CN1319131A - 使用酪氨酸激酶src调制血管生成的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明描述了使用Src蛋白质、修饰的Src蛋白质和编码这类蛋白质的核酸在组织中调制血管生成的方法。本发明特别描述了用于使用失活的Src蛋白质或编码它们的核酸抑制血管生成或用于使用活性Src蛋白质或编码它们的核酸强化血管生成的方法。本发明还描述了基因转运系统用于提供编码Src蛋白质或其修饰形式的核酸的用途。

Description

使用酪氨酸激酶SRC调制血管 生成的方法和组合物

相关申请的参考

本申请要求1998年5月29日提交的美国临时申请顺序号60/087,220的利益，正如本文所引用的所有参考文献一样，将该文献引入作为参考。

技术领域

本发明一般涉及药物领域且特别涉及使用蛋白质酪氨酸激酶Src、Src的变体和编码它们的核酸调制组织血管生成的方法和组合物。

背景

血管生成是一种包括新发育的血管生长成组织的组织血管化的过程并且还将它称作新血管形成。该过程由内皮细胞和平滑肌细胞渗入介导。认为该过程以下列三种方式中任意一种进行：血管从预先存在的血管中生长；血管的从新发育可能是由前体细胞导致的(血管发生)；或存在的小血管可以直径扩大。参见Blood等《生物化学和生物物理学誌》(Bioch.Biophys.Acta)1032,89-118(1990)。

血管生成是新生儿生长中的重要过程，而在伤口愈合过程中和大量不同的临床疾病的发病机制中也是重要的，所述的临床疾病包括组织炎症、关节炎、肿瘤生长、糖尿病性视网膜病、由视网膜新血管形成导致的黄斑变性和类似疾病。将这些与血管生成有关的临床表现称作血管源性疾病。参见Folkman等《科学》(Science),235:442-447(1987)。一般在成年人或成熟组织中不存在血管生成，不过它确实在伤口愈合过程中和黄体生长周期中发生。参见例如Moses等《科学》(Science),248:1408-1410(1990)。

已经提出抑制血管生成是用于限制肿瘤生长的有用的疗法。已经提出通过下列方法来抑制血管生成：(1)抑制“血管源性分子”诸如bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的释放；(2)诸如通过使用抗βbFGF抗体使血管源性分子失效；(3)应用玻连蛋白受体α_vβ₃的抑制剂；和(4)抑制内皮细胞对血管源性刺激物的反应。这后一种策略已经受到关注，且Folkman等在《癌症生物学》(Cancer Biology)，3:89-96(1992)中已经描述了几种内皮细胞反应抑制剂，包括可用于抑制血管生成的胶原酶抑制剂、基膜更新抑制剂、静态血管类固醇、真菌产生的血管生成抑制剂、血小板因子4、血小板生成素、诸如D-青霉胺和硫羟苹果酸金这样的关节炎药物、维生素D₃类似物、α-干扰素等。对于另外提示的血管生成抑制剂来说，参见Blood等《生物化学和生物物理学誌》(Bioch.Biophys.Acta)1032,89-118(1990)；Moses等《科学》(Science),248:1408-1410(1990)；Ingber等《实验室研究》(Lab.Invest.)59:44-51(1988)；和美国专利5,092,885、5,112,946、5,192,744、5,202,352、5,753,230和5,766,591。在上述参考文献中所述的血管生成抑制剂中没有一种包括Src蛋白质。

为使血管生成发生，内皮细胞必须首先以肿瘤细胞发生侵害和转移瘤形成过程中所用的类似方式降解并通过血管基膜。

目前已经有报导血管生成取决于血管整联蛋白与胞外基质蛋白之间的相互作用。参见Brook等《科学》(Science),264:569-571(1994)。此外，据报导血管源性血管细胞的程序性细胞死亡(编程性细胞死亡)由这种相互作用引发，所述的相互作用由血管整联蛋白α_vβ₃的某些拮抗剂来抑制。参见Brook等《细胞》(Cell),79:1157-1164(1994)。更进一步来说，已经报导使用α_vβ₅拮抗剂可以抑制基质金属蛋白酶-2(MMP-2)与玻连蛋白受体(α_vβ₅)的结合，且由此可抑制所述蛋白酶的酶功能。参见Brook等《细胞》(Cell),85:683-693(1996)。

发明概括

本发明涉及用酪氨酸激酶Src、本文一般也称作Src，在组织中调制血管生成的方法。

本发明关注的是用于在组织中调制与疾病相关的血管生成的组合物和方法。将含有调制血管生成量的Src蛋白质的组合物给予所治疗的对调制血管生成有反应的疾病组织。提供Src蛋白质的该组合物可以含有纯化的蛋白质、蛋白质的生物活性片段、重组生产的Src蛋白质或蛋白质片段或其融合蛋白或用于表达Src蛋白质的基因/核酸表达载体。

如果Src蛋白质失活或受到抑制，那么调制过程就是抑制血管生成。如果Src蛋白质是活性的或被激活，那么调制过程就是强化血管生成。

所治疗的组织可以是需要调制血管生成的任意组织。对于血管生成抑制来说，将它用于治疗发生有害的新血管形成的患病组织。例示的组织包括炎症组织、实体肿瘤、转移瘤、发生再狭窄的组织及类似组织。

对于强化来说，其用于治疗具有局部缺血肢体的患者，其中因糖尿病或其它疾病使肢体中存在不良循环。同样可以治疗带有不愈合且由此得益于血管细胞增殖增加和新血管形成的慢性伤口的患者。

特别优选的是含有本文所述的修饰的氨基酸序列的Src蛋白质的应用。本文描述了几种特别有用修饰的Src蛋白质及其表达。

本发明还包括一种用于刺激靶哺乳动物组织中血管生成的药物组合物，它包括含有核酸的病毒或非病毒基因转移载体和药物上可接受的载体或赋形剂；所述的核酸具有编码src蛋白质的核酸片段，所述的src蛋白质在527位密码子上带有除酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸外的任意氨基酸残基。

另外关注的是一种用于抑制靶哺乳动物组织中血管生成的药物组合物，它包括含有核酸的病毒或非病毒基因转移载体和药物上可接受的载体或赋形剂；所述的核酸具有编码不具有激酶活性的src蛋白质的核酸片段。

附图的简要说明

在构成本说明书公开内容一部分的附图中：

附图1是鸡c-Src的cDNA序列，它是首先如Takeya等在《细胞》(Cell),32:881-890(1983)中所述删除内含子的全编码序列。该序列可以通过基因库登记号J00844找到。该序列含有蛋白质编码部分分别在相应的112和1713位核苷酸处开始和终止的1759个核苷酸。

附图2是附图1中所示编码序列编码的鸡c-Src的氨基酸残基序列。

附图3是首先由Braeuninger等在《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),88:10411-10415(1991)中所述的人c-Src的cDNA序列。该序列可以通过基因库登记号X59932X71157找到。该序列含有蛋白质编码部分分别在相应的134和1486位核苷酸处开始和终止的2187个核苷酸。

附图4是附图3中所示编码序列的编码的人c-Src的氨基酸残基序列。

附图5解释了如实施例4中所述由bFGF或VEGF激活内源性Src的情况。附图上部表示使用由bFGF或VEGF倍增激活内源性c-Src的体外激酶试验结果。附图的下部是用抗-Src抗体作为等含量Src和IgG上样对照品探测的激酶试验印迹。

附图6解释了如实施例4中所述的逆转录病毒介导的c-SrcA的基因表达对鸡尿囊绒膜(CAM)中血管生成的作用。使9日龄鸡CAMs与RCAS-SrcA(活性突变的c-Src)或对照品RCAS-GFP(绿色荧光蛋白；一种荧光指示剂蛋白)逆转录病毒或缓冲液接触72小时。如附图6A中所示，使用相应于用立体显微镜记录的各次处理结果的附图6B中有代表性的显微照片(4x)来对血管生成水平进行定量。

附图7解释了c-SrcA在激活血管MAP激酶磷酸化中的逆转录病毒表达。附图7A表示已经与VEGF或PMA接触30分钟或用c-SrcA逆转录病毒感染48小时的10日龄鸡CAMs的组织提取物。NT代表没有经过处理。Src免疫沉淀自等量的总蛋白质提取物并使用FAK-GST融合蛋白作为底物进行了体外免疫复合激酶试验、将其进行电泳并转到硝化纤维上。还通过使用抗-磷酸-ERK抗体进行的免疫印迹测定了等份的上述完整组织裂解物的内源性ERK磷酸化作用。附图7B表示用模拟物RCAS或含有SRCA的RCAS感染的10日龄CAMs。两天后，解剖CAMs、将其在OCT中低温储藏并切成4μm的片。将切片用抗磷酸化ERK抗体(New England Biolabs)进行免疫染色、洗涤并用山羊抗家兔FITC接合的二级抗体检测。在静态CCD照相机(PrincetonInst.)上捕捉到了荧光图象。

附图8解释了在VEGF而非bFGF-诱发的血管生成过程中对Src活性的选择性需求。使9日龄鸡CAMs与RCAS-Src251或对照品RCAS-GFP逆转录病毒或缓冲液接触20小时且然后在有或没有bFGF或VEGF存在的情况下再培养72小时。附图8A如上所述对血管生成水平进行了定量并如附图8B中所示用立体显微镜记录下了有代表性的显微照片(6x)。附图8C表示用抗-Src抗体探测的印迹以便证明与模拟物处理相比Src251在转染细胞中的表达。

附图9解释了RCAS-Src251的逆转录病毒转运至人肿瘤的结果。附图9A是表示根据光切面法检测仅在肿瘤血管(箭头)中表达GFP的RCAS-GFP(RCAS-绿色荧光蛋白)感染的人成神经管细胞瘤断片的显微照片，其中所述的光切面法使用Bio Rad激光聚焦扫描显微镜进行(光栅=500μm)。附图9B描绘了来自通过局部施用逆转录病毒而治疗的肿瘤的数据，使肿瘤在切下并测定湿重后生长3或6天。将数据表示为肿瘤重量(来自50mg肿瘤起始重量)的平均改变值+/-2次重复试验的SEM。附图9C描绘了手术取自胚胎的成神经管细胞瘤的有代表性的显微照片(光栅=350μm)。下部照片组是具体表示各肿瘤血管系统的各肿瘤的高倍放大照片(光栅=350μm)。箭头表示RCAS-Src251治疗的肿瘤中血管的破裂情况。

附图10是说明RCASBP(RGAS)载体构建体的限制酶图谱的示意图。

发明详述A．定义

氨基酸残基：多肽在其肽键化学消化(水解)时形成的氨基酸。本文所述的氨基酸残基优选是“L”异构型。然而，可以用“D”异构型残基取代任意的L-氨基酸残基，条件是所述的多肽保持所需的功能特性。NH₂指的是在多肽氨基末端上存在的游离氨基。COOH指的是在保持标准多肽名称(在《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)243:3552-59(1969)中所述并在37CFR§1.822(b)(2)中采用)的多肽羧基末端上存在的游离羧基。

应注意在本文中所有的氨基酸残基序列均由通式来代表，该通式的左和右侧取向是氨基末端至羧基末端常规的取向。此外，氨基酸残基序列的起始或终止端的虚线表示与一个或多个氨基酸残基的另外的序列结合的肽键。

多肽：指的是通过邻接氨基酸残基的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的氨基酸残基的线性排列。

肽：本文所用的这一术语指的是不超过大约50个作为多肽中彼此连接的氨基酸残基的线性排列。

环肽：指的是具有包括作为典型肽中几个酰胺键的环结构的化合物。该环肽可以是一种“从头至尾”的均键环肽；或它可以含有杂键环结构，其中所述的环由二硫桥、内酯桥、硫酯、硫代酰胺、胍基及类似键闭合。

蛋白质：指的是超过50个作为多肽中彼此连接的氨基酸残基的线性排列。

融合蛋白：指的是含有可操作地通过典型肽键连接的(“融合的”)至少两个不同多肽结构域的多肽，其中所述的两个结构域相当于自然界中没有发现融合的肽类。

合成肽：指的是不含天然存在的蛋白质及其片段的以化学方式产生的通过肽键彼此连接的氨基酸残基的链。B．一般讨论

本发明一般涉及由酪氨酸激酶Src蛋白质介导的血管生成和可以通过分别为强化或抑制血管生成提供活性或失活Src蛋白质来调制血管生成的发现。

这个发现是重要的，因为血管生成即新血管的形成在各疾病进程中起重要作用。如果与疾病相关的组织需要组织生长的血管生成，那么需要抑制血管生成且由此抑制患病组织的生长。如果受损伤的组织需要用于组织生长和愈合的血管生成，那么需要强化或促进血管生成且由此促进组织愈合和生长。

如果新血管生长是与患病组织相关的病理学原因或有助于与患病组织相关的病理情况出现，那么抑制血管生成可降低疾病的有害作用。通过抑制血管生成，可以干扰疾病、改善症状并在某些情况中治愈疾病。

得益于血管生成的抑制性调制的与疾病和新血管形成相关的组织的实例包括类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病、炎症疾病、再狭窄等。如果有害组织生长需要新血管生长的支持，那么抑制血管生成可减少对所述组织的供血量并由此使以供血量为基础的组织质量下降。实例包括肿瘤的生长，其中持续需要新血管形成以使肿瘤生长超过几毫米的厚度并形成实体转移瘤。

如果新血管生长导致组织愈合，那么强化血管生成有助于愈合。实例包括治疗肢体局部缺血的患者，其中因糖尿病或其它疾病而导致肢体中的循环不良。另外对治疗关注的是带有某些伤口的患者，这些伤口不愈合且由此可以得益于血管细胞增殖和新血管形成的增加。

