CN1875107A

CN1875107A - 载体

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Publication number: CN1875107A
Application number: CNA2004800321948A
Authority: CN
Inventors: P·拉德克利菲; F·维尔克斯; S·金斯曼; K·米特罗法诺斯
Original assignee: Oxford Biomedica UK Ltd
Current assignee: Oxford Biomedica UK Ltd
Priority date: 2003-10-30
Filing date: 2004-10-28
Publication date: 2006-12-06
Also published as: JP2007510412A; EP1678311A2; GB0325379D0; US20060281180A1; WO2005052171A2; WO2005052171A3

Abstract

能够送递目的核苷酸(NOI)到需要的靶位点的慢病毒载体，其中所述NOI编码因子VIII，并且在将NOI送递到需要的靶位点之后表达因子VIII。

Description

载体

发明领域

本发明涉及载体。

具体地，本发明涉及用于在逆转录病毒颗粒中包装和表达遗传物质的新系统。

发明背景

逆转录病毒是生命周期与裂解病毒不同的RNA病毒。在这一点上，逆转录病毒是通过DNA中间物复制的传染性实体。当逆转录病毒感染细胞时，其基因组通过逆转录酶转化为DNA形式。DNA拷贝作为生产新RNA基因组和传染性病毒颗粒的组装所必须的病毒编码蛋白的模板。

在感染过程中，逆转录病毒最初附着于特定的细胞表面受体。在进入易感的宿主细胞时，逆转录病毒RNA基因组由亲本病毒内携带的病毒编码的逆转录酶拷贝为DNA。该DNA被运送到宿主细胞核，在此其随后整合到宿主基因组中。在此阶段，它通常被称作原病毒。原病毒在细胞分裂过程中在宿主染色体中是稳定的，并且其转录与其它细胞基因相似。原病毒编码制备更多的病毒所需的蛋白和包装机制，其可以通过有时称作“出芽”的过程离开细胞。

每种病毒包含称作gag、pol和env的基因，其编码毒粒蛋白和酶。在原病毒中，病毒基因组两端的侧翼是称作长末端重复(LTRs)的区域。LTRs负责原病毒的整合和转录。它们也作为增强子-启动子序列。也就是说，LTRs能够控制病毒基因的表达。通过位于病毒基因组5’末端的psi序列发生逆转录病毒RNAs的包壳作用。

LTRs自身是相同的序列，可以分为三种元件，称作U3、R和U5。U3衍生自RNA的3’末端特有的序列。R衍生自在RNA的两端重复的序列，U5衍生自RNA的5’末端特有的序列。在不同的逆转录病毒中，三种元件的大小可以显著不同。

原病毒转录的控制仍然很大程度是通过病毒LTR的非编码序列。转录起始的位点位于左手侧LTR中的U3和R之间的边界，聚腺苷酸(终止)添加位点位于右手侧LTR中的R和U5之间的边界。U3包含原病毒的转录控制元件的大多数，其包括反应于细胞转录激活物蛋白，和在某些情况下，反应于转录激活物蛋白的启动子和多个增强子序列。一些逆转录病毒具有一种或多种以下基因，如tat、rev、tax和rex，它们编码参与基因表达调节的蛋白。

原病毒DNA的转录重新产生了全长病毒RNA基因组和亚基因组大小的RNA分子，它们是通过RNA加工产生的。典型地，所有的RNA产物作为生产病毒蛋白的模板。通过翻译过程中的RNA转录物剪接和核糖体移码的组合，获得了RNA产物的表达。

RNA剪接是一种过程，通过该过程去除了间插或“内含子”RNA序列，并且将剩余的“外显子”序列进行连接，以提供用于翻译的连续读框。以多种方式修饰逆转录病毒DNA的一级转录物，并且非常类似于细胞mRNA。但是，与大多数mRNA(其中所有的内含子都被有效地剪接)不同，必须将新合成的逆转录病毒RNA二分为两个群体。一个群体保持不被剪接，以作为基因组RNA，另一个群体被剪接，以提供亚基因组RNA。

指导单剪接和多重剪接的RNA合成的复杂逆转录病毒，通过RNA上的序列与辅助基因之一，如HIV-1中的rev的蛋白产物的相互作用，调节不同基因组和亚基因组大小的RNA种类的转运和剪接。

通常将逆转录病毒用作送递系统(或者表示为送递运载体或送递载体)，用于转移NOI或多种NOIs到一个或多个目的位点等。转移可以体外、离体、体内发生，或其组合。当以这种方式使用时，逆转录病毒通常称作逆转录病毒载体或重组逆转录病毒载体。已经采用逆转录病毒载体研究逆转录病毒生命周期的各个方面，包括受体使用、逆转录和RNA包装(由Miller，1992 Curr Top Microbiol Immunol158：1-24综述)。

在用于基因治疗的典型重组逆转录病毒载体中，可以从病毒除去一个或多个gag、pol和env蛋白编码区的至少一部分。这使得逆转录病毒成为复制缺陷型。除去的蛋白甚至可以由NOI替代，以产生能够将其基因组整合到宿主基因组中的病毒，但由于缺乏结构蛋白，其中修饰的病毒基因组自身不能够繁殖。当整合到宿主基因组时，发生NOI的表达-例如，导致治疗和/或诊断作用。这样，通常通过以下过程将NOI转移到目的位点：将NOI整合到重组病毒载体中；将修饰的病毒载体包装到毒粒外壳中；并且允许感兴趣位点的转导-如靶定的细胞或靶定的细胞群。

可以繁殖和分离一定量的逆转录病毒(如，制备合适滴度的逆转录病毒载体)，以便随后利用包装或辅助细胞系和重组载体的组合，转导例如目的位点。

在一些情况下，繁殖和分离可以导致逆转录病毒gag、pol和env基因的分离，以及将它们独立地导入宿主细胞，以生产“包装细胞系”。包装细胞系产生包装逆转录病毒DNA所需的蛋白，但由于缺乏psi区，它不能带来包壳作用。但是，当将携带NOI和psi区域的重组载体导入包装细胞系时，辅助蛋白可以包装psi阳性重组载体，以制备重组病毒原种。可以将其用于转导细胞，以将NOI导入细胞的基因组。基因组缺乏制备病毒蛋白所需的所有基因的重组病毒只能转导一次，并且不能繁殖。这些只能进行单轮靶细胞转导的病毒载体被称作复制缺陷载体。因此，在没有产生潜在有害的逆转录病毒的条件下将NOI导入宿主/靶细胞基因组。关于可获得的包装细胞系的总结描述于“Retroviruses”(1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds：JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus pp 449)。

开发慢病毒系统已经引起了相当大的兴趣。该兴趣首先来自用基于HIV的载体将抗HIV治疗基因靶定到HIV易感细胞的概念，其次来自以下预测：由于慢病毒能够感染非分裂细胞(Lewis & Emerman1993 J.Virol.68，510)，基于这些病毒的载体系统能够转导非分裂细胞(例如Vile & Russel 1995 Brit.Med.Bull.51，12)。已经生产了基于HIV的载体系统(Buchschacher & Panganiban 1992 J.Virol.66，2731)，并且已经将它们用于转导CD4+细胞，并且如同预期，用于转导非分裂细胞(Naldini et al，1996 Science 272，263)。此外慢病毒载体使得目的基因能够进行非常稳定的长期表达。对于体内转导大鼠神经元细胞而言至少是一年(Biennemann et al，2003 Mol.Ther.5，588)。基于MLV的载体仅仅能够表达目的基因六周。

有时，在生长慢病毒载体时，不希望在生产细胞中表达治疗基因，因为这可能导致由各种机理引起的病毒滴度减少。为了防止，可以按照我们的WO99/15683和WO00/56910中的描述采用分裂的内含子构造的载体。但是，由LTP启动子导致的表达水平通常低于由内部启动子导致的表达水平。

A型血友病影响5000分之一的男性，并且是由于血浆中的因子VIII蛋白缺乏导致的。根据血液中的因子VIII水平，A型血友病分为轻度、中度和严重形式。50％的A型血友病患者具有疾病的严重形式，特征在于自发和延长的出血事件。

因子VIII是凝血途径中的辅因子。在血液中循环的因子VIII是与其载体蛋白von Willebrand因子非共价复合的。该相互作用稳定了因子VIII并且防止因子VIII与膜表面的缔合。经过凝血酶或因子Xa对因子VIII的蛋白水解，因子VIII转化为其活性状态，即因子VIIIa。人类因子VIII合成为单链多肽，预测分子量为265kDa。因子VIII基因编码2351个氨基酸，该蛋白在细胞内加工，以产生异二聚体，其中主要包含含有A1、A2和B结构域的200kDa的重链和含有A3、C1和C2结构域的80kDa的轻链(Kaufman et al.，J.Biol.Chem.，263：6352-6362[1988])。单链多肽和异二聚体都作为无活性的前体在血浆中循环(Ganz et al.，Eur.J.Biochem.，170：521-528[1988])。通过A2和B结构域之间的凝血酶切割而起始血浆中的因子VIII激活，这释放出B结构域，并且得到由A1和A2结构域组成的重链。蛋白水解的因子VIIIa从Willebrand因子解离。形成了含有因子VIIIa和因子IXa的膜结合复合物，随后在凝血级联中激活因子X。血友病可能由导致终止密码子的点突变、缺失或突变造成(参见Antonarakis et al.，Mol.Biol.Med.，4：81[1987])。

目前，通常通过将纯化的因子VIII输入血液而治疗A型血友病。尽管治疗血友病的该方法确实减少了出血的频率和严重程度，该治疗受到以下因素的限制：因子VIII的可获得性和价格、因子VIII的体内半衰期短、和去除污染性AIDS和肝炎病毒的必要性。尽管目前可以获得重组的因子VIII，但该形式的因子VIII维持治疗是昂贵和长期的。

基因治疗是A型血友病的蛋白输注治疗的有吸引力的替代疗法。可以使用两种基因治疗方法。体内基因治疗将编码因子VIII蛋白的核苷酸导入患者的细胞。离体基因治疗技术将编码因子VIII蛋白的核苷酸导入体外培养的细胞。然后将转化的培养细胞再植入患者。

因子VIII的生物来源和分泌的研究受到了缺乏表达大量因子VIII的细胞系的限制。对分泌的分析限于自体基因表达。概言之，这些研究表明因子VIII具有低表达水平。例如，参见Lenting et al.(1998)Blood 92：3983-3996，Connelly et al.(1996)Human Gene Therapy 7：183-195，Kaufman et al.(1989)Mol.Cell.Biol.9：1233，Dorner et al.(1987)J.Cell Biol.105：2665及其中引用的参考文献。

对人类和犬的研究表明在肝脏移植后因子VIII的水平上升到正常值，肝脏移植过程中可以没有因子VIII的肝外合成。这表明肝脏合成了临床显著量的因子VIII蛋白。本领域公知，肝细胞表达因子VIII，但是关于其它类型的肝脏细胞是否合成因子VIII还有争议。参见综述Bloom et al.(1979)Clin.Haematol.8：53-77和Lenting(1998)Blood92：3983-3996，在此引入这两篇文献作为参考。

