JP2002530115A

JP2002530115A - ベクター

Info

Publication number: JP2002530115A
Application number: JP2000584089A
Authority: JP
Inventors: ミトラファノス，キリヤコス; ユーデン，マーク; ロール，ジョナサン; キングズマン，スーザン・メアリ; キングズマン，アラン・ジョン
Original assignee: オックスフォードバイオメディカ（ユーケイ）リミテッド
Priority date: 1998-11-20
Filing date: 1999-11-19
Publication date: 2002-09-17
Also published as: GB9825524D0; CA2351630A1; WO2000031280A3; GB0108870D0; AU1395400A; WO2000031280A2; US20020034393A1; EP1141342A2; GB2359306A; CN1348497A

Abstract

(57)【要約】ＮＯＩを送達することができ、かつ外因性第２の合成エレメントを含む、レトロウイルスベクター。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、プラス鎖合成エレメント、その使用およびベクターへのその組み
込みに関する。

【０００２】特に、本発明は、関心のあるヌクレオチド配列（以後、「ＮＯＩ（ｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｉｎｔｅｒｅｓｔ）」との略語を使用す
る）を、または複数のＮＯＩをも、１つまたは複数の標的部位に送達することが
できる新規なレトロウイルスベクターに関する。

【０００３】さらに、本発明は、とりわけ、遺伝子療法において有用な新規なレトロウイ
ルスベクターに関する。

【０００４】遺伝子療法は、たとえば、１つまたは複数の標的部位、たとえば標的細胞にお
ける１つまたは複数のヌクレオチド配列の付加、置換、欠失、補足、操作等のい
ずれか１つまたは複数を含んでもよい。標的部位が標的細胞である場合、この細
胞は組織または器官の一部であってもよい。遺伝子療法に関する一般的教示は、
分子生物学（ＥｄＲｏｂｅｒｔＭｅｙｅｒｓ，ＰｕｂＶＣＨ、たとえば、
５５６〜５５８ページ）に記載されている。

【０００５】さらなる例として、遺伝子療法は、以下に挙げる１つまたは複数の手段を提供
することもできる。ヌクレオチド配列、たとえば、遺伝子を使用して、欠陥遺伝
子を置換または補足することができる。病原性のヌクレオチド配列、たとえば遺
伝子、またはその発現産物を除去することができる。たとえば、さらに好適な表
現型を作リ出すために、ヌクレオチド配列、たとえば遺伝子、またはその発現産
物を付加または導入することができる。たとえば、選択の目的で（すなわち非形
質転換細胞より優れた形質転換細胞等々を選択するために）ヌクレオチド配列、
たとえば遺伝子、またはその発現産物付加または導入することができる。癌等の
疾患状態（Ｓｃｈｍｉｄｔ−ＷｏｌｆａｎｄＳｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｌｆ，１
９９４，ＡｎｎａｌｓｏｆＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ６９；２７３−２７９）
あるいは免疫疾患、心血管疾患、神経学的疾患、炎症性疾患または感染症等の他
の疾患状態を、治療、治癒、または予防するために、分子レベルで細胞を操作す
ることができる。遺伝子ワクチン接種等の免疫応答を誘導するために、抗原を操
作および／または導入することができる。

【０００６】近年、遺伝子療法にレトロウイルスを使用することが推奨されている。本質的
に、レトロウイルスは、溶菌ウイルスとは異なるライフサイクルを有するＲＮＡ
ウイルスである。この点に関して、レトロウイルスは、ＤＮＡ中間体を介して複
製する感染性実体（ｅｎｔｉｔｙ）である。レトロウイルスが細胞を感染させる
とき、そのゲノムは、逆転写酵素酵素によりＤＮＡ型に変換される。ＤＮＡコピ
ーは、感染性ウイルス粒子の組み立てに必要な新しいＲＮＡゲノムおよびウイル
スにコードされるタンパク質を産生するための鋳型の役割をする。

【０００７】多くのレトロウイルスがあり、以下に例を挙げる。ネズミ白血病ウイルス（Ｍ
ＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ
）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、フ
ジナミ肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬ
Ｖ）、ＦＢＲネズミ骨肉種ウイルス（ＦＢＲＭＳＶ）、モロニーネズミ肉腫ウ
イルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、エーベルソンネズミ白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、
鳥類骨髄細胞腫ウイルス−２９（ＭＣ２９）、および鳥類赤芽球症ウイルス（Ａ
ＥＶ）。

【０００８】レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ等の（“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕ
ｓｅｓ”１９９７ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＰｒｅｓｓＥｄｓ：ＪＭＣｏｆｆｉｎ，ＳＭＨｕｇｈｅｓ，ＨＥ
Ｖａｒｍｕｓｐｐ７５８−７６３）にある。

【０００９】基本的に、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科は、オンコウイルス、スプマウイルス
およびレンチウイルスの３つの亜科に細分され、全メンバーが、ＤＮＡ中間体を
経て複製する正向（ｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｎｓｅ）ＲＮＡウイルスである。こ
のＲＮＡのＤＮＡへの変換過程は、ウイルスのｐｏｌ遺伝子のタンパク質産物、
すなわち、ＲＮＡ依存性ＤＮＡ−ポリメラーゼ（逆転写酵素）およびＲＮアーゼ
Ｈにより実行される。この過程の効率は、ウイルス内に含まれる配列エレメント
に依存する。古典的に、これは、ＲおよびｔＲＮＡプライマー結合部位（第１鎖
合成に必要）および３′ポリプリントラクト（３′ＰＰＴ）（第２鎖合成に必要
）と呼ばれる２つの直接反復を含む。その後、他の第２鎖合成エレメントが同定
され（今までのところ、レンチウイルスでのみ）、その中には、中央ＰＰＴ（ｃ
−ＰＰＴ）、中央終止配列（ＣＴＳ）およびＵボックスが含まれる（Ｌｌｙｉｎ
ｓｋｉｉａｎｄＤｅｓｒｏｓｉｅｒｓ１９９８）。これらのエレメントの
機能および第２鎖合成に関する最近の概説については、Ｃｏｆｆｉｎ等１９９７
を参照されたい。

【００１０】過去１０年にわたって、３つの亜科全てからのレトロウイルスが、遺伝子発現
ベクター用に修飾されてきた。このような修飾は、通常、必須ウイルス遺伝子／
配列の欠失ならびにそれらの選りすぐりの外来プロモーターおよび／またはｃＤ
ＮＡとの置換を含む。２つの理由から、ｃＤＮＡの付加よりむしろこの置換が不
可欠である。第１に、野生型よりはるかに大きいウイルスゲノムはパッケージさ
れず、第２に、必須遺伝子がなければ、このようなゲノムは複製できない。後者
は、安全性の観点から重要である。従って、このような複製能欠陥ゲノムを含む
レトロウイルスベクターを作るためには、欠失した遺伝子（通常、ｇａｇ、ｐｏ
ｌおよびｅｎｖ）をトランスで補充しなければならない。これは、通常、非ウイ
ルス発現ベクターからこれらの遺伝子を発現するように工作されたプロデューサ
ー細胞を使用して実現される。これらのプロデューサー細胞は、ベクターゲノム
をレトロウイルスの粒子内にパッケージすることができ、結果として得られる粒
子は、レシピエント細胞が、たとえば、ヘルパーウイルスからのｇａｇ−ｐｏｌ
およびｅｎｖのソースを含んでいなければ、１巡しか感染できない。レトロウイ
ルス発現ベクターの構築に関する最近の概説については、Ｃｏｆｆｉｎ等１９９
７を参照されたい。

【００１１】理解しやすくするために、レトロウイルスゲノムのＲＮＡ型およびＤＮＡ型の
、簡単な一般的構造（定率での拡大ではない）を以下に示すと同時に、ＬＴＲの
基本的な特徴およびｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの相対的な位置を表す。

【００１２】

【化１】

【００１３】上の線図に示す通り、感染性レトロウイルスＲＮＡゲノムの基本的な分子編成
は、（５′）Ｒ−Ｕ５−ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ−Ｕ３−Ｒ（３′）である。欠
陥レトロウイルスベクターゲノムでは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖが存在しな
くてもよく、あるいは機能しなくてもよい。ＲＮＡの両端におけるＲ領域は、反
復配列である。Ｕ５およびＵ３は、それぞれ、ＲＮＡゲノムの５′末端および３
′末端における固有の配列を表す。

【００１４】ビリオンＲＮＡから二本鎖ＤＮＡへの逆転写は、細胞質で起こり、鋳型分子の
５′末端から３′末端への、逆転写酵素の２つのジャンプを含む。これらのジャ
ンプの結果、ビリオンＲＮＡの５′末端および３′末端に位置する配列が二重に
なる。ついで、これらの配列はウイルスＤＮＡの両端で縦一列に融合し、Ｒ、Ｕ
５およびＵ３領域を含む長い末端反復（ＬＴＲ）を形成する。逆転写が完了する
とすぐに、ウイルスＤＮＡは核に転位し、そこでは、ビリオンインテグラーゼの
助けをかりて、線状コピーが、前組み込み複合体（ＰＩＣ）と呼ばれるレトロウ
イルスゲノムの染色体ＤＮＡにランダムに挿入され、安定なプロウイルスが形成
される。宿主細胞ゲノムへの組み込みが可能な部位の数は非常に多くかつ広く分
布している。

【００１５】プロウイルスの転写の調節は、主としてウイルスＬＴＲの非コード配列に帰す
る。転写開始部位は、左側ＬＴＲのＵ３とＲとの間の境界であり（上に示す通り
）、ｐｏｌｙ（Ａ）付加（終結）部位は、右側ＬＴＲ（上に示す通り）のＲとＵ
５との間の境界である。Ｕ３は、細胞性の、また場合によってはウイルスの、転
写活性化因子タンパク質に応答するプロモーター配列および多数のエンハンサ配
列を含む、プロウイルスの転写調節エレメントの大部分を含む。一部のレトロウ
イルスは、遺伝子発現の制御に関与するタンパク質をコードする以下の遺伝子、
たとえば、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｔａｘおよびｒｅｘのいずれか１つまたは複数を有
する。

【００１６】プロウイルスのＤＮＡの転写により、全長がウイルスＲＮＡゲノムサイズのＲ
ＮＡ分子およびＲＮＡプロセッシングにより生成するゲノム未満のサイズのＲＮ
Ａ分子が再現される。一般に、全てのＲＮＡ産物は、ウイルスタンパク質産生用
の鋳型の役割をする。ＲＮＡ産物の発現は、ＲＮＡ転写物スプライシングと翻訳
中のリボソームのフレームシフトとの組み合せによって実現する。

