DE69333471T2 - Erzielbare vektorenpartikel - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft "zielgerichtete" Vektorpartikel. Insbesondere betrifft die Erfindung Vektorpartikel, die eine Rezeptorbindungsregion umfassen, die an einen Rezeptor einer Zielzelle eines Menschen oder eines Tieres bindet.
  • Die Vektorpartikel sind brauchbare Mittel zur Einführung von Genen oder DNA (RNA) in eine Zelle, wie eine eukaryontische Zelle. Die Gene werden durch einen geeigneten Promotor kontrolliert. Beispiele für Vektoren, die verwendet werden können, um Vektorpartikel zu erzeugen, umfassen prokaryontische Vektoren, wie bakterielle Vetoren, eukaryontische Vektoren, einschließlich Pilzvektoren, wie Hefevektoren und virale Vektoren, wie DNA Virusvektoren, RNA Virusvektoren und retrovirale Vektoren. Retrovirale Vektoren, die zur Erzeugung von Vektorpartikeln zur Einführung von Genen oder DNA (RNA) in eine Zelle verwendet wurden, umfassen Moloney Murine Leukemia Virus, Milznekrosevirus und Vektoren, die von Retroviren stammen, wie Rous Sarcoma Virus und Harvey Sarcoma Virus. Der Ausdruck "einführen" umfasst, wie er hierin verwendet wird, eine Vielzahl an Verfahren zur Überführung von Genen oder DNA (RNA) in eine Zelle, wobei die Verfahren Transformation, Transduktion, Transfektion und Infektion umfassen.
  • Es wurden Vektorpartikel zur Einführung von DNA (RNA) in Zellen für Gentherapiezwecke verwendet. Im allgemeinen umfasst ein solches Verfahren die Gewinnung von Zellen von einem Patienten und die Verwendung eines Vektorpartikels zur Einführung der gewünschten DNA (RNA) in die Zellen und die anschließende Versorgung des Patienten mit den veränderten Zellen für einen therapeutischen Zweck. Es wäre erwünscht, ein alternatives Verfahren für die Gentherapie bereitzustellen. Ein solches alternatives Verfahren würde genetisch veränderte Zellen in vivo umfassen. In einem solchen Verfahren würde ein Vektorpartikel, das die gewünschte DNA (RNA) enthält, direkt an die Zielzellen eines Patienten in vivo verabreicht werden.
  • Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Gentherapie durch die Einführung eines Vektorpartikels, wie beispielsweise eines retroviralen Vektorpartikels, direkt in die gewünschte Zielzelle eines Patienten bereitzustellen.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein retrovirales Vektorpartikel bereitgestellt, das eine Rezeptorbinderegion oder einen Liganden umfasst, der an einen Rezeptor einer Zielzelle bindet. Der Rezeptor der Zielzelle ist ein Rezeptor, der nicht der amphotrophe Zellrezeptor ist.
  • Retroviren weisen ein Hüllprotein auf, das eine Rezeptorbindungsregion enthält. Es wurde festgestellt, dass Retroviren "zielgerichtet" auf einen spezifischen Zelltyp erzeugt werden können, falls die Rezeptorbindungsregion des Retrovirus, das unter anderen Typen amphotroph, ecotroph oder xenotroph sein kann, so modifiziert wird, dass die Rezeptorbindungsregion des Hüllproteins eine Rezeptorbindungsregion umfasst, die an einen Rezeptor der Zielzelle bindet. Beispielsweise wird zumindest ein Teil der Rezeptorbindungsregion und ein Teil oder die gesamte Gelenkregion des Hüllproteins des Retrovirus deletiert und durch eine Rezeptorbindungsregion oder einen Liganden ersetzt, der an einen Rezeptor einer Zielzelle bindet. Daher wird ein retroviraler Vektor bereitgestellt, bei dem zumindest ein Teil der DNA (RNA), die für die Rezeptorbindungsregion kodiert oder ein Teil oder die gesamte Gelenkregion des Hüllproteins des Retrovirus deletiert und durch DNA (RNA) ersetzt wurde, die für eine Rezeptorbindungsregion oder einen Liganden kodiert, der an einen Rezeptor einer Zielzelle bindet.
  • In einer Ausführungsform ist der Retrovirus ein Mausleukämievirus.
  • Die Hülle der Mausleukämieviren umfasst ein als gp70 bekanntes Protein. Solche Viren können gegen einen bestimmten Zelltyp "zielgerichtet" werden, falls ein Teil des gp70 Proteins deletiert und durch eine Rezeptorbindungsregion oder einen Liganden ersetzt wird, der an einen Rezeptor einer Zielzelle bindet. Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein retroviraler Vektor bereitgestellt, worin ein Teil aber nicht die gesamte DNA (RNA), die für das gp70 Protein kodiert, deletiert und durch DNA (RNA) ersetzt wurde, die für eine Rezeptorbindungsregion oder einen Liganden kodiert, der an einen Rezeptor einer Zielzelle bindet.