本发明的方法是有效的，在一定程度上是因为该疗法对血管生成具有高度的选择性并且没有其它生物过程。

如上所述，血管生成包括涉及组织的新血管形成的许多过程，组织的新血管形成包括“发芽”、血管发生或血管增大，所有的血管生成过程均通过Src蛋白质起作用。除创伤伤口愈合、黄体形成和胚胎发生外，认为大多数血管生成过程与疾病的进程有关。因此，本治疗方法对所述疾病是选择性的并且没有有害的副作用。C．Src蛋白质

用于本发明的酪氨酸激酶Src蛋白质可以随应用的不同而改变。术语“Src蛋白质”或“Src”用以指本文所述的活性或失活形式的各种形式的酪氨酸激酶Src蛋白质。

“活性Src蛋白质”指的是强化血管生成的各种形式的src蛋白质。测定血管生成的强化程度的试验如本文所述但不起限定作用。如果血管生成的水平高于试验系统中未添加src的对照水平至少10％、优选25％且更优选50％，那么认为蛋白质是有活性的。用于测定强化程度的优选试验是使用实施例中所述RCAS病毒载体的CAM试验，其中生血管指数通过统计分支点来计算。优选的活性Src蛋白质也表现出酪氨酸激酶活性。例示的活性Src蛋白质在实施例中描述并包括Src-A。

“失活Src蛋白质”指的是抑制血管生成的各种形式的Src蛋白质。测定血管生成的抑制程度的试验如本文所述但不起限定作用。如果血管生成的水平低于试验系统中未添加外源性Src的对照水平至少10％、优选25％且更优选50％，那么认为蛋白质是失活的。用于测定抑制程度的优选试验是使用实施例中所述RCAS病毒载体的CAM试验，其中生血管指数通过统计分支点来计算。优选的失活Src蛋白质也表现出降低的酪氨酸激酶活性。例示的失活Src蛋白质在实施例中描述并包括Src-251。

可以用任意的各种方法来生产用于本发明的Src蛋白质，包括从包括组织在内的天然来源中的分离法、通过重组DNA表达和纯化的生产法等。通过将基因疗法系统引入所关注的组织且然后在该组织中表达所述的蛋白质也可以在“原位”产生Src蛋白质。

通过本领域中各种公知的方法可以制备编码Src蛋白质的基因且本发明不以这方面起限定作用。例如，众所周知Src的自然史包括来自哺乳动物、鸟类、病毒等物种的同系物，而使用来自表达该蛋白质的任意组织的cDNA克隆法可以方便地克隆其基因。用于本发明的优选Src是细胞蛋白质诸如命名为c-Src的哺乳动物或鸟类同系物。特别优选的是人c-Src。D．重组DNA分子和用于表达Src蛋白质的表达系统

本发明描述了特别用于本发明的几种核苷酸序列。这些序列包括编码用于本发明的Src蛋白质的序列、以及各种DNA片段、重组DNA(rDNA)分子和为表达Src蛋白质所构建的载体。

本发明的DNA分子(片段)由此可以含有编码完整结构基因的序列、结构基因片段和如本文进一步所述的转录单位。

优选的DNA片段是编码本文所述的Src蛋白质或其生物活性片段的核苷酸序列。

优选的c-Src的氨基酸残基序列和核苷酸序列在实施例中描述。

优选的DNA片段编码与相应于本文所述的Src蛋白质的氨基酸残基序列或其部分基本相同且优选主要由它们组成的氨基酸残基序列。有代表性的和优选的DNA片段在实施例中进一步描述。

蛋白质或多肽的氨基酸残基序列通过遗传密码直接与编码所述蛋白质的结构基因的脱氧核酸(DNA)序列相关。因此，可以根据氨基酸残基序列即其所编码的蛋白质或多肽的氨基酸残基序列来定义结构基因或DNA片段。

所述遗传密码的重要和众所周知的特征在于其丰余性。这就是说，对于用于制备蛋白质的大多数氨基酸，一种以上的编码核苷酸三联体(密码子)可以编码或指定特定的氨基酸残基。因此，大量不同的核苷酸序列可以编码一个特定的氨基酸残基序列。将这类核苷酸序列在功能上看作是等价的，因为它们可以导致在所有生物体中产生相同的氨基酸残基序列。有时，可以将嘌呤或嘧啶的甲基化变体引入给定的核苷酸序列。然而，这类甲基化不会影响任何形式的编码关系。

核酸是任意的多核苷酸或核酸片段，它可以是多脱氧核糖核苷酸或多核糖核苷酸即RNA或DNA或其类似物。在优选的实施方案中，核酸分子是双链体DNA片段即DNA片段的形式，不过，对于某些分子生物学方法来说，优选单链DNA或RNA。

通过大量方法包括化学合成法和重组手段、优选通过克隆或通过聚合酶链反应(PCR)来生产DNA片段。通过化学技术例如Matteucci等在《美国化学协会杂志》(J.Am.Chem.Soc.),103:3185-3191,1981中所述的磷酸三酯法或使用自动合成法可以方便地合成编码Src蛋白质部分的DNA片段。此外，通过众所周知的方法诸如合成一组定义DNA片段的寡核苷酸、随后杂交并连接寡核苷酸构建完整片段的方法可以方便地制备较长的DNA片段。另一种方法包括通过使用一对寡核苷酸引物进行PCR来分离优选的DNA片段的步骤，所述的寡核苷酸引物用在认为含有编码Src蛋白质的成分的cDNA文库上。

当然，通过化学合成，可以经用合适的碱基置换那些编码天然氨基酸残基序列的碱基而简便地进行任何所需的修饰。这种方法是众所周知的且可以将该方法方便地用于生产本文所述的各种不同的“修饰的”Src蛋白质。

此外，随后可以诸如通过定向诱变或随机诱变来修饰主要由编码Src蛋白质的结构基因组成的DNA片段以便引入任何所需的置换。1．克隆Src基因

可以通过各种生物化学方法从合适来源的基因组DNA或信使RNA(mRNA)中克隆Src基因。按照实施例中所述和作为本领域中公知的一般方法可以进行这些基因的克隆。

用于克隆适用于本发明方法的8rc基因的核酸的来源可以包括cDNA文库形式的基因组DNA或信使RNA(mRNA)，它们来自认为表达这些蛋白质的组织。优选的组织是人肺组织，不过可以使用任何其它合适的组织。

优选的克隆方法包括使用标准方法制备cDNA文库和通过使用以本文所述核苷酸序列为基础的配对寡核苷酸引物进行的PCR扩增来分离编码Src的核苷酸序列的步骤。另一方面，可以鉴定所需的cDNA克隆并通过常规的核酸杂交法、使用以本文所述核酸序列为基础的杂交探针而从cDNA或基因组文库中分离它们。分离和克隆编码核酸的src的其它方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。2．表达载体

如本文所述可以生产含有编码Src蛋白质的DNA片段的重组DNA分子(rDNA)。特别地，通过将载体可操作地(符合读框的，可表达地)与编码src的DNA片段连接可以生产可表达的rDNA。因此，重组DNA分子是一种含有至少两种通常自然界中不在一起的核苷酸序列的核酸的杂交DNA分子。

正如本领域众所周知的，对可操作地连接DNA片段的载体的选择直接取决于所需的功能特性、例如蛋白质的表达和所转化的宿主细胞。适用于实施本发明的载体是至少能够引导复制且还优选表达包括在可操作地与之连接的载体DNA片段中的结构基因。

原核和真核表达载体是载体构建领域技术人员熟知的并且由Ausebel等在《分子生物学最新方案》(Current Protocols inMolecular Biology),Wiley和Sons,New York(1993)和由Sambrook等在《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)。冷泉巷实验室(1989)中描述。这些参考文献中还描述了本文参照的许多一般重组DNA方法。

在一个实施方案中，合适的载体包括原核复制子，即具有直接自主复制和在原核宿主细胞、诸如以此转化的细菌宿主细胞内染色体外维持所述重组DNA分子的能力的DNA序列。这类复制子在本领域中是众所周知的。此外，那些包括原核复制子的实施方案还包括基因表达使抗药性转递给以此转化的细菌宿主的基因。典型的细菌抗药剂基因是对氨苄西林或四环素产生抗性的那些基因。

那些包括原核生物复制子的载体还可以包括能够指导结构基因在以此转化的细菌宿主细胞诸如大肠杆菌中的表达(转录和翻译)的原核生物启动子。启动子是由允许结合RNA聚合酶并发生翻译的DNA序列形成的表达控制元件。一般在含有用于插入本发明DNA片段的便利限制位点的质粒载体中载有与细菌宿主相容的启动子序列。典型的这类质粒载体是：商购自Biorad Laboratories,(Richmond,CA)的pUC8、pUC9、pBR322和pBR329；商购自Invitrogen(San Diego,CA)的pRSET以及商购自Pharmacia,Piscataway,N.J.的pPL和pKK223。

还可以将与真核细胞相容、优选那些与脊椎动物细胞相容的表达载体用于形成本发明的重组DNA分子。真核细胞表达载体在本领域中是众所周知的且它们可以从几种商业来源得到。一般来说，提供这类含有便利限制位点的载体是用于插入所需的DNA片段。典型的这类载体是pSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1/pML2d(InternatinonalBiotechnologies,Inc.)、pTDT1(ATCC,#31255)、pRc/CMV(Invitrogen,Inc.)、实施例中所述的优选载体以及类似的真核生物表达载体。

本发明上下文中用于基因表达的特别优选的系统包括基因转运成分，即有将基因转运至所关注组织的能力的成分。合适的载体是基因工程改造成表达所需蛋白质并具有感染预选择靶组织的特征的“感染性”载体诸如重组DNA病毒、腺病毒或逆转录病毒载体。特别优选的是本文所述的复制感受态禽类肉瘤病毒(RCAS)。

可以基因工程改造应用重组病毒或病毒元件指导表达的哺乳动物细胞系。例如，当使用腺病毒表达载体时，可以将多肽的编码序列与腺病毒转录/翻译控制复合物例如晚期启动子和三联前导序列连接。然后可以通过体外或体内重组将这种嵌合基因插入腺病毒基因组。插入病毒基因组的非必需区(例如E1或E3区)会导致重组病毒有存活力并能够表达感染宿主中的多肽(例如，参见Logan等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),81:3655-3659(1984))。另一方面，可以使用牛痘病毒7.5K启动子(例如，参见Mackett等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),79:7415-7419(1982)；Mackett等《病毒学杂志》(J.Virol.),49:857-864(1984)；Panicali等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),79:4927-4931(1982))。特别关注的是以牛乳头瘤病毒为基础的载体，它们具有作为染色体外元件复制的能力(Sarver等《细胞分子生物学》(Mol.Cell.Biol.),1:486(1981))。在这种DNA进入靶细胞后不久，质粒复制成约100-200个拷贝/细胞。插入的cDNA的转录不需将所述质粒整合入宿主染色体，由此产生高水平的表达。可以通过使所述质粒中包含选择性标记诸如新基因而将这些载体用于稳定的表达。另一方面，可以修饰逆转录病毒基因组以便用作能够引入并指导编码多肽的核苷酸序列在宿主细胞中表达的载体(Cone等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),81:6349-6353(1984))。也可以使用包括但不限于金属硫蛋白(metallothionine)IIA启动子和热激启动子在内的诱导型启动子来实现高水平的表达。

目前，已经研究了巨细胞病毒(CMV)启动子与劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子驱动的胸苷激酶(TK)基因疗法对具有人卵巢癌的无胸腺小鼠产生的长期存活率。发现腺病毒介导的CMV启动子驱动的单纯疱疹病毒TK基因疗法的杀细胞功效的有效性超过RSV驱动的疗法2-10倍。(Tong等，1999《杂交瘤》(Hybridoma)18(1):93-97)。还描述了用于实施要求低水平表达、随后是诱导型高水平表达的基因疗法的嵌合启动子的设计。(Suzuki等，1996《人体基因疗法》(HumanGene Therapy)7:1883-1893)。

为了长期高产率地生产重组蛋白质，优选稳定的表达。不使用含有病毒复制起点的表达载体，可以用由合适的表达控制元件(例如启动子和增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)所控制的cDNA和选择性标记转化宿主细胞。如上所述，重组质粒中的选择性标记可赋予选择抗性并使细胞稳定地将所述质粒整合入其染色体并生长至形成可以依次克隆并扩展入细胞系中的病灶。

例如，在引入外源DNA后，可以使工程细胞在富集的培养基中生长1-2天，且然后将它们转换到选择性培养基中。可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹胸苷激酶(Wigler等《细胞》(Cell),11:223(1977))、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),48:2026(1962))和腺嘌呤转磷酸核糖基酶(Lowy等《细胞》(Cell),22:817(1980))基因，可以将它们分别用于tk^-、hgprt^-或aprt^-细胞。此外，可以将提供抗代谢物抗性的基因用作选择的基础；例如使氨甲蝶呤产生抗性的dhfr(Wigler等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),77:3567(1980)；O’Hare等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),78:1527(1981))、使霉酚酸产生抗性的gpt(Mulligan等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),78:2072(1981))、使氨基糖苷G-418产生抗性的neo(Colberre-Garapin等《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol),150:1(1981))和使潮霉素产生抗性hygro(Santerre等《基因》(Gene),30:147(1984))的基因。近来，已经描述了另外的选择性基因，即可使细胞应用吲哚来取代色氨酸的trpB、使细胞应用组氨醇(histinol)取代组氨酸的hisD(Harman等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),85:804(1988))和使鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸DFMO产生抗性的ODC(鸟氨酸脱羧酶)(McConlogue L.在《分子生物学最新通讯》(Current Communications in Molecular Biology)，冷泉巷实验室编辑(1987))。

