan käyttämällä muita virusvektoreita, joilla on lyhyemmän ajan vaikutus, esim. adenovirusvektoreita.
Vektorituotteiden tuotanto, konsentraatio ja säilytys on kuten on aikaisemmin selitetty. Hoito on suoraa in vivo -··· 25 hoitoa kuten aikaisemmin tai PBL:n ja/tai luuytimen ex . .·. corpore -hoitoa. Annokset ovat suunnilleen samoilla tasoilla kuin esimerkissä 4. Virusvektoritartunnan pommittaminen ei ole CD4-reseptorin kautta, vaan voidaan suorittaa tekemällä vektoreita hybridi-MLVenv-CD4-"vaippa"-proteiinien kanssa ·* * 30 (katso osa VII) pommittamaan gp 120:ä ilmentäviä soluja (se on HlVrllä infektoituja soluja). Tätä normaalin virus-resep-tori-vuorovaikutuksen päinvastaista järjestystä pommittamaan virusten infektoimia soluja voidaan käyttää kaiken tyyp-: pisillä viruksilla.
35 ' Samalla tavalla kuin edellisessä suoritusmuodossa, retrovirusvektorirakenteessa voi olla geeni fosforylaatiota, ' fosforibosylaatiota, ribosylaatiota, tai puriini- tai pyrimidiinipohjäisen lääkkeen muuta aineenvaihduntaa varten.
; 40 Tällä geenillä ei ehkä ole vastiketta nisäkässoluissa ja se 37 1 1347;· voi olla peräisin eliöstä kuten viruksesta, bakteerista, sienestä tai alkueläimestä. Esimerkki tästä olisi E. colin guaniinifosforibosyylitransferaasi-geenituote, joka on kuolettava tioksantiinin läsnäollessa (katso Besnard et ai., 5 Mol. Cell. Biol. 7:4139-4141, 1987). Tämän tyyppisillä ehdollisesti kuolettavilla geenituotteilla on mahdollinen sovellutus moniin nykyään tunnettuihin puriini- tai pyrimidiinipohjäisiin antisyöpälääkkeisiin, jotka usein vaativat solun sisäisen ribosylaation tai fosforylaation, 10 jotta ne tulisivat tehokkaiksi solumyrkyllisiksi vaikut-timiksi. Ehdollisesti kuolettava geenituote voisi myös aineenvaihdunnan aikana muuttaa lääkkeen, joka ei ole myrkyllinen eikä puriini- tai pyrimidiinianalogi, myrkylliseen muotoon.
15
Nisäkkäiden viruksilla on yleensä taipumus omistaa "hyvin varhaisen alueen" geenejä, jotka ovat välttämättömiä myöhemmälle transkription aktivaatiolle muista viruspromoottoriai-neksista. Tämän laatuiset geenituotteet ovat erinomaisia 20 ehdokkaita virustartunnan solun sisäisiä signaaleja (tai "tunnistusvaikuttimia") varten. Täten ehdollisesti kuolettavat geenit transkription promoottoriaineksista, jotka reagoivat herkästi näille viruksen "hyvin varhaisen alueen" | '·· geenituotteille, voisivat erityisesti tappaa millä tahansa ;· 25 tietyllä viruksella infektoituja soluja. Lisäksi, koska : ihmisen a- ja 3~interferonin promoottoriaineksien transkrip- tio aktivoidaan vuorovaikutuksessa tartunnalle, jonka ovat ··, saaneet aikaan suuri määrä eri kuulumattomia viruksia, ehdollisesti kuolettavaa geenituotetta, kuten HSVTK:ta, 30 esimerkiksi näistä virukselle herkästi reagoivista aineksista (VRE), ilmentävien vektoreiden käyttöön ottaminen voisi johtaa suurella määrällä eri viruksia infektoitujen solujen tuhoamiseen.
35 Neljännen suoritusmuodon mukaan yhdistelmäretroviruksella on geeni, joka määrää tarkoin tuotteen, joka ei ole itse . myrkyllinen, mutta kun virukselle tai muulle taudinaiheut- , , tajalle erityinen proteaasi jalostaa sitä, se muuttuu ,, myrkylliseen muotoon.
40 38 1154 7 c
Viidennen suoritusmuodon mukaan retrovirusrakenne saattaa ilmentää "selostavaa tuotetta" kohdesolujen pinnalla vuorovaikutuksessa soluissa olevalle tunnistusvaikuttimelle (kuten HIV:n tat-proteiinille). Tämän pintaproteiinin voi 5 tunnistaa solumyrkyllinen vaikutin, kuten vasta-aineet selostavalle proteiinille tai solumyrkylliset T-solut. Samalla tavalla tällaista järjestelmää voidaan käyttää paljastamisjärjestelmänä (katso alla) yksinkertaisesti tunnistamaan ne solut, joilla on tietty geeni, joka ilmentää 10 tunnistusproteiinia, kuten HIV:n tat-geeni.
Samalla tavoin kuudennen suoritusmuodon mukaan voitaisiin ilmentää pintaproteiinia, joka olisi itse hoidollisesti hyödyllinen. HIV:n erityistapauksessa ihmisen CD4-proteiinin 15 ilmeneminen HIV:n infektoimissa soluissa saattaa olla hyödyllinen kahdella tavalla: 1. CD4:n sitoutuminen HIV:n env:iin solun sisäisesti voisi estää elinkykyisten virusten muodostumista yhtä paljon kuin 20 liukoisen CD4:n on osoitettu tekevän vapaalle virukselle, mutta ilman systemaattisen raivaamisen ja mahdollisen im-munogeenisyyden ongelmaa, koska proteiini jää kalvoon sitoutuneeksi ja on rakenteellisesti sama kuin sisäsyntyinen CD4 (jota potilaan pitäisi immunologisesti sietää).
•I 25 2. Koska CD4/HIV env -yhdistelmä tuotetaan solukuoleman seurauksena, CD4:n lisäilmeneminen (kun HIV:n infektoimissa i soluissa on ylimäärä HIV:n env:ä) johtaa nopeampaan solukuo- ! lemaan ja täten estää viruksen levittämistä. Tämä saattaa 30 olla erityisesti sovellettavissa monosyytteihin ja makrofageihin, jotka toimivat virustuotannon varastona niiden suhteellisen HIV:n indusoiman solumyrkyllisyyden taittokykyisyyden tuloksena (joka puolestaan ilmeisesti johtuu CD4:n suhteellisesta puutteesta niiden solupinnoil-:Y 35 la).
(iii) Immuniteetin laskusäätely.
Sopimattoman tai epämieluisan immuunivasteen erityinen 40 laskusäätely, kuten kroonisessa maksatulehduksessa tai 113 4 7 ir 39 heterologisen kudoksen, kuten luuytimen, siirrossa, voidaan saada aikaan käyttämällä anti-MHC-luokan I geenejä, kuten immuniteettia tukahduttavia viruksen geenejä. C-ryhmän Ad2-ja Ad5-adenoviruksilla on 19 kd glykoproteiini (gp 19), jota 5 koodataan viruksen E3-alueella. Tämä gp 19 -molekyyli sitoutuu luokan I MHC-molekyyleihin solulimakalvostoissa ja estää luokan I MHC:n terminaalisen glykosylaation ja translaation solupinnalle. Esimerkiksi ennen luuydinsiirtoa luovuttajaluuydinsolut voidaan infektoida gp 19:ä koodaavil-10 la vektorirakenteilla, jotka gp 19:n ilmennyttyä estävät MHC-luokan I kudossiirtoantigeenien pintailmenemistä. Nämä luovuttajasolut voidaan siirtää siten, että siirrännäisen hylkimisriski on alhainen ja että vaaditaan pienimmät mahdolliset immuniteettia tukahduttavat hoito-ohjeet kudossiir-15 topotilaalle. Tämä saattaa sallia hyväksyttävän kimeerisen luovuttaja-vastaanottajatilan vähemmillä lisätaudeilla. Samanlaisia hoitoja voidaan käyttää niin kutsuttujen autoimmuunisairauksien kirjon hoidossa, mukaan lukien lupus erytromiatis, multippeli skleroosi, nivelreuma tai krooninen 20 hepatiitti B -infektio.
IV Merkitsijöiden ilmeneminen.
Yllä selitettyä tekniikkaa lievittävän lääkkeen 25 ilmentämiseksi solussa vuorovaikutuksessa johonkin tunnis-tusvaikuttimeen voidaan myös muuttaa tekemään mahdolliseksi ! tietyn geenin selville saaminen solussa, joka ilmentää tunnistusproteiinia (esimerkiksi tietyssä viruksessa olevan geenin), ja siten tekee mahdolliseksi solujen selville 30 saamisen, joissa on tämä virus. Lisäksi tämä tekniikka tekee mahdolliseksi virusten (kuten HIV:n) selville saamisen kliinisessä näytteessä, joka on soluista, joilla on tunnis-tusproteiini liittyneenä viruksen kanssa.
