JP3533219B2 - 標的指向ベクター粒子 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
この発明は「標的指向」ベクター粒子に関する。より
詳細には、この発明はヒトあるいは非ヒト動物の標的細
胞の受容体に結合する受容体結合領域を含むベクター粒
子に関する。
詳細には、この発明はヒトあるいは非ヒト動物の標的細
胞の受容体に結合する受容体結合領域を含むベクター粒
子に関する。
ベクター粒子は遺伝子あるいはDNA（RNA）を真核細胞
などのような細胞に導入するのに有用な因子である。遺
伝子は適切なプロモーターで調節される。ベクター粒子
を生成するのに使用されるベクターの例は、細菌ベクタ
ーなどの原核ベクター；酵母菌ベクターなどの真菌ベク
ターを含む真核ベクター；およびDNAウイルスベクター,
RNAウィルスベクター，レトロウイルスベクターなどの
ウイルスベクターを含む。遺伝子あるいはDNA（RNA）を
細胞に導入することによりベクター粒子を生成するのに
これまで使用されてきたレトロウイルスベクターは、モ
ロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、およ
びラウス肉腫ウイルスならびにハーヴェイ肉腫ウイルス
などのレトロウイルスから誘導されるベクターを含む。
ここで使用される「導入」という用語は、遺伝子あるい
はDNA（RNA）を細胞に移入する種々の方法を包含し、そ
のような方法は形質転換、形質導入、形質移入および感
染を含む。
などのような細胞に導入するのに有用な因子である。遺
伝子は適切なプロモーターで調節される。ベクター粒子
を生成するのに使用されるベクターの例は、細菌ベクタ
ーなどの原核ベクター；酵母菌ベクターなどの真菌ベク
ターを含む真核ベクター；およびDNAウイルスベクター,
RNAウィルスベクター，レトロウイルスベクターなどの
ウイルスベクターを含む。遺伝子あるいはDNA（RNA）を
細胞に導入することによりベクター粒子を生成するのに
これまで使用されてきたレトロウイルスベクターは、モ
ロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、およ
びラウス肉腫ウイルスならびにハーヴェイ肉腫ウイルス
などのレトロウイルスから誘導されるベクターを含む。
ここで使用される「導入」という用語は、遺伝子あるい
はDNA（RNA）を細胞に移入する種々の方法を包含し、そ
のような方法は形質転換、形質導入、形質移入および感
染を含む。
ベクター粒子はこれまでDNA（RNA）を細胞に導入して
遺伝子治療目的のために使用されてきた。一般にこのよ
うな方法は、患者から細胞をとり出し、ベクター粒子を
用いて望ましいDNA（RNA）を細胞に導入し、次いで治療
目的のため遺伝子操作された細胞を患者に提供すること
を含む。遺伝子治療のためには代替的手法を提供するこ
とが望ましい。このような代替的手法は遺伝子操作細胞
を「生体内」に含むことになろう。このような手法にお
いて、望ましいDNA（RNA）を含むベクター粒子は患者の
標的細胞に生体内で直接投与されることになろう。
遺伝子治療目的のために使用されてきた。一般にこのよ
うな方法は、患者から細胞をとり出し、ベクター粒子を
用いて望ましいDNA（RNA）を細胞に導入し、次いで治療
目的のため遺伝子操作された細胞を患者に提供すること
を含む。遺伝子治療のためには代替的手法を提供するこ
とが望ましい。このような代替的手法は遺伝子操作細胞
を「生体内」に含むことになろう。このような手法にお
いて、望ましいDNA（RNA）を含むベクター粒子は患者の
標的細胞に生体内で直接投与されることになろう。
従ってこの発明の一つの目的は、例えばレトロウイル
スベクター粒子のようなベクター粒子を患者の望ましい
標的細胞に直接導入することによって遺伝子治療を行う
ことである。
スベクター粒子のようなベクター粒子を患者の望ましい
標的細胞に直接導入することによって遺伝子治療を行う
ことである。
この発明の一つの見地に従って、標的細胞の受容体に
結合する受容体結合領域あるいはリガンドを含むレトロ
ウイルスベクター粒子が提供される。標的細胞の受容体
は、両性細胞受容体以外の受容体である。
結合する受容体結合領域あるいはリガンドを含むレトロ
ウイルスベクター粒子が提供される。標的細胞の受容体
は、両性細胞受容体以外の受容体である。
レトロウイルスは受容体結合領域を含有する包膜タン
パク質を持つ。もしレトロウイルスが他のものの中でも
両性，エコトロピック，あるいはキセノトロピックレト
ロウィルスである場合、包膜タンパク質の受容体結合領
域が標的細胞の受容体に結合する受容体結合領域を含む
ようにレトロウイルスの受容体結合領域が修飾されるな
らば、レトロウイルスが細胞の特異的なタイプに「標的
指向」することができることを出願人は発見した。例え
ば、レトロウイルスの包膜タンパク質の受容体結合領域
の少なくとも一部分が欠失し、標的細胞の受容体に結合
する受容体結合領域あるいはリガンドで置換される。か
くして、レトロウイルスの包膜タンパク質の受容体結合
領域をエンコードする少なくとも一部のDNA（RNA）が欠
失し、標的細胞の受容体に結合する受容体結合領域ある
いはリガンドをエンコードするDNA（RNA）で置換された
レトロウイルスベクターが提供される。
パク質を持つ。もしレトロウイルスが他のものの中でも
両性，エコトロピック，あるいはキセノトロピックレト
ロウィルスである場合、包膜タンパク質の受容体結合領
域が標的細胞の受容体に結合する受容体結合領域を含む
ようにレトロウイルスの受容体結合領域が修飾されるな
らば、レトロウイルスが細胞の特異的なタイプに「標的
指向」することができることを出願人は発見した。例え
ば、レトロウイルスの包膜タンパク質の受容体結合領域
の少なくとも一部分が欠失し、標的細胞の受容体に結合
する受容体結合領域あるいはリガンドで置換される。か
くして、レトロウイルスの包膜タンパク質の受容体結合
領域をエンコードする少なくとも一部のDNA（RNA）が欠
失し、標的細胞の受容体に結合する受容体結合領域ある
いはリガンドをエンコードするDNA（RNA）で置換された
レトロウイルスベクターが提供される。
一つの実施例において、レトロウイルスはマウス白血
病ウイルスである。
病ウイルスである。
マウス白血病ウイルスの包膜はgp70で知られるタンパ
ク質を含む。このようなウイルスは、もしgp70タンパク
質の一部が欠失し標的細胞の受容体に結合する受容体結
合領域あるいはリガンドで置換されるなら、ウイルスは
特異的タイプの細胞に「標的指向」することが出来る。
かくして望ましい実施例において、gp70タンパク質をエ
ンコードするDNA（RNA）の全部ではなく一部が欠失し、
標的細胞の受容体に結合する受容体結合領域あるいはリ
ガンドをエンコードするDNA（RNA）で置換されるレトロ
ウイルスベクターが提供される。
ク質を含む。このようなウイルスは、もしgp70タンパク
質の一部が欠失し標的細胞の受容体に結合する受容体結
合領域あるいはリガンドで置換されるなら、ウイルスは
特異的タイプの細胞に「標的指向」することが出来る。
かくして望ましい実施例において、gp70タンパク質をエ
ンコードするDNA（RNA）の全部ではなく一部が欠失し、
標的細胞の受容体に結合する受容体結合領域あるいはリ
ガンドをエンコードするDNA（RNA）で置換されるレトロ
ウイルスベクターが提供される。
一般にgp70タンパク失は下記の領域：（ｉ）分泌シグ
ナルあるいは「リーダー」配列，（ii）受容体結合ドメ
イン，（iii）ヒンジ領域、および（iv）ボディー部を
含む。望ましくはgp70タンパク質の受容体結合ドメイン
をエンコードするDNA（RNA）の少なくとも一部が欠失
し、標的細胞の受容体に結合する受容体結合領域あるい
はリガンドをエンコードするDNA（RNA）で置換される。
より望ましくは、gp70タンパク質の全縁受容体結合ドメ
インをエンコードするDNA（RNA）が欠失し、標的細胞の
受容体に結合する受容体結合領域あるいはリガンドをエ
ンコードするDNA（RNA）で置換される。も一つの実施例
において、gp70タンパク質の全縁受容体結合ドメインを
エンコードするDNA（RNA）、プラスgp70タンパク質のヒ
ンジ領域をエンコードするDNA（RNA）の全部あるいは一
部を欠失し、標的細胞の受容体結合領域あるいはリガン
ドをエンコードするDNA（RNA）で置換される。
ナルあるいは「リーダー」配列，（ii）受容体結合ドメ
イン，（iii）ヒンジ領域、および（iv）ボディー部を
含む。望ましくはgp70タンパク質の受容体結合ドメイン
をエンコードするDNA（RNA）の少なくとも一部が欠失
し、標的細胞の受容体に結合する受容体結合領域あるい
はリガンドをエンコードするDNA（RNA）で置換される。
より望ましくは、gp70タンパク質の全縁受容体結合ドメ
インをエンコードするDNA（RNA）が欠失し、標的細胞の
受容体に結合する受容体結合領域あるいはリガンドをエ
ンコードするDNA（RNA）で置換される。も一つの実施例
において、gp70タンパク質の全縁受容体結合ドメインを
エンコードするDNA（RNA）、プラスgp70タンパク質のヒ
ンジ領域をエンコードするDNA（RNA）の全部あるいは一
部を欠失し、標的細胞の受容体結合領域あるいはリガン
ドをエンコードするDNA（RNA）で置換される。
gp70タンパク質はエコトロピックマウス白血病ウイル
ス、キセノトロピックマウス白血病ウイルス、あるいは
両性マウス白血病ウイルスから誘導することが出来る。