【００１７】ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて、複合レトロウイルスは、アクセサリー
タンパク質すなわち補助タンパク質をコードする「アクセサリー」遺伝子を含む
。アクセサリータンパク質すなわち補助タンパク質は、通常の複製可能遺伝子ま
たは構造遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖによりコードされるタンパク質に
加えて、アクセサリー遺伝子によりコードされるタンパク質と定義される。これ
らのアクセサリータンパク質は、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｔａｘおよびｒｅｘによりコ
ードされるもののような遺伝子発現の制御に関与するものと異なる。アクセサリ
ー遺伝子の例は、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕおよびｎｅｆの１つまたは複
数を含む。これらのアクセサリー遺伝子は、たとえば、ＨＩＶで見つけることが
できる（たとえば、“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”Ｅｄ．Ｃｏｆｆｉｎｅｔ
ａｌＰｕｂ．ＣＳＨＬ１９９７の８０２ページおよび８０３ページ参照）。非
必須アクセサリータンパク質は、特殊化した細胞型で機能することができ、細胞
性タンパク質により提供される機能を少なくとも部分的に２倍にするのに役立つ
機能を提供する。一般に、このアクセサリー遺伝子はｐｏｌとｅｎｖとの間、Ｌ
ＴＲのＵ３領域を含むｅｎｖからすぐ下流、またはｅｎｖと相互に重複する部分
に位置する。

【００１８】このようなアクセサリー遺伝子、さらにはプラス鎖合成エレメントに隣接する
（含んでもよい）領域も欠如していることは、第２世代ベクターには普通である
。

【００１９】複合レトロウイルスはウイルス性にコードされる転写活性化因子ならびに細胞
性転写因子を使用する進化した調節機構を有する。こうしたトランス作用性ウイ
ルスタンパク質は、ＬＴＲに指令されるＲＮＡ転写の活性化因子の役割を果たす
。レンチウイルスの転写のトランス活性化因子は、ウイルスのｔａｔ遺伝子によ
りコードされる。ｔａｔは、安定なステムループ（ＴＡＲと呼ばれるＲＮＡ二次
構造で、その１つの機能は、ｔａｔを明らかに最適に配置して、転写をトランス
活性化することである）に結合する。

【００２０】既述の通り、レトロウイルスは、とりわけ、ＮＯＩ、または複数のＮＯＩを、
関心のある１つまたは複数の部位に転移させるための送達システムとして推奨さ
れている（ほかには、送達媒体または送達ベクターと表現される）。転移は、ｉ
ｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏ、ｉｎｖｉｖｏ、またはそれらの組み合せで
起こりうる。この様式で使用されるとき、レトロウイルスは、一般に、レトロウ
イルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクターと呼ばれる。レトロウイル
スベクターはさらに、受容体の使用、逆転写およびＲＮＡパッケージングを含む
レトロウイルスライフサイクルの様々な態様を研究するためにも使用されている
（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２ＣｕｒｒＴｏｐＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕ
ｎｏｌ１５８：１−２４による概説）。

【００２１】遺伝子療法向けの典型的な組換えレトロウイルスベクターの場合、ｇａｇ、ｐ
ｏｌおよびｅｎｖタンパク質コード領域の１つまたは複数の少なくとも一部をウ
イルスから除去することが可能である。これにより、レトロウイルスベクターは
複製能が欠陥となる。ウイルスのゲノムを宿主ゲノムに組み込むことができるが
、修飾されたウイルスゲノムは構造タンパク質が欠如しているため、それ自身増
殖できないウイルスを作るために、除去された部分をさらにＮＯＩと置換するこ
とが可能である。宿主ゲノムに組み込まれたとき、ＮＯＩが発現され、その結果
として、たとえば、治療作用および／または診断作用が生じる。従って、ＮＯＩ
を関心のある部位に転移させることは、一般に、ＮＯＩを組換えウイルスベクタ
ーに組み込むステップと、この修飾されたウイルスベクターをビリオンコート内
にパッケージングするステップと、標的細胞または標的細胞集団等の関心のある
部位の形質導入を可能にするステップとによって実現される。

【００２２】パッケージングまたはヘルパー細胞系と組換えベクターとの組み合せを使用し
て、たとえば、関心のある部位を形質導入するために、多量のレトロウイルスベ
クターを増殖させて単離することが可能である（たとえば、適当な力価のレトロ
ウイルスベクターを調製するため）。

【００２３】場合によっては、増殖および単離には、レトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌおよ
びｅｎｖ遺伝子を単離し、それらを宿主細胞に別々に導入して、「パッケージン
グ細胞系」を作ることが必要なこともある。このパッケージング細胞系は、レト
ロウイルスＤＮＡのパッケージングに必要なタンパク質を産生するが、ｐｓｉ領
域が欠如しているため、包膜をもたらすことはできない。しかし、ＮＯＩおよび
ｐｓｉ領域を担持する組換えベクターがパッケージング細胞系に導入されると、
ヘルパータンパク質がｐｓｉ陽性組換えベクターをパッケージして、組換えウイ
ルスストックを産生することができる。これを使用して細胞を形質導入し、ＮＯ
Ｉを細胞のゲノムに導入することができる。ウイルスタンパク質の産生に必要な
遺伝子が全て欠如しているゲノムを有する組換えウイルスは、一度形質導入でき
るだけで、増殖することはできない。これらの、標的細胞の形質導入を一巡だけ
できるウイルスベクターは、複製能欠陥ベクターとして知られる。従って、潜在
的に危険なレトロウイルスが発生することなく、宿主／標的細胞ゲノムにＮＯＩ
が導入される。「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」（１９９７ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓＥｄｓ：ＪＭＣ
ｏｆｆｉｎ，ＳＭＨｕｇｈｅｓ，ＨＥＶａｒｍｕｓｐｐ４４９）に、利
用できるパッケージング系の一覧表が掲載されている。

【００２４】レトロウイルスのパッケージング細胞系のデザインは、とりわけ、初期のデザ
インで頻繁に直面するヘルパーウイルスの自然産生の問題に取り組むところまで
進化した。組換えは、一般に、相同により助長されるため、ベクターのゲノムと
ヘルパーのゲノムとの間の相同を減少もしくは排除することにより、ヘルパーウ
イルス産生の問題が減少する。その後、パッケージング細胞系に独立してトラン
スフェクトされ、その結果、野生型ウイルスの産生に３つの組換え事象を必要と
する別々の発現プラスミド上にｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖウイルスコード領域
を担持するパッケージング細胞が開発された。これによって、複製有能ウイルス
が産生する可能性が減少した。この方法は、３プラスミドトランスフェクション
法と呼ばれることもある（Ｓｏｎｅｏｋａｅｔａｌ１９９５Ｎｕｃｌ．
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３：６２８−６３３）。

【００２５】ベクターを開発するとき、一過性トランスフェクションを使用して、ベクター
産生を測定することもできる。この点に関して、一過性トランスフェクションは
、安定なベクター産生細胞系を作り出すのに要する長い期間を必要とせず、また
、ベクターまたはレトロウイルスのパッケージング成分が細胞に有毒な場合に使
用される。レトロウイルスベクターの作製に一般に使用される成分としては、Ｇ
ａｇ／Ｐｏｌタンパク質をコードするプラスミド、Ｅｎｖタンパク質をコードす
るプラスミドおよびＮＯＩを含むプラスミドが挙げられる。ベクター産生は、こ
れらの成分の１つまたは複数を、その他の必要な成分を含む細胞に一時的にトラ
ンスフェクトすること含む。ベクターが有毒な遺伝子、または宿主細胞の複製を
妨害する遺伝子、たとえば、細胞周期のインヒビターまたはアポトーシスを誘導
する遺伝子をコードする場合、安定なベクター産生細胞系を作製することは困難
であろうが、細胞が死ぬ前に、一過性トランスフェクションを使用してベクター
を産生することができる。また、一過性感染を使用して、安定なベクター産生細
胞系から得られるレベルに匹敵するベクター力価レベルをもたらす細胞系が開発
されている（Ｐｅａｒｅｔａｌ１９９３，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄ
Ｓｃｉ９０：８３９２−８３９６）。

【００２６】取り組みの１つは、遺伝子送達用の高力価ベクターを作り出すことである。遺
伝子送達用の高力価ベクターを開発するための代替法は、（ｉ）アデノウイルス
、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルス等
の欠陥ウイルスベクター、および（ｉｉ）修飾されたレトロウイルスベクターの
デザインを含む。

【００２７】我々は、ベクター機能を改良することができ、特に高力価ベクターを提供でき
ることを発見した。

【００２８】本発明の第１の態様によれば、フランキングポリプリントラクト（Ｆ−ＰＰＴ
）配列またはその誘導体、変異体または相同体が提供される。

【００２９】我々は、この領域を同定し、これが優れたベクター機能に有用な可能性がある
ことを確認した。

【００３０】本発明によるＦ−ＰＰＴ配列の例としては、配列番号１〜７などがある。

【００３１】本発明の第２の態様によれば、レトロウイルスベクターまたはレトロウイルス
ベクター粒子の形質導入力を変化させるために、レトロウイルスプラス鎖合成エ
レメントを使用することができる。

【００３２】この力は、形質導入効率を高めることを含んでもよい。

【００３３】本発明で使用するためのプラス鎖合成エレメントの例としては、３′ＰＰＴ、
ｃ−ＰＰＴ、ＣＴＳ、Ｕボックス、Ｆ−ＰＰＴおよびそれらの誘導体、変異体お
よび相同体を含むＰＰＴが挙げられる。

【００３４】本発明の第３の態様によれば、レトロウイルスベクターの力価を高めるために
、レトロウイルスプラス鎖合成エレメントを使用することができる。

【００３５】本発明の第４の態様によれば、プラス鎖合成エレメントを含む点が特徴である
１つまたは複数のアクセサリー遺伝子が存在しないレトロウイルスベクターが提
供される。

【００３６】ベクターは、ベクター粒子がレトロウイルスから誘導されることを意味する「
レトロウイルス系」であることが好ましい。ベクター粒子のゲノムは、レンチウ
イルスからの成分をバックボーンとして含む。概して、ベクター粒子は、逆転写
システムおよび組み込みシステムを含む、ＲＮＡゲノムと適合する必須ベクター
成分を含む。通常、これらは、レトロウイルス由来のｇａｇタンパク質およびｐ
ｏｌタンパク質を含む。ベクターは、標的細胞を形質導入できることが好ましい
。通常は、ベクターはレトロウイルス由来のｅｎｖタンパク質を含む。特に好ま
しい実施形態では、ベクターは「レンチウイルス系」である。

【００３７】ＨＩＶ−Ｉ補助遺伝子または他のレトロウイルスの類似した補助遺伝子からの
遺伝子ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｎｅｆの少なくとも１つが除去されて
いるか破壊されいるという意味で、ベクターは、「最小限」であることが好まし
い。全部存在しないことが好ましい。ｒｅｖまたは類似した遺伝子または機能的
に類似したそのシステムが存在することが好ましい。このようなシステムに関す
るこれ以上の詳細は、筆者らのＷ０９８／１７８１５で確認できる。

【００３８】本発明の第５の態様によれば、ＮＯＩを送達でき、かつ外因性プラス鎖合成エ
レメントを含むレトロウイルスベクターが提供される。

【００３９】このように、我々は、プラス鎖合成エレメントを使用して、野生型プラス鎖合
成エレメントを欠くベクターまたは有するベクターより優れたベクター機能を改
良できることを発見した。

【００４０】ベクター機能が幾つかの方法で修飾されることは、本発明に従って使用される
プラス鎖合成エレメントを含む機能と、次いで同エレメントを含まない機能と、
比較することによって判定できる。このような判定を以下の実施例で説明する。

