CN1688323A - 慢病毒载体介导的基因转移及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可用于人类遗传性或获得性增生性眼病基因治疗的慢病毒载体。本发明还提供利用该慢病毒载体转导具有有丝分裂活性和无活性细胞的能力治疗眼病的方法。

Description

慢病毒载体介导的基因转移及其应用
相关申请的交叉参照
本申请是2001年12月19日提交的USSN 10/025,264的后续申请，要求2000年12月19日，提交现已放弃的美国临时专利申请60/256,701的优先权。
发明背景
发明领域
本发明总的涉及基因输送载体和基因治疗领域。更具体地说，本发明涉及可用于遗传性和增生性眼病人类基因治疗的慢病毒载体。
相关领域的描述
人类致盲的一个最常见原因是异常的眼内细胞增生，常导致视轴的澄明度下降，或者由于直接作用于视网膜表面的牵引力而使视网膜与视网膜色素上皮分离。不论是与增生性糖尿病、早产儿视网膜病变、增生性玻璃体视网膜病变相关的，还是与新生血管老化有关肌肉退变相关的(neovascular age-related musculardegeneration)增生性视网膜脱落，如果延误治疗最终都会导致永久性的失明。
眼内新血管的异常增生，即眼内新生血管化，在发达国家中是最常见永久性致盲原因。眼内新生血管化绝大多数病例与三种疾病相关，即糖尿病、早产儿视网膜病和老龄相关的肌肉退变。虽然这三种疾病的临床表现不同，影响的人群也不同，但是它们最终都有一个共同的通路，该通路涉及内皮细胞的失控性分裂增殖，导致新血管的形成，最终影响视网膜的功能。在美国有7％的人受眼内增生性疾病的影响，每年可导致25000人失明。在美国，65岁以上的老年人中有30％受该疾病的影响。
视网膜内血管内皮细胞的增生可导致增生型糖尿病视网膜病变(PDR)。如果不进行治疗，这些内皮细胞会持续分裂，最终形成纤维血管膜，沿视网膜的内表面生长或者延伸到玻璃体腔内。后玻璃体表面的皱缩会在玻璃体-纤维血管膜粘附部位产生张力，最终导致视网膜剥脱。大约有50％的1型糖尿病患者在被诊断为糖尿病后的20年内会发生PDR，然而在相同的时期内只有10％的2型糖尿病患者会发生PDR。
血管的生成通常有两种方式：血管发生和新血管生成。在血管发生过程中，最初的毛细血管网是胚胎发育期间由多能间充质祖细胞成熟而产生。而新血管生成是一种已有血管的重塑过程。在新血管生成过程中，新血管芽从已有的老血管中长出，并侵入周围组织。在视网膜内，正常的血管网络一旦形成，此网络的重塑过程主要受组织氧浓度的影响。缺氧(氧不足)可刺激新血管生成。正是这一过程导致了我们社会中数百万的糖尿病患者、早产儿或老年人失明。
目前对眼内新生血管性疾病的治疗是侵入性和损伤性的。其治疗常常需要眼内手术，手术时伴有某些组织的死子。因此需要找到一种新的治疗方法来治疗此类疾病，确定是否可将那些调节新血管生成的基因导入到眼内以控制增生性疾病是令人感兴趣的。目前用哺乳动物细胞进行高效的基因转导有困难。用传统的载体，如腺病毒载体、脂质体和树枝状高分子试剂转导所得到的结果都相当短暂。要将这些载体导入眼内而不诱导强炎症反应也是很困难的。
为了介导向眼细胞和眼组织的基因输送，理想的基因输送载体应该具有宽广的嗜性，并且能转导静止的细胞。用于治疗慢性疾病时该载体还需要能使转基因持续和强表达。到目前为止，还缺少转导人眼内的或眼来源的终末分化细胞或增殖细胞的方法。本发明满足了本领域的这一长期需求和期望。
发明概述
本发明的目的之一是开发慢病毒载体以及利用这些载体对人类遗传性和增生性眼病进行基因治疗的方法。本发明还描述了该慢病毒载体在转导人视网膜细胞、角膜细胞、血管内皮细胞、增生性玻璃体视网膜病变细胞和视网膜色素上皮细胞中的应用。
现已证实利用慢病毒输送的组成性活化的(突变或变异的)视网膜母细胞瘤(CA-rb)基因有有能抑制眼内的细胞分裂。在体外测试了人的眼细胞，并在体内测试了两种眼内增生性疾病模型(增生性玻璃体视网膜病变和晶状体摘除后囊后混浊)。体外在许多不同类型的细胞中观察到细胞分裂爱到明显而持久地抑制。在体内模型中观察到增生性玻璃体视网膜病变和晶状体摘除术后囊后混浊严重程度的降低。
另外还已证实利用慢病毒转运已已知的对新血管生长(新血管生成)的发生和抑制或原程序性细胞死亡(凋亡)很重要的基因，可用于治疗病理性眼内新血管生成(如糖尿病性视网膜病变或“湿性”老年性黄斑变性)或病理性细胞死亡(如“干性”老年性黄斑变性)。可将这些基因置于两个分开的各个强启动子的控制之下，已知这些启动子在人视网膜、角膜和视网膜色素上皮细胞内具有活性。已在家兔模型上证实此可抑制角膜新血管的生成。已在角膜移植模型中显示角膜新新血管生成的抑制与防止移植失败相关连。
另外，本发明的慢病毒载体可用于输送已知的遗传性眼疾病患者缺失的那些基因。利用本文所描述的载体转移这些基因可成为治疗眼病患者有用疗法的基础。
本发明提供一种治疗眼病患者眼内细胞增生的方法，该方法包括：给予所述患者药学上有效量的含有抑制眼内细胞增生治疗性基因的慢病毒载体。
本发明还提供一种治疗眼病患者眼内新新血管生成的方法，该方法包括：给予所述患者药学上有效量的含有可抑制眼内新血管生成治疗性基因的慢病毒载体。
本发明还提供一种抑制新新血管生成和防止角膜移植失败的方法，该方法包括活体外用含有能抑制新新血管生成治疗性基因的慢病毒载体转导角膜组织，。
通过下文提供的本发明优选实施方式的描述，可以理解本发明的其他方面、特征和优点。这些实施方式是为了说明的目的而提供的。
附图的简要说明
通过参考附图所描述的某些特定实施方式，对上面的发明概述作了更具体的说明，可以更详细地了解上面所说的以及更清楚本发明的特征、优点和目的。这些附图构成了本说明书的一部分。但是需要注意附图只是说明本发明的优选实施方式，而不应认为是对本发明范围的限制。
图1描述了Inder Verma博士(Salk Institute，San Diego，CA)提供的载体。HIV：人免疫缺陷病毒，LTR：长末端重复序列，GAG：HIV GAG基因，POL：HIV逆转录酶，ENV：HIV包膜基因，rre：rev-反应性元件，CMV：巨细胞病毒，VSV：水泡性口炎病毒，Poly A：聚腺苷酸信号，特异性启动子：任何能增强转录的启动子都可用于此处以调节治疗性基因的空间、临时或量的表达，治疗性基因：任何具有治疗功能的基因都可用于此处，其中包括但不限于CA-rb，或那些缺失后可致病的基因。
图2显示下列人细胞系的体外转导效率：人视网膜色素上皮细胞(RPE)，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，脉络膜纤维母细胞(CF)，人视网膜母细胞瘤(视网膜衍生的)细胞(Weri-Rb-1和Y79)。这些细胞系用含标记基因(增强的绿荧光蛋白基因)的慢病毒颗粒转导，经荧光活化细胞分选方法测定表达该标记基因的细胞组分。剂量-反应曲线显示转导慢病毒颗粒数越多(病毒感染单位-MOI)的细胞荧光强度越强。
图3A说明慢病毒转导培养的视网膜色素上皮细胞的情况。标记基因(eGFP)的表达使细胞发出绿色的荧光。图3B显示用荧光活化细胞分选法分析转导的效率。第一分图R2门之外的数据反映了转导前细胞无荧光。第二分图显示转导后＞95％的细胞发荧光。
图4说明人视网膜色素上皮细胞的有丝分裂活性和转导效率。人网膜色素上皮细胞用慢病毒载体或鼠白血病病毒(MLV)载体转导。接触载体的细胞是无有丝分裂活性的(汇合的)，或者是有具有丝分裂活性的(处于生长状态)。这些结果表明慢病毒载体转导非分裂细胞的能力比其他逆转录病毒载体高。
图5描述人视网膜色素上皮细胞中的表达稳定性。使细胞接触含eGFP的慢病毒，随后持续培养至少120天。图5A描述这些细胞内eGFP表达的稳定性以及没有选到慢病毒转导的细胞(已转导的细胞组分随时间推移保持恒定)。图5B是5个细胞克隆群的DNA印迹分析结果。1泳道含非转导亲代细胞系的基因组DNA.2泳道和3泳道含接触过载体但不发荧光的细胞(非转导的)的DNA。4泳道和5泳道含转导的绿荧光细胞的DNA，由于基因组整合这些细胞保持e-GFP阳性。
图6说明人胚胎细胞的转基因表达。此图说明当与非慢病毒的逆转录病毒载体(MND-eGFP)或无病毒载体(对照)相比，采用慢病毒载体实现了高效地转导人胚胎细胞。
图7显示角膜的转导。图7A是人角膜的示意图。图7B显示人角膜上皮细胞可被含e-GFP的慢病毒载体转导。在角膜移植时取出人角膜瓣，与慢病毒颗粒接触。随后取出角膜后弹性层，在普通灯光下(左侧)及适合荧光检测的条件下(右侧)拍照。图7C显示对人角膜上皮细胞的慢病毒介导的eGFP基因转移。分图A是带有人工剥脱上皮层的人角膜光学显微照片。荧光显微镜(分图B)显示上皮细胞发出的荧光。
图8提供慢病毒基因转移缺失后可导致人类眼病的基因的一个实例。在进行视网膜母细胞瘤摘除术时手术切取正常的人视网膜组织或视网膜上皮(RPE)组织，使其接触不含治疗性基因(模拟)或含人外周蛋白基因的慢病毒载体。已知当人遗传缺失该外周蛋白基因可导致各种各样的残疾表型。图中显示逆转录聚合酶链式反应(rt-PCR)的结果，设计所用的引物只识别转移的外周蛋白基因。清楚地表明人外周蛋白可在人视网膜和RPE中表达。