35 Tämä muuttelu voidaan toteuttaa käyttämällä genomia, joka » » koodaa tuotetta, jonka läsnäolo voidaan helposti tunnistaa ("merkitsijätuote"), ja jossa on promoottori, joka reagoi * · indikaattorisoluissa olevaan tunnistusproteiiniin, vaih tamalla selostavan tuotteen ilmenemistä ilmenevän ja il-40 menemättömän tilan välillä. Esimerkiksi kun HIV infektoi 11347' 40 sopivia indikaattorisoluja, se tekee tat:a ja rev:ä. In-dikaattorisolut voidaan täten varustaa genomilla (infektoimalla sopivalla yhdistelmäretroviruksella), joka koodaa merkitsijägeeniä, kuten alkaalinen fosfataasi -geeniä, β-5 galaktosidaasi-geeniä tai luciferaasi-geeniä, ja promoottorilla, kuten HIV:n promoottorilla, joka valvoo merkit-sijägeenin ilmenemistä. Kun indikaattorisolut asetetaan alttiiksi testattavalle kliiniselle näytteelle, ja näyte sisältää HIV:tä, HIV infektoi indikaattorisolut, mikä johtaa 10 tatin ja/tai revin ilmenemiseen (tunnistusproteiini). HIV-ilmenemiskontrollit indikaattorisoluissa sitten reagoisivat tat- ja/tai rev-proteiinille vaihtamalla normaalisti il-menemättömät β-galaktosidaasia, luciferaasia, tai alkaalista fosfataasia (merkitsijätuotteet) koodaavat geenit ilmenevik-15 si. β-galaktosidaasin tai alkaalisen fosfataasin tapauksessa solujen asettaminen alttiiksi substraattianalogeille johtaa värin tai fluoresenssin muutokseen, jos näyte on HIV-positiivinen. Luciferaasin tapauksessa näytteen asettaminen alttiiksi luciferiinille johtaa luminesenssiin, jos näyte on 20 HIV-positiivinen. Solunsisäisille entsyymeille, kuten β-galaktosidaasille, voidaan mitata heti virustiitteri mittaamalla värjätyt tai fluoresoidut solut, tai tekemällä : solu-uutteet ja suorittamalla sopiva koe. Eritettyjen •|· entsyymien, kuten alkaalisen fosfataasin muutetun muodon, . .·. 25 ollessa kyseessä, viljelmäsupernatantin pienten näytteiden aktiivisuus määritetään, mikä sallii yhden viljelmän jat-.! kuvan tarkkailun ajan suhteen. Täten tämän merkitsijäjärjesti telmän eri muotoja voidaan käyttää eri tarkoituksiin. Näihin kuuluvat aktiivisen viruksen laskeminen tai viruksen vil-30 jelmässä leviämisen herkkä ja yksinkertainen mittaaminen ja tämän leviämisen estäminen eri lääkkeillä.
: : Lisäerityisyys voidaan liittää edelliseen järjestelmään :testaamalla viruksen olemassaolo joko neutralisoivilla ' *. 35 virusvasta-aineilla tai ilman niitä. Esimerkiksi testat tavan kliinisen näytteen yhdessä osassa voi olla neutralisoivia HIV-vasta-aineita; kun taas toisessa osassa ei olisi neutralisoivia vasta-aineita. Jos testit olisivat negatiivisia järjestelmässä, jossa olisi vasta-aineita ja 40 positiivisia, kun ei ole vasta-aineita, tämä auttaisi HIVin 4i 1 1347··' olemassaolon varmistamisessa.
In vitro -kokeelle analogisen järjestelmän mukaan tietyn geenin olemassaolo, kuten viruksen geenin, voidaan määrittää 5 solunäytteessä. Tässä tapauksessa näytteen solut infektoidaan sopivalla retrovirusvektorilla, jolla on selos-tajageeni liittyneenä mielenkiinnon kohteena olevan viruksen ilmenemisvalvojiin. Sen jälkeen, kun selostajageeni on päässyt näytesolujen sisään, se ilmentää sen selostavaa 10 tuotetta (kuten β-galaktosidaasia tai luciferaasia) vain, jos isäntäsolu ilmentää sopivia viruksen proteiineja.
Nämä kokeet ovat nopeampia ja herkempiä, koska selostajageeni voi ilmentää suurempia määriä 15 selostajatuotetta kuin tunnistusvaikutin, mikä johtaa vaikutuksen vahvistumiseen. Esimerkki 6 selittää edustavaa tekniikkaa geenin selville saamiseksi, joka ilmentää tunnis-tusproteiinia.
20 Esimerkki 6. HIV:lie erityinen merkitsijäjärjestelmä tai koe.
: ’·· A. Rakenteet.
: 25 HIV:n ilmenemisjärjestelmän valvonnan alaisuudessa olevat selostajarakenteet esitetään kuviossa 12 (yhdistelmäretrovi-, ·. rusvektori) ja kuviossa 13 (transfektiossa käytetty yksinkertainen plasmidi). Näiden suosittujen vektori- ja plasmidiselostajien osat saatiin seuraavasti: 30
Retrovirusrunko saatiin pAFVXM-rakenteesta (Krieger et ai., Cell 38^:384, 1984), joka oli suoristettu käyttämällä XhoI:tä ja Clal:tä. SV2neo saatiin pKoneo-plasmidista (Hanahen, julkaisematon) eristämällä 1,8 kb Clal-kappale.
35 . HIV:n LTR eristettiin 0,7 kb Hind ΙΙΙ-kappaleena pC15CAT- ,. plasmidista (Arya et ai., Science 229:69, 1985). Beeta-gal saatiin pSP65 β-gal -plasmidista (Cepko, henkilökohtaisesti) .: Hind III -Sma I -kappaleena. Ihmisen alkaalisen fosfataasin 40 eritettävä muoto tuotettiin ottamalla käyttöön yleispätevä 42 1 1347c lopetussignaali alkaalisen fosfataasin solupintamuodon 489-aminohapon jälkeen (kuten Berger ym. ovat selittäneet Gene 66.:1, 1988). Eritettävää alkaalista fosfataasia koodaava geeni eristettiin 1,8 kb Hind III:sta Kpn I:een kappaleena.
5 HIV:n envtn CRS-CAR-jaksot saatiin eristämällä 2,1 kb Kpn I:stä Bam Hl:een kappaleena HTLVIIIB/BH10R3:sta (Fisher et ai., Science 233:655, 1986). Tämä kappale liitettiin Bam HI:llä suoristettuun pUC31:een, ja Kpn I pUC31 on pUC19 (Yanisch-Perron et ai., Gene 33.:103, 1985), jolla on ylimää-10 räiset Xho I-, Bgl II-, Bssh II- ja Neo I-kohdat pUC19:n Eco Rl- ja Kpn I -kohtien välissä. Tulokseksi saadun rakenteen Bam Hl-kohta muutettiin Neo I -kohdaksi, jotta sallittaisiin CRS-CAR-jaksojen pilkkominen Neo I:llä. SV40:n t-introni saatiin pSV0L:stä 0,8 kb Neo I:stä Bam Hl:een kappaleena.
15 B. Indikaattorisolut ja retrovirusvektorit.
Ihmisen T-solu- (H-9, CEM ja Sup Tl) ja monosyytti (U-937)-solulinjat saatiin ATCC:stä, ja ylläpidettiin RPM1 1640 -20 elatusaineessa täydennettynä 10 % härän alkion seerumilla ja 1% penisilliinillä/strepomysiinillä.
Vektorit, jotka eivät olleet retroviruksia, vietiin solulin-·: jojen sisään elektroporaation avulla käyttämällä Bio-Rad , 25 Gene Pulser:a. Solulinjat valittiin G-418:ssa (1 mg/ml) 2-3 viikkoa, jotta saataisiin pysyvät G-418r-solulinjat, ja !!! sitten laimennos kloonattiin, jotta saataisiin solulin jakloonit.
30 pAF-vektorit transfektoitiin PA 317 -pakkaussolulinjaan kalsiumfosfaattisakkana (Wigler et ai.. Cell 16:777, 1979). Virusta tuottavia PA 317 -soluja viljeltiin yhdessä ihmisen : · monosyyttilinjojen kanssa 24 tuntia polybreenin läsnäolles- sa, minkä jälkeen suspensiosolut poistettiin ja valittiin G-' ; 35 418:ssa ja kloonattiin kuten yllä.
C. Koe.
: Pysyvät solulinjat infektoitiin HIV:llä (HTLVIIIb) ja solut 40 (β-gal) tai elatusaineet (alkaalinen fosfataasi) määritet- 11347' 43 tiin päivittäin 6 päivän ajan tartunnan jälkeen. β-galaktosidaasikoe.
5 Infektoidut solut voitaisiin määrittää joko: (i) In situ kudoskemiallisella värjäyksellä, kuten MacGregor ym. ovat selittäneet Somatic Cell and Mol. Genetics 13:253, 1987); tai (ii) käyttämällä entsymaattista liuoskoetta ONPG:n ollessa substraattina (Norton ja Coffin, Mol. Cel.
10 Biol. 5:281, 1985).
Alkaalinen fosfataasi -liuoskoe.
Elatusaineesta poistettiin infektoidut solut, elatusainetta 15 sentrifugoitiin 10 sekunttia, ja sitten kuumennettiin 68°C:een 10 minuutiksi sisäsyntyisten fosfataasien tuhoamiseksi. Sitten elatusainetta sentrifugoitiin 2 minuuttia ja poistettiin erä (10-50 μΐ) koetta varten. 100 μΐ puskuria (IM dietanolamiini, pH 9,8; 0,5 mM MgCl2; 10 mM L-20 homoarginiini) lisättiin ja sitten 20 μΐ 120 mM p- nitrofenyylifosfaattia (puskureissa) lisättiin. Reaktioseok-sen A4os:a valvottiin käyttämällä automaattista maljojen lukijaa.
25 Kuviot 14 ja 15 kuvaavat Sup Tl-solujen tartunnan ajan kulun ;· tyypillisiä tuloksia alkaalinen fosfataasi -koetta käyt- tämällä antiviruslääkkeiden vaihtelevien konsentraatioiden läsnäollessa. "+" ja 6 päivänä osoittavat solujen yh teensulautumisen tai sen puuttumisen.
30 Tämä keksintö käyttää lukuisia muita tekniikoita (selitetty alla), joita voidaan käyttää retrovirusvektorijärjestelmien kanssa, joita on käytetty yllä, lisäämään niiden suoritusta. Vaihtoehtoisesti näitä tekniikoita voidaan käyttää muiden 35 geenin toimitusjärjestelmien kanssa.
V. Pakkaussoluvalinta.
Tämän keksinnön tämä näkökohta perustuu osittain pakkaus-40 solujen alhaisten yhdistelmävirustiittereiden pääsyiden 11347.': 44 löytymiseen, ja tekniikoiden, joilla korjataan näitä syitä. Pohjimmiltaan voidaan ainakin viisi tekijää väittää alhaisten yhdistelmävirustiittereiden aiheuttajiksi: 5 1. viruksen pakkausproteiinien rajoitettu saatavuus; 2. retrovirusvektorin RNA-genomeiden rajoitettu saatavuus; 3. solukalvon rajoitettu kelpoisuus yhdistelmäretrovirusten 10 silmikoitumista varten; 4. retrovirusvektorin genomin rajoitettu luontainen pakkaus-tehokkuus; ja 15 5. annetun retroviruksen vaipalle erityisen reseptorin tiheys.