【００４１】我々は、ベクター産生を、たとえば、少なくとも１００倍増強できることを発
見した。現在のベクターでは、本発明の好ましいプラス鎖合成エレメントの少な
くとも１つが、いわゆるアクセサリー遺伝子と一緒に、定型的に除去されており
、このような最小限のベクターは、アクセサリーの特徴を定型的に含む第１世代
ベクターより優れた長所を提供すると考えられていたため、これは意外である。
本発明で使用することが可能なプラス鎖合成エレメントの一部について先に説明
したが、以前に、そのエレメントを、改良されたベクターの開発に使用できるこ
とを実現した者はいない。

【００４２】逆転写は、ウイルス粒子が標的細胞の細胞質に入ったときに開始する。ウイル
スＲＮＡゲノムは、十分に特性決定されていない核タンパク質複合体の一部とし
て細胞質に入る。逆転写の過程で、複雑な一連のステップにより、細胞質内でに
線状ＤＮＡ二重鎖が生成する。このＤＮＡは、そのＲＮＡ鋳型と同一線形順序に
並んでいるが、長末端反復（ＬＴＲ）として知られる、ウイルスＲＮＡには存在
しない末端重複を含む。現存する逆転写モデルから、ＬＴＲの生成には、鎖転移
反応または「ジャンプ」として知られる２つの特殊化した鋳型スイッチが必要な
ことがわかる。

【００４３】レトロウイルスＤＮＡ合成は、ＲＴの２つの異なる酵素活性、すなわち、ＲＮ
ＡまたはＤＮＡのいずれかを鋳型として使用することができるＤＮＡポリメラー
ゼと、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）と呼ばれる、ＲＮＡとＤＮＡとの二
重鎖のＲＮＡ鎖に特異的なヌクレアーゼとに完全に依存している。他のタンパク
質に対する役割を除外することはできず、また、ある一定のウイルスタンパク質
（たとえば、ヌクレオカプシド、ＮＣ）は逆転写の効率を高める可能性があるが
、レトロウイルスＤＮＡの産生に関与する一連のステップを完了するのに必要な
酵素機能全てが、ＲＴのＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮアーゼＨに起因すると考
えられる。レトロウイルスＤＮＡ合成の過程は、以下に略述する概要に従うと考
えられる。

【００４４】１．ゲノムＲＮＡ内のプライマー結合部位（ＰＢＳ）にアニーリングされる、
部分的に巻き戻したｔＲＮＡの３′末端をプライマーとして使用して、マイナス
鎖ＤＮＡ合成を開始する。マイナス鎖ＤＮＡ合成は、ゲノムＲＮＡの５′末端に
到達し、マイナス鎖強力終結ＤＮＡ（−ｓｓｓＤＮＡ）と呼ばれる不連続な長さ
のＤＮＡ中間体が生成するまで続行する。ｔＲＮＡプライマーの結合部位はウイ
ルスＲＮＡの５′末端に近いため、−ｓｓｓＤＮＡは比較的短く、１００〜１５
０塩基程度である。

【００４５】２．ＲＮＡ：−ｓｓｓＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖のＲＮアーゼ−Ｈ仲介分解後、
第１鎖転移により、−ｓｓｓＤＮＡをウイルスゲノムＲＮＡの３′末端にアニー
リングさせる。この転移は、反復（Ｒ）配列（ＲＮＡゲノムの５′末端および３
′末端に存在する）として知られる同じ配列により仲介される。−ｓｓｓＤＮＡ
の３′末端は、ウイルスゲノムの５′末端におけるＲ配列からコピーしたため、
Ｒに相補的な配列を含む。ＲＮＡ鋳型を除去した後、−ｓｓｓＤＮＡを、ＲＮＡ
ゲノムの３′末端におけるＲ配列にアニーリングすることができる。アニーリン
グ反応は、ＮＣにより促進されると考えられる。

【００４６】３．いったん−ｓｓｓＤＮＡがウイルスＲＮＡ上の３′Ｒ断片に転移されたら
、マイナス鎖ＤＮＡ合成が再び始まり、鋳型鎖のＲＮアーゼＨ消化を伴う。しか
し、この分解は完全ではない。

【００４７】４．ＲＮＡゲノムは、ＲＮアーゼＨ分解に対して比較的抵抗力のある短いポリ
プリントラクト（ＰＰＴ：ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅｔｒａｃｔ）を含む。ＰＰＴ
由来の明確に定められたＲＮＡ断片は、プラス鎖ＤＮＡ合成を刺激する。プライ
マーｔＲＮＡの一部を逆転写した後、プラス鎖合成を停止して、プラス鎖強力終
結ＤＮＡ（＋ｓｓｓＤＮＡ）と呼ばれるＤＮＡを生成する。レトロウイルスの全
ての種が明確に定められたプラス鎖プライマーをＰＰＴから生成するが、一部の
ウイルスはさらなるプラス鎖プライマーをＲＮＡゲノムから生成する。

【００４８】５．ＲＮアーゼＨはプライマーｔＲＮＡを除去し、プラス鎖ＤＮＡの３′末端
における配列またはその付近の配列に相補的な、＋ｓｓｓＤＮＡ中の配列をあら
わにする。

【００４９】６．第２鎖転移は、＋ｓｓｓＤＮＡにおける相補的ＰＢＳセグメントおよびマ
イナス鎖ＤＮＡのアニーリングからなる。

【００５０】７．ついで、プラス鎖合成およびマイナス鎖合成が完了し、ＤＮＡのプラス鎖
およびマイナス鎖は、それぞれ他の鎖の鋳型の役割を果たす。プラス鎖合成エレ
メントは、プラス鎖ＤＮＡ合成に貢献するウイルスＲＮＡを意味する。

【００５１】プラス鎖は、第２鎖と呼ばれることもあり、プラス鎖ＤＮＡは＋ｓｓｓＤＮＡ
と表記される。本発明は、シス作用性エレメントとしても知られるエレメントを
含むことが理解されるであろう。

【００５２】プラス鎖合成に貢献するＲＮＡは、プラス鎖ＤＮＡ合成用のプライマーの本源
であるＲＮＡであってもよく、またはこのようなＲＮＡと関連していてもよい。
ＲＮＡは、ＲＮアーゼ分解に抵抗力のあることが好ましい。あるいは、プラス鎖
合成エレメントは、シス作動性ターミネーター配列、すなわち効果的なプラス鎖
合成に関与する配列であってもよい。

【００５３】ＲＮＡは、第２鎖ＤＮＡ合成用プライマーの本源であるＲＮＡであることが好
ましい。この点に関して、１つの実施形態では、ＲＮＡはポリプリントラクト（
ＰＰＴ）ととして知られる領域であり、その名称はその塩基組成を表す。塩基組
成は保存されるものの、ＰＰＴ配列はウイルス毎に異なり、これは全て本発明に
含まれる。

【００５４】一部のレトロウイルス（特にＢＩＶおよびＡＬＶ）は、さらに、ウイルスＲＮ
Ａ由来の内部プラス鎖プライマーも使用する。このような内部プライマーの本源
であってもよいＲＮＡも本発明の範囲内である。

【００５５】このような内部プライマーの例としては、中央ＰＰＴ（ｃ−ＰＰＴ）、中央終
止配列（ＣＴＳ）およびＵボックスが挙げられる。

【００５６】本発明のベクターは、１つより多くの外因性プラス鎖合成エレメントを含んで
もよいことが理解されるであろう。この場合、合成エレメントは同じであっても
よく、異なってもよい。

【００５７】外因性は、修飾されたプラス鎖合成エレメントまたは付加されたプラス鎖合成
エレメントを有するレトロウイルスを含むものとする。野生型プラス鎖合成エレ
メントの置換も含むものとする。プラス鎖合成エレメントは、ベクターの基礎で
あるプロウイルスから誘導されてもよく、他のレトロウイルスから誘導されても
よく、ウイルスの連続継代進化またはランダム突然変異誘発試験により選択され
る人工的デザインのものであってもよい。従って、本発明は、このようなエレメ
ントの誘導体も含む。本発明は、このようなエレメントの変異体および相同体も
含む。

【００５８】本発明のヌクレオチド配列に関して、用語「変異体」、「相同体」または「誘
導体」は、配列からの、または配列への、１つの（またはそれより多い）核酸の
置き換え（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、変更、修飾、置換（ｒｅｐｌａｃｅｍ
ｅｎｔ）、欠失または付加を含み、結果として得られるヌクレオチド配列はプラ
ス鎖合成配列の活性を有する、好ましくは、配列番号１〜１８に示す配列の１つ
と少なくとも同じ活性を有する。

【００５９】配列相同性に関し、本明細書の配列リストに示す配列に、好ましくは少なくと
も７５％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９
０％、相同である。さらに好ましくは、少なくとも９５％、さらに好ましくは少
なくとも９８％、相同である。上述の通り、ヌクレオチド相同比較を実施するこ
とが可能である。好ましい配列比較プログラムは、上述のＧＣＧＷｉｓｃｏｎ
ｓｉｎＢｅｓｔｆｉｔプログラムである。デフォルト得点マトリックスは、そ
れぞれ同じヌクレオチドの場合１０の得点、それぞれ不適当な組み合せの場合、
−９の得点を有する。各ヌクレオチドの、デフォルト時間隙発生ペナルティは−
５０であり、デフォルト時間隙伸長ペナルティは−３である。

【００６０】本発明は、本明細書に記載の配列、またはその変異体、フラグメントまたは誘
導体、あるいは上述のいずれかの補体にハイブリダイズ（交雑）できるヌクレオ
チド配列も含む。

【００６１】本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」は、「核酸の鎖が、塩基
対形成により相補鎖と接合する過程」ならびにポリメラーゼ連鎖反応技術で実施
されるような増幅過程を含むものとする。

【００６２】本明細書に示すヌクレオチド配列、またはそれらの補体にハイブリダイズする
ことができる本発明のポリヌクレオチドは、一般に、本明細書に示す対応するヌ
クレオチド配列に、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％
、さらに好ましくは少なくとも９５％または９８％相同性を有する。

【００６３】ハイブリダイゼーション条件は、ＢｅｒｇｅｒａｎｄＫｉｍｍｅｌ（１９
８７，ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ１５２，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏＣＡ）に教示されている、
核酸結合性複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、以下に説明する明確に定められ
た「ストリンジェンシー（緊縮調節）」を与える。

【００６４】最大のストリンジェンシーは、一般に、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５
℃低い）で現れ、Ｔｍより約５℃〜約１０℃低温で高いストリンジェンシー、Ｔ
ｍより約１０℃〜約２０℃低温で中程度のストリンジェンシー、Ｔｍより約２０
℃〜約２５℃低温で低いストリンジェンシーが現れる。当業者により理解される
通り、最大のストリンジェンシーハイブリダイゼーションを使用して、同じポリ
ヌクレオチド配列を同定または検出することができ、中間（または低）ストリン
ジェンシーハイブリダイゼーションを使用して、類似したまたは関連したポリヌ
クレオチド配列を同定または検出することができる。

