JP4612950B2 - レトロウイルス送達システム - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、送達システムに関する。特に、本発明は、関心のあるヌクレオチド配列（nucleotide sequence of interest; 以下、「ＮＯＩ」と略記する）、または複数のＮＯＩを、関心のある部位に送達することができるレトロウイルスベクターに関する。
【０００２】
さらに、特に、本発明は、遺伝子療法に有用なレトロウイルスベクターに関する。
【０００３】
遺伝子療法は、たとえば、標的細胞等の、１つまたは複数の標的部位における１つまたは複数のヌクレオチド配列の、付加、置換、欠失、補足、操作等のいずれか１つまたは複数を含む。標的部位が標的細胞であれば、そのときは、その細胞は、組織または器官の一部であってもよい。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｒｏｂｅｒｔ Ｍｅｙｅｒｓ編、ＶＣＨ発行、たとえば、５５６−５５８ページ）には、遺伝子療法に関する一般的教示が記載されている。
【０００４】
さらなる例として、遺伝子療法は、以下のいずれか１つまたは複数を提供する方法も提供する。即ち、ヌクレオチド配列、たとえば遺伝子を使用して、欠陥遺伝子を置換または補足することができる。病原遺伝子または遺伝子産物を除去することができる。たとえば、より好ましい表現型を作るために、新しい遺伝子を付加することができる。細胞を分子レベルで操作して癌（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｌｆ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｌｆ， １９９４， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ６９；２７３−２７９）、または他の状態、たとえば、免疫病、心血管疾患、神経学的疾患、炎症性疾患または感染性疾患を治療することができる。抗原を操作および／または導入して、免疫応答を誘導することができる（たとえば、遺伝子ワクチン接種）。
【０００５】
近年、レトロウイルスを遺伝子療法に使用することが推奨されている。本来、レトロウイルは、溶菌性ウイルスとは異なるライフサイクルを有するＲＮＡウイルスである。この点について、レトロウイルスが細胞に感染すると、そのゲノムは、ＤＮＡ型に変換される。言い換えれば、レトロウイルスは、ＤＮＡ中間体を介して複製する感染実体である。レトロウイルス感染等に関するさらなる詳細については後述する。
【０００６】
多くのレトロウイルスがあり、その例を以下に挙げる。ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、フジナミ肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲネズミ骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニーネズミ肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、エーベルソンネズミ白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、鳥類骨髄細胞腫ウイルス−２９（ＭＣ２９）、および鳥類赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）。
【０００７】
レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ （"Ｒｅｔｏｒｏｖｉｒｕｓｅｓ" １９９７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｏｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ｅｄｓ： ＬＭ Ｃｏｆｆｉｎ， ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ， ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８−７６３）に掲載されている。
【０００８】
当技術分野で、幾つかのレトロウイルスのゲノム構造に関する詳細を見つけることができる。例として、ＨＩＶに関する詳細をＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋからみつけることができる（すなわち、ゲノム寄託番号第ＡＦ０３３８１９号）。
【０００９】
全てのレトロウイルスは、不可欠なビリオンタンパク質をコードする３つの主要なコード領域、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖを含む。それにもかかわらず、レトロウイルスは、大きく２つのカテゴリー（すなわち、「単純」と「複雑」）に分けられる。これらのカテゴリーは、そのゲノムの構成によって識別できる。単純レトロウイルスは、通常、この基本情報のみを担持する。対照的に、複雑レトロウイルスは、多数のスプライシングされたメッセージから誘導される調節タンパク質もさらにコードする。
【００１０】
レトロウイルスは、さらに７群にわけることができる。そのうち５群は、発癌性を有するレトロウイルスを表す。残りの２群は、レンチウイルスおよびスプマウイルスである。これらのレトロウイルスに関する総説は、"Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ"（１９９７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｏｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＬＭ Ｃｏｆｆｉｎ， ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ， ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ １−２５）にある。
【００１１】
ヒトＴ細胞白血病ウイルス−ウシ白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−ＢＬＶ）以外の全ての発癌性メンバーは、単純レトロウイルスである。ＨＴＬＶ、ＢＬＶならびにレンチウイルスおよびスプマウイルスは、複雑レトロウイルスである。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）およびヒトＴ−細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）は、最もよく研究された発癌性レトロウイルスの一部である。
【００１２】
レンチウイルス群は、さらに、「霊長類」および「非霊長類」に分けられる。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などが挙げられる。非霊長類レンチウイルス群には、基本型「スローウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）が含まれ、最近では、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）について記載されている。
【００１３】
レンチウイルスファミリーと他のタイプのレトロウイルスとの間の重要な相違点は、レンチウイルスは、分裂細胞も非分裂細胞も共に感染することができる点である（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ １９９２ ＥＭＢＯ． Ｊ １１； ３０５３−３０５８、Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｅｍｅｒｍａｎ １９９４ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：５１０−５１６）。対照的に、他のレトロウイルス、たとえば、ＭＬＶは、非分裂細胞（たとえば、筋組織、脳組織、肺組織および肝組織を構成するもの等）に感染することができない。
【００１４】
感染の経過中、レトロウイルスは、最初に、特定の細胞表面レセプターに付着する。感染しやすい宿主細胞に侵入すると、レトロウイルスＲＮＡゲノムは、親ウイルス内部にある、ウイルスによりコードされた逆転写酵素によってＤＮＡにコピーされる。このＤＮＡは、宿主細胞核に輸送され、続いて宿主ゲノムに組み込まれる。この段階で、一般に、プロウイルスと呼ばれる。プロウイルスは、細胞分裂中、宿主染色体内で安定であり、且つ他の細胞タンパク質と同様に転写される。プロウイルスは、より多くのウイルスを作るのに必要なタンパク質およびパッケージング機構をコードし、「出芽」と呼ばれることもあるプロセスにより、細胞をそのままの状態にしておくことができる。
【００１５】
既に指摘した通り、各レトロウイルスゲノムは、ビリオンタンパク質および酵素をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖと呼ばれる遺伝子を含む。これらの遺伝子は、その両端が、長末端反復配列（long terminal repeats; ＬＴＲ）と呼ばれる領域により挟まれている。このＬＴＲは、プロウイルスの組み込み、および転写に関与する。ＬＴＲは、エンハンサー−プロモーター配列の役割も果たす。言い換えれば、ＬＴＲは、ウイルス遺伝子の発現を調節することができる。レトロウイルスＲＮＡのキャプシド形成は、ウイルスゲノムの５'末端にあるｐｓｉ配列によって起こる。
【００１６】
ＬＴＲそれ自体は、Ｕ３、ＲおよびＵ５と呼ばれる、３つのエレメントに分けることができる配列と同じ配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３'末端に特有の配列から誘導される。Ｒは、ＲＮＡの両末端で反復する配列から誘導され、Ｕ５は、ＲＮＡの５'末端に特有の配列から誘導される。３つのエレメントのサイズは、異なるレトロウイルス間でかなり変化する可能性がある。
【００１７】
理解しやすくするために、ＬＴＲ、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの基本的特徴を示すレトロウイルスゲノムの簡単な一般的線図を（比率は別として）、図６に示す。
【００１８】
ウイルスゲノムの場合、転写開始部位は、左手側のＬＴＲ内のＵ３とＲとの間の境界にあり（図６に示す）、ｐｏｌy（Ａ）付加（終結）部位は、ＲおよびＵ５は、右手側ＬＴＲ内のＲとＵ５との間の境界にある（図６に示す）。Ｕ３は、プロウイルスの転写調節エレメントの大部分を含み、その中には細胞の転写アクティベータータンパク質、および場合によってはウイルスの転写アクティベータータンパク質に応答するプロモーター配列および多数のエンハンサー配列が含まれる。一部のレトロウイルスは、遺伝子発現の調節に関与するタンパク質をコードする遺伝子であるｔａｔ、ｒｅｖ、ｔａｘおよびｒｅｘのいずれか１つまたは複数を含む。
【００１９】
構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖそれ自体に関しては、ｇａｇはウイルスの内部構造タンパク質をコードする。ｇａｇは、タンパク質分解によるプロセシングを受けて、成熟タンパク質ＭＡ（基質）、ＣＡ（キャプシド）、ＮＣ（ヌクレオキャプシド）になる。遺伝子ｐｏｌは、逆転写酵素（ＲＴ）をコードし、ＤＮＡポリメラーゼ、および関連ＲＮａｓｅＨ活性の両者およびゲノムの複製を仲介するインテグラーゼ（ＩＮ）を含む。遺伝子ｅｎｖは、ビリオンの表面（ＳＵ）糖タンパク質および膜貫通（ＴＭ）タンパク質をコードし、これらは、細胞レセプタータンパク質と特異的に相互に反応する複合体を形成する。この相互作用は、最終的に、ウイルス膜と細胞膜との融合につながる。
【００２０】
レトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質複合体は、２つのポリペプチド、すなわち、外側の、グリコシル化された親水性ポリペプチド（ＳＵ）および膜貫通タンパク質（ＴＭ）を含む。これらは、一緒に、オリゴマーの「こぶ」または「こぶ付きスパイク」をビリオンの表面上に形成する。両ポリペプチドは、ｅｎｖ遺伝子にコードされ、ポリタンパク質前駆体の形で合成されて、細胞表面に輸送される間にタンパク質分解により切断される。未分解のｅｎｖタンパク質はレセプターに結合することができるが、切断事象それ自体は、ウイルスが宿主細胞に侵入するのに必要なタンパク質の融合潜在能力を活性化することが必要である。一般に、ＳＵタンパク質とＴＭタンパク質の両者が多数の部位でグリコシル化されている。しかし、一部のウイルス（ＭＬＶが好例である）では、ＴＭはグリコシル化されていない。
【００２１】
ＳＵタンパク質およびＴＭタンパク質は常に必要なわけではないが、エンベロープに包まれたビリオン粒子それ自体を組み立てるために、侵入過程において極めて重要な役割を果たす。この点について、ＳＵドメインは標的細胞上のレセプター分子（多くの場合、特定のレセプター分子）に結合する。この結合事象はＴＭタンパク質の膜融合誘導性能を活性化し、その後、ウイルス膜と細胞膜が融合すると考えられる。一部のウイルス（特にＭＬＶ）では、結果としてＴＭの細胞質尾部の短い部分が除去される切断事象は、タンパク質の全融合活性を明らかにする際に、重要な役割を果たす（Ｂｒｏｄｙ ｅｔ ａｌ １９９４ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：４６２０−４６２７， Ｒｅｉｎ ｅｔ ａｌ １９９４ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：１７７３−１７８１）。ＴＭの膜貫通断片から離れた、この細胞質「尾部」は、ウイルス膜の内側に残存し、異なるレトロウイルスで長さがかなり変化する。
【００２２】
このように、ＳＵ／レセプター相互作用の特異性により、レトロウイルスの宿主範囲および組織親和性が規定される。ある場合には、この特異性により、組換えレトロウイルスベクターの形質導入能が制限される。このため、多くの遺伝子療法実験でＭＬＶが使用されてきた。４０７０Ａと呼ばれるエンベロープタンパク質を有する独特のＭＬＶは、両種性ウイルスとして知られ、そのエンベロープタンパク質は、ヒトとマウスとの間で保存されるリン酸輸送タンパク質と「ドッキング」するため、ヒト細胞を感染させることができる。この輸送体は遍在しているため、これらのウイルスは、多くの細胞タイプを感染させることができる。しかし、場合によっては、特に安全性の観点から、限られた細胞を特異的に標的とすることが有益なこともある。このために、幾つかのグループは、マウス狭宿主性（その両種親和性系統と異なり、通常、マウス細胞のみを感染させる）レトロウイルスを、特定のヒト細胞を特異的に感染させるように操作した。エリトロポエチンセグメントを含むエンベロープタンパク質のフラグメントを置換すると、赤血球前駆体等の、エリトロポエチンレセプターを表面上に発現するヒト細胞に特異的に結合する組換えレトロウイルスを生じる（Ｍａｕｌｉｋ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ １９９７ "Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ" １９９７． Wｉｌｅｙ−Lｉｓｓ Ｉｎｃ． ｐｐ ４５．）。
【００２３】
複雑レトロウイルスは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて、アクセサリータンパク質すなわち補助タンパク質をコードする「アクセサリー」遺伝子も含む。アクセサリータンパク質すなわち補助タンパク質は、通常の伴複製遺伝子すなわち構造遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖにコードされるものに加えて、アクセサリー遺伝子によりコードされるタンパク質と定義される。これらのアクセサリータンパク質は、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｔａｒおよびｒｅｘによりコードされるもの等の、遺伝子発現の調節に関与するものと異なる。アクセサリー遺伝子の例としては、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕおよびｎｅｆの１つまたは複数を挙げることができる。これらのアクセサリー遺伝子は、たとえば、ＨＩＶにみられる（たとえば、"Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ" Ｅｄ． Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ Ｐｕｂ． ＣＳＨL １９９７の８０２ページ および ８０３ページを参照）。非必須アクセサリータンパク質は、分化した細胞タイプで機能することができ、細胞タンパク質により提供される機能を少なくとも部分的に倍加する機能を提供する。一般に、アクセサリー遺伝子は、ｐｏｌとｅｎｖとの間、ＬＴＲのＵ３領域を含むｅｎｖからすぐ下流、またはｅｎｖの重複部分および互いの重複部分に位置する。
【００２４】
複雑レトロウイルスは、ウイルスによりコードされる転写アクティベーターならびに細胞性転写因子を使用する調節機構を進化させた。これらのトランス作用ウイルスタンパク質は、ＬＴＲにより指令されるＲＮＡ転写のアクティベーターの役割をする。レンチウイルスの転写トランスアクティベーターは、ウイルスのｔａｔ遺伝子によりコードされる。ｔａｔは、ＴＡＲと呼ばれるＲＮＡ二次構造（その１つの機能はＴａｔを最適所に置いて、転写をトランス−活性化することである）である、安定なステム・ループに結合する。
【００２５】
前述の通り、レトロウイルスは、特に、ＮＯＩ、または複数のＮＯＩを、関心のある１つまたは複数の部位に移動させるための送達システム（あるいは、送達媒体または送達ベクターと表現される）として推薦されている。この移送は、それらの組み合わせで起こり得る。この様式で使用するとき、レトロウイルスは、一般に、レトロウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクターと呼ばれる。レトロウイルスベクターは、レセプター使用法、逆転写およびＲＮＡパッケージングを含め、レトロウイルスライフサイクルの様々な態様の研究に利用されてきた（Ｍｉｌｌｅｒ， １９９２ Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８：１−２４による論評）。
【００２６】
遺伝子治療用の一般的な組換えレトロウイルスベクターの場合、ｇａｇタンパク質コード領域、ｐｏｌタンパク質コード領域およびｅｎｖタンパク質コード領域の１つまたは複数の少なくとも一部をウイルスから除去することができる。こうすることにより、レトロウイルスベクターを複製能欠損にさせる。宿主ゲノムにウイルスゲノムを組み込むことができるウイルスを産生するために、除去された部分をＮＯＩと置き換えることも可能であるが、この場合、改変されたウイルスゲノムは構造タンパク質が欠如しているため、それ自体増殖できない。宿主ゲノムに組み込まれるとき、ＮＯＩの発現が起こり、結果として、たとえば、治療効果が生じる。したがって、関心のある部位へのＮＯＩの移動は、一般に、ＮＯＩを組換えウイルスベクターに組み込むこと、改変されたウイルスベクターをビリオン外皮内にパッケージングすること、および関心のある部位、たとえば、標的細胞または標的細胞群への形質導入を可能にすることによって実現される。
【００２７】
パッケージングまたはヘルパー細胞系と、組換えベクターとの組み合わせを使用することにより、次に、たとえば、関心のある部位に形質導入するために、多量のレトロウイルスベクターを増殖させて単離する（たとえば、適当なタイターのレトロウイルスベクターを作成する）ことができる。
【００２８】
場合によっては、増殖および単離が、レトロウイルスのｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子を単離し、宿主細胞に別々に導入して「パッケージング細胞系」を作成することを伴ってもよい。このパッケージング細胞系は、パッケージングレトロウイルスのＤＮＡに必要なタンパク質を産生するが、ｐｓｉ領域が欠如しているため、パッケージングすることはできない。しかし、ＮＯＩおよびｐｓｉ領域を担持する組換えベクターをパッケージング細胞系に導入するとき、ヘルパータンパク質は、ｐｓｉ陽性組換えベクターをパッケージして、組換えウイルスストックを製作することができる。これを使用して、細胞を感染させ、ＮＯＩを細胞のゲノムに導入することができる。ウイルスタンパク質の作成に必要な全ての遺伝子が欠如しているゲノムを有する組換えウイルスは、１度だけ感染させることができ、増殖することはできない。したがって、潜在的に有害なレトロウイルスの世代なしに、宿主細胞ゲノムにＮＯＩが導入される。"Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅ" （１９９７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｏｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＬＭ Ｃｏｆｆｉｎ， ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ， ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ４４９）に、利用できるパッケージング系の概要が掲載されている。
【００２９】
しかし、この技術は、タイターレベルが常に満足のゆくレベルにあるとは限らないという意味で問題がある。それにもかかわらず、特に、初期のデザインで頻繁に直面するヘルパーウイルスの自発的産生の問題を検討するところまで、レトロウイルスのパッケージング細胞系のデザインは進化した。相同性により組換えが非常に容易になるため、ベクターのゲノムとヘルパーのゲノムとの間の相同性を減少または排除することにより、ヘルパーウイルス産生の問題を減少させた。
【００３０】
その後、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖウイルスのコード領域が、それぞれ独立にパッケージング細胞系に形質導入される別々の発現プラスミド上に担持されており、それ故、野生型ウイルスの産生に３つの組換え事象が必要とされるパッケージング細胞が開発された。この方策は、３プラスミドトランスフェクション法と呼ばれることもある（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ １９９５ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：６２８−６３３）。
【００３１】
ベクターを開発するとき、一過性トランスフェクションを使用して、ベクター生成を測定することもできる。この点について、一過性トランスフェクションは、安定なベクター製作細胞系の生成に必要なより長い期間を避けることができ、ベクターまたはレトロウイルスのパッケージング成分が細胞に有毒である場合、使用される。レトロウイルスベクターの製作に一般に使用される構成要素は、Ｇａｇ／Ｐｏｌタンパク質をコードするプラスミド、ｅｎｖタンパク質をコードするプラスミドおよびＮＯＩを含むプラスミドを含む。ベクター生成は、その他の必要な成分を含む細胞内に、これらの成分の１つまたは複数を一時的にトランスフェクトすることを含む。ベクターが、有毒な遺伝子または宿主細胞の複製を妨害する遺伝子、たとえば、細胞周期の阻害剤またはアポトーシスを誘導する遺伝子をコードするのであれば、安定なベクター製作細胞系を製作することは困難であろうが、一過性トランスフェクションを使用して、細胞が死ぬ前にベクターを製作することができる。また、一過性の感染を使用して、安定なベクター製作細胞系から得られるレベルに匹敵するベクタータイターレベルを生じる細胞系が開発された（Ｐｅａｒ ｅｔ ａｌ １９９３， ＰＮＡＳ ９０：８３９２−８３９６）。
【００３２】
幾つかのＨＩＶタンパク質の毒性（安定なＨＩＶを基にしたパッケージング細胞の製作を困難にする可能性がある）を考慮して、ＨＩＶベクターは、通常、ベクターおよびヘルパーウイルスの一過性トランスフェクションにより製作される。ＨＩＶＥｎｖタンパク質を水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のｅｎｖタンパク質と置き換えた研究者さえいる。一過性トランスフェクションにより５×１０5（濃縮後１０8）のタイターを有するＨＩＶ／ＶＳＶ−Ｇベクターを製作したように、ＶＳＶのＥｎｖタンパク質を挿入すると、ベクター濃縮が容易になる（Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ １９９６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−２６７）。したがって、ＨＩＶベクターの一過性トランスフェクションは、高タイターベクターを製作するための有用な方策を提供することが可能である（Yｅｅ ｅｔ ａｌ １９９４ ＰＮＡＳ ９１：９５６４−９５６８）。しかし、この方法による欠点は、ＶＳＶ−Ｇタンパク質が細胞に対してかなり有毒なことである。
【００３３】
ｅｎｖ遺伝子と異種ｅｎｖ遺伝子との置き換えは、シュードタイピング（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）と呼ばれる技術または方策の一例である。シュードタイピングは、新しい現象ではなく、WＯ−Ａ−９８／０５７５９、WＯ−Ａ−９８／０５７５４、WＯ−Ａ−９７／１７４５７、WＯ−Ａ−９６／０９４００、WＯ−Ａ−９１／０００４７およびＭｅｂａｔｓｉｏｎ ｅｔ ａｌ １９９７ Ｃｅｌｌ ９０， ８４１−８４７に例が見られる。
【００３４】
シュードタイピングは、１つまたは複数の利点を与えることができる。たとえば、レンチウイルスのベクターを使用すると、ＨＩＶを基にしたベクターのｅｎｖ遺伝子産物は、ＣＤ４と呼ばれるタンパク質を発現する細胞のみを感染させるように、これらのベクターを制限するようになる。しかし、これらのベクターのｅｎｖ遺伝子が、他のＲＮＡウイルス由来のｅｎｖ配列と置換されると、その時には、より広い感染性スペクトルを有する可能性がある（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ １９９７ Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９− ２４２）。前述の通り、また例として、研究者らは、ＶＳＶ由来の糖タンパク質を含むＨＩＶを基にしたベクターを、シュードタイプした（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ １９９７ 同書）。
