CN104884627A - 具有小型启动子盒的逆转录病毒载体 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了用于基因递送的逆转录病毒复制型载体,其包括含有至少一个与待表达的基因相连接的小型启动子的治疗盒。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年10月25日提交的美国临时专利申请第61/718,610号的优先权,其公开的内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及治疗细胞增殖的逆转录病毒复制型载体(RRV)。本公开还涉及使用这些逆转录病毒复制型载体递送和表达异源核酸。
发明背景
递送基因和异源核酸至细胞和受试者的有效方法的发展一直是可能治疗疾病和病症的目标。
复制型逆转录病毒载体(RRV;又名具有复制能力的逆转录病毒)已被用于选择性地感染动物模型的肿瘤(Wang et al.,Hum.Gene.Ther.,14:117-127,2003,Tai et al.,Mol Ther,12:842-851,2005),其中通过肿瘤发生复制。对于转基因表达的常规策略一直使用IRES元件,以允许翻译从内部核糖体结合位点开始。在大小受限的载体中,该IRES组件约600bp,离编码序列大约900bp。如果该载体配备了前药活化基因如由内部IRES序列表达的胞嘧啶脱氨酶或嘌呤核苷酸磷酸化酶,则通过前药(例如,5-氟胞嘧啶,其由胞嘧啶脱氨酶原位转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶)的后续处理,肿瘤可以被消除或生长/扩散被抑制(Tai etal.,Mol Ther.,12:117-127,2005,Ostertag et al.,Neuro Oncol.,2012)。这样的载体现在被用于临床实验治疗原发性脑肿瘤(参见万维网clinicaltrials.gov,NCT01156584)。然而,当总的插入大小超过约1.5kb时,这种RRV的遗传稳定性显著降低,致使若干潜在有用的基因或基因组合物对于简单可靠的治疗应用不能保证足够稳定。具体的例子是源于疱疹胸苷激酶(HSVtk)(SEQ ID NO:35)的常用前药激活基因,可以通过原位磷酸化激活常见的抗疱疹药物如更昔洛韦,阿昔洛韦,伐昔洛韦(ValtrexTM)或其它类似物,导致细胞杀伤。HSVtk基因具有正好超过1.1kb的编码序列,当与IRES组合在一些表达构建体中使用时,形成大于约1.6kb的插入序列。这个大小对于临床使用是不够稳定的。另一例子是胞嘧啶脱氨酶基因(SEQ ID NO:1或3)与UPRT基因(SEQID NO:7)或OPRT基因(WO2010036986,Perez et al.,Mol.Ther.,2005)的组合,其中这些融合基因大约1200bp。虽然缺失发生之前的表达是令人满意的,但是与IRES组合时大小超过1.8kb并表现出不期望的不稳定性。
Logg等人(PNAS,105(12):4733-4738,2008)尝试过各种较短序列的IRES构建体,以改善整合至RRV中的外源基因大小,仅获得了有限的成功。具体地讲,Logg等人证明可以得到表达,但是由于IRES具有的剪接供体/受体作用较小的性质,其稳定性被降低。
发明简述
本公开提供了允许复制型载体中总体大小超过约0.9kb的基因或多个基因在体内稳定表达的方法和组合物。本公开提供了包含至少一个小型启动子盒的载体,其能够表达大于1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,或1.9kb的异源基因。如果考虑的治疗盒是多个小型启动子盒,或者单一小型启动子盒与包含可操作地连接至第二治疗分子的polIII启动子或IRES的第二盒,则整个治疗盒可包含约1.2-2.0kb。例如,当治疗盒中存在两个小型启动子盒时,第一小型盒可以表达第一基因或治疗性分子,而第二盒可以表达第二基因或治疗性分子。
还公开了,用于驱动约1.2kb的基因表达的新的小型启动子构建体,其位于具有复制能力的重组逆转录病毒(RRV)中。考虑到前述的一般概念,本公开提供了具有复制能力的重组逆转录病毒(RRV),其包括:逆转录病毒GAG蛋白;逆转录病毒POL蛋白;逆转录病毒包膜(ENV);逆转录病毒多核苷酸,其包含位于逆转录病毒多核苷酸序列3'端的长末端重复(LTR)序列,位于逆转录病毒多核苷酸5'端的启动子序列,所述启动子适于在哺乳动物细胞中表达,gag核酸结构域,pol核酸结构域和env核酸结构域;治疗盒,其包含至少一个可操作地连接至异源多核苷酸的小型启动子,其中所述盒位于到3'端LTR的5'端和编码逆转录病毒包膜的env核酸结构域的3'端;以及在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列。在一实施方案中,治疗盒包含至少一个可操作地连接至异源多核苷酸的核心启动子或小型启动子和增强子。在一实施方案中,逆转录病毒多核苷酸序列源自γ逆转录病毒,如鼠白血病病毒(MLV),莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV),猫白血病病毒(FeLV),狒狒内源性逆转录病毒(BEV),猪内源性病毒(PERV),源自猫的逆转录病毒RD114,松鼠猴逆转录病毒,异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMRV),禽网状内皮组织增殖病病毒(REV),或长臂猿白血病病毒(GALV)。在另一实施方案中,MLV是兼嗜性MLV或亲嗜性MLV,具有双嗜性或GALV包膜基因。在又一实施方案中,逆转录病毒是致癌逆转录病毒或γ逆转录病毒。在又一实施方案中,载体包含能够感染哺乳动物靶细胞的小型启动子盒。在另一实施方案中,靶细胞是具有异常增殖能力的细胞,例如那些与细胞增殖性病症有关的细胞。所述细胞增殖性病症可以选自但不限于瘤形成和自身免疫性疾病。在一实施方案中,用于RRV基因组转录的启动子包括CMV启动子。在进一步的实施方案中,启动子包含CMV-R-U5结构域多核苷酸。在一实施方案中,CMV-R-U5结构域包含连接至MLV R-U5区的来自人巨细胞病毒的立即早期启动子。在另一实施方案中,gag和pol多核苷酸源自致癌逆转录病毒或γ逆转录病毒。在一实施方案中,env结构域编码兼嗜性ENV蛋白。在任一前述的又一实施案例中,治疗盒包含至少一个小型启动子盒并且还可包含增强子,其包含表达时编码治疗性蛋白的治疗性(异源的)多核苷酸序列或治疗性核酸(如siRNA,shRNA,microRNA等)。在一实施方案中,小型启动子盒是RNA聚合酶II的启动子。在另一实施方案中,小型启动子盒是RNA聚合酶III的启动子(例如U6启动子)。在一实施方案中,治疗盒包含单一小型启动子盒,其包含可操作地连接至治疗性分子或分子编码序列的小型启动子和增强子。在另一实施方案中,治疗盒包含至少一个小型启动子盒和第二盒。第二盒可以是第二小型启动子盒,IRES盒或polIII启动子盒。小型启动子促进可操作地连接的基因或编码核酸序列的转录。
小型启动子,正如其名称所指,包括对于有效转录和/或翻译所必需的可操作地连接至编码序列的最少量元件,并且具有比核心启动子更好的表达。小型启动子可以包括核心启动子,而且还包括其他促进转录的调控结构域。小型启动子长度为约100-600bp,而核心启动子通常小于约100bp(例如约70-80bp)。治疗盒包含核心启动子时,将存在第二盒(例如第二小型启动子盒,polIII启动子盒或IRES盒),或者核心启动子将伴随有增强子。此外,核心启动子存在时,盒一般包含位于核心启动子序列上游或下游的增强子元件或另一元件,其促进可操作地连接的编码序列的表达高于核心启动子单独的表达水平。
相应地,本公开提供了确定为“核心启动子”元件的源自任一细胞元件的较小调控启动子结构域(如改良的核心启动子)(<100,<200,<400或<600bp),其允许在靶细胞中以显著水平普遍表达,在一般情况下用于稳定整合入载体,特别是复制型逆转录病毒载体,以允许转基因的有效表达。还提供的是仍在200,400或600bp以下的核心启动子加上最小增强子序列,以允许更好的基因表达。这种增强的启动子包括改良过的核心启动子,天然存在的组织特异性启动子,小的病毒启动子,如源自劳氏肉瘤病毒的启动子。在其他实施方案中,所述治疗性盒包含至少一个小型启动子盒,其对相同基因的表达水平大于或约等于IRES盒的表达水平,或者小于RES盒的表达水平1倍至2倍。
所述载体可包含可操作地连接至核心启动子或小型启动子的任何数量的不同异源多核苷酸。例如,该异源多核苷酸可包括细胞因子基因,siRNA,microRNA或RNAi分子,靶向序列,结合结构域,细胞毒性基因,单链抗体或它们的任意组合。当该异源多核苷酸是非翻译的RNA如siRNA,microRNA或RNAi时,则可能无需小型启动子,但也可以包含在转录基因的组合中。在又进一步的实施方案中,异源多核苷酸包含具有如SEQ ID NO:3(CDopt-3pt)、5(CDopt),11(CDopt-UPRT)、13(CDopt-linker-UPRT)、15(CDopt3-OPRT)、17(CDopt3-linker-OPRT)或75(HSVtkopt)所示序列的多核苷酸。在进一步的实施方案中,异源序列编码包含如SEQ ID NO:4或76所示序列的多肽。在一实施方案中,所述异源核酸是优化的人密码子且编码如SEQ ID N0:4或76所示序列的多肽。
本公开提供了分离的多核苷酸,其从5'至3'包含:来自人巨细胞病毒的立即早期启动子融合至MLV R-U5区域的CMV-R-U5;PBS,逆转录酶的引物结合位点;5'剪接位点;ψ包装信号;MLV组特异性抗原的编码序列gag;MLV聚合酶多蛋白的编码序列pol;3'剪接位点;MLV 4070A株系包膜蛋白的编码序列4070A env;至少一个可操作连接至治疗性基因的小型启动子盒;多嘌呤区;以及U3-R-U5MLV长末端重复。在一实施方案中,3'端LTR源自致癌逆转录病毒或γ-逆转录病毒。在进一步的实施方案中,3'端LTR包含U3-R-U5结构域。
本公开提供了治疗受试者细胞增殖性病症的方法,包括将受试者或细胞与本公开中的逆转录病毒接触,其中所述的异源核酸序列编码抑制赘生性细胞增殖的治疗性蛋白。在一实施方案中,逆转录病毒包含编码具有如SEQ ID NO:4,12,14,16,18或76所示序列的多肽的多核苷酸,其中所述多核苷酸可操作地连接至小型启动子上。
本公开提供了具有可操作地连接至细胞毒素基因的启动子盒的某些RRV序列。例如,SEQ ID NO:19显示了PAC3-C1.yCD2载体,其中该载体包含gag,pol和env序列,env序列后紧跟着启动子CMV核心启动子和具有3个热稳定突变的人源化胞嘧啶脱氨酶,其后接3'LTR。SEQ ID NO:20显示了相似的结构,但是该盒包含S1启动子,其后接转基因的人GMCSF。SEQ ID NO:21显示了RRV载体“PACE-CD”的序列。SEQ ID NO:22显示了除了其启动子盒包含可操作地连接到鼠GMCSF的S1启动子外,与SEQ ID NO:19和20相似的序列。SEQ ID NO:39显示了具有S1-yCD2盒的RRV序列。SEQ IDNO:40示出了具有C1-GFP盒的RRV序列。SEQ ID NO:41示出了具有S1-GFP盒的RRV序列。本公开的其他载体包括连接至异源核酸的小型启动子如SEQ ID NO:77-85和86所示。
本公开提供了包含具有复制能力的重组逆转录病毒(RRV)和具有小型启动子盒的载体,其中该载体感染靶细胞多次,导致每个靶细胞的逆转录病毒基因组平均3个或更多个拷贝数。多个拷贝数在体内和体外为基因递送和蛋白生产提供了有用的“超级”感染。在一实施方案中,RRV包含:逆转录病毒GAG蛋白;逆转录病毒POL蛋白;逆转录病毒包膜;逆转录病毒多核苷酸,其包含位于逆转录病毒多核苷酸序列3'端的长末端重复(LTR)序列,位于逆转录病毒多核苷酸5'端的启动子序列,所述启动子适于在哺乳动物细胞中表达,gag核酸结构域,pol核酸结构域和env核酸结构域;盒,其包含至少一个可操作地连接至异源多核苷酸的小型启动子或核心启动子和增强子,其中所述盒被定位于3'LTR的5'端和编码逆转录病毒包膜的env核酸结构域的3'端;在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列,其中与pACE质粒相比,在6次传代后该RRV保持较高的复制能力(SEQ ID NO:21,即Logg等(Hum Gene Ther.2001May 20;12(8):921-32)所述的载体)。在一实施方案中,逆转录病毒多核苷酸序列源自鼠白血病病毒(MLV),莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV),猫白血病病毒(FeLV),狒狒内源性逆转录病毒(BEV),猪内源性病毒(PERV),源自猫的逆转录病毒RD114,松鼠猴逆转录病毒,异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMRV),禽网状内皮组织增殖病病毒(REV),或长臂猿白血病病毒(GALV)。在另一实施方案中,MLV是兼嗜性MLV。在又一实施方案中,逆转录病毒是致癌逆转录病毒或γ逆转录病毒。在又一实施方案中,靶细胞是具有异常细胞增殖能力的细胞,如那些与有细胞增殖性病症(例如癌症细胞)相关联的细胞。所述细胞增殖性病症可以选自以下,但不限于:肺癌,结肠-直肠癌,乳腺癌,前列腺癌,尿道癌,子宫癌,脑癌,头颈癌,胰腺癌,黑素瘤,胃癌和卵巢癌,淋巴瘤,白血病,类风湿性关节炎和其他自身免疫性疾病。在一实施方案中,载体可包括启动子以驱动gag、pol和env的转录,例如具有如SEQ ID NO:19,20或22所示核苷酸1至核苷酸约582的序列的CMV启动子,且可包括对一个或多个核酸碱基的修饰从而能够指导和起始转录。在又进一步的实施方案中,启动子包含如SEQ ID NO:19,20或22所示核苷酸1至核苷酸约582的序列。在进一步的实施方案中,启动子包含CMV-R-U5结构域多核苷酸。在一实施方案中,CMV-R-U5结构域包含连接至MLVR-U5区的来自人巨细胞病毒的立即早期启动子。在又一实施方案中,CMV-R-U5结构域多核苷酸包含如SEQ ID NO:19,20或22所示核苷酸约1至核苷酸约1202的序列,或者与SEQ ID NO:19,20或22所示序列具有至少95%一致性的序列,其中该多核苷酸促进与其可操作地连接的核酸分子的转录。在另一实施方案中,多核苷酸gag和pol源自致癌逆转录病毒或γ逆转录病毒。该gag核酸结构域可包含SEQID NO:19或22中核苷酸编号约1203至核苷酸约2819的序列,或者与其具有至少95%、98%、99%或99.8%一致性的序列。该pol结构域可包含SEQ ID NO:19或22中核苷酸编号约2820至核苷酸约6358的序列,或者与其具有至少95%、98%、99%或99.9%一致性的序列。在一实施方案中,env结构域编码兼嗜性env蛋白。该env结构域可包含SEQ ID NO:19或22中核苷酸编号约6359至核苷酸约8323的序列,或者与其具有至少95%、98%、99%或99.8%一致性的序列。该载体的小型启动子可以是小于600bp(如约600bp,550bp,500bp,450bp,400bp,350bp,300bp,250bp,200bp,150bp,100bp,约90bp,约80bp,约76bp,约74bp或更小)的任何调控结构域,并允许可操作地连接至编码序列或非编码序列的转录。在一实施方案中,小型启动子包括SEQ ID NO:19或22中核苷酸编号约8330至核苷酸约8406的序列,或者与其具有至少95%、98%或99%一致性的序列。在另一实施方案中,小型启动子包含选自SEQ ID NO:56,57,59,65,67,68,69,71,72,73和74的序列。
本公开的一个或多个实施方案的详细内容阐述于附图和以下的说明书中。其他特征、目的和优点体现在说明书和附图及权利要求书中。
附图简述
图1显示了核心启动子和各种可存在的元件的一般结构基序(Juven-Gershon&Kadonaga,Developmental Biology 339:225–2292010)。通常,核心启动子从转录起始位点上游约-40bp延伸至翻译起始密码子的起始位点下游约40bp。缩写具有下列含义:BREu-上游TFIIB识别元件;TATA-“tata盒”;BREd-下游TFIIB识别元件;Inr-转录的起始子位点;MTE-基序十元件团;DPE-下游启动子元件;DCE-下游核心元件;XCPE1-X核心启动子元件1。
图2A至图2B显示了含有驱动转基因(A)GFP和(B)CD表达的C1和S1核心启动子的pAC骨架中的RRV载体的稳定性。每列上方的数字表示感染周期数。箭头指示预期的片段大小。
图3显示了含有驱动转基因(人和鼠GM-CSF)表达的IRES元件或S1核心启动子的pAC骨架中的RRV载体的稳定性。每列上方的数字表示感染周期数。箭头指示预期的片段大小。