【００６５】好ましい態様において、本発明は、厳重な条件（たとえば６５℃および０．１
×ＳＳＣ｛ｌ×ＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウ
ムｐＨ７．０）で、本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるヌクレ
オチド配列をカバーする。

【００６６】本発明の配列に１００％の相同性はないが、本発明の範囲内に入るポリヌクレ
オチドを、多数の方法で取得することができる。たとえばＤＮＡライブラリーを
精査することによって、本明細書に記載の配列の他の変異体を取得することがで
きる。さらに、他のウイルスの相同体、特に、たとえばラット、マウス、ウシお
よび霊長類で見つけられる相同体を取得することができ、このような相同体およ
びそのフラグメントは、一般に、本明細書の配列リストに示す配列に選択的にハ
イブリダイズできる。このような配列は、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤ
ＮＡライブラリーを精査すること、つまり、配列番号１〜１８の全部または一部
を含むプローブを用いて、中程度から高いストリンジェンシーの条件で、このよ
うなライブラリーを精査することによって、取得することができる。本発明のヌ
クレオチド配列の種相同体および対立遺伝子変異体を取得するために、同様の条
件が適用される。

【００６７】本発明の配列内に保存されたアミノ酸配列をコードする変異体内および相同体
内の配列を標的とするようにデザインされたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを
使用して、変異体および菌株／種相同体を取得することもできる。たとえば、幾
つかの変異体／相同体からのアミノ酸配列を一列に並べることによって、保存さ
れた配列を予測することができる。当技術分野で周知のコンピューターソフトウ
エアを使用して、配列の整列を実施することができる。たとえば、ＧＣＧＷｉ
ｓｃｏｎｓｉｎＰｉｌｅＵｐプログラムが広く使用されている。

【００６８】縮重ＰＣＲに使用されるプライマーは、１つまたは複数の縮重位置を含み、既
知の配列に対して単一配列プライマーを含む配列をクローニングするのに使用さ
れるものより低いストリンジェンシー条件にて使用される。

【００６９】あるいは、特性決定された配列、たとえば、配列番号１〜１８の、位置指定突
然変異誘発によって、このようなポリヌクレオチドを取得することができる。

【００７０】本発明のポリヌクレオチドを使用して、プライマー、たとえばＰＣＲプライマ
ー、代替の増幅反応用のプライマー、たとえば、放射性標識または非放射性標識
を使用した従来の方法によるプローブ標識で標識したプローブを作製することが
できる。

【００７１】本発明に従って、組換えで、合成的で、または当業者が利用できる方法で、核
酸配列およびプローブを作製することができる。標準技術で、核酸配列およびプ
ローブをクローニングすることも可能である。

【００７２】一般に、プライマーは、一度にヌクレオチド１個ずつ、所望の核酸配列を段階
的に製造することを含む合成によって作製される。自動化した技術を使用して、
これを遂行するための技法は、当技術分野で容易に入手できる。

【００７３】一般に、より長いポリヌクレオチドは、たとえばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反
応：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）クローニング技術
を使用した組換え方法を使用して作製される。

【００７４】このような誘導体または合成エレメントもやはりプラス鎖合成エレメントであ
るということは、たとえば実施例１の方法に従って試験することが可能である。

【００７５】１つの実施形態において、合成エレメントは、プラス鎖プライマーの本源であ
るＲＮＡに隣接する領域である。本発明は、入手できるようになる第２鎖配列も
含む。

【００７６】特に好ましいプラス鎖合成エレメントの１例は、３′ＰＰＴに隣接するレトロ
ウイルス発現ベクターの機能領域である。我々は、このような領域をフランキン
グＰＰＴ（Ｆ−ＰＰＴ）と名づけた。このような領域は、以前には、レトロウイ
ルス発現における機能領域として認められていなかった。

【００７７】このようなＦ−ＰＰＴの例を、図２および配列番号１〜７に示す。

【００７８】プラス鎖合成は最適ベクター機能に重要であるという我々の発明に基づいた理
論に縛られたくないが、このような合成は、第２鎖合成に必要なシス作用性エレ
メントのいずれかと相互に作用するトランス作用性タンパク質の修飾によって増
進させることも可能である。

【００７９】従って、本発明の第６の態様によれば、外因性トランス作用性エレメントを含
むレトロウイルスベクターパッケージング細胞または細胞系、またはレトロウイ
ルスベクター発現プラスミドまたはカセットが提供される。

【００８０】このエレメントはｐｏｌであることが好ましい。

【００８１】また、外因性は、修飾されたまたは付加されたトランス作用性エレメントを含
むものとする。野生型トランス作用性エレメントの置換も含むものとする。トラ
ンス作用性エレメントは、ベクターの基礎であるプロウイルスから誘導されても
よく、他のレトロウイルスから誘導されてもよく、ウイルスの連続継代進化また
はランダム突然変異誘発試験により選択される人工的デザインのものであっても
よい。従って、本発明は、このようなエレメントの誘導体も含む。このようなエ
レメントの誘導体は、たとえば、突然変異誘発によって得ることができる。

【００８２】本発明のベクターは、一般に、独立した複製ができない点で欠陥である。従っ
て、いったん、第１のウイルスベクター成分が第１の標的細胞を形質導入すると
、第１のウイルスベクターは複製によってさらなる標的細胞に広がることはでき
ない。また、第２のウイルスベクター成分がＮＯＩのためのベクターの役割を果
たすとき、いったん、第２のウイルスベクター成分が二次標的細胞を形質導入す
ると、第２のウイルスベクターは複製によってさらなる標的細胞に広がることは
できない。複製能欠陥レトロウイルスベクターを実現する方法は、当技術分野で
周知である。たとえば、この場合、第２のウイルスベクター成分のＬＴＲ間の相
同を減少させることも、複製ができる独立した感染性ウイルスを産生する遺伝子
組換えの確率を低下させる効果がある。

【００８３】１つの好ましい態様では、本発明のレトロウイルスベクターを偽型別した。こ
の点に関して、偽型別は、１つまたは複数の利点を与えることができる。たとえ
ば、レンチウイルスベクターを用いると、ＨＩＶ系ベクターのｅｎｖ遺伝子産物
は、これらのベクターが、ＣＤ４と呼ばれるタンパク質を発現する細胞のみを感
染させるように制限するようになる。しかし、これらのベクターのｅｎｖ遺伝子
が他のＲＮＡウイルスからのｅｎｖ配列と置き換えられている場合、ベクターは
、より広い感染スペクトルを示す可能性がある（ＶｅｒｍａａｎｄＳｏｍｉ
ａ１９９７Ｎａｔｕｒｅ３８９：２３９−２４２）。例として、研究者は
ＶＳＶからの糖タンパク質を用いてＨＩＶ系ベクターを偽型別した（Ｖｅｒｍａ
ａｎｄＳｏｍｉａ１９９７同書）。あるいは、その特異性に影響を及ぼ
す（たとえば、変化させる）ために、ｅｎｖを修飾することができる。

【００８４】もう１つの代替法で、Ｅｎｖタンパク質は修飾されたＥｎｖタンパク質、たと
えば、突然変異体または工作されたＥｎｖタンパク質であってもよい。ターゲッ
ティング力を導入するため、または毒性を減少させるため、あるいは別の目的の
ために、修飾または選択を行うことが可能である。

【００８５】適当なＮＯＩコード配列としては、サイトカイン類、ケモカイン類、ホルモン
類、諸抗体、工作された免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、
酵素、免疫共刺激分子、免疫調節性分子、アンチセンスＲＮＡ、標的タンパク質
のトランスドミナント陰性突然変異体、毒素、条件付毒素（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
ａｌｔｏｘｉｎ）、抗原、腫瘍サプレッサータンパク質および成長因子、膜タ
ンパク質、血管作用性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質および
リボザイム、およびそれらの誘導体（たとえば、関連のレポーター群を含む）を
コードする配列等の、治療用および／または診断用のものが挙げられるが、その
限りではない。このようなコード配列が含まれるとき、一般に、適当なプロモー
ターに作動可能に連結されていてもよく、そのプロモーターはリボザイムの発現
を推進するプロモーターであってもよく、あるいは異なるプロモーターであって
もよい。

【００８６】ＮＯＩコード配列は、融合タンパク質をコードしてもよく、コード配列の断片
をコードしてもよい。癌を治療するために、本発明のレトロウイルスベクターを
使用して、プロドラッグ活性化酵素等のＮＯＩを、腫瘍部位に送達することが可
能である。いずれの場合にも、適当なプロドラッグを適切なプロドラッグ活性化
酵素と組み合せて、個体（たとえば、患者）の治療に使用する。適切なプロドラ
ッグをベクターと共に投与する。プロドラッグの例を以下に挙げる。リン酸エト
ポシド（アルカリホスファターゼと一緒に使用される、Ｓｅｎｔｅｒ等１９
８８ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ８５：４８４２−４８４６）、
５−フルオロシトシン（シトシンデアミナーゼトと一緒に使用される、Ｍｕｌｌ
ｅｎ等１９９４ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５４：１５０３−１５０６）、ド
キソルビシン−Ｎ−ｐ−ヒドロキシフェノキシアセトアミド（ペニシリン−Ｖ−
アミダーゼと一緒に使用される、Ｋｅｒｒ等１９９０ＣａｎｃｅｒＩｍ
ｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ３１：２０２−２０６）、パラ−Ｎ−ビス
（２−クロロエチル）アミノベンゾイルグルタメート（カルボキシペプチダーゼ
Ｇ２と一緒に使用される）；セファロスポリンナイトロジェンマスタードカルバ
メート（β−ラクタマーゼと一緒に使用される）、ＳＲ４２３３（Ｐ４５０Ｒ
ｅｄｕｃａｓｅと一緒に使用される）、ガンシクロビル（ＨＳＶチミジンキナー
ゼと一緒に使用される、Ｂｏｒｒｅｌｌｉ等１９８８ＰｒｏｃＮａｔｌ
ＡｃａｄＳｃｉ８５：７５７２−７５７６）、マスタードプロドラッグ（
ニトロ還元酵素と一緒に使用される、Ｆｒｉｅｄｌｏｓ等１９９７ＪＭ
ｅｄＣｈｅｍ４０：１２７０−１２７５）およびシクロホスファミド（Ｐ４
５０と一緒に使用される、Ｃｈｅｎ等１９９６ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５
６：１３３１−１３４０）。

【００８７】本発明のレトロウイルスベクター、プラス鎖合成エレメントおよびトランス作
用性エレメントは、既知のレトロウイルスまたは発見されたレトロウイルスから
得られる。参照を容易にするために、レトロウイルスの分類を表１に示す。表２
に、主要なレトロウイルスおよびそれらの起源を示し、表３に主要なレンチウイ
ルスを示す。これらの表は、ＣｏｆｆｉｎＪＭ等（同書）にある。

【００８８】ベクターは、レンチウイルスゲノムから得られることが好ましい。

【００８９】ベクターが特定の細胞に向けられるように、自然のウイルスと比較して改変さ
れている組織親和性を有するベクターを目標に向けることが可能である。

【００９０】本発明の第７の態様によれば、レトロウイルスベクターをコードする核酸配列
を含む本発明のレトロウイルスベクターを作製するための、レトロウイルス産生
システムが提供される。