目前正在研究治疗A型血友病的许多不同的基因治疗方法。离体基因治疗技术发现因子VIII蛋白表达在转导的体外培养细胞中很低，并且在体内是检测不到的(Lynch et al.(1993)Hum.Gene Therapy 4：259；Chuah et al.(1995)Hum.Gene Ther.6：1363；Hoeben et al.(1990)J.Biol.Chem.265：7318；Hoeben et al.(1993)Hum.Gene Ther.4：179；Israel et al.(1990)Blood 75：1074和van der Eb(1996)J.Clin.Biochem.Nutr.21：78-80；在此全部引入作用参考)。这表明需要开发使得能够进行高水平因子VIII表达的构建体。

美国转录6221349和6200560都公开了在腺伴随病毒载体中含有因子VIII的基因治疗构建体。

尽管文献中已知将因子VIII基因引入逆转录病毒载体通常导致低载体滴度，这通常是归因于基因内的转录沉默子和/或缺乏基因上游的内含子。还没有报道由于生产细胞中的因子VIII蛋白的表达导致的功能性病毒颗粒生产的干扰。在该领域中大量研究都没有发现这一观点，这是出乎意料的。

本发明提供能够提供在一个或多个靶位点的目的核苷酸(NOI)-或甚至多个NOIs-有效表达的新的逆转录病毒载体。

本发明也提供用于有效制备一定滴度的毒粒载体的方法，该滴度的毒粒载体掺入了用于体内使用的安全性特征，并且能够在一个或多个靶位点的NOI-或甚至多个NOIs-的有效表达。

在一个实施方案中，本发明的载体可以用于治疗血友病。具体地，它提供了一种途径，其中可以以用于有效基因治疗的足够高的滴度生产基于慢病毒的因子VIII表达载体。在另一方面，使得因子VIII能够在组织特异性启动子(如肝特异性启动子)的控制下表达。

根据本发明的一个方面，提供了能够将目的核苷酸(NOI)送递到需要的靶位点，并且其中仅仅在需要的靶位点表达编码因子VIII和因子VIIIa的NOI的慢病毒载体。

根据本发明的另一方面，提供了包含编码并且能够表达因子VIII的核苷酸序列的逆转录病毒载体，其中所述核苷酸序列与组织特异性启动子可操作性连接。

据报道，在将cDNA转染到哺乳动物细胞之后的因子VIII表达比通常用其它基因获得的表达低2-3个数量级。Kaufman et al(1989 Mol.Cell Biol.9：1233-42)报道了三个不同的原因：

1.因子VIII mRNA的低效表达。

2.一级翻译产物从内质网到高尔基体的低效转运

3.需要高水平的Willebrands’因子(vWF)以促进蛋白的稳定聚集。

已经提出了多种因素，其可以限制因子VIII mRNA在转染的细胞中的聚集，包括转录减弱(Hoeben et al 1995 Blood 85：2447-54；Koeberlet al 1995 Human Gene Ther.6：469-79；Fallaux et al 1996 Mol.Cell Biol.16：4264-72)。但是，Kaufman等(1989，出处同上文)提出主要的限速步骤是转录后水平。发现因子VIII上游的内含子的引入显著改进了表达(Chuah et al 1995 Human Gene Ther.6：1363-77；Dwarki et al1995 Proc Natl Acad Sci.USA 92：1023-7；Chuah et al 1998 Human GeneTher.9：353-65；VandenDriessche et al 1999 Proc Natl Acad Sci.USA96：10379-84)。

根据本发明的另一方面，提供了编码编码因子VIII并且为在哺乳动物细胞中有效表达而进行了密码子优化的多核苷酸序列。

对因子VIII基因进行密码子优化的原理是改进翻译效率。通过去除抑制元件而对因子VIII mRNA聚焦的显著增强，被认为不太可能是以前尝试过，并且是不成功的这种策略：推定的1.2kb的抑制区的保守诱变不能导致因子VIII表达的显著增加(Chuah et al 1995，出处同上文)。实际上，置疑了转录抑制元件的真实存在(Kaufman，1999 HumanGene Ther.10：2091-107)。密码子优化在改进从病毒表达基因，如HIV-1 GagPol(Kotsopoulou et al 2000 J.Virol.74：4839-52)和Cre重组酶(Koresawa 2000 Transplant Proc.32：2516-7)、从细菌表达例如四环素阻遏物(Wells 1999 Transgenic Res.8：371-81)和从水母Aequorea Victoria(Haas et al 1996 Curr Biol.6：315-24)表达绿色荧光蛋白中非常成功。由于这些生物与哺乳动物是高度趋异的，对这些基因进行再工程化以符合高度表达的人类蛋白的密码子偏倚，预计可能导致表达的显著改进。哺乳动物基因不像例如埃希氏菌属那样表现高度的密码子偏倚。

然而，作为表达差的基因，我们决定对因子VIII基因的密码子进行再工程化。以前发现因子VIII mRNA的翻译效率与检验的两种其它mRNA：vWF和二氢叶酸还原酶(Kaufman et al，1989出处同上文)相似，因此，预计基因表达的增强是中度的。尽管如此，考虑这将是有价值的方法，因为该基因表达的改进可以用于开发A型血友病基因治疗。

出乎意料的是，我们发现密码子优化使因子VIII的表达改进了大约20倍。考虑以下几点，改进的强度是出乎意料的：

1.因子VIII是一种人类基因，因此与再工程化病毒或细菌基因，或来自不同物种的基因相比，预计任何益处都是中度的。

2.以前用相似的策略(近四分之一的cDNA的保守诱变)没能改进表达。

3.已经研究了mRNA的翻译，发现是低效的。

在一个高度优选的实施方案中，密码子优化是基于高度表达的人类基因的密码子选择(Haas et al 1996，Curr.Biol.6，315)。参见图15所示的因子VIII基因表。密码子优化的因子VIII基因的优选实施方案示于图19和图21(碱基20到7072)。

根据本发明的另一方面，提供了能够送递第一种目的核苷酸(NOI)并且可衍生自逆转录病毒原-载体(pro-vector)的逆转录病毒载体，其中所述逆转录病毒原-载体包含与内部启动子可操作性连接的第一种NOI和在第一种NOI和内部启动子之间的第二种NOI，使得第二种NOI能够被切除，并且其中启动子、第一种NOI和第二种NOI处于反向互补方向，并且任选地，其中第二种NOI在第一种NOI的读框外。

在优选实施方案中，与密码子优化的因子VIII和/或因子VIII一起使用的病毒载体基因组与具有至少一个以下特征的组织特异性启动子可操作性连接：

1.存在WPRE

2.主要剪接供体突变

3.部分Tat ORF破坏

4.使任何可能的从上游ORFs开始的读码最少，可以在读框外克隆因子VIII ORFs。

本发明涉及载体构建体，其使得能够在不表达治疗基因的条件下，在包装细胞中生产重组载体。这是通过将优选在读框外的，任选具有其自身的启动子的含有ORF(开放读框)或其至少一部分的内含子插入在启动子和治疗基因之间而实现的。ORF可以编码任何基因，包括，但不限于，报道基因，如lac Z和GFP或抗生素抗性基因。ORF也处于反向互补方向，并且因为它是在内部启动子下游遇到的第一个ORF，通过转录机制，它在治疗基因之前翻译。翻译在ORF的末端的终止信号终止。为了进一步使表达治疗基因的可能性最小，可以将聚腺苷酸化信号(也处于内含子内)加入在第一ORF之后。这将辅助翻译终止，以及减少超过该点的反向互补链的转录。

为了在靶细胞中表达第一种NOI，需要在载体基因组转录物中除去内含子内的ORF。这是通过以正确方向存在侧翼于该区的剪接供体和剪接受体位点而确保的，以便在包装之前剪接基因组转录物。在rev的存在下，内含子保持在原有的位置。在rev不存在时，内含子被切除，从而也除去了ORF。在通过后者转导的靶细胞中，将正常表达治疗基因。也就是说，该策略利用了在不存在rev的条件下生产载体的能力。将在生产细胞中表达由ORF编码，并且不是治疗性的蛋白。但是，将在包装之前，从基因组转录物切除ORF。由于第一ORF被从基因组转录物切除，将在整合后在转导的细胞中表达治疗基因。

根据本发明，每一种NS都可以是合适的核苷酸序列。例如，每种序列可以独立地是DNA或RNA-可以是合成制备的或可以通过使用重组DNA技术制备，或可以从天然来源分离，或可以是其组合。该序列可以是有义序列或反义序列。可以存在多个序列，它们可以彼此直接或间接连接，或其组合。

第二种NOI可以包括已经成功用于逆转录病毒载体的以下选择标记物中的一种或多种：分别赋予对G418和潮霉素抗性的细菌新霉素和潮霉素磷酸转移酶基因(Palmer et al 1987 Proc Natl Acad Sci 84：1055-1059；Yang et al 1987 Mol Cell Biol 7：3923-3928)；赋予氨甲喋呤抗性的突变的小鼠二氢叶酸还原酶基因(dhfr)(Miller et al 1985 MolCell Biol5：431-437)；使得细胞能够在含有霉酚酸、黄嘌呤和氨基蝶呤的培养基中生长的细菌gpt基因(Mann et al 1983 Cell 33：153-159)；使得细胞能够在不含组氨酸，但是含有组氨醇的培养基中生长的细菌hisD基因(Danos and Mulligan 1988 Proc Natl Acad Sci 85：6460-6464)；赋予多种药物抗性的多药物抗性基因(mdr)(Guild et al 1988Proc Natl Acad Sci 85：1595-1599；Pastan et al 1988 Proc Natl Acad Sci85：4486-4490)，和赋予嘌呤霉素或腐草霉素抗性的细菌基因(Morgenstern and Land 1990 Nucleic Acid Res 18：3587-3596)。

所有这些标记物都是显性的选择标记物，使得能够对表达这些基因的大多数细胞进行化学选择。也可以将GFP/β-半乳糖苷酶认为是显性标记物；可以通过使用荧光激活的细胞分选器选择表达GFP/β-半乳糖苷酶的细胞。实际上，任何细胞表面蛋白都能够提供不产生该蛋白的细胞的选择标记物。可以通过使用蛋白的荧光抗体和细胞分选器，选择表达蛋白的细胞。包括在载体中的其它选择标记物包括hprt和HSV胸苷激酶，它们允许细胞在含有次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸苷的培养基中生长。

第二种NOI可以包含使得第一种NOI在包装细胞中不翻译的非编码序列(例如，聚腺苷酸化信号)，但是当通过转导之后的剪接除去后，随后第一NOI显示出来，用于功能表达。

第二种NOI也可以编码病毒必须元件，如编码可以降低生产系统的复杂程度的Env蛋白的env。

合适的第一种NOI编码序列包括具有治疗和/或诊断用途的那些，例如，但不限于编码以下分子的序列：编码细胞因子、趋化因子、激素、抗体、工程化的免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、酶、免疫共刺激分子、免疫调节分子、抗反义RNA、靶蛋白的反式显性失活突变体、毒素、条件毒素、抗原、肿瘤阻抑蛋白和生长因子、膜蛋白、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶、及其衍生物(如，具有相关的报道基团)。