图4A至图4H显示了(A)在pAC3-GFP,pAC3.C1-GFP和pAC3.S1-GFP载体完全感染的人肿瘤细胞系U87,1306-MG和T98s中,通过荧光激活细胞分选(FACS)测量的GFP蛋白表达。MFI-平均萤光强度。(B)在pAC3-yCD2,pAC3.C1-yCD2和pAC3.S1-yCD2载体瞬时转染的293T细胞中的蛋白表达(Western Blot法)。(C)在pAC3-yCD2,pAC3.C1-yCD2和pAC3.S1-yCD2载体完全感染的U87细胞中的蛋白表达(Western Blot法)。(D)至(F)pAC3-hGMCSF和pAC3.S1-hGMCSF中GM-CSF蛋白的表达:(D)在瞬时转染293T中;(E)在完全感染的U87中;(F)在完全感染的PC3细胞中。(G)至(H)pAC3-mGMCSF和pAC3.S1-mGMCSF中的GM-CSF蛋白表达:(G)在瞬时转染的293T中;(H)在完全感染的EMT6细胞中。
图5A至图5B显示了(A)载体pAC3-EMD,pAC3-hGMCSF和pAC3S1-hGMCSF在U87细胞中的病毒复制动力学。(B)载体pAC3-EMD,pAC3-mGMCSF和pAC3.S1-mGMCSF在EMT6细胞中的病毒复制动力学。
图6显示在用两个不同的来源PALA处理U87细胞后具有几乎相同结果的细胞杀伤曲线。
图7显示了IRES-盒,S1盒和SV40盒的GFP表达。
图8A至图8B显示了本公开中使用的构建体的图。
图9显示了在瞬时转染的细胞(293T,左侧;Hela细胞,右侧)由小型启动子和合成启动子介导的基因表达。
发明详述
如本文和所附权利要求中所使用的,单数形式“一个/一种”,“和”和“所述”包括复数引用,除非上下文另有明确说明。因此,例如,提及“一种细胞”时包括多个这样的细胞,提及“所述载体”时包括一个或多个载体等。
此外,使用“或”表示“和/或”,除非另有说明。同样,“包含”,“包括”,“含有”,“具有”,“涵盖”和“涉及”是可互换的,并且并非意在限制。
要进一步理解的是,描述各种实施方案时使用术语“包括”,本领域技术人员可理解,在一些特定情况下,可使用“基本上由......组成”或“由……组成”的语言来替代地描述实施方案。
除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语与本公开所属的技术领域中普通技术人员通常理解的含义具有相同的含义。虽然类似或等同于本文所述的那些方法和材料可以在所公开的方法和组成的实践中使用,示例性的方法,装置和材料如本文所述。
通用教材和系列期刊描述了在本文中有用的分子生物学技术,涉及载体,启动子和许多其它相关主题的应用,这包括:Methods inMolecular Biology,Series John M.Walker编,Humana出版社,ISSN:1064-3745;Methods in Enzymology,Elsevier出版社;公司试剂事实清单和方法支持出版物;科学网站,如Researchgate(www.researchgate.net)和在线实验室测试(例如,http://labtestonline.org/understanding/features/methods/)和个人实验室网站,如http://www.cshl.edu。
整个文本中讨论的出版物仅在其公开内容早于本申请申请日时被提供。本文没有任何内容可被解释为承认本发明人由于先前公开内容而无权先公开这些发明。
本公开提供了用于将基因或蛋白递送至细胞或受试者的方法和组合物。可将这样的方法和组合物用于治疗受试者的各种疾病和病症,包括癌症和其它细胞增殖性疾病和病症。本公开提供了用于基因递送的逆转录病毒复制型载体,利用可操作地连接至待表达的异源多核苷酸的核心启动子和/或小型启动子盒。
大小在约1.5kb以上时,RRV载体上转基因的稳定性可能变化。将IRES盒成功克隆至MLV后的转基因表达的常规策略(Logg等人,同上)一直使用IRES元件,以允许翻译从内部核糖体结合位点开始。该IRES组件约600bp,离编码序列约900bp。因此,连接至IRES盒的多核苷酸的大小受稳定性限制。增加待表达或递送的多核苷酸的大小的一种替代方案是使用促进转录的较小调控序列,如启动子、启动子/增强子、或其它调控结构域。
大多数启动子是相当大的;完整功能性的通常超过600bp,启动子的全长可以是几千碱基。较小启动子可由允许转基因在哺乳动物细胞中可靠表达的载体生成,如复制型逆转录病毒载体(RRVs)等。例如,一种可能的方案是使用由Kadanaga和合作者所描述的“核心”启动子(Juven-Gershon et al.,Nature Methods,11:917-922,2006)。这些核心启动子是基于腺病毒主要晚期(AdML)和巨细胞病毒(CMV)主要立即早期基因,以及合成的“超级核心启动子”SCP 1。其他细胞核心启动子包括但不限于,人血红素加氧酶近端启动子(121bp;Tyrrell et al.,Carcinogenesis,14:761-765,1993);CTP:磷酸胆碱胞苷酰转移酶(CCT)启动子(240bp;Zhou et al.,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,30:61–68,2004);人ASK(S期激酶活化剂,也称为HsDbf4基因,63bp;Yamadaet al.J.Biol.Chem.,277:27668–27681,2002);以及HSVtk基因内核心(Al-Shawi et al.,Mol.Cell.Biol.,11:4207,1991;Salamon et al.,Mol.Cell.Biol.,15:5322,1995)。此外,这些“核心”启动子可以作为进一步改良的起点,以提高启动子的活性。例如,这样的改良,包括在“核心”启动子上附加其他结构域和序列以改善其功能(例如增强子、Kozak序列等)。在实施方案中,这样进一步的改良可包括加入增强子。
这些核心启动子的长度大约每个70-80bp,从而为转基因序列留下大约1.4kb的大小。使用这些启动子可提供有利于诸如HSVtk基因的基因表达,其长度大于1.1kb。然而,对于获得同等或者优于IRES驱动表达载体的表达水平,这样的启动子并不总是可靠的。此外,表达水平在不同细胞中存在变化,并且在一些情况下检测不到转基因的表达水平。这两种源自CMV和腺病毒的核心启动子甚至不如合成的SCP1启动子可靠。
如本文所述,核心启动子(Juven–Gershon et al.,Nat.Methods,2006;Juven-Gershon and Kadonaga Dev.Biol.339:225-229,2010)的使用,虽然不如IRES启动子高效,却允许更长基因的表达,这具有治疗益处。此外,使用合理设计技术,可将不同的启动子组件用于优化RRV的表达和稳定性。这些优化的核心启动子提供了病毒多核苷酸的更有效表达和稳定性。例如,“设计者”启动子可包括已被进一步改良以包括适于稳定和表达的一种或多种附加元件的核心启动子。
如本文中所述,这些核心启动子单独使用或包括用于表达的其他元件使用,可在包括具有复制能力的逆转录病毒载体的各种载体中应用。本公开提供了包含位于env编码序列的3'端和3'LTR的5'端的治疗盒的RRV。“治疗盒”是指在RRV内包含至少一种小型启动子盒或核心启动子盒和一种附加盒(例如IRES,polIII或小型启动子盒)的结构域,其中治疗性多核苷酸序列表达时编码治疗性蛋白质(例如胞嘧啶脱氨酶,胸苷激酶等)或治疗性核酸(例如siRNA,shRNA,microRNA等)。因此,“治疗性盒”可包含单一的小型启动子盒,其包含可操作地连接至治疗性分子的编码序列的小型启动子,或者可包含至少一个小型启动子盒和第二盒。所述第二盒可以是第二小型启动子盒,核心启动子盒,IRES盒或polIII启动子盒。
如本文所使用,“核心启动子”指的是最小启动子,其包含约50-100bp并且缺乏增强子元件。这样的核心启动子包括但不限于,SCP1、AdML和CMV核心启动子。更具体地,当核心启动子盒存在时,第二盒(例如第二小型启动子盒,polIII启动子盒或IRES盒)也将存在。在一些实施方案中,包括具有核心启动子的盒的载体,特别排除使用SCP1、AdML和CMV核心启动子,而利用如本文和以下进一步描述的设计者核心启动子。
核心启动子包括某些病毒启动子。如本文中所使用的病毒启动子是具有核心序列且通常具有一些其他附属元件的启动子。例如,SV40早期启动子包含三种类型的元件:TATA盒,起始位点和GC重复(Barrera-Saldana et al.,EMBO J,4:3839-3849,1985;Yaniv,Virology,384:369–374,2009)。该TATA盒位于转录起始位点上游约20碱基对。GC重复区是含有6个GC框的21碱基对重复,并且是决定转录方向的位点。这个核心启动子序列约100bp。增加额外的72碱基对重复,从而使其成为“小型启动子”,作为转录增强子以约10的因子增加该启动子的功能性是有用的。当SP1蛋白与21bp重复相互作用时,它结合在第一或最后的三个GC框。前三个结合启动早期表达,而最后三个结合启动较晚的表达。72bp重复的功能是增强稳定的RNA量,并提高合成的速率。这是通过与AP1(激活剂蛋白1)结合(二聚)以产生3'聚腺苷酸化和5'加帽的初级转录物而完成的。其它病毒启动子,如劳氏肉瘤病毒(RSV),HBV X基因启动子和疱疹胸苷激酶核心启动子也可被用作所期望选择功能的基础。
核心启动子通常包括相对于+1转录起始位点-40至+40(Juven-Gershon and Kadonaga,Dev.Biol.339:225–229,2010),其限定了RNA聚合酶II机制启动转录的位置。通常,RNA聚合酶II与许多在启动子中结合至DNA基序的转录因子相互作用。这些因子通常被称为“通用”或“基础”转录因子,包括但不限于TFIIA(RNA聚合酶IIA转录因子),TFIIB,TFIID,TFIIE,TFIID和TFIIH。这些因子以“通用”方式与所有核心启动子作用;因此,它们通常被称为“基础”转录因子。
Juven-Gershon等(2006同上)描述了核心启动子的元件。例如,PRC/CMV核心启动子由TATA盒组成,长度为81bp;CMV核心启动子由TATA盒和起始子位点组成;而SCP合成核心启动子(SCP1和SCP2)由TATA盒,Inr(起始子),MTE位点(基序十元件)和DPE位点(下游启动子元件)组成,长度为约81bp。SCP合成启动子与简单的pRC/CMV核心启动子相比有更好的表达。
如本文使用的“小型启动子”或“小启动子”指的是促进可操作连接的基因或编码核酸序列的转录的调控结构域。小型启动子,正如其名称所暗示的,包括对于可操作地连接的编码序列的有效转录和/或翻译所必需的最小量元件。小型启动子可包含“核心启动子”与额外的调控元件或“改良的核心启动子”的组合。通常,小型启动子或改良的核心启动子长度约为100-600bp,而核心启动子通常小于约100bp(例如,约70-80bp)。在其他实施方案中,当核心启动子存在时,该盒通常包含在核心启动子序列上游或下游的增强子元件或另一元件,其有利于上述可操作连接的编码序列的表达高于单独的核心启动子的表达水平。
因此,本公开提供了源自细胞元件的小型启动子(例如改良的核心启动子),确定为允许在靶细胞中以显著水平广泛表达的“核心启动子”元件(<100<200<400或<600bp),并且通常对于稳定并入载体是有用的,特别是复制型逆转录病毒载体,允许转基因的有效表达。还提供了包括核心启动子加上最小的增强子序列和/或Kozak序列的小型启动子,与仍少于200、400或600bp的缺乏这些序列的核心启动子相比允许更好的基因表达。此类小型启动子包括改良的核心启动子和天然存在的组织特异性启动子,如弹性蛋白启动子(对胰腺腺泡细胞特异的,204bp;Hammer et al.,Mol Cell Biol.,7:2956-2967,1987)和来自小鼠和人的细胞周期依赖性ASK基因的启动子(63-380bp;Yamada et al.,J.Biol.Chem.,277:27668–27681,2002)。广泛表达的小启动子还包括病毒启动子如SV40早期和晚期启动子(约340bp),RSV LTR启动子(约270bp)和HBV X基因启动子(约180bp)(如,R Anish et al.,PLoS One,4:5103,2009),其没有典型的“TATTAA盒”,并具有13bp的核心序列5'-CCCCGTTGCCCGG-3'(SEQ ID NO:42)。在其它实施方案中,包含至少一个小型启动子盒的治疗盒具有的表达水平超过,约等于,或约1倍至2.5倍低于RRV中存在IRES盒时的表达水平
核心启动子或小型启动子的转录通过各种元件的相互作用发生。在集中型转录中,例如,在数个核苷酸的狭窄区域内存在单一的主要转录起始位点或者几个起始位点。集中型转录是简单生物体中转录的主要模式。在分散型转录中,在约50至100核苷酸的大区域内存在几个弱的转录起始位点。分散型转录是脊椎动物中最常见的方式。例如,在约三分之二的人基因中观察到分散转录。在脊椎动物中,集中型转录往往与调控启动子相关,而分散型转录通常在CpG岛的组成型启动子中观察到。
表1列举和描述了一些可插入至集中型或分散型启动子元件的核心启动子序列中的核心启动子元件。如前所述,在本公开的组合物中所使用的小型启动子可包括被进一步改良的核心启动子。这样的改良可包括并入如表1所列的一个或多个附加元件。
表1:可作为集中型核心启动子(几乎总具有“TATA盒和单一的转录起始位点(TSS)),或无TATA盒的分散型启动子,通常具有DPE元件(参见R.Dickstein,Trasncription,2(5):201-206,2011;Juven-Gershonet al.,Nat.Methods,2006,如上)的结合位点。核苷酸符号遵循国际公约(万维网:chem.qmul.ac.uk/iubmb/misc/naseq.html)。
表2列出可用于构建和克隆增强子元件至核心启动子区的寡核苷酸。如上所述,本公开的改良/优化的核心启动子可包括加入表1中元件的核心序列,并且还可进一步包括示于表2中的克隆的增强子。在这样做时,核心启动子的大小增加,并且可以被描述为“小型启动子”。然而,最终的小型启动不应超过600bp,且通常为约100bp,200bp,300bp,400bp,500bp和其间的任何整数。
表2.用于构建增强子区段的寡核苷酸
AP-1,激活蛋白-1;NF-κB,核因子κB;CRE,cAMP应答元件。
此外,大多数真核mRNA包含被称为Kozak序列的短的识别序列(RCCATGG(SEQ ID NO:51)),其中ATG是翻译起始位点。Kozak序列的存在可极大促进mRNA在翻译机制中结合至核糖体。为了提高基因表达水平,将Kozak序列并入核心启动子的下游是有利的。虽然核心启动子已证明在转录中有用,高效蛋白翻译对基因表达同样同样重要。因此,在一实施方案中,小型启动子包括调控元件(例如Kozak序列),其可提高转录本mRNA的翻译。其它能有效促进翻译的“Kozak-样”序列是本领域已知的。例如,源自烟草花叶病毒mRNA的5'-UTR和源自龙虾原肌球蛋白基因的序列,能够在真核细胞中发挥功能以增强蛋白翻译(Gallei et al.,1989,Gallei et al.,1992以及Gallei et al.,2002;Sano et al.,2002)。这些序列的长度在7至68核苷酸之间变化(参见,如表3)。
表3:编码基因5'端UTR中存在的已知翻译增强子
具体地,已表明在ATG起始密码子上游紧接的5'UTR影响翻译起始的水平。因此,在一实施方案中,小型启动子包括可提高转录本mRNA翻译的调控元件(如Kozak序列。此外,对待表达和待翻译序列(即该小型启动子可操作连接的序列)的分析可为更好表达的有用改良提供见解。例如,热稳定的人源化酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD2)编码序列(参见,如SEQ ID NO:3)在编码区的前15个氨基酸内具有3个框中ATG。yCD2mRNA中5'UTR与缺失Kozak序列侧翼的起始密码子的间距对于高效蛋白翻译起始是次优的。因此,Kozak序列和/或其他翻译增强子元件的并入可极大提高翻译起始水平,从而生产转基因蛋白。