【００９１】本発明の第８の態様によれば、本発明の産生システムで作製されたレトロウイ
ルスベクターが提供される。

【００９２】本発明の第９の態様によれば、本発明のレトロウイルスベクターから得られる
レトロウイルス粒子が提供される。

【００９３】用語「レトロウイルスベクター粒子」は、好ましくは、標的細胞に結合して入
ることができる、パッケージされたレトロウイルスベクターを指す。この粒子の
成分については、ベクターに関して既に論じた通り、野生型レトロウイルスに関
して修飾されていてもよい。たとえば、粒子のタンパク質コートにおけるＥｎｖ
タンパク質は、それらのターゲッティング特異性を変えたり、若干の他の所望の
機能を実現するために、一般に、修飾されていてもよい。

【００９４】本発明の第１０の態様によれば、本発明のレトロウイルスベクターを用いてト
ランスフェクトされたまたは形質導入された細胞が提供される。

【００９５】本発明の第１１の態様によれば、本発明に従って、医療用のレトロウイルスベ
クター、またはレトロウイルス粒子、または細胞が提供される。

【００９６】本発明によるベクターシステムによる１つまたは複数の治療用遺伝子の１つま
たは複数の送達を単独で、または他の治療もしくは治療成分と組み合せて、使用
することができる。

【００９７】たとえば、本発明のレトロウイルスベクターを使用して、ＷＯ−Ａ−９８／０
５６３５に記載の疾患を治療するのに有用な１つまたは複数のＮＯＩを送達する
ことが可能である。参照しやすくするために、その疾患のリストの一部をここに
示す。癌、炎症または炎症性疾患、皮膚病、発熱、心血管作用、出血、凝血およ
び急性期応答、悪液質、食欲不振、急性感染、ＨＩＶ感染、ショック状態、移植
片対宿主反応、自己免疫病、再灌流傷害、髄膜炎、偏頭痛およびアスピリン依存
性抗血栓症、腫瘍成長、浸潤およびびまん、血管形成、転移、悪性腫瘍、腹水お
よび悪性胸水。脳虚血、虚血性心臓疾患、変形性関節炎、慢性関節リウマチ、骨
粗鬆症、喘息、多発性硬化症、神経変性、アルツハイマー病、アテローム性動脈
硬化、卒中、血管炎、クローン病および潰瘍性大腸炎。歯周炎、歯肉炎。乾癬、
アトピー性皮膚炎、慢性潰瘍、表皮剥離。角膜潰瘍形成、網膜症および外科手術
創傷治癒。鼻炎、アレルギー性結膜炎、湿疹、アナフィラキシー。再狭窄、うっ
血性心不全、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化または内膜硬化症（ｅｎｄｏｓ
ｃｌｅｒｏｓｉｓ）。

【００９８】さらに、または代わりに、本発明のレトロウイルスベクターを使用して、ＷＯ
−Ａ−９８／０７８５９に記載の疾患を治療するのに有用な１つまたは複数のＮ
ＯＩを送達することが可能である。参照しやすくするために、その疾患のリスト
の一部をここに示す。サイトカインおよび細胞増殖／分化活性、免疫抑制活性ま
たは免疫刺激活性（たとえば、ヒト免疫不全イルスによる感染を含む免疫不全症
の治療、リンパ球増殖の制御、癌および多くの自己免疫病の治療のため、および
移植拒絶を予防するかまたは腫瘍免疫を誘導するため）。造血の制御、たとえば
骨髄性疾患またはリンパ性疾患の治療。たとえば創傷治癒、火傷、潰瘍および歯
周病ならびに神経変性の治療のための、骨、軟骨、腱、靭帯および神経組織の成
長促進。卵胞刺激ホルモンの阻害または活性化（受胎調節）。走化性／ケモカイ
ンの活性（たとえば、特定の細胞型を傷害または感染の部位に動員するため）。
止血作用および血栓溶解作用（たとえば血友病および卒中を治療するため）。抗
炎症活性（たとえば敗血症性ショックまたはクローン病を治療するため）。抗菌
薬として、たとえば代謝または挙動の調節剤。鎮痛薬として、特定の不全疾患を
治療するための、たとえば乾癬の治療における、ヒトまたは動物用薬。

【００９９】さらに、またはあるいは、本発明のレトロウイルスベクターを使用して、ＷＯ
−Ａ−９８／０９９８５に記載の疾患を治療するのに有用な１つまたは複数のＮ
ＯＩを送達することが可能である。参照を容易にするために、そのリストの一部
をここに示す。マクロファージ阻害性活性および／またはＴ細胞阻害活性、した
がって、抗炎症活性。抗免疫活性、すなわち炎症関連ではない応答を含む細胞性
および／または体液性免疫応答に対する阻害作用。マクロファージおよびＴ細胞
が細胞外マトリックス成分およびフィブロネクチンに接着する力、ならびにＴ細
胞におけるアップレギュレートされたｆａｓ受容体発現を阻害する。慢性関節リ
ウマチを含む関節炎、過敏症、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス
、膠原病および他の自己免疫病関連の炎症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症
、動脈硬化性心臓疾患、再灌流傷害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性疾患、呼吸
窮迫症候群または他の心肺疾患関連の炎症、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎および他
の消化管疾患関連の炎症、肝線維症、肝硬変または他の肝疾、甲状腺炎または他
の腺疾患、糸球体腎炎または他の腎疾患および泌尿器疾患、耳炎または他の耳鼻
咽喉科疾患、皮膚炎または他の皮膚疾患、歯周病または他の歯科疾患、精巣炎ま
たは精巣上体精巣炎、不妊症、睾丸外傷または他の免疫関連の睾丸疾患、胎盤機
能障害、胎盤機能不全、習慣性流産、子癇、早期子癇、および他の免疫および／
または炎症関連の婦人科疾患、後ブドウ膜炎、中ブドウ膜炎、前ブドウ膜炎、結
膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜網膜炎、視神経炎、眼内炎症、たとえば網膜炎また
は胞状黄斑浮腫、交感神経性眼炎、強膜炎、網膜炎色素沈着、退行変性眼底疾患
の免疫成分および炎症性成分、眼外傷感染による眼炎症、増殖性硝子体網膜症、
急性虚血性視神経障害、たとえば緑内障濾過手術後の過瘢痕形成の炎症性成分、
眼球移植に対する免疫および／または炎症反応ならびに他の免疫および炎症関連
の眼疾患、自己免疫疾患あるいは中枢神経系（ＣＮＳ）または他の器官において
免疫および／または炎症抑制が有益と考えられる病気または障害と関連した炎症
、パーキンソン病、パーキンソン病の合併症および／またはパーキンソン病の治
療による副作用、ＡＩＤＳ関連痴呆症複合ＨＩＶ関連脳症、ドビック病、シデナ
ム舞踏病、アルツハイマー病および他の退行変性疾患、ＣＮＳの病気およびまた
は障害、卒中の炎症性成分、ポリオ後症候群、精神障害の免疫および炎症性成分
、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化、汎脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障
害、慢性神経障害、ギラン・バレー症候群、シデナム舞踏病、重症筋無力症、偽
脳腫瘍、ダウン症候群、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、ＣＮＳの炎
症性成分またはＣＮＳ外傷またはＣＮＳの炎症、筋萎縮症および筋ジストロフィ
ーの炎症性成分、中枢神経系および末梢神経系の免疫および炎症関連の疾患、病
気または障害、外傷後炎症、敗血症性ショック、感染症、外科手術の炎症性合併
症または副作用、骨髄移植または他の移植合併症および／または副作用、たとえ
ば、ウイルスキャリヤー感染に起因する遺伝子療法の炎症性および／または免疫
合併症および副作用、またはＡＩＤＳ関連の炎症、体液性および／または細胞性
免疫応答を抑制または阻害すること、または単球増殖性疾患または白血球増殖性
疾患、たとえば白血病を単球またはリンパ球の量を減少させることにより改善す
ること、天然または人工の、細胞、組織および器官、たとえば角膜、骨髄、器官
、レンズ、ペースメーカー、天然または人工の皮膚組織の移植の場合に、移植片
拒絶を予防および／または治療することを含む望ましくない免疫反応および炎症
を阻害する。

【０１００】本発明は、１つまたは複数の送達可能な治療用および／または診断用のＮＯＩ
を含む本発明のレトロウイルスベクターまたはそれから作製されるかまたは得ら
れるウイルス粒子の治療有効量を含む、遺伝子療法で個体を治療するための薬剤
組成物も提供する。本薬剤組成物は、ヒト向けであってもよく、動物向けであっ
てもよい。一般に、対象個体に最も適当であろう実際の投薬量は医師が決定する
が、年齢、体重および個々の個体の応答によって異なるであろう。

【０１０１】本組成物は、製薬上許容できる担体、希釈剤、賦形剤または助剤を任意に含ん
でもよい。製剤担体、賦形剤または希釈剤の選択は、所期の投与経路および標準
製剤業務に関して選択することができる。本薬剤組成物は、担体、賦形剤または
希釈剤として、または担体、賦形剤または希釈剤に加えて、適当なバインダー、
滑沢剤、沈殿防止剤、コーティング剤、可溶化剤およびウイルスが標的部位に入
るのを助けるかまたは増進することが可能な他の担体（たとえば液体送達システ
ム）を含んでもよい。

【０１０２】適切であれば、下記のいずれか１つまたは複数で、本薬剤組成物を投与するこ
とができる。吸入、座薬またはペッサリーの形態で、ローション、溶液、クリー
ム、軟膏または粉剤の形態で、局所的に、皮膚パッチを使用して、デンプンまた
は乳糖等の賦形剤を含有する錠剤の形態で、あるいは単独または賦形剤との混合
物のいずれかでのカプセルまたは腔坐剤で、あるいは香味料または着色剤を含む
エリキシル、溶液または懸濁液の形態で、経口的に、あるいは、本薬剤組成物を
非経口的に、たとえば洞内、静脈内、筋内または皮下に注射することができる。
非経口投与の場合、溶液を血液と等張にするために、他の物質、たとえば十分な
塩類または単糖類を含んでもよい滅菌水溶液の形態で、組成物を最もよく使用で
きる。バッカル投与または舌下投与の場合、従来の方法で調剤できる錠剤または
トローチ剤の形態で本組成物を投与することが可能である。

【０１０３】本発明によるベクターシステムによる１つまたは複数の治療用遺伝子の送達は
、単独でまたは他の治療または治療成分と組み合せて使用することが可能である
。治療することが可能な疾患としては、癌、神経学的疾患、遺伝病、心臓疾患、
卒中、関節炎、ウイルス感染症および免疫システムの疾患などがあるが、その限
りではない。適当な治療用遺伝子としては、腫瘍サプレッサータンパク質、酵素
、プロドラッグ活性化酵素、免疫調節性分子、抗体、加工した免疫グロブリン様
分子、融合タンパク質、ホルモン類、膜タンパク質、血管作用性タンパク質また
はペプチド類、サイトカイン類、ケモカイン類、抗ウイルスタンパク質、アンチ
センスＲＮＡおよびリボザイムをコードするものなどがある。

