JP4992032B2 - レトロウイルスベクター - Google Patents

Description

本発明はレトロウイルスベクターに関し、特に、細胞に対して潜在的に有害である組み換えＲＮＡまたはタンパク質を産生する細胞を作製するための新規の系に関するがそれに限定されない。本発明はまた、それ自身が、目的のヌクレオチド配列（以後「ＮＯＩ」と略する）−または複数のＮＯＩさえも−を目的の部位へ配送する能力があるレトロウイルス粒子を発現することができるレトロウイルスベクターに関する。より具体的には、本発明は遺伝子治療において有用であるベクター、安定な細胞株、および方法に関する。

遺伝子治療は、たとえば、標的細胞といった１つ以上の標的部位における、１つ以上のヌクレオチド配列の付加、置換、欠失、補足、操作、など：のうち任意の１つ以上を含む。標的部位が標的細胞である場合は、その細胞は組織または器官の一部でありうる。遺伝子治療に関する一般的教示は、『分子生物学』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ロバート・マイヤーズ（Ｒｏｂｅｒｔ Ｍｅｙｅｒｓ）編、ＶＣＨ出版社、たとえば５５６〜５５８ページ）に見出すことができる。

別の例として、遺伝子治療はまた、たとえば遺伝子といったヌクレオチド配列を適用して欠陥遺伝子を置換または補足することができる；病因遺伝子または遺伝子産物を除去できる；たとえば、より好ましい表現型を作製するために、新しい遺伝子を加えることができる；細胞を分子レベルで操作して、がん（シュミット−ウルフおよびシュミット−ウルフ（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｌｆ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｌｆ）、１９９４，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ６９；２７３−２７９）または他の症状−たとえば免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、炎症性疾患または感染症を治療することができる；抗原を操作および／または導入して免疫反応を導くことができる−たとえば遺伝子ワクチン接種：のうち任意の１つ以上のための手段を提供する。

近年、レトロウイルスが遺伝子治療における用途に提案されている。本質的に、レトロウイルスは溶菌性ウイルスとは異なる生活環を有するＲＮＡウイルスである。この点では、レトロウイルスが細胞を感染させる時、そのゲノムはＤＮＡ型に変換される。言い換えると、レトロウイルスはＤＮＡ中間体を介して複製する感染体である。レトロウイルス感染などに関するさらなる詳細は後掲する。

上述の通り、レトロウイルスは、特にＮＯＩまたは複数のＮＯＩの１つ以上の目的部位への導入のための配送系（配送媒体または配送ベクターともいう）として提案されている。導入はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはその組み合わせで起こりうる。このような形で用いられる場合、レトロウイルスは典型的にはレトロウイルスベクターまたは組み換えレトロウイルスベクターと呼ばれる。レトロウイルスベクターは、受容体の使用法、逆転写およびＲＮＡパッケージングを含む、レトロウイルス生活環のさまざまな面を研究するのに利用されてきている（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）による総説、１９９２ Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８；１−２４）。

遺伝子治療における使用のための典型的な組み換えレトロウイルスベクターでは、少なくともｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質コード領域の１つ以上の部分をウイルスから除去することができる。これによってレトロウイルスベクターは複製能を欠くようになる。自分のゲノムを宿主ゲノムへ組み込むことができるが、改変されたウイルスゲノムは構造タンパク質を欠くために自身を増殖することができないウイルスを作製するために、除去された部分をＮＯＩで置き換えることさえ可能である。宿主ゲノムに組み込まれた場合、ＮＯＩの発現が起こり、結果としてたとえば治療効果を生じる。このように、ＮＯＩの目的部位への導入は典型的には；ＮＯＩを組み換えウイルスベクターへ組み込むこと；改変されたウイルスベクターをビリオン被覆へパッケージングすること；および標的細胞または標的細胞集団といった目的部位へ導入させることによって達成される。

パッケージングまたはヘルパー細胞株と組み換えベクターの組み合わせを用いることによって、たとえば、目的部位のその後の導入のためのレトロウイルスベクター（たとえば適当な力価のレトロウイルスベクターを調製するため）を増殖および単離することが可能である。

一部の場合には、増殖および単離は、「パッケージング細胞株」を作製するための、レトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の単離と宿主細胞へのそれらの別々の導入を含みうる。パッケージング細胞株は、レトロウイルスＲＮＡをパッケージングするのに必要なタンパク質を産生する。しかし、ＮＯＩおよびｐｓｉ領域を有する組み換えベクターがパッケージング細胞株へ導入される場合、そのヘルパータンパク質はｐｓｉ−陽性組み換えベクターをパッケージングして組み換えウイルスストックを生じることができる。これは一般に「ウイルス産生細胞」として知られる。ベクターは細胞を感染させてＮＯＩを細胞のゲノム中へ導入するために用いることができる。ゲノムがウイルスタンパク質を作るために必要なすべての遺伝子を欠く組み換えウイルスは、１回しか感染することができず、また増殖することはできない。したがって、ＮＯＩは潜在的に有害なレトロウイルスを生じることなく宿主細胞ゲノムへ導入される。入手可能なパッケージング株の概要は『レトロウイルス』（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）（１９９７、コールド・スプリング・ハーパー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ＪＭ・コフィン（Ｃｏｆｆｉｎ）、ＳＭ・ヒューズ（Ｈｕｇｈｅｓ）、ＨＥ・バーマス（Ｖａｒｍｕｓ）編、ｐｐ４４９）に示されている。

レトロウイルスパッケージング細胞株の設計は、初期の設計でしばしば見られた、ヘルパーウイルスの自発産生の問題に対処するように進化してきている。組み換えはホモロジーによって大幅に促進されるため、ベクターとｇａｇ／ｐｏｌとの間のホモロジーを減少または消失させることがヘルパーウイルス産生の問題を減少させている。

より近年には、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖウイルスコード領域とウイルスベクターが、パッケージング細胞株へ独立してトランスフェクションされる別々の発現プラスミド上に存在し、そのため野生型ウイルス産生には３回の組み換え現象が必要であるパッケージング細胞が開発されている。

一過性トランスフェクションを用いてベクターを作製することができる。これに関しては、ベクターまたはレトロウイルスパッケージング成分が細胞に対して毒性である場合に、一過性トランスフェクションが用いられている。レトロウイルスベクターを作製するために典型的に用いられる成分は、Ｇａｇ／Ｐｏｌタンパク質をコードするプラスミド、Ｅｎｖタンパク質をコードするプラスミド、およびＮＯＩを含むプラスミドを含む。ベクター産生は、これらの成分のうち１つ以上の、その他の必要な成分を含む細胞への一過性トランスフェクションを含む。ベクターが毒性遺伝子または、細胞周期の阻害因子といった宿主細胞の複製に干渉する遺伝子、またはアポトーシスを誘導する遺伝子をコードする場合は、安定なベクター産生細胞株を作製するのは難しいことが証明されており、したがって細胞が死ぬ前にベクターを産生するのに一過性トランスフェクションを用いることができる。しかし、前述の技術は、力価レベルが必ずしも十分とは限らないこと、大バッチのウイルスを作製するのが困難であること、および個々の小バッチについて安全性試験を実施しなければならないという意味で問題になりうる。

一部のＨＩＶタンパク質、たとえばＨＩＶプロテアーゼ（６）（安定なＨＩＶ基礎のパッケージング細胞を作製するのを困難にする可能性がある）の毒性の観点から、ＨＩＶベクターは通常はベクターおよびヘルパーウイルスの一過性トランスフェクションによって作製される。一部の研究者は、ＨＩＶのＥｎｖタンパク質を水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のものと交換さえしている。しかし、この手法に伴う不利益は、ＶＳＶ−Ｇタンパク質が細胞に対して非常に毒性が高いことである。

したがって、かつ示した通り、レトロウイルスベクターは生物医学研究においてまた遺伝子治療のために広範囲に用いられている。レトロウイルスベクターの産生のための現行の手法は、野生型レトロウイルスゲノムの二つの役割、すなわちタンパク質コードおよび新しいゲノムコピーのテンプレートとしての役割は、分離することができるという事実を利用する（たとえばセネオカ（Ｓｏｎｅｏｋａ）他１９９５ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３， ６２８およびその参考文献）。新しいウイルス粒子の組立のために、および酵素および調節機能のために必要なタンパク質は、たとえば、哺乳類パッケージング細胞株中の非ゲノム配列によって産生することができる（たとえばミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）１９９０ Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １， ５）。結果として生じるレトロウイルスベクター粒子が感染能力を持つが標的細胞中で複製する能力は無いように、タンパク質コード機能を欠くゲノム配列が提供される。ゲノム配列はまた、治療遺伝子の配送および組み込みのために設計することができる（バイル（Ｖｉｌｅ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ）１９９５ Ｂｒｉｔ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ ５１， １２）。マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）基礎のベクターを産生するための標準的方法は、たとえば、ＭＬＶのｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子（パッケージング成分）を発現する安定に操作された細胞株の使用を含む。これらは適当なプラスミドを用いてトランスフェクションによって導入された適合するレトロウイルスベクターゲノムをパッケージングする。ＨＩＶ基礎のベクターを産生するための代替的方法は、たとえば、適当な細胞へのｇａｇ−ｐｏｌ、ｅｎｖ、およびベクターゲノムプラスミドの同時の一過性トランスフェクションを含む。

これらの系の原理はよく理解されているが、実際には再構成されたウイルス組立系はしばしば、遺伝子治療における用途のために実際に必要なベクター粒子の量を産生することができない。レトロウイルスベクター粒子は一般的に、粒子産生細胞の培養から上清を取ることによって採集される。結果として得られる懸濁液は、物理的方法を用いてベクター粒子に関して濃縮することができるが、しかし凝集または損傷といった問題が生じがちであるため限られた程度までである。したがって、ベクター粒子の懸濁液を最大１００倍まで濃縮することができるだけである。

発現されている宿主細胞に対して潜在的に有害な組み換えタンパク質を産生することを試みる場合、同じ問題が生じる。考えられている１つの手法は、誘導系を用いることである；しかし、これは毒性の基本的問題を克服せず、誘導産生は一過性でしかなく、また「リーキー（ｌｅａｋｙ）」プロモーターから問題が生じている。

１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）を基礎とするベクターは、分裂および非分裂の両方の幅広い細胞型への治療導入遺伝子の配送のための方法を提供する。ＨＩＶ−１を基礎とするベクターは、一過性に²⁰またはベクター産生が誘導されるパッケージング細胞株を用いて^7-9のどちらかで一般に産生されている。大量のＨＩＶ−１Ｇａｇ−Ｐｏｌを安定に発現するのが困難であったため、近年まで、高力価のＨＩＶ−１ベクターを連続的に産生する安定なパッケージング細胞は入手できなかった。さらに、ＨＩＶ−１自身のエンベロープタンパク質および'偽型'ＨＩＶ−１ベクター粒子を置換するのに最も広く用いられている、ラブドウイルスである水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）を連続的に産生するのは困難であることもまた証明されている^20,21,11,12。

本発明は医学分野においてその後有用でありうるウイルス粒子を調製するための改良された系を提供することを目指す。

特に、本発明は、医学分野においてその後有用でありうる組み換えタンパク質および／またはウイルス粒子の連続的供給を調製するための改良された系を提供することを目指す。

本発明はまた、医学分野においてその後有用でありうる高力価の組み換えタンパク質および／またはウイルス粒子を調製するための改良された系を提供することを目指す。

我々は、安定な、構成的パッケージングを開発した。この系は高力価ベクターの大バッチの速やかでまた再現性のある産生を行い、それはたとえば、臨床用途の重要な態様である、大規模な管理試験を可能にする。

本発明の一態様によると、我々は現在、ＨＩＶタンパク質の安定な高レベル発現を結果として生じる細胞株を作製するための方法を見出している。より詳細には、我々は、レトロウイルス感染が安定なＨＩＶＧａｇ−Ｐｏｌ発現を結果として生じうることを見出している。より一般的に、我々は、他のいくらか細胞毒性であるタンパク質を安定に発現するためにレトロウイルス遺伝子配送を用いることができるという概念を見出している。

本発明の一態様によると、目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）を含み、かつＮＯＩを発現することができ、ＮＯＩは細胞に対して潜在的に有害なＲＮＡまたはタンパク質をコードする、レトロウイルスベクター（第一のレトロウイルスベクター）の形の組成物が提供される。

そのレトロウイルスベクターは細胞を感染させることができる。

細胞に対して潜在的に有害な、とは、代謝過程を変えることができるかまたは細胞に対して破壊的な作用を有することができる、すなわち潜在的に細胞毒性であるタンパク質を含む。タンパク質毒性はさまざまなレベルで現れることが可能であり、たとえば一部のタンパク質は細胞増殖を阻害し、一方、別のタンパク質はまた細胞を死滅させる。一部のタンパク質は、たとえば細胞周期の阻害因子またはアポトーシスを誘導するタンパク質のように、宿主細胞の複製に干渉する。我々は、本発明は、細胞に対してある程度の有害作用を示す、すなわち細胞機能を亜致死レベルで阻害するタンパク質の産生に特に有用であることを見出している。あるタンパク質が細胞に対して有害であるかどうかは、構成的プロモーターを用いてそのタンパク質を細胞で発現させ、対照と比較してその細胞に対して何らかの有害作用があるかどうかを判定することによって通常は評価される。

一態様ではＮＯＩは、ＨＩＶプロテアーゼといったＨＩＶタンパク質を発現することができる。

好ましくはＮＯＩは、医学、たとえばがん治療において有用である。

ＮＯＩはレトロウイルスベクター中に転写単位内に存在する。一態様ではＮＯＩは第二のレトロウイルスゲノムの一部を成すことができ、第二のレトロウイルスゲノム自体が第二のＮＯＩを含みうる。この第二のＮＯＩは好ましくは、医学、たとえば遺伝子治療において有用である。この第二のＮＯＩは、細胞に対して有害であってもなくてもよい。

このように、本発明の特別の利点は、本発明が、従来のパッケージング細胞株よりも高い力価で偽型粒子を含むレトロウイルス粒子を産生し、かつそのようなレトロウイルス粒子をより長期間産生するパッケージング細胞株の作製を可能にすることである。この利点は、感染を介して第一のレトロウイルスベクターによって細胞のゲノムに組み込まれうる成分である、レトロウイルス粒子の少なくとも１つの成分の安定な組み込みを介して達成される。この状況では、ＮＯＩは第二のレトロウイルス粒子の少なくとも１つの成分をコードすると見ることができる。

このように、本発明のこの態様によると、第二のレトロウイルス成分を含む第一のレトロウイルスベクターを含み、第一のレトロウイルスベクターは細胞を感染させることができ、かつ第二のレトロウイルス成分は第二のレトロウイルスベクターの少なくとも１つの成分をコードする、レトロウイルス発現系の形の組成物が提供される。

言い換えると、細胞を感染させることができる第一のレトロウイルスベクターを含むレトロウイルス発現系が提供され、かつその第一のレトロウイルスベクターは第二のレトロウイルスベクターの少なくとも１つの成分をコードする、すなわち第二のレトロウイルス成分は第一のレトロウイルスベクター内に組み込まれている。

この系の一実施形態では、第二のレトロウイルス成分のｇａｇ−ｐｏｌといった遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含む第一のレトロウイルス成分を細胞に導入することができる。たとえば第二のレトロウイルス粒子に由来する、ＴａｔおよびＲｅｖといった調節タンパク質を、効率的なベクターゲノム産生のためにＥｎｖおよび第二のレトロウイルス成分のベクターゲノムと共に導入することができ、結果として第二のレトロウイルス粒子の産生が起こる。

「細胞を感染させることができる」とは、第一のレトロウイルス成分がそれ自身を細胞のゲノムへ組み込むことができることを意味する。

細胞は、レトロウイルス粒子の産生のための、パッケージング細胞またはウイルス産生細胞でありうるかまたはそれを形成するのに用いることができる。簡略化のために、我々は第一のレトロウイルスベクターによって感染させられた細胞を「宿主細胞」と呼ぶことがある。

第二のレトロウイルス成分は、レトロウイルスｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子、またはｅｎｖを含みうる。本分野での偏見とは逆に、我々は、たとえばＧａｇ−ＰｏｌおよびＥｎｖの毒性は、レトロウイルスベクターを用いた組み込み後に安定に発現された場合に低下することを見出している。

好ましくは第一のレトロウイルス成分は、第二のレトロウイルス成分とは異なるレトロウイルスから導き出せる。

好ましくは第一のレトロウイルス成分はＭＬＶに由来する。

好ましくは第二のレトロウイルスベクター成分は、ＨＩＶまたはＥＩＡＶ、より好ましくはＨＩＶ、さらにより好ましくはＨＩＶ−１に由来する。

本発明の別の実施形態では下記が提供される；

組み込まれたプロウイルスの形の、本発明に記載のレトロウイルスベクター。

第一のウイルスベクター成分をコードする核酸配列および第二のウイルスベクター成分をコードする核酸配列を含む、本発明のレトロウイルスベクターを産生するための、レトロウイルス産生系。

本発明の産生系によって産生されたレトロウイルスベクター。

本発明のレトロウイルスベクターまたは産生系から得られたレトロウイルス粒子。

ＮＯＩが前記細胞に対して有害であるタンパク質をコードする、そのレトロウイルスベクターに感染した細胞。

医薬における使用のための、本発明のレトロウイルスベクター、レトロウイルス粒子、または細胞。

細胞に対して有害であるタンパク質を産生するための、本発明のレトロウイルスベクター、レトロウイルス粒子、または細胞の使用。

ＮＯＩをそれを必要とする患者へ配送するための薬剤の調製のための、本発明のレトロウイルスベクター、レトロウイルス粒子、または細胞の使用。

細胞を本発明のレトロウイルスベクターまたはレトロウイルス粒子に感染させることを含む、安定な細胞株を作製するための方法。

細胞を本発明のレトロウイルスベクターまたはレトロウイルス粒子に感染させることを含む、細胞に対して有害であるタンパク質を産生する方法。

本発明は、細胞に対して有害でありうる、したがって従来の方法を用いて産生するのが困難であると証明された組み換えタンパク質の発現を可能にする。本発明は、
安定な
長期
高レベル
：である発現を可能にする。

長期とは、少なくとも３ヶ月の期間にわたる発現を含む。高レベルとは、最大約８５０ｎｇ／ｍｌのＨＩＶ−１ ｐ２４分泌および最大１０⁷２９３Ｔ感染単位／ｍｌの組み換えＨＩＶ−１ウイルス力価のレベルを含む。

本発明はこのように、ＨＩＶ−１を基礎とするベクターのようなベクターおよび目的のタンパク質を連続的に産生する細胞株の作成を可能にし、かつ、前臨床および臨床用途のためのこれらの産物の大バッチの、再現性のある作成を可能にする。

何らかの理論によって縛られることを望まない一方、我々は、ＨＩＶ−１ ｇａｇ−ｐｏｌコード領域といったコード領域の、レトロウイルス感染による導入は、レトロウイルス感染後に起こりうるようなタンパク質の安定な高レベル発現を結果として生じると確信する。

本発明のさまざまな好ましい性質および実施形態を、ここで非限定的な実施例によって説明する。

一般的にここで言及される技術は本分野でよく知られているが、特にサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他、『分子クローニング・実験の手引き』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（１９８９）およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他、『分子生物学簡略プロトコル』（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９９９）第４版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ）（および『分子生物学最新プロトコル』（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）の完全版）を参照することができる。

レトロウイルスベクター
本発明のレトロウイルスベクターは、第二のまたは二次ウイルスベクターをコードする一次ウイルスベクターを含むハイブリッドウイルスベクター系の形として見ることができ、第一のまたは一次ベクターは宿主細胞を感染させてその中で二次ウイルスベクターを発現させることができ、二次ベクターは他の標的細胞を形質導入することができる。

したがって、本発明の遺伝子ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで二次ベクターを産生するのに必要な遺伝子をコードする、ｉｎ ｖｉｔｒｏで作製された一次ベクターから成る。使用の際に、二次ベクターは標的細胞への挿入のための１つ以上の選択された遺伝子を有する。その選択された遺伝子は、１つ以上のマーカー遺伝子および／または治療遺伝子であることができる。

一次および二次ウイルスベクターは、さまざまな異なるレトロウイルスベクター、たとえばレンチウイルスベクターであることができ、または複数の一次ウイルスベクターの場合には、異なるウイルス起源のベクターの混合物であることができる。いずれの場合にも、二次ウイルスベクターは好ましくは独立複製ができないような欠陥がある。したがって、二次ウイルスベクターは標的細胞に進入して二次ベクター配列を配送することができるが、複製して他の標的細胞を感染させ続けることはできない。

ハイブリッドウイルスベクター系が、二次ベクターをコードする一次ベクターを１つ以上含む場合、すべての一次ベクターは、通常は同時に、一次標的細胞集団を感染させるのに用いられる。

好ましい単一または複数の一次ウイルスベクターはＭＬＶベクターである。

二次ウイルスベクターは好ましくはレンチウイルスベクターである。好ましい一実施形態では第二のウイルスベクターはＨＩＶに由来する。レトロレンチウイルス系の構築は実施例に記載する。二次ベクターは宿主細胞内で、欠陥ウイルスベクター粒子の組立およびパッケージングに必須である遺伝子の発現によって産生される。二次ベクターは、独立複製ができない点で欠陥がある。したがって、いったん二次レトロウイルスベクターが標的細胞へ導入されると、それは他のどの標的細胞へも複製によって広がることができない。