エコトロピックgp70（あるいはエコgp70）（配列識別番
号１）はアミノ酸469個を持つタンパク質であり、（配
列識別番号２）でコードされる。アミノ酸残基１−33は
リーダー配列を構成する。アミノ酸残基34−263は受容
体結合ドメインを構成する。アミノ酸残基264−312はヒ
ンジ領域を構成する。また、アミノ酸残基313−469はボ
ディー部を構成する。望ましくは受容体結合領域の少な
くとも一部をエンコードするDNA（RNA）は除去され、標
的細胞の受容体に結合する受容体結合領域あるいはリガ
ンドをエンコードするDNA（RNA）で置換される。より望
ましくは、アミノ酸残基34から263（すなわち受容体結
合ドメイン）のいくつかあるいはすべてをエンコードす
るDNA（RNA）は除去され、標的細胞の受容体に結合する
受容体結合領域あるいはリガンドをエンコードするDNA
（RNA）で置換される。
ス、キセノトロピックマウス白血病ウイルス、あるいは
両性マウス白血病ウイルスから誘導することが出来る。
エコトロピックgp70（あるいはエコgp70）（配列識別番
号１）はアミノ酸469個を持つタンパク質であり、（配
列識別番号２）でコードされる。アミノ酸残基１−33は
リーダー配列を構成する。アミノ酸残基34−263は受容
体結合ドメインを構成する。アミノ酸残基264−312はヒ
ンジ領域を構成する。また、アミノ酸残基313−469はボ
ディー部を構成する。望ましくは受容体結合領域の少な
くとも一部をエンコードするDNA（RNA）は除去され、標
的細胞の受容体に結合する受容体結合領域あるいはリガ
ンドをエンコードするDNA（RNA）で置換される。より望
ましくは、アミノ酸残基34から263（すなわち受容体結
合ドメイン）のいくつかあるいはすべてをエンコードす
るDNA（RNA）は除去され、標的細胞の受容体に結合する
受容体結合領域あるいはリガンドをエンコードするDNA
（RNA）で置換される。
キセノトロピックgp70（あるいはキセノgp70）（配列
識別番号３）はアミノ酸443個を持ち、（配列識別番号
４）でエンコードされる。アミノ酸残基１−30はリーダ
ー配列を構成する。アミノ酸残基31−232は受容体結合
ドメインを構成する。アミノ酸残基233−286はヒンジ領
域を構成する。またアミノ酸残基287−443はボディー部
を構成する。望ましくは、受容体結合領域の少なくとも
一部をエンコードするDNA（RNA）は除去され、標的細胞
の受容体に結合する受容体結合領域あるいはリガンドを
エンコードするDNA（RNA）で置換される。より望ましく
は、アミノ酸残基31から232のいくつかあるいはすべて
をエンコードするDNA（RNA）は除去され、標的細胞の受
容体に結合する受容体結合領域あるいはリガンドをエン
コードするDNA（RNA）で置換される。
識別番号３）はアミノ酸443個を持ち、（配列識別番号
４）でエンコードされる。アミノ酸残基１−30はリーダ
ー配列を構成する。アミノ酸残基31−232は受容体結合
ドメインを構成する。アミノ酸残基233−286はヒンジ領
域を構成する。またアミノ酸残基287−443はボディー部
を構成する。望ましくは、受容体結合領域の少なくとも
一部をエンコードするDNA（RNA）は除去され、標的細胞
の受容体に結合する受容体結合領域あるいはリガンドを
エンコードするDNA（RNA）で置換される。より望ましく
は、アミノ酸残基31から232のいくつかあるいはすべて
をエンコードするDNA（RNA）は除去され、標的細胞の受
容体に結合する受容体結合領域あるいはリガンドをエン
コードするDNA（RNA）で置換される。
レトロウイルスベクター粒子が結合する標的細胞は、
必ずしもそれに限定されないが肝臓細胞、Ｔ細胞、リン
パ球、内皮細胞、T4ヘルパー細胞およびマクロファージ
である。一つの実施例においてレトロウイルスベクター
粒子は肝臓細胞、とりわけ肝細胞に結合する。このよう
な結合を可能にするため、レトロウイルスベクターはDN
A（RNA）によりエンコードされるキメラタンパク質を含
有し、ここでgp70タンク質の受容体結合ドメインをエン
コードするDNA（RNA）の少なくとも一部が除去され、肝
細胞のアシアログリコプロテイン受容体（あるいはASG
−Ｒ）に結合するタンパク質をエンコードするDNA（RN
A）で置換される。
必ずしもそれに限定されないが肝臓細胞、Ｔ細胞、リン
パ球、内皮細胞、T4ヘルパー細胞およびマクロファージ
である。一つの実施例においてレトロウイルスベクター
粒子は肝臓細胞、とりわけ肝細胞に結合する。このよう
な結合を可能にするため、レトロウイルスベクターはDN
A（RNA）によりエンコードされるキメラタンパク質を含
有し、ここでgp70タンク質の受容体結合ドメインをエン
コードするDNA（RNA）の少なくとも一部が除去され、肝
細胞のアシアログリコプロテイン受容体（あるいはASG
−Ｒ）に結合するタンパク質をエンコードするDNA（RN
A）で置換される。
肝臓細胞のアシアログリコプロテインに結合するタン
パク質は必ずしもそれに限定されないが、オロソムコイ
ドとして知られるα１アシッドグリコプロテイン（AG
P）、およびアシアロフェチュインである。AGPはASG−
Ｒに対する天然の高結合性リガンドである。アシアログ
リコプロテイン受容体は肝細胞によってのみ発現され
る。受容体は細胞当り約３×105模写で存在し、こよう
な受容体はAGPのようにアシアログリコプロテインに対
して高結合性を有する。かくしてgp70の天然受容体結合
ドメインに代わりアシアログリコプロテインを含有する
レトロフィルスベクター粒子の遺伝子操作手法は、肝細
胞のアシアログリコプロテインに結合し、対象となる遺
伝子を肝臓細胞へ移入させる効率的な手段を提供するレ
トロウイルスベクター粒子を生成する。
パク質は必ずしもそれに限定されないが、オロソムコイ
ドとして知られるα１アシッドグリコプロテイン（AG
P）、およびアシアロフェチュインである。AGPはASG−
Ｒに対する天然の高結合性リガンドである。アシアログ
リコプロテイン受容体は肝細胞によってのみ発現され
る。受容体は細胞当り約３×105模写で存在し、こよう
な受容体はAGPのようにアシアログリコプロテインに対
して高結合性を有する。かくしてgp70の天然受容体結合
ドメインに代わりアシアログリコプロテインを含有する
レトロフィルスベクター粒子の遺伝子操作手法は、肝細
胞のアシアログリコプロテインに結合し、対象となる遺
伝子を肝臓細胞へ移入させる効率的な手段を提供するレ
トロウイルスベクター粒子を生成する。
細胞系はレトロウイルスベクター粒子を生成し、それ
はノイラミニダーゼ処理により粒子末端シアル酸基を除
去することなく肝細胞のアシアログリコプロテイン受容
体を標的指向することが可能であるが、この細胞系は細
胞障害レクチン，コムギ胚芽凝集素（WGA）により選択
的に発育することが出来る。レトロウイルスタンパク質
gagおよびpolを発現する細胞系は、キメラ包膜遺伝子を
エンコードするプラスミドで形質移入された後に、レト
ロウイルスベクター・パッケージング細胞系となる。こ
れら細胞系は対応するキメラgp70グリコプロテインを発
現する。より高い濃度のWGAに連続して曝すことによっ
て、末端シアル酸基を欠くグリコプロテインを合成する
細胞の成長が確証される（スタンレー，他「体細胞遺伝
学」３巻、391−405ページ（1977年））。この選択は、
ガラクトシル糖群において終結するオリゴ糖を合成する
細胞の分離を可能にする。このような細胞なアシアログ
リコプロテイン受容体を標的指向するレトロウイルスベ
クター粒子を生成することのできるパッケージング細胞
系の構築を可能とする。他の異なった糖タイプを持つパ
ッケージング細胞の亜個体群を選択することもまた可能
であり、このような細胞は肝細胞以外の細胞を標的指向
することが潜在的に可能であるウイルスベクターを産出
する。例えばマクロファージはユニークな高マンノース
受容体を発現する。PHA耐性亜個体群は、高マンノース
基で終結するＮ結合オリゴ糖を持つであろう（スタンレ
ー他，「インビトロ」12巻,208−215ページ（1976
年））。従って、このような細胞個体群は、この受容体
を経由してマクロファージを標的指向出来るウイルスベ
クター粒子を産出することが出来るであろう。他の細胞
障害レクチンで選択された後他の新規なオリゴ糖を合成
する突然変異体糖タイプを持つ細胞もまた、リンパ球あ
るいは内皮細胞のような他の細胞タイプにベクター粒子
を標的指向させるのに有用であることが証明されること
になる。
はノイラミニダーゼ処理により粒子末端シアル酸基を除
去することなく肝細胞のアシアログリコプロテイン受容
体を標的指向することが可能であるが、この細胞系は細
胞障害レクチン，コムギ胚芽凝集素（WGA）により選択
的に発育することが出来る。レトロウイルスタンパク質
gagおよびpolを発現する細胞系は、キメラ包膜遺伝子を
エンコードするプラスミドで形質移入された後に、レト
ロウイルスベクター・パッケージング細胞系となる。こ
れら細胞系は対応するキメラgp70グリコプロテインを発
現する。より高い濃度のWGAに連続して曝すことによっ
て、末端シアル酸基を欠くグリコプロテインを合成する
細胞の成長が確証される（スタンレー，他「体細胞遺伝
学」３巻、391−405ページ（1977年））。この選択は、
ガラクトシル糖群において終結するオリゴ糖を合成する
細胞の分離を可能にする。このような細胞なアシアログ
リコプロテイン受容体を標的指向するレトロウイルスベ
クター粒子を生成することのできるパッケージング細胞
