JP2007510412A - レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクター - Google Patents

Abstract

目的ヌクレオチド（ＮＯＩ）を所望の標的部位に送達する能力を有し、ＮＯＩは第ＶＩＩＩ因子をコードし、ＮＯＩを所望の標的部位に送達した後に第ＶＩＩＩ因子が発現される、レンチウイルスベクター。

Description

本発明はベクターに関する。

詳細には、本発明は、レトロウイルス粒子中で遺伝物質をパッケージングして発現させる新規の系に関する。

レトロウイルスとは、溶解性ウイルスとは異なる生活環を有するＲＮＡウイルスである。この点において、レトロウイルスは、ＤＮＡ中間体を介して複製される感染性のもの（entity）である。レトロウイルスが細胞に感染すると、そのゲノムは逆転写酵素によってＤＮＡの形態に変換される。ＤＮＡのコピーは、新しいＲＮＡゲノム、及び感染性ウイルス粒子の組立てに必要な、ウイルスにコードされたタンパク質を産生するための鋳型として役割を果たす。

感染過程の間、レトロウイルスは最初に特異的な細胞表面受容体に付着する。感受性のある宿主細胞内の進入に際し、レトロウイルスＲＮＡゲノムは、親ウイルスの内部に保有されている、ウイルスにコードされた逆転写酵素によってＤＮＡへと複写される。このＤＮＡは宿主細胞の核に輸送され、次いでそこで宿主ゲノム内に組み込まれる。この段階では、これは一般的にプロウイルスと呼ばれる。プロウイルスは細胞分裂の間宿主の染色体内で安定しており、他の細胞性遺伝子と同様に転写される。プロウイルスはタンパク質及び追加のウイルスを作製するために必要なパッケージング機構をコードし、時折「出芽」と呼ばれる過程によって、細胞から出ることができる。

それぞれのウイルスは、ウイルス粒子タンパク質及び酵素をコードする、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖと呼ばれる遺伝子を含む。プロウイルス内では、レトロウイルスのゲノムの両端には末端反復配列（ＬＴＲ、long terminal repeats）と呼ばれる領域が隣接している。ＬＴＲはプロウイルスの組込み及び転写を司っている。また、これらはエンハンサー−プロモーター配列としての役割も果たす。言い換えれば、ＬＴＲはウイルス遺伝子の発現を制御することができる。レトロウイルスＲＮＡのキャプシド形成は、ウイルスゲノムの５’末端に位置するｐｓｉ配列に基づいて起こる。

ＬＴＲ自体は、Ｕ３、Ｒ及びＵ５と呼ばれる３つの要素に分割することができる同一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に独特な配列に由来する。ＲはＲＮＡの両末端で繰り返される配列に由来し、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に独特な配列に由来する。３つの要素の大きさは、様々なレトロウイルス間で大幅に変化することができる。

プロウイルスの転写の制御は、概ねウイルスのＬＴＲの非コード配列に任される。転写開始部位は左側のＬＴＲ中のＵ３とＲとの境界にあり、ポリ（Ａ）付加（停止）部位は右側のＬＴＲ中のＲとＵ５との境界にある。Ｕ３は、細胞性及び一部の場合はウイルス性の転写活性化タンパク質に応答性のあるプロモーター配列並びに複数のエンハンサー配列を含めた、プロウイルスの転写制御要素のほとんどを含む。一部のレトロウイルスは、遺伝子発現の調節に関与するタンパク質をコードするｔａｔ、ｒｅｖ、ｔａｘ及びｒｅｘなどの遺伝子のうち、任意の１つ又は複数を有する。

プロウイルスＤＮＡの転写により、ＲＮＡプロセッシングによって生じる完全長のウイルスＲＮＡのゲノム及びサブゲノムの大きさのＲＮＡ分子が再作製される。典型的には、すべてのＲＮＡ産物が、ウイルスタンパク質産生の鋳型として役割を果たす。ＲＮＡ産物の発現は、ＲＮＡ転写物のスプライシング及び翻訳中におけるリボソームのフレームシフトの組合せによって果たされる。

ＲＮＡスプライシングとは、介在性、すなわち「イントロン」のＲＮＡ配列が除去されて、残った「エクソン」配列がライゲーションされて翻訳の連続的な読み枠が提供される過程である。レトロウイルスＤＮＡの一次転写物はいくつかの方法で改変され、細胞性ｍＲＮＡに酷似している。しかし、すべてのイントロンが効率的にスプライシングされるほとんどの細胞性ｍＲＮＡとは異なり、新しく合成されたレトロウイルスＲＮＡは２つの集団に転じられる。一方の集団はスプライシングされずにゲノムＲＮＡとして役割を果たし、他方の集団はスプライシングされてサブゲノムＲＮＡを提供する。

１回及び複数回スプライシングされたＲＮＡのどちらについてもその合成を指示する複合レトロウイルスは、ＲＮＡ上の配列と、ＨＩＶ−１中のｒｅｖなどのアクセサリー遺伝子の１つのタンパク質産物との相互作用によって、様々なゲノム及びサブゲノムの大きさのＲＮＡ種の輸送及びスプライシングを調節する。

レトロウイルスは、とりわけＮＯＩ又は複数のＮＯＩを１つ若しくは複数の目的部位へ移動させるための送達系（送達ベヒクル若しくは送達ベクターとも表現される）としてしばしば用いられる。移動は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、又はその組合せで行うことができる。このように用いた場合、レトロウイルスは一般にレトロウイルスベクター又は組換えレトロウイルスベクターと呼ばれる。レトロウイルスベクターは、受容体の用法、逆転写及びＲＮＡパッケージングを含めたレトロウイルスの生活環の様々な側面を研究するために活用されてきた（Miller, 1992 Curr Top Microbiol Immunol 158:1-24に総説されている）。

遺伝子治療で用いるための典型的な組換えレトロウイルスベクターでは、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖのタンパク質コード領域の１つ又は複数の少なくとも一部をウイルスから取り除き得る。これにより、レトロウイルスベクターは複製に欠陥をもつこととなる。そのゲノムを宿主ゲノム内に組み込む能力を有するが、改変されたウイルスゲノムは構造タンパク質を欠くために自身を増殖させることができないウイルスを作製するために、取り除いた部分はさらにＮＯＩで置き換えてもよい。宿主ゲノム内に組み込まれると、ＮＯＩの発現が起こり、例えば治療効果及び／又は診断的効果がもたらされる。したがって、ＮＯＩの目的部位への移動は、典型的には、ＮＯＩを組換えウイルスベクター内に組み込ませること；改変したウイルスベクターをウイルス粒子コーティング内へパッケージングすること；及び標的とした細胞又は標的とした細胞集団などの目的部位の形質導入によって果たされる。

パッケージング又はヘルパー細胞系と組換えベクターとの組合せを用いることによって、例えば後に目的部位の形質導入を行うために多量のレトロウイルスベクター（例えば適切なレトロウイルスベクターの力価を調製するため）を増殖及び単離することが可能である。

一部の場合では、増殖及び単離により、レトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子が単離され、それらが個別に宿主細胞内に導入されて「パッケージング細胞系」が生じることが起こり得る。パッケージング細胞系は、レトロウイルスＤＮＡのパッケージングに必要なタンパク質を産生するが、ｐｓｉ領域を欠くためにキャプシド形成をもたらすことはできない。しかし、ＮＯＩ及びｐｓｉ領域を保有する組換えベクターをパッケージング細胞系内に導入した場合、ヘルパータンパク質がｐｓｉ陽性の組換えベクターをパッケージングして、組換えウイルスのストックを産生することができる。このことを用いて、ＮＯＩを細胞のゲノム内に導入するために細胞の形質導入を行うことができる。そのゲノムがウイルスタンパク質の作製に必要な遺伝子をすべて欠いている組換えウイルスは、１回のみ形質導入することができ、増殖することができない。標的細胞の形質導入が１回のみ可能なこのようなウイルスベクターは、複製欠陥ベクターとして知られている。したがって、ＮＯＩは、潜在的に有害なレトロウイルスが生じることなしに宿主／標的細胞のゲノム内に導入される。利用可能なパッケージング系の概要は、"Retroviruses"(1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 449)に示されている。

レンチウイルスベクター系の開発に相当な関心がもたれている。この関心は、第１に、ＨＩＶに感受性のある細胞を抗ＨＩＶ治療遺伝子の標的とするためにＨＩＶに基づいたベクターを用いるという概念、及び第２に、レンチウイルスは非分裂細胞に感染することができるので（Lewis & Emerman 1993 J.Virol. 68, 510）、これらのウイルスに基づいたベクター系は非分裂細胞に形質導入するすることができるであろうという予測（例えばVile & Russel 1995 Brit. Med. Bull. 51, 12）から生じている。ＨＩＶに基づいたベクター系は産生されており（Buchschacher & Panganiban 1992 J.Virol. 66, 2731）、ＣＤ４＋細胞、及び予測どおり、非分裂細胞に形質導入するために用いられている（Naldini et al, 1996 Science 272, 263）。さらに、レンチウイルスベクターは、目的遺伝子の非常に安定した長期的な発現を可能にする。その期間は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、形質導入したラット神経細胞で少なくとも１年間であることが示されている（Biennemann et al, 2003 Mol. Ther. 5, 588）。ＭＬＶに基づいたベクターは、目的遺伝子を６週間の間しか発現させることができなかった。

場合によっては、レンチウイルスベクターの産生において、治療遺伝子を産生（producer）細胞内で発現させないことが望ましく、これは、いくつかの機構によってウイルス力価の低下が生じ得るからである。これを防ぐためには、本発明者らの国際公開公報ＷＯ９９／１５６８３号及び国際公開公報ＷＯ００／５６９１０号に記載のスプリットイントロン構成のベクターを採用することが可能である。しかし、ＬＴＲプロモーターからの発現レベルは一般に内部プロモーターからの発現レベルよりも低い。

血友病Ａは５，０００人に１人の男性を冒し、血漿中の第VIII因子タンパク質の欠乏によって引き起こされる。血液中の第VIII因子の活性レベルに基づいて、血友病Ａは軽度、中程度、及び重篤の型に分類される。血友病Ａ患者の５０％はこの疾患の重篤な型に罹患しており、これは自発性且つ長引く出血症状を特徴とする。

第VIII因子とは、凝血経路の補因子である。第VIII因子は血液中に循環しており、その担体タンパク質であるフォンウィルブランド因子と非共有結合で複合している。この相互作用は第VIII因子を安定化し、第VIII因子と膜表面との会合を防ぐ。第VIII因子からその活性状態である第VIIIａ因子への変換は、トロンビン又は第Ｘａ因子による第VIII因子のタンパク質分解を介して起こる。ヒト第VIII因子は単鎖ポリペプチドとして合成され、予想される分子量は２６５ｋＤａである。第VIII因子の遺伝子は２３５１個のアミノ酸をコードし、タンパク質が細胞内でプロセッシングされて、主にＡ１、Ａ２、及びＢドメインを含む２００ｋＤａの重鎖並びにＡ３、Ｃ１、及びＣ２ドメインを含む８０ｋＤａの軽鎖からなるヘテロ二量体が得られる（Kaufman et al., J. Biol. Chem., 263:6352-6362 [1988]）。単鎖ポリペプチド及びヘテロ二量体はいずれも不活性の前駆体として血漿中を循環する（Ganz et al., Eur. J. Biochem., 170:521-528 [1988]）。血漿中における第VIII因子の活性化はＡ２ドメインとＢドメインとの間のトロンビンの切断によって開始され、これによりＢドメインが放出され、その結果Ａ１及びＡ２ドメインからなる重鎖が生じる。タンパク質分解された第VIIIａ因子はフォンウィルブランド因子から解離する。第VIIIａ因子及び第IXａ因子を含む膜結合複合体が形成され、これが次いで凝血カスケード中の第Ｘ因子を活性化させる。血友病は、点突然変異、欠失、又はストップコドンを生じる突然変異から起こり得る（Antonarakis et al., Mol. Biol. Med., 4:81 [1987]を参照されたい）。

現在、血友病Ａは精製した第VIII因子を血液中に頻繁に注入することによって治療されている。血友病Ａを治療するこの方法は出血の頻度及び重篤度を軽減させるが、この治療は精製した第VIII因子の入手可能性及び費用、ｉｎ ｖｉｖｏにおける第VIII因子の半減期が短いこと、並びに汚染ＡＩＤＳウイルス及び肝炎ウイルスを除去する必要性によって制限されている。現在では組換え第VIII因子が利用可能であるが、この第VIII因子維持療法の形態は高価且つ慢性的である。

遺伝子治療は、血友病Ａのタンパク質注入治療に代わる魅力的な代替方法である。２つの遺伝子治療手法を用い得る。Ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療では、第VIII因子タンパク質をコードするヌクレオチド患者の細胞内に導入する。Ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療技法では、第VIII因子タンパク質をコードするヌクレオチドを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した細胞内に導入する。その後、形質転換して培養細胞を患者に再移植する。

第VIII因子の生物発生及び分泌の研究は、有意な量の第VIII因子を発現するヒト細胞系の不足により制限されている。分泌の分析は自己遺伝子の発現に限定されている。一般に、これらの研究では第VIII因子の発現レベルが低いことが示されている。例えば、Lenting et al. (1998) Blood 92:3983-3996、Connelly et al. (1996) Human Gene Therapy 7:183-195、Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 1233、Dorner et al. (1987) J. Cell Biol. 105:2665及びそれ中に引用される参考文献を参照されたい。

ヒト及びイヌ科動物の研究では、肝臓移植後に第VIII因子レベルが正常値まで上昇し、この間、第VIII因子は肝外合成されることができないことが示されている。これは、肝臓が臨床的に有意な量の第VIII因子タンパク質を合成することを示している。肝細胞が第VIII因子を発現することは当分野で周知であるが、他の種類の肝細胞が第VIII因子を合成しているかどうかは依然として議論の余地がある。総説には、いずれも本明細書中に参考として組み込まれているBloom et al. (1979) Clin. Haematol. 8:53-77及びLenting (1998) Blood 92:3983-3996を参照されたい。

血友病Ａを治療するための数多くの様々な遺伝子治療手法が現在研究されている。Ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療技法により、第VIII因子タンパク質の発現は、形質導入したｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した細胞で低く、ｉｎ ｖｉｖｏでは検出不可能であることが判明している（すべて本明細書中に参考として組み込まれている、Lynch et al. (1993) Hum. Gene Therapy 4:259；Chuah et al. (1995) Hum. Gene Ther. 6:1363；Hoeben et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:7318；Hoeben et al. (1993) Hum. Gene Ther. 4:179；Israel et al. (1990) Blood 75:1074及びvan der Eb (1996) J. Clin. Biochem. Nutr. 21: 78-80を参照されたい）。これは、より高いレベルの第VIII因子の発現を可能にする構築体を開発する必要性が存在することを示唆している。

