KR20010085261A - 티로신 키나제 Ｓｒｃ를 사용하는, 맥관형성의 조절에유용한 방법 및 조성물 - Google Patents
티로신 키나제 Ｓｒｃ를 사용하는, 맥관형성의 조절에유용한 방법 및 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20010085261A KR20010085261A KR1020007013490A KR20007013490A KR20010085261A KR 20010085261 A KR20010085261 A KR 20010085261A KR 1020007013490 A KR1020007013490 A KR 1020007013490A KR 20007013490 A KR20007013490 A KR 20007013490A KR 20010085261 A KR20010085261 A KR 20010085261A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- src
- angiogenesis
- tissue
- protein
- product
- Prior art date
Links
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 title claims abstract description 156
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 94
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 34
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 title claims description 9
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 title description 5
- 101150001535 SRC gene Proteins 0.000 claims abstract description 198
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 34
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 claims abstract description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 96
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 77
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 76
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 43
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 41
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 34
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 17
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 15
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 13
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 13
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 10
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 10
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 9
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 claims description 9
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 9
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 8
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 7
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 6
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 5
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 claims description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 5
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 5
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000007887 coronary angioplasty Methods 0.000 claims description 3
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 claims 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 94
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 51
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 45
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 40
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 38
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 37
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 37
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 33
- 108060006706 SRC Proteins 0.000 description 29
- 102000001332 SRC Human genes 0.000 description 29
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 24
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 22
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 21
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 20
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 20
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 20
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 20
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 19
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 18
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 17
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 17
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 17
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 16
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 16
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 15
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 14
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 14
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 13
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 12
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 12
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 11
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 11
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 238000000021 kinase assay Methods 0.000 description 8
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 8
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 8
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 7
- 101100058944 Gallus gallus CALM gene Proteins 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 7
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 7
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 7
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 7
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 6
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 6
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 6
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 6
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000000172 Medulloblastoma Diseases 0.000 description 5
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 5
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 4
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 4
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 4
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 4
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 4
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 4
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 4
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 4
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 3
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 3
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 3
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 108700026239 src Genes Proteins 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N Cortisone acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)CC2=O ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N 0.000 description 2
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 102000000424 Matrix Metalloproteinase 2 Human genes 0.000 description 2
- 108010016165 Matrix Metalloproteinase 2 Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 102000038008 SrcA subfamily Human genes 0.000 description 2
- 108091008119 SrcA subfamily Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108010048673 Vitronectin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 201000009378 breast hemangioma Diseases 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 2
- 229960003290 cortisone acetate Drugs 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- VLCYCQAOQCDTCN-UHFFFAOYSA-N eflornithine Chemical compound NCCCC(N)(C(F)F)C(O)=O VLCYCQAOQCDTCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 2
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000006884 regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 2
- QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N (2R)-2-hydroxy-2-phenylacetic acid Chemical compound O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1.O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1 QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N 0.000 description 1
- MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 2-(ethylamino)ethanol Chemical compound CCNCCO MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- 101150094949 APRT gene Proteins 0.000 description 1
- 108010024223 Adenine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029457 Adenine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 241000713842 Avian sarcoma virus Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N DDT Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C(C(Cl)(Cl)Cl)C1=CC=C(Cl)C=C1 YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 102100029217 High affinity cationic amino acid transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000773083 Homo sapiens 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000633751 Homo sapiens High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100321817 Human parvovirus B19 (strain HV) 7.5K gene Proteins 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical group 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- VVNCNSJFMMFHPL-GSVOUGTGSA-N L-penicillamine Chemical compound CC(C)(S)[C@H](N)C(O)=O VVNCNSJFMMFHPL-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 101100261636 Methanothermobacter marburgensis (strain ATCC BAA-927 / DSM 2133 / JCM 14651 / NBRC 100331 / OCM 82 / Marburg) trpB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701029 Murid betaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102000004211 Platelet factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000778 Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N R-2-phenyl-2-hydroxyacetic acid Natural products OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JOOSFXXMIOXKAZ-UHFFFAOYSA-H [Au+3].[Au+3].[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O Chemical compound [Au+3].[Au+3].[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O JOOSFXXMIOXKAZ-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004252 chorionic villi Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010226 confocal imaging Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- -1 cottonseed oil Chemical compound 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 230000001517 counterregulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000437 effect on angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- AEOCXXJPGCBFJA-UHFFFAOYSA-N ethionamide Chemical compound CCC1=CC(C(N)=S)=CC=N1 AEOCXXJPGCBFJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 235000014413 iron hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L iron(ii) hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Fe+2] NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960002510 mandelic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N nebularine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC=C2N=C1 MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000008196 pharmacological composition Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000002212 purine nucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004233 retinal vasculature Effects 0.000 description 1
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000998 shell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101150081616 trpB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150111232 trpB-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000000626 ureter Anatomy 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Hematology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 Src 단백질, 변형된 Src 단백질, 및 이들을 암호화하는 핵산을 사용하여 조직내에서 맥관형성을 조절하는 방법을 기술한다. 특히, 본 발명은 불활성 Src 단백질, 또는 이를 암호화하는 핵산을 사용하여 맥관형성을 억제하거나, 활성 Src 단백질, 또는 이를 암호화하는 핵산을 사용하여 맥관형성을 증강시키는 방법을 기술한다. 또한, 본 발명은 Src 단백질을 암호화하는 핵산, 또는 이의 변형된 형태를 제공하기 위한 유전자 전달 시스템의 용도를 기술한다.
Description
관련 특허 문헌
본원은 1998년 5월 29일자로 출원된 미국 가특허원 제60/087,220호를 우선권으로 주장하며, 이의 전체 내용이 본원에서 인용된다.
맥관형성은 새로이 발달하는 혈관의 조직으로의 성장을 포함하는 조직의 맥관화 과정이며, 이는 또한 맥관신생이라고도 한다. 이 과정은 내피세포 및 평활근 세포로의 침윤에 의해 매개된다. 이 과정은 맥관이 이미 존재하는 맥관으로부터 성장하거나, 맥관의 신생 발달이 전구체 세포(맥관형성)으로부터 발생하거나, 존재하는 소형 맥관의 직경이 확장되는 것과 같은 3가지 경로 중 어느 하나에 의해 진행되는 것으로 믿어진다[참고문헌: Blood et al.,Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990)].
맥관형성은 신생 성장에 있어 중요한 과정이나, 상처 치유, 및 조직 염증, 관절염, 종양 증식, 당뇨성 망막증, 망막의 맥관신생에 의한 반점 변성 등을 포함한 다수의 임상 질환의 발병에도 관여된다. 맥관형성과 관련된 이러한 임상 징후들을 맥관형성 질환이라고 한다[참고문헌: Folkman et al.,Science, 235:442-447 (1987)]. 맥관형성은 일반적으로 성숙하거나 완전히 성숙한 조직에는 없으며, 상처 치유 및 황체 성장 주기 중에 나타난다[참고문헌: Moses et al.,Science, 248:1408-1410 (1990)].
맥관형성의 억제가 종양 증식을 억제하는 치료에 유용한 것으로 제시되었다. 맥관형성의 억제는, (1) bFGF(염기성 섬유아세포 증식 인자)와 같은 "맥관형성 분자"의 방출 억제, (2) 예를 들어, 항-βbFGF 항체의 사용에 의한 맥관형성 분자의 중화, (3) 비트로넥틴 수용체 αvβ3의 억제제의 사용, 및 (4) 맥관형성 촉진에 대한 내피 세포 반응의 억제에 의해 제안되었다. 이러한 후자의 방법은 주목을 받았고, 문헌[참고문헌: Folkman et al.,Cancer Biology, 3:89-96 (1992)]에는 여러 내피 세포 반응 억제제, 예를 들면 콜라겐아제 억제제, 기저막 교체 억제제, 맥관억제 스테로이드, 진균-유래된 맥관형성 억제제, 혈소판 인자 4, 크롬보스폰딘, 관절염 약제(예: D-페니실린아민 및 골드 티오말레이트), 비타민 D3동족체, 알파-인터페론, 및 기타 맥관형성을 억제할 수 있는 것들이 기술되어 있다. 추가로, 맥관형성의 억제제가 제안되었다[참고문헌: Blood et al.,Bioch. Biophys. Acta., 1032:89-118 (1990), Ingber et al.,Lab. Invest., 59:44-51 (1998), 및 미국 특허 제5,092,885호, 제5,112,946호, 제5,192,744호, 제5,202,352호, 제5,753,230호 및 제5,766,591호]. 전술한 참고문헌에 기술된 맥관형성 억제제의 어떤 것도 Src 단백질을 포함하지 않는다.
맥관형성이 발생하기 위해서는, 일차적으로, 종양 세포의 침입과 전이체 형성에 사용되는 방법과 유사하게, 내피 세포가 분해되어야 하고 혈관 기저막이 교차되어야 한다.
맥관형성이 맥관 인테그린과 세포외 매트릭스 단백질 사이의 상호작용에 의존한다는 것이 이미 보고되었다[참고문헌: Brooks et al.,Science, 264:569-571 (1994)]. 또한, 맥관형성성 맥관 세포의 프로그래밍된 세포 사멸(아폽토시스(apoptosis))이 상기와 같은 상호작용에 의해 개시되고, 이는 맥관 인테그린 αvβ3의 특정 길항제에 의해 억제된다는 것이 보고되었다[참고문헌: Brooks et al.,Cell, 79:1157-1164 (1994)]. 보다 최근에는, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2)가 비트로넥틴 수용체(αvβ5)에 결합하는 것을 αvβ5길항제를 사용하여 억제할 수 있으므로, 프로테이나제의 효소 기능을 억제할 수 있다는 것이 보고되었다[참고문헌: Brooks et al.,Cell, 85:683-693 (1996)].
발명의 요약
본 발명은 티로신 키나제 Src(일반적으로, 본원에서는 Src로도 또한 지칭됨)에 의한 조직내 맥관형성의 조절에 관한 것이다.
질환과 관련된 조직내 맥관형성을 조절하기 위한 조성물 및 방법도 고려된다. 맥관형성-조절량의 Src 단백질을 포함하는 조성물을, 맥관형성의 조절에 반응하는 질환을 치료하고자 하는 조직에 투여한다. Src 단백질을 제공하는 조성물은 정제된 단백질, 생물학적 활성 단편, 재조합에 의해 생성된 Src 단백질 또는 이의 단백질 단편 또는 융합 단백질, 또는 Src 단백질 발현용 유전자/핵산 발현 벡터를 함유할 수 있다.
Src 단백질이 불활성화되거나 억제되는 경우, 맥관형성의 억제가 조절된다. Src 단백질이 활성형이거나 활성화되는 경우, 맥관형성의 강화가 조절된다.
치료할 조직은 맥관형성의 조절이 바람직한 임의의 조직일 수 있다. 맥관형성 억제의 경우, 유해한 맥관신생이 발생하는 질환의 조직을 치료하는 것이 유용하다. 조직의 예로는 염증성 조직, 충실성 종양, 전이체, 재협착증의 조직 등이 포함된다.
증강작용의 경우, 당뇨병 또는 기타 질환으로부터 사지에서 순환이 저조한 허혈성 사지를 갖는 환자를 치료하는 것이 유용하다. 치유되지 않아, 맥관 세포의 증식 및 맥관신생이 유리할 수 있는 만성 상처를 보유하는 환자도 마차가지로 치료될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 변형된 아미노산 서열을 함유하는 Src 단백질을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 특히 유용한 몇몇 변형된 Src 단백질 및 이의 발현이 본원에 기술되어 있다.
또한, 본 발명은, 코돈 527에 티로신, 세린 또는 트레오닌을 제외한 임의의 아미노산을 포함하는 Src 단백질을 암호화하는 핵산 단편을 갖는 핵산을 함유하는 바이러스 또는 비-바이러스 유전자 전달 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는, 표적 포유동물 조직에서 맥관형성을 촉진시키기 위한 약제학적 조성물을 포함한다.
키나제 활성을 갖지 않는 Src 단백질을 암호화하는 핵산 단편을 갖는 핵산을 함유하는 바이러스 또는 비-바이러스 유전자 전달 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는, 표적 포유동물 조직에서 맥관형성을 억제하기 위한 약제학적 조성물도 또한 고려된다.
본 발명은 일반적으로 의학에 관한 것이고, 구체적으로는, 단백질인 티로신 키나제 Src, Src의 변이체, 및 이들을 암호화하는 핵산을 사용하는, 조직의 맥관형성 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일부를 구성하는 도면에서:
도 1은 인트론이 결실된 완전한 암호화 서열인, 닭 c-Src의 cDNA 서열이다[참고문헌: Takeya et al.,Cell, 32:881-890 (1983)]. 이 서열은 GenBank 수탁번호 제J00844호로서 입수가능하다. 이 서열은 뉴클레오타이드 위치 112에서 개시되어 뉴클레오타이드 위치 1713에서 종결되는 단백질 암호화 영역을 갖는 1759개의 뉴클레오타이드를 함유한다.
도 2는 도 1에 도시된 암호화 서열의 닭 c-Src의 암호화된 아미노산 잔기 서열이다.
도 3은 문헌[참고문헌: Braeuninger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:10411-1415 (1991)]에 처음으로 기술된 사람 c-Src의 cDNA 서열이다. 이 서열은 이 서열은 GenBank 수탁번호 제X59932 X71157호로서 입수가능하다. 이 서열은 뉴클레오타이드 위치 134에서 개시되어 뉴클레오타이드 위치 1486에서 종결되는 단백질 암호화 영역을 갖는 2187개의 뉴클레오타이드를 함유한다.
도 4는 도 3에 도시된 암호화 서열의 사람 c-Src의 암호화된 아미노산 잔기 서열이다.
도 5는 실시예 4에 기술된 바와 같은 bFGF 또는 VEGF에 의한 내인성 Src의 활성화를 도시한다. 도면의 상부는, bFGF 또는 VEGF에 의한 내인성 Src의 배수 활성화를 나타내는 시험관내 키나제 분석의 결과를 나타낸다. 도면의 하부는, 등가의 Src 및 IgG 함량에 대한 로딩 대조군으로서 항-Src 항체로 프로빙한 키나제 검정 블롯이다.