Kuten yllä on kiinnitetty huomiota, viruksen pakkausproteiinien rajoitettu tarjonaolo on ensimmäinen rajoittava tekijä 20 yhdistelmäretroviruksen tuotannossa pakkaussoluista. Kun pakkausproteiinin taso pakkaussoluissa kasvaa, tiitteri kasvaa noin 10s infektiiviseen yksikköön millilitrassa, : ·.. minkä jälkeen kasvavalla pakkausproteiinin tasolla ei ole • mitään lisävaikutusta tiittereihin. Kuitenkin tiittereitä . 25 voidaan edelleen lisätä myös lisäämällä pakkausta varten saatavilla olevan retrovirusvektorin genomin tasoa. Täten, - kuten tässä on selitetty, on hyödyllistä valita pakkaus- solut, jotka valmistavat pakkausproteiinien ja retroviruksen genomien enimmäistasoja. On saatu selville, että tunnistus-30 menetelmillä, ja täten pakkaussolujen ja tuottajasolujen valitsemisella, mitä on aikaisemmin selitetty osassa, joka kertoo keksinnön taustasta, on taipumus johtaa monien tuotta jasolujen valintaan, jotka tuottavat alhaisia tiittereitä syiden vuoksi, jotka on selitetty alla.
; ' 35 Tämä keksintö käyttää hyväkseen aikaisemmin haitallista tosiasiaa, että geenin, joka on 3’-suuntaan 5’ LTR:stä tai muusta promoottorista, ja tämän promoottorin ja geenin välissä on toinen geeni, proteiinin ilmenemistaso on olen-40 naisilta osiltaan pienempi kuin, jos välissä olevaa geeniä 11347c 45 ei olisi. Tässä keksinnössä valikoitava geeni on sijoitettu 3'-suuntaan pakkausgenomin geenistä tai vektorirakenteessa olevasta mielenkiinnon kohteena olevasta geenistä, mutta sitä yhä transkriboidaan viruksen 5' LTR:n tai muun promoot-5 torin valvonnan alaisuudessa ilman mitään splice donor - tai splice acceptor -kohtia. Tämä toteuttaa kaksi asiaa. Ensiksi, koska pakkausgeenit tai mielenkiinnon kohteena olevat geenit ovat nyt 5'-suuntaan ja niiden ja promoottorin välissä ei ole mitään geeniä, niiden vastaavia proteiineja 10 {pakkausproteiinia tai mielenkiinnon kohteena olevaa proteiinia) ilmennetään korkeammalla tasolla (5-20-kertaisesti) kuin valikoitavaa proteiinia. Toiseksi valikoitavaa proteiinia ilmennetään keskimäärin alemmalla tasolla, jolloin ilmenemistason jakauma siirtyy kohti alempia tasoja. 15 Fleor-proteiinin tapauksessa tätä muutosta jakaumassa valaistaan katkoviivalla, joka osoitetaan kuviossa 16. Kuitenkin valintataso fleomysiini-vastustuskykyä varten jää samaksi siten, että vain yläpään ilmenevät solut jäävät henkiin. Pakkausproteiinin tai mielenkiinnon kohteena olevan 20 proteiinin tasot ovat yhä suhteellisia, vain tässä tapauksessa, valikoitavan proteiinin koekeampi taso vastaa pakkausproteiinin tai mielenkiinnon kohteena olevan proteiinin : ·* paljon korkeampaa tasoa.
: · 25 Mieluummin edellinen menetelmä suoritetaan käyttämällä : plasmidia, jossa on yksi proviruksen gag/pol- tai env-pak- kausgeeneistä yhdessä ensimmäisen valikoitavan geenin kans-, · sa. Näistä soluista sitten seulotaan solut, jotka tuottavat proteiinin koekeimpia tasoja reaktiossa, jossa on vasta-aine 30 env:lle (tai mahdollisesti gag/pol:lie), toinen fluoresoiva vasta-aine, ja sitten lajitellaan fluoresenssilla aktivoidulla solulajittelijalla (FACS). Vaihtoehtoisesti ’>· voidaan käyttää muita testejä proteiinitasoa varten. Myöhem- *.* min menetelmä ja seulonta toistetaan käyttämällä näitä ··.. 35 valittuja soluja, ja toista gag/pol- tai env-pakkausgeeneis- ,,, tä. Tässä vaiheessa vaadittaisiin toinen valikoitava geeni (erilainen kuin ensimmäinen) 3'-suuntaan pakkausgeenistä ja solut, jotka tuottavat suurinta määrää toista valittua viruksen proteiinia. Sitten menetelmä ja seulonta toistetaan 40 käyttämällä henkiin jääneitä soluja plasmidin kanssa, jossa 46 1 13 47? on provirusvektori, jossa on mielenkiinnon kohteena oleva geeni ja kolmas valikoitava geeni, joka on erilainen kuin ensimmäinen ja toinen valikoitava geeni. Tämän menetelmän tuloksena valitaan solut, jotka tuottavat halutun 5 yhdistelmäretroviruksen korkeita tiittereitä, ja niitä voidaan viljellä, kuten vaaditaan yhdistelmäretroviruksen hankkimiseksi. Lisäksi gag ja pol voidaan ottaa toisistaan riippumatta käyttöön ja valita.
10 Esimerkki 7 selittää gag/pol- ja env-plasmidien rakentamista, jotka on suunniteltu käyttämään näitä menetelmiä.
Esimerkki 7. Plasmidit, jotka on suunniteltu tekemään pak-kausproteiinien korkeita tasoja (kuvio 7).
15 1. 2,7 kb Xba I -kappale pPAMrsta (Miller et ai.. Mol. Cell. Biol. 5:431, 1985), joka sisältää amfotrooppisen env-jakson, kloonattiin pUC18:aan Xba I -kohtaan, sitten poistettiin HindIII:lla ja Sma I:llä. Tämä kappale kloonattiin pRSV neo 20 -vektoriin (Gorman et ai., Mol. Cell. Biol. 2:1044, 1982; Southern et ai., J. Mol. Appi. Genet. 1:327, 1982) pilkottiin Hind III:lla ja Pvu II:lla, jolloin saatiin pRSV env. 0,7 kb Bam Hiistä BstEII:een kappaleessa pUT507-plasmidista • (Mulsant et ai., Somat. Cell. Mol. Genet. 14^:243, 1988), 25 jonka BstEII-pää on täytetty, on fleo-vastustuskykyä - * : koodaava jakso. 4,2 kb Bam Hl:stä Xholieen kappale, vierei- -·, nen 1,6 kb XhoI:stä Xbal:een (Xbal täytetty) RSVenv:stä, ja ! fleo-kappale liitettiin, jolloin saatiin pRSVenv-fleo.
30 2. Kappale Pst I -kohdasta MLY:n 563-nukleotidin kohdalta (RNA Tumor Viruses, voi. II, 1985, Cold Spring Harbor) Sea I -kohtaan 5870-kohdalle saatiin pMLV-K:sta (Miller et ai., Γ ) ·
:.,. 1985, op. cit.) ja kloonattiin Pst I:stä Bam Hl:een (Bam HI
: ; täytetty) kappaleeseen p4aA8:sta (Jolly et al., Proc. Natl.
35 Acad. Sci. USA 80.:477, 1983), jolla on SV40:n promoottori, pBR322:n ampisilliinivastustuskyky ja replikaation alkukohta > ♦
. , ja SV40:n polyA-kohta. Tällöin saatiin pSVgp. pSVgpDHFR
tehtiin käyttämällä seuraavia kappaleita: 3,6 kb Hind III:sta Sal I:een kappaletta pSVgp:stä, joka sisälsi SV40:n 40 promoottorin plus MLY gag:n ja joitakin pol-jaksoja; 2,1 kb 11347c 47
Sallista Sea Ireen kappaletta pMLV-K:sta, jossa oli loput pol-geenistä, 3,2 kb Xba lista (Xba I täytetty) Pst I:een kappaletta pF400:stä, jossa oli DHFR-geeni plus polyA-kohta, pBR322:n replikaation aloituskohta ja puolet 5 ampisilliinivastustuskyky-geenistä; 0,7 kb Pst lista Hind Illieen kappaletta pBR322:sta, jossa oli toinen puoli am-pisilliinivastustuskyky-geenistä. Tällöin saadaan pSVgp-DHFR. Kaikki nämä rakenteet esitetään kuviossa 7. Nämä plasmidit voidaan transfektoida 3T3-soluihin tai muihin 10 soluihin ja saada gag:n, polin tai envin korkeita tasoja.
Lisämenetelmä valinnan suorittamiseksi on käyttää geenivalintaa yhdellä kierroksella ja sen vastamerkitystä seuraavalla kierroksella. Esimerkiksi gag/pol voidaan ottaa 15 käyttöön HPRT-puutteellisessa solussa HPRT-geenin kanssa ja valikoida tämän geenin läsnäolo käyttämällä elatusaineita, jotka vaativat HPRTitä puriinien hyödyksi käyttöä varten. Seuraavalla kierroksella voitaisiin toimittaa HPRTin vas-tamerkitys envistä 3'-suuntaan ja valikoida solu 6 20 tioguaniinissa HPRT-puutteellisen ilmiasun suhteen. Vaadittaisiin suuria määriä vastamerkitys-HPRT:tä, jotta lopetettaisiin HPRT-geenin transkriptien toiminta olettaen, ettei esiinny mitään alkuperäisen tilan palautumista.
25 Vaippakorvautumiset.
♦ : Kyky ilmentää gagpol- ja env-toimintaa erikseen saallii näiden toimintojen käsittelyn toisistaan riippumatta. Solulinjaa, joka ilmentää suuria määriä gagpolia, voidaan 30 käyttää esimerkiksi osoittamaan tiittereiden epävarmuuksia envin suhteen. Yksi alhaisista tiittereistä seuraava tekijä , on sopivien reseptorimolekyylien tiheys kohdesolussa tai ; kudoksessa. Annettu env-ilmeneminen on erillisestä yksikös tä, suuri määrä vaippageeneistä (jotka vaativat eri resep-'· 35 toriproteiineja), kuten ksenotrooppisia, polytrooppisia, tai amfotrooppisia envijä eri lähteistä, voidaan testata ; * korkeimmat tiitterit erityisessä kohdekudoksessa. Lisäksi vaippoja retroviruslähteistä, jotka eivät ole hiiristä, • voidaan käyttää vektorin valetyypittelyyn. Lisäksi 40 hybridivaippoja (kuten on selitetty alla) voidaan käyttää 11347c 48 myös tässä järjestelmässä räätälöimään retrovirusvektorin tropismia (ja tehokkaasti lisäämään tiittereitä). Päinvastoin solulinjaa, joka ilmentää suuria määriä annettua vaip-pageeniä, voidaan käyttää osoittamaan tiitterin epävarmuuk-5 siä gag:n ja pol:n suhteen.
V. Vaihtoehtoiset virusvektorin pakkausmenetelmät.