二次ベクターは、一次ベクターのＤＮＡにコードされた、レトロウイルスベクター産生のための必須遺伝子の発現から産生されうる。そのような遺伝子は、レトロウイルス由来のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子、エンベロープを持つウイルス由来のエンベロープ遺伝子、または細胞進入を媒介することができる任意の他のタンパク質、糖、脂質、またはこれらの複合体、および１つ以上の治療遺伝子を含む欠陥レトロウイルスゲノムを含むことができる。そのレトロウイルスゲノムは一般論として、少なくとも５'長末端反復（ＬＴＲ）の一部、少なくとも３'ＬＴＲの一部、およびパッケージングシグナルの、逆転写を可能にする配列を含む。

特に好ましい一実施形態では、我々は安定な構成的ＨＩＶ−１パッケージング系を開発しており、ここでは「ＳＴＡＲ」と呼ぶ。この系は高力価ベクターの大バッチの速やかでまた再現性のある産生を行い、それは臨床用途の重要な態様である、大規模な安全性管理試験を可能にする。この系では、ＨＩＶ−１Ｇａｇ−Ｐｏｌの高レベル発現が、コドン最適化されたｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子をコードするマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ベクターを用いて細胞、好ましくは２９３Ｔ細胞に導入することによって達成された¹¹。その後、効率的なベクターゲノム産生のためのＨＩＶ−１調節タンパク質ＴａｔおよびＲｅｖ、およびガンマレトロウイルスエンベロープ（Ｅｎｖ）が導入され、結果として空のベクター粒子を産生するパッケージング細胞株を生じた。ＮＯＩをコードするＨＩＶベクターゲノムの導入によって、高力価ＨＩＶ−ＮＯＩベクターが作製された。

好ましい一実施形態では、二次ベクターはまた、独立複製が可能な感染性ウイルスを生じる組み換えの可能性を消去する１つ以上の安全機能が組み込まれている点で、ｉｎ ｖｉｖｏ用途についても安全である。

複製能を欠くことを確実にするため、二次ベクターは単一または二個以上の一次ベクターに位置しうる複数の転写単位によってコードされうる。したがって、二次ベクターゲノムをコードする転写単位、ｇａｇ−ｐｏｌをコードする転写単位、およびｅｎｖをコードする転写単位が存在しうる。代替的に、これらのうち二個以上を組み合わせることができる。たとえば、ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ、またはｅｎｖおよびゲノムをコードする核酸配列を、単一の転写単位中に組み合わせることができる。これを達成するための方法は本分野で既知である。

ここで記載される転写単位は、コード配列、および他のどのコード配列からも独立してそれらのコード配列の発現を達成するためのシグナルを含む、核酸の領域である。したがって、個々の転写単位は一般的に、少なくとも、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルを含む。二次ベクターをコードする転写単位のプロモーターおよびエンハンサーは、標的細胞中で二次ウイルスベクターの産生のための条件下で、好ましくは強く活性であるか、または強く誘導されうる。プロモーターおよび／またはエンハンサーは、構成的に効率的であることができ、またはその活性に関して組織限定的であるかまたは一時的に限られていることができる。

ハイブリッドウイルスベクター系に組み込まれうる安全機能を後述する。そのような機能の１つ以上が存在しうる。

第一に、二次ベクターの成分をコードする配列間の配列ホモロジーは、ホモロジーの領域の欠失によって回避することができる。ホモロジーの領域は、遺伝子組み換えが起こるのを可能にする。特定の一実施形態では、二次レトロウイルスベクターを構築するのに３つの転写単位が用いられる。第一の転写単位は、非レトロウイルスプロモーターおよびエンハンサーの調節下の、レトロウイルスｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子を含む。第二の転写単位は、非レトロウイルスプロモーターおよびエンハンサーの調節下の、レトロウイルスｅｎｖ遺伝子を含む。第三の転写単位は、非レトロウイルスプロモーターおよびエンハンサーの調節下の、欠陥レトロウイルスゲノムを含む。天然のレトロウイルスゲノムでは、パッケージングシグナルは、適切に機能するためにｇａｇ配列が必要であるような部分に位置する。通常はレトロウイルスベクター系がその結果構成されている場合、ｇａｇ遺伝子の部分を含むパッケージングシグナルは、ベクターゲノム中に残る。この場合にはしかし、ベクターとのホモロジーを欠く合成ｇａｇ配列を用いることができる。

第二に、複製能を有する二次ウイルスベクターの可能性は、ｅｎｖとｇａｇ−ｐｏｌの成分の間のホモロジーの領域が回避されるように、１つのレトロウイルスのゲノムを、別のレトロウイルスまたはエンベロープを持つ別のウイルスのエンベロープタンパク質を用いて偽型化することによって回避することができる。特定の一実施形態では、レトロウイルスベクターは下記の３成分から構成される。第一の転写単位は、非レトロウイルスプロモーターおよびエンハンサーの調節下の、レトロウイルスｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子を含む。第二の転写単位は、非レトロウイルスプロモーターおよびエンハンサーの調節下の、エンベロープを持つ別のウイルス由来のｅｎｖ遺伝子を含む。第三の転写単位は、非レトロウイルスプロモーターおよびエンハンサーの調節下の、欠陥レトロウイルスゲノムを含む。一次ウイルスベクターは偽型化されうることもまた予見される。偽型化は下記により詳細に記載する。

第三に、複製能を有するレトロウイルスの可能性は、特定の方法で構成された２つの転写単位を用いることによって消去することができる。第一の転写単位は、ｈＣＭＶプロモーター−エンハンサーまたは組織限定プロモーター−エンハンサーといった、一次標的細胞中で活性であるプロモーター−エンハンサーの調節下にあるｇａｇ−ｐｏｌコード領域を含む。第二の転写単位は、レトロウイルス粒子中にパッケージングされうるレトロウイルスゲノムＲＮＡをコードする。第二の転写単位は、パッケージング，組み込みおよび逆転写に必要なレトロウイルス配列を含み、またエンベロープを持つウイルスのｅｎｖタンパク質をコードする配列、および１つ以上の治療遺伝子をコードする配列を含む。

一次レトロウイルスベクターは複製能を有するベクターであることができるが、より好ましくは複製能を欠くレトロウイルスベクターである。

記載の本発明の実施形態は、遺伝子治療に用いられる一部のウイルスベクターの産生に伴う主要な問題の１つ、すなわち産生が一過性であることを解決する。

二次ベクターとしてのレトロウイルスベクターの使用はまた、増殖している標的細胞における安定な発現を含む、標的組織における治療遺伝子の安定な発現を可能にするため、有利である。

好ましくは、二次ウイルスベクターは特定の１つの細胞型または複数の細胞型を優先的に感染させる。より好ましくは、二次ベクターは標的化ベクターであり、すなわち二次ベクターは、特定の細胞を標的とするように、天然のウイルスに比較して改変された組織親和性を有する。「標的化ベクター」の語は必ずしも「標的細胞」の語と結びつかない。「標的細胞」は単に、天然のまたは標的化された第二のベクターが感染または導入することができる細胞をいう。

レトロウイルスベクターについては、標的化はエンベロープタンパク質を改変することによって達成することができる。レトロウイルス二次ベクターのエンベロープタンパク質は、たとえばＭＬＶ両種性エンベロープまたは改変された両種性エンベロープといった、無毒性エンベロープまたは一次標的細胞内において無毒性量で産生されうるエンベロープである必要がある。

本発明に記載の二次ベクターのための標的細胞は、造血細胞（単球、マクロファージ、リンパ球、顆粒球、またはこれらのいずれかの前駆細胞を含む）；内皮細胞；腫瘍細胞；間質細胞；星状細胞または膠細胞；筋細胞；上皮細胞；および成体または胚性幹細胞を含むがそれらに限定されない。

二次ベクターがＮＯＩを含む場合、好ましくはこの第二の転写単位は、虚血部位または固形腫瘍の微小環境といった、体内の疾患部位において優先的に活性であるプロモーター−エンハンサーの調節下にある。本発明のこの態様の、特に好ましい一実施形態では、第二の転写単位は、標的細胞へのそのゲノムの挿入に際して、ウイルスｅｎｖ遺伝子の発現を低下させ治療遺伝子の効率的な発現を可能にするように作用するイントロンが生じるように構成されている。

宿主細胞集団は標的細胞集団と同一であることができる。たとえば本発明の一次ベクターの腫瘍細胞への配送は、別の腫瘍細胞へ導入することができる別のベクター粒子の複製および産生に繋がる。代替的に、標的細胞集団は宿主細胞集団とは異なることができる。この場合には、宿主細胞は治療される個体の体内の内在性工場として作用し、標的細胞集団を感染させることができる追加のベクター粒子を産生する。たとえば、宿主細胞集団は、一次ベクターをｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで導入された造血細胞であることができる。標的細胞はその後、腫瘍といった体内の部位へ配送されるかまたは移動して、二次ベクター粒子を産生し、二次ベクター粒子はたとえば固形腫瘍内の細胞に形質導入することができる。

本発明は、単一または複数の治療タンパク質の作用が必要である部位またはその近傍で、高力価の欠陥レトロウイルスベクター粒子のｉｎ ｖｉｖｏの局所化された産生を、その後の標的細胞の効率的な形質導入と共に可能にする。この場合、一次ベクターもまた複製能を欠く。

本発明はまた、分裂しないかまたは分裂の遅い細胞においてｉｎ ｖｉｖｏで、ＭＬＶを基礎とするベクターのようなレトロウイルスベクターの産生を可能にする。ＭＬＶを基礎とするレトロウイルスベクターを産生することは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖する組織培養順応細胞またはｉｎ ｖｉｖｏの速やかに分裂する腫瘍細胞といった速やかに分裂する細胞でのみ以前は可能であった。レトロウイルスベクターを産生することができる細胞型の範囲を拡大することは、多くはゆっくり分裂する固形腫瘍の細胞への遺伝子の配送に、および、治療タンパク質の産生のための内在性工場としての内皮細胞およびさまざまな造血系譜の細胞といった分裂しない細胞の利用に有利である。

レトロウイルス
レトロウイルスベクターを遺伝子治療および遺伝子配送に用いるという概念はよく知られている（バーマ（Ｖｅｒｍａ）およびソミア（Ｓｏｍｉａ）（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９；２３９−２４２）。

レトロウイルスは多数存在する。本用途のためには、「レトロウイルス」の語は下記を含む；マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤波肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、アベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄細胞腫症ウイルス−２９（ＭＣ２９）、およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）、およびスプーマウイルスおよびレンチウイルスを含むすべての他のレトロウイルス科。

レトロウイルスの詳細な一覧は、コフィン（Ｃｏｆｆｉｎ）他（『レトロウイルス』１９９７、コールド・スプリング・ハーパー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ＪＭ・コフィン（Ｃｏｆｆｉｎ）、ＳＭ・ヒューズ（Ｈｕｇｈｅｓ）、ＨＥ・バーマス（Ｖａｒｍｕｓ）編、ｐｐ ７５８〜７６３）に見ることができる。

好ましい一実施形態では、二次レトロウイルスベクターは少なくともレンチウイルスから導くことができる。レンチウイルスもまたレトロウイルス科に属するが、しかしレンチウイルスは分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させることができる（ルイス（Ｌｅｗｉｓ）他 （１９９２） ＥＭＢＯ Ｊ． ３０５３−３０５８）。

レンチウイルス群は「霊長類」および「非霊長類」に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例は、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む。非霊長類レンチウイルス群は、典型的な「スローウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、および関連するヤギ関節炎−脳脊髄炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ならびにより近年に記載されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）を含む。

ここで用いられるＨＩＶは、たとえばＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２といったＨＩＶ、およびたとえばＨＴＬＶ−ＩＩＩといったＨＴＬＶのような、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）およびＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）の病原体とみなされるウイルスに与えられるすべての表記を包含する。２つの主要なＨＩＶの型であるＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のうち、ＨＩＶ−１が全世界で優勢な種である。現在まで、ＨＩＶ−１の主な２つの群「Ｍ」および「Ｏ」が存在する。ＨＩＶ−１感染の大多数を引き起こすウイルスはＭ群に属する。Ｏ群分離株はＭ群とは遺伝的に大きく隔たっている。Ｍ群のＨＩＶ−１亜型はＡ〜Ｊ亜型を含む。

一部のレンチウイルスのゲノム構造に関する詳細を本分野で見出すことができる。一例として、ＨＩＶおよびＥＩＡＶに関する詳細は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに見出すことができる（すなわちそれぞれゲノム登録番号ＡＦ０３３８１９およびＡＦ０３３８２０）。ＨＩＶ変異株の詳細もまた、 HYPERLINK http://hiv-web.lanl.gov ｈｔｔｐ；／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ．に見出すことができる。ＥＩＡＶ変異株の詳細は、ｈｔｔｐ；／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．から見出すことができる。

感染の過程の間に、レトロウイルスは最初に特定の細胞表面受容体に結合する。感受性の宿主細胞への進入に際して、親ウイルス内に運ばれる、ウイルスにコードされた逆転写酵素によって、レトロウイルスＲＮＡゲノムは次いでＤＮＡへコピーされる。このＤＮＡは宿主細胞核へ輸送され、そこで続いて宿主ゲノム中へ組み込まれる。この段階でそれは典型的にはプロウイルスと呼ばれる。プロウイルスは、宿主染色体中で細胞分裂の間に安定であり、他の細胞遺伝子のように複写される。プロウイルスはより多くのウイルスを作るのに必要なタンパク質および他の因子をコードし、そのウイルスは「出芽」と時に呼ばれる過程によって細胞を離れることができる。

個々のレトロウイルスゲノムは、ビリオンタンパク質および酵素をコードする、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖと呼ばれる遺伝子を含む。これらの遺伝子の両端には、長末端反復（ＬＴＲ）と呼ばれる領域が隣接する。ＬＴＲは、プロウイルス組み込み、および転写を担う。ＬＴＲはまた、エンハンサー−プロモーター配列としても機能する。言い換えると、ＬＴＲはウイルス遺伝子の発現を調節することができる。レトロウイルスＲＮＡのキャプシド形成は、ウイルスゲノムの５'末端に位置するｐｓｉ配列によって起こる。

ＬＴＲ自身は、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５と呼ばれる３つの配列に分けることができる同一の配列である。Ｕ３はＲＮＡの３'末端に特有の配列に由来する。ＲはＲＮＡの両端で反復される配列に由来し、Ｕ５はＲＮＡの５'末端に特有の配列に由来する。その３つの配列の大きさは、異なるレトロウイルスの間では顕著に異なりうる。

ウイルスゲノムに関しては、転写開始の部位は一方のＬＴＲのＵ３とＲの間の境界に、またポリ（Ａ）付加（終止）の部位はもう一方のＬＴＲのＲとＵ５の間の境界に位置する。Ｕ３は、プロウイルスの転写調節配列の大部分を含み、それは細胞のおよび一部の場合にはウイルスの転写活性化タンパク質に反応する、プロモーターおよび複数のエンハンサー配列を含む。一部のレトロウイルスは、遺伝子発現の調節に関与するタンパク質をコードする下記の遺伝子のうちいずれか１つ以上を有する；ｔａｔ、ｒｅｖ、ｔａｘおよびｒｅｘ。

構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ自身に関しては、ｇａｇはウイルスの内部構造タンパク質をコードする。Ｇａｇタンパク質はタンパク質分解によりプロセシングされて成熟タンパク質ＭＡ（マトリクス）、ＣＡ（キャプシド）およびＮＣ（ヌクレオキャプシド）となる。ｐｏｌ遺伝子は、ゲノムの複製を媒介する、ＤＮＡポリメラーゼ、随伴ＲＮａｓｅＨおよびインテグラーゼ（ＩＮ）を含む、逆転写酵素（ＲＴ）をコードする。ｅｎｖ遺伝子は、細胞受容体タンパク質と特異的に相互作用する複合体を形成する、ビリオンの表面（ＳＵ）糖タンパク質および膜貫通（ＴＭ）タンパク質をコードする。この相互作用は最終的に、ウイルス膜の細胞膜との融合によって感染に繋がる。

レトロウイルスはまた、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ以外のタンパク質をコードする「追加の」遺伝子を含むことができる。追加の遺伝子の例は、ＨＩＶでは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖおよびｎｅｆのうち１つ以上を含む。ＥＩＡＶは（中でも）追加の遺伝子Ｓ２を持つ。

追加の遺伝子によってコードされたタンパク質はさまざまな機能を果たし、その一部は細胞タンパク質によって提供される機能を複製することができる。ＥＩＡＶでは、たとえば、ｔａｔはウイルスＬＴＲの転写活性化因子として作用する。それはＴＡＲと呼ばれる安定なステム−ループＲＮ二次構造に結合する。Ｒｅｖはｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）を通じてウイルス遺伝子の発現を調節および調整する。これらの２つのタンパク質の作用機序は霊長類ウイルスにおける類似の機構と大まかに同様であると考えられている。Ｓ２の機能は未知である。加えて、スプライシングされて膜貫通タンパク質の最初のｅｎｖコード配列となるｔａｔの第一のエクソンによってコードされる、ＥＩＡＶタンパク質であるＴｔｍが同定されている。

ベクター系
レンチウイルスベクター系といったレトロウイルスベクター系が、特に１つ以上の目的部位へのＮＯＩの輸送のための配送系として提案されている。輸送は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはその組み合わせで起こりうる。レトロウイルスベクター系は、受容体の使用法、逆転写およびＲＮＡパッケージングを含む、レトロウイルス生活環のさまざまな面を研究するのに利用されてきている（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）による総説、１９９２ Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８；１−２４）。

ここで用いられる「ベクター系」の語は、レシピエント細胞にＮＯＩを形質導入することができるベクター粒子を意味する。

ベクター粒子は下記の成分を含む；１つ以上のＮＯＩを含むことができるベクターゲノム、核酸をキャプシド化するヌクレオキャプシド、およびヌクレオキャプシドを囲む膜。

「ヌクレオキャプシド」の語は、レトロウイルスゲノムの少なくとも群特異的ウイルスコアタンパク質（ｇａｇ）およびウイルスポリメラーゼ（ｐｏｌ）をいう。これらのタンパク質はパッケージング可能な配列をキャプシド化し、自身がさらにエンベロープ糖タンパク質を含む膜に囲まれている。

一旦細胞内へ入ると、レトロウイルスベクター粒子由来のＲＮＡゲノムは逆転写されてＤＮＡになり、レシピエント細胞のＤＮＡへ組み込まれる。

「ベクターゲノム」の語は、レトロウイルスベクター粒子中に存在するＲＮＡ構造と組み込まれたＤＮＡ構造の両方をいう。その語はまた、そのようなＲＮＡゲノムをコードすることができる個別のまたは単離されたＤＮＡ構造も含む。レトロウイルスまたはレンチウイルスゲノムは、レトロウイルスまたはレンチウイルスから導くことができる１つの成分の部分を含むべきである。「導くことができる」の語は、必ずしもレンチウイルスといったレトロウイルスから得られたのでなくてもよく代わりにそれから導くことができるヌクレオチド配列またはその一部という意味として通常の意味で用いられる。一例として、その配列は合成的にまたは組み換えＤＮＡ技術によって調製することができる。好ましくはゲノムはｐｓｉ領域（またはキャプシド形成を起こすことができる類似の成分）を含む。

好ましくは一次レトロウイルスベクターは自己不活性化（ＳＩＮ）ベクター系である。

好ましくは一次レトロウイルスベクターは、目的のＮＯＩの発現を促進するための内部プロモーターを含む。

好ましくは一次レトロウイルスベクターはスプリットイントロン配列を含む（Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０００ Ｍａｒ； ７４（５）；２３６５−７１． 『スプリットイントロンレトロウイルスベクター；安全性の向上した発現促進』（Ｓｐｌｉｔ−ｉｎｔｒｏｎ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ； ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓａｆｅｔｙ．）イスマイル（Ｉｓｍａｉｌ）ＳＩ， キングズマン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ）ＳＭ， キングズマン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ）ＡＪ， ウーデン（Ｕｄｅｎ）Ｍ．）。

好ましくは一次レトロウイルスベクターはスプリットポリＡ配列を含む（Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００１ Ｊａｎ； ７５（１）；１９９−２０４． 『レトロウイルスベクターの発現および安全性を高めるためのイントロン破壊されたポリアデニル化部位の使用』（Ｕｓｅ ｏｆ ｉｎｔｒｏｎ−ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．）イスマイル（Ｉｓｍａｉｌ）ＳＩ， ロール（Ｒｏｈｌｌ）ＪＢ， キングズマン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ）ＳＭ， キングズマン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ）ＡＪ， ウーデン（Ｕｄｅｎ）Ｍ．）。

好ましくは二次レトロウイルスベクターは自己不活性化（ＳＩＮ）ベクター系である。

一例として、自己不活性化レトロウイルスベクター系が、３(ＬＴＲのＵ３領域中の転写エンハンサー、またはエンハンサーおよびプロモーターを欠失させることによって構築されている。１回のベクター逆転写および組み込み後、これらの変化は５(および３(ＬＴＲの両方にコピーされ、転写的に不活性なプロウイルスを生じる。しかし、そのようなベクター中のＬＴＲ内の任意の（一または複数の）プロモーターは、なお転写的に活性である。この戦略は、内部に置かれた遺伝子からの転写に際してウイルスＬＴＲ中のエンハンサーおよびプロモーターの作用を消去するために用いられている。そのような作用は、転写の増加または転写の抑制を含む。この戦略はまた、３(ＬＴＲからゲノムＤＮＡ中への下流転写を消去するのに用いることができる。これは、内在性発がん遺伝子の偶発的活性化を防ぐことが重要でありうる、ヒト遺伝子治療において特に重要である。