为人基因疗法所关注的主要载体来源于逆转录病毒(Wilson,1997《免疫学临床实验》(Clin.Exp.Immunol.),107(增刊1)：31-32；Bank等，1996《生物试验》(Bioessays)18(12):999-1007；Robbins等，1998《药学疗法》(Pharmacol.Ther.)80(1):35-47)。基因转移和反义疗法的治疗潜能已经刺激了用于治疗各种组织的许多载体系统的开发。(血管系统：参见Stephan等，1997《临床药学基础》(Fundam.Clin.Pharmacol.)11(2):97-110；Feldman等，1997《心血管研究》(Cardiovasc.Res.)35(3):391-404；Vassalli等，1997《心血管研究》(Cardiovasc.Res.)35(3):459-69；Baek等，1998《循环研究》(Circ.Res.)82(3):295-305；肾脏：参见Lien等，1997《国际肾脏增刊》(Kidney Int.Suppl.)61:S85-8；肝脏：参见Ferry等，1998《人体基因疗法》(Hum.GeneTher.)9(14):1975-81；肌肉，参见Marshall等，1998《遗传学发展最新观点》(Curr.Opn.Genet.Dev.)8(3):360-5)。除这些组织外，用于人体基因疗法的关键靶物还有癌，即肿瘤自身或相关组织。(Runnebaum,1997《抗癌研究》(Anticancer Res.)17(4B):2887-90；Spear等，1998《神经病毒学》(J.Neurovirol.)4(2):133-47)。

下面简要地描述了易适用于本发明方法的病毒基因疗法载体系统的具体实例。目前Federspiel和Hughes已经综述了逆转录病毒的基因转运(1998，《细胞生物学方法》(Methods in Cell Biol.)52:179-214)，他们特别描述了禽类白血病病毒(ALV)逆转录病毒族(Federspiel等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93:4931(1996)；Federspiel等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),91:11241(1994))。包括ALV和鼠白血病病毒(MLV)在内的逆转录病毒载体由Svoboda进一步描述(1998，《基因》(Gene)206:153-163)。

修饰的逆转录病毒/腺病毒表达系统可以方便地适用于实施本发明的方法。例如，Karavanas等在《肿瘤学/血液学边缘研究》(Crit.Rev.in Oncology/Hematology)28:7-30中综述了鼠白血病病毒(MLV)系统。Von Seggern和Nemerow在《基因表达系统》(GeneExpression Systems)(Fernandez&Hoeffler编辑，Academic Press,San Diego,CA,1999，第5章第112-157页)中综述了腺病毒表达系统。

已经证实蛋白质表达系统在体内和体外均具有有效的作用。例如，已经描述了由单纯疱疹1型病毒(HSV)扩增子载体进行的至人鳞状细胞癌的有效基因转运。(Carew等，1998《美国外科学杂志》(Am.J.Surg.)176:404-408)。已经将单纯疱疹病毒用于至神经系统的基因转运。(Goins等，1997，《神经病毒学》(J.Neurovirol.)3(增刊1):S80-8)。已经在实体肿瘤上检测了使用HSV-TK的靶向自杀载体。(Smiley等，1997《人体基因疗法》(Hum.Gene Ther.)8(8):965-77)。已经将单纯疱疹1型病毒载体用于对结肠癌细胞的癌症基因疗法。(Yoon等，1998《外科学年鉴》(Ann.Surg.)228(3):366-74)。已经开发了杂交载体用于延长转染时间长度，包括用于治疗肝细胞的HSV/AAV(与腺相关的病毒)杂种。(Fraefel等，1997《分子药物》(Mol.Med.)3(12):813-825)。

痘苗病毒因其基因组较大而已经被开发用于人体基因疗法。(Peplinski等《美国肿瘤外科学临床标准》(Surg.Oncol.Clin.N.Am.)7(3):575-88)。已经描述将表达嘌呤核苷焦磷酸酶的胸苷激酶缺失的痘苗病毒用作肿瘤定向基因疗法的载体。(Puhlman等，1999《人体基因疗法》(Human Gene Therapy)10:649-657)。

已经描述将与腺相关的2型病毒(AAV)用于人体基因疗法，然而，AAV需要辅助病毒(诸如腺病毒或疱疹病毒)用于在哺乳动物细胞内的最佳复制和包装。(Snoeck等，1997《肾脏学实验》(Exp.Nephrol.)5(6):514-20；Rabinowitz等，1998《生物技术最新观点》(Curr.Opn.Biotechnol.)9(5):470-5)。不过，已经描述了在体外包装感染重组AAV，使得该系统极有价值。(Ding等，1997《基因疗法》(Gene Therapy)4:1167-1172)。已经证实亲环境的逆转录病毒受体cDNA的AAV介导的转移使得确定和主要的人体细胞发生亲环境的逆转录病毒转导。(Qing等，1997《病毒学杂志》(J.Virology)71(7):5663-5667)。已经论证了使用表达人野生型p53的AAV载体的癌症基因疗法。(Qazilbash等，1997《基因疗法》(Gene Therapy)4:675-682)。还证实了使用AAV载体将基因转入血管细胞的方法。(Maeda等，1997《心血管研究》(Cardiovasc.Res.)35(3):514-521)。已经证实AAV可用作肝脏定向基因疗法的合适的载体。(Xiao等，1998《病毒学杂志》(J.Virol.)72(12):10222-6)。已经证实AAV载体可用于大脑组织和中枢神经系统的基因疗法。(Chamberlin等，1998《大脑研究》(Brain Res.)793:(1-2):169-75；During等，1998《基因疗法》(Gene Therapy)5(6):820-7)。还将AAV载体与腺病毒载体(AdV)比较了它们的肺部基因疗法和至人囊性纤维化上皮细胞的转移。(Teramoto等，1998《病毒学杂志》(J.Virol.)72(11):8904-12)。

嵌合型AdV/逆转录病毒基因疗法载体系统可引入有用量的各病毒以便生成非整合型AdV，使它通过逆转录病毒生产者细胞的中间体生成而在功能上成为整合型的。(Feng等，1997《国际生物技术》(Nat.Biotechnology)15(9):866-70；Bilbao等，1997《FASEB杂志》(FASEB J)11(8):624-34)。已经将这种新产生的有功效的基因疗法载体用于靶向的癌症基因疗法。(Bibao等，1998《实验药物生物学进展》(Adv.Exp.Med.Biol.)451:365-74)。单一注射表达p53的AdV抑制人前列腺癌细胞皮下肿瘤结节的生长。(Asgari等，1997《国际癌症杂志》(Int.J.Cancer)71(3):377-82)。已经描述了患晚期非小型细胞肺癌患者野生型p53的AdV介导的基因转移。(Schuler等，1998《人体基因疗法》(Human Gene Therapy)9:2075-2082)。这种相同的癌症已经成为由AdV载体介导的p53基因替代疗法的治疗对象。(Roth等，1998《肿瘤学研讨》(Semin.Oncol.)25(3增刊8):33-7)。AdV介导的p53的基因转移可在体内抑制内皮细胞分化和血管生成。(Riccioni等，1998《基因疗法》(Gene Ther.)5(6):747-54)。还描述了黑素瘤抗原gp75的腺病毒介导的表达作为转移黑素瘤的免疫疗法。(Hirschowitz等，1998《基因疗法》(Gene Therapy)5:975-983)。AdV有助于用亲环境的逆转录病毒感染人体细胞并提高逆转录病毒感染的功效。(Scott-Taylor等，1998《基因疗法》(Gene Ther.)5(5):621-9)。已经将AdV载体用于至血管平滑肌细胞(Li等，1997《中国药学杂志(英文版)》(Chin.Med.J.(Engl))110(12):950-4)、鳞状细胞癌细胞(Goebel等，1998《耳鼻咽喉科头颈部外科学》(Otolarynol Head Neck Surg)119(4):331-6)、食管癌细胞(Senmaru等，1998《国际癌症杂志》(Int.J.Cancer)78(3):366-71)、肾小球系膜细胞(Nahman等，1998《药物研究杂志》(J.Investig.Med.)46(5):204-9)、神经胶质细胞(Chen等，1998《癌症研究》(Cancer Res.)58(16):3504-7)的基因转移和至动物关节的基因转移(Ikeda等，1998《风湿病学杂志》(J.Rheumatol.)25(9):1666-73)。最近，已经论证了由AcV载体介导的以导管为基础的心包基因转移。(March等，1999《临床心脏病学》(Clin.Cardiol.)22(1增刊1):I23-9)。用适当控制的遗传元件操作AdV系统要求在体内进行AdV介导的可调节的靶基因表达。(Burcin等，1999PNAS(USA)96(2):355-60)。

已经使用适合于用适用于新培斯(sindbis)病毒和SemlikiForest病毒衍生的载体的表达盒转化的包装细胞系开发了甲病毒属载体用于实施人体基因疗法。(Polo等，1999《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),96:4598-4603)。还开发了以非细胞病变黄病毒复制子RNA为基础的系统。(Varnavski等，1999《病毒学》(Virology)255(2):366-75)。已经将含有新培斯病毒载体的自杀HSV-TK基因用于定向进入肿瘤细胞的细胞特异性寻靶。(Iijima等，1998《国际癌症杂志》(Int.J.Cancer)80(1):110-8)。

以人泡沫(foamy)病毒(HFV)为基础的逆转录病毒载体也显示出作为基因疗法载体的前景。(Trobridge等，1998《人体基因疗法》(Human Gene Therapy)9:2517-2525)。已经将泡沫病毒载体设计成用于自杀基因疗法。(Nestler等，1997《基因疗法》(GeneTher.)4(11):1270-7)。还将重组鼠巨细胞病毒和启动子系统用作高水平表达的载体。(Manning等，1998《病毒学方法杂志》(J.Viro1.Meth.)73(1):31-9；Tong等，1998《杂交瘤》(Hybridoma)18(1):93-7)。

通过生产以仙台病毒为基础的载体将基因转运入未分裂细胞是可行的。(Nakanishi等，1998《控释杂志》(J.Controlled Release)54(1):61-8)。

在为可能转化未分裂体细胞进行的其它努力中，已经研究了慢病毒载体。已经描述了使用以复制缺陷的人免疫缺陷病毒(HIV)为基础的载体进行的囊性纤维化基因疗法。(Goldman等，1997《人体基因疗法》(Human Gene Therapy)8:2261-2268)。还论证了通过慢病毒载体转运入肝脏和肌肉的基因的持续表达。(Kafri等，1997《国际遗传学》(Nat.Genet.)17(3):314-7)。不过，对安全性的关注是主要的且对改进载体的开发也在迅速进行中。(Kim等，1998《病毒学杂志》(J.Virol.)72(2):994-1004)。HIV LTR和Tat检验产生了有关开发载体基因组的结构的重要信息。(Sadaie等，1998《药物病毒学杂志》(J.Med.Virol.)54(2):118-28)。因此，目前对以有效HIV为基础的载体的遗传需求得到了更好的理解。(Gasmi等，1999《病毒学杂志》(J.Virol.)73(3):1828-34)。已经描述了自失活载体或条件包装细胞系。(例如，Zuffery等，1998《病毒学杂志》(J.Virol.)72(12):9873-80；Miyoshi等，1998《病毒学杂志》(J.Virol.)72(10):8150-7；Dull等，1998《病毒学杂志》(J.Virol.)72(11):8463-71；和Kaul等，1998《病毒学》(Virology)249(1):167-74)。已经证实了由HIV载体对人淋巴细胞和CD34+细胞的有效转导。(Douglas等，1999《人体基因疗法》(Human Gene Ther.)10(6):935-45；Miyoshi等，1999《科学》(Science)283(5402)；682-6)。已经证实了由猫免疫缺陷病毒(FIV)慢病毒载体对未分裂人细胞的有效转导，这种转导可将使用以HIV为基础的载体所涉及到的安全性问题降到最低限度。(Poeschla等，1998《天然药物》(Nature Medicine)4(3):354-357)。已经论证了人血单核细胞通过FIV载体的生产性感染。(Johnston等，1999《病毒学杂志》(J.Virol.)73(3):2491-8)。

尽管许多病毒载体难以控制且所插入的DNA的能力受到限制，但是已经研究了这些限制和缺陷。例如，除简易病毒包装细胞系外，还开发了来源于人疱疹病毒、单纯疱疹1型病毒(HSV-1)和EB病毒(EBV)的微小病毒载体以便简化遗传物质的操作和病毒载体的生产。(Wang等，1996《病毒学杂志》(J.Virology)70(12):8422-8430)。已经预先证明了连接质粒可简化外源DNA插入不依赖于辅助病毒的逆转录病毒载体的过程。(1987，《病毒学杂志》(J.Virology)61(10):3004-3012)。

尽管还描述了几种非病毒载体，但是病毒载体并不是实施基因疗法的唯一工具。已经证实以应用表皮生长因子/DNA polyplex(EGF/DNA)为基础的靶向的非病毒基因转运载体可产生有效的和特异性的基因转运。(Cristiano,1998《抗癌研究》(Anticancer Res.)18:3241-3246)。已经使用阳离子型脂质体论证了血管系统和CNS的基因疗法。(Yang等，1997《神经外伤杂志》(J.Neurotrauma)14(5):281-97)。还使用阳离子型脂质体完成了胰腺炎的瞬时基因疗法。(Denham等，1998《外科学年鉴》(Ann.Surg.)227(6):812-20)。已经证实用于基因转运的以脱乙酰壳多糖为基础的载体/DNA复合物是有效的。(Erbacher等，1998《药物研究》(Pharm.Res.)15(9):1332-9)。已经描述了以terplex系统为基础的非病毒DNA转运载体。(Kim等，1998,53(1-3):175-82)。还将病毒颗粒包被的脂质体复合物用于实现基因转移。(Hirai等，1997《生物化学和生物物理学研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)241(1):112-8)。