系の構築を可能とする。他の異なった糖タイプを持つパ
ッケージング細胞の亜個体群を選択することもまた可能
であり、このような細胞は肝細胞以外の細胞を標的指向
することが潜在的に可能であるウイルスベクターを産出
する。例えばマクロファージはユニークな高マンノース
受容体を発現する。PHA耐性亜個体群は、高マンノース
基で終結するＮ結合オリゴ糖を持つであろう（スタンレ
ー他，「インビトロ」12巻,208−215ページ（1976
年））。従って、このような細胞個体群は、この受容体
を経由してマクロファージを標的指向出来るウイルスベ
クター粒子を産出することが出来るであろう。他の細胞
障害レクチンで選択された後他の新規なオリゴ糖を合成
する突然変異体糖タイプを持つ細胞もまた、リンパ球あ
るいは内皮細胞のような他の細胞タイプにベクター粒子
を標的指向させるのに有用であることが証明されること
になる。
も一つの実施例において、受容体結合領域はヒトウイ
ルスの受容体結合領域である。一実施例ではヒトウイル
ス受容体結合領域はＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質結
合領域であり、標的細胞は肝臓細胞である。
ルスの受容体結合領域である。一実施例ではヒトウイル
ス受容体結合領域はＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質結
合領域であり、標的細胞は肝臓細胞である。
も一つの実施例においてヒトウイルスの受容体結合領
域はHTLV−Ｉ（ヒトＴ細胞リンパ球ウイルスＩ型）ウイ
ルスのgp46タンパク質であり、標的細胞はＴ細胞であ
る。
域はHTLV−Ｉ（ヒトＴ細胞リンパ球ウイルスＩ型）ウイ
ルスのgp46タンパク質であり、標的細胞はＴ細胞であ
る。
更にも一つの実施例において、ヒトウイルスの受容体
結合領域は、HIV（ヒト免疫不全ウイルス）gp120 CD4
結合領域であり、標的細胞T4ヘルパー細胞である。
結合領域は、HIV（ヒト免疫不全ウイルス）gp120 CD4
結合領域であり、標的細胞T4ヘルパー細胞である。
一つの実施例において、ベンダー他「ウイルス学ジャ
ーナル61巻、1639−1649ページ（1987年）、およびミラ
ー他「バイオテクニク」７巻、980−990ページ（1989
年）に記述されているように、レトロウイルスベクター
はLNシリーズのベクターである。
ーナル61巻、1639−1649ページ（1987年）、およびミラ
ー他「バイオテクニク」７巻、980−990ページ（1989
年）に記述されているように、レトロウイルスベクター
はLNシリーズのベクターである。
も一つの実施例において、レトロウイルスベクターは
多重制限酵素部位を、あるいは多重クローニング部位を
含む。多重クローニング部位は少なくとも４個のクロー
ニングあるいは制限酵素部位を含み、ここで少なくとも
２個の部位は10,000塩基対で１回以下の真核遺伝子内平
均出現頻度を持つ。すなわち制限生成物は少なくとも1
0,000塩基対の平均サイズを有する。
多重制限酵素部位を、あるいは多重クローニング部位を
含む。多重クローニング部位は少なくとも４個のクロー
ニングあるいは制限酵素部位を含み、ここで少なくとも
２個の部位は10,000塩基対で１回以下の真核遺伝子内平
均出現頻度を持つ。すなわち制限生成物は少なくとも1
0,000塩基対の平均サイズを有する。
一般に、このような制限部位、または以下「希有」部
位としてしばしば引用される部位は10,000塩基対に１回
以下の真核遺伝子内平均出現頻度を持ち、その認識配列
内にCGダブレットを含有し、このようなダブレットは特
に哺乳類ゲノムでは殆どまれにしか現れない。哺乳類に
おける制限酵素部位の「希有度」あるいは「希少性」を
表わす他の尺度は、SV40などの哺乳類ウイルスで表示さ
れる。一般にその認識部位がSV40で欠除している酵素
は、「希有」哺乳類カッターになり得る候補であり得
る。
位としてしばしば引用される部位は10,000塩基対に１回
以下の真核遺伝子内平均出現頻度を持ち、その認識配列
内にCGダブレットを含有し、このようなダブレットは特
に哺乳類ゲノムでは殆どまれにしか現れない。哺乳類に
おける制限酵素部位の「希有度」あるいは「希少性」を
表わす他の尺度は、SV40などの哺乳類ウイルスで表示さ
れる。一般にその認識部位がSV40で欠除している酵素
は、「希有」哺乳類カッターになり得る候補であり得
る。
10,000塩基対当り１回以下の真核遺伝子内平均出現率
を持つ制限酵素部位の例は、必ずしもそれに限定されな
いが、Not I、SnaB I、Sal I,Xho I,Cla I,Sac I,Eag I
およびSma Iの各部位である。望ましいクローニング部
位は、Not I,SnaB I,Sal I,およびXho Iよりなるグルー
プから選択される。
を持つ制限酵素部位の例は、必ずしもそれに限定されな
いが、Not I、SnaB I、Sal I,Xho I,Cla I,Sac I,Eag I
およびSma Iの各部位である。望ましいクローニング部
位は、Not I,SnaB I,Sal I,およびXho Iよりなるグルー
プから選択される。
望ましくは多重クローニング部位は約70塩基対以下の
長さであり、より望ましくは約60塩基対以下である。一
般に多重制限酵素部位、すなわち多重クローニング部位
はレトロウイルスベクターの５′LTRおよび３′3TRの間
に位置を占める。多重クローニング部位の５′末端は
５′LTRの３′末端から約895塩基対以下であり、望まし
くは５′LTRの３′末端から少なくとも約375塩基対であ
る。多重クローニング部位の３′末端は３′LTRの５′
末端から約40塩基対以下であり、また望ましくは３′LT
Rの５′末端から少なくとも11塩基対である。
長さであり、より望ましくは約60塩基対以下である。一
般に多重制限酵素部位、すなわち多重クローニング部位
はレトロウイルスベクターの５′LTRおよび３′3TRの間
に位置を占める。多重クローニング部位の５′末端は
５′LTRの３′末端から約895塩基対以下であり、望まし
くは５′LTRの３′末端から少なくとも約375塩基対であ
る。多重クローニング部位の３′末端は３′LTRの５′
末端から約40塩基対以下であり、また望ましくは３′LT
Rの５′末端から少なくとも11塩基対である。
このようなベクターはレトロウルスベクターが少なく
とも４個のクローニング部位を含むような従来の技術で
知られる遺伝子操作手法を通じて現存するレトロウイル
スベクターから操作することが出来、ここでは少なくと
も２個のクローニング部位がNot I,SnaB I,Sal I,およ
びXho Iクローニング部位よりなるグループから選択さ
れる。望ましい実施例においては、レトロウイルスベク
ターはNot I,,SnaB I,Sal IおよびXho Iクローニング部
位のそれぞれを含む。
とも４個のクローニング部位を含むような従来の技術で
知られる遺伝子操作手法を通じて現存するレトロウイル
スベクターから操作することが出来、ここでは少なくと
も２個のクローニング部位がNot I,SnaB I,Sal I,およ
びXho Iクローニング部位よりなるグループから選択さ
れる。望ましい実施例においては、レトロウイルスベク
ターはNot I,,SnaB I,Sal IおよびXho Iクローニング部
位のそれぞれを含む。
このようなレトロウイルスベクターは、遺伝子をレト
ロウイルスベクターに移入するためのクローニングシス
テムの部分として役立つ。かくして前記記載のタイプの
多重クローニング部位を含むレトロウイルスベクター、
およびレトロウイルスベクターに位置するNot I,SnaB
I,Sal I,およびXho Iからなるグループから選択される
少なくとも２個のクローニング部位と適合性である少な
くとも２個のクローニング部位を含むシャトルクローニ
ングベクターを含むレトロウイルスベクターにある遺伝
子操作のための一つのクローニングシステムが提供され
る。シャトルクローニングベクターは更に、前記シャト
ルクローニングベクターから前記レトロウイルスベクタ
ーに移入されることが可能な少なくとも１個の望ましい
遺伝子を含む。
ロウイルスベクターに移入するためのクローニングシス
テムの部分として役立つ。かくして前記記載のタイプの
多重クローニング部位を含むレトロウイルスベクター、
およびレトロウイルスベクターに位置するNot I,SnaB
I,Sal I,およびXho Iからなるグループから選択される
少なくとも２個のクローニング部位と適合性である少な
くとも２個のクローニング部位を含むシャトルクローニ
ングベクターを含むレトロウイルスベクターにある遺伝
子操作のための一つのクローニングシステムが提供され
る。シャトルクローニングベクターは更に、前記シャト
ルクローニングベクターから前記レトロウイルスベクタ
ーに移入されることが可能な少なくとも１個の望ましい
遺伝子を含む。
シャトルクローニングベクターは塩基性「バックボー
ン」ベクターあるいは断片から構築することが出来、こ
のベクターあるいは断片にクローニングあるいは制限酵
素部位を含む１個もしくはそれ以上のリンカーが連結さ
れる。クローニング部位に含まれるものは前記適合性、
あるいは相補的クローニング部位である。シャトルベク
ターの制限部位に対応する末端を持つ遺伝子およびもし
くはプロモーターは、従来の技術によりシャトルベクタ
ーに連結することが出来る。
ン」ベクターあるいは断片から構築することが出来、こ
のベクターあるいは断片にクローニングあるいは制限酵