【００３５】
また、例として、レトロウイルスｅｎｖタンパク質の相対的な脆弱性によって、レトロウイルスベクターを濃縮できる能力が限定される可能性があり、ウイルスを濃縮すると、ウイルスの回収が不十分になる。レトロウイルスＥｎｖタンパク質をより安定なＶＳＶ−Ｇタンパク質と置換して、収率の高い、より効率的なベクター濃度が可能になり、この問題をある程度まで克服することができる（Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ １９９６． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−２６７）。
【００３６】
しかし、ＶＳＶ−Ｇタンパク質を用いたシュードタイピングが常に望ましいとは限らない。これは、ＶＳＶ−Ｇタンパク質が細胞障害性であるためである（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １００５７およびその中に引用の参考文献）。
【００３７】
それゆえ、無毒で且つレトロウイルスベクターのシュードタイピングに使用することができる他のタンパク質を発見することが望ましい。
したがって、本発明は、改良されたレトロウイルスベクターを提供しようとするものである。
【００３８】
本発明の態様によれば、標的部位に形質導入することが可能なレトロウイルス送達システムであって、エンベロープタンパク質の少なくとも一部をコードする第１のヌクレオチド配列、およびレトロウイルス送達システムにより標的部位への形質導入を確実にするレトロウイルスから誘導できる１つまたは複数の他のヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列は、前記その他のヌクレオチド配列の少なくとも１つに関して異種であり、第１のヌクレオチド配列は、標的部位を認識することができる狂犬病Ｇタンパク質またはその突然変異体、変異型、誘導体またはフラグメントの少なくとも一部をコードすることを特徴とするレトロウイルス送達システムが提供される。
【００３９】
本発明のレトロウイルス送達システムは、１つの実体(entity)を含むことができる。あるいは、本発明のレトロウイルス送達システムは、共同して、本発明のレトロウイルス送達システムを提供する複数の実体を含むことができる。これらのウイルス送達システムの例としては、Ｓａｖａｒｄ ｅｔ ａｌ １９９７， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１（５）：４１１１−４１１７； Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ １９９７， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５（９）：８６６−８７０； および英国特許出願第９７２０４６５．５号に記載されているような、ヘルペスウイルスおよびアデノウイルスが挙げられるが、その限りではない。
【００４０】
用語「誘導可能な」は、必ずしもレトロウイルスから得る必要はなく、それから誘導することができる配列を意味するという、通常の意味で使用される。例として、この配列を合成的に、もしくは組換えＤＮＡ技術を使用して、製作することができる。
【００４１】
本発明の第２の態様によれば、本発明によるレトロウイルス送達システムから得られるウイルス粒子が提供される。
【００４２】
本発明の第３の態様によれば、レトロウイルスベクターが本発明の第１の態様によるレトロウイルス送達システムであるか、それから得られる、レトロウイルスベクターが提供される。
【００４３】
本発明の第４の態様によれば、本発明によるレトロウイルス送達システム、本発明によるウイルス粒子、または本発明によるレトロウイルスベクターを用いて形質導入された細胞が提供される。
【００４４】
本発明の第５の態様によれば、医薬用の、本発明によるレトロウイルス送達システム、本発明によるウイルス粒子、本発明によるレトロウイルスベクターが提供される。
【００４５】
本発明の第６の態様によれば、ＮＯＩを必要とする標的部位に、それを送達するための医薬組成物の製造において、本発明によるレトロウイルス送達システム、本発明によるウイルス粒子、本発明によるレトロウイルスベクターを使用することができる。
【００４６】
本発明の第７の態様によれば、細胞を、本発明によるレトロウイルス送達システム、または本発明によるウイルス粒子、または本発明によるレトロウイルスベクターと接触させることを含む方法が提供される。
【００４７】
本発明の第８の態様によれば、本発明によるレトロウイルス送達システム、本発明によるウイルス粒子、本発明によるレトロウイルスベクターを提供するためのベクターであって、狂犬病Ｇタンパク質またはその突然変異体、変異型、誘導体またはフラグメントの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含むベクターが提供される。
【００４８】
本発明の第９の態様によれば、本発明によるレトロウイルス送達システム、本発明によるウイルス粒子、または本発明によるレトロウイルスベクターを提供するためのプラスミドであって、狂犬病Ｇタンパク質またはその突然変異体、変異型、誘導体またはフラグメントの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドが提供される。
【００４９】
本発明の第１０の態様によれば、少なくとも１つのプラスミドが、本発明によるプラスミドであり、少なくとも１つの他のプラスミドがレトロウイルスから誘導できる１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、複数のプラスミドが提供される。
【００５０】
本発明の第１１の態様によれば、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターまたはレトロウイルス粒子の感染性プロフィールに影響を及ぼすために、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターまたはレトロウイルス粒子をシュードタイプするのに、狂犬病Ｇタンパク質を使用することができる。
【００５１】
本発明の第１２の態様によれば、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターまたはレトロウイルス粒子の宿主範囲および／または細胞親和性に影響を及ぼすために、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターまたはレトロウイルス粒子をシュードタイプするのに、狂犬病Ｇタンパク質を使用することができる。
【００５２】
本発明の第１３の態様によれば、狂犬病Ｇタンパク質を用いてシュードタイプされたレトロウイルスまたはレトロウイルスベクターまたはレトロウイルス粒子が提供される。
【００５３】
本発明の第１４の態様によれば、異種ｅｎｖ領域が狂犬病Ｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を含む、異種ｅｎｖ領域を含むレトロウイルス送達システムが提供される。
【００５４】
本発明の第１５の態様によれば、異種ｅｎｖ領域が狂犬病Ｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、異種ｅｎｖ領域を含むレトロウイルス送達システムが提供される。
【００５５】
第１のヌクレオチド配列は、狂犬病Ｇタンパク質またはその突然変異体、変異型、誘導体またはフラグメントの全てをコードすることが好ましい。
【００５６】
他のヌクレオチド配列の少なくとも１つは、レンチウイルスまたはオンコレトロウイルスから誘導できることが好ましい。
【００５７】
その他のヌクレオチド配列は、レンチウイルスまたはオンコレトロウイルスから誘導できることが好ましい。
【００５８】
その他のヌクレオチド配列は、ＭＬＶ、ＨＩＶまたはＥＩＡＶから誘導できることが好ましい。
【００５９】
レトロウイルス送達システムは、少なくとも１つのＮＯＩを含むことが好ましい。
【００６０】
ＮＯＩは治療効果を有するか、治療効果を有するタンパク質をコードすることが好ましい。
【００６１】
標的部位は細胞であることが好ましい。
【００６２】
したがって、本発明は、異種エンベロープタンパク質を有するレトロウイルスベクターを提供する。このレトロウイルスベクターは、遺伝子療法に有用である。
【００６３】
本発明の重要な態様は、狂犬病タンパク質、特に、狂犬病Ｇタンパク質を含む、コードするヌクレオチド配列を用いた、レトロウイルス、および／または誘導可能なもしくはレトロウイルスを基にしたレトロウイルスベクターのシュードタイピングである。ここで、用語シュードタイピングは、別のウイルス由来のタンパク質を、ウイルスゲノムまたはウイルスベクターのｅｎｖ遺伝子の少なくとも一部に組み込むこと、一部と置換すること、全てを置き換えることを意味する。
【００６４】
狂犬病Ｇタンパク質、ならびにその突然変異体に関する教示は、Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９８２ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．４３： ３６１−３６４， Ｈａｎｈａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，６７，５３０−５４２， Ｔｕｆｆｅｒｅａｕｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２， １０８５−１０９１， Ｋｕｃｅｒａ ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ５５， １５８−１６２， Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．， １９８３ ＰＮＡＳ ８０， ７０−７４， Ｓｅｉｆ ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ５３，９２６−９３４， Ｃｏｕｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，７２，２７３−２７８， Ｔｕｆｆｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，７２， １０８５−１０９１０， Ｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ ６５， ４１９８−４２９３， Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ １９９８ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４２， １８７−１９３， Ｃｏｌｌ １９９７ Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４２， ２０８９−２０９７， Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ ５１， ３５−４１， Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ １９９８ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４２２， １８７−１９３， Ｃｏｌｌ １９９５ Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４０， ８２７−８５１， Ｔｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．， １９９２ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ ２５， １−１３， Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ １９９２ ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８９， ２０３−２１６， Ｇａｕｄｉｎ ｅｔ ａｌ １９９２ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８７， ６２７−６３２， Ｗｈｉｔｔ ｅｔａｌ １９９１ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５， ６８１−６８８， Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ １９７８ Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ４０， １３１−１３９， Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ １９７８ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ ４０， ４５−５５， Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ １９７８ Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ２３， ２８６−２９３及びＯｔｃｏｓｅｔａｌ １９９４ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２２４，６８−７６にある。狂犬病Ｇタンパク質は、欧州特許ＥＰ−Ａ−０４４５６２５号にも記載されている。
【００６５】
本発明による狂犬病Ｇタンパク質を使用すると、優先的に標的細胞にｉｎ ｖｉｖｏで形質導入し、この細胞を狂犬病ウイルスが優先的に感染させるベクターを得ることができる。この中には、特に、ｉｎ ｖｉｖｏでのニューロン標的細胞が含まれる。ニューロンを標的としたベクターの場合、ＥＲＡ等の、狂犬病の病原性株由来の狂犬病Ｇが特に有効である。その反面、狂犬病Ｇタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験したほぼ全ての哺乳類細胞タイプおよび鳥類細胞タイプを含む広い標的細胞範囲を与える（Ｓｅｇａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．， １９９０ Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ． ３４， １５５−１６３； Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｖｏｌ．２， Lｉｐｐ ｉｎｃｏｔｔ− Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｎｅw Yｏｒｋ）。関心のある他の細胞タイプを感染させる能力を与えることも、多分、確認されるであろう。したがって、本発明による狂犬病Ｇタンパク質を使用すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも、多種多様の細胞タイプに形質導入するベクターを提供することもできる。ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで異なる狂犬病ウイルスの親和性は、狂犬病Ｇが一連のレセプターに結合できる能力（その一部はｉｎ ｖｉｔｒｏのみで活性である）に起因すると考えられる。
【００６６】
あるいは、本発明にしたがってシュードタイプされたベクター粒子の親和性は、細胞外ドメイン内で改変される突然変異体狂犬病Ｇを使用することにより、改変することが可能である。狂犬病Ｇタンパク質には、標的細胞範囲を制限するように突然変異させることが可能であるという利点がある。ｉｎ ｖｉｖｏでの標的細胞による狂犬病ウイルスの取り込みには、アセチルコリンレセプター（ＡｃｈＲ）が介在するが、ｉｎ ｖｉｖｏで結合する他のレセプターもある（Ｈａｎｈａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９３ J． Ｖｉｒｏｌ．， ６７， ５３０−５４２； Ｔｕｆｆｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８ J． Ｖｉｒｏｌ．， ７２， １０８５−１０９１）。狂犬病Ｇタンパク質の抗原性部位ＩＩＩにおける突然変異がウイルス親和性に及ぼす作用について研究が行われており、この領域は、ウイルスのアセチルコリンレセプターへの結合に関与していないと考えられている（Kｕｃｅｒａ ｅｔ ａｌ．， １９８５ J． Ｖｉｒｏｌ ５５， １５８− １６２； Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．， １９８３ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８０， ７０−７４； Ｓｅｉｆ ｅｔ ａｌ．， １９８５ J．Ｖｉｒｏｌ．， ５３， ９２６−９３４； Ｃｏｕｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８ J． Ｖｉｒｏｌ．， ７２， ２７３−２７８； Ｔｕｆｆｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８ J． Ｖｉｒｏｌ．， ７２， １０８５−１０９１０）。たとえば、成熟タンパク質のアミノ酸３３３におけるアルギニンの、グルタミンへの突然変異を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでのウイルスの嗅覚器官および末梢ニューロンへの侵入を制限すると同時に、中枢神経系への増殖を減少させることができる。これらのウイルスは、ｗｔウイルスと同じぐらい効率よく運動ニューロンおよび感覚ニューロンを透通することができたが、経ニューロン移動は起こらなかった（Ｃｏｕｌｏｎ ｅｔ ａｌ． １９８９ J． Ｖｉｒｏｌ． ６３ ３５５０−３５５４）。アミノ酸３３０が突然変異したウイルスの筋内注射後に、運動ニューロンまたは感覚ニューロンのいずれも感染させることができないところまで、さらに弱毒化する（Ｃｏｕｌｏｎ ｅｔ ａｌ． １９９８ J． Ｖｉｒｏｌ． ７２ ２７３−２７８）。
【００６７】
代替的に、又は追加の手法として、狂犬病の実験用継代株由来の狂犬病Ｇタンパク質を使用してもよい。親和性の変化について、これらをスクリーニングすることができる。このような株として、以下のものが挙げられる。
【００６８】
【表１】
【００６９】
例として、ＥＲＡ株は、狂犬病の病原性株であり、ニューロン細胞への形質導入に、この株由来の狂犬病Ｇタンパク質を使用することができる。ＥＲＡ株由来の狂犬病Ｇの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに存在する（寄託番号J０２２９３）。このタンパク質は、１９アミノ酸のシグナルペプチドを有し、成熟タンパク質は、翻訳開始メチオニンから２０アミノ酸のリジン残基で開始する。ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株は、低減した病原性と関連し、且つウイルスエンベロープの親和性を制限するのに使用することができる、成熟タンパク質のアミノ酸３３３位におけるアルギニンからグルタミンまでの突然変異を含む。
【００７０】
狂犬病Ｇタンパク質の一例を配列番号２として示し、そのコード配列を配列番号１として表す。本発明は、これらの配列の変異型、相同物(homologue)または誘導体を含む。
【００７１】
本発明の好ましい酵素に関するアミノ酸配列に関連した用語「変異型」、「相同物」または「フラグメント」は、配列からもしくは配列への、１つ（または複数）のアミノ酸の置換、変異、修飾、置き換え、欠失または付加のいずれかを含むが、但し、結果として得られるタンパク質が、Ｇタンパク質活性および／またはＧタンパク質特性またはプロフィールを有し、配列番号２として示したＧタンパク質と少なくとも同じぐらい生物学的に活性であることが好ましい。特に、用語「相同物」は、構造および／または機能に関して相同を含む。配列相同に関しては、配列番号２として示した配列と、好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％の相同性がある。さらに好ましくは、配列番号２として示した配列と、少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性がある。
【００７２】
本発明の好ましい酵素をコードするヌクレオチド配列に関連した用語「変異型」、「相同物」または「フラグメント」は、配列からもしくは配列への、１つ（または複数の）核酸の、置換、変異、修飾、置き換え、欠失または付加を含むが、但し、結果として得られるヌクレオチド配列は、Ｇタンパク質活性および／またはＧタンパク質特性またはプロフィールを有するタンパク質をコードするか、コードすることができ、配列番号１として示した配列によりコードされるＧタンパク質と少なくとも同じぐらい生物学的に活性であることが好ましい。特に、用語「相同物」は、構造および／または機能に関して相同を含むが、但し、結果として得られるヌクレオチド配列は、Ｇタンパク質活性および／またはＧタンパク質特性またはプロフィールを有するタンパク質をコードするか、コードすることができる。配列の相同性に関しては、配列番号１として示した配列と、好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％の相同性がある。さらに好ましくは、配列番号１として示した配列と、少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性がある。
【００７３】
特に、本明細書で使用する用語「相同」は、用語「同一性」と等価とみなされる。相対的配列相同（すなわち配列同一性）は、２つ以上の配列間の％相同を算出することができる市販のコンピュータープログラムによって決定することができる。このようなコンピュータープログラムの代表例はＣＬＵＳＴＡＬである。
【００７４】
用語「変異型」、「相同物」または「フラグメント」は、配列の対立遺伝子変異と同義である。
【００７５】
用語「変異型」は、本明細書に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる配列に相補的な配列も含む。好ましくは、用語「変異型」は、ストリンジェントな条件（たとえば、６５℃および０．１ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０｝）で、本明細書に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる配列に相補的な配列を含む。
【００７６】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列（本明細書に記載のものの相補的配列を含む）にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列も含む。好ましい態様では、本発明は、ストリンジェントな条件（たとえば、６５℃および０．１ ＳＳＣ）で、本明細書のヌクレオチド配列（本明細書に記載のものの相補的配列を含む）にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む。
【００７７】
ＶＳＶ糖タンパク質と比較して、狂犬病糖タンパク質を使用する主な利点は、狂犬病ワクチンが長く使用されてきたため、ヒトおよび他の動物に対する毒性が詳しくわかっていることである。特に、カナリヤ痘組換えウイルスから発現される狂犬病糖タンパク質のヒトワクチンとしての使用に関する、フェーズＩ臨床治験が報告され（Ｆｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｖａｃｃｉｎｅ １４， ４２８−４３４）、これらの研究で、このワクチンは、ヒトに使用して安全であると結論づけられた。
【００７８】
本発明のレトロウイルスベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞に１つまたは複数のＮＯＩを送達するのに、特に、治療上有効なＮＯＩを送達するのに有用である。１つまたは複数の選択されたＮＯＩを、標的細胞で発現させるためのベクターゲノムに組み込むことができる。ＮＯＩは、１つまたは複数の、それ自身の発現調節配列を具有してもよく、その発現をベクターＬＴＲで調節してもよい。ＮＯＩを適切に発現するために、ＬＴＲ内またはＬＴＲ間に、ある一定の条件下またはある一定の細胞タイプで、優先的に活性であるプロモーターを含めてもよい。ＮＯＩは、センス配列であってもよく、アンチセンス配列であってもよい。さらに、複数のＮＯＩが存在する場合、これらのＮＯＩは、センス配列であってもよく、アンチセンス配列であってもよく、あるいはそれらの組み合わせであってもよい。
【００７９】
本発明のレトロウイルスベクターゲノムは、一般に、５'末端および３'末端におけるＬＴＲ、治療上有効な遺伝子および／またはマーカー遺伝子を含む１つまたは複数のＮＯＩ、または１つまたは複数のＮＯＩ（ｓ）を挿入するための適当な挿入部位、およびプロデューサー細胞内のベクター粒子内にゲノムをパッケージできるようにするパッケージングシグナルを含む。ベクターＲＮＡのＤＮＡへの逆転写およびプロウイルスＤＮＡの標的細胞ゲノムへの組み込みを可能にするための、適当なプライマー結合部位および組み込み部位さえ存在する可能性がある。好ましい実施形態では、レトロウイルスベクター粒子は、逆転写システム（適合した逆転写部位およびプライマー結合部位）および組み込みシステム（適合したインテグラーゼおよび組み込み部位）を有する。
【００８０】