【０１０４】本発明による治療方法の好ましい実施形態では、本発明のベクターシステムを
使用してプロドラッグ活性化酵素をコードする遺伝子が腫瘍に送達され、その後
、適切なプロドラッグで個体が治療される。プロドラッグの例としては、リン酸
エトポシド（アルカリホスファターゼと一緒に使用される。Ｓｅｎｔｅｒ等．
,１９８８Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：４８４２−４８４
６）；５−フルオロシトシン（シトシンデアミナーゼと一緒に使用される。Ｍｕ
ｌｌｅｎ等．１９９４ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５４：１５０３−１５０６）
；ドキソルビシン−Ｎ−ｐ−ヒドロキシフェノキシアセトアミド（ペニシリン−
Ｖ−アミダーゼと一緒に使用される、Ｋｅｒｒ等．１９９０Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３１：２０２−２０６）；パラ−Ｎ
−ビス（２−クロロエチル）アミノベンゾイルグルタメート（カルボキシペプチ
ダーゼＧ２と一緒に使用される）；セファロスポリンナイトロジェンマスタード
カルバメート（β−ラクタマーゼと一緒に使用される）；ＳＲ４２３３（Ｐ４５
０Ｒｅｄｕｃａｓｅと一緒に使用される）；ガンシクロビル（ＨＳＶチミジン
キナーゼと一緒に使用される。Ｂｏｒｒｅｌｌｉ等．１９８８Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：７５７２−７５７６）マスタードプロドラッ
グ（ニトロ還元酵素と一緒に使用される。Ｆｒｉｅｄｌｏｓ等．１９９７Ｊ
ＭｅｄＣｈｅｍ４０：１２７０−１２７５）およびシクロホスファミドま
たはイフォスファミド（チトクロームＰ４５０と一緒に使用される。Ｃｈｅｎ
等．１９９６ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５６：１３３１−１３４０）。

【０１０５】本発明の第１２の態様によれば、形質導入効率を高めるのに使用するための、本
発明によるレトロウイルスベクター、またはレトロウイルス粒子、または細胞を
使用することができる。

【０１０６】本発明の第１３の態様によれば、ベクターの形質導入力を変更する際に使用す
るための、本発明によるレトロウイルスベクター、またはレトロウイルス粒子、
または細胞を使用することができる。たとえば、本発明のベクターは、その野生
型等価物と異なり、非分裂細胞を形質導入できる力を有する。

【０１０７】本発明の第１４の態様によれば、プラス鎖合成を促進する際に使用するための
、本発明によるレトロウイルスベクター、またはレトロウイルス粒子、または細
胞を使用することができる。

【０１０８】本発明の第１５の態様によれば、ベクター力価を高める際に使用するための、
本発明によるレトロウイルスベクター、またはレトロウイルス粒子、または細胞
を使用することができる。

【０１０９】本発明の第１６の態様によれば、ＮＯＩを必要としている標的部位にＮＯＩを
送達するための、薬剤組成物を製造するために、本発明によるレトロウイルスベ
クター、またはレトロウイルス粒子、または細胞を使用することができる。

【０１１０】本発明の第１７の態様によれば、本発明によるレトロウイルスベクター、また
はレトロウイルス粒子で、または本発明による細胞を使用して、細胞をトランス
フェクトまたは形質導入することを含む方法が提供される。

【０１１１】本発明の第１８の態様によれば、本発明によるレトロウイルスベクター、また
はレトロウイルス粒子、または細胞の形態で、送達システムが提供される。

【０１１２】本発明の第１９の態様によれば、送達システムが非レトロウイルス発現ベクタ
ー、アデノウイルスおよび／またはプラスミドを含む、本発明によるレトロウイ
ルスベクター、またはレトロウイルス粒子、または細胞用の送達システムが提供
される。

【０１１３】本発明のベクターを、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターにより標的
部位に送達することが可能である。

【０１１４】当技術分野で周知の通り、ベクターは、実体を１つの環境から別の環境に転移
させるのを可能にするまたは容易にする道具である。例として、組換えＤＮＡ技
術で使用される若干のベクターは、実体、たとえば、ＤＮＡの断片（異種ＤＮＡ
断片等、異種ｃＤＮＡ断片等）を、標的細胞に転移させることができる。任意に
、いったん標的細胞内に入ると、次にはベクターは異種ＤＮＡを細胞内に維持す
るのに役立つことができ、あるいは、ＤＮＡ複製の単位の役割をすることができ
る。組換えＤＮＡ技術で使用されるベクターの例としては、プラスミド、染色体
、人工染色体またはウイルスなどがある。

【０１１５】非ウイルス送達システムとして、ＤＮＡトランスフェクション法が挙げられる
。ここでは、トランスフェクションは、遺伝子を標的哺乳類細胞に送達するため
に、非ウイルスベクターを使用する工程を含む。

【０１１６】代表的なトランスフェクション法としては、エレクトロポレーション、ＤＮＡ
微粒子銃、脂質仲介トランスフェクション、コンパクト化ＤＮＡ仲介トランスフ
ェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクチン、陽イオン作動物
質介在性、陽イオン表面両親媒性物質（ＣＦＡ）（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ１９９６１４；５５６）、およびそれらの組み合せなどがあ
る。

【０１１７】ウイルスの送達システムとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイ
ルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター
、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなどがあるが、その限り
ではない。ベクターの他の例としては、ｅｘｖｉｖｏ送達システムが挙げられ
、エレクトロポレーション、ＤＮＡ微粒子銃、脂質仲介トランスフェクション、
コンパクト化ＤＮＡ仲介トランスフェクション等のＤＮＡトランスフェクション
方法などがあるが、その限りではない。

【０１１８】本発明に従って、当分野の技術レベルの範囲内である標準分子生物学技術を使
用することが可能である。このような技術は、文献に十分に説明されている。た
とえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ（実験マニュアル）、ＨａｍｅｓａｎｄＧｌｏｖｅｒ（１９８５−１９９
７）ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ,Ｖ
ｏｌｕｍｅｓＩ−ＩＶ（第２版）を参照されたい。

【０１１９】例として、以下の図を参考に、本発明をさらに説明する。

【０１２０】さらに詳細に説明する：図１Ａ：フランキングＰＰＴ配列をＭＬＶ系発現カセットから除去することが力
価に及ぼす作用を表し、配列の列は、野生型ＭＬＶプロウイルスと誘導された２
つの発現ベクターとの間の変化を比較する。終結コドン（ボールド体で表示）は
、プロウイルスでは、エンベロープの翻訳を停止させ、発現ベクターでは、ｎｅ
ｏの翻訳を停止させる。プロウイルス配列について、想定されるＵボックスを小
文字ボールド体で表し、３′ＰＰＴに下線を施した。ウイルス産生およびＸ−ｇ
ａｌ染色を既述の通りに実施した。（Ｓｏｎｅｏｋａ等１９９５）。図１Ｂ
および図Ｃは、筋肉のフランキングＰＰＴ配列を組み入れると、ＭＬＶ系発現ベ
クターの力価が大幅に上昇する（約１００倍）ことを表す。図１Ｂおよび図Ｃは
、１０^-1ウイルス希釈における、Ｘ−ｇａｌ染色細胞層の写真である。図１Ｂは
、Ｍｉｌｌｅｒ等からの３′配列を含む発現ベクターを表し、力価は、通常、
５００,０００〜１,０００,０００／ｍｌである。図１Ｃは、Ｋｉｍ等からの
３′配列を含む発現ベクターを表し、力価は、通常、５,０００〜１０,０００／
ｍｌである。

【０１２１】図２Ａは、本発明で使用することが可能なＦ−ＰＰＴ／３′ＰＰＴエレメント
を（Ｆ−ＰＰＴ配列は小文字で、３′ＰＰＴは大文字で）表す。図２Ｂは、本発
明で使用することが可能なＣ−ＰＰＴエレメントを（Ｆ−ＰＰＴ配列は小文字で
、３′ＰＰＴは大文字で）表す。図２Ｃは、本発明で使用することが可能なＣＴ
Ｓエレメントを表す（ＨＩＶは３つの終結シグナルｔ０、ｔ１およびｔ３を有す
る。図２Ｄは、たとえば、野生型ＰＰＴ配列への付加、または野生型ＰＰＴ配列
の置換のいずれかによってこのような縮重ＰＰＴ配列を含むプロウイルスライブ
ラリーを構築し、次に、適切な細胞でこのようなロウイルスライブラリーを継代
し、次いで選択されたウイルスを分析することにより、進化試験で使用すること
ができる、縮重エレメントの例を表す。

【０１２２】レトロウイルス発現ベクターのプラス鎖合成エレメント組み入れ：我々は、Ｆ−ＰＰＴ領域等のプラス鎖合成エレメントは、レトロウイルス発現
ベクターの機能に重要であること、また、ｐＭＯＩ等の最小限のベクターを含む
発現ベクターにこのような配列を導入すると、このようなのベクター機能を増強
できることを証明した（以下の実施例１参照実施例１）。

【０１２３】レトロウイルス系ベクターにおけるＰＰＴ／第２鎖合成機能の最適化：我々は、Ｆ−ＰＰＴの変化が、レトロウイルス発現ベクター機能に影響を及ぼす
ことを証明した。このＦ−ＰＰＴ仲介作用は、最適ベクター機能に重要なことが
わかる。Ｆ−ＰＰＴ機能は、ＰＰＴエレメントそれ自身の機能と関連している可
能性がある。このエレメントは、ｃ−ＰＰＴおよびＣＴＳと同様、第２鎖合成に
関与する。したがって、このようなエレメントは、組み合せて、あるいは単独で
、少なくとも若干のレトロウイルス発現カセットにおけるベクター機能を決定す
ることが可能である。また、このようなエレメントは、変化に極めて敏感な可能
性がある。我々は、Ｆ−ＰＰＴおよび前述の関連エレメント（３′ＰＰＴ、ｃ−
ＰＰＴおよびＣＴＳ）の最適化についても教示する。これについては、先のベク
ターデザインでざっと論じた。従って、ベクターゲノム内に配置された、修飾さ
れたまたは付加された第２鎖合成エレメントを有するレトロウイルス発現ベクタ
ーは、ベクター機能を増強できることが理解されるであろう。