第一种NOI编码序列可以编码融合蛋白，或者编码序列的片段。

附图说明

图1表示根据本发明的第一方面的载体的示意图。SD＝剪接供体，SA＝剪接受体，pA＝聚腺苷酸化信号，BGH＝牛生长激素，syn＝合成的，Ψ＝包装信号。

图2表示根据本发明的一方面的整合载体的示意图。

图3表示侧翼于因子VIII的B结构域的氨基酸序列。更具体地，是A2序列(从737到740)、A3序列(从1690到1696)。示出了在蛋白水解激活过程中由凝血酶切割的位点(加框的)。通过将Ser743与Gln1638融合，制备了因子VIII的SQ形式，而通过去除残基760-1639(将Thr759与Pro1640融合)，制备了LA形式。认为Arg740和Glu1649对因子VIII的加工是重要的。因此，SQ形式在90kDa链的C末端(Arg740)和80kDa轻链的N末端之间具有14个氨基酸的接头。

图4表示人α1-抗胰蛋白酶启动子(305bp)的示意图(Kramer et al(2003)Mol Ther.7：375-85)。更具体地，示出了特异性(C/EBP，CCAAT增强子结合蛋白α或β；HNF，肝细胞核因子)和非特异性(AP-1)转录激活因子。描绘了非肝细胞中存在的推定的阻遏因子的结合区(De Simone and Cortese 1989)。针对加帽位点示出了坐标。示出了调节元件：DE，远端元件；TSE，组织特异性元件，TATA盒。

图5表示通过PERT(性能增强的逆转录)分析测量的病毒载体制备物的预测滴度。载体基因组从CMV启动子表达LacZ或因子VIII。

图6表示具有CMV和组织特异性启动子的载体的RNA基因组水平。更具体地，从hAAT(暗)或ICAM-2(亮)启动子表达GFP、LacZ和因子VIII的载体的预测滴度。也与对照一起制备了含有内部CMV启动子的载体(NCG＝pONY8.95NCG，NCZ＝pONY8.95NCZ，NCF＝pONY8.7NCF)。用Ross河病毒(RRV)或埃博拉包膜对载体进行假型化。

图7表示293T细胞中的启动子活性。更具体地，用从内部启动子(示出的)表达GFP的基因组转染293T细胞，通过相差或UV显微镜观察。

图8表示用指出的载体转导的HepG2和293A细胞。

图9表示用指出的载体转导的HUVEC细胞。

图10表示整合测定的结果：hAAT和CMV启动子。更具体地，用指出的载体(RRV-假型化的)转导293A细胞。传代和DNA提取后，通过实时PCR测量EIAVΨ水平。

图11表示整合测定的结果：ICAM2和CMV启动子。更具体地，用指出的载体(埃博拉-假型化的)转导293A细胞。传代和DNA提取后，通过实时PCR测量EIAVΨ水平。

图12表示当用第二基因组共转染时的pONY8.95NCZ(VSV-G)滴度。更具体地，将等量的pONY8.95NCZ质粒和指出的质粒用于转染。示出了得到的LacZ滴度。

图13表示HIV、MLV和EIAV的D17滴度：因子VIII基因组混合。更具体地，通过用最优化比例的质粒成分转染而制备HIV(pH7G)、MLV(pHIT111)和EIAV(pONY8.7NCZ)载体。向转染混合物中加入2μg指出的质粒。示出了D17滴度(集落形成单位)。

图14表示具有Tat外显子1和/或主要剪接供体1的突变的pONY8.4NCZ(SINMIN)载体的D17滴度。

图15表示因子VIII基因的密码子选择表。

图16表示COATEST的结果。

图17表示通过蛋白量和活性测定对野生型和密码子优化的因子VIII基因进行的比较。

图18表示来自用编码因子VIII的EIAV载体转导的HepG2s的上清液的蛋白质印迹(泳道1：未转导的；泳道2：COx1；泳道3：COx1；泳道4：WTx10；泳道5：未转导的；泳道6：pONY8.95 NAF；泳道7：pONY8.95NAF；泳道8：标记物；泳道9：标记物；泳道10：rFVIII)。

图19表示根据本发明的密码子优化的因子VIII核苷酸序列。

图20表示命名为pONY8.95NAFβ的pONY8.95主链中的全长的、密码子优化的因子VIII基因的示意图。

图21表示pONY8.95NAFβ的完整序列。

图22表示全长的、密码子优化的序列的翻译。

图23表示含有密码子优化的全长因子VIII(NAFb)、野生型因子VIII(NAFa)、B结构域缺失的因子VIII(NASqwt)和密码子优化的B结构域缺失的因子VIII(NAF)的pONY8.95-hAAT载体的滴度比较。

图24表示293T生产细胞中因子VIII的表达对VSV-G包膜浓度的影响。

图25表示当用不同包膜蛋白假型化时，因子VIII表达对病毒载体生产的影响。

发明详述

现在通过非限定性的实施例对本发明的各个优选特征和实施方案进行描述。

除非指出相反的意思，本发明的实施将使用常规的化学、分子生物、微生物、重组DNA和免疫学技术，这些技术在本领域技术人员的能力范围内。所述技术在文献中解释。参见，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Second Edition，Books 1-3，Cold Spring Harbor LaboratoryPress；Ausubel，F.M.et al.(1995 and periodic supplements；CurrentProtocols in Molecular Biology，ch.9，13，and 16，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，and A.Kahn，1996，DNAIsolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley&Sons；J.M.Polak and James O’D.McGee，1990，In Situ Hybridization：Principles and Practice；Oxford University Press；M.J.Gait(Editor)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，Irl Press；and，D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNAStructure Part A：Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods inEnzymology，Academic Press。在此引入这些文献的内容作为参考。

因子VIII基因

本发明优选涉及产生人类因子VIII或其同源物或功能性衍生物的治疗性NOI的用途。功能性的人类因子VIII的序列在美国专利5,618,788中给出。

在一种实施方案中，我们构建了全长的密码子优化的因子VIII基因。

存在许多B结构域缺失的因子VIII基因衍生物；即，其中缺失了没有必须功能的B结构域分子的衍生物，所述衍生物可以用于本发明。

在一种实施方案中，我们将合成基因基于已经进行了充分的生化表征的“LA”形式(Pittman et al 1993)。从LGC(ATCC#53100)购买了该构建体的前体pDGR-2(Toole et al 1986)，以比较野生型和密码子优化的基因。构建了两种基因的密码子优化和野生型形式。

在另一种实施方案中，我们通过重叠PCR，从合成基因构建了更短的“SQ”形式。

侧翼于因子VIIIB结构域的氨基酸序列示于图3。

密码子优化的因子VIII核苷酸序列的例子示于图19和图21(见碱基20-7072)。

构建具有组织特异性启动子的基因组肝脏特异性启动子

人类α₁-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子被认为是肝脏特异性启动子。在一项最近的研究中，在体外和通过水动力学送递在小鼠中检验了白蛋白、人类α₁-抗胰蛋白酶和血红素结合蛋白启动子(单独的，或与增强子区组合)(Kramer et al 2003，出处同上文)。从长期研究(50天)得到的体内数据表明，人α₁-抗胰蛋白酶启动子导致稳定水平的报道基因表达。在一项较早的研究中，在逆转录病毒载体的范围中比较了hAAT、小鼠白蛋白、大鼠磷酸烯醇式丙酮酸羧基激酶(PEPCK)和大鼠肝脏脂肪酸结合蛋白启动子，发现hAAT启动子导致最高的表达(Hafenrichter et al 1994 Blood 84：3394-404)。但是，可以使用上述任何肝脏启动子。

选择hAAT启动子用于检验。基于上文引用的Kramer et al 2003中的描述，进行了一些修改，用引物通过PCR从HT1080基因组DNA克隆启动子。所使用的引物是：

(包括限制性位点和突出端)：

HA ATN：TATGAGCGGCCGCGTACCCGCCACCCCCTCCACCTTGG

(包含NotI位点)

HAATP：ATCATGCACGTGTTCACTGTCCCAGGTCAGTGGTG

(包含PmlI位点)

启动子的示意图示于图4。

也可以使用肝脏特异性增强子元件，如人类血清白蛋白增强子、人类凝血酶原增强子、α-1微球蛋白增强子和内含醛缩酶增强子。用于本发明的组织特异性启动子可以包括一种或多种增强子，例如，但不限于，来自于载脂蛋白E(ApoE)基因的肝脏基因座控制区(HCR)、乙型肝炎病毒(HBV)增强子2元件和白蛋白增强子。

内皮特异性启动子

许多文献描述了可以用于本发明的内皮特异性启动子的分析，所述启动子包括，fms样酪氨酸激酶1(Flt-1/VEGF受体-1)、细胞内粘附分子-2(ICAM-2)、von Willebrand因子(vWF)、VEGF受体-2(Flk-1/KDR)、endoglin(Nicklin et al 2001 Hypertension 38：65-70；Kappel et al 1999 Blood 93：4284-92；Cowan et al 1998 J.Biol Chem.273：11737-44；Velasco et al 2001 Gene Ther.8：897-904)和tie启动子，如tie 1和2(Korhonen et al 1 Blood 86：1828-35)。

可以基于上文引用的Nicklin et al 2001中的描述，用引物从293T基因组DNA扩增ICAM-2启动子。

防止转基因在生产细胞中表达

在高度优选的实施方案中，将缺失B结构域的因子VIII基因插入本发明的第一个方面的载体中，处于人类α₁-抗胰蛋白酶(hAAT)肝脏特异性启动子的控制下。这使得载体能够以足够高的滴度生产，以用于基因治疗中缓解血友病。避开了由在生产细胞中表达因子VIII而导致的载体生产的问题。

由于在生产细胞中表达因子VIII似乎减少了滴度，设计了防止这些细胞中的表达的替代策略。该策略利用在不存在Rev的条件下生产新的EIAV载体世代的能力。将开放读框(ORF)插入内部启动子和治疗基因之间，所有这些都是处于反向方向。因此将在生产细胞中表达由该ORF编码的非治疗性的蛋白。ORF及其聚腺苷酸化信号包含在内含子中，使得在包装前(不存在Rev)该信号从基因组切除。如图1所示。

由于第一ORF已经被从基因组转录物中切除，在整合后将在转导的细胞中表达治疗基因(图2)。

为了检验该策略，构建了如图1所描述的含有LacZ和GFP报道基因的载体。通过使用这些载体，LacZ蛋白表达在生产细胞中是最少的，但在转导时获得了高水平表达。

逆转录病毒

如本领域公知的，载体是允许或促进将一种实体从一个环境转移到另一个环境的工具。根据本发明，并且通过举例，用于重组DNA技术的一些载体，使得实体，如DNA片段(如异源DNA片段，如异源cDNA片段)被转移到宿主细胞，以便复制包含DNA片段的载体。用于重组DNA技术的载体的实例包括，但不限于，质粒、染色体、人工染色体或病毒。

术语“表达载体”表示能够体内或体外/离体表达的构建体。

用于本发明各方面的逆转录病毒载体可能衍生自或者可能可衍生自任何合适的逆转录病毒。已经鉴定了许多不同的逆转录病毒。其实例包括：鼠白血病病毒(MLV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类T细胞淋巴瘤病毒(HTLV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)，莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、禽类成髓细胞瘤病毒-29(MC29)和禽类成红细胞瘤病毒(AEV)。逆转录病毒的详细列表可以参见Coffin et al.，1997，“retroviruses”，Cold Spring HarbourLaboratory Press Eds：JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus pp 758-763。