好ましくは、本発明のウイルス産生細胞からの高力価の調節されたレトロウイルスベクターの産生を促進する、リコンビナーゼ補助機構が用いられる。

ここで用いられる「リコンビナーゼ補助系」の語は、バクテリオファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼ／ｌｏｘＰ認識部位、または３４ｂｐＦＬＰ認識標的（ＦＲＴｓ）間の組み換え現象を触媒する酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の部位特異的ＦＬＰリコンビナーゼを用いる系を含むがそれらに限定されない。

３４ｂｐＦＬＰ認識標的（ＦＲＴ）間の組み換え現象を触媒する酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の部位特異的ＦＬＰリコンビナーゼは、リコンビナーゼ補助組み換え現象を用いて高レベルウイルス産生細胞株を作製するためにＤＮＡ構造へ組み込まれている（カーレマン（Ｋａｒｒｅｍａｎ）他（１９９６）ＮＡＲ ２４；１６１６−１６２４）。同様の系が、バクテリオファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼ／ｌｏｘＰ認識部位を用いて開発されている（ＰＣＴ／ＧＢ００／０３８３７；バニン（Ｖａｎｉｎ）他 （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ７１；７８２０−７８２６を参照）。これは高力価レンチウイルスウイルス産生細胞株が作製されるようにレンチウイルスゲノムへ組み込まれた。

本発明のウイルス産生／パッケージング細胞株を用いることによって、たとえば、目的の部位（成体脳組織のような）のその後の形質導入のための、多量のウイルスベクター粒子を増殖および単離することが可能である（たとえばウイルスベクター粒子の適当な力価を調製すること）。ウイルス産生細胞株は、通常、大スケール産生またはベクター粒子により適している。

ウイルス産生細胞／パッケージング細胞は、任意の適当な細胞型であることができる。ウイルス産生細胞は一般的に哺乳類細胞であるが、たとえば、昆虫細胞であることができる。

ここで用いられる「ウイルス産生細胞」または「ベクター産生細胞」の語は、レトロウイルスベクター粒子の産生に必要なすべての要素を含む細胞をいう。

好ましくは、ウイルス産生細胞は、生成された安定な細胞株から得ることができる。

ここで用いられる「生成された安定なウイルス産生細胞株」の語は、マーカー遺伝子の高発現についてスクリーニングされ選択されている、形質導入されたウイルス産生細胞株である。そのような細胞株は、ウイルスゲノムからの高レベル発現を支持する。「生成されたウイルス産生細胞株」の語は、「生成された安定なウイルス産生細胞株」の語および「安定なウイルス産生細胞株」の語と相互に交換可能に用いられる。

好ましくは、生成されたウイルス産生細胞株はＨＩＶまたはＥＩＡＶウイルス産生細胞株である。

好ましくは、エンベロープタンパク質配列、およびヌクレオキャプシド配列は、ウイルス産生細胞および／またはパッケージング細胞にすべて安定に組み込まれている。しかし、これらの配列のうち１つ以上は、エピソーム形でもまた存在することができ、遺伝子発現はエピソームからも起こりうる。

ここで用いられる「パッケージング細胞」の語は、ＲＮＡゲノムに欠けている、感染性組み換えウイルスの産生に必要な要素を含む細胞をいう。典型的には、そのようなパッケージング細胞は、ウイルス構造タンパク質（たとえばｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ、コドン最適化されうる）を発現することができるウイルス産生プラスミドを１つ以上含むが、それらはパッケージングシグナルを含まない。

「パッケージングシグナル」の語は、相互に交換可能に「パッケージング配列」または「ｐｓｉ」ともいうが、ウイルス粒子形成中にレトロウイルスＲＮＡ鎖のキャプシド形成に必要な非コードｃｉｓ作用性配列について用いられる。ＨＩＶ−１では、この配列は主要スプライシングドナー部位（ＳＤ）の上流から少なくともｇａｇ開始コドンにわたる遺伝子座にマッピングされている。

パッケージング細胞株は容易に作製することができ（国際公開第９２／０５２６６号パンフレットも参照）、レトロウイルスベクター粒子のためのウイルス産生細胞株を作製するために利用されうる。上記で既に言及した通り、入手可能なパッケージング細胞株の概要は『レトロウイルス』（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）に示されている。

パッケージング細胞株は、キャプシド化および高力価ベクター粒子産生のための膜タンパク質を提供するのに必要な遺伝子産物を提供するのに有用である。パッケージング細胞は、組織培養細胞株のように、ｉｎｖｉｔｒｏで培養された細胞であることができる。適当な細胞株は、マウス線維芽細胞由来細胞株またはヒト細胞株といった哺乳類細胞を含むがそれらに限定されない。好ましくはパッケージング細胞株はヒト細胞株である。適当な細胞株の例は；ＨＥＫ２９３、２９３−Ｔ、ＴＥ６７１、ＨＴ１０８０またはＨｅＬａ、より好ましくは２９３ＴまたはＨＴ１０８０、さらにより好ましくは２９３Ｔ、を含む。

代替的に、パッケージング細胞は、単球、マクロファージ、血球または線維芽細胞といった、治療される個体に由来する細胞であることができる。細胞を個体から単離し、パッケージングおよびベクター成分をｅｘ ｖｉｖｏで投与し、その後に自家パッケージング細胞の再投与を行うことができる。

高力価ウイルス調製物を用いることが、実験的用途および実用の両方において非常に望ましい。ウイルス力価を高めるための技術は、ｐｓｉプラスパッケージングシグナルを上記の通り用いることおよびウイルスストックの濃縮を含む。

ここで用いられる「高力価」の語は、標的部位に形質導入することができるウイルスベクターまたは粒子の有効量を意味する。

ここで用いられる「有効量」の語は、標的部位でのＮＯＩの発現を誘導するのに十分である、調節されたレトロウイルスベクター粒子の量を意味する。

ウイルス産生／パッケージング細胞のための高力価ウイルス調製物は、通常はｍｌ当たり１０⁵ないし１０⁷ｔ．ｕ．程度である（力価は、２９３ＴまたはＤ１７といった標準細胞株について力価測定して、ｍｌ当たり形質導入単位（ｔ．ｕ．／ｍｌ）として表される）。一部の組織における形質導入については、ごく小さい容量を用いる必要がある可能性があり、そのためウイルス調製物は超遠心分離、低速遠心分離、またはクロスフロー（ｃｒｏｓｓ−ｓｌｏｗ）濾過によって濃縮される。

ＮＯＩにコードされた発現産物は、細胞から分泌されるタンパク質であることができる。代替的に、ＮＯＩ発現産物は分泌されず、細胞内で活性である。一部の用途には、ＮＯＩ発現産物がバイスタンダー効果または遠隔バイスタンダー効果；すなわち、１つの細胞における発現産物の産生が、共通の表現型を有する近傍のまたは離れた（たとえば転移性の）別の、関係する細胞の調節に繋がることを示すことが好ましい。

中心ポリプリン区域（ｃＰＰＴ）といわれる配列の存在は、非分裂細胞への遺伝子配送の効率を改善しうる（国際公開第００／３１２００号パンフレットを参照）。このｃｉｓ作用性配列は、たとえば、ＥＩＡＶポリメラーゼコード領域配列中に位置する。好ましくは本発明に用いられるベクター系のゲノムはｃＰＰＴ配列を含む。加えて、または代替として、ウイルスゲノムは翻訳後調節配列および／または翻訳エンハンサーを含みうる。

ＮＯＩは１つ以上のプロモーター／エンハンサー配列に調節可能に連鎖することができる。１つ以上のＮＯＩの転写は、ウイルスＬＴＲの調節下にあることができ、または代替的にプロモーター−エンハンサー配列を導入遺伝子に組み込むことができる。好ましくはプロモーターはＣＭＶのような強いプロモーターである。プロモーターは調節されたプロモーターでありうる。プロモーターは組織特異的でありうる。

最小系
ベクター産生または分裂および非分裂細胞の形質導入のどちらにも、ＨＩＶ／ＳＩＶ追加遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖおよびｎｅｆのどれも必要としない、霊長類レンチウイルス最小系を構成することができるのが実証されている。ベクター産生または分裂および非分裂細胞の形質導入のどちらにもＳ２を必要としない、ＥＩＡＶ最小ベクター系を構成することができるのもまた実証されている。追加遺伝子の欠失は非常に有利である。第一に、それはレンチウイルス（たとえばＨＩＶ）感染において疾患に関連する遺伝子無しでベクターが産生されるのを可能にする。特に、ｔａｔは疾患に関連する。第二に、追加遺伝子の欠失は、ベクターがより多くの異種ＤＮＡをパッケージングするのを可能にする。第三に、Ｓ２のように機能が未知である遺伝子を除外することができ、それによって、望まない作用を引き起こす危険を低下することができる。最小レンチウイルスベクターの例は、国際公開第Ａ−９９／３２６４６号パンフレットに、および国際公開第Ａ−９８／１７８１５号パンフレットに開示されている。

このように、好ましくは、本発明に用いられるレトロウイルスベクターは、少なくともｔａｔおよびＳ２を欠き（ＥＩＡＶベクター系であれば）、およびおそらくｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕおよびｎｅｆも欠く。より好ましくは、本発明の系はまたｒｅｖも欠く。Ｒｅｖは以前は、一部のレトロウイルスゲノムにおいて効率的なウイルス産生のために必須と考えられていた。たとえば、ＨＩＶの場合には、ｒｅｖおよびＲＲＥ配列を含むべきと考えられていた。しかし、ｒｅｖおよびＲＲＥの必要性は、コドン最適化（下記参照）によって、またはＭＰＭＶ系のような他の機能する同等の系での置換によって、低下または除去できることが見出されている。コドン最適化されたｇａｇ−ｐｏｌの発現はＲＥＶに依存しないため、ＲＲＥをｇａｇ−ｐｏｌ発現カセットから除去することができ、そのようにしてベクターゲノム上に含まれるいずれかのＲＲＥとの組み換えの可能性を除くことができる。

好ましい一実施形態では、本発明の第一の態様のウイルスゲノムは、Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）を欠く。

好ましい一実施形態では、本発明に用いられる系は、一部またはすべての追加遺伝子が除去されたいわゆる「最小」系を基礎とする。

コドン最適化
コドン最適化は、国際公開第９９／４１３９７号パンフレットおよび国際公開第０１／７９５１８号パンフレットに以前に記載されている。異なる細胞は、特定のコドンの用法が異なる。このコドンの偏りは、その細胞型における特定のｔＲＮＡの相対存在量の偏りに相当する。対応するｔＲＮＡの相対存在量に調和するように合わせて、配列中のコドンを変更することによって、発現を増加させることができる。同様に、その特定の細胞型で対応するｔＲＮＡが稀であることが知られているコドンを意図的に選択することによって、発現を低下させることができる。このように、追加の程度の翻訳調節が利用可能である。

ＨＩＶおよび他のレンチウイルスを含む多数のウイルスが、多数の稀なコドンを使用し、そしてこれらを一般に用いられる哺乳類コドンに対応するように変えることによって、哺乳類ウイルス産生細胞におけるパッケージング成分の発現増加を達成することができる。コドン用法表は、哺乳類細胞について、およびさまざまな他の生物について、本分野で既知である。

コドン最適化はいくつかの他の利点を有する。配列の変化によって、ウイルス産生細胞／パッケージング細胞においてウイルス粒子の組立に必要であるウイルス粒子のパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列から、ＲＮＡ不安定性配列（ＩＮＳ）が除去される。同時に、パッケージング成分についてのアミノ酸配列コード配列は保持されるため、その配列によってコードされるウイルス成分は、同一のままであるか、または少なくとも十分に類似しているのでパッケージング成分の機能が障害されない。コドン最適化はまた、輸送のためのＲｅｖ／ＲＲＥの必要性を克服し、最適化された配列をＲｅｖ非依存性にする。コドン最適化はまた、ベクター系内での異なる構造間の（たとえばｇａｇ−ｐｏｌとｅｎｖのオープン・リーディング・フレームの重なりの領域間）相同組み換えを減少させる。コドン最適化の全体的効果はしたがって、ウイルス力価の顕著な増加および安全性の改善である。

一実施形態では、ＩＮＳに関連するコドンだけがコドン最適化される。しかし、はるかに好ましくまた実際的な一実施形態では、配列は、フレームシフト部位を包含する配列を例外として、全体がコドン最適化される。

ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子は、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質をコードする２つの重なり合う読み枠を含む。両方のタンパク質の発現は、翻訳中のフレームシフトに依存する。このフレームシフトは、翻訳中のリボソームの「ずれ」の結果として起こる。このずれは、少なくとも部分的には、リボソームを停止させるＲＮ二次構造によって引き起こされると考えられている。そのような二次構造は、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子中のフレームシフト部位の下流に存在する。ＨＩＶについては、重なりの領域はｇａｇの開始の下流のヌクレオチド１２２２から（ここでヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡである）、ｇａｇの終わり（ｎｔ１５０３）まで伸びている。このため、フレームシフト部位および２つの読み枠の重なり領域にわたる２８１ｂｐ断片は、好ましくはコドン最適化されていない。この断片を保持することは、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質のより効率的な発現を可能にする。

ＥＩＡＶについては、重なりの開始はｎｔ１２６２（ここでヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡである）と考えられている。重なりの終わりは１４６１ｂｐにある。フレームシフト部位およびｇａｇ−ｐｏｌ重複が保存されていることを確実にするため、野生型配列がｎｔ１１５６から１４６５まで保持されている。

たとえば、便利な制限部位を提供するために、最適コドン用法からの派生を行うことができ、保存されたアミノ酸変化をｇａｇ−ｐｏｌタンパク質に導入することができる。

非常に好ましい一実施形態では、コドン最適化は、わずかに発現された哺乳類遺伝子に基づいた。三番目の、および時に二番目および三番目の塩基を変えることができる。

遺伝コードの縮重的性質のため、当業者によって多数のｇａｇ−ｐｏｌ配列を達成することができることが理解される。また、コドン最適化されたｇａｇ−ｐｏｌ配列を作製するための出発点として用いることができる、記載された多数のレトロウイルス変異株が存在する。レンチウイルスゲノムは非常に可変的でありうる。たとえば、ＨＩＶ−１のなお機能する多数の準種が存在する。ＥＩＡＶについてもその通りである。これらの変異株は、形質導入過程の特定部分を促進するのに用いることができる。ＨＩＶ−１変異株の例は HYPERLINK http://hiv-web.lanl.vov ｈｔｔｐ；／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ．で見出すことができる。ＥＩＡＶクローンの詳細はＮＣＢＩデータベース； HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov ｈｔｔｐ；／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．で見出すことができる。

コドン最適化されたｇａｇ−ｐｏｌ配列のための戦略は、どのレトロウイルスについても用いることができる。これはＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＶＭＲ、ＳＩＶ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を含むすべてのレンチウイルスに当てはまる。加えて、この方法は、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＦＶ、ＨＳＲＶおよびヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、ＭＬＶ、および他のレトロウイルスに由来する遺伝子の発現を増加させるのに用いることができる。

コドン最適化は、ｇａｇ−ｐｏｌ発現をＲｅｖ非依存性にすることができる。レトロウイルスベクターにおける抗ｒｅｖまたはＲＲＥ因子の使用を可能にするためには、しかし、ウイルスベクター産生系を完全にＲｅｖ／ＲＲＥ非依存性にする必要がある。したがって、ゲノムを改変する必要もある。これはベクターゲノム成分を最適化することによって達成される。有利なことに、これらの改変はまた、ウイルス産生細胞と形質導入された細胞の両方にすべての追加タンパク質が存在しない、より安全な系の作製に繋がる。

上述の通り、レトロウイルスベクターのためのパッケージング成分は、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の発現産物を含む。加えて、効率的なパッケージングは、ｇａｇおよびｅｎｖ由来の部分配列が後続する、４つのステムループの短い配列に依存する（「パッケージングシグナル」）。したがって、レトロウイルスベクターゲノムに欠失したｇａｇ配列を含めること（パッケージング構造上の完全なｇａｇ配列に加えて）はベクター力価を最適化する。現在まで、効率的なパッケージングは、ｅｎｖ配列をまだ保持しているベクター中にｇａｇの２５５ないし３６０ヌクレオチドを、または特定の組み合わせのスプライスドナー変異であるｇａｇおよびｅｎｖ欠失中のｇａｇの約４０ヌクレオチドを必要とすると報告されている。驚くべきことに、ｇａｇ中のＮ末端の３６０個程度のヌクレオチド以外全部の欠失が、ベクター力価の増加に繋がることが見出されている。したがって、好ましくは、レトロウイルスベクターゲノムは１つ以上の欠失を含むｇａｇ配列を含み、より好ましくはそのｇａｇ配列は、Ｎ末端から導くことができる約３６０ヌクレオチドを含む。

偽型化
ウイルスベクター系の設計においては、より広い範囲または変化させた範囲の細胞型への遺伝物質の配送を可能にするため、天然ウイルスとは異なる標的細胞特異性を有する粒子を作製することが好ましい。これを達成するための１つの方法は、ウイルスエンベロープタンパク質を操作することによってその特異性を変化させることである。もう１つの手法は、異種エンベロープタンパク質をベクター粒子へ導入し、そのウイルスの天然エンベロープタンパク質を置換するかまたはそれに加えることである。

このように、好ましい一実施形態によると、一次および／または二次ウイルスベクターは偽型化されている。

偽型化の語は、ウイルスゲノムのｅｎｖ遺伝子を、たとえば別のウイルス由来のｅｎｖ遺伝子といった異種ｅｎｖ遺伝子を用いて、少なくとも一部を組み込むか、または一部を置換するか、または全部を代替することを意味する。偽型化は新しい現象ではなく、例は国際公開第９９／６１６３９号パンフレット、国際公開第Ａ−９８／０５７５９号パンフレット、国際公開第Ａ−９８／０５７５４号パンフレット、国際公開第Ａ−９７／１７４５７号パンフレット、国際公開第Ａ−９６／０９４００号パンフレット、国際公開第Ａ−９１／０００４７号パンフレット、およびメバチオン（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ）他 １９９７ Ｃｅｌｌ ９０， ８４１−８４７に見出すことができる。

偽型化は、レトロウイルスベクター安定性および形質導入効率を改善することができる。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）を用いてパッケージングされたマウス白血病ウイルスの偽型が記載されており（マイルティック（Ｍｉｌｅｔｉｃ）他（１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３；６１１４−６１１６）、超遠心分離中に安定であり異なる生物種に由来するいくつかの細胞株を感染させる能力があることが示されている。エボラウイルス由来のエンベロープタンパク質といった他のエンベロープタンパク質もまた用いることができる。

本発明の一実施形態では、ベクター系はＬＭＣＶｅｎｖタンパク質を用いて偽型化することができる。

本発明の別の一実施形態では、ベクター系はエボラウイルス由来のエンベロープタンパク質を用いて偽型化することができる。

本発明の別の一実施形態では、ベクター系はアルファウイルスを用いて偽型化することができる。

別の一実施形態では、両種性ＭＬＶ（ＭＬＶ−Ａ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）およびネコ内在性ウイルスＲＤ１１４^22,16といったガンマレトロウイルス株由来のＥｎｖを利用することができる。これらのＥｎｖについての細胞受容体は互いに異なり、多様なヒト細胞型上で見出される²³。これらのＥｎｖを有するＭＬＶベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ^24-26およびｅｘ ｖｉｖｏ^27-30の両方で、リンパ球およびＣＤ３４⁺前駆細胞といったいくつかの臨床的に意義のある細胞型の形質導入に用いられている。

成熟ガンマレトロウイルスＥｎｖは、ヘテロ二量体（複数）の三量体から成る。個々の二量体はウイルス外表面サブユニット（ＳＵ）および膜貫通サブユニット（ＴＭ）から成る。成熟タンパク質ではＳＵとＴＭはいくつかの非共有相互作用³¹および不安定なジスルフィド結合³²を介して結合している。

本発明に記載の細胞から産生され、ガンマレトロウイルスＥｎｖを用いて偽型化された、ＨＩＶ−１ベクターといった高力価ベクターは、一過性に産生されたＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）を含む他の系と比較して、多数の臨床状況および実験状況において有利でありうる。

本発明はまた、ガンマレトロウイルスＥｎｖの突然変異型、異型、ホモログまたは断片も利用する。たとえば、ＲＤ１１４の細胞質尾部は、ＭＬＶエンベロープのもので置き換えることができ、またはＲＤ１１４ＥｎｖはＲペプチド切断部位配列をＨＩＶ−１Ｇａｇ中のマトリクス−キャプシド切断部位のもので置き換えてＲＤｐｒｏを生じることによって改変することができる。

ガンマレトロウイルス偽型の力価は、ポリブレンおよび／またはスピノキュレーションの使用で増大できることを我々は見出している。ポリブレンおよびスピノキュレーションの使用は、ベクター形質導入を相加的に促進する。

本発明の別の一実施形態では、ウイルスベクター系は、狂犬病Ｇタンパク質またはその突然変異型、異型、ホモログまたは断片の少なくとも一部、またはＶＳＶ Ｇタンパク質またはその突然変異型、異型、ホモログまたは断片の少なくとも一部、またはコカルウイルス糖タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０４５５５６）またはその突然変異型、異型、ホモログまたは断片の少なくとも一部、またはチャンディプラウイルス糖タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ Ｊ０４３５０）またはその突然変異型、異型、ホモログまたは断片の少なくとも一部、を用いて偽型化することができる。