Kahta vaihtoehtoista lisäjärjestelmää voidaan käyttää tuot-10 tamaan yhdistelmäretroviruksia, joissa on vektorirakenne. Kumpikin näistä järjestelmistä käyttää hyväkseen tosiasiaa, että hyönteisvirusta, baculovirusta, ja nisäkäsviruksia, lehmärokko- ja adenovirusta, on sovellettu äskettäin tekemään suuria määriä mitä tahansa annettua proteiinia, 15 jonka geeni on kloonattu. Esimerkiksi katso Smith et ai.
(Mol. Cell. Biol. 3:12, 1983); Piccini et ai. (Meth. En-zymology, 153:545, 1987); ja Mansour et ai. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:1359, 1985).
20 Näitä virusvektoreja voidaan käyttää proteiinien tuottamiseksi kudosviljelysoluissa liittämällä sopivia geenejä virusvektoriin, ja täten voitaisiin soveltaa ‘ tekemään retrovirusvektoreita.
25 Adenovirusvektorit on saatu nukleaarisesti replikoituvista ; vektoreista ja ne voivat olla puutteellisia. Geenejä voidaan liittää vektoreihin ja käyttää ilmentämään proteiineja ' nisäkässoluissa joko in vitro -rakentamisen avulla (Ballay et ai., EMBO J. 4:3861, 1985) tai soluissa uudelleen järjes-30 telyn avulla (Thummel et ai., J. Mol. Appi. Genetics 1:435, 1982) .
• Yksi suosittu menetelmä on rakentaa plasmideja käyttämällä i adenoviruksen myöhäistä pääpromoottoria (MLP), joka panee 35 liikkeelle: (1) gag/pol:n, (2) env:n, (3) muutetun virusvek-, torirakenteen. Muutettu virusvektorirakenne on mahdollinen, koska 5’ LTR:n U3-alue, joka sisältää virusvektorin promoottorin, voidaan korvata muilla promoottori jaksoilla (katso esimerkiksi Hartman, Nucl. Acids Res. 16:9345, 1988). Tämä 40 osa korvataan yhden käänteistranskriptaasikierroksen jälkeen 49 U3:11a 3' LTR:stä. 11347( Näitä plasmideja voidaan sitten käyttää tekemään adenoviruk-sen genomeja in vitro (Ballay et ai., op. cit.), ja nämä 5 transfektoidaan 293-soluihin (ihmissolulinja, joka tekee adenoviruksen ElA-proteiinia), jonka suhteen adenovirusvek-torit ovat puutteellisia, jolloin saadaan puhtaita stokkeja gag:stä, polrsta, env:stä ja retrovirusvektorista, joka on erillään puutteellisissa adenovirusvektoreissa. Koska 10 tällaisten vektoreiden tiitterit ovat tyypillisesti 107- 1011/ml, näitä stokkeja voidaan käyttää infektoimaan kudos-viljelmäsoluja samanaikaisesti korkealla moninaisuudella. Sitten solut ohjelmoidaan tuottamaan retroviruksen proteiineja ja retrovirusvektorin genomeja korkeilla tasoil-15 la. Koska adenovirusvektorit ovat puutteellisia, ei esiinny mitään suuria määriä suoraa solunhajoamista ja retrovirus-vektorit voidaan korjata solusupernatanteista.
Vaihtoehtoisessa järjestelmässä (joka on totuudenmukaisemmin 20 solun ulkopuolinen) käytetään seuraavia osatekijöitä: 1. gag/pol- ja env-proteiineja, jotka on tehty baculovirusjärjestelmässä samalla tavalla kuin Smith ym. (supra) ovat selittäneet (tai muissa 25 proteiinituotantojärjestelmissä, kuten hiivassa tai E. colissa); ! 2. virusvektorin RNA:ta, joka on tehty tunnetussa T7- tai ; SP6- tai muussa in vitro RNA:ta kehittävässä järjestelmässä 30 (katso esimerkiksi Flamant ja Sorge, J. Virol. 62:1827, 1988); 3. tRNA:ta, joka on tehty kuten kohdassa (2) tai puhdistettu : hiivasta tai nisäkäskudoksen viljelmäsoluista; 35 4. liposomeja (jotka sulkevat sisäänsä env-proteiinin); ja 5. solu-uutetta tai puhdistettuja tarpeellisia osatekijöitä :(kun tunnistetaan) (tyypillisesti hiiren soluista) käytet- 40 täväksi env-käsittelyyn, ja mihin tahansa tai muihin tar- 50 11347c peellisiin solusta saatuihin toimintoihin.
Tämän menetelmän mukaan (1), (2) ja (3) sekoitetaan, ja sitten env-proteiini, solu-uute ja esiliposomiseos (lipidi 5 sopivassa liuottimessa) lisätään. Saattaa kuitenkin olla välttämätöntä aikaisemmin sulkea env-proteiini liposomien sisään ennen kuin lisätään tulokseksi saatu liposomin sisään suljettu env (1):n, (2):n, ja (3):n seokseen. Seosta käsitellään (esim. sonikoimalla, lämpökäsittelyn avulla tai 10 kiertodialyysin avulla), jotta sallitaan syntyvien virusten pakkautuminen kuoreen lipidien plus sisään suljetun env-proteiinin kanssa samalla tavalla kuin lääkkeet pakataan liposomiin kuten Gould-Fogerite ym. ovat selittäneet (Anal. Biochem. 148:15, 1985). Tämä menetelmä sallii replikaatioon 15 kykenemättömien yhdistelmäretrovirusten korkeiden tiitterei-den tuotannon ilman kontaminaatiota tautia aiheuttavilla retroviruksilla tai replikaatioon kykenevillä retroviruksil-la.
20 VII. Tietylle solulinjalle erityiset retrovirukset - "hybri-divaippa".
Retroviruksen isäntäsolukirjoerityisyys määritetään osittain : env-geenituotteiden avulla. Esimerkiksi J. Coffin (RNA Tumor |· 25 Viruses 2:25-27, Cold Spring Harbor, 1985) kiinnittää huomi- . ota, että proteiinien solun ulkopuolinen osatekijä hiiren leukemisviruksesta (MLV) ja Rousin sarkoomaviruksesta (RSV) ! on vastuussa erityisestä reseptorin sitoutumisesta. Vaip- ; paproteiinien solulima-alueen on toisaalta ymmärretty osal- 30 listuvan viruspartikkelin muodostukseen. Vaikka valetyypit-telyä (se on viruksen RNA:n pakkaaminen kuoreen yhdestä lajista toisen lajin viruksen proteiinien avulla) esiintyy alhaisella taajuudella, vaippaproteiinilla on jotain erityi-: : syyttä annetun retroviruksen viruspartikkelin muodostuk- 35 selle. Tämä keksintö tunnustaa, että järjestämällä hybridi-env-geenituote (se on erityisesti env-proteiini, jolla on solulima-alueet ja ulkosyntyiset sitoutumisalueet, jotka eivät ole samassa proteiinimolekyylissä luonnossa) voidaan isäntäkirjoeritylsyyttä vaihtaa riippumatta solulimatoimin-' : 40 nasta. Täten voidaan tuottaa yhdistelmäretroviruksia, jotka 11347" 51 erityisesti sitoutuvat esivalittuihin kohdesoluihin.
Jotta tehtäisiin hybridiproteiini, jonka reseptorin sitoutu-misosatekijä ja solulimaosatekijä ovat eri retroviruksista, 5 suosittu paikka uudelleen järjestelylle on solulimaosateki-jän kalvon läpi menevässä alueessa. Esimerkki 8 selittää hybridi-env-geenin rakentamista, joka ilmentää proteiinia, jonka HIV:n vaippaproteiinin CD4-sitoutumisosa on yhdistynyt MLV:n vaippaproteiinin solulimaosaan.
10
Esimerkki 8. Hybridi-HIV-MLV-vaipat.
Hybridivaippageeni valmistetaan käyttämällä in vitro -mutageneesiä {Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492, 15 1985) tuomaan uuden restriktioentsyymin paikan liitoskohdan sopivaan kohtaan. Vaihtoehtoisesti, jos kaksi vaippajaksoa ovat samassa plasmidissa, ne voidaan yhdistää heti missä tahansa halutussa kohdassa käyttämällä in vitro -mutageneesiä. Lopputulos molemmissa tapauksissa on 20 hybridigeeni, joka sisältää HIV:n gp 160:n 5'-pään ja MLB:n pl5E:n 3'-pään. Tulokseksi saadun yhdistelmägeenin ilmentämä hybridiproteiini valaistaan kuviossa 18 ja se sisältää HIV:n gp 120:n (CD4-reseptoria sitova proteiini), HIV:n gp41:n solun ulkopuolisen osan (gp 120:ä sitovat ja fusigeeniset 25 alueet), ja MLV:n pl5E:n solulimaosan, liitekohdan kanssa, joka esiintyy missä tahansa useissa kohdissa isännän kalvos-! sa. Hybridigeeniä, joka on tehty fuusion avulla uuteen Eco I Rl -kohtaan, joka on esitetty kuviossa 18, ilmennetään CMVIE-geenin valvonnan alaisuudessa ihmisen Sup Tl-soluissa 30 ja johtaa solujen yhteensulautumiseen, kuten aidon HIV:n env-geenin tapauksessa. Täten hybridi kuljetetaan oikein solun pinnalle ja korvataan siellä.
'· Vaikka esimerkki 8 valaisee yhtä hybridiproteiinia, joka on 35 tuotettu kahdesta eri retroviruksesta, mahdollisuudet eivät • ; rajoitu retroviruksiin tai jopa yksinkertaisesti muihin viruksiin. Esimerkiksi ihmisen interleukiini-2:n beeta-reseptoriosa voidaan yhdistää MLV:n vaippaproteiinin kanssa. Tässä tapauksessa uudelleen järjestely mieluummin sijoitet-. : 40 täisiin MLV:n env-geenin gp 70 -osaan, mikä jättää pl5E- 11347f 52 proteiinin ehjäksi. Lisäksi edellistä tekniikkaa voidaan käyttää saamaan aikaan yhdistelmäretrovirus, jolla on vaip-paproteiini, joka tunnistaa vasta-aine-Fc-osat. Monoklonaaliset vasta-aineet, jotka tunnistavat vain 5 esivalittuja kohdesoluja, voitaisiin sitten vain sitoa tällaiseen yhdistelmäretrovirukseen, mikä tuo esiin tällaisia vaippaproteiineja siten, että retrovirus siotutuisi ja infektoisi vain näitä esivalittuja kohdesoluja.