逆转录病毒可以广泛地分为两类：即，“简单的”和“复杂的”。逆转录病毒甚至可以进一步分为7组。其中的5组代表具有致癌可能的逆转录病毒。其余的两组是慢病毒属和泡沫病毒属。这些逆转录病毒的综述见Coffin et al.，1997(出处同上文)。

在用于本发明方法中的典型载体中，可以从病毒除去编码复制必须的区域的一种或多种蛋白的至少一部分。这使病毒载体成为复制缺陷的。也可以用与载体基因组中的调控区和报道部分可操作性连接的编码候选调节部分的文库代替病毒基因组的部分，以便制备包含候选调节部分的载体，所述部分能够将非分裂的靶宿主细胞转导到宿主基因组中和/或将其基因组整合到宿主基因组中。

优选地，能够转导非分裂的靶细胞或缓慢分裂的细胞的病毒载体是慢病毒载体。

慢病毒载体是一组较大的逆转录病毒载体的部分。慢病毒的详细列表可以参见Coffin et al(“Retroviruses”1997 Cold Spring HarbourLaboratory Press Eds：JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus pp 758-763)。简言之，慢病毒可以分为灵长类动物和非灵长类动物组。灵长类动物慢病毒的实例包括，但不限于：人类免疫缺陷病毒(HIV)，即人类自身免疫缺陷综合征(AIDS)的致病剂和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类动物慢病毒组包括原型“慢病毒”绵羊髓鞘脱落病毒/maedi病毒(VMV)，以及相关的山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和最近描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。

慢病毒科和其它类型的逆转录病毒之间的区别是慢病毒具有感染分裂和非分裂细胞这两者的能力(Lewis et al 1992 EMBO.J 11：3053-3058；Lewis and Emerman 1994 J.Virol.68：510-516)。相反，其它逆转录病毒-如MLV-不能感染非分裂的或缓慢分裂的细胞，如组成，例如肌肉、脑、肺和肝组织的那些。

此处使用本发明的某些方面中的“非灵长类动物”载体是指衍生自主要不感染灵长类动物，特别是人的病毒的载体。因此，非灵长类动物病毒载体包括感染非灵长类哺乳动物，如狗、羊和马、爬行动物、鸟类和昆虫的载体。

此处使用的慢病毒或慢病毒载体是包含可衍生自慢病毒的至少一种组成部分的载体。优选地，该组成部分参与载体感染细胞、表达基因或复制的生物机制。术语“可衍生自”以其常规意义使用，表示不一定从逆转录病毒获得该序列，而是可以由其衍生。例如，该序列可以合成制备或使用重组DNA技术制备。

非灵长类动物慢病毒病毒可以是慢病毒科的任何成员，其天然不感染灵长类动物，可以包括猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、Maedi绵羊髓鞘脱落病毒(MVV)或马传染性贫血病毒(EIAV)。优选地，慢病毒是EIAV。马传染性贫血病毒感染所有的马科动物，导致血浆病毒血症和血小板减少症(Clabough，et al.1991.J Virol.65：6242-51)。通过单核细胞成熟为巨噬细胞的过程控制病毒复制。

在一个实施方案中，病毒载体衍生自EIAV。EIVA具有慢病毒的最简单基因组结构，并且特别优选用于本发明。除gag、pol和env基因外，EIAV编码三种其它的基因：tat，rev和S2。Tat作为病毒LTR的转录激活物(Derse and Newbold 1993 Virology.194：530-6；Maury，et al 1994 Virology.200：632-42)，Rev调节并协调通过rev反应元件(RRE)进行的病毒基因表达(Martarano et al 1994 J Virol.68：3102-11)。认为这两种蛋白的作用机制广泛类似于灵长类动物病毒中的类似机制(Martano et al，出处同上文)。S2的功能是未知的。此外，一种EIAV蛋白，Ttm，已经被鉴定为由tat的第一个外显子编码，该外显子被剪接到跨膜蛋白的起始处的env编码序列。

除蛋白酶、逆转录酶和整合酶外，非灵长类动物慢病毒包括第四个pol基因产物，其编码dUTP酶。它可能在这些慢病毒感染某些非分裂的细胞类型的能力中起作用。

本发明这方面的病毒RNA由病毒或非病毒来源的启动子转录，所述启动子能够指导真核细胞，如哺乳动物细胞中的表达。任选将增强子添加到启动子上游或下游。在慢病毒3’LTR提供的聚腺苷酸化位点或不同的聚腺苷酸化信号处终止RNA转录物。

因此，本发明使用包含启动子和任选包含能够指导非灵长类动物慢病毒载体基因组表达的增强子的DNA转录单位。

此处描述的转录单位包括含有能够被转录的序列的核酸区域。因此，编码mRNA、tRNA和rRNA的序列包含在该定义中。所述序列可以与启动子处于有义或反义方向。反义构建体可以用于根据公知技术抑制细胞中的基因表达。核酸可以是，例如，核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)或其类似物。编码mRNA的序列任选包含一些或全部的5′和/或3′转录的但未翻译的侧翼序列，所述序列是天然的，或与翻译的编码区相关。它可以任选进一步包含与转录的序列正常相关的相关转录控制序列，例如转录终止信号、聚腺苷酸化位点和下游增强子元件。核酸可以包括cDNA或基因组DNA(其可以包含内含子)。

逆转录病毒基因组的基本结构是5’LTR和3’LTR，其间或内部包含使基因组能够被包装的包装信号、引物结合位点、使得能够整合到宿主细胞中的整合位点和编码包装成分的gag、pol和env基因-所述包装成分是病毒颗粒组装必须的多肽。更复杂的逆转录病毒具有其它的特征，如HIV中的rev和RRE序列，它们使得整合的原病毒的RNA转录物能够有效地从受感染靶细胞的细胞核转运到细胞质。

在原病毒中，这些基因的两端的侧翼是称作长末端重复(LTRs)的区域。LTRs负责原病毒整合和转录。LTRs也作为增强子-启动子序列，并且能够控制病毒基因的表达。通过位于病毒基因组5’末端的psi序列发生逆转录病毒的包壳作用。

在缺陷型逆转录病毒载体基因组中，gag，pol和env可以不存在或者无功能。在RNA两端的R区是重复的序列。U5和U3分别代表RNA基因组5’和3’末端的独特序列。

根据本发明的一方面使用的优选载体是重组非灵长类动物慢病毒载体。

术语“重组慢病毒载体”(RLV)是指在包装成分的存在下，具有足够的逆转录病毒遗传信息以将RNA基因组包装到能够感染靶细胞的病毒颗粒中的载体。靶细胞的感染包括逆转录和整合到靶细胞基因组中。RLV携带将被载体送递到靶细胞中的非病毒编码序列。RLV不能够独立复制以生产最终的靶细胞内的传染性逆转录病毒颗粒。RLV通常缺乏功能性gag-pol和/或env基因和/或复制所必须的其它基因。本发明的载体可以构造为分裂-内含子载体。分裂内含子载体描述于PCT专利申请WO 99/15683。

本发明的慢病毒载体优选具有最小病毒基因组。

此处使用的术语“最小病毒基因组”表示病毒载体经过操作以除去非必须元件，并且保留必要元件，以提供将目的核苷酸序列感染、转导和送递到靶宿主序列的所需的功能。该策略的其它细节可以见我们的WO98/17815。

因此，用于本发明的最小慢病毒基因组包含(5’)R-U5-一个或多个第一种核苷酸序列-U3-R(3’)。但是，用于在宿主细胞/包装细胞中产生慢病毒基因组的质粒载体也将包含与慢病毒基因组可操作性连接的转录调控序列，以指导基因组在宿主细胞/包装细胞中的转录。这些调节序列可以是与转录的逆转录病毒序列，即5’U3区相关的天然序列，或者，它们可以是异源启动子，如另一种病毒启动子，如CMV启动子。一些慢病毒基因组需要额外的序列用于有效的病毒生产。例如，在HIV的情况下，优选包括rev和RRE序列。但是可以通过密码子优化减少或消除对rev和RRE的要求。该策略的进一步的细节可以参见我们的WO01/79518。与rev/RRE系统起相同功能的其它序列也是公知的。例如，在Mason Pfizer猴病毒中发现了rev/RRE系统的功能类似物。这被称作CTE，并且在基因组中包含RRE型序列，该序列被认为与受感染细胞中的因子相互作用。细胞因子可以被认为是rev类似物。这样，CTE可被用作rev/RRE系统的替代物。已知或可获得的任何其它功能等同物可以与本发明相关。例如，已知HTLV-I的Rex蛋白可以功能性代替HIV-1的Rev蛋白。也已知Rev和Rex与IRE-BP具有相似的作用。

在本发明的一种实施方案中，慢病毒载体是自我灭活的载体。

例如，通过去除3′LTR的U3区中的转录增强子或增强子和启动子，构建了自我灭活的逆转录病毒载体。在一轮载体逆转录和整合后，这些改变被拷贝到5′和3′LTRs，产生无转录活性的原病毒(Yu et al1986 Proc Natl Acad Sci 83：3194-3198；Dougherty and Temin 1987 ProcNatl Acad Sci 84：1197-1201；Hawley et al 1987 Proc Natl Acad Sci 84：2406-2410；Yee et al 1987 Proc Natl Acad Sci 91：9564-9568)。但是，所述载体中的LTRs内部的任何启动子将仍然具有转录活性。已经用该策略消除病毒LTRs中的增强子和启动子对从内部基因转录的作用。所述作用包括增加转录(Jolly et al 1983 Nucleic Acids Res 11：1855-1872)或抑制转录(Emerman and Temin 1984 Cell 39：449-467)。也可以将该策略用于消除从3’LTR到基因组DNA的下游转录(Hermanand Coffin 1987 Science 236：845-848)。这在人类基因治疗中引起了特别的关注，其中防止内源癌基因的偶然激活是特别重要的。

在我们的WO99/32646中，我们详细描述了可以有利地用于本发明的特征。具体地，可以理解，非灵长类动物慢病毒基因组(1)优选包含缺失的gag基因，其中gag中的缺失除去了gag编码区的大约核苷酸350或354下游的一个或多个核苷酸；(2)优选具有一个或多个非灵长类动物慢病毒基因组中不存在的附属基因；(3)优选缺乏tat基因，但包含5’LTR的末端和gag的ATG之间的前导序列；和(4)上述(1)、(2)和(3)的组合。在一种特别优选的实施方案中，慢病毒载体包含上述(1)和(2)和(3)的所有特征。

非灵长类动物慢病毒载体可以是靶定的载体。术语“靶定的载体”是指感染/转染/转导细胞或在宿主和/或靶细胞中表达的能力被限制到宿主生物中某些细胞类型的载体，所述细胞类型通常是具有共同或相似表型的细胞。

可以用包括启动子/增强子和其它表达调节信号的控制序列控制表达。可以使用原核启动子和在真核细胞中起作用的启动子。可以使用组织特异性或刺激特异性启动子。也可以使用嵌合启动子，其包含来自两个或多个不同启动子的序列元件。