  • Im allgemeinen umfasst das gp70 Protein die folgenden Regionen: (i) Die sekretorische Signal- oder "Leadersequenz", (ii) die Rezeptorbindungsdomäne, (iii) die Gelenkregion und (iv) den Kernteil. Vorzugsweise ist zumindest ein Teil der DNA (RNA), die für die Rezeptorbindungsdomäne des gp70 Proteins und ein Teil oder die gesamte DNA (RNA), die für die Gelenkregion des gp70 Proteins kodiert, deletiert und durch DNA (RNA) ersetzt, die für eine Rezeptorbindungsregion oder einen Liganden kodiert, der an einen Rezeptor der Zielzelle bindet. In einer weiteren Ausführungsform ist die DNA (RNA), die für die gesamte Rezeptorbindungsdomäne des gp70 Proteins plus die gesamte oder ein Teil der DNA (RNA), die für die Gelenkregion des gp70 Proteins kodiert, deletiert und durch DNA (RNA) ersetzt, die für eine Rezeptorbindungsregion oder einen Liganden einer Zielzelle kodiert.
  • Das gp70 Protein kann aus einem ecotropen Mausleukämievirus, einem xenotropen Mausleukämievirus oder einem amphotrophen Mausleukämievirus stammen. Ecotropes gp70 (oder eco gp70) (SEQ ID Nr. 1) ist ein Protein mit 469 Aminosäuren und wird durch die (SEQ ID Nr. 2) kodiert. Die Aminosäurereste 1-33 stellen die Signalsequenz dar, die Aminosäurereste 34-263 stellen die Rezeptorbindungsdomäne dar, die Aminosäurereste 264-312 stellen die Gelenkregion dar und die Aminosäurereste 313-469 stellen den Kernbereich dar. Vorzugsweise wird die DNA (RNA), die zumindest einen Teil der Rezeptorbindurgsregion und einen Teil oder die gesamte Gelenkregion kodiert, entfernt und durch DNA (RNA) ersetzt, die für eine Rezeptorbindungsregion oder einen Liganden kodiert, der an einen Rezeptor einer Zielzelle bindet. Bevorzugter wird DNA (RNA), die für einige oder alle Aminosäurereste 34 bis 312 kodiert (das heißt die Rezeptorbindungsdomäne und die Gelenkregion) entfernt und durch DNA (RNA) ersetzt, die für eine Rezeptorbindungsregion oder einen Liganden kodiert, der an einen Rezeptor einer Zielzelle bindet.
  • Xenotropes gp70 (oder xeno gp70) (SEQ ID Nr. 3) hat 443 Aminosäurereste und wird durch die (SEQ ID Nr. 4) kodiert. Die Aminosäurereste 1-30 stellen die Signalsequenz dar, die Aminosäurereste 31-232 stellen die Rezeptorbindungsdomäne dar, die Aminosäurereste 233-286 stellen die Gelenkregion dar und die Aminosäurereste 287-443 stellen den Kernbereich dar. Vorzugsweise wird die DNA (RNA), die zumindest einen Teil der Rezeptorbindungsregion und einen Teil oder die gesamte Gelenkregion kodiert, entfernt und durch DNA (RNA) ersetzt, die für eine Rezeptorbindungsregion oder einen Liganden kodiert, der an einen Rezeptor einer Zielzelle bindet. Bevorzugter wird DNA (RNA), die für einige oder alle Aminosäurereste 31 bis 286 kodiert entfernt und durch DNA (RNA) ersetzt, die für eine Rezeptorbindungsregion oder einen Liganden kodiert, der an einen Rezeptor einer Zielzelle bindet.
  • Zielzellen, an die das Retroviruspartikel binden kann, umfassen unter anderem Leberzellen, T-Zellen, Lymphocyten, Endothelzellen, T4 Helferzellen und Makrophagen. In einer Ausführungsform bindet das retrovirale Vektorpartikel an eine Leberzelle und insbesondere an Hepatocyten. Um eine solche Bindung zu ermöglichen, enthält das Retroviruspartikel ein chimäres Protein, das von DNA (RNA) kodiert wird, worin zumindest ein Teil der DNA (RNA), die für die Rezeptorbindungsdomäne des gp70 Proteins kodiert, entfernt ist und durch DNA (RNA ersetzt ist, die für ein Protein kodiert, das an einen Asialoglycoproteinrezeptor (oder ASG-R) von Heptocyten bindet.
  • Proteine, die an den Asialoglycoproteinrezeptor von Leberzellen binden, umfassen unter anderem Asialoglycoproteine, wie beispielsweise α-1-Säureglycoprotein (AGP), das auch als Orosomucoid bekannt ist, und Asialofetuin. AGP ist ein natürlicher hochaffiner Ligand für ASG-R. Der Asialoglycoproteinrezeptor oder ASG-R wird nur durch Hepatocyten exprimiert. Der Rezeptor kommt mit etwa 3 × 105 Kopien pro Zelle vor und solche Rezeptoren haben eine hohe Affinität für Asialoglycoproteine, wie AGP. Daher erzeugt der Umbau von retroviralen Vektorpartikeln, die Asialoglycoprotein anstelle der natürlichen Rezeptorbindedomäne von gp70 aufweisen, Vektorpartikel, die an den Asialoglycoproteinrezeptor von Heptocyten binden, die ein effizientes Mittel für den Transfer der Gene von Interesse an Leberzellen liefern.