したがって、本発明によれば、ウイルス遺伝子が１つまたは複数のＮＯＩで置き換えられるか、または１つまたは複数のＮＯＩを補足されるように、ウイルスゲノムまたはレトロウイルスベクターヌクレオチド配列を操作することが可能である。ＮＯＩは、選択遺伝子、マーカー遺伝子および治療用のいずれか１つまたは複数であってもよい。レトロウイルスベクターに、多くの異なる選択可能なマーカーが申し分なく使用されてきた。これらは、"Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ"（１９９７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｏｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＬＭ Ｃｏｆｆｉｎ， ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ， ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ４４４）で検討されており、その例として、細菌のネオマイシン遺伝子およびヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（それぞれ、Ｇ４１８およびヒグロマイシンに対する耐性を与える）、突然変異体マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（メトトレキサートに対する耐性を与える）、細菌のｇｐｔ遺伝子（マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、キサンチンおよびアミノプテリンを含む培地中で細胞を成長させる）、細菌のｈｉｓＤ遺伝子（ヒスチジンを含むがヒスチジノールを含まない培地中で細胞を成長させる）、多剤耐性遺伝子（ｍｄｒ）（様々な薬剤に対する耐性を与える）、およびピューロマイシンまたはフレオマイシンに対する耐性を与える細菌遺伝子が挙げられるが、その限りではない。これらのマーカーは全て、優性遺伝子選択可能であり、且つこれらの遺伝子を発現するほとんどの細胞を化学的に選択することが可能である。
【００８１】
本発明によれば、遺伝子それ自体が治療効果を誘発できてもよく、あるいは、治療効果を誘発することができる生成物をコードしてもよいという意味で、ＮＯＩは治療用遺伝子であり得る。
【００８２】
治療用ＮＯＩの非限定的例としては、腫瘍サプレッサータンパク質、サイトカイン類、抗ウイルスタンパク質、免疫調節分子、抗体、操作されたイムノグロブリン様分子、融合タンパク質、ホルモン類、膜タンパク質、血管作用性タンパク質またはペプチド、成長因子、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、酵素、プロドラッグ活性化酵素等のプロドラッグ、細胞障害性薬剤、および酵素阻害剤をコードする遺伝子が挙げられる。
【００８３】
プロドラッグの例としては、リン酸エトポシド（アルカリホスファターゼと一緒に使用される）、５−フルオロシトシン（シトシンデアミナーゼと一緒に使用される）；ドキソルビシン−Ｎ−ｐ−ヒドロキシフェノキシアセトアミド（ペニシリン−Ｖ−アミダーゼと一緒に使用される）、パラ−Ｎ−ビス（２−クロロエチル）グルタミン酸アミノベンゾイル（カルボキシペプチダーゼＧ２と一緒に使用される）、セファロスポリンナイトロジェンマスタードカルバメート（Ｂ−ラクタマーゼと一緒に使用される）、ＳＲ４２３３（ｐ４５０還元酵素と一緒に使用される）、ガンシクロビル（ＨＳＶチミジンキナーゼと一緒に使用される）、ニトロリダクターゼおよびシクロホスファミドまたはイホスファミドを含むマスタードプロドラッグ（チトクロームｐ４５０と一緒に使用される）が挙げられるが、その限りではない。
【００８４】
治療することが可能な疾患としては、癌、心疾患、脳卒中、神経変性疾患、関節炎、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、免疫システム疾患、ウイルス感染、腫瘍、血液凝固障害、およびレッシュ−ナイハン症候群、パーキンソン病、膿胸、フェニルケトン尿症、鎌形赤血球貧血、α−サラセミア、β−サラセミア、ゴーシュ病等の慢性肉芽腫症遺伝病が挙げられるが、その限りではない。
【００８５】
レトロウイルスベクターを使用した遺伝子療法用の標的細胞としては、造血細胞（単球、マクロファージ、リンパ球、顆粒球、またはこれらのいずれかの前駆細胞を含む）、内皮細胞、腫瘍細胞、ストロマ細胞、星状細胞、またはグリア細胞、筋細胞、上皮細胞、ニューロン、線維芽細胞、肝細胞、星状細胞、および肺細胞が挙げられるが、その限りではない。
【００８６】
本発明のレトロウイルスベクター内で、１つまたは複数のＮＯＩは、ウイルスＬＴＲの転写調節下にあってもよい。あるいは、より高いレベルの発現を実現するために、エンハンサー−プロモーターエレメントの組み合わせが存在してもよい。プロモーター−エンハンサーエレメントは、好ましくは、標的細胞内で、強く活性であるかまたは強力に誘導することができる。強く活性なプロモーター−エンハンサー組み合わせの１例は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）主要中間初期（ＭＩＥ）プロモーター／エンハンサー組み合わせである。プロモーター−エンハンサー組み合わせは、それらの活性が組織制限的であってもよく、時間制限的であってもよい。ＭＵＭ遺伝子またはＣＥＡ遺伝子由来のプロモーター−エンハンサー等の、適当な組織制限プロモーター−エンハンサー組み合わせの例は、腫瘍細胞内で極めて活性である。
【００８７】
低酸素または虚血制御可能な発現も、ある一定の環境で、特に有用な可能性がある。低酸素は、広範囲の異なる細胞タイプで遺伝子発現の強力なレギュレーターであり、様々な遺伝子プロモーター上の低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）である、同族のＤＮＡ認識部位に結合する低酸素誘導可能因子−Ｉ（ＨＩＦ−１）等の、低酸素−誘導可能な転写因子の活性の誘導によって作用する（Wａｎｇ ａｎｄ Ｓｅｍｅｎｚａ １９９３ ＰＮＡＳ．（ＵＳＡ） ９０：４３０）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは低酸素に応答して、またｉｎ ｖｉｖｏでは充実性腫瘍内で、ヒト線維腫細胞によるマーカー遺伝子と治療用遺伝子の両者の発現の調節に、マウスホスホグリセレートキナーゼ−Ｉ（ＰＧK−１）遺伝子由来のＨＲＥの多重結合型が使用されてきた。（Ｆｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ １９９４， ＰＮＡＳ ９１０４）：６４９６−６５００； Ｄａｃｈｓ ｅｔ ａｌ １９９７ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ５：５１５）。あるいは、腫瘍の虚血領域にグルコース欠乏も存在することを使用して、特に腫瘍における異種遺伝子発現を活性化することができる。グルコース欠乏により特異的に活性化されることが知られているｇｒｐ７８遺伝子プロモーターの末端を切断した６３２塩基対配列は、ｉｎｖｉｖｏで、ネズミ腫瘍におけるレポーター遺伝子の高レベル発現を推進できることが証明されている（Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ １９９５ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５： １６６０)。
【００８８】
次の遺伝子療法に使用するための本発明のレトロウイルスベクターゲノムは、ベクターとして効率よく機能するのに必要な最小限のレトロウイルス物質を含むことが好ましい。この目的は、ＮＯＩを組み込むための空間を与えるためと、安全性の理由である。レトロウイルスベクターゲノムは、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子によりコードされる構造（またはパッケージング）成分の１つまたは複数をコードする機能遺伝子が欠けていることによる複製能欠損であることが好ましい。粒子製作に必要な、欠けている成分は、プロデューサー細胞において、トランスで提供される。ゲノムにウイルス構造成分が欠けていることは、標的細胞で発現されるウイルスタンパク質に対して発生する望ましくない免疫応答が、減少するか回避されることも意味する。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏ使用を考慮する場合、感染性ウイルス粒子の可能な再建を避けることが好ましい。したがって、組換えの機会を減少させるために、できる限り、ウイルスの構造成分をゲノムから排除することが好ましい。
【００８９】
本発明のレトロウイルスベクター粒子は、一般に、適当なプロデューサー細胞で生成される。プロデューサー細胞は、一般に、哺乳類細胞であるが、たとえば昆虫細胞であってもよい。プロデューサー細胞は、通常はそのゲノムに組み込まれる、ウイルス構造遺伝子を含むパッケージング細胞であってもよい。次いで、感染性の複製能欠損ベクター粒子を製作するために、ベクターゲノムをコードする核酸を、パッケージング細胞に形質導入する。あるいはプロデューサー細胞に、ベクターゲノムおよび構造成分をコードする核酸配列、および／またはプラスミド、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターまたは機能的ＤＮＡを標的細胞に送達することがわかっているいずれかの方法の１つまたは複数の発現ベクター上に存在する核酸配列を共形質導入する。
【００９０】
本発明の好ましい実施形態に従って、筆者らは、狂犬病ウイルス由来のエンベロープタンパク質、すなわち、狂犬病Ｇタンパク質が、多種多様のレトロウイルスベクターを効率よくシュードタイプできることを予期せず発見した。この中には、ＭＬＶ等のネズミオンコレトロウイルスから構築されるベクターのみならず、ＨＩＶ等の霊長類レンチウイルスから構築されるベクターおよび非霊長類レンチウイルス等のウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）から構築されるベクターも含まれる。
【００９１】
１つの実施形態では、本発明のベクターは、レンチウイルスから構築されるか誘導される。これは、ベクターが非分裂細胞および分裂細胞に形質導入を行うことができる可能性があるという利点を有する。
【００９２】
したがって、本発明によるシュードタイピングに好ましいレトロウイルスベクターは、ＨＩＶベクターまたはＥＩＡＶベクター等のレンチウイルスベクターである。これらには、上記の利点がある。特に、狂犬病ウイルス標的細胞範囲を有する狂犬病Ｇでシュードタイプされたレンチウイルスベクターは、ニューロン等の、中枢神経系の非分裂細胞に形質導入を行うことができる。
【００９３】
本発明の発見は非常に目覚しい。この点に関して、狂犬病およびＶＳＶは、（５つの異なる下位群を含む非常に大きいファミリーである）が、それら（すなわちＶＳＶおよび狂犬病）は、異なる下位群にある。さらに、狂犬病Ｇタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇとの相同性をほとんど持たない（Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９８２ J． Ｖｉｒｏｌ． ４３： ３６１− ３６４）。この狂犬病Ｇタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇよりもはるかに長い細胞質ドメインも有し、２８〜３１アミノ酸のＶＳＶ−Ｇ細胞質ドメインに対して約４４アミノ酸（長さ）である。したがって、１４４アミノ酸ＨＩＶ−１細胞質の尾部の末端切断には、効率よくＭＬＶ粒子をシュードタイプする必要があることを考えると（Ｍａｍｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７ J． Ｖｉｒｏｌ． ７１：３３４１−３３４５）、狂犬病Ｇタンパク質がＭＬＶをシュードタイプできるという発見は予想外である。狂犬病Ｇタンパク質が、他のレトロウイルス、たとえば、レンチウイルス群のウイルスをさらにシュードタイプできることも意外である。
【００９４】
したがって、本発明は、１つの態様において、狂犬病ウイルスＧタンパク質でシュードタイプしたレトロウイルスベクター粒子を提供する。
【００９５】
別の態様では、本発明は、狂犬病ウイルスＧタンパク質をコードする核酸配列、レトロウイルスベクターゲノムをコードする核酸配列、および任意に、そのゲノムを含む感染性レトロウイルスベクター粒子の製作に必要なパッケージング成分をコードする１つまたは複数のさらなる核酸配列を含む、レトロウイルスベクター製作システムを提供する。
【００９６】
さらなる態様では、本発明にしたがって、レトロウイルスベクターの標的細胞範囲を変えるために狂犬病ウイルスＧタンパク質を使用することができる。
【００９７】
別の態様では、本発明は、狂犬病ウイルスＧタンパク質を含むエンベロープを有するレトロウイルスベクター粒子を製作する方法であって、本明細書に記載の、プロデューサー細胞内のレトロウイルスベクター製作システムを提供することと、上記プロデューサー細胞をベクター粒子成分の発現およびベクター粒子の製作に適した条件に供することと、ベクター粒子を上澄から回収することとを含む方法を提供する。
【００９８】
さらに別の態様では、本発明は、標的細胞にＮＯＩを形質導入する方法であって、本明細書に記載のレトロウイルスベクター粒子と上記細胞を接触させることと、ＮＯＩが標的細胞ゲノム内に侵入するように、ベクターが付着し、細胞内に侵入できる条件でＮＯＩを担持することを含む方法を提供する。
【００９９】
本発明によるベクターのエンベロープ内に存在する狂犬病Ｇタンパク質に加えて、１つまたは複数の他のエンベロープタンパク質も存在してもよい。この中には、たとえば、レトロウイルスの天然のエンベロープタンパク質も含まれる。シュードタイピングタンパク質に加えて天然のエンベロープタンパク質を使用することは、エンベロープの安定性および／または機能に有益な可能性がある。ベクターの感染性プロフィールを広げることさえ可能である。
【０１００】
本発明は、遺伝子療法によって個体を治療するための医薬組成物であって、本発明によるレトロウイルスベクターの治療有効量を含む組成物を提供する。この医薬組成物は、ヒト用または動物用である。一般に、医師が、個々の対象者に最も適当であろう実際の投与量を決定するが、これは、年齢、体重および個々の患者の応答によって様々であろう。
【０１０１】
本組成物は、薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤、または補助剤を任意に含んでもよい。製剤担体、担体、賦形剤または希釈剤の選択は、所期の投与経路および標準的な製剤実施に関して、選択することができる。この医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として、あるいは担体、賦形剤または希釈剤に加えて、適当なバインダー、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤、およびウイルスが標的部位に侵入するのを助けるまたは増進することが可能な他の担体剤（たとえば脂質送達システム等）を含んでもよい。
【０１０２】
適当な場合、吸入、坐剤またはペッサリーの形で、ローション、溶液、クリーム、軟膏、または粉剤の形で局所的に、皮膚パッチを使用して、スターチまたはラクトース等の賦形剤を含む錠剤の形で、単独または賦形剤との混合物のいずれかのカプセルもしくは小卵内で、または調味料もしくは着色剤を含むエリキシル、溶液もしくは懸濁液の形で経口的に投与する方法のうち、いずれか１以上の方法によって、本医薬組成物を投与することができる。あるいは、本医薬組成物を、非経口的に、たとえば海綿体内、静脈内、筋内または皮下に注射することができる。非経口投与の場合、溶液を血液と等張にするために、他の物質、たとえば十分な塩類または単糖類を含んでもよい無菌水溶液の形で、本組成物を最もよく使用することができる。頬投与または舌下投与の場合、従来の方式で調剤することが可能な錠剤もしくはトローチ剤の形で、本組成物を投与することができる。
【０１０３】
したがって、要約すると、本発明は、異種エンベロープタンパク質、特に狂犬病ウイルスＧタンパク質を有するレトロウイルスベクターに関する。本発明は、狂犬病ウイルスＧタンパク質を含むエンベロープを有するレトロウイルスベクターを製作するための、レトロウイルスベクター製作システム、ならびに、ベクターおよびシステムを製作する方法、およびベクターおよびシステムの使用を含む方法にも関する。
【０１０４】
次に、単なる例として、また下記の図を参照しながら、本発明を説明する。ここで、
図１は、プラスミド地図を表す図であり、
図２は、ｇｅｌの写真であり、
図３は、一組の略線図であり、
図４は、グラフを表し、
図５は、２つのグラフを表し、
図６は、略線図を表す。
【０１０５】
例１−狂ｆ犬病Ｇタンパク質を発現するベクターの製作および使用した他のベクターの詳細。
ｐＳＧ５ｒａｂｇｐ（Ｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７２． ３５９−３６７）由来の１．７ｋｂｐのＢｇｌＩＩ狂犬病Ｇフラグメント（株ＥＲＡ）を、ＢａｍＨＩ消化および再連結によりｇｐｔ遺伝子が除去されたｐＧWｌＨＧ誘導体（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ １９９５ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：６２８−６３３）であるｐＳＡ９１（図１）にクローニングすることにより、狂犬病Ｇに関する発現ベクターを構築した。この構築物ｐＳＡ９１ＲｂＧはヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時型初期遺伝子プロモーター−エンハンサーから狂犬病Ｇを発現させることができる。Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ １９９５（同書）に記載の方法で、このプラスミドを、ｐＯＮＹ３（後述の構築に関する詳細を参照）およびｐＯＮＹ２．１ｎｌｓＬａｃＺ（後述の構築に関する詳細を参照）と一緒に２９３Ｔ細胞に形質導入し、形質導入した細胞における狂犬病Ｇの発現を、ウエスタンブロッティングによって確認した。狂犬病Ｇの代わりにＨＣＭＶの調節下でＶＳＶ−ＧがｐＳＡ９１で発現されたＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを、陰性対象として使用した。形質導入細胞をＰＢＳで洗浄し、用時調製した１ｍＭ ＰＭＳＦを含むＲＩＰＡ緩衝溶液で溶解し、製造会社の仕様書に従ってＢＣＡタンパク質定量化試薬キット（ＢＣＡ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を使用して、総タンパク質濃度を決定した。５０μｇの細胞溶解物を、１０％ＳＤＳ／ＰＡＧＥにかけた。このゲルをイモビロン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｉｎｃ）上にエレクトロブロットした。狂犬病Ｇに対するマウスモノクローナル抗体である１７Ｄ２（１：３０００希釈）およびウサギペルオキシダーゼ接合抗マウスＩｇＧ（１：１０００希釈）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ， ＵＫ）を用いて、ウエスタンブロット分析を実施した。ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ＵK）を使用して、化学ルミネセンスによる検出を実施した。ｐＳＡ９１ＲｂＧを形質導入した細胞で、狂犬病Ｇについて報告されたサイズに対応する６８ｋＤバンドが（図２）が識別できる。
【０１０６】
下記の実施例の全てで、前述の３プラスミドトランスフェクション法（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９５、同書）を使用して、シュードタイプされたベクターを製作した。これらの実験で使用したプラスミドは、次の通りであった。ｐＨＩＴ１１１およびｐＨＩＴ６０は、Ｅ． ｃｏｌｉ ｌａｃＺマーカー遺伝子およびＭＬＶ ｇａｇ−ｐｏｌを含むＭＬＶベクターを発現する（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。ｐＨ３ZおよびｐＧＰ−ＲＲＥ３は、対応するＨＩＶベクター成分である（Kｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９９８ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８１１−８１６）。ｐＯＮＹ２．１ｎｌｓＬａｃＺおよびｐＯＮＹ３は、対応するＥＩＡＶベクター成分である（英国特許出願第９７２７１３５．７号）。ＥＩＡＶベクターの特徴を含む、これらのベクターの重要な特徴を図３に示す。
略語の説明および図３に使用したラベルは次の通りである
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
ＥＩＡＶベクターの構築は以下の通りであった。
Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：４２５−９）に記載の感染性プロウイルスのクローン、ｐＳＰＥＩＡＶ１９を出発点として使用した。エンベロープタンパク質をコードするプラスミドの領域から、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント５８３５−６５７１を欠失させることにより、プラスミドｐＳＰＥＩＡＶΔＨを構築した。ＰＣＲでｐＳＰＥＩＡＶ１９から増幅したＥＩＡＶＬＴＲをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入することにより、ベクターゲノムプラスミドを構築した。次いで、ｐＳＰＥＩＡＶＡＨのＭｌｕＩ／ＭｌｕＩ（２１６／８１４）フラグメントをＬＴＲ／Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドに挿入してｐＯＮＹ２を製作した。さらに、ｐｏｌ（１９０１／４９４９）内のＢｇｌＩＩ／ＮｃｏＩフラグメントを欠失させ、ＨＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーターにより駆動される核限局性β−ガラクトシダーゼ遺伝子を、その場所に挿入した。これを、ｐＯＮＹ２．１ｎｌｓＬａｃＺと呼んだ。
【０１０９】
次いで、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質がＨＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーターから発現されるように、ｐＯＮＹ２ΔＨ由来のＭｌｕＩ／ＭｌｕＩフラグメントを哺乳類発現プラスミドｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入することにより、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子をコードするＥＩＡＶプラスミド（ｐＯＮＹ３）を製作した。
【０１１０】
【表３】
【０１１１】
例２−狂犬病Ｇタンパク質を用いたレトロウイルスベクターのシュードタイピング
前述の３プラスミドトランスフェクション法（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ １９９５）を使用して、シュードタイプされたベクターを製作した。最初の実験で、６ウェル組織培養皿のウェル当たり、各１０μｇのｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミドおよびＥ． ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子を発現させることができるレトロウイルスベクターで、１０μｇのｐＳＡ９１ＲｂＧをコトランスフェクトした。１０μｇのｐＲＶ６７（ヒトサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーの調節下でＶＳＶ−Ｇが発現されたＶＳＶ−Ｇ発現プラスミド）を、ｐＳＡ９１における狂犬病Ｇの代わりに使用することにより、ＶＳＶ−Ｇを用いたシュードタイピングをこれらの実験用の陽性対照として使用した。
【０１１２】
ヒト腎細胞系２９３Ｔでトランスフェクションを実施し（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９５に記載通り）、ベクタービリオンを製作した。トランスフェクションの３６時間後に培養上澄を収穫し、０．４５ｍｍポアサイズのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通過させて濾過した。
【０１１３】
ｉｎ ｖｉｖｏでの狂犬病のニューロン特異性と対照的に、狂犬病ウイルス実験用株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで広く様々な細胞系と相互に作用できる（Ｒｅａｇａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｎｅｒ １９８５ Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ． ８４：２７７−２８２）。狂犬病Ｇでシュードタイプしたレトロウイルスベクターの標的細胞として使用するために、２つの細胞系ＢＨＫ２１細胞（ベビーハムスター腎細胞系）およびＤ１７細胞（イヌ黒色腫細胞系）を評価した。
【０１１４】
感染の前日に、ウェル当たり３×１０5細胞にて、細胞を６ウェル組織培養プレートにまいた。上述のＥＩＡＶ、ＨＩＶ−１およびＭＬＶベクターをシュードタイプするために、２９３Ｔ細胞を適当なプラスミドでトランスフェクトすることによって調製したウイルス上澄を、これらの細胞に加えた。感染用に使用される培養上澄１ｍｌに形質導入する時に、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）を各ウェルに加えた。感染の１２時間後、培養上澄を新鮮培地と取り替えた。ウイルスタイターを測定するために、細胞を洗浄し、感染の４８時間後に固定して染色した。
【０１１５】
３レトロウイルスベクター構築物の全てを含むｐＳＡ９１ＲｂＧおよびｐＲＶ６７を用いてトランスフェクトする場合、Ｄ１７細胞のβ−ガラクトシダーゼ陽性コロニーを確認することができた。ｐＳＡ９１ＲｂＧまたはｐＲＶ６７のいずれかが存在しないトランスフェクションでは、β−ガラクトシダーゼ陽性コロニーは皆無であり、形質導入を引き起こすためには、エンベロープが必要なことがわかる。ＢＨＫ２１細胞を用いた感染の場合、ＭＬＶシュードタイプの場合に限ってβ−ガラクトシダーゼ陽性コロニーを確認することができたが、ＥＩＡＶおよびＨＩＶ−１シュードタイプでは確認できなかった。このように確認できなかったのは、この細胞タイプにおけるＥＩＡＶおよびＨＩＶ−１に対する結合後ブロックによる可能性がある。以上の結果から、狂犬病ＧがＥＩＡＶ、ＨＩＶおよびＭＬＶベクターをシュードタイプできることが証明される。
【０１１６】
これらのシュードタイプされたベクターについて、ウイルスタイターを比較することによりシュードタイピングの効率を試験した。β−ガラクトシダーゼ陽性コロニー数からウイルスタイターを推定した（表４）。
【０１１７】
【表４】
【０１１８】