已经论证了使用直接给肿瘤注射编码胸苷激酶基因的非病毒T7载体的癌症基因疗法。(Chen等，1998《人体基因疗法》(Human GeneTherapy)9:729-736)。质粒DNA的制备对直接注射的基因转移来说是重要的。(Horn等，1995《人体基因疗法》(Hum.Gene Ther.)6(5):656-73)。特别采用修饰的质粒载体用于直接注射。(Hartikka等，1996《人体基因疗法》(Hum.Gene Ther.)7(10):1205-17)。

因此，各种基因转移/基因疗法载体和构建体在本领域中是公知的。可以将这些载体便利地用于本发明的方法。通过合适的操作、使用用于将可操作连接的src(活性或失活的)插入所选择的表达/转运载体的重组DNA/分子生物学技术，可以生产用于实施本发明的许多等价载体。E．用于调制血管生成的方法

本发明提供了一种用于调制组织中与疾病进程或疾病状况相关的血管生成且由此对依赖于血管生成的组织中的情况起作用的方法。一般来说，该方法包括对与疾病进程或疾病状况相关的组织给予一种组合物的步骤，所述的组合物含有调制血管生成量的Src蛋白质或表达活性或失活Src的核酸载体。

正如本文所述，任意的不同组织或由器官化组织构成的器官可以维持包括皮肤、肌肉、肠、结缔组织、关节、骨等组织疾病中的血管生成，在这些组织中血管可以在生血管刺激时侵入。

理想的情况是按照本发明在其很多实施方案中治疗的患者是人患者，不过可以理解的是本发明的机理表明本发明对于所有哺乳动物均是有效的，所以术语“患者”的含义是包括所有的哺乳动物。在本发明的上下文中，将哺乳动物理解为包括需要对与涉及血管生成的疾病相关的组织进行治疗的任何哺乳动物种类，特别是农业用和家养哺乳动物种类。

因此，该方法包括对患者给予治疗有效量的药理上可接受的组合物的步骤，所述的组合物含有Src蛋白质或用于在实施本发明方法中表达Src蛋白质的DNA载体。

正如本文进一步所述的，Src蛋白质的给药剂量范围取决于蛋白质的形式及其功效。该剂量大到足以产生所需的血管生成和由血管生成介导的疾病症状得到改善的作用。然而，该剂量不应大到导致不良的副作用，诸如高粘滞性综合征、肺水肿、充血性心衰等。一般来说，所述的剂量随患者的年龄、疾病情况、患者的性别以及患者体内疾病的发展程度而改变并且可以方便地由本领域技术人员来确定。还可以由各临床医师根据所有并发症情况调整所述的剂量。

治疗有效量是足以在受治疗的组织中产生可检测到的血管生成调制作用的Src蛋白质或编码(活性或失活的)src蛋白质的核酸的用量，即调制血管生成的量。可以通过如本文所述的CAM检测试验或通过本领域技术人员所公知的其它方法来测定对血管生成的调制作用。

通过注射或通过在一段时间内连续输注可以非肠道给予Src蛋白质或表达Src蛋白质的核酸载体。尽管一般可以通过全身给药而在体内接触要治疗的组织，因此最常见的情况是通过静脉内给予治疗组合物来治疗它们，但是其它组织和转运方式也是所关注的。因此，可以通过静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、经皮来给予并可以通过蠕动方式来送递本发明的组合物。

常规下可以通过静脉内给予诸如例如通过注射单位剂量来给予含有Src蛋白质或表达Src蛋白质的核酸载体的治疗组合物。术语“单位剂量”在指本发明的治疗组合物使用时指的是适合作为用于治疗对象单位剂量的物理分散单位，各单位含有预定量的计算为产生所需治疗作用的活性物质以及所需稀释剂即载体或赋形剂。

在一个优选的实施方案中，按照单一剂量方式通过静脉内给予所述试剂。通过下列步骤可以完成局部给药：直接注射或通过利用解剖分离隔室、分离靶器官系统的微循环、循环系统中再灌注或与患病组织相关的血管系统靶区的以导管为基础的暂时闭合。

按照与剂型匹配的方式和以治疗有效量给予所述的组合物。所给予的量和计时取决于所治疗的治疗对象、利用活性组分的治疗对象系统的容量和所需治疗作用的程度。需要给予的活性组分的精确用量取决于医师的判断且对每一个个体来说均是特定的。然而，用于全身施用的合适剂量范围在本文中公开并且取决于给药途径。合适的给药方案也是可变的，不过一般是初次给药之后通过接下来的注射或其它给药方式在1小时或1小时以上的间隔给予重复剂量。另一方面，所关注的是足以维持体内疗法特定范围内血药浓度的连续静脉输注方式。

1．血管生成的抑制

血管生成的抑制在各种称作生血管疾病的疾病中是重要的。这类疾病包括但不限于：炎症疾病，诸如免疫或非免疫炎症；慢性关节风湿病和银屑病；与不适当或不适宜的血管侵害相关的疾病，诸如糖尿病性视网膜病、新血管形成性青光眼、再狭窄、动脉粥样硬化斑中的毛细管增生和骨质疏松；以及与癌症相关的疾病，诸如需要新血管形成以维持肿瘤生长的实体肿瘤、实体转移瘤、血管纤维瘤、晶体状后纤维组织形成、血管瘤、卡波西肉瘤等癌症。

因此，抑制组织中与疾病相关的血管生成的方法可改善所述疾病的症状，并且可以治愈疾病，这取决于疾病状况。在一个实施方案中，本发明关注组织中本身与疾病状况相关的血管生成的抑制。通过不同的方法可以评估组织中血管生成的程度和由此由本方法实现的抑制程度。

因此，在一个相关的实施方案中，所治疗的组织是炎症组织且所抑制的血管生成是其中存在炎症组织新血管形成的炎症组织的血管生成。在这类情况中，本方法关注关节炎组织(诸如在患有慢性关节风湿病的患者体内)、免疫或非免疫炎症组织中、银屑病组织等中的血管生成的抑制。

在另一个相关的实施方案中，所治疗的组织是患有诸如糖尿病性视网膜病、黄斑变性或新血管性青光眼这样的视网膜疾病患者的视网膜组织且所抑制的血管生成是其中存在视网膜组织新血管形成的视网膜组织的血管生成。

在另一个相关的实施方案中，所治疗的组织是患有实体肿瘤、转移瘤、皮肤癌、乳腺癌、血管瘤或血管纤维瘤和类似癌症的患者的肿瘤组织且所抑制的血管生成是其中存在肿瘤组织新血管形成的肿瘤组织的血管生成。可以由本发明方法治疗的典型实体肿瘤组织包括肺、胰、乳腺、结肠、喉、卵巢和类似组织。抑制肿瘤组织血管生成是一个特别优选的实施方案，因为新血管形成在肿瘤生长中起重要作用。在没有肿瘤组织新血管生成的情况下，所述的肿瘤组织不会获得所需的营养物、生长减慢、另外出现生长停止、退化并最终发生使肿瘤死亡的坏死。

换句话说，本发明提供了一种通过按照本方法抑制肿瘤血管生成来抑制肿瘤新血管形成的方法。类似地，本发明提供了一种通过实施抑制血管生成的方法来抑制肿瘤生长的方法。

本方法还对抗转移瘤的形成特别有效，因为(1)转移瘤的形成需要原始肿瘤的血管形成以便转移的癌细胞可以离开原始肿瘤和(2)它们在次级部位中的建立需要新血管形成以便维持转移瘤的生长。

在一个相关的实施方案中，本发明关注本方法与其它疗法诸如常用的直接对实体肿瘤和用于控制转移瘤建立的化疗结合的实施。一般在化疗过程中或之后进行血管生成抑制剂的给药，不过，优选在肿瘤组织对通过诱发经对所述的肿瘤组织供血和营养物而恢复血管生成而对毒性侵害起反应时进行的化疗方案后抑制血管生成。此外，优选在已经将实体肿瘤作为预防转移瘤而切除的外科手术后施用血管生成抑制方法。

既然本方法用于抑制肿瘤的新血管形成，那么该方法也可以用于抑制肿瘤组织生长、抑制转移瘤形成并使建立的肿瘤退化。

再狭窄是平滑肌细胞(SMC)迁移和增殖入阻碍血管成形术成功的经皮跨腔冠状血管成形术部位处的组织的过程。可以将这种再狭窄过程中SMC’s的迁移和增殖看作由本方法抑制的血管生成过程。因此，本发明还关注通过按照本方法抑制血管成形术后患者血管生成来抑制再狭窄的方法。为了抑制再狭窄，一般在血管成形术后给予失活的酪氨酸激酶，因为冠脉壁受到再狭窄的危害，给药持续约2天至约28天，且更常见的情况是在该手术后的约前14天给药。

用于在组织中抑制与疾病状况相关的血管生成且由此还用于实施涉及血管生成的疾病的治疗方法的本方法包括使发生血管生成或有发生血管生成危险的组织与一种组合物接触的步骤，所述的组合物含有治疗有效量的失活的Src蛋白质或表达该蛋白质的载体。

在与治疗组合物开始接触后的前7天发生血管生成的抑制和肿瘤退化。与失活的Src蛋白质的附加或延长接触优选进行7天至6周，优选约14天至28天。

2．血管生成的强化

在需要促进或强化血管生成的情况中，对组织给予活性Src蛋白质是有用的。给药的途径和计时可与上文所述用于抑制的方法相类似。

F．治疗组合物

本发明关注用于实施本文所述治疗方法的治疗组合物。本发明的治疗组合物含有药理上耐受的载体与溶于或分散于其中作为活性组分的Src蛋白质或能够表达如本文所述Src蛋白质的载体。在一个优选的实施方案中，当为达到治疗目的而对哺乳动物或人患者给药时，所述的治疗组合物不是免疫原性的。

本文所用的术语“药物上可接受的”、“药理上耐受的”及其语法上的变化形式在它们指的是组合物、载体、稀释剂和试剂时可以互换使用并代表能够给予或对哺乳动物给药而不会产生诸如恶心、头晕、胃肠不适等不期望的药理作用的物质。

含有溶于或分散于其中的活性组分的药物组合物制剂在本领域中是众所周知的并且不基于制剂来限定。一般将这类组合物制备成注射用液体溶液或混悬液，不过，也可以制备适合于在应用前制成溶液或混悬液这样液体形式的固体剂型。还可以将制剂乳化或制成脂质体组合物。

可以将活性组分与药物上可接受和可与所述活性组分相容的赋形剂以适用于本文所述治疗方法的用量混合。例如，合适的赋形剂是水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其混合物。此外，如果需要，所述的组合物可以含有少量提高所述活性组分有效性的辅助物质诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等。

本发明的治疗组合物可以在其中包括任意成盐成分的药物上可接受的盐。药物上可接受的盐包括与诸如例如盐酸或磷酸这样的无机酸或诸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等这样的有机酸形成的酸加成的盐(与多肽的游离氨基形成)。与游离羧基形成的盐也可以衍生于诸如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁这样的无机碱和诸如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等这样的有机碱。

用于活性组分的药理上耐受的载体在本领域中是众所周知的。液体载体的例子是不含包括活性组分和水在内的物质或含有诸如生理pH值下的磷酸钠、生理盐水或两者均含有(诸如磷酸缓冲盐水)这样的缓冲液的无菌水溶液。再进一步说，含水载体可以含有一种以上的缓冲盐以及诸如氯化钠和氯化钾这样的盐、右旋糖、聚乙二醇和其它溶质。

液体组合物还可以含有包括水和不包括水在内的液相。例示的这类附加液相是甘油、诸如棉子油这样的植物油和水-油乳剂。

治疗组合物含有本发明调制血管生成量的Src蛋白质或表达有效量的Src蛋白质的充分重组DNA表达载体，一般将其配制成含有按总治疗组分物重量计至少0.1重量百分比的Src蛋白质。重量百分比是Src蛋白质与总组合物的重量比。因此，例如，0.1重量百分比是每100g总组合物中含0.1g的Src蛋白质。对于DNA表达载体来说，给药量取决于所述表达载体的特性、所治疗的组织和类似考虑因素。G．制品

本发明还关注一种用于提供本发明Src蛋白质的标记容器的制品。制品包括带有用于所治疗疾病的合适标记的包装物质和包含在所述包装物质内的药剂。

制品中的药剂是适合于提供Src蛋白质并配制成如本文根据公开的适应证所述的药物上可接受的剂型的本发明组合物的任何一种。因此，该组合物可以含有Src蛋白质或能够表达Src蛋白质的DNA分子。该制品中包含足以用于治疗本文所述疾病的量的药剂，可以是单位剂量或多重剂量。

包装物质带有指示其中所含的药剂的应用的标记，例如用于通过抑制或强化血管生成而有助于治疗疾病和本文公开的类似疾病。该标记可以进一步包括为销售所需要的使用说明和相关信息。所述的包装物质可以包括用于储存药剂的容器。

本文所用的术语包装物质指的是诸如玻璃、塑料、纸、箔等能够将药剂保存在固定装置中的物质。因此，例如，所述的包装物质可以是塑料或玻璃小瓶、层状包封物和用于包含包括药剂在内的药物组合物的容器。

在优选的实施方案中，所述的包装物质包括一种标记，它是描述制品含量和其中所含药剂用途的明确表示。

实施例

涉及本发明的下列实施例是解释性的且当然不应用来作为本发明的特别限定。此外，将目前公知或后来发展的本领域技术人员权限内的这类本发明变化形式看作属于下文所要求保护的本发明的范围内。1.c-Src表达构建体的制备