도 6은, 실시예 4에 기술된 바와 같이 닭 융모요막(CAM)에서 맥관형성에 미치는 c-Src A의 레트로바이러스-매개된 유전자 발현의 영향을 도시한다. 9일령 닭의 CAM을, RCAS-Src A(활성 돌연변이형 c-Src) 또는 대조군 RCAP-GFP(녹색 형광 단백질; 형광성 지시 단백질) 레트로바이러스 또는 완충액에 72시간 동안 노출시킨다. 맥관형성의 수준이 도 6A에 도시된 바와 같이 정량화되어 있고, 도 6B에는 입체현미경으로 찍은 각각의 처리에 대응하는 대표적 현미경사진(4x)이 도시되어 있다.
도 7은 맥관 MAP 키나제 포스포릴화를 활성화 중의 c-Src A의 레트로바이러스 발현을 도시한다. 도 7A는 VEGF 또는 PMA에 30분 동안 노출되거나, c-Src A 레트로바이러스로 48시간 동안 감염시킨 10일령 닭의 CAM의 조직 추출물을 도시한다. NT는 비처리를 의미한다. Src를 등량의 전체 단백질 추출물로부터 면역침전시키고, FAK-GST 융합 단백질을 기질로서 사용하여 시험관내 면역 복합체 키나제 검정을 수행하고, 전기영동시키고, 니트로셀룰로즈로 이송시킨다. 상기 완전한 조직 용해물의 분액을, 항-포스포-ERK 항체를 사용하는 면역블롯팅을 통해 내인성 ERK 포스포릴화에 대해 측정한다. 도 7B는 SRC A를 함유하는 RCAS 또는 모의 RCAS로 감염시킨 10일령 CAM을 도시한다. 2일 후, CAM을 절개하여, OCT 중에 동결보관한 다음, 4㎛로 절단한다. 단편을 항-포스포릴화 ERK 항체(New England Biolabs)로 면역염색하고, 세척한 후, 염소 항-토끼 FITC-접합된 제2 항체로 검출한다. 형광 상을 냉각-CCD 카메라(Princeton Inst) 상에 포착한다.
도 8은, VEGF-유도된 맥관형성 동안의 Src 활성에 대해서는 선택적이나, bFGF-유도된 맥관형성 동안의 Src 활성에 대해서는 선택적이지 않은 요건을 도시한다. 9일령 닭의 CAM을 RCAS-Src 251 또는 대조군 RCAP-GFP 레트로바이러스 또는 완충액에 20시간 동안 노출시킨 후, bFGF 또는 VEGF의 존재 또는 부재하에 72시간 동안 추가로 배양한다. 맥관형성의 수준이 상기한 바와 같이 도 8A에 정량화되어 있고, 도 8B에는 입체현미경으로 찍은 대표적 현미경사진(6x)이 도시되어 있다. 도 8C는, 모의 처리와 비교된 형질감염된 세포에서 Src 251의 발현을 확인하기 위하여, 항-Src 항체로 프로빙한 블롯을 도시한다.
도 9는 사람 종양에 대한 RCAS-Src 251의 레트로바이러스 방출 결과를 도시한다. 도 9A는 Bio Rad 레이저 공초점 스캐닝 현미경(bar = 500㎛)을 사용한 광학 절단에 의해 검출되는, 종양 혈관(화살표) 중에서 배타적으로 GFP를 발현시키는 RCAS-GFP(RCAS-Green Fluorescent Protein)로 감염된 사람 수아종 종양 단편을 나타내는 현미경 사진이다. 도 9B는 3 내지 6일 동안 증식시킨 다음, 절제하고, 습윤 중량을 측정한, 레티노바이러스의 국소 적용을 사용하여 치료된 종양으로부터의 데이터를 나타낸다. 데이터는 2개의 복제물의 종양 중량의 평균 변화율(50mg의 종양 출발 중량으로부터) +/- SEM을 나타낸다. 도 9C는 배아로부터 외과적으로 제거된 수아종 종양의 현미경 사진을 나타낸다(bar = 350㎛). 하위 패널은 각각의 종양의 맥관계를 자세하게 나타내는 각각의 종양의 고배율 상이다(bar = 350㎛). 화살표는 RCAS-Src 251-치료된 종양내의 혈관 파괴를 나타낸다.
도 10은 RCASBP(RCAS) 벡터 작제물의 제한 효소 지도를 설명하는 다이아그램이다.
A.정의
아미노산 잔기: 아미노산은 이의 펩타이드 연결부에서 폴리펩타이드의 화학적 절단(가수분해)시 형성된다. 본원에서 기술된 아미노산 잔기는 바람직하게는 "L" 이성체 형태이다. 그러나, "D" 이성체 형태의 잔기는 폴리펩타이드에 의해 목적하는 작용 특성이 유지되는 한, 모든 L-아미노산 잔기 대신 치환될 수 있다. NH2는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노 그룹을 나타낸다. COOH는 표준 폴리펩타이드 명명법을 사용하여 기록된 폴리펩타이드의 카복시 말단에 존재하는 유리 카복시 그룹을 나타낸다[참고문헌:J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) 및 37 CFR §1.822(b)(2)에서 채택].
본원에서 화학식에 의해 표현되는 모든 아미노산 잔기 서열의 좌측 및 우측 배향은 아미노-말단 내지 카복시-말단의 통상적인 방향이다. 또한, 아미노산 잔기 서열의 시작 또는 끝의 대시 기호(-)는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가 서열에 결합되는 펩타이드를 나타낸다.
폴리펩타이드: α-아미노 그룹과 인접한 아미노산 잔기의 카복시 그룹 사이의 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 아미노산 잔기들의 선형 배열을 나타낸다.
펩타이드: 폴리펩타이드내에서 서로 결합된 약 50개 이하의 아미노산 잔기의 선형 배열을 나타낸다.
사이클릭 펩타이드: 젼형적인 펩타이드 중에 몇개의 아미드 결합을 포함하는 환 구조를 갖는 화합물을 나타낸다. 사이클릭 펩타이드는 호모데틱(homodetic) 사이클릭 펩타이드이거나, 디설파이드 가교, 락탐 가교, 티오에스테르, 티오아미드, 구아니디노 등과 같은 연결에 의해 폐환된 환 중에 헤테로데틱 환 구조를 함유할 수 있다.
단백질: 폴리펩타이드내에서 서로 연결된 50개 이상의 아미노산 잔기의 선형배열을 나타낸다.
융합 단백질: 전형적인 펩타이드 결합에 의해 작용적으로 연결된(융합된) 2개 이상의 상이한 폴리펩타이드 도메인을 함유하는 폴리펩타이드를 나타내며, 여기서, 2개의 도메인은 자연적으로 융합되지 않는 펩타이드에 상응한다.
합성 펩타이드: 자연적으로 발생하는 단백질 및 이의 단편이 유리된 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기의 화학적으로 생성된 쇄를 나타낸다.
B.일반적인 고찰
본 발명은 일반적으로, 맥관형성이 티로신 키나제 Src 단백질에 의해 매개되며, 맥관형성이 각각 맥관형성을 증강시키거나 억제하기 위한 활성 또는 불활성 Src 단백질을 제공함으로써 조절될 수 있다는 발견에 관한 것이다.
이러한 발견은 맥관형성, 즉 새로운 혈관의 형성이 다양한 질환 진행에서 작용하는 역할로 인해 중요하다. 질환과 관련된 조직이 조직 증식을 위해 맥관형성을 필요로 하는 경우, 맥관형성을 억제하여, 질환에 걸린 조직 증식을 억제하는 것이 바람직하다. 상처를 입은 조직이 조직 성장 및 치유를 위해 맥관형성을 필요로 하는 경우, 맥관형성을 증강시키거나 촉진시켜, 조직 치유 및 증식을 촉진시키는 것이 바람직하다.
새로운 혈관의 성장은, 질환 조직과 관련된 병리학에서, 질환의 해로운 효과를 감소시키는 맥관형성의 억제 원인이 되거나 또는 기여한다. 맥관형성의 억제에 의해, 질환에 개입하여, 징후를 개선하며, 때로 질환을 치료할 수 있다.
맥관형성의 억제 조절에 의해 이익을 얻는 질환 및 맥관신생과 관련된 조직의 예는 류마티스성 관절염, 당뇨성 망막증, 염증성 질환, 재발협착증 등을 포함하는 하다. 해로운 조직의 증식을 지지하기 위해 요구되는 신혈관의 성장에서, 맥관형성의 억제는 조직으로 공급되는 혈액을 감소시켜, 혈액 공급 요구를 기본으로 하는 조직의 질량을 감소시키는데 기여한다. 종양의 증식을 포함하는 예에서, 신맥관형성은 종양을 몇 밀리미터 이상의 두께로 증식시키고, 충실성 종양 전이를 확립하기 위해 끊임없이 요구한다.
조직의 치유에 기여하는 새로운 혈관의 성장에서, 맥관형성의 증강은 치유를 돕는다. 당뇨병 또는 기타 증상으로부터 사지의 부족한 혈액순환인 허혈성 사지를 갖는 환자의 치료가 포함된다. 또한, 치유되지 않는 만성 외상을 가져, 혈관 세포 성장 및 맥관신생의 증가에 의해 유리할 수 있는 환자에 대한 치료가 고려된다.
본 발명의 방법은 치료법이 기타 생물학적 공정이 아닌 맥관형성에 대해 매우 선택적이므로, 부분적으로 효과적이다.
상기 기술된 바와 같이, 맥관형성은 "성장", 맥관형성, 또는 혈관 확장을 포함하는 조직의 맥관신생과 관련된 다양한 과정을 포함하며, 모든 맥관형성 과정은 Src 단백질에 의해 수행된다. 외상 치유, 황체 형성 및 배아 형성을 제외하고는, 대부분의 맥관형성 과정은 질환 과정과 관련된다. 따라서, 본 발명의 치료 방법은 질환에 선택적이며, 유해한 부작용이 없다.
C.Src 단백질
본 발명에 사용되는 티로신 키나제 Src 단백질은 사용 목적에 따라 다양할 수 있다. 용어 "Src 단백질" 또는 "Src"는 본원에 기재된 활성 또는 불활성 형태인 다양한 형태의 티로신 키나제 Src 단백질을 언급하는데 사용된다.
"활성 Src 단백질"은 맥관형성을 증강시키는 Src 단백질의 임의의 다양한 형태를 지칭한다. 맥관형성의 강화작용의 측정의 검정이 본원에 기재되어 있지만, 이로써 한정 해석되어서는 안된다. 단백질은 맥관형성의 수준이 검정 시스템에 어떠한 Src도 첨가되지 않는 대조군 수준보다 10% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상인 경우에 활성이라고 간주된다. 증강작용 측정에 바람직한 검정은 맥관형성 지수가 분지점을 카운팅함으로써 계산되는 실시예에 기술된 바와 같은 RCAS 바이러스 벡터를 사용하는 CAM 검정이다. 바람직한 활성 Src 단백질은 티로신 키나제 활성을 또한 나타낸다. 예시적인 활성 Src 단백질이 실시예에 기재되어 있으며, Src-A가 포함된다.
"불활성 Src 단백질"은 맥관형성을 억제하는 Src 단백질의 임의의 다양한 형태를 지칭한다. 맥관형성의 억제작용 측정을 위한 검정은 본원에 기재되어 있지만, 이로써 한정 해석되어서는 안된다. 단백질은 맥관형성의 수준이 검정 시스템에 어떠한 외인성 Src도 첨가되지 않는 대조군 수준보다 10% 이하, 바람직하게는 25% 이하, 보다 바람직하게는 50% 이하인 경우에 불활성이라고 간주된다. 억제작용 측정의 바람직한 분석은 맥관형성 지수가 분지점을 카운팅함으로써 계산되는 실시예에 기술된 바와 같은 RCAS 바이러스 벡터를 사용하는 CAM 분석이다. 바람직한 불활성 Src 단백질은 감소된 티로신 키나제 활성을 또한 나타낸다. 예시적인 불활성 Src 단백질이 실시예에 기재되어 있으며, Src-251이 포함된다.
본 발명에서 유용한 Src 단백질은 조직을 포함한 천연 공급원으로부터의 분리, 재조합 DNA 발현 및 정제에 의한 생산 등을 포함하는 각종 방법으로 제조할 수 있다. 또한, Src 단백질은 조직내에서 단백질을 발현시키는 목적하는 조직에 유전자 요법 시스템을 도입시킴으로써 "동일 반응계내에서" 제공할 수도 있다.
Src 단백질의 유전자 암호화는 당해 기술 분야의 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있지만, 본 발명은 이로써 한정 해석되지 않는다. 예를 들면, Src의 천연 유래는 포유동물, 조류, 바이러스 및 기타 종으로부터의 다양한 상동체를 포함한다고 익히 공지되어 있으며, 유전자는 단백질을 발현시키는 임의의 조직으로부터 cDNA 클로닝 방법을 사용하여 용이하게 클로닝시킬 수 있다. 본 발명에 사용되는 바람직한 Src는 c-Src로 명명되는 포유동물 또는 조류의 상동체와 같은 세포성 단백질이다. 사람 c-Src가 특히 바람직하다.
D.Src 단백질의 발현을 위한 재조합 DNA 분자 및 발현 시스템
본 발명은 본 발명에 특별히 사용되는 수개의 뉴클레오타이드 서열을 기술한다. 이러한 서열은 본 발명에서 유용한 Src 단백질, 및 다양한 DNA 단편, 재조합 DNA(rDNA) 분자 및 Src 단백질의 발현용으로 작제된 벡터를 암호화하는 서열을 포함한다.
따라서, 본 발명의 DNA 분자(단편)는 완전 구조 유전자, 구조 유전자의 단편, 및 본원에 추가로 기재된 전사 단위를 암호화하는 서열을 포함한다.
바람직한 DNA 단편은 본원에 기재된 Src 단백질, 또는 이들의 생물학적 활성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다.
바람직한 c-Src의 아미노산 잔기 서열 및 뉴클레오타이드 서열이 실시예에 기재되어 있다.
바람직한 DNA 단편은 바람직하게는 본원에 기재된 Src 단백질에 상응하는 아미노산 잔기 서열 또는 이들의 분획으로 필수적으로 이루어지며, 이들과 실질적으로 동일한 아미노산 잔기 서열을 암호화한다. 대표적인 바람직한 DNA 단편이 실시예에 추가로 기재되어 있다.