  • Zelllinien, die retrovirale Vektorpartikel enthalten, die zur Zielführung des Asialoglycoproteinrezeptors der Hepatocyten ohne der Entfernung der terminalen Sialinsäuregruppen der Partikel durch Neuraminidasebehandlung fähig sind, können durch Selektion mit dem cytotoxischen Lektin Weizenkeimagglutinin (WGA) entwickelt werden. Zelllinien, die die retrovitalen Proteine gag und pol exprimieren, werden zu retroviralen Vektorverpackungszellinien nachdem sie mit den Plasmiden transfiziert wurden, die für Chimäre Hüllgene kodieren. Diese Zelllinien exprimieren die entsprechenden chimären gp70 Glycoproteine. Nach einer Exposition gegenüber immer höheren Konzentrationen an WGA wird das Wachstum von Zellen bevorzugt, die Glycoproteine synthetisieren, denen die terminalen Sialinsäuregruppen fehlen. (Stanley et al., Somatic Cell Genetics, Band 3, Seiten 391-405 (1997)). Diese Selektion erlaubt die Isolierung von Zellen, die Oligosaccharide synthetisieren, die mit Galactosylzuckergruppen enden. Solche Zellen erlauben die Konstruktion von Verpackungszelllinien, die zur Erzeugung von retroviralen Vektorpartikeln fähig sind, die den Asialoglycoproteinrezeptor ansteuern. Es ist auch möglich, Subpopulationen von Verpackungszellen zu selektieren, die andere distinkte Glycoproteine aufweisen, wobei diese Zellen zu viralen Vektoren führen, die potentiell zur Ansteuerung von anderen Zellen als Hepatocyten fähig sind. Makrophagen exprimieren beispielsweise einzigartige, stark Mannose-haltige Rezeptoren. Die PHA-resistente Subpopulation hat N-gebundene Oligosaccharide, die in stark Mannose-haltigen Gruppen enden (Stanley et al., In Vitro, Band 12, Seiten 208-215 (1976)). Daher ist eine solche Zellpopulation zur Bildung von viralen Vektorpartikeln fähig, die zur Ansteuerung von Makrophagen über diesen Rezeptor fähig sind. Zellen mit mutierten Glycotypen, die andere neue Oligosaccharide nach einer Selektion mit anderen cytotoxischen Lectinen synthetisieren, können auch bei der Zielführung von Vektorpartikeln zu anderen Zelltypen brauchbar sein, wie Lymphocyten oder Endothelzellen.
  • In einer anderen Ausführungsform ist die Rezeptorbindungsregion eine Rezeptorbindungsregion eines humanen Virus. In einer Ausführungsform ist die Rezeptorbindungsregion eines humanen Virus eine Oberflächenproteinbindungsregion des Hepatitis B Virus und die Zielzelle ist eine Leberzelle.
  • In einer anderen Ausführungsform ist die Rezeptorbindungsregion eines humanen Virus das gp46 Protein des HTLV-1 Virus und die Zielzelle ist eine T-Zelle.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die Rezeptorbindungsregion eines humanen Virus die gp120 CD4 Bindungsregion von HIV und die Zielzelle ist eine T4 Helferzelle.
  • In einer Ausführungsform kann der Retrovirusvektor einer der LN Serie der Vektoren sein, die von Bender et al., J. Virol. Band 61, Seiten 1639-1649 (1987) und Miller et al., Biotechniques, Band 7, Seiten 98-990 (1989).
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst der retrovirale Vektor einen Polylinker oder eine multiple Klonierungsstelle. Die multiple Klonierungsstelle umfasst zumindest vier Klonierungs- oder Restriktionsenzymstellen, worin zumindest zwei der Stellen eine mittlere Häufigkeit in eukaryontischen Genen von weniger als einmal in 10 000 Basenpaaren aufweisen, das heißt das Restriktionsprodukt hat eine mittlere Größe von mindestens 10 000 Basenpaaren.
  • Allgemein werden solche Restriktionsschnittstellen hierin manchmal auch als "seltene" Stellen bezeichnet, die eine mittlere Häufigkeit des Vorkommens in eukaryontischen Genen von weniger als 10 000 Basenpaaren aufweisen, ein CG Duplett innerhalb ihrer Erkennungssequenz aufweisen, wobei ein solches Duplett besonders selten im Säugergenom vorkommt. Ein weiteres Mittel für die Seltenheit oder Rarheit einer Restriktionsenzymschnittstelle bei Säugern ist das Vorkommen in Säugeviren, wie SV40. Im allgemeinen kann ein Enzym, dessen Erkennungssequenz in SV40 fehlt, ein Kandidat für ein "seltenes" Schneideenzym bei Säugern sein.
  • Beispiele für solche Restriktionsenzymschnittstellen haben eine Häufigkeit bei eukaryontischen Genen von weniger als einmal in 10 000 Basenpaaren, wie unter anderem Notl, SnaBl, Sall, Xhol, Clal, Sacl, Eagl und Smal Schnittstellen. Bevorzugte Klonierungsstellen werden aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus Notl, SnaBl, Sall und Xhol.
  • Vorzugsweise hat die multiple Klonierungsstelle eine Länge von nicht mehr als etwa 70 Basenpaaren und vorzugsweise nicht mehr als etwa 60 Basenpaaren. Im allgemeinen liegt der Polylinker oder die multiple Klonierungsstelle zwischen den 5' LTR und 3' LTR des retroviralen Vektors. Das 5'-Ende der multiplen Klonierungsstelle liegt nicht mehr als etwa 895 Basenpaare vom 3'-Ende der 5' LTR und vorzugsweise mindestens etwa 375 Basenpaare vom 3'-Ende der 5' LTR entfernt. Das 3'-Ende der multiplen Klonierungsstelle liegt nicht mehr als etwa 40 Basenpaare vom 5'-Ende der 3' LTR und vorzugsweise zumindest 11 Basenpaare vom 5'-Ende der 3'-LTR entfernt.