为了制备用于通过本发明方法调制血管生成的表达构建体，操作c-Src cDNA并将其插入表达构建体/载体中。

图1给出编码野生型(即内源性)鸡c-Src的cDNA序列(SEQ IDNO.:2)，图2给出编码的氨基酸残基序列(SEQ ID NO.:3)。从cDNA的第112-1713位核苷酸翻译编码的蛋白质序列。相应于人c-Src cDNA的核酸序列(SEQ ID NO.:4)和编码的氨基酸残基(SEQ IDNO.:5)序列分别如附图3和4中所示。对于人蛋白质序列来说，编码序列开始于cDNA的第134-1486位核苷酸。

制备野生型以及大量突变型c-Src cDNA。使用Kaplan等在《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)13:4745-4756(1994)中所述的定向诱变来制备突变型c-Src构建体。编码用于本发明方法的突变型c-Src蛋白质的突变型c-Src构建体如Kaplan等在上述相同文献中描述。Kaplan等描述了各种突变型c-Src构建体和用于实施本发明的编码蛋白质。例如，Kaplan等在其附图1中描绘了鸡c-src等位基因的几种产物，包括SrcA和Src251。

描述了起调制血管生成作用的两类c-Src。如上所述，一类含有增加血管生成的Src分子且由此被看作是活性蛋白质。本发明中证实了诱发血管生成的野生型Src以及各种突变体。在本文中根据体内诱发血管生长且由此增加肿瘤重量的能力起作用的野生型c-src的一种优选突变是在527位酪氨酸改变成苯丙氨酸的527位氨基酸(aa)残基上具有点突变的SrcA突变体。该位点通常是用于通过称作激酶CSK的c-Src激酶负调节的位点。当CSK可使野生型src中的aa527磷酸化时，蛋白质是失活的。然而，在突变型SrcA中，调节的酪氨酸转化成苯丙氨酸，由此不用使蛋白质通过磷酸化失活而赋予蛋白质在构成上(即永久地)的活性。

还证实src中的突变对血管生成具有反向调制作用，从而抑制血管生成而非剌激它。将这类突变称作失活src突变。还将具有提供这种抑制活性的突变的蛋白质称作显性失活的Src蛋白质即，它们抑制新血管形成，包括由Src内源性活性所导致的以及由生长因子刺激产生的提高的Src活性所导致的。因此，本发明野生型c-src的某些突变体就其阻断血管生长且例如由此降低体内肿瘤重量的能力来说还起显性失活的作用。

这类优选的抑制性c-Src蛋白质包括仅表达Src前251个氨基酸的Src251。这种构建体缺乏完整的激酶结构域且由此称作“激酶死亡”src蛋白质。第二种构建体是295位赖氨酸氨基酸残基突变成甲硫氨酸的Src(K295M)突变体。这种激酶结构域中的点突变防止ATP结合并且还阻断与血管细胞和肿瘤细胞信号传输和增殖相关的激酶依赖性Src功能。

例如，对于527位残基上的突变来说，只要产生的突变氨基酸残基不是酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸，那么本发明关注的是在期望位点另一种氨基酸的存在将产生具有所需活性，促进血管生成调制活性的Src蛋白质。

就点突变而言，任何导致所需抑制或刺激活性的突变体均是本发明应用中所关注的。还关注的是将所需src蛋白质(突变体或其片段)与表达的氨基酸标记、抗原表位、荧光蛋白或其它这类蛋白质或肽类合并的融合蛋白构建体，条件是src蛋白质的所需调制作用是完整的。

               表Ⅰ

Src/突变体    Src功能    对血管生成的作用

c-Src           +           活性刺激

SrcA(T527F)     +           活性刺激

Src527(点)      +           活性刺激

Src251          -           失活抑制

Src(截短物)     -           失活抑制

Src(K295M)      -           失活抑制

Src295(点)      -           失活抑制

用于本发明的一种优选表达构建体是RCASBP(A)构建体(SEQ IDNO.:1)。这种表达载体以一系列含有改善滴度的强化Bryan聚合酶(BP)的复制感受态禽类肉瘤病毒为基础并且对在正常鸟细胞上表达的A型包膜糖蛋白具有特异性(《细胞生物学方法综述》(Reviewedin Methods in Cell Biology),52:179-214(1997)；还参见Hughes等，1987《病毒学杂志》(J.Virol.)61:3004-3012；Fekete&Cepko,1993细胞分子生物学》(Mol.Cellular Biol.)13(4):2604-2613；Itoh等，1996《发展》(Development)122:291-300；和Stott等，1998《生物技术》(BioTechniques)24:660-666)。RCASBP(A)的全序列(SEQ ID NO.:1)在所附的序列表中给出且该构建体的限制酶图谱描绘为附图10，在本文中称作RCAS。

原始Src251构建体由Dr.Pam Schwartzberg在Dr.HaroldVarmus’s实验室中的NIH亚克隆。简单地说，通过将含有NotⅠ-BstB1-NotⅠ限制位点的接头插入Src251的5’末端中唯一NotⅠ位点来完成对src cDNA序列的克隆以便于表达它。Src带有3’末端上的唯一ClaⅠ位点。用BstB1和ClaⅠ消化Src251产生BstB1-ClaⅠ片段，然后将该片段连入RCASBP(A)上的ClaⅠ位点。BstB1的突出端要求用没有用ClaⅠ重新切割的ClaⅠ突出端连接。通过首先用NotⅠ和ClaⅠ消化含有Src251的RCAS载体(在DAM+背景中)在上述载体中方便地获得适用于实施本发明的src构建体以便插入类似消化的Src cDNA。因此，将这种含有Src251的原始RCASBP(A)构建体进一步用于将如上述和Kaplan等(1994，《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)13(20):4745-4756)所述的所有其它Src构建体通过经Src251构建产生的NotⅠ-ClaⅠ片段亚克隆入RCASBP(A)。为了在cDNA中产生所需的c-src突变，应用本领域技术人员所熟知的标准定向诱变过程。还将设计成引入所需突变的PCR引物用限制位点设计以便促进随后的克隆步骤。通过以Src的鸡、人和类似同系物的公知cDNA序列为基础的PCR扩增技术和随后形成新构建体从核酸构建体中删除编码Src的核酸序列的完整片段。

在本发明的一个实施方案中，用于扩增src核酸的3’PCR引物还编码符合读框的序列。应用这种引物将9E10-myc表位标记添加到随后的Src构建体的羧基末端。

在Src的251位氨基酸后添加下列氨基酸以便产生含有9E10-myc表位标记的载体构建体：VDMEQKLIAEEDLN(SEQ ID NO.:6)。对每一种构建体进行两种独立的PCRs并获得类似的结果。还通过证实克隆的推定DNA序列的PCR来对由PCR构建的所有突变体构建体进行测序。用于本发明表达系统的野生型和突变型Src cDNAs还商购自销售鸟以及人src和几种激酶死亡和激活突变型的Upstate BiotechLaboratories,Lake Placid,NY。

另一种用于表达本发明Src蛋白质的表达载体还包括如美国专利号4,797,368、5,173,414、5,436,146、5,589,377和5,670,488中所述的腺病毒载体。用于转运Src调制蛋白质的另一种方法包括用如美国专利号5,675,954中所述的非病毒载体系统转运Src cDNA和如美国专利号5,589,466中所述的将cDNA本身作为裸DNA转运。本发明的构建体的转运也不限于局部施用如下CAM试验系统中所述的病毒载体。例如，还将病毒载体制剂通过静脉内注射以用于系统性转运入血管床。这些载体还通过局部对肿瘤注射(作为一个实例)而可定向至血管形成增加的部位。

对体外表达的蛋白质所关注的是它在通过用于转运蛋白质或多肽类的方法表达和纯化选择的Src蛋白质后的转运。一种这样的方法包括诸如美国专利号4,356,167、5,580,575、5,542,935和5,643,599中所述的脂质体转运系统。用于表达和/或转运本发明Src蛋白质的其它载体和蛋白质转运系统对于本领域技术人员来说是众所周知的。2．未处理的鸡尿囊绒膜(CAM)的特征记述

A．CAM的制备

在正常胚胎血管生成导致成熟血管形成后可以在鸡尿囊绒膜(CAM)上诱发血管生成。已经证实所诱发的血管生成对由Leibovich等在《自然》(Nature)329:630(1987)和Ausprunk等在《美国病理学杂志》(Am.J.Pathol.)79:597(1975)中所述的特异性细胞因子或肿瘤断片有反应。由随后用于诱发血管生成及其抑制的鸡胚胎制备CAMs。10日龄的鸡胚胎获自McIntyre Poultry(Lakeside,CA)并将其在37℃和60％湿度下进行培养。使用小型工具钻(Dremel,Division of Emerson Electric Co.Racine WI)通过直接置于气囊上的卵边缘上的卵壳打一个小孔。在没有预先通过对卵透光检验确定的胚胎血管的区内的卵宽侧面上钻第二个孔。将负压施于原始孔，产生从卵壳膜中拉出并在CAM上生成假气囊的CAM(尿囊绒膜)。使用小型砂轮(Dremel)在滴落的CAM上的卵壳上打入一个1.0厘米(cm)×1.0cm的正方形开孔。该小开孔使得可以直接进入下面的CAM。

然后将所得的CAM制备物在胚胎发生6日时使用，该阶段由活性新血管形成来标注，对反映出用于评估对胚胎血管形成的作用或在血管生成已经减退的10日胚脂血管生成时使用的模式的CAM没有进行附加的处理。由此将后一种制备物在本发明中用于诱发对细胞因子处理或如下所述的肿瘤接触起反应的重新开始的血管生成。3．CAM血管生成的检测试验

A．由生长因子诱发的血管生成

已经证实通过细胞因子或生长因子可以诱发血管生成。

通过在没有血管区中的9或10日龄鸡胚胎的CAM上放置用含有2微克/毫升(μg/ml)重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或血管内皮细胞生长因子(VEGF)(Genzyme,Cambridge,MA)的Hanks平衡盐溶液(HBSS,GIBCO,Grand Island,NY)饱和的5毫米(mm)×5mm Whatman滤片(Whatman1号滤纸)来诱发血管生成且随后将开孔用胶带密封。其它浓度的生长因子对诱发血管生长也有效。对于通过静脉注射拮抗剂评估血管生成抑制情况的试验来说，首先在成纤维细胞生长培养基中用1-2μg/ml bFGF或VEGF诱发血管生成。在72小时后通过显微照相术监测血管生成。

B．胚胎血管生成

用于评估血管生成抑制剂对天然形成的胚胎新血管形成的作用的CAM制备物是如上所述的6日龄胚胎鸡的胚胎。在这一发育阶段，使血管重新生长且由此提供用于评估由本发明Src蛋白质的血管生成调制作用的有用系统。除在第6天胚胎而不是第9或10天胚胎时进行该试验外，如上所述制备CAM系统。4．根据CAM检测试验测定的血管生成调制作用

为了评估Src蛋白质对血管生成的作用，对10日龄鸡CAM制备物进行下列检测试验。将如实施例1中所述制备的5μg的RCAS构建体转染入鸡无限增殖化成纤维细胞系DF-1(Doug Foster的赠品，U.of Minn.)。该细胞系以及初级鸡胚胎成纤维细胞系能够产生病毒，不过DF-1细胞系产生较高滴度。在无血清CLM培养基[组成：用DMSO、叶酸、谷氨酸和MEM维生素溶液补充的F-10培养基基质]中从分会合DF-1生产者细胞系中收集病毒上清液。通过在4℃下以22,000rpm超离心2小时来浓缩35ml的病毒上清液。将这些浓缩的病毒沉淀重新悬浮于不含血清的CLM培养基中的1/100原始体积中、分成等分并在-80℃下保存。通过顺序稀释具有编码绿色荧光蛋白(GFP)称作RCAS-GFP的核苷酸序列的对照病毒载体、在培养48-72小时的初级鸡胚胎成纤维细胞上感染来估计滴度。在浓缩后获得的病毒原种溶液的滴度通常超过10⁸I.u./ml。为了使用病毒原种溶液进行CAM检测试验，在95％乙醇中用3mg/ml醋酸可的松制备醋酸可的松浸泡持续30分钟的6mm直径的Whatman滤片。将该滤片在层流罩超静台中干燥且然后用20μl的病毒原种溶液/片浸泡10分钟。将这些片置于9或10日龄鸡胚胎的CAM上并用赛璐玢胶带密封并在37℃下培养18-24小时。接着以5μg/ml的浓度将模拟物PBS或生长因子加入到20μl体积合适病毒原种溶液中的CAM上作为对CAM组织的附加病毒强化。72小时后，收集CAMs并检验通过对片下CAM中分支点数量的双盲计数所测定的生血管指数的改变。为了进行激酶检测试验，在RIPA中收集片下的组织、用自动研磨机将其匀化并从等量的总蛋白质中Src免疫沉淀且使用FAK-GST融合蛋白作为底物进行体外激酶检测试验。为了进行免疫荧光研究，用冷藏剂OCT冷冻片下的CAM组织、切成4μm的片、在丙酮中固定1分钟、在3％正常山羊血清中培养1小时、随后在如上所述的初级家兔抗磷酸化ERK抗体中培养(Eliceiri等《细胞生物学杂志》(J.Cell.Biol.)140:1255-1263(1998))、在PBS中洗涤并用荧光二级抗体进行检测。

A．通过bFGF或VEGF激活内源性Src

为了评估生长因子在调制血管生成的Src活性的作用，进行下列检测试验。裂解已经与bFGF或VEGF(2μg/ml)接触2小时的10日龄鸡CAMs的组织提取物。从等量的总蛋白质中免疫沉淀内源性Src且使用FAK-GST融合蛋白作为底物使其进行体外免疫复合激酶检测试验、电泳并转到硝化纤维上。