狂犬病ＧでシュードタイプしたＭＬＶに関するウイルスタイターは、試験した両細胞系のＶＳＶ−Ｇシュードタイプで確認されたものに匹敵する（ＢＨＫ２１において、ＶＳＶ−Ｇおよび狂犬病Ｇは、それぞれ、４．８×１０6および７．８×１０6；Ｄ１７細胞において、ＶＳＶ−Ｇおよび狂犬病Ｇは、それぞれ、６．３×１０6および１．６×１０6）。
【０１１９】
ＶＳＶ−Ｇおよび狂犬病ＧでシュードタイプしたＥＩＡＶおよびＨＩＶ−１の場合、Ｄ１７細胞において、同様の結果が得られた。ＥＩＡＶの場合、ＶＳＶ−Ｇおよび狂犬病Ｇでシュードタイプしたベクターに関するウイルスタイターは、それぞれ、８．４×１０4および３．２×１０4であった。ＶＳＶ−Ｇおよび狂犬病Ｇを用いたシュードタイプの場合、ＨＩＶ−１では、ウイルスタイターは、それぞれ、３．０×１０4および６．４×１０3であった。以上の結果から、狂犬病Ｇは、３レトロウイルスベクターの全てでシュードタイプする際に、本質的にＶＳＶ−Ｇと同じぐらい効率がよいことがわかる。
【０１２０】
筆者らの結果から、狂犬病Ｇタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇで得られるものに匹敵する非常に高いタイターで、レトロウイルスベクターＥＩＡＶ、ＨＩＶ−１およびＭＬＶをシュードタイプできることが証明される。
【０１２１】
例３−変化したアミノ酸３３３を含む狂犬病Ｇタンパク質の製作および特性決定 重複ＰＣＲを使用して、結果として得られるタンパク質が、３３３位にアルギニンではなくグルタメートを有するように、ｐＳＡ９１ＲｂＧにおける狂犬病糖タンパク質遺伝子のコード配列を操作した。この変化は、狂犬病ウイルスにおいて、弱毒化および変化した細胞親和性をもたらすと報告されている。突然変異誘発に使用したプライマーは、次の通りであった：
正プライマー
5'GATGCTCACTACAAGTCAGTCCAGACTTGGAATGAGATCCTCCC3'
逆プライマー
5'GGGAGGATCTCATTCCAAGTCTGGACTGACTTGTAGTGAGCATC3'
【０１２２】
操作したフラグメントを、ＳｐｈＩＢｇｌＩＩフラグメントとしてｐＳＡ９ｌＲｇに再導入した。結果として得られたプラスミドはｐＳＡ９１ＲＭである。このベクターから生成した、操作された狂犬病Ｇタンパク質を、これがＭＬＶ粒子をシュードタイプできる能力について試験した。Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ １９９５に記載の通りに、このプラスミドを、ｐＨＩＴ６０およびｐＨＩＴ１１１と一緒に、２９３Ｔ細胞内にトランスフェクトし、ｐＳＡ９ｌＲｇを陽性対照として使用した。前述の通り、これらのトランスフェクションからの上澄を収穫し、ＢＨK−２１またはネズミ神経芽腫細胞系Ｃ−１３００クローンＮＡのいずれかに形質導入できる能力によって、２つのエンベロープがＭＬＶ粒子をシュードタイプできる能力を評価した（表５）。
【０１２３】
【表５】
【０１２４】
ＢＨK−２１細胞（狂犬病ワクチンの生産によく使用される細胞系）で得られたタイターは、ｗｔを用いたときより操作された狂犬病Ｇタンパク質を用いた方が低かったが、Ｃ−１３００細胞の場合、２つのエンベロープで等価のタイターが得られた。以上の結果から、操作されたタンパク質は、ＭＬＶ粒子を効率よくシュードタイプできることがわかる。
【０１２５】
例４−狂犬病Ｇでシュードタイプされたレトロウイルスベクターのタイターの最適化
最適ウイルスタイターを決定するために、３−プラスミドトランスフェクションシステムに加えたｐＳＡ９１ＲｂＧＤＮＡの量を、他の２成分に対して滴定した。
【０１２６】
この実験で、ＣａＰＯ4沈殿と、プラスミドｐＳＡ９１ＲｂＧ、ｐＨＩＴ１１１、およびｐＨＩＴ６０とを使用して、ＣＯＳ−１細胞をトランスフェクトした。後者の２つのプラスミドを等量で使用した（８μｇ／トランスフェクション／ｍｍ組織培養皿）が、ｐＳＡ９１ＲｂＧの量は、逐次減少させた。トランスフェクションの３６時間後にトランスフェクションからの上澄を収穫し、存在する形質導入粒子数を、ＨＴ１０８０細胞で決定した。結果を図４に示す。他のプラスミドと比較して、ｐＳＡ９１ＲｂＧ ＤＮＡの量を８倍減少させると、最高のタイターをもたらすことがわかった。タイターは、例１で２９３Ｔ細胞から得られたものより全般的に低かった。
【０１２７】
ＥＩＡＶ−を基にしたベクターの製作に必要な２成分に対するｐＳＡ９１ＲｂＧの滴定も実施した。この場合、ＣａＰＯ4沈殿と、ｇａｇ／ｐｏｌをコードするプラスミド（ｐＯＮＹ３）８μｇおよびβ−ガラクトシダーゼをコードするＥＩＡＶベクターを発現するプラスミド（ｐＯＮＹ２．１ｌｎｌａｃＺ）８μｇとを使用して、２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。様々な量のｐＳＡ９１ＲｂＧまたはｐＲＶ６７を上述の通りに加え、それぞれ、狂犬病ＧもしくはＶＳＶ−Ｇでシュードタイプしたベクターを得た。トランスフェクションの３６時間後に、トランスフェクションからの上澄を収穫し、存在する形質導入粒子数を、Ｄ１７細胞で決定した。結果を図５に示す。他のプラスミドと比較して、ｐＳＡ９１ＲｂＧ ＤＮＡの量を２〜４倍減少させると、最高のタイターをもたらすことがわかった。ｐＲＶ６７を他の２プラスミドと等量で使用したとき、タイターの有意な低下は認められなかった。
【０１２８】
以上の結果から、プロデューサー細胞で発現される狂犬病Ｇおよび他のベクター成分の相対量を調整することにより、狂犬病Ｇでシュードタイプされたレトロウイルスベクターの改良されたタイターを得ることが可能である。
【０１２９】
例５−狂犬病Ｇでシュードタイプされたレトロウイルスベクターの濃度
超遠心分離を使用してウイルス上澄を濃縮することにより、ウイルスタイターを高めることができるかどうかをさらに調査し（Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３ ＰＮＡＳ ９０：８０３３−８０３７）、超遠心分離で、ＶＳＶ−ＧでシュードタイプされたＭＬＶを基にしたベクターを含む１ｍｌ当たり１０9形質導入粒子というウイルスタイターが得られた。
【０１３０】
前述の３プラスミドトランスフェクション法（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９５）を使用して、狂犬病ＧまたはＶＳＶ−Ｇでシュードタイプした粒子を製作した。トランスフェクションの３６時間後に、形質導入粒子を収穫し、超遠心分離で濃縮し、Ｄ１７細胞で滴定した。４８時間後、β−ガラクトシダーゼを求めるためにこれらの細胞を染色した。３つの独立した実験からタイターを平均し、ｍｌ当たりのβ−ガラクトシダーゼ産生単位として計算した。実験間で、１０％を超える差はなかった。２つのエンベロープのいずれかでシュードタイプしたＥＩＡＶもＭＬＶ粒子も、かなりの形質導入粒子の損失なしに、収穫量を１３０倍減少することができた（表６）。
【０１３１】
【表６】
【０１３２】
以上の結果から、超遠心分離で、狂犬病Ｇでシュードタイプしたベクターを濃縮でき、ベクタータイターの上昇はＶＳＶ−Ｇで観察されるものに匹敵することがわかる。
【０１３３】
これらの特性は、ニューロン細胞に対する狂犬病Ｇのｉｎｖｉｖｏ特異性と相俟って、狂犬病Ｇを用いたシュードタイピングを、神経系に治療用遺伝子を運搬するレトロウイルスベクターを容易にターゲッティングするための魅力的な計画にしている。
【０１３４】
例６−狂犬病Ｇシュードタイプが培養ヒト標的細胞に形質導入できる能力の選択性。
狂犬病Ｇでシュードタイプしたベクター細胞の特異性を、ニューロンおよび非ニューロン起源のヒト細胞系を使用して決定した。ＶＳＶ−Ｇを用いたシュードタイピングを陽性対照として使用した。３プラスミドトランスフェクションから調製したウイルス上澄を使用して、ＩＭＲ−３２（ヒト神経芽腫細胞系）およびＣＥＭ−Ａ（ヒトＴ細胞系）を感染させた。β−ガラクトシダーゼ陽性コロニーからウイルスタイターを推定する（表７）。
【０１３５】
【表７】
【０１３６】
狂犬病ＧおよびＶＳＶ−ＧでシュードタイプしたＭＬＶベクターは、ＩＭＲ−３２細胞を感染させることができた。しかし、狂犬病ＧでシュードタイプしたＭＬＶベクターは、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイプしたもの（４．９×１０3）より１００倍高い（３．１×１０5）タイターを生じた。ＣＥＭ−Ａ細胞では、狂犬病ＧでシュードタイプしたＭＬＶベクターは、１．７×１０1という低いタイターを示した。このように効率が低かったのは、ＭＬＶがこれらの細胞に形質導入できないためではなかった。このことは、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイプした同ベクターでは、比較的高いタイター（７．３×１０2）を示したことによって証明される。
【０１３７】
筆者らの結果から、狂犬病ＧシュードタイプはＶＳＶ−Ｇと違って、ヒト標的細胞に形質導入できる能力に選択性があり、Ｔ−細胞系よりニューロン細胞で、形質導入効率が高いことがわかる。
【０１３８】
例７−ｉｎ ｖｉｔｒｏ（一次培養）およびｉｎ ｖｉｖｏ（ラット／マウスモデル系）で、狂犬病Ｇシュードタイプが脳細胞に形質導入できる能力。
ｉｎ ｖｉｖｏで、狂犬病ウイルスにより、少なくとも２つの異なるレセプターが使用され（Ｈａｎｈａｒｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３ J． Ｖｉｒｏｌ． ６７：５３０−５４２； Ｔｕｆｆｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．， J． Ｖｉｒｏｌ． ７２：１０８５−１０９１）、これらのレセプターの１つがニコチン性アセチルコリンレセプターであることを示唆する証拠がある。マウスモデル系で、ｗｔ狂犬病（ＣＶＳ株）およびこの株の二重突然変異体（アミノ酸３３０および３３３にて変化している）を用いて、感染したニューロン細胞のタイプおよび神経系全体にわたるウイルスの広がりに関する詳細な研究が実施されている（Ｃｏｕｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：３５５０−３５５４； Ｌａｆａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８３；３２０−３３０）。上記研究から、突然変異ウイルスの広がりおよび範囲は、ｗｔに比べて著しく制限されることがわかる。
【０１３９】
狂犬病Ｇタンパク質でシュードタイプされたＥＩＡＶベクターの親和性を決定するために、以下の分析を開始した。成体メスＡＯラットを麻酔し、２×１μｌのウイルスストックを、線条領域または他の脳領域内に定位注入した。注射の後７日または３０日に、ラットを麻酔し、４％パラホルムアルデヒドで心臓内灌流した。脳を摘除し、２４時間固定後、３０％スクロースで飽和し、凍結用低温装置で切断した（５０μｍ）。Ｘ−ｇａｌ溶液で切片を３時間から一晩染色し、スライドガラスに載せ、光学顕微鏡で分析した。ニューロン（ＮｅｕＮほか）、星状細胞（ＧＦＡＰ）または希突起神経膠細胞（ＧａｌＣ）およびβ−ガラクトシダーゼに特異的な抗体と種特異的二次抗体とを組み合わせて使用した免疫蛍光法三重標識によって、形質導入された詳細な細胞タイプの同定を行った。共焦点検鏡法を使用して、形質導入された脳領域の画像を分析した。
【０１４０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入実験用に、一次ニューロンを、ラット胎芽から培養し、完全に分化するまで成長させる。４μｇ／ｍｌのポリブレンを使用して、ウイルスベクターを５時間加える。培地を変え、２日後に、Ｘ−ｇａｌ染色または抗体のいずれかを使用して、発現分析を実施する。
【０１４１】
例８−狂犬病ＧでシュードタイプされたＨＩＶ−１ベクターの濃度、ならびにこのようなベクターを製作するためのＶＳＶ−Ｇ使用と狂犬病エンベロープ使用との間の比較
例５から、狂犬病ＧでシュードタイプしたＥＩＡＶベクターは、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイプされたベクターで報告されていたものと同じ様式で、超遠心分離によって、効率よく濃縮できることがわかる。狂犬病Ｇを使用して、ＨＩＶ−１ベクターをシュードタイプできること、これらの粒子を超遠心分離で効率よく濃縮できること、およびＶＳＶ−Ｇでシュードタイプされたベクターを用いてＤ１７細胞で得られるものと同じタイターを得ることが可能なことを証明するために、これらの観察を拡張した。
【０１４２】
前述の３プラスミドトランスフェクション法（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９５）を使用して、狂犬病ＧまたはＶＳＶ−Ｇのいずれかでシュードタイプした粒子を製作した。この実験で使用したＨＩＶ−１プラスミド、ｐＨ４ＺおよびｐＧＰ−ＲＲＥ３は、Kｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９８ Jｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：８１１−８１６）に記載されている。この実験で使用した成分の比率は、狂犬病Ｇの場合、１：１：１、ｇａｇ１ｐｏｌ：ゲノム：エンベロープであり、ＶＳＶ−Ｇの場合、１：１：０．５、ｇａｇ１ｐｏｌ：ゲノム：エンベロープであって、これは、ＣＯＳ １細胞の場合に使用された比率と異なるが、それは、２９３Ｔ細胞はＣＯＳ細胞よりも狂犬病Ｇタンパク質の発現に抵抗することがわかったためである。トランスフェクションの４８時間後に形質導入粒子を収穫し、超遠心分離で濃縮し、Ｄ１７細胞で滴定した。４８時間後、β−ガラクトシダーゼを求めるために、これらの細胞を染色した。２つのエンベロープのいずれかでシュードタイプしたＨＩＶ−１粒子によって、収穫物のタイターを約１００倍高めることができた（表８）。上記エンベロープのいずれかでシュードタイプしたベクターで得られるタイターは、有意に異ならなかった。以上の結果から、狂犬病Ｇでシュードタイプしたベクターは、超遠心分離で濃縮することができ、ベクタータイターの上昇は、ＶＳＶ−Ｇで確認されたものに匹敵し、且つＤ１７細胞で、２つのエンベロープは同様に有効であった。
【０１４３】
【表８】
【０１４４】
考察および要約
前述の通り、レトロウイルスおよびレトロウイルスから誘導されるベクターは、標的細胞に効率よく形質導入するために、特定のエンベロープタンパク質を必要とする。このエンベロープタンパク質は、ウイルスまたはベクターを産生する細胞で発現され、ウイルスまたはベクター粒子に組み込まれる。レトロウイルス粒子は、ウイルスＲＮＡを包むｇａｇ遺伝子から誘導されるタンパク質コアを含む。次いで、このコアは、ウイルスｅｎｖ遺伝子から誘導されるエンベロープタンパク質を含む細胞膜の一部に包まれる。このエンベロープタンパク質は、前駆体として産生され、２つまたは３つの単位に処理される。それらは、エンベロープの完全に外側にある表面タンパク質（ＳＵ）、ＳＵと相互に作用し、且つ膜貫通領域および細胞質尾部を含む貫膜タンパク質（ＴＭ）である（Ｃｏｆｆｉｎ １９９２ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｌｅｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ｅｄ Ｌｅｖｙ）。一部のレトロウイルスでは、小ペプチドがＴＭから除去される。標的細胞表面に結合してウイルスの侵入を仲介できる有効なエンベロープタンパク質の役割を果たすためには、生産的感染を起こさせるために、エンベロープタンパク質は、結果として細胞の正確な区画にゲノムを送達するのに適当な方式でウイルス粒子のインターナリゼーションを招来するような方法で、標的細胞上の適切なレセプターと的確に相互に作用しなければならない。
【０１４５】
１つのウイルス由来のエンベロープを、異なるウイルスのパッケージングに使用する多くの試みがなされ、これがシュードタイピングとして知られている。シュードタイピングの効率は非常に変わりやすく、また、エンベロープの細胞質尾部とウイルス粒子のコアタンパク質との間の相互作用により強く影響されるようである。エンベロープタンパク質が出芽ビリオン内に召集されるプロセスは十分に理解されていなが、ほとんどのＴ細胞タンパク質がレトロウイルス粒子排除されるため、プロセスは選択的であることが判明しており（Ｈｕｎｔｅｒ １９９４ Ｓｅｍｉｎ． Ｖｉｒｏｌ． ５：７１−８３）、エンベロープタンパク質が存在しない条件下で、出芽が起こり得ることが、一部のレトロウイルスで記録されている（Ｅｉｎｆｅｌｄ １９９６ Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１４：１３３−１７６； Kｒｄｕｓｓｌｉｃｈ および Wｅｌｋｅｒ １９９６ Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１４：２５−６３）。エンベロープタンパク質の細胞質メインと、一部のレトロウイルス内のウイルスコアとの間の的確な分子相互作用に関する証拠がある。Jａｎｕｓｚｅｓｋｉ ｅｔ ａｌ（１９９７ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：３６１３−３６１９）は、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）エンベロープタンパク質の細胞質尾部における小さい欠失または置換は、エンベロープタンパク質のウイルス粒子への組み込みを強く阻害することを証明した。ＨＩＶ−１の場合、Ｃｏｓｓｏｎ（１９９６ ＥＭＢＯ Ｊ． １５：５７８３−５７８８）は、ＨＩＶ−１の基質タンパク質とそのエンベロープタンパク質の細胞質ドメインとの間の直接相互作用を証明した。基質とエンベロープタンパク質との間のこの相互作用は、エンベロープタンパク質の出芽ＨＩＶ−１ビリオンへの取りこみにおいて、重要な役割を果たす。このことは、ビスナウイルスｇａｇポリタンパク質の基質ドメインのアミノ末端が等価のＨＩＶ−１基質ドメインで置き換えられた場合に、ビスナウイルスをＨＩＶ−１ｅｎｖで効率よくシュードタイプできるにすぎないことによって証明される（Ｄｏｒｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：１６８９−１６９６）。しかし、モロニーネズミ白血病ウイルスを効率よくシュードタイプするにはＨＩＶ−１ｅｎｖの切頭が必要である（Ｍａｍｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：３３４１−３３４５）が、ヒト泡沫ウイルスエンベロープタンパク質を末端を切断すると、ネズミ白血病ウイルスをシュードタイプすることができる能力が低下する（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４８１５−４８２０）ため、状況は複雑である。レトロウイルスのコアとそのエンベロープタンパク質の細胞質尾部との間の相互作用には、環境成分もある。一部の細胞系においてＥＩＡＶを長期継代すると糖タンパク質の末端が切断されうるため、エンベロープタンパク質のＣ末端ドメインに基づいて、ウイルスに適した宿主細胞因子を選択できることが示唆される（Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， １９９０ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １９９０ ６４：３７７０− ３７７８）。
【０１４６】
以上の研究および多くの他の研究者の研究から、近縁関係にあるレトロウイルスでさえも互いにシュードタイプできる可能性があることをなことがわかる。さらに、所与のエンベロープが特定のウイルスシュードタイプできない場合、シュードタイプできる能力を与えるであろう分子の変化を予測することは不可能である。シュードタイピングは幾らかの成功をおさめたが、ウイルス成分と異種エンベロープタンパク質との間の適合性の必要性によって明らかに制約を受ける。
【０１４７】
細胞タイプの拡大された範囲または変化した範囲への遺伝物質の送達を可能にするために、レトロウイルスベクターを構築する際に、天然のウイルスに対して異なる標的細胞特異性を有するベクターを操作することが望ましい。これを実現する１つの方式は、ウイルスエンベロープタンパク質を操作してその特異性を変えることによる。別のアプローチは、異種エンベロープタンパク質をベクターに導入して、ウイルスの天然のエンベロープタンパク質に補充する、すなわち加えることである。
【０１４８】
ＭＬＶエンベロープタンパク質は、様々な異なるレトロウイルスをシュードタイプすることができる。両種性ウイルス由来のＭＬＶエンベロープタンパク質を使用すると、ヒト細胞を含む広範囲の細胞タイプに形質導入することが可能になる。しかし、多数の細胞タイプを感染させるレトロウイルスベクターを有することが常に望ましいとは限らない。
【０１４９】
水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（ラブドウイルス）のエンベロープ糖タンパク質（Ｇ）は、ある一定のレトロウイルスをシュードタイプできることが証明されている別のエンベロープタンパク質である。レトロウイルスＭＬＶは首尾よくシュードタイプし（Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ １９９３ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：８０３３−７）、結果として、天然型のＭＬＶに比べて変化した宿主範囲範囲を有するベクターを生じた。ＶＳＶ−Ｇシュードタイプされたベクターは、哺乳類細胞のみならず、魚、爬虫類および昆虫由来の細胞系も感染させることが証明されている（Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ １９９３）。その細胞質尾部はレトロウイルスのコアと相互に作用することができるため、ＶＳＶ−Ｇタンパク質を使用して、ある一定のレトロウイルスシュードタイプすることができる。ＶＳＶ−ＧおよびＭＬＶエンベロープタンパク質は、両者ともに短い細胞質尾部（それぞれ、２８〜３１アミノ酸および３２アミノ酸）を有しており、したがって、よく似た長さである。
【０１５０】
非レトロウイルスのシュードタイピングエンベロープ、たとえば、ＶＳＶ−Ｇタンパク質を提供することにより、感染性を失わずに高タイターまで、ベクター粒子を濃縮できるという利点が得られる（Ａｋｋｉｎａ ｅｔ ａｌ １９９６ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０：２５８１−５）。レトロウイルスエンベロープタンパク質は、明らかに、超遠心分離中の剪断力に耐えることができないが、それは、このタンパク質が２つの非共有結合サブユニットからなるためであろう。サブユニット間の相互作用は、遠心分離により破壊される。比較すると、ＶＳＶ糖タンパク質は、ただ１つの単位を含む。
【０１５１】
したがって、ＶＳＶ−Ｇタンパク質シュードタイピングは、潜在的な利点を提供する。しかし、ＶＳＶ−Ｇタンパク質を使用して実現されるもの以外の標的細胞特異性も望ましい可能性がある。タンパク質内に標的部位を操作することにより、ＶＳＶ−Ｇの標的細胞範囲を変えようという試みがなされた。１９９７年の治療用遺伝子送達のためのベクターターゲッティング方法に関する会議（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｏｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＵＳＡ）で報告されたこれらの試み（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）は、成功しなかった。したがって、レトロウイルスベクター標的細胞範囲を変える他の方法が必要である。
【０１５２】
他のラブドウイルスエンベロープでレトロウイルスを効率よくシュードタイプするための試みが幾つかのなされた。１９９７年の治療用遺伝子送達のためのベクターターゲッティング方法に関する会議（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｏｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＵＳＡ）での１つのレポート（Ｒｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．）で、狂犬病ウイルスおよびモコラウイルスの糖タンパク質は、ＨＩＶ−１粒子をシュードタイプすることができたが、「得られたタイターは、ＶＳＶ Ｇタンパク質を用いて得られるものよりはるかに低い」と報告された。
【０１５３】
本発明は、狂犬病タンパク質、特に狂犬病Ｇタンパク質でシュードタイプされたレトロウイルス送達システムを提供することによって、上記の問題を克服しようとするものである。
【０１５４】
上記明細書に記載の全ての出版物を、参照により本明細書に援用する。説明した本発明の方法およびシステムの様々な修飾および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかになるであろう。本発明を具体的な好ましい実施形態と一緒に説明してきたが、請求の範囲に記載されている本発明が、そのような具体的な実施形態に不当に制限されると考えてはならない。それどころか、分子生物学または関連分野における熟練者に明白な、本発明を実施するための、記載された形態の様々な修飾は、特許請求の範囲内と解釈される。
本発明は、送達システムに関する。特に、本発明は、関心のあるヌクレオチド配列（nucleotide sequence of interest; 以下、「ＮＯＩ」と略記する）、または複数のＮＯＩを、関心のある部位に送達することができるレトロウイルスベクターに関する。
【０００２】
さらに、特に、本発明は、遺伝子療法に有用なレトロウイルスベクターに関する。
【０００３】
遺伝子療法は、たとえば、標的細胞等の、１つまたは複数の標的部位における１つまたは複数のヌクレオチド配列の、付加、置換、欠失、補足、操作等のいずれか１つまたは複数を含む。標的部位が標的細胞であれば、そのときは、その細胞は、組織または器官の一部であってもよい。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｒｏｂｅｒｔ Ｍｅｙｅｒｓ編、ＶＣＨ発行、たとえば、５５６−５５８ページ）には、遺伝子療法に関する一般的教示が記載されている。
【０００４】