このように、本発明の一実施形態では、異種ｅｎｖ領域が狂犬病Ｇタンパク質またはその突然変異型、異型、ホモログまたは断片の少なくとも一部、またはＶＳＶ Ｇタンパク質またはその突然変異型、異型、ホモログまたは断片の少なくとも一部、またはコカル糖タンパク質またはその突然変異型、異型、ホモログまたは断片の少なくとも一部、またはチャンディプラ糖タンパク質またはその突然変異型、異型、ホモログまたは断片の少なくとも一部を含み、標的脂肪組織部位へ形質導入するための、異種ｅｎｖ領域を含むウイルスベクターの用途が提供される。

異種ｅｎｖ領域は、ウイルス産生プラスミド上に存在する遺伝子によってコードされうる。ウイルス産生プラスミドは、本発明の第一の態様における用途に適したウイルスベクター粒子の産生のためのキットの一部として存在することができる。

狂犬病Ｇタンパク質
本発明の別の一実施形態では、ベクターを狂犬病Ｇタンパク質またはその突然変異型、異型、ホモログまたは断片の少なくとも一部を用いて偽型化することができる。

狂犬病Ｇタンパク質およびその突然変異型に関する教示は、国際公開第９９／６１６３９号パンフレットおよび同じくローズ（Ｒｏｓｅ）他， １９８２ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４３； ３６１−３６４， ハンハム（Ｈａｎｈａｍ）他， １９９３ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，６７， ５３０−５４２， タフロー（Ｔｕｆｆｅｒｅａｕ）他，１９９８ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２， １０８５−１０９１， クセラ（Ｋｕｃｅｒａ）他， １９８５ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ５５， １５８−１６２， ディーツショルト（Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ）他， １９８３ ＰＮＡＳ ８０， ７０−７４， サイフ（Ｓｅｉｆ）他， １９８５ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．， ５３， ９２６−９３４， クーロン（Ｃｏｕｌｏｎ）他，１９９８ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２， ２７３−２７８， タフロー（Ｔｕｆｆｅｒｅａｕ）他，１９９８ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２， １０８５−１０９１０， バーガー（Ｂｕｒｇｅｒ）他， １９９１ Ｊ．Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７２． ３５９−３６７， ゴーディン（Ｇａｕｄｉｎ）他 １９９５ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６９， ５５２８−５５３４， ベンマンスール（Ｂｅｎｍａｎｓｏｕｒ）他 １９９１ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６５， ４１９８−４２０３， ルオ（Ｌｕｏ）他 １９９８ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４２， １８７−１９３， コール（Ｃｏｌｌ）１９９７ Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４２， ２０８９−２０９７， ルオ（Ｌｕｏ）他 １９９７ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ ５１， ３５−４１， ルオ（Ｌｕｏ）他 １９９８ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４２， １８７−１９３， コール（Ｃｏｌｌ）１９９５ Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４０， ８２７−８５１， ツチヤ（Ｔｕｃｈｉｙａ）他 １９９２ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ ２５， １−１３， モリモト（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ）他 １９９２ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８９， ２０３−２１６， ゴーディン（Ｇａｕｄｉｎ）他 １９９２ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８７， ６２７−６３２， ホイット（Ｗｈｉｔｔ）他 １９９１ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５， ６８１−６８８， ディーツショルト（Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ）他 １９７８ Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ４０， １３１−１３９， ディーツショルト（Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ）他 １９７８ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ ４０， ４５−５５， ディーツショルト（Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ）他 １９７７ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２３， ２８６−２９３， およびオトボス（Ｏｔｖｏｓ）他 １９９４ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２２４， ６８−７６に見出すことができる。狂犬病 Ｇ タンパク質はまた欧州特許第Ａ−０４４５６２５号明細書にも記載されている。

狂犬病Ｇタンパク質の使用は、狂犬病ウイルスが優先的に感染させる標的細胞へｉｎ ｖｉｖｏで優先的に形質導入するベクターを提供する。これは、ｉｎ ｖｉｖｏの脂肪組織標的細胞を含む。脂肪組織標的化ベクターには、ＥＲＡといった狂犬病の病原性株に由来する狂犬病Ｇが特に有効でありうる。一方、狂犬病Ｇタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ で、試験したほぼすべての哺乳類および鳥類細胞型を含む、より広い標的細胞範囲を与える（セガンチ（Ｓｅｇａｎｔｉ）他， １９９０ Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ． ３４，１５５−１６３；フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）他、１９９６『フィールズのウイルス学』（Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）第３版第２巻、リッピンコット−レイブン社（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、フィラデルフィア、ニューヨーク）。

偽型化されたベクター粒子の親和性は、細胞外ドメインが改変された突然変異狂犬病Ｇの使用によって改変することができる。狂犬病Ｇタンパク質は、標的細胞範囲を制限するために突然変異が可能であるという利点を有する。標的細胞によるｉｎ ｖｉｖｏの狂犬病ウイルスの取り込みは、アセチルコリン受容体（ＡｃｈＲ）によって媒介されると考えられているが、しかし狂犬病ウイルスがｉｎ ｖｉｖｏで結合する他の受容体が存在しうる（ハンハム（Ｈａｎｈａｍ）他， １９９３ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，６７， ５３０−５４２； タフロー（Ｔｕｆｆｅｒｅａｕ）他，１９９８ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２， １０８５−１０９１）。ウイルス進入には神経系において、ＮＣＡＭ（サウルーズ（Ｔｈｏｕｌｏｕｚｅ）他（１９９８）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ７２（９）；７１８１−９０）および ｐ７５ニューロトロフィン受容体（タフロー（Ｔｕｆｆｅｒｅａｕ）Ｃ他（１９９８） Ｅｍｂｏ Ｊ １７（２４） ７２５０−９）を含む複数の受容体が用いられると考えられている。

狂犬病Ｇタンパク質の抗原性部位ＩＩＩにおける突然変異のウイルス親和性に対する効果が調べられており、この領域はアセチルコリン受容体へのウイルスの結合に関与しないと考えられる（クセラ（Ｋｕｃｅｒａ）他， １９８５ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ５５， １５８−１６２； ディーツショルト（Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ）他， １９８３ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８０， ７０−７４；サイフ（Ｓｅｉｆ）他， １９８５ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．， ５３， ９２６−９３４；クーロン（Ｃｏｕｌｏｎ）他，１９９８ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２， ２７３−２７８； タフロー（Ｔｕｆｆｅｒｅａｕ）他，１９９８ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２， １０８５−１０９１０）。たとえば成熟タンパク質中のアミノ酸３３３位のアルギニンのグルタミンへの突然変異は、ｉｎ ｖｉｖｏで嗅覚神経細胞および末梢神経細胞へのウイルス進入を制限する一方で中枢神経系への増殖を減少させるのに用いることができる。これらのウイルスは、野生型ウイルスと同程度に効率的に、運動神経細胞および感覚神経細胞へ侵入することができたが、それでも神経細胞間伝播は起こらなかった（クーロン（Ｃｏｕｌｏｎ）他，１９８９， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３， ３５５０−３５５４）。ウイルスアミノ酸３３０が突然変異したウイルスは、さらに弱毒化され、筋肉内注射後に運動神経細胞または感覚神経細胞のどちらも感染させることができない（クーロン（Ｃｏｕｌｏｎ）他，１９９８ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２， ２７３−２７８）。

代替的に、または加えて、狂犬病の実験室継代株由来の狂犬病Ｇタンパク質を用いることができる。これらは親和性における変化についてスクリーニングすることができる。そのようなウイルス株は下記を含む；

一例として、ＥＲＡ株は狂犬病の病原性株であり、この株に由来する狂犬病Ｇタンパク質は神経細胞の形質導入に用いることができる。ＥＲＡ株由来の狂犬病Ｇの配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにある（登録番号Ｊ０２２９３）。このタンパク質は１９アミノ酸のシグナルペプチドを有し、成熟タンパク質は転写開始メチオニンから２０番目のアミノ酸のリジン残基から始まる。ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株は、成熟タンパク質中の３３３位アミノ酸のアルギニンからグルタミンへの突然変異を含み、これは病原性低下に関連し、ウイルスエンベロープの親和性を制限するのに用いることができる。

国際公開第９９／６１６３９号パンフレットは、狂犬病ウイルスＥＲＡ株について核酸配列およびアミノ酸配列を開示する（Ｇｅｎｂａｎｋ遺伝子座ＲＡＶＧＰＬＳ、登録番号Ｍ３８４５２）。

ＶＳＶ−Ｇタンパク質
ラブドウイルスの一種である水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質（Ｇ）は、ある種のレトロウイルスを偽型化することができることが示されているもう１つのエンベロープタンパク質である。

ＭｏＭＬＶを基礎とするレトロウイルスベクターを、レトロウイルスエンベロープタンパク質の非存在下で偽型化するその能力は、エミ（Ｅｍｉ）他によって最初に示された（１９９１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５；１２０２−１２０７）。国際公開第９４／２９４４４０号パンフレットは、ＶＳＶ−Ｇを用いてレトロウイルスベクターの偽型化に成功しうることを教示する。これらの偽型化されたＶＳＶ−Ｇベクターは、幅広い哺乳類細胞に形質導入するのに用いることができる。より近年には、アベ（Ａｂｅ）他（Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９８ ７２（８）６３５６−６３６１）は、非感染性レトロウイルス粒子をＶＳＶ−Ｇの添加によって感染性にすることができることを教示する。

バーンズ（Ｂｕｒｎｓ）他（１９９３ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０； ８０３３−７）は、ＶＳＶ−Ｇを用いてレトロウイルスＭＬＶの偽型化に成功し、これは結果として、天然型のＭＬＶと比較して変化した宿主範囲を有するベクターを生じた。ＶＳＶ−Ｇ偽型化ベクターは、哺乳類 細胞だけでなく、魚類、爬虫類、および昆虫に由来する細胞株もまた感染させることが示されている（バーンズ（Ｂｕｒｎｓ）他１９９３、同節）。それらはまた、さまざまな細胞株について、従来の両種性エンベロープよりも効率的であることも示されている（イー（Ｙｅｅ）他， １９９４ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１； ９５６４−９５６８， リン（Ｌｉｎ），エミ（Ｅｍｉ）他， １９９１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５；１２０２−１２０７）。ＶＳＶ−Ｇタンパク質の細胞質尾部はレトロウイルスコアと相互作用することができるため、ＶＳＶ−Ｇタンパク質を用いて一部のレトロウイルスを偽型化することができる。

ＶＳＶ−Ｇタンパク質といった非レトロウイルス偽型化エンベロープの提供は、ベクター粒子を感染性の損失無しで高力価に濃縮することができるという長所を与える（アッキナ（Ａｋｋｉｎａ）他， １９９６ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０； ２５８１−５）。レトロウイルスエンベロープタンパク質は、おそらく２個の非共有結合したサブユニットから成るために、明らかに超遠心分離中のせん断力に耐えられない。サブユニット間の相互作用は遠心分離によって破壊されうる。対照的に、ＶＳＶ糖タンパク質は単一のユニットから成る。ＶＳＶ−Ｇタンパク質偽型化は、したがって、潜在的な利点を提供する。

国際公開第００／５２１８８号パンフレットは、安定なウイルス産生細胞株からの、水疱性口内炎ウイルス−Ｇタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）を膜結合ウイルスエンベロープタンパク質として有する偽型化レトロウイルスベクターの作製を記載し、ＶＳＶ−Ｇタンパク質について遺伝子配列を提供する。

ＶＳＶ糖タンパク質と比較して、狂犬病糖タンパク質を用いることの潜在的な利点は、狂犬病ワクチンの広範囲の使用による、ヒトおよび他の動物に対するその毒性の詳細な知識である。特に、カナリア痘組み換えウイルスから発現される狂犬病糖タンパク質のヒトワクチンとしての使用について第１相臨床試験が報告されており（フリース（Ｆｒｉｅｓ）他，１９９６ Ｖａｃｃｉｎｅ １４， ４２８−４３４）、これらの試験はそのワクチンはヒトにおける使用について安全であったと結論した。

突然変異型、異型、ホモログ、および断片
本発明の一実施形態では、本発明に用いられるレトロウイルスベクター系はエンベロープタンパク質の突然変異型、異型、ホモログ、または断片を用いて偽型化することができる。

「野生型」の語は、天然タンパク質（すなわちウイルスタンパク質）と同一である一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを意味するのに用いられる。

「突然変異型」の語は、野生型配列とは１つ以上のアミノ酸付加、置換、または欠失で異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを意味するのに用いられる。突然変異型は天然に生じうるかまたは、人工的に作製しうる（たとえば部位特異的突然変異誘発によって）。好ましくは突然変異型は野生型配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。好ましくは突然変異型は野生型配列全体にわたって２０個以下の突然変異を有する。より好ましくは突然変異型は野生型配列全体にわたって１０個以下の突然変異、非常に好ましくは５個以下の突然変異を有する。

「異型」の語は、野生型配列とは異なる天然に存在するポリペプチドを意味するのに用いられる。異型は同一のウイルス株内で見出されうる（すなわちそのタンパク質の２個以上のアイソフォームが存在する場合）かまたは別の株で見出されうる。好ましくは異型は野生型配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。好ましくは異型は野生型配列全体にわたって２０個以下の突然変異を有する。より好ましくは異型は野生型配列全体にわたって１０個以下の突然変異、非常に好ましくは５個以下の突然変異を有する。

ここでは、「ホモログ」の語は、野生型アミノ酸配列および野生型ヌクレオチド配列と一定のホモロジーを有するものを意味する。ここでは、「ホモロジー」の語は、「同一性」と同一視することができる。

この背景では、相同な配列は、対象配列と少なくとも７５、８５または９０％同一でありうる、好ましくは少なくとも９５または９８％同一でありうるアミノ酸配列を含むものとする。典型的には、ホモログは対象アミノ酸配列と同一の活性部位などを含む。ホモロジーはまた類似性（すなわち類似した化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）の点から考えることもできるが、本発明との関連ではホモロジーを配列同一性の点から表すのが好ましい。

この背景では、相同な配列は、対象配列と少なくとも７５、８５または９０％同一でありうる、好ましくは少なくとも９５または９８％同一でありうるヌクレオチド配列を含むものとする。典型的には、ホモログは対象配列と同一の、活性部位などをコードする配列を含む。ホモロジーはまた類似性（すなわち類似した化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）の点から考えることもできるが、本発明との関連ではホモロジーを配列同一性の点から表すのが好ましい。

ホモロジー比較は、目視によって、またはより普通には、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて実施することができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、２つ以上の配列間の％ホモロジーを計算することができる。

％ホモロジーは連続配列にわたって計算することができ、すなわち一方の配列を他方の配列と整列させて、一方の配列中の各アミノ酸を他方の配列の対応するアミノ酸と、一度に一残基直接比較することができる。これは「ギャップ無し」整列と呼ばれる。典型的には、そのようなギャップ無し整列は相対的に短い数の残基にわたってだけ実施される。

これは非常に単純で一貫した方法であるが、これはたとえば、他の点では同一である一対の配列で、１つの挿入または欠失が、以降のアミノ酸残基を整列から押し出し、全体の整列が実施される際にそのようにして潜在的に％ホモロジーの大幅な低下を結果として生じることを考慮していない。このため、大部分の配列比較方法は、全体のホモロジー得点に過度に失点を課すことなく、可能な挿入および欠失を考慮に入れた最適整列を生じるように設計されている。これは、局所的ホモロジーの最大化を試みるように、配列整列中に「ギャップ」を挿入することによって達成される。

しかし、これらのより複雑な方法は、同数の同一なアミノ酸について、可能な限り少数のギャップ（比較される２つの配列間のより高い関連性を反映する）を持つ配列整列が、多数のギャップを持つものよりも高得点を取るように、整列中に生じる各ギャップに「ギャップ失点」を割り当てる。ギャップの存在に相対的に高いコスト、およびそのギャップ中の後続の各残基についてより小さい失点を課す「アフィンギャップコスト」が典型的には用いられる。これは最も広く用いられるギャップ採点系である。高いギャップ失点はもちろん、ギャップがより少ない、最適化された整列を生じる。大部分の整列プログラムは、ギャップ失点を改変することができる。しかし、配列比較のためのそのようなソフトウェアを用いる場合は、既定値を用いることが好ましい。たとえばＧＣＧウィスコンシン・ベストフィット（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ）パッケージを用いる場合は、アミノ酸配列についてのギャップ失点既定値は、１ギャップについて−１２、伸長ごとに−４である。

最大％ホモロジーの計算は、したがって、第一にギャップ失点を考慮した最適整列の作製を要する。そのような整列を実施するために適したコンピュータープログラムはＧＣＧウィスコンシン・ベストフィット（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ）パッケージである（米国ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；デベロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）他， １９８４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２；３８７）。配列比較を実施することができる他のソフトウェアの例は、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）パッケージ（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，１９９９前記−１８章を参照）、ファスタ（ＦＡＳＴＡ）（アチュール（Ａｔｓｃｈｕｌ）他，１９９０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４０３−４１０）および比較ツールのジーンワークス（ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ）一式を含むがそれらに限定されない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡは共にオフラインおよびオンライン検索に利用可能である（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，１９９９前記、７−５８から７−６０ページ参照）。しかし、一部の用途には、ＧＣＧベストフィット（Ｂｅｓｔｆｉｔ）プログラムを用いるのが好ましい。ブラスト２シーケンス（ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）という新しいツールもまた、タンパク質およびヌクレオチド配列を比較するために利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７４（２）； ２４７−５０； ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７７（１）； １８７−８およびｔａｔｉａｎａ@ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。

最終的な％ホモロジーは同一性に関して測定することができるが、整列過程自体は典型的には、全か無か（ａｌｌ−ｏｒ−ｎｏｔｈｉｎｇ）の対比較には基づかない。代わりに、化学的類似性または進化的距離に基づく対比較ごとに得点を割り当てる、換算類似性得点行列が一般的に用いられる。普通に用いられるそのような行列の一例は、ＢＬＡＳＴプログラム一式に用いられる既定値行列の、ＢＬＯＳＵＭ６２行列である。ＧＣＧウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）プログラムは一般的に、公開の既定値かまたは、もしあれば個別のシンボル比較表かのどちらかを用いる（さらなる詳細は取扱説明書を参照）。一部の用途には、ＧＣＧパッケージ用の公開既定値、または他のソフトウェアの場合にはＢＬＯＳＵＭ６２といった既定値行列を用いることが好ましい。

ソフトウェアが最適整列を一旦作製すると、％ホモロジー、好ましくは％配列同一性を計算することが可能である。ソフトウェアは典型的にはこれを配列比較の一部として実施し、数値結果を生成する。

配列はまた、サイレント変化を生じその結果として機能的に等価な物質を生じるアミノ酸 残基の欠失、挿入、または置換を有しうる。物質の二次結合活性が保持される限り、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または残基の両親媒的性質における類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行いうる。たとえば、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む；正に荷電したアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含む；および、同様の親水性値を有する、非荷電の極性頭部基を持つアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。

保存的置換は、たとえば下記の表に従って行うことができる。２列目で同一区分にあり、および好ましくは３列目で同一行にあるアミノ酸は互いに置換が可能である；

本発明はまた、相同置換（置換および交換は両方ともここでは、既存のアミノ酸残基の、別の残基との置き替えを意味するように用いられる）、すなわち塩基性に塩基性、酸性に酸性、極性に極性、などといった同等の置換が起こりうることを包含する。非相同置換、すなわちある種類の残基から別の種類への置換もまた起こる可能性があり、または代替的にオルニチン（以後Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以後Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以後Ｏと呼ぶ）、ピリジル（ｐｙｒｉｙｌ）アラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、およびフェニルグリシンといった非天然アミノ酸を含めることを含む。

交換はまた、下記を含む非天然アミノ酸によっても行いうる；アルファ^*およびアルファ二置換^*アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸*、乳酸^*、トリフルオロチロシン^*、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン^*、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン^*、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン^*といった天然アミノ酸のハロゲン化誘導体、Ｌ−アリル−グリシン^*、β−アラニン^*、Ｌ−α−アミノ酪酸^*、Ｌ−γ−アミノ酪酸^*、Ｌ−α−アミノイソ酪酸^*、Ｌ−ε−アミノカプロン酸^#、７−アミノヘプタン酸^*、Ｌ−メチオニンスルホン^#*、Ｌ−ノルロイシン^*、Ｌ−ノルバリン^*、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン^*、Ｌ−ヒドロキシプロリン^#、Ｌ−チオプロリン^*、４−メチル−Ｐｈｅ^*、ペンタメチル−Ｐｈｅ^*といったフェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）^#、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）^*、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）^*、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸）^*、Ｌ−ジアミノプロピオン酸⁽およびＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）^*。記号*は上記の考察の目的に用いられ（相同または非相同置換に関して）、誘導体の疎水的性質を示し、一方で#は誘導体の親水的性質を示すのに用いられ、#*は両親媒的性質を示す。

異型アミノ酸配列は、グリシンまたはβ−アラニン残基といったアミノ酸スペーサーに加えて、メチル、エチル、またはプロピル基といったアルキル基を含む、配列の任意の２個のアミノ酸残基間に挿入することができる適当なスペーサー基を含みうる。他の形の変化は、ペプトイド型の１つ以上のアミノ酸残基の存在を含み、当業者によく理解される。疑いを避けるために、「ペプトイド型」は、α−炭素置換基がその残基のα−炭素上でなく窒素原子上にある異型アミノ酸残基をいうのに用いられる。ペプトイド型のペプチドを調製するための過程は本分野で既知であり、たとえばサイモン（Ｓｉｍｏｎ）ＲＪ 他， ＰＮＡＳ （１９９２） ８９（２０），９３６７−９３７１およびホーウェル（Ｈｏｒｗｅｌｌ）ＤＣ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （１９９５） １３（４），１３２−１３４。