如上所述,小型启动子可包括优化或改良的核心启动子,其包括促进可操作连接的编码序列表达的一个或多个附加元件。选择这些元件的功能混合物的一种方法是简单合成不同元件或这些元件的变体,将它们连接在一起,并功能性选择能够在所期望情况下表达的小型启动子。Juven-Gershon等描述了可用于测定可操作连接基因的表达水平的测定法(例如,使用荧光素酶报告构建体等)。使用这些技术,与结合转录因子AP-1,核因子κB(NF-κB),CArG结合因子A(CBF-A)和核因子Y(NF-Y)(见表2)相组合,可获得与细胞核心启动子(如来自血红素加氧酶核心)相组合的功能性增强子(Ogawa et al.,Biotechniques,42:628-633,2007),以产生总大小约为165bp的整体活性启动子。然而,可使用其他核心启动子如SCP1核心,如本文所述优化的核心序列,TK基因内核心(Al-shawi et al.,Mol.Cell.Biol.,11:4207,1991;Salamon et al.,Mol.Cell.Biol.,15:53221995);或人ASK基因核心(Yamada et al.)。可将不同的其它基因用作阳性选择标记。这些包括:二氢叶酸还原酶(DHFR;Simonsen et al.,Nuc Acid Res.,16:2235-2246,1988),具有甲氨蝶呤连同核苷酸转运抑制剂,如双嘧达莫(dipyridamole)(Warlick et al.,Biochemical Pharmacology,59:141–151,2000)或磷酸化硝基苄巯基嘌呤核苷(nitrobenzyl mercaptopurineriboside phosphate)(Allayet al.,Stem Cells,16(suppl 1):223-233,1998));胞嘧啶脱氨酶,使用N-膦乙酰基-L-天冬氨酸(PALA)来阻断从头合成尿嘧啶及同化下游碱基和胞嘧啶,以通过嘧啶补救途径来供应这些(Wahl et al.,J.Biol.Chem.,254:8679;Unger et al.,Can.Gene Ther.,14:30-38);以及本领域技术人员所熟知的其他各种选择标记。通常,选择性标记的高水平表达是更好表达的指示。
此外,改良或优化的启动子可通过“直接进化”,易错PCR等获得。例如,通过使用如上述的诸如DHFR的可选择系统和CD选择方案,多轮表达和筛选可提供用于在小型启动子(如核心启动子或改良的核心启动子)中引入错误和选择阳性表达谱。在另一实施方案中,通过在RRV中包括代谢选择性基因并由多轮复制和筛选传代RRV,可选择使用小型启动子不足以表达的转基因用于在RRV背景中增加表达。病毒逆转录酶相对高的错误率允许突变和有益突变的并入,然后选择并成为主导序列。这样改良的小型启动子可被扩增、克隆并用作更有效的小型启动子。有利的是,对于使用RRV作为抗癌剂,筛选可在所期望细胞类型的肿瘤细胞系中进行,如结肠癌,脑癌,肺癌,乳腺癌或前列腺癌。例如,在选择剂的存在下,由推定最小启动子驱动编码可选择标记的RRV的连续传代,导致选择最佳表达的最小启动子。如果存在具有特定组合的组织特异性组织,可使用在推荐靶类型的肿瘤细胞系中传代RRV。在一实施方案中,小型启动子作为单一的实体合成,并且RRV逆转录酶的错误积累速率依赖于引入多样性,可在其进行选择。在单独的实施方案中,合成在序列中具有随机编程的不均一性的初始启动子,使得当引入RRV作为可选择标记的启动子时,存在选择可能序列的更大景观。在另一实施方案中,可以在启动子序列中的随机变异体提供初始病毒载体,并且可使用相同类型的选择来鉴定最优的小型启动子序列。在另一实施方案中,可将Kozak序列RCCATGG(SEQ ID NO:51)引入小型启动子下游,以促进mRNA初始结合至核糖体的小亚基,从而提高翻译。
具有足够表达的优化的小型启动子可在大小受限的核酸(如病毒载体)中用于任何情况。在一实施方案中,将优化的小型启动子用于复制型RRV中来表达一个或多个具有抗癌效果的基因。在一实施方案中,将小型启动子用于表达两个基因,作为融合体,融合基因由诸如像弗林内源蛋白酶靶点的蛋白酶切割位点分开或通过如2A家族(deFelipe et al.,Trends Biotech,24:68-75,2006)的自处理序列分开,或者通过包含两个小型启动子,每个基因用一个小型启动子。在另一实施方案中,小型启动子可用于表达第一基因或编码序列,接着第二盒,其包含polIII启动子,可用于表达siRNA,shRNA或microRNA。因为小型启动子盒较小,它可以有效地结合以并入其他治疗编码序列。
可将本文所述的可操作地连接至待表达的基因或编码序列的小型启动子用于驱动载体中的转录。在一实施方案中,本公开提供的载体从5'至3'包括:来自人巨细胞病毒的立即早期启动子至MLV R-U5区的CMV-R-U5融合体;PBS,逆转录酶的引物结合位点;5'剪接位点;ψ包装信号;用于MLV组特异性抗原的gag编码序列;用于MLV聚合酶多聚蛋白的pol编码序列;3'剪接位点;用于MLV 4070A株系包膜蛋白的4070A env编码序列;治疗盒,其包括(a)至少一个可操作连接至治疗基因的小型启动子盒,或者(b)核心启动子和至少一个选自以下的另一盒:polIII启动子盒,第二核心启动子盒,小型启动子盒和IRES盒;多嘌呤区;以及U3-R-U5MLV长末端重复。在进一步的实施方案中,载体中这些不同“部分”的每一个(如gag、pol、env等)可包括本领域所熟知的源自不同γ逆转录病毒载体(如MLV,GALV等)的序列。在一些实施方案中,载体源自或改造自MLV病毒序列。图8A和图8B描绘了如本文其他地方更加详细描述的本公开的各种载体。例如,在载体5'端的启动子可包括CMV启动子,其具有如SEQ ID NO:19,20或22所示核苷酸1至核苷酸约582的序列,并且可包括对一个或多个核酸酸碱基的修饰,这能够指导和起始转录。在又一进一步的实施方案中,载体启动子包含如SEQ ID NO:19,20或22所示核苷酸1至核苷酸约582的序列。在进一步的实施方案中,启动子包含CMV-R-U5结构域多核苷酸。在一实施方案中,CMV-R-U5结构域包含连接至MLV R-U5区的来自人巨细胞病毒立即早期启动子。在又一实施方案中,CMV-R-U5结构域多核苷酸包含如SEQ ID NO:19,20或22所示核苷酸约1至核苷酸约1202的序列,或者与如SEQ ID NO:19,20或22所示核苷酸约1至约1202的序列至少95%一致性的序列,其中多核苷酸促进与其可操作连接的核酸分子的转录。在另一实施方案中,载体的gag和pol基因源自致癌逆转录病毒或γ逆转录病毒。gag核酸结构域可包括,例如SEQ ID NO:19或22的核苷酸编号约1203至核苷酸约2819的序列,或者与其具有至少95%,98%,99%或99.8%一致性的序列。pol结构域可包含SEQ ID NO:19或22的核苷酸编号约2820至核苷酸约6358的序列,或者与其具有至少95%,98%,99%或99.9%一致性的序列。在一实施方案中,env结构域编码兼嗜性env蛋白。该env结构域可包含SEQ ID NO:19或22的核苷酸编号约6359至核苷酸约8323的序列,或者与其具有至少95%,98%,99%或99.8%一致性的序列。
治疗盒正好位于env终止密码子的下游。通常该治疗盒于env终止密码子之后立即开始,或者在env终止密码子下游约1,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50或100碱基对。治疗盒的开始通常具有从env终止密码子的最小距离,以便优化盒中异源基因的大小。如上所述,治疗盒可包括各自可操作地连接至治疗性编码序列的一个或多个小型启动子,或者各自可操作地连接至治疗性编码序列的小型启动子和polIII启动子,或者各自可操作地连接到治疗性的编码序列的小型启动子和IRES。载体的小型启动子可以是小于600bp(如约599bp,550bp,500bp,450bp,400bp,350bp,300bp,250bp,200bp,150bp,100bp,约90bp,约80bp,约76bp,约74bp或更小)的任何调控结构域,并允许可操作连接的编码序列或非编码序列的转录。在一实施方案中,该盒包括核心启动子,其如SEQ ID NO:19或22的核苷酸编号约8330至核苷酸约8406,或者与其具有至少95%,98%,或99%同一性的序列。在另一实施方案中,如SEQ ID NO:19或22的约8328至8404所示的核心启动子可被任何数目的其它核心启动子或小型启动子取代,包括具有如SEQ ID NO:56,57,59,65,66,67,68,69,71,72,73,和74所示序列的启动子,并且还可包括额外的序列,如增强子(如SEQ ID NO:58和70)。
本公开提供了具有可操作地连接至细胞毒素基因的启动子盒的某些RRVs的序列。例如,SEQ ID NO:19描述了pAC3-C1.yCD2载体,其中所述载体包含gag,pol和env序列,env序列之后紧跟CMV核心启动子和具有3个热稳定突变的人源化胞嘧啶脱氨酶,其后是3'LTR。SEQ ID NO:20描述了相似的结构,但是所述盒包含S1启动子,其后是人GMCSF转基因。SEQ ID NO:21示出了现有技术的RRV载体“PACE-CD”的序列。SEQ ID NO:22示出了与SEQ ID NO:19和20相似的序列,除了该启动子盒包含可操作地连接至鼠GMCSF的S1启动子。SEQ ID NO:39示出了具有S1-yCD2盒的RRV的序列。SEQID NO:40示出具有C1-GFP盒的RRV的序列。SEQ ID NO:41示出了具有S1-GFP盒的RRV的序列。
术语“表达”是指允许或致使基因或DNA序列中的信息显示,例如,通过激活参与相应基因或DNA序列的转录和翻译的细胞功能来产生蛋白质。DNA序列表达于细胞中或通过细胞表达来形成“表达产物”,如蛋白。表达产物本身,如所得到的蛋白,也可以说是通过细胞“被表达的”。多核苷酸或多肽被重组表达,例如,当它在外源或天然启动子的控制下在外来宿主细胞中表达或产生,或者在外源启动子的控制下在天然宿主细胞中表达或产生。
虽然本公开描述了使用含有核心启动子或小型启动子的RRVs,其他“载体”可包括这样的核心启动子或小型启动子构建体来表达可操作连接的基因和序列。术语“载体”,“载体构建体”和“表达载体”是指可通过其将DNA或RNA序列(如外源基因)引入至宿主细胞中以转化宿主并促进被引入序列表达(如转录和翻译)的媒介物。载体通常包括可传送因子的DNA,编码蛋白的外源DNA可通过限制性酶技术插入其中。载体的常见类型是“质粒”,其通常是双链DNA的自包含分子,可以容易地接受额外的(外源)DNA和容易地导入合适的宿主细胞中。许多载体,包括质粒和真菌载体,已经被描述用于在多种真核和原核宿主中复制和/或表达。然而,大多数的载体具有什么可以被克隆至载体的特定尺寸限制(例如,对质粒,12kb;对λ噬菌体,20kb;对粘粒,30-35kb)。当考虑逆转录病毒载体时,这种限制更加明显。例如,典型的具有复制能力的鼠逆转录病毒的基因组为约8.3kb,而α逆转录病毒RSV的基因组为约9.3kb,其中包含除了病毒基因的正常补体之外的一次性src序列。对于具有复制能力的脾坏死病毒载体,其最大尺寸相似,约为10kb(Gelinas and Temin 1986)(Retroviruses.,CoffinJM,Hughes SH,Varmus HE编,Cold Spring Harbor(NY):Cold SpringHarbor Laboratory Press;1997)。据推测,逆转录病毒基因组的大小限制取决于折叠二聚体RNA的大小。此外,“空壳(gutted)”或复制缺陷型逆转录病毒载体可比其复制能力对应物并入更大的序列。
本公开提供了逆转录病毒复制型载体,其包含编码例如以下的可被递送至细胞或受试者的异源多核苷酸:具有胞嘧啶脱氨酶或其突变体的多肽;具有胸苷激酶活性或其突变体的多肽;其他前药活化基因;microRNA,shRNA或siRNA;细胞因子;抗体结合结构域或其组合。除了逆转录病毒载体,可用于本公开的组合物和方法且可被改造以包含核心启动子或小型启动子盒的其他病毒载体,包括腺病毒载体,麻疹载体,疱疹载体,逆转录病毒载体(包括慢病毒载体),诸如水泡性口炎病毒载体的弹状病毒载体,呼肠孤病毒载体,塞内卡谷(SenecaValley Virus)病毒载体,痘病毒载体(包括源自动物痘或牛痘病毒的载体),细小病毒载体(包括AAV载体),甲病毒载体,或者本领域技术人员已知的其他病毒载体(还参见,例如Concepts in Genetic Medicine,ed.Boro Dropulic and Barrie Carter,Wiley,2008,Hoboken,NJ.;TheDevelopment of Human Gene Therapy,ed.Theodore Friedmann,ColdSprings Harbor Laboratory Press,Cold springs Harbor,New York,1999;Gene and Cell Therapy,ed.Nancy Smyth Templeton,Marcel Dekker Inc.,New York,New York,2000;Gene Therapy:Therapeutic Mechanism andStrategies,ed.Nancy Smyth Templetone and Danilo D Lasic,MarcelDekker,Inc.,New York,New York,2004;Gene and Cell Therapy:Therapeutic Mechanisms and Strategies,Third Edition,ed.Nancy SmythTempleton,CRC Press,2008);其公开内容通过引用并入本文)。
如本文所述,本公开提供了改良的逆转录病毒载体。该改良的逆转录病毒载体可源自逆转录病毒家族的成员。逆转录病毒以不同的方式进行了分类,但在过去的几十年中命名已经标准化(参见ICTVdB–通用病毒数据库,2012发布,万维网址(www)ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/以及教科书“Retroviruses”Coffin,Hughs and Varmus编,Cold Spring Harbor Press 1997;其公开的内容在此引入作为参考)。在一实施方案中,逆转录病毒复制型载体可包含正逆转录病毒(Orthoretrovirus)或更典型的γ逆转录病毒载体。
在许多情况下,使用治疗性逆转录病毒复制型载体,有利的是由逆转录病毒复制型载体所编码的转基因具有高水平表达。例如,对于前药激活基因如胞嘧啶脱氨酶基因,有利的是细胞中的CD蛋白具有更高水平的表达,使得前药5-FC更为有效地转化为5-FU。类似高水平表达的siRNA或shRNA导致更有效的抑制靶基因表达。同样对于细胞因子或单链抗体(scAbs)或抗体的结合部分,通常有利的是表达高水平的细胞因子或单链抗体。此外,在一些载体拷贝中存在使载体或转基因失活或破坏的突变的情况下,有利的是在靶细胞中具有多个拷贝,因为这提供了完整转基因有效表达的高概率。本公开提供能够多次感染靶细胞或靶细胞群体导致拷贝/二倍体基因组的平均数目为3或者更大的具有复制能力的重组逆转录病毒。本公开还提供了测试该特性的方法。还提供的是使用能够多次感染靶细胞或靶细胞群导致拷贝/二倍体基因组的平均数目为5或更大的逆转录病毒复制型载体,治疗细胞增殖性病症的方法。
在一实施方案中,本公开提供了重组逆转录病毒,其能够感染非分裂细胞,分裂细胞,或具有增殖性疾病的细胞。本公开的具有复制能力的重组逆转录病毒包括编码以下的多核苷酸序列:病毒GAG,病毒POL,病毒ENV,包裹在病毒体内的治疗盒,所述治疗盒包括其前有核心启动子或小型启动子的至少一种异源多核苷酸。
短语“非分裂”细胞是指不经过有丝分裂的细胞。只要该细胞不活跃分裂,非分裂细胞可在细胞周期中的任何点被阻断(例如G0/G1,G1/S期,G2/M期)。对于分裂细胞,可使用正逆转录病毒载体或γ逆转录病毒载体。
“分裂”细胞指的是经历活跃有丝分裂或减数分裂的细胞。这些分裂细胞包括干细胞,皮肤细胞(如成纤维细胞和角化细胞),配子及本领域已知的其它分裂细胞。通过术语分裂细胞特别感兴趣且包括的是具有细胞增殖性疾病的细胞,如肿瘤细胞。术语“细胞增殖性病症”是指以异常细胞数量为特征的症状。该症状可包括细胞生长过度(细胞连续增殖导致组织中的细胞群体过度增长)和细胞生长不良(组织中没有或缺乏细胞),或者细胞过度流入或迁移至身体的一部位。该细胞群体并非必须是被转化,致瘤或恶性的细胞,但还可包括正常细胞。细胞增殖性病症包括与结缔组织的过度生长相关的疾病,如各种纤维化病症,包括硬皮病,关节炎和肝硬化。细胞增殖性疾病包括肿瘤性疾病,如头颈癌,鳞状细胞癌,恶性黑素瘤,鼻窦未分化癌(SNUC),脑(包括胶质母细胞瘤),血瘤,区域淋巴结癌,肺癌,结直肠癌,乳腺癌,前列腺癌,尿道癌,子宫癌,淋巴瘤,口腔癌,胰腺癌,白血病,黑素瘤,胃癌,皮肤癌和卵巢癌(参见,例如DeVita,Hellman,andRosenberg's Cancer:Principles and Practice of Oncology第9版2011Wolters Kluwer/Lippincott Williams&Williams for descriptions of thesevarious neoplasia and their current treatments)。细胞增殖性疾病还包括类风湿性关节炎(O’Dell NEJM 350:25912004)和通常以免疫系统细胞不适当增殖为特征的其他自体免疫疾病(Mackay et al NEJM 345:3402001)。
如本文所述,本公开的载体(如RRV载体)包含可操作地连接至异源核酸序列的核心启动子和/或小型启动子盒。如上所述,在本公开的载体中可以有多于一个的小型启动子盒。如本文所使用,术语“异源”核酸序列或转基因是指(i)在野生型逆转录病毒中通常不存在的序列,(ii)来自外来物种的序列,或者(iii)如果来自相同物种,则可以是由其原始形式实质性改造的。可选择地,在细胞中通常不表达的未改变的核酸序列是异源核酸序列。