10 VIII. Erityiseen paikkaan sitoutuminen.
Retrovirusvektorin pommittaminen edeltä määrättyyn lokukseen kromosomissa lisää geenitoimitusjärjestelmien etuja. Turval-lisuusaste saavutetaan suoraan liittämällä "turvalliseen" 15 kohtaan kromosomissa, se on kohtaan, johon vektorin liittämisen ei ole osoitettu aiheuttavan deleetioita. Toinen mahdollinen etu on kyky ohjata geeni kromosomin "avoimelle" alueelle, jossa sen ilmeneminen tehtäisiin suurimmaksi mahdolliseksi. Kaksi tekniikaa retrovirusten liittämiseksi 20 erityisiin kohtiin selitetään alla.
(i) Homologinen rekombinaatio.
Yksi tekniikka yhdistelmäretroviruksen vektorirakenteen 25 ulkosyntyisen geenin liittämiseksi erityiseen paikkaan • kohdesolun DNA:han käyttää homologista rekombinaatiota.
Plasmidien, jotka sisältävät DNA:n jaksoja, jotka ovat isompia kuin noin 300 bp ja jotka ovat homologisia genomin ! jaksoille, on osoitettu vuorovaikuttavan (joko korvaamalla 30 tai liittämällä) näiden genomin jaksojen kanssa määrällä, joka on suurempi kuin 103-kertaisesti verrattuna erityiseen vuorovaikutukseen tällaisen homologian poissaollessa (katso Thomas ja Capecchi, Cell 51^:503-12, 1987; ja Doetscheman et : ,/ ai., Nature 330:576-78, 1987). On osoitettu, että liittämis- ; : 35 tapahtuman, tai vaihtoehtoisesti korvaamistapahtuman, voi panna liikkeelle vektorin erityinen rakenne.
Jotta käytettäisiin homologista rekombinaatiota retroviruk-, . sen erityiseen paikkaan liittämisessä, vektorirakenne pitäisi muuttaa siten, että (a) homologiset jaksot (koh-·,: 40 desolun genomille) sisällytetään rakenteeseen sopivassa 53 1 1347f' paikassa; ja (b) liittämisen normaali mekanismi ei häiritse pommittamista, jota esiintyy homologisten jaksojen johdosta. Suosittu aloittamistapa tässä suhteessa on lisätä homologisia jaksoja (isompia kuin noin 300 bp) 3' LTR:ään, 3'-suun-5 taan käänteisestä U3-toistosta. Tässä aloittamistavassa rakenne tehdään alussa homologia-alueen kanssa, joka on liitetty 3’ LTRcään Nhe I -kohtaan U3:ssa.
Käänteistranskriptio isäntäsolussa johtaa homologia-alueen kahdentumiseen 5' LTRissä käänteisen toiston (IR) pään 31 10 bp:ssä. Liittyminen isännän genomiin esiintyy normaalin liittymismekanismin läsnä- tai poissaollessa. Vektorissa olevaa geeniä voidaan ilmentää joko LTR:stä tai sisäisestä promoottorista. Tällä aloittamistavalla on vaikutus siihen, että homologia-alue sijoitetaan kaksijuosteisen retrovirus-15 vektorin genomin mahdollisen vapaan pään lähelle. Vapaiden päiden tunnetaan lisäävän homologisen rekombinaation taajuutta tekijällä, joka on noin 10. Tässä aloittamistavassa saattaa olla välttämätöntä tehdä tyhjäksi liittämisen normaali mekanismi, tai ainakin muuttaa sitä hidastamaan 20 taphtumaa, antaen homologisille DNA:ille aikaa asettua riviin. Sen, tarvitaanko jälkimmäistä muuttelua tietyssä tapauksessa, voi alan ammattimies helposti ottaa selville.
{ii> Integraasimuuttelut.
;· 25
Toinen tekniikka vektorirakenteen liittämiseksi erityisiin ·. esivalittuihin kohdesolun genomin paikkoihin sisältää in- tegraasimuuttelun.
30 Retroviruksen pol-geenituote yleensä jalostetaan neljään osaan: (i) proteaasiksi, joka jalostaa viruksen gag- ja pol-tuotteet; (ii) käänteistranskriptaasiksi ; ja (iii) RNAasi H:ksi, joka pilkkoo RNA:n RNA/DNA-dupleksista; ja (iv) endonukleaasiksi tai "integraasiksi" .
:Y 35 Y Johnson ym. ovat analysoineet yleisen integraasirakenteen (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8J3:7648-7652, 1986). On ehdotet-.. tu, että tällä proteiinilla on sinkkiä sitova sormi, jolla ‘(t> se vuorovaikuttaa isännän DNA:n kanssa ennen kuin liittää 40 retroviruksen jaksot.
54 113 47 f
Muissa proteiineissa tällaiset "sormet" sallivat proteiinin sitoutua DNArhan tietyissä jaksoissa. Yksi valaiseva esimerkki on steroidireseptorit. Tässä tapauksessa voidaan 5 tehdä estrogeenireseptori, joka reagoi estrogeenille ja jolla on glukokortikoidin vaikutus, joka reagoi glukokor-tikoideille, yksinkertaisesti korvaamalla glukokortikoidire-septorin "sormi" (se on DNA:ta sitova osa) estrogeeniresep-torin sormen paikalle estrogeenireseptorin geenissä. Tässä 10 esimerkissä genomissa olevaa paikkaa, johon proteiineja pommitetaan, on muutettu. Tällaiset ohjaavat jaksot voidaan myös korvata integraasigeeniin sinkkisormen tilalle. Esimerkiksi osa, joka koodaa ihmisen estrogeenireseptorin geenin DNA:ta sitovaa aluetta, voidaan korvata integraasin DNA:ta 15 sitovan alueen tilalle pakkausgenomissa. Alussa erityinen liittyminen testattaisiin in vitro -liittymisjärjestelmän keinoilla (Brown et ai., Cell 29.:347-356, 1987). Jotta vahvistetaan, että erityisyys nähtäisiin in vivo, tätä pakkausgenomia käytetään tekemään infektiivisiä vektoreita, 20 ja solujen, jotka ovat tai eivät ole herkkiä estrogeenille, tartuntaa ja niihin liittymistä verrataan viljelmässä.
Tätä tekniikkaa käyttämällä sisään tulevia virusvektoreita voidaan ohjata liittymään esivalittuihin kohtiin kohdesolun -·· 25 genomissa, joita määräävät paikkaspesifisien DNA:ta sitovien proteiiniosien genomia sitovat ominaisuudet, jotka on pilkottu integraasigenomiin. Alan ammattimiehet ymmärtävät, ! että liittymiskohdan täytyy itse asiassa olla altis muutetun I integraasin sormille. Esimerkiksi useimmat solut ovat herk- 30 kiä glukokortikoideille ja sen tähden niiden kromatiinilla on kohtia glukokortikoidireseptoreille. Täten useimpien solujen kohdalla muutettu integraasi, jolla on glukokor-tikoidireseptorin sormi, olisi sopivaa liittää provirusvek-: torirakenteeseen näihin glukokortikoidireseptoria sitoviin :Y 35 kohtiin.
IX. Yhdistelmäretrovirusvektoreiden tuotanto siirtogeenisissä eläimissä.
40 Kaksi aikaisemmin selitettyä ongelmaa retrovirusvektoreiden « 11347c bb auttajalinjän kehittämisessä ovat: (a) vaikeus vektoreiden suurien määrien kehittämisessä; ja (b) yleinen tarve käyttää pysyviä soluja alkuperäissolujen sijaan vektoreita tehtäessä. Nämä ongelmat voidaan voittaa tuottaja- tai pakkauslin-5 joilla, joita kehitetään siirtogeenisissä eläimissä. Näissä eläimissä olisi pakkausgenomit ja retrovirusvektorigenomit. Nykyinen teknologia ei salli pakkaussolulinjojen ja toivottujen vektoria tuottavien linjojen kehittämistä alkuperäis-soluissa niiden rajoitetun elinajan johdosta. Nykyinen 10 teknologia on sellainen, että laaja luonnehtiminen on välttämätöntä, mikä sulkee pois alkuperäissolujen käytön vanhenemisen vuoksi. Kuitenkin voidaan kehittää siirtogeenisten eläinten yksittäisiä linjoja tässä annetuilla menetelmillä, jotka tuottavat pakkaustoimintoja, kuten 15 gag:ä, pol:a tai env:ä. Sitten nämä eläinten linjat luonnehditaan ilmenemistä varten joko koko eläimessä tai kohdekudoksessa valikoivasti käyttämällä kaikissa solutyypeissä tarvittavia tai tietylle kudokselle erityisiä promoottoreja transkriboimaan pakkaustoimintoja. Toimitet-20 tava vektori myös liitetään siirtogeenisten aläinten linjaan tietylle kudokselle erityisen tai kaikissa solutyypeissä tarvittavan promoottorin kanssa. Kuten yllä on käsitelty, vektori voidaan ajaa pois korvaamalla tällaisella promoottorilla 5' LTR:n U3-alue (kuvio 19). Tämän siirretyn geenin : 25 ilmeneminen voisi olla indusoitavaa tai kaikkialla läsnä olevaa. Tätä vektoria ei kuitenkaan pakata. Sitten nämä • eläinten linjat risteytetään gag/pol/env-eläimen kanssa ja seuraavat jälkeläiset tuottavat pakattua vektoria. Jälkeläiset, jotka ovat olennaisesti identtisiä, luonneh-30 ditaan ja ne tarjoavat tuottavien alkuperäissolujen rajoittamattoman lähteen. Vaihtoehtoisesti alkuperäissolut, jotka tekevät gag/pol:a ja env:ä ja jotka on saatu siirtogeenisistä eläimistä, voidaan infektoida tai transfek-:... toida ruumiiseen retrovirusvektoreiden kanssa tekemään 35 alkuperäissolutuottajalinjän. Monet erilaiset siirtogeeniset eläimet tai hyönteiset voisivat tuottaa näitä vektoreja, kuten hiiret, rotat, kananpojat, siat, kanit, lehmät, lam-, . paat, kala ja kärpäset. Vektori ja pakkausgenomit räätälöitäisiin lajitartuntaerityisyyttä ja kudosspesifistä 40 ilmenemistä varten käyttämällä tietylle kudokselle erityisiä 11347c 56 promoottoreja ja eri vaippaproteiineja. Esimerkki tällaisesta menetelmästä valaistaan kuviossa 20.