素部位を含む１個もしくはそれ以上のリンカーが連結さ
れる。クローニング部位に含まれるものは前記適合性、
あるいは相補的クローニング部位である。シャトルベク
ターの制限部位に対応する末端を持つ遺伝子およびもし
くはプロモーターは、従来の技術によりシャトルベクタ
ーに連結することが出来る。
シャトルクローニングベクターは原核システム内でDN
Aを増幅するのに使用する。シャトルクローニングベク
ターは一般に原核システムに、とりわけ細菌に使用され
るプラスミドから調製される。かくして、例えばシャト
ルクローニングベクターは、pBR322,pUC18などのプラス
ミドから誘導される。
Aを増幅するのに使用する。シャトルクローニングベク
ターは一般に原核システムに、とりわけ細菌に使用され
るプラスミドから調製される。かくして、例えばシャト
ルクローニングベクターは、pBR322,pUC18などのプラス
ミドから誘導される。
このようなレトロウイルスベクターはパッケージング
細胞系に形質移入あるいは形質導入され、これによりレ
トロウイルスベクターを含む感染性ベクター粒子が生成
される。一般にベクターはウイルスのgag,polおよびenv
タンパク質をエンコードする遺伝子を含むパッケージン
グ欠陥ヘルパーウイルスと一緒にパッケージング細胞系
に形質移入される。パッケージング細胞系の代表的な例
は必ずしもそれに限定されないが、ミラー他「バイオテ
クニク」７巻、980−990ページ（1989年）で開示された
PE501およびPA317細胞系である。
細胞系に形質移入あるいは形質導入され、これによりレ
トロウイルスベクターを含む感染性ベクター粒子が生成
される。一般にベクターはウイルスのgag,polおよびenv
タンパク質をエンコードする遺伝子を含むパッケージン
グ欠陥ヘルパーウイルスと一緒にパッケージング細胞系
に形質移入される。パッケージング細胞系の代表的な例
は必ずしもそれに限定されないが、ミラー他「バイオテ
クニク」７巻、980−990ページ（1989年）で開示された
PE501およびPA317細胞系である。
パッケージ細胞系から生成されるベクター粒子は、標
的細胞の受容体と結合する受容体結合領域を含むタンパ
ク質で工学的に作られ、前記受容体は両性細胞受容体以
外のものであったが、このベクター粒子は標的指向であ
り、これにより受容体結合領域はベクター粒子を標的細
胞に結合させることが出来る。レトロウイルスベクター
粒子はこうして望ましい標的細胞に「生体外」で直接投
与され、このような細胞は次いで遺伝子治療方法の一部
として患者に投与される。
的細胞の受容体と結合する受容体結合領域を含むタンパ
ク質で工学的に作られ、前記受容体は両性細胞受容体以
外のものであったが、このベクター粒子は標的指向であ
り、これにより受容体結合領域はベクター粒子を標的細
胞に結合させることが出来る。レトロウイルスベクター
粒子はこうして望ましい標的細胞に「生体外」で直接投
与され、このような細胞は次いで遺伝子治療方法の一部
として患者に投与される。
ベクター粒子は直接標的細胞に投与されるけれども、
ベクター粒子が標的指向であると同様に「注射可能」で
あるようにベクター粒子は遺伝子操作される。すなわち
ベクター粒子はヒト血清による不活性化に耐性であり、
かくして標的指向ベクター粒子は患者に対し静脈注射に
より投与され、ヒト血清により不活性化されることなく
望ましい標的細胞あるいは組織に直接進行する。
ベクター粒子が標的指向であると同様に「注射可能」で
あるようにベクター粒子は遺伝子操作される。すなわち
ベクター粒子はヒト血清による不活性化に耐性であり、
かくして標的指向ベクター粒子は患者に対し静脈注射に
より投与され、ヒト血清により不活性化されることなく
望ましい標的細胞あるいは組織に直接進行する。
レトロウイルスの包膜はp15Eとして知られるタンパク
質も含み、レトロウイルスのp15Eタンパク質部の血清に
存在する補体タンパク質の作用の結果としてヒト血清に
よる不活性化をレトロウイルスが受けやすいことを出願
人は発見した。出願人は更にこのようなレトロウイルが
p15Eタンパク質の様なものを突然変異させることにより
ヒト血清による不活性化に耐性にさせ得ることも発見し
た。
質も含み、レトロウイルスのp15Eタンパク質部の血清に
存在する補体タンパク質の作用の結果としてヒト血清に
よる不活性化をレトロウイルスが受けやすいことを出願
人は発見した。出願人は更にこのようなレトロウイルが
p15Eタンパク質の様なものを突然変異させることにより
ヒト血清による不活性化に耐性にさせ得ることも発見し
た。
従って、一つの実施例では（添付配列リストで配列識
別番号７で示される）p15Eタンパク質をエンコードする
DNA（RNA）の一部が、ヒト血清による不活性化にベクタ
ー粒子を耐性にするように突然変異されるようにベクタ
ー粒子が遺伝子操作され、すなわちp15Eタンパク質のア
ミノ酸の全部ではなく少なくとも１個のアミノ酸が交換
され、あるいは突然変異された。
別番号７で示される）p15Eタンパク質をエンコードする
DNA（RNA）の一部が、ヒト血清による不活性化にベクタ
ー粒子を耐性にするように突然変異されるようにベクタ
ー粒子が遺伝子操作され、すなわちp15Eタンパク質のア
ミノ酸の全部ではなく少なくとも１個のアミノ酸が交換
され、あるいは突然変異された。
p15Eタンパク質は196個のアミノ酸残基を持つウイル
スタンパク質である。ウイルスではある時は196個のア
ミノ酸残基全部が存在し、また他のウイルスではアミノ
酸残基181から196（「ｒ」ペプチドとして知られるも
の）が存在せず、生成するタンパク質はp12Eとして知ら
れるp15Eの「成熟」形態となる。かくしてウイルスはp1
5Eおよびp12Eタンパク質双方を含むことが出来る。p15E
タンパク質はアミノ酸残基１から134がウイルスの外側
に存在するようにウイルス膜内に固定される。この発明
の実施例は以下に述べる論証のいずれにも限定されるも
のではないが、補体タンパク質がこの領域に結合し、そ
れによりこのような結合がレトロウイルスの不活性化お
よびもしくは溶菌に導くものと出願人は確信する。とり
わけp15Eタンパク質は２個の領域，アミノ酸残基39から
61（以下領域１として引用される）およびアミノ残基10
1から123（以下領域２として引用される）を含み、これ
がp15Eタンパク質の３次元構造内で外部に位置すると出
願人は考える。つまりこのような領域は直接ヒト血清に
曝される。領域２は、その領域のアミノ酸配列がすべて
のレトロウイルスで同一でないけれども、それは多くの
レトロウイルスにおいて、高度の保存領域である。この
ような領域は補体結合領域である。補体結合領域に結合
する補体タンパク質の例はC1SおよびC2Sであり、これは
領域１および２に結合する。
スタンパク質である。ウイルスではある時は196個のア
ミノ酸残基全部が存在し、また他のウイルスではアミノ
酸残基181から196（「ｒ」ペプチドとして知られるも
の）が存在せず、生成するタンパク質はp12Eとして知ら
れるp15Eの「成熟」形態となる。かくしてウイルスはp1
5Eおよびp12Eタンパク質双方を含むことが出来る。p15E
タンパク質はアミノ酸残基１から134がウイルスの外側
に存在するようにウイルス膜内に固定される。この発明
の実施例は以下に述べる論証のいずれにも限定されるも
のではないが、補体タンパク質がこの領域に結合し、そ
れによりこのような結合がレトロウイルスの不活性化お
よびもしくは溶菌に導くものと出願人は確信する。とり
わけp15Eタンパク質は２個の領域，アミノ酸残基39から
61（以下領域１として引用される）およびアミノ残基10
1から123（以下領域２として引用される）を含み、これ
がp15Eタンパク質の３次元構造内で外部に位置すると出
願人は考える。つまりこのような領域は直接ヒト血清に
曝される。領域２は、その領域のアミノ酸配列がすべて
のレトロウイルスで同一でないけれども、それは多くの
レトロウイルスにおいて、高度の保存領域である。この
ような領域は補体結合領域である。補体結合領域に結合
する補体タンパク質の例はC1SおよびC2Sであり、これは
領域１および２に結合する。
レトロウイルスを不活性化するために、補体タンパク
質は領域１および領域２に結合する。かくして望ましい
実施例において、p15Eタンパク質の補体結合領域をエン
コードするDNAの少なくとも一部が突然変異される。こ
の突然変異はp15Eタンパク質の補体結合領域の少なくと
も１個のアミノ酸残基の変化を起こす。p15Eタンパク質
の補体結合領域の少なくとも１個のアミノ酸残基の変化
は、補体結合領域に補体タンパク質が結合するのを妨
げ、レトロウイルスの補体不活性を妨げる。一つの実施
例において、p15Eタンパク質の両方の補体結合領域で少
なくとも１個のアミノ酸残基が変化し、一方も一つの実
施例においては、補体結合領域の一つの少なくとも１個
のアミノ酸残基が変化する。
質は領域１および領域２に結合する。かくして望ましい
実施例において、p15Eタンパク質の補体結合領域をエン
コードするDNAの少なくとも一部が突然変異される。こ
の突然変異はp15Eタンパク質の補体結合領域の少なくと
も１個のアミノ酸残基の変化を起こす。p15Eタンパク質
の補体結合領域の少なくとも１個のアミノ酸残基の変化
は、補体結合領域に補体タンパク質が結合するのを妨
げ、レトロウイルスの補体不活性を妨げる。一つの実施
例において、p15Eタンパク質の両方の補体結合領域で少
なくとも１個のアミノ酸残基が変化し、一方も一つの実