단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 서열은 유전자 암호를 통하여 단백질을 암호화하는 구조 유전자의 데옥시리보핵산(DNA) 서열에 직접 정합된다. 따라서, 구조 유전자 또는 DNA 단편은 아미노산 잔기 서열, 즉, 이것이 암호화하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 기초로 하여 한정될 수 있다.
유전자 암호의 중요하고 익히 공지된 특징은 이의 중복성이다. 즉, 단백질을 제조하는데 사용되는 대부분의 아미노산의 경우에, 하나 이상의 암호화 뉴클레오타이드 트리플렛(코돈)이 특정한 아미노산 잔기를 암호화시키거나 명시할 수 있다. 따라서, 다수의 상이한 뉴클레오타이드 서열은 특정한 아미노산 잔기 서열을 암호화할 수 있다. 이와 같은 뉴클레오타이드 서열은 이들이 모든 유기체내에서 동일한 아미노산 잔기 서열을 생성시킬 수 있기 때문에 기능적으로 동일한 것으로 간주된다. 종종, 퓨린 또는 피리미딘의 메틸화 변이체가 제공된 뉴클레오타이드 서열에 혼입될 수 있다. 그러나, 이와 같은 메틸화는 어떠한 방식으로든 암호화관계에 영향을 미치지 않는다.
핵산이 폴리데옥시리보뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드, 즉, RNA 또는 DNA, 또는 이들의 유사체이건 아니건, 이는 임의의 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 단편이다. 바람직한 양태에서, 비록 특정한 분자 생물학적 방법론에 있어서는, 일본쇄 DNA 또는 RNA가 바람직하다고 해도, 핵산 분자는 중복 DNA의 단편, 즉, DNA 단편 형태이다.
DNA 단편은 화학적 합성법 및 재조합 방법을 포함하는 다수의 수단에 의해, 바람직하게는 클로닝 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 제조한다. Src 단백질의 분획을 암호화하는 DNA 단편은, 예를 들면, 포스포트리에스테르 방법[참고문헌: Matteucci et al.,J. Am. Chem. Soc., 103:3158-3191, 1981]과 같은 화학적 방식 또는 자동화 합성 방법에 의해 용이하게 합성할 수 있다. 또한, 보다 큰 DNA 단편은 DNA 단편을 한정하고, 이어서 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화 및 연결에 의해 완전한 단편을 구축하는 올리고뉴클레오타이드 그룹의 합성과 같은 익히 공지된 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 또 다른 방법은 Src 단백질을 암호화하는 성분을 함유하는 것으로 여겨지는 cDNA 라이브러리 상에서 사용된 올리고뉴클레오타이드 프라어머의 한쌍을 사용하는 PCR에 의한 바람직한 DNA 단편의 분리방법을 포함한다
물론, 화학적 합성을 통해, 천연 아미노산 잔기 서열을 암호화하는 염기를 적합한 염기로 교체함으로써 임의의 목적하는 변형을 간단히 달성할 수 있다. 이 방법은 익히 공지되어 있으며, 본원에 기재된 다양하고 상이한 "변형된" Src 단백질의 제조에 용이하게 적용시킬 수 있다.
또한, 본질적으로 Src 단백질을 암호화하는 구조 유전자로 이루어진 DNA 단편은 후속적으로 부위-지시되거나 랜덤한 돌연변이 유발에 의해 변형되어 임의의 목적하는 치환을 도입시킬 수 있다.
1.Src 유전자의 클로닝
Src 유전자는 게놈 DNA 또는 메신저 RNA(mRNA)의 적합한 공급원으로부터 다양한 생화학적 방법에 의해 클로닝시킬 수 있다. 이러한 유전자의 클로닝은 실시예에 기재되고, 당해 기술 분야에 공지된 일반적 방법에 따라 수행할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 Src 유전자를 클로닝시키기 위한 핵산의 공급원은 이러한 단백질을 발현시키는 것으로 여겨지는 조직으로부터, cDNA 라이브러리 형태의 게놈 DNA 또는 메신저 RNA(mRNA)를 포함할 수 있다. 바람직한 조직은 사람 폐 조직이며, 임의의 다른 적합한 조직을 사용할 수도 있다.
바람직한 클로닝 방법은 표준 방법을 이용하며, 본원에 기재된 뉴클레오타이드를 기초로 하는 짝지워진 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 Src-암호화 뉴클레오타이드 서열을 분리하는 cDNA 라이브러리의 제조법을 포함한다. 또는, 목적하는 cDNA 클론을 본원에 기재된 핵산 서열을 기초로하는 하이브리드화 프로브를 이용하는 통상의 핵산 하이브리드화 방법에 의해 cDNA 또는 유전자 라이브러리로부터 동정 분리할 수 있다. 적합한 Src 암호화 핵산을 분리하고 클로닝시키는 기타 방법은 당해 기술 분야의 숙련가에게는 용이하게 명백한 것이다.
2.발현 벡터
Src 단백질을 암호화하는 DNA 단편을 함유하는 재조합 DNA 분자(rDNA)는 본원에 기재된 바에 따라 제조할 수 있다. 특히, 발현가능한 rDNA는 벡터를 Src 암호화 DNA 단편에 작동적으로(프레임내에, 발현적으로) 연결시킴으로써 제조할 수 있다. 이와 같이, 재조합 DNA 분자는 전적으로 통상적으로는 동시에 발견될 수 없는, 뉴클레오타이드 서열 중 2개 이상의 핵산을 포함하는 하이브리드 DNA 분자이다.
DVA 단편이 작동적으로 연결되는 벡터의 선택은, 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있는 바와 같이, 직접적으로 목적하는 기능적 특성, 예를 들어 단백질 발현 및 형질변환시킬 숙주 세포에 따라 좌우된다. 본 발명을 수행하는데 사용하기에 적합한 벡터는 적어도 작동적으로 연결되는 벡터 DNA 단편에 포함되는 구조 유전자의 복제, 및 바람직하게는 또한 발현을 지시할 수 있다.
원핵 및 진핵 발현 벡터 둘 다는 벡터 작제 기술 분야의 통상의 숙련가에게 익히 공지되어 있으며, 문헌[참고문헌: Ausebel et al.,Current Prorocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York (1993) 및 Sambrook et al.,Molecular Clonging: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)]에 기재되어 있다. 이들 참고문헌은 또한 본원에서 언급되는 다수의 일반적인 재조합 DNA 방법을 기술하고 있다.
특정 양태에서, 적합한 벡터는 원핵 레플리콘, 즉, 세균성 숙주 세포와 같은 원핵 숙주 세포내에서 염색체외 형질전환된 재조합 DNA 분자를 직접 자가 복제하고 유지하는 능력을 갖는 DNA 서열을 포함한다. 이러한 레플리콘은 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있다. 또한, 원핵 레플리콘을 포함하는 상기한 양태는 또한 발현되어 형질전환되는 세균성 숙주에 약물 내성을 부여하는 유전자를 포함한다. 통상적인 세균성 약물 내성 유전자는 암피실린 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하는 것들이다.
원핵 레플리콘을 포함하는 벡터들은 또한 형질전환된, 이. 콜라이(E. coli)와 같은 세균성 숙주 세포내에서 구조 유전자의 발현(전사 및 해독)을 지시할 수 있는 원핵 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 RNA 폴리머라제의 결합과 전사를 야기시키는 DNA 서열에 의해 형성되는 발현 제어 인자이다. 세균성 숙주와 적합성인 프로모터 서열은 전형적으로 본 발명의 DNA 단편을 삽입하기에 적합한 제한 부위를 함유하는 플라스미드 벡터내에 제공한다. 전형적인 상기 벡터 플라스미드는 pUC8, pUC9, pBR322 및 pBR329(공급원: Biorad Laboratories; 캘리포니아주 리치몬드 소재), pRSET(공급원: Invitrogen; 캘리포니아주 샌디에고 소재) 및 pPL 및 pKK223(공급원: Pharmacia; 뉴저지주 피스카타웨이 소재)이다.
진핵 세포와 적합성인 발현 벡터, 바람직하게는 척추동물 세포와 적합성인 발현 벡터는 또한 본 발명의 재조합 DNA 분자를 형성하는데 사용할 수 있다. 진핵 세포 발현 벡터는 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있고, 다수의 상업적인 공급원으로부터 시판되고 있다. 전형적으로는, 목적하는 DNA 단편을 삽입하기에 적합한제한 부위를 함유하는 상기한 벡터가 제공된다. 전형적인 상기한 벡터는 pSVL 및 pKSV-10(공급원: Pharmacia), pBPV-I/pML2d(공급원: International Biotechnologies, Inc.), pTDT1(ATCC, #31255), pRc/CMV(공급원: Invitrogen, Inc.), 당해 실시예에서 기술된 바람직한 벡터 및 유사한 진핵 발현 벡터이다.
본원 발명의 관점에서 유전자 발현을 위해 특히 바람직한 시스템은 유전자 전달 성분, 즉 유전자를 목적하는 조직에 유전자를 전달하는 능력을 포함한다. 적합한 벡터는 목적하는 단백질을 발현시키고 예비선택된 표적 조직을 감염시키는 특징을 갖도록 작제된 DNA 바이러스, 아데노바이러스 또는 레트로바이러스와 같은 "전염성" 벡터이다. 본원에서 기술된 조류의 육종 바이러스(RCAS)에 대응 능력이 있는 복제물이 특히 바람직하다.
재조합 바이러스 또는 바이러스 성분을 직접 발현에 사용하는 포유동물 세포 시스템을 작제할 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 발현 벡터를 사용할 경우, 폴리펩타이드의 암호화 서열은 아데노바이러스 전사/해독 제어 복합체, 예를 들어, 레이트 프로모터 및 3분절계 리더 서열에 연결시킬 수 있다. 이어서, 이러한 키메라 유전자는 아데노바이러스 게놈에 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 삽입할 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수적인 영역(예: 영역 E1 또는 E3)에 삽입시키면, 생육가능하고 감염된 숙주내에서 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 재조합 바이러스를 유도한다[참고문헌: Logan et al.,Proc. Natl. Sci., USA, 81:3655-3659 (1984)]. 또한, 우두 바이러스 7.5K 프로모터를 사용할 수 있다[참고문헌: Mackett et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79:7415-7419 (1982); Mackett etal.,J. Virol., 49:857-864 (1984); Panicali et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 79:4927-4931 (1982)]. 염색체외 인자로서 복제하는 능력을 갖는 소 유두종 바이러스를 기본으로 하는 벡터가 특히 관심의 대상이다[참고문헌: Sarver et al.,Mol. Cell. Biol., 1:486 (1981)]. 표적 세포내로 이러한 DNA를 삽입한 직후, 플라스미드를 세포당 약 100 내지 200 복사체로 복제한다. 삽입된 cDNA의 전사는 플라스미드의 숙주 염색체내로의 삽입을 필요로 하지 않으므로, 높은 수준의 발현을 수득한다. 이러한 벡터를, 플라스미드내에서 선택가능한 마커, 예를 들어,neo유전자를 포함함으로써 안정한 발현에 사용할 수 있다. 또는, 레트로바이러스 게놈은 숙주 세포내에서 폴리펩타이드-암호화 뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도하고 지시할 수 있는 벡터로서 사용하기 위해 개질시킬 수 있다[참고문헌: Cone et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA,81:6349-6353 (1984)]. 높은 수준의 발현은 또한 이에 한정되지는 않지만, 메탈로티오닌 IIA 프로모터 및 열-쇽 프로모터를 포함하는 유도가능한 프로모터를 사용하여 달성할 수 있다.
최근에, 사람 난소암을 보유하는 누드 마우스에 대한 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 대 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터-유도된 티미딘 키나제(TK) 유전자 요법의 장시간 존속을 연구되어 왔다. 아데노바이러스-매개된 CMV 프로모터-유도된 단순 포진 바이러스 TK 유전자 요법의 세포 사멸 효능은 RSV 유도된 요법보다 2 내지 10배 더 효과적인 것으로 밝혀졌다[참고문헌: Tong et al., 1999,Hybridoma18(1):93-97]. 유도가능한 고수준 발현에 따르는 저수준 발현이라 불리는 유전자 요법 적용을 위한 키메라 프로모터의 디자인이 또한 기술되어 있다[참고문헌: Suzuki et al., 1996,Human Gene Therapy7:1883-1893].
재조합 단백질의 장시간 고수율 제조를 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 숙주 세포는, 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 사용하기 보다는 적합한 발현 제어 인자(예: 프로모터 및 인핸서 서열, 전사 터미네이터, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택가능한 마커를 사용하여 형질전환시킬 수 있다. 상기한 바와 같이, 재조합 플라스미드내에서 선택가능한 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 이들의 염색체내에 안정하게 삽입하도록 하며, 성장하여 또한 세포주내로 클로닝되어 확대될 수 있는 병소를 형성한다.
예를 들어, 외래 DNA의 도입에 따라서, 조작된 세포는 증강시킨 매질내에서 1 내지 2일 동안 성장시킨 다음, 선택성 매질에 스위칭시킨다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 각각 tk-, hgprt-또는 aprt-세포에 사용될 수 있는, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제[참고문헌: Wigler et al.,Cell, 11:223 (1977)], 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제[참고문헌: Szybalska et al,Proc. Natl. Acad., Sci., USA, 48:2026 (1962)] 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제[참고문헌: Lowy et al.,Cell, 22:817 (1980)] 유전자를 포함하는 다수의 선택 시스템을 사용할 수 있다. 또한, 항대사산물 내성 부여 유전자, 예를 들어, 메토트렉세이트에 내성을 부여하는 dhfr[참고문헌: Wigler et al.,Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 77:3567 (1980); O'Hare er al.,Proc. Natl. Acad., Sci., USA, 78:1527 (1981)];마이코페놀산에 내성을 부여하는 gpt[참고문헌: Mulligan et al.,Proc. Natl. Acad., Sci., USA, 78:2072 (1981)]; 아미노글리코사이드 G-418에 내성을 부여하는 neo[참고문헌: Colberre-Garapin et al.,J. Mol. Biol., 150:1 (1981)] 및 하이드로마이신에 내성을 부여하는 hygro[참고문헌: Santerre et al.,Gene, 30:147 (1984)]에 대한 유전자를 선택 기준으로서 사용할 수 있다. 최근에, 추가의 선택가능한 유전자, 즉 세포가 트립토판 대신에 인돌을 사용하도록 하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 사용하도록 하는 hisD[참고문헌: Hartman et al.,Proc. Natl. Acad., Sci., USA, 85:804 (1988)]; 및 오르니틴 디카복실라제 억제제에 내성을 부여하는 ODC(오르니틴 디카복실라제), 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO[참고문헌: McConlogue L., Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed., (1987)]이 기술되어 있다.