「断片」の語は、ポリペプチドが野生型アミノ酸配列の一部を含むことを示す。断片は配列の１つ以上の大きな連続部分または複数の小さな部分を含みうる。そのポリペプチドはまた配列の他の要素も含むことができ、たとえば、それは別のタンパク質との融合タンパク質でありうる。好ましくはそのポリペプチドは、野生型配列の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６５％、非常に好ましくは少なくとも８０％を含む。

機能に関しては、突然変異型、異型、ホモログ、または断片は、適当なベクターを偽型化するのに用いられた場合、細胞に形質導入することができる。

本発明で用いられるレトロウイルスベクターは、ここに示すヌクレオチド配列（ここに示すものの相補配列を含む）とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含みうる。好ましい一態様では、本発明は、本発明のヌクレオチド配列と厳密条件下で（たとえば６５℃および０．１ＳＳＣ）、ここに示すヌクレオチド配列（ここに示すものの相補配列を含む）とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を包含する。

ＮＯＩ
本発明では、１つ以上のＮＯＩ（目的のヌクレオチド配列）を標的細胞へｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで配送することができる。

本発明にしたがって、異種ＮＯＩでありうる１つ以上のＮＯＩで置換または補完されるように、ウイルスゲノムを操作することが可能である。

「異種」の語は、天然には結合していない核酸配列またはタンパク質配列と結合した、核酸配列またはタンパク質配列をいう

本発明では、ＮＯＩの語は任意の適当なヌクレオチド配列を含み、完全な天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡ配列である必要はない。したがって、ＮＯＩはたとえば、合成ＲＮＡ／ＤＮＡ配列、組み換えＲＮＡ／ＤＮＡ配列（すなわち組み換えＤＮＡ技術を用いて調製された）、ｃＤＮＡ配列、または部分ゲノムＤＮＡ配列であることができ、その組み合わせを含む。配列はコード領域である必要はない。コード領域である場合は、完全なコード領域である必要はない。加えて、そのＲＮＡ／ＤＮＡ配列はセンス方向またはアンチセンス方向であることができる。好ましくは、それはセンス方向である。好ましくは、配列はｃＤＮＡを含むかまたはｃＤＮＡから転写される。

レトロウイルスベクターゲノムは一般的に、５'末端および３'末端のＬＴＲ、１つ以上のＮＯＩを挿入するための適当な挿入部位、および／またはウイルス産生細胞中でゲノムがベクター粒子にパッケージングされることを可能にするパッケージングシグナルを含みうる。ベクターＲＮＡのＤＮＡへの逆転写およびプロウイルスＤＮＡの標的細胞ゲノムへの組み込みを可能にする、適当なプライマー結合部位および組み込み部位さえ存在しうる。好ましい一実施形態では、レンチウイルスベクター粒子は逆転写系（適合性逆転写およびプライマー結合部位）および組み込み系（適合性インテグラーゼおよび組み込み部位）を有する。

ＮＯＩは目的のタンパク質（「ＰＯＩ」）をコードすることができる。このようにして、標的細胞における外来遺伝子の発現の効果を調べるのに、レトロウイルス配送系を用いることができる。たとえば、レトロウイルス配送系を用いて、標的部位に及ぼす特定の作用に関してｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることができる。

ＮＯＩは標的部位において遺伝子の発現を遮断または阻害する能力を有しうる。たとえば、ＮＯＩはアンチセンス配列または干渉するＲＮＡ配列でありうる。アンチセンス技術を用いた遺伝子発現の阻害はよく知られている。

ＮＯＩまたはそれに由来する配列は、標的部位において特定遺伝子の発現を「ノックアウト」する能力を有しうる。いくつかの「ノックアウト」戦略が本分野で既知である。たとえば、ＮＯＩは、特定遺伝子の発現を妨害するように標的部位の細胞のゲノムに組み込まれる能力を有しうる。ＮＯＩは、たとえば、早期終止コドンを導入することによって、下流コード配列を読み枠から外すことによって、またはコードされたタンパク質の折りたたみ能力に影響を及ぼすことによって（それによってその機能に影響する）、発現を妨害しうる。

代替的に、ＮＯＩは標的部位において遺伝子の異所性発現を促進または誘導する能力を有しうる。ＮＯＩまたはそれに由来する配列は、特定遺伝子の発現を「ノックイン」する能力を有しうる。

特定の遺伝子を発現するかまたは特定の遺伝子の発現を欠く、形質導入された細胞は、創薬および標的評価に用途を有する。その発現系を用いて、どの遺伝子が標的組織細胞に対して望ましい作用を有するかを判定することができる。

本発明のウイルス配送系によって配送されたＮＯＩは、選択遺伝子、またはマーカー遺伝子であることができる。多数の異なる選択可能なマーカーが、レトロウイルスベクターにおける使用に成功している。

本発明のウイルス配送系によって配送されたＮＯＩは、その遺伝子自身が治療効果を導く能力を有しうるかまたは治療効果を導く能力を持つ産物をコードしうるという意味で、治療遺伝子であることができる。

本発明にしたがって、適当なＮＯＩは、下記のような治療および／または診断用途のものを含むがそれらに限定されない；サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗酸化剤分子、組み換え免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、酵素、免疫共刺激分子、免疫調節分子、アンチセンスＲＮＡ、標的タンパク質の種横断優性阻害突然変異型、毒素、条件毒素、抗原、腫瘍抑制因子タンパク質および増殖因子、膜タンパク質、血管作用性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質およびリボザイム、およびその誘導体（たとえば付随するレポーター基を持つ）をコードする配列。ＮＯＩはまた、プロドラッグ活性化酵素をコードすることができる。

ここで用いられる「抗体」は、完全な免疫グロブリン分子、またはその一部、またはそのバイオイソスターまたはミメティック、またはその誘導体、またはその組み合わせを含む。その一部の例は；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）'₂、およびＦｖを含む。バイオイソスターの例は、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）断片、キメラ抗体、二価抗体を含む。

「ミメティック」の語は、抗体と同じ結合特異性を有する、ペプチド、ポリペプチド、抗体、または他の有機化学物質でありうる化学物質に関する。

ここで用いられる「誘導体」の語は、抗体の化学的修飾を含む。そのような修飾の例は、アルキル、アシル、またはアミノ基による水素の交換である。

スクリーニング法
別の態様では、本発明はまた、スクリーニング法およびそのような方法によって単離可能な調節因子、およびそのような因子の用途に関する。

一実施形態では、本発明は細胞についての調節因子に関するスクリーニングのための方法を提供し、その方法は下記の段階を含む；
（ｉ） 標的細胞を提供する；
（ｉｉ） 複数の候補化合物をコードすることができるｃＤＮＡライブラリ を、本発明のレトロウイルスベクターを用いて細胞に形質導入する；
（ｉｉ） 候補化合物の発現を監視する；および
（ｉｉｉ） 標的細胞の活性を調節することができる候補化合物に関してスク リーニングする。

ｃＤＮＡライブラリは、レンチウイルスベクター中に構築されたリボザイムライブラリであることができる。リボザイムライブラリは、ハンマーヘッドリボザイム、ＥＧＳ、またはグループＩＩイントロンリボザイムを含むことができるがそれらに限定されない。リボザイムライブラリは目的の細胞型にｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで形質導入するのに用いることができる。これらの細胞を次いで、目的の表現型に関してスクリーニングすることができる。遺伝子またはリボザイムに影響された遺伝子は、リボザイムのＰＣＲ分析によって明らかにすることができる。リボザイムに関する一般的教示については、国際公開第９９／４１３９７号パンフレットを参照。

好ましくはレトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターを用いてこれを行うことの利点は、それが初代（非分裂）細胞の形質導入を可能にすることである。

医薬組成物
本発明はまた、本発明のレトロウイルスベクターの、医薬組成物の製造における用途を提供する。医薬組成物は、ＮＯＩを、それを必要とする標的細胞へ配送するのに用いることができる。

医薬組成物は遺伝子治療によって個体を治療するのに用いることができ、ここで組成物は本発明に記載のレトロウイルスベクター系の治療上有効な量を含むかまたは産生することができる。

本発明の方法および医薬組成物は、ヒトまたは動物の対象を治療するのに用いることができる。好ましくは対象は哺乳類対象である。より好ましくは対象はヒトである。典型的には、医師が個別の対象について最適となる実際の投与量を決定し、投与量はその特定の患者の年齢、体重、および反応に応じて変化する。

組成物は随意的に、医薬品として許容されるキャリヤー、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含むことができる。キャリヤー、賦形剤または希釈剤の選択は、予定の投与経路および標準的な医療行為に関して選ぶことができる。医薬組成物は、キャリヤー、賦形剤または希釈剤として（またはそれに加えて）、任意の適当な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤、および標的組織部位へのウイルス進入を助けるかまたは増加させうる他のキャリヤー物質（たとえば脂質配送系のような）を含むことができる。

適当な場合には、医薬組成物は下記のいずれか１つ以上によって投与することができる；吸入、坐剤またはペッサリーの形で、ローション、液剤、クリーム、軟膏、または散布剤の形で局所的に、皮膚パッチを用いて、経口的にデンプンまたは乳糖といった賦形剤を含む錠剤の形で、または、カプセル剤または胚珠状で単独でまたは賦形剤と混合して、または、香料または着色料を含むエリキシル剤、液剤または懸濁剤の形で、または非経口的に、たとえば海綿体内に、静脈内に、筋肉内にまたは皮下に注射することができる。非経口投与のためには、組成物はたとえば溶液を血液と等張にするために十分な塩または単糖といった他の物質を含みうる、無菌水溶液の形で最善に用いることができる。口内または舌下投与のためには、組成物は従来の方法で処方することができる錠剤またはトローチ剤の形で投与することができる。

本発明で用いられるベクター系は、患者への直接注射によって便利に投与することができる。

疾患
本発明のベクター系による１つ以上の治療遺伝子の配送は、単独で、または他の治療または治療の構成要素と組み合わせて用いることができる。

たとえば、本発明のレトロウイルスベクターは、国際公開第Ａ−９８／０５６３５号パンフレットに列挙された疾患の治療に有用な１つ以上のＮＯＩを配送するのに用いることができる。参照の簡略化のため、その一覧の一部をここに提供する；がん、炎症または炎症性疾患、皮膚疾患、発熱、心血管作用、出血、凝固および急性期反応、カヘキシー、食欲不振症、急性感染、ＨＩＶ感染、ショック状態、移植片対宿主反応、自己免疫疾患、再灌流傷害、髄膜炎、偏頭痛およびアスピリン依存性抗血栓症；腫瘍増殖、浸潤および伝播、血管新生、転移、悪性腹水および悪性胸水；脳虚血、虚血性心疾患、変形性関節炎、慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、喘息、多発性硬化症、神経変性、アルツハイマー病、アテローム性硬化症、脳卒中、血管炎、クローン病および潰瘍性大腸炎；歯周炎、歯肉炎；乾癬、アトピー性皮膚炎、慢性潰瘍、表皮水疱症；角膜潰瘍形成、網膜症および外科創傷治癒；鼻炎、アレルギー性結膜炎、湿疹、アナフィラキシー；再狭窄、鬱血性心不全、子宮内膜症、アテローム性硬化症または内膜硬化症。

加えて、または別の方法では、本発明のレトロウイルスベクターは、国際公開第Ａ−９８／０７８５９号パンフレットに列挙された疾患の治療に有用な１つ以上のＮＯＩを配送するのに用いることができる。参照の簡略化のため、その一覧の一部をここに提供する；サイトカインおよび細胞増殖／分化活性；免疫抑制または免疫刺激活性（たとえばヒト免疫不全ウイルスによる感染を含む免疫不全を治療するため；リンパ球増殖の調節；がんおよび多数の自己免疫疾患の治療、および移植片拒絶を防ぐかまたは腫瘍免疫を誘導するため）；造血の調節、たとえば骨髄疾患またはリンパ性疾患の治療；たとえば創傷治癒、火傷、潰瘍、および歯周疾患および神経変性の治療のための、骨、軟骨、腱、靱帯および神経組織の増殖の促進；濾胞刺激ホルモンの阻害または活性化（生殖能の調節）；走化性／化学運動性活性（たとえば特定の細胞型を傷害または感染の部位へ動員するため）；止血活性および血栓溶解活性（たとえば血友病および脳卒中を治療するため）；抗炎症活性（たとえば敗血性ショックまたはクローン病を治療するため）；抗菌剤として；たとえば代謝または行動の調節因子として；鎮痛剤として；特定の不全症の治療；たとえば感染の治療に、医学または獣医学において。

加えて、または別の方法では、本発明のレトロウイルスベクターは、国際公開第Ａ−９８／０９９８５号パンフレットに列挙された疾患の治療に有用な１つ以上のＮＯＩを配送するのに用いることができる。参照の簡略化のため、その一覧の一部をここに提供する；マクロファージ阻害活性および／またはＴ細胞阻害活性およびしたがって、抗炎症活性；抗免疫活性、すなわち細胞性および／または体液性免疫反応に対する阻害作用、炎症に随伴しない反応を含む；マクロファージおよびＴ細胞の、細胞外マトリクス成分およびフィブロネクチンに接着する能力、およびＴ細胞におけるアップレギュレートされたｆａｓ受容体発現を阻害する；慢性関節リウマチを含む関節炎、過敏性、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、膠原病、および他の自己免疫疾患に伴う炎症、アテローム性硬化症、動脈硬化症、アテローム硬化性心疾患、再灌流傷害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性疾患、呼吸窮迫症候群または他の心肺疾患に伴う炎症、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎および消化管の他の疾患に伴う炎症、肝線維症、肝硬変または他の肝疾患、甲状腺炎または他の腺疾患、糸球体腎炎または他の腎および泌尿器疾患、耳炎または他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎または他の皮膚疾患、歯周疾患または他の歯科疾患、精巣炎または精巣・精巣上体炎、不妊症、精巣外傷または他の免疫関連精巣疾患、胎盤機能障害、胎盤機能不全、習慣流産、子癇、子癇前症および他の免疫および／または炎症性関連婦人科疾患、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜強膜炎、視神経炎、眼内炎症、たとえば網膜炎または嚢胞様黄斑浮腫、交感性眼炎、強膜炎、網膜色素変性症、変性眼底疾患の免疫および炎症性要素、眼外傷の炎症性要素、感染によって引き起こされる眼炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経症、たとえば緑内障濾過手術後の過度の瘢痕、眼インプラントに対する免疫および／または炎症反応、および他の免疫および炎症性関連眼疾患、自己免疫疾患または症状に伴う炎症、または、中枢神経系（ＣＮＳ）または任意の他の臓器の両方で、免疫および／または炎症抑制が有益である疾患、パーキンソン病、パーキンソン病の治療に由来する合併症および／または副作用、ＡＩＤＳ関連痴呆症候群、ＨＩＶ関連脳症、デビック病、シデナム舞踏病、アルツハイマー病および他の変性疾患、症状、またはＣＮＳ疾患、脳卒中（ｓｔｏｋｅｓ）の炎症性要素、ポリオ後症候群、精神疾患の免疫および炎症性要素、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性全脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、ギラン・バレー症候群、シデナム舞踏病（ｃｈｏｒａ）、重症筋無力症、特発性頭蓋内圧亢進症、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ＣＮＳ圧迫またはＣＮＳ外傷またはＣＮＳ感染の炎症性要素、筋萎縮症および筋ジストロフィーの炎症性要素、および、中枢および末梢神経系の免疫および炎症性関連疾患、症状または障害、外傷後炎症、敗血性ショック、感染症、手術または骨髄移植の炎症性合併症または副作用、またはその他の移植合併症および／または副作用、遺伝子治療のたとえばウイルスキャリヤーの感染による炎症性および／または免疫合併症および副作用、または体液性および／または細胞性免疫反応を抑制または阻害するＡＩＤＳに関連する炎症、単球または白血球増殖性疾患、たとえば白血病を、単球またはリンパ球の量を減らすことによって治療または改善すること、角膜、骨髄、臓器、レンズ、ペースメーカー、天然または人工皮膚組織といった天然または人工細胞、組織、および臓器の移植術の場合に移植片拒絶の防止および／または治療のため、を含む、望ましくない免疫反応および炎症を阻害する。

本発明はまた、遺伝子治療によって個体を治療するための医薬組成物を提供し、ここでその組成物は、１つ以上の配送可能な治療および／または診断ＮＯＩ、またはそれによって産生されたかまたはそれから得られたウイルス粒子を含む、本発明のレトロウイルスベクターの治療上有効な量を含む。医薬組成物はヒト用または動物用であることができる。典型的には、医師が個別の対象について最適となる実際の投与量を決定し、投与量はその特定の個体の年齢、体重、および反応に応じて変化する。

組成物は随意的に、医薬品として許容されるキャリヤー、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含むことができる。キャリヤー、賦形剤または希釈剤の選択は、予定の投与経路および標準的な医療行為に関して選ぶことができる。医薬組成物は、キャリヤー、賦形剤または希釈剤として（またはそれに加えて）、任意の適当な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤、および標的部位へのウイルス進入を助けるかまたは増加させうる他のキャリヤー物質（たとえば脂質配送系のような）を含むことができる。

適当な場合には、医薬組成物は下記のいずれか１つ以上によって投与することができる；吸入、坐剤またはペッサリーの形でローション、液剤、クリーム、軟膏、または散布剤の形で局所的に、皮膚パッチを用いて、経口的にデンプンまたは乳糖といった賦形剤を含む錠剤の形で、または、カプセル剤または胚珠状で単独でまたは賦形剤と混合して、または、香料または着色料を含むエリキシル剤、液剤または懸濁剤の形で、または非経口的に、たとえば海綿体内に、静脈内に、筋肉内にまたは皮下に注射することができる。非経口投与のためには、組成物はたとえば溶液を血液と等張にするために十分な塩または単糖といった他の物質を含みうる、無菌水溶液の形で最善に用いることができる。口内または舌下投与のためには、組成物は従来の方法で処方することができる錠剤またはトローチ剤の形で投与することができる。

本発明に記載のベクター系による１つ以上の治療遺伝子の配送は、単独で、または他の治療または治療の構成要素と組み合わせて用いることができる。治療することができる疾患は；がん、神経疾患、遺伝性疾患、心疾患、脳卒中、関節炎、ウイルス感染、および免疫系の疾患を含むがそれらに限定されない。適当な治療遺伝子は、腫瘍抑制因子タンパク質、酵素、プロドラッグ活性化酵素、免疫調節分子、抗体、組み換え免疫グロブリン様分子、融合タンパク質、ホルモン、膜タンパク質、血管作用性タンパク質またはペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗ウイルスタンパク質、アンチセンスＲＮＡ、およびリボザイムをコードするものを含む。

本発明に記載の治療方法の好ましい一実施形態では、プロドラッグ活性化酵素をコードする遺伝子を本発明のベクター系を用いて腫瘍へ配送し、その個体を次いで適当なプロドラッグを用いて治療する。プロドラッグの例は、リン酸エトポシド（アルカリホスファターゼと共に使用、センター（Ｓｅｎｔｅｒ）他， １９８８ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５； ４８４２−４８４６）；５−フルオロシトシン（シトシンデアミナーゼと共に、ミューレン（Ｍｕｌｌｅｎ）他１９９４ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４； １５０３−１５０６）；ドキソルビシン−Ｎ−ｐ−ヒドロキシフェノキシアセトアミド（ペニシリン−Ｖ−アミダーゼと共に（カー（Ｋｅｒｒ）他 １９９０ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ３１； ２０２−２０６）；グルタミン酸パラ−Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノベンゾイル（カルボキシペプチダーゼＧ２と共に）；セファロスポリンナイトロジェンマスタードカルバメート（ｂ−ラクタマーゼと共に）；ＳＲ４２３３（Ｐ４５０還元酵素と共に）；ガンシクロビル（ＨＳＶチミジンキナーゼと共に、ボレリ（Ｂｏｒｒｅｌｌｉ）他１９８８ Ｐｒｏｃ ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５； ７５７２−７５７６）、マスタードプロドラッグ、ニトロ還元酵素と共に（フリードロス（Ｆｒｉｅｄｌｏｓ）他 １９９７Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４０； １２７０−１２７５）、およびシクロホスファミドまたはイホスファミド（シトクロムＰ４５０と共に、チェン（Ｃｈｅｎ）他 １９９６ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６； １３３１−１３４０）を含む。

１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）を用いた細胞の感染は、感染性ウイルスを安定に産生する培養を結果として生じうる（１）。しかし、安定なＨＩＶ−１を基礎とするベクターパッケージング細胞を、ＨＩＶ−１ ｇａｇ−ｐｏｌをコードするプラスミドのトランスフェクションによって作製する試みは、一部のＨＩＶ−１感染細胞株によって分泌される１０００ｎｇ／ｍｌ（５）と比較して低レベルのｐ２４抗原（２０〜８０ｎｇ／ｍｌ）しか分泌しない細胞を結果として生じている（２−４）。これはＨＩＶ−１プロテアーゼの細胞毒性が原因でありうると考えられており（６）、ＨＩＶ−１ Ｇａｇ−Ｐｏｌ発現を誘導することができるパッケージング細胞株の構築に繋がっている（７−１０）。

我々は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）を基礎とするレトロウイルスベクターを用いたＨＩＶ−１Ｇａｇ−Ｐｏｌ発現カセットの導入は、ＨＩＶ−１ Ｇａｇの安定な、長期の、高レベル（最大８５０ｎｇ／ｍｌ）の発現を可能にすることを実証している。コドン最適化されたＨＩＶ−１ Ｇａｇ−Ｐｏｌ（１１）、ＨＩＶ−１ ＴａｔおよびＲｅｖ、およびＣ型レトロウイルスのエンベロープタンパク質を発現する、ＨＴ１０８０または２９３Ｔを基礎とするパッケージング細胞が構築された。ＨＩＶ−１ベクターの導入は、最大１０⁷ ２９３Ｔ感染単位／ｍｌ（２０ ２９３Ｔ 感染単位／細胞／日）を３ヶ月間にわたって培養中で産生することができるウイルス産生細胞を結果として生じた。