根据本公开的载体的预期用途,可将任何数目的异源多核苷酸或核酸序列插入至逆转录病毒载体。还可将编码任何期望的多肽序列的附加多核苷酸序列插入至本公开的载体中。其中体内递送异源核酸序列是寻求可使用的治疗性和非治疗性序列。例如,异源序列可编码治疗性分子,包括抑制性核酸分子(microRNA,shRNA,siRNA)或定向于与细胞增殖性病症或其他基因相关的疾病或病症相关的特定基因的核酶;异源序列可以是自杀基因(如HSV-tk或PNP或胞嘧啶脱氨酶;改良或未改良的的),生长因子,或治疗性蛋白(如IX因子,IL2,GMCSF等)及其任意组合。适用于本公开的其它治疗性蛋白质或编码序列易于在本领域中鉴定。
在一实施方案中,载体内的异源多核苷酸包括已优化在人细胞中表达的胞嘧啶脱氨酶(参见,如SEQ ID NO:3和5)。在进一步的实施方案中,胞嘧啶脱氨酶包含人密码子优化的序列,并包含与野生型胞嘧啶脱氨酶(参见,如SEQ ID NO:3)相比增加了胞嘧啶脱氨酶的稳定性(如减少降解或提高热稳定性)的突变。在又一实施方案中,异源多核苷酸编码融合构建体,其包含可操作地连接至编码具有UPRT或OPRT活性的多肽的多核苷酸的胞嘧啶脱氨酶(人密码子优化或未优化的,突变或非突变的)。在另一实施方案中,异源多核苷酸包含本公开的CD多核苷酸(如SEQ ID NO:3,5,11,13,15,或17)。在另一实施方案中,异源多核苷酸是人密码子优化的序列,其编码具有胸苷激酶活性的多肽(参见,如SEQ ID NO:75)。
在另一实施方案中,本公开的载体(如RRV)可包括编码包含胞嘧啶脱氨酶活性的多肽的异源多核苷酸,并且还可以进一步包括包含microRNA或siRNA分子的多核苷酸,其作为病毒启动子的初级转录物的一部分,或者连接至细胞类型或组织特异性的启动子。
在另一实施方案中,本公开提供了重组逆转录病毒复制型载体,其包含位于env基因下游的人初级前体miR-128-2(SEQ ID NO:32)的异源多核苷酸序列。可将在癌症中下调的miRNA并入至用于递送治疗性基因的载体。例如,let-7,miR-26,miR-124,miR181,MiR181d和miR-137(Esquela-Kerscher et al.,2008Cell Cycle 7,759–764;Kumaret al.,2008Proc Natl Acad Sci USA 105,3903–3908;Kota et al.,2009Cell 137,1005-1017;Silber et al.,2008BMC Medicine 6:141-17)。
通过表达改造的siRNA,shRNA或miRNA(Dennis,Nature,418:1222002),可将本公开的复制型逆转录病毒载体用于治疗疾病,其中所述siRNA,shRNA或miRNA关关闭或减少控制包括肿瘤细胞在内的病变细胞增殖或存活的关键基因的表达。这些靶包括基因如Rad51,其是DNA修复的中心酶,如果没有它,细胞生长严重受限制。其他靶包括控制细胞生长(Marquez&McCaffrey Hum Gene Ther.19:272008)或抑制病毒复制(WE Johnson Current Topics in Microbiology andImmunology 371:123-151,2013)的许多信号通路分子,如APOBEC3G或tetherin。可将所述siRNA或miRNA与由本公开的相同或不同逆转录病毒载体表达的细胞毒性基因相组合。合适的细胞毒性基因实例包括本公开的胞嘧啶脱氨酶或改良的胞嘧啶脱氨酶。可由具有胞嘧啶脱氨酶的相同载体或不同载体表达的siRNA或miRNA的实例,是靶向胸苷酸合成酶、二氢嘧啶脱氢酶或其它核酸合成代谢或合成的酶的siRNA或miRNA,其可增强或补充通过胞嘧啶脱氨酶激活5-FC而在肿瘤或组织中局部产生的5-FU的作用。在这种情况下,RRV将包括治疗盒,其具有核心启动子或小型启动子可操作地连接至编码具有CD活性的多肽序列,并且还包括可操作地连接至编码miRNA序列的polIII启动子盒。
使用时,逆转录病毒载体将通过肿瘤或其他靶组织复制,并在生长抑制发生之前,病毒首先整合入宿主基因组并在该细胞生长被抑制之后继续制备病毒。用于选择功能性miRNA或siRNA序列的方法是本领域已知的。本公开的逆转录病毒载体可使用来自相应蛋白未被显著靶向的其它物种的细胞制备。这样的细胞包括犬细胞系或鸡细胞系。可选择地,所述病毒通过瞬时转染源自人293的细胞或允许高效瞬时转染的其它细胞系来制备。为了这种应用,可将siRNA或miRNA序列简单地插入病毒基因组的方便位点处。这个位点包括复制型逆转录病毒包膜下游和3'LTR上游的区域。可选择地,可将polIII转录单位插入具有合适siRNA或miRNA的病毒基因组中,通常是3'包膜基因的下游。在一实施方案中,转录方向与逆转录病毒复制型载体的方向相同。可插入几种不同的siRNA或miRNA序列,以确保靶基因的有效下调或多于一个基因的下调。合适的序列和靶可获自本领域技术人员已知的商业和学术来源(例如,MIT/ICBP siRNA数据库http:(//)web.mit.edu/sirna/;http:(//)katahdin.cshl.org:9331/RNAi_web/scripts/main2.pl RNAi资源,包括siRNA和shRNA的设计工具(HannonLab,Cold Spring Harbor Laboratory);http:(//)www.rnaiweb.com/Generalresource;http:(//)genomics.jp/sidirect/;http:(//)[www].rnainterference.org/;http:(//)bioinfo.wistar.upenn.edu/siRNA/siRNA.htm;http:(//)www(.)ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html(Ambion))。
可将miRNA靶插入转基因的3'端,但在治疗盒的3'LTR之前或小型启动子上游,且在包膜3'端之后。一般来说,不会将靶插入至蛋白编码序列。
在又进一步的实施方案中,异源多核苷酸可包含细胞因子,如白细胞介素、干扰素γ等。可由本公开的逆转录病毒载体表达的细胞因子包括但不限于:IL-1α,IL-1β,IL-2(SEQ ID NO:38),IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-11,IL-12,IL-13,IL-14,IL-15,IL-16,IL-17,IL-18,IL-19,IL-20和IL-21,抗CD40,CD40L,IFN-γ(SEQ ID NO:36,37,38)和TNF-α,可溶性形式的TNF-α,淋巴毒素-α(LT-α,又称为TNF-β),LT-β(存在于复合异源三聚体LT-α2-β中),OPGL,FasL,CD27L,CD30L,CD40L,4-1BBL,DcR3,OX40L,TNF-γ(国际公开号WO 96/14328),AIM-I(国际公开号WO 97/33899),endokine-α(国际公开号WO 98/07880),OPG,以及neutrokine-α(国际公开号WO 98/18921),OX40和神经生长因子(NGF),以及可溶形式的Fas,CD30,CD27,CD40和4-IBB,TR2(国际公开号WO 96/34095),DR3(国际公开号WO 97/33904),DR4(国际公开号WO 98/32856),TR5(国际公开号WO 98/30693),TRANK,TR9(国际公开号WO 98/56892),TR10(国际公开号WO 98/54202),312C2(国际公开号WO 98/06842)和TR12,以及可溶形式的CD154,CD70和CD153。血管生成蛋白在一些实施例中可能是有用的,特别是用于由细胞系生产蛋白。这样的血管生成因子包括但不限于,神经胶质瘤衍生生长因子(GDGF),血小板衍生生长因子-A(PDGF-A),血小板衍生生长因子-B(PDGF-B),胎盘生长因子(PIGF),胎盘生长因子-2(PIGF-2),血管内皮生长因子(VEGF),血管内皮生长因子-A(VEGF-A),血管内皮生长因子-2(VEGF-2),血管内皮生长因子B(VEGF-3),血管内皮生长因子B-186(VEGF-B186),血管内皮生长因子-D(VEGF-D),血管内皮生长因子-D(VEGF-D),以及血管内皮生长因子-E(VEGF-E)。成纤维细胞生长因子可通过本公开的载体递送,其包括但不限于,FGF-1,FGF-2,FGF-3,FGF-4,FGF-5,FGF-6,FGF-7,FGF-8,FGF-9,FGF-10,FGF-11,FGF-12,FGF-13,FGF-14和FGF-15。可使用本公开的载体递送造血生长因子,这样的生长因子包括但不限于,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(沙格司亭,sargramostim),粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(非格司亭,filgrastim),巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF,CSF-1),促红细胞生成素(阿法依伯汀,epoetin alfa),干细胞因子(SCF,c-kit配体,steel因子),巨核细胞集落刺激因子,PIXY321(GMCSF/IL-3)融合蛋白等。
本公开的方法和组合物在与其他治疗组合时是有用的,治疗包括用其他获批准的药物或生物制剂如阿瓦斯丁(Avastin),赫赛汀(Herceptin)或各种HDAC抑制剂。本公开提供了用于治疗细胞增殖性疾病如癌症和肿瘤的方法,包括给予本公开的RRV载体,之后用化疗剂或抗癌剂治疗。一方面,在给予允许RRV感染和复制的化疗或抗癌剂之前的一段时间,先将RRV载体给予受试者。然后用化疗剂或抗癌剂治疗受试者一段时间和剂量,以减少细胞增殖或杀死癌细胞。一方面,如果用化疗剂或抗癌剂的治疗减少但不杀死癌症/肿瘤(例如,部分缓解或暂时缓解),则可用良性治疗剂(如5-FC)治疗受试者,所述良性治疗剂在由RRV表达细胞毒性基因(如胞嘧啶脱氨酶)的细胞中被转化成毒性治疗剂。
用这样的方法,本公开的RRVs在肿瘤细胞的复制过程中扩散,然后可通过用抗癌剂或化疗剂治疗杀死这些细胞,并且使用本文所述的RRV治疗方法可发生进一步杀伤。
在本公开的又一实施方案中,异源基因可包括靶抗原(如癌抗原)的编码序列。在本实施方案中,用包含编码靶抗原的异源多核苷酸的RRV感染包含细胞增殖性病症的细胞,以供靶抗原的表达(例如,癌抗原的过表达)。然后将包含与靶抗原特异性相互作用的靶向同源部分的抗癌剂给予受试者。靶向同源部分可以可操作地连接至细胞毒性剂,或其自身可以是抗癌剂。因此,通过包含靶向抗原编码序列的RRV感染癌细胞提高癌细胞上标靶的表达,致使细胞毒性靶向的效率/效力增加。
阻断免疫系统细胞之间的相互作用已经显示出具有显著的免疫效果,无论是激活或抑制(Waldmann Annu Rev Med.57:652006;Callahan&Wolchok J Leukoc Biol.2013Jul;94(1):41-53.doi:10.1189/jlb.1212631)。全身性给予这些类型的分子可能具有不期望的整体影响,其在最低限度将导致有害副作用效果,在一种CD28激动剂的情况下甚至导致死亡(Suntharalingam et al.NEJM 35510182006)。辉瑞(Pfizer)一直在开发一种这样的抗CTLA-4封阻抗体(CP-675206)作为抗癌试剂,但最近由于副作用显著已停止开发。百时美施贵宝(Bristol MeyersSquibb)具有用于晚期黑素瘤的获批准产品Yervoy,其是阻断CTLA-4的单克隆抗体,但是这已公认引起显著毒性。用编码释放至细胞外空间的这些分子的具有复制能力的载体感染之后,局部递送从肿瘤释放至局部环境的封阻分子,提供了局部免疫调节并可避免这些严重的副作用。所述封阻分子是抗体,单链抗体,可溶形式的天然配体或结合这些受体的其他肽。阻断标靶是各种表面分子,包括除CTLA-4外参与辅助免疫相互作用的分子,且是本领域技术人员所熟知的。关于利用RRV与较小单个基因这些策略的进一步信息可获自WO2010/036986,WO2010/045002,WO2011/126864和WO2012/058673(其通过引用并入本文),并且与本公开的载体相似。
因此,本公开包括对于治疗细胞增殖性病症是有用的不同药物组合物。使用运载体、赋形剂和添加剂或助剂,通过使逆转录病毒载体变成适合于给予受试者的形式来制备根据本公开的药物组合物,所述逆转录病毒载体根据本公开含有在治疗或调节细胞增殖性病症中有用的异源多核苷酸序列。关于利用RRV与单个较小基因的这些策略的进一步信息在WO2010/036986,WO2010/045002,WO2011/126864和WO2012/058673提供,并且与本发明中的载体类似。
例如但不是限制,在治疗细胞增殖性病症中有用的逆转录病毒载体包括兼嗜性ENV蛋白,GAG和POL蛋白,在逆转录病毒基因组U3区域的启动子序列,以及将逆转录病毒基因组复制、包装和整合至靶细胞所必需的全部顺式作用序列。
如上和本文其他地方所述,本公开的载体可包括核心启动子盒和/或小型启动子盒,并且可进一步包括IRES盒。内部核糖体进入位点(“IRES”,Pelletier et al.,1988,Mol.Cell.Biol.,8,1103-1112;Jang et al.,J.Virol.,1988,62,2636-2643)是指编码序列翻译期间促进核糖体进入或滞留的核酸片段,通常在IRES的3'端。在一些实施方案中,IRES可包含剪接受体/供体位点,然而,优选的IRESs缺乏剪接受体/供体位点。本公开考虑治疗盒可包括小型启动子,启动子3'端进一步接着IRES。
另外,本公开的RRV包含逆转录病毒多核苷酸序列5'端的启动子区。在本文中以其普通意义使用的术语“启动子区”是指核苷酸区,其包含DNA调节序列,其中所述调控序列源自能够结合RNA聚合酶并启动下游(3'方向)编码序列转录的基因。该调控序列可与期望的基因序列同源或异源。例如,可利用范围广泛的启动子,包括如上所述的病毒或哺乳动物启动子。关于使用RRV与单个较小基因的这些策略的进一步信息在WO2010/036986,WO2010/045002,WO2011/126864和WO2012/058673中提供,并且与本公开的载体类似。
在一实施方案中,本公开的逆转录病毒基因组包含小型启动子,其包含小型启动子下游的克隆位点,用于在可操作框架内插入期望/异源多核苷酸,以完成异源多核苷酸的表达。在一实施方案中,至少一个小型启动子位于逆转录病毒载体的env基因3'端且所期望的异源多核苷酸5'端。因此,编码期望多肽的异源多核苷酸可以可操作地连接至小型启动子。
在一实施方案中,本公开的重组逆转录病毒以这样的方式被基因改造,使得该病毒靶向于特定细胞类型(如平滑肌细胞,肝细胞,肾细胞,成纤维细胞,角质形成细胞,间质干细胞,骨髓细胞,软骨细胞,上皮细胞,肠细胞,乳腺细胞,赘生性细胞,胶质瘤细胞,神经元细胞和其它本领域中已知的细胞),使得逆转录病毒载体的重组基因组被递送至非分裂靶细胞,分裂靶细胞或者具有细胞增殖性病症的靶细胞。
在进一步相关的实施方案中,使用嵌合env蛋白实现载体的靶向,所述蛋白包含可操作地连接至靶向多肽的逆转录病毒ENV蛋白。所述靶向多肽可以是细胞特异性受体分子,细胞特异性受体的配体,细胞特异性抗原表位的抗体或抗体片段,或本领域容易鉴定的能够与靶细胞结合或相互作用的任何其它配体。靶向多肽或分子的实例包括使用生物素-链霉作为接头的二价抗体(Etienne-Julan et al.,J.Of GeneralVirol.,73,3251-3255,1992;Roux et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 86,9079-9083,1989),其包膜中包含编码抗半抗原的单链抗体可变区的序列的重组病毒(Russell et al.,Nucleic Acids Research,21,1081-1085(1993)),肽激素配体克隆至逆转录病毒包膜(Kasahara et al.,Science,266,1373-1376,1994;Krueger&Albritton,J.Virol.,87:5916-5925,2013),嵌合EPO/env构建体(Kasahara et al.,1994),亲嗜性MLV包膜中抗低密度脂蛋白(LDL)受体的单链抗体,导致特异性感染表达LDL受体的HeLa细胞(Somia et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA,92,7570-7574(1995)),相似地,ALV的宿主范围可通过并入整合素配体而改变,从而使病毒现在能够跨物种特异性感染大鼠胶质母细胞瘤细胞(Valsesia-Wittmann et al.,J.Virol.68,4609-4619(1994)),以及Dornberg及其同事(Chu and Dornburg,J.Virol 69,2659-2663(1995);M.Engelstadter等(Gene Therapy 8,1202–1206(2001))报道了使用含有针对肿瘤标志物的单链抗体的包膜,组织特异性靶向禽逆转录病毒——脾坏死病毒(SNV)。