试验结果如附图5中所示，其中与在CAM检测试验中表现出基线Src活性的未处理(模拟物)样品相比，在用bFGF或VEGF处理增加凝胶密度的过程中Src活性增加明显。导致内源性Src活性增加约2倍的bFGF和VEGF存在于CAM中。还用抗-Src抗体作为Src和IgG含量相等的加样对照来探测上述激酶试验印迹。

B．逆转录病毒介导的SrcA的基因表达对鸡CAM中血管生成的作用

进行下列试验以便评估突变型Src蛋白质对CAM制备物中血管生成的作用。为了进行该试验，在实施上述方案后使9日龄鸡CAMs与表达逆转录病毒的RCAS-SrcA或RCAS-GFP或缓冲液接触72小时。

试验结果如附图6中所示，其中如上所述对血管生成的水平进行定量。如附图6B中所示用立体显微镜记录有代表性的显微照片(4x)。基线内源性Src活性具有的生血管指数约为50。相反，用在527位氨基酸残基上具有从酪氨酸至苯丙氨酸的点突变的逆转录病毒载体表达的RCAS-SrcA处理的CAMs导致提高(诱发)的血管生成的生血管指数约为90。Src-A介导的血管生成的增加在附图6B中所示的照片中是明显的。

C．SrcA的逆转录病毒表达激活血管MAP激酶磷酸化

在上述和本文所述的试验过程后还评估了SrcA与生长因子VEGF和PMA相比较对血管MAP激酶磷酸化的作用。将与VEGF或PMA(另一种可比拟浓度的促分裂原)接触30分钟的10日龄的鸡CAMs的组织提取物与用表达SrcA的逆转录病毒感染48小时的那些组织提取物进行比较。然后(than)从等量的总蛋白质提取物中免疫沉淀Src且使用FAK-GST融合蛋白作为底物使其进行体外免疫复合激酶检测试验、电泳并转到硝化纤维上。

试验结果如附图7A中所示，其中未处理的CAMs(NT)表现出基线内源性Src介导的血管MAP激酶磷酸化。VEGF和PMA导致比基线增加约2倍。相反，SrcA比用未处理样品观察到的活性提高约5-10倍。

还通过用如附图7B中所示的抗-磷酸-ERK抗体进行的免疫印迹对上述完整组织裂解物的等分试样测定了内源性ERK磷酸化程度。为了进行这种评估，用模拟物RCAS或表达SRCA的RCAS感染10日龄的CAMs。2天后，将CAMs解剖、在OCT中低温冷藏并切成4μm的片。将切片用抗磷酸化ERK抗体(New England Biolabs)免疫染色、洗涤并用山羊抗家兔FITC接合的二级抗体检测。在稳定的CCD照相机(Princeton Inst.)上捕捉荧光影象。显微照片显示出用SrcA处理的制备物的免疫荧光比模拟物对照增强。

D．在VEGF而非bFGF诱发的血管生成过程中对Src活性的选择性需求

为了评估Src调制活性对生长因子诱发的血管生成的作用，进行下列试验。使9日龄鸡CAMs与表达称作如上所述的Src251或SrcK295M的显性失活Src突变体的逆转录病毒制备物接触。将RCAS-Src251或对照品RCAS-GFP逆转录病毒或缓冲液CAMS处理20小时且然后在有或没有bFGF或VEGF存在的情况下再培养72小时。

如上所述定量的血管生成的水平如附图8A中所示。用立体显微镜记录附图8B中所示的有代表性的显微照片(6x)。附图8C解释了用抗-Src抗体探测的印迹以便证实与模拟物处理相比Src251在转染细胞中的表达。

上述试验结果表明在有RCAS-GFP对照品存在的情况下bFGF和VEGF处理的CAMS诱发的血管生成超过使用模拟物或未处理CAM制备物观察到的Src介导的基线血管生成。所表达的显性失活突变体Src251在抑制VEGF诱发的血管生成恢复至基线水平方面是有效的，而在抑制bFGF介导的血管生成方面无效。附图8B中所示的显微照片以图的方式证实了附图8A中所示的数据。因此，当用VEGF诱发血管生成时，逆转录病毒表达的Src251是一种有效的血管生成抑制剂。

在本发明中关注与下面实施例中所述的其它血管生成模型一起施用本发明的Src蛋白质。5．用由体内家兔眼模型试验确定的Src调制剂使肿瘤组织生长退化

在以眼角膜为典型实例的天然透明结构中可以观察到Src调制剂对生长因子诱发的血管生成的作用。新血管从供血丰富的角膜边缘生长至正常情况下无法供血的角膜中心。血管生成刺激物诸如bFGF在施用于角膜时可诱发新血管从角膜的边缘生长。施用于角膜的血管生成拮抗剂抑制新血管从角膜边缘生长。因此，角膜通过从角膜边缘进入易观察的坚韧胶原包裹的角膜组织的内皮细胞侵害而经受了血管生成。家兔眼模型试验由此提供了用于直接观察在直接将化合物植入眼角膜后的刺激情况和抑制血管生成的体内模型。

A．体内家兔眼模型试验

1)由生长因子诱发的血管生成

在体内家兔眼模型试验中用生长因子bFGF或VEGF诱发血管生成并如下部分中所述。

a．含有生长因子和单克隆抗体的Hydron颗粒的制备

如D’Amato等在《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),91:4082-4085(1994)中所述制备含有生长因子的Hydron聚合物颗粒。各颗粒含有650ng的单独与硫糖铝(Carafet,MarionMerrell Dow Corporation)结合以稳定生长因子并确保其缓慢释放入周围组织中的生长因子。此外，制备含有如上所述所需的表达Src的逆转录病毒的hydron颗粒。所述颗粒在具有穿入表面2.5mm芯的特殊制备的特氟隆梭芯中浇铸。将约12μl浇铸物质放入各梭芯并在无菌通风橱中聚合过夜。然后通过紫外线照射对颗粒灭菌。接着如上所述评估Src蛋白质的作用。6．由嵌合鼠：人体试验测定的用Src调制剂的体内使肿瘤组织生长退化

通过用人新生儿包皮取代来自SCID鼠的部分皮肤来生成体内嵌合鼠：人模型。主要如Yan等在《临床研究杂志》(J.Clim.Invest.)91:986-996(1993)中所述制备体内嵌合鼠：人模型。概括地说，通过手术从SCID小鼠(6-8周龄)中取出2cm²的正方形面积的皮肤并用人包皮替换。麻醉小鼠并通过刮削从外侧腹部区的每一侧上的5cm²面积中取下毛发。通过将全厚度的皮肤向下取至筋膜来制备2cm²的两个环状移植物床。将来源于人新生儿包皮的相同大小的全厚度人皮肤移植物放在伤口床上并在该位置上缝合。用与皮肤缝合的Band-Aid覆盖移植物。还将微孔布带用于覆盖伤口。

将M21-L人黑素瘤细胞系或MDA23.1乳腺癌细胞系(ATCC HTB26；使用mAb LM609的组织切片的免疫反应性为α_vβ₃阴性)用于在SCID小鼠上的人皮肤移植物上形成人实体肿瘤。将5×10⁶M21-L或MDA23.1细胞的单细胞悬浮液经皮内注入人皮肤移植物。然后观察小鼠2-4周以便使人肿瘤生长至可测量。

在建立可测量的肿瘤后，将本发明的逆转录病毒制剂或PBS注入小鼠尾静脉。2-3周的期限后，切下肿瘤并通过重量和组织学进行分析。然后评估本发明表达的Src蛋白质对该肿瘤的作用。7．由CAM试验测定的用Src调制剂的人肿瘤组织生长的体外退化

肿瘤生长取决于血管生成(Folkman,1992；Weidner等，1991；Brooks等，1994b)。实际上，近期的报导提示肿瘤生长对VEGF受体拮抗剂的抗生血管作用敏感(Kim等，1993)。因此，我们检验了通过转运激酶缺失的Src251而产生的血管生成抑制作用是否会影响人成神经管细胞瘤(DAOY)即一种公知可产生VEGF和极少bFGF的高度生血管的肿瘤的生长(数据未显示)。

在主要如上所述的鸡CAM中进行3和6日DAOY成神经管细胞瘤生长试验(Brooks等，1994)。洗涤在含有10％胎牛血清的RPMI1640中培养的5×10⁶DAOY细胞并将其接种在10日胚胎的CAM上以便产生DAOY肿瘤断片。7天后，将50mg的肿瘤断片解剖并重新接种在另一个10日胚胎上并通过局部施用(25μl)的对照品RCAS-GFP逆转录病毒，RCAS-Src251或模拟物处理再培养3或6天。使用作为指导的感染肿瘤的完整组织聚焦成象，我们能够使用这种局部手段测定肿瘤断片周围和内部存在的对RCAS构建体的显著表达。以双盲方式进行肿瘤的切除和称重，从而仅除去易于确定的实体肿瘤块(Brooks等，1994)。将3或6天后的湿肿瘤重量与原始重量进行比较并测定每组肿瘤重量改变的百分比。

这些肿瘤易于在CAM上生长并产生活性血管生成(附图9)，使得我们通过使用鸟特异性RCAS逆转录病毒选择性地靶向鸟衍生的肿瘤血管系统。

附图9描绘了表示RCAS-Src 251至在鸡CAM上生长的人肿瘤的逆转录病毒转运这一过程使肿瘤生长退化的结果。附图9A表示在如上所述的鸡胚胎CAM上生长的人成神经管细胞瘤。将含有RCAS-GFP或RCAS-Src251的逆转录病毒表面施用于预先建立的大于50mg的肿瘤。用表达GFP的RCAS-GFP感染的成神经管细胞瘤断片的有代表性的显微照片显示了通过使用Bio Rad激光聚焦扫描显微镜(光栅=500μm)的光学切片检测的肿瘤血管(箭头)中的确限表达。附图9B表示来自如上述处理的肿瘤的结果，所述的上述处理是指在将肿瘤切除并测定湿重后使它们生长3或6天。将数据表示为肿瘤重量的平均改变值(来自50mg肿瘤的原始重量)+/-2次重复试验的SEM。RCAS-Src251对肿瘤生长在3天后具有显著的影响(*,P＜0.002)且在6天后也有显著影响(**,P＜0.05)。附图9C表示用Olympus立体显微镜(光栅=350μm)记录的手术取自胚胎的成神经管细胞瘤的有代表性的立体显微照片。(下面的组)各肿瘤的高放大倍数的显微照片具体表示各肿瘤的血管系统(光栅=350μm)。箭头表示在RCAS-Src251处理的肿瘤中血管的破裂情况。

结果表明将含有Src 251的RCAS转运至预先建立的成神经管细胞瘤可在与肿瘤相关的血管内产生选择性病毒表达(附图9A)且这最终会导致这些肿瘤在6天的间隔内退化(附图9B)。重要的是，用含有Src251的病毒处理的动物体内与肿瘤相关的血管严重破裂且与对照组动物体内的肿瘤血管相比数量较少(附图9C)。RCAS-GFP感染的肿瘤表明GFP仅局限在肿瘤血管系统中这一事实提示采用逆转录病毒转运的Src251观察到的抗肿瘤作用是由于其抗生血管特性导致的。

上述实施例和附加说明是解释性的且并不看作起限定作用。本发明也不限于保藏的细胞系的范围，因为保藏的实施方案用来作为本发明一个方面的解释。任何功能上等价的细胞系均属于本发明的范围内。物质的保藏并不使得本文包含的撰写说明不足以能够实施本发明的任何方面、包括最佳实施方式，也不用来将权利要求的范围限定到它所代表的特定解释。实际上，可以根据上述描述对包括本文所证明和描述的那些技术方案在内的本发明作各种修改，这对本领域技术人员来说是显而易见的，并且这些修改也属于所附权利要求的范围内。