さらなる例として、遺伝子療法は、以下のいずれか１つまたは複数を提供する方法も提供する。即ち、ヌクレオチド配列、たとえば遺伝子を使用して、欠陥遺伝子を置換または補足することができる。病原遺伝子または遺伝子産物を除去することができる。たとえば、より好ましい表現型を作るために、新しい遺伝子を付加することができる。細胞を分子レベルで操作して癌（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｌｆ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｌｆ， １９９４， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ６９；２７３−２７９）、または他の状態、たとえば、免疫病、心血管疾患、神経学的疾患、炎症性疾患または感染性疾患を治療することができる。抗原を操作および／または導入して、免疫応答を誘導することができる（たとえば、遺伝子ワクチン接種）。
【０００５】
近年、レトロウイルスを遺伝子療法に使用することが推奨されている。本来、レトロウイルは、溶菌性ウイルスとは異なるライフサイクルを有するＲＮＡウイルスである。この点について、レトロウイルスが細胞に感染すると、そのゲノムは、ＤＮＡ型に変換される。言い換えれば、レトロウイルスは、ＤＮＡ中間体を介して複製する感染実体である。レトロウイルス感染等に関するさらなる詳細については後述する。
【０００６】
多くのレトロウイルスがあり、その例を以下に挙げる。ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、フジナミ肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲネズミ骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニーネズミ肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、エーベルソンネズミ白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、鳥類骨髄細胞腫ウイルス−２９（ＭＣ２９）、および鳥類赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）。
【０００７】
レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ （"Ｒｅｔｏｒｏｖｉｒｕｓｅｓ" １９９７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｏｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ｅｄｓ： ＬＭ Ｃｏｆｆｉｎ， ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ， ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８−７６３）に掲載されている。
【０００８】
当技術分野で、幾つかのレトロウイルスのゲノム構造に関する詳細を見つけることができる。例として、ＨＩＶに関する詳細をＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋからみつけることができる（すなわち、ゲノム寄託番号第ＡＦ０３３８１９号）。
【０００９】
全てのレトロウイルスは、不可欠なビリオンタンパク質をコードする３つの主要なコード領域、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖを含む。それにもかかわらず、レトロウイルスは、大きく２つのカテゴリー（すなわち、「単純」と「複雑」）に分けられる。これらのカテゴリーは、そのゲノムの構成によって識別できる。単純レトロウイルスは、通常、この基本情報のみを担持する。対照的に、複雑レトロウイルスは、多数のスプライシングされたメッセージから誘導される調節タンパク質もさらにコードする。
【００１０】
レトロウイルスは、さらに７群にわけることができる。そのうち５群は、発癌性を有するレトロウイルスを表す。残りの２群は、レンチウイルスおよびスプマウイルスである。これらのレトロウイルスに関する総説は、"Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ"（１９９７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｏｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＬＭ Ｃｏｆｆｉｎ， ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ， ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ １−２５）にある。
【００１１】
ヒトＴ細胞白血病ウイルス−ウシ白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−ＢＬＶ）以外の全ての発癌性メンバーは、単純レトロウイルスである。ＨＴＬＶ、ＢＬＶならびにレンチウイルスおよびスプマウイルスは、複雑レトロウイルスである。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）およびヒトＴ−細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）は、最もよく研究された発癌性レトロウイルスの一部である。
【００１２】
レンチウイルス群は、さらに、「霊長類」および「非霊長類」に分けられる。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などが挙げられる。非霊長類レンチウイルス群には、基本型「スローウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）が含まれ、最近では、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）について記載されている。
【００１３】
レンチウイルスファミリーと他のタイプのレトロウイルスとの間の重要な相違点は、レンチウイルスは、分裂細胞も非分裂細胞も共に感染することができる点である（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ １９９２ ＥＭＢＯ． Ｊ １１； ３０５３−３０５８、Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｅｍｅｒｍａｎ １９９４ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：５１０−５１６）。対照的に、他のレトロウイルス、たとえば、ＭＬＶは、非分裂細胞（たとえば、筋組織、脳組織、肺組織および肝組織を構成するもの等）に感染することができない。
【００１４】
感染の経過中、レトロウイルスは、最初に、特定の細胞表面レセプターに付着する。感染しやすい宿主細胞に侵入すると、レトロウイルスＲＮＡゲノムは、親ウイルス内部にある、ウイルスによりコードされた逆転写酵素によってＤＮＡにコピーされる。このＤＮＡは、宿主細胞核に輸送され、続いて宿主ゲノムに組み込まれる。この段階で、一般に、プロウイルスと呼ばれる。プロウイルスは、細胞分裂中、宿主染色体内で安定であり、且つ他の細胞タンパク質と同様に転写される。プロウイルスは、より多くのウイルスを作るのに必要なタンパク質およびパッケージング機構をコードし、「出芽」と呼ばれることもあるプロセスにより、細胞をそのままの状態にしておくことができる。
【００１５】
既に指摘した通り、各レトロウイルスゲノムは、ビリオンタンパク質および酵素をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖと呼ばれる遺伝子を含む。これらの遺伝子は、その両端が、長末端反復配列（long terminal repeats; ＬＴＲ）と呼ばれる領域により挟まれている。このＬＴＲは、プロウイルスの組み込み、および転写に関与する。ＬＴＲは、エンハンサー−プロモーター配列の役割も果たす。言い換えれば、ＬＴＲは、ウイルス遺伝子の発現を調節することができる。レトロウイルスＲＮＡのキャプシド形成は、ウイルスゲノムの５'末端にあるｐｓｉ配列によって起こる。
【００１６】
ＬＴＲそれ自体は、Ｕ３、ＲおよびＵ５と呼ばれる、３つのエレメントに分けることができる配列と同じ配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３'末端に特有の配列から誘導される。Ｒは、ＲＮＡの両末端で反復する配列から誘導され、Ｕ５は、ＲＮＡの５'末端に特有の配列から誘導される。３つのエレメントのサイズは、異なるレトロウイルス間でかなり変化する可能性がある。
【００１７】
理解しやすくするために、ＬＴＲ、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの基本的特徴を示すレトロウイルスゲノムの簡単な一般的線図を（比率は別として）、図６に示す。
【００１８】
ウイルスゲノムの場合、転写開始部位は、左手側のＬＴＲ内のＵ３とＲとの間の境界にあり（図６に示す）、ｐｏｌy（Ａ）付加（終結）部位は、ＲおよびＵ５は、右手側ＬＴＲ内のＲとＵ５との間の境界にある（図６に示す）。Ｕ３は、プロウイルスの転写調節エレメントの大部分を含み、その中には細胞の転写アクティベータータンパク質、および場合によってはウイルスの転写アクティベータータンパク質に応答するプロモーター配列および多数のエンハンサー配列が含まれる。一部のレトロウイルスは、遺伝子発現の調節に関与するタンパク質をコードする遺伝子であるｔａｔ、ｒｅｖ、ｔａｘおよびｒｅｘのいずれか１つまたは複数を含む。
【００１９】
構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖそれ自体に関しては、ｇａｇはウイルスの内部構造タンパク質をコードする。ｇａｇは、タンパク質分解によるプロセシングを受けて、成熟タンパク質ＭＡ（基質）、ＣＡ（キャプシド）、ＮＣ（ヌクレオキャプシド）になる。遺伝子ｐｏｌは、逆転写酵素（ＲＴ）をコードし、ＤＮＡポリメラーゼ、および関連ＲＮａｓｅＨ活性の両者およびゲノムの複製を仲介するインテグラーゼ（ＩＮ）を含む。遺伝子ｅｎｖは、ビリオンの表面（ＳＵ）糖タンパク質および膜貫通（ＴＭ）タンパク質をコードし、これらは、細胞レセプタータンパク質と特異的に相互に反応する複合体を形成する。この相互作用は、最終的に、ウイルス膜と細胞膜との融合につながる。
【００２０】
レトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質複合体は、２つのポリペプチド、すなわち、外側の、グリコシル化された親水性ポリペプチド（ＳＵ）および膜貫通タンパク質（ＴＭ）を含む。これらは、一緒に、オリゴマーの「こぶ」または「こぶ付きスパイク」をビリオンの表面上に形成する。両ポリペプチドは、ｅｎｖ遺伝子にコードされ、ポリタンパク質前駆体の形で合成されて、細胞表面に輸送される間にタンパク質分解により切断される。未分解のｅｎｖタンパク質はレセプターに結合することができるが、切断事象それ自体は、ウイルスが宿主細胞に侵入するのに必要なタンパク質の融合潜在能力を活性化することが必要である。一般に、ＳＵタンパク質とＴＭタンパク質の両者が多数の部位でグリコシル化されている。しかし、一部のウイルス（ＭＬＶが好例である）では、ＴＭはグリコシル化されていない。
【００２１】
ＳＵタンパク質およびＴＭタンパク質は常に必要なわけではないが、エンベロープに包まれたビリオン粒子それ自体を組み立てるために、侵入過程において極めて重要な役割を果たす。この点について、ＳＵドメインは標的細胞上のレセプター分子（多くの場合、特定のレセプター分子）に結合する。この結合事象はＴＭタンパク質の膜融合誘導性能を活性化し、その後、ウイルス膜と細胞膜が融合すると考えられる。一部のウイルス（特にＭＬＶ）では、結果としてＴＭの細胞質尾部の短い部分が除去される切断事象は、タンパク質の全融合活性を明らかにする際に、重要な役割を果たす（Ｂｒｏｄｙ ｅｔ ａｌ １９９４ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：４６２０−４６２７， Ｒｅｉｎ ｅｔ ａｌ １９９４ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：１７７３−１７８１）。ＴＭの膜貫通断片から離れた、この細胞質「尾部」は、ウイルス膜の内側に残存し、異なるレトロウイルスで長さがかなり変化する。
【００２２】
このように、ＳＵ／レセプター相互作用の特異性により、レトロウイルスの宿主範囲および組織親和性が規定される。ある場合には、この特異性により、組換えレトロウイルスベクターの形質導入能が制限される。このため、多くの遺伝子療法実験でＭＬＶが使用されてきた。４０７０Ａと呼ばれるエンベロープタンパク質を有する独特のＭＬＶは、両種性ウイルスとして知られ、そのエンベロープタンパク質は、ヒトとマウスとの間で保存されるリン酸輸送タンパク質と「ドッキング」するため、ヒト細胞を感染させることができる。この輸送体は遍在しているため、これらのウイルスは、多くの細胞タイプを感染させることができる。しかし、場合によっては、特に安全性の観点から、限られた細胞を特異的に標的とすることが有益なこともある。このために、幾つかのグループは、マウス狭宿主性（その両種親和性系統と異なり、通常、マウス細胞のみを感染させる）レトロウイルスを、特定のヒト細胞を特異的に感染させるように操作した。エリトロポエチンセグメントを含むエンベロープタンパク質のフラグメントを置換すると、赤血球前駆体等の、エリトロポエチンレセプターを表面上に発現するヒト細胞に特異的に結合する組換えレトロウイルスを生じる（Ｍａｕｌｉｋ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ １９９７ "Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ" １９９７． Wｉｌｅｙ−Lｉｓｓ Ｉｎｃ． ｐｐ ４５．）。
【００２３】
複雑レトロウイルスは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて、アクセサリータンパク質すなわち補助タンパク質をコードする「アクセサリー」遺伝子も含む。アクセサリータンパク質すなわち補助タンパク質は、通常の伴複製遺伝子すなわち構造遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖにコードされるものに加えて、アクセサリー遺伝子によりコードされるタンパク質と定義される。これらのアクセサリータンパク質は、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｔａｒおよびｒｅｘによりコードされるもの等の、遺伝子発現の調節に関与するものと異なる。アクセサリー遺伝子の例としては、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕおよびｎｅｆの１つまたは複数を挙げることができる。これらのアクセサリー遺伝子は、たとえば、ＨＩＶにみられる（たとえば、"Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ" Ｅｄ． Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ Ｐｕｂ． ＣＳＨL １９９７の８０２ページ および ８０３ページを参照）。非必須アクセサリータンパク質は、分化した細胞タイプで機能することができ、細胞タンパク質により提供される機能を少なくとも部分的に倍加する機能を提供する。一般に、アクセサリー遺伝子は、ｐｏｌとｅｎｖとの間、ＬＴＲのＵ３領域を含むｅｎｖからすぐ下流、またはｅｎｖの重複部分および互いの重複部分に位置する。
【００２４】
複雑レトロウイルスは、ウイルスによりコードされる転写アクティベーターならびに細胞性転写因子を使用する調節機構を進化させた。これらのトランス作用ウイルスタンパク質は、ＬＴＲにより指令されるＲＮＡ転写のアクティベーターの役割をする。レンチウイルスの転写トランスアクティベーターは、ウイルスのｔａｔ遺伝子によりコードされる。ｔａｔは、ＴＡＲと呼ばれるＲＮＡ二次構造（その１つの機能はＴａｔを最適所に置いて、転写をトランス−活性化することである）である、安定なステム・ループに結合する。
【００２５】
前述の通り、レトロウイルスは、特に、ＮＯＩ、または複数のＮＯＩを、関心のある１つまたは複数の部位に移動させるための送達システム（あるいは、送達媒体または送達ベクターと表現される）として推薦されている。この移送は、それらの組み合わせで起こり得る。この様式で使用するとき、レトロウイルスは、一般に、レトロウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクターと呼ばれる。レトロウイルスベクターは、レセプター使用法、逆転写およびＲＮＡパッケージングを含め、レトロウイルスライフサイクルの様々な態様の研究に利用されてきた（Ｍｉｌｌｅｒ， １９９２ Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８：１−２４による論評）。
【００２６】
遺伝子治療用の一般的な組換えレトロウイルスベクターの場合、ｇａｇタンパク質コード領域、ｐｏｌタンパク質コード領域およびｅｎｖタンパク質コード領域の１つまたは複数の少なくとも一部をウイルスから除去することができる。こうすることにより、レトロウイルスベクターを複製能欠損にさせる。宿主ゲノムにウイルスゲノムを組み込むことができるウイルスを産生するために、除去された部分をＮＯＩと置き換えることも可能であるが、この場合、改変されたウイルスゲノムは構造タンパク質が欠如しているため、それ自体増殖できない。宿主ゲノムに組み込まれるとき、ＮＯＩの発現が起こり、結果として、たとえば、治療効果が生じる。したがって、関心のある部位へのＮＯＩの移動は、一般に、ＮＯＩを組換えウイルスベクターに組み込むこと、改変されたウイルスベクターをビリオン外皮内にパッケージングすること、および関心のある部位、たとえば、標的細胞または標的細胞群への形質導入を可能にすることによって実現される。
【００２７】
パッケージングまたはヘルパー細胞系と、組換えベクターとの組み合わせを使用することにより、次に、たとえば、関心のある部位に形質導入するために、多量のレトロウイルスベクターを増殖させて単離する（たとえば、適当なタイターのレトロウイルスベクターを作成する）ことができる。
【００２８】
場合によっては、増殖および単離が、レトロウイルスのｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子を単離し、宿主細胞に別々に導入して「パッケージング細胞系」を作成することを伴ってもよい。このパッケージング細胞系は、パッケージングレトロウイルスのＤＮＡに必要なタンパク質を産生するが、ｐｓｉ領域が欠如しているため、パッケージングすることはできない。しかし、ＮＯＩおよびｐｓｉ領域を担持する組換えベクターをパッケージング細胞系に導入するとき、ヘルパータンパク質は、ｐｓｉ陽性組換えベクターをパッケージして、組換えウイルスストックを製作することができる。これを使用して、細胞を感染させ、ＮＯＩを細胞のゲノムに導入することができる。ウイルスタンパク質の作成に必要な全ての遺伝子が欠如しているゲノムを有する組換えウイルスは、１度だけ感染させることができ、増殖することはできない。したがって、潜在的に有害なレトロウイルスの世代なしに、宿主細胞ゲノムにＮＯＩが導入される。"Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅ" （１９９７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｏｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＬＭ Ｃｏｆｆｉｎ， ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ， ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ４４９）に、利用できるパッケージング系の概要が掲載されている。
【００２９】
しかし、この技術は、タイターレベルが常に満足のゆくレベルにあるとは限らないという意味で問題がある。それにもかかわらず、特に、初期のデザインで頻繁に直面するヘルパーウイルスの自発的産生の問題を検討するところまで、レトロウイルスのパッケージング細胞系のデザインは進化した。相同性により組換えが非常に容易になるため、ベクターのゲノムとヘルパーのゲノムとの間の相同性を減少または排除することにより、ヘルパーウイルス産生の問題を減少させた。
【００３０】
その後、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖウイルスのコード領域が、それぞれ独立にパッケージング細胞系に形質導入される別々の発現プラスミド上に担持されており、それ故、野生型ウイルスの産生に３つの組換え事象が必要とされるパッケージング細胞が開発された。この方策は、３プラスミドトランスフェクション法と呼ばれることもある（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ １９９５ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：６２８−６３３）。
【００３１】
ベクターを開発するとき、一過性トランスフェクションを使用して、ベクター生成を測定することもできる。この点について、一過性トランスフェクションは、安定なベクター製作細胞系の生成に必要なより長い期間を避けることができ、ベクターまたはレトロウイルスのパッケージング成分が細胞に有毒である場合、使用される。レトロウイルスベクターの製作に一般に使用される構成要素は、Ｇａｇ／Ｐｏｌタンパク質をコードするプラスミド、ｅｎｖタンパク質をコードするプラスミドおよびＮＯＩを含むプラスミドを含む。ベクター生成は、その他の必要な成分を含む細胞内に、これらの成分の１つまたは複数を一時的にトランスフェクトすることを含む。ベクターが、有毒な遺伝子または宿主細胞の複製を妨害する遺伝子、たとえば、細胞周期の阻害剤またはアポトーシスを誘導する遺伝子をコードするのであれば、安定なベクター製作細胞系を製作することは困難であろうが、一過性トランスフェクションを使用して、細胞が死ぬ前にベクターを製作することができる。また、一過性の感染を使用して、安定なベクター製作細胞系から得られるレベルに匹敵するベクタータイターレベルを生じる細胞系が開発された（Ｐｅａｒ ｅｔ ａｌ １９９３， ＰＮＡＳ ９０：８３９２−８３９６）。
【００３２】
幾つかのＨＩＶタンパク質の毒性（安定なＨＩＶを基にしたパッケージング細胞の製作を困難にする可能性がある）を考慮して、ＨＩＶベクターは、通常、ベクターおよびヘルパーウイルスの一過性トランスフェクションにより製作される。ＨＩＶＥｎｖタンパク質を水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のｅｎｖタンパク質と置き換えた研究者さえいる。一過性トランスフェクションにより５×１０5（濃縮後１０8）のタイターを有するＨＩＶ／ＶＳＶ−Ｇベクターを製作したように、ＶＳＶのＥｎｖタンパク質を挿入すると、ベクター濃縮が容易になる（Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ １９９６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−２６７）。したがって、ＨＩＶベクターの一過性トランスフェクションは、高タイターベクターを製作するための有用な方策を提供することが可能である（Yｅｅ ｅｔ ａｌ １９９４ ＰＮＡＳ ９１：９５６４−９５６８）。しかし、この方法による欠点は、ＶＳＶ−Ｇタンパク質が細胞に対してかなり有毒なことである。
【００３３】
ｅｎｖ遺伝子と異種ｅｎｖ遺伝子との置き換えは、シュードタイピング（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）と呼ばれる技術または方策の一例である。シュードタイピングは、新しい現象ではなく、WＯ−Ａ−９８／０５７５９、WＯ−Ａ−９８／０５７５４、WＯ−Ａ−９７／１７４５７、WＯ−Ａ−９６／０９４００、WＯ−Ａ−９１／０００４７およびＭｅｂａｔｓｉｏｎ ｅｔ ａｌ １９９７ Ｃｅｌｌ ９０， ８４１−８４７に例が見られる。
【００３４】
シュードタイピングは、１つまたは複数の利点を与えることができる。たとえば、レンチウイルスのベクターを使用すると、ＨＩＶを基にしたベクターのｅｎｖ遺伝子産物は、ＣＤ４と呼ばれるタンパク質を発現する細胞のみを感染させるように、これらのベクターを制限するようになる。しかし、これらのベクターのｅｎｖ遺伝子が、他のＲＮＡウイルス由来のｅｎｖ配列と置換されると、その時には、より広い感染性スペクトルを有する可能性がある（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ １９９７ Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９− ２４２）。前述の通り、また例として、研究者らは、ＶＳＶ由来の糖タンパク質を含むＨＩＶを基にしたベクターを、シュードタイプした（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ １９９７ 同書）。
【００３５】
また、例として、レトロウイルスｅｎｖタンパク質の相対的な脆弱性によって、レトロウイルスベクターを濃縮できる能力が限定される可能性があり、ウイルスを濃縮すると、ウイルスの回収が不十分になる。レトロウイルスＥｎｖタンパク質をより安定なＶＳＶ−Ｇタンパク質と置換して、収率の高い、より効率的なベクター濃度が可能になり、この問題をある程度まで克服することができる（Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ １９９６． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−２６７）。
【００３６】
しかし、ＶＳＶ−Ｇタンパク質を用いたシュードタイピングが常に望ましいとは限らない。これは、ＶＳＶ−Ｇタンパク質が細胞障害性であるためである（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １００５７およびその中に引用の参考文献）。
【００３７】
それゆえ、無毒で且つレトロウイルスベクターのシュードタイピングに使用することができる他のタンパク質を発見することが望ましい。
したがって、本発明は、改良されたレトロウイルスベクターを提供しようとするものである。
【００３８】