米国特許第６２２１３４９号及び第６２００５６０号はいずれも、アデノ関連ウイルスベクター中に第VIII因子を含む遺伝子治療用の構築体を開示している。

第VIII因子の遺伝子をレトロウイルスベクター内に含めることによりしばしば低いベクター力価が生じることが文献で知られているが、これは一般に遺伝子中に転写サイレンサーが存在すること及び／又は遺伝子の上流にイントロンを欠くことに起因するとされてきた。産生細胞内で第VIII因子タンパク質が発現された結果、機能的ウイルス粒子の産生が妨害されたということは報告されていない。この分野における多数の研究を考えると、このことが以前に発見されていないことは驚くべきである。
国際公開公報ＷＯ９９／１５６８３号 国際公開公報ＷＯ００／５６９１０号 米国特許第６２２１３４９号 米国特許第６２００５６０号 Miller, 1992 Curr Top Microbiol Immunol 158:1-24 "Retroviruses"(1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 449) Lewis & Emerman 1993 J.Virol. 68, 510 Vile & Russel 1995 Brit. Med. Bull. 51, 12 Buchschacher & Panganiban 1992 J.Virol. 66, 2731 Naldini et al, 1996 Science 272, 263 Biennemann et al, 2003 Mol. Ther. 5, 588 Kaufman et al., J. Biol. Chem., 263:6352-6362 [1988] Ganz et al., Eur. J. Biochem., 170:521-528 [1988] Antonarakis et al., Mol. Biol. Med., 4:81 [1987] Lenting et al. (1998) Blood 92:3983-3996 Connelly et al. (1996) Human Gene Therapy 7:183-195 Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 1233 Dorner et al. (1987) J. Cell Biol. 105:2665 Bloom et al. (1979) Clin. Haematol. 8:53-77 Lenting (1998) Blood 92:3983-3996 Lynch et al. (1993) Hum. Gene Therapy 4:259 Chuah et al. (1995) Hum. Gene Ther. 6:1363 Hoeben et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:7318 Hoeben et al. (1993) Hum. Gene Ther. 4:179 Israel et al. (1990) Blood 75:1074 van der Eb (1996) J. Clin. Biochem. Nutr. 21: 78-80

本発明は、１つの目的ヌクレオチド（ＮＯＩ、nucleotide of interest）、さらには複数のＮＯＩの効率的な発現を、１つ若しくは複数の標的部位においてもたらすことができる新規レトロウイルスベクターを提供することを目的とする。

本発明はまた、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用の安全機能を組み入れており、１つのＮＯＩ、さらには複数のＮＯＩの効率的な発現を、１つ若しくは複数の標的部位においてもたらすことができる、ウイルス粒子ベクターの力価を効率的に調製する新規の系を提供することを目的とする。

一実施形態では、本発明のベクターは血友病を治療するために用いることができる。詳細には、本発明は、レンチウイルスに基づいた第VIII因子の発現ベクターを、有効な遺伝子治療のために十分高い力価で産生することができるような方法を提供する。別の態様では、本発明は、組織特異的なプロモーター（例えば肝臓に特異的なプロモーター）の下で第VIII因子が発現されることを可能にする。

本発明の一態様によれば、本発明は、目的ヌクレオチド（ＮＯＩ）を所望の標的部位へ送達することができるレンチウイルスベクターを提供し、ＮＯＩは第VIII因子をコードし、第VIII因子は所望の標的部位でのみ発現される。

本発明の別の態様によれば、本発明は、第VIII因子をコードし、且つそれを発現させることができるヌクレオチド配列を含むレトロウイルスベクターを提供し、ヌクレオチド配列は組織特異的なプロモーターに作動可能に連結している。

ｃＤＮＡを哺乳動物細胞内に形質移入した後の第VIII因子の発現は、一般に他の遺伝子で得られるものよりも２〜３桁少ないと報告されている。Kaufman et al (1989 Mol. Cell Biol. 9: 1233-42)は、これについて３つの異なる理由を報告している：
１．第VIII因子のｍＲＮＡの発現が非効率的であること。

２．小胞体からゴルジ体への一次翻訳産物の輸送が非効率的であること。

３．タンパク質の安定した蓄積を促進するために高レベルのフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ、von Willebrands' Factor）が必要であること。

形質移入した細胞における第VIII因子のｍＲＮＡの蓄積を制限し得る、転写の減衰を含めた様々な要因が提案されている（Hoeben et al 1995 Blood 85: 2447-54；Koeberl et al 1995 Human Gene Ther. 6: 469-79；Fallaux et al 1996 Mol. Cell Biol. 16: 4264-72）。しかし、Kaufman et al (1989、同書)は、速度を制限する主要な工程は転写後のレベルであることを提案した。第VIII因子の上流にイントロンを含めることは、発現を顕著に向上させることが判明している（Chuah et al 1995 Human Gene Ther. 6: 1363-77；Dwarki et al 1995 Proc Natl Acad Sci. USA 92: 1023-7；Chuah et al 1998 Human Gene Ther. 9: 353-65；VandenDriessche et al 1999 Proc Natl Acad Sci. USA 96: 10379-84）。

本発明の別の態様によれば、本発明は、哺乳動物細胞における効率的な発現のためにコドンが最適化されている、第VIII因子をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。

第VIII因子の遺伝子のコドンを最適化する理論的根拠は、翻訳効率を向上させることであった。阻害要素の排除による第VIII因子ｍＲＮＡの蓄積の顕著な増強は、この戦略は以前に試みられ、成功しなかったことから可能性が低いと考えられていた：推定上の１．２ｋｂの阻害領域の保存的突然変異誘発では、第VIII因子の発現を顕著に増加させることに成功しなかった（Chuah et al 1995、同書）。実際、転写阻害要素の存在自体が疑問視されている（Kaufman, 1999 Human Gene Ther. 10: 2091-107）。コドンの最適化により、ＨＩＶ−１ ＧａｇＰｏｌ（Kotsopoulou et al 2000 J. Virol. 74: 4839-52）及びＣｒｅリコンビナーゼ（Koresawa 2000 Transplant Proc. 32: 2516-7）などのウイルス、細菌、例えばテトラサイクリンリプレッサー（Wells 1999 Transgenic Res. 8: 371-81）、並びにオワンクラゲ（Aequorea Victoria）由来の緑色蛍光タンパク質（Haas et al 1996 Curr Biol. 6: 315-24）から遺伝子の発現を向上させることに非常に成功している。これらの生物は哺乳動物から高度に分岐しているので、高度に発現されるヒトタンパク質のコドンの偏りに同調するようにこれらの遺伝子を再操作することにより、相当な発現の向上が生じることが期待され得る。哺乳動物の遺伝子は、例えば大腸菌由来の遺伝子ほど重大なコドンの偏りを示さない。

それでもやはり、発現が乏しい遺伝子であるので、本発明者らは第VIII因子の遺伝子のコドンを再操作することを決定した。第VIII因子のｍＲＮＡの翻訳効率は、試験した２つの別のｍＲＮＡ、すなわちｖＷＦ及びジヒドロ葉酸還元酵素（Kaufman et al, 1989、同書）の翻訳効率に匹敵することが以前に判明しているので、遺伝子発現の増強は控えめである可能性が高いと予測されていた。それにもかかわらず、この遺伝子の発現の向上はいくらであっても血友病Ａの遺伝子治療法の開発に有用となるので、これは労力をかける価値がある手法であると考えた。

驚くべきことに、本発明者らは、コドンの最適化により第VIII因子の発現が約２０倍向上することを発見した。この向上の規模は、以下の観点から驚くべきである：
１．第VIII因子はヒト遺伝子であり、利点が生じても、ウイルス若しくは細菌の遺伝子、又は異なる種由来の遺伝子の再操作と比較して控えめであると予測されていた。

２．以前の同様の戦略（ｃＤＮＡのほぼ四分の一の保存的突然変異誘発）では発現の向上が成功していなかった。

３．ｍＲＮＡの翻訳が研究されており、非効率的であることは判明していなかった。

高度に好ましい実施形態では、コドンの最適化は、高度に発現されるヒト遺伝子のコドン使用頻度に基づく（Haas et al 1996, Curr. Biol. 6, 315）。図１５に示した第VIII因子の遺伝子の表を参照されたい。コドンを最適化した第VIII因子の遺伝子の好ましい実施形態を図１９及び図２１に示した（塩基２０〜７０７２）。

本発明の別の態様によれば、本発明は、第１の目的ヌクレオチド（ＮＯＩ）を送達する能力を有し、且つレトロウイルスプロベクターから誘導可能なレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスプロベクターは、内部プロモーターに作動可能に連結している第１のＮＯＩ、及び第２のＮＯＩがスプライシングされて除去されることができるように第１のＮＯＩと内部プロモーターとの間に第２のＮＯＩを含み、プロモーター、第１のＮＯＩ及び第２のＮＯＩは逆相補的配向にあり、任意選択で第２のＮＯＩは第１のＮＯＩに対してフレーム外にある、レトロウイルスベクターを提供する。

好ましい実施形態では、組織特異的なプロモーターに作動可能に連結している、コドンを最適化した第VIII因子及び／又は第VIII因子と共に用いるウイルスベクターのゲノムは、以下の特徴の少なくとも１つ又は複数を有する：
１．ＷＰＲＥが存在する
２．主要なスプライスドナーが突然変異している
３．Ｔａｔ ＯＲＦが部分的に破壊されている
４．上流ＯＲＦからの読み過ごしの可能性を最小限にするために、第VIII因子のＯＲＦをフレーム外にクローニングし得る。

本発明は、治療遺伝子を発現させずにパッケージング細胞内で組換えベクターの産生を可能にする、ベクター構築体に関する。これは、好ましくはフレーム外にある、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム、open reading frame）又は少なくともその一部を含むイントロンを、任意選択でそれ自身のプロモーターと共に、そのプロモーターと治療遺伝子との間に挿入することによって果たす。ＯＲＦは、それだけには限定されないが、ｌａｃＺ及びＧＦＰなどのレポーター遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を含めた任意の遺伝子をコードしていてよい。ＯＲＦも逆相補的配向にあり、これは内部プロモーターの下流で最初に遭遇するＯＲＦであるので、翻訳機構によって治療遺伝子の前に翻訳される。翻訳は、ＯＲＦの最後で、ストップシグナルの位置で停止する。治療遺伝子の発現の可能性をさらに最小限にするために、ポリアデニル化シグナル（やはりイントロン内にある）を第１のＯＲＦの後に付加し得る。これにより、翻訳停止及びこの点以降の逆相補鎖の転写の低減が補助される。

第１のＮＯＩが標的細胞内で発現されるためには、ベクターゲノム転写物中でイントロン内のＯＲＦが取り除かれている必要がある。これは、パッケージングの前にゲノム転写物のスプライシングを行うために、この領域中に隣接してスプライスドナー及びスプライスアクセプター部位が正しい配向で存在することによって保証される。ｒｅｖが存在する場合は、イントロンは位置が変わらない。ｒｅｖが存在しない場合は、イントロンはスプライシングされて除去され、したがってＯＲＦも取り除かれる。後者で形質導入した標的細胞では、治療遺伝子は正常どおり発現される。言い換えれば、この戦略は、ｒｅｖの非存在下でベクターを産生させる能力を利用している。ＯＲＦにコードされているタンパク質は産生細胞中で発現され、治療遺伝子は発現されない。しかし、ＯＲＦはパッケージングの前にゲノム転写物からスプライシングされて除去される。第１のＯＲＦがゲノム転写物からスプライシングされて除去されるので、治療遺伝子は組込み後、形質導入した細胞中で発現される。

本発明によれば、それぞれのＮＳは任意の適切なヌクレオチド配列であることができる。例えば、それぞれの配列は、独立して、合成によって調製し得るか、組換えＤＮＡ技術を用いることによって調製し得るか、天然源から単離し得るか、又はそれらの組合せであり得る、ＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。配列はセンス配列又はアンチセンス配列であり得る。互いに直接若しくは間接的に結合されていてもよい、又はその組合せでもよい、複数の配列が存在していてもよい。

第２のＮＯＩは、レトロウイルスベクターでの使用が成功している以下の選択マーカーのうち任意の１つ又は複数を含み得る：それぞれＧ４１８及びハイグロマイシンに対する耐性を与える細菌性ネオマイシン及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Palmer et al 1987 Proc Natl Acad Sci 84: 1055-1059；Yang et al 1987 Mol Cell Biol 7: 3923-3928）；メトトレキサートに対する耐性を与えるマウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）突然変異体（Miller et al 1985 Mol Cell Biol 5: 431-437）；細胞がミコフェノール酸、キサンチン及びアミノプテリンを含む培地中で増殖することを可能にする細菌性ｇｐｔ遺伝子（Mann et al 1983 Cell 33: 153-159）；細胞がヒスチジンを含まないがヒスチジノールを含む培地中で増殖することを可能にする細菌性ｈｉｓＤ遺伝子（Danos及びMulligan 1988 Proc Natl Acad Sci 85: 6460-6464）；様々な薬物に対する耐性を与える多剤耐性遺伝子（ｍｄｒ）（Guild et al 1988 Proc Natl Acad Sci 85: 1595-1599；Pastan et al 1988 Proc Natl Acad Sci 85: 4486-4490）並びにプロマイシン又はフレオマイシンに対する耐性を与える細菌性遺伝子（Morgenstern及びLand 1990 Nucleic Acid Res 18: 3587-3596）。

これらのマーカーはすべて優性選択マーカーであり、これらの遺伝子を発現するほとんどの細胞の化学的選択を可能にする。ＧＦＰ／β−ガラクトシダーゼも優性マーカーとみなすことができる。ＧＦＰ／β−ガラクトシダーゼを発現する細胞は、蛍光活性化細胞分取器を用いて選択することができる。実際、任意の細胞表面タンパク質が、このタンパク質を既に産生していない細胞の選択マーカーを提供することができる。このタンパク質を発現する細胞は、このタンパク質に対する蛍光抗体及び細胞分取器を用いて選択することができる。ベクターに含まれたことのある他の選択マーカーには、細胞がヒポキサンチン、アメトプテリン及びチミジンを含む培地で増殖することを可能にするｈｐｒｔ及びＨＳＶチミジンキナーゼが含まれる。

第２のＮＯＩは、第１のＮＯＩがパッケージング細胞内で翻訳されないようにするが（例えばポリアデニル化シグナル）、形質導入の後それがスプライシングによって取り除かれた場合、その後に第１のＮＯＩは機能的発現のために露呈される非コード配列を含むことができる。

第２のＮＯＩは、産生系の複雑性を軽減することができる、Ｅｎｖタンパク質をコードするｅｎｖなどのウイルスの必須要素もコードしていてよい。

適切な第１のＮＯＩのコード配列には、それだけには限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、操作した免疫グロブリン様分子、単鎖抗体、融合タンパク質、酵素、免疫共刺激分子、免疫調節分子、抗センスＲＮＡ、標的タンパク質のトランス優性（transdominant）陰性突然変異体、毒素、条件付毒素、抗原、腫瘍抑制タンパク質及び成長因子、膜タンパク質、血管作用性タンパク質及びペプチド、抗ウイルスタンパク質及びリボザイム、並びにそれらの誘導体（レポーターグループと会合しているものなど）をコードする配列などの、治療的及び／又は診断的用途のものが含まれる。