图9显示慢病毒介导的CA-rb mRNA的表达。图中显示逆转录酶聚合酶链式反应(rt-PCR)的结果，设计所用的引物只识别组成活化形式的视网膜母细胞瘤基因.1泳道：分子量标准，2泳道：与慢病毒-eGFP转导细胞分离的RNA的反应结果，3泳道：与慢病毒-CA-rb转导细胞分离的RNA的反应结果。反应产物的大小与预期一致。
图10显示慢病毒CA-rb对人视网膜和脉络膜细胞分裂的抑制作用。使细胞与递减稀释的单一慢病毒贮液(1∶400到1∶50稀释)接触并培养，与接触不含CA-rb基因的慢病毒载体的细胞作比较。可以清楚地观察到随时间推移细胞的分裂受到抑制，并且这种抑制作用是剂量依赖性的。
图11显示慢病毒CA-rb对人晶状体上皮细胞的抑制作用。在白内障摘除术时取出人眼细胞，使其与递减稀释的单一慢病毒贮液(1∶400到1∶50稀释)接触并培养，与接触不含CA-rb基因的慢病毒载体的细胞作比较。可以清楚地观察到随时间推移细胞的分裂受到抑制，并且这种抑制作用是剂量依赖性的。
图12显示慢病毒CA-rb对致盲性眼内细胞增殖的体内抑制作用。在三组家兔中诱导出增生性玻璃体视网膜病变。一组动物不作处理，另一组动物用不含CA-rb基因的慢病毒载体处理，最后一组动物玻璃体内注射慢病毒CA-rb。在前两组中观察到增生性玻璃体视网膜病变和视网膜剥脱发生频率大于90％。而用CA-rb处理组的动物发生视网膜剥脱的频率明显较低(26％)。图中显示两张视网膜照片。左图眼睛视网膜完整附着，是用CA-rb处理的，右图眼睛视网膜完全剥脱，这是眼内玻璃体视网膜病变细胞增生的结果，是用不含CA-rb基因的慢病毒载体处理的。
图13显示体内慢病毒CA-rb对晶状体摘除后囊后混浊过程的抑制作用。对三组家兔进行标准的晶状体乳化术以去除天然的晶状体。第一组(组1)随后不作任何处理，另外两组或用空的慢病毒构建物(不含治疗性基因，组2)或用慢病毒CA-rb处理(组3)，在闭合白内障伤口时将其输入到完整的晶状体囊袋内。不断观察动物是否出现囊后混浊。混浊的程度评为1到5分，1分代表无混浊，5分代表混浊程度严重到用间接双目眼镜看不见视网膜。组1和组2(不处理组和空载体对照组)所得到的结果无显著差异。图中显示慢病毒CA-rb对囊后混浊的发展有显著抑制作用。在28天时，对照组动物平均混浊得分为4.4，而慢病毒CA-rb处理动物的平均混浊得分为2.1。
图14显示慢病毒载体输送的内皮抑素-18/血管生长抑素融合基因的示意图。
图15显示携带内皮抑素/血管生长抑素融合基因的慢病毒载体pHR-CMV-Endo/Ang-ires-eGFP的示意图。
图16显示携带BIK基因的慢病毒载体pHR-CMV-BIK-ires-eGFP的示意图。
图17显示携带内皮抑素/kringle融合基因的慢病毒载体pHR-CMV-Endo/Kringle-ires-eGFP的示意图。
图18显示携带KDR基因的慢病毒载体pHR-CMV-KDR-ires-eGFP的示意图。
图19显示携带p16基因的慢病毒载体pHR-CMV-P16-ires-eGFP示的意图。
图20显示携带p21基因的慢病毒载体pHR-CMV-P21-ires-eGFP的示意图。
图21显示携带Timp1基因的慢病毒载体pHR-CMV-Timp1-ires-eGFP的示意图。
图22显示携带血管生长抑素基因的慢病毒载体pHR-EF1/HTLV-Ang-ires-eGFP的示意图。
图23显示携带内皮抑素XV基因的慢病毒载体pHR-EF1/HTLV-Endo XV-ires-eGFP的示意图。
图24显示携带内皮抑素/血管生长抑素融合基因的慢病毒载体pHR-EF1/HTLV-EndoAng-ires-eGFP的示意图。
图25显示携带内皮抑素/kringle融合基因的慢病毒载体pHR-EF1/HTLV-EndoKringle-ires-eGFP的示意图。
图26显示携带Kringle基因的慢病毒载体pHR-EF1/HTLV-Kringle1-5-ires-eGFP的示意图。
图27显示携带Mig/IP10融合基因的慢病毒载体pHR-EF1/HTLV-MigIP10-ires-eGFP的示意图。
图28显示携带Timp1基因的慢病毒载体pHR-EF1/HTLV-Timp1-ires-eGFP的示意图。
图29显示携带Timp4基因的慢病毒载体pHR-EF1/HTLV-Timp4-ires-eGFP的示意图。
图30显示携带p21基因的慢病毒载体pHR-EF1/HTLV-P21-ires-eGFP的示意图。
图31显示携带内皮抑素XVIII基因的慢病毒载体pHR-EF1/HTLV-Endo XVIII-ires-eGFP的示意图。
图32显示RT-PCR扩增人皮肤微血管内皮(hDMVE)细胞mRNA的结果，该细胞转导了内皮抑素-18/血管生长抑素融合基因.1泳道：1000/100bp梯级混合物；2-5泳道：分离自hDMVE细胞的mRNA经RT-PCR扩增的产物，hDMVE细胞分别用12孔培养板每孔中的1μl、5μl、10μl和20μl pHR’-eF1/HTLV-Endo∷Ang-IRES-eGFP病毒上清转导；6泳道：分离自与20μl PB与培育的hDMVE细胞的mRNA经RT-PCR扩增的产物；7泳道：阴性对照(H20作为RT-PCR的模板)；8泳道：100bp梯标记。
图33显示评价碱烧灼后角膜新生新血管生成的标准方法。新生新血管生成的面积用如下公式计算：半径RT所界定的较大扇区面积减去半径R2界定的较小扇区面积。半径RT所界定的较大扇区面积等于扇区时钟小时数÷12×πRT2。半径R2所界定的较小扇区面积等于扇区时钟小时数÷12×π(R2)2。两个扇区相减所得到的面积就是新生新血管生成的面积。
图34显示的是处理组动物角膜微袋内存在eGFP。图34A显示荧光显微照片，表明微袋内有eGFP的表达。图34B显示与A相同的组织内无荧光的显微照片。图34C显示未处理组动物的相似组织的荧光显微照片。
图35显示用慢病毒Endo/K5载体处理动物眼内新生新血管生成受到抑制。图中描述了用PBS(n＝3)、携带标记基因eGFP的慢病毒载体(n＝3)或携带Endo/K5融合基因的慢病毒载体(n＝10)处理动物中的新生新血管生成平均面积。
图36显示的是慢病毒K1-5载体处理动物眼内新生新血管生成受到抑制。图中描述了用PBS(n＝3)、携带标记基因eGFP的慢病毒载体(n＝3)或携带K1-5基因的慢病毒载体(n＝9)处理动物中的新生新血管生成平均面积。
图37显示用Mig/IP10慢病毒载体处理对动物眼内新生新血管生成的抑制作用。图37A显示正常角膜(未处理的、未刺激的)的照片。图37B显示用Mig/IP10慢病毒载体处理动物角膜经碱烧灼后的照片。注意角膜内无血管。图37C显示用不含治疗性抗血管生成基因的对照慢病毒载体处理动物的角膜经碱烧灼后的照片。注意角膜内有血管侵入。图37D显示未处理动物角膜经碱烧灼后的照片。注意角膜内有血管侵入。
图38显示用Mig/IP10慢病毒载体处理动物眼内新生新血管生成受到抑制。图中描述了用PBS、携带标记基因eGFP的慢病毒载体或携带K1-5基因的慢病毒载体处理动物中的新生新血管生成平均面积。
图39显示用慢病毒KDR载体处理动物眼内新生新血管生成受到抑制。图中描述用PBS(n＝3)、携带标记基因eGFP的慢病毒载体(n＝6)或携带KDR基因的慢病毒载体(n＝9)处理动物中的新生新血管生成平均面积。
                               发明详述
慢病毒是一种致病缓慢的病毒，其自然的致病过程可达数月到数年。此病毒属包括逆转录病毒，如HIV。已知这些病毒可感染和转导各种各样终末分化的具有有丝分裂活性的或不具有有丝分裂活性的人类细胞。其转导效率很高，即使传上对基因转移非常顽抗的细胞系，如人视网膜细胞、角膜细胞、小梁细胞、晶状体细胞、视网膜色素上皮细胞、增生性玻璃体视网膜病变细胞和血管内皮细胞都可用这种载体转导。
一旦感染了慢病毒，慢病毒就会将自身的遗传物质整合到宿主基因组内。因此，此病毒的基因就成为宿主细胞遗传物质的一种永久成分，在宿主细胞的一生中持续地表达。转导了慢病毒的所有细胞都可以将遗传信息传给子代细胞。在自然感染条件下，慢病毒是一种不会诱导炎症反应的眼内病原体。因此，慢病毒是用于眼内疾病基因治疗的一种优良候选载体。以前对这个病毒的研究工作表明它可以成功地用于转导神经元和视网膜细胞(Naldini等，1996；Miyoshi等，1997)。
本发明提供了在两个克隆位点之间加入了IRES(内部核糖体进入位点)元件的新型慢病毒载体。IRES元件可使mRNA与核糖体结合并合成蛋白质。这个载体主链内可容纳两个不同的表达基因。在转导细胞内只产生一个信使RNA；但是，这个信使RNA是一个功能性的双顺反子，由于存在IRES元件可驱使合成两种不同的蛋白质。这两个基因可置于强启动子，如CMV或HTLV启动子的控制之下。另外，本领域技术人员也不难采用其他已知的在人视网膜细胞、角膜细胞或视网膜色素上皮细胞内有活性的启动子。以这种方式，可将下述的每个潜在的治疗性基因连接一个标记基因(如增强的绿色荧光蛋白基因，eGFP基因)，这样转导的细胞可被标记并同时表达治疗性目的基因。标记的细胞易于在体外分离，也易于体内观测。