사람 유전자 요법을 위해 고려되는 주요 벡터는 레트로바이러스 기원으로부터 유래된다[참고문헌: Wilson, 1997,Clin. Exp. Immunol.107(Sup. I):31-32; Bank et al., 1996,Bioessavs18(12):999-1007; Robbins et al., 1998,Pharmacol. Ther.80(1):35-47]. 유전자 전이 및 안티센스 치료의 치료학적 잠재력은 각종 조직을 치료하기 위한 다수의 벡터 시스템 개발을 자극한다[참고문헌: vasculature, Stephan et al., 1997,Fundam. Clin. Pharmacol.11(2):97-110; Feldman et al., 1997,Cardiovasc. Res.35(3):391-404; Vassalli et al., 1997,Cardiovasc. Res.35(3):459-69; Baek et al., 1998,Circ. Res.82(3):295-305; kidney, Lien et al., 1997,Kidney Int. Suppl.61:S85-8; liver, Ferry et al.,1998,Hum Gene Ther.9(14):1975-81; muscle, Marshall et al., 1998,Curr. Opn. Genet. Dev.8(3):360-5]. 이들 조직 이외에, 사람 유전자 요법의 중요한 표적은 암, 종양 자체 또는 관련 조직이다[참고문헌: Runnebaum, 1997,Anticancer Res.17(4B):2887-90; Spear et al., 1998,J. Neurovirol.4(2):133-47].
본 발명의 방법에 사용하기 위해서 용이하게 적용가능한 바이러스 유전자 요법 벡터 시스템의 특정 예를 다음에 간단히 기재한다. 레트로바이러스 유전자 전달이 최근에 특히 조류 백혈증 바이러스(ALV) 레트로바이러스계[참고문헌: Federspiel et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:4931 (1996); Federspiel et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:11241 (1994)]가 기재되어 있는 문헌[참고문헌: Federspiel 및 Hughes, 1998,Methods in Cell Biol.52:179-214]에 의해 검토되었다. ALV 및 쥐 백혈병 바이러스(MLV)를 포함하는 레트로바이러스 벡터가 스보보다(Svoboda)에 의해 추가로 기재되었다[참고문헌: 1998,Gene206:153-163].
개질된 레트로바이러스/아데노바이러스 발현 시스템은 본 발명의 방법의 수행을 위해서 쉽게 적합화시킬 수 있다. 예를 들면, 쥐 백혈병 바이러스(MLV) 시스템이 카라바나스(Karavanas) 등에 의해 검토되었다[참고문헌: 1998,Crit. Rev. in Oncology/Hematology28:7-30]. 아데노바이러스 발현 시스템은 본 세게른(Von Seggern)과 네메로우(Nemerow)에 의해 검토되었다[참고문헌:Gene Expression Systems(ed. Fernandez & Hoeffler, Academic Press, San Diego, CA, 1999, chapter 5, pages 112-157)].
단백질 발현 시스템은 생체내 및 시험관내 둘다에서 효과적으로 사용되는 것으로 입증되었다. 예를 들면, 단순 포진 바이러스(HSV) 1형 암플리콘 벡터에 의한 사람의 판상 세포 암종으로의 유효한 유전자 전이가 기재되어 있다[참고문헌: Carew et al., 1998,Am. J. Surg.176:404-408]. 단순 포진 바이러스는 신경계로의 유전자 전이에 사용된다[참고문헌: Goins et al., 1997,J. Neurovirol, 3 (Sup. 1):S80-8]. HSV-TK를 사용하는 표적된 자살 벡터를 충실성 종양에 대해 시험한다[참고문헌: Smiley et al., 1997,Hum. Gene Ther.8(8):965-77]. 단순 포진 바이러스 1형 벡터는 결장 암종 세포에 대한 암 유전자 요법에 사용된다[참고문헌: Yoon et al., 1998,Ann. Surg.228(3):366-74]. 하이브리드 벡터가 개발되어, 간세포를 치료하기 위한 HSV/AAV(아데노-관련 바이러스) 하이브리드를 포함하는 형질감염 시간의 길이를 연장시킨다[참고문헌: Fraefel et al., 1997,Mol. Med.3(12):813-825].
백신 바이러스가 이의 대형 게놈으로 인해 사람 유전자 요법을 위해 개발되었다[참고문헌: Peplinski et al., 1998,Surg. Oncol. Clin. N. Am.7(3):575-88]. 퓨린 뉴클레오사이드 피로포스포릴라제를 발현시키는 티미딘 키나제-결실된 백신 바이러스가 종양 지시된 유전자 요법 벡터로서 사용되는 것으로 기재되어 있다[참고문헌: Puhlman et al., 1999,Human Gene Therapy10:649-657].
아데노-관련 바이러스 2(AAV)는 사람 유전자 요법에 사용하는 것으로 기재되어 있지만, AAV는 포유동물 세포내에서의 최적 복제 및 팩키징을 위해서 헬퍼 바이러스(예: 아데노바이러스 또는 포진 바이러스)를 필요로 한다[참고문헌: Snoeck et al., 1997,Exp. Nephrol.5(6):514-20; Rabinowitz et al., 1998,Curr. Opn.Biotechnol.9(5):470-5]. 그러나, 감염성 재조합 AAV의 시험관내 팩키징이 당해 시스템을 훨씬 보다 유망하게 만드는 것으로 기재되어 있다[참고문헌: Ding et al., 1997,Gene Therapy4:1167-1172]. 에코트로픽 레트로바이러스 수용체 cDNA의 AAV 매개된 전이가 정립되고 근본적인 사람 세포의 에코트로픽 레트로바이러스의 형질도입을 허용하는 것으로 제시되어 있다[참고문헌: Qing et al., 1997,J. Virology71(7):5663-5667]. 사람 야생형 p53을 발현시키는 AAV 벡터를 사용하는 암 유전자 요법이 입증되어 있다[참고문헌: Qazilbash et al., 1997,Gene Therapy4:675-682]. AAV 벡터를 사용한 맥관 세포로의 유전자 전이가 또한 제시되어 있다[참고문헌: Maeda et al., 1997,Cardiovascular Res.35:514-521]. AAV는 간 지시된 유전자 요법에 적합한 벡터인 것으로 입증되어 있다[참고문헌: Xiao et al., 1998,J. Virol.72(12):10222-6]. AAV 벡터는 뇌 조직 및 중추 신경계의 유전자 요법에 대한 사용이 입증되어 있다[참고문헌: Chamberlin et al., 1998,Brain Res.793(1-2):169-75; During et al., 1998,Gene Therapy5(6):820-7]. AAV 벡터는 또한 폐의 유전자 요법 및 사람 낭포성섬유증 상피 세포로의 전이에 있어서 아데노바이러스 벡터(AdV)와 비교되어 있다[참고문헌: Teramoto et al., 1998,J. Virol.72(11):8904-12].
키메라 AdV/레트로바이러스 유전자 요법 벡터 시스템은 각각의 바이러스의 유용한 특성을 도입하여 비통합 AdV를 생성시키고, 이는 레트로바이러스 생산자 세포의 중간체 생성을 통해 작용을 통합하도록 한다[참고문헌: Feng et al., 1997,Nat. Biotechnology15(9):866-70; Bilbao et al., 1997,FASEB J11(8):624-34].이러한 유전자 요법 벡터의 강력한 신규 생성을 표적 암 유전자 요법을 위해 적합화시킨다[참고문헌: Bilbao et al., 1998,Adv. Ecp. Med. Biol.451:365-74]. p53을 발현시키는 AdV를 단일 주사하면 사람 전립선 암 세포의 피하 종양 소결절의 성장이 억제된다[참고문헌: Asgari et al., 1997,Int. J. Cancer71(3):377-82]. 진전된 비-소형 세포 폐암을 앓는 환자의 야생형 p53의 AdV 매개된 유전자 전이가 기재되어 있다[참고문헌: Schuler et al., 1998,Human Gene Therapy9:2075-2082]. 이러한 동일한 암은 AdV 벡터에 의해 매개된 p53 유전자 대체 요법의 대상이다[참고문헌: Roth et al., 1998,Semin. Oncol.25(3 Suppl 8):33-7]. p53의 AdV 매개된 유전자 전이는 내피 세포 변이 및 생체내 맥관형성을 억제한다[참고문헌: Riccioni et al., 1998,Gene Ther.5(6):747-54]. 전이성 흑색종에 대한 면역요법으로서 흑색종 항원 gp75의 아데노바이러스 매개된 발현이 또한 기재되어 있다[참고문헌: Hirschowitz et al., 1998,Gene Therapy5:975-983]. AdV는 에코트로픽 레트로바이러스와 함께 사람 세포의 감염을 촉진시키고 레트로바이러스 감염의 유효성을 증가시킨다[참고문헌: Scott-Taylor, et al., 1998,Gene Ther.5(5):621-9]. AdV 벡터는 혈관 평활근 세포[참고문헌: Li et al., 1997,Chin. Med. J.(Engl)110(12):950-4], 판상 세포 암종 세포[참고문헌: Goebel et al., 1998,Otolarynol Head Neck Surg119(4):331-6], 식도암 세포[참고문헌: Senmaru et al., 1998,Int J. Cancer78(3):366-71], 맥관막 세포[참고문헌: Nahman et al., 1998,J. Investig. Med.46(5):204-9], 신경교 세포[참고문헌: Chen et al., 1998,Cancer Res.58(16):3504-7] 및 동물의 관절[참고문헌: Ikeda et al., 1998,J. Rheumatol.25(9):1666-73]로의 유전자 전이에 사용된다. 보다 최근, AcV 벡터에 의해 매개된 카테테르-기재 심막 유전자 전이가 입증되어 있다[참고문헌: March et al., 1999,Clin. Cardiol.22(1 Suppl 1):I23-9]. AdV 시스템을 적합한 제어 유전자 인자로 조작함으로써, 생체내에서의 AdV-매개된 조절가능한 표적 유전자 발현이 가능해진다[참고문헌: Burcin et al., 1999,PNAS (USA)96(2):355-60].
신드비스 바이러스 및 셈리키 포레스트 바이러스 유도된 벡터와 함께 사용하기에 적합한 발현 카세트를 사용한 형질전환에 적합한 팩키징 세포주를 갖는 알파바이러스 벡터가 사람 유전자 요법용으로 개발되었다[참고문헌: Polo et al., 1999,Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:4598-4603]. 비세포변성 플라비바이러스 리플리콘 RNA계 시스템이 또한 개발되었다[참고문헌: Varnavski et al., 1999,Virology255(2):366-75]. 신비스 바이러스 벡터를 함유하는 자살 HSV-TK 유전자는 종양 세포에 대한 세포 특이성 표적용으로 사용된다[참고문헌: Iijima et al., 1998,Int. J. Cancer80(1):110-8].
사람 포말 바이러스(HFV)를 기본으로 하는 레트로바이러스 벡터는 또한 유전자 요법 벡터로서의 가능성을 보여준다[참고문헌: Trobridge et al., 1998,Human Gene Therapy9:2517-2525]. 포말 바이러스 벡터는 자살 유전자 요법을 위해 고안되었다[참고문헌: Nestler et al., 1997,Gene Ther.4(11):1270-7]. 재조합 뮤린 사이토메갈로바이러스 및 프로모터 시스템이 또한 높은 발현을 위한 벡터로서 사용되었다[참고문헌: Manning et al., 1998,J. Virol. Meth.73(1):31-9; Tong et al., 1998,Hybridoma18(1):93-7].
비-분열 세포로의 유전자 전달은 센다이 바이러스계 벡터의 생성에 의해 실행가능하게 되었다[참고문헌: Nakanishi et al., 1998,J. Controlled Release54(1):61-8].
비-분열 체세포의 형질전환을 가능하도록 하는 또 다른 노력으로 렌티바이러스 벡터가 개발되었다. 복제-결함 사람 면역결핍 바이러스(HIV)계 벡터를 사용하는 낭종성 섬유증의 유전자 요법이 기재되어 있다[참고문헌: Goldman et al., 1997,Human Gene Therapy8:2261-2268]. 렌티바이러스 벡터에 의해 간과 근육으로 전달된 유전자의 지속된 발현이 또한 기재되어 있다[참고문헌: Kafri et al., 1997,Nat. Genet.17(3):314-7]. 그러나, 안전에 대한 우려가 우세하여, 향상된 벡터 개발이 급속히 진행되고 있다[참고문헌: Kim et al., 1998,J. Virol.72(2):994-1004]. HIV, LTR 및 Tat의 조사로 개발되고 있는 벡터의 게놈 조직에 대한 중요한 정보를 수득한다[참고문헌: Sadaie et al., 1998,J. Med. Virol.54(2):118-28]. 이와 같이, 효과적인 HIV계 벡터에 대한 유전자 요건이 현재 충분히 파악되어 있다[참고문헌: Gasmi et al., 1999,J. Virol.73(3):1828-34]. 자가 불활성화 벡터, 또는 조건부 팩키징 세포주가 기재되어 있다[참고문헌: Zuffery et al., 1998,J. Virol.72(12):9873-80; Miyoshi et al., 1998,J. Virol.72(10):8150-7; Dull et al., 1998,J. Virol.72(11):8463-71; 및 Kaul et al., 1998,Virology249(1):167-74]. HIV 벡터에 의한 사람 임파구와 CD34+ 세포의 효율적인 형질도입이 제시되어 있다[참고문헌: Douglas et al., 1999,Hum. Gene Ther.10(6):935-45; Miyoshi et al.,1999.Science283(5402):682-6]. 고양이 면역결핍 바이러스(FIV) 렌티바이러스 벡터에 의한 비-분열 사람 세포의 효율적인 형질도입이 기재되어 있고, 이는 HIV를 기본으로 하는 벡터를 사용하여 안전에 대한 우려를 최소화한다[참고문헌: Poeschla et al.,1998,Nature Medicine4(3):354-357]. FIV 벡터에 의한 사람 혈액 단핵세포의 생산형 감염이 제시되어 있다[참고문헌: Johnston et al., 1999,J. Virol.73(3):2491-8].