第１のＮＯＩのコード配列は、コード配列の融合タンパク質又はセグメントをコードしていてもよい。

以降、本発明の様々な好ましい特徴及び実施形態を非限定的な例によって説明する。

本発明の実施には、別段に指定しない限りは、当業者の能力範囲にある化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ学及び免疫学の慣用技術を用いる。このような技術は文献中に説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements； Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)；B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons；J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice； Oxford University Press； M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press；並びにD. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Pressを参照されたい。これら一般的な書籍のそれぞれは本明細書中に参考として組み込まれている。

第VIII因子の遺伝子
本発明は、好ましくはヒト第VIII因子又はその相同体若しくは機能的な誘導体を生じさせる治療的ＮＯＩの使用を含む。機能的なヒト第VIII因子の配列は米国特許第５，６１８，７８８号から得られる。

一実施形態では、本発明者らは、完全長のコドンを最適化した第VIII因子の遺伝子を構築した。

Ｂ−ドメインが欠失した第VIII因子の遺伝子の誘導体、すなわちそれに帰する必須の機能がないＢ−ドメイン分子が欠失しており、本発明で用い得る誘導体がいくつか存在する。

一実施形態では、本発明者らの合成遺伝子は、生化学的によく特徴づけられている「ＬＡ」型に基づく（Pittman et al 1993）。野生型及びコドンを最適化した遺伝子の比較を可能にするために、この構築体の前駆体であるpDGR-2（Toole et al 1986）をＬＧＣ（ＡＴＣＣ＃５３１００）から注文した。２つの遺伝子のコドンを最適化した型及び野生型をどちらも構築した。

別の実施形態では、本発明者らは、この合成遺伝子から重複（overlapping）ＰＣＲによってより短い「ＳＱ」型を構築した。

第VIII因子のＢ−ドメインに隣接するアミノ酸配列を図３に示した。

コドンを最適化した第VIII因子のヌクレオチド配列の例を図１９及び図２１に示した（塩基２０〜７０７２を参照されたい）。

組織特異的なプロモーターを用いたゲノムの構築
肝臓に特異的なプロモーター
ヒトα_１−抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターは、肝臓に特異的な強力なプロモーターとみなされている。最近の研究では、アルブミン、ヒトα_１−抗トリプシン及びヘモペキシンのプロモーター（単独で及びエンハンサー領域と組み合わせて）を、水力学的送達によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで及びマウス内で試験した（Kramer et al 2003、同書）。長期的な研究（５０日間）からのｉｎ ｖｉｖｏデータにより、ヒトα_１−抗トリプシンプロモーターは安定したレベルのレポーター遺伝子の発現を生じさせることが示された。ｈＡＡＴ、ネズミアルブミン、ラットホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ、phosphoenolpyruvate carboxykinase）及びラット肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーターをレトロウイルスベクターとの関係で比較した初期の研究では、ｈＡＡＴプロモーターが最も高い発現をもたらすことが判明している（Hafenrichter et al 1994 Blood 84: 3394-404）。しかし、前述の肝臓プロモーターのうち任意のものを用い得る。

試験用にｈＡＡＴプロモーターを選択した。このプロモーターは、Kramer et al 2003、同書に記載のプライマーに基づくが、一部改変を加えたプライマーを用いて、ＰＣＲによってＨＴ１０８０ゲノムＤＮＡからクローニングした。用いたプライマーは以下のとおりである：
（制限部位及びオーバーハングを含む）：
HAATN: TATGAGCGGCCGCGTACCCGCCACCCCCTCCACCTTGG
（ＮｏｔＩ部位を含む）
HAATP: ATCATGCACGTGTTCACTGTCCCAGGTCAGTGGTG
（ＰｍｌＩ部位を含む）
プロモーターの模式図を図４に示した。

また、ヒト血清アルブミンエンハンサー、ヒトプロトロンビンエンハンサー、α−１ミクログロブリンエンハンサー及びイントロンアルドラーゼエンハンサーなどの肝臓に特異的なエンハンサー要素も用い得る。本発明で用いる組織特異的なプロモーターには、それだけには限定されないが、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ、apolipoprotein E）由来の肝部制御領域の遺伝子（ＨＣＲ、hepatic locus control region）、肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ、hepatitis B virus）エンハンサー２要素及びアルブミンエンハンサーなどの１つ又は複数のエンハンサーが含まれ得る。

内皮に特異的なプロモーター
いくつかの出版物が、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１（Ｆｌｔ−１／ＶＥＧＦ受容体−１）、細胞間接着分子−２（ＩＣＡＭ−２、intercellular adhesion molecule-2）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）、ＶＥＧＦ受容体−２（Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）、エンドグリン（Nicklin et al 2001 Hypertension 38: 65-70；Kappel et al 1999 Blood 93:4284-92；Cowan et al 1998 J. Biol Chem. 273: 11737-44；Velasco et al 2001 Gene Ther. 8:897-904）並びにｔｉｅ１及びｔｉｅ２などのｔｉｅプロモーター（Korhonen et al 1 Blood 86:1828-35）を含めた、本発明で用い得る内皮に特異的なプロモーターの分析について記載している。

ＩＣＡＭ−２プロモーターは、Nicklin et al 2001、同書に記載のものに基づいたプライマーを用いて、２９３ＴゲノムＤＮＡから増幅し得る。

産生細胞における導入遺伝子の発現の防止
高度に好ましい実施形態では、Ｂ−ドメインが欠失した第VIII因子の遺伝子を、本発明の第１の態様のベクター内に、ヒトα１抗トリプシン（ｈＡＡＴ、human alpha one antitrypsin）肝臓特異的プロモーターの制御下で挿入した。これにより、血友病緩和させるための遺伝子治療で使用するのに十分に高い力価でベクターを産生させることが可能となった。産生細胞中における第VIII因子の発現によって引き起こされるベクター産生の問題を迂回すること。

産生細胞中での第VIII因子の発現は力価を低下させていると思われるので、これらの細胞中での発現を妨げる代替戦略が考案された。この戦略では、Ｒｅｖの非存在下で新しい世代のＥＩＡＶベクターを産生させる能力を活用する。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を内部プロモーターと治療遺伝子との間に挿入する。これらはすべて逆配向にある。したがって、このＯＲＦにコードされているタンパク質は産生細胞中で発現され、治療タンパク質は発現されない。ＯＲＦ及びそのポリアデニル化シグナルは、（Ｒｅｖの非存在下で）パッケージングの前にゲノム転写物からスプライシングされて除去されるようにイントロン内に含まれている。これを図１に示した。

第１のＯＲＦはゲノム転写物からスプライシングされて除去されているので、組込み後には形質導入した細胞中で治療遺伝子が発現される（図２）。

この戦略を試験するために、図１に示す、ＬａｃＺ及びＧＦＰレポーター遺伝子を含むベクターを構築した。これらのベクターを用いることで、ＬａｃＺタンパク質の発現は産生細胞中では最小限であるが、形質導入後には高レベルの発現が得られる。

レトロウイルス
当分野では周知のように、ベクターとは、実体が１つの環境から別の環境へと移動することを可能にする又は容易にするツールである。本発明によれば、例として、組換えＤＮＡ技術で用いる一部のベクターは、ＤＮＡセグメント（異種ｃＤＮＡセグメントなどの異種ＤＮＡセグメント等）などの実体を、ＤＮＡセグメントを含むベクターを複製することを目的として宿主細胞内に移動することを可能にする。組換えＤＮＡ技術で用いるベクターの例には、それだけには限定されないが、プラスミド、染色体、人工染色体又はウイルスが含まれる。

用語「発現ベクター」とは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｅｘ ｖｉｖｏの発現が可能な構築体を意味する。

本発明の態様で用いるレトロウイルスベクターは、任意の適切なレトロウイルスに由来する、又はそれから誘導可能であり得る。多数の様々なレトロウイルスが同定されている。例には、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ、murine leukemia virus）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ、human immunodeficiency virus）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ、human T-cell leukemia virus）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ、mouse mammary tumour virus）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ、Rous sarcoma virus）、藤浪肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ、Fujinami sarcoma virus）、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ、Moloney murine leukemia virus）、ＦＢＲネズミ骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ、FBR murine osteosarcoma virus）、モロニーネズミ肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ、Moloney murine sarcoma virus）、アベルソンネズミ白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ、Abelson murine leukemia virus）、トリ骨髄球腫症ウイルス−２９（ＭＣ２９、Avian myelocytomatosis virus-29）、及びトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ、Avian erythroblastosis virus）が含まれる。レトロウイルスの詳細なリストはCoffin et al., 1997, "retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763に見つかり得る。

レトロウイルスは大きく２つにすなわち、「単純」及び「複合」に分類し得る。レトロウイルスは、さらに７つの群に分類し得る。これらの群のうち５つは、発癌の潜在性を有するレトロウイルスを表す。残りの２つの群はレンチウイルス及びスプマウイルスである。これらレトロウイルスの総説は、Coffin et al., 1997 (同書)に示されている。

本発明の方法で用いるための典型的なベクターでは、複製に必須の１つ又は複数のタンパク質コード領域の少なくとも一部をウイルスから取り除き得る。これにより、ウイルスベクターは複製に欠陥をもつこととなる。また、標的の非分裂宿主細胞に形質導入することができる且つ／又はそのゲノムを宿主ゲノム内に組み込ませることができる候補の変調部分を含むベクターを産生させるために、ウイルスゲノムを、部分的に、調節性の制御領域に作動可能に連結している候補の変調部分とベクターゲノム内のレポーター部分ｔｐをコードするライブラリで置き換えてもよい。

好ましくは、標的の非分裂細胞又は分裂が遅い細胞に形質導入することができるウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。

レンチウイルスベクターは、レトロウイルスベクターのより大きな群の一部である。レンチウイルスの詳細なリストは、Coffin et al ("Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763)に見つかり得る。手短に述べると、レンチウイルスは霊長類群及び非霊長類群に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例には、それだけには限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト自己免疫不全症（ＡＩＤＳ、auto-immunodeficiency syndrome）の原因物質、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ、simian immunodeficiency virus）が含まれる。非霊長類レンチウイルス群には、プロトタイプ「遅発性ウイルス」のビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ、visna/maedi virus）、並びにそれに関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ、caprine arthritis-encephalitis virus）、ウマ科動物伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ、equine infectious anaemia virus）、さらにより最近になって記述されているネコ科動物免疫不全ウイルス（ＦＩＶ、feline immunodeficiency virus）及びウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ、bovine immunodeficiency virus）が含まれる。

レンチウイルスファミリーと他の種類のレトロウイルスとの差異は、レンチウイルスは分裂細胞及び非分裂細胞のどちらにも感染する能力を有することである（Lewis et al 1992 EMBO. J 11: 3053-3058；Lewis and Emerman 1994 J. Virol. 68: 510-516）。対照的に、ＭＬＶなどの他のレトロウイルスは、例えば筋肉、脳、肺及び肝臓組織を構成する非分裂細胞又は分裂が遅い細胞に感染することができない。

本明細書中において本発明の一部の態様で使用する「非霊長類」ベクターとは、主として霊長類、特にヒトに感染しないウイルス由来のベクターをいう。したがって、非霊長類ウイルスベクターには、犬、羊及び馬、爬虫類、鳥並びに昆虫などの非霊長類哺乳動物に感染するベクターが含まれる。

本明細書中で使用するレンチウイルスの（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ベクター又はレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）ベクターとは、レンチウイルスから誘導可能な構成成分を少なくとも１つ含むベクターである。好ましくは、その構成成分は、ベクターが細胞に感染する、遺伝子を発現する、又は複製される生物学的機構に関与している。用語「誘導可能」は、配列は必ずしもレトロウイルスから得られる必要はないが、それから誘導することができるという意味で、通常の感覚で使用される。例として、配列は合成によって又は組換えＤＮＡ技術を用いることによって調製し得る。

非霊長類レンチウイルスは、自然には霊長類に感染しないレンチウイルス科の任意のメンバーであり得、ネコ科動物免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、マエディビスナウイルス（ＭＶＶ、Maedi visna virus）又はウマ科動物伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）が含まれ得る。好ましくは、レンチウイルスはＥＩＡＶである。ウマ科動物伝染性貧血ウイルスはすべてのウマ科動物に感染し、血漿ウイルス血症及び血小板減少症を生じさせる（Clabough, et al. 1991. J Virol. 65:6242-51）。ウイルスの複製は、単球からマクロファージへの成熟過程によって制御されていると考えられている。

一実施形態では、ウイルスベクターはＥＩＡＶ由来である。ＥＩＡＶはレンチウイルスの最も単純なゲノム構造を有しており、本発明での使用に特に好ましい。ＥＩＡＶは、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子に加えて３つの他の遺伝子、すなわちｔａｔ、ｒｅｖ、及びＳ２をコードする。ＴａｔはウイルスのＬＴＲの転写活性化剤として作用し（Derse及びNewbold 1993 Virology. 194:530-6；Maury, et al 1994 Virology. 200:632-42）、Ｒｅｖはｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ、rev-response element）によってウイルス遺伝子の発現を調節及びコーディネートする（Martarano et al 1994 J Virol. 68:3102-11）。これら２つのタンパク質の作用機構は、霊長類ウイルスの類似機構に大まかに似ていると考えられている（Martano et al 同書）。Ｓ２の機能は知られていない。さらに、ＥＩＡＶタンパク質であるＴｔｍが同定されており、これは、膜貫通タンパク質の開始点にあるｅｎｖコード配列までスプライシングされたｔａｔの第１のエクソンによってコードされている。

プロテアーゼ、逆転写酵素及びインテグラーゼに加えて、非霊長類レンチウイルスはｄＵＴＰａｓｅをコードする第４のｐｏｌ遺伝子産物を含む。このことは、これらのレンチウイルスが特定の非分裂細胞種に感染する能力において役割を果たしているかもしれない。

本発明のこの態様のウイルスＲＮＡは、ウイルス又は非ウイルスの起源であり得るが、哺乳動物細胞などの真核細胞中で発現を指揮することができるプロモーターから転写される。任意選択で、エンハンサーをプロモーターの上流又は下流のどちらかに付加する。ＲＮＡの転写は、レンチウイルスの３’ＬＴＲ中に提供され得るポリアデニル化部位、又は異なるポリアデニル化シグナルで停止する。