本领域技术人员清楚，除了增强的绿色荧光蛋白基因以外，也可将其他的标记基因插入到慢病毒载体内。除了本文描述的载体以外，本领域技术人员也能够容易地构建含其他治疗性目的基因的其他慢病毒载体。另外，本文所述的慢病毒载体系统可用于转移遗传性眼病或其他疾病患者已知的缺失基因。利用这个系统将这些基因转移到人眼细胞或其他组织构成了治疗各种疾病患者有效疗法的基础。
本文所详细描述的基本内容表明慢病毒载体可转移各种基因以矫正异常的眼内增生，而减少新生血管性疾病、视网膜剥离或白内障摘除后囊后混浊的发生。许多治疗性基因都可用于临床以抑制眼内细胞的分裂。这些基因包括近年鉴定到的新血管生长(新血管生成)或凋亡过程的各种调节剂。据信通过慢病毒介导的基因转移遗传调控这些调节剂的表达，可用于治疗眼内新生血管性疾病，如老年相关性黄斑退变(AMD)、早产儿视网膜病(ROP)和增生性糖尿病视网膜病变(PDR)。
血管内皮细胞在血管发生和新血管生成中起着关键作用。这些细胞对各种蛋白性细胞因子的反应是进行有丝分裂(变成活跃的细胞分裂和迁移)。例如，血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血管生成素、促血管生成素-1(Ang1)和舒血管素是能刺激内皮细胞分裂、迁移或细胞-细胞粘附的细胞因子，因此可促进新血管生成。内皮抑素、可溶性(decoy)VEGF受体(sflt)和血小板反应蛋白是看来能抑制新血管生成的内源性蛋白细胞因子。本发明证明许多这样的抑制蛋白通过慢病毒载体输送后可用于治疗眼内新生血管的形成。可插入到本发明慢病毒载体内的基因例子包括但不限于如下基因：
金属蛋白酶的组织抑制剂
金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs)代表了一个普遍存在的蛋白质家族，它们是基质金属蛋白酶(MMPs)的天然抑制剂。基质金属蛋白酶是一组锌结合内肽酶，参与细胞外基质(ECM)的结缔组织基质重塑和降解，这是肿瘤侵润、新血管生成和转移的一个基本步骤。每种基质金属蛋白酶在胞外基质中都有各自的底物特异性，对于基质的降解很重要。对人乳腺病理中金属蛋白酶的分析表明有以下几种基质金属蛋白酶参与胞外基质的降解：胶原酶(MMP1)可降解原纤维间质胶原；明胶酶(MMP2)主要降解IV型胶原；基质降解酶(MMP3)的作用范围较宽。
TIMP家族有4个成员。TIMP-1和TIMP-2具有基质金属蛋白酶抑制活性，能抑制肿瘤生长、侵润和转移。另外，TIMP-1和TIMP-2都参与新血管生成的抑制。与TIMP家族的其他成员不同，TIMP-3只见于ECM内，可能的作用是终末分化的标记。最后，TIMP-4被认为可能以组织特异性方式在胞外基质稳态中发挥作用(Gomez等，1997)。
TIMP-1
金属蛋白酶的组织抑制剂-1(TIMP-1)是一种23kD的蛋白质，也称为金属蛋白酶抑制剂-1、成纤维细胞胶原酶抑制剂、胶原酶抑制剂和红系形成活性(EPA)。编码TIMP-1的基因已由Docherty等，(1985)描述。TIMP-1可与金属蛋白酶(如胶原酶)形成复合物导致其不可逆的灭活。已在转基因小鼠模型中研究了TIMP-1的作用：一种是肝内过量表达TIPP-1，另一种是表达病毒癌基因猿猴病毒40/T抗原(TAg)可导致遗传性肝细胞癌的发生。在二重转基因实验中，使TIMP-1晶系与Tag转基因晶系小鼠杂交，报道肝内TIMP-1的过量表达可通过抑制肿瘤生长和新血管生成而阻断TAg-诱导的肝细胞癌发生(Martin等，1996)。
TIMP-2
金属蛋白酶的组织抑制剂-2(TIMP-2)是一种24kD的蛋白质，也称为金属蛋白酶抑制剂-2。编码TIMP-2的基因已由Stetler-Stevenson等(1990)描述。金属蛋白酶(MMP2)在肿瘤的侵润中起着关键作用，可与TIMP-2形成复合物而受到抑制。因此，TIMP-2可用于抑制癌转移(Musso等，1997)。当高侵润性和高转移性的鼠黑色素瘤细胞B16F10用编码人TIMP-2的质粒转染皮下注射到小鼠体内时，TIMP-2的过量表达能够抑制体内肿瘤的生长和新生血管的形成(Valente等，1998)。
TIMP-3
金属蛋白酶的组织抑制剂-3(TIMP-3)也称为金属蛋白酶抑制剂3。当乳腺癌和恶性黑色素瘤细胞系转染TIMP-3质粒后皮下注射到裸鼠体内时，观察到肿瘤的生长受到抑制(Anand-Apte等，1996)。但是，TIMP-3的过量表达在体外对此二肿瘤细胞系的生长没有影响。因此提示肿瘤细胞释放到附近胞外基质中的TIMP-3可能通过抑制胞外基质中生长因子的释放或者通过抑制新血管生成而抑制肿瘤的生长(Anand-Apte等，1996)。
TIMP-4
金属蛋白酶的组织抑制剂-4(TIMP-3)也被称为金属蛋白酶抑制剂4。TIMP-4基因及其组织定位已由Greene等(1996)描述。生化研究表明TIMP-4与TIMP-2相似可结合人明胶酶A(Bigg等，1997)。Wang等(1997)研究了TIMP-4调节人乳腺癌体内生长的作用。发现TIMP-4过量表达在体外可抑制细胞侵袭，用TIMP-4肿瘤细胞转化子体内注射裸鼠后肿瘤生长受到明显降低(Wang等，1997)。
内皮抑素、血管生长抑素、PEX、Kringle-5和融合基因
J.Folkman和他的同事们(Boehm等，1997)显示用内皮抑素+血管生长抑素蛋白治疗Lewis肺癌小鼠完全抑制了肿瘤的生长，在剩余的生存时间内小鼠保持健康。只用内皮抑素+血管生长抑素治疗一个疗程(25天)就获得了这种效果，而单用内皮抑素治疗需要6个疗程才能诱导肿瘤休眠。
D.Hanahan和他的同事们(Bergers等，1999)证明内皮抑素+血管生长抑素蛋白合用在胰岛癌小鼠模型中获得了极好的抗肿瘤效果。内皮抑素+血管生长抑素合用导致明显抑制肿瘤的生长，而单用内皮抑素或血管生长抑素无效。
内皮抑素XVIII
内皮抑素是由血管内皮瘤产生的一种新血管生成抑制剂，由O’Reilly等(1997)首先鉴定到。内皮抑素是胶原XVIII的一个20kD的C端片段，能特异性抑制内皮细胞增殖、和强烈抑制新血管生成和肿瘤生长。事实上，已证明注射重组内皮抑素后可使原代肿瘤回复成静止的显微病灶(O’Reilly等，1997)。据报道，内皮抑素可通过结合参与生长因子信号转导的硫酸肝素蛋白聚糖来抑制新生血管的形成(Zetter，1998)。
内皮抑素XV
最近已证明，胶原XV的C末端片段(内皮抑素XV)与内皮抑素XVIII一样能抑制血管的形成，但是二者的功能有几种差异(Sasaki等，2000)。
血管生长抑素
血管生长抑素是纤溶酶原的一个内部片段，含有四个kringle结构域中的第一个kringle结构，是迄今所述最强的内源性新血管生成抑制剂之一。已证明全身给予血管生长抑素可有效抑制体内恶性胶质瘤的生长(Kirsch等，1998)。血管生长抑素与常规的放疗联合使用提高了肿瘤的根除率，而不会增加体内的毒性作用(Mauceri等，1998)。其它研究表明逆转录病毒和腺病毒介导的血管生长抑素cDNA的基因转移，可导致体外抑制内皮细胞的生长和体内的新血管生成。通过抑制肿瘤诱导的新血管生成促进肿瘤细胞的死亡(Tanaka等，1998)。将编码鼠血管生长抑素的cDNA转移到鼠T241纤维肉瘤细胞内证明可抑制体内原代肿瘤和转移性肿瘤的生长(Cao等，1998)。
PEX
PEX是MMP-2的C末端血红素结合蛋白结构域，可抑制MMP-2与整合素αvβ3的结合，阻断新血管生成和肿瘤生长所需要的细胞表面胶原溶解活性。这个基因已被Brooks等(1998)克隆和描述。
Kringle-5
人纤溶酶原的kringle-5结构域与血管生长抑素的四个kringle具有高度序列同源性，已证明是内皮细胞增殖的一种特异性抑制剂。Kringle-5抑制碱性成纤维细胞生长因子刺激的毛细血管内皮细胞增殖的活性看来比血管生长抑素更强(Cao等，1997)。除了具有抗增殖活性以外，kringle-5还显示了类似于血管生长抑素的抗迁移活性，可选择性地影响内皮细胞(Ji等，1998)。
血管生长抑制性融合基因
可采用一种弹性蛋白肽基序(Val-Pro-Gly-Val-Gly)作为接头克隆了新型的血管生长抑制融合基因。这些融合基因联合了两种强血管生长抑制性基因以提高对肿瘤新血管生成的抑制。由于这些分子通过不同的机制发挥功能，其联合可产生协同效应。血管生长抑制性融合蛋白的例子包括但不限于内皮抑素18和血管生长抑素的融合(endo/ang)、内皮抑素18和纤溶酶原kringle 5基序的融合(eudolsk)以及干扰素γ所诱导的单核因子和干扰素α可诱导的蛋白10的融合。
趋化因子
趋化因子是低分子量的促炎症细胞因子，能够引起白细胞的趋化。根据趋化因子的不同，化学引诱作用对某些白细胞类型是特异性的。在肿瘤内表达趋化因子的基因可更有效地募集具有抗肿瘤活性的白细胞。除了其趋化活性以外，某些趋化因子还具有抗新血管生成活性，即它们能抑制供给肿瘤血液的血管形成。因此，这些趋化因子可用于癌的治疗。
干扰素γ诱导的单核因子(MIG)
MIG是干扰素γ所诱导的单核因子，是一种与IP-10有关的CXC趋化因子，由单核细胞产生。MIG是活化T细胞的化学吸引剂，也具有很强的血管生长抑制活性。瘤内注射MIG可诱导肿瘤的坏死(Sgadari等，1997)。
干扰素α可诱导的蛋白质10(IP-10)