다수의 바이러스 벡터가 처리하기 힘들고, 삽입된 DNA에 대한 용량이 제한되면서, 이러한 제한 및 결점이 제기되어 왔다. 예를 들면, 단순화된 바이러스 팩키징된 세포주 이외에, 사람 포진 바이러스, 단순 포진 바이러스 1형(HSV-1) 및 엡슈타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스(EBV)로부터 유도된 미니-바이러스 벡터가 개발되어, 유전 물질의 조작 및 바이러스 벡터의 생성을 단순화시켰다[참고문헌: Wang et al., 1996,J. Virology70(12):8422-8430]. 이전에, 어댑터 플라스미드가 헬퍼-독립적 레트로바이러스 벡터로의 외부 DNA의 삽입을 단순화하는 것으로 제시되었다[참고문헌: 1987,J. Virology61(10):3004-3012].
바이러스 벡터는 유전자 요법을 수행하는 유일한 수단은 아니며, 몇가지 비-바이러스 벡터가 또한 기재되어 있다. 표피 성장 인자/DNA 폴리플렉스(EGF/DNA)의 사용을 기본으로 한 표적화된 비-바이러스 유전자 전달 벡터는 효과적이고 특이적으로 유전자를 전달하는 것으로 제시되어 있다[참고문헌: Cristiano. 1998,Anticancer Res.18:3241-3246]. 맥관계 및 CNS의 유전자 요법은 양이온성 리포좀을 사용하여 입증되었다[참고문헌: Yang et al., 1997,J. Neurotrauma14(5):281-97]. 췌장염의 일시적인 유전자 요법이 또한 양이온성 리포좀을 사용하여 수행되었다[참고문헌: Denham et al., 1998,Amm. Surg.227(6):812-20]. 유전자 전달을 위한 키토산계 벡터/DNA 복합체가 효과적인 것으로 제시되어 있다[참고문헌: Erbacher et al., 1998,Pharm. Res.15(9):1332-9]. 터플렉스 시스템을 기본으로 하는 비-바이러스 DNA 전달 벡터가 기재되어 있다[참고문헌: Kim et al., 1998, 53(1-3):175-82]. 또한, 바이러스 입자 피복된 리포좀 복합체가 유전자 전달을 수행하는데 사용된다[참고문헌: Hirai et al., 1997,Biochem. Biophys. Res. Commun.241(1):112-8].
티미딘 키나제 유전자를 암호화하는 비-바이러스 T7 벡터의 직접적인 종양 주입에 의한 암 유전자 요법이 입증되어 있다[참고문헌: Chen et al., 1998,Human Gene Therapy9:729-736]. 플라스미드 DNA 제제는 직접 주입 유전자 전달에 중요하다[참고문헌: Horn et al., 1995,Hum. Gene Ther.6(5):656-73]. 개질된 플라스미드 벡터가 특히 직접 주입에 적용되었다[참고문헌: Hartikka et al., 1996,Hum. Gene Ther.7(10):1205-17].
이와 같이, 광범위한 유전자 전달/유전자 요법 벡터 및 작제물이 당해 분야에 공지되어 있다. 이들 벡터는 본 발명의 방법에서 사용하기에 용이하게 적합화된다. 재조합 DNA/분자 생물학 기술을 사용하여, 선택된 발현/전달 벡터에 조작에 의해 결합된 Src(활성 또는 불활성)을 삽입함으로써, 본 발명을 수행하기 위한 다수의 등가의 벡터를 생성시킬 수 있다.
E.맥관형성 조절 방법
본 발명은 질환 과정 또는 질환과 관련된 조직에서의 맥관형성을 조절함으로써, 맥관형성에 따라 달라지는 조직내에서의 질환에 영향을 미치는 방법을 제공한다. 일반적으로, 당해 방법은 질환 과정 또는 질환과 관련된 조직에 맥관형성-조절량의 Src 단백질 또는 활성 또는 불활성 Src를 발현시키는 핵산 벡터를 포함하는 조성물을 투여함을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 맥관형성 촉진시 혈관이 침입할 수 있는 피부, 근육, 장, 결합 조직, 관절, 골 및 기타 조직을 포함하여 임의의 다양한 조직 또는 생물 조직으로 구성된 기관이 질환에서의 맥관형성을 지지할 수 있다.
다수의 양태에서 본 발명에 따라 치료할 환자는, 비록 본 발명의 원칙에 의하면 본 발명은 용어 "환자"에 포함되도록 의도된 모든 포유동물에 대해 효과적이지만, 바람직하게는 사람이다. 본원에서, 포유동물은 맥관형성을 포함하는 질환과 관련된 조직의 치료가 바람직한 임의의 포유동물 종, 특히 농사용 및 가축 포유동물 종을 포함하는 것으로 이해된다.
따라서, 당해 방법은 본 발명의 방법을 수행할 때, Sre 단백질 또는 Src 단백질을 발현시키는 DNA 벡터를 함유하는 치료학적 유효량의 생리학적으로 허용되는 조성물을 환자에게 투여함을 포함한다.
추가로 본원에 기재된 바와 같이, Src 단백질 투여시의 투여량 범위는 당해 단백질의 형태 및 이의 효능에 따라 달라진다. 투여량은 맥관형성 및 맥관형성에 의해 매개된 질환이 개선되는 목적하는 효과가 나타내기에 충분히 다량이다. 그러나, 투여량은 부작용, 예를 들면, 과점조도 증후군, 폐부종, 울혈성 심부전증 등을일으킬 정도로 다량이어서는 안된다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 환자 질환의 중증도에 따라 달라지며, 당해 분야의 숙련가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한 투여량은 합병증의 경우 주치의가 조정할 수 있다.
치료학적 유효량은 치료할 조직내에서 측정할 수 있을 정도로 맥관형성을 조절하기에 충분한 Src 단백질 또는 (활성 또는 불활성) Src 단백질을 암호화하는 핵산의 양, 즉 맥관형성 조절량이다. 맥관형성 조절은 본원에 기재된 바와 같은 CAM 검정 또는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 기타의 방법으로 측정할 수 있다.
Src 단백질 또는 Src 단백질을 암호화하는 핵산은 주사 또는 시간에 따른 점진적인 주입에 의해 비경구 투여할 수 있다. 치료할 조직이 전형적으로 전신 투여에 의해 신체내에서 접근되어 치료학적 조성물의 정맥내 투여에 의해 매우 간혹 치료될 수 있을지라도, 기타 조직 및 전달 수단이 또한 고려된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 정맥내, 복강내, 근육내, 피하내, 내강, 경피적으로 투여할 수 있으며, 연동 수단에 의해 전달할 수 있다.
Src 단백질 또는 Src 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 치료학적 조성물은 통상적으로 정맥내 투여, 예를 들면, 단위 투여량을 주사 투여할 수 있다. 본 발명의 치료학적 조성물에 대하여 사용되는 경우, 용어 "단위 투여량"은 환자에 대한 하나의 투여량으로서 적합한 물리적으로 구별되는 단위를 의미하고, 각각의 단위는 필요한 희석제, 즉 담체 또는 비히클과 배합되어 목적하는 치료학적 효과를 나타내도록 계산된 소정량의 활성 물질을 함유한다.
바람직한 특정 양태에서, 시약은 단일 투여량을 정맥내 투여한다. 국소 투여는 직접 주사하거나, 해부학적으로 분리된 컴파트먼트를 사용하거나, 표적 조직 시스템의 미세 순환을 분리시키거나, 순환 시스템을 재관류시키거나 질환에 걸린 조직과 관련된 맥관계의 표적 영역을 카테테르를 기본으로 하여 일시적으로 흡장시켜 수행할 수 있다.
당해 조성물은 투여 제형과 양립할 수 있는 방식에 의해 치료학적 유효량으로 투여된다. 투여량과 투여 시기는 치료할 환자, 활성 성분을 이용하는 환자 시스템의 용량 및 목적하는 치료 효과 정도에 따라 달라진다. 투여하는데 필요한 활성 성분의 정확한 양은 의사 판단에 따라 달라지고, 각 개인에 따라 다르다. 그러나, 전신에 사용하기에 적합한 투여량 범위가 본원에 기재되어 있으며, 투여 경로에 따라 달라진다. 또한, 투여에 적합한 섭생도 다양하지만, 전형적으로는 초기 투여한 후, 이후의 주사 또는 다른 투여와는 한 시간 이상 간격을 두고 반복 투여한다. 또한, 생체내 치료를 조건으로 하는 범위로 혈액내 농도를 유지하기에 충분한 연속적인 정맥내 주입이 고려된다.
1.맥관형성의 억제
맥관형성의 억제는 맥관형성성 질환으로서 언급되는 다양한 질환에 있어서 중요하다. 이러한 질환은 면역 및 비-면역 염증과 같은 염증성 장애, 만성 관절성 류마티즘 및 건선, 당뇨성 망막증, 맥관신생 녹내장, 재발협착증, 아테롬성경화증 플라크내 모세혈관 성장 및 골다공증과 같은 부적절하거나 부적당한 맥관의 침입과 관련된 장애, 및 충실성 종양, 충실성 종양 전이, 혈관섬유종, 후수정체 섬유증식증, 혈관종, 카포시 육종 및 종양 성장을 지속시키는데 맥관신생을 필요로 하는 암과 같은 암 관련 장애를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
이와 같이, 질환과 관련된 조직내 맥관형성을 억제하는 방법은 질환의 증상을 약화시키고, 질환에 따라 질환을 치료하는데 기여할 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명은 질환과 관련된 조직내에서 본질적으로 맥관형성의 억제에 관한 것이다. 조직내 맥관형성의 정도 및 본 발명의 방법에 의해 성취되는 억제 정도를 다양한 방법으로 평가할 수 있다.
따라서, 관련된 양태에서, 치료할 조직은 염증을 일으킨 조직이고, 억제될 맥관형성은 염증을 일으킨 조직에서 맥관신생이 발생된, 염증 유발된 조직 맥관형성이다. 이경우에, 상기 방법은 만성 관절성 류마티즘을 앓는 환자에서의 관절성 조직, 면역 또는 비-면역 염증 유발된 조직 및 건선 조직내 맥관형성을 억제하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 관련 양태에서, 치료할 조직은 당뇨성 망막증, 황반 변성 또는 맥관신생 녹내장과 같은 망막 질환을 앓는 환자의 망막 조직이고, 억제될 맥관형성은 망막 조직의 맥관신생이 발생된 망막 조직 맥관형성이다.
또 다른 관련 양태에서, 치료할 조직은 충실성 종양, 전이, 피부암, 유방암, 혈관종 또는 혈관섬유종 및 기타 암을 앓는 환자의 종양 조직이고, 억제될 맥관형성은 종양 조직의 맥관신생이 발생된 종양 조직 맥관형성이다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 전형적인 충실성 종양 조직은 폐, 췌장, 유방, 결장, 후두 및 난소 조직을 포함한다. 종양 조직 맥관형성의 억제는 맥관신생이 종양 성장에 중요한 역할을 하기 때문에 특히 바람직한 양태이다. 종양 조직내 맥관신생이 존재하지 않는 경우, 종양 조직은 요구되는 영양물을 수득할 수 없어, 성장이 느리고 추가의 성장이 정지되어, 퇴화되고 결과적으로 괴사하여 종양이 사멸하게 된다.
즉, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 종양 맥관형성을 억제함에 의해 종양 맥관신생을 억제하는 방법을 제공한다. 유사하게, 본 발명은 맥관형성-억제 방법을 수행하여 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 방법은 (1) 전이체 형성은 전이성 암세포가 1차 종양으로부터 떨어져 나갈수 있도록 하기 위해, 1차 종양의 맥관신생을 필요로 하고, (2) 2차 부위에서 이의 확립이 전이암의 성장을 유지하기 위해 맥관신생을 요구하기 때문에, 전이체의 형성에 대해 특히 효과적이다.
관련된 양태에서, 본 발명은 충실성 종양에 대한 통상적인 화학요법과 같은 또 다른 치료법과 연계된 방법의 수행 및 전이암의 확립을 억제하기 하기 위한 방법의 수행에 관한 것이다. 맥관형성 억제제의 투여는 전형적으로 화학요법 동안이나 화학요법 후에 수행되지만, 종양 조직이 독성 공격에 응답하여 혈액 및 영양물을 종양 조직으로 공급함으로써 맥관형성이 회복되도록 유도하는 시점에서 화학요법의 섭생 후에 맥관형성을 억제하는 것이 바람직하다. 추가로, 전이에 대한 예방으로서 충실성 종양을 제거하는 수술 후에 맥관형성 억제 방법을 적용하는 것이 바람직하다.
지금까지, 본 발명의 방법은 종양의 맥관신생의 억제에 적용되었지만, 또한 본 발명의 방법은 종양 조직 성장 억제, 종양 전이체 형성의 억제 및 확립된 종양의 퇴화에 적용될 수 있다.
재발협착증은 성공적인 맥관성형술을 방해하는, 경피 트랜스루미날 관상동맥 맥관성형술 부위에서, 조직으로의 평활근 세포(SMC)의 이동 및 증식 과정이다. 재발협착증 동안에 SMC의 이동 및 증식은 본 발명의 방법에 의해 억제되는 맥관형성 과정으로서 여겨질 수 있다. 따라서, 또한 본 발명은 맥관성형술을 받은 후의 환자에서 본 발명의 방법에 따라 형관성형술을 억제함에 의해 재발협착증을 억제하는 방법에 관한 것이다. 재발 협착증의 억제를 위해, 불활성화된 티로신 키나제가 전형적으로 맥관성형술 후 투여되는데 이것은 관상 동맥 혈관벽이 전형적으로 약 2 내지 약 28일, 보다 전형적으로는 수술 후에 약 처음 14일 동안 재발협착증의 위험성이 있기 때문이다.
질환과 관련된 조직에서 맥관형성을 억제하기 위한 본 발명의 방법, 및 이어서 맥관형성 관련 질환의 치료를 위한 방법을 수행하기 위한 방법은 맥관형성이 발생되거나 발생될 위험성이 있는 조직을, 치료학적 유효량의 불활성화된 Src 단백질 또는 단백질을 발현시키는 벡터를 포함하는 조성물과 접촉시킴을 포함한다.