したがって、本発明は、プロモーターと、任意選択で、非霊長類レンチウイルスベクターゲノムの発現を指揮することができるエンハンサーとを含むＤＮＡ転写単位を用いる。

本明細書中に記載した転写単位は、転写されることができる配列を含む核酸の領域を含む。したがって、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｒＲＮＡをコードする配列がこの定義内に含まれる。配列は、プロモーターに対してセンス方向又はアンチセンス方向であり得る。アンチセンス構築体は、周知の技術に従って細胞内での遺伝子の発現を阻害するために用いることができる。核酸は、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ、ribonucleic acid）若しくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ、deoxyribonucleic acid）又はその類似体であり得る。ｍＲＮＡをコードする配列は、任意選択で、翻訳されたコード配列と天然に又は他の方法で会合している５’及び／若しくは３’の転写されているが翻訳されていないフランキング配列の一部或いは全体を含む。この配列は、通常は転写された配列、例えば転写ストップシグナル、ポリアデニル化部位及び下流のエンハンサー要素と会合している、配列と会合した転写制御配列をさらに含み得る。核酸はｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ（イントロンを含み得る）を含み得る。

レトロウイルスゲノムの基本構造は５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲであり、その間又は内部にゲノムのパッケージングを可能にするパッケージングシグナル、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノム内への組込みを可能にする組込み部位、並びにパッケージング成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子（これらはウイルス粒子の組立てに必要なポリペプチドである）が位置する。より複合的なレトロウイルスは、組み込まれたプロウイルスのＲＮＡ転写物が感染した標的細胞の核から細胞質へと効率的に輸出されることを可能にするＨＩＶ中のｒｅｖ及びＲＲＥ配列などの、さらなる特徴を有する。

プロウイルス内では、これらの遺伝子の両末端に末端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれる領域が隣接している。ＬＴＲはプロウイルスの組込み及び転写を司っている。ＬＴＲはまた、エンハンサー−プロモーター配列としての役割も果たし、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。レトロウイルスＲＮＡのキャプシド形成は、ウイルスゲノムの５’末端に位置するｐｓｉ配列に基づいて起こる。

ＬＴＲ自体は、Ｕ３、Ｒ及びＵ５と呼ばれる３つの要素に分割することができる同一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に独特な配列に由来する。ＲはＲＮＡの両末端で繰り返される配列に由来し、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に独特な配列に由来する。３つの要素の大きさは、様々なレトロウイルス間で大幅に変化することができる。

欠陥をもつレトロウイルスベクターゲノムでは、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖは存在しないか、又は機能的でないかもしれない。ＲＮＡの両末端にあるＲ領域は反復配列である。Ｕ５及びＵ３はそれぞれＲＮＡゲノムの５’及び３’末端の独特の配列を表す。

本発明の一態様によって使用する好ましいベクターは、組換え非霊長類レンチウイルスベクターである。

用語「組換えレンチウイルスベクター」（ＲＬＶ、recombinant lentiviral vector）とは、パッケージング成分の存在下で、標的細胞に感染することができるウイルス粒子内へのＲＮＡゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なレトロウイルスの遺伝情報を有するベクターをいう。標的細胞の感染には、逆転写及び標的細胞ゲノム内への組込みが含まれる。ＲＬＶは、ベクターによって標的細胞内へ送達する非ウイルス性のコード配列を保有する。ＲＬＶは、最終標的細胞内で独立に複製して感染性レトロウイルス粒子を産生することができない。通常、ＲＬＶは機能的なｇａｇ−ｐｏｌ及び／若しくはｅｎｖ遺伝子並びに／又は複製に必須の他の遺伝子を欠く。本発明のベクターはスプリットイントロンベクターとして構成し得る。スプリットイントロンベクターは、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／１５６８３号に記載されている。

好ましくは、本発明のレンチウイルスベクターは最小限のウイルスゲノムを有する。

本明細書中で使用する用語「最小限のウイルスゲノム」とは、非必須要素が取り除かれ、目的のヌクレオチド配列を標的宿主細胞に感染させる、形質導入する、及び送達するために必要な機能を提供するための必須要素が保持されるよう、ウイルスベクターを操作したこと意味する。この戦略に関するさらなる詳細は、本発明者らの国際公開公報ＷＯ９８／１７８１５号に見つけることができる。

したがって、本発明で使用するための最小限のレンチウイルスゲノムは、（５’）Ｒ−Ｕ５−１つ又は複数の第１のヌクレオチド配列−Ｕ３−Ｒ（３’）を含む。しかし、宿主細胞／パッケージング細胞内でレンチウイルスゲノムを産生させるために用いたプラスミドベクターは、宿主細胞／パッケージング細胞内でのゲノムの転写を指揮するために、レンチウイルスゲノムに作動可能に連結している転写調節制御配列も含む。これらの制御配列は、転写されたレトロウイルスの配列に会合した天然配列、すなわち５’Ｕ３領域であるか、又は別のウイルスのプロモーター、例えばＣＭＶプロモーターなどの異種プロモーターであり得る。一部のレンチウイルスゲノムは、効率的にウイルスを産生するために追加の配列を必要とする。例えば、ＨＩＶの場合、ｒｅｖ及びＲＲＥ配列が含まれることが好ましい。しかし、ｒｅｖ及びＲＲＥの必要性は、コドンの最適化によって軽減又は排除され得る。この戦略のさらなる詳細は、本発明者らの国際公開公報ＷＯ０１／７９５１８号に見つけることができる。ｒｅｖ／ＲＲＥ系と同じ機能を行う代替配列も知られている。例えば、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の機能的な類似体がメーソンファイザー（Mason Pfizer）サルウイルス中に見つかる。これはＣＴＥとして知られており、ゲノム中にＲＲＥ型の配列を含み、感染した細胞内で因子と相互作用すると考えられている。細胞性因子はｒｅｖ類似体とみなすことができる。したがって、ＣＴＥをｒｅｖ／ＲＲＥ系の代替法として用い得る。知られている、又は利用可能となる任意の別の機能的な均等物が本発明に関連し得る。例えば、ＨＴＬＶ−ＩのＲｅｘタンパク質をＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質で機能的に置き換えることができることも知られている。また、Ｒｅｖ及びＲｅｘがＩＲＥ−ＢＰに対して同様の効果を有することも知られている。

本発明の一実施形態では、レンチウイルスベクターは自己失活ベクターである。

例として、３’ＬＴＲのＵ３領域中の転写エンハンサー又はエンハンサー及びプロモーターを欠失させることによって、自己失活レトロウイルスベクターを構築した。一回りのベクターの逆転写及び組込みののち、これらの変更が転写を失活させたプロウイルスを産生する５’及び３’ＬＴＲの両方にコピーされる（Yu et al 1986 Proc Natl Acad Sci 83: 3194-3198；Dougherty及びTemin 1987 Proc Natl Acad Sci 84: 1197-1201；Hawley et al 1987 Proc Natl Acad Sci 84: 2406-2410；Yee et al 1987 Proc Natl Acad Sci 91: 9564-9568）。しかし、このようなベクター中のＬＴＲの内部にある任意のプロモーター（又は複数のプロモーター）は、それでも転写が活性である。この戦略は、内部に配置された遺伝子からの転写に対する、ウイルスのＬＴＲ中のエンハンサー及びプロモーターの効果を排除するために用いた。そのような効果には、転写の増加（Jolly et al 1983 Nucleic Acids Res 11: 1855-1872）又は転写の抑制（Emerman及びTemin 1984 Cell 39: 449-467）が含まれる。また、この戦略は、３’ＬＴＲからゲノムＤＮＡへの下流転写を排除するためにも用いることができる（Herman及びCoffin 1987 Science 236: 845-848）。これは、内在性発癌遺伝子の偶発的な活性化を防ぐことが非常に重要であるヒトの遺伝子治療において特に関心がもたれる。

本発明者らの国際公開公報ＷＯ９９／３２６４６号では、本発明者らは、本発明に有利に適用し得る特徴の詳細を示している。詳細には、非霊長類レンチウイルスゲノムは、（１）好ましくはｇａｇ遺伝子が欠失しており、ｇａｇの欠失により、ｇａｇコード配列のヌクレオチド約３５０又は３５４の下流の１つ若しくは複数のヌクレオチドが取り除かれている；（２）好ましくは非霊長類レンチウイルスゲノムから１つ又は複数のアクセサリー遺伝子が欠如している；（３）好ましくはｔａｔ遺伝子を欠くが、５’ＬＴＲの末端とｇａｇのＡＴＧとの間にリーダー配列を含む；並びに（４）（１）、（２）及び（３）の組合せであることを理解されたい。特に好ましい実施形態では、レンチウイルスベクターは（１）及び（２）及び（３）の特徴すべてを含む。

非霊長類レンチウイルスベクターは標的化ベクターであり得る。用語「標的化ベクター」とは、細胞に感染／形質移入／形質導入する能力、又は宿主細胞及び／若しくは標的細胞中で発現される能力が、宿主生物中の特定の細胞種、通常は共通の又は類似した表現型を有する細胞に制限されているベクターをいう。

発現は、プロモーター／エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含めた制御配列を用いて制御し得る。原核細胞プロモーター及び真核細胞中で機能的なプロモーターを用い得る。組織特異的又は刺激特異的なプロモーターを用い得る。２つ以上の異なるプロモーター由来の配列要素を含むキメラプロモーターも用い得る。

適切なプロモーター配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ、cytomegalovirus）、レトロウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０、Simian Virus 40）などのウイルスゲノム由来のもの、又はアクチンプロモーター若しくはリボソームタンパク質プロモーターなどの異種の哺乳動物プロモーター由来のものを含めた強力なプロモーターである。遺伝子の転写は、ベクター内にエンハンサー配列を挿入することによってさらに増大させ得る。エンハンサーは配向及び位置に比較的非依存的であるが、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）及びＣＭＶ初期プロモーターエンハンサーなどの真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを用いてもよい。エンハンサーはプロモーターの５’又は３’側の位置でベクター内へとスプライシングされ得るが、プロモーターの５’側の部位に位置することが好ましい。

プロモーターはさらに、適切な宿主中での発現を確実にする又は増加させるさらなる特徴を含むことができる。例えば、その特徴は、保存的領域、例えばプリブノーボックス又はＴＡＴＡボックスであることができる。プロモーターはさらに、ヌクレオチド配列の発現レベルに影響を与える（維持する、増強する、低減させる）ために、他の配列も含み得る。適切な他の配列には、Ｓｈ１−イントロン又はＡＤＨイントロンが含まれる。他の配列には、温度、化学、光、又はストレス誘導要素などの誘導要素が含まれる。また、転写又は翻訳を増強させる適切な要素を存在させてもよい。

本発明の発現ベクターは、シグナル配列と目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結しているアミノ末端ｔａｇ配列とを含む。

本発明の特に好ましい実施形態では、ＮＯＩが第VIII因子をコードする場合、上述の組織特異的なプロモーターを用いる。

産生／パッケージング細胞系を用いることによって、多量のレトロウイルスベクター粒子を増殖及び単離して（例えばレトロウイルスベクター粒子の適切な力価を調製する）、次いで例えば目的部位（成人の脳組織など）への形質導入を行うことが可能である。大規模な産生又はベクター粒子には通常産生細胞系の方がよい。

一過性の形質移入には、パッケージング細胞法を超える数々の利点がある。この点に関して、一過性の形質移入では、安定したベクター産生細胞系の作製により長い時間が必要とされることが回避され、ベクターゲノム又はレトロウイルスのパッケージング成分が細胞に毒性である場合に用いる。ベクターゲノムが、細胞周期の阻害剤やアポトーシスを誘導する遺伝子などの、毒性遺伝子又は宿主細胞の複製を妨害する遺伝子をコードする場合、安定したベクター産生細胞系の作製は困難であるかもしれないが、一過性の形質移入を用いると、細胞が死滅する前にベクターを産生させることができる。また、一過性の感染を用いて、安定したベクター産生細胞系から得られるレベルに匹敵するベクター力価レベルを産生する細胞系が開発されている（Pear et al 1993, PNAS 90:8392-8396）。

産生細胞／パッケージング細胞は、任意の適切な細胞種のものであることができる。産生細胞は一般に哺乳動物細胞であるが、例えば昆虫細胞であることができる。

本明細書中で使用する用語「産生細胞」又は「ベクター産生細胞」とは、レトロウイルスベクター粒子の産生に必要なすべての要素を含む細胞をいう。

好ましくは、産生細胞は安定した産生細胞系から得ることができる。

好ましくは、産生細胞は誘導した安定した産生細胞系から得ることができる。

好ましくは、産生細胞は誘導した産生細胞系から得ることができる。

本明細書中で使用する用語「誘導した産生細胞系」とは、マーカー遺伝子の高い発現についてスクリーニング及び選択を行った、形質導入した産生細胞系である。このような細胞系は、レトロウイルスのゲノムからの高レベルの発現を支援する。用語「誘導した産生細胞系」は、用語「誘導した安定した産生細胞系」及び用語「安定した産生細胞系と互換性があるように用いる。

好ましくは、誘導した産生細胞系には、それだけには限定されないが、レトロウイルス産生細胞及び／又はレンチウイルス産生細胞が含まれる。

好ましくは、誘導した産生細胞系はＨＩＶ又はＥＩＡＶ産生細胞系、より好ましくはＥＩＡＶ産生細胞系である。

好ましくは、エンベロープタンパク質の配列及びヌクレオカプシドの配列はすべて産生細胞及び／又はパッケージング細胞内に安定して組み込まれている。しかし、これらの配列の１つ又は複数がエピソームの形態で存在し、遺伝子の発現がエピソームから起こることもできる。

本明細書中で使用する用語「パッケージング細胞」とは、ＲＮＡゲノムを欠く感染性組換えウイルスの産生に必要な要素を含む細胞をいう。典型的には、このようなパッケージング細胞は、ウイルスの構造タンパク質（コドンを最適化したｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖなど）を発現することができるがパッケージングシグナルを含まない１つ又は複数の産生プラスミドを含む。

「パッケージング配列」又は「ｐｓｉ」と互換性があるように用いられる用語「パッケージングシグナル」とは、ウイルス粒子の形成中においてレトロウイルスＲＮＡ鎖のキャプシド形成に必要である、非コード性のシス作用性の配列に関して用いる。ＨＩＶ−１では、この配列は、主要なスプライスドナー部位（ＳＤ、splice donor）の上流から少なくともｇａｇ開始コドンまで延びている座位に位置づけられている。

上述のベクター構築体との使用に適したパッケージング細胞系は容易に調製し得（国際公開公報ＷＯ９２／０５２６６号も参照）、また、レトロウイルスベクター粒子を産生するための産生細胞系を作製するために利用できる。上述のように、利用可能なパッケージング系の概要は「レトロウイルス」（上記）に示されている。

また、上述のように、パッケージングシグナルが欠失しているプロウイルスを含む単純パッケージング細胞系は、組換えによって望ましくない、複製に適格性のあるウイルスの迅速な産生をもたらすことが判明している。安全性を改善するために、プロウイルスの３’ＬＴＲが欠失している第２世代の細胞系が作製されている。このような細胞では、野生型のウイルスを産生するために２回の組換えが必要となる。さらなる改善は、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子を別々の構築体、すなわちいわゆる第３世代のパッケージング細胞系内に導入することを含む。これらの構築体は、形質移入中の組換えを防ぐために逐次的に導入する。