干扰素α可诱导的蛋白质10(IP-10)是CXC趋化因子家族的成员。IP-10主要由单核细胞产生，但是T细胞、成纤维细胞和内皮细胞也可以产生IP-10。IP-10对淋巴样细胞如T细胞、单核细胞和NK细胞具有趋化活性，也是一种新新血管生成的强抑制剂。它通过抑制内皮细胞的分化来抑制新生血管的形成。由于其对免疫细胞具有趋化活性，因此IP-10被认为是一种增强抗肿瘤免疫反应的良好候选者。将IP-10基因转移到肿瘤细胞内可降低肿瘤细胞的成瘤能力，并且激发长期的保护性免疫反应(Luster和Leder，1993)。还证明IP-10的血管生长抑制活性可介导肿瘤抑制。表达IP-10的肿瘤细胞在体内坏死(Sgadari等，1996)。还证明IP-10可介导IL-12的血管生长抑制作用，导致肿瘤抑制(Tannenbaum等，1998)。
可溶性VEGF受体
FLT-1(fms-样酪氨酸激酶1受体)是VEGF的膜结合受体(VEGF受体1)。已证明FLT-1的可溶性片段(sFLT-1)通过其抗VEGF的拮抗活性具有血管生长抑制性能。可溶性FLT-1通过与VEGF的结合起作用，但也可因为它能结合并阻断膜结合FLT-1的胞外功能域而起作用。sFLT-1的一个例子是人sFLT-1，它含有FLT-1胞外部分的7个免疫球蛋白样结构域。
sFLK-1/KDR
FLK-1或KDR(激酶插入区受体)是VEGF的膜结合受体(VEGF受体2)。已证明KDR可溶性片段(sKDR)通过其抗VEGF的拮抗活性具有血管生长抑制性能。sKDR也能结合并阻断膜结合KDR的胞外区。sKDR的一个例子是人sKDR，它含有KDR胞外部分的7个免疫球蛋白样结构域。
血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)
VEGF是一种在新血管生成和内皮细胞生长中具有活性的生长因子。它能诱导内皮细胞的增殖和提高血管渗透性。bFGF是一种血管生长剂，具有许多潜在的基因治疗用途，例如动脉粥样硬化的治疗。VEGF和bFGF是用于新型基因转移方案促进新血管生长的理想候选者。通过基因转移方法刺激新血管生成为治疗目前无法治疗的组织局部缺血提供了希望。
凋亡
凋亡是用于描述程序性细胞死亡或细胞自杀过程的术语。这个过程是多细胞生物体发育和保持健康的正常组成成分。已证明凋亡的调节的异常涉及癌症到自身免疫疾病的各种病理性机制。
Bcl-2相互作用杀伤剂(BIK)
Bik是一种18kD(160个氨基酸)的强促凋亡蛋白质，也称为凋亡诱导剂NBK、BP4和BIP1。Bik由基因bik(或nbk)编码，其功能是通过与各种凋亡阻抑蛋白如Bcl-XL、BHRF1、Bcl-2或其腺病毒同源物E1B蛋白结合，加速程序性细胞死亡。在瞬时转染试验中，Bik以与Bcl-2家族促凋亡成员Bax和Bak相似方式促进了细胞的死亡。
BAK
Bcl-2同源物Bak是一种促凋亡蛋白质，能通过与抗凋亡家族的成员如Bcl-2和Bcl-XL结合并抑制它们的活性来促进凋亡，如先前对Bik的描述(Chittenden等，1995)。
BAX
Bax是一种21kD的蛋白质，功能为凋亡调节剂。Bax可通过与凋亡阻抑蛋白Bcl-2形成二聚物并拮抗其活性来加速程序性细胞死亡。认为这些蛋白二聚物的比例与凋亡启动有关。Kobayashi等(1998)研究了重组Bax的表达在K562红系白血病细胞中的作用。将Bax载体转染导入K562细胞中导致诱导细胞凋亡。另外，也发现稳定转染Bax的细胞对化疗药物如ara-X、阿霉素和SN-38更敏感(Kobayashi等，1998)。
BAD
Bad蛋白(Bcl-2结合组分6，bad基因或bbc6或bcl218)是一种能促进细胞死亡的小分子蛋白质(168个氨基酸，18kDa)。它能成功地与Bcl-XL和Bcl-2竞争结合从而影响这二种蛋白与Bax形成异源二聚体的水平。它可以逆转Bcl-XL的死亡阻抑活性，但不能逆转Bcl-2的死亡阻抑活性。
BCL-2
B细胞白血病/淋巴瘤-2(Bcl-2)是细胞死亡调节蛋白家族的原型成员。Bcl-2主要存在于线粒体内，通过干扰级联反应的活化而阻断凋亡。已证明将Bcl-2基因转移到肿瘤细胞内可增强肿瘤的转移能力(Miyake等，1999)。Bcl-2基因转移可用于骨髓移植，因为Bcl-2可提高照射接受者重建后造血干细胞的存活力(Innes等，1999)。Bcl-2基因转移还可用于治疗神经变性疾病，因为Bcl-2在神经元内的表达可保护神经元不发生凋亡(Saille等，1999)。
BCL-XS
Bcl-XS(短的同功型)是Bcl-2和Bcl-XL的主要的负性阻抑蛋白。已在基因治疗实验中用于启动表达Bcl-2和Bcl-XL肿瘤的凋亡。Bcl-XS的表达可减少肿瘤大小(Ealovega等，1996)，使肿瘤细胞对化疗药物敏感(Sumatran等，1995)，提示Bcl-XS在那些表达Bcl-2或Bcl-XL的肿瘤内具有启动细胞死亡的作用(Dole等，1996)。
GAX
Gax是一种编码转录因子的同源框基因，其所编码的转录因子可以p21依赖的方式抑制细胞增殖。当细胞受刺激而增殖时Gax表达下调。Gax过量表达可导致丝裂原活化细胞内Bcl-2表达下调而Bax表达上调(Perlman等，1998)。因此，Gax可用于抑制某些肿瘤细胞的生长。另外，Gax在血管平滑肌细胞内的过量表达可抑制细胞的增殖(Perlman等，1999)。因此，Gax基因转移能够限制血管损伤后产生的血管狭窄。
肿瘤抑制基因
肿瘤抑制基因的各种突变已证明与不同类型的癌症有关。在这些情况下，已考虑利用野生型肿瘤抑制基因进行体细胞基因治疗作为一种抗癌治疗措施。p16、p21、p27和p53通过作用于周期蛋白依赖的激酶来抑制细胞周期。
P16
P16是一种15kD的蛋白质(148个氨基酸)，也称为CDK4I、P16-INK4、P16-INK4A或多肿瘤抑制剂1(MTS1)。P16由基因cdkn2a或cdkn2编码。P16可与周期蛋白依赖的激酶4和6形成异源二聚物从而阻止此二激酶与周期蛋白D的体外和体内相互作用。因此，P16的作用是正常细胞增殖的负性调节剂。
P16(cdkn2)突变参与各种组织的肿瘤形成。cdkn2a在大部分的肿瘤细胞系以及某些原代肿瘤包括黑色素瘤和胆道肿瘤、胰腺癌、胃癌中都会发生纯合性缺失、突变或失活。p16IKN4a基因表达的缺失常见于间皮瘤和其他细胞系。已证明用腺病毒表达载体将p16INK4a转导入到间皮瘤细胞内导致转导细胞的生长抑制和细胞死亡(Frizelle等，1998)。另外，用腺病毒介导野生型p16基因转移到不表达内源性p16/CDKN2基因的三种人胶质瘤细胞系(U251 MG、U-87 MG和D54 MG)内可导致细胞生长静止于G0和G1期(Fueyo等，1996)。另外，用腺病毒介导野生型p16-INK4A基因转移到不表达p16-INK4A的肺癌细胞系内，可在体外和体内抑制肿瘤增殖(Jin等，1995)。因此，恢复肿瘤细胞内野生型P16蛋白质可用于癌的治疗。
P21
p21是一种18kD的蛋白质(164个氨基酸)，也称为周期蛋白依赖的激酶抑制剂1(CDKN1)、黑色素瘤分化相关蛋白6(MDA-6)和CDK相互作用蛋白1。p21由基因CDKN1编码，该基因也称为CIP1和WAF1。p21可能是重要的中介物，在对DNA损伤的反应中p53通过它发挥细胞增殖抑制剂的作用。p21可结合并抑制周期蛋白依赖的蛋白激酶活性，阻止关键的周期蛋白依赖性蛋白激酶底物的磷酸化，阻断细胞周期的进展和细胞增殖。p21在所有的成年人组织中都有表达。将p21基因转移到肿瘤细胞内可用于抑制肿瘤生长。
用重组腺病毒介导p21基因转移到两株人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系内导致以剂量依赖方式诱导p21表达并伴随有因细胞静止于G0/G1期而使其生长受到抑制。另外，将携带p21的腺病毒注射到小鼠中预先建立的NSCLC肿瘤内可抑制肿瘤生长和延长动物的生存(Joshi等，1998)。这些结果支持p21可用于癌的基因治疗。
根据本发明，可采用本领域中的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中已有完整的描述。参见Maniatis，Fritsch & Sambrook，《分子克隆：实验室手册》(1982)；《DNA克隆：实用方法》卷I和II(D.N.Glover编辑，1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1985))；《转录和翻译》(B.D.Hames & S.J.Higgins编辑，(1984))；《动物细胞培养》(R.I.Freshney编辑，(1986))；《固定化细胞和酶》(IRL Press，(1986))；B.Perbal，《分子克隆实验指导》(1984)。
“载体”是一种复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，可将另外的DNA片段连接到载体上以使该连接的片段得以复制。
“启动子序列”是一种能结合细胞内RNA聚合酶并启动下游(3’方向)编码序列转录的DNA调节区。为了定义本发明，启动子序列在其3’末端连接有转录起始位点，向上游(5’方向)延伸包括启动背景以上可检测水平的转录所必须的最少数目的碱基或元件。在启动子序列内有一个转录起始位点(常规用核酸酶S1图谱来定义)和负责结合RNA聚合酶的蛋白结合结构域(共有序列)。真核启动子通常，但不总是包含″TATA″盒和″CAT″盒。可采用各种启动子来驱动载体。