  • Solche Vektoren können aus existierenden retroviralen Vektoren durch in der Technik bekannte Gentechnik so erzeugt werden, dass der retrovirale Vektor zumindest vier Klonierungsschnittstellen umfasst, worin zumindest zwei der Klonierungsstellen aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Notl, SnaBl, Sall und Xhol Klonierungsstellen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der retrovirale Vektor jede der Klonierungsstellen Notl, SnaBl, Sall und Xhol.
  • Ein solcher retroviraler Vektor kann als Teil eines Klonierungssystems für den Transfer von Genen in solche retroviralen Vektoren dienen. Daher wird ein Klonierungssystem für die Manipulation von Genen in einem retroviralen Vektor bereitgestellt, das einen retroviralen Vektor umfasst, der eine multiple Klonierungsstelle des vorher beschriebenen Typs enthält, und einen Schaukelklonierungsvektor, der zumindest zwei Klonierungsschnittstellen enthält, die mit zumindest zwei Klonierungsstellen kompatibel sind, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche besteht aus Notl, SnaBl, Sall und Xhol, welche auf dem retroviralen Vektor liegen. Der Schaukelklonierungsvektor umfasst auch zumindest ein gewünschtes Gen, das von diesem Schaukelklonierungsvektor in diesen retroviralen Vektor transferiert werden kann.
  • Der Schaukelklonierungsvektor kann aus einem grundlegenden "Rückgratvektor" oder einem Fragment hiervon konstruiert werden, an den einer oder mehrere Linker ligiert werden, die Klonierungs- oder Restriktionsenzymerkennungsstellen enthalten. Eingeschlossen in den Klonierungsstellen sind die kompatiblen oder komplementären Klonierungsstellen, die hierin vorher beschrieben wurden. Gene und/oder Promotoren mit Enden, die den Restriktionsstellen des Schaukelvektors entsprechen, können in den Schaukelvektor über in der Technik bekannte Verfahren ligiert werden.
  • Der Schaukelklonierungsvektor kann zur Amplifizierung von DNA Sequenzen in prokaryontischen Systemen verwendet werden. Der Schaukelklonierungsvektor kann aus Plasmiden konstruiert werden, die im allgemeinen in prokaryontischen Systemen und insbesondere in Bakterien verwendet werden. Daher kann der Schaukelklonierungsvektor sich beispielsweise ableiten von Plasmiden, wie pBR322, pUC18 usw.
  • Solche retroviralen Vektoren werden in eine Verpackungszelllinie transfiziert oder transduziert, wobei infektiöse Vektorpartikel erzeugt werden, die den retroviralen Vektor enthalten. Im allgemeinen wird der Vektor in die Verpackungszelllinie zusammen mit einem verpackungsdefekten Helfervirus transfiziert, der Gene enthält, die gag und pol und die env Proteine des Virus kodieren. Repräsentative Beispiele für Verpackungszelllinien umfassen unter anderem die PE501 und PA317 Zelllinien, die in Miller et al., Biotechniques, Band 7, Seiten 980-990 (1989) beschrieben sind.
  • Die Vektorpartikel, die aus der Verpackungszelllinie erzeugt werden, sind zielgerichtet und auch durch ein Protein modifiziert worden, das eine an einen Rezeptor bindende Domäne enthält, die an einen Rezeptor einer Zielzelle bindet, wobei der Rezeptor nicht der amphotrophe Zellrezeptor ist, wobei diese Rezeptor-bindende Region es den Vektorpartikeln erlaubt, an eine Zielzelle zu binden. Die retroviralen Vektorpartikel können daher direkt an eine gewünschte Zielzelle ex vivo verabreicht werden und solche Zellen können dann an einen Patienten als Teil eines Gentherapieverfahrens verabreicht werden.
  • Obwohl die Vektorpartikel direkt an eine Zielzelle verabreicht werden können, können die Vektorpartikel so verändert werden, dass die Vektorpartikel "injizierbar" wie auch zielgerichtet sind, das heißt die Vektorpartikel sind gegenüber einer Inaktivierung durch Humanserum resistent und so können die zielgerichteten Vektorpartikel an einen Patienten durch eine intravenöse Injektion verabreicht werden und wandern so direkt zu einer gewünschten Zielzelle oder einem Zielgewebe ohne durch das Humanserum inaktiviert zu werden.
  • Die Hülle der Retroviren umfasst auch ein als p15E bekanntes Protein und es wurde festgestellt, dass die Retroviren gegenüber einer Inaktivierung durch Humanserum als Ergebnis der Wirkung der im Serum vorhandenen Komplementproteine auf den p15E Proteinteil des Retrovirus empfindlich sind. Es wurde ferner festgestellt, dass solche Retroviren durch die Mutation des p15E Poteins gegenüber einer Inaktivierung durch Humanserum resistent gemacht werden können.
  • In einer Ausführungsform wird daher der retrovirale Vektor so verändert, dass ein Teil der DNA (RNA), die für das p15E Protein kodiert (in der begleitenden Sequenzliste als SEQ ID Nr. 7 gezeigt) mutiert wurde, um das Vektorpartikel gegenüber einer Inaktivierung durch Humanserum resistent zu machen, das heißt es wurde zumindest eine Aminosäure, aber nicht alle Aminosäuren des p15E Proteins verändert oder mutiert.