在进一步的相关实施方案中,本公开提供了使用调控序列被靶向的逆转录病毒载体。可利用细胞或组织特异性调控序列(如启动子)靶向特定细胞群体中的基因序列表达。合适的哺乳动物和病毒启动子在本公开其他地方描述。因此,在一实施方案中,本公开提供了在逆转录病毒基因组5'端具有组织特异性启动子元件的逆转录病毒。通常,组织特异性调控元件/序列位于逆转录病毒基因组LTR的U3区域,包括例如,针对赘生性细胞的细胞或组织特异性启动子和增强子(如肿瘤细胞特异性的增强子和启动子),以及诱导型启动子(如四环素)。
本公开的转录控制序列还可包括天然存在的转录控制序列,与编码超级抗原、细胞因子或趋化因子相关的基因天然相关。
除此之外,可根据期望的表达水平利用具有不同活性强度的不同病毒启动子。在哺乳动物细胞中,CMV立即早期启动子经常用于提供强的转录激活。当需要减少转基因表达水平时,可使用较小效力的改良版CMV启动子。当需要在造血细胞中表达转基因时,可使用诸如来自MLV或MMTV的LTR逆转录病毒启动子。可使用的其他病毒启动子包括SV40,RSV LTR,HIV-1和HIV-2LTR,来自E1A,E2A或MLP区域的腺病毒启动子,AAV ITR,花椰菜花叶病毒,HSV-TK,以及禽肉瘤病毒。
类似地,可将组织特异性或选择性启动子用于在特定组织或细胞中实现转录,从而减少非靶组织中潜在的毒性或不期望的作用。例如,可将诸如PSA,probasin,前列腺酸性磷酸酶或前列腺特异性腺激肽释放酶(hK2)的启动子用于前列腺中靶基因的表达。可将乳清辅助蛋白(WAP)用于乳腺组织中的表达(Andres et al.,PNAS 84:1299-1303,1987)。
“组织特异性调控元件”是能够在一种组织中驱动基因转录而在其他组织类型中主要是“沉默的”调控元件(如启动子)。然而,应当理解,在它们沉默的那些组织中,组织特异性启动子可具有可检测的“背景”或“基础”活性量。在靶组织中启动子选择性激活的程度可表示为选择性比率(在靶组织中的活性/在对照组织中的活性)。在这方面,本公开实践中有用的组织特异性启动子通常具有大于约5的选择性比率。更优先地,选择性比率大于约15。
在某些适应症,可能期望在给予本公开的重组逆转录病毒复制型载体(RRV)之后的特定时间激活转录。这可用受激素或细胞因子调控的启动子来完成。例如在治疗应用中,其中适应症是在特定类固醇产生或途经至此的性腺组织中,使用雄激素或雌激素调控的启动子可能是有利的。激素调控的这些启动子包括MMTV,MT-1,蜕皮素和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)。可以使用其它激素调控的启动子,如响应于甲状腺,垂体和肾上腺激素的那些启动子。关于使用RRV和单个较小基因的受控或组织特异性启动子策略的进一步信息在WO2010/036986,WO2010/045002,WO2011/126864和WO2012/058673中提供,并且与本公开中的载体相似。
此外,启动子的列表不应被解释为是排他性的或限制性的,本领域技术人员将知道可与本文公开的启动子和方法结合使用的其他启动子。
应当进一步理解的是,某些启动子,虽然其活性并未局限于单一的组织类型,然而,它们在可能有活性的一组组织中显示出选择性,而在另一组组织中活性较低或沉默。这样的启动子也被称为“组织特异性”,并考虑在本公开中使用。例如,在各种中枢神经系统(CNS)神经元中有活性的启动子在使免受由于中风的损伤中是治疗有用的,由于中风的损伤可能影响任意数量的大脑不同区域。因此,在本公开中使用的组织特异性调控元件,具有在本逆转录病毒载体中调控异源蛋白的适用性,以及作为靶向多核苷酸序列的适用性。
本公开的逆转录病毒载体和方法提供了具有复制能力的逆转录病毒,其无需辅助病毒或另外的核酸序列或蛋白就可以传播并产生病毒体。例如,如上所述,本公开的逆转录病毒的核酸序列分别编码的一组特定抗原和逆转录酶,(以及整合酶和蛋白酶——对于成熟和逆转录所必需的酶)。病毒gag和pol可源自慢病毒如HIV,或致癌病毒,或γ逆转录病毒如MoMLV。此外,本公开的逆转录病毒的核酸基因组包括编码病毒包膜(ENV)蛋白的序列。env基因可源自任何逆转录病毒或其它病毒。env可以是兼嗜性包膜蛋白,其允许在人和其它物种的细胞中转导,或者可以是亲嗜性包膜蛋白,其只能转导小鼠和大鼠细胞。在一实施方案中,env基因源自非逆转录病毒(如CMV或VSV)。逆转录病毒衍生的env基因的实例包括但不限于:莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV),哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV),鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV),长臂猿白血病病毒(GALV),人免疫缺陷病毒(HIV)和劳氏肉瘤病毒(RSV)。还可使用其他env基因如水泡性口炎病毒(VSV)(G蛋白),巨细胞病毒包膜(CMV),或流感病毒血凝素(HA)。
在一实施方案中,逆转录病毒基因组源自致癌逆转录病毒,更具体是哺乳动物致癌逆转录病毒。在进一步的实施方案中,逆转录病毒基因组源自γ逆转录病毒,更具体是哺乳动物γ逆转录病毒。“源自/衍生”是指亲本多核苷酸序列是通过插入或去除天然存在的序列而改造的野生型致癌病毒(例如,插入小型启动子,插入编码多肽或感兴趣的抑制性核酸的异源多核苷酸,将来自不同逆转录病毒或病毒的更有效启动子交换代替野生型启动子等)。
与通过本领域的标准方法产生的有缺陷且需要协助才能产生感染性载体颗粒的重组逆转录病毒不同,本公开提供具有复制能力的逆转录病毒。
在另一实施方案中,本公开提供了包含重组逆转录病毒衍生的构建体的质粒。该质粒可直接引入至诸如NIH 3T3的靶细胞或细胞培养物,或其它组织培养的细胞。所得细胞将逆转录病毒载体释放入培养基。
在其他实施方案中,提供了用本公开的逆转录病毒复制型载体转染的宿主细胞。宿主细胞包括真核细胞,例如酵母细胞,昆虫细胞,或动物细胞。宿主细胞还包括原核细胞,如细菌细胞。
还提供了用本文提供的载体(如逆转录病毒复制型载体)转导(转化或转染)的工程化宿主细胞。工程化宿主细胞可在经改良适于激活启动子、选择转化子或扩增编码多核苷酸的常规营养培养基中培养。培养条件,如温度、pH等,是先前用于所选择宿主细胞表达的那些条件,并且对本领域技术人员和在本文引用的参考文献中是显而易见的,包括,例如Freshney(1994)Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechinique,第3版(Wiley-Liss,New York)和各种类型的干细胞(万维网址stembook.org)及其中引用的参考文献。通过给予动物或受试者(如患者)受感染的细胞,可将这些宿主细胞用于递送RRV。
合适的表达宿主实例包括:细菌细胞,如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌;真菌细胞,如酿酒酵母、毕赤酵母、和粗糙脉孢菌;昆虫细胞,如果蝇和草地贪夜蛾;哺乳动物细胞,如CHO、COS、BHK、HEK 293br Bowes黑素瘤;或者植物细胞或外植体等。通常情况下将使用人细胞或细胞系;然而,为了测序、扩增和克隆的目的,可能期望将本公开的载体和多核苷酸克隆至非人宿主细胞。
本公开提供了多核苷酸构建体,其从5'至3'包括:对起始转录有用的启动子或调控区;psi包装信号;gag编码核酸序列,pol编码核酸序列;env编码核酸序列;治疗盒,其包含(a)核心启动子和至少一个另外的启动子,各自可操作地连接至治疗性多核苷酸序列,或者(b)至少一个小型启动子,可操作地连接至编码标记物、治疗剂或诊断多肽的异源多核苷酸;以及LTR核酸序列。如本文其它地方所述,本公开多核苷酸构建的不同区段(如具有复制能力的重组逆转录病毒多核苷酸)是部分根据所期望的宿主细胞,表达时间或数量及异源多核苷酸而工程化的。本公开的具有复制能力的逆转录病毒构建体可划分成可由本领域技术人员独立改良的多个结构域。
例如,病毒启动子可包括CMV启动子,其具有如SEQ ID NO:19,20或22所示核苷酸1至核苷酸约582的序列,并且可包括一个或多个(如2-5,5-10,10-20,20-30,30-50,50-100或更多个核酸碱基)修饰,只要该修饰的启动子能够指导和起始转录。在一实施方案中,启动子或调控区包含CMV-R-U5结构域多核苷酸。该CMV-R-U5结构域包含来自人巨细胞病毒至MLV R-U5区的立即早期启动子。在一实施方案中,CMV-R-U5结构域多核苷酸包含如SEQ ID NO:19,20或22所示核苷酸约1至核苷酸约1202的序列,或者与SEQ ID NO:19,20,或22所示序列至少95%一致性的序列,其中所述多核苷酸促进与其可操作连接的核酸分子的转录。gag多核苷酸结构域可源自任何数量的逆转录病毒,但通常源自致癌逆转录病毒,并且更具体地,源自哺乳动物致癌逆转录病毒。在一实施方案中,gag结构域包括核苷酸编号约1203至核苷酸编号约2819的序列,或者与其具有至少95%,98%,99%或99.8%(化整至最接近10th)一致性的序列。pol多核苷酸结构域可源自任何数量的逆转录病毒,但通常源自致癌逆转录病毒,并且更具体地,源自哺乳动物致癌逆转录病毒。在一实施方案中,pol结构域包含核苷酸编号约2820至核苷酸约6358的序列,或者与其具有至少95%,98%,99%或99.9%(化整至最接近10th)一致性的序列。env多核苷酸结构域可源自任何数量的逆转录病毒,但通常源自致癌逆转录病毒或γ-逆转录病毒,更具体地,源自哺乳动物致癌逆转录病毒或γ-逆转录病毒。在一些实施例中,env编码结构域包含兼嗜性env结构域。在一实施方案中,env结构域包含核苷酸编号约6359至核苷酸约8323的序列,或者与其具有至少95%,98%,99%或99.8%(化整至最接近10th)一致性的序列。env终止密码子3'是治疗盒,其包含至少一个核心启动子盒和/或小型启动子盒,并且还可包括polIII启动子盒和/或IRES盒,各自可操作地连接至异源结构域(如编码治疗性分子如具有胞嘧啶脱氨酶或胸苷激酶活性的多肽的序列)。该异源结构域可包含本公开的胞嘧啶脱氨酶或胸苷激酶。在一实施方案中,CD多核苷酸包含人密码子优化序列。在另一实施方案中,CD多核苷酸编码具有胞嘧啶脱氨酶的突变体多肽,其中所述突变赋予提高的热稳定性,其提高10℃的熔融温度(Tm),使其在更宽的温度范围内保持动力学活性并增加蛋白的积累水平。在另一实施方案中,异源结构域是包含SEQ ID NO:75的人密码子优化序列,并且编码具有胸苷激酶活性的多肽。
本公开还提供了重组逆转录病毒载体,其从5'至3'包括:CMV-R-U5,来自人巨细胞病毒的立即早期启动子至MLV R-U5区的融合体;PBS,逆转录酶的引物结合位点;5'剪接位点;ψ包装信号;gag,MLV组特异性抗原的ORF;pol,MLV聚合酶多蛋白的ORF;3'剪接位点;4070A env,MLV 4070A株系的包膜蛋白的ORF;治疗盒,其包含至少一个可操作地连接至编码治疗性分子(如经修饰(热稳定性且密码子优化)的胞嘧啶脱氨酶)的异源多核苷酸的小型启动子;PPT,多嘌呤区;以及U3-R-U5,MLV长末端重复。
此外,本文所述的治疗方法(如基因治疗或基因递送方法)可在体内或体外进行。更优选的可能是在基因治疗之前,通过例如外科手术或辐射去除大部分的肿瘤。在一些方面中,所述逆转录病毒疗法可在手术、化疗或放疗之前或之后。在一些实施方案中,类固醇与载体共同给予(之前,期间或之后立即)。
以下实施例意在示例而非限制本公开。虽然这样的实施例是那些可被使用的典型,可选择使用本领域技术人员已知的其他方法。
实施例
实施例1:emd.GFP和tk基因载体的稳定性
在完全培养基中培养早期传代的人胶质瘤细胞系U87-MG。在感染前一天,将初始细胞以每孔2e5细胞接种在6孔板中。通过瞬时转染293T细胞,制备不同质粒的载体并收集上清液。滴度如(WO2010036986,Perez et al.,Mol.Ther.,2012)所述测定,通常大约10^6TU/毫升。基于pAZ的载体类似于基于pAC3的载体,但起始质粒具有驱动整体病毒RNA转录本的LTR启动子,而不是杂交CMV-LTR启动子(图8)。接下来,来自两种类型质粒的病毒颗粒在基因组的5'端和3'端具有完整的MLV LTRs。在4μg/mL的聚凝胺存在下,根据计算滴度(TU/mL)以0.1的MOI进行感染的第一个周期。在随后的感染中,将所述由受感染细胞产生的病毒上清液的十分之一用于感染初始细胞。在每一个感染周期中,在感染后d4,将受感染细胞于6孔板中传代。感染后d7,将受感染细胞的病毒上清液收集用于后续感染,收集细胞用于基因组提取,以通过IRES-PCR评估载体稳定性。用于PCR的引物如下:IRES-F:5'-CTGATCTTACTCTTTGGACCTTG-3'(SEQ ID NO:54)和IRES-R:5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3'(SEQ ID NO:54)。表达emd(GFP)的载体中的A1和S1启动子源自pAZ.A1.emd和pAZ.S1.emd,似乎比源自pAZ.C1.emd的载体更加稳定,但经验表明,在此试验中载体稳定传代6代是有用的,表现出稳定性,并且当装配合适的基因时,可以治疗小鼠肿瘤模型(CR.Logg et al.,Hum Gene Ther 12:921–932,2001;Logg&Kasahara in Methods in Molecular Biology,vol.246:GeneDelivery to Mammalian Cells:Vol.2:Viral Gene Transfer Techniquespp499-525.Edited by:W.C.HeiserHumana Press Inc.,Totowa,NJ)。对人体使用,需要优选出进一步的稳定性(到8-12代)。pAZ.S1.sr39tk和pAZ.S1.tko衍生的载体稳定性具有增加的稳定性(因而实用)。该sr39tk基因(M.Black et al.Cancer Res 2001;61:3022-3026)是疱疹胸苷激酶基因的功能优化的突变版本,并且tko基因是sr39基因的人密码子优化版本。
实施例2:含有驱动GFP表达的C1和S1核心启动子的基于pAC3的载体的构建和配置
逆转录病毒复制型载体pAC3-C1.GFP和pAC3-S1.GFP均源自pAC3-yCD2骨架。该pAC3骨架由核酸内切酶消化pAC3-yCD2质粒DNA的Mlu I和Not I分离。C1.GFP和S1.GFP的DNA序列由核酸内切酶分别消化pAZ-C1.GFP和pAZ.S1.GFP的Mlu I和Not I分离,随后将所分离的DNA片段插入pAC3骨架相应的限制性酶位点。
实施例3:含有驱动CD表达的C1,S1和S2核心启动子的基于pAC3的载体的构建和配置
逆转录病毒复制型载体pAC3-C1.yCD2和pAC3-S1.yCD2均源自pAC3-yCD2骨架。该pAC3骨架由核酸内切酶消化pAC3-yCD2质粒DNA的Mlu I和Not I分离。C1.yCD2,S1.yCD2和S2.yCD2的DNA序列由该DNA片段各端存在的限制性酶位点Mlu I和Not I合成,随后克隆至pAC3骨架的相应位点。
实施例4:含有驱动hGMCSF和mGMCSF表达的EMCV IRES和C1或S1核心启动子的基于pAC3的载体的构建和配置
逆转录病毒复制型载体pAC3-hGMCSF和pAC3.S1-hGMCSF,pAC3-mGMCSF和pAC3.S1-mGMCSF(参见,如图8)均源自pAC3-yCD2载体骨架(参见,如美国专利公开号20110217267A1,其通过引用并入本文)。对于pAC3-hGMCSF和pAC3-mGMCSF载体,载体中的PAC3骨架由核酸内切酶消化pAC3-yCD2质粒DNA的Psi I和Not I分离。人与小鼠GMCSF基因的cDNA序列分别由该DNA片段各端的限制性酶位点Psi I和Not I合成,并随后克隆至pAC3骨架的相应位点。对于pAC3.S1-hGMCSF和pAC3.S1-mGMCSF载体,载体中的pAC3骨架由核酸内切酶消化pAC3-yCD2质粒DNA的Mlu I和Not I分离。S1-hGMCSF和S1-mGMCSF的DNA序列分别由DNA片段各端的限制性酶位点Mlu I和Not I合成,并随后克隆至pAC3骨架的相应位点。
实施例5:含有驱动GFP表达的C1和S1核心启动子的基于pAC3的载体的载体稳定性和转基因表达