Vaikka seuraavat esimerkit alkuperäispakkauslinjojen siirto-5 geenisestä tuotannosta on selitetty vain hiirien osalta, näitä menetelmiä voisivat alan ammattimiehet laajentaa muihin lajeihin. Kun annetaan homologia MLV-jaksoille hiirien genomissa, hiiret eivät olisi lopullisia suosittuja eläimiä.
10
Esimerkki 9. Gag-pol-proteiinien tuotanto käyttämällä kaikissa solutyypeissä tarvittavia promoottoreja kaikkialla läsnä olevaa ilmenemistä varten siirtogeenisissä eläimissä.
15 Esimerkki hyvin tunnusomaisesta kaikissa solutyypeissä tarvittavasta promoottorista on HPRT-promoottori. HPRT on puriinin hyödyksi käytössä tarvittava entsyymi, jota ilmenee kaikissa kudoksissa. (Katso Patel et ai., Mol. Cell Biol.
6:4 -403, 1986 ja Melton et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.
20 83^:2147-2151, 1984). Tämä promoottori liitettäisiin eri gag/pol-kappaleiden eteen (esim. Bal I/Sca I; Aat II/Sca I; MoMLV:n Pst I/Sca I; katso RNA Tumor Viruses 2, 1985, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985), jotka on kloonattu *' Bluescript-plasmideihin (Strategene, Inc.) käyttämällä j' 25 yhdistelmä-DNA-tekniikoita (katso Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982).
Tulokseksi saadut plasmidit puhdistetaan (Maniatis et ai., ·. op. cit.) ja asiaankuuluva geneettinen tieto eristetään • käyttämällä Genecleania (Bio 101) tai elektroeluutiota 30 (katso Hogan et ai., (eds.) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1986).
Nämä täysin tunnusomaiset DNA:t, joiden konsentraatio on 2 pg/ml, mikroruiskutettaisiin hedelmöitettyjen hiiren 35 munasolujen esitumaan. Elävänä syntyneet hiiret seulottaisiin häntätäplä-analyysin avulla Hogan et ai., op. cit.). Siirtogeenispositiivisten eläinten gag-pol-proteiinien ilmenemistasot luonnehdittaisiin radioaktiivisesti leimattujen alkuperäissolujen, kuten 40 fibroblastin, immunosaostuksen avulla (katso Harlow et ai., 57 1 1247c eds. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1988). Sitten eläimet jalostettaisiin homotsygoottisiksi eläinlinjojen perustamiseksi, jotka tuottavat gag-pol:n tunnusomaisia tasoja.
5
Esimerkki 10. Env-proteiinien/hybridivaippaproteiinien tuotanto käyttämällä kaikissa solutyypeissä tarvittavia promoottoreja kaikkialla läsnä olevaa ilmenemistä varten siirtogeenisissä eläimissä.
10 Tämä esimerkki käyttää hyödyksi HPRT-promoottoria joko vaippa- tai hybridivaippaproteiinien ilmenemistä varten. Vaippaproteiinit voisivat olla mistä tahansa retrovirukses-ta, joka pystyy täydentämään merkityksellisen gag-pol:n, 15 tässä tapauksessa MLV:n gag-pol:n. Esimerkkejä ovat ekotrooppinen MLV, amfotrooppinen MLV, ksenotrooppinen MLV, polytrooppinen MLV, tai hybridivaipat. Kuten yllä, vaip-pageeni kloonattaisiin HPRT-promoottorin taakse käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikoita (katso Maniatis et ai., op.
20 cit.). Tulokseksi saatu "minigeeni" eristettäisiin (katso Hogan et ai., op. cit.), ja vaippaproteiinin ilmeneminen määritettäisiin (Harlow et ai., op. cit.). Siirtogeeniset vaippaeläimet jalostettaisiin homotsygoottisiksi, jotta perustettaisiin hyvin tunnusomainen vaippaeläin.
i 25 < · ;'· Esimerkki 11. Gag-pol-env-eläinten tuotanto käyttämällä < · j kaikissa solutyypeissä tarvittavia promoottoreja ilmenemistä * * *· varten siirtogeenisissä eläimissä.
30 Tämä käyttäisi hyvin tunnusomaisia gag-pol-eläimiä yhtä hyvin kuin eläimiä, joita käytetään pysyvän gag-pol/vaip-paeläinlinjän perustamiseksi. Tämä sisältäisi jalostuksen homotsygoottisiksi ja hyvin tunnusomaisen linjan • · · perustamisen. Sitten näitä linjoja käytettäisiin perustamaan » · /> 35 hiiren alkuperäisalkiolinjoja, joita voitaisiin käyttää ,,,, vektoreiden pakkaamisessa kudosviljelmässä. Lisäksi eläimiä, jotka sisältävät retrovirusvektorin, voitaisiin jalostaa ,. tähän linjaan.
» » 40 11347c 58
Esimerkki 12. Gag-pol-env- tai hybridivaipan kudosspesifisen ilmenemisen tuotanto siirtogeenisissä eläimissä.
Tässä annettu esimerkki ohjaa gagpolrn, vaipan, tai hybridi-5 vaipan kudosilmenemisen erityisiin kudoksiin, kuten T-solui-hin. Tämä sisältää CD2-jaksojen käytön (katso Lang et ai., EMBO J. 7:1675-1682, 1988), joka antaa sijainnin ja kopiolu-kuriippumattomuuden. 1,5 kb Bam HI/Hind III -kappale CD2-geenistä liitettäisiin gag-pol:n, vaipan, tai hybridivaip-10 pakappaleiden eteen käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikoita. Nämä geenit liitettäisiin hiiren hedelmöitettyihin munasoluihin mikroruiskutuksen avulla. Siirtogeeniset eläimet luonnehdittaisiin kuten aikaisemmin. Ilmeneminen T-soluissa saataisiin aikaan. Eläimet jalostettaisiin homot-15 sygoottisiksi, jotta perustettaisiin siirtogeenisten eläinten hyvin tunnusomaisia linjoja. Gag-pol-eläimet risteytettäisiin vaippaeläinten kanssa, jotta perustettaisiin gag-pol-env-eläimiä, joiden gag-, pol- ja env-geenit ilmenevät vain T-soluissa. Sitten näiden eläinten T-solut olisivat T-20 solujen lähde, jotka pystyvät pakkaamaan retrovirusvektore-ja. Taas vektorieläimet voitaisiin jalostaa näiksi gag-pol-env-eläimiksi, jotta perustettaisiin T-soluja, jotka ilmentävät vektoria.
·; 25 Tämä tekniikka sallii muiden kudosspesifisten promoottorien ··' käytön, kuten maidolle erityisien (hera), haiman (insuliini 1: tai elastiini), tai hermostollisten (myeliinipohjäinen proteiini) promoottorien. Käyttämällä promoottoreja, kuten :: maidolle erityisiä promoottoreja, voidaan eristää yhdis- 30 telmäretroviruksia suoraan jälkeläisten biologisesta nesteestä.
.··_ Esimerkki 13. Joko kaikissa solutyypeissä tarvittavien tai tietylle kudokselle erityisten retrovirusvektoreiden tuotan-.. 35 to siirtogeenisissä eläimissä.
:··· Retrovirusten tai retrovirusvektoreiden liittäminen λ’ siirtogeenisten eläinten iturataan johtaa ilmenemättömyyteen tai vähäiseen ilmenemiseen. Tämä vaikutus, jonka Jaenisch on 40 selittänyt (katso Jahner et ai., Nature 298:623-628, 1982), 59 1 1347c luetaan retroviruksen 5' LTR-jaksojen metylaation ansioksi. Tämä tekniikka voittaisi metylaatiovaikutuksen korvaamalla joko kaikissa solutyypeissä tarvittavan tai tietylle kudokselle erityisen promoottorin ilmentämään retrovirusvektoria-5 /retrovirusta. 5' LTR:n U3-alue, joka sisältää tehostaja-aineksia, korvataan säätelyjaksoilla kaikissa solutyypeissä tarvittavista tai tietylle kudokselle erityisistä promoottoreista (katso kuvio 20). 3' LTR pidetään täysin paikoillaan, koska se sisältää jaksoja, jotka ovat välttämättömiä 10 virus-RNA:n polyadenylaatiolle ja liittymiselle. Retroviruksen replikaation ainutlaatuisten ominaisuuksien tuloksena kehitetään liittyneen proviruksen 5’ LTR:n U3-alue infek-toivan viruksen 3' LTR:n U3-alueen avulla. Sen tähden 3' on välttämätön, kun taas 5' U3 on tarpeeton. 5' LTR U3-jaksojen 15 korvaaminen promoottoreilla ja liittäminen siirtogeenisten eläinten iturataan johtaa eläinten linjoihin, jotka pystyvät tuottamaan retrovirusvektorin transkripteja. Sitten nämä eläimet risteytettäisiin gag-pol-env-eläinten kanssa, jotta kehitettäisiin retrovirusta tuottavia eläimiä (katso kuvio 20 20) .
Edellisestä arvostetaan sitä, vaikka keksinnön erityissuori-tusmuodot on selitetty tässä esimerkin tarkoituksissa, voidaan tehdä eri muutteluja ilman, että poiketaan keksinnön ·;' 25 hengestä ja rajoista. Niinpä keksintöä ei rajoiteta, paitsi liitteenä olevilla patenttivaatimuksilla.