実験プロトコル（実施例１〜４用）
細胞株。ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）、２９３Ｔ、ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ，ＣＣｌ−１２１）およびすべての誘導体クローンは、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および抗生物質を添加したダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。

プラスミド。ＨＩＶパッケージング（ｐＣＭＶＲ８．９１）およびＶＳＶ−Ｇ（ｐＭＤＧ）プラスミドは（１２）に記載されている。ｐＣＮＣ−ＭＣＳは、ｐＣＮＣＧのＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩ短断片（１３）をＳａｃＩＩ−Ｘｈｏｌ−ＮｏｔＩリンカーで交換して構築された。ｐＣＭＶＲ８．９のＳａｃＩＩ−Ｘｈｏｌ断片は、ＨＩＶ−１ ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖ、ｔａｔ遺伝子およびＲＲＥを含むが、ｐＣＮＣ−ＭＣＳのＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ部位へ導入されてｐＣＮＣ−ＧＰＲＴを生じた。ｐＣＮＣ−ＳＹＮＧＰは、コドン最適化されたｇａｇ−ｐｏｌ配列を含むｐＳＹＮＧＰのＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩ断片（１１）を、ｐＣＮＣ−ＭＣＳのＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩ部位へ導入することによって構築された。ｐＣＮＣ−ＧＰを構築するために、ｐＣＭＶＲ８．９１をテンプレートとして用いるＰＣＲによってＨＩＶ ＲＲＥ配列を増幅し、ｐＣＮＣ−ＭＣＳのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ部位へ導入し、その後、ｐＣＭＶ８．９１のＳａｃＩＩ−ＳａＩＩ断片の、そのＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ部位への導入を行った。ｐＣＮＣ−ＴＡＴおよびｐＣＮＣ−ＲＥＶは、ｐＣＭＶＲ８．９１由来のＴａｔおよびＲｅｖｃＤＮＡを、ｐＣＮＣ−ＭＣＳのＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ部位へ導入することによって構築された。ｐＨＲＳＩＮ−ＣＳＧＷは（１５）に記載されている。その非自己不活性化誘導体ｐＨＶは、ｐＨＲＳＩＮ−ＣＳＧＷのＮｒｕＩ−ＸｈｏＩ断片を、ｐＨ７ＧのＮｒｕＩ−ＳａＩＩ部位へ導入することによって構築された（１１）。レトロウイルスエンベロープベクターｐＡＬＦおよびｐＧ＋Ｆは報告された（１６，１８）。ｐＲＤｐｒｏＬＦは、ｐＲＤＬＦのＢｃＩＩ−Ａｐａｌ断片（１６）を、ＢｃＩＩ−Ａｐａｌ断片ｐｈＣＭＶＲＤｐｒｏで交換することによって構築された。

トランスフェクションおよび選択。トランスフェクションはリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて実施した。ｐＣＮＣ−ＧＰＲＴおよびｐＣＮＣ−ＳＹＮＧＰトランスフェクションされた細胞を、Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて選択し、Ｇ４１８耐性クローンを２から３週間後に単離した。エンベローププラスミドをトランスフェクションされた細胞を、フレオマイシン；３０μｇ／ｍｌを用いてｐＡＬＦ、およびｐＲＤｐｒｏＬＦをトランスフェクションされた細胞について、および７μｇ／ｍｌを用いてｐＧ＋Ｆをトランスフェクションされた細胞について選択した。フレオマイシン耐性コロニーを３週間後に単離した。ベクターゲノムプラスミド（ｐＨＶおよびｐＳＩＮ−ＣＳＧＷ）の安定なトランスフェクションのために、ベクタープラスミドをｐＰＵＲ（クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））と２０；１の比率で同時トランスフェクションした。ピューロマイシン３μｇ／ｍｌを用いた３週間の選択後、１５個のピューロマイシンに対して安定なコロニーが単離され、残りの耐性コロニー（>５００個）は一括の集団として採取した。

ベクター産生および形質導入。感染性ＣＮＣ−ＧＰＲＴ、ＣＮＣ−ＳＹＮＧＰ、ＣＮＣ−ＧＰ、ＣＮＣ−ＲＥＶおよびＣＮＣ−ＴＡＴ ＭＬＶビリオンを、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって、ベクター対パッケージング対ＶＳＶ−Ｇプラスミドの３：２：１の重量比で、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を用いて産生した（１３）。細胞上清は超遠心分離（１０，０００ｘｇ、１．５ｈｒ）によって濃縮し、ＨｅＬａ、ＨＴ１０８０、２９３Ｔ細胞の形質導入に用いた。ＧＰＲＴまたはＳＹＮＧＰクローンを確立するために、感染効率（ＭＯＩ）４のＣＮＣ−ＧＰＲＴベクターで３回、またはＭＯＩ２のＣＮＣ−ＳＹＮＧＰベクターで１回、細胞を感染させた。ＨｅＬａまたはＨＴ１０８０細胞は１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて３週間選択し、２９３Ｔ細胞は限界希釈法によってクローニングし、クローンをｐ２４発現についてスクリーニングした。ＨｅＬａ−ＧＰ＋Ｒクローンに関しては、ＨｅＬａ細胞をＣＮＣ−ＧＰベクターを用いてＭＯＩ４にて２回形質導入し、次いでＧ４１８中で２週間選択した。Ｇ４１８耐性細胞はさらにＣＮＣ−ＲＥＶベクターを用いてＭＯＩ２０にて形質導入し、次いで限界希釈法によってクローニングした。ＨｅＬａ−ＧＰＲＴ１および２９３Ｔ−ＧＰＲＴ１細胞はＣＮＣ−ＲＥＶベクターを用いてＭＯＩ＝２０にて形質導入し、さらに限界希釈法によってクローニングして、ＨｅＬａ ＧＰＲＴ１＋Ｒ１（クローン２２個から１個）および２９３Ｔ ＧＰＲＴ１＋Ｒ１細胞（クローン３２個から１個）を選択した。ＨＴ−ＳＴＡＲおよびＳＴＡＲ細胞を確立するために、ＨＴ−ＳＹＮＧＰ１および２９３Ｔ−ＳＹＮＧＰ１クローンを、Ｔａｔ−およびＲｅｖ−発現ＭＬＶベクターを用いてそれぞれＭＯＩ＝２０にて形質導入し、限界希釈法によってクローニングした。ＨＴ−ＳＴＡＲクローン（２８個中１個）およびＳＴＡＲクローン（３４個中１個）を、ｐＨＲＳＩＮ−ＣＳＧＷおよびｐＭＤＧのトランスフェクションによってＴａｔ−およびＲｅｖ−発現についてのスクリーニング後に選択した。ＶＳＶ−Ｇ偽型化Ｈ７ＧおよびＨＶベクターは、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって、ベクター対ｐＣＭＶＲ８．９１対ｐＭＤＧプラスミドの３：２：１の重量比で、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を用いて産生した。ベクターを採取し、０．４５μｍフィルターを通し、超遠心分離によって濃縮した。ベクターを用いてパッケージング細胞株を形質導入し、ＨＩＶベクター産生細胞株を確立した。

Ｇａｇ−Ｐｏｌ−安定クローンからのベクターレスキュー。ＧＰＲＴ、ＧＰＲＴ１＋Ｒ１細胞がＨＩＶ−１ベクターをパッケージングする能力を評価するために、ｐＳＩＮ−ＣＳＧＷおよびｐＭＤＧの重量比３：１での一過性トランスフェクションによってベクターレスキュー実験を実施した。ＧＰ＋Ｒ細胞およびＳＹＮＧＰ細胞の場合には、ＴａｔおよびＲｅｖを発現するプラスミドであるｐＣＮＣ−ＲＥＶおよびｐＣＮＣ−ＴＡＴもまた、ベクター対ＶＳＶ−Ｇ対Ｔａｔ対Ｒｅｖプラスミドの重量比３：１：１：１でトランスフェクションされた。

ウイルス力価測定。力価を測定するため、２４ウェルプレートのウェル当たり計２ｘ１０⁵個の２３９Ｔ細胞に、ポリブレン８μｇ／ｍｌの存在下で６時間、ウイルス上清の連続希釈を接種した。感染した細胞の数を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によるＦＡＣＳｃａｎおよびセル・クエスト（ＣＥＬＬ ＱＵＥＳＴ）ソフトウェア（ベクトン・ディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いた少なくとも４８時間後のｅＧＦＰ発現の測定によって測定した。個々のウイルス産生細胞株についての力価は、細胞集団の５〜２０％がｅＧＦＰ−陽性であったデータ点から計算した。

Ｐ２４免疫染色。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、マルチウェルスライドグラスに塗沫して風乾した。アセトンを用いて２０分間固定後、細胞を抗ｐ２４マウスモノクローナル抗体３８；９６Ｋ（ＡＩＤＳ試薬ＭＲＣプログラム（ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ ＭＲＣ Ｐｒｏｇｒａｍ）１；２００）と共に３０分間３７℃にてインキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した後、二次抗体であるＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリンと共に３０分間３７℃にてインキュベートした。細胞をその後ＰＢＳで２回洗浄し、共焦点顕微鏡法で観察した（クリプトン−アルゴンレーザーを装備したＭＲＣ１０２４[バイオラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）]）。

Ｐ２４ ＥＬＩＳＡ。細胞１ｘ１０⁶個を６ウェルプレートで２ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））を用いて２４時間培養し、連続希釈した試料を、抗ｐ２４抗体Ｄ７３２０ （アールト・バイオリエージェント社（Ａａｌｔｏ ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）、ダブリン）、 ＥＨ１２ＥＩ−ＡＰ （ＭＲＣ ＡＤＰ試薬、 ＡＤＰ４５２）、およびｐ２４標準品（ＭＲＣ ＡＤＰ試薬、ＡＤＰ６２０）を用いたＥＬＩＳＡによって、ｐ２４の検出について分析した。

イムノブロッティング分析。細胞１０⁶個を６ウェルプレートで２ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭを用いて２日間培養した。５ｘ１０⁴個の細胞に由来する総タンパク質を細胞溶解物として用いた。培養上清は、４５０ｎｍ孔径のシリンジフィルターを通した濾過および１００，０００ｇで９０分間の超遠心分離後に用いた。試料は１２．５％変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離した。ｐ２４ＣＡおよび前駆体タンパク質の発現は、抗ｐ２４マウスモノクローナル抗体３８；９Ｋによって検出した。

安全性測定法。ＲＣＲまたはＧａｇ／Ｐｏｌ機能導入の検出のために、１０⁶個の２９３ＴまたはＶＡＴ−７細胞を、２ｘ１０⁷ ２９３Ｔ ｉｕのベクターを用いて６−ウェルプレート中で一夜感染させた。表示の時間の継代および増殖後に、細胞の一部を１０ｃｍシャーレに播種し、３日後に培地１２ｍｌを採取して、１５００ｇで９０分間４℃にて遠心分離した。結果として得られた沈澱を２２０μｌのＯｐｔｉＭＥＭに再懸濁し、２ｘ１０⁵個の２９３Ｔ細胞をポリブレン８μｇ／ｍｌの存在下で感染させるのに用いた。４日後、緑色蛍光を発するコロニーを計数することによって力価を測定した。Ｇａｇ−Ｐｏｌ配列導入の検出は、ネステッドＰＣＲによってｇａｇ特異的プライマーおよびアンプリタックゴールド（Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ）（パーキン・エルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を用いて実施した。Ｆ１／Ｒ１およびＦ２／Ｒ２を野生型配列に用い、ＳｙｎＦ１／ＳｙｎＲ１およびＳｙｎＦ２／ＳｙｎＲ２を合成ｇａｇに用いた。
Ｆ１； ＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＴＧＣＡＧＧＧＣＣＴＡＴ
Ｒ１； ＴＣＴＴＴＧＣＣＡＣＡＡＴＴＧＡＡＡＣＡＣＴＴＡＡＣ
ＳｙｎＦ１； ＧＧＴＧＣＡＣＧＣＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＣＡＣＣＧＧ
ＳｙｎＲ１； ＧＣＣＡＣＡＧＴＴＧＡＡＧＣＡＣＴＴＧＡＣＧＡＴＣＴ
Ｆ２； ＡＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＣＡＴＡＧＣＡＧＧＡＡＣＴＡＣ
Ｒ２； ＧＣＣＴＴＴＣＴＧＴＡＴＣＡＴＴＡＴＧＧＴＡＧＣＴ
ＳｙｎＦ２； ＡＣＧＧＧＧＣＴＣＡＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＧＡＡＣＧＡＣ
ＳｙｎＲ２； ＡＡＡＧＴＴＧＣＣＧＣＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＧＡＴＧＧ
細胞ＤＮＡ１μｇを、約１０⁵個の細胞の等価物として用いた。１回目のＰＣＲ反応の１／２０をネステッドＰＣＲの２回目のためのテンプレートとして用いた。感度を測定するために、プラスミドｐＣＭＶＲ８．９１およびｐＳＹＮＧＰの連続希釈を用いた。

実施例１
ベクターｐＣＮＣ−ＧＰＲＴ（図１Ｂに示す）およびｐＣＮＣ−ＳＹＮＧＰ（図１Ｃに示す）は、ｐＣＭＶＲ８．９１（１２）またはｐＳＹＮＧＰ（１１）にそれぞれ由来するＨＩＶ−１配列を、図１Ａに示すＭＬＶベクターｐＣＮＣ−ＭＣＳへ挿入することによって構築した。

ｐＣＮＣ−ＧＰＲＴおよびｐＣＮＣ−ＳＹＮＧＰは、（ａ）ＨｅＬａまたはＨＴ１０８０細胞へ直接トランスフェクションされたか、または（ｂ）まず一過性ＭＬＶパッケージング系を用いて（１３）ＭＬＶビリオンへパッケージングされ、それを次いでＨｅＬａ、ＨＴ１０８０、または２９３Ｔ細胞を感染させるのに用いた。

トランスフェクションされたかまたは感染したＨｅＬａおよびＨＴ１０８０を、Ｇ４１８中でｎｅｏ遺伝子の存在について選択した。感染した２９３Ｔ細胞は、すでにＧ４１８耐性であるため、限界希釈法によってクローニングした。個々のクローンを次いでＨＩＶ−１ ｐ２４の存在について免疫蛍光法によって分析した。

図２は、どちらかのウイルスによるＨｅＬａ細胞の、トランスフェクションでなく感染が、ＨＩＶ−１ｐ２４を発現したクローンをより高頻度に生じたことを示す。

ＨｅＬａ細胞のトランスフェクションによって生じた２つの稀な陽性クローンにおけるｐ２４発現のレベルは相対的に低かったことを示す、免疫蛍光測定法の結果の例を図３に示す。

ＣＮＣ−ＳＹＮＧＰベクターによる３つすべての細胞株の感染において、ＣＮＣ−ＧＰＲＴベクターよりも高頻度の陽性クローンが生じた（図２）。

これらのデータは、レトロウイルス感染の結果として安定なＨＩＶ−１Ｇａｇ−Ｐｏｌ発現が生じうることを支持する。

実施例２
細胞がＨＩＶ−１ベクターをパッケージングする能力を、ベクターｐＳＩＮ−ＣＳＧＷ（１５）（図７Ｂに示す）および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）−Ｇタンパク質発現プラスミド（１２）の一過性トランスフェクションによって評価した。ＧＰ＋Ｒ細胞およびＳＹＮＧＰ細胞の場合には、ベクター発現を可能にするために、ＴａｔおよびＲｅｖを発現するプラスミドであるｐＣＮＣ−ＲＥＶおよびｐＣＮＣ−ＴＡＴもまた同時トランスフェクションした。一過性にトランスフェクションされた細胞に由来する上清を、２９３Ｔ細胞を感染させるのに用い、ＧＦＰ発現を監視した。

追加のＲｅｖ発現の効果もまた、追加のＲｅｖを発現するためのＭＬＶベクターＣＮＣ−ＲＥＶを用いてＨｅＬａ ＧＰＲＴ１＋Ｒ１および ２９３Ｔ ＧＰＲＴ１＋Ｒ１クローンを構築することによって、ｐＣＮＣ−ＧＰＲＴ細胞において検討した。

図４は、追加のＲｅｖがベクター産生を促進したこと、およびＧＰＲＴ１＋Ｒ１ ２９３Ｔクローンが、この測定で最高の１０⁶ｉ．ｕ．／ｍｌの力価を産生したことを示す。ＳＹＮＧＰを発現している細胞のうち、２９３Ｔクローンが図４に示す通り最高の力価を与えた。

我々はまた、いわゆる「第３世代」ＨＩＶ−１パッケージング構造（１４）を、ＨＩＶ−１ｇａｇ−ｐｏｌおよびＲＲＥ配列がｐＣＭＶＲ８．９１に由来する（１２）ＭＬＶベクターＣＮＣ−ＧＰ（図１Ｄに示す）を構築することによって検討した。これを用いてＨｅＬａ細胞を感染させ、ここでもＭＬＶベクターＣＮＣ−ＲＥＶを用いてＲｅｖを供給し、ＣＰ＋Ｒクローンを作製した。

図４は、これらの細胞がＧＰＲＴ１＋Ｒ１細胞より高い力価を与えなかったことを示す。明らかに、これらの測定はまた、複数プラスミドを用いる相対的な細胞のトランスフェクション効率を反映する。

図５は、ＣＮＣ−ＧＰＲＴでトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞とＣＮＣ−ＧＰＲＴおよびＣＮＣ−ＳＹＮＧＰを感染させたＨｅＬａ細胞に由来する細胞溶解物および上清のイムノブロットを示す。ベクター産生と一致して、Ｒｅｖ発現の増加は、ＨＩＶ−１ Ｇａｇ発現のレベルおよびＣＮＣ−ＧＰＲＴによる分泌を向上させた。我々は、細胞溶解物中のＧａｇに対する上清中のＧａｇの比はＨｅＬａウイルス産生細胞のほうが低いこと、および成熟ｐ２４に対する前駆体Ｇａｇの比はＨｅＬａ由来の上清のほうがＨＴ１０８０または２９３Ｔよりも高いことに注目した。これらの結果は、ＨｅＬａ細胞は他の細胞株よりも、ウイルス放出および成熟に関して効率が低いことを示唆する。図６は細胞上清中のｐ２４レベルを示す；いくつかのＳＹＮＧＰ ２９３ＴおよびＨＴ１０８０クローンはＨｅＬａ細胞よりも多く産生する。

実施例３
安定なパッケージング細胞を作製するために、我々は、毒性が無く、ＨＩＶ−１の相対的に高力価の偽型を産生することができ、臨床遺伝子治療用途に幅広く用いられているため、ＭＬＶおよび他のＣ型レトロウイルスのエンベロープタンパク質を発現することを選んだ。

２９３Ｔ ＧＰＲＴ１＋Ｒ１細胞、ＭＬＶベクターＣＮＣ−ＴＡＴおよびＣＮＣ−ＲＥＶを用いてＴａｔおよびＲｅｖを発現するように操作されたＨＴ１０８０ ＳＹＮＧＰ１細胞のクローン（ＨＴ−ＳＴＡＲで表す、クローン２８個中の１個）、および、ＭＬＶベクターを用いてＴａｔおよびＲｅｖを発現するように操作された２９３Ｔ ＳＹＮＧＰ１細胞のクローン（ＳＴＡＲで表す、クローン３４個中の１個）を以降の試験のために選択した。

細胞を、ＭＬＶ４０７０Ａのエンベロープ（Ａｍｐｈｏ（１６）で表す）、ＨＩＶプロテアーゼ部位をＲペプチド切断部位に導入したネコ内在性ウイルスＲＤ１１４（Ｒｄｐｒｏで表す）、またはＭＬＶ細胞質尾部を有するテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）（ＧＡＬＶ＋で表す（１８））を発現するベクターｐＡＬＦ、ｐＲＤｐｒｏＬＦ、またはｐＧ＋Ｆを用いてトランスフェクションした。それぞれの場合で、トランスフェクションされた細胞はフレオマイシン中で選択され、高レベルのエンベロープを発現しているクローンが選択された（クローン１２個から１個）。Ｒｅｖ非依存性ｐＨ７Ｇ（１１）（図７Ａ）、Ｒｅｖ依存性ｐＨＲＳＩＮ−ＣＳＧＷ（１５）（図７Ｂ）、またはその非自己不活性化誘導体ｐＨＶ（図７Ｃ）という３種類のＨＩＶ−１ベクターのパッケージングを比較した。

図８は、ＳＴＡＲ−Ａｍｐｈｏ細胞は、感染によるベクターゲノムの導入後の一括集団から、１０⁷ｉ．ｕ．／ｍｌを超える最高力価のウイルスを産生したことを示す。ベクター中のＲｅｖの存在は、ＳＴＡＲ細胞において力価に影響せず、パッケージング細胞中のＲｅｖのレベルが十分であったことを示唆する（図８）。

ＳＴＡＲ−Ａｍｐｈｏ細胞のトランスフェクションおよび選択後に、最大１０⁷ｉ．ｕ．／ｍｌの自己不活性化ベクターを産生するクローンを用いて、十分な力価のウイルスを産生することもまた可能であった（図８）。

ＳＴＡＲ細胞によるウイルス産生のレベルは、長期培養後に安定であり（図９）、ウイルスを遠心分離によって濃縮して最大５ｘ１０⁹ｉ．ｕ．／ｍｌの力価を有するストックを作製することができた。