合适的启动序列是包括衍生自病毒基因组的启动子或来自异源哺乳动物启动子的强启动子，所述病毒如多瘤病毒、腺病毒、禽痘病毒、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、逆转录病毒和猿猴病毒40(SV40)，所述哺乳动物启动子如肌动蛋白启动子或核糖体蛋白启动子。可以通过将增强子序列插入载体而进一步增加基因的转录。增强子是相对不依赖于方向和位置的，但是，可以使用来自真核细胞病毒的增强子-如，位于复制起点的晚期侧(bp 100-270)的SV40增强子和CMV早期启动子增强子。可以将增强子剪接到载体的启动子的5′或3′的位置，但优选位于启动子的5′的位点。

启动子可以额外包括一些特征以确保或增加在合适的宿主中的表达。例如，所述特征可以是保守区，如Pribnow盒或TATA盒。启动子甚至可以包含影响(如维持、增强、降低)核苷酸序列表达水平的其它序列。合适的其它序列包括Sh1-内含子或ADH内含子。其它序列包括诱导型启动子，如温度、化学、光或胁迫诱导型元件。同源，可以存在增强转录或翻译的合适元件。

本发明的表达载体包含信号序列和与目的核苷酸序列可操作性连接的氨基末端标记序列。

在本发明的一种特别优选的实施方案中，当NOI编码因子VIII时，使用上文讨论的组织特异性启动子。

通过使用生产/包装细胞系，可以繁殖并分裂一定量的逆转录病毒载体颗粒(如制备合适滴度的逆转录病毒颗粒)，用于随后转导，例如，目的位点(如成人脑组织)。生产细胞系通常更适用于大规模生产载体颗粒。

瞬时转染与包装细胞方法相比具有许多优点。在这一点上，瞬时转染避免了制备稳定的载体生产细胞系所必须的更长时间，并且在载体基因组或逆转录病毒包装成分对细胞有毒性的情况下使用。如果载体基因组编码毒性基因，或干扰宿主细胞复制的基因，例如细胞周期抑制剂或诱导凋亡的基因，生产稳定的载体生产细胞系可能是困难的，但可以在细胞死亡之前用瞬时转染制备载体。同样，已经用瞬时感染开发了细胞系，该细胞系生产的病毒滴度水平与从稳定的载体生产细胞系获得的水平相似(Pear et al 1993，PNAS 90：8392-8396)。

生产细胞/包装细胞可以是任何合适的细胞类型。生产细胞通常是哺乳动物细胞，但可以是，例如，昆虫细胞。

此处使用的术语“生产细胞”或“载体生产细胞”是指包含生产逆转录病毒颗粒所必须的所有元件的细胞。

优选地，可以从稳定的生产细胞系获得生产细胞。

优选地，可以从衍生的稳定生产细胞系获得生产细胞。

优选地，可以从衍生的生产细胞系获得生产细胞。

如此处所使用的，术语“衍生的生产细胞系”是转导的生产细胞系，其经过筛选和选择，用于标记物基因的高表达。所述细胞系支持从逆转录病毒基因组的高水平表达。术语“衍生的生产细胞系”可以与术语“衍生的稳定生产细胞系”和术语“稳定的生产细胞系”互换使用。

优选地，衍生的生产细胞系包括，但不限于逆转录病毒和/或慢病毒生产细胞。

优选地，衍生的生产细胞系是HIV或EIAV生产细胞系，更优选是EIAV生产细胞系。

优选地，包膜蛋白序列和核壳序列都稳定整合到生产和/或包装细胞中。但是，一种或多种所述序列也可以以附加形式存在，并且可以从附加体发生基因表达。

如此处使用的，术语“包装细胞”是指包含生产缺乏RNA基因组的传染性重组病毒所必须的元件的细胞。典型地，所述包装细胞包含一个或多个生产质粒，其能够表达病毒结构蛋白(如密码子优化的gag-pol和env)，但它们不包含包装信号。

可与“包装序列”或“psi”互换使用的术语“包装信号”是针对病毒颗粒形成期间逆转录病毒RNA链的包壳作用所需的非编码、顺式作用序列而使用的。在HIV-1中，该序列作图于从主要剪接供体位点(SD)上游至少延伸到gag起始密码子的基因座。

可以很容易制备适用于与上述载体构建体一起使用的包装细胞系(也参见WO 92/05266)，并且制备用于生产逆转录病毒载体颗粒的生产细胞系。如已经指出的，可获得的包装细胞系的概述参见“逆转录病毒”(如上文所述)。

如同上文所讨论的，已经发现包含缺失了包装信号的原病毒的简单包装细胞系导致能够复制的不需要的病毒通过重组进行迅速生产。为了改进安全性，生产了第二代细胞系，其中缺失了原病毒的3’LTR。在所述细胞中，生产野生型病毒需要两次重组。进一步的改进涉及将分开的构建体上的gag-pol基因和env基因导入所谓的第三代包装细胞系。依次导入这些构建体，以防止转染过程中的重组。

优选地，包装细胞系是第二代包装细胞系。

优选地，包装细胞系是第三代包装细胞系。

在这些分裂-构建体，第三代细胞系中，可以通过改变密码子而达到重组的进一步减少。基于遗传密码的冗余的该技术，目的在于减少分开的构建体，例如gag-pol和env开放读框中的重叠区域之间的同源性。

包装细胞系用于提供包壳作用必须的基因产物，并且提供用于生产高滴度载体颗粒的膜蛋白。包装细胞可以是体外培养的细胞，如组织培养细胞系。合适的细胞系包括，但不限于，哺乳动物细胞，如鼠成纤维细胞衍生的细胞系或人类细胞系。优选地，包装细胞系是人类细胞系，例如，HEK293、293-T、TE671、HT1080。

或者，包装细胞可以是衍生自待治疗的个体的细胞，如单核细胞、巨噬细胞、血细胞或成纤维细胞。所述细胞可以从个体分离，离体施用包装和载体成分，然后再施用自体包装细胞。

更具体地，包装细胞可以是待治疗个体的身体内的体内包装细胞，或者其可以是体外培养的细胞，如组织培养细胞系。合适的细胞系包括哺乳动物细胞，如鼠成纤维细胞衍生的细胞系或人类细胞系。优选地，包装细胞系是人细胞系，如293细胞系、HEK293、293-T、TE671、HT1080。

或者，包装细胞系可以是衍生自待治疗个体的细胞，如单核细胞、巨噬细胞、干细胞、血细胞或成纤维细胞。所述细胞可以从个体分离，离体施用包装和载体成分，然后再施用自体包装细胞。或者可以体内给包装细胞施用包装和载体成分。用于将慢病毒包装和载体成分导入个体细胞的方法是本领域公知的。例如，一种方法是导入生产慢病毒颗粒所需的不同DNA序列，如通过瞬时三重转染将env编码序列、gag-pol编码序列和缺陷型慢病毒基因组同时导入细胞(Landau &Littman 1992 J.Virol.66，5110；Soneoka et al 1995 Nucleic Acids Res23：628-633)。

在一种实施方案中，本发明的载体构型使用表达基因组、gag-pol成分和包膜的三个转录单位作为其生产系统。包膜表达盒可以包含许多包膜之一，如VSV-G或多种鼠逆转录病毒包膜，如4070A。

常规地，这三个盒将从瞬时转染到合适的细胞系，如293T的三个质粒表达，或者从稳定的生产细胞系中的整合拷贝表达。一种替代的方法是使用另一种病毒作为用于这三个盒的表达系统，例如杆状病毒或腺病毒。它们都是核表达系统。迄今为止还没有描述过用痘病毒表达慢病毒载体系统的所有成分。具体地，已知慢病毒的不常见的密码子选择和它们对RNA操作系统，如rev/RRE系统的要求。

假型化

在一个优选方面，本发明的逆转录病毒载体已经被假型化。在这一点上，假型化可以赋予一个或多个优点。例如，有了慢病毒载体，基于HIV的载体的env基因产物将限制这些载体，使其仅仅感染表达称作CD4的蛋白的细胞。但如果这些载体中的env基因被来自其它RNA病毒的env序列取代，那么它们可能具有更宽的传染谱(Vermaand Somia 1997 Nature 389：239-242)。例如，工作者已经用来自VSV的糖蛋白对基于HIV的载体进行了假型化(Verma and Somia 1997，出处同上文)。

在另一种替代方案中，Env蛋白可以是修饰的Env蛋白，如突变的或工程化的Env蛋白。可以进行修饰或选择修饰，以导入靶定能力或减少毒性或用于其它目的(Valsesia-Wittman et al 1996 J Virol 70：2056-64；Nilson et al 1996 Gene Therapy 3：280-6；Fielding et al 1998Blood 9：1802及其中引用的参考文献)。

可以用任何选择的分子进行假型化。

VSV-G：

已经在不存在DNA循环的条件下，在非侵入性静脉内注射(尾静脉)注射后用VSV-G假型化的慢病毒载体体内(小鼠)获得了肝细胞的有效转导(Follenzi et al 2002；Pan et al 2002)。已经提出了与其它数据符合的这些数据(Pfeifer et al 2001)与以前的发现之间有明显矛盾，以前的发现是，肝的有效转导需要细胞周期(Park et al 2000b)，这是由于改进的载体设计，具体是cPPT的引入和增加的颗粒感染性。但是，在一项研究中，使用的载体(HR’cmvGFP)不包含cPPT元件并且观察到了肝的转导：在注射后4天有59％GFP阳性细胞，在40天后下降到1.3％(Pan et al 2002)。

Ross河病毒

用Ross河病毒包膜对非灵长类动物慢病毒载体(FIV)进行假型化，并且按照系统施用主要转导肝(Kang et al 2002)。报道的效率比用VSV-G假型化的载体获得的效率高20倍，并且通过提示肝毒性的肝酶血清水平测量的毒性更低。

Ross河病毒(RRV)是一种通过在热带和澳大利亚的温带地区特有和流行的蚊子传播的甲病毒。温带沿海地区中正常人群中的抗体率倾向于较低(6％-15％)，但在Murray Valley River系统中血清普遍程度达到27-37％。在1979-1980年，RRV开始在太平洋岛屿中流行。该疾病在人类之间是传染性的，并且不致死，在大约一半的患者中第一个症状是关节疼痛，伴有疲劳和倦怠(Fields Virology)。

杆状病毒GP64

已经证明了杆状病毒GP64蛋白是对VSVG的有吸引力的替代，作为在临床和商业应用中需要的高滴度病毒大规模生产中使用的病毒载体(Kumar M，Bradow BP，Zimmerberg J，Hum Gene Ther.2003 Jan1；14(1)：67-77)。与VSVG相比，GP64载体具有相似的宽亲嗜性和相似的天然滴度。因为GP64不杀伤细胞，可以制备组成型表达GP64的基于293T的细胞系。

其它包膜

当用于对EIAV进行假型化时产生合理滴度的其它包膜包括Mokola、狂犬病、埃博拉和LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)。在小鼠中子宫内注射后，发现VSV-G包膜比埃博拉或Mokola更有效转导肝细胞(Mackenzie et al 2002)。将用4070A假型化的慢病毒静脉内输注到小鼠后，导致肝脏中的最大基因表达(Peng et al 2001)。