맥관형성의 억제 및 종양 퇴화는 치료학적 조성물과 처음 접촉시킨 후 7일 정도 빨리 발생한다. 추가로 또는 지속적으로 불활성 Src 단백질로의 노출은 7일 내지 6주가 바람직하고, 바람직하게는 약 14 내지 28일이다.
2.맥관형성의 증강
맥관형성을 촉진시키거나 증강시키는 것이 요망되는 경우에, 조직에 Src 단백질을 투여하는 것이 유용하다. 투여 경로 및 적절한 투여 시점은 상기에 기술된 억제 방법에 필적한다.
F.치료학적 조성물
본 발명의 방법은 본원에 기술된 치료학적 방법을 수행하기에 유용한 치료학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 치료학적 조성물은 활성 성분으로서 용해되어 있거나 분산되어 있는 Src 단백질 또는 본원에 기술된 바와 같은 Src 단백질을 발현시킬 수 있는 단백질과 함께 생리학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 바람직한 양태에서, 치료학적 조성물은 치료학적 목적을 위해 포유동물 또는 사람 환자에게 투여되는 경우 면역원성이 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 조성물, 담체, 희석제 및 시약을 언급하는데 있어서 용어 "약제학적으로 허용되는", "생리학적으로 허용되는" 및 이의 문법적인 변형은 상호교환적으로 사용되고, 물질이 구역질, 현기증, 구토와 같은 목적하지 않는 생리학적 효과를 나타내지 않으면서 포유동물에게 투여될 수 있다는 것을 의미한다.
용해되거나 분해되어 있는 활성 성분을 포함하는 약리학적 조성물의 제조는 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 제형화에 제한될 필요가 없다. 전형적으로는, 상기 조성물은 주사용으로서 또는 액제 또는 현탁제로서 제조되지만, 또한 사용 전에 액제에 적합한 고체 형태 또는 액체 중의 현탁제가 제조될 수 있다. 또한, 제제는 유화될 수 있거나 리포좀 조성물로서 제공될 수 있다.
활성 성분은 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 혼화될 수 있는 부형제와 본원에 기술된 치료학적 방법에 사용하기에 적합한 양으로 혼합될 수 있다. 적합한 부형제는, 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 배합물이다. 추가로, 경우에 따라, 조성물은 활성 성분의 효과를 증진시키는 습윤화제 또는 유화제, pH 완충제등과 같은 소량의 보조 물질을 함유할 수 있다.
본 발명의 치료학적 조성물은, 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 타르타르산 및 만델산과 같은 유기산과 함께 형성되는 임의의 염 형성 성분의 약제학적으로 허용되는 염(폴리펩타이드의 유리된 아미노 그룹과 함께 형성됨)을 함유한다. 유리된 카복실 그룹과 함께 형성된 염은 또한 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화철과 같은 무기염 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘 및 프로카인 등과 같은 유기염으로부터 유래될 수 있다.
활성 성분을 대한 생리학적으로 허용되는 담체는 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 액체 담체의 예는 활성 성분 및 물에 추가로 어떠한 물질을 함유하지 않거나 생리학적 pH에서 인산나트륨, 생리학적 식염수 또는 이 모두의 인산-완충된 식염수와 같은 완충액을 함유하는 멸균 수용액이다. 추가로, 수성 담체는 완충염, 및 염화나트륨 및 염화칼륨과 같은 염, 덱스트로스, 폴리에틸렌 글리콜 및 기타 용질을 하나 이상 함유할 수 있다.
액체 조성물은 또한 물이 첨가된 액상 및 물이 배제된 액상을 함유할 수 있다. 추가의 액상의 예는 글리세린, 면실유와 같은 식물성 오일 및 수중유 에멀젼이다.
치료학적 조성물은 본 발명의 맥관형성 조절량의 본 발명의 Src 단백질 또는 유효량의 Src 단백질을 발현시키는데 충분한 재조합 DNA 발현 벡터를 함유하고, 전형적으로 전체 치료학적 조성물의 중량당 0.1중량% 이상의 Src 단백질을 함유하도록 제형화된다. 중량%는 Src 단백질 대 총 조성물의 비율이다. 따라서, 예를 들어, 0.1중량%는 총 조성물 100g당 Src 단백질 0.1g이다. DNA 발현 벡터를 위해 투여되는 양은 발현 벡터의 성질, 치료될 조직의 특성에 따라 좌우된다.
G.제품
본 발명은 또한 본 발명의 Src 단백질을 제공하기 위한 라벨링된 용기인 제품을 고려한다. 제품은 치료될 질환에 대한 적당한 라벨링이 붙여진 팩키징재 및 상기 팩키징재내에 함유된 약제를 포함한다.
제품내의 약제는 Src 단백질을 제공하는데 적합하고, 기술된 지시에 따라 본원 기술된 약제학적으로 허용되는 형태로 제형화된, 본 발명의 임의의 조성물이다. 따라서, 조성물은 Src 단백질 또는 Src 단백질을 발현시킬 수 있는 DNA 분자를 포함할 수 있다. 제품은 단위 또는 다중 투여 용량으로 본원에 나타낸 증상을 치료하는데 사용하기에 충분한 양의 약제를 함유한다.
팩키징재는 이에 함유된 약제의 용도, 예를 들어, 맥관형성의 억제 또는 증강에 의해 원조되는 증상 및 본원에 기술된 증상의 치료용이라는 것을 나타내는 라벨을 포함한다. 라벨은 추가로 시판하는데 요구될 수 있는 용도 및 관련 정보에대한 지시를 포함할 수 있다. 팩키징재는 약제를 저장하기 위한 용기를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 팩키징재는 유리, 플라스틱, 종이, 호일 등 약제를 고정된 수단내에 유지시킬 수 있는 물질을 언급한다. 따라서, 예를 들어, 팩키징재는 플라스틱 또는 유리 바이알, 박층 엔벨로프 및 약제를 함유하는 약제학적 조성물이 내장되록 사용되는 기타 용기일 수 있다.
바람직한 양태에서, 팩키징재는 제품의 내용물 및 여기에 함유된 약제의 용도를 기술하는 명백한 표현으로 되어 있는 라벨을 포함한다.
본 발명에 관한 하기 실시예는 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 특정하게 제한하려고 하는 것으로 해석되지 말아야 함은 당연하다. 더욱이, 당해 기술분야의 숙련가가 이해할 수 있는 범위내에서 있을 수 있는, 현재 공지되어 있거나 후에 개발될 본 발명의 변형된 방법은 이후에 청구될 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주되어야만 한다.
1.c-Src 발현 작제물의 제조
본 발명의 방법에 의해 맥관형성을 조절하는데 유용한 발현 작제물을 제조하기 위해서, c-Src cDNA를 조작하여 발현 작제물/벡터내로 삽입시킨다.
야생형(즉, 내인성) 닭 c-Src를 암호화하는 cDNA 서열은 도 1(서열 2)에 제시하며, 암호화된 아미노산 잔기 서열은 도 2(서열 3)에 나타낸다. 암호화된 단백질 서열은 cDNA 뉴클레오타이드 112 내지 1713번 위치로부터 해독된다. 사람 c-Src cDNA(서열 4)의 핵산 서열에 상응하는 핵산 서열 및 암호화된 아미노산 잔기(서열 5) 서열은 각각 도 3 및 4에 제시한다. 사람 단백질 서열에 있어서, 암호화 서열은 cDNA의 뉴클레오타이드 위치 134 내지 1486에서 시작된다.
야생형 뿐만 아니라, 다수의 돌연변이된 c-Src cDNA를 제조한다. 돌연변이된 c-Src 작제물은 문헌[참조: Kaplan et al.,EMBO J., 13:4745-4756 (1994)]에 기술된 바와 같이 부위-지시된 돌연변이 유발로 제조한다. 본 발명의 방법에서 유용한 돌연변이된 c-Src 단백질을 암호화하는 돌연변이된 c-Src 작제물은 문헌[참조: Kaplan et al., 상기 동일]에 기술되어 있다. 카플란(Kaplan) 등은 본 발명의 실시에 유용한 다양한 돌연변이된 c-Src 작제물 및 암호화된 단백질을 기술한다. 예를 들면, 카플란 등은 SrcA 및 Src 251을 포함하는 수개의 닭 c-Src 대립형질의 생성물을 상기 문헌의 도 1에서 도시하고 있다.
맥관형성을 조절하는 c-Src 작용에 대한 2가지 카테고리가 기술되어 있다. 전술한 바와 같이, 하나의 카테고리는 맥관형성을 증강시켜, 활성 단백질로서 고려되는 Src 분자를 포함한다. 본 발명에서는, 다양한 돌연변이와 함께 야생형 Src는 맥관형성을 유도하는 것으로 나타난다. 생체내에서 혈관 성장을 유도하고 결과적으로 종양 중량을 증가시키는 이의 능력과 관련하여 작용하는 야생형 c-Src의 한 바람직한 돌연변이는 아미노산(aa) 잔기 위치 527에서 티로신 527을 페닐알라닌으로 대체시키는 점 돌연변이를 갖는 Src A 돌연변이체이다. 상기 부위는 통상적으로는 키나제 CSK로 불리는 c-Src 키나제에 의한 네가티브 조절 부위이다. CSK가 야생형 Src에서 aa527을 포스포릴화시키는 경우, 상기 단백질은 불활성화된다. 그러나, 돌연변이된 Src A에서, 조절성 티로신이 페닐알라닌으로 전환되어, 단백질 상에서 본질적으로(즉, 영구적으로) 활성 단백질이 되는 경우에는 포스포릴화에 의해 불활성화에 좌우되지 않는다.
Src에서의 돌연변이는, 또한 맥관형성을 억제하는 대신에 이를 촉진시켜, 맥관형성에 역조절 효과를 갖는 것으로 나타난다. 상기 돌연변이는 불활성 Src 돌연변이로 불린다. 상기 억제 활성을 부여하는 돌연변이를 갖는 단백질은 또한 우성 네가티브 Src 단백질로 불리며, 이들은 내인성 Src 활성 뿐만 아니라, 성장 인자 자극에 의해 강화된 Src 활성으로부터 야기되는 맥관신생을 억제한다. 따라서, 본 발명의 야생형 c-Src의 특정 돌연변이는 혈관 성장을 차단하는 이의 능력과 관련하여 우성 네가티브로서 작용할 수 있으며, 결과적으로 생체내에서 종양 중량을 감소시킨다.
이러한 바람직한 억제성 c-Src 단백질은 Src의 처음 251개 아미노산만이 발현되는 Src 251을 포함한다. 상기 작제물은 전체 키나제 도메인이 결여되어 있어, "키나제 데드(kinase dead)" Src 단백질로 불린다. 제2 작제물은 라이신 아미노산 잔기 295가 메티오닌으로 돌연변이된 Src(K295M) 돌연변이이다. 키나제 도메인내에서 상기 점 돌연변이는 ATP 결합을 방해하고, 또한 혈관 세포 및 종양 세포 신호 전달 및 증식에 관련된 키나제-의존성 Src 기능을 차단한다.
예를 들면, 잔기 527에서의 돌연변이에 있어서, 생성된 돌연변이된 아미노산잔기가 티로신, 세린 또는 트레오닌이 아닌 한, 본 발명은 바람직한 위치에서 대체 아미노산이 바람직한 활성, 맥관형성 촉진 조절 활성을 갖는 Src 단백질을 형성시킬 것으로 예상된다.
점 돌연변이와 관련하여, 바람직한 억제성 또는 촉진성 활성을 초래하는 임의의 돌연변이도 본 발명에서의 사용이 고려된다. 바람직한 Src 단백질(돌연변이 또는 이의 단편)을 발현된 아미노산 태그, 항원성 에피토프, 형광 단백질 또는 다른 상기 단백질 또는 펩타이드와 혼용하는 융합 단백질 작제물도 Src 단백질의 바람직한 조절 효과가 손상되지 않는 한, 또한 고려된다.
| Src/돌연변이 | Src 기능 | 맥관형성에 대한 효과 |
| c-Src | + 활성 | 촉진 |
| SrcA(T527F) | + 활성 | 촉진 |
| Src527(점) | + 활성 | 촉진 |
| Src 251 | - 불활성 | 억제 |
| Src(말단절단됨) | - 불활성 | 억제 |
| Src(K295M) | - 불활성 | 억제 |
| Src 295(점) | - 불활성 | 억제 |
본 발명에서 사용하기 위한 한 가지 바람직한 발현 작제물은 RCASBP(A) 작제물(서열 1)이다. 상기 발현 벡터는 개선된 역가를 위한 증강된 브라이언 폴리머라제(Bryan polymerase, BP)를 갖는 일련의 복제능 조류 육종 바이러스에 기초하며, 정상적인 조류 세포에서 발현되는 A형 외피 당단백질에 특이적이다[참고문헌: Methods in Cell Biology, 52:179-214 (1997); Hughes et al., 1987,J. Virol.61:3004-3012; Fekete & Cepko, 1993,Mol. Cellular Biol.13(4):2604-2613; Itoh et al., 1996,Development122:291-300; 및 Stott et al., 1998,BioTechniques24:660-666]. RCASBP(A)(서열 1)의 완전한 서열은 첨부된 서열 목록에 제시하고, 작제물의 제한 지도는 도 10으로 도시하며, 본원에서 RCAS로 칭한다.