実施例４
安定なパッケージング細胞によって産生されたＨＩＶ−１ベクターの安全性を評価するために、我々はまず、ＧＰＲＴ１＋Ｒ１−Ａｍｐｈｏ細胞またはＳＴＡＲＲＤｐｒｏ細胞のどちらかのクローンから産生されたベクターｐＨＶの２ｘ１０⁷ｉｕを用いて２９３Ｔ細胞を感染させることによって、複製能を有するレトロウイルス（ＲＣＲ）を測定した（図８）。導入された２９３Ｔ細胞の４週間の継代後、上清を濃縮し、それを用いて新しい２９３Ｔ細胞を感染させた。共焦点顕微鏡法によってＧＦＰ陽性細胞は検出されず、これはベクター２ｘ１０⁷ｉｕ中にＲＣＲは存在しなかったことを示す。

我々はまた、ｐＨ７Ｇ、ＡｍｐｈｏエンベロープおよびＴａｔを安定に発現している２９３Ｔ細胞のクローン（ＶＡＴ−７細胞と表す）を用いて、Ｇａｇ−Ｐｏｌ機能の導入を測定した。図１０は、２ｘ１０⁷ｉｕの一過性にまたは安定に産生されたベクターを用いてＶＡＴ−７細胞を感染させた結果を示す。感染したＶＡＴ−７細胞に由来する上清を表示の日に採取し、濃縮して、これを用いて新しい２９３Ｔ細胞を感染させ、新しい２９３Ｔ細胞をＧＦＰ発現についてスクリーニングした。野生型ＨＩＶ Ｇａｇ−Ｐｏｌ構造ｐＣＭＶＲ８．９１によって一過性に産生されたベクターは、Ｇａｇ−Ｐｏｌ機能の導入の顕著なレベルを示した。２９３ＧＰＲＴ＋Ｒ１細胞で発現されたその誘導体ｐＣＮＣ−ＧＰＲＴによって安定に産生されたベクターは、より低いレベルを示した。対照的に、ｐＳＹＮＧＰによって一過性に産生されたベクター、またはＳＴＡＲ細胞でその誘導体ｐＣＮＣ−ＳＹＮＧＰによって安定に産生されたベクターは、散発的なＧａｇ−Ｐｏｌ機能導入しか示さなかった。

２９３Ｔ細胞のベクター感染後のＧａｇ−Ｐｏｌ配列導入はまた、ネステッドＰＣＲによって検出された（図１１）；ここでも野生型Ｇａｇ−Ｐｏｌはより高いレベルの導入を示し、安定なウイルス産生細胞株はより低いレベルを示した。

実験プロトコル（実施例５〜１０用）
細胞株。すべての細胞は、３７℃、１０％ＣＯ₂にて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ギブコＢＲＬ社（ＧｉｂＣｏＢＲＬ））中で維持し、ただし例外としてＮＩＨ３Ｔ３細胞は、１０％ドナー仔ウシ血清、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ中で維持した。ｐＲＤ＋プラスミド¹⁷由来のＲＤ＋Ｅｎｖ配列をＲＤＬプラスミド¹⁶へ導入し、結果としてＲＤ＋Ｌプラスミドを生じた。ＳＴＡＲ ＲＤ＋細胞は、ＲＤ＋ＬプラスミドをＳＴＡＲ細胞へトランスフェクションすることによって作製し、前述の通りｅＧＦＰをコードするＨＩＶ−１ベクターであるＨＩＶ−１（ＲＤ＋）を産生するのに用いた。ｅＧＦＰをコードするＨＩＶ−１ベクターであるＨＩＶ−１（ＭＬＶ−Ａ）、ＨＩＶ−１（ＲＤｐｒｏ）およびＨＩＶ−１（ＧＡＬＶ＋）をそれぞれ産生する、ＳＴＡＲ Ａｍｐｈｏ、ＳＴＡＲ ＲＤｐｒｏおよびＳＴＡＲ ＧＡＬＶ＋細胞は前述した。

ウイルスベクター調製。ウイルスは１０ｃｍシャーレから採取した。ＳＴＡＲ細胞からのウイルス採取のために、細胞４ ｘ １０⁶個をウイルス採取の開始２４時間前に播種した。ウイルスはＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋ペニシリンおよびストレプトマイシン、またはＯｐｔｉＭＥＭ（ギブコＢＲＬ社（ＧｉｂＣｏＢＲＬ））のどちらかの８ｍｌ中で、４８時間、３７℃にて採取した。ウイルス上清を次いで孔径０．４５μｍのフィルターに通した。ＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）ウイルスは、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって、ベクター（ｐＨＶ）対パッケージング（ｐＣＭＶΔＲ８．９１¹²）対エンベロープ（ｐＭＤ−Ｇ²⁰）プラスミドの３：２：１の重量比で、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（ギブコＢＲＬ社）を用いて、取扱説明書に従って作製した。ＯｐｔｉＭＥＭで洗浄後、ウイルスを、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋ペニシリンおよびストレプトマイシン、またはＯｐｔｉＭＥＭのどちらかの８ｍｌ中で、４８時間、３７℃にて採取した。ウイルス上清を次いで孔径０．４５μｍのフィルターに通した。

ウイルス力価測定。２ ｘ １０⁵個の細胞に、ウイルス上清の連続希釈を接種した。感染の４８ 時間後に、蛍光活性化細胞走査機（ＦＡＣＳ）を用いてｅＧＦＰ力価（ｉｕ／ｍｌ）を測定した。表示した場合には、力価測定はポリブレン（臭化ヘキサジメトリン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）））８μｇ／ｍｌの存在下で、またはスピノキュレーション（１，２００ｇ、２ 時間、２５℃）を用いて、または両方で実施した。

ウェスタンブロッティング。上清８ｍｌ中のウイルスを分析のために、ＳＷ４１ベックマン・ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｒｏｔｏｒ）（３０，０００ｒｐｍ、１時間、４℃）での超遠心分離によって沈澱させた。沈澱を、ＯｐｔｉＭＥＭで希釈した６ｘ負荷緩衝液３０μｌに再懸濁した。試料を５分間沸騰させ、以降の分析まで−２０℃にて冷凍した。試料を１０または１４％ポリアクリルアミド（ＳＤＳ）ゲルで泳動した。タンパク質を次いでハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）ＥＣＬニトロセルロースフィルター（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））上へ、セミドライ転写器および転写緩衝液（３９ｍＭグリシン、４８ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、２０％メタノール）を用いて転写した。

ＭＬＶ−ＡおよびＧＡＬＶエンベロープのＴＭサブユニットは、ラットハイブリドーマ４２／１１４⁴⁵由来の非希釈上清を用いて検出した。ＭＬＶ−Ａ ＳＵは、１／１０００希釈したヤギポリクローナル抗ラウシャー（Ｒａｕｓｃｈｅｒ）白血病ウイルスｇｐ７０（クオリティ・バイオテク社（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、ニュージャージー州カムデン（Ｃａｍｄｅｎ））を用いて検出した。ＲＤ１１４ＳＵは、１／５０００希釈したヤギポリクローナル抗ＲＤ１１４ｇｐ７０（クオリティ・バイオテク社、ニュージャージー州カムデン）を用いて検出した。ＨＩＶ−１ＣＡは、共に１／２００希釈したマウスモノクローナル抗体ＡＤＰ３６５およびＡＤＰ３６６（ＭＲＣＡＲＤ）の１；１混合物を用いて検出した。ＭＬＶキャプシド（ＣＡ）は、１／１０００希釈したヤギポリクローナル抗ラウシャー白血病ウイルスｇｐ７０（クオリティ・バイオテク社、ニュージャージー州カムデン）を用いて検出した。ブロットは、１／１０００希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗免疫グロブリン（ダコ社（ＤＡＫＯ））、および高感度化学発光法（ＥＣＬ）キット（アマシャム・ライフサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ））を用いて現像した。

ヒト血清の調製。ヒト末梢血を氷上で一夜４℃にて凝固させた。血清を血餅から分離して、小分けして必要なだけ−８０℃にて冷凍した（新鮮血清調製物）、または５６℃にて４５分間熱不活化してその後−８０℃にて冷凍した（熱不活化血清調製物）。

ベクター濃縮。ＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）およびガンマレトロウイルス偽型をＯｐｔｉＭＥＭ中に採取した。各上清１０ｍｌを１０⁵ｇにてベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｌ７超遠心分離機（ＳＷ４１ローター、３５，０００ｒｐｍ、１．５時間、４℃）を用いて濃縮し、沈澱をＯｐｔｉＭＥＭ２５０μｌに再懸濁した。ベックマンＬ７超遠心分離機はまた、ウイルスを１０⁴ｇにて濃縮するのにも用いた（ＳＷ４１ローター、１５，０００ｒｐｍ、３時間、４℃）。この場合も沈澱をＯｐｔｉＭＥＭ２５０μｌに再懸濁した。上清３０ｍｌを３０００ｇにて（４，０００ｒｐｍ、８時間、４℃）、ヘレウス・メガフュージ（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｅｇａｆｕｇｅ）２．０Ｒ卓上遠心分離機（セパテック社（Ｓｅｐａｔｅｃｈ））を用いて濃縮した。ここでは沈澱をＯｐｔｉＭＥＭ７５０μｌに再懸濁した。ウイルスを遠心濾過によってセントリコン・プラス２０（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−２０）（アミコン社（Ａｍｉｃｏｍ））フィルターを用いて取扱説明書に従って濃縮した。ここでは上清１６ｍｌを各フィルターに加え、ウイルスは４００μｌ中に回収された。

ゲル濾過。濃縮されたウイルス上清１００μｌを、ＯｐｔｉＭＥＭで予め平衡化したセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）Ｇ ＰＣ ３．２／３０カラム（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に負荷した。分画は、スマート・マネージャー（Ｓｍａｒｔ Ｍａｎａｇｅｒ）ソフトウェアを用いて制御したＬＫＢ；μ分離ユニット（アマシャム社）を用いて実施した。カラムの流速は４０μｌ／分に保ち、１００μｌの２２画分を回収した。ゲル濾過の各画分の２５μｌを６ｘ負荷緩衝液と混合し、沸騰させ、次いで１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって上記の通り分離した。

実施例５
ガンマレトロウイルス偽型を産生するＳＴＡＲ細胞の作製
ＭＬＶ−Ａ、ＲＤ１１４およびＧＡＬＶに由来するＥｎｖを用いて偽型化したＨＩＶ−１ベクターが一過性系で産生されている^26,34,35。以前の研究は、ＧＡＬＶおよびＲＤ１１４に由来するＥｎｖを用いて偽型化したレンチウイルスベクターの力価はそれらの細胞質尾部をＭＬＶエンベロープのもので置換することによって向上しうることを示している^34,35,17。したがって、これらの置換を有する構造であるＧＡＬＶ＋¹⁸およびＲＤ＋¹⁷を用いた。これらの改変は、ＨＩＶ−１プロテアーゼ（ＰＲ）とＥｎｖの間の反応を促進することによって、ガンマレトロウイルスＥｎｖ機能を促進する可能性がある^34,17。ＰＲ−Ｅｎｖ反応を促進するための代替戦略として、ＲＤ１１４ Ｅｎｖはまた、Ｒペプチド切断部位配列をＨＩＶ−１ Ｇａｇのマトリクス−キャプシド切断部位のもので交換することによって、ＲＤｐｒｏを生じるように改変された。

ＭＬＶ−Ａ、ＧＡＬＶ＋、ＲＤ＋およびＲＤｐｒｏについてのエンベロープ発現プラスミドをＳＴＡＲ細胞にトランスフェクションし、エンベロープ発現のためのクローン細胞株を得た。これらのクローンを、ｅＧＦＰをコードするベクターＨＶを有するＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）に感染させた。最も高力価のウイルスを産生するエンベロープクローンを選択した。培養上清を採取し、Ｅｎｖ組み込みおよびいくつかの細胞株についての感染力に関して分析した。

図１２はＳＴＡＲ細胞上清の超遠心分離からの沈澱のウェスタンブロッティングを示す。抗ＨＩＶ−１ ｐ２４を用いてプロービングしたブロットによって、ベクター粒子の存在がすべてのＳＴＡＲ細胞株について実証されたが、２９３Ｔ親細胞については示されなかった。ＲＤ１１４ＳＵに対して作製された抗体は、ＲＤ＋またはＲＤｐｒｏエンベロープを発現しているＳＴＡＲ細胞に由来する上清中のＲＤ１１４ｇｐ７０を認識したが（図１、レーン５および６）、その２者は識別できなかった。同一の膜を、ＭＬＶエンベロープＳＵに対して作製されたポリクローナル抗体を用いてプロービングした。これらの抗体はＭＬＶ−Ａ ＳＵを強く認識するが、ＧＡＬＶ ＳＵとは弱い交差反応しか示さないことが明らかになった³⁶。この血清を用いて、ＭＬＶ−Ａを観察することができたがＧＡＬＶ ＳＵは観察できなかった（図１、レーン３および４）。ＭＬＶ−ＡおよびＧＡＬＶの両方に由来するＴＭを認識するモノクローナル抗体（４２／４１１）³⁴は、２つのＲＤ１１４構造とは反応しなかったが、それはそのエピトープが細胞質尾部でなくＴＭの細胞外ドメインに存在するためである。ＭＬＶ−ＡおよびＧＡＬＶ＋エンベロープの未成熟型（ｐ１５）および成熟型（ｐ１２）の両方を観察することができた（図１、レーン３および４）。総合すると、これらの結果は正しいエンベロープ組み込みを実証する。

いくつかの細胞株についてｅＧＦＰ力価を、一過性に産生されたＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）と比較して測定した（図１３）。ガンマレトロウイルスＥｎｖを持つすべてのＨＩＶ−１ベクターは、試験したすべてのヒト細胞株について、１０⁶〜１０⁷ｉｕ／ｍｌの範囲の力価を有した；ＭＬＶ−Ａが最高、ＧＡＬＶ＋が最低であった。これらの力価は、ＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）の力価と同様であるかまたはそれよりわずかに低かった。ＳＴＡＲ細胞株の上清はすべて、４５０〜６５０ｎｇ／ｍｌの範囲のｐ２４を有したことに注意する（データ記載せず）。これは一過性に産生されたＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）についての約１００ｎｇ／ｍｌに匹敵し、ガンマレトロウイルス偽型についてＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）よりもベクター粒子当たりの低い感染力を示す。予想される通り、ＧＡＬＶ＋、ＲＤ＋およびＲＤｐｒｏを有するベクターは、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞を感染させることができなかったが、その理由は、マウスはそれらの同族の機能性受容体 遺伝子を持たないためである。受容体の正しい利用はさらに受容体干渉によって実証された；ＨＩＶ−１（ＭＬＶ−Ａ）は複製能を有するＭＬＶ−Ａに慢性的に感染したＴＥ６７１細胞を感染させず、ＨＩＶ−１（ＧＡＬＶ＋）はＧＡＬＶおよびＨＩＶ−１（ＲＤ＋）に慢性的に感染したＴＥ６７１細胞を感染させず、およびＨＩＶ−１（ＲＤｐｒｏ）はＲＤ１１４に慢性的に感染したＴＥ６７１細胞を感染させなかった（データ記載せず）。交差干渉は観察されなかった。

実施例６
３７℃での安定性
偽型化されたＨＩＶ−１ベクターの保存および形質導入中の安定性は重要な側面である。我々は、ガンマレトロウイルスＥｎｖを有するＨＩＶ−１ベクター、およびＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）を、３７℃での安定性、凍結／融解サイクルに対する感受性、およびヒト血清による不活化について検討した。多くの遺伝子治療用途ではベクター調製物中にＦＣＳが存在しないことが望ましいため、これらの実験では、ベクターはＯｐｔｉＭＥＭまたはＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳのどちらかの中に採取した。

ベクター安定性を評価するために、３７℃でのインキュベート後に感染力の減衰を測定した。ＯｐｔｉＭＥＭまたはＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中の各ウイルスの一定量を３７℃でインキュベートし、インキュベート開始後２および６時間に２９３Ｔ細胞について力価測定した（図１４）。ＯｐｔｉＭＥＭ中に採取されインキュベートされたウイルスとＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中のものとの間で、３７℃での安定性に実質的な差は観察されなかった。ＨＩＶ−１（ＭＬＶ−Ａ）およびＨＩＶ−１（ＲＤｐｒｏ）は半減期が２時間未満であって最も不安定に見えた一方、ＧＡＬＶ＋またはＲＤ＋のどちらかを持つＨＩＶ−１は２時間のインキュベートにわたってわずかに安定性が高いように見えた（２ないし６時間の半減期）。ＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）ウイルスは一方、３７℃で６時間インキュベート後に、最初の力価の最大４０％だけを失った。３７℃で２４時間インキュベート後のウイルス力価測定は、ＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）力価が９０％低下したことを示した（データ記載せず）。このウイルスの３７℃での半減期はしたがって２４時間より短かった。

実施例７
凍結／融解サイクル反復に対する耐性
−８０℃と３７℃の間のサイクル反復後に、２９３Ｔ細胞についてウイルスを力価測定することによって、凍結／融解サイクル中のベクター安定性を次いで検討した。力価は、１回目のサイクルを開始する前の力価の比率として表す（図１５）。すべてのガンマレトロウイルス偽型は、凍結／融解に対して何らかの耐性を示した。１サイクル後に、ＭＬＶ−Ａ偽型化ベクター はどちらの培地中でも元の力価の５％ 未満を失った。他のすべてのレトロウイルス偽型は凍結／融解に対してより感受性が高いように見えたが、３サイクル後に元の力価の５０％より大きい力価を失ったレトロウイルス偽型は無かった。ＯｐｔｉＭＥＭとＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中に採取されたベクターの間に、安定性に実質的な差は無かった。これは、しかし、ＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）ベクターには当てはまらなかった。１サイクル後に、ＯｐｔｉＭＥＭ中に採取されたウイルスは元の力価の最大６５％を失った一方、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中のウイルス力価は安定であるように見えた。さらに、３サイクル後に、ＯｐｔｉＭＥＭ中のウイルスは元の力価の９０％を失った一方、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中のウイルスが失ったのは１０％未満であった。このように、ＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）を冷凍するための条件は、注意深い最適化を要しうる。

実施例８
新鮮ヒト血清中の不活化に対する耐性
ＯｐｔｉＭＥＭまたはＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳのどちらかの中の各ウイルスを、等量の新鮮血清または熱不活化血清と共に３７℃にて１時間インキュベートし、その後２９３Ｔ細胞について力価測定した。新鮮凍結血清とのインキュベート後の、対応する熱不活化血清とのインキュベートに対する、ウイルス力価の比率を示す（図１６）。両方の培地中ですべてのガンマレトロウイルス偽型は、ヒト血清に曝露された際に良好な安定性を示した。ＨＩＶ−１（ＭＬＶ−Ａ）は力価の多くとも８％だけを失った一方、ＧＡＬＶ＋エンベロープを持つものは、ある場合においては力価の損失（２７％）を示した。レトロウイルス偽型力価の最大の低下である、血清１に曝露された、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中に採取されたＨＩＶ−１（ＲＤｐｒｏ）は、４０％だけであった。ＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）ウイルスは、対照的に、ヒト新鮮血清による不活化に対して感受性であるように見えた。本研究では、異なるガンマレトロウイルスＥｎｖを持つベクター間で血清感受性に実質的な差は無かった。対照的に、ガラクトシル（α１−３）ガラクトシル（αＧａｌ）陰性ヒト細胞によって産生された場合³⁷、複製能を有するＭＬＶ−ＡはＲＤ１１４またはＧＡＬＶよりも感受性が高かったことを我々は以前に報告した。

ＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）は、ガンマレトロウイルスＥｎｖで偽型化されたＨＩＶ−１ベクターよりも、ヒト血清中での不活化に対して感受性が高かった。血清１への曝露は力価の最大８０％の損失を引き起こした一方、血清２とのインキュベートはこのウイルスの力価の、検出閾値を下回る低下を引き起こした。これらの結果は、ＶＳＶ−Ｇ偽型化ＨＩＶベクターはヒト血清中で補体によって容易に不活化される³⁸ことを示すＤｅＰｏｌｏと共同研究者らによるデータと合致する。さらに、我々の結果および、ＤｅＰｏｌｏと共同研究者らの結果は、異種αＧａｌ抗原を持たない、ヒト細胞中で複製している野生型ＶＳＶは、ヒト血清中での不活化に感受性であったが、αＧａｌ抗原を持つＶＳＶよりはその程度は小さかった^39,40という以前の観察と合致する。

実施例９
ポリブレンおよびスピノキュレーションを用いたベクター力価の向上
ウイルス結合を増加させるための、形質導入前のベクター濃縮、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ またはｅｘ ｖｉｖｏ形質導入手順の改変は、レトロ／レンチウイルスベクター採取物の力価を高めるために一般的に行われている。我々は、ポリブレンの使用、および遠心接種すなわちスピノキュレーションによる、ベクター力価の向上を検討した。偽型ベクターはＯｐｔｉＭＥＭ中に採取した。ポリブレンの存在下で、またはスピノキュレーションを用いて、または両方を用いて、各偽型を２９３Ｔ細胞について力価測定した。これらの実験からの結果を図１７に示す。ポリブレンはガンマレトロウイルスＥｎｖを持つＨＩＶ−１ベクターの感染を平均して５〜６倍促進した一方、スピノキュレーションは感染を平均して４倍促進した。ポリブレンの存在はＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）力価を実質的に向上させなかった。ポリブレンおよびスピノキュレーションを併用した場合、それらの効果は全例で加法的であった。