好ましくは、パッケージング細胞系は第２世代のパッケージング細胞系である。

好ましくは、パッケージング細胞系は第３世代のパッケージング細胞系である。

このようなスプリット構築体、すなわち第３世代の細胞系では、コドンを変更することによって組換えをさらに軽減させ得る。遺伝暗号の冗長に基づくこの技法は、個別の構築体間、例えばｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖのオープンリーディングフレーム中の重複領域間の相同性を低減させることを目的とする。

パッケージング細胞系は、キャプシド形成に必要な遺伝子産物を提供するため、及び高力価のベクター粒子を産生させるための膜タンパク質を提供するために有用である。パッケージング細胞は、組織培養細胞系などのｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した細胞である得る。適切な細胞系には、それだけには限定されないが、ネズミ線維芽細胞由来の細胞系又はヒト細胞系などの哺乳動物細胞が含まれる。好ましくは、パッケージング細胞系は、例えばＨＥＫ２９３、２９３−Ｔ、ＴＥ６７１、ＨＴ１０８０などのヒト細胞系である。

或いは、パッケージング細胞は、単球、マクロファージ、血液細胞又は線維芽細胞などの、治療する個体に由来する細胞であり得る。細胞を個体から単離し、パッケージング成分及びベクター成分をｅｘ ｖｉｖｏで投与し、次いで自己パッケージング細胞を再投与し得る。

より詳細には、パッケージング細胞は、治療する個体の体内にあるｉｎ ｖｉｖｏパッケージング細胞であるか、又は組織培養細胞系などのｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した細胞である得る。適切な細胞系には、ネズミ線維芽細胞由来の細胞系又はヒト細胞系などの哺乳動物細胞が含まれる。好ましくは、パッケージング細胞系は、例えば２９３細胞系、ＨＥＫ２９３、２９３−Ｔ、ＴＥ６７１、ＨＴ１０８０などのヒト細胞系である。

或いは、パッケージング細胞は、単球、マクロファージ、幹細胞、血液細胞又は線維芽細胞などの、治療する個体に由来する細胞であり得る。細胞を個体から単離し、パッケージング成分及びベクター成分をｅｘ ｖｉｖｏで投与し、次いで自己パッケージング細胞を再投与し得る。或いは、パッケージング成分及びベクター成分をパッケージング細胞にｉｎ ｖｉｖｏで投与し得る。レンチウイルスパッケージング成分及びベクター成分を個体の細胞内に導入する方法は、当分野で公知である。例えば、一手法はレンチウイルスベクター粒子の産生に必要な様々なＤＮＡ配列、例えばｅｎｖコード配列、ｇａｇ−ｐｏｌコード配列及び欠陥をもつレンチウイルスゲノムを、一過性の三重形質移入によって細胞内に同時に導入することである（Landau & Littman 1992 J. Virol. 66, 5110；Soneoka et al 1995 Nucleic Acids Res 23:628-633）。

一実施形態では、本発明のベクターの構成は、その産生系としてゲノム、ｇａｇ−ｐｏｌ成分及びエンベロープを発現する３つの転写単位を用いる。エンベロープ発現カセットは、ＶＳＶ−Ｇなど数々のエンベロープのうちの１つ、又は４０７０Ａなど様々なネズミレトロウイルスエンベロープのうちの１つを含み得る。

従来、これら３つのカセットは、２９３Ｔなどの適切な細胞系内に一過的に形質移入した３つのプラスミドから、又は安定した産生細胞系中に組み込まれたコピーから発現させていた。代替手法は、３つのカセットの発現系として別のウイルス、例えばバキュロウイルス又はアデノウイルスを用いることである。これらはどちらも核発現系である。現在までに、レンチウイルスベクター系の成分をすべて発現させるためにポックスウイルスを用いることは記載されていない。詳細には、レンチウイルスのコドン使用頻度が特異であること、及びそれがｒｅｖ／ＲＲＥ系などＲＮＡを取り扱う系が必要であることを考慮すると

シュードタイプ作製
好ましい一態様では、本発明のレトロウイルスベクターのシュードタイプを作製した。この点において、シュードタイプ作製によって１つ又は複数の利点を与えることができる。例えば、レンチウイルスベクターでは、ＨＩＶに基づいたベクターのｅｎｖ遺伝子産物により、これらのベクターがＣＤ４と呼ばれるタンパク質を発現する細胞にのみ感染するよう制限される。しかし、これらのベクター中のｅｎｖ遺伝子を他のＲＮＡウイルス由来のｅｎｖ配列で置き換えると、感染範囲がより広範になり得る（Verma及びSomia 1997 Nature 389:239-242）。例として、研究者によりＶＳＶ由来の糖タンパク質を用いてＨＩＶに基づいたベクターのシュードタイプが作製されている（Verma及びSomia 1997、同書）。

別の代替方法では、Ｅｎｖタンパク質は、突然変異体又は操作したＥｎｖタンパク質などの改変したＥｎｖタンパク質であり得る。改変は、標的化能力を導入するため若しくは毒性を軽減させるため、又は別の目的のために行い或いは選択し得る（Valsesia-Wittman et al 1996 J Virol 70: 2056-64；Nilson et al 1996 Gene Therapy 3: 280-6；Fielding et al 1998 Blood 9: 1802及びそれ中に引用される参考文献）。

選択した任意の分子を用いてベクターのシュードタイプを作製し得る。

ＶＳＶ−Ｇ：
ＶＳＶ−Ｇでシュードタイプを作製したレンチウイルスベクターを用いて、ＤＮＡのサイクリングなしで非侵襲性の静脈内注射（尾の静脈）ののち、ｉｎ ｖｉｖｏ（マウス）で肝細胞の効率的な形質導入が成された（Follenzi et al 2002；Pan et al 2002）。他のデータ（Pfeifer et al 2001）と一致しているこれらのデータと、肝臓の効率的な形質導入には細胞サイクリングが必要であるという以前の発見（Park et al 2000b）との明らかな矛盾は、ベクター設計の改善、具体的にはｃＰＰＴを含めること、及び粒子の感染力の増大に起因することが示唆されている。しかし、１つの研究では、用いたベクター（ＨＲ’ｃｍｖＧＦＰ）はｃＰＰＴ要素を含まず、肝臓の形質導入が観察された：注射の４日後に５９％のＧＦＰ陽性細胞、４０日後には１．３％まで低下（Pan et al 2002）。

ロスリバーウイルス
ロスリバーウイルスのエンベロープは、非霊長類レンチウイルスベクター（ＦＩＶ）のシュードタイプ作製に用いられており、全身投与した後、主に肝臓に形質導入した（Kang et al 2002）。その効率はＶＳＶ−Ｇでシュードタイプを作製したベクターで得られたものよりも２０倍高く、且つそれにより引き起こされる、肝毒性を示唆する肝臓酵素の血清レベルによって測定した細胞毒性が低かったと報告されている。

ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）とは、オーストラリアの熱帯及び温帯地域に特有且つ流行性である、蚊によって伝播するαウイルスである。温暖な沿岸域における正常集団の抗体保有率は低い傾向があるが（６％〜１５％）、マレーバレー（Murrey Valley）水系の平野における血清陽性率は２７〜３７％に至る。１９７９〜１９８０年に、ＲＲＶは太平洋諸島で異常発生した。この疾患はヒトの間で接触感染性はなく、致命的となることはないが、その第１の症状は、患者の約半数で疲労及び嗜眠を伴う関節痛であった（Fields Virology）。

バキュロウイルスＧＰ６４
バキュロウイルスのＧＰ６４タンパク質は、臨床及び市販の用途に必要な、高力価のウイルスの大規模な産生で用いるウイルスベクターに関して、ＶＳＶＧの魅力的な代替物であることが示されている（Kumar M, Bradow BP, Zimmerberg J, Hum Gene Ther. 2003 Jan 1；14(1):67-77）。ＶＳＶＧと比較すると、ＧＰ６４ベクターは屈性が広範であることが類似しており、且つネイティブ力価が類似している。ＧＰ６４の発現により細胞が死滅しないので、ＧＰ６４を構成的に発現する２９３Ｔ系の細胞系を作製することができる。

別のエンベロープ
ＥＩＡＶのシュードタイプの作製に用いた場合に妥当な力価を与える他のエンベロープには、モコラ（Mokola）、狂犬病、エボラ及びＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、lymphocytic choriomeningitis virus）が含まれる。マウスに子宮内注射した後、ＶＳＶ−Ｇのエンベロープは、エボラ又はモコラのどちらよりも肝細胞により効率的に形質導入されることが判明した（Mackenzie et al 2002）。４０７０Ａでシュードタイプを作製したレンチウイルスをマウスに静脈点滴することにより、肝臓中で最大の遺伝子発現がもたらされた（Peng et al 2001。

Ｔａｔの破壊
Ｔａｔの第１のエクソンはパッケージングシグナルの内部にあるという事実にもかかわらず、Ｔａｔのオープンリーディングフレームの破壊は、力価に不利益な影響を与えずにベクターの安全性プロフィールを増強する。

この破壊は、ベクターゲノム中のＴａｔオープンリーディングフレームの開始コドン（プラスミドのヌクレオチド１３１７〜１３１９）内にヌクレオチドを１つ挿入することによって成し得る。
gttgaacCTG→gttgaacCTCG
これは配列決定によって確認され、新しいゲノム力価決定では、この改変による力価の損失は示されなかった。この改変を行わないゲノムは、産生細胞中でウイルスタンパク質Ｔａｔのアミノ末端部分（２９個のαα）を発現する。

主要なスプライスドナー（ＳＤ１）の突然変異
本発明者らは、この改変を有するベクターの力価が、少なくとも機能的な主要なスプライスドナーの力価と同等に高いことを見出した。

破壊は、ヌクレオチド１４０５（Ｔ）を「Ｃ」で置き換えることによってスプライスドナーを破壊する部位特異的突然変異誘発によって成し得る。
AGGT→AGGC
突然変異したスプライスドナーは、下流に機能的なスプライスアクセプターを挿入することによって試験すると、非機能的であった。

ＷＰＲＥ／ｃＰＰＴ要素の含有
ＷＰＲＥ要素は発現を亢進するので、最大レベルの第VIII因子の実現に有益である可能性が高い。

産生細胞における導入遺伝子の発現
２９３Ｔ細胞などの産生細胞における導入遺伝子の発現の潜在性を最小限にするために、導入遺伝子のベクターへのクローニングは、第１のＮＯＩが任意の上流のＯＲＦに対してフレーム外となるように設計されている。

送達系
本発明のベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターによって標的部位に送達し得る。

当分野では周知のように、ベクターとは、実体が１つの環境から別の環境へと移動することを可能にする又は容易にする道具である。例として、組換えＤＮＡ技術で用いる一部のベクターは、ＤＮＡセグメント（異種ｃＤＮＡセグメントなどの異種ＤＮＡセグメント等）などの実体が標的細胞内に移動することを可能にする。任意選択で、標的細胞内に移動した後、ベクターは、異種ＤＮＡを細胞内に維持するために役割を果たすか、又はＤＮＡ複製単位として機能を果たし得る。組換えＤＮＡ技術で用いるベクターの例には、プラスミド、染色体、人工染色体又はウイルスが含まれる。

非ウイルス送達系には、それだけには限定されないが、ＤＮＡ形質移入方法が含まれる。ここでは、形質移入には、遺伝子を標的哺乳動物細胞内に送達するために非ウイルスベクターを用いる過程が含まれる。

典型的な形質移入方法には、電気穿孔、ＤＮＡ微粒子銃、脂質媒介の形質移入、コンパクトＤＮＡ（compacted DNA）媒介の形質移入、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、陽イオン剤（cationic agent）媒介、陽イオン性両親媒性物質（ＣＦＡ、cationic facial amphiphile）（Nature Biotechnology 1996 14; 556）、及びそれらの組合せが含まれる。

ウイルス送達系には、それだけには限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ、adeno-associated viral）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターが含まれる。ベクターの他の例には、それだけには限定されないが、電気穿孔、ＤＮＡ微粒子銃、脂質媒介の形質移入、コンパクトＤＮＡ媒介の形質移入などのＤＮＡ形質移入方法を含めたｅｘ ｖｉｖｏ送達系が含まれる。

本発明のベクター送達系は、ｉｎ ｖｉｖｏで二次ベクターを産生するのに必要な遺伝子をコードする、ｉｎ ｖｉｔｒｏで作製した一次ベクターからなり得る。

一次ウイルスベクター又は複数の一次ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス若しくはポックスウイルスベクターなどの様々な異なるウイルスベクターであってもよく、又は複数の一次ウイルスベクターの場合は、これらは様々なウイルス起源のベクターの混合物であり得る。いずれの場合にも、一次ウイルスベクターは、独立して複製できないという欠陥をもつことが好ましい。したがって、これらは標的細胞内に入って二次ベクター配列を送達することはできるが、複製して追加のさらなる標的細胞にさらに感染することはできない。

本発明によるベクター系による、１つ若しくは複数の治療遺伝子の送達は、単独で、又は他の治療若しくは治療の他の成分と組み合わせて用い得る。

例えば、本発明のレトロウイルスベクターは、国際公開公報ＷＯ−Ａ−９８／０５６３５号に記載した障害の治療に有用な１つ又は複数のＮＯＩを送達するために用い得る。参照を容易にするために、その一部をここに記載する：癌、炎症又は炎症性疾患、皮膚障害、発熱、心血管系への影響、出血、凝血及び急性期反応、悪液質、摂食障害、急性感染症、ＨＩＶ感染症、ショック状態、移植片対宿主反応、自己免疫疾患、再灌流傷害、髄膜炎、偏頭痛及びアスピリン依存性抗血栓症；腫瘍増殖、侵襲及び拡大、血管形成、転移、悪性、腹水及び悪性胸水；大脳虚血、虚血性心臓病、骨関節炎、関節リウマチ、骨粗鬆症、喘息、多発性硬化症、神経変性、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、血管炎、クローン病及び潰瘍性大腸炎；歯周病、歯肉炎；乾癬、後ピー性皮膚炎、慢性潰瘍、表皮水泡症；角膜潰瘍、網膜症及び外科的創傷治癒；鼻炎、アレルギー性結膜炎、湿疹、アナフィラキシー；再狭窄、鬱血性心不全、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化症又は内部硬化症（endosclerosis）。