本発明の態様によれば、標的部位に形質導入することが可能なレトロウイルス送達システムであって、エンベロープタンパク質の少なくとも一部をコードする第１のヌクレオチド配列、およびレトロウイルス送達システムにより標的部位への形質導入を確実にするレトロウイルスから誘導できる１つまたは複数の他のヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列は、前記その他のヌクレオチド配列の少なくとも１つに関して異種であり、第１のヌクレオチド配列は、標的部位を認識することができる狂犬病Ｇタンパク質またはその突然変異体、変異型、誘導体またはフラグメントの少なくとも一部をコードすることを特徴とするレトロウイルス送達システムが提供される。
【００３９】
本発明のレトロウイルス送達システムは、１つの実体(entity)を含むことができる。あるいは、本発明のレトロウイルス送達システムは、共同して、本発明のレトロウイルス送達システムを提供する複数の実体を含むことができる。これらのウイルス送達システムの例としては、Ｓａｖａｒｄ ｅｔ ａｌ １９９７， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１（５）：４１１１−４１１７； Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ １９９７， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５（９）：８６６−８７０； および英国特許出願第９７２０４６５．５号に記載されているような、ヘルペスウイルスおよびアデノウイルスが挙げられるが、その限りではない。
【００４０】
用語「誘導可能な」は、必ずしもレトロウイルスから得る必要はなく、それから誘導することができる配列を意味するという、通常の意味で使用される。例として、この配列を合成的に、もしくは組換えＤＮＡ技術を使用して、製作することができる。
【００４１】
本発明の第２の態様によれば、本発明によるレトロウイルス送達システムから得られるウイルス粒子が提供される。
【００４２】
本発明の第３の態様によれば、レトロウイルスベクターが本発明の第１の態様によるレトロウイルス送達システムであるか、それから得られる、レトロウイルスベクターが提供される。
【００４３】
本発明の第４の態様によれば、本発明によるレトロウイルス送達システム、本発明によるウイルス粒子、または本発明によるレトロウイルスベクターを用いて形質導入された細胞が提供される。
【００４４】
本発明の第５の態様によれば、医薬用の、本発明によるレトロウイルス送達システム、本発明によるウイルス粒子、本発明によるレトロウイルスベクターが提供される。
【００４５】
本発明の第６の態様によれば、ＮＯＩを必要とする標的部位に、それを送達するための医薬組成物の製造において、本発明によるレトロウイルス送達システム、本発明によるウイルス粒子、本発明によるレトロウイルスベクターを使用することができる。
【００４６】
本発明の第７の態様によれば、細胞を、本発明によるレトロウイルス送達システム、または本発明によるウイルス粒子、または本発明によるレトロウイルスベクターと接触させることを含む方法が提供される。
【００４７】
本発明の第８の態様によれば、本発明によるレトロウイルス送達システム、本発明によるウイルス粒子、本発明によるレトロウイルスベクターを提供するためのベクターであって、狂犬病Ｇタンパク質またはその突然変異体、変異型、誘導体またはフラグメントの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含むベクターが提供される。
【００４８】
本発明の第９の態様によれば、本発明によるレトロウイルス送達システム、本発明によるウイルス粒子、または本発明によるレトロウイルスベクターを提供するためのプラスミドであって、狂犬病Ｇタンパク質またはその突然変異体、変異型、誘導体またはフラグメントの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドが提供される。
【００４９】
本発明の第１０の態様によれば、少なくとも１つのプラスミドが、本発明によるプラスミドであり、少なくとも１つの他のプラスミドがレトロウイルスから誘導できる１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、複数のプラスミドが提供される。
【００５０】
本発明の第１１の態様によれば、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターまたはレトロウイルス粒子の感染性プロフィールに影響を及ぼすために、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターまたはレトロウイルス粒子をシュードタイプするのに、狂犬病Ｇタンパク質を使用することができる。
【００５１】
本発明の第１２の態様によれば、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターまたはレトロウイルス粒子の宿主範囲および／または細胞親和性に影響を及ぼすために、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターまたはレトロウイルス粒子をシュードタイプするのに、狂犬病Ｇタンパク質を使用することができる。
【００５２】
本発明の第１３の態様によれば、狂犬病Ｇタンパク質を用いてシュードタイプされたレトロウイルスまたはレトロウイルスベクターまたはレトロウイルス粒子が提供される。
【００５３】
本発明の第１４の態様によれば、異種ｅｎｖ領域が狂犬病Ｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を含む、異種ｅｎｖ領域を含むレトロウイルス送達システムが提供される。
【００５４】
本発明の第１５の態様によれば、異種ｅｎｖ領域が狂犬病Ｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、異種ｅｎｖ領域を含むレトロウイルス送達システムが提供される。
【００５５】
第１のヌクレオチド配列は、狂犬病Ｇタンパク質またはその突然変異体、変異型、誘導体またはフラグメントの全てをコードすることが好ましい。
【００５６】
他のヌクレオチド配列の少なくとも１つは、レンチウイルスまたはオンコレトロウイルスから誘導できることが好ましい。
【００５７】
その他のヌクレオチド配列は、レンチウイルスまたはオンコレトロウイルスから誘導できることが好ましい。
【００５８】
その他のヌクレオチド配列は、ＭＬＶ、ＨＩＶまたはＥＩＡＶから誘導できることが好ましい。
【００５９】
レトロウイルス送達システムは、少なくとも１つのＮＯＩを含むことが好ましい。
【００６０】
ＮＯＩは治療効果を有するか、治療効果を有するタンパク質をコードすることが好ましい。
【００６１】
標的部位は細胞であることが好ましい。
【００６２】
したがって、本発明は、異種エンベロープタンパク質を有するレトロウイルスベクターを提供する。このレトロウイルスベクターは、遺伝子療法に有用である。
【００６３】
本発明の重要な態様は、狂犬病タンパク質、特に、狂犬病Ｇタンパク質を含む、コードするヌクレオチド配列を用いた、レトロウイルス、および／または誘導可能なもしくはレトロウイルスを基にしたレトロウイルスベクターのシュードタイピングである。ここで、用語シュードタイピングは、別のウイルス由来のタンパク質を、ウイルスゲノムまたはウイルスベクターのｅｎｖ遺伝子の少なくとも一部に組み込むこと、一部と置換すること、全てを置き換えることを意味する。
【００６４】
狂犬病Ｇタンパク質、ならびにその突然変異体に関する教示は、Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９８２ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．４３： ３６１−３６４， Ｈａｎｈａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，６７，５３０−５４２， Ｔｕｆｆｅｒｅａｕｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２， １０８５−１０９１， Ｋｕｃｅｒａ ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ５５， １５８−１６２， Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．， １９８３ ＰＮＡＳ ８０， ７０−７４， Ｓｅｉｆ ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ５３，９２６−９３４， Ｃｏｕｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，７２，２７３−２７８， Ｔｕｆｆｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，７２， １０８５−１０９１０， Ｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ ６５， ４１９８−４２９３， Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ １９９８ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４２， １８７−１９３， Ｃｏｌｌ １９９７ Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４２， ２０８９−２０９７， Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ ５１， ３５−４１， Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ １９９８ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４２２， １８７−１９３， Ｃｏｌｌ １９９５ Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４０， ８２７−８５１， Ｔｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．， １９９２ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ ２５， １−１３， Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ １９９２ ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８９， ２０３−２１６， Ｇａｕｄｉｎ ｅｔ ａｌ １９９２ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８７， ６２７−６３２， Ｗｈｉｔｔ ｅｔａｌ １９９１ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５， ６８１−６８８， Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ １９７８ Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ４０， １３１−１３９， Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ １９７８ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ ４０， ４５−５５， Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ １９７８ Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ２３， ２８６−２９３及びＯｔｃｏｓｅｔａｌ １９９４ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２２４，６８−７６にある。狂犬病Ｇタンパク質は、欧州特許ＥＰ−Ａ−０４４５６２５号にも記載されている。
【００６５】
本発明による狂犬病Ｇタンパク質を使用すると、優先的に標的細胞にｉｎ ｖｉｖｏで形質導入し、この細胞を狂犬病ウイルスが優先的に感染させるベクターを得ることができる。この中には、特に、ｉｎ ｖｉｖｏでのニューロン標的細胞が含まれる。ニューロンを標的としたベクターの場合、ＥＲＡ等の、狂犬病の病原性株由来の狂犬病Ｇが特に有効である。その反面、狂犬病Ｇタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験したほぼ全ての哺乳類細胞タイプおよび鳥類細胞タイプを含む広い標的細胞範囲を与える（Ｓｅｇａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．， １９９０ Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ． ３４， １５５−１６３； Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｖｏｌ．２， Lｉｐｐ ｉｎｃｏｔｔ− Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｎｅw Yｏｒｋ）。関心のある他の細胞タイプを感染させる能力を与えることも、多分、確認されるであろう。したがって、本発明による狂犬病Ｇタンパク質を使用すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも、多種多様の細胞タイプに形質導入するベクターを提供することもできる。ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで異なる狂犬病ウイルスの親和性は、狂犬病Ｇが一連のレセプターに結合できる能力（その一部はｉｎ ｖｉｔｒｏのみで活性である）に起因すると考えられる。
【００６６】
あるいは、本発明にしたがってシュードタイプされたベクター粒子の親和性は、細胞外ドメイン内で改変される突然変異体狂犬病Ｇを使用することにより、改変することが可能である。狂犬病Ｇタンパク質には、標的細胞範囲を制限するように突然変異させることが可能であるという利点がある。ｉｎ ｖｉｖｏでの標的細胞による狂犬病ウイルスの取り込みには、アセチルコリンレセプター（ＡｃｈＲ）が介在するが、ｉｎ ｖｉｖｏで結合する他のレセプターもある（Ｈａｎｈａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９３ J． Ｖｉｒｏｌ．， ６７， ５３０−５４２； Ｔｕｆｆｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８ J． Ｖｉｒｏｌ．， ７２， １０８５−１０９１）。狂犬病Ｇタンパク質の抗原性部位ＩＩＩにおける突然変異がウイルス親和性に及ぼす作用について研究が行われており、この領域は、ウイルスのアセチルコリンレセプターへの結合に関与していないと考えられている（Kｕｃｅｒａ ｅｔ ａｌ．， １９８５ J． Ｖｉｒｏｌ ５５， １５８− １６２； Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．， １９８３ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８０， ７０−７４； Ｓｅｉｆ ｅｔ ａｌ．， １９８５ J．Ｖｉｒｏｌ．， ５３， ９２６−９３４； Ｃｏｕｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８ J． Ｖｉｒｏｌ．， ７２， ２７３−２７８； Ｔｕｆｆｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８ J． Ｖｉｒｏｌ．， ７２， １０８５−１０９１０）。たとえば、成熟タンパク質のアミノ酸３３３におけるアルギニンの、グルタミンへの突然変異を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでのウイルスの嗅覚器官および末梢ニューロンへの侵入を制限すると同時に、中枢神経系への増殖を減少させることができる。これらのウイルスは、ｗｔウイルスと同じぐらい効率よく運動ニューロンおよび感覚ニューロンを透通することができたが、経ニューロン移動は起こらなかった（Ｃｏｕｌｏｎ ｅｔ ａｌ． １９８９ J． Ｖｉｒｏｌ． ６３ ３５５０−３５５４）。アミノ酸３３０が突然変異したウイルスの筋内注射後に、運動ニューロンまたは感覚ニューロンのいずれも感染させることができないところまで、さらに弱毒化する（Ｃｏｕｌｏｎ ｅｔ ａｌ． １９９８ J． Ｖｉｒｏｌ． ７２ ２７３−２７８）。
【００６７】
代替的に、又は追加の手法として、狂犬病の実験用継代株由来の狂犬病Ｇタンパク質を使用してもよい。親和性の変化について、これらをスクリーニングすることができる。このような株として、以下のものが挙げられる。
【００６８】
【表１】
例として、ＥＲＡ株は、狂犬病の病原性株であり、ニューロン細胞への形質導入に、この株由来の狂犬病Ｇタンパク質を使用することができる。ＥＲＡ株由来の狂犬病Ｇの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに存在する（寄託番号J０２２９３）。このタンパク質は、１９アミノ酸のシグナルペプチドを有し、成熟タンパク質は、翻訳開始メチオニンから２０アミノ酸のリジン残基で開始する。ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株は、低減した病原性と関連し、且つウイルスエンベロープの親和性を制限するのに使用することができる、成熟タンパク質のアミノ酸３３３位におけるアルギニンからグルタミンまでの突然変異を含む。
【００７０】
狂犬病Ｇタンパク質の一例を配列番号２として示し、そのコード配列を配列番号１として表す。本発明は、これらの配列の変異型、相同物(homologue)または誘導体を含む。
【００７１】
本発明の好ましい酵素に関するアミノ酸配列に関連した用語「変異型」、「相同物」または「フラグメント」は、配列からもしくは配列への、１つ（または複数）のアミノ酸の置換、変異、修飾、置き換え、欠失または付加のいずれかを含むが、但し、結果として得られるタンパク質が、Ｇタンパク質活性および／またはＧタンパク質特性またはプロフィールを有し、配列番号２として示したＧタンパク質と少なくとも同じぐらい生物学的に活性であることが好ましい。特に、用語「相同物」は、構造および／または機能に関して相同を含む。配列相同に関しては、配列番号２として示した配列と、好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％の相同性がある。さらに好ましくは、配列番号２として示した配列と、少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性がある。
【００７２】
本発明の好ましい酵素をコードするヌクレオチド配列に関連した用語「変異型」、「相同物」または「フラグメント」は、配列からもしくは配列への、１つ（または複数の）核酸の、置換、変異、修飾、置き換え、欠失または付加を含むが、但し、結果として得られるヌクレオチド配列は、Ｇタンパク質活性および／またはＧタンパク質特性またはプロフィールを有するタンパク質をコードするか、コードすることができ、配列番号１として示した配列によりコードされるＧタンパク質と少なくとも同じぐらい生物学的に活性であることが好ましい。特に、用語「相同物」は、構造および／または機能に関して相同を含むが、但し、結果として得られるヌクレオチド配列は、Ｇタンパク質活性および／またはＧタンパク質特性またはプロフィールを有するタンパク質をコードするか、コードすることができる。配列の相同性に関しては、配列番号１として示した配列と、好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％の相同性がある。さらに好ましくは、配列番号１として示した配列と、少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性がある。
【００７３】
特に、本明細書で使用する用語「相同」は、用語「同一性」と等価とみなされる。相対的配列相同（すなわち配列同一性）は、２つ以上の配列間の％相同を算出することができる市販のコンピュータープログラムによって決定することができる。このようなコンピュータープログラムの代表例はＣＬＵＳＴＡＬである。
【００７４】
用語「変異型」、「相同物」または「フラグメント」は、配列の対立遺伝子変異と同義である。
【００７５】
用語「変異型」は、本明細書に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる配列に相補的な配列も含む。好ましくは、用語「変異型」は、ストリンジェントな条件（たとえば、６５℃および０．１ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０｝）で、本明細書に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる配列に相補的な配列を含む。
【００７６】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列（本明細書に記載のものの相補的配列を含む）にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列も含む。好ましい態様では、本発明は、ストリンジェントな条件（たとえば、６５℃および０．１ ＳＳＣ）で、本明細書のヌクレオチド配列（本明細書に記載のものの相補的配列を含む）にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む。
【００７７】
ＶＳＶ糖タンパク質と比較して、狂犬病糖タンパク質を使用する主な利点は、狂犬病ワクチンが長く使用されてきたため、ヒトおよび他の動物に対する毒性が詳しくわかっていることである。特に、カナリヤ痘組換えウイルスから発現される狂犬病糖タンパク質のヒトワクチンとしての使用に関する、フェーズＩ臨床治験が報告され（Ｆｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｖａｃｃｉｎｅ １４， ４２８−４３４）、これらの研究で、このワクチンは、ヒトに使用して安全であると結論づけられた。
【００７８】
本発明のレトロウイルスベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞に１つまたは複数のＮＯＩを送達するのに、特に、治療上有効なＮＯＩを送達するのに有用である。１つまたは複数の選択されたＮＯＩを、標的細胞で発現させるためのベクターゲノムに組み込むことができる。ＮＯＩは、１つまたは複数の、それ自身の発現調節配列を具有してもよく、その発現をベクターＬＴＲで調節してもよい。ＮＯＩを適切に発現するために、ＬＴＲ内またはＬＴＲ間に、ある一定の条件下またはある一定の細胞タイプで、優先的に活性であるプロモーターを含めてもよい。ＮＯＩは、センス配列であってもよく、アンチセンス配列であってもよい。さらに、複数のＮＯＩが存在する場合、これらのＮＯＩは、センス配列であってもよく、アンチセンス配列であってもよく、あるいはそれらの組み合わせであってもよい。
【００７９】
本発明のレトロウイルスベクターゲノムは、一般に、５'末端および３'末端におけるＬＴＲ、治療上有効な遺伝子および／またはマーカー遺伝子を含む１つまたは複数のＮＯＩ、または１つまたは複数のＮＯＩ（ｓ）を挿入するための適当な挿入部位、およびプロデューサー細胞内のベクター粒子内にゲノムをパッケージできるようにするパッケージングシグナルを含む。ベクターＲＮＡのＤＮＡへの逆転写およびプロウイルスＤＮＡの標的細胞ゲノムへの組み込みを可能にするための、適当なプライマー結合部位および組み込み部位さえ存在する可能性がある。好ましい実施形態では、レトロウイルスベクター粒子は、逆転写システム（適合した逆転写部位およびプライマー結合部位）および組み込みシステム（適合したインテグラーゼおよび組み込み部位）を有する。
【００８０】
したがって、本発明によれば、ウイルス遺伝子が１つまたは複数のＮＯＩで置き換えられるか、または１つまたは複数のＮＯＩを補足されるように、ウイルスゲノムまたはレトロウイルスベクターヌクレオチド配列を操作することが可能である。ＮＯＩは、選択遺伝子、マーカー遺伝子および治療用のいずれか１つまたは複数であってもよい。レトロウイルスベクターに、多くの異なる選択可能なマーカーが申し分なく使用されてきた。これらは、"Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ"（１９９７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｏｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＬＭ Ｃｏｆｆｉｎ， ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ， ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ４４４）で検討されており、その例として、細菌のネオマイシン遺伝子およびヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（それぞれ、Ｇ４１８およびヒグロマイシンに対する耐性を与える）、突然変異体マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（メトトレキサートに対する耐性を与える）、細菌のｇｐｔ遺伝子（マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、キサンチンおよびアミノプテリンを含む培地中で細胞を成長させる）、細菌のｈｉｓＤ遺伝子（ヒスチジンを含むがヒスチジノールを含まない培地中で細胞を成長させる）、多剤耐性遺伝子（ｍｄｒ）（様々な薬剤に対する耐性を与える）、およびピューロマイシンまたはフレオマイシンに対する耐性を与える細菌遺伝子が挙げられるが、その限りではない。これらのマーカーは全て、優性遺伝子選択可能であり、且つこれらの遺伝子を発現するほとんどの細胞を化学的に選択することが可能である。
【００８１】
本発明によれば、遺伝子それ自体が治療効果を誘発できてもよく、あるいは、治療効果を誘発することができる生成物をコードしてもよいという意味で、ＮＯＩは治療用遺伝子であり得る。
【００８２】