如所述构建基于pAC3载体的含有驱动翠绿色GFP表达的核心启动子(PAC3-C1.emd和PAC3-S1.emd(emd又名GFP)并与pAC3.emd(又名PAC3-GFP,Perez et al.,Mol.Ther.2012))相比较,这是使用内部IRES驱动emd.GFP基因表达的等效载体。感染性载体如前由瞬时转染制备。在完全培养基中培养早期传代的人胶质瘤细胞系U87-MG。在感染前一天,将初始细胞以每孔2e5细胞接种于6孔板。在4μg/mL聚凝胺存在下,根据计算的滴度(TU/mL)以0.1的MOI进行感染的第一个周期。在随后的感染中,将由受感染细胞产生的病毒上清液的十分之一用于感染初始细胞。在每一个感染周期中,在感染后d4天,将受感染细胞接种至6孔板中传代。在感染后d7,收集受感染细胞的病毒上清液用于后续感染,收获细胞用于基因组提取,以通过IRES-PCR评估载体稳定性。用于PCR的引物是:IRES-F:5'-CTGATCTTACTCTTTGGACCTTG-3'(SEQ ID NO:54)和IRES-R:5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3'(SEQ ID NO:55)。
如从图2A中可以看出,具有C1核心启动子(pAC3-C1.emd)的载体版本与IRES驱动的emd.GFP表达载体(PAC3-EMD)具有等同的稳定性,而具有S1(SCP1)核心启动子(pAC3-S1.yCD2)的版本甚至更稳定。
采用GFP阳性细胞的适当门控,通过流式细胞术测量平均荧光强度来测定用不同载体感染的三种人胶质母细胞瘤细胞系(U87-MG,1306-MG和T98G)中的GFP表达水平。在感染的前一天,将初始细胞以每孔2e5细胞接种于6孔板中。在4μg/mL聚凝胺存在下,根据计算滴度(TU/mL)以0.1的MOI进行病毒感染。在感染后d7,收获细胞用于流式细胞术分析,以测定GFP阳性细胞和平均荧光强度(MFI)的百分比。图4A示出了显示了所有这些载体表达的结果。在此所检测的所有3种不同的胶质母细胞瘤细胞系中,IRES依赖性表达系统在受感染细胞中显示比S1启动子构建体更高约5倍的GFP表达水平,虽然在以上三种细胞系的绝对表达水平也改变了大约5倍的因子。
实施例6:含有驱动CD表达的C1和S1核心启动子的基于pAC3的载体的载体稳定性并与pACE-yCD2比较
如所述构建基于pAC3载体的含有驱动CD表达的核心启动子(pAC3-C1.CD和pAC3-S1.CD),对应的传染性载体制剂与来自pAC3.yCD2的载体相比较(O.D.Perez et al.,Mol.Ther.,2012)。早期传代的人胶质瘤细胞系U87-MG在完全培养基中培养。在感染前一天,将初始细胞以每孔2E5细胞接种于6孔板。在4μg/mL聚凝胺存在下,根据计算滴度(TU/mL)以0.1的MOI进行感染的第一个周期。在随后的感染中,用受感染细胞产生的病毒上清液的十分之一感染初始细胞。在每个感染周期中,在感染后d4,将受感染细胞在6孔板中进行传代。在感染后d7,收集受感染细胞的病毒上清液用于后续感染,收获细胞用于基因组提取,以通过IRES-PCR评估载体稳定性。用于PCR的引物是:IRES-F:5'-CTGATCTTACTCTTTGGACCTTG-3'(SEQ ID NO:54)和IRES-R:5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3'(SEQ ID NO:55)。相对稳定性示于图2B中,表明C1.yCD2载体没有其它两个载体稳定,其他两个在稳定性上大致相当,其中S1.yCD2载体比IRES载体(PAC3-yCD2)稍显稳定。
实施例7:含有驱动CD表达的C1和S1核心启动子的基于pAC3的载体的转基因表达,并在转染293T细胞后与pAC3-yCD2比较
转染293T细胞后,通过使用抗CD的抗体的免疫印迹检测载体中CD的表达水平(图4B)。在转染前一天,将初始细胞以每10cm板2E6细胞接种。通过磷酸钙法,使用编码每个病毒基因组的质粒DNA进行瞬时转染。在转染后40小时,收获细胞并裂解以获得细胞裂解物。测定细胞裂解物的蛋白浓度,以使得如GAPDH所示的等量蛋白上样。图4B显示的结果证实,所有这些具有IRES系统的载体的表达产生比S1启动子子构建体的表达更高约15倍。图4C示出了用源自pAC3-yCD2的载体pAC3-C1.yCD2和pAC3-S1.yCD2完全转导U87细胞后细胞提取物的蛋白印迹。虽然对于pAC3-yCD2而言,容易检测到CD蛋白条带,但是在该实验中,用pAC3-C1.yCD2和pAC3-S1.yCD2感染的细胞中没有足量的CD蛋白供检测。
实施例8:含有驱动人和小鼠GM-CSF表达的IRES或S1核心启动子的基于pAC3的载体的复制动力学,载体稳定性和转基因表达
pAC3-IRES.hGMCSF,pAC3-S1.hGMCSF和pAC3-emd的复制动力学通过qRT-PCR在U87-MG中进行了评估。pAC3-IRES.mGMCSF,pAC3-S1.mGMCSF和pAC3-emd的复制动力学在EMT6(小鼠乳腺癌细胞系)中进行了评估。在感染前一天,将初始细胞以1E5细胞(U87-MG)或5E4细胞(EMT6)接种于6孔板。在4μg/mL聚凝胺存在下,根据计算滴度(TU/mL)以0.1的MOI(U87-MG)或1的MOI(EMT6)进行病毒感染。在整个感染过程中,每次传代(对U87-MG每2天,对EMT6细胞每3-4天)接种相同数量的受感染细胞,在不同时间点收集受感染细胞产生的病毒上清并保存于-80℃冰柜中。处理收集的病毒上清液样品,以获得病毒RNA(Maxwell 16LEV simplyRNA Cells Kit,Promega),随后进行qRT-PCR。每个时间点的病毒RNA拷贝/ml的数目由包括于qRT-PCR中的标准曲线来确定。
图5A和图5B显示了载体的生长动力学结果,表明该载体在所有靶细胞中的增殖具有相似于原型pAC3-EMD载体在人和小鼠细胞中的动力学。
早期传代的人胶质瘤细胞系U87-MG在完全培养基中进行培养。在感染前一天,将初始细胞以每孔2e5细胞接种于6孔板中。在44μg/mL凝聚胺存在下,用源自pAC3-hGMCSF,pAC3-S1.hGMCSF和pAC3-emd的感染病毒载体根据计算滴度(TU/毫升)以0.1的MOI进行感染的第一个周期。在随后的感染中,将受感染细胞产生的病毒上清液的十分之一用于感染初始细胞。在每个感染周期中,在感染后d4,将受感染细胞在6孔板中进行传代。在感染后d7,收集受感染细胞的病毒上清液用于后续感染,收获细胞用于基因组提取,通过IRES-PCR评估载体稳定性。用于PCR的引物是:IRES-F:5'-CTGATCTTACTCTTTGGACCTTG-3'(SEQ ID NO:54)和IRES-R:5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3'(SEQ ID NO:55)。连续传代的稳定性曲线示于图3中,表明具有S1启动子的载体与IRES-hGMCSF载体至少是一样稳定的,而对于小鼠GMCSF,S1载体比IRES版本更稳定。
构建基于pAC3的具有驱动人和小鼠GM-CSF(PAC3-S1.hGMCSF和PAC3-S1.mGMCSF)表达的核心启动子的载体,并分别与pAC3-IRES.hGMCSF和pAC3-IRES.mGMCSF进行比较。如前所述,通过瞬时转染由构建体制备了载体制剂。测定该载体转染的293T细胞产生的hGMCSF和mGMCSF,图4D和图4G表明,在转染细胞中观测到这些蛋白的表达,并且由IRES表达系统的载体和S1核心启动子系统的载体转染的细胞分别产生大约相同水平的人或小鼠GMCSF。然而,图4E和图4F表明在完全感染的U87和PC3细胞中,由S1启动子驱动的hGMCSF表达比IRES结构少3倍以下。类似地,图4H示出了对于受感染后mGMCSF的表达,S1启动子在小鼠EMT6细胞中不如IRES载体有效。
实施例9:含有C1和S1核心启动子基于pAC3的载体驱动yCD2相对于pAC3-yCD2的转基因表达较差
在293T细胞中,使用抗CD的抗体通过免疫印迹检测CD表达的水平(图4B)。转染前一天,初始细胞以每10cm板2E6细胞接种。使用编码每个载体中病毒基因组的质粒DNA通过磷酸钙法进行瞬时转染。在转染后40小时,收获细胞并裂解以获得细胞裂解物。确定细胞裂解物的蛋白浓度以使得如GAPDH所示的等量蛋白上样。图4B显示的结果证明,所有这些载体的表达,IRES系统产生比S1启动子构建体更高约15倍的表达水平。此外,图4C显示了在用来自pAC3-yCD2的载体(IRES载体)完全感染的U87-MG细胞中蛋白免疫印迹CD蛋白的表达,但是在C1.yCD2和S1.yCD2载体中未检测到yCD2的表达。
实施例10:在人细胞中使用pAC3-S1.yCD2载体体外阳性筛选以增加yCD2表达
阳性筛选完全感染的pAC3.S1.yCD2载体是通过同时给予从头合成嘧啶的抑制剂N-(磷乙酰)-L-天冬氨酸(PALA)进行的,这导致嘧啶耗尽介导的非感染细胞或yCD2低水平表达细胞的细胞死亡。通过在培养物中加入胞嘧啶,通过嘧啶补救途径挽救yCD2基因高水平表达的细胞。下面描述的方法适用于在实验室中使用的U87胶质母细胞瘤衍生的细胞系,但同样的程序可以用于来自不同肿瘤类型的多种不同的细胞系。在这些情况下,试剂的实际浓度和步骤时间将由细胞的生长速率和细胞系的初始感染率来确定。这样的调整可由本领域技术人员根据需要来做出,并且在实施该方法的过程中来确定。此外,该优化程序可以使用在复制型载体中驱动可选基因的任何启动子。实际试剂浓度和选择的时间点的其他改变也是可能的。
首先确定杀死初始U87细胞所需的PALA浓度,用pAC3-yCD2载体感染U87细胞,pAC3.S1-yCD2载体感染U87细胞。在前一天将细胞以3E3细胞接种于96孔板中。在细胞接种后24小时,将0.00975,0.039,0.156,0.625,2.5,10,40和160uM的PALA加入到培养物中,连续5天,接着通过MTS测定来确定细胞活力。图6示出8-30uM范围内PALA的IC50。在培养物中的胞嘧啶浓度范围(0.2,1,5,10mM)也通过进行与上述相同的实验来确定。这表明,该细胞可以耐受所有测试浓度下胞嘧啶。
对于体外阳性筛选,在前一天将初始U87细胞以1e5细胞接种于6孔板中。第二天,将细胞分别用pAC3-yCD2载体(阳性对照)和pAC3.S1-yCD2载体以0.1的MOI感染。在感染后48小时(~20%的感染率),将1μM的PALA和10mM的胞嘧啶加入到含有初始U87细胞(阴性对照),用pAC3-yCD2载体感染的U87细胞(阳性对照)以及用pAC3.S1-yCD2感染的U87细胞的培养物中,连续5天,在此时间点,收集培养上清液用于新一轮感染初始U87细胞。在PALA和胞嘧啶存在下的感染周期,用增加浓度的PALA重复12轮(周期1-2:1uM;周期3-4:3.3uM;周期5-6:10uM,周期7-8:20uM和周期9-12:30uM))。在筛选结束时,在30uM PALA和10mM胞嘧啶的存在下,将细胞分离并扩增。进行MTS测定以显示由于阴性筛选而细胞活力增加。筛选之前,用pAC3.S1.yCD2载体感染的细胞由于低CD表达而不能有效地利用补救途径。与此相反,用pAC3.S1-yCD2载体感染的细胞表现出与用pAC3-yCD2载体感染的细胞相当的高细胞活力。
为了证实高细胞活力是由于CD表达的上调,进行蛋白印迹来检测CD的表达。收获细胞并裂解以获得细胞裂解物。确定细胞裂解物的蛋白浓度以使得在免疫印迹中如由GAPDH所示的等量蛋白上样。数据显示,用pAC3.S1-YC2载体感染的U87细胞的细胞提取物的CD表达与pAC3-yCD2的CD表达相当。然后从用pAC3.S1-yCD2载体感染的U87细胞中分离基因组DNA,并使用以下引物组通过PCR扩增S1-yCD2区域。IRES-F:5'-CTGATCTTACTCTTTGGACCTTG-3'(SEQID NO:54)和IRES-R:5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3'(SEQID NO:55)。将所得的PCR产物分离用于PCR克隆测序分析。测序结果显示,S1核心启动子中发生多种突变。接着,如上所述,合成含有被鉴定突变的S1启动子,将其DNA片段各端的Mlu I和Not I位点亚克隆至pAC3骨架。所得到的具有优化S1启动子的载体被命名为pAC3.mtS1-yCD2。
如前所述,通过瞬时转染293T细胞制备感染性pAC3.mtS1-yCD2载体。用pAC3.mtS1-yCD2载体以0.1的MOI感染初始U87细胞。在感染后第7天,收获细胞并裂解以获得细胞裂解物。确定细胞裂解物的蛋白浓度以使得在免疫印迹中如由GAPDH所示的等量蛋白上样。数据表明,用pAC3.mtS1-yCD2载体感染的U87细胞的细胞提取物的CD表达与由IRES驱动的pAC3-yCD2载体的CD表达相当。
为了使CD表达与5-FC敏感性相关,将无载体的U87细胞,具有pAC3-yCD2载体和pAC3.mtS1-yCD2载体的U87细胞分别以每孔1e3细胞接种于96-孔板。它们在用不同浓度的5-FC处理后进行为期八天的监测,其中在接种后第一天首次加入5-FC,然后每两天用加有5-FC的全培养基补充。通过MTS测定每两天评估细胞活力。该数据表明,用pAC3.mtS1-yCD2载体感染的U87细胞的IC50值与用pAC3-yCD2载体感染的那些细胞(0.5ug/mL;Perez et al.,2012)相当。可使用这些技术优化其它启动子配置的基因表达。
实施例11:核心启动子下游整合Kozak序列增加yCD2基因表达而不改变载体稳定性
大多数真核生物的mRNA含有促进蛋白翻译起始的Kozak序列。核心启动子的下游整合Kozak序列增加yCD2在瞬时转染和完全感染的细胞中的表达。优化的酵母CD基因yCD2在编码区的前15个氨基酸内具有3个框中的ATG。5'UTR上的间距和yCD2mRNA的起始密码子侧翼缺乏Kozak序列被认为对于高效的蛋白翻译起始是不够理想的。整合Kozak序列和/或其他翻译增强子元件可大大提高翻译起始,从而生产转基因的蛋白。
pAC3.S1-yCD2载体含有的核心启动子不含Kozak序列。虽然核心启动子已经被证明对转录有用,高效的蛋白翻译对基因表达同样重要。对于改进的核心启动子或其他改进的小型启动子,这种改进可以与本说明书中的其他相结合。
pAC3-kozakS1.yCD2(即为pAC3.S1K-yCD2)和pAC3.kozakS2-yCD2(即为pAC3.S2K-yCD2)源自pAC3-yCD2的骨架。该pAC3骨架由核酸内切酶消化pAC3-yCD2质粒DNA的Mlu I和Not I分离。kozakS1yCD2和kozakS2yCd2的DNA序列用存在于该DNA片段各端的Mlu I和Not I限制性酶位点合成,随后克隆至pAC3骨架的相应位点。
如前所述,通过瞬时转染293T细胞制备感染性载体。以0.1的MOI载体感染初始U87细胞。在感染后第7天,将细胞收获并裂解以获得细胞裂解物。确定细胞裂解物的蛋白浓度以使得在免疫印迹中如GAPDH所示的等量蛋白上样。图4B显示了用pAC3.S1K-yCD2载体瞬时转染的293T的细胞提取物的CD表达比pAC3.S1-yCD2载体更高大约2-5倍。同样地,瞬时转染的293T细胞中,pAC3.S2K-yCD2的CD表达比pAC3-S2-yCD2载体更高大约2-5倍。此外,在瞬时转染的293T细胞中,pAC3-S1K-yCD2和pAC3-S2K-yCD2之间的CD表达相当。相反地,图4C示出用四个载体中的任何一个最大感染的U87细胞都检测不到CD表达。
数据表明,用pAC3-kozakS1.yC2载体感染的U87细胞的细胞提取物的CD表达比pAC3-S1.yCD2载体更高大约2-5倍。
为了使CD表达与5-FC敏感性相关,将无载体的U87细胞,具有pAC3-yCD2载体和pAC3-kozakS1.yCD2载体的U87细胞分别以每孔1E3细胞接种于96孔板。它们在用不同浓度的5-FC处理后进行为期八天的监测,其中在接种后第一天首次加入5-FC,然后每两天用加有5-FC的全培养基补充。通过MTS测定每两天评估细胞活力。该数据表明,用pAC3-kozakS1.yCD2载体感染的U87细胞的IC50值比用pAC3-S1.yCD2载体感染的那些细胞更高大约5倍,且在pAC3-yCD2载体的10倍以内(0.5ug/mL;Perez et al.,2012)。
对于载体稳定性,在感染前一天,将初始U87细胞以每孔2E5细胞接种于6孔板。在4μg/mL的聚凝胺存在下,根据计算滴度(TU/mL)以0.1的MOI进行感染的第一个周期。在随后的感染,将受感染细胞产生的病毒上清液的十分之一用于感染初始细胞。在每个感染周期中,在感染后d4,将受感染细胞于6孔板中传代。在感染后d7,收集受感染细胞的病毒上清液用于后续感染,收获细胞用于基因组提取,并通过IRES-PCR评估载体稳定性。用于PCR的引物是:IRES-F:5'-CTGATCTTACTCTTTGGACCTTG-3'(SEQ ID NO:54)和IRES-R:5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3'(SEQ ID NO:55)。数据表明,pAC3.kozakS1-yCD2载体的稳定性与pAC3-yCD2和pAC3.S1-yCD2载体相当。