Claims (7)

11347c 60
1. Menetelmä yhdistelmäretroviruksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vektorirakenteen pakkaamisen kapsidiin ja vaippaan replikaation suhteen puutteellisen yh-5 distelmäretroviruksen aikaansaamiseksi, joka vektorirakenne ohjaa patogeenistä tai syöpäpesäkkeestä peräisin olevan tau-tiantigeenin tai sen muutetun muodon ilmenemistä kohdeso-luissa, jotka on infektoitu retroviruksella, kyseessä olevan antigeenin tai sen muutetun muodon kyetessä stimuloimaan so-10 luvälitteisen immuunivasteen eläimessä tai ihmisessä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä yhdistelmäretroviruksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että vektorirakenne ohjaa patogeenistä peräisin olevan tautiantigeenin muutetun muodon ilmenemistä kohdesoluissa, jotka on infek-15 toitu retroviruksella, kyseisen modifioidun antigeenin kyetessä stimuloimaan immuunivasteen eläimessä tai ihmisessä, mutta omatessa alentuneen patogeenisyyden mainitun patogeenin suhteen.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu \\ 20 siitä, että ilmennetty antigeeni tuo esiin HLA-luokkaan I ja/tai -luokkaan II rajoittuvan immuunivasteen.
4. Mikä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ilmennetty antigeeni on HIV-proteiini, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu gp 160:stä, gp 120:stä 25 ja gp 41:stä tai niiden muutetuista muodoista.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii- ; tä, että vektorirakenne ohjaa erityisen T-solureseptorin tai immunoglobuliinin ilmenemistä, joka tunnistaa halutun antigeenin.
6. Menetelmä Ex-vivo-solujen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että solut infektoidaan minkä tahansa patenttivaatimuk-.* sen 1-5 mukaisella menetelmällä valmistetulla yhdistelmäret- roviruksella. 61 1 1347c'
7. Menetelmä eukaryoottisolun valmistamiseksi, tunnettu siitä, että solu infektoidaan minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-5 mukaisella menetelmällä valmistetulla yhdistelmä-retroviruksella, solun sisältäessä retroviraalisen genomin 5 rekombinanttista retrovirusta varten, jossa genomissa on pakkaussignaali ja joka koodaa tautiantigeenia, joka on peräisin patogeenistä tai on syöpäantigeeni tai sen muutettu muoto, ilman koodaussekvenssiä yhdelle tai useammalle retro-viraaliselle proteiinille, jolloin mainittu solu kykenee 10 myös ilmentämään viraalisia proteiineja mainitun yhdistelmä-retroviruksen tuottamiseksi.
FI904647A 1988-03-21 1990-09-20 Menetelmä yhdistelmäretroviruksen valmistamiseksi FI113476B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17051588A 1988-03-21 1988-03-21
US17051588 1988-03-21
PCT/US1989/001139 WO1989009271A1 (en) 1988-03-21 1989-03-20 Recombinant retroviruses
US8901139 1989-03-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI904647A0 FI904647A0 (fi) 1990-09-20
FI113476B true FI113476B (fi) 2004-04-30