【０１２４】最適な第２鎖合成エレメントの同定およびレンチウイルスベクターへの組み入れ
：オンコレトロウイルスと異なり、多くの場合、野生型レンチウイルスは中央Ｐ
ＰＴ（ｃ−ＰＰＴ）および３′ＰＰＴという２つのＰＰＴ配列を有する。これら
の配列は、多くの場合、ウイルスタンパク質オープンリーディングフレーム内に
位置する（ＯＲＦ）。ＨＩＶでは、ｃ−ＰＰＴはインテグラーゼＯＲＦ内に位置
し、３′ＰＰＴはＮＥＦ内に位置する。このような位置にあるため、レンチウイ
ルスのＰＰＴ配列は、第２鎖合成におけるタンパク質コード配列とシス作用性エ
レメントの両者の役割を果たすという、二重の機能を有すると言える。この二重
機能の結果として、このような配列エレメントは、最適組成でなくてもよいが、
その代わりに、配列エレメントが位置するＯＲＦにより束縛される。結果として
、第２鎖合成は最適ではない可能性がある。従って、このような可能性があるた
め、今度は全てのタンパク質をトランスで供給し、従って、ベクターゲノムＰＰ
Ｔおよび関連の第２鎖合成エレメントのコード配列に対する束縛が緩められるた
め、レンチウイルスベクターにおけるこのようなエレメントを最適化する余地が
ある。このような最適化は、既存の第２鎖合成エレメント（３′ＰＰＴ、ｃ−Ｐ
ＰＴ、Ｆ−ＰＰＴ、ＵボックスおよびＣＴＳ配列）の置換、またはウイルス発現
ベクターへの補足的エレメント組み入れによって実現する。事実、最適なベクタ
ー第２鎖合成は、プロウイルスの場合のように２つだけ、または多くのレンチウ
イルスにより誘導される発現ベクターの場合のように１つだけ（３′ＰＰＴ）と
いうよりむしろ、第２鎖合成の多数の起点を組み入れることによって実現する（
たとえばＺｕｆｆｅｒｅｙ等１９９７；Ｋｉｍ等Ｂ１９９８参照）。

【０１２５】非分裂細胞の形質導入を助けるための、レトロウイルス系ベクターへのプラス鎖
合成エレメント組み入れ：オンコレトロウイルスおよびオンコレトロウイルス由来のベクターは、申し分
のない形質導入に細胞分裂を必要とするが、それらのレンチウイルス等価物は、
非分裂細胞も形質導入できる（Ｎａｌｄｉｎｉ等１９９６）。今までのところ
、この違いの理由は理解しがたいままでである。これらの２タイプのウイルス間
の１つの可変要素は、レンチウイルスファミリーの多くのメンバーでは、第２鎖
合成の２つの起点（ｃ−ＰＰＴから１つと、３′ＰＰＴから１つ）が同定されて
いることである（たとえば、Ｂｌｕｍ等１９８６，Ｃｈａｒｎｅａｕ等１９
９４参照）。オンコレトロウイルスの場合、１つ（３′ＰＰＴ）存在するだけで
ある。もう１つの、かつ第１の違いに関連した違いは、オンコレトロウイルスで
はないレンチウイルスは、明確に定められた中央終止配列（ＣＴＳ）も有するこ
とである（この配列も、効果的な第２鎖合成に関与している）。

【０１２６】我々は、３′ＰＰＴ関連の配列エレメントが、ベクター機能に対して重大な作
用を有することを証明した。そこで、我々は、第２鎖合成における変化も、異な
るレトロウイルスベクター間の形質導入力が変化する原因であると提案する。特
に、オンコレトロウイルス系ベクターにおける第２鎖合成パラメーターを修飾す
ることにより、非分裂細胞を形質導入する力をベクターに与えることが可能であ
る。さらに、レンチウイルス系ベクターにおける第２鎖合成パラメーターを同様
に修飾することにより、非分裂細胞形質導入効率を高めることが可能である。パ
ラメーターの変更としては、オンコレトロウイルス系ベクターおよびレンチウイ
ルス系ベクターに、第２鎖合成の起点を多数生成することなどが挙げられるが、
その限りではない。たとえば、ＭＬＶ由来のベクターゲノムまたはＨＩＶ由来の
ベクターゲノムのいずれかに、Ｆ−ＰＰＴ／ＰＰＴ配列エレメントをさらに入れ
、また、必要に応じて適切なＣＴＳエレメントを組み入れることによる。

【０１２７】第２鎖合成を増進するためのＰｏｌ系修飾の組み入れ：最適なベクター機能を得るためには、最適な第２鎖合成シス作用性エレメント
をレトロウイルス発現ベクターに組み入れることが重要なことを、我々は証明し
た。第２鎖合成は、ベクター機能および力価を限定する、重要な、ざっと論じた
パラメーターであろう。効果的な第２鎖合成を促進するこのようなシス作用性エ
レメントを、最適に作動するものを用いて組み入れ、付加または置換により修飾
することによって、ベクター機能を増強することが可能である。しかし、これが
、第２鎖合成を最適化できる唯一の方法ではない。さらなる方法は、レトロウイ
ルスのｐｏｌ遺伝子の修飾による。この遺伝子は、逆転写、従って第２鎖合成過
程にに不可欠な酵素的タンパク質産物（逆転写酵素、ＲＮアーゼＨおよびインテ
グラーゼ）をコードする。従って、関連プロウイルスからの最適ＰＰＴ配列また
は非自己起源の最適ＰＰＴ配列のいずれかをレトロウイルスベクターゲノムに導
入するためには、ベクターゲノムの効果的なパッケージングおよび送達に必要な
ウイルスタンパク質をトランスで供給するのに使用されるウイルスのｐｏｌ遺伝
子発現カセット（通常は、より大きなｇａｇｌｐｏｌ発現カセットとして含まれ
る）の一部または全部を変更することも必要である。たとえば、オンコレトロウ
イルスのＰＰＴ配列をレンチウイルスの発現ベクターに導入するためには、ｐｏ
ｌ発現カセットへの、オンコレトロウイルス系ｐｏｌ配列の同様の組み入れまた
は置換も必要であろう。最適ベクター機能には第２鎖合成が重要であるという我
々の観察結果に基づいて、第２鎖合成に必要なシス作用性エレメントのいずれか
と相互に作用するトランス作用性タンパク質を修飾することにより、このような
合成も増進することが可能である。そこで、我々は、このような相互作用を、次
には第２鎖合成を増強するためにデザインされたこのような修飾を含める。

【０１２８】実施例１２つの公表されたベクターバックボーン、ｐＬＸＳＮ（Ｍｉｌｌｅｒ等１
９８９）およびｐＭＯＩ（Ｋｉｍ等Ｂ１９９８）を基本とするオンコレト
ロウイルス由来の発現ベクターを使用した。ｐＭＯＩベクターは、５′ＬＴＲと
３′ＬＴＲの両者に隣接するウイルス由来の配列を、ｐＬＸＳＮよりも有意に少
なく有し、従って、より「最小限」と考えることができる。具体的には、ｐＭＯ
Ｉはベクターの５′にて全てのｇａｇコード配列が欠けており、３′ＰＰＴの間
に３′ＵＴＲ（未翻訳）配列を全く持たない。

【０１２９】我々は、遺伝子療法プロトコールにおける遺伝子送達の潜在的候補として、ｐ
ＬＸＳＮベクターとｐＭＯＩベクターの両者を使用することについて研究した。
興味深いことに、同じ発現カセット（ｐ４５０ＩＲＥＳｌａｃＺ−Ｓｖ４０Ｎｅ
ｏ）を両ベクターに入れたとき、ｐＬＸＳＮベクターは、ｐＭＯＩより力価が１
００倍優れていた（図１参照）。当初、この観察結果は、パッケージングシグナ
ル内にｇａｇ配列が欠けているためと考えられた（既報の通り、Ｂｅｎｄｅｒ
等１９８７）が、この特別のｇａｇ系のパッケージングシグナルをｐＭＯＩに
組み入れたとき、力価はｐＬＸＳＮレベルまで回復しなかった。両ベクターとも
、最適ベクター機能を得るための、既知の機能的エレメントを全て含んでいたた
め、この結果は意外であった。

【０１３０】これらの２つのベクター間の配列比較により、残る唯一の違い（プラスミドバ
ックボーンは別にして）は、３′ＰＰＴの上流の、ウイルス配列ベクターの３′
末端にあることが明らかになった。このため、このウイルス配列の存在（ＮＥＶ
プロウイルスの、ｅｎｖと３′ＰＰＴとの間に位置する）が、ｐＬＸＳＮ系ベク
ターの高い性能の原因に違いないという結論に至った。この結論を検証するため
に、ｐＬＸＳＮ系ベクターの３′配列を、ｐＭＯＩの３′配列と置換し、２つの
、今度は微妙に（１８塩基対、図１参照）異なるベクターを比較した。仮定通り
、ｐＬＸＳＮ系ベクターは、ｐＬＸＳＮ−３′ｐＭＯＩより約１００倍優れてい
た（図１参照）。

【０１３１】以上の観察結果から、以前には確認されなかった、３′ＰＰＴに隣接するレト
ロウイルス発現ベクターの機能的領域が存在すると考えるに至った。我々は、こ
うした領域をフランキングＰＰＴ（Ｆ−ＰＰＴ）と呼び、レトロウイルス発現ベ
クターの能率的な機能に不可欠であることを証明した。これが、この領域がレト
ロウイルス系ベクターに重要なことが証明された最初であった。興味深いことに
、この領域は、先にＳＩＶのＵボックスに一列に並べたＭＬＶの配列と部分的に
重複する（ＬｌｙｉｎｓｋｉｉａｎｄＤｅｓｒｏｓｉｅｒｓ１９９８）。
未知の機能ではあったが、このＵボックスは、ＳＩＶプロウイルスの複製に重要
なことが最近証明され、３′ＰＰＴ、ｃ−ＰＰＴおよびＣＴＳと同様、ＲＴ仲介
第２鎖開始／合成に関与する配列エレメントであると考えられる。（Ｌｌｙｉｎ
ｓｋｉｉａｎｄＤｅｓｒｏｓｉｅｒｓ１９９８）。

【０１３２】実施例２−レンチベクターにおける中央ＰＰＴおよび中央終止配列の組み入れ先に論じた通り、第２鎖合成に関与するシス作用性配列、たとえば中央ポリプ
リントラクト（ｃＰＰＴ）および中央終止配列（ＣＴＳ）のシス作用性配列の組
み入れにより、レンチウイルスベクターの性能を最適化することが可能である。
このような配列は、ＥＩＡＶに関してＳｔｅｔｏｒ等．（１９９９）により記
載のものであり、ＥＩＡＶゲノムＧｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ０１８６６のヌクレ
オチド４９１６−５０３９に相当する。

【０１３３】ＥＩＡＶベクター、ｐＯＮＹ４．０に特有の、酵素ＳａｌＩおよびＸｂａＩに
関する配列を含むプライマーを使用して、ＥＩＡＶプロウイルスのクローンから
、この配列および少量のフランキング残基を増幅した。このベクターｐＯＮＹ４
．０は、我々のＷ０９９／３２６４６に記載されている。増幅した配列は次の通
りであった：

【化２】

【０１３４】Ｘｂａｌ部位に下線を施し、ＳａｌＩをイタリック体で示す。機能的に活性な
配列（４９１６−５０３９）は、ボールド体で示してあり、中央ＰＰＴおよびＣ
ＴＳと呼ばれるエレメントを含む。Ｘｂａｌ部位を使用することにより、このエ
レメントを、内部ＣＭＶプロモーターの上流に配置することが可能である。Ｓａ
ｌＩ部位を使用して、このエレメントを、ｐＯＮＹ４．０のＬａｃＺ遺伝子の下
流に配置することができる。