  • Das p15E Protein ist ein virales Protein, das 196 Aminosäurereste aufweist. Bei Viren sind manchmal alle 196 Aminosäurereste vorhanden und in anderen Viren sind die Aminosäurereste 181 bis 196 (bekannt als das "r" Peptid) nicht vorhanden und das entstehende Protein ist die "reife" Form von p15E, die als p12E bekannt ist. Daher können Viren sowohl das p15E als auch das p12E Protein enthalten. Das p15E Protein ist in der viralen Membran so verankert, dass die Aminosäurereste 1 bis 134 auf der Außenseite des Virus vorkommen. Obwohl diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nicht auf eine der folgenden Schlussfolgerungen beschränkt ist, wird angenommen, dass Komplementproteine an diese Region binden können, wobei die Bindung zur Inaktivierung und/oder Lyse des Retrovirus führt. Insbesondere umfasst das p15E Protein zwei Regionen, nämlich die Aminosäurereste 39 bis 61 (hierin später manchmal als Region 1 bezeichnet) und die Aminosäurereste 101 bis 123 (hierin später manchmal als Region 2 bezeichnet), von denen angenommen wird, dass sie eine externe Lage in der dreidimensionalen Struktur des p15E Proteins aufweisen, das heißt diese Regionen sind direkt dem Humanserum ausgesetzt. Die Region 2 ist eine hoch konservierte Region in vielen Retroviren, wenn auch die Aminosäuresequenzen dieser Region nicht in allen Retroviren identisch sind. Solche Regionen sind Komplement-bindende Regionen. Beispiele für Komplementproteine, die an die Komplement-bindenden Regionen binden, sind C1S und C1Q, die an die Regionen 1 und 2 binden.
  • Um das Retrovirus zu inaktivieren, binden Komplementproteine sowohl an die Region 1 als auch an die Region 2. Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform zumindest ein Teil der DNA mutiert, der für eine Komplement-bindende Region des p15E Proteins kodiert. Eine solche Mutation führt zu einer Veränderung von zumindest einem Aminosäurerest einer Komplementbindungsregion des p15E Proteins. Die Veränderung in zumindest einem Aminosäurerest einer Komplement-bindenden Region des p15E Proteins verhindert die Bindung eines Komplementproteins an die Komplementbindungsregion, wobei die Komplementinaktivierung des Retrovirus verhindert wird. In einer Ausführungsform ist zumindest ein Aminosäurerest in beiden Komplementbindungsregionen des p15E Proteins verändert, während in einer weiteren Ausführungsform zumindest ein Aminosäurerest in einer der Komplementbindungsregionen verändert wird.
  • Es ist verständlich, dass jedoch nicht die gesamte für das p15E Protein kodierende DNA Sequenz mutiert werden kann, da eine solche Veränderung den Vektor für eine in vivo Veränderung unbrauchbar macht.
  • In einer Ausführungsform kann die Mutation der DNA (RNA), die das p15E Protein kodiert, durch die Deletion eines Teils des p15E Gens und dem Ersatz des deletierten Teils des p15E Gens mit Fragmenten oder Teilen eines Gens bewirkt werden, das für ein anderes virales Protein kodiert. In einer Ausführungsform wird ein Teil der DNA, die für das p15E Protein kodiert, durch ein Fragment des für das p21 Protein kodierenden Gens ausgetauscht, das ein HTLV-I Transmembranprotein ist. Das HTLV-I Virus ist gegen die Bindung von Komplementproteinen resistent und daher ist HTLV-1 gegenüber einer Inaktivierung durch Humanserum resistent (Hoshino et al., Nature, Band 310, Seiten 324-325 (1984)). Daher wird in einer Ausführungsform ein retrovirales Vektorpartikel bereitgestellt, worin ein Teil des p15E Proteins deletiert und durch einen Teil eines anderen viralen Proteins ersetzt wird, wie einem Teil des p21 Proteins.
  • Das p21 Protein (wie es in der begleitenden Sequenzliste als SEQ ID Nr. 8 gezeigt ist) ist ein Protein mit 176 Aminosäureresten und hat beim Vergleich mit p15E eine signifikante Sequenzhomologie. In einer Ausführungsform werden zumindest die Aminosäurereste 39 bis 61 und 101 bis 123 aus dem p15E Protein deletiert und durch die Aminosäurereste 34 bis 56 und 96 bis 118 des p21 Proteins ersetzt. In einer Alternative werden zumindest die Aminosäurereste 39 bis 123 des p15E Proteins deletiert und durch die Aminosäurereste 34 bis 118 des p21 Proteins ersetzt.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die Aminosäurereste 39 bis 69 des p15E Proteins deletiert und durch die Aminosäurereste 34 bis 64 des p21 Proteins und die Aminsäurereste 96 bis 123 des p15E Proteins werden deletiert und mit den Aminosäureresten 91 bis 118 des p21 Proteins ersetzt.
  • Vektorpartikel, die aus solchen Verpackungslinien erzeugt werden, sind daher "zielgerichtet" und "injizierbar", wobei solche Vektorpartikel nach einer Verabreichung an den Patienten direkt zu der gewünschten Zielzelle oder dem Zielgewebe wandern.
  • Die zielgerichteten Vektorpartikel sind zur Einführung von gewünschten heterologen Genen in Zielzellen ex vivo brauchbar. Solche Zellen können dann einem Patienten als Gentherapieverfahren verabreicht werden, wobei Vektorpartikel, die zielgerichtet und injizierbar sind, in vivo an den Patienten verabreicht werden können, wobei die Vektorpartikel direkt zur gewünschten Zielzelle wandern.