施例においては、補体結合領域の一つの少なくとも１個
のアミノ酸残基が変化する。
しかしp15Eタンパク質をエンコードする全縁DNA配列
は突然変異することはできないということが理解されね
ばならない。というのはそのような変化はベクターが
「生体内」での使用には不適切になるためである。
は突然変異することはできないということが理解されね
ばならない。というのはそのような変化はベクターが
「生体内」での使用には不適切になるためである。
一つの実施例においてp15Eタンパク質をエンコードす
るDNA（RNA）の突然変異はp15E遺伝子の一部を欠失し、
p15E遺伝子の欠失部をも一つのウイルスタンパク質をエ
ンコードする遺伝子の断片あるいは部分で置換すること
で実施される。一つの実施例では、p15Eタンパク質をエ
ンコードするDNAの一部が、HTLV−Ｉトランスメンブレ
ンタンパク質であるp21タンパク質をエンコードする遺
伝子の断片で置換される。HTLV−Ｉウイルスは補体タン
パク質による結合に耐性であり、従って、HTLV−Ｉはヒ
ト血清による不活性化に耐性であることが発見された
（星野他「ネイチャー」310巻、324−325ページ（1984
年））。かくして一つの実施例では、p15Eタンパク質の
一部が欠失しp21タンパク質の一部のようなも一つのウ
イルスタンパク質の一部で置換されているレトロウイル
スベクターも提供される。
るDNA（RNA）の突然変異はp15E遺伝子の一部を欠失し、
p15E遺伝子の欠失部をも一つのウイルスタンパク質をエ
ンコードする遺伝子の断片あるいは部分で置換すること
で実施される。一つの実施例では、p15Eタンパク質をエ
ンコードするDNAの一部が、HTLV−Ｉトランスメンブレ
ンタンパク質であるp21タンパク質をエンコードする遺
伝子の断片で置換される。HTLV−Ｉウイルスは補体タン
パク質による結合に耐性であり、従って、HTLV−Ｉはヒ
ト血清による不活性化に耐性であることが発見された
（星野他「ネイチャー」310巻、324−325ページ（1984
年））。かくして一つの実施例では、p15Eタンパク質の
一部が欠失しp21タンパク質の一部のようなも一つのウ
イルスタンパク質の一部で置換されているレトロウイル
スベクターも提供される。
p21タンパク質（添付配列リストで配列識別番号８で
示される）は176個のアミノ酸残基を持つタンパク質で
あり、これはp15Eとの関連で顕著なアミノ酸配列相同性
を持つ。一つの実施例において、少なくともアミノ酸残
基39から61、および101から123までがp15Eタンパク質か
ら欠失し、p21タンパク質のアミノ酸残基34から56,およ
び96から118により置換される。一つの代替実施例で
は、p15Eの少なくとも39から123までのアミノ酸残基が
欠失し、p21タンパク質のアミノ酸残基34から118で置換
される。
示される）は176個のアミノ酸残基を持つタンパク質で
あり、これはp15Eとの関連で顕著なアミノ酸配列相同性
を持つ。一つの実施例において、少なくともアミノ酸残
基39から61、および101から123までがp15Eタンパク質か
ら欠失し、p21タンパク質のアミノ酸残基34から56,およ
び96から118により置換される。一つの代替実施例で
は、p15Eの少なくとも39から123までのアミノ酸残基が
欠失し、p21タンパク質のアミノ酸残基34から118で置換
される。
も一つの実施例において、p15Eタンパク質のアミノ酸
残基39から69が欠失し、p21たんぱく質のアミノ酸残基3
4から64で置換され、またp15Eタンパク質のアミノ酸残
基96から123が欠失しp21タンパク質のアミノ酸残基91か
ら118で置換される。
残基39から69が欠失し、p21たんぱく質のアミノ酸残基3
4から64で置換され、またp15Eタンパク質のアミノ酸残
基96から123が欠失しp21タンパク質のアミノ酸残基91か
ら118で置換される。
従ってこのようなパッケージング系から生成されるベ
クター粒子は「標的指向」および「注射可能」であり、
ここでそのベクター粒子は患者への投与に際し直接望ま
しい標的細胞あるいは組織に進行する。
クター粒子は「標的指向」および「注射可能」であり、
ここでそのベクター粒子は患者への投与に際し直接望ま
しい標的細胞あるいは組織に進行する。
標的指向ベクター粒子は望ましい異型遺伝子を標的細
胞に「生体外」で導入するのに有用である。このような
細胞は次いで患者に遺伝子治療方法として投与され、標
的指向で注射可能なこのベクター粒子は「生体内」で患
者に投与され、そこでベクター粒子は望ましい標的細胞
に直接進行する。
胞に「生体外」で導入するのに有用である。このような
細胞は次いで患者に遺伝子治療方法として投与され、標
的指向で注射可能なこのベクター粒子は「生体内」で患
者に投与され、そこでベクター粒子は望ましい標的細胞
に直接進行する。
かくして、望ましくはこの発明のベクターあるいはベ
クター粒子は更に少なくとも１個の異型遺伝子を含む。
ベクターあるいはベクター粒子に位置される異型あるい
は外来性遺伝子は、必ずしもそれに限定されないが、リ
ンパ球の成長因子であるリンホカインのようなサイトカ
インあるいは細胞成長因子をエンコードする遺伝子であ
る。外来性遺伝子の他の例は、必ずしもそれに限定され
ないが、因子VIII,因子IX,腫瘍壊死因子（TNF's）、AD
A,ApoE,ApoC、およびプロテインＣである。
クター粒子は更に少なくとも１個の異型遺伝子を含む。
ベクターあるいはベクター粒子に位置される異型あるい
は外来性遺伝子は、必ずしもそれに限定されないが、リ
ンパ球の成長因子であるリンホカインのようなサイトカ
インあるいは細胞成長因子をエンコードする遺伝子であ
る。外来性遺伝子の他の例は、必ずしもそれに限定され
ないが、因子VIII,因子IX,腫瘍壊死因子（TNF's）、AD
A,ApoE,ApoC、およびプロテインＣである。
この発明のベクターは１個あるいはそれ以上のプロモ
ーターを含む。採用される適切なプロモーターは、必ず
しもそれに限定されないが、レトロウイルスLTR;SV40プ
ロモーター；およびミラー他「バイオテクニク」７巻、
９号980−990ページ（1989年）で説明されているヒトサ
イトメガロウイルス（CMV）プロモーター、あるいは他
の何らかのプロモーター（例えば必ずしもそれに限定さ
れないが、ヒストン,pol III,およびＢアクチンプロモ
ーターなどを含む真核細胞プロモーターなどのような細
胞プロモーター）を含む。採用される他のウイルスプロ
モーターは、必ずしもそれに限定されないが、アデノウ
イルスプロモーター、TKプロモーター、およびB19パル
ボウイルスプロモーターである。適切なプロモーターの
選択はここに含まれる教訓から当業者にとっては明白あ
ろう。
ーターを含む。採用される適切なプロモーターは、必ず
しもそれに限定されないが、レトロウイルスLTR;SV40プ
ロモーター；およびミラー他「バイオテクニク」７巻、
９号980−990ページ（1989年）で説明されているヒトサ
イトメガロウイルス（CMV）プロモーター、あるいは他
の何らかのプロモーター（例えば必ずしもそれに限定さ
れないが、ヒストン,pol III,およびＢアクチンプロモ
ーターなどを含む真核細胞プロモーターなどのような細
胞プロモーター）を含む。採用される他のウイルスプロ
モーターは、必ずしもそれに限定されないが、アデノウ
イルスプロモーター、TKプロモーター、およびB19パル
ボウイルスプロモーターである。適切なプロモーターの
選択はここに含まれる教訓から当業者にとっては明白あ
ろう。
この発明のベクターは調節要素を含むことが出来、そ
れは必要とあれば望ましい異型遺伝子の組織に特異的発
現を確実にし、およびもしくは細胞または代謝シグナル
に応答して異型遺伝子の発現を調節する。
れは必要とあれば望ましい異型遺伝子の組織に特異的発
現を確実にし、およびもしくは細胞または代謝シグナル
に応答して異型遺伝子の発現を調節する。
この発明はレトロウイルスベクター粒子に関連して説
明されてきたが、他のウイルスベクター粒子（例えばア
デノウイルス、アデノ関連性ウイルス、および単純性疱
瘡（ヘルペス）ウイルスなどの粒子）、あるいは合成粒
子が、標的細胞の受容体に結合する受容体結合領域をベ
クター粒子が含むように構築することが出来、ここでヒ
ト標的細胞の受容体は両性細胞受容体以外のものであ
る。このようなベクター粒子は望ましい標的細胞に「生
体内」で投与するのに適切である。
明されてきたが、他のウイルスベクター粒子（例えばア
デノウイルス、アデノ関連性ウイルス、および単純性疱
瘡（ヘルペス）ウイルスなどの粒子）、あるいは合成粒
子が、標的細胞の受容体に結合する受容体結合領域をベ
クター粒子が含むように構築することが出来、ここでヒ
ト標的細胞の受容体は両性細胞受容体以外のものであ
る。このようなベクター粒子は望ましい標的細胞に「生
体内」で投与するのに適切である。
この発明の利点は、望まれる標的細胞あるいは組織に
直接投与され、そこで望まれる遺伝子は標的細胞あるい
は組織に送達され、そこで標的細胞あるいは組織がその
遺伝子により発現されるタンパク質を産出するようなベ
クター粒子を提供する能力を含む。
直接投与され、そこで望まれる遺伝子は標的細胞あるい
は組織に送達され、そこで標的細胞あるいは組織がその
遺伝子により発現されるタンパク質を産出するようなベ
クター粒子を提供する能力を含む。
この発明は下記の実施に関連して説明される。しかし
この発明の範囲にそれに限定されるものではない。
この発明の範囲にそれに限定されるものではない。
実施例1.