治療用ＮＯＩの非限定的例としては、腫瘍サプレッサータンパク質、サイトカイン類、抗ウイルスタンパク質、免疫調節分子、抗体、操作されたイムノグロブリン様分子、融合タンパク質、ホルモン類、膜タンパク質、血管作用性タンパク質またはペプチド、成長因子、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、酵素、プロドラッグ活性化酵素等のプロドラッグ、細胞障害性薬剤、および酵素阻害剤をコードする遺伝子が挙げられる。
【００８３】
プロドラッグの例としては、リン酸エトポシド（アルカリホスファターゼと一緒に使用される）、５−フルオロシトシン（シトシンデアミナーゼと一緒に使用される）；ドキソルビシン−Ｎ−ｐ−ヒドロキシフェノキシアセトアミド（ペニシリン−Ｖ−アミダーゼと一緒に使用される）、パラ−Ｎ−ビス（２−クロロエチル）グルタミン酸アミノベンゾイル（カルボキシペプチダーゼＧ２と一緒に使用される）、セファロスポリンナイトロジェンマスタードカルバメート（Ｂ−ラクタマーゼと一緒に使用される）、ＳＲ４２３３（ｐ４５０還元酵素と一緒に使用される）、ガンシクロビル（ＨＳＶチミジンキナーゼと一緒に使用される）、ニトロリダクターゼおよびシクロホスファミドまたはイホスファミドを含むマスタードプロドラッグ（チトクロームｐ４５０と一緒に使用される）が挙げられるが、その限りではない。
【００８４】
治療することが可能な疾患としては、癌、心疾患、脳卒中、神経変性疾患、関節炎、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、免疫システム疾患、ウイルス感染、腫瘍、血液凝固障害、およびレッシュ−ナイハン症候群、パーキンソン病、膿胸、フェニルケトン尿症、鎌形赤血球貧血、α−サラセミア、β−サラセミア、ゴーシュ病等の慢性肉芽腫症遺伝病が挙げられるが、その限りではない。
【００８５】
レトロウイルスベクターを使用した遺伝子療法用の標的細胞としては、造血細胞（単球、マクロファージ、リンパ球、顆粒球、またはこれらのいずれかの前駆細胞を含む）、内皮細胞、腫瘍細胞、ストロマ細胞、星状細胞、またはグリア細胞、筋細胞、上皮細胞、ニューロン、線維芽細胞、肝細胞、星状細胞、および肺細胞が挙げられるが、その限りではない。
【００８６】
本発明のレトロウイルスベクター内で、１つまたは複数のＮＯＩは、ウイルスＬＴＲの転写調節下にあってもよい。あるいは、より高いレベルの発現を実現するために、エンハンサー−プロモーターエレメントの組み合わせが存在してもよい。プロモーター−エンハンサーエレメントは、好ましくは、標的細胞内で、強く活性であるかまたは強力に誘導することができる。強く活性なプロモーター−エンハンサー組み合わせの１例は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）主要中間初期（ＭＩＥ）プロモーター／エンハンサー組み合わせである。プロモーター−エンハンサー組み合わせは、それらの活性が組織制限的であってもよく、時間制限的であってもよい。ＭＵＭ遺伝子またはＣＥＡ遺伝子由来のプロモーター−エンハンサー等の、適当な組織制限プロモーター−エンハンサー組み合わせの例は、腫瘍細胞内で極めて活性である。
【００８７】
低酸素または虚血制御可能な発現も、ある一定の環境で、特に有用な可能性がある。低酸素は、広範囲の異なる細胞タイプで遺伝子発現の強力なレギュレーターであり、様々な遺伝子プロモーター上の低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）である、同族のＤＮＡ認識部位に結合する低酸素誘導可能因子−Ｉ（ＨＩＦ−１）等の、低酸素−誘導可能な転写因子の活性の誘導によって作用する（Wａｎｇ ａｎｄ Ｓｅｍｅｎｚａ １９９３ ＰＮＡＳ．（ＵＳＡ） ９０：４３０）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは低酸素に応答して、またｉｎ ｖｉｖｏでは充実性腫瘍内で、ヒト線維腫細胞によるマーカー遺伝子と治療用遺伝子の両者の発現の調節に、マウスホスホグリセレートキナーゼ−Ｉ（ＰＧK−１）遺伝子由来のＨＲＥの多重結合型が使用されてきた。（Ｆｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ １９９４， ＰＮＡＳ ９１０４）：６４９６−６５００； Ｄａｃｈｓ ｅｔ ａｌ １９９７ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ５：５１５）。あるいは、腫瘍の虚血領域にグルコース欠乏も存在することを使用して、特に腫瘍における異種遺伝子発現を活性化することができる。グルコース欠乏により特異的に活性化されることが知られているｇｒｐ７８遺伝子プロモーターの末端を切断した６３２塩基対配列は、ｉｎｖｉｖｏで、ネズミ腫瘍におけるレポーター遺伝子の高レベル発現を推進できることが証明されている（Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ １９９５ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５： １６６０)。
【００８８】
次の遺伝子療法に使用するための本発明のレトロウイルスベクターゲノムは、ベクターとして効率よく機能するのに必要な最小限のレトロウイルス物質を含むことが好ましい。この目的は、ＮＯＩを組み込むための空間を与えるためと、安全性の理由である。レトロウイルスベクターゲノムは、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子によりコードされる構造（またはパッケージング）成分の１つまたは複数をコードする機能遺伝子が欠けていることによる複製能欠損であることが好ましい。粒子製作に必要な、欠けている成分は、プロデューサー細胞において、トランスで提供される。ゲノムにウイルス構造成分が欠けていることは、標的細胞で発現されるウイルスタンパク質に対して発生する望ましくない免疫応答が、減少するか回避されることも意味する。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏ使用を考慮する場合、感染性ウイルス粒子の可能な再建を避けることが好ましい。したがって、組換えの機会を減少させるために、できる限り、ウイルスの構造成分をゲノムから排除することが好ましい。
【００８９】
本発明のレトロウイルスベクター粒子は、一般に、適当なプロデューサー細胞で生成される。プロデューサー細胞は、一般に、哺乳類細胞であるが、たとえば昆虫細胞であってもよい。プロデューサー細胞は、通常はそのゲノムに組み込まれる、ウイルス構造遺伝子を含むパッケージング細胞であってもよい。次いで、感染性の複製能欠損ベクター粒子を製作するために、ベクターゲノムをコードする核酸を、パッケージング細胞に形質導入する。あるいはプロデューサー細胞に、ベクターゲノムおよび構造成分をコードする核酸配列、および／またはプラスミド、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターまたは機能的ＤＮＡを標的細胞に送達することがわかっているいずれかの方法の１つまたは複数の発現ベクター上に存在する核酸配列を共形質導入する。
【００９０】
本発明の好ましい実施形態に従って、筆者らは、狂犬病ウイルス由来のエンベロープタンパク質、すなわち、狂犬病Ｇタンパク質が、多種多様のレトロウイルスベクターを効率よくシュードタイプできることを予期せず発見した。この中には、ＭＬＶ等のネズミオンコレトロウイルスから構築されるベクターのみならず、ＨＩＶ等の霊長類レンチウイルスから構築されるベクターおよび非霊長類レンチウイルス等のウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）から構築されるベクターも含まれる。
【００９１】
１つの実施形態では、本発明のベクターは、レンチウイルスから構築されるか誘導される。これは、ベクターが非分裂細胞および分裂細胞に形質導入を行うことができる可能性があるという利点を有する。
【００９２】
したがって、本発明によるシュードタイピングに好ましいレトロウイルスベクターは、ＨＩＶベクターまたはＥＩＡＶベクター等のレンチウイルスベクターである。これらには、上記の利点がある。特に、狂犬病ウイルス標的細胞範囲を有する狂犬病Ｇでシュードタイプされたレンチウイルスベクターは、ニューロン等の、中枢神経系の非分裂細胞に形質導入を行うことができる。
【００９３】
本発明の発見は非常に目覚しい。この点に関して、狂犬病およびＶＳＶは、（５つの異なる下位群を含む非常に大きいファミリーである）が、それら（すなわちＶＳＶおよび狂犬病）は、異なる下位群にある。さらに、狂犬病Ｇタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇとの相同性をほとんど持たない（Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９８２ J． Ｖｉｒｏｌ． ４３： ３６１− ３６４）。この狂犬病Ｇタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇよりもはるかに長い細胞質ドメインも有し、２８〜３１アミノ酸のＶＳＶ−Ｇ細胞質ドメインに対して約４４アミノ酸（長さ）である。したがって、１４４アミノ酸ＨＩＶ−１細胞質の尾部の末端切断には、効率よくＭＬＶ粒子をシュードタイプする必要があることを考えると（Ｍａｍｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７ J． Ｖｉｒｏｌ． ７１：３３４１−３３４５）、狂犬病Ｇタンパク質がＭＬＶをシュードタイプできるという発見は予想外である。狂犬病Ｇタンパク質が、他のレトロウイルス、たとえば、レンチウイルス群のウイルスをさらにシュードタイプできることも意外である。
【００９４】
したがって、本発明は、１つの態様において、狂犬病ウイルスＧタンパク質でシュードタイプしたレトロウイルスベクター粒子を提供する。
【００９５】
別の態様では、本発明は、狂犬病ウイルスＧタンパク質をコードする核酸配列、レトロウイルスベクターゲノムをコードする核酸配列、および任意に、そのゲノムを含む感染性レトロウイルスベクター粒子の製作に必要なパッケージング成分をコードする１つまたは複数のさらなる核酸配列を含む、レトロウイルスベクター製作システムを提供する。
【００９６】
さらなる態様では、本発明にしたがって、レトロウイルスベクターの標的細胞範囲を変えるために狂犬病ウイルスＧタンパク質を使用することができる。
【００９７】
別の態様では、本発明は、狂犬病ウイルスＧタンパク質を含むエンベロープを有するレトロウイルスベクター粒子を製作する方法であって、本明細書に記載の、プロデューサー細胞内のレトロウイルスベクター製作システムを提供することと、上記プロデューサー細胞をベクター粒子成分の発現およびベクター粒子の製作に適した条件に供することと、ベクター粒子を上澄から回収することとを含む方法を提供する。
【００９８】
さらに別の態様では、本発明は、標的細胞にＮＯＩを形質導入する方法であって、本明細書に記載のレトロウイルスベクター粒子と上記細胞を接触させることと、ＮＯＩが標的細胞ゲノム内に侵入するように、ベクターが付着し、細胞内に侵入できる条件でＮＯＩを担持することを含む方法を提供する。
【００９９】
本発明によるベクターのエンベロープ内に存在する狂犬病Ｇタンパク質に加えて、１つまたは複数の他のエンベロープタンパク質も存在してもよい。この中には、たとえば、レトロウイルスの天然のエンベロープタンパク質も含まれる。シュードタイピングタンパク質に加えて天然のエンベロープタンパク質を使用することは、エンベロープの安定性および／または機能に有益な可能性がある。ベクターの感染性プロフィールを広げることさえ可能である。
【０１００】
本発明は、遺伝子療法によって個体を治療するための医薬組成物であって、本発明によるレトロウイルスベクターの治療有効量を含む組成物を提供する。この医薬組成物は、ヒト用または動物用である。一般に、医師が、個々の対象者に最も適当であろう実際の投与量を決定するが、これは、年齢、体重および個々の患者の応答によって様々であろう。
【０１０１】
本組成物は、薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤、または補助剤を任意に含んでもよい。製剤担体、担体、賦形剤または希釈剤の選択は、所期の投与経路および標準的な製剤実施に関して、選択することができる。この医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として、あるいは担体、賦形剤または希釈剤に加えて、適当なバインダー、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤、およびウイルスが標的部位に侵入するのを助けるまたは増進することが可能な他の担体剤（たとえば脂質送達システム等）を含んでもよい。
【０１０２】
適当な場合、吸入、坐剤またはペッサリーの形で、ローション、溶液、クリーム、軟膏、または粉剤の形で局所的に、皮膚パッチを使用して、スターチまたはラクトース等の賦形剤を含む錠剤の形で、単独または賦形剤との混合物のいずれかのカプセルもしくは小卵内で、または調味料もしくは着色剤を含むエリキシル、溶液もしくは懸濁液の形で経口的に投与する方法のうち、いずれか１以上の方法によって、本医薬組成物を投与することができる。あるいは、本医薬組成物を、非経口的に、たとえば海綿体内、静脈内、筋内または皮下に注射することができる。非経口投与の場合、溶液を血液と等張にするために、他の物質、たとえば十分な塩類または単糖類を含んでもよい無菌水溶液の形で、本組成物を最もよく使用することができる。頬投与または舌下投与の場合、従来の方式で調剤することが可能な錠剤もしくはトローチ剤の形で、本組成物を投与することができる。
【０１０３】
したがって、要約すると、本発明は、異種エンベロープタンパク質、特に狂犬病ウイルスＧタンパク質を有するレトロウイルスベクターに関する。本発明は、狂犬病ウイルスＧタンパク質を含むエンベロープを有するレトロウイルスベクターを製作するための、レトロウイルスベクター製作システム、ならびに、ベクターおよびシステムを製作する方法、およびベクターおよびシステムの使用を含む方法にも関する。
【０１０４】
次に、単なる例として、また下記の図を参照しながら、本発明を説明する。ここで、
図１は、プラスミド地図を表す図であり、
図２は、ｇｅｌの写真であり、
図３は、一組の略線図であり、
図４は、グラフを表し、
図５は、２つのグラフを表し、
図６は、略線図を表す。
【０１０５】
例１−狂ｆ犬病Ｇタンパク質を発現するベクターの製作および使用した他のベクターの詳細。
ｐＳＧ５ｒａｂｇｐ（Ｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７２． ３５９−３６７）由来の１．７ｋｂｐのＢｇｌＩＩ狂犬病Ｇフラグメント（株ＥＲＡ）を、ＢａｍＨＩ消化および再連結によりｇｐｔ遺伝子が除去されたｐＧWｌＨＧ誘導体（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ １９９５ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：６２８−６３３）であるｐＳＡ９１（図１）にクローニングすることにより、狂犬病Ｇに関する発現ベクターを構築した。この構築物ｐＳＡ９１ＲｂＧはヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時型初期遺伝子プロモーター−エンハンサーから狂犬病Ｇを発現させることができる。Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ １９９５（同書）に記載の方法で、このプラスミドを、ｐＯＮＹ３（後述の構築に関する詳細を参照）およびｐＯＮＹ２．１ｎｌｓＬａｃＺ（後述の構築に関する詳細を参照）と一緒に２９３Ｔ細胞に形質導入し、形質導入した細胞における狂犬病Ｇの発現を、ウエスタンブロッティングによって確認した。狂犬病Ｇの代わりにＨＣＭＶの調節下でＶＳＶ−ＧがｐＳＡ９１で発現されたＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを、陰性対象として使用した。形質導入細胞をＰＢＳで洗浄し、用時調製した１ｍＭ ＰＭＳＦを含むＲＩＰＡ緩衝溶液で溶解し、製造会社の仕様書に従ってＢＣＡタンパク質定量化試薬キット（ＢＣＡ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を使用して、総タンパク質濃度を決定した。５０μｇの細胞溶解物を、１０％ＳＤＳ／ＰＡＧＥにかけた。このゲルをイモビロン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｉｎｃ）上にエレクトロブロットした。狂犬病Ｇに対するマウスモノクローナル抗体である１７Ｄ２（１：３０００希釈）およびウサギペルオキシダーゼ接合抗マウスＩｇＧ（１：１０００希釈）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ， ＵＫ）を用いて、ウエスタンブロット分析を実施した。ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ＵK）を使用して、化学ルミネセンスによる検出を実施した。ｐＳＡ９１ＲｂＧを形質導入した細胞で、狂犬病Ｇについて報告されたサイズに対応する６８ｋＤバンドが（図２）が識別できる。
【０１０６】
下記の実施例の全てで、前述の３プラスミドトランスフェクション法（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９５、同書）を使用して、シュードタイプされたベクターを製作した。これらの実験で使用したプラスミドは、次の通りであった。ｐＨＩＴ１１１およびｐＨＩＴ６０は、Ｅ． ｃｏｌｉ ｌａｃＺマーカー遺伝子およびＭＬＶ ｇａｇ−ｐｏｌを含むＭＬＶベクターを発現する（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。ｐＨ３ZおよびｐＧＰ−ＲＲＥ３は、対応するＨＩＶベクター成分である（Kｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９９８ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８１１−８１６）。ｐＯＮＹ２．１ｎｌｓＬａｃＺおよびｐＯＮＹ３は、対応するＥＩＡＶベクター成分である（英国特許出願第９７２７１３５．７号）。ＥＩＡＶベクターの特徴を含む、これらのベクターの重要な特徴を図３に示す。
略語の説明および図３に使用したラベルは次の通りである
【０１０７】
【表２】
ＥＩＡＶベクターの構築は以下の通りであった。
Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：４２５−９）に記載の感染性プロウイルスのクローン、ｐＳＰＥＩＡＶ１９を出発点として使用した。エンベロープタンパク質をコードするプラスミドの領域から、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント５８３５−６５７１を欠失させることにより、プラスミドｐＳＰＥＩＡＶΔＨを構築した。ＰＣＲでｐＳＰＥＩＡＶ１９から増幅したＥＩＡＶＬＴＲをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入することにより、ベクターゲノムプラスミドを構築した。次いで、ｐＳＰＥＩＡＶＡＨのＭｌｕＩ／ＭｌｕＩ（２１６／８１４）フラグメントをＬＴＲ／Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドに挿入してｐＯＮＹ２を製作した。さらに、ｐｏｌ（１９０１／４９４９）内のＢｇｌＩＩ／ＮｃｏＩフラグメントを欠失させ、ＨＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーターにより駆動される核限局性β−ガラクトシダーゼ遺伝子を、その場所に挿入した。これを、ｐＯＮＹ２．１ｎｌｓＬａｃＺと呼んだ。
【０１０９】
次いで、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質がＨＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーターから発現されるように、ｐＯＮＹ２ΔＨ由来のＭｌｕＩ／ＭｌｕＩフラグメントを哺乳類発現プラスミドｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入することにより、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子をコードするＥＩＡＶプラスミド（ｐＯＮＹ３）を製作した。
【０１１０】
【表３】
例２−狂犬病Ｇタンパク質を用いたレトロウイルスベクターのシュードタイピング
前述の３プラスミドトランスフェクション法（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ １９９５）を使用して、シュードタイプされたベクターを製作した。最初の実験で、６ウェル組織培養皿のウェル当たり、各１０μｇのｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミドおよびＥ． ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子を発現させることができるレトロウイルスベクターで、１０μｇのｐＳＡ９１ＲｂＧをコトランスフェクトした。１０μｇのｐＲＶ６７（ヒトサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーの調節下でＶＳＶ−Ｇが発現されたＶＳＶ−Ｇ発現プラスミド）を、ｐＳＡ９１における狂犬病Ｇの代わりに使用することにより、ＶＳＶ−Ｇを用いたシュードタイピングをこれらの実験用の陽性対照として使用した。
【０１１２】
ヒト腎細胞系２９３Ｔでトランスフェクションを実施し（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９５に記載通り）、ベクタービリオンを製作した。トランスフェクションの３６時間後に培養上澄を収穫し、０．４５ｍｍポアサイズのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通過させて濾過した。
【０１１３】
ｉｎ ｖｉｖｏでの狂犬病のニューロン特異性と対照的に、狂犬病ウイルス実験用株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで広く様々な細胞系と相互に作用できる（Ｒｅａｇａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｎｅｒ １９８５ Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ． ８４：２７７−２８２）。狂犬病Ｇでシュードタイプしたレトロウイルスベクターの標的細胞として使用するために、２つの細胞系ＢＨＫ２１細胞（ベビーハムスター腎細胞系）およびＤ１７細胞（イヌ黒色腫細胞系）を評価した。
【０１１４】
感染の前日に、ウェル当たり３×１０5細胞にて、細胞を６ウェル組織培養プレートにまいた。上述のＥＩＡＶ、ＨＩＶ−１およびＭＬＶベクターをシュードタイプするために、２９３Ｔ細胞を適当なプラスミドでトランスフェクトすることによって調製したウイルス上澄を、これらの細胞に加えた。感染用に使用される培養上澄１ｍｌに形質導入する時に、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）を各ウェルに加えた。感染の１２時間後、培養上澄を新鮮培地と取り替えた。ウイルスタイターを測定するために、細胞を洗浄し、感染の４８時間後に固定して染色した。
【０１１５】
３レトロウイルスベクター構築物の全てを含むｐＳＡ９１ＲｂＧおよびｐＲＶ６７を用いてトランスフェクトする場合、Ｄ１７細胞のβ−ガラクトシダーゼ陽性コロニーを確認することができた。ｐＳＡ９１ＲｂＧまたはｐＲＶ６７のいずれかが存在しないトランスフェクションでは、β−ガラクトシダーゼ陽性コロニーは皆無であり、形質導入を引き起こすためには、エンベロープが必要なことがわかる。ＢＨＫ２１細胞を用いた感染の場合、ＭＬＶシュードタイプの場合に限ってβ−ガラクトシダーゼ陽性コロニーを確認することができたが、ＥＩＡＶおよびＨＩＶ−１シュードタイプでは確認できなかった。このように確認できなかったのは、この細胞タイプにおけるＥＩＡＶおよびＨＩＶ−１に対する結合後ブロックによる可能性がある。以上の結果から、狂犬病ＧがＥＩＡＶ、ＨＩＶおよびＭＬＶベクターをシュードタイプできることが証明される。
【０１１６】
これらのシュードタイプされたベクターについて、ウイルスタイターを比較することによりシュードタイピングの効率を試験した。β−ガラクトシダーゼ陽性コロニー数からウイルスタイターを推定した（表４）。
【０１１７】
【表４】
狂犬病ＧでシュードタイプしたＭＬＶに関するウイルスタイターは、試験した両細胞系のＶＳＶ−Ｇシュードタイプで確認されたものに匹敵する（ＢＨＫ２１において、ＶＳＶ−Ｇおよび狂犬病Ｇは、それぞれ、４．８×１０6および７．８×１０6；Ｄ１７細胞において、ＶＳＶ−Ｇおよび狂犬病Ｇは、それぞれ、６．３×１０6および１．６×１０6）。
【０１１９】
ＶＳＶ−Ｇおよび狂犬病ＧでシュードタイプしたＥＩＡＶおよびＨＩＶ−１の場合、Ｄ１７細胞において、同様の結果が得られた。ＥＩＡＶの場合、ＶＳＶ−Ｇおよび狂犬病Ｇでシュードタイプしたベクターに関するウイルスタイターは、それぞれ、８．４×１０4および３．２×１０4であった。ＶＳＶ−Ｇおよび狂犬病Ｇを用いたシュードタイプの場合、ＨＩＶ−１では、ウイルスタイターは、それぞれ、３．０×１０4および６．４×１０3であった。以上の結果から、狂犬病Ｇは、３レトロウイルスベクターの全てでシュードタイプする際に、本質的にＶＳＶ−Ｇと同じぐらい効率がよいことがわかる。
【０１２０】
筆者らの結果から、狂犬病Ｇタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇで得られるものに匹敵する非常に高いタイターで、レトロウイルスベクターＥＩＡＶ、ＨＩＶ−１およびＭＬＶをシュードタイプできることが証明される。
【０１２１】
例３−変化したアミノ酸３３３を含む狂犬病Ｇタンパク質の製作および特性決定 重複ＰＣＲを使用して、結果として得られるタンパク質が、３３３位にアルギニンではなくグルタメートを有するように、ｐＳＡ９１ＲｂＧにおける狂犬病糖タンパク質遺伝子のコード配列を操作した。この変化は、狂犬病ウイルスにおいて、弱毒化および変化した細胞親和性をもたらすと報告されている。突然変異誘発に使用したプライマーは、次の通りであった：