본래의 Src 251 작제물은 닥터 팜 슈바르츠베르크(Dr. Pam Schwartzberg; NIH, Dr. Harold Varmus's laboratory)에 의해 서브클로닝되었다. 간략하면, 이의 발현을 위한 Src cDNA 서열의 클로닝은 Src 251의 5' 말단에서 유일한 NotI 부위내로 NotI-BstBI-NotI 제한 부위를 함유하는 링커를 삽입함으로써 달성된다. Src는 3' 말단에서 유일한 ClaI부위를 갖는다. BstB1 및 ClaI을 사용하여 Src 251을 절단하여, BstBI-ClaI 단편을 생성시키고, 이를 RCASBP(A) 상의 ClaI 부위내로 연결시킨다. BstBI 돌출부는 ClaI에 의해 재절단되지 않게 되는 ClaI 돌출부와의 연결을 가능하게 한다. 본 발명을 실시하는데 사용하기에 적합한 Src 작제물은 우선 Src 251을 함유하는 RCAS를 NotI 및 ClaI(DAM + 바탕값)을 사용하여 절단하여, 마찬가지로 절단된 Src cDNA의 삽입을 가능하게 함으로써, 상기 벡터로부터 용이하게 수득된다. 따라서, 상기 Src 251을 함유하는 초기 RCASBP(A) 작제물은 문헌[참조: Kaplan et al., 1994,The EMBO J., 13(20):4745-4756]에 기술된 바와 같은 다른 모든 Src 작제물을 Src 251 작제물을 통해 생성된 NotI-ClaI 단편을 통해 RCASBP(A)내로 서브클로닝하는데 추가로 사용된다. cDNA내에서 바람직한 c-Src 돌연변이를 생성시키기 위해서, 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 익히 공지된 표준 부위-지시된 돌연변이 유발 과정을 사용한다. 바람직한 돌연변이를 도입하기 위해서 디자인된 PCR 프라이머는 또한 제한 부위들과 함께 디자인되어 후속적인 클로닝 단계를 촉진시킨다. Src 암호화 핵산 서열의 전체 단편을 닭, 사람 및 Src 기타동족체의 공지된 cDNA 서열에 기초하여 PCR 증폭 기술을 통해 핵산 작제물로부터 결실시켜, 신규한 작제물을 후속적으로 형성시킨다.
본 발명의 특정 양태에서, Src 핵산을 증폭시키는데 사용되는 3' PCR 프라이머는 또한 프레임내 서열을 암호화한다. 상기 프라이머의 사용은 9E10-myc 에피토프 태그를 후속적인 Src 작제물의 카복실 말단에 부가한다.
하기 아미노산 서열을 Src의 아미노산 251 이후에 부가하여 9E10-myc 에피토프 태그를 함유하는 벡터 작제물을 생성시킨다: VDMEQKLIAEEDLN(서열 6). 2개의 개별적인 PCR을 각각의 작제물에 대해 수행하면 유사한 결과가 수득된다. PCR에 의해 작제된 모든 돌연변이 작제물은 또한 PCR로 서열 분석하여 클론의 예견된 DNA 서열을 확인한다. 본 발명의 발현 시스템에서 유용한 야생형 및 돌연변이된 Src cDNA는 제조원(Upstate Biotech Laboratories, Lake Placid, NY)으로부터 또한 유용하며, 상기 제조원은 조류 뿐만 아니라, 사람 Src, 및 수개의 키나제 데드 및 활성화된 돌연변이된 형태를 판매한다.
본 발명의 Src 단백질을 발현시키는데 유용한 또 다른 발현 벡터는 또한 문헌[참조: 미국 특허 제4,797,368호, 제5,173,414호, 제5,436,146호, 제5,589,377호 및 제5,670,488호]에 기술된 아데노바이러스 벡터를 포함한다. Src 조절성 단백질의 전달을 위한 또 다른 수단은 문헌[참조:미국 특허 제5,675,954호]에 기술된 바와 같은 비-바이러스 벡터 시스템을 사용한 Src cDNA 전달, 및 문헌[참조: 미국 특허 제5,589,466호]에 기술된 순수한 DNA로서 그 자체 cDNA의 전달을 포함한다. 본 발명의 작제물의 전달은 또한 하기 CAM 분석 시스템에 기술된 바와 같은 바이러스벡터의 국부적인 적용에 제한되지 않는다. 예를 들면, 바이러스 벡터 제제는 또한 전신계 전달을 위해 맥관층내로 정맥내 주사된다. 상기 벡터들은 또한 예를 들면, 종양의 국부적인 주사에 의해 증가된 맥관신생 부위내로 표적화될 수 있다.
시험관내 발현된 단백질은 또한 선택된 Src 단백질의 발현 및 정제 이후 단백질 또는 폴리펩타이드의 전달에 유용한 수단에 의한 이의 전달을 위해 고려된다. 특정의 이러한 방법은 문헌[참조: 미국 특허 제4,361,167호, 제5,580,575호, 제5,542,935호 및 제5,643,599호]에 기술된 바와 같은 리포좀 전달 시스템을 포함한다. 본 발명의 Src 단백질의 발현 및/또는 전달에 유용한 기타 벡터 및 단백질 전달 시스템이 또한 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 숙지되어 있다.
2.비처리된 닭 융모요막(CAM)의 특성화
A.CAM 제제
맥관형성은, 정상적인 배 맥관형성이 성숙한 혈관의 형성을 초래한 후, 닭 융모요막(CAM)에서 유도시킬 수 있다. 맥관형성은 문헌[참조: Leibovich et al.,Nature, 329:630 (1987) 및 Ausprunk et al.,Am. J. Pathol., 79:597 (1975)]에 기술된 바와 같이 특정한 사이토킨 또는 종양 단편에 반응하여 유도되는 것으로 나타난다. CAM은 후속적인 맥관형성 유도 및 억제를 위해서 닭 배아로부터 제조한다. 10일령 닭 배아를 공급원(McIntyre Poultry; 캘리포니아주 레이크사이드)로부터 입수하여, 60% 습도하 37℃에서 배양한다. 소형 공예용 드릴(제조원: Dremel, Division of Emerson Electric Co., 위스콘신주 라신 소재)을 사용하여 기낭 상부에서 직접적으로 계란의 말단에 껍질을 통해 작은 구멍을 형성시킨다. 제2 구멍은 사전에 계란에 불빛을 비추어 결정한 배아성 무혈관 영역에서 계란의 장축상에서 형성시킨다. 처음 구멍에 네가티브 압력을 가하면, 이는 껍질 막으로부터 CAM(융모요막)의 분리를 초래하여 CAM 위에 위 기낭을 형성시킨다. 소형 모델 그라인딩 휠(제조원: Dremel)을 사용하여 떨어진 CAM 상의 껍질을 통해 1.0센티미터(㎝) x 1.0㎝ 정방형 윈도우를 잘라낸다. 소형 윈도우는 하부 CAM에 직접적으로 접근을 가능하게 한다.
생성된 CAM 표본은 배아 맥관신생에 대한 효과를 평가하는데 사용하는 모델을 나타내는 CAM에 대한 부가적인 처리없이 활성 맥관신생에 의해 특성화되는 단계인 배발생 6일째에 사용하거나, 맥관형성이 진정되는 배발생 10일째에 사용한다. 따라서, 후자의 표본은 본 발명에서 하기 기술되는 바와 같이 사이토킨 처리 또는 종양 접촉에 대한 반응으로 신규한 재맥관형성을 유도하는데 사용된다.
3.CAM 맥관형성 검정
A.성장 인자에 의해 유도되는 맥관형성
맥관형성은 사이토킨 또는 성장 인자에 의해 유도되는 것으로 나타난다.
맥관형성은, 행크스 평형 염 용액(Hanks Balanced Salt Solution; HBSS, 제조원:GIBCO; 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재) 또는 2마이크로그램/밀리리터(㎍/㎖)의 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 또는 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF)(제조원:Genzyme; 메사츄세츠주 캠브리지 소재)를 포함한 HBSS로 포화시킨 5밀리미터(㎜)×5㎜ 와트만 필터 디스크(Whatman filter disk; 제조원: Whatman Filter paper No. 1)를, 무혈관 영역의 9일령 또는 10일령 닭 배아의 CAM 배지상에 위치시켜 유도시킨 다음, 윈도위를 테이프로 밀봉시킨다. 다른 농도의 성장 인자도 또한 혈관 성장을 유도시키는데 효과적이다. 길항제를 정맥내로 주입하여 맥관형성이 어디에서 억제되는지를 검정하기 위해, 먼저 섬유아세포 성장 배지중 1 내지 2㎍/㎖의 bFGF 및 VEGD로 맥관형성을 유도시킨다. 72시간 후, 광학현미경으로 맥관형성을 모니터링한다.
B.배아 맥관형성
배아성 신혈관의 자연적인 형성에 대한 혈관혈성 억제 효과를 평가하기 위한 CAM 제제는 상기에서 기술한 바와 같이 6일령 미발달 닭 배아이다. 발생 단계에서, 혈관은 새롭게 성장하고, 따라서 본 발명의 Src 단백질에 의한 맥관형성 조절을 평가하는데 유용한 시스템을 제공한다. CAM 시스템은, 9일령 또는 10일령 배아가 아닌 6일령 배아에서 검정을 수행하는 것을 제외하고는, 상기한 바와 같이 준비한다.
4.CAM 검정에서 측정되는 바와 같은 맥관형성 조절
맥관형성에 대한 Src 단백질의 효과를 평가하기 위해 10일령 닭 CAM 제제에서 하기 검정을 수행한다. 실시예 1에서 제조한 RCAS 작제물 5㎍을 닭의 고정화 섬유아세포주 DF-1(Douglas Foster, U. of Minn)으로 형질감염시킨다. 상기 세포주뿐만 아니라, 1차 닭 배아 섬유아세포도 바이러스를 생성할 수 있지만, DF-1 세포주가 보다 높은 역가의 바이러스를 생성한다. 무혈청 CLM 배지(조성: DMSO, 엽산, 글루탐산 및 MEM 비타민 용액이 보충된 F-10 배지 기재)중 서브컨플루언트 DF-1 생산 세포주로부터 바이러스 상층액을 회수한다. 바이러스 상층액 35㎖는 22,000rpm 및 4℃에서 2시간 동안 원심분리하여 농축시킨다. 농축된 바이러스 펠렛은 무혈청 CLM 배지 중에 원용적의 1/100로 재현탁시키고, 분액화하여 -80℃에 저장한다. RCAS-FGP로 불리는 녹색 형광성 단백질(GFP)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 조절 바이러스 벡터를 연속으로 희석시켜 역가를 검정하고, 1차 닭 배아 섬유아세포상에 감염시켜 48 내지 72시간 동안 배양한다. 다음 농도로 수득되는 바이러스 원액의 역가는 통상 108I.u./㎖를 초과한다. 바이러스 원액을 사용하는 CAM 검정의 경우, 코르티손 아세테이트에 침지시킨 직경이 6㎜인 와트만 필터 디스크는 95% 에탄올 중 3㎍/㎖ 코르티손 아세테이트 중에 30분 동안 제조한다. 디스크는 적층 유동 후드에서 건조시킨 다음, 디스크당 바이러스 원액 20㎖에 10분 동안 침지시킨다. 상기한 디스크는 9일령 또는 10일령 닭 배아 CAM에 도포하고, 셀로판 테이프로 밀봉시킨 다음, 37℃에서 18 내지 24시간 동안 배양한다. CAM 조직에 대한 바이러스의 추가 자극원로서, 모의 PBS 또는 성장 인자를 적절한 바이러스 원액 20㎕ 용적 중의 CAM에 5㎍/㎖의 농도로 가한다. 72시간 후, CAM을 수집하고, 디스크 아래에 있는 CAM에서 측쇄 점의 수를 이중 맹검법으로 계수함으로써 측정되는 맥관형성 지수 변화를 조사한다. 키나제 검정의 경우, 디스크 아래에 있는조직을 RIPA내에 회수하고, 구동 분쇄기를 사용하여 균질화한 다음, 전체 단백질의 상응하는 양으로부터 Src를 면역침전시키고, 기질로서 FAK-GST 융합 단백질을 사용하여, 시험관내 키나제 검정을 수행한다. 면역형광법 실험의 경우, 디스크 아래에 있는 CAM 조직을 저온 방부제 OCT 중에서 냉동시키고, 4㎛로 절단하고, 아세톤내에서 1분 동안 고정시키고, 3% 정상 염소 혈청 중에서 1시간 동안 배양한 다음, 문헌에 기술된 바와 같이 1차 토끼 항-포스포릴화 ERK 항체 중에서 배양하고[참고문헌: Eliceiri et al.,J. Cell Biol., 140:1255-1263 (1998)], PBS로 세척하고 형광성 2차 항체를 사용하여 검출한다.
A.bFGF 또는 VEGF에 의한 내인성 Src의 활성화
성장 인자의 맥관형성을 조절하는데 있어서의 Src 활성에의 효과를 평가하기 위해, 다음의 분석을 수행한다. bFGF 또는 VEGF(2㎍/㎖)에 2시간 동안 노출시킨 10일령 닭 CAM의 조직 추출물을 용해시킨다. 내인성 Src를 동일한 양의 전체 단백질로부터 면역침강시키고, 기질로서 FAK-GST 융합 단백질을 사용하여, 시험관내에서 면역 복합 키나제 검정에 적용시키고, 전기영동하고, 니트로셀룰로즈에 이송시킨다.
검정의 결과를 도 5에 도시하는데, 여기서 Src 활성의 증가는, CAM 검정에서 Src 활성의 바닥선을 나타내는 비처리(모의) 샘플에 비해 bFGF 또는 VEGF으로 처리된 겔의 증가된 밀도로부터 분명하다. bFGF와 VEGF 둘다는 CAM에 존재하는 내인성 Src 활성의 약 2배의 증가를 초래한다. 상기한 키나제 검정 블롯은 동일한 양의Src 및 IgG 함량에 대한 로딩 대조군으로서 항-Src 항체로 또한 조사한다.
B.닭 CAM에서 맥관형성에 대한 Src A의 레트로바이러스-매개된 유전자 발현의 영향
다음 검정을 CAM 제조에서 맥관형성에 대한 돌연변이 Src 단백질의 효과를 평가하기 위해 수행한다. 이러한 검정에 있어서, 9일령 닭 CAM을 RCAS-Src A 또는 RCAS-GFP 발현 레트라바이러스 또는 완충액에 72시간 동안 노출시킨 다음, 상기한 절차를 따른다.
이러한 검정의 결과를 도 6A에 도시하는데, 여기서 맥관형성의 수준은 상기한 바와 같이 정량화한다. 도 6B에 도시된 바와 같이, 대표적인 현미경사진(4x)을 입체현미경으로 찍는다. 바닥선 내인성 Src 활성의 맥관형성 지수는 약 50이다. 이와 반대로, 아미노산 잔기 위치 527에서 티로신으로부터 페닐알라닌로의 점 돌연변이를 갖는, 레트로바이러스 벡터-발현된 RCAS-Src A로 처리된 CAM은 약 90의 맥관형성 지수의 맥관형성의 증강(유도)을 초래한다. Src-A 매개된 맥관형성의 강화는 도 6B에 도시된 사진에서 또한 분명하다.