                 序列表<110>scripps研究院等<120>使用酪氨酸激酶SRC调制血管生成的方法和组合物<130>TSRI 651.1<140>仍然未知<141>待确定<150>60/087,220<151>1998-05-29<160>6<170>PatentIn2.0版<210>1<211>11627<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：以禽类肉瘤病毒为基础的RCASBP(A)<220><221>misc_特征<222>(7649)..(11258)<223>pBR322序列<220><221>LTR<222>(7166)..(7494)<223>上游<220><221>LTR<222>(1)..(101)<223>上游(在上游R处开始编码)<220><221>misc特征<222>(11394)..(11623)<223>U3<220><221>misc_特征<222>(1)..(21)<223>R<220><221>misc特征<222>(22)..(101)<223>U5<220><221>misc_特征<222>(102)..(119)<220><221>LTR<222>(7166)..(7494)<223>下游<220><221>misc_特征<222>(7166)..(7393)<223>U3<220><221>misc_特征<222>(7394)..(7414)<223>R<220><221>misc特征<222>(7415 )..(7494)<223>U5<220><221>misc_特征<222>(7154)..(7165)<223>PPT<220><221>misc_特征<222>(388)..(391)<223>剪接供体(AGGT)<220><221>misc_特征<222>(5074)..(5077)<223>env剪接受体(AGGC)<220><221>misc_特征<222>(6982)..(6985)<223>Clal剪接受体 (AGGA)<220><221>基因<222>(372)..(902)<223>gag p19<220><221>基因<222>(909)..(1094)<223>gag p10<220><221>基因<222>(1095)..(1814)<223>gag p27<220><221>基因<222>(1843)..(2108)<223>gag p12<220><221>基因<222>(2109)..(2480)<223>gag p15<220><221>misc_信号<222>(2481)..(2483)<223>gag终止<220><221>基因<222>(2501)..(4216)<223>pol RT<220><221>基因<222>(4217)..(5185)<223>pol IN<220><221>misc_信号<222>(5186)..(5188)<223>pol终止<220><221>基因<222>(5244)..(6263)<223>env gp85<220><221>基因<222>(6264)..(6878)<223>env gp37<220><221>misc_信号<222>(6879)..(6881)<223>env终止<220><221>misc特征<222>(7027)<223>在Dam+菌株中使gag中的Clal位点/Clal位点甲基化且不切割。<400>1gccatttgac cattcaccac attggtgtgc acctgggttg atggccggac cgttgattcc 60ctgacgacta cgagcacctg catgaagcag aaggcttcat ttggtgaccc cgacgtgata 220gttagggaat agtggtcggc cacagacggc gtggcgatcc tgtctccatc cgtctcgtct 180atcgggaggc gagttcgatg accctggtgg agggggctgc ggcttaggga ggcagaagct 240gagtaccgtc ggagggagct ccagggcccg gagcgactga cccctgccga gaactcagag 300ggtcgtcgga agacggagag tgagcccgac gaccacccca ggcacgtctt tggtcggcct 360gcggatcaag catggaagcc gtcattaagg tgatttcgtc cgcgtgtaaa acctattgcg 420ggaaaatctc tccttctaag aaggaaatcg gggccatgtt gtccctgtta caaaaggaag 480ggttgcttat gtctccctca gatttatatt ctccggggtc ctgggatccc atcactgcgg 540cgctctccca gcgggcaatg gtacttggaa aatcgggaga gttaaaaacc tggggattgg 600ttttgggggc attgaaggcg gctcgagagg aacaggttac atctgagcaa gcaaagtttt 660ggttgggatt agggggaggg agggtctctc ccccaggtcc ggagtgcatc gagaaaccag 720ctacggagcg gcgaatcgac aaaggggagg aggtgggaga aacaactgtg cagcgagatg 780cgaagatggc gccagaggaa gcggccacac ctaaaaccgt tggcacatcc tgctatcatt 840gcggaacagc tgttggctgc aattgcgcca ccgccacagc ctcggcccct cctccccctt 900atgtggggag tggtttgtat ccttccctgg cgggggtggg agagcagcag ggccagggag 960ataacacgtc tcggggggcg gagcagccaa gggaggagcc agggcacgcg ggtcaggccc 1020ctgggccggc cctgactgac tgggcaaggg taagggagga gcttgcgagt actggtccgc 1080ccgtggtggc catgcctgta gtgattaaga cagagggacc cgcctggacc cctctggagc 1140caaaattgat cacaagactg gctgatacgg tcaggaccaa gggcttacga tccccgatca 1200ctatggcaga agtggaagcg ctcatgtcct ccccgttgct gccgcatgac gtcacgaatc 1260taatgagagt gattttagga cctgccccat atgccttatg gatggacgct tggggagtcc 1320aactccagac ggttatagcg gcagccactc gcgacccccg acacccagcg aacggtcaag 1380ggcgggggga acggactaac ttggatcgat taaagggctt agctgatggg atggtgggca 1440acccacaggg tcaggccgca ttattaagac cgggggaatt ggttgctatt acggcgtcgg 1500ctctccaggc gtttagagaa gttgcccggc tggcggaacc tgcaggtcca tgggcggaca 1560tcacgcaggg accatctgag tcctttgttg attttgccaa tcggcttata aaggcggttg 1620aggggtcaga tctcccgcct tccgcgcggg ctccggtgat cattgactgc tttaggcaga 1680agtcacagcc agatattcag cagcttatac gggcagcacc ctccacgctg accaccccag 1740gagagataat caaatatgtg ctagacaggc agaagattgc ccctcttacg gatcaaggca 1800tagccgcggc catgtcgtct gctatccagc ccttagttat ggcagtagtc aatagagaga 1860gggatggaca aactgggtcg ggtggtcgtg cccgagggct ctgctacact tgtggatccc 1920cgggacatta tcaggcacag tgcccgaaaa aacgaaagtc aggaaacagc cgtgagcgat 1980gtcagctgtg tgacgggatg ggacacaacg ctaaacagtg taggaagcgg gatggcaacc 2040agggccaacg cccaggaaga ggtctctctt cggggccgtg gcccggccct gagcagcctg 2100ccgtctcgtt agcgatgaca atggaacata aagatcgccc cttggttagg gtcattctga 2160ctaacactgg gagtcatcca gtcaaacaac gttcggtgta tatcaccgcg ctgttggact 2220ccggagcgga catcactatt atttcggagg aggattggcc tactgattgg ccggtggtgg 2280acaccgcgaa cccacagatc catggcatag gagggggaat tcccatgcga aaatcccggg 2340atatgataga ggtgggggtt attaaccgag acgggtcgtt ggagcgaccc ctgctcctct 2400tccccgcagt cgctatggtt agagggagta tcctaggaag agattgtctg cagggcctag 2460ggctccgctt gacaaattta tagggagggc cactgttctc actgttgcgc tacatctggc 2520tattccgctc aaatggaagc cagaccgcac gcctgtgtgg attgaccagt ggcccctccc 2580tgaaggtaaa cttgtaggcc taacgcaatt agtggaaaaa gaattacagt taggacatat 2640agagccctca cttagttgtt ggaacacacc tgtttttcgt gatccggaag gcttccgggt 2700cttatcgctt attgcatgat ttgcgcgctg ttaacgccaa gcttgtccct tttggggccg 2760tccaacaggg ggcgccagtt ctctccgcgc tcccgcgtgg ctggcccctg atggtcctag 2820acctcaagga ttgcttcttt tctatccctc ttgcggaaca agatcgcgaa gcttttgcat 2880ttacgctccc ctctgtgaat aaccaggccc ccgctcgaag attccaatgg aaggtcttgc 2940cccaagggat gacctgttct cccactatct gtcagttggt agtgggtcag gtgctcgagc 3000ccttgcgact caagcaccca gctctgcgca tgttgcatta 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cc aag ttc ccc atc aag tgg aca gcc ccc gag gca gcc   1413Arg Gln Gly Ala Lys Phe Pro Ile Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ala420                 425                 430ctc tat ggc cgg ttc acc atc aag tcg gat gtc tgg tcc ttc ggc atc   1461Leu Tyr Gly Arg Phe Thr Ile Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile435                 440                 445                 450ctg ctg act gag ctg acc acc aag ggc cgg gtg cca tac cca ggg atg   1509Leu Leu Thr Glu Leu Thr Thr Lys Gly Arg Val Pro Tyr Pro Gly Met455                 460                 465gtc aac agg gag gtg ctg gac cag gtg gag agg ggc tac cgc atg ccc   1557Val Asn Arg Glu Val Leu Asp Gln Val Glu Arg Gly Tyr Arg Met Pro470                 475                 480tgc ccg ccc gag tgc ccc gag tcg ctg cat gac ctc atg tgc cag tgc   1605Cys Pro Pro Glu Cys Pro Glu Ser Leu His Asp Leu Met Cys Gln Cys485                 490                 495tgg cgg agg gac cct gag gag cgg ccc act ttt gag tac ctg cag gcc   1653Trp Arg Arg Asp Pro Glu Glu Arg Pro Thr Phe Glu Tyr Leu Gln Ala500                 505                 510ttc ctg gag gac tac ttc acc tcg aca gag ccc cag tac cag cct gga   1701Phe Leu Glu Asp Tyr Phe Thr Ser Thr Glu Pro Gln Tyr Gln Pro Gly515                 520                 525                 530gag aac cta taggcctgga gctcctcctg gaccagaggc ctcgctgtgg ggtacaggg 1759Glu Asn Leu<210>3<211>533<212>PRT<213>鸡<400>3Met Gly Ser Ser Lys Ser Lys Pro Lys Asp Pro Ser Gln Arg Arg Arg

 1            5                  10                 15Ser Leu Glu Pro Pro Asp Ser Thr His His Gly Gly Phe Pro Ala Ser

         20                  25                  30Gln Thr Pro Asn Lys Thr Ala Ala Pro Asp Thr His Arg Thr Pro Ser

     35                  40                  45Arg Ser Phe Gly Thr Val Ala Thr Glu Pro Lys Leu Phe Gly Gly Phe

 50                  55                  60Asn Thr Ser Asp Thr Val Thr Ser Pro Gln Arg Ala Gly Ala Leu Ala65                  70                  75                  80Gly Gly Val Thr Thr Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ser Arg Thr

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        100                 105                 110Asn Thr Glu Gly Asp Trp Trp Leu Ala His Ser Leu Thr Thr Gly Gln

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            165                 170                 175Ser Glu Thr Thr Lys Gly Ala Tyr Cys Leu Ser Val Ser Asp Phe Asp

        180                 185                 190Asn Ala Lys Gly Leu Asn Val Lys His Tyr Lys Ile Arg Lys Leu Asp

    195                 200                 205Ser Gly Gly Phe Tyr Ile Thr Ser Arg Thr Gln Phe Ser Ser Leu Gln

210                 215                 220Gln Leu Val Ala Tyr Tyr Ser Lys His Ala Asp Gly Leu Cys His Arg225                 230                 235                 240Leu Thr Asn Val Cys Pro Thr Ser Lys Pro Gln Thr Gln Gly Leu Ala

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    275                 280                 285Thr Thr Arg Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Pro Gly Thr Met Ser Pro

290                 295                 300Glu Ala Phe Leu Gln Glu Ala Gln Val Met Lys Lys Leu Arg His Glu305                 310                 315                 320Lys Leu Val Gln Leu Tyr Ala Val Val Ser Glu Glu Pro Ile Tyr Ile

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        340                 345                 350Glu Met Gly Lys Tyr Leu Arg Leu Pro Gln Leu Val Asp Met A la Ala

    355                 360                 365Gln Ile Ala Ser Gly Met Ala Tyr Val Glu Arg Met Asn Tyr Val His

370                 375                 380Arg Asp Leu Arg Ala Ala Asn Ile Leu Val Gly Glu Asn Leu Val Cys385                 390                 395                 400Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Leu Ile Glu Asp Asn Glu Tyr

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    435                 440                 445Gly Ile Leu Leu Thr Glu Leu Thr Thr Lys Gly Arg Val Pro Tyr Pro

450                 455                 460Gly Met Val Asn Arg Glu Val Leu Asp Gln Val Glu Arg Gly Tyr Arg465                 470                 475                 480Met Pro Cys Pro Pro Glu Cys Pro Glu Ser Leu His Asp Leu Met Cys

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530<210>4<211>2187<212>DNA<213>人<220><221>基因<222>(1)..(2187)<223>人c-SRC-cDNA<220><221>CDS<222>(134)..(1483)<400>4gcgccgcgtc ccgcaggccg tgatgccgcc cgcgcggagg tggcccggac cgcagtgccc 60caagagagct ctaatggtac caagtgacag gttggcttta ctgtgactcg gggacgccag 120agctcctgag aag atg tca gca ata cag gcc gcc tgg cca tcc ggt aca     169

           Met Ser Ala Ile Gln Ala Ala Trp Pro Ser Gly Thr

             1               5                  10gaa tgt att gcc aag tac aac ttc cac ggc act gcc gag cag gac ctg   217Glu Cys Ile Ala Lys Tyr Asn Phe His Gly Thr Ala Glu Gln Asp Leu

     15                  20                  25ccc ttc tgc aaa gga gac gtg ctc acc att gtg gcc gtc acc aag gac   265Pro Phe Cys Lys Gly Asp Val Leu Thr Ile Val Ala Val Thr Lys Asp

 30                  35                  40ccc aac tgg tac aaa gcc aaa aac aag gtg ggc cgt gag ggc atc atc   313Pro Asn Trp Tyr Lys Ala Lys Asn Lys Val Gly Arg Glu Gly Ile Ile45                  50                  55                  60cca gcc aac tac gtc cag aag cgg gag ggc gtg aag gcg ggt acc aaa   361Pro Ala Asn Tyr Val Gln Lys Arg Glu Gly Val Lys Ala Gly Thr Lys

             65                  70                  75ctc agc ctc atg cct tgg ttc cac ggc aag atc aca cgg gag cag gct   409Leu Ser Leu Met Pro Trp Phe His Gly Lys Ile Thr Arg Glu Gln Ala

         80                  85                  90gag cgg ctt ctg tac ccg ccg gag aca ggc ctg ttc ctg gtg cgg gag   457Glu Arg Leu Leu Tyr Pro Pro Glu Thr Gly Leu Phe Leu Val Arg Glu

     95                 100                 105agc acc aac tac ccc gga gac tac acg ctg tgc gtg agc tgc gac ggc   505Ser Thr Asn Tyr Pro Gly Asp Tyr Thr Leu Cys Val Ser Cys Asp Gly

110                 115                 120aag gtg gag cac tac cgc atc atg tac cat gcc agc aag ctc agc atc   553Lys Val Glu His Tyr Arg Ile Met Tyr His Ala Ser Lys Leu Ser Ile125                 130                 135                 140gac gag gag gtg tac ttt gag aac ctc atg cag ctg gtg gag cac tac   601Asp Glu Glu Val Tyr Phe Glu Asn Leu Met Gln Leu Val Glu His Tyr

            145                 150                 155acc tca gac gca gat gga ctc tgt acg cgc ctc att aaa cca aag gtc   649Thr Ser Asp Ala Asp Gly Leu Cys Thr Arg Leu Ile Lys Pro Lys Val

        160                 165                 170atg gag ggc aca gtg gcg gcc cag gat gag ttc tac cgc agc ggc tgg   697Met Glu Gly Thr Val Ala Ala Gln Asp Glu Phe Tyr Arg Ser Gly Trp

    175                 180                 185gcc ctg aac atg aag gag ctg aag ctg ctg cag acc atc ggg aag ggg   745Ala Leu Asn Met Lys Glu Leu Lys Leu Leu Gln Thr Ile Gly Lys Gly