  • Daher umfassen die Vektoren oder Vektorpartikel der vorliegenden Erfindung ferner zumindest ein heterologes Gen. Heterologe oder fremde Gene, die in den Vektor oder in die Vektorpartikel gegeben werden, sind unter anderem Gene, die Cytokine oder zelluläre Wachstumsfaktoren kodieren, wie Lymphokine, die Wachstumsfaktoren für Lymphocyten sind. Andere Beispiele für fremde Gene umfassen unter anderem Gene, die den Faktor VIII, den Faktor IX, Tumornekrosefaktoren (TNF's), ADA, ApoE, ApoG und Protein C kodieren.
  • Die Vektoren der vorliegenden Erfindung umfassen einen oder mehrere Promotoren. Geeignete Promotoren, die verwendet werden können, umfassen unter anderem den retroviralen LTR, den SV40 Promotor und den Promotor des humanen Cytomegalievirus (CMV), wie er in Miller et al., Biotechniques, Band 7, Nr. 9, Seiten 980-990 (1989) beschrieben ist oder jeden anderen Promotor (beispielsweise zelluläre Promotoren, wie zelluläre eukaryontische Promotoren, einschließlich unter anderem die Histon, Pol III und B-Actin Promotoren). Andere virale Promotoren, die verwendet werden können, umfassen unter anderem Adenoviruspromotoren, TK Promotoren und B19 Parvovirus-Promotoren. Die Auswahl eines geeigneten Promotors ist für den Fachmann aus den hierin enthaltenen Beschreibungen naheliegend.
  • Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können Regulationselemente enthalten, um erforderlichenfalls eine gewebespezifische Expression der gewünschten heterologen Gene sicherzustellen und/oder die Expression der heterologen Gene in Reaktion auf zelluläre oder metabolische Signale zu regulieren.
  • Obwohl die Erfindung in Bezug auf retrovitrale Vektorpartikel beschrieben wurde, können andere virale Vektorpartikel (wie beispielsweise Partikel vom Adenovirus, Adeno-assoziierten Virus und Herpes Simplex Virus) oder synthetische Partikel so konstruiert werden dass die Vektorpartikel eine Rezeptorbindungsregion umfassen, die an einen Rezeptor einer Zielzelle bindet, wobei der Rezeptor einer humanen Zielzelle nicht der amphotrophe Zellrezeptor ist. Solche Vektorpartikel sind für eine. in vivo Verabreichung an eine gewünschte Zielzelle geeignet.
  • Die Vorteile der vorliegenden Erfindung umfassen die Fähigkeit zur Bereitstellung von Vektorpartikeln, die direkt an eine gewünschte Zielzelle oder ein Zielgewebe verabreicht werden können, wobei die gewünschten Gene an die Zielzelle oder das Zielgewebe abgegeben werden, wobei die Zielzelle oder das Zielgewebe die Proteine bilden, die durch solche Gene exprimiert werden.
  • Die Erfindung wird in Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben, wobei der Umfang der vorliegenden Erfindung hierdurch nicht beschränkt werden soll.
  • Beispiel 1
  • Das Plasmid pCee (1), das das ecotrope Mausleukämievirus gp70 Gen und das p15E Gen unter der Kontrolle des CMV Promotors enthält, wird mit Accl geschnitten und ein Accl Fragment, das für die Aminosäurereste 1-312 des eco gp70 Proteins kodiert, wird entfernt. In die Accl Stelle wird ein PCR Fragment kloniert, das das eco gp70 Sekretionssignal (oder die Leadersequenz, die die Aminosäurereste 1-33 von eco gp70 umfasst), gefolgt vom reifen Kaninchen-α-1-säureglycoprotein (Aminosäurereste 19-201) enthält (Ray et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, Band 178, Nr. 2, Seiten 507-513 (1991)). Die Aminosäuresequenz des Kaninchen-α-1-säureglycoproteins ist in (SEQ ID Nr. 5) gezeigt und die DNA Sequenz, die hierfür kodiert, ist in (SEQ ID Nr. 6) gezeigt. Das entstehende Plasmid pAGP-1- (2) enthält die eco gp70 Leadersequenz (Aminosäurereste 1-33 von eco gp70), eine Sequenz, die das reife Kaninchen-α-1-säureglycoprotein (Aminosäurereste 19-201) kodiert und eine Sequenz, die die Aminosäurereste 313 bis 469 von eco gp70 kodiert.
  • Beispiel 2
  • Das Plasmid pCee wird mit Sall und PfIMI geschnitten und ein Sall-PfIMI Fragment, das die Aminosäurereste 1-262 von eco gp70 enthält, wird entfernt. In diese Stelle wird ein durch PCR erzeugtes Sall-PfIMI Fragment kloniert, das die eco gp70 Leadersequenz und die Sequenz enthält, die für reifes Kaninchen-α-1-säureglycoprotein kodiert. Das entstehende Plasmid pAGP-3 (3) umfasst daher eine Sequenz, die die Signalsequenz von eco gp70 kodiert, eine Sequenz, die ein reifes Kaninchen-α-1-säureglycoprotein kodiert und eine Sequenz, die für die Aminosäurereste 263 bis 469 von eco gp70 kodiert.