实施例12:含有驱动yCD2-UPRT的优化S1核心启动子的基于pAC3载体的构建和配置
yCD2-UPRT为~1.2kB。该mtS1启动子=优化的S1启动子(参见实施例11)。pAC3-mtS1.yCD2-UPRT载体源自pAC3-yCD2的骨架。pAC3骨架由核酸内切酶消化pAC3-yCD2质粒DNA的Mlu I和Not I分离。mtS1.yCD2-UPRT的DNA序列用存在于该DNA片段各端的Mlu I和Not I限制酶位点合成,随后克隆至pAC3骨架的相应位点。
实施例13:含有驱动yCD2-UPRT表达的优化S1核心启动子的基于pAC3的载体的载体稳定性和转基因表达
使用如上所述的技术来构建具有驱动yCD2-UPRT表达的优化核心启动子的基于pAC3的载体,并与pAC3-yCD2-U(又名T50003,Perezet al.,Mol.Ther.,2012,WO2010045002)相比较,所述pAC3-yCD2-U是使用内部IRES驱动yCD2-UPRT融合基因表达的等效载体。
通过瞬时转染293T细胞制备感染性pAC3-mtS1.yCD2-UPRT载体。pAC3kozakS1.yCD2载体以0.1的MOI感染初始U87细胞。在感染后第7天,收获细胞并裂解以获得细胞裂解物。确定细胞裂解物的蛋白浓度以使得在免疫印迹中如由GAPDH所示的等量蛋白上样。数据表明,用pAC3-mtS1.yCD2-UPRT载体感染的U87细胞的细胞提取物的CD-UPRT表达(~44KDa)与pAC3-yCD2-U和pAC3-yCD2载体相当。
为了使CD表达与5-FC敏感性相关,将无载体的U87细胞,具有pAC3-yCD2、pAC3-yCD2-U和pAC3-mtS1.yCD2-UPRT载体的U87细胞分别以每孔1E3细胞接种于96孔板。它们在用不同浓度的5-FC处理后进行为期八天的监测,其中在接种后第一天首次加入5-FC,然后每两天用加有5-FC的全培养基补充。通过MTS测定每两天评估细胞活力。该数据表明,用pAC3-mtS1.yCD2-UPRT载体感染的U87细胞的IC50值至少等同于用pAC3-yCD2和pAC3-yCD2-U载体感染的那些细胞。
对于载体稳定性,在感染前一天,将初始U87细胞以每孔2E5细胞接种于6孔板。在4μg/mL的聚凝胺存在下,根据计算滴度(TU/mL)以0.1的MOI进行感染的第一个周期。在随后的感染中,将受感染细胞产生的病毒上清液的十分之一用于感染初始细胞。在每个感染周期中,在感染后d4,将受感染细胞于6孔板中传代。在感染后d7,收集受感染细胞的病毒上清液用于后续感染,收获细胞用于基因组提取并通过IRES-PCR评估载体稳定性。用于PCR的引物是:IRES-F:5'-CTGATCTTACTCTTTGGACCTTG-3'(SEQ ID NO:56)和IRES-R:5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3'(SEQ ID NO:57)。数据表明,pAC3-S1.yCD2-UPRT载体稳定性显著优于IRES驱动的pAC3-yCD2-U载体。
实施例14:含有驱动yCD2表达和驱动抗TGFb2的shRNA的人U6(Pol III)启动子的优化S1核心启动子的基于pAC3的载体的构建和配置
pAC3-S1.yCD2-polIII启动子-shRNATGFb2载体源自pAC3-yCD2的骨架。该pAC3骨架由核酸内切酶消化pAC3-yCD2质粒DNA的Mlu I和Not I分离。mtS1.yCD2和polIII启动子-shRNATGFb2的DNA序列用该DNA片段各端的Mlu I和Not I限制性酶位点合成,随后克隆至pAC3骨架的相应位点。
实施例15:含有驱动yCD2表达和人U6(Pol III)启动子驱动抗TGFb2的shRNA表达的优化S1核心启动子的基于pAC3的载体的载体稳定性和转基因表达
如前所述,通过瞬时转染293T细胞制备感染性pAC3-S1.yCD2-polIII启动子-shRNATGFb2载体。用pAC3-kozakS1.yCD2载体以0.1的MOI感染初始U87细胞。在感染后第7天,收获一部分细胞并裂解以获得细胞裂解物,并收获了一部分细胞用于总RNA提取。确定细胞裂解物的蛋白浓度以使得在免疫印迹中如由GAPDH所示的等量蛋白上样。数据表明,用pAC3-S1.yCD2-polIII启动子-shRNATGFb2载体感染的U87细胞的细胞提取物的yCD2表达与pAC3-yCD2和pAC3-mtS1.yCD2载体的yCD2表达相当。
为了使CD表达与5-FC敏感性相关,将无载体的U87细胞,具有pAC3-yCD2、pAC3-mtS1.yCD2和pAC3-S1.yCD2-polIII启动子-shRNATGFb2载体的U87细胞分别以每孔1E3细胞接种于在96孔板。它们在用不同浓度的5-FC处理后进行为期八天的监测,其中在接种后第一天首次加入5-FC,然后每两天用加有5-FC的培养基补充。通过MTS测定每两天评估细胞活力。该数据表明,用pAC3-S1.yCD2-polIII启动子-shRNATGFb2载体感染的U87细胞的IC50值与用pAC3-yCD2和pAC3-mtS1.yCD2载体感染的那些细胞相当。
为了证明在用pAC3-S1.yCD2-polIII启动子-shRNATGFb2载体感染的U87细胞中TGFb2被有效敲除,如上所述,在感染后d7,从收获的细胞中提取总RNA。为了标准化,使用RNA polIII启动子作为内参,通过qRT-PCR测量TGFb2的基因表达。使用ΔΔC(t)法计算TGFb2相对于初始U87细胞的表达水平。数据显示,在感染后d7,TGFb2下调超过70%。培养受感染细胞至30天,并观测TFGb2的持续敲除。
对于载体稳定性,在感染前一天,将初始U87细胞以每孔2E5细胞接种于6孔板。在4μg/mL的聚凝胺存在下,根据计算滴度(TU/mL)以0.1的MOI进行感染的第一个周期。在随后的感染中,将受感染细胞产生的病毒上清液的十分之一用于感染初始细胞。在每个感染周期中,在感染后d4,将受感染细胞于6孔板中传代。在感染后d7,收集受感染细胞的病毒上清液用于后续感染,收获细胞用于基因组提取并通过IRES-PCR评估载体稳定性。用于PCR的引物是:IRES-F:5'-CTGATCTTACTCTTTGGACCTTG-3'(SEQ ID NO:54)和IRES-R:5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3'(SEQ ID NO:55)。数据表明,pAC3-mtS1.yCD2-polIII启动子-shRNATGFb2载体的稳定性与pAC3-yCD2和pAC3-mtS1.yCD2载体相当。
实施例16:含有驱动yCD2表达的优化S1核心启动子和驱动tko的优化S1核心启动子的基于pAC3的载体的构建和配置。
优化胸苷激酶tko由于其较高的载体稳定性被用于本实施例中。该pAC3-mtS1.yCD2-mtS1.tko载体源自PAC3-yCD2的骨架。该pAC3骨架由核酸内切酶消化pAC3-yCD2质粒DNA的Mlu I和Not I分离,用存在于该DNA各端的Mlu I和Not I限制酶合成mtS1.yCD2-mtS1.tko的DNA序列,随后克隆至pAC3骨架的相应位点。
实施例17:含有驱动yCD2表达的优化S1核心启动子和驱动tko的优化S1核心启动子的基于pAC3的载体的载体稳定性和转基因表达
如前所述,通过瞬时转染293T细胞制备感染性pAC3-mtS1.yCD2-mtS1.tko载体。用pAC3-kozakS1.yCD2载体以0.1的MOI感染初始U87细胞。在感染后第7天,收获细胞并裂解以获得细胞裂解物。确定细胞裂解物的蛋白浓度以使得在免疫印迹如由GAPDH所示的等量蛋白上样。数据表明,用pAC3-mtS1.yCD2-mtS1.tko载体感染的U87细胞的细胞提取物的yCD2和TK表达与由IRES介导的pAC3-yCD2和pAC3-tko载体的那些细胞的表达相当。
为了使CD表达与5-FC敏感性相关,将无载体的U87细胞,具有pAC3-yCD2和PAC3-mtS1.yCD2-mtS1.tko载体的U87细胞分别以每孔1E3细胞接种于96孔板。它们用不同浓度的5-FC处理后进行为期八天的监测,在接种后第一天首次加入5-FC,然后每两天用加有5-FC的培养基补充。通过MTS测定每两天评估细胞活力。该数据表明,用PAC3-mtS1.yCD2-mtS1.tko载体感染的U87细胞的IC50值与用pAC3-yCD2载体感染的那些细胞相当。
为了使tko表达与更昔洛韦(ganciclovir)的敏感性相关,将无载体的U87细胞,具有pAC3-yCD2和PAC3-mtS1.yCD2-mtS1.tko载体的U87细胞分别以每孔1E3细胞接种于96孔板。它们在用不同浓度的更昔洛韦处理后进行为期八天的监测,在接种后第一天首次加入更昔洛韦,然后每两天用加有更昔洛韦的培养基补充。通过MTS测定每两天评估细胞活力。该数据表明,用PAC3-mtS1.yCD2-mtS1.tko载体感染的U87细胞的IC50值与用pAC3-tko载体感染的那些细胞相当。
对于载体稳定性,在感染前一天,将初始U87细胞以每孔2E5细胞接种于6孔板。在4μg/mL的聚凝胺存在下,根据计算滴度(TU/mL)以0.1的MOI进行感染的第一个周期。在随后的感染中,将受感染细胞产生的病毒上清液的十分之一用于感染初始细胞。在每个感染周期中,在感染后d4,将受感染细胞于6孔板中传代。在感染后d7,收集受感染细胞的病毒上清液用于后续感染,收获细胞用于基因组提取并通过IRES-PCR评估载体稳定性。用于PCR的引物是:IRES-F:5'-CTGATCTTACTCTTTGGACCTTG-3'(SEQ ID NO:54)和IRES-R:5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3'(SEQ ID NO:55)。数据表明,pAC3-mtS1.yCD2-mtS1.tko载体的稳定性与pAC3-yCD2载体相当,并且远远优于pAC3-tko载体。
实施例18:含有驱动yCD2基因表达的具有人血红素加氧酶基因核心启动子,选定增强子区段和Kozak序列的杂合启动子的基于pAC3的载体pAC3-HOE1.yCD2,pAC3-HOE2.yCD等的构建,配置和测试
载体中的pAC3骨架由核酸内切酶消化pAC3-yCD2质粒DNA的Mlu I和Not I来分离。
表2中列出了编码元件的六个双链合成DNA片段,并且使用包含Mlu1识别位点(ACGCGT)的双链合成DNA片段。表2中的每个片段也具有为了彼此连接的5'突出5-GATC-3,如Mlu1位点一样。各个片段通过加热到90℃并缓慢冷却进行退火,在5'端用T4多核苷酸激酶反应磷酸化,然后以等摩尔量与1/10和1/100摩尔激酶化的Mlu1位点混合并连接。用Mlu1消化连接混合物,其产物在凝胶上电泳,将40-200bp部分从凝胶切出并纯化。
对应于与Kozak起始位点和yCD2基因融合的人血红素加氧酶1基因核心启动子序列在3'端Not1和5'端Mlu1位点合成,并用两种酶消化。
合成的片段是:
5’-
ACGCGTGGGGCGGGCTGGGCGCGGGCCCCTGCGGGTGTTGCAACGCCCGGCCAGAAAGTGGGCATCAGCTGTTCCGCCTGGCCCACGTGACCCGCCGAGCATAAATGTGACCGGCCGCGGCTCCGGCAGTCAACGCCACC GTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTTACGAGGAGGCCCTGCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAACAAGGACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTCCGCCACCCTGCACGGCGAGATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTACAAGGACACCACCCTGTACACCACCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATGTACGGCATCCCTAGGTGTGTGATCGGCGAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAGTACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTGGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAGAAGCTGATGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGGATATCGGCGAGTG AGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO:56);
其中大C是转录起始位点,第一个划线序列是包括yCD2基因的ATG起始密码子(斜体)的Kozak序列,并且第二个下划线序列是yCD2的终止密码子。该片段是625个核苷酸,具有转录起始位点上游的126bp片段,其为血红素加氧酶启动子。在携带转录因子结合位点混合物的过量Mlu1片段存在下,将该片段连接到如上分离的pAC3Mlu1-Not骨架片段上,并且通过细菌转染分离单个的克隆,之后分析DNA小量制备的限制性消化,以鉴定具有pAC3骨架的血红素加氧酶启动子和CD的质粒,并且结合位点混合物的单个拷贝低于约200bp。
将携带所需序列的质粒随后通过瞬时感染用于制备感染性载体,感染U87细胞并通过蛋白印迹检测CD蛋白。鉴定并测序表达CD蛋白与pAC3-yCD2等量或以上的载体,以表征转录因子结合位点混合物。将鉴定的小至40bp的合适结合位点混合物与其他基因一起用于制备载体。如前所述,通过连续传代测试载体的稳定性。
可选择地,将转录因子结合位点,核心启动子-CD和pAC3骨架的连接混合物用于PALA选择法在诸如U87的靶细胞中筛选高水平表达CD蛋白的载体。
实施例19:含有驱动yCD2基因表达的具有疱疹病毒1胸苷激酶基因启动子,选定增强子区段和Kozak序列的杂合启动子的基于pAC3的载体pAC3-cTK.yCD2的构建,配置和测试
已知疱疹胸苷激酶基因序列在正常mRNA编码序列的第一和第三ATG之间具有隐藏的核心启动子(Al-shawi et al.Mol.Cell.Biol.11:42071991,Salamon et al Mol.Cell.Biol.15:53221995)。这180bp序列:
ATGGCTTCGTACCCCTGCCATCAACACGCGTCTGCGTTCGACCAGGCTGCGCGTTCTCGCGGCCATAGCAACCGACGTACGGCGTTGCGCCCTCGCCGGCAGCAAGAAGCCACGGAAGTCCGCCTGGAGCAGAAAATGCCCACGCTACTGCGGGTTTATATAGACGGTCCTCACGGGATG(SEQ ID NO:57)
与诸如实施例18中分离的那些混合物的两个增强子或在此情况下与来自SV40的72bp增强子重复共同合成(Gruss et al PNAS 78:943-9471981,NCBI参考序列:NC_001669.1),其单个副本是:
5'-
TGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTT CCACACC-3'(SEQ ID NO:58),位于TK隐藏启动子上游,并且具有yCD2序列下游,起始于该隐藏启动子3'端的ATG起始密码子。总的合成序列在5'端和3'端分别具有MLu1和Not1位点,并且插入如实施例18中分离的pAC3MLu1-Not1骨架片段。将连接混合物用于转染细菌,分离期望的分子克隆,并通过如实施例所述的蛋白印迹法检测稳定性和CD蛋白。CD表达水平至少与pAC3-yCD2中一样好。
实施例20:含有SV40启动子,RSV启动子,具有选定增强子区段的合成启动子的基于pAC3的载体的构建,配置和转基因表达的测试
载体中的pAC3骨架由核酸内切酶消化pAC3-yCD2质粒DNA的Mlu I和Not I位点,或由核酸内切酶消化pAC3-Gluc质粒DNA的MluI和Psi I位点来分离。
逆转录病毒复制型载体pAC3-SV40-GFP-R,pAC3-SV40-Gluc,pAC3-RSV-Gluc和pAC3.ES1-Gluc源自pAC3-yCD2的骨架。pAC3骨架由核酸内切酶消化pAC3-yCD2质粒DNA的Mlu I和Not I分离。用在DNA片段各端的Mlu I和Psi I通过聚合酶链反应(PCR)合成或扩增SV40-GFP-R的DNA序列,用于亚克隆至pAC3-Gluc骨架,以替换在相应限制性位点上的IRES序列。
在pAC3-SV40-GFP-R构建体上,将SV40-GFP盒以与3'UTR相反的方向放置,以使启动子对前病毒DNA配置的干扰最小。