それに加えて、又はその代わりに、本発明のレトロウイルスベクターは、国際公開公報ＷＯ−Ａ−９８／０７８５９号に記載した障害の治療に有用な１つ若しくは複数のＮＯＩを送達するために用い得る。参照を容易にするために、その一部をここに記載する：サイトカイン及び細胞の増殖／分化活性；免疫抑制活性又は免疫賦活活性（例えば、ヒト免疫不全ウイルスによる感染症を含めた免疫不全の治療；リンパ球増殖の調節；癌及び多くの自己免疫疾患の治療、及び移植拒絶の予防若しくは腫瘍免疫の誘導のため）；造血の調節（例えば骨髄系又はリンパ系疾患の治療）；骨、軟骨、腱、靱帯及び神経組織の増殖促進（例えば創傷治癒、火傷、潰瘍及び歯周病、並びに神経変性の治療；卵胞刺激ホルモンの阻害又は活性化（受精能の変調）のため）；化学走性／化学運動性の活性（例えば特定の細胞種を傷害又は感染部位に動員するため）；止血及び血栓溶解活性（例えば血友病及び脳卒中を治療するため）；抗炎症性活性（例えば敗血症性ショック又はクローン病を治療するため）；抗微生物剤として；例えば代謝又は行動のモジュレーター；鎮痛剤として；特定の欠乏性障害の治療；ヒト又は獣医学における例えば乾癬の治療において。

それに加えて、又はその代わりに、本発明のレトロウイルスベクターは、国際公開公報ＷＯ−Ａ−９８／０９９８５号に記載した障害の治療に有用な１つ若しくは複数のＮＯＩを送達するために用い得る。参照を容易にするために、その一部をここに記載する：マクロファージ阻害活性及び／又はＴ細胞阻害活性、したがって抗炎症性活性；抗免疫活性、すなわち炎症に関連しない応答を含めた細胞性及び／又は液性免疫応答に対する阻害効果；マクロファージ及びＴ細胞が細胞外基質成分及びフィブロネクチンに接着する能力の阻害、並びにＴ細胞におけるｆａｓ受容体発現のアップレギュレーション；関節リウマチを含めた関節炎、過敏症に関連する炎症、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、コラーゲン病及び他の自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症に関連する炎症、動脈硬化症、アテローム硬化性の心臓病、再灌流傷害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性障害、呼吸窮迫症候群又は他の心肺疾患、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎及び胃腸管の他の疾患に関連する炎症、肝線維症、肝硬変又は他の肝臓病、甲状腺炎又は他の腺性疾患、糸球体腎炎又は他の腎臓及び泌尿器系疾患、耳炎又は他の耳鼻咽喉学系疾患、皮膚炎又は他の皮膚病、歯周病又は他の歯牙疾患、睾丸炎又は睾丸副睾丸炎、不妊症、睾丸外傷又は他の免疫関連の精巣疾患、胎盤機能障害、胎盤機能不全、習慣性流産、子癇、子癇前症並びに他の免疫及び／又は炎症性関連の婦人科疾患、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜網膜炎、視神経炎、眼内炎、例えば網膜炎若しくは類嚢胞黄斑浮腫、交感性眼炎、強膜炎、網膜色素変性症、変性フォンダス（fondus）病の免疫及び炎症性成分、眼球外傷の炎症性成分、感染症によって引き起こされる眼球炎、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経障害、例えば緑内障濾過手術後の過剰な瘢痕、眼球移植に対する免疫及び／又は炎症反応並びに他の免疫及び炎症性関連の眼病、自己免疫疾患或いは中枢神経系（ＣＮＳ、central nervous system）又は任意の他の器官のどちらにおいても免疫及び／若しくは炎症の抑制が有益となる病気若しくは障害に関連する炎症、パーキンソン病、パーキンソン病の治療による合併症及び／又は副作用、ＡＩＤＳに関連する痴呆、複合ＨＩＶに関連する脳症、デビック病、シデナム舞踏病、アルツハイマー病及び他の変性疾患、ＣＮＳの病気又は障害、ストークスの炎症性成分、ポリオ後症候群、精神障害の免疫及び炎症性成分、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性汎脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、ギラム−バレー症候群、シデナムコラ、重症筋無力症、偽脳腫瘍、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ＣＮＳ圧迫若しくはＣＮＳ外傷又はＣＮＳ感染症の炎症性成分、筋萎縮及び筋ジストロフィーの炎症性成分、並びに免疫及び炎症関連疾患、中枢神経系及び末梢神経系の病気又は障害、外傷後炎症、敗血症性ショック、感染症、手術の炎症性合併症又は副作用、骨髄移植又は他の移植合併症及び／若しくは副作用、遺伝子治療の炎症性及び／又は免疫合併症並びに副作用（例えばウイルス担体の感染による）、或いは、液性及び／若しくは細胞性の免疫応答を抑制又は阻害するため、単球若しくは白血球の増殖性疾患、例えば白血病を、単球若しくはリンパ球の量を低減させることによって治療又は寛解させるため、角膜、骨髄、器官、水晶体、ペースメーカー、天然若しくは人工皮膚組織などの天然又は人工の細胞、組織及び器官を移植する場合の移植片拒絶を予防及び／若しくは治療するための、ＡＩＤに関連する炎症を含めた、所望しない免疫反応及び炎症の阻害。

本発明は血友病の治療に特に有用である。

本発明はまた、遺伝子治療によって個体を治療するための薬剤組成物であって、組成物が、１つ若しくは複数の送達可能な治療的及び／又は診断的ＮＯＩ、或いはそれから産生した又は得たウイルス粒子を含む治療上有効な量の本発明のレトロウイルスベクターを含む薬剤組成物を提供する。薬剤組成物は、ヒト又は動物で使用するものであり得る。典型的には、個体対象に最も適切である実際の用量を医師が決定し、これは、特定の個体の年齢、重量及び応答に応じて異なる。

組成物は、任意選択で製薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤又はアジュバントを含み得る。製薬用の担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図する投与経路及び標準の製薬上の慣行に関連して行うことができる。薬剤組成物は、担体、賦形剤若しくは希釈剤として、又はそれに加えて、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤、及びウイルスが標的部位内に進入することを補助又は増加させ得る他の担体物質（例えば脂質送達系など）を含み得る。

必要に応じて、薬剤組成物は以下のうちの任意の１つ又は複数によって投与することができる：吸入、坐薬又は膣坐薬の形態、ローション、溶液、クリーム、軟膏又は粉剤の形態で局所的に、皮膚パッチの使用、デンプン若しくはラクトースなどの賦形剤を含む錠剤、又はカプセル若しくは胚珠中に単独で若しくは賦形剤と混合した形態で、或いは香味剤若しくは着色料を含むエリキシル、液剤又は懸濁液の形態で経口的に、或いは、例えば空洞内、静脈内、筋肉内又は皮下に非経口的に注射することができる。非経口投与には、組成物を他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩又は単糖を含み得る滅菌した水溶液の形態で用いることが最もよいかもしれない。頬側又は舌下投与には、従来方法によって形成することができる錠剤又はロゼンジの形態で組成物を投与し得る。

第VIII因子のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生
本発明のコドンを最適化した第VIII因子をコードするベクター又は核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ／細胞培養物発現系中での第VIII因子の発現でも用い得る。したがって、本発明の別の態様では、本発明は、発明の任意の態様によるベクターを形質導入した、又は発明の任意の態様による核酸を形質移入した宿主細胞を提供する。

本発明のコドンを最適化した第VIII因子をコードするベクター又は核酸を用いた形質導入に適した宿主細胞には、宿主生物の細胞、正常な初代細胞又は培養一次組織に由来する細胞系が含まれ、これを用い得る。適切には、細胞は哺乳動物細胞、好ましくはハムスターＣＨＯ細胞、マウスＣ１２７細胞又はヒト「２９３」細胞である。別の実施形態では、細胞は、本明細書中に記載したＨｅｐＧ２細胞であり得る。

宿主細胞の形質導入は、本発明のベクター又は核酸を宿主細胞と共にインキュベートすることを含む。形質導入した／形質移入した細胞の継代ののち、例えば本明細書中に記載したＣＯＡＴＥＳＴ（ＣｈｒｏｍｏｇｅｎIX）を用いた第VIII因子の活性の試験を行うために培地を取り出した。

遺伝子が適切な宿主細胞内に導入された後、宿主細胞を適切な培地中で高密度まで増殖させ得る。発現された第VIII因子が分泌されている又は溶解によって細胞から単離した場合は、慣用の手段を用いて細胞培地から抽出することができる。その後、所望の産物を慣用技術、例えば、固定した抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー、アミノヘキシル−セファロース上のクロモトグラフィー又は混合高分子電解質方法によって単離及び精製する。

したがって、本発明のさらなる態様明は、本発明による細胞を作製すること、前記細胞を培地中で継代すること、前記培地を取り除くこと、及び第VIII因子を単離することを含む、第VIII因子をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する方法を提供する。

本発明の別の態様は、本発明による、第VIII因子をコードするコドンを最適化した核酸を含む細胞を作製すること、前記細胞を倍地中で継代すること、前記培地を除去すること、及び第VIII因子を単離することを含む、第VIII因子をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する方法を提供する。

ベクター構築体
pONY8.4の詳細は、本発明者らの国際公開公報ＷＯ０３／０６４６６５号に見つけることができる。より詳細には、pONY8.4シリーズのベクターは、力価に不利益な影響を与えずに、アクセサリータンパク質から完全に独立して一過性の又は安定したベクター系の一部として機能することを可能にする、いくつかの改変を有する。従来、レンチウイルスベクターゲノムは、十分な力価を得るために産生細胞（一過性又は安定）中にウイルスタンパク質ｒｅｖが存在することを必要としていた。これには、現在のＨＩＶベクター系及びより初期のＥＩＡＶベクターが含まれる。

pONY8.1シリーズのベクターゲノムと比較した場合に、以下の４つの改変点が存在する：
ａ）ｇａｇから、及びパッケージングシグナルの一部から誘導したＡＴＧモチーフはすべて、ＡＴＴＧと読まれるように改変されている。これにより、ＬＴＲ中のプロモーターによって駆動させることができるオープンリーディングフレームの挿入が可能となる。

ｂ）ゲノムの長さ、すなわちＲ領域間の距離は、ｗｔウイルスで見られる距離よりも短い（７．９ｋｂ）。

ｃ）３’Ｕ３領域はモロニー白血病ウイルス（ＭＬＶ）のＵ３領域由来の配列を含むように改変されているので、形質導入された後、これは内部カセットに加えて第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を駆動することができる。本実施例では本発明者らはＭＬＶを用いたが、これは任意のプロモーターであることができる。

ｄ）ベクターはウイルスのＬＴＲに作動可能に連結しているヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は内部プロモーターの上流にあり、前記ヌクレオチド配列はポリペプチド又はその断片をコードする。

これらの改変は一緒になって、アクセサリータンパク質を必要とせずにウイルス送達系の産生を可能にし、元のウイルス配列の１０％のみが標的細胞内に組み込まれる。免疫応答及び複製に適格性のあるウイルスが発生する確率の観点から、これらの要素は将来の安全性への配慮に重要である。ＬＴＲを改変するさらなる詳細は、本発明者らの国際公開公報ＷＯ９６／３７６２３号及び国際公開公報ＷＯ９８／１７８１６号に見つけることができる。

pONY8.7シリーズのベクターはｃＰＰＴ及びＷＰＲＥを有する（pONY8.4はどちらも有さない）。

pONY8.8シリーズのベクターはｃＰＰＴを有するがＷＰＲＥを有さない。

pONY8.9シリーズのベクターはＷＰＲＥを有するがｃＰＰＴを有さない。

ベクターでは、末尾の５（例えばpONY8.95）は、以下に記載するＴａｔ及びスプライスドナー両方の改変を示す。

ベクターでは、末尾の３（例えばpONY8.43）は、以下に記載するＴａｔの改変を示すがスプライスドナーの改変は示さない。

ベクターの学名では：
「Ｎ」はｎｅｏの存在を示し、
「Ｃ」はＣＭＶの存在を示し、
「Ｇ」はＧＦＰの存在を示し、
「Ｆ」又は「ＨＥＮ」若しくは「ＨＥＮＳＱ」は、コドンを最適化した、Ｂドメインが欠失した第VIII因子の存在を示し、
「Ｚ」はＬａｃＺの存在を示し、
「Ａ」はｈＡＡＴの存在を示し、
「Ｉ」はＩＣＡＭ−２の存在を示す。

したがって、例として：pONY8.4NCZは、ＳＩＮ ＬＴＲを有し、ｎｅｏは発現されず、Ｒｅｖからの独立のために上流のＯＲＦがある。pONY8.95NCZは、ＷＰＲＥを有し、ｃＰＰＴを有さず、ＳＩＮ ＬＴＲを有するのでｎｅｏは発現されず、Ｔａｔエクソン１及びＳＤ１は突然変異している。pONY8.7NCFは、ｃＰＰＴ、ＷＰＲＥ、上流ＯＲＦはｎｅｏであり、ＣＭＶ内部プロモーター、コドンを最適化したＢドメインが欠失した第VIII因子を有する。
ベクターの分析
ＰＥＲＴ（高性能逆転写）による力価の予測値
内部ＣＭＶプロモーターからＬａｃＺ又は第VIII因子を発現するベクターゲノムを用いて、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイプを作製したベクターを調製した。リアルタイムＰＣＲを用いて、粒子を破壊した後のＭＳ２ ＲＮＡ鋳型からのＲＴ−ＰＣＲ産物を測定することによって、逆転写酵素の活性を定量した。ベクター粒子の数（力価）の予測値は、未知のものを参照標準と比較することによって決定する。

第VIII因子のゲノムの力価予測値はＬａｃＺよりも低かったが、その差は１ｌｏｇ以内であった。

ＲＮＡゲノムのレベルによる力価
ＣＭＶ又は組織特異的なプロモーターからＧＦＰ、ＬａｃＺ及び第VIII因子の導入遺伝子を発現するベクターゲノムを用いて、ウイルスベクターを調製した。ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）エンベロープを用いてｈＡＡＴ内部プロモーターを含むベクターのシュードタイプを作製し、エボラエンベロープを用いてＩＣＡＭ−２プロモーターを含むベクターのシュードタイプを作製した。エンベロープの選択は標的細胞種に基づく：エボラエンベロープは、ＩＣＡＭ−２プロモーターの活性を試験するために選択したＨＵＶＥＣ細胞の効率的な形質導入を可能にし、ＲＲＶエンベロープは、肝細胞の効率的な形質導入を可能にすることが報告されている（Kang et al 2002）。両エンベロープを用いて、内部ＣＭＶプロモーターを含む対照シュードタイプベクターを作製した。ウイルスＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲ分析の結果を図６に示した。

組織特異的な内部プロモーターを含む第VIII因子のゲノムの力価予測値は、標準のＣＭＶ（一貫して〜１×１０^５ＴＵ／ｍｌの力価予測値を与える）で得られた力価よりも約５倍高い。

２９３Ｔ細胞内のプロモーター活性
産生細胞内におけるＩＣＡＭ−２、ｈＡＡＴ及びＣＭＶプロモーターの相対活性を決定するために、２９３ＴにＧＦＰを発現するゲノムを一過的に形質移入した。細胞は、酪酸ナトリウム処理の約２４時間後、形質移入の３６時間後にＵＶ顕微鏡で観察した。代表的な画像を図７に示した。