当通常用病毒载体将外源或异源DNA导入到细胞内时，该细胞即被外源或异源DNA所“转导”。转导的DNA可以整合到细胞的基因组内(如慢病毒载体的情况)，或可以不整合到细胞的基因组内(共价连接)。例如，在原核细胞、酵母及哺乳动物细胞内，DNA可保持在游离元件如质粒中。对于真核细胞来说，稳定转化的细胞是其中转化的DNA已经整合到染色体内并且可通过染色体复制遗传给子代细胞的细胞。这种稳定性通过真核细胞能够形成含转化DNA的子代细胞群的细胞系或克隆得到证明。“克隆”指由一个细胞或共同祖先通过有丝分裂而形成的一群细胞。“细胞系”指能在体外稳定生长很多代的原代细胞的克隆。
“治疗性基因”指能赋予细胞所期望表型的基因。例如，具有组成性活化的视网膜母细胞瘤(CA-rb)基因可用于阻止眼内细胞的增生，或者通过转移外周蛋白基因恢复遗传性缺陷。所期望的其他表型包括肿瘤生长的抑制、新血管生成的抑制或调节以及凋亡的调节。
本文所用的术语“标记基因”指连接有异源启动子或增强子元件的一种编码序列，当将该构建物导入到组织或细胞内时其产物易于定量分析。常用的标记物包括放射性元件、酶、蛋白质(如增强的绿色荧光蛋白)或在紫外灯下能发荧光的化学物质、以及其他标记物。
本发明涉及通过慢病毒基因转移治疗遗传性或增殖性致盲疾病的一种新方法。本发明提供了一种抑制眼病患者眼内细胞增生的方法，该方法包括给予所述患者药学上有效量的含治疗性基因的慢病毒载体以抑制眼内的细胞增生。可用本发明的这个方法治疗的眼内疾病的例子，包括老年相关性黄斑退变、增生性糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、青光眼以及增生性玻璃体视网膜病变。治疗性基因可以是视网膜母细胞瘤基因、p16基因或p21基因的组成性活化形式。优选将约106到109转导单位的慢病毒载体导入到后囊、玻璃体或视网膜下腔中。
本发明还提供一种抑制眼病患者眼内新生血管化的方法，该方法包括给予所述患者药学上有效量的含治疗性基因的慢病毒载体以抑制新生血管的形成。可用本发明的这个方法治疗的眼内疾病的典型例子，包括老年相关性黄斑退变、增生性糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、青光眼以及增生性玻璃体视网膜病变。治疗性基因可以是能调节新血管生成或凋亡的基因。一般来说，调节新血管生成的基因包括编码如下蛋白的基因：金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)-1，TIMP-2，TIMP-3，TIMP-4，内皮抑素，血管生长抑素，内皮抑素XVIII，内皮抑素XV，基质金属蛋白酶-2的C末端血红素结合蛋白结构域，人纤溶酶原的kringle 5结构域，内皮抑素和血管生长抑素的融合蛋白，内皮抑素和人纤溶酶原kringle 5结构域的融合蛋白，干扰素γ所诱导的单核因子(Mig)，干扰素α可诱导的蛋白质10(IP-10)、Mig和IP10的融合蛋白、可溶性FLT-1(fms样酪氨酸激酶受体)和激酶插入区受体(KDR)，而能调节凋亡的基因包括编码Bcl-2、Bad、Bak、Bax、Bik、Bcl-X短同功型和Gax的基因。优选给予剂量约106到109转导单位的慢病毒载体，导入到囊后腔、玻璃体或视网膜下腔。
本发明还提供一种防止新生血管化和角膜移植失败的方法。在移植前用含有能抑制新生血管化的治疗性基因的慢病毒载体活体外转导角膜瓣。治疗性基因是能调节新血管生成的基因，这种基因的典型例子已在上面列出。
在本发明的另一个方面提供了能介导基因转移到各种类型细胞内的慢病毒载体。该重组慢病毒载体包含(i)位于两个克隆位点之间的IRES(内部核糖体进入位点)元件，这样可从一条转录子上产生两种不同的蛋白；(ii)标记基因如增强的绿色荧光蛋白基因；以及(iii)治疗性基因。一般情况下，该治疗性基因可调节肿瘤的生长、新血管生成或凋亡。在一个实施方式中，调节肿瘤生长的治疗性基因包括p16、p21、p27、p53和PTEN，典型的慢病毒载体是pHR-CMV-P16-ires-eGFP(图19)、pHR-CMV-P21-ires-eGFP(图20)和pHR-EF1/HTLV-P21-ires-eGFP(图30)。
在另外一个实施方式中，能调节凋亡的治疗性基因包括Bik、Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-XL和Gax，典型的慢病毒载体是pHR-CMV-BIK-ires-eGFP(图16)。
在另外一个实施方式中，能调节新血管生成的治疗性基因包括金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4、内皮抑素、血管生长抑素、内皮抑素XVIII、内皮抑素XV、基质金属蛋白酶-2的C末端血红素结合蛋结构域、人纤溶酶原的kringle 5结构域、FLT-1(fms-样酪氨酸激酶1受体)、KDR(激酶插入区受体)、IP-10(干扰素α可诱导的蛋白质10)以及MIG(干扰素γ所诱导的单核因子)。典型的慢病毒载体是pHR-CMV-KDR-ires-eGFP(图18)、pHR-CMV-Timp1-ires-eGFP(图21)、pHR-EF1/HTLV-Ang-ires-eGFP(图22)、pHR-EF1/HTLV-Endo XV-ires-eGFP(图23)、pHR-EF1/HTLV-Kringle 1-5-ires-eGFP(图26)、pHR-EF1/HTLV-Timp1-ires-eGFP(图28)、pHR-EF1/HTLV-Timp4-ires-eGFP(图29)和pHR-EF1/HTLV-EndoXVIII-ires-eGFP(图31)。
在另外的实施方式中，调节新血管生成的治疗性基因编码血管生长抑制性融合蛋白，如内皮抑素和血管生长抑素的融合蛋白、内皮抑素和人纤溶酶原kringle 5结构域的融合蛋白、以及MIG(干扰素γ所诱导的单核因子)和IP-10(干扰素α可诱导的蛋白质10)的融合蛋白。典型的慢病毒载体有pHR-CMV-Endo/Ang-ires-eGFP(图15)、pHR-CMV-Endo/Kringle-ires-eGFP(图17)、pHR-EF1/HTLV-EndoAng-ires-eGFP(图24)、pHR-EF1/HTLV-EndoKringle-ires-eGFP(图25)以及pHR-EF1/HTLV-MigIP10-ires-eGFP(图27)。
给出下面的实施例是为了说明本发明的各种实施方式，并不意味着以任何方式限制本发明：
                                实施例1
细胞和组织
建立人脉络膜纤维母细胞(HCF)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人胚胎视网膜色素上皮细胞(HRPE)的原代外植块，在接种在能成不能促进有丝分裂的条件下。也培养稳定的感光细胞(Y-79和Weri-Rb-1)。
采用视网膜母细胞瘤摘除术时得到的人视网膜和RPE来证明慢病毒载体转导这些无有丝分裂活性细胞的能力以及诱导外源性人外周蛋白转基因表达的能力。采用角膜移植术时得到的人角膜来证明慢病毒载体将增强的绿色荧光蛋白标记基因转导到这些无有丝分裂活性细胞内的能力。
                               实施例2
慢病毒载体
具有水泡性口炎病毒(VSV)包膜蛋白假型，的三种质粒为基础的慢病毒载体系统含有绿色荧光蛋白(GFP)基因为标记基因(图1)。重组慢病毒的制备方法见Naldini等人的描述。巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子指导质粒pHR’-CMV-eGFP内eGFP的表达。病毒贮液的制备过程如下：将人肾293T细胞(5×106)接种在10cm培养皿内，次日通过磷酸钙沉淀在含抗生素的D10培养基(含10％胎牛血清的高葡萄糖DMEM)中共转染10ug pCMVΔR8.91(具有包装功能的质粒)、10ug pHR’-CMV-eGFP(标记基因质粒)和2ug pMD.G(含VSV-G包膜蛋白的质粒)。37℃培养12-16小时后除去培养液加入新鲜的D10培养基。细胞再培养10小时。加入含10mM丁酸钠和20mM Hepes缓冲物的新鲜D10培养基，细胞再培养12小时。用含20mM Hepes缓冲物的新鲜D10培养基换液，12小时后收集含病毒的培养基。随后4天内每24小时加入一次新鲜培养液并收集上清液。病毒上清液收集后立即置于-80℃储存。
室温下超速离心(19,000rpm，Beckman SW28转子)上清液140分钟浓缩病毒贮液，得到的病毒沉淀重悬于1-3ml磷酸盐缓冲液中。用293细胞滴定等伤病毒贮液的滴度，剩余的样品储存在-80℃。
通过感染植物凝集素刺激的人外周血单个核细胞、随后用ELIS分析培养液内的p24gag来检测所有的慢病毒上清液中是否存在复制活性逆转录病毒(RCR)。在所制备的任何病毒上清液中都未测到RCR。
                               实施例3