さまざまな細胞株（ヒト細胞株２９３Ｔ、ＴＥ６７１、ＨｅＬａおよびＨＴ１０８０、およびマウス細胞株ＮＩＨ３Ｔ３）に対するポリブレンの促進効果もまた検討した（データ記載せず）。ポリブレンは試験したどの細胞株についてもＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）力価を２倍より大きく上昇させなかった。ガンマレトロウイルス偽型の力価についてのポリブレンの効果は、２９３ＴまたはＥ６７１細胞（８倍〜１６倍）について最も顕著であった一方、その効果はＨｅＬａまたはＨＴ１０８０細胞（２ｘ−４ｘ）についてはそれほど劇的でなかった。ＮＩＨ３Ｔ３細胞についてのポリブレンの感染促進は無視できた。

実施例１０
ＳＴＡＲ細胞由来偽型の濃縮
ベクターストックの濃縮はしばしば必要である。超遠心分離、低速遠心分離、および遠心濾過（または限外濾過）がＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）ベクター濃縮に適用され成功している^20,41,42。ガンマレトロウイルス偽型に関しては、超遠心分離および遠心濾過によって濃縮される能力を評価するために調べられているのはＨＩＶ−１（ＭＬＶ−Ａ）だけである。我々は、したがって、４つの異なる偽型を４つの異なる方法／条件で濃縮する比較試験を実施した。ＭＬＶ−Ａ、ＧＡＬＶ＋およびＲＤｐｒｏＥｎｖを持つベクターおよびＶＳＶ−ＧをＯｐｔｉＭＥＭ中に採取し、４つの条件によって容量で４０倍に濃縮した−１００ｋＤａのカットオフを有するフィルターを用いた遠心濾過、または３つの異なる速度での遠心分離；１００，０００ｇで１．５時間；１０，０００ｇで１．５時間；３，０００ｇで７時間。濃縮の前後に、％ｅＧＦＰ導入細胞を２倍連続希釈で２９３Ｔ細胞についてポリブレンの存在下で測定した。図１８は、ＨＩＶ−１（ＭＬＶ−Ａ）およびＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）について力価測定曲線の例を示す。濃縮手順後の各ベクター調製物のｅＧＦＰ力価および％回収率は、力価測定の直線範囲での希釈についての％形質導入データを用いて推定し、表１に示した。

産生されたウイルスを、１００，０００ｇ、１０，０００ｇおよび３，０００ｇでの遠心分離、および１００ｋＤａカットオフでの遠心濾過によって、４０倍濃縮した（ａ）。ウイルスは２９３Ｔ細胞についてポリブレン８μｇ／ｍｌと共に力価測定し、ｅＧＦＰ発現をＦＡＣＳによって測定した。ｂ、力価は１０⁷ｉｕ／ｍｌで表す；ｃ、％回収率（１００Ｘ濃縮後の力価）／（４０Ｘ濃縮前の力価）を括弧内に示す。

ベクター回収率は大部分の実験で５０％より大であったため、濃縮によるベクターへの損傷は限られていたのが観察された。１０，０００ｇまたは３，０００ｇでの遠心分離は一般的に、ガンマレトロウイルス偽型についてより高い回収率を結果として生じた。ＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）は、より高い超遠心分離速度で、または遠心濾過によって濃縮された場合、ガンマレトロウイルスＥｎｖを持つＨＩＶ−１ベクターよりも安定でありうる。また、この試験の延長において、１０，０００ｇまたは３，０００ｇのどちらかでの１段階遠心分離によって、最大１００倍のより高い濃縮を高収量で達成することができ、結果として２．０Ｘ１０⁸〜１．５Ｘ１０⁹ｉｕ／ｍｌの力価を生じたことが注目された（データ記載せず）。

ＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）はすべての条件において濃縮後に高用量では１００％感染を達成した一方（図１８Ｂｂ）、ガンマレトロウイルス偽型はウイルス上清をより穏和な条件の遠心分離に供した場合のみ、２９３Ｔ細胞について１００％感染を達成することができた（ＨＩＶ−１（ＭＬＶ−Ａ）に関して図１８Ａａ、ＨＩＶ−１（ＧＡＬＶ＋）とＨＩＶ−１（ＲＤｐｒｏ）はデータ記載せず）。高用量では、ガンマレトロウイルス偽型の感染は、ウイルス粒子が１００，０００ｇでの超遠心分離かまたは遠心濾過によって濃縮された場合に阻害された。ＭＬＶベクターパッケージング細胞株であるＦＬＹＡ１３¹⁶は多量のＭＬＶ−Ａ Ｅｎｖをベクター粒子から遊離して培地中へ放出することが以前に報告されている。過剰の可溶性Ｅｎｖは、細胞受容体に関してベクター粒子と競合して、ベクター形質導入を阻害するように見えた^43,44。可溶性ＭＬＶ−Ａ Ｅｎｖが遠心濾過中にベクター粒子と一緒に濃縮され、それによって濾過調製物による高用量での形質導入の低下を引き起こしたかどうかを確認するため、遠心濾過による調製物をセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ゲル濾過によって分画した。ゲル濾過画分を感染およびＨＩＶ−１キャプシド（ＣＡ）とＭＬＶ−Ａ Ｅｎｖの存在について分析した（図８Ａおよび８Ｂ）。ｅＧＦＰ感染力およびＨＩＶ−１ ｐ２４が初めの素通り画分に検出され、感染性ベクター粒子の存在を示した。これらの素通り画分である３〜５は高用量で高率の形質導入が可能であり、遠心濾過後のゲル濾過前の調製物による約５％（図１９Ｃ）と比較して、９５〜１００％形質導入が画分２０μｌの投入量で達成された（データ記載せず）。これは、ゲル濾過が何らかの阻害因子をベクター粒子画分から分離したことを示す。抗ＭＬＶ ＳＵを用いてプロービングしたウェスタンブロットは、ＭＬＶ−Ａ Ｅｎｖ ＳＵの大部分が遅い画分１０〜１３に出現したことを明らかにし、粒子から遊離したＥｎｖが遠心濾過調製物中に多量に存在することを示した（図１９Ｂ）。

ベクター粒子を含まない遅い画分によるベクター感染の阻害について試験するため、画分９〜２２を２９３Ｔ細胞に、一定量のＨＩＶ−１（ＭＬＶ−Ａ）およびＨＩＶ−１（ＲＤｐｒｏ）と共に加えた（図１９Ｃ）。阻害無しでは、これらのベクター用量は、４０〜５０％のｅＧＦＰ形質導入を結果として生じた。ｅＧＦＰ形質導入のＨＩＶ−１（ＭＬＶ−Ａ）による相当な低下が、大部分のＭＬＶ−Ａ Ｅｎｖを含む画分１０〜１３について観察されたが、ＨＩＶ−１（ＲＤｐｒｏ）によっては観察されなかった。これは、画分１０〜１３中に存在する、ビリオンと結合していないエンベロープが、おそらく細胞受容体についてベクター粒子を競合的に閉め出して、ＨＩＶ−１（ＭＬＶ−Ａ）感染を特異的に阻害したことを示す。

これらの結果は、したがって、ガンマレトロウイルス偽型を産生するＳＴＡＲ細胞の上清中に見出される、ビリオンと結合していないエンベロープが、ウイルス粒子と共に濃縮された場合に感染の阻害因子として作用しうることを示唆する。しかし、ウイルス粒子がより低速で濃縮された場合、感染の阻害はみられない。１０，０００ｇないし１００，０００ｇの速度での遠心分離は、したがって、濃縮されたウイルスストックの調製を要する用途に用いることができる。さらに、低速遠心分離は、より長時間かかるにしても、大バッチのベクターストックを濃縮するのにより適している可能性がある。

要約すると、ＳＴＡＲ細胞から産生されガンマレトロウイルスＥｎｖで偽型化されたＨＩＶベクターは、ＶＳＶ−Ｇ偽型化されたＨＩＶ−１ベクターと同程度に効率的に、ある種の型のヒト細胞を感染させることができる。それらはＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）に比べて、新鮮ヒト血清中でより安定であり、ｅｘ ｖｉｖｏ用途においてポリブレンおよびスピノキュレーションと共により効果的に用いることができる。それらは凍結／融解に対して耐性であるが、３７℃での減衰速度はＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）の減衰速度よりも速い。これは、不要なベクター伝播の無い局所的遺伝子導入が必要である場合に、潜在的に有利である。ベクター調製物中の可溶性Ｅｎｖは好ましくはベクター遠心分離を用いて除去される。これらの結果は、一過性系または誘導系における場合と比較した、安定な連続的ベクター産生における品質管理の容易さと共に、ＳＴＡＲ細胞に由来しガンマレトロウイルスＥｎｖで偽型化されたＨＩＶ−１ベクターの、前臨床および臨床応用のさらなる検討を支持する。

上記の明細書中で言及されたすべての出版物は参照により本開示に含まれる。本発明の記載された方法および系のさまざまな改変および変形は、本発明の範囲および精神を離れることなく当業者に明らかとなる。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、請求される通りの本発明はそのような特定の実施形態に過度に制限されるべきでないことが理解されるべきである。実際、分子生物学または関連分野の当業者に明らかである、本発明を実施するための記載された様式のさまざまな改変は、下記の請求項の範囲に含まれることが意図される。
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３７． Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｙ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ １９９６； ３７９； ８５−８８．
３８． ＤｅＰｏｌｏ ＮＪ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０００； ２； ２１８−２２２．
３９． Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９７； ７１； ６１７４−６１７８．
４０． Ｗｅｌｓｈ ＲＭ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９８； ７２； ４６５０−４６５６．
４１． Ｒｅｉｓｅｒ Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０００； ７； ９１０−９１３．
４２． ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２００２； ３４６； ５７３−５８９．
４３． Ｓｌｉｎｇｓｂｙ ＪＨ ｅｔ ａｌ． ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０００； １１； １４３９−１４５１．
４４． Ａｒａｉ Ｔ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９８； ７２； １１１５−１１２１．
４５． Ｐｉｎｔｅｒ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８２； １１６； ４９９−５１６．

図１はＭＬＶを基礎とするベクター構造の説明を示す。ＨＩＶｇａｇ−ｐｏｌ配列をｐＣＮＣ−ＭＣＳのクローニング部位に導入し、ｐＣＮＣ−ＧＰＲＴ、ｐＣＮＣ−ＳＹＮＧＰ、およびｐＣＮＣ−ＧＰを構築した。より詳細には、図１ＡはｐＣＮＣ−ＭＣＳを図解する。図１ＢはｐＣＮＣ−ＧＰＲＴを図解する。図１ＣはｐＣＮＣ−ＳＹＮＧＰを図解する。図１ＤはｐＣＮＣ−ＧＰを図解する。 図２はトランスフェクションとレトロウイルス形質導入の間の比較を示す表である。Ｇ４１８−耐性クローンはトランスフェクションまたはレトロウイルス形質導入の２ないし３週間後に単離され、または２９３Ｔクローンは形質導入後に限界希釈法によって単離され、次いでＨＩＶｐ２４ＣＡ抗原発現に関して免疫染色によってスクリーニングされた。 図３はＨｅＬａクローンにおけるｐ２４発現についての免疫蛍光測定法の結果を示す。ＣＮＣ−ＧＰＲＴ形質導入によって作製された１２の陽性クローンの全部が（ＨｅＬａ ＣＮＣ−ＧＰＲＴクローンと表す）、ｐＣＮＣ−ＧＰＲＴのトランスフェクションによって作製された稀な陽性クローン（ＨｅＬａ ＴＦクローンと表す）よりも明るい蛍光を示した。 図４は細胞がＨＩＶ−１ベクターをパッケージングする能力を図解するグラフである。能力は重量比３：１のｐＳＩＮ−ＣＳＧＷおよびｐＭＤＧの一過性トランスフェクションによって評価した。ＧＰ＋Ｒ細胞およびＳＹＮＧＰ細胞の場合、ＴａｔおよびＲｅｖを発現するプラスミドもまたベクター対ＶＳＶ−Ｇ対Ｔａｔ対Ｒｅｖプラスミドの重量比３：１：１：１でトランスフェクションされた。力価は２９３Ｔ細胞で測定した。 図５はＨｅＬａ、２９３Ｔ、およびＨＴ１０８０クローン由来の細胞溶解物および上清のｐ２４イムノブロットの結果を示す。細胞５ｘ１０⁴個に由来する総タンパク質を細胞溶解物として用いた。２ｍｌの培養上清を超遠心分離し、結果として得られた沈澱を上清として用いた。 図６はＨＩＶ−１Ｇａｇ−安定クローン由来の培養上清中のｐ２４抗原のレベルを示すグラフである。Ｇａｇ−安定クローンの上清中のｐ２４抗原の検出は、培養上清の連続希釈試料についてｐ２４ＥＬＩＳＡによって実施した。 図７は、安定なＨＩＶ−１ウイルス産生細胞株の確立に用いた、ＨＩＶを基礎とするベクター構造を図解する。図７ＡはＲｅｖを発現するｐＨ７Ｇベクターを図解する。図７ＢはｐＨＲＳＩＮ−ＣＳＧＷを図解する。図７ＣはｐＨＶを図解する。 図８はレトロウイルスエンベロープ安定パッケージング細胞株からのベクター産生を説明する表である。パッケージング細胞はＨＶベクターのＨ７Ｇに感染させ、またはそのベクターおよびピューロマイシン耐性プラスミドの同時トランスフェクション後にピューロマイシンを用いて選択した。力価は２９３Ｔ細胞で測定した。 図９は長期培養後のＳＴＡＲ細胞によるウイルス産生のレベルを説明する表である。 図１０は、ｐＨ７Ｇ、Ｔａｔおよびａｍｐｈｏエンベロープを含むＶＡＴ−７細胞からウイルスレスキューする能力によって測定された、ｇａｇ／ｐｏｌ機能導入のレベルを明らかにする表である。表示の数字は２９３Ｔ細胞についてレスキューされたウイルスの力価を示す。 図１１は、ネステッドＰＣＲによって測定した、２９３Ｔ細胞へのｇａｇ配列の導入のレベルを示す。 図１２はＨＩＶ−１ベクターにおけるガンマレトロウイルスエンベロープの組み込みを明らかにするゲルを示す。上清８ｍｌを超遠心分離によって濃縮し、沈澱を負荷緩衝液３０μｌに再懸濁した。各試料１５μｌを１０％（上３図）または１４％（最下図）ポリアクリルアミドゲルで泳動した。転写後に膜を、ＨＩＶ ＣＡに対して作製したマウスモノクローナル抗体ＡＤＰ３６５とＡＤＰ３６６の１：１混合物（抗ＨＩＶｐ２４）、ＲＤ１１４ＳＵに対して作製したヤギポリクローナル血清（抗ＲＤ１１４ＳＵ）、ラウシャー（Ｒａｕｓｃｈｅｒ）ＭＬＶに対して作製したヤギポリクローナル血清ＳＵ（抗ＭＬＶ ＳＵ）、またはＭＬＶ ＴＭに対して作製したラットモノクローナル抗体４２／４１１（抗ＭＬＶ ｐ１５Ｅ）を用いてプロービングした。タンパク質マーカーの位置（ｋＤａで）を示す。ポリブレンの存在下での２９３Ｔ細胞に対する各ウイルス上清のｅＧＦＰ力価もまた示す。 図１３はさまざまな細胞株に対するＨＩＶ−１ベクターの力価測定を示すグラフである。ガンマレトロウイルスエンベロープを用いて偽型化したＨＩＶ−１ベクター（ＭＬＶ−Ａ、ＧＡＬＶ＋、ＲＤ＋、およびＲＤｐｒｏ）はＯｐｔｉＭＥＭ中にＳＴＡＲ細胞から採取され、またはＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）の場合にはＯｐｔｉＭＥＭ中に一過性ウイルス産生の間に採取された。各偽型はポリブレン（８μｇ／ｍｌ）の存在下で、ヒト細胞株２９３Ｔ、ＴＥ６７１、ＨｅＬａおよびＨＴ１０８０、またはマウス細胞株ＮＩＨ３Ｔ３について力価測定した。力価はＦＡＣＳによって感染の４８時間後に測定した。４Ｘ１０⁴ｉｕ／ｍｌの検出限界を矢印で示す。 図１４はＨＩＶ−１ベクターの３７℃での安定性を示すグラフである。ベクターはＯｐｔｉＭＥＭ中またはＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中のどちらかに採取した。ベクターストックを３７℃にてインキュベートし、いろいろな時点で力価測定した。ポリブレン８μｇ／ｍｌの存在下での２９３Ｔ細胞に対するｅＧＦＰ力価を、インキュベート前のウイルス力価の比率として示す。表示の値は２回の実験の平均値であり、エラーバーは実際のデータ点を示す。 図１５は凍結／融解サイクル反復に対するＨＩＶ−１ベクターの耐性を示すグラフである。偽型化ＨＩＶベクターを最大３回、−８０℃および３７℃にてそれぞれ凍結および融解した。ポリブレン８μｇ／ｍｌの存在下での２９３Ｔについての、１回目のサイクルの開始前の対照力価に対する相対ｅＧＦＰ力価を比率で示す。表示の値は２回の実験の平均値であり、エラーバーは実際のデータ点を示す。 図１６はヒト血清に対するＨＩＶ−１ベクターの耐性を示すグラフである。ＯｐｔｉＭＥＭ中またはＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中のどちらかに採取した偽型化ＨＩＶベクターをヒト血清に曝露した。ポリブレン８μｇ／ｍｌの存在下での２９３Ｔ細胞についての力価を、新鮮凍結血清とのインキュベート後に、対応する熱不活化血清とのインキュベートに対して、ウイルス力価の比率で示す。表示の値は２回の実験の平均値である。２回の実験においてウイルス力価に２倍より大きい差は無かった。対照力価の６％を下回る値はＦＡＣＳによって検出することができなかった。 図１７はＨＩＶ−１ベクター感染に及ぼすポリブレンおよびスピノキュレーションの効果を示すグラフである。ＨＩＶ−１ベクターはＯｐｔｉＭＥＭ中に採取した。各偽型は２９３Ｔ細胞について力価測定し、１２００ｇで２時間２５℃にて遠心分離したかまたは、２９３Ｔについてポリブレン（８μｇ／ｍｌ）の存在下で力価測定したかまたは、両方を行った。ポリブレンの非存在下およびスピノキュレーション無しでの対照力価に対する相対力価の値を示す。 図１８は濃縮されたＨＩＶ−１ベクターの力価測定を説明するグラフを示す。ＯｐｔｉＭＥＭ中に採取したＨＩＶ−１（ＭＬＶ−Ａ）（図Ａ）およびＨＩＶ−１（ＶＳＶ−Ｇ）（図Ｂ）をさまざまな方法によって４０倍に濃縮した；１００，０００ｇおよび１０，０００ｇでの超遠心分離、３，０００ｇでの低速遠心分離、およびセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）−２０フィルター（１００ｋＤａフィルター）を用いた遠心濾過。濃縮された各ストックを２倍連続希釈し、２９３Ｔ細胞についてポリブレン８μｇ／ｍｌの存在下で力価測定した。ｅＧＦＰ形質導入された細胞をＦＡＣＳによって計数した。 図１９は遠心濾過によるＨＩＶ（ＭＬＶ−Ａ）調製物のゲル濾過分析を説明するグラフを示す。ＨＩＶ−１（ＭＬＶ−Ａ）偽型をＯｐｔｉＭＥＭ中に採取し、遠心濾過による濃縮に供した。結果として生じる濃縮されたストックをセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ゲル濾過によって分画した。各画分の部分標本を、ｅＧＦＰ形質導入（図Ａ）および、ＨＩＶ−１ＣＡおよびＭＬＶ−ＡＥｎｖの存在についてウェスタンブロットによってＣＡおよびＥｎｖ ｇｐ７０に対する抗体を用いて分析した（図Ｂ）。画分９〜２２に由来する部分標本を、一定量のＨＩＶ（ＭＬＶ−Ａ）またはＨＩＶ（ＲＤｐｒｏ）のどちらかと混合し、２９３Ｔ細胞上へポリブレン８μｇ／ｍｌの存在下でプレートに加えた。パーセントｅＧＦＰ形質導入をＦＡＣＳによって測定した（図Ｃ）。

Claims (6)

1. 細胞をレトロウイルスベクターに感染させることを含む、安定発現細胞株を作製するための方法であって、
   前記レトロウイルスベクターは、細胞を感染させることが可能であり、かつ５’ＬＴＲ又はその一部と３’ＬＴＲ又はその一部との間にレンチウイルスの転写単位を含み、
   前記レンチウイルスの転写単位は、レンチウイルスのＧａｇ-Ｐｏｌ及び／又はＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質をコードする塩基配列を含み、
   前記レトロウイルスベクター及び前記レンチウイルスの転写単位は、異なるウイルスに由来し、かつ
   前記安定発現細胞株は、少なくとも３ヶ月の間、連続的にレンチウイルスのＧａｇ-Ｐｏｌ及び／又はＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質を安定に産生する、上記方法。
2. 前記レンチウイルスの転写単位がレンチウイルスのｇａｇ及びｐｏｌを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記レトロウイルスベクターがＭＬＶに由来する、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記レンチウイルスの転写単位がＨＩＶまたはＥＩＡＶに由来する、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記レトロウイルスベクターは、組み込まれたプロウイルスの形態である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
6. レンチウイルスのＧａｇ-Ｐｏｌ及び／又はＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質を産生する方法であって、
   請求項１から５のいずれか１項に定義されるレトロウイルスベクターを用いて細胞を感染させること、及び
   レンチウイルスのＧａｇ-Ｐｏｌ及び／又はＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質を産生すること、を含む上記方法。

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