CMVプロモーターの制御の下でエコトロピックマウス
白血病ウイルスgp70およびp15E遺伝子を含むプラスミド
pCee（図１）がAcc Iで切断され、eco gp70タンパク質
のアミノ酸残基１−312をエンコードするAcc I断片が除
去された。eco gp70分泌シグナルを含有するPCR断片
（あるいはeco gp70のアミノ酸残基１−33を含むリー
ダー）がAcc I部位にクローンされ、続いて成熟ウサギ
α１アシッドグリコプロテイン（アミノ酸残基19−20
1）によりクローンされた（レイ他、「生化学および生
物物理学研究通信」178巻、２号、507−513ページ（199
1年））。ウサギα１アシッドグリコプロテインのアミ
ノ酸配列は（配列識別番号５）に示される。またそれを
エンコードするDNA配列は（配列識別番号６）で示され
る。生成するプラスミドpAGP−１（図２）はeco gp70
リーダー配列（eco gp70のアミノ酸残基１−33）、成
熟ウサギα１−アシッドグリコプロテインをエンコード
する配列（アミノ酸残基19−201）およびeco gp70のア
ミノ酸残基313−469をエンコードする配列を含む。
白血病ウイルスgp70およびp15E遺伝子を含むプラスミド
pCee（図１）がAcc Iで切断され、eco gp70タンパク質
のアミノ酸残基１−312をエンコードするAcc I断片が除
去された。eco gp70分泌シグナルを含有するPCR断片
（あるいはeco gp70のアミノ酸残基１−33を含むリー
ダー）がAcc I部位にクローンされ、続いて成熟ウサギ
α１アシッドグリコプロテイン（アミノ酸残基19−20
1）によりクローンされた（レイ他、「生化学および生
物物理学研究通信」178巻、２号、507−513ページ（199
1年））。ウサギα１アシッドグリコプロテインのアミ
ノ酸配列は（配列識別番号５）に示される。またそれを
エンコードするDNA配列は（配列識別番号６）で示され
る。生成するプラスミドpAGP−１（図２）はeco gp70
リーダー配列（eco gp70のアミノ酸残基１−33）、成
熟ウサギα１−アシッドグリコプロテインをエンコード
する配列（アミノ酸残基19−201）およびeco gp70のア
ミノ酸残基313−469をエンコードする配列を含む。
実施例2.
プラスミドpCeeはSal IおよびPf1M Iで切断され、eco
gp70のアミノ酸残基１−262をエンコードするSal I−
Pf1M I断片が除去された。この部位にクローンされたの
はeco gp70リーダー配列および成熟ウサギα１アシッ
ドグリコプロテインをエンコードする配列を含むPCR生
成Sal I−Pf1M I断片であった。生成するプラスミドpAG
P−３（図３）は、かくしてeco gp70のリーダー配列、
成熟ウサギα１アシッドグリコプロテインをエンードす
る配列、およびeco gp70のアミノ酸残基263−469をエ
ンコードする配列を含む。
gp70のアミノ酸残基１−262をエンコードするSal I−
Pf1M I断片が除去された。この部位にクローンされたの
はeco gp70リーダー配列および成熟ウサギα１アシッ
ドグリコプロテインをエンコードする配列を含むPCR生
成Sal I−Pf1M I断片であった。生成するプラスミドpAG
P−３（図３）は、かくしてeco gp70のリーダー配列、
成熟ウサギα１アシッドグリコプロテインをエンードす
る配列、およびeco gp70のアミノ酸残基263−469をエ
ンコードする配列を含む。
実施例3.
RSVプロモーターの制御の下で、キセノトロピックマ
ウス白血病ウイルスgp70およびp15E遺伝子を含むプラス
ミドpUC18RSVXeno（図４）はAco IおよびStu Iで切断さ
れ、xeno gp70のアミノ酸残基１−258をエンコードす
るAcc−Stu I断片が除去された。この部位にクローンさ
れたのはxeno gp70リーダー（アミノ酸残基１−30）を
エンコードするPCR生成Acc I−Stu I断片、および成熟
ウサギα１アジットグリコプロテインであった。生成プ
ラスミドpAX2（図５）はかくしてxeno gp70リーダーを
エンコードする配列、成熟ウサギα１アシッドグリコプ
ロテインをエンコードする配列およびxeno gp70のアミ
ノ酸残基259−443を含む。
ウス白血病ウイルスgp70およびp15E遺伝子を含むプラス
ミドpUC18RSVXeno（図４）はAco IおよびStu Iで切断さ
れ、xeno gp70のアミノ酸残基１−258をエンコードす
るAcc−Stu I断片が除去された。この部位にクローンさ
れたのはxeno gp70リーダー（アミノ酸残基１−30）を
エンコードするPCR生成Acc I−Stu I断片、および成熟
ウサギα１アジットグリコプロテインであった。生成プ
ラスミドpAX2（図５）はかくしてxeno gp70リーダーを
エンコードする配列、成熟ウサギα１アシッドグリコプ
ロテインをエンコードする配列およびxeno gp70のアミ
ノ酸残基259−443を含む。
実施例4.
プラスミドpUC18RSVXenoはAcc IおよびCla Iで切断さ
れ、xeno gp70のアミノ酸残基１−210をエンコードす
る断片は除去された。この部位にクローンさたのはxeno
gp70リーダーをエンコードするPCR生成Aco I−Cla I
断片であり、成熟α１アシッドグリコプロテインにより
続けられた。生成するプラスミド,pAX6（図６）はかく
してxeno gp70リーダーをエンコードする配列、成熟ウ
サギα１アシッドグリコプロテインをエンコードする配
列、およびxeno gp70のアミノ酸残基211−443を含む。
れ、xeno gp70のアミノ酸残基１−210をエンコードす
る断片は除去された。この部位にクローンさたのはxeno
gp70リーダーをエンコードするPCR生成Aco I−Cla I
断片であり、成熟α１アシッドグリコプロテインにより
続けられた。生成するプラスミド,pAX6（図６）はかく
してxeno gp70リーダーをエンコードする配列、成熟ウ
サギα１アシッドグリコプロテインをエンコードする配
列、およびxeno gp70のアミノ酸残基211−443を含む。
実施例5.