  • Beispiel 3
  • Das Plasmid pUC18RSVXeno (4), das das xenotrophe Mausleukämievirus gp70 Gen und das p15E Gen unter der Kontrolle eines RSV Promotors enthält, wird mit Accl und Stul geschnitten und ein Accl-Stul Fragment, das die Aminosäurereste 1-258 von xeno gp70 enthält, wird entfernt. In diese Stelle wird ein durch PCR erzeugtes Accl-Stul Fragment kloniert, das die xeno gp70 Leadersequenz (Aminosäurereste 1-30) und das reife Kaninchen-α-1-säureglycoprotein kodiert. Das entstehende Plasmid pAX2 (5) enthält daher eine Sequenz, die für die xeno gp70 Signalsequenz kodiert, eine Sequenz, die das reife Kaninchen-α-1-säureglycoprotein kodiert und die Aminosäurereste 259-443 von xeno gp70.
  • Beispiel 4
  • Das Plasmid pUC18RSVXeno wird mit Accl und Clal geschnitten und ein Fragment, das die Aminosäurereste 1-210 von xeno gp70 kodiert, wird entfernt. In diese Stelle wird ein durch PCR erzeugtes Accl-Clal Fragment kloniert, das für die xeno gp70 Signalsequenz kodiert, die vom reifen Kaninchen-α-1-säureglycoprotein gefolgt wird. Das entstehende Plasmid pAX6 (6) umfasst daher eine Sequenz, die die xeno gp70 Signalsequenz, eine Sequenz, die reifes Kaninchen-α-1-säureglycoprotein kodiert und die Aminosäurereste 211-443 von xeno gp70.
  • Beispiel 5
  • 5 × 105 GPL Zellen in 10 cm Gewebekulturplatten werden (mittels CaPO4) mit 30 µg/Platte von einem der Plasmide pAGP-1, pAGP-3, pAX2 oder pAX6 transfiziert. Das CaPO4 wird 24 Stunden später entfernt und 10 ml an frischem D10 Medium werden für weitere 24 Stunden zugegeben. Das D10 Medium wird dann entfernt und mit serumfreiem DX Medium für weitere 24 Stunden ersetzt. Das DX Medium wird dann gewonnen, filtriert und auf Eis gelagert. Der Überstand enthält die Vektorpartikel.
  • Die Überstände werden dann filtriert und durch Standardverfahren gewonnen und dann zentrifugiert. Nach der Zentrifugation werden die Viruspellets in einem Puffer rekonstituiert, der 0,1 M Natriumacetat, 0,15 M Natriumchlorid und 2 mM Calciumchlorid enthält, wobei der Puffer mittels eines Falcon 0,2 Millimicrongewebekulturfilters sterilisiert wurde.
  • 2,2 ml an konzentriertem Überstand, der Viruspartikel enthält, die von pAGP-1 oder pAGP-3 erzeugt wurden, wobei diese Viruspartikel hierin manchmal als Chimeric-1- oder Chimeric-3 bezeichnet werden, werden auf zwei Einwegplastiksäulen aufgetragen, die mit Alkohol sterilisiert und getrocknet wurden. Zu jeder Säule (1 cm × 6 cm) wird eine Einheit Neuraminidase von Clostridium gerfringens als 2 ml Suspension gegeben, die an Agarosekügelchen gebunden ist. Dies repräsentiert 1 ml gepacktes Gel oder die an Enzymeinheiten pro Säule (15,7 mg an Agarose/ml und 28 Einheiten pro Gramm Agarose). Als Einheit ist die Menge an Neuraminidase definiert, die 1,0 µmol N-Acetylneuraminsäure pro Minute von NAN-Lactose bei pH 5,0 und 37°C freisetzt.
  • Die Säulen werden dann mit einem großen Überschuss (50 ml) des hierin vorher beschriebenen Puffers gewaschen, um das Harz von allen Spuren an freier Neuraminidase zu befreien und das Harz vor der Inkubation mit dem Virus zu sterilisieren. Die Säulen werden dann getrocknet und die Böden werden mit Kappen verschlossen und mit Parafilm gesichert. Das konzentrierte Virus, das im Puffer (2,0 ml pro Probe) rekonstituiert wurde, wird dann zum Harz gegeben. Die Deckel werden auf die Säulengegeben und mit Parafilm gesichert. Das Harz wird vorsichtig mit der Hand resuspendiert. Das Virus wird mit dem Harz für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit sanfter Rotation auf einem Rad inkubiert. Die Säulen werden periodisch überprüft, um ein gutes Mischen des Harzes und des Virus sicherzustellen.
  • Am Ende der Inkubationsperiode werden die Chimera-1 und Chimera-3 Viren durch sanfte Vakuumfiltration gewonnen und in getrennten sterilen 12 × 75 mm Falcon 2063 Polypropylenkunststoffröhrchen gesammelt. Die Ausbeute beträgt mehr als 90 %, was etwa 1,9 mol des desialisierten Virus ergibt.