正プライマー
5'GATGCTCACTACAAGTCAGTCCAGACTTGGAATGAGATCCTCCC3'
逆プライマー
5'GGGAGGATCTCATTCCAAGTCTGGACTGACTTGTAGTGAGCATC3'
【０１２２】
操作したフラグメントを、ＳｐｈＩＢｇｌＩＩフラグメントとしてｐＳＡ９ｌＲｇに再導入した。結果として得られたプラスミドはｐＳＡ９１ＲＭである。このベクターから生成した、操作された狂犬病Ｇタンパク質を、これがＭＬＶ粒子をシュードタイプできる能力について試験した。Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ １９９５に記載の通りに、このプラスミドを、ｐＨＩＴ６０およびｐＨＩＴ１１１と一緒に、２９３Ｔ細胞内にトランスフェクトし、ｐＳＡ９ｌＲｇを陽性対照として使用した。前述の通り、これらのトランスフェクションからの上澄を収穫し、ＢＨK−２１またはネズミ神経芽腫細胞系Ｃ−１３００クローンＮＡのいずれかに形質導入できる能力によって、２つのエンベロープがＭＬＶ粒子をシュードタイプできる能力を評価した（表５）。
【０１２３】
【表５】
ＢＨK−２１細胞（狂犬病ワクチンの生産によく使用される細胞系）で得られたタイターは、ｗｔを用いたときより操作された狂犬病Ｇタンパク質を用いた方が低かったが、Ｃ−１３００細胞の場合、２つのエンベロープで等価のタイターが得られた。以上の結果から、操作されたタンパク質は、ＭＬＶ粒子を効率よくシュードタイプできることがわかる。
【０１２５】
例４−狂犬病Ｇでシュードタイプされたレトロウイルスベクターのタイターの最適化
最適ウイルスタイターを決定するために、３−プラスミドトランスフェクションシステムに加えたｐＳＡ９１ＲｂＧＤＮＡの量を、他の２成分に対して滴定した。
【０１２６】
この実験で、ＣａＰＯ4沈殿と、プラスミドｐＳＡ９１ＲｂＧ、ｐＨＩＴ１１１、およびｐＨＩＴ６０とを使用して、ＣＯＳ−１細胞をトランスフェクトした。後者の２つのプラスミドを等量で使用した（８μｇ／トランスフェクション／ｍｍ組織培養皿）が、ｐＳＡ９１ＲｂＧの量は、逐次減少させた。トランスフェクションの３６時間後にトランスフェクションからの上澄を収穫し、存在する形質導入粒子数を、ＨＴ１０８０細胞で決定した。結果を図４に示す。他のプラスミドと比較して、ｐＳＡ９１ＲｂＧ ＤＮＡの量を８倍減少させると、最高のタイターをもたらすことがわかった。タイターは、例１で２９３Ｔ細胞から得られたものより全般的に低かった。
【０１２７】
ＥＩＡＶ−を基にしたベクターの製作に必要な２成分に対するｐＳＡ９１ＲｂＧの滴定も実施した。この場合、ＣａＰＯ4沈殿と、ｇａｇ／ｐｏｌをコードするプラスミド（ｐＯＮＹ３）８μｇおよびβ−ガラクトシダーゼをコードするＥＩＡＶベクターを発現するプラスミド（ｐＯＮＹ２．１ｌｎｌａｃＺ）８μｇとを使用して、２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。様々な量のｐＳＡ９１ＲｂＧまたはｐＲＶ６７を上述の通りに加え、それぞれ、狂犬病ＧもしくはＶＳＶ−Ｇでシュードタイプしたベクターを得た。トランスフェクションの３６時間後に、トランスフェクションからの上澄を収穫し、存在する形質導入粒子数を、Ｄ１７細胞で決定した。結果を図５に示す。他のプラスミドと比較して、ｐＳＡ９１ＲｂＧ ＤＮＡの量を２〜４倍減少させると、最高のタイターをもたらすことがわかった。ｐＲＶ６７を他の２プラスミドと等量で使用したとき、タイターの有意な低下は認められなかった。
【０１２８】
以上の結果から、プロデューサー細胞で発現される狂犬病Ｇおよび他のベクター成分の相対量を調整することにより、狂犬病Ｇでシュードタイプされたレトロウイルスベクターの改良されたタイターを得ることが可能である。
【０１２９】
例５−狂犬病Ｇでシュードタイプされたレトロウイルスベクターの濃度
超遠心分離を使用してウイルス上澄を濃縮することにより、ウイルスタイターを高めることができるかどうかをさらに調査し（Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３ ＰＮＡＳ ９０：８０３３−８０３７）、超遠心分離で、ＶＳＶ−ＧでシュードタイプされたＭＬＶを基にしたベクターを含む１ｍｌ当たり１０9形質導入粒子というウイルスタイターが得られた。
【０１３０】
前述の３プラスミドトランスフェクション法（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９５）を使用して、狂犬病ＧまたはＶＳＶ−Ｇでシュードタイプした粒子を製作した。トランスフェクションの３６時間後に、形質導入粒子を収穫し、超遠心分離で濃縮し、Ｄ１７細胞で滴定した。４８時間後、β−ガラクトシダーゼを求めるためにこれらの細胞を染色した。３つの独立した実験からタイターを平均し、ｍｌ当たりのβ−ガラクトシダーゼ産生単位として計算した。実験間で、１０％を超える差はなかった。２つのエンベロープのいずれかでシュードタイプしたＥＩＡＶもＭＬＶ粒子も、かなりの形質導入粒子の損失なしに、収穫量を１３０倍減少することができた（表６）。
【０１３１】
【表６】
以上の結果から、超遠心分離で、狂犬病Ｇでシュードタイプしたベクターを濃縮でき、ベクタータイターの上昇はＶＳＶ−Ｇで観察されるものに匹敵することがわかる。
【０１３３】
これらの特性は、ニューロン細胞に対する狂犬病Ｇのｉｎｖｉｖｏ特異性と相俟って、狂犬病Ｇを用いたシュードタイピングを、神経系に治療用遺伝子を運搬するレトロウイルスベクターを容易にターゲッティングするための魅力的な計画にしている。
【０１３４】
例６−狂犬病Ｇシュードタイプが培養ヒト標的細胞に形質導入できる能力の選択性。
狂犬病Ｇでシュードタイプしたベクター細胞の特異性を、ニューロンおよび非ニューロン起源のヒト細胞系を使用して決定した。ＶＳＶ−Ｇを用いたシュードタイピングを陽性対照として使用した。３プラスミドトランスフェクションから調製したウイルス上澄を使用して、ＩＭＲ−３２（ヒト神経芽腫細胞系）およびＣＥＭ−Ａ（ヒトＴ細胞系）を感染させた。β−ガラクトシダーゼ陽性コロニーからウイルスタイターを推定する（表７）。
【０１３５】
【表７】
狂犬病ＧおよびＶＳＶ−ＧでシュードタイプしたＭＬＶベクターは、ＩＭＲ−３２細胞を感染させることができた。しかし、狂犬病ＧでシュードタイプしたＭＬＶベクターは、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイプしたもの（４．９×１０3）より１００倍高い（３．１×１０5）タイターを生じた。ＣＥＭ−Ａ細胞では、狂犬病ＧでシュードタイプしたＭＬＶベクターは、１．７×１０1という低いタイターを示した。このように効率が低かったのは、ＭＬＶがこれらの細胞に形質導入できないためではなかった。このことは、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイプした同ベクターでは、比較的高いタイター（７．３×１０2）を示したことによって証明される。
【０１３７】
筆者らの結果から、狂犬病ＧシュードタイプはＶＳＶ−Ｇと違って、ヒト標的細胞に形質導入できる能力に選択性があり、Ｔ−細胞系よりニューロン細胞で、形質導入効率が高いことがわかる。
【０１３８】
例７−ｉｎ ｖｉｔｒｏ（一次培養）およびｉｎ ｖｉｖｏ（ラット／マウスモデル系）で、狂犬病Ｇシュードタイプが脳細胞に形質導入できる能力。
ｉｎ ｖｉｖｏで、狂犬病ウイルスにより、少なくとも２つの異なるレセプターが使用され（Ｈａｎｈａｒｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３ J． Ｖｉｒｏｌ． ６７：５３０−５４２； Ｔｕｆｆｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．， J． Ｖｉｒｏｌ． ７２：１０８５−１０９１）、これらのレセプターの１つがニコチン性アセチルコリンレセプターであることを示唆する証拠がある。マウスモデル系で、ｗｔ狂犬病（ＣＶＳ株）およびこの株の二重突然変異体（アミノ酸３３０および３３３にて変化している）を用いて、感染したニューロン細胞のタイプおよび神経系全体にわたるウイルスの広がりに関する詳細な研究が実施されている（Ｃｏｕｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：３５５０−３５５４； Ｌａｆａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８３；３２０−３３０）。上記研究から、突然変異ウイルスの広がりおよび範囲は、ｗｔに比べて著しく制限されることがわかる。
【０１３９】
狂犬病Ｇタンパク質でシュードタイプされたＥＩＡＶベクターの親和性を決定するために、以下の分析を開始した。成体メスＡＯラットを麻酔し、２×１μｌのウイルスストックを、線条領域または他の脳領域内に定位注入した。注射の後７日または３０日に、ラットを麻酔し、４％パラホルムアルデヒドで心臓内灌流した。脳を摘除し、２４時間固定後、３０％スクロースで飽和し、凍結用低温装置で切断した（５０μｍ）。Ｘ−ｇａｌ溶液で切片を３時間から一晩染色し、スライドガラスに載せ、光学顕微鏡で分析した。ニューロン（ＮｅｕＮほか）、星状細胞（ＧＦＡＰ）または希突起神経膠細胞（ＧａｌＣ）およびβ−ガラクトシダーゼに特異的な抗体と種特異的二次抗体とを組み合わせて使用した免疫蛍光法三重標識によって、形質導入された詳細な細胞タイプの同定を行った。共焦点検鏡法を使用して、形質導入された脳領域の画像を分析した。
【０１４０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入実験用に、一次ニューロンを、ラット胎芽から培養し、完全に分化するまで成長させる。４μｇ／ｍｌのポリブレンを使用して、ウイルスベクターを５時間加える。培地を変え、２日後に、Ｘ−ｇａｌ染色または抗体のいずれかを使用して、発現分析を実施する。
【０１４１】
例８−狂犬病ＧでシュードタイプされたＨＩＶ−１ベクターの濃度、ならびにこのようなベクターを製作するためのＶＳＶ−Ｇ使用と狂犬病エンベロープ使用との間の比較
例５から、狂犬病ＧでシュードタイプしたＥＩＡＶベクターは、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイプされたベクターで報告されていたものと同じ様式で、超遠心分離によって、効率よく濃縮できることがわかる。狂犬病Ｇを使用して、ＨＩＶ−１ベクターをシュードタイプできること、これらの粒子を超遠心分離で効率よく濃縮できること、およびＶＳＶ−Ｇでシュードタイプされたベクターを用いてＤ１７細胞で得られるものと同じタイターを得ることが可能なことを証明するために、これらの観察を拡張した。
【０１４２】
前述の３プラスミドトランスフェクション法（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９５）を使用して、狂犬病ＧまたはＶＳＶ−Ｇのいずれかでシュードタイプした粒子を製作した。この実験で使用したＨＩＶ−１プラスミド、ｐＨ４ＺおよびｐＧＰ−ＲＲＥ３は、Kｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９８ Jｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：８１１−８１６）に記載されている。この実験で使用した成分の比率は、狂犬病Ｇの場合、１：１：１、ｇａｇ１ｐｏｌ：ゲノム：エンベロープであり、ＶＳＶ−Ｇの場合、１：１：０．５、ｇａｇ１ｐｏｌ：ゲノム：エンベロープであって、これは、ＣＯＳ １細胞の場合に使用された比率と異なるが、それは、２９３Ｔ細胞はＣＯＳ細胞よりも狂犬病Ｇタンパク質の発現に抵抗することがわかったためである。トランスフェクションの４８時間後に形質導入粒子を収穫し、超遠心分離で濃縮し、Ｄ１７細胞で滴定した。４８時間後、β−ガラクトシダーゼを求めるために、これらの細胞を染色した。２つのエンベロープのいずれかでシュードタイプしたＨＩＶ−１粒子によって、収穫物のタイターを約１００倍高めることができた（表８）。上記エンベロープのいずれかでシュードタイプしたベクターで得られるタイターは、有意に異ならなかった。以上の結果から、狂犬病Ｇでシュードタイプしたベクターは、超遠心分離で濃縮することができ、ベクタータイターの上昇は、ＶＳＶ−Ｇで確認されたものに匹敵し、且つＤ１７細胞で、２つのエンベロープは同様に有効であった。
【０１４３】
【表８】
考察および要約
前述の通り、レトロウイルスおよびレトロウイルスから誘導されるベクターは、標的細胞に効率よく形質導入するために、特定のエンベロープタンパク質を必要とする。このエンベロープタンパク質は、ウイルスまたはベクターを産生する細胞で発現され、ウイルスまたはベクター粒子に組み込まれる。レトロウイルス粒子は、ウイルスＲＮＡを包むｇａｇ遺伝子から誘導されるタンパク質コアを含む。次いで、このコアは、ウイルスｅｎｖ遺伝子から誘導されるエンベロープタンパク質を含む細胞膜の一部に包まれる。このエンベロープタンパク質は、前駆体として産生され、２つまたは３つの単位に処理される。それらは、エンベロープの完全に外側にある表面タンパク質（ＳＵ）、ＳＵと相互に作用し、且つ膜貫通領域および細胞質尾部を含む貫膜タンパク質（ＴＭ）である（Ｃｏｆｆｉｎ １９９２ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｌｅｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ｅｄ Ｌｅｖｙ）。一部のレトロウイルスでは、小ペプチドがＴＭから除去される。標的細胞表面に結合してウイルスの侵入を仲介できる有効なエンベロープタンパク質の役割を果たすためには、生産的感染を起こさせるために、エンベロープタンパク質は、結果として細胞の正確な区画にゲノムを送達するのに適当な方式でウイルス粒子のインターナリゼーションを招来するような方法で、標的細胞上の適切なレセプターと的確に相互に作用しなければならない。
【０１４５】
１つのウイルス由来のエンベロープを、異なるウイルスのパッケージングに使用する多くの試みがなされ、これがシュードタイピングとして知られている。シュードタイピングの効率は非常に変わりやすく、また、エンベロープの細胞質尾部とウイルス粒子のコアタンパク質との間の相互作用により強く影響されるようである。エンベロープタンパク質が出芽ビリオン内に召集されるプロセスは十分に理解されていなが、ほとんどのＴ細胞タンパク質がレトロウイルス粒子排除されるため、プロセスは選択的であることが判明しており（Ｈｕｎｔｅｒ １９９４ Ｓｅｍｉｎ． Ｖｉｒｏｌ． ５：７１−８３）、エンベロープタンパク質が存在しない条件下で、出芽が起こり得ることが、一部のレトロウイルスで記録されている（Ｅｉｎｆｅｌｄ １９９６ Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１４：１３３−１７６； Kｒｄｕｓｓｌｉｃｈ および Wｅｌｋｅｒ １９９６ Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１４：２５−６３）。エンベロープタンパク質の細胞質メインと、一部のレトロウイルス内のウイルスコアとの間の的確な分子相互作用に関する証拠がある。Jａｎｕｓｚｅｓｋｉ ｅｔ ａｌ（１９９７ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：３６１３−３６１９）は、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）エンベロープタンパク質の細胞質尾部における小さい欠失または置換は、エンベロープタンパク質のウイルス粒子への組み込みを強く阻害することを証明した。ＨＩＶ−１の場合、Ｃｏｓｓｏｎ（１９９６ ＥＭＢＯ Ｊ． １５：５７８３−５７８８）は、ＨＩＶ−１の基質タンパク質とそのエンベロープタンパク質の細胞質ドメインとの間の直接相互作用を証明した。基質とエンベロープタンパク質との間のこの相互作用は、エンベロープタンパク質の出芽ＨＩＶ−１ビリオンへの取りこみにおいて、重要な役割を果たす。このことは、ビスナウイルスｇａｇポリタンパク質の基質ドメインのアミノ末端が等価のＨＩＶ−１基質ドメインで置き換えられた場合に、ビスナウイルスをＨＩＶ−１ｅｎｖで効率よくシュードタイプできるにすぎないことによって証明される（Ｄｏｒｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：１６８９−１６９６）。しかし、モロニーネズミ白血病ウイルスを効率よくシュードタイプするにはＨＩＶ−１ｅｎｖの切頭が必要である（Ｍａｍｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：３３４１−３３４５）が、ヒト泡沫ウイルスエンベロープタンパク質を末端を切断すると、ネズミ白血病ウイルスをシュードタイプすることができる能力が低下する（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４８１５−４８２０）ため、状況は複雑である。レトロウイルスのコアとそのエンベロープタンパク質の細胞質尾部との間の相互作用には、環境成分もある。一部の細胞系においてＥＩＡＶを長期継代すると糖タンパク質の末端が切断されうるため、エンベロープタンパク質のＣ末端ドメインに基づいて、ウイルスに適した宿主細胞因子を選択できることが示唆される（Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， １９９０ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １９９０ ６４：３７７０− ３７７８）。
【０１４６】
以上の研究および多くの他の研究者の研究から、近縁関係にあるレトロウイルスでさえも互いにシュードタイプできる可能性があることをなことがわかる。さらに、所与のエンベロープが特定のウイルスシュードタイプできない場合、シュードタイプできる能力を与えるであろう分子の変化を予測することは不可能である。シュードタイピングは幾らかの成功をおさめたが、ウイルス成分と異種エンベロープタンパク質との間の適合性の必要性によって明らかに制約を受ける。
【０１４７】
細胞タイプの拡大された範囲または変化した範囲への遺伝物質の送達を可能にするために、レトロウイルスベクターを構築する際に、天然のウイルスに対して異なる標的細胞特異性を有するベクターを操作することが望ましい。これを実現する１つの方式は、ウイルスエンベロープタンパク質を操作してその特異性を変えることによる。別のアプローチは、異種エンベロープタンパク質をベクターに導入して、ウイルスの天然のエンベロープタンパク質に補充する、すなわち加えることである。
【０１４８】
ＭＬＶエンベロープタンパク質は、様々な異なるレトロウイルスをシュードタイプすることができる。両種性ウイルス由来のＭＬＶエンベロープタンパク質を使用すると、ヒト細胞を含む広範囲の細胞タイプに形質導入することが可能になる。しかし、多数の細胞タイプを感染させるレトロウイルスベクターを有することが常に望ましいとは限らない。
【０１４９】
水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（ラブドウイルス）のエンベロープ糖タンパク質（Ｇ）は、ある一定のレトロウイルスをシュードタイプできることが証明されている別のエンベロープタンパク質である。レトロウイルスＭＬＶは首尾よくシュードタイプし（Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ １９９３ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：８０３３−７）、結果として、天然型のＭＬＶに比べて変化した宿主範囲範囲を有するベクターを生じた。ＶＳＶ−Ｇシュードタイプされたベクターは、哺乳類細胞のみならず、魚、爬虫類および昆虫由来の細胞系も感染させることが証明されている（Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ １９９３）。その細胞質尾部はレトロウイルスのコアと相互に作用することができるため、ＶＳＶ−Ｇタンパク質を使用して、ある一定のレトロウイルスシュードタイプすることができる。ＶＳＶ−ＧおよびＭＬＶエンベロープタンパク質は、両者ともに短い細胞質尾部（それぞれ、２８〜３１アミノ酸および３２アミノ酸）を有しており、したがって、よく似た長さである。
【０１５０】
非レトロウイルスのシュードタイピングエンベロープ、たとえば、ＶＳＶ−Ｇタンパク質を提供することにより、感染性を失わずに高タイターまで、ベクター粒子を濃縮できるという利点が得られる（Ａｋｋｉｎａ ｅｔ ａｌ １９９６ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０：２５８１−５）。レトロウイルスエンベロープタンパク質は、明らかに、超遠心分離中の剪断力に耐えることができないが、それは、このタンパク質が２つの非共有結合サブユニットからなるためであろう。サブユニット間の相互作用は、遠心分離により破壊される。比較すると、ＶＳＶ糖タンパク質は、ただ１つの単位を含む。
【０１５１】
したがって、ＶＳＶ−Ｇタンパク質シュードタイピングは、潜在的な利点を提供する。しかし、ＶＳＶ−Ｇタンパク質を使用して実現されるもの以外の標的細胞特異性も望ましい可能性がある。タンパク質内に標的部位を操作することにより、ＶＳＶ−Ｇの標的細胞範囲を変えようという試みがなされた。１９９７年の治療用遺伝子送達のためのベクターターゲッティング方法に関する会議（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｏｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＵＳＡ）で報告されたこれらの試み（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）は、成功しなかった。したがって、レトロウイルスベクター標的細胞範囲を変える他の方法が必要である。
【０１５２】
他のラブドウイルスエンベロープでレトロウイルスを効率よくシュードタイプするための試みが幾つかのなされた。１９９７年の治療用遺伝子送達のためのベクターターゲッティング方法に関する会議（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｏｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＵＳＡ）での１つのレポート（Ｒｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．）で、狂犬病ウイルスおよびモコラウイルスの糖タンパク質は、ＨＩＶ−１粒子をシュードタイプすることができたが、「得られたタイターは、ＶＳＶ Ｇタンパク質を用いて得られるものよりはるかに低い」と報告された。
【０１５３】
本発明は、狂犬病タンパク質、特に狂犬病Ｇタンパク質でシュードタイプされたレトロウイルス送達システムを提供することによって、上記の問題を克服しようとするものである。
【０１５４】
上記明細書に記載の全ての出版物を、参照により本明細書に援用する。説明した本発明の方法およびシステムの様々な修飾および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかになるであろう。本発明を具体的な好ましい実施形態と一緒に説明してきたが、請求の範囲に記載されている本発明が、そのような具体的な実施形態に不当に制限されると考えてはならない。それどころか、分子生物学または関連分野における熟練者に明白な、本発明を実施するための、記載された形態の様々な修飾は、特許請求の範囲内と解釈される。
Claims (12)
- ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）から誘導できるレトロウイルス製作システムであって、狂犬病Ｇタンパク質もしくは標的細胞上のレセプター分子に結合し、レトロウイルスをシュードタイプする狂犬病Ｇタンパク質の活性を有するそのフラグメント、または、標的細胞上のレセプター分子に結合し、レトロウイルスをシュードタイプする狂犬病Ｇタンパク質の活性を有する狂犬病Ｇタンパク質の突然変異体もしくは変異型の全長もしくはフラグメントをコードする第１の核酸配列と、ＥＩＡＶベクターゲノムをコードする第２の核酸配列とを含む、システム。
- ゲノムを含む感染性ＥＩＡＶベクター粒子を生成するために要求されるパッケージング成分をコードする、ＥＩＡＶ由来の１以上のさらなる核酸配列を含む、請求項１に記載のシステム。
- 第１のヌクレオチド配列が、狂犬病Ｇタンパク質またはその突然変異体、変異型もしくはフラグメントの全長をコードする請求項１又は２に記載のレトロウイルス製作システム。
- 前記レトロウイルス製作システムが、少なくとも１つの関心のあるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のレトロウイルス製作システム。
- 前記関心のあるヌクレオチド配列が、治療効果を有するか、あるいは治療効果を有するタンパク質をコードする請求項４に記載のレトロウイルス製作システム。
- 請求項１〜５のいずれか１項に記載のレトロウイルス製作システムから得られるＥＩＡＶベクター粒子。
- 請求項６に記載のＥＩＡＶベクター粒子により形質導入された細胞。
- 医療に使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のレトロウイルス製作システム、または請求項６に記載のＥＩＡＶベクター粒子。
- 請求項６に記載のＥＩＡＶベクター粒子と、単離された細胞を接触させることを含む方法。
- 狂犬病Ｇタンパク質を含むエンベロープを有するＥＩＡＶ粒子を製作するための方法であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載のレトロウイルスベクター製作システムを提供するステップと、前記レトロウイルス製作システムをベクター粒子成分の発現及びベクター粒子の製作に適した条件におくステップと、ベクター粒子を上澄から回収するステップとを含む、方法。
- プロデューサー細胞中に、請求項１〜５のいずれか１項に記載のレトロウイルスベクター製作システムを提供するステップと、プロデューサー細胞をベクター粒子成分の発現及びベクター粒子の製作に適した条件下におくステップと、ベクター粒子を上澄から回収するステップとを含む、請求項１０に記載のＥＩＡＶ粒子の製作方法。
- 超遠心分離を使用して上澄を濃縮する請求項１０又は１１に記載の方法。
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