如前所述,通过瞬时转染293T细胞制备pAC3-SV40-GFP-R病毒。用这些载体以0.01的MOI感染初始U87细胞。在感染后第13天,收获并通过流式细胞术由门控的GFP阳性细胞分析细胞,测定GFP阳性群体的平均荧光强度。图7显示pAC3-SV40-GFP-R的GFP表达水平高于pAC3-S1-GFP,但仍显著低于通过IRES介导的pAC3-GFP的表达水平。
如前所述,通过瞬时转染293T细胞制备pAC3-Gluc,pAC3-SV40-Gluc,pAC3-RSV-Gluc和pAC3.ES1-Gluc病毒。用这些载体以0.01的MOI感染初始U87细胞。收集每代细胞的上清液(感染后第3天,第6天以及第9天)。在每次细胞传代时,将相同数量的细胞接种并培养于等体积的培养基中。制备1:5连续稀释的各时间点每个样品上清液,以测量在底物肠腔素以15uM终浓度存在时的发光强度。数据表明,用SV40,RSV和ES1启动子介导的Gluc表达水平少于由IRES介导的水平2-3倍。
实施例21:含有RSV启动子,SV40启动子,S1核心启动子,EC1合成子和ES1合成启动的基于pAC3的载体的构建,配置和转基因表达测试
如前所述,载体中的pAC3骨架由核酸内切酶消化pAC3-yCD2质粒DNA的Mlu I和Not I位点,或由核酸内切酶消化pAC3-Gluc质粒DNA的Mlu I和Psi I位点来分离。
逆转录病毒复制型载体pAC3-SV40-GFP-R,pAC3-SV40-Gluc,pAC3-RSV-Gluc和pAC3.ES1-Gluc源自pAC3-yCD2的骨架。该pAC3骨架由核酸内切酶消化pAC3-yCD2质粒DNA的Mlu I和Not I来分离。在DNA片段各端的Mlu I和Psi I通过聚合酶链反应(PCR)分别合成或扩增SV40-GFP-R、SV40-Gluc、RSV-Gluc和ES1-Gluc的DNA序列,用于亚克隆至pAC3-Gluc骨架,以替换相应限制性位点的IRES序列。在pAC3-SV40-GFP-R构建体中,将SV40-GFP盒以与3'UTR相反的方向放置,以使启动子对前病毒DNA配置的干扰最小。
将具有Mlu I和Psi I位点的SV40-Gluc,RSV-Gluc和EC1-Gluc,S1-Gluc和ES1-Gluc盒以与LTR相同的方向放置。RVS启动子长度为271nts;SV40启动子长度为324nts。合成S1核心启动子长度为80nts。由CRE的串联重复(Schlabach et al.,2010PNAS)和C 1核心启动子(Juven-Gershon et al.,2006Nature Methods)组成的杂合启动子EC1的长度为181nts。CRE的串联重复和S1核心启动子(Juven-Gershon et al.,2006Nature Methods)的杂交体ES1的长度为188nts。
在瞬时转染的293T和Hela细胞中评估了pAC3-Gluc,pAC3-RSV-Gluc,pAC3-SV40-Gluc,pAC3-EC1-Gluc,pAC3-S1-Gluc和pAC3-ES1-Gluc的Gluc表达。在感染后48小时,收集上清液,通过与15uM终浓度的肠腔素共孵育1:3或1:4连续稀释的上清液来测定Gluc表达水平。
数据示于图9中。在293T细胞中,由RSV介导的Gluc表达水平高于由IRES介导的Gluc表达大约3倍。由SV40,EC1启动子介导的Gluc表达水平与IRES介导的表达相当。如所预期的,S1核心启动子介导的Gluc表达少于IRES介导的表达3倍。对ES1而言,启动子活性小于IRES和EC1约1/3,但高于单独的S12倍。
在HeLa细胞中,由RSV,SV40和ES1介导的Gluc表达水平低于IRES介导的Gluc表达水平大约2.5倍。RSV结果与见于293T细胞中的结果(比高于IRES3倍)的差异如所预期的,虽然已知RSV LTR启动子是普遍表达的,但异常地,在Hela细胞中,它被在大多数其它细胞类型中不存在的21kD抑制蛋白特异性抑制。由单独的S1核心启动子介导的Gluc表达水平小于由IRES介导的表达约10倍。然而,合成增强子(ES1)的整合提高启动子活性4倍。通过EC1介导的Gluc表达水平略高于由IRES介导的表达(图9)。
通过瞬时感染293T细胞制备pAC3-Gluc,pAC3-CMV-Gluc,pAC3-RSV-Gluc和pAC3-SV40-Gluc病毒。这些载体以0.01的MOI感染初始U87细胞。收集每次细胞传代的上清液(感染后第3天,第6天以及第9天)。在每次细胞传代中,将相同数量的细胞接种并在相同体积的培养基中培养。制备各时间点的每个样品的上清液的1:3连续稀释,以测量15uM终浓度的腔肠素底物存在下的荧光强度。数据显示,由RSV,SV40,EC1和ES1启动子介导的Gluc的表达水平与由IRES介导的表达水平相当。
已描述了本公开的大量实施方案。然而,将理解的是,不脱离本公开的精神和范围可进行各种修改。因此,其他实施方案在以下权利要求的范围之内。
Claims (52)
1.具有复制能力的重组γ逆转录病毒,其包含:
逆转录病毒GAG蛋白;
逆转录病毒POL蛋白;
逆转录病毒包膜;
逆转录病毒多核苷酸,其包含位于所述逆转录病毒多核苷酸序列3'端的长末端重复(LTR)序列、位于所述逆转录病毒多核苷酸5'端的启动子序列、gag核酸结构域、pol核酸结构域和env核酸结构域,所述启动子适于在哺乳动物细胞中表达;
治疗盒,其包含具有可操作地连接至异源多核苷酸的小型启动子的至少一个小型启动子盒,其中所述治疗盒位于3'LTR的5'端和编码所述逆转录病毒包膜的env核酸结构域的3'端,并且其中当仅有一个小型启动子盒存在时,所述异源多核苷酸的长度为1.2kb至2.0kb;以及
在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列。
2.重组复制型逆转录病毒载体,其包含:
逆转录病毒GAG蛋白;
逆转录病毒POL蛋白;
逆转录病毒包膜;
逆转录病毒多核苷酸,其包含位于所述逆转录病毒多核苷酸序列3'端的长末端重复(LTR)序列、位于所述逆转录病毒多核苷酸5'端的启动子序列、gag核酸结构域、pol核酸结构域和env核酸结构域,所述启动子适于在哺乳动物细胞中表达;
治疗盒,其包含含有可操作地连接至异源多核苷酸的小型启动子的小型启动子盒,其中所述小型启动子盒位于3'LTR的5'端和编码所述逆转录病毒包膜的env核酸结构域的3'端,其中所述小型启动子缺少SCP1,Ad或CMV核心启动子;以及
在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列。
3.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述逆转录病毒多核苷酸序列源自选自以下的病毒:鼠白血病病毒(MLV),莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV),猫白血病病毒(FeLV),狒狒内源性逆转录病毒(BEV),猪内源性病毒(PERV),源自猫的逆转录病毒RD114,松鼠猴逆转录病毒,禽网状内皮组织增殖病病毒(REV),或长臂猿白血病病毒(GALV)。
4.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述逆转录病毒包膜为兼嗜性MLV包膜。
5.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述靶细胞为具有细胞增殖性病症的细胞。
6.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述靶细胞为赘生性细胞。
7.如权利要求5所述的逆转录病毒,其中所述细胞增殖性病症选自:肺癌,结肠-直肠癌,乳腺癌,前列腺癌,尿道癌,子宫癌,脑癌,头颈癌,胰腺癌,黑素瘤,胃癌和卵巢癌,淋巴瘤,白血病,类风湿性关节炎或其它自身免疫性疾病。
8.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述启动子序列与生长调控基因相关。
9.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述启动子序列包含组织特异性启动子序列。
10.如权利要求9所述的逆转录病毒,其中所述组织特异性启动子序列包含至少一个雄激素应答元件(ARE)。
11.如权利要求9所述的逆转录病毒,其中所述组织特异性启动子序列包含至少一个糖皮质激素应答元件。
12.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述启动子包含CMV-R-U5结构域多核苷酸。
13.如权利要求12所述的逆转录病毒,其中所述CMV-R-U5结构域包含连接至MLV R-U5区的来自人巨细胞病毒的立即早期启动子。
14.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述gag多核苷酸源自γ逆转录病毒。
15.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述pol多核苷酸结构域源自γ逆转录病毒。
16.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述小型启动子是核心启动子。
17.如权利要求1,2或16所述的逆转录病毒,其中所述小型启动子是优化的核心启动子。
18.前述权利要求中任一项所述的逆转录病毒,其中所述治疗盒包含(a)至少两个小型启动子盒,(b)至少一个小型启动子盒和polIII启动子盒,或(c)至少一个小型启动子盒和IRES盒。
19.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述小型启动子长度为约70-500bp。
20.如权利要求1,2或19所述的逆转录病毒,其中所述小型启动子包含核心启动子,并且还包含增强子元件。
21.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述小型启动子包含TATA盒和起始子位点,基序十元件(MTE),下游启动子元件(DPE)和至少一种选自以下的附加元件:(a)TFIIB识别元件,上游(BREu);(b)TFIIB识别元件,下游(BREd);(c)HBV X核心启动子元件1(XCPE1);(d)HBV X核心启动子元件2(XCPE2);(d)下游核心元件位点I(CDE SI);(e)下游核心元件位点II(CDE SII);以及(f)下游核心元件位点III(CDE SIII)。
22.如权利要求21所述的逆转录病毒,其中所述小型启动子还包含增强元件。
23.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述异源核酸包含具有如SEQ ID NO:3,5,11,13,15或17所示序列的多核苷酸。
24.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述异源核酸编码包含如SEQ ID NO:4所示序列的多肽。
25.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述异源核酸为人密码子优化的,并且编码如SEQ ID NO:4所示的多肽。
26.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述3'LTR源自γ逆转录病毒。
27.如权利要求26所述的逆转录病毒,其中所述3'LTR包含U3-R-U5结构域。
28.如权利要求1所述的逆转录病毒,其中所述异源核酸序列编码生物应答调节剂或免疫增强细胞因子。
29.如权利要求28所述的逆转录病毒,其中所述免疫增强细胞因子选自:白细胞介素1至15,干扰素,肿瘤坏死因子(TNF),以及粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)。
30.如权利要求28所述的逆转录病毒,其中所述免疫增强细胞因子为干扰素γ。
31.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述异源核酸编码将无毒性前药转化为毒性药物的多肽。
32.如权利要求31所述的逆转录病毒,其中所述将无毒性前药转化为毒性药物的多肽是胸苷激酶,嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)或胞嘧啶脱氨酶。
33.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述异源核酸序列编码受体结构域,抗体或抗体片段。
34.如权利要求1或2所述的逆转录病毒,其中所述异源核酸序列包括抑制性多核苷酸。
35.如权利要求34所述的逆转录病毒,其中所述抑制性多核苷酸包括miRNA,RNAi或siRNA序列。
36.如权利要求35所述的逆转录病毒,其中所述治疗盒包含可操作地连接至异源核酸的小型启动子和可操作地连接至所述miRNA、RNAi或siRNA编码结构域的polIII启动子。
37.用于产生权利要求1或2所述逆转录病毒的重组逆转录病毒多核苷酸基因组。
38.将治疗分子递送至受试者的方法,其包括使受试者与前述权利要求中任一项所述的逆转录病毒接触。
39.治疗细胞增殖性病症的方法,其包括在使胞嘧啶脱氨酶多核苷酸表达的条件下使受试者与权利要求23所述的逆转录病毒接触,以及使受试者与5-氟胞嘧啶接触。
40.如权利要求39所述的方法,其中所述细胞增殖性病症是多形性胶质母细胞瘤。
41.如权利要求39所述的方法,其中所述细胞增殖性病症选自:肺癌,结肠-直肠癌,乳腺癌,前列腺癌,尿道癌,子宫癌,脑癌,头颈癌,胰腺癌,黑素瘤,胃癌和卵巢癌。
42.治疗受试者细胞增殖性病症的方法,其包括使受试者与权利要求1所述的逆转录病毒接触,其中所述异源核酸序列编码抑制赘生性细胞增殖的治疗性蛋白。
43.如权利要求42所述的方法,其中所述治疗性蛋白包含将非细胞毒性药物转化为细胞毒性药物的多肽。
44.如权利要求43所述的方法,其中所述多肽具有胞嘧啶脱氨酶活性。
45.如权利要求44所述的方法,其中所述多肽包含如SEQ ID NO:4,12,14,16或18所示的序列。
46.如权利要求43所述的方法,其中所述非细胞毒性药物为5-氟胞嘧啶。
47.治疗细胞增殖性病症的方法,其包括在使逆转录病毒感染患病细胞的条件下,将权利要求1或2所述的逆转录病毒给予患有细胞增殖性病症的受试者,以及使受试者与抗癌剂或化疗剂接触。
48.如权利要求47所述的方法,其中所述抗癌剂选自:贝伐单抗(bevacizumab),哌加他尼(pegaptanib),雷珠单抗(ranibizumab),索拉非尼(sorafenib),舒尼替尼(sunitinib),AE-941,VEGF Trap,帕唑帕尼(pazopanib),凡德他尼(vandetanib),瓦他拉尼(vatalanib),西地尼布(cediranib),芬维A胺(fenretinide),角鲨胺(squalamine),INGN-241,口服四硫钼酸盐,四硫钼酸盐,Panzem NCD,2-甲氧雌二醇,AEE-788,AG-013958,bevasiranib钠,AMG-706,阿西替尼(axitinib),BIBF-1120,CDP-791,CP-547632,PI-88,SU-14813,SU-6668,XL-647,XL-999,IMC-1121B,ABT-869,BAY-57-9352,BAY-73-4506,BMS-582664,CEP-7055,CHIR-265,CT-322,CX-3542,E-7080,ENMD-1198,OSI-930,PTC-299,Sirna-027,TKI-258,Veglin,XL-184,或ZK-304709。
49.如权利要求47所述的方法,其中所述逆转录病毒按约103至107TU/g脑重量给予。
50.如权利要求49所述的方法,其中所述逆转录病毒按约104至106TU/g脑重量给予。
51.重组逆转录病毒复制型载体(RRV),其包含:
逆转录病毒GAG蛋白;
逆转录病毒POL蛋白;
逆转录病毒包膜;
逆转录病毒多核苷酸,其包含位于所述逆转录病毒多核苷酸序列3'端的长末端重复(LTR)序列、位于所述逆转录病毒多核苷酸5'端的启动子序列、gag核酸结构域、pol核酸结构域和env核酸结构域,所述启动子适于在哺乳动物细胞中表达;
治疗盒,其包含可操作地连接至异源多核苷酸的小型启动子盒,包含连接至miRNA的初级前体miRNA(pri-miRNA)或siRNA序列的POLIII PROMOTER启动子的miRNA盒;以及
在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列。
52.如权利要求51所述的RRV,其中所述miRNA选自:miR-142-3p,miR-181,miR-223,miR128-1和miR128-2。
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