Tat的破坏

破坏Tat的开放读框，增强了载体的安全谱，尽管Tat的第一个外显子位于包装信号内，但对滴度没有有害作用。

可以通过将核苷酸插入载体基因组中的Tat开放读框的起始密码子内(质粒核苷酸1317-1319)而完成破坏。

gttgaacCTG-＞gttgaacCT CG

这是通过对新的基因组进行测序和滴定，没有发现该修饰导致滴度损失而证实的。没有该修饰的基因组在生产细胞中表达病毒蛋白Tat的氨基末端部分(29αα)。

主要剪接供体(SD1)的突变

我们发现，具有该修饰的载体的滴度至少与具有功能性主要剪接供体的载体的滴度一样高。

通过定点诱变，将核苷酸1405(T)取代为‘C’，从而破坏剪接供体，可以完成该破坏。

AGGT-＞AGG C

通过将功能性剪接受体插入下游，测试所述突变的剪接供体是无功能的。

引入WPRE/cPPT元件

WPRE元件增强了表达，并且因此很可能在达到因子VIII的最高水平方面是有益的。

生产细胞中的转基因表达

为了使在生产细胞，如293T细胞中表达转基因的可能性最小，以使得第一种NOI相对于任何上游ORFs而言位于读框外的方式设计了克隆转基因的载体。

送递载体

可以通过病毒或非病毒载体将本发明的载体送递到靶位点。

如本领域公知的，载体是允许或促进将一种实体从一个环境转移到另一个环境的工具。举例来说，用于重组DNA技术的一些载体，使得实体，如DNA片段(如异源DNA片段，如异源cDNA片段)被转移到靶细胞。任选地，一旦位于靶细胞内，载体随后可以用于维持细胞内的异源DNA或作为DNA复制的单位。用于重组DNA技术的载体的实例包括，但不限于，质粒、染色体、人工染色体或病毒。

非病毒送递系统包括，但不限于，DNA转染方法。因此，转染包括使用非病毒载体将基因送递到靶哺乳动物细胞的过程。

典型的转染方法包括电穿孔、DNA生物轰击、脂质介导的转染、紧密的DNA介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂转染试剂、阳离子试剂介导、阳离子表面两性试剂(CFAs)(Nature Biotechnology 199614；556)，及其组合。

病毒送递系统包括，但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。载体的其它实例包括离体送递系统，其包括，但不限于DNA转染方法，如电穿孔、DNA生物轰击、脂质介导的转染、紧密的DNA介导的转染。

本发明的载体送递系统可以由在体外制备的一级载体组成，所述一级载体编码体内产生二级载体所必须的基因。

一级病毒载体可以是多种不同的病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒或痘病毒载体，或者在多个一级病毒载体的情况下，它们可以是具有不同病毒来源的混合物。在任何情况下，一级病毒载体优选是缺陷型的，因为它们不能独立复制。因此，它们能够进入靶细胞，并且送递二级载体序列，但不能复制以继续感染其它的靶细胞。

通过本发明的载体系统进行的一种或多种治疗基因的送递，可以单独使用或与其它治疗或治疗成分组合。

例如，本发明的逆转录病毒载体可以用于送递用于治疗WO-A-98/05635中列出的病症的一种或多种NOI(s)。为了容易参考，此处提供该列表的一部分：癌症、炎症或炎性疾病、皮肤病症、发热、心血管作用、出血、凝血和急性期反应、恶病质、厌食、急性感染、HIV感染、休克状态、移植物抗宿主反应、自身免疫病、再灌注损伤、脑膜炎、偏头痛和阿司匹林依赖性抗血栓形成；肿瘤生长、侵入和传播、血管发生、转移、恶性肿瘤、腹水和恶性胸膜渗出；大脑缺血、缺血性心脏病、骨关节炎、类风湿性关节炎、骨质疏松、哮喘、多发性硬化、神经退化、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、卒中、血管炎、克隆氏病和溃疡性结肠炎；牙周炎、葡萄膜炎；牛皮癣、特应性皮炎、慢性溃疡、大疱性表皮松解症；角膜溃疡、肾病和手术创伤愈合；鼻炎、过敏性结膜炎、湿疹、过敏；再狭窄、充血性心衰、子宫内膜异位、动脉粥样硬化或内皮粥样硬化。

此外，或者替代地，本发明的逆转录病毒载体可以用于送递用于治疗WO-A-98/07859中列出的病症的一种或多种NOI(s)。为了容易参考，此处提供该列表的一部分：细胞因子和细胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(如治疗免疫缺陷，包括人类免疫缺陷病毒感染；调节淋巴细胞生长；治疗癌症和许多自身免疫病，和防止移植排斥或诱导肿瘤免疫)；调节造血，如治疗骨髓或淋巴疾病；促进骨骼、软骨、腱、韧带和神经组织生长，如伤口愈合、治疗烧伤、溃疡和牙周疾病以及神经退化；抑制或激活滤泡刺激激素(调节不育)；趋化/化学动力活性(如动员特定细胞类型到损伤或感染位点)；造血和血栓溶解活性(如治疗血友病和卒中)；抗炎活性(如治疗例如脓毒性休克或克隆氏病)；作为抗微生物剂；例如代谢或行为的调节剂；作为镇痛药；治疗特定的缺陷病症；用于治疗例如牛皮癣、用于人类或兽医药物。

此外，或者替代地，本发明的逆转录病毒载体可以用于送递用于治疗WO-A-98/09985中列出的病症的一种或多种NOI(s)。为了容易参考，此处提供该列表的一部分：巨噬细胞抑制和/或T细胞抑制活性并且因此具有抗炎活性；抗免疫活性，即，抗细胞和/或体液免疫应答的抑制作用，包括不与炎症相关的应答；抑制巨噬细胞和T细胞粘附细胞外基质成分和纤连蛋白的能力，以及上调T细胞中的fas受体表达；抑制不良的免疫反应和炎症，包括关节炎，包括类风湿性关节炎、与过敏相关的炎症、变态反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原病和其它自身免疫病、与动脉粥样硬化相关的炎症、动脉硬化、动脉粥样硬化性心脏病、再灌注损伤、心脏骤停、心肌梗塞、血管炎性病症、呼吸窘迫综合征或其它心肺疾病、与胃溃疡相关的炎症、溃疡性结肠炎和其它胃肠道疾病、肝纤维化、肝硬化或其它肝病、甲状腺炎或其它腺体疾病、肾小球肾炎或其它肾和泌尿系统疾病、耳炎或其它耳鼻喉疾病、皮炎或其它皮肤病、牙周病或其它牙科疾病、睾丸炎或睾丸附睾炎、不育、睾丸外伤或其它免疫相关睾丸疾病、胎盘功能障碍、胎盘不全、习惯性流产、子痫、先兆子痫和其它免疫和/或免疫相关妇产科疾病、后葡萄膜炎、中葡萄膜炎、前葡萄膜炎、结膜炎、脉络膜视网膜炎、葡萄膜视网膜炎、视神经炎、眼内炎症，如视网膜炎或类囊肿黄斑水肿、交感神经性眼炎、巩膜炎、视网膜炎色点、退化性fondus病的免疫和炎症成分、眼肿瘤的炎症成分、由感染导致的眼炎、增生性玻璃体-视网膜病、急性缺血性视神经病、过度的疤痕形成，例如青光眼过滤手术后、抗眼植入物的免疫和/或炎症反应和其它免疫和炎症相关的眼病、与自身免疫疾病或状况或病症相关的炎症，其中在中枢神经系统(CNS)或任何其它器官中，免疫和/或炎症抑制都是有益的、帕金森病、帕金森病的治疗导致的合并症和/或副作用、AIDS相关的痴呆、复杂的HIV相关脑病、Devic氏病、小舞蹈病、阿尔茨海默病和其它退化性疾病、CNS的状况或病症、卒中的炎症成分、脊髓灰质炎后综合征、心理障碍的免疫和炎症成分、脊髓炎、脑炎、亚急性硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、格林巴利综合征、小舞蹈病、重症肌无力、假大脑肿瘤、唐氏综合征、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、CNS压缩或CNS创伤或CNS感染的炎症成分、肌萎缩和营养不良的炎症成分、和中枢和周围神经系统的免疫和炎症相关疾病、状况或病症、创伤后炎症、脓毒性休克、感染性疾病、手术的炎症合并症或副作用、骨髓移植或其它移植合并症和/或副作用、基因治疗的炎症和/或免疫合并症和副作用，例如，由于感染了病毒载体、或与AIDS相关的炎症、阻抑或抑制体液和/或细胞免疫应答、通过减少单核细胞或淋巴细胞的量治疗或改善单核细胞或白细胞增殖疾病，如白血病、预防和/或治疗天然或人工细胞、组织和器官，如角膜、骨髓、器官、晶状体、起搏器、天然或人工皮肤组织移植情况下的移植物排斥。

本发明特别适用于治疗血友病。

本发明也提供了用于通过基因治疗对个体进行治疗的药物组合物，其中所述组合物包含治疗有效量的本发明的逆转录病毒载体，所述载体包含一种或多种可送递的治疗和/或诊断NOI(s)或通过其产生或获得的病毒颗粒。所述药物组合物可以用于人或动物。典型地，医生将决定实际剂量，该剂量最适合个人受试者，并且将随年龄、体重和特定个体的反应而改变。

所述组合物可任选包含药学可接受的载体、稀释剂、附形剂或佐剂。可以根据施用的途径和标准药学实践选择药物载体、附形剂或稀释剂。药物组合物可以包含可以辅助或增加病毒进入靶位点的任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂和其它载体试剂(例如脂质送递系统)作为-或补充-载体、附形剂或稀释剂。

在合适的情况下，可以通过以下一种或多种方式施用药物组合物：吸入、栓剂或阴道环形式、以洗液、溶液、乳膏、油膏或扑粉形式体表施用、通过使用皮肤贴剂、以含有诸如淀粉或乳糖的附形剂的片剂形式口服、或单独或与附形剂混合的胶囊或珠、或含有调味剂或着色剂的酏剂、溶液或悬浮液形式、或它们可以肠胃外注射，例如海绵体内、静脉内、肌内、或皮下注射。对于肠胃外施用，组合物最好是以可以含有其它物质，例如使溶液与血液等渗的足够的盐或单糖的无菌水溶液形式使用。对于颊或舌下施用，可以以常规方式制剂化的片剂或锭剂形式施用。

因子VIII的体外生产

本发明的载体或编码密码子优化的因子VIII的核酸可以用于在体外/细胞培养表达系统中表达因子VIII。因此，在本发明的另一方面，提供了用本发明的任意方面的载体转导或核酸转染的宿主细胞。

用本发明的载体或编码密码子优化的因子VIII的核酸转导的合适的宿主细胞包括宿主生物体的细胞，可以使用正常原代细胞或衍生自培养的原代组织的细胞系。合适地，细胞是哺乳动物细胞，优选仓鼠CHO细胞、小鼠C127细胞或人“293”细胞。在另一种实施方案中，细胞可以是此处描述的HepG2细胞。

宿主细胞的转导包括将本发明的载体或核酸与宿主细胞一起温育。在转导/转染的细胞传代后，除去培养基以使用例如此处描述的COATEST(Chromogenix)检测因子VIII活性。

一旦将基因导入了合适的宿主细胞，可以在合适的培养基中将宿主细胞生长至高密度。如果使用裂解从细胞分泌或分离，可以用常规方法从细胞的培养基提取表达的因子VIII。然后通过常规技术分离和纯化需要的产物，所述技术例如用固定化的抗体进行亲和层析、在氨基己基-琼脂糖上层析或混合的多电解质方法。