慢病毒载体转导
如上所述用慢病毒载体转染293细胞制备含2×106复制缺陷型慢病毒颗粒/ml的上清液。细胞与病毒颗粒共培养24小时，在随后的4天内用正常的培养基培养细胞，然后通过荧光活化细胞分选技术测定GFP表达情况(图2-3)。
测定转导效率作为1到1000感染复数(MOI)的函数。一些人细胞系的体外转导结果表明MOI与转导效率之间呈正相关，因为随慢病毒颗粒的数量增加，被转导的细胞越多(图2)。
检测了慢病毒载体转导非分裂细胞的能力。用慢病毒载体或鼠白血病病毒载体转导人视网膜色素上皮细胞。在接触载体时，细胞有(生长)或无有丝分裂活的(汇合)。图4所显示的结果表明慢病毒载体转导非分裂细胞的能力比其他逆转录病毒载体都强。与非慢病毒的逆转录病毒相比，慢病毒载体也可以高效转导人胚胎细胞(图6)。
为了确定eGFP转基因表达的持续时间，测定了慢病毒载体转导的细胞120天。对转导细胞克隆群的DNA印迹分析结果表明慢病毒-eGFP载体被整合入宿主基因组内(图5B)。整合的eGFP转基因可稳定表达120天以上，赋予转导细胞无选择性的优势(图5A)。
                              实施例4
角膜原位转导
采用角膜移植术时得到的人角膜瓣来证明慢病毒载体转导具有增强的绿色荧光蛋白标记基因的这些无有丝分裂活性细胞的能力(图7)。从转导的角膜组织剥下后弹性层膜上附着的内皮细胞，用光学显微镜和荧光显微镜观察。角膜内皮细胞为eGFP阳性，表明获得了有效的基因转移和表达(图7B)。在上皮层也观察到了有效的原位转导和eGFP表达(图7C)。
总之，这些结果表明复制缺陷型慢病毒载体能将转基因有效地原位导入到人角膜内皮细胞和上皮细胞内，并可达到转基因的长期表达。这种载体可用于治疗角膜内皮细胞疾病或上皮细胞疾病，可以这种方式在移植前活体外修饰供体角膜组织的基因构成以永久地抑制同种异体移植物排斥反应的发生。
                              实施例5
眼增生性疾病的生长抑制因子治疗
人外周蛋白基因可作为治疗性基因的一个例子。已知人外周蛋白基因的遗传性缺陷可导致各种残疾表型。使视网膜母细胞瘤摘除手术时切下的人正常视网膜或视网膜色素上皮(RPE)组织与不含治疗性基因的慢病毒载体或含人外周蛋白基因的慢病毒载体接触。图8的结果表明慢病毒载体可将外周蛋白基因有效地转移到人视网膜组织内。
作为治疗性基因转移的另一个例子是视网膜母细胞瘤基因(CA-rb)的组成性活化形式。本文所述的慢病毒载体介导了视网膜细胞瘤基因组成性活化形式的有效转移(图9)。转移的CA-rb基因显示以剂量依赖方式抑制了人视网膜和脉络膜细胞(图10)以及人晶状体上皮细胞(图11)的增殖。
慢病毒载体转移的组成性活化形式的视网膜母细胞瘤基因还在体内抑制了眼细胞增生。体内实验采用两种眼内增生性疾病模型(增生性玻璃体视网膜病变和晶状体摘除后囊后混浊)。在三组家兔中诱导了增生性玻璃体视网膜病变(图12)。一组动物不作任何处理，另一组动物用不含CA-rb基因的慢病毒载体处理，最后一组动物玻璃体内输入慢病毒CA-rb。在头两组中增生性玻璃体视网膜病变和视网膜剥离出现的频率大于90％。而用CA-rb处理的动物视网膜剥离的频几率低得多(26％)。
图13的结果证明了体内慢病毒CA-rb对晶状体摘除后囊后混浊过程的抑制作用。对三组家兔进行标准的晶状体乳化术以去除天然的晶状体。第一组(组1)随后不作任何处理，另外两组或用空的慢病毒构建物(不含治疗性基因，组2)或用慢病毒CA-rb处理(组3)，在闭合白内障伤口时将慢病毒输入到完整的晶状体囊袋内。不断观察动物是否出现囊后混浊。混浊的程度评为1到5分，1分代表无混浊，5分代表混浊的程度严重到用间接双目眼镜不能看见视网膜。组1和组2(不处理组和空载体对照组)所得到的结果无显著差异。图中显示慢病毒CA-rb对囊后混浊的进展有显著的抑制作用。在28天时，对照组的动物平均混浊得分为4.4，而慢病毒CA-rb处理组动物的评价混浊得分为2.1。
                               实施例6
“双基因”慢病毒载体
构建了在两个克隆位点之间插入IRES(内部核糖体进入位点)元件的新型慢病毒载体。IRES元件可使mRNA与核糖体结合并合成蛋白质。此主链内可容纳两个不同的可表达基因。然而在转导细胞内只产生一个信使RNA；由于IRES元件的存在这个信使RNA是一个功能性的双顺反子可以合成两种不同的蛋白质。以这种方式，可将许多潜在的治疗性基因(表1)连接于标记基因(如增强的绿色荧光蛋白基因，eGFP基因)，这样转导细胞将被标记同时可表达治疗性目的基因。标记的细胞易于在体外分离，也易于体内观测。
慢病毒载体也可以携带融合基因，该融合基因可通过一个弹性蛋白肽接头将不同的血管生长抑制性蛋白的功能基序连接起来。这些融合蛋白将两个强的血管生长抑制性基因连接起来增强了抑制肿瘤的新血管生成。由于这些分子的作用机制不同，因此它们的结合可产生叠加效应或协同效应。血管生长抑制性融合蛋白的例子包括但不限于内皮抑素18和血管生长抑素的融合蛋白(endo/ang，图14)、内皮抑素18和纤溶酶原kringle 5基序的融合蛋白(endo/k5)、内皮抑素18和PEX的融合蛋白以及干扰素γ所诱导的单核因子和干扰素α可诱导的蛋白质10的融合蛋白(MIG/IP10)。一些携带各种治疗性基因的慢病毒载体的基因图谱见图15-31。
使已知不表达治疗性基因的原初细胞与携带上述融合基因之一的慢病毒载体接触24小时。接触两天后分离这些细胞的RNA，并用逆转录酶辅助的聚合酶链式反应(RT-PCR)检测转基因的表达。图32显示从人皮肤微血管内皮细胞分离的mRNA扩增的内皮抑素18/血管生长抑素融合基因的阳性RT-PCR产物，从而证明了慢病毒可以介导体外基因转移。
            表1
         候选治疗基因
新血管生成抑制剂 MMP抑制剂hTIMP1hTIMP2hTIMP3hTIMP4hPEX内皮抑素hEndo XVhEndo XVIII血管生长抑素hK1-5Anti-VEGFhFLTshFLK-1(KDR)趋化因子MigIP-10 肿瘤抑制剂hp16hp21hp27hp53hPTEN凋亡hBadhBakhBax-ahBcl2-ahBclXLhBikhGAX
                              实施例7
新生血管化动物模型
如上所述，证明了慢病毒可用于体外基因转移后，再检测了体内抑制新生新血管生成的能力。用如下的方法在家兔角膜组织内诱导新生新血管生成：
角膜基质内微袋模型的制备以及包埋有腺病毒的尼龙网筛的插入
家兔通过面罩吸入异氟醚(4L/分)和氧(2L/分)进行全身麻醉。在穹隆部滴一滴丙美卡因进行局部麻醉。将异氟醚流量减少到2.5L/分。穹隆部滴聚烯吡酮碘30秒，用BSS(平衡盐溶液，Alcon Inc)淋洗。眼内放置眼睑窥镜。用一把2.8mm显微角膜刀插入到角膜基质12点部位。用McPherson镊子和Iris Sweep工具前后摆动使基质内切口深入5×5mm基质内袋中。将12点位置的切口向两侧扩充，用Vannas剪刀切开一个4.5mm的切口。将一个4×4mm包埋有10μL慢病毒的Amersham杂交尼龙网筛(Amersham Bioscientist RPN 2519)插入到先前切开的袋内。将一滴妥布霉素滴到角膜上。停用异氟醚，鼻内吸氧增加到4L/分。以这种方式20分钟后成功地使家兔全身麻醉，等恢复正常活力后放回笼内。
家兔每天接受两次0.2cc的buprenex(.3mg/cc)止痛，共给药两天。给家兔滴一滴阿托品和一滴妥布霉素进行术后睫状肌麻痹和抗生素护理，两天。在术后第一天，每只家兔眼内滴一滴丙美卡因进行局部麻醉，用.12的镊子将尼龙网筛从角膜基质内袋内取出。每天监测术后疼痛控制和护理情况两周。
碱诱导的新生血管化
首次手术后两周，使角膜接触6mm大的用20微升1.0M NaOH饱和的Whatman 3号滤纸圆片1分钟。然后用BSS充分洗涤所有的角膜。给家兔滴一滴阿托品和一滴妥布霉素进行术后睫状肌麻痹和抗生素护理两天。用数码照相设备记录新生血管反应。在术后1、3、5、7和10天用狭缝灯检查观察钟点小时及血管长度来测定新生血管反应。通过计算图33所示血管生长面积，定量检测新生血管化情况。用共聚焦显微镜记录慢病毒双顺反子信使RNA内所含增强的绿色荧光蛋白标记基因的表达。图34的显微照片表明慢病毒载体处理动物的角膜微袋内有eGFP存在。
                             实施例8
通过Endo/K5融合基因抑制新生血管的形成
本实施例检测慢病毒介导的内皮抑素：Kringle-5融合基因的表达对角膜移植的新生新血管生成和失败是否有抑制作用。
美国每年要进行30,000例以上的角膜移植。比所有的心、肾、肝移植的总例数还要多。角膜移植是人类最成功的移植手术之一，成功率超过90％。但是每年仍然有许多角膜移植物被排斥，导致移植失败。在美国的许多临床中心，角膜移植失败需要重新移植是角膜移植的两大适应症之一，与假晶状体大泡性角膜病变发生的概率相似。出现排斥的主要危险因素是以前进行过角膜移植、青光眼和术前角膜的新生血管化。防止角膜出现新生血管化是防止移植失败和排斥的中心环节，开发出能对抗促新血管生成刺激的生物制剂将是有用的工具。