【０１３５】標準技術を使用して、修飾されたｐＯＮＹ４．０ベクターをコードするプラス
ミドと一緒にｇａｇ／ｐｏｌおよびＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを２９３Ｔ細胞系
に共トランスフェクトすることにより、これらの修飾を組み込むベクター調製物
を作製する。

【０１３６】ＦＨＶベクターに類似した修飾を、以下の通りに施す。

【０１３７】以下に示すｃＰＰＴ／ＴＣＳ配列はＰＣＲで作製され、ＨＩＶゲノム（菌株Ｈ
ＸＢ２４７７１−４９２６ｎｔ、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ３８４３２）から
獲得され、Ｃｈａｒｎｅａｕ等（１９９４）により中央ＰＰＴおよびＣＴＳは
縮重していると描かれている。

【０１３８】

【化３】

【０１３９】ｃＰＰＴには下線を施し、ＣＴＳは、ボールド体で表すと共に下線を施してあ
る。

【０１４０】次いで、ＰＣＲ産物をｐＨ４ＺのＭｓｃＩ部位（Ｋｉｍ等．，Ａ１９９
８）に挿入してｐＨ４ＺｃＰＰＴを作製する。

【０１４１】

【表１】

【０１４２】

【表２】

【０１４３】

【表２（つづき）】

【０１４４】

【表３】

【０１４５】［配列表］ SEQ ID NO:1 ATAAAATAAAAGATTTTA SEQ ID NO:2 CACATCTCATGTATCAATGCCTCAGTATGTTT SEQ ID NO:3 TGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTT SEQ ID NO:4 AATGACTTATAAACTTGCAGCGGATTTTTCGCACTTTTT SEQ ID NO:5 GACAGCTATTTGTAACTGCGAAATACGCTTTTGCAT SEQ ID NO:6 ATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAC SEQ ID NO:7 TACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTT SEQ ID NO:8 AGAAAAAGGGGGGAA SEQ ID NO:9 AGAAAAACAAGGGGGGAA SEQ ID NO:10 AAAAGAAAAGGGGGGA SEQ ID NO:11 SSSSGAAAAGGGAGGA SEQ ID NO:12 AGGGAGGGGGAAA SEQ ID NO:13 AAAAAGGGGGGAA SEQ ID NO:14 AAAAGAAAAGGGGGGATGGGGGG SEQ ID NO:15 TACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGGTTTATTA SEQ ID NO:16 AACAAAGGGAGGGAAACTATGGGAGGACAGACACCATGGGAAGTATTTATCACTAATCAAGCACAAGTAATA
CATGAGAAACTTTTACTACAGCAAGCACAATCCTCCAAAAAATTTTGTTTTT SEQ ID NO:17 AAAAGAAAAGGGGGG SEQ ID NO:18 AAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTT

【０１４６】［引用文献］ Bender et al (1987) Evidence that the packaging signal of Moloney murin
e leukaemia virus extends into the gag region. J.Virol. 61:1639-1646 Blum et al (1985) Synthesis in Cell Culture of the Gapped Linear DNA of the Slow Virus Visna. Virology 142; 270-277 Charneau et al (1994) HIV-1 Reverse transcription: A termination Step a
t the Centre of the Genome. J. Mol. Biol (194) 241;651-662 Coffin et al (1997) Retroviruses. Cold Spring Harbour Laboratory Press IIyinskii and Desrosiers (1998) Identification of a sequence element im
mediately upstream of the polypurine tract that is essential for replica
tion of simian immunodeficiency virus. EMBO.J 17;3766-3774 Kim et al (1998) Minimal requirements for a lentivirus vector based on
human immunodeficiency virus type 1. Jn. of Virology 72; 811-816 Kim et al (1998) Construction of Retroviral Vectors with Improved Safet
y, Gene Expression and Versatility. Jn of Virology 72;994-1004 Lavigne et al (1997) DNA curvature Controls Termination of Plus Strand
DNA synthesis at the Centre of HIV-1 genome. JMB (1997) 266;507-524 Miller et al (1989) Improved retroviral vectors for gene transfer and e
xpression. Biotechniques 7: 980-990 Naldini et al (1996) In vivo delivery and stable transduction of nondi
viding cells by a lentiviral vector. Science 272: 263-267 Soneoka et al (1995) A transient three-plasmid expression system for the
publication of high titre retroviral vectors. Nucleic Acid Res 1995 23
; 628-33 Stetor et al (1999) Biochemistry 38: 3656-3667 Zufferey R et al (1997) Multiple attenuated lentiviral vector achieves
efficient gene delivery in vivo. Nature Biotech. 1997 15:871-5

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】フランキングＰＰＴ配列をＭＬＶ系発現カセットから除去することが力価に及
ぼす作用を表す。

【図２】本発明で使用することが可能なプラス鎖合成エレメントの例および縮重エレメ
ントの例を表す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１月３１日（２００１．１．３１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 11/06 Ａ６１Ｐ 17/00 17/00 25/00 １０１ 25/00 １０１ 25/28 25/28 27/02 27/02 29/00 29/00 31/12 31/12 35/00 35/00 37/00 37/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 7/00 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ユーデン，マークイギリス国、エヌ４２ジェイエヌロンドン、フィンズベリー・パーク、ソマーフィールド・ロード 17、フラット２ (72)発明者ロール，ジョナサンイギリス国、アールジー８０ジェイダブリューバークシャー、リーディング、サウス・ストーク、チャペル・クローズ 10 (72)発明者キングズマン，スーザン・メアリイギリス国、オーエックス５２エスエフオックスフォードシャー、イズリップ、ミドル・ストリート、グレイストーンズ (72)発明者キングズマン，アラン・ジョンイギリス国、オーエックス５２エスエフオックスフォードシャー、イズリップ、ミドル・ストリート、グレイストーンズＦターム(参考） 4B024 AA01 BA07 CA04 DA03 EA02 GA11 GA14 HA17 4B065 AA93X AA95X AA95Y AB01 BA02 BA03 CA24 CA27 CA44 4C084 AA13 CA62 MA16 MA23 MA28 MA31 MA32 MA37 MA43 MA55 MA63 MA66 NA13 NA14 ZA022 ZA162 ZA332 ZA342 ZA362 ZA592 ZA682 ZA892 ZB072 ZB112 ZB132 ZB262 4C087 AA01 BC83 MA16 MA23 MA28 MA31 MA32 MA35 MA37 MA43 MA52 MA55 MA63 MA66 NA13 NA14 ZA02 ZA16 ZA33 ZA34 ZA36 ZA59 ZA68 ZA89 ZB07 ZB11 ZB13 ZB26 ZB33

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】フランキングポリプリントラクト（Ｆ−ＰＰＴ）またはその
誘導体、変異体または相同体を含むプラス鎖合成エレメント。
【請求項２】レトロウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター粒子
の形質導入力を変化させるためのレトロウイルスプラス鎖合成エレメントの使用
。
【請求項３】レトロウイルスベクターの力価を高めるためのレトロウイル
スプラス鎖合成エレメントの使用。
【請求項４】プラス鎖合成エレメントを含む点で特徴的である１つ以上のア
クセサリー遺伝子が存在しないレトロウイルスベクター。
【請求項５】関心のあるヌクレオチド配列を送達することができ、かつ外
因性の第２の合成エレメントを含むレトロウイルスベクター。
【請求項６】前記プラス鎖合成エレメントが、ＰＰＴ、ｃ−ＰＰＴ、ＣＴ
Ｓ、ＵボックスまたはＦ−ＰＰＴであり、これらの誘導体、変異体および相同体
を含む請求項２〜５のいずれかに記載の使用またはレトロウイルスベクター。
【請求項７】前記ベクターが、レンチウイルスゲノムから得られる請求項
１〜６項のいずれかに記載の使用またはレトロウイルスベクター。
【請求項８】外因性トランス作用性エレメントを含む、レトロウイルスベ
クターパッケージング細胞もしくは細胞系、またはレトロウイルスベクター発現
プラスミドもしくはカセット。
【請求項９】前記トランス作用性エレメントがｐｏｌである、請求項８に
記載のレトロウイルスベクターパッケージング細胞もしくは細胞系、またはレト
ロウイルスベクター発現プラスミドもしくはカセット。
【請求項１０】レトロウイルスベクターをコードする核酸配列を含む、請
求項４〜７のいずれかに記載のレトロウイルスベクターを作製するためのレトロ
ウイルス産生システム。
【請求項１１】請求項８または９に記載のレトロウイルスベクターパッケ
ージング細胞もしくは細胞系、またはレトロウイルスベクター発現プラスミドも
しくはカセットをさらに含む、請求項１０に記載のレトロウイルス産生システム
。
【請求項１２】請求項１０または１１の産生システムによって産生される
レトロウイルスベクター。
【請求項１３】請求項４〜７または請求項１２のいずれかに記載のレトロ
ウイルスベクターから得られるレトロウイルス粒子。
【請求項１４】請求項４〜７または請求項１２のいずれかに記載のレトロ
ウイルスベクターを用いてトランスフェクトまたは形質導入される細胞。
【請求項１５】請求項４〜７または請求項１２〜１４のいずれかに記載の
医薬品に使用されるレトロウイルスベクター、またはレトロウイルス粒子、また
は細胞。
【請求項１６】ベクターの形質導入力を変化させるのに使用するための、
請求項４〜７または請求項１２〜１４のいずれかに記載のレトロウイルスベクタ
ー、またはレトロウイルス粒子、または細胞の使用。
【請求項１７】プラス鎖合成の促進に使用するための、請求項４〜７また
は請求項１２〜１４のいずれかに記載のレトロウイルスベクター、またはレトロ
ウイルス粒子、または細胞の使用。
【請求項１８】ベクター力価を高めるのに使用するための、請求項４〜７
または請求項１２〜１４のいずれかに記載のレトロウイルスベクター、またはレ
トロウイルス粒子、または細胞の使用。
【請求項１９】請求項４〜７または請求項１２〜１４のいずれかに記載の
レトロウイルスベクター、またはレトロウイルス粒子、または細胞と、製薬上許
容できる賦形剤、希釈剤または担体とを含む薬剤組成物。
【請求項２０】関心のあるヌクレオチド配列を必要としている標的部位に
関心のあるヌクレオチド配列を送達するための薬剤組成物を製造するための、請
求項４〜７または請求項１２〜１４のいずれかに記載の、レトロウイルスベクタ
ー、またはレトロウイルス粒子、または細胞の使用。
【請求項２１】請求項４〜７または請求項１２〜１４のいずれかに記載の
レトロウイルスベクターもしくはレトロウイルス粒子を用いるか、または細胞を
使用することによって、細胞をトランスフェクトまたは形質導入することを含む
方法。
【請求項２２】請求項４〜７または請求項１２〜１４のいずれかに記載の
レトロウイルスベクター、またはレトロウイルス粒子、または細胞の形態である
送達システム。
【請求項２３】請求項４〜７または請求項１２〜１４のいずれかに記載の
レトロウイルスベクター、またはレトロウイルス粒子、または細胞用であって、
レトロウイルスでない発現ベクター、アデノウイルスおよび／またはプラスミド
を含む送達システム。