10cm組織培養平板でGPL細胞５×105がプラスミドpAGP
−1,pAGP−3,pAX2,あるいはpAX6のいずれか１個30μg/
平板で（リン酸カルシウムCaPO4を用いて）形質移入さ
れた。リン酸カルシウムは24時間後に除去され、新鮮D1
0培地10mlが次の24時間のため加えられた。D10培地は次
いで除去され次の24時間のため無血清DX培地に置換され
た。DX培地は次いで集められ、濾過され、氷上に貯蔵さ
れた。この上澄みがベクター粒子を含む。
−1,pAGP−3,pAX2,あるいはpAX6のいずれか１個30μg/
平板で（リン酸カルシウムCaPO4を用いて）形質移入さ
れた。リン酸カルシウムは24時間後に除去され、新鮮D1
0培地10mlが次の24時間のため加えられた。D10培地は次
いで除去され次の24時間のため無血清DX培地に置換され
た。DX培地は次いで集められ、濾過され、氷上に貯蔵さ
れた。この上澄みがベクター粒子を含む。
上澄みは次いで標準方法で濾過、収集され次いで遠心
分離された。遠心分離の後ウイルスペレットは酢酸ナト
ルウム0.1M,塩化ナトリウム0.15Mおよび塩化カルシウム
2mMを含有する緩衝液内で再構成された。緩衝液はファ
ルコン0.2ミリミクロン組織培養フィルターを用いて無
菌化された。
分離された。遠心分離の後ウイルスペレットは酢酸ナト
ルウム0.1M,塩化ナトリウム0.15Mおよび塩化カルシウム
2mMを含有する緩衝液内で再構成された。緩衝液はファ
ルコン0.2ミリミクロン組織培養フィルターを用いて無
菌化された。
ウイルス粒子を含有する濃縮上澄み2.2mlがpAGP−１
あるいはpAGP−３から生成し、前記ウイルス粒子は、以
下でキメラ１あるいはキメラ３として引用されるが、こ
の濃縮上澄みはアルコール滅菌乾燥した２個の使い捨て
プラスチックカラムに入れられた。各カラム（1cm×6c
m）に対し、数珠玉アガロースに結合された「ウエルチ
菌（Ａ型）」より得たノイラミニダーゼ１ユニットが懸
濁液2mlとして加えられた。これは充填ゲル1ml、あるい
はカラム当たり酵素のユニット（アガロース/ml,15.7mg
およびアガロースのグラム当り28ユニット）を表す。１
ユニットはpH5.0,37℃でNANラクトースから分当りＮア
セチルノイラミン酸1.0ミクロモルを遊離させるノイラ
ミニダーゼの量として定義される。
あるいはpAGP−３から生成し、前記ウイルス粒子は、以
下でキメラ１あるいはキメラ３として引用されるが、こ
の濃縮上澄みはアルコール滅菌乾燥した２個の使い捨て
プラスチックカラムに入れられた。各カラム（1cm×6c
m）に対し、数珠玉アガロースに結合された「ウエルチ
菌（Ａ型）」より得たノイラミニダーゼ１ユニットが懸
濁液2mlとして加えられた。これは充填ゲル1ml、あるい
はカラム当たり酵素のユニット（アガロース/ml,15.7mg
およびアガロースのグラム当り28ユニット）を表す。１
ユニットはpH5.0,37℃でNANラクトースから分当りＮア
セチルノイラミン酸1.0ミクロモルを遊離させるノイラ
ミニダーゼの量として定義される。
カラムは次いで遊離ノイラミニダーゼのすべての極微
量のレジンを無くし、ウイルスで保温する前にレジンを
滅菌化するために前記記載の緩衝液の過剰量で洗浄され
た。カラムは次いで乾燥され、底はキャップシールされ
パラフィルムで安全に包まれた。緩衝液（サンプル当り
2.0ml）で再構成された濃縮ウイルスは次いでレジンに
加えられた。上部がカラムに置かれ、パラフィルムで包
まれた。レジンはゆっくりと手で再懸濁された。次いで
ウイルスは輪の上でゆっくりと回転させながら室温で１
時間レジンと一緒に保温された。カラムはレジンとウイ
ルスが良く混じり合うように周期的にチェックされた。
量のレジンを無くし、ウイルスで保温する前にレジンを
滅菌化するために前記記載の緩衝液の過剰量で洗浄され
た。カラムは次いで乾燥され、底はキャップシールされ
パラフィルムで安全に包まれた。緩衝液（サンプル当り
2.0ml）で再構成された濃縮ウイルスは次いでレジンに
加えられた。上部がカラムに置かれ、パラフィルムで包
まれた。レジンはゆっくりと手で再懸濁された。次いで
ウイルスは輪の上でゆっくりと回転させながら室温で１
時間レジンと一緒に保温された。カラムはレジンとウイ
ルスが良く混じり合うように周期的にチェックされた。
保温期間の最後に、キメラ１およびキメラ３ウイルス
が緩やかな真空濾過により集められ、別の無菌プラスチ
ックポリプロピレンファルコン2063チューブ12×75ミリ
に収集された。回収率は90％を上回り、脱シアル酸ウイ
ルス約1.8mlを得た。
が緩やかな真空濾過により集められ、別の無菌プラスチ
ックポリプロピレンファルコン2063チューブ12×75ミリ
に収集された。回収率は90％を上回り、脱シアル酸ウイ
ルス約1.8mlを得た。
D10 2ml培地に約105受容体陽性（Hep G2）あるいは
受容体陰性（SK Hep I）ヒト肝細胞を含有する６個の
ウエル平板が標的細胞として使用された。平板培養24時
間後にD10,1mlが最初のウエルから除去され、キメラ１
あるいはキメラ３を含むノイラミニダーゼ処理（あるい
は対照として未処理）ウイルス上澄み2mlが加えられ、
よく混合された。最初のウエルからの200ulが第２のウ
エルにある2mlで希釈され混合された。次いで、第２ウ
エルの200ulが第３のウエルにある1.8mlで希釈された、
かくして希釈は約2/3,1/15,および1/150となった。形質
導入の間にポリブレン（Polybrene）8ug/mlが各ウエル
に加えられた。ウイルス粒子は細胞と接触したまま一晩
放置され、続いてウイルス粒子を含む培地が除去され、
G418,1,000mg/mlを含むD10で置換された。培地は必要に
応じて新鮮D10およびG418で４〜５日毎に取替えられ
た。G418耐性コロニーは２−３週後に計数された。
受容体陰性（SK Hep I）ヒト肝細胞を含有する６個の
ウエル平板が標的細胞として使用された。平板培養24時
間後にD10,1mlが最初のウエルから除去され、キメラ１
あるいはキメラ３を含むノイラミニダーゼ処理（あるい
は対照として未処理）ウイルス上澄み2mlが加えられ、
よく混合された。最初のウエルからの200ulが第２のウ
エルにある2mlで希釈され混合された。次いで、第２ウ
エルの200ulが第３のウエルにある1.8mlで希釈された、
かくして希釈は約2/3,1/15,および1/150となった。形質
導入の間にポリブレン（Polybrene）8ug/mlが各ウエル
に加えられた。ウイルス粒子は細胞と接触したまま一晩
放置され、続いてウイルス粒子を含む培地が除去され、
G418,1,000mg/mlを含むD10で置換された。培地は必要に
応じて新鮮D10およびG418で４〜５日毎に取替えられ
た。G418耐性コロニーは２−３週後に計数された。
実施例6.