内皮抑素是胶原XVIII的一个20kDa的C-末端片段，在大鼠血管内皮瘤模型中已证明是新血管生成和肿瘤生长的内源性抑制剂。内皮抑素通过特异性地下调内皮细胞中参与细胞生长、抗凋亡和新血管生成的基因的表达，来阻止细胞的增殖和迁移。血管生长抑素是一种纤溶酶原内部片段蛋白裂解产生的蛋白质，包含高达4个kringle结构域，可抑制新血管生成依赖性肿瘤的生长。纤溶酶原的kringle-5与血管生长抑素的4个kringl各结构域具有46％-57％的氨基酸序列相同性，与单用血管生长抑素相比是碱性成纤维细胞生长因子刺激的新血管生成的一种更强的抑制剂。Kringle-5通过抑制细胞迁移特异性地作用于内皮细胞。研究表明，在体外肿瘤模型中，含有小鼠内皮抑素和小鼠血管生长抑素的血管生长抑制性融合蛋白比单基因产物具有更强的生物活性。在这个实施例中，人内皮抑素18的生物活性结构域和人kringle-5连接在一起形成融合蛋白Endo∷K-5，用于制备一种能同时抑制内皮细胞增殖和迁移的蛋白质。
慢病毒产品
利用含BamH1位点的正向引物(5’CTGAGGGATCCGGCGAAGG AG 3’，SEQ ID NO.1)和含BamH1位点的反向引物(5’CAATGTATCGGATCCT G TCGAGCTAGC 3’，SEQ ID NO.2)通过PCR从EK-5 pBlast载体(Invivogen)内扩增得到内皮抑素-Kringle-5(Endo-Kr5)融合cDNA。这个融合基因编码人白细胞介素-2分泌信号肽的20个氨基酸、人胶原XVIII基因的丙氨酸1333-赖氨酸1516(内皮抑素)、含8个氨基酸的弹性蛋白接头基序VPGVGTAS(SEQ ID NO.3)和人纤溶酶原基因的脯氨酸466至天冬氨酸566。PCR片段用BamH1消化，连接到慢病毒载体内，置于巨细胞病毒(CMV)启动子的转录控制之下(图17)。通过直接测定转基因插入片段的序列证实了Endo∷K-5融合基因的构建成功。
病毒试验
按照厂家的说明书用p24 GAG抗原ELISA试剂盒(Zeptometrix)证实了病毒颗粒的存在。为了确保慢病毒试剂的感染性，将10、50和100μl病毒加入到6孔培养板内的人皮肤微血管内皮细胞(HDMEC)中37℃孵育20分钟。然后加入Media131(Cascade Biologicals；Oregon)，37℃5％CO2培育细胞5天，隔天更换一次培养基。第五天用Trizol(Gibco-BRL)分离得到RNA，并用标准RT-PCR方法分析。正向引物(5’TCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGG 3’，SEQ ID NO.4)和反向引物(5’CAAATGAAGGGGCCGCAC 3’，SEQ ID NO.5)分别位于弹性蛋白接头区的两侧，因此只扩增该融合基因转录子。
家兔的角膜移植
从8只新西兰白兔获得18个7mm的环型供体角膜。每个角膜瓣分别在含50μlEndo∷K-5慢病毒、50μl eGFP慢病毒或50μl PBS的2ml optisol(CHIRON)内37℃孵育18小时。
家兔面罩吸入异氟醚诱导全身麻醉。进行角膜穿刺将肝素和viscoelastic滴到前房(AC)内。Hessburg-Barron 7mm环钻用于取宿主的角膜瓣。将宿主角膜瓣放入含病毒或对照添加物的optisol介质内，用于次日的移植。将Enod∷K-5、eGFP或PBS处理的7mm环型角膜瓣用16根不连续的7-0尼龙缝线缝合。结膜下注射0.1cc的英氟沙星(Baytril，23mg/cc)和Kenolog(40mg/cc)。术后局部给予所有动物单剂阿托品(1％)和单剂卡洛芬(2.5mg/kg)SQ，以及一滴妥布霉素，一天两次共5天，必要时给予0.1mg/kg SQ的Buprenex。术后不局部滴类固醇。
新生血管化的测定及移植排斥反应的评价
术后第5、9、12、14、16、24、28、36天用狭缝灯检查新生新血管生成情况。以观察者/眼科学家单盲方式用便携式狭缝灯测定形成的新生血管。生长到角膜上的血管以mm和时钟小时数记录。用如下公式来计算血管生长的楔形面积以定量新生新血管从生成：面积＝(时钟小时数/12)πr2(图33)。在大多数情况下，血管不会占据整个楔形面。为了校正这种情况，要从总面积内减去无血管生长的面积(图33)。用便携式狭缝灯评价移植排斥。角膜移植物持续水肿伴移植物100％混浊判断为移植失败。拍摄角膜的系列照片。术后9、21、30和40天处死动物。新鲜的角膜组织放入Trizol(Gibco-BRL)中用于RT-PCR，或者用甲醛固定进行组织病理学检测。
结果
取16只新西兰白兔，每只家兔的一只眼睛中实施同种异体穿透性角膜移植术。其中10只家兔移植的角膜在Optisol+含内皮抑素/kringle 5融合基因的慢病毒载体浸泡过夜，3只家兔移植的角膜用Optisol+含eGFP基因的慢病毒载体浸泡，3只家兔移植的角膜用Optisol+PBS浸泡。
术后5、9、12、14、16、18、24、28和36天，慢病毒Endo∷K-5移植后的眼中角膜形成的新生血管，比慢病毒eGFP或PBS对照眼中明显为少(图35)。所有PBS处理角膜和慢病毒eGFP处理角膜都显示有新生血管呈分支状长入移植物床内。而10个Endo∷K-5处理角膜没有一个有新生血管长入.3/3个PBS处理角膜和2/3个eGFP处理角膜出现了角膜混浊和移植失败，而在术后39天时，10个Endo∷K-5移植物中没有一个完全混浊或移植失败。
术后30天和40天，用RT-PCR检测发现所有5个移植物内都存在融合基因转录物。所有对照眼和未手术眼融合基因BT-PCR为阴性。移植物的组织病理学检测发现，与Endo∷K-5处理眼相比，对照眼的角膜增厚、水肿更严重。眼组织连续切片分析揭示对照眼内新生血管和嗜碱性炎症细胞浸润比Endo∷K-5处理眼或未手术眼严重。对留置缝合线部位组织病理性检测，通常这个部位都有炎症细胞浸润，但是在所检测的Endo∷K-5角膜内未发现炎症细胞。
角膜移植的成功使这个手术的适应症得以扩大，每年所进行的角膜成形术例数增加。虽然这个手术较易成功，但由于多种原因引发的移植排斥依然是其主要问题。引发移植排斥的主要危险因素是受者角膜床、移植物/宿主界面或移植物本身的新生血管化。新生血管长入移植物中与移植物内大量炎症细胞、血浆蛋白和细胞因子有关，通常预示排斥和失败。据信新生血管的形成会促进排斥，研究人员一直以来都在寻找药物或手术方法来消除角膜的新生血管化进程。
本实施例描述了一种抑制兔模型穿透性角膜成形术后新生新血管生成的成功方法。该方法依据慢病毒载体活体外转导角膜组织的能力，该慢病毒载体含有已知在肿瘤新血管生成动物模型中具有抗新血管生成活性的基因。本文所检测的融合基因包含人内皮抑素基因和人纤溶酶原kringle 5元件的组合，作为新血管生长的抑制剂。
用慢病毒Endo∷K-5处理角膜瓣能防止所有处理的角膜中新血管长入供者移植物内。组织学研究表明Endo∷K-5处理的角膜内炎症反应显著降低，其中包括留置缝合线周围区域，这个区域是常见的炎症区域。另外，对Endo∷K-5处理角膜的持续角膜水肿和角膜混浊检测没有移植失败的证据，而6个对照角膜中有5个呈现混浊和失败。这些结果表明在穿透性角膜成形术前用含有抗新血管生成融合基因的慢病毒载体活体外转导供者角膜组织，可提高移植物长期存活的可能性，这可能是一种有效的手术辅助措施。
                             实施例9
用Kringle 1-5基因抑制新生血管的形成
血管生长抑素K1-5编码由纤溶酶原所有5个kringle结构域组成的55kD蛋白质，通过纤溶酶对纤溶酶原的蛋白酶解作用而产生。在多种模型中它是种强效抗新血管生成因子。
在新西兰白兔上进行了角膜袋试验以测定Kringle 1-5基因对眼内新生血管化的影响。将尼龙网筛作为垫片插入到基质内角膜袋中，然后注射携带Kringle1-5基因和标记基因eGFP的慢病毒载体(图26)、或只携带标记基因eGFP的慢病毒载体或单独PBS。24小时后从眼内取出尼龙网筛，缝线留在眼内7天以刺激新生新血管生成。于缝合后3、5、7和10天测定新生血管化程度。收获角膜进行组织病理学分析和转基因表达分析。如图36所示，用携带Kringle 1-5基因的慢病毒载体处理的动物眼内新生血管化受到明显抑制。
                            实施例10
用Mig/IP10基因抑制新生血管的形成
Mig是由干扰素γ诱生的单核因子，而IP10是干扰素α可诱导蛋白质10。二者的结构和功能相似，都是属于CXC家族的趋化因子。人类中这两种蛋白相同性达37％，其基因位于染色体4q21.21上，彼此相邻。Mig和IP10都能与一种主要表达在记忆T细胞和活化T细胞上的G蛋白偶联受体CXCR3结合。B细胞、NK细胞和单核细胞上也有CXCR3。最近在内皮细胞上发现了Mig和IP10的第二个受体。在功能上，Mig和IP10都是活化T细胞的趋化因子，认为可通过抑制内皮细胞的趋化性和生长因子诱导的新血管生成来影响血管的形成。下面描述测定Mig/IP10融合基因对眼内新生血管化的影响。