190                 195                 200gag ttc gga gac gtg atg ctg ggc gat tac cga ggg aac aaa gtc gcc   793Glu Phe Gly Asp Val Met Leu Gly Asp Tyr Arg Gly Asn Lys Val Ala205                 210                 215                 220gtc aag tgc att aag aac gac gcc act gcc cag gcc ttc ctg gct gaa   841Val Lys Cys Ile Lys Asn Asp Ala Thr Ala Gln Ala Phe Leu Ala Glu

            225                 230                 235gcc tca gtc atg acg caa ctg cgg cat agc aac ctg gtg cag ctc ctg   889Ala Ser Val Met Thr Gln Leu Arg His Ser Asn Leu Vel Gln Leu Leu

        240                 245                 250ggc gtg atc gty gag gag aag ggc ggg ctc tac atc gtc act gag tac   937Gly Val Ile Val Glu Glu Lys Gly Gly Leu Tyr Ile Val Thr Glu Tyr

    255                 260                 265atg gcc aag ggg agc ctt gtg gac tac ctg cgg tct agg ggt cgg tca   985Met Ala Lys Gly Ser Leu Val Asp Tyr Leu Arg Ser Arg Gly Arg Ser

270                 275                 280gtg ctg ggc gga gac tgt ctc ctc aag ttc tcg cta gat gtc tgc gag   1033Val Leu Gly Gly Asp Cys Leu Leu Lys Phe Ser Leu Asp Val Cys Glu285                 290                 295                 300gcc atg gaa tac ctg gag ggc aac aat ttc gtg cat cga gac ctg gct   1081Ala Met Glu Tyr Leu Glu Gly Asn Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala

            305                 310                 315gcc cgc aat gtg ctg gtg tct gag gac aac gtg gcc aag gtc agc gac   1129Ala Arg Asn Val Leu Val Ser Glu Asp Asn Val Ala Lys Val Ser Asp

        320                 325                 330ttt ggt ctc acc aag gag gcg tcc agc acc cag gac acg ggc aag ctg   1177Phe Gly Leu Thr Lys Glu Ala Ser Ser Thr Gln Asp Thr Gly Lys Leu

    335                 340                 345cca gtc aag tgg aca gcc cct gag gcc ctg aga gag aag aaa ttc tcc   1225Pro Val Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ala Leu Arg Glu Lys Lys Phe Ser

350                 355                 360act aag tct gac gtg tgg agt ttc gga atc ctt ctc tgg gaa atc tac   1273Thr Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile Tyr365                 370                 375                 380tcc ttt ggg cga gtg cct tat cca aga att ccc ctg aag gac gtc gtc   1321Ser Phe Gly Arg Val Pro Tyr Pro Arg Ile Pro Leu Lys Asp Val Val

            385                 390                 395cct cgg gtg gag aag ggc tac aag atg gat gcc ccc gac ggc tgc ccg   1369Pro Arg Val Glu Lys Gly Tyr Lys Met Asp Ala Pro Asp Gly Cys Pro

        400                 405                 410ccc gca gtc tat gaa gtc atg aag aac tgc tgg cac ctg gac gcc gcc   1417Pro Ala Val Tyr Glu Val Met Lys Asn Cys Trp His Leu Asp Ala Ala

    415                 420                 425atg cgg ccc tcc ttc cta cag ctc cga gag cag ctt gag cac atc aaa    1465Met Arg Pro Ser Phe Leu Gln Leu Arg Glu Gln Leu Glu His Ile Lys

430                 435                 440acc cac gag ctg cac ctg tgacggctgg cctccgcctg ggtcatgggc            1513Thr His Glu Leu His Leu445                 450ctgtggggac tgaacctgga agatcatgga cctggtgccc ctgctcactg ggcccgagcc 1573tgaactgagc cccagcgggc tggcgggcct ttttcctgcg tcccagcctg cacccctccg 1633gccccgtctc tcttggaccc acctgtgggg cctggggagc ccactgaggg gccagggagg 1693aaggaggcca cggagcggga ggcagcgccc caccacgtcg ggcttccctg gcctcccgcc 1753actcgccttc ttagagtttt attcctttcc ttttttgaga ttttttttcc gtgtgtttat 1813tttttattat ttttcaagat aaggagaaag aaagtaccca gcaaatgggc attttacaag 1873aagtacgaat cttatttttc ctgtcctgcc cgtgagggtg ggggggaccg ggcccctctc 1933tagggacccc tcgccccagc ctcattcccc attctgtgtc ccatgtcccg tgtctcctcg 1993gtcgccccgt gtttgcgctt gaccatgttg cactgtttgc atgcgcccga ggcagacgtc 2053tgtcaggggc ttggatttcg tgtgccgctg ccacccgccc acccgccttg tgagatggaa 2113ttgtaataaa ccacgccatg aggacaccgc cgcccgcctc ggcgcttcct ccaccgaaaa 2173aaaaaaaaaa aaaa                                                   2187<210>5<211>450<212>PRT<213>人<400>5Met Ser Ala Ile Gln Ala Ala Trp Pro Ser Gly Thr Glu Cys Ile Ala1               5                  10                  15Lys Tyr Asn Phe His Gly Thr Ala Glu Gln Aap Leu Pro Phe Cys Lys

         20                  25                  30Gly Asp Val Leu Thr Ile Val Ala Val Thr Lys Asp Pro Asn Trp Tyr

     35                  40                  45Lys Ala Lys Asn Lys Val Gly Arg Glu Gly Ile Ile Pro Ala Asn Tyr

 50                  55                  60Val Gln Lys Arg Glu Gly Val Lys Ala Gly Thr Lys Leu Ser Leu Net65                  70                  75                  80Pro Trp Phe His Gly Lys Ile Thr Arg Glu Gln Ala Glu Arg Leu Leu

             85                  90                  95Tyr Pro Pro Glu Thr Gly Leu Phe Leu Val Arg Glu Ser Thr Asn Tyr

        100                 105                 110Pro Gly Asp Tyr Thr Leu Cys Val Ser Cys Asp Gly Lys Val Glu His

    115                 120                 125Tyr Arg Ile Met Tyr His Ala Ser Lys Leu Ser Ile Asp Glu Glu Val

130                 135                 140Tyr Phe Glu Asn Leu Met Gln Leu Val Glu His Tyr Thr Sar Asp Ala145                 150                 155                 160Asp Gly Leu Cys Thr Arg Leu Ile Lys Pro Lys Val Met Glu Gly Thr

            165                 170                 175Val Ala Ala Gln Asp Glu Phe Tyr Arg Ser Gly Trp Ala Leu Asn Met

        180                 185                 190Lys Glu Leu Lys Leu Leu Gln Thr Ile Gly Lys Gly Glu Phe Gly Asp

    195                 200             205Val Met Leu Gly Asp Tyr Arg Gly Asn Lys Val Ala Val Lys Cys Ile

210                 215                 220Lys Asn Asp Ala Thr Ala Gln Ala Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Net225                 230                 235                 240Thr Gln Leu Arg His Ser Asn Leu Val Gln Leu Leu Gly Val Ile Val

            245                 250                 255Glu Glu Lys Gly Gly Leu Tyr Ile Val Thr Glu Tyr Met Ala Lys Gly

        260                 265                 270Ser Leu Val Asp Tyr Leu Arg Ser Arg Gly Arg Ser Val Leu Gly Gly

    275                 280                 285Asp Cys Leu Leu Lys Phe Ser Leu Asp Val Cys Glu Ala Met Glu Tyr

290                 295                 300Leu Glu Gly Asn Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val305                 310                 315                 320Leu Val Ser Glu Asp Asn Val Ala Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Thr

            325                 330                 335Lys Glu Ala Ser Ser Thr Gln Asp Thr Gly Lys Leu Pro Val Lys Trp

        340                 345                 350Thr Ala Pro Glu Ala Leu Arg Glu Lys Lys Phe Ser Thr Lys Ser Asp

    355                 360                 365Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile Tyr Ser Phe Gly Arg

370                 375                 380Val Pro Tyr Pro Arg Ile Pro Leu Lys Asp Val Val Pro Arg Val Glu385                 390                 395                 400Lys Gly Tyr Lys Met Asp Ala Pro Asp Gly Cys Pro Pro Ala Val Tyr

            405                 410                 415Glu Val Met Lys Asn Cys Trp His Leu Asp Ala Ala Met Arg Pro Ser

        420                 425                 430Phe Leu Gln Leu Arg Glu Gln Leu GLu His Ile Lys Thr His Glu Leu

    435                 440                 445His Leu

450<210>6<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：9E10-myc表位标记<400>6Val Asp Met Glu Gln Lys Leu Ile Ala Glu Glu Asp Leu Asn1               5                  10

Claims (38)

1．一种包括包装物质和所述包装物质中含有的药物组合物的制品，其中所述的药物组合物能够在组织中调制与疾病状况相关的血管生成；其中所述的包装物质带有一种可指示将所述的药物组合物通过调制血管生成用于治疗疾病的标记；且其中所述的药物组合物含有Src蛋白质或具有能够表达所述蛋白质的核苷酸序列的寡核苷酸。

2．权利要求1的制品，其中所述的Src蛋白质是一种活性Src蛋白质且所述的调制强化血管生成。

3．权利要求2的制品，其中所述的活性Src蛋白质是SrcA。

4．权利要求2的制品，其中所述的组织具有不良的循环。

5．权利要求1的制品，其中所述的酪氨酸激酶Src蛋白质是一种失活的Src蛋白质且所述的调制抑制血管生成。

6．权利要求5的制品，其中所述的失活的Src蛋白质是Src251或Src K295M。

7．权利要求5的制品，其中所述的组织是炎症组织且所述的疾病是关节炎或类风湿性关节炎。

8．权利要求5的制品，其中所述的组织是一种实体肿瘤或实体转移瘤。

9．权利要求8的制品，其中将所述的给药步骤与化疗共同进行。

10．权利要求5的制品，其中所述的组织是视网膜组织且所述的疾病是视网膜病、糖尿病性视网膜病或黄斑变性。

11．权利要求5的制品，其中所述的组织位于冠状血管成形术的部位且所述的疾病是再狭窄。

12．权利要求1的制品，其中所述的给药包括静脉内、经皮、滑膜内、肌内或口服给药。

13．权利要求1的制品，其中所述的给药包括静脉内给予单一剂量。

14．权利要求1的制品，其中所述的药物组合物进一步含有一种脂质体。

15．权利要求1的制品，其中所述的药物组合物含有能够表达所述核苷酸序列的病毒表达载体。

16．权利要求1的制品，其中所述的药物组合物含有能够表达所述核苷酸序列的非病毒表达载体。

17．一种用于在组织中调制与疾病状况相关的血管生成的方法，该方法包括对所述的组织给予药物组合物的步骤，该组合物含有Src蛋白质或能够表达所述蛋白质的核苷酸序列。

18．权利要求17的方法，其中所述的Src蛋白质是活性Src蛋白质且所述的调制强化血管生成。

19．权利要求18的方法，其中所述的活性Src蛋白质是SrcA。

20．权利要求18的方法，其中所述的组织具有不良的循环。

21．权利要求17的方法，其中所述的Src蛋白质是失活的Src蛋白质且所述的调制抑制血管生成。

22．权利要求21的方法，其中所述的失活的Src蛋白质是Src251或Src K295M。

23．权利要求21的方法，其中所述的组织是炎症组织且所述的疾病是关节炎或类风湿性关节炎。

24．权利要求21的方法，其中所述的组织是一种实体肿瘤或实体转移瘤。

25．权利要求24的方法，其中将所述的给药步骤与化疗共同进行。

26．权利要求21的方法，其中所述的组织是视网膜组织且所述的疾病是视网膜病、糖尿病性视网膜病或黄斑变性。

27．权利要求21的方法，其中所述的组织位于冠状血管成形术的部位且所述的组织有再狭窄的危险。

28．权利要求17的方法，其中所述的给药包括静脉内、经皮、滑膜内、肌内或口服给药。

29．权利要求17的方法，其中所述的给药包括静脉内给予单一剂量。

30．权利要求17的方法，其中所述的药物组合物进一步含有一种脂质体。

31．权利要求17的方法，其中所述的药物组合物含有能够表达所述核苷酸序列的逆转录病毒表达载体。

32．权利要求17的方法，其中所述的药物组合物含有能够表达所述核苷酸序列的非病毒表达载体。

33．一种用于在靶哺乳动物组织中刺激血管生成的药物组合物，它包括含有核酸的病毒基因转移载体和药物上可接受的载体或赋形剂；所述的核酸具有编码src蛋白质的核酸片段，所述的src蛋白质在527位密码子上带有除酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸外的任意氨基酸残基。

34．一种用于在靶哺乳动物组织中刺激血管生成的药物组合物，它包括含有核酸的非病毒基因转移载体和药物上可接受的载体或赋形剂；所述的核酸具有编码src蛋白质的核酸片段且所述的src蛋白质在527位密码子上带有除酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸外的任意氨基酸残基。

35．一种用于在靶哺乳动物组织中抑制血管生成的药物组合物，它包括含有核酸的病毒基因转移载体和药物上可接受的载体或赋形剂；所述的核酸具有编码不具有激活性的src蛋白质的核酸片段。

36．一种用于在靶哺乳动物组织中抑制血管生成的药物组合物，它包括含有核酸的非病毒基因转移载体和药物上可接受的载体或赋形剂；所述的核酸具有编码src蛋白质的核酸片段，所述的src蛋白质不具有激酶活性。

37．一种用于在靶哺乳动物组织中刺激血管生成的药物组合物，它在药物上可接受的载体或赋形剂中含有治疗量的src蛋白质；所述的src蛋白质在527位密码子上带有除酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸外的任意氨基酸残基。

38．一种用于在靶哺乳动物组织中抑制血管生成的药物组合物，它在药物上可接受的载体或赋形剂中含有src蛋白质；所述的src蛋白质不具有激酶活性。

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