因此，在本发明的另一方面，提供了体外生产因子VIII的方法，包括根据本发明的方法制备细胞，在培养基中使所述细胞传代，除去所述培养基并且分离因子VIII。

在本发明的另一方面，提供了体外制备因子VIII的方法，包括制备包含本发明的密码子优化的编码因子VIII的核酸的细胞，在培养基中使所述细胞传代，除去所述培养基并且分离因子VIII。

实施例

载体构建

pONY8.4的细节参见我们的WO03/064665。更具体地，pONY 8.4载体系列具有一些修饰，使它能够作为完全独立于附属蛋白的瞬时或稳定载体系统的一部分，对滴度无有害作用。通常慢病毒载体基因组需要病毒蛋白rev在生产细胞(瞬时或稳定的)中的存在，以便获得足够的滴度。这包括目前的HIV载体系统以及更早的EIAV载体。

与pONY 8.1载体基因组系列相比，存在4种修饰：

a)衍生自gag并且形成包装信号的一部分的所有ATG基序经过修饰以读出ATTG。这使得能够插入可以由LTR中的启动子驱动的开放读框。

b)基因组的长度，即，R区之间的距离更接近wt病毒中的距离(7.9kb)。

c)3’U3经过修饰以包括来自莫洛尼白血病病毒(MLV)U3区的序列，这样在转导时，除内部盒之外，它还可以驱动第二开放读框(ORF)，在该实施例中，我们使用了MLV，但可以是任何启动子。

d)载体含有与病毒LTR可操作性连接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于内部启动子的上游，并且其中所述核苷酸序列编码多肽或其片段。

这些修饰一起使得能够生产病毒送递系统，而不需要附属蛋白，并且仅仅10％的原始病毒序列被整合到靶细胞中。这些因素对未来的关于免疫应答的安全性考虑和产生能够复制的病毒方面的可能性是重要的。修饰LTRs的其它细节可以参见我们的WO96/37623和WO98/17816。

pONY8.7系列载体具有cPPT和WPRE(pONY8.4都没有)。

pONY8.8系列载体具有cPPT但没有WPRE。

pONY8.9系列载体具有WPRE但没有cPPT。

在载体中，下标5(如pONY8.95)表示下文描述的Tat和剪接供体修饰这两者。

在载体中，下标3(如pONY8.43)表示下文描述的Tat，但没有剪接供体修饰。

在载体命名中：

“N”表示neo的存在，

“C”表示CMV的存在，

“G”表示GFP的存在，

“F”或“HEN”或“HENSQ”表示密码子优化的B结构域缺失的因子VIII的存在，

“Z”表示LacZ的存在，

“A”表示hAAT的存在，

“I”表示ICAM-2的存在。

因此，举例说明：pONY8.4NCZ具有SIN LTR，不表达neo，针对Rev非依赖性的上游ORF。pONY8.95NCZ具有WPRE，无cPPT，一个SIN LTR，因此不表达neo，Tat外显子1和SD1突变。pONY8.7NCF具有cPPT，WPRE，上游ORF是neo，CMV内部启动子，密码子优化的B结构域缺失的因子VIII。

载体的分析

通过PERT(性能增强的逆转录)预测的滴度

用从内部CMV启动子表达LacZ或因子VIII的病毒基因组制备用VSV-G假型化的载体。通过测量颗粒破坏后来自MS2 RNA模板的RT-PCR产物，将实时PCR用于逆转录酶活性的定量。通过比较未知值与参照标准，确定载体颗粒的预测数目(滴度)。

因子VIII基因组的预测滴度低于LacZ，但差异在1log之内。

通过RNA基因组水平测定的滴度

用从CMV或组织特异性启动子表达GFP、LacZ和因子VIII转基因的载体基因组制备病毒载体。用Ross和病毒(RRV)包膜对含有hAAT内部启动子的载体假型化，具有ICAM-2启动子的那些用埃博拉包膜假型化。包膜的选择是基于靶细胞类型：埃博拉包膜允许选择用来检测ICAM-2启动子活性的HUVEC细胞的有效转导，并且据报道，RRV包膜使得肝细胞能够有效转导(Kang et al 2002)。用两种包膜对含有内部CMV启动子的对照载体进行假型化。图6示出了病毒RNA水平的实时PCR分析结果。

含有组织特异性内部启动子的因子VIII基因组的预测滴度比用标准CMV获得的滴度(其一致地产生大约1×10⁵TU/ml的预测滴度)高大约5倍。

293T细胞中的启动子活性

为了确定生产细胞中的ICAM-2、hAAT和CMV启动子的相对活性，用表达GFP的基因组瞬时转染293T细胞。大约在丁酸钠处理后24小时，转染后36小时，通过UV显微镜观察细胞。图7示出了代表性的图像。

靶细胞中的启动子活性

肝细胞

选择人类肝细胞癌细胞系Hep G2，用于检测hAAT启动子的活性。该细胞系以前是用于体外检测该启动子(Kramer et al 2003)，其据报道具有立即早期巨细胞病毒(CNV)启动子(包括增强子区)的40％的活性。图8中示出了从CMV或hAAT启动子表达报道基因的载体转导的HepG2和293A的代表性图像。

当用CMV或hAAT启动子驱动转基因表达时，采用β-半乳糖苷酶和GFP报道基因，都可以容易观察到转导的细胞的集落。生物滴度(X-gal染色的细胞)相同，反映了通过RNA基因组水平测量的相似的滴度，并且表示两种启动子的活性在HepG2s中相似。从转导的细胞制备的裂解物的β-半乳糖苷酶分析支持了该结果(数据未示出)。

内皮细胞

选择HUVECs(人类脐静脉内皮细胞)用于检测ICAM-2启动子的活性。图9示出了用从ICAM-2和CMV启动子表达LacZ的载体转导的X-gal染色的细胞的图像。

293A细胞

FACS分析显示在用含有组织特异性启动子的载体转导的293A细胞中检测不到GFP阳性细胞(数据未示出)。这与导致高表达细胞群体的CMV对照载体相反。

总之，组织特异性启动子ICAM-2和hAAT均按照需要导致293(293A和293T)细胞中的低水平活性。在ICAM-2载体的情况下，可以在内皮细胞中检测到启动子活性的证据。在hAAT启动子的情况下，在肝细胞中，非常高的活性是明显的(与CMV启动子相似)。

编码从遍在启动子表达的因子VIII的载体的低滴度是由于293T生产细胞中的因子VIII表达抑制了功能性病毒颗粒的生产。因此，寻求了避免293T细胞中的转基因表达的策略。尽管在靶细胞中维持高转基因表达，达到此目的的最有效方法是用强的肝脏特异性人类α₁-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子替代内部CMV启动子。对基因组进行了进一步改进：进行了Tat外显子1和主要剪接供体的突变，而随后没有损失滴度。

通过整合测定而检测的滴度

载体性能的功能分析对确定是否可以生产用于送递因子VIII的高滴度载体是关键的。如图5和6所示，RNA基因组水平和病毒颗粒数目(PERT)测量都不足以预测滴度。因此，通过用病毒上清液转导293A细胞而进行整合测定。图10中示出了hAAT载体和CMV对照载体的数据。

用pONY8.95NAF转导的细胞(从hAAT启动子表达因子VIII)与用编码报道基因的载体(pONY8.95NCG)转导的细胞含有相似水平的载体。但是，用pONY8.7NCF(内部CMV启动子)转导的细胞含有非常少量的载体，仅仅略微高于背景(UT＝未转导的细胞)，反映了用该载体构建体获得了很低的功能性滴度。这些数据表明，通过将CMV启动子换成hAAT启动子，完全避免了生产细胞中由因子VIII表达导致的颗粒生产的抑制。

图11示出了ICAM-2载体，CMV对照载体的数据。

至于hAAT载体，使用ICAM-2启动子使得能够生产具有高功能性滴度(大约是LacZ对照载体的三分之一)的因子VIII载体。

基因组混合实验

表达因子VIII的基因组(pONY8.7NCHENSQ)或表达因子VIII(pSQ)的质粒的共转染通常导致表达报道基因的载体滴度降低大约2logs。为了证实新的因子VIII基因组的共转染不导致第二基因组滴度的不成比例的减少，用pONY8.95NCZ共转染，在对D17细胞滴定后对LacZ滴度评分。结果示于图12。

这些数据证明了整合测定的结果：新的因子VIII载体基因组不导致功能性病毒颗粒生产的抑制。

为了确定生产细胞中因子VIII蛋白的表达是否影响其它慢病毒和逆转录病毒载体的功能性滴度，用HIV和MLV载体进行混合实验。数据示于图13。

数据表明，当在转染中使用表达因子VIII的质粒时，滴度减少了大约1log的MLV和HIV载体。这些数据与以前的相似实验的结果一致。生产细胞中因子VIII的表达明显对HIV和MLV载体滴度具有有害作用，但不如对EIAV明显。

pONY8.45NCZ的构建

Tat外显子1

通过在核苷酸434后插入胞嘧啶残基而进行Tat外显子1的突变(编号EIU01866)。

采用标准程序，用T4多核苷酸激酶处理如下所示的寡核苷酸，退火，然后连接到pONY8.4NCZ消化的BseRI和Eco0109I(9463bp片段)以制备pONY8.43NCZ。

用于突变TAT的外显子1的寡核苷酸

寡核苷酸1

GGGACCTGAGAGGGGCGCAGACCCTACCTGTTGAACCTCGGC

TGATCGTAGGATCCCCGGGA

寡核苷酸2

TGTAAGTTCTCCTCTGCTGTCCCGGGGATCCTACGATCAGCCG

AGGTTCAACAGGTAGGG

主要剪接供体

通过用以下寡核苷酸将不变的酪氨酸转变为胞嘧啶而获得主要剪接供体的突变：

SD1KO1F：CAGAACACAGGAGGACAGGCAAGATTGGGAGACCCTTTG

SD1KO2R：CAAAGGGTCTCCCAATCTTGCCTGTCCTCCTGTGTTCTG

(改变的核苷酸用粗体表示)

用Stratagene的QuickChange^TM定点诱变试剂盒制备剪接供体突变，并且通过测序证实。将含有Tat外显子1和主要剪接供体突变的构建体命名为pONY8.45NCZ。