標的細胞内のプロモーター活性
肝細胞
ヒト肝細胞癌細胞系であるＨｅｐＧ２を、ｈＡＡＴプロモーターの活性を試験するために選択した。これは、このプロモーターのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験に以前に用いられており（Kramer et al 2003）、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（エンハンサー領域を含む）の活性の４０％の活性を有すると報告されている。ＣＭＶ又はｈＡＡＴプロモーターのいずれかからレポーター遺伝子を発現するベクターを形質導入したＨｅｐＧ２及び２９３Ａ細胞の代表的な画像を図８に示した。

β−ガラクトシダーゼ及びＧＦＰレポーター遺伝子をどちらも用いると、ＣＭＶ又はｈＡＡＴプロモーターのどちらかを用いて導入遺伝子の発現を駆動した場合に形質導入した細胞のコロニーが容易に可視化された。生物学的力価（Ｘ−ｇａｌで染色された細胞）は等価であり、これはＲＮＡゲノムのレベルによって測定した力価が匹敵することを反映しており、また、２つのプロモーターの活性がＨｅｐＧ２中で類似していることを示している。このことは、形質導入した細胞から調製した溶解物のβ−ガラクトシダーゼアッセイによって支持されている（データ示さず）。

内皮細胞
ＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞、human embilical vein endothelial cell）を、ＩＣＡＭ−２プロモーターの活性を試験するために選択した。ＩＣＡＭ−２及びＣＭＶプロモーターからＬａｃＺを発現するベクターで形質導入した、Ｘ−ｇａｌで染色された細胞の画像を図９に示した。

２９３Ａ細胞
ＦＡＣＳ解析では、組織特異的なプロモーターを含むベクターで形質導入した２９３Ａ細胞中でＧＦＰ陽性細胞を検出することができなかった（データ示さず）。このことは、発現の高い細胞の集団をもたらしたＣＭＶ対照ベクターと対照的である。

要約すると、ＩＣＡＭ−２及びｈＡＡＴのどちらの組織特異的なプロモーターも、所望どおり２９３（２９３Ａ及び２９３Ｔ）細胞中で低い活性レベルをもたらした。ＩＣＡＭ−２ベクターの場合は、内皮細胞中でのプロモーター活性の証拠を検出することができた。ｈＡＡＴプロモーターの場合は、肝細胞中で非常に高い活性が明らかであった（ＣＭＶプロモーターに匹敵する）。

遍在性プロモーターから発現される第VIII因子をコードするベクターの力価が低いことは、機能的なウイルス粒子の産生を阻害する２９３Ｔ産生細胞中での第VIII因子タンパク質の発現に起因する。したがって、２９３Ｔにおける導入遺伝子の発現を回避する戦略が求められていた。標的細胞における導入遺伝子の高い発現を維持したままでこれを達成するために最も有効な手段は、内部ＣＭＶプロモーターを強力な肝臓特異的ヒトα_１−抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターで置き換えることであった。さらに、ゲノムにさらなる改善が加えられている：結果的に力価が減少されることなしに、Ｔａｔエクソン１及び主要なスプライスドナーの突然変異が行われている。

組込みアッセイによる力価
ベクターの性能の機能的アッセイは、第VIII因子を送達するための高力価のベクターを産生することができるかを確かめるのに重要である。図５及び６に示したように、ＲＮＡゲノムのレベルの測定もウイルス粒子数（ＰＥＲＴ）の測定も、力価の予測に不十分である。したがって、２９３Ａ細胞をウイルスの上清で形質導入ことによって組込みアッセイを実施した。ｈＡＡＴベクター及びＣＭＶ対照ベクターのデータを図１０に示した。

pONY8.95NAF（ｈＡＡＴプロモーターから発現させた第VIII因子）で形質導入した細胞は、レポーター遺伝子をコードするベクター（pONY8.95NCG）で形質導入した細胞と同様のレベルのベクターを含む。しかし、pONY8.7NCF（内部ＣＭＶプロモーター）で形質導入した細胞は、バックグラウンド（ＵＴ＝形質導入していない細胞、untransduced cells）より僅かだけの高い非常に少ない量のベクターしか含まず、これは、このベクター構築体で得られた機能的力価が低いことを反映している。これらのデータは、ＣＭＶプロモーターをｈＡＡＴプロモーターに交換することによって産生細胞中の第VIII因子の発現によりもたらされる粒子産生の阻害が完全に回避されたことを示している。

ＣＡＭ−２ベクター及びＣＭＶ対照ベクターのデータを図１１に示した。

ｈＡＡＴベクターの場合と同様、ＩＣＡＭ−２プロモーターを用いることにより、高い機能的力価（ＬａｃＺ対照ベクターの約１／３）を有する第VIII因子のベクターの産生が可能となる。

ゲノム混合実験
第VIII因子を発現するゲノム（pONY8.7NCHENSQ）、又は第VIII因子を発現するプラスミド（pSQ）の同時形質移入の結果、レポーター遺伝子を発現するベクターの力価が常に約２ｌｏｇ低下する。新しい第VIII因子のゲノムの同時形質移入が第２のゲノムの力価の不相応な低下をもたらしたのではないことを確認するために、これらをpONY8.95NCZを共に同時形質移入し、Ｄ１７細胞で力価決定した後にＬａｃＺ力価のスコアをつけた。結果を図１２に示した。

これらのデータは、組込みアッセイの結果を確かにしている：新しい第VIII因子のベクターゲノムは機能的なウイルス粒子の産生の阻害を引き起こさない。

産生細胞における第VIII因子タンパク質の発現が他のレンチウイルスベクター及びレトロウイルスベクターの機能的力価に影響を与えるかどうかを確認するために、ＨＩＶ及びＭＬＶベクターを用いて混合実験を行った。データを図１３に示した。

データは、第VIII因子を発現するプラスミドを形質移入に含めた場合、ＭＬＶ及びＨＩＶベクターの力価が約１ｌｏｇ低下することを示している。これらのデータは類似の以前の実験と一致している。産生細胞における第VIII因子の発現は、明らかにＨＩＶ及びＭＬＶベクターの力価に不利益な影響を与える。ただし、これはＥＩＡＶではそれほど劇的ではない。

pONY8.45NCZの構築
Ｔａｔエクソン１
Ｔａｔエクソン１の突然変異は、シトシン残基をヌクレオチド４３４の後に挿入することによって行った（アクセッション番号ＥＩＵ０１８６６）。

標準の手順を用いて以下に示すオリゴヌクレオチドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、アニーリングさせ、その後、BseRI及びEco0109Iで消化したpONY8.4NCZ（９４６３ｂｐの断片）内にライゲーションさせて、pONY8.43NCZを作製した。

ＴＡＴのエクソン１を突然変異させるために用いたオリゴ
オリゴ１ GGGACCTGAGAGGGGCGCAGACCCTACCTGTTGAACCTCGGCTGATCGTAGGATCCCCGGGA
オリゴ２ TGTAAGTTCTCCTCTGCTGTCCCGGGGATCCTACGATCAGCCGAGGTTCAACAGGTAGGG
主要なスプライスドナー
主要なスプライスドナーの突然変異は、以下のオリゴヌクレオチドを用いて不変のチロシンをシトシンへと交換することによって達成された：
SD1KO1F: CAGAACACAGGAGGACAGGCAAGATTGGGAGACCCTTTG
SD1KO2R: CAAAGGGTCTCCCAATCTTGCCTGTCCTCCTGTGTTCTG
（変化したヌクレオチドを太字で示す）。

スプライスドナーの突然変異はStratageneのQuickChange（商標）部位特異的突然変異誘発キットを用いて行い、配列決定によって確認した。Ｔａｔエクソン１及び主要なスプライスドナーの突然変異をどちらも含むこの構築体は、pONY8.45NCZと命名した。

単一の突然変異でも、２つの突然変異の組合せでも、力価は顕著に変更されなかった。図１４の第１実験のデータを参照されたい。

主要なスプライスドナーを含むベクターの力価は僅かに増強された。このことは、次の実験でも観察された。

以下に、ＴＡＴの第１のエクソン、主要なスプライスドナーのノックアウト及びpONY8.45NCZベクターのパッケージングシグナルにおける突然変異及び挿入を示す。
UI01866 401 cctgagaggggcgcagaccctacctgttgaacct-ggctgatcgtaggatccccgggacagcagaggagaacttacagaagtcttctggaggtgttcctggccagaacacaggaggacag

8.45 NCZ 213 cctgagaggggcgcagaccctacctgttgaacctcggctgatcgtaggatccccgggacagcagaggagaacttacagaagtcttctggaggtgttcctggccagaacacaggaggacag

UI01866 520 gtaagat-gggagaccctttgacat-ggagcaaggcgctcaagaagttagagaaggtgacggtacaagggtctcagaaattaactactggtaactgtaattgggcgctaagtctagtaga

8.45 NCZ 333 gcaagattgggagaccctttgacattggagcaaggcgctcaagaagttagagaaggtgacggtacaagggtctcagaaattaactactggtaactgtaattgggcgctaagtctagtaga

UI01866
638 cttatttcat-gataccaactttgtaaaagaaaaggactggcagctgagggat-gtcattccattgctggaagat-gtaactcagacgctgtcaggacaagaaagagaggcctttgaaag

8.45 NCZ 453 cttatttcattgataccaactttgtaaaagaaaaggactggcagctgagggattgtcattccattgctggaagattgtaactcagacgctgtcaggacaagaaagagaggcctttgaaag

UI01866 755 aacat-ggtgggcaatttctgctgtaaagat-gggcctccagattaataat-gtagtagat-ggaaaggcatcattccagctcctaagagcgaaatat-gaaaagaagactgctaataaa

8.45 NCZ 573 aacattggtgggcaatttctgctgtaaagattgggcctccagattaataattgtagtagattggaaaggcatcattccagctcctaagagcgaaatattgaaaagaagactgctaataaa

UI01866 870 aagcagtctgagccctctgaagaatatc
8.45 NCZ 693 aagcagtctgagccctctgaagaatatc
コドンの最適化
Ｂドメインが欠失した第VIII因子のＳＱ型のコドンの最適化
ＨｅｐＧ２細胞を、第VIII因子の遺伝子の野生型（ＷＴ、wild type）又はコドンを最適化した（ＣＯ、codon optimised）「ＳＱ」型を発現するＥＩＡＶベクターを用いて、２つの異なるＭＯＩ（１×及び１０×）で形質導入した。形質導入した細胞を継代した後、新しい培地を加え、細胞を２４時間インキュベーションした。培地を取り出し、ＣＯＡＴＥＳＴ（ＣｈｒｏｍｏｇｅｎIX）を用いて第VIII因子の活性について試験した。このアッセイでは、合成の第VIII因子の遺伝子を含むベクターの最も高いＭＯＩで形質導入した細胞からの上清が、非常に高いレベルの活性をもたらした（アッセイの直線範囲を超えた）。ＷＴ×１０の結果とＣＯ×１の結果とを比較すると、コドンの最適化の結果、細胞上清中で第VIII因子の活性が約５０倍増大し、ＷＴの形質導入細胞中に１０倍多いベクターコピー数が存在すると考えられる。

このことを試験するために、継代ののち、形質導入した細胞においてＥＩＡＶΨシグナルのリアルタイムＰＣＲアッセイを実施した。このアッセイでは、ＷＴベクターと比較して、ＣＯベクターで形質導入した細胞中で約２．５倍多いベクターコピー数が検出された。したがって、コドンの最適化の結果、第VIII因子の活性に２０倍の増加（ベクターコピー１つあたり）がもたらされた。結果を図１６に示した。

図１６に概要を示した実験を繰り返し、上清を２つに分割し、タンパク質の量（Affinity Biologicals FVIII ELISA）及び活性（ＣＯＡＴＥＳＴ）についてアッセイを行うために適切に希釈した。

第VIII因子の活性は全体的により低いが、ここでも、コドンを最適化した試料は、両方のアッセイでの測定においてはるかに高いレベルの第VIII因子が存在していた。最も高いＭＯＩで形質導入したＨｅｐＧ２細胞からの上清のみで、ＥＬＩＳＡによる測定においてバックグラウンドよりも高い第VIII因子のレベルが得られた。これは、ポリクローナル一次抗体は、完全長の第VIII因子タンパク質対して産生させており、Ｂ−ドメインが欠失した型では欠落している完全長のタンパク質上のエピトープを認識することに起因する可能性が高い。結果を図１７に示した。

図１８は、１７０、９０及び８０ｋＤａの第VIII因子ポリペプチドに対応するコドンを最適化した（ＣＯ）ベクターを用いて形質導入した細胞の上清中に存在する特異的なバンドを示すウエスタンブロットを示す図である。

これらのバンドは、形質導入なしの上清、又は野生型の第VIII因子の遺伝子をコードするベクターで形質導入した細胞からの上清のどちらにも存在していない。

完全長第VIII因子の遺伝子のコドンの最適化
ウイルスベクターはＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性の形質移入によって作製し、２０００倍まで濃縮した。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示したベクター（pRV67シュードタイプ）で形質導入した。継代及びＤＮＡ抽出ののち、ＥＩＡＶΨレベルをリアルタイムＰＣＲによって測定し、結果を上述のグラフ中に形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）として表した。結果を図２３に示した。

ＮＡＦａは完全長（ｆｌ、full-length）、野生型（ｗｔ）の第VIII因子の配列を表し；ＮＡＦｂは完全長の、コドンを最適化した（ｃｏ）第VIII因子の配列を表し；ＮＡＳｑｗｔはＢ−ドメインが欠失した（ｂｄｄ、B-domain deleted）、野生型の第VIII因子の配列を表し；ＮＡＦはＢ−ドメインが欠失した、コドンを最適化した第VIII因子の配列を表す。すべてのゲノムはpONY8.95の骨格中にある。

完全長の配列から得た力価の比較により、コドンを最適化した型（ＮＡＦβ）は、野生型（ＮＡＦａ）よりも５０倍高い力価を生じることが示されている。さらに、Ｂ−ドメインが欠失した型から得た力価の比較により、コドンを最適化した型（ＮＡＦ）は、野生型（ＮＡＳｑｗｔ）よりも８倍高い力価を生じることが示されている。全体的に、Ｂ−ドメインが欠失した、コドンを最適化した型の第VIII因子ゲノムが最も高い力価を生じる。

エンベロープに対する第VIII因子発現の影響
産生細胞における第VIII因子の発現は、明らかにベクターの力価に不利益な影響を与える。これまで、この矛盾の理由は不明確であった。しかし、本発明者らは今回、２９３Ｔ産生細胞における第VIII因子の発現によりウイルス粒子上のＶＳＶ−Ｇエンベロープの顕著な低減がもたらされることを示した（図２４参照）。