レトロウイルスタンパク質gagおよびpolを発現するプ
レパッケージング細胞系GP8、およびプラスミドpAGP−
1,pAGP−3,pAX2、あるいはpAX6によりエンコードされる
キメラgp70グリコプロテインを更に発現するものから誘
導されるパッケージング細胞系は、細胞培養を持続さ
れ、コムギ胚芽凝集素（WGA）の15ug/mから始まる順次
高い濃度のものに曝された。細胞系はWGA濃度の選択の
下で細胞培養６−８週持続され、WGA40−50ug/mlに耐性
の個体群から得られた。後者は次いで望まれる突然変異
体グリコタイプを発現する細胞を富化するためにFITC接
合レクチン（例えばベータＤガラクトシル基のためのFI
TCエリトリナ クリスタギャッリ凝集素、およびアルフ
ァＤマンノシル基のためのFITCコンカナバリンＡ）を使
って蛍光活性細胞選別を受けた。レトロウイルスベクタ
ーパッケージングおよび生産者細胞系は次いで標準の方
法により生じる個体群から生成された。
レパッケージング細胞系GP8、およびプラスミドpAGP−
1,pAGP−3,pAX2、あるいはpAX6によりエンコードされる
キメラgp70グリコプロテインを更に発現するものから誘
導されるパッケージング細胞系は、細胞培養を持続さ
れ、コムギ胚芽凝集素（WGA）の15ug/mから始まる順次
高い濃度のものに曝された。細胞系はWGA濃度の選択の
下で細胞培養６−８週持続され、WGA40−50ug/mlに耐性
の個体群から得られた。後者は次いで望まれる突然変異
体グリコタイプを発現する細胞を富化するためにFITC接
合レクチン（例えばベータＤガラクトシル基のためのFI
TCエリトリナ クリスタギャッリ凝集素、およびアルフ
ァＤマンノシル基のためのFITCコンカナバリンＡ）を使
って蛍光活性細胞選別を受けた。レトロウイルスベクタ
ーパッケージングおよび生産者細胞系は次いで標準の方
法により生じる個体群から生成された。
しかしこの発明の範囲は前記特異的実施例に限定され
るものでないことは理解されねばならない。この発明は
特に説明されたもの以外にも実施することが可能であ
り、しかも以下の請求の範囲内にある。
るものでないことは理解されねばならない。この発明は
特に説明されたもの以外にも実施することが可能であ
り、しかも以下の請求の範囲内にある。
配列リスト
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：アンダースン，ダブリュ．フレンチ
バルトラッキ，レオン エフ．
メースン，ジェイムス エム．
（ii）発明の名称：標的指向ベクター粒子
（iii）配列の数:8
（iv）連絡先：
（Ａ）受信人：キュレラ，バーン，ベーン，ジルフ
ィラン， セスキ アンド スチュワート （Ｂ）通：ベッカー ファーム ロード ６ （Ｃ）市：ローズランド （Ｄ）州：ニュージャージー （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:07068 （ｖ）コンピューター読取りフォーム： （Ａ）媒体型式:3.5インチ ディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM PS/2 （Ｃ）操作システム:PC−DOS （Ｄ）ソフトウエア:DW4.V2 （vi）現行出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）先行出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （viii）弁護士／代理人情報： （Ａ）氏名：リリー，レイモンド ジェイ． （Ｂ）登録番号:31,778 （Ｃ）参照／ドケット番号:271010−107 （ix）通信情報： （Ａ）電話:201−994−1700 （Ｂ）テレファックス:201−994−1744 （２）配列識別番号１に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：塩基 469個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）連鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：エコトロピックgp70タンパク質 （xi）配列の記述：配列識別番号１ （２）配列識別番号２に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：塩基 1446個 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）連鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：ウイルスDNA （xi）配列の記述：配列識別番号２ （２）配列識別番号３に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：アミノ酸 443個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）連鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：キセノトロピックgp70タンパク
質 （xi）配列の記述：配列識別番号３ （２）配列識別番号４に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：塩基 1356個 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）連鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：ウイルスDNA （xi）配列の記述：配列識別番号４ （２）配列識別番号５に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：アミノ酸 201個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）連鎖： （Ｄ）トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ウサギα１アシッドグリコプロ
テイン （ｘ）公開情報 （Ａ）著者：レイ他 （Ｂ）題名： （Ｃ）雑誌：「生化学および生物物理学研究注解」 （Ｄ）巻:178巻 （Ｅ）号:2号 （Ｆ）ページ:507−513 （Ｇ）発行:1991年 （xi）配列の記述：配列識別番号５ （２）配列識別番号６に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：塩基 759個 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）連鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：ゲノムDNA （ｘ）公開情報 （Ａ）著者：レイ他 （Ｂ）題名： （Ｃ）雑誌：「生化学および生物物理学研究注解」 （Ｄ）巻:178巻 （Ｅ）号:2号 （Ｆ）ページ:507−513 （Ｇ）発行:1991年 （xi）配列の記述：配列識別番号６ （２）配列識別番号７に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：アミノ酸 196個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）連鎖： （Ｄ）トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：エコトロピックp15Eタンパク質 （xi）配列の記述：配列識別番号７ （２）配列識別番号８に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：アミノ酸 176個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）連鎖： （Ｄ）トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：タンパク質 （ｘ）公開情報 （Ａ）著者：マリク他 （Ｂ）題名： （Ｃ）雑誌：「遺伝子ウイルス学ジャーナル」 （Ｄ）巻:69巻 （Ｅ）号： （Ｆ）ページ:1695−1710 （Ｇ）発行:1988年 （xi）配列の記述：配列識別番号８
ィラン， セスキ アンド スチュワート （Ｂ）通：ベッカー ファーム ロード ６ （Ｃ）市：ローズランド （Ｄ）州：ニュージャージー （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:07068 （ｖ）コンピューター読取りフォーム： （Ａ）媒体型式:3.5インチ ディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM PS/2 （Ｃ）操作システム:PC−DOS （Ｄ）ソフトウエア:DW4.V2 （vi）現行出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）先行出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （viii）弁護士／代理人情報： （Ａ）氏名：リリー，レイモンド ジェイ． （Ｂ）登録番号:31,778 （Ｃ）参照／ドケット番号:271010−107 （ix）通信情報： （Ａ）電話:201−994−1700 （Ｂ）テレファックス:201−994−1744 （２）配列識別番号１に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：塩基 469個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）連鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：エコトロピックgp70タンパク質 （xi）配列の記述：配列識別番号１ （２）配列識別番号２に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：塩基 1446個 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）連鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：ウイルスDNA （xi）配列の記述：配列識別番号２ （２）配列識別番号３に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：アミノ酸 443個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）連鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：キセノトロピックgp70タンパク
質 （xi）配列の記述：配列識別番号３ （２）配列識別番号４に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：塩基 1356個 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）連鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：ウイルスDNA （xi）配列の記述：配列識別番号４ （２）配列識別番号５に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：アミノ酸 201個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）連鎖： （Ｄ）トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ウサギα１アシッドグリコプロ
テイン （ｘ）公開情報 （Ａ）著者：レイ他 （Ｂ）題名： （Ｃ）雑誌：「生化学および生物物理学研究注解」 （Ｄ）巻:178巻 （Ｅ）号:2号 （Ｆ）ページ:507−513 （Ｇ）発行:1991年 （xi）配列の記述：配列識別番号５ （２）配列識別番号６に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：塩基 759個 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）連鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：ゲノムDNA （ｘ）公開情報 （Ａ）著者：レイ他 （Ｂ）題名： （Ｃ）雑誌：「生化学および生物物理学研究注解」 （Ｄ）巻:178巻 （Ｅ）号:2号 （Ｆ）ページ:507−513 （Ｇ）発行:1991年 （xi）配列の記述：配列識別番号６ （２）配列識別番号７に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：アミノ酸 196個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）連鎖： （Ｄ）トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：エコトロピックp15Eタンパク質 （xi）配列の記述：配列識別番号７ （２）配列識別番号８に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：アミノ酸 176個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）連鎖： （Ｄ）トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：タンパク質 （ｘ）公開情報 （Ａ）著者：マリク他 （Ｂ）題名： （Ｃ）雑誌：「遺伝子ウイルス学ジャーナル」 （Ｄ）巻:69巻 （Ｅ）号： （Ｆ）ページ:1695−1710 （Ｇ）発行:1988年 （xi）配列の記述：配列識別番号８
─────────────────────────────────────────────────────
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州，ロックヴィル，アパートメント
203，コウヴ レイン 14002番地
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アメリカ合衆国，20707 メリーランド
州，ローレル，チェスナット コート
14008番地
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(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (11)
- 【請求項１】一つのレトロウイルスベクター粒子であっ
て、受容体結合ドメイン、ヒンジ領域およびボディー部
を含むレトロウイルス包膜タンパク質を含み、ここで前
記レトロウイルス包膜タンパク質の一部が欠失し、標的
細胞の受容体に結合する受容体結合領域あるいはリガン
ドが前記欠失部位に挿入され、前記標的細胞の受容体が
両性細胞受容体以外のものであり、またここで欠失した
レトロウイルス包膜タンパク質の部位が、 （ｉ）受容体結合ドメインの一部とヒンジ領域の一部あ
るいは全部 もしくは （ii）受容体結合ドメインの全部とヒンジ領域の一部あ
るいは全部 のみであることを特徴とするレトロウイルスベクター粒
子。 - 【請求項２】レトロウイルス包膜タンパク質のヒンジ領
域の一部が欠失することを特徴とする請求項１記載のレ
トロウイルスベクター粒子。 - 【請求項３】標的細胞の受容体に結合する前記受容体結
合領域がヒトウイルスの受容体結合領域であることを特
徴とする請求項１あるいは２記載のレトロウイルスベク
ター粒子。 - 【請求項４】前記のヒトウイルスの受容体結合領域がＢ
型肝炎ウイルス表面タンパク質結合領域であり、前記標
的細胞が肝臓細胞であることを特徴とする請求項３記載
のレトロウイルスベクター粒子。 - 【請求項５】前記のヒトウイルスの受容体結合領域がHT
LV−Ｉウイルスのgp46の受容体結合領域であり、前記標
的細胞がＴ細胞であることを特徴とする請求項３記載の
レトロウイルスベクター粒子。 - 【請求項６】前記のヒトウイルスの受容体結合領域がHI
Vgp120CD4結合領域であり、前記標的細胞がT4ヘルパー
細胞であることを特徴とする請求項３記載のレトロウイ
ルスベクター粒子。 - 【請求項７】前記欠失部位中に挿入される標的細胞の受
容体に結合する前記の受容体結合領域あるいはリガンド
が、肝細胞のアシアログリコプロテイン受容体に結合す
るタンパク質であることを特徴とする請求項１記載のレ
トロウイルスベクター粒子。 - 【請求項８】前記の肝細胞のアシアログリコプロテイン
受容体に結合するタンパク質がα１アシッドグリコプロ
テインであることを特徴とする請求項７記載のレトロウ
イルスベクター粒子。 - 【請求項９】さらに少なくとも一つの異種遺伝子を含む
ことを特徴とする請求項１記載のレトロウイルスベクタ
ー粒子。 - 【請求項１０】請求項１ないし９いずれか記載のレトロ
ウイルスベクター粒子を作り出すことを特徴とする一つ
のパッケージング細胞系。 - 【請求項１１】請求項１ないし９いずれか記載のレトロ
ウイルスベクター粒子を使用した治療用あるいは予防用
の組成物を製造する方法。
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