  • Platten mit 6 Vertiefungen, die etwa 105 Rezeptor-positive (Hep G2) oder Rezeptornegative (SK Hepl) humane Hepatocyten in 2 ml D10 Medium enthalten, werden als Zielzellen verwendet. 24 Stunden nachdem die Zellen plattiert wurden, wird 1 ml an D10 aus der ersten Vertiefung entfernt und 2 ml an Neuraminidase-behandelter (oder unbehandelter als Kontrolle) viraler Überstand, der Chimeric-1 oder Chimeric-3 enthält, wird zugegeben und gut gemischt. 200 µl aus der ersten Vertiefung werden in die 2 ml verdünnt, die in der zweiten Vertiefung enthalten sind, werden dann gemischt und dann werden 200 µl aus der zweiten Vertiefung in die 1,8 ml verdünnt, die in der dritten Vertiefung enthalten sind, wobei sich ungefähre Verdünnungen von 2/3, 1/15 und 1/150 ergeben. 8 µg/ml an Polybren werden in jede Vertiefung während der Transduktion gegeben. Die viralen Partikel werden mit den Zellen über Nacht in Kontakt gelassen, wonach eine Entfernung des Mediums erfolgt, das die Viruspartikel enthält, und durch D10 ersetzt, worin 1000 mg/ml an G418 enthalten sind. Das Medium wird gegen frisches D10 und G418 alle 4 bis 5 Tage gewechselt, wie dies erforderlich ist. G418-resistente Kolonien werden nach 2 bis 3 Wochen herausgesucht.
  • Beispiel 6
  • Die Präverpackungszelllinie GP8, die die retroviralen Proteine gag und pol exprimiert, und die Verpackungszelllinien, die sich von ihr ableiten und die auch die durch die Plasmide pAGP-1, pAGP-3, pAX2 oder pAX6 kodierten Chimären gp70 Glycoproteine exprimieren, werden in Zellkultur gehalten und stetig ansteigenden Konzentrationen an Weizenkeimagglutinin ausgesetzt, wobei mit 15 µg/ml begonnen wird. Die Zelllinien werden unter WGA Selektion in der Zellkultur für 6 bis 8 Wochen gehalten, bis man Populationen erhält, die gegenüber 40-50 µg/ml WGA resistent sind. Die Letzteren werden dann einer Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung mittels FITC-konjugierten Lektinen angezogen, um die Zellen anzureichern, die den gewünschten mutierten Glycoryp kodieren (beispielsweise FITC-Enthrina cristanalli Agglutinin für Beta-D-galactosylgruppen und FITC-Concanavalin A für a-D-Mannosylgruppen). Verpackungs- und Produzentenzelllinien für retrovirale Vektoren werden dann aus den entstehenden Populationen durch Standardtechniken erzeugt.
  • Es ist jedoch verständlich, dass sich der Umfang der Erfindung nicht auf die spezifischen hierin beschriebenen Ausführungsformen beschränkt. Die Erfindung kann auch anders als hierin im einzelnen beschrieben und immer noch innerhalb des Umfangs der begleitenden Patentansprüche angewandt werden.
  • Sequenzliste
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Claims (11)

  1. Retrovirales Vektorpartikel, wobei das retrovirale Vektorpartikel ein retrovirales Hüllprotein umfasst, das eine Rezeptorbindedomäne, eine Gelenkregion und eine Kernregion enthält, wobei ein Teil des retroviralen Hüllproteins deletiert ist und eine Rezeptorbindungsregion oder ein Ligand, der an einen Rezeptor einer Zielzelle bindet, in diesen deletierten Teil inseriert ist, wobei der Rezeptor der Zielzelle ein anderer als der amphotrophe Zellrezeptor ist und worin der einzige Teil des retroviralen Hüllproteins, der deletiert ist, folgender ist (i) ein Teil der Rezeptorbindungsdomäne und ein Teil oder die gesamte Gelenkregion, oder (ii) die gesamte Rezeptorbindungsdomäne und ein Teil oder die gesamte Gelenkregion.
  2. Retrovirales Vektorpartikel nach Anspruch 1, worin ein Teil der Gelenkregion des retroviralen Hüllproteins deletiert ist.
  3. Retrovirales Vektorpartikel nach Anspruch 1, worin die Rezeptorbindungsregion, die an einen Rezeptor einer Zielzelle bindet, eine Rezeptorbindungsregion eines humanen Virus ist.
  4. Retrovirales Vektorpartikel nach Anspruch 3, worin die Rezeptorbindungsregion eines humanen Virus eine Oberflächenproteinbinderegion des Hepatitis B Virus ist und die Zielzelle eine Leberzelle ist.
  5. Retrovirales Vektorpartikel nach Anspruch 3, worin die Rezeptorbindungsregion eines humanen Virus die Rezeptorbindungsregion von gp46 des HTLV-I Virus ist und die Zielzelle eine T-Zelle ist.
  6. Retrovirales Vektorpartikel nach Anspruch 3, worin die Rezeptorbindungsregion eines humanen Virus die CD4 Bindungsregion des HIV gp 120 ist und die Zielzelle eine T4 Helferzelle ist.
  7. Retrovirales Vektorpartikel nach Anspruch 1, worin die Rezeptorbindungsregion oder der Ligand, der an einen Rezeptor einer Zielzelle bindet, welcher im deletierten Teil inseriert ist, ein Protein ist, das an einen Asialoglycoproteinrezeptor von Hepatocyten bindet.
  8. Retrovirales Vektorpartikel nach Anspruch 7, worin das Protein, das an einen Asialoglycoproteinrezeptor von Hepatocyten bindet, das alpha-1 Säureglycoprotein ist.
  9. Retrovirales Vektorpartikel nach Anspruch 1, das ferner zumindest ein heterologes Gen umfasst.
  10. Verpackungszelllinie, die die retroviralen Partikel aller vorangehenden Ansprüche umfasst.
  11. Verwendung eines retroviralen Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung einer therapeutischen oder prophylaktischen Zusammensetzung.
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