Family

ID=22620165

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI904647A FI113476B (fi) 1988-03-21 1990-09-20 Menetelmä yhdistelmäretroviruksen valmistamiseksi

Country Status (16)

Country Link
EP (2) EP0334301B1 (fi)
JP (5) JPH03504079A (fi)
CN (1) CN1038306A (fi)
AT (2) ATE174960T1 (fi)
AU (1) AU651311B2 (fi)
CA (1) CA1341585C (fi)
CH (1) CH684094A5 (fi)
DE (2) DE68929122T2 (fi)
DK (1) DK175857B1 (fi)
ES (1) ES2139810T3 (fi)
FI (1) FI113476B (fi)
GB (2) GB2236753B (fi)
GR (1) GR3032940T3 (fi)
IL (1) IL89701A (fi)
NO (1) NO314596B1 (fi)
WO (1) WO1989009271A1 (fi)

Families Citing this family (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6133029A (en) 1988-03-21 2000-10-17 Chiron Corporation Replication defective viral vectors for infecting human cells
US5716826A (en) * 1988-03-21 1998-02-10 Chiron Viagene, Inc. Recombinant retroviruses
US5662896A (en) * 1988-03-21 1997-09-02 Chiron Viagene, Inc. Compositions and methods for cancer immunotherapy
US5591624A (en) * 1988-03-21 1997-01-07 Chiron Viagene, Inc. Retroviral packaging cell lines
US6241982B1 (en) 1988-03-21 2001-06-05 Chiron Corporation Method for treating brain cancer with a conditionally lethal gene
US6569679B1 (en) 1988-03-21 2003-05-27 Chiron Corporation Producer cell that generates adenoviral vectors encoding a cytokine and a conditionally lethal gene
US5614404A (en) * 1988-06-10 1997-03-25 Theriod Biologics, Incorporated Self-assembled, defective, non-self-propagating lentivirus particles
US5747324A (en) * 1988-06-10 1998-05-05 Therion Biologics Corporation Self-assembled, defective, non-self-propagating lentivirus particles
US5650148A (en) * 1988-12-15 1997-07-22 The Regents Of The University Of California Method of grafting genetically modified cells to treat defects, disease or damage of the central nervous system
DE69032841T2 (de) * 1989-01-23 1999-05-12 Chiron Corp Rekombinante zellen für therapien von infektionen und hyperprolieferative störungen und deren herstellung
EP0454781B1 (en) * 1989-01-23 1998-12-16 Chiron Corporation Recombinant cells for therapies of infection and hyperproliferative disorders and preparation thereof
JP3140757B2 (ja) * 1989-02-06 2001-03-05 デイナ・フアーバー・キヤンサー・インステイテユート パッケージング欠陥ｈｉｖプロウイルス、細胞系及びその使用
US5693622A (en) * 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
US6673776B1 (en) 1989-03-21 2004-01-06 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate, mammal, fish, bird or human
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
WO1990012087A1 (en) * 1989-04-05 1990-10-18 Novacell Corporation Infectious targetted replication-defective virion
EP0487587A1 (en) * 1989-08-18 1992-06-03 Chiron Corporation Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
GB8919607D0 (en) * 1989-08-30 1989-10-11 Wellcome Found Novel entities for cancer therapy
US6337209B1 (en) 1992-02-26 2002-01-08 Glaxo Wellcome Inc. Molecular constructs containing a carcinoembryonic antigen regulatory sequence
ATE199398T1 (de) * 1989-10-24 2001-03-15 Chiron Corp Sekretion vom mit gamma-interferon signalpeptid gebundenen humänen protein
FR2655855B1 (fr) * 1989-12-20 1992-04-10 Pasteur Institut Protection genetique d'animaux contre l'infection par le virus leucemogene bovin, et provirus et virus recombinant derive de ce virus.
US6706694B1 (en) 1990-03-21 2004-03-16 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate
US6228844B1 (en) 1991-11-12 2001-05-08 Vical Incorporated Stimulating vascular growth by administration of DNA sequences encoding VEGF
US6537541B1 (en) * 1990-09-14 2003-03-25 The General Hospital Corporation Implantation of HSV-TK retrovirus producer cells to destroy glioma
US6555108B1 (en) * 1990-09-14 2003-04-29 The General Hospital Corporation Implanting HSV-TK retrovirus producing cells to treat tumors
JPH06500923A (ja) * 1990-09-21 1994-01-27 カイロン　コーポレイション パッケージング細胞
DE69132311T2 (de) 1990-09-25 2000-12-14 Cantab Pharma Res Bei einer transkomplementenden zellinie erzeugter defektiver virenimpfstoff
US5665362A (en) * 1990-09-25 1997-09-09 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Viral vaccines
US5837261A (en) * 1990-09-25 1998-11-17 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Viral vaccines
US7374768B1 (en) 1990-09-25 2008-05-20 Xenova Research Limited Viral vaccines
GB9100612D0 (en) * 1991-01-11 1991-02-27 Univ Edinburgh Method of altering the metabolic state of non-dividing cells,transgenic animals and therapeutic agents
GB9104165D0 (en) * 1991-02-27 1991-04-17 Wellcome Found Novel entities for hiv therapy
GB9107631D0 (en) * 1991-04-10 1991-05-29 British Bio Technology Proteinaceous particles
WO1993000103A1 (en) * 1991-06-21 1993-01-07 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Chimeric envelope proteins for viral targeting
WO1993005147A1 (en) * 1991-08-30 1993-03-18 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Defective interfering hiv particles with chimeric cd4-env
DE69230491T2 (de) * 1991-10-30 2000-08-03 Univ Paris Curie Transformierte zellen zur verhütung oder zur behandlung von virus-induzierten erkrankungen,besonders pathogenen retroviren
WO1993010218A1 (en) 1991-11-14 1993-05-27 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vectors including foreign genes and negative selective markers
US7223411B1 (en) 1992-07-31 2007-05-29 Dana-Farber Cancer Institute Herpesvirus replication defective mutants
GB2269175A (en) * 1992-07-31 1994-02-02 Imperial College Retroviral vectors
JP3533219B2 (ja) * 1992-11-09 2004-05-31 アメリカ合衆国 標的指向ベクター粒子
WO1994016072A1 (en) * 1993-01-14 1994-07-21 Intracell Therapeutics, Inc. Vectors useful for controlling hiv-1 replication and methods for using the same
CA2158936C (en) 1993-11-18 2012-02-21 Jack R. Barber Compositions and methods for utilizing conditionally lethal genes
US6451571B1 (en) 1994-05-02 2002-09-17 University Of Washington Thymidine kinase mutants
EP0758387B1 (en) * 1994-05-02 2001-12-19 University of Washington Thymidine kinase mutants
US5888814A (en) * 1994-06-06 1999-03-30 Chiron Corporation Recombinant host cells encoding TNF proteins
WO1995033842A1 (en) * 1994-06-07 1995-12-14 Immunomedics, Inc. Safe retroviral vectors, their production and use
GB9414652D0 (en) * 1994-07-20 1994-09-07 Moeller Erna Method of treatment
AU7665396A (en) * 1995-10-27 1997-05-15 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Recombinant viruses containing mobile genetic elements and methods of use in gene therapy
FR2741358B1 (fr) * 1995-11-17 1998-01-02 Centre Nat Rech Scient Production de vecteurs retroviraux par l'intermediaire de vecteurs viraux a base de virus a adn
US6365344B1 (en) 1996-01-23 2002-04-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for screening for transdominant effector peptides and RNA molecules
WO1997027213A1 (en) 1996-01-23 1997-07-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for screening for transdominant effector peptides and rna molecules
US6776986B1 (en) 1996-06-06 2004-08-17 Novartis Ag Inhibition of HIV-1 replication by antisense RNA expression
US6953687B1 (en) 1997-07-17 2005-10-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vectors for delivering viral and oncogenic inhibitors
EP0917585B1 (en) * 1996-07-22 2007-04-11 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Vectors for delivering viral and oncogenic inhibitors
US6544523B1 (en) 1996-11-13 2003-04-08 Chiron Corporation Mutant forms of Fas ligand and uses thereof
GB9703802D0 (en) 1997-02-24 1997-04-16 Kingsman Susan M Anti-hiv peptides and proteins
AU737727B2 (en) 1997-04-10 2001-08-30 University Of Southern California Modified viral surface proteins for binding to extracellular matrix components
GB9711578D0 (en) * 1997-06-04 1997-07-30 Oxford Biomedica Ltd Novel retroviral vector production systems
DE19737442C2 (de) * 1997-08-22 1999-06-24 Olfert Landt Tib Molbiol Synth Proteinumhüllte Polyribonukleinsäuren, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
JP2001514235A (ja) * 1997-09-02 2001-09-11 カイロン コーポレイション 遺伝子治療を利用して関節炎を処置するための組成物および方法
US6914131B1 (en) 1998-10-09 2005-07-05 Chiron S.R.L. Neisserial antigens
AU9363798A (en) 1997-11-06 1999-05-31 Chiron S.P.A. Neisserial antigens
SG152917A1 (en) 1998-01-14 2009-06-29 Chiron Srl Neisseria meningitidis antigens
US7078483B2 (en) 1998-04-29 2006-07-18 University Of Southern California Retroviral vectors including modified envelope escort proteins
EP2261347A3 (en) 1998-05-01 2012-01-11 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Neisseria meningitidis antigens and compositions
US6492166B1 (en) 1998-07-29 2002-12-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of constitutive transport elements for host range control
US6399354B1 (en) 1998-07-31 2002-06-04 President And Fellows Of Harvard College Replication-competent virus expressing a detectable fusion protein
EP1141313A2 (en) 1998-12-31 2001-10-10 Chiron Corporation Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles
US7935805B1 (en) 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
NZ581940A (en) 1999-04-30 2011-07-29 Novartis Vaccines & Diagnostic Conserved neisserial antigens
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
ATE449858T1 (de) * 1999-10-11 2009-12-15 Pasteur Institut Lentivirale vektoren für die herstellung von immunotherapeutischen zusammensetzungen
CN1433470A (zh) 1999-10-29 2003-07-30 启龙股份公司 奈瑟球菌的抗原性肽
DK1248647T3 (da) 2000-01-17 2010-09-27 Novartis Vaccines & Diagnostic Ydre membranvesikel (OMV) vaccine omfattende N. meningitidis serogruppe B ydre membranproteiner
PT1947187E (pt) 2000-02-28 2011-07-04 Novartis Vaccines & Diagnostic Expressões híbridas de proteínas de neisseria
CA2881568C (en) 2000-10-27 2019-09-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
AU2002235141A1 (en) 2000-11-27 2002-06-03 Geron Corporation Glycosyltransferase vectors for treating cancer
WO2002044394A2 (en) 2000-11-29 2002-06-06 University Of Southern California Targetet retoviral vectors for cancer immunotherapy
FR2820146B1 (fr) * 2001-01-29 2003-06-27 Centre Nat Rech Scient Procede d'obtention de cellules d'encapsidation fortement productrices de retrovirus par elimination, au sein de la culture, des cellules permissives a l'infection par le retro virus produit
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
GB0111442D0 (en) * 2001-05-10 2001-07-04 Isis Innovation Method for preparing recombinant virus
CA2452015C (en) 2001-07-05 2012-07-03 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
US20030198621A1 (en) 2001-07-05 2003-10-23 Megede Jan Zur Polynucleotides encoding antigenic HIV type B and/or type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
NZ533428A (en) 2001-12-12 2008-03-28 Chiron Srl Immunisation against chlamydia trachomatis
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
US20070178066A1 (en) 2003-04-21 2007-08-02 Hall Frederick L Pathotropic targeted gene delivery system for cancer and other disorders
JP2006524057A (ja) 2003-04-21 2006-10-26 エペイウス バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド 疾患を処置するための方法および組成物
EP1736541B1 (en) 2004-03-29 2013-01-23 Galpharma Co., Ltd. Novel modified galectin 9 protein and use thereof
GB0606190D0 (en) 2006-03-28 2006-05-10 Isis Innovation Construct
US20100015168A1 (en) 2006-06-09 2010-01-21 Novartis Ag Immunogenic compositions for streptococcus agalactiae
CN107022217A (zh) * 2017-06-08 2017-08-08 南通市乐佳涂料有限公司 一种采用水包水的环保抗锈涂料
CN109722465B (zh) * 2019-01-07 2022-02-01 福建省疾病预防控制中心(福建省健康教育促进中心、福建省卫生检验检测中心) 一种hiv耐药检测载体和构建方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2559159B1 (fr) * 1984-02-02 1986-09-12 Inst Nat Sante Rech Med Vecteurs viraux de clonage et d'expression d'une proteine dans une cellule eucaryote, comportant au moins une partie du genome d'un retro-virus; cellules eucaryotes transfectees; procede utilisant de telles cellules et proteines obtenues
CA1310924C (en) * 1986-04-24 1992-12-01 Francis P. Mccormick Infective drug delivery system
FR2606030B1 (fr) * 1986-10-31 1989-10-20 Pasteur Institut Retrovirus recombinant defectif, son procede de fabrication et ses applications, notamment pour l'etude de l'interaction des retrovirus sauvages avec des lignees cellulaires infectables par celui-ci
WO1990001870A1 (en) * 1988-08-22 1990-03-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce Retroviral vectors expressing soluble cd4; a gene therapy for aids

Also Published As

Publication number Publication date
NO314596B1 (no) 2003-04-14
AU651311B2 (en) 1994-07-21
WO1989009271A1 (en) 1989-10-05
DK175857B1 (da) 2005-04-11
GB9217086D0 (en) 1992-09-23
CH684094A5 (de) 1994-07-15
JP2007289206A (ja) 2007-11-08
AU3364089A (en) 1989-10-16
DE68929122T2 (de) 2000-04-20
CA1341585C (en) 2008-11-18
ATE187983T1 (de) 2000-01-15
ES2139810T3 (es) 2000-02-16
EP0702084A1 (en) 1996-03-20
IL89701A0 (en) 1989-09-28
EP0334301A1 (en) 1989-09-27
NO904103D0 (no) 1990-09-20
GB2255777B (en) 1993-02-03
JPH11262397A (ja) 1999-09-28
EP0334301B1 (en) 1998-12-23
DE68928884D1 (de) 1999-02-04
ATE174960T1 (de) 1999-01-15
DE68929122D1 (de) 2000-01-27
GB2255777A (en) 1992-11-18
DK226890D0 (da) 1990-09-20
DE68928884T2 (de) 1999-05-12
JP2002306188A (ja) 2002-10-22
JPH03504079A (ja) 1991-09-12
GB2236753A (en) 1991-04-17
GB9020586D0 (en) 1991-01-23
GB2236753B (en) 1993-02-03
JP2004008227A (ja) 2004-01-15
NO904103L (no) 1990-11-16
IL89701A (en) 1995-07-31
DK226890A (da) 1990-11-20
EP0702084B1 (en) 1999-12-22
FI904647A0 (fi) 1990-09-20
GR3032940T3 (en) 2000-07-31
CN1038306A (zh) 1989-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI113476B (fi) Menetelmä yhdistelmäretroviruksen valmistamiseksi
JP4041535B2 (ja) 標的細胞にベクター構造体を運搬する組換レトロウィルス
US6495349B1 (en) Chimeric gene constructs
US5856185A (en) Method for making reflection defective retroviral vectors for infecting human cells
JPH06500923A (ja) パッケージング細胞
JPH11505128A (ja) キメラインテグラーゼタンパク質に媒介される真核生物ゲノム中へのベクター構築物の位置特異的組み込み
JPH10512243A (ja) 遺伝子送達ビヒクルの非外傷性投与
JPH10512242A (ja) 組み合わせ遺伝子送達ビヒクル
JPH11503916A (ja) 高力価組換えレトロウイルス調製物による細胞の高効率エクスビボ形質導入
AU689799B2 (en) Recombinant retroviruses
US20040063652A1 (en) Combination gene delivery vehicles
GB2254424A (en) Indicator cells and retroviruses for the detection of gene sequenes
US20060121011A1 (en) Combination gene delivery vehicles
JPH10511951A (ja) 高力価組換えレトロウイルスの産生および投与

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: CHIRON CORPORATION

GB Transfer or assigment of application

Owner name: CHIRON CORPORATION

FG Patent granted

Owner name: CHIRON CORPORATION

MA Patent expired