按照实施例7所述方法制作角膜基质内微袋，将包埋携带Mig/IP10融合基因的慢病毒载体(图27)、或只携带标记基因eGFP的慢病毒载体的尼龙网筛、或者只包埋PBS的尼龙网筛插入到该微袋内。24小时后取出尼龙网筛。为了诱导新生血管形成，使上述角膜接触6mm已用20微升1.0M NaOH饱和的Whatman#3号滤纸圆片。新生新血管的生成10天内测定。如图37-38所示，用携带Mig/IP10融合基因慢病毒载体处理的动物眼内新生血管化受到明显抑制。
                             实施例11
用KDR基因抑制新生血管的形成
KDR(激酶插入区受体)是VEGF的膜结合受体(VEGF受体2)。VEGF是一种强效丝裂原，可诱导血管内皮细胞增殖、迁移和产生蛋白酶。已证实KDR的可溶性片段(sKDR)通过其抗VEGF的拮抗活性具有血管生长抑制活性。sKDR也能结合并封闭膜结合KDR的细胞外区。在上述动物模型中检测了慢病毒载体(图18)输送的sKDR基因对眼内新生血管化的作用。结果如图39所示，用携带sKDR基因的慢病毒载体处理的动物眼内新生血管化受到明显抑制。
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本说明书中所提到的所有专利或文献说明了本发明所属领域技术人员的水平。另外，这些专利和出版物的内容纳入本文作参考的程度与各个出版物具体和单独纳入本文作参考的程度相同。
本领域的技术人员不难理解本发明很适合实施本文所提到的目标，获得所提及的结果和优点，以及本文所固有的那些目标、结果和优点。本文所述的实施例及方法、过程、治疗方案和具体的化合物代表优选的实施方式，并不意味限制本发明的范围。本领域技术人员可在权利要求范围所定义的本发明的思路内对本发明作出修改。

Claims (24)

1.一种抑制眼病患者眼内细胞增生的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
给予所述患者药学上有效量的、含有能抑制眼内细胞增生治疗性基因的慢病毒载体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述眼病选自：老年相关性黄斑退变、增生性糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变以及增生性玻璃体视网膜病变。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述治疗性基因选自：视网膜母细胞瘤基因的组成性活化形式或其他生长抑制基因(p53、p21、p16、p27，如上所述)。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述慢病毒载体以约106到109转导颗粒的剂量注射到角膜、囊后、玻璃体或视网膜下腔中。
5.一种抑制眼病患者眼内新生血管化的方法，该方法包括如下步骤：
给予所述患者药学上有效量的、含有能抑制眼内新生血管化治疗性基因的慢病毒载体。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述眼病选自：老年相关性黄斑退变、增生性糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、青光眼以及增生性玻璃体视网膜病变。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述治疗性基因选自能调节新血管生成的基因和能调节凋亡的基因。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述能调节新血管生成的基因编码的蛋白质或多肽选自：金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4、内皮抑素、血管生长抑素、内皮抑素XVIII、内皮抑素XV、基质金属蛋白酶-2的C末端血红素结合蛋白结构域、人纤溶酶原的kringle 5结构域、内皮抑素和血管生长抑素的融合蛋白、内皮抑素和人纤溶酶原kringle 5结构域的融合蛋白、干扰素γ诱导的单核因子(Mig)、干扰素α可诱导蛋白质10(IP10)、Mig和IP10的融合蛋白、可溶性FLT-1(fms-样酪氨酸激酶1受体)、以及激酶插入区受体(KDR)。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述能调节凋亡的基因编码的蛋白或多肽选自：Bcl-2、Bad、Bak、Bax、Bik、Bcl-X短同功型和Gax。
10.如权利要求5所述的方法，其中所述慢病毒载体以约106到109转导颗粒剂量注射到囊后、玻璃体或视网膜下腔中。
11.一种抑制新生新血管生成和角膜移植失败的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
在活体外用含有能抑制新生血管形成的治疗性基因的慢病毒载体转导角膜组织；以及
将所述角膜组织移植到患者眼内，其中由于用所述的慢病毒载体处理导致新生血管的形成和角膜移植失败被抑制。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述治疗性基因能调节新血管生成。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述的能调节新血管生成的基因编码的蛋白质或多肽选自：金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4、内皮抑素、血管生长抑素、内皮抑素XVIII、内皮抑素XV、基质金属蛋白酶-2的C末端血红素结合蛋白结构域、人纤溶酶原的kringle 5结构域、内皮抑素和血管生长抑素的融合蛋白、内皮抑素和人纤溶酶原kringle 5结构域的融合蛋白、干扰素γ诱导的单核因子(Mig)、干扰素α可诱导蛋白质10(IP10)、Mig和IP10的融合蛋白、可溶性的FLT-1(fms-样酪氨酸激酶1受体)、以及激酶插入区受体(KDR)。
14.一种重组慢病毒载体，其特征在于，该载体包含有：
位于两个克隆位点之间的IRES(内部核糖体进入位点)元件，可使一个转录子产生两个不同的蛋白质；及
一个标记基因；和
一个治疗性基因。
15.如权利要求14所述的重组慢病毒载体，其中所述的标记基因是增强的绿色荧光蛋白基因。
16.如权利要求14所述的重组慢病毒载体，其中所述治疗性基因所调节的表型选自如下一组：肿瘤生长、新血管生成和凋亡。
17.如权利要求16所述的重组慢病毒载体，其中所述的调节肿瘤生长的治疗性基因选自：p16、p21、p27、p53和PTEN。
18.如权利要求17所述的重组慢病毒载体，其中所述慢病毒载体选自：pHR-CMV-P16-ires-eGFP、pHR-CMV-P21-ires-eGFP和pHR-EF1/HTLV-P21-ires-eGFP。
19.如权利要求16所述的重组慢病毒载体，其中所述的调节凋亡的治疗性基因选自：Bik、Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-XL和Gax。
20.如权利要求19所述的重组慢病毒载体，其中所述慢病毒载体是pHR-CMV-BIK-ires-eGFP。
21.如权利要求16所述的重组慢病毒载体，其中所述的调节新血管生成的治疗性基因编码的蛋白质或多肽选自：金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4、内皮抑素、血管生长抑素、内皮抑素XVIII、内皮抑素XV、基质金属蛋白酶-2的C末端血红素结合蛋白结构域、人纤溶酶原的kringle 5结构域、FLT-1(fms-样酪氨酸激酶1受体)、KDR(激酶插入区受体)、IP10(干扰素α可诱导蛋白质10)以及MIG(干扰素γ诱导的单核因子)。
22.如权利要求21所述的重组慢病毒载体，其中所述慢病毒载体选自：pHR-CMV-KDR-ires-eGFP、pHR-CMV-Timp1-ires-eGFP、pHR-EF1/HTLV-Ang-ires-eGFP、pHR-EF1/HTLV-Endo XV-ires-eGFP、pHR-EF1/HTLV-Kringle 1-5-ires-eGFP、pHR-EF1/HTLV-Timp1-ires-eGFP、pHR-EF1/HTLV-Timp4-ires-eGFP和pHR-EF1/HTLV-Endo XVIII-ires-eGFP。
23.如权利要求16所述的重组慢病毒载体，其中所述的调节新血管生成的治疗性基因编码的融合蛋白选自：内皮抑素和血管生长抑素的融合蛋白、内皮抑素和人纤溶酶原kringle 5结构域的融合蛋白、Mig(干扰素γ诱导的单核因子)和IP10(干扰素α可诱导蛋白质10)的融合蛋白。
24.如权利要求23所述的重组慢病毒载体，其中所述慢病毒载体选自：pHR-CMV-Endo/Ang-ires-eGFP、pHR-CMV-Endo/Kringle-ires-eGFP、pHR-EF1/HTLV-EndoAng-ires-eGFP、pHR-EF1/HTLV-EndoKringle-ires-eGFP和pHR-EF1/HTLV-MigIP10-ires-eGFP。
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