单个突变或两个组合的突变都没有显著改变滴度。参见图14中第一个实验的数据。

含有主要剪接供体的载体的滴度略微升高。在后续的实验中也观察到这一点。

下文示出了TAT的第一个外显子中的突变和插入、主要剪接供体敲除和pONY 8.45NCZ载体的包装信号。

UI01866 401 cctgagaggggcgcagaccctacctgttgaacct-

ggctgatcgtaggatccccgggacagcagaggagaacttacagaagtcttctggaggtgttcctggccagaacaca

ggaggacag

8.45 NCZ 213

cctgagaggggcgcagaccctacctgttgaacctcggctgatcgtaggatccccgggacagcagaggagaactta

cagaagtcttctggaggtgttcctggccagaacacaggaggacag

UI01 866 520 gtaagat-gggagaccctttgacat-

ggagcaaggcgctcaagaagttagagaaggtgacggtacaagggtctcagaaattaactactggtaactgtaattg

ggcgctaagtctagtaga

8.45 NCZ 333

gcaagattgggagaccctttgacattggagcaaggcgctcaagaagttagagaaggtgacggtacaagggtctca

gaaattaactactggtaactgtaattgggcgctaagtctagtaga

UI01866

638 cttatttcat-gataccaactttgtaaaagaaaaggactggcagctgagggat-gtcattccattgctggaagat-

gtaactcagacgctgtcaggacaagaaagagaggcctttgaaag

8.45 NCZ 453

cttatttcattgataccaactttgtaaaagaaaaggactggcagctgagggattgtcattccattgctggaagattgtaa

ctcagacgctgtcaggacaagaaagagaggcctttgaaag

UI01866 755 aacat-ggtgggcaatttctgctgtaaagat-gggcctccagattaataat-gtagtagat-

ggaaaggcatcattccagctcctaagagcgaaatat-gaaaagaagactgctaataaa

8.45 NCZ 573

aacattggtgggcaatttctgctgtaaagattgggcctccagattaataattgtagtagattggaaaggcatcattcca

gctcctaagagcgaaatattgaaaagaagactgctaataaa

UI01866 870 aagcagtctgagccctctgaagaatatc

8.45NCZ 693 aagcagtctgagccctctgaagaatatc

密码子优化

B结构域缺失的因子VIII的SQ形式的密码子优化

以两个不同的MOIs(1x和10x)，用表达野生型(WT)或密码子优化的(CO)‘SQ’形式的因子VIII基因的EIAV载体转导HepG2细胞。在转导的细胞传代后，加入新鲜的培养基，将细胞温育24小时。除去培养基，并且用COATEST(Chromogenix)检测因子VIII活性。在该测定中，用最高MOI的含有合成因子VIII基因的载体转导的细胞的上清液产生了非常高水平的活性(超过该测定的线性范围)。比较WTx10和COx1结果，存在细胞上清液中因子VIII活性的50倍增加，这是密码子优化的结果，假定在WT诱导的细胞中存在高10倍的载体拷贝。

为了检验该结果，在传代后在转导的细胞上进行了EIAVΨ信号的实时PCR分析。该测定检测到与WT载体相比，用CO载体转导的细胞中的载体拷贝高大约2.5倍。因此，密码子优化导致了因子VIII活性增加20倍(每个载体拷贝)。结果示于图16。

重复在图16中总结的实验，将上清液分为两份，适当稀释以测定蛋白量(Affinity Biologicals FVIII ELISA)和活性(COATEST)。

尽管因子VIII活性总体上较低，通过两次测定，测量到密码子优化的样品再次具有高得多的因子VIII水平。通过ELISA测量发现，仅有用最高MOI转导的HepG2细胞的上清液产生了高于背景的因子VIII水平。这可能是由于多克隆第一抗体是针对全长因子VIII蛋白产生，并且识别全长蛋白上的表位，该表位在B结构域缺失的形式中不存在。结果示于图17。

图18表示蛋白印迹，该印迹显示在用密码子优化的(CO)载体转导的细胞的上清液中存在相当于170、90和80kDa因子VIII多肽的特定条带。

在未转导的上清液或用编码野生型因子VIII基因的载体转导的细胞的上清液中不存在这些条带。

全长因子VIII基因组的密码子优化

通过瞬时转染HEK293T细胞和浓缩2000倍而制备病毒载体。然后用指出的载体(pRV67假型化的)转导HEK293T细胞。在传代和DNA提取后，通过实时PCR测量EIAVΨ水平，在上述附图中以转导单位/ml(TU/ml)表示结果。结果如图23所示。

NAFa代表全长(fl)、野生型(wt)因子VIII序列；NAFb代表全长、密码子优化的(co)因子VIII序列；NASqwt代表B结构域缺失的(bdd)、野生型因子VIII序列；NAF代表B结构域缺失的、密码子优化的因子VIII序列。所有基因组都处于pONY8.95主链中。

从全长序列获得的滴度的比较表明密码子优化的形式(NAFβ)产生的滴度比野生型形式(NAFa)高50倍。此外，从B结构域缺失的形式获得的滴度的比较表明，密码子优化的形式(NAF)产生的滴度比野生型形式(NASqwt)高8倍。总体上，B结构域缺失的、密码子优化形式的因子VIII基因组产生最高的滴度。

因子VIII在包膜上的表达的影响

生产细胞中的因子VIII表达明显对病毒滴度具有有害作用。以前没有明确该矛盾的原因。但是，我们现在已经证明了293T生产细胞中的因子VIII表达导致病毒颗粒上的VSV-G包膜的显著减少(参见图24)。

当用不同包膜蛋白假型化时，因子VIII对病毒载体生产的抑制

通过用优化比例的包含各种包膜的质粒成分转染，制备pONY8.95NCZ(LacZ基因组)。向转染混合物中加入2μg pSQ(因子VIII表达质粒)或pCIneo(对照质粒)。示出了D17滴度(集落形成单位(cfu))。

一些实验证明了因子VIII表达对在用VSV-G(pRV67)假型化时的病毒载体生产具有抑制作用。为了阐明该抑制是否对VSV-G特异，用7种不同的包膜进行了上述实验(参见图25)。结果表明该抑制作用不是对VSV-G特异，并且所有滴度都不同程度受到了因子VIII表达的影响。pHCMV-G似乎比pRV67受因子VIII表达的影响小。这可能是由于第二个糖基化位点上的单氨基酸改变，或者可能是由于表达水平的差异。

在此引入上文说明书中提到的所有公开文献作为参考。在不偏离本发明的范围和精神的前提下，对本发明所描述的方法和系统的各种改变和变化对本领域技术人员是显而易见的。尽管参照特定的优选实施方案对本发明进行描述，应该理解，所要求保护的发明不应该过度限制于所述特定实施方案。实际上，以下权利要求的范围中意欲包括对生化和生物技术或相关领域的技术人员来说显而易见的、对描述的实施本发明的方式进行的各种修改。

Claims

1.能够送递目的核苷酸(NOI)到需要的靶位点的慢病毒载体或其衍生物，其中所述NOI编码因子VIII，并且在将NOI送递到需要的靶位点之后表达因子VIII。

2.包含编码因子VIII的NOI的慢病毒载体或其衍生物，其中所述NOI与组织特异性启动子可操作性连接。

3.权利要求2的慢病毒载体，其中所述组织特异性启动子是肝脏或内皮组织特异性启动子。

4.前述任意一项权利要求的慢病毒载体，其中NOI进行了密码子优化以便在哺乳动物细胞中表达。

5.前述任意一项权利要求的慢病毒载体，其中NOI是B结构域缺失的因子VIII基因。

6.包含编码因子VIII的NOI的慢病毒载体或其衍生物，其中所述NOI进行了密码子优化以便在哺乳动物细胞中表达。

7.权利要求6的载体，其中所述NOI与组织特异性启动子可操作性连接。

8.权利要求7的载体，其中所述组织特异性启动子是肝脏或内皮组织特异性启动子。

9.能够送递第一种目的核苷酸(NOI)并且可衍生自逆转录病毒原-载体的逆转录病毒载体，其中所述逆转录病毒原-载体包含与内部启动子可操作性连接的第一种NOI和在第一种NOI和内部启动子之间的第二种NOI，使得第二种NOI能够被切除，并且其中启动子、第一种NOI和第二种NOI处于反向互补方向，并且任选地，其中第二种NOI任选在第一种NOI的读框外。

10.权利要求9的载体，其中第二种NOI是任选包含开放读框(ORF)的至少一部分的内含子。

11.权利要求9或10的载体，其中逆转录病毒原-载体包含能够产生功能性剪接供体位点的第一种核苷酸序列(NS)和能够产生侧翼于第二种NOI的功能性剪接受体位点的第二种NS，并且其中所述功能性剪接供体位点位于功能性剪接受体位点的上游。

12.权利要求9-11的任意一项的载体，其中所述第一种NOI或其表达产物是治疗剂或诊断剂，或包含治疗剂或诊断剂。

13.权利要求12的载体，其中所述第一种NOI的表达产物是因子VIII。

14.权利要求13的载体，其中因子VIII进行了密码子优化，以便在哺乳动物细胞中表达。

15.权利要求9-14的任意一项的载体，其中所述第一种NOI与组织特异性启动子可操作性连接。

16.权利要求15的载体，其中所述组织特异性启动子是肝脏或内皮组织特异性启动子。

17.权利要求9-16的任意一项的载体，其中所述第二种NOI或其表达产物是或包含任何一种或多种赋予选择能力的试剂(如标记物元件)、病毒必须元件，或其部分，或其组合。

18.权利要求9-17的任意一项的载体，其中所述第二种NOI包括聚腺苷酸化信号。

19.前述任意一项权利要求的载体，其中所述载体或原-载体可衍生自慢病毒。

20.前述任意一项权利要求的载体，其中所述慢病毒是HIV-1或EIAV。

21.前述任意一项权利要求的载体，其中所述载体是假型化的。

22.前述任意一项权利要求的载体，其中所述载体用VSV-G、Ross河病毒包膜或GP64假型化。

23.前述任意一项权利要求的载体，进一步包含旱獭肝炎转录后元件(WPRE)。

24.一种逆转录病毒载体，其中不存在主要剪接供体，或主要剪接供体被破坏。

25.权利要求24的逆转录病毒载体，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。

26.权利要求21-23的任意一项的载体，其中不存在主要剪接供体，或主要剪接供体被破坏。

27.一种逆转录病毒载体，其中Tat外显子的起始密码子被破坏。

28.权利要求27的逆转录病毒载体，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。

29.权利要求21-26的任意一项的逆转录病毒载体，其中Tat外显子的起始密码子被破坏。

30.用Ross河病毒包膜假型化的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体可衍生自HIV-1或EIAV。

31.可衍生自慢病毒原-载体的慢病毒载体，其中慢病毒原-载体的Tat外显子缺失或被破坏，使得Tat蛋白的至少一部分不在靶细胞中表达。

32.可衍生自逆转录病毒原-载体的逆转录病毒载体，其中不存在主要剪接供体，或主要剪接供体被破坏。

33.前述任意一项权利要求的逆转录病毒载体，其中所述逆转录病毒载体是整合的原病毒。

34.可从前述任意一项权利要求的逆转录病毒载体获得的逆转录病毒颗粒。

35.用权利要求1-33的任意一项的逆转录病毒载体或权利要求34的逆转录病毒颗粒转染或转导的细胞。

36.权利要求1-33的任意一项的逆转录病毒载体或权利要求34的病毒颗粒或权利要求35的细胞，用于医药。

37.权利要求1-33的任意一项的逆转录病毒载体或权利要求34的病毒颗粒或权利要求35的细胞在制备用于将一种或多种NOIs送递到有需要的靶位点的药物中的用途。

38.一种方法，包括用权利要求1-33的任意一项的逆转录病毒载体或权利要求34的病毒颗粒转染或转导细胞，或通过使用权利要求35的细胞。

39.体外制备因子VIII的方法，包括制备权利要求35的细胞，在培养基中将所述细胞传代，除去所述培养基，并且分离因子VIII。

40.体外制备因子VIII的方法，包括制备包含本发明的密码子优化的编码因子VIII的核酸的细胞，在培养基中将所述细胞传代，除去所述培养基，并且分离因子VIII。