様々なエンベロープタンパク質でシュードタイプを作製した場合における、第VIII因子によるウイルスベクター産生の阻害
最適化した比の、様々なエンベロープを含めたプラスミド成分を用いた形質移入によって、pONY8.95NCZ（ＬａｃＺゲノム）を調製した。形質移入混合物にpSQ（第VIII因子を発現するプラスミド）又はpCIneo（対照プラスミド）のどちらかを２μｇ加えた。Ｄ１７力価（コロニー形成単位（ｃｆｕ、colony forming unit））を示した。

いくつかの実験により、ＶＳＶ−Ｇ（pRV67）でシュードタイプを作製した場合、第VIII因子の発現がウイルスベクターの産生に対して阻害効果を有することが示されている。この阻害がＶＳＶ−Ｇに特異的であるかどうかを検討するために、７つの異なるエンベロープを用いて上述の実験を行った（図２５参照）。結果は、阻害はＶＳＶ−Ｇに特異的ではなく、すべての力価が第VIII因子の発現によって様々な度合いで影響を受けることを示している。pHCMV-Gは、pRV67と比べて第VIII因子の発現による影響が少ないと考えられる。これは、第２のグリコシル化部位上の単一のアミノ酸の変更に起因しているかもしれず、又は発現レベルの差異に起因している可能性がある。

上述の明細書中で言及したすべての出版物は本明細書中に参考として組み込まれている。本発明の記載した方法及び系の様々な改変及び変形が、本発明の範囲及び精神から逸脱せずに、当業者には明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して記載したが、特許請求した本発明は、そのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解されたい。実際、生化学及び生命工学又は関連分野の技術者には明らかである、ほん発明を実施するための記載した方法の様々な改変が、添付の特許請求の範囲内にあることを意図する。

本発明の一態様によるベクターを示す模式図である。ＳＤ＝スプライスドナー、ＳＡ＝スプライスアクセプター、ｐＡ＝ポリアデニル化シグナル、ＢＧＨ＝ウシ成長ホルモン、ｓｙｎ＝合成、Ψ＝パッケージングシグナルである。 組み込まれた本発明の一態様によるベクターを示す模式図である。 第VIII因子のＢ−ドメインに隣接するアミノ酸配列を示す図である。より詳細には、Ａ２配列（７３７から７４０）、Ａ３配列（１６９０から１６９６）を示した。タンパク質分解性の活性化中にトロンビンによって切断される部位を示した（四角で囲んだ）。第VIII因子のＳＱ型はＳｅｒ７４３をＧｌｎ１６３８に融合させることによって作製し、ＬＡ型は７６０から１６３９の残基を欠失させることによって作製した（Ｔｈｒ７５９をＰｒｏ１６４０に融合）。Ａｒｇ７４０及びＧｌｕ１６４９は、第VIII因子のプロセッシングに重要であると考えられている。したがって、ＳＱ型は９０ｋＤａ鎖のＣ末端（Ａｒｇ７４０）と８０ｋＤａの軽鎖のＮ末端との間に１４個のアミノ酸の連結部を有する。 ヒトα１−抗トリプシンプロモーター（３０５ｂｐ）を示す模式図である（Kramer et al (2003) Mol Ther. 7:375-85）。より詳細には、特異的（Ｃ／ＥＢＰ、ＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質α又はβ；ＨＮＦ（hepatocyte nuclear factor）、肝細胞核因子）及び非特異的（ＡＰ−１）な活性化転写因子を示した。非肝細胞中に存在する推定上のリプレッサー因子の結合領域を示した（De Simone及びCortese 1989）。ｃａｐ部位に対する座標を示した。制御要素を示した：ＤＥ、遠位要素（distal element）；ＴＳＥ、組織特異的要素（tissue-specific element）、ＴＡＴＡボックス。 ＰＥＲＴ（高性能逆転写、performance enhanced reverse transcription）アッセイによって測定したウイルスベクター調製物の力価の予測値を示す図である。ベクターゲノムは、ＣＭＶプロモーターからＬａｃＺ又は第VIII因子を発現する。 ＣＭＶ及び組織特異的なプロモーターを有するベクターのＲＮＡゲノムのレベルを示す図である。より詳細には、ｈＡＡＴ（暗）又はＩＣＡＭ−２（明）プロモーターのどちらかからの、ＧＦＰ、ＬａｃＺ及び第VIII因子を発現するベクターの力価予測値を示した。内部ＣＭＶプロモーターを含むベクターも、対照として平行して調製した（ＮＣＧ＝pONY8.95NCG、ＮＣＺ＝pONY8.95NCZ、ＮＣＦ＝pONY8.7NCF）。ロスリバーウイルス（ＲＲＶ、Ross river Virus）又はエボラのエンベロープを用いてベクターのシュードタイプを作製した。 ２９３Ｔ細胞におけるプロモーターの活性を示す図である。より詳細には、２９３Ｔ細胞を様々な内部プロモーター由来のＧＦＰ（示したもの）を発現するゲノムで形質移入し、位相差又はＵＶ顕微鏡観察によって観察した。 示したベクターで形質導入したＨｅｐＧ２及び２９３Ａ細胞を示す図である。 示したベクターで形質導入したＨＵＶＥＣ細胞を示す図である。 組込みアッセイ：ｈＡＡＴ及びＣＭＶプロモーターの結果を示す図である。より詳細には、２９３Ａ細胞を示したベクター（ＲＲＶシュードタイプ）で形質導入した。継代及びＤＮＡ抽出ののち、ＥＩＡＶΨレベルをリアルタイムＰＣＲによって測定した。 組込みアッセイ：ＩＣＡＭ２及びＣＭＶプロモーターの結果を示す図である。より詳細には、２９３Ａ細胞を示したベクター（エボラシュードタイプ）で形質導入した。継代及びＤＮＡ抽出ののち、ＥＩＡＶΨレベルをリアルタイムＰＣＲによって測定した。 第２のゲノムで同時形質移入した場合のpONY8.95NCZ（ＶＳＶ−Ｇ）の力価を示す図である。より詳細には、等量のpONY8.95NCZプラスミド及び示したプラスミドを形質移入に用いた。その結果生じたＬａｃＺの力価を示した。 ＨＩＶ、ＭＬＶ及びＥＩＡＶのＤ１７力価：第VIII因子のゲノムの混合を示す図である。より詳細には、ＨＩＶ（pH7G）、ＭＬＶ（pHIT111）及びＥＩＡＶ（pONY8.7NCZ）ベクターは、最適化した比のプラスミド成分を用いて形質移入を行うことによって調整した。形質移入混合物に２μｇの示したプラスミドを加えた。Ｄ１７力価（コロニー形成単位）を示した。 Ｔａｔエクソン１及び／又は主要なスプライスドナー１の突然変異を有するpONY8.4NCZ（ＳＩＮＭＩＮ）ベクターのＤ１７力価を示す図である。 第VIII因子の遺伝子のコドン使用頻度を示す表である。 ＣＯＡＴＥＳＴの結果を示す図である。 タンパク質の量及び活性のアッセイによる、野生型及びコドンを最適化した第VIII因子の遺伝子の比較を示す図である。 第VIII因子をコードするＥＩＡＶベクターで形質導入したＨｅｐＧ２由来の上清のウエスタンブロットを示す図である（レーン１：形質導入なし；レーン２：ＣＯ×１；レーン３：ＣＯ×１；レーン４：ＷＴ×１０；レーン５：形質導入なし；レーン６：pONY8.95NAF；レーン７：pONY8.95NAF；レーン８：マーカー；レーン９：マーカー；レーン１０：ｒＦVIII）。 本発明によるコドンを最適化した第VIII因子のヌクレオチド配列を示す図である。 pONY8.95NAFβと命名したpONY8.95骨格中における、完全長の、コドンを最適化した第VIII因子の遺伝子を示す図である。 pONY8.95NAFβの完全な配列を示す図である。 完全長の、コドンを最適化した配列の翻訳を示す図である。 コドンを最適化した完全長の第VIII因子（ＮＡＦｂ）、野生型の第VIII因子（ＮＡＦａ）、Ｂ−ドメインが欠失した第VIII因子（ＮＡＳｑｗｔ）及びコドンを最適化した、Ｂ−ドメインが欠失した第VIII因子（ＮＡＦ）を含む、pONY8.95-hAATベクターの力価の比較を示す図である。 ＶＳＶ−Ｇエンベロープの濃度に対する、２９３Ｔ産生細胞中での第VIII因子の発現の影響を示す図である。 様々なエンベロープタンパク質を用いてシュードタイプを作製した場合における、ウイルスベクター産生の産生に対する第VIII因子の発現の影響を示す図である。

Claims (40)

1. 目的ヌクレオチド（ＮＯＩ）を所望の標的部位に送達する能力を有するレンチウイルスベクターであって、ＮＯＩは第VIII因子又はその誘導体をコードし、ＮＯＩを所望の標的部位に送達した後に第VIII因子が発現される、レンチウイルスベクター。
2. 第VIII因子又はその誘導体をコードするＮＯＩであって、組織特異的なプロモーターに作動可能に連結しているＮＯＩを含むレンチウイルスベクター。
3. 組織特異的なプロモーターが肝臓又は内皮組織に特異的なプロモーターである、請求項２に記載のレンチウイルスベクター。
4. ＮＯＩが哺乳動物細胞における発現のためにコドンが最適化されている、請求項１から３のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
5. ＮＯＩがＢ−ドメインが欠失した第VIII因子の遺伝子である、請求項１から４のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
6. 第VIII因子又はその誘導体をコードするＮＯＩであって、哺乳動物細胞における発現のためにコドンが最適化されているＮＯＩを含むレトロウイルスベクター。
7. ＮＯＩが組織特異的なプロモーターに作動可能に連結している、請求項６に記載のベクター。
8. 組織特異的なプロモーターが肝臓又は内皮組織に特異的なプロモーターである、請求項７に記載のベクター。
9. 第１の目的ヌクレオチド（ＮＯＩ）を送達する能力を有し、レトロウイルスプロベクターから誘導可能なレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスプロベクターは内部プロモーターに作動可能に連結している第１のＮＯＩ、及び第２のＮＯＩがスプライシングされて除去されることができるように第１のＮＯＩと内部プロモーターとの間に第２のＮＯＩを含み、さらにプロモーター、第１のＮＯＩ及び第２のＮＯＩは逆相補的配向にあり、任意選択で第２のＮＯＩは任意選択で第１のＮＯＩに対してフレーム外にあるレトロウイルスベクター。
10. 第２のＮＯＩがオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の少なくとも一部を任意選択で含むイントロンである、請求項９に記載のベクター。
11. レトロウイルスプロベクターが機能的なスプライスドナー部位を与えることができる第１のヌクレオチド配列（ＮＳ）と第２のＮＯＩに隣接する機能的なスプライスアクセプター部位を与えることができる第２のＮＳとを含み、機能的なスプライスドナー部位は機能的なスプライスアクセプター部位の上流にある、請求項９又は１０に記載のベクター。
12. 第１のＮＯＩ又はその発現産物が治療剤若しくは診断剤である、又はそれを含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載のベクター。
13. 第１のＮＯＩの発現産物が第VIII因子である、請求項１２に記載のベクター。
14. 第VIII因子は哺乳動物細胞における発現のためにコドンが最適化されている、請求項１３に記載のベクター。
15. 第１のＮＯＩが組織特異的なプロモーターに作動可能に連結している、請求項９から１４のいずれか一項に記載のベクター。
16. 組織特異的なプロモーターが肝臓又は内皮組織に特異的なプロモーターである、請求項１５に記載のベクター。
17. 第２のＮＯＩ又はその発現産物が、選択性を与える任意の１つ又は複数の薬剤（例えばマーカー要素）、ウイルスの必須要素若しくはその一部、又はその組合せである、或いはそれを含む、請求項９から１６のいずれか一項に記載のベクター。
18. 第２のＮＯＩがポリアデニル化シグナルを含む、請求項９から１７のいずれか一項に記載のベクター。
19. ベクター又はプロベクターがレンチウイルスから誘導可能である、請求項１から１８のいずれかに記載のベクター。
20. レンチウイルスがＨＩＶ−１又はＥＩＡＶである、請求項１から１９のいずれかに記載のベクター。
21. ベクターのシュードタイプを作製する、請求項１から２０のいずれかに記載のベクター。
22. ＶＳＶ−Ｇ、ロスリバーウイルスエンベロープ又はＧＰ６４を用いてベクターのシュードタイプを作製する、請求項１から２１のいずれかに記載のベクター。
23. ウッドチャック肝炎転写後要素（ＷＰＲＥ）をさらに含む、請求項１から２２のいずれかに記載のベクター。
24. 主要なスプライスドナーが存在しない、又は破壊されているレトロウイルスベクター。
25. レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２４に記載のレトロウイルスベクター。
26. 主要なスプライスドナーが存在しない、又は破壊されている、請求項２１から２３のいずれか一項に記載のベクター。
27. Ｔａｔエクソンの開始コドンが破壊されている、レトロウイルスベクター。
28. レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２７に記載のレトロウイルスベクター。
29. Ｔａｔエクソンの開始コドンが破壊されている、請求項２１から２６のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクター。
30. ＨＩＶ−１又はＥＩＡＶから誘導可能であるレンチウイルスベクターであって、ロスリバーウイルスのエンベロープを用いてシュードタイプとしたレンチウイルスベクター。
31. Ｔａｔタンパク質の少なくとも一部が標的細胞中で発現されないようにレンチウイルスプロベクターのＴａｔエクソンが欠失しているか、又は破壊されている、レンチウイルスプロベクターから誘導可能なレンチウイルスベクター。
32. 主要なスプライスドナーが存在しない、又は破壊されている、レトロウイルスプロベクターから誘導可能なレトロウイルスベクター。
33. レトロウイルスベクターが組み込まれたプロウイルスである、請求項１から３２のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクター。
34. 請求項１から３３のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクターから得ることができるレトロウイルス粒子。
35. 請求項１から３３のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクター又は請求項３４に記載のレトロウイルス粒子を用いて形質移入又は形質導入した細胞。
36. 医薬で用いるための、請求項１から３３のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクター又は請求項３４に記載のウイルス粒子又は請求項３５に記載の細胞。
37. １つ又は複数のＮＯＩを、それを必要としている標的部位に送達する医薬品を調製するための、請求項１から３３のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクター又は請求項３４に記載のウイルス粒子又は請求項３５に記載の細胞の使用。
38. 請求項１から３３のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクター若しくは請求項３４に記載のウイルス粒子を用いて、又は請求項３５に記載の細胞を使用して、細胞の形質移入又は形質導入を行うことを含む方法。
39. 請求項３５に記載の細胞を作製すること、前記細胞を培地中で継代すること、前記培地を除去すること、及び第VIII因子を単離することを含む、第VIII因子をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する方法。
40. 本発明による第VIII因子をコードするコドンを最適化した核酸を含む細胞を作製すること、前記細胞を培地中で継代すること、前記培地を除去すること、及び第VIII因子を単離することを含む、第VIII因子をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する方法。
    

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