C.Src A의 레트로바이러스 발현: 맥관 MAP 키나제 포스포릴화를 활성화시킴
성장 인자 VEGF 및 PMA에 대한 Src A의 맥관 MAP 키나제 포스포릴화에 대한 영향은 여기서에 그리고 이미 기술한 분석 절차에 따라 또한 평가한다. VEGF 또는 PMA(필적하는 농도의 또 다른 미토겐)에 30분 동안 노출된 10일령 닭 CAM을 Src A-발현 레트라바이러스로 48시간 동안 감염시킨 것과 비교한다. 이어서, Src를 동일한 양의 전체 단백질 추출물로부터 면역침강시키고, 기질로서 FAK-GST 융합 단백질을 사용하여 시험관내에서 면역 복합 키나제 분석에 도입시키고, 전기영동하고, 니트로셀룰로즈에 이송시킨다.
검정 결과를 도 7A에 도시하는데, 여기서, 비처리 CAM(NT)는 바닥선 내인성 Src-매개된 혈관 MAP 키나제 포스포릴화를 나타낸다. VEGF 및 PMA 둘다는 바닥선에 비해 약 2배의 증가를 초래한다. 이와 반대로, Src A는 비처리 샘플에서 보여진 것에 비해 활성을 약 5 내지 10배 증강시킨다.
도 7B에 도시된 바와 같이, 상기 전체 조직 용해물의 분획물은 항-포스포-ERK 항체로 면역블롯팅시킴으로써 내인성 ERK 포스포릴화에 대해 또한 측정한다. 이러한 평가에 있어서, 10일령 CAM을 Src A를 발현시키는 모의 RCAS 또는 RCAS로 감염시킨다. 2일 후에, CAM을 분리하고, OCT에서 저온보관하고, 4㎛로 절단한다. 이러한 분획물을 항-포스포릴화된 ERK 항체(제조원: New England Biolabs)로 면역염색하고, 세척한 다음, 염소 항-토끼 FITC-공액화된 2차 항체로 검출한다. 형광 영상이 냉각된-CCD 카메라(제조원: Princeton Inst.) 상에서 포착된다. 현미경사진은 모의 대조군에 비해 Src A-처리된 제제에서의 강화된 면역형광성을 나타낸다.
D.VEGF-유도된 맥관형성 동안의 Src 활성에 대해서는 선택적이나, bFGF-유도된 맥관형성 동안의 Src 활성에 대해서는 선택적이지 않은 요건
성장 인자 유도된 맥관형성에 대한 Src 조절 활성의 영향을 평가하기 위해,다음 검정을 수행한다. 9일령 닭 CAM을 상기한 바와 같이 Src 251 또는 Src K295M으로 불리는 우성 네가티브 Src 돌연변이를 발현시키는 레트로바이러스 벡터 제제에 노출시킨다. RCAS-Src 251 또는 대조군 RCAS-GFP 레트로바이러스 또는 완충액 CAM을 20시간 동안 처리하고, 추가 72시간 동안 bFGF 또는 VEGF의 존재 또는 부재하에 배양한다.
상기한 바와 같이 정량화된 맥관형성의 수준은 도 8A에 도시된다. 도 8B에 도시된 바와 같이, 대표적 현미경사진(6x)을 입체현미경으로 찍는다. 도 8C는 모의 처리물과 비교하여, 형질도입된 세포에서 Src 251의 발현을 확인하기 위해 항-Src 항체로 조사된 블롯을 나타낸다.
상기한 검정의 결과는, RCAS-GFP 대조군의 존재하에 bFGF 및 VEGF 처리된 CAM 둘다는 모의 또는 비처리 CAM 제제에서 보여진 Src-매개된 바닥선 맥관형성에 대해 맥관형성을 유도한다는 것을 나타낸다. 발현된 우성 네가티브 돌연변이 Src-251은 VEGF-유도된 맥관형성이 다시 바닥선으로 돌아가는 것을 억제하는데에는 효과적이지만, bFGF-매개된 맥관형성을 억제하는데에는 효과적이지 않다. 도 8B에 도시된 현미경사진은 도 8A에 도시된 데이타를 도식적으로 확인시킨다. 따라서, 형관형성이 VEGF로 유도되는 경우, 레트로바이러스로 발현된 Src 251은 효과적인 맥관형성 억제제이다.
아래의 실시예에서 기술되는 바와 같이, 본 발명의 Src 단백질을 기타 맥관형성 모델에 적용하는 것은 본 발명에서 고려되는 사항이다.
5.생체내 토끼 이브 모델 검정에 의해 측정된 Src 조절인자를 사용한 종양 조직 성장의 퇴화
성장 인자-유도된 맥관형성에 대한 Src 조절자의 효과는 눈의 각막과 같은 자연적으로 투명한 구조에서 관찰될 수 있다. 새로운 혈관이 혈액 공급이 풍부한 각막의 테두리로부터 혈액 공급이 정상적이지 않은 각막의 중앙 쪽으로 성장한다. 각막에 적용되는 경우, bFGF와 같은 맥관형성 촉진인자는 각막의 테두리로부터 새로운 혈관의 성장을 유도한다. 각막에 적용되는 경우, 맥관형성의 길항제는 각막의 테두리로부터 새로운 혈관의 성장을 억제한다. 따라서, 각막은 내피 세포의 침투를 통해 각막의 테두리로부터 맥관형성되어, 쉽게 가시화되는 경성 콜라겐-팩킹된 각막 조직으로 된다. 따라서, 토끼 눈 모델 검정은 맥관형성의 촉진 및 억제의 직접적인 관찰, 및 이어서 눈의 각막에의 직접적인 화합물 이식을 위한 생체내 모델을 제공한다.
A.생체내 토끼 눈 모델 분석
1)성장 인자에 의해 유도된 맥관형성
맥관형성을 생체내 토끼 눈 모델 검정에서 성장 인자 bFGF 또는 VEGF를 사용하여 유도하고, 아래에 기술한다.
a.성장 인자 및 모노클로날 항체를 함유하는 하이드론 펠렛의 제조
성장 인자를 함유하는 하이드론 중합체 펠렛은 문헌[참조: D'Amato, et al.,Proc. Natl. Sci., USA, 91:4082-4085 (1994)]에 기술된 바와 같이 제조한다. 개개의 펠렛은 수크랄페이트(Carafet, Marion Merrell Dow Corporation)에 별도로 결합된 성장 인자 650ng을 함유하여, 성장 인자를 안정화시키고 주변 조직으로 서서히 방출시킨다. 또한, 상술된 바와 같이 목적하는 Src-발현 레트로바이러스를 함유하는 하이드론 펠렛을 제조한다. 이 펠렛은 이의 표면에 천공된 2.5mm 코어를 갖는, 특별히 제조된 테플론 펙에서 주조된다. 주조물 약 12㎕를 각각의 펙에 두고, 멸균 후드에서 밤새 중합시킨다. 이어서, 펠렛을 자외선 조사에 의해 멸균시킨다. 이어서, Src 단백질의 효과를 상술된 바와 같이 평가한다.
6.키메라 마우스:사람 검정에 의해 측정한 바와 같은 Src 조절인자에 의한 종양 조직 성장의 생체내 퇴행
생체내 키메라 마우스:사람 모델은 SCID 마우스로부터의 피부 일부를 사람 신생아 포피로 대체하여 제조한다. 생체내 키메라 마우스:사람 모델은 본질적으로 문헌[참조: Yan, et al.,J. Clin. Invest., 91:986-996 (1993)]에 기술된 바와 같이 제조한다. 요약하면, 피부 2㎠ 면적을 SCID 마우스(6 내지 8주령)로부터 외과적으로 제거하고, 사람 포피로 대체시킨다. 마우스를 마취시키고, 측면 복부의 양쪽 측면의 5㎠ 면적으로부터 털을 면도에 의해 제거한다. 2㎠의 2개의 원형 이식편 층은 근막 하부의 전체 두께의 피부를 제거하여 제조한다. 사람 신생한 포피로부터 유도된 동일한 크기의 사람 피부 이식편 전체 두께를 상처 층 위에 놓고, 그 부분을 봉합한다. 피부로 봉합되는 밴드-보조물로 이식편을 덮는다. 미세공 헝겊 테이프를 적용하여 또한 상처를 덮는다.
M21-L 사람 흑색종 세포주 또는 MDA 23.1 유방암 세포주(ATCC HTB 26; mAb LM609와 조직 단편의 면역반응에 의해 αVβ3네가티브)를 사용하여 SCID 마우스 상의 사람 피부 이식편 위에 충실성 사람 종양을 형성시킨다. 5×106M21-L 또는 MDA 23.1 세포의 단일 세포 현탁액을 사람 피부 이식편내로 경피 주사한다. 이어서, 마우스를 2 내지 4주 동안 관찰하여, 측정가능한 사람 종양을 성장시킨다.
측정가능한 종양이 생성된 후, 본 발명의 레트로바이러스 제제 또는 PBS를 마우스 꼬리 정맥내로 주사한다. 2 내지 3주 경과한 후, 종양을 절개하여, 중량 및 미세구조에 의해 분석한다. 이어서, 종양에 대한 본 발명의 발현된 Src 단백질의 효과를 검정한다.
7.CAM 분석에 의해 측정된 바와 같은 Src 조절인자에 의한 사람 종양 조직 성장의 시험관내 퇴행
종양 성장은 맥관형성에 따라 달라진다[참고문헌: Folkman, 1992; Weidner et al., 1991; Brooks et al., 1994b]. 사실, 최근의 보고서는 종양 성장이 VEGF 수용체 길항제의 항-맥관형성 효과에 감수성이라는 것을 시사한다[참고문헌: Kim et al., 1993]. 따라서, 본 발명자들은 키나제-결실된 Src 251의 전달에 의한 맥관형성의 억제가 사람 수모세포종(DAOY; VEGF 및 매우 적은 bFGF를 생성하는 것으로 알려진 고도의 맥관형성 종양)의 성장에 영향을 주는지를 검사하였다(데이타는 제시하지 않음).
3일 및 6일 DAOY 수모세포종 종양 성장 분석은 실질적으로 문헌[참조: Brooks et al., 1994]에 기술된 바와 같이 닭 CAM에서 수행한다. 10% 태아 소 혈청을 함유하는 RPMI 1640에서 배양된 5×106DAOY 세포를 10일령 배의 CAM 상의 씨딩물로 세척하여, DAOY 종양 단편을 생성시킨다. 7일 후, 종양 단편 50mg을 절개하고, 또다른 10일령 배에 재씨딩하고, 대조군 RCAS-GFP 레트로바이러스, RCAS-Src 251 또는 모의 처리를 국소 적용하여, 추가로 3 내지 6일 동안 배양한다. 가이드로서 감염된 종양의 전체 조직 공초점 영상화를 사용하여, 본 발명자들은 이러한 국소 방법에 의해 종양 단편 주변 및 종양 단편내에서 RCAS 작제물이 현저히 발현됨을 측정할 수 있었다. 종양 절개 및 칭량은 용이하게 정의가능한 충실성 종양 덩어리만을 제거한 이중 블라인드 방식으로 수행한다[참고문헌: Brooks et al., 1994]. 3 또는 6일 후의 습윤 종양 중량을 초기 중량과 비교하고, 각각의 그룹에 대해 종양 중량 변화율(%)를 측정한다.
이들 종양은 CAM 상에서 용이하게 성장하고, 활성 맥관형성을 나타내는데(도 9), 이는 조류-특이적 RCAS 레트로바이러스를 사용하여 조류-유도된 종양 맥관계를 선택적으로 표적시킬 수 있게 한다.
도 9는 닭 CAM 상에서 성장하는 사람 종양에 대한 RCAS-Src 251의 레트로바이러스 전달이 종양 성장을 역전시킨다는 것을 보여주는 결과를 도시한다. 도 9A는 상술된 바와 같이 닭 배의 CAM 상에서 성장한 사람 수모세포종을 나타낸다. RCAS-GFP 또는 RCAS-Src 251을 함유하는 레트로바이러스를 국소 적용하여 50mg 이상의 종양을 재생성시킨다. GFP를 발현시키는 RCAS-GFP로 감염된 수모세포종 종양 단편의 대표적인 현미경사진은 Bio Rad 레이저 공초점 주사 현미경(bar = 500㎛)로 광학 분할하여 검출된 바와 같이 종양 혈관(화살표)에서 유일한 발현을 나타낸다. 도 9B는 이들을 절개하고 습윤 중량을 측정한 후의 3일 또는 6일 동안 성장시킨, 상기와 같이 처리한 종양으로부터의 결과를 나타낸다. 데이타는 2회 반복치의 중양 중량(중양 출발 중량 50mg으로부터) +/- SEM의 평균 변화로서 표시한다. RCAS-Src 251은 3일(*, P<0.002) 및 6일(**, P<0.05) 후에 종양 성장에 대해 현저한 효과를 갖는다. 도 9C는 배로부터 외과적으로 제거된 수모세포종 종양의 대표적인 입체현미경 사진을 올림푸스 입체현미경(bar = 350㎛)로 관찰한 것을 나타낸다(하부 패널). 각 종양의 고비율 현미경은 각 종양의 맥관계를 상세히 나타낸다(bar = 350㎛). 화살표는 RCAS-Src 251-처리된 종양의 혈관 파괴를 나타낸다.
이 결과는, 미리 생성된 수모세포종에 대한 Src 251 함유 RCAS의 전달이 종양-관련된 혈관에서 선택적 바이러스 발현을 유도하고(도 9A), 이는 궁극적으로 6일의 기간내에 이들 종양의 퇴행을 유도함(도 9B)을 나타낸다. 중요하게는, Src 251을 함유하는 바이러스로 처리된 동물에서 종양-관련된 혈관은 현저히 파괴되었고, 그 수가 대조군 동물의 종양 혈관과 비교하여 감소하였다(도 9C). RCAS-GFP 감염된 종양이 종양 맥관계에서만 GFP 국지화를 나타낸다는 사실은 레트로바이러스에 의해 전달된 Src 251로 관찰된 항-종양 효과가 이의 항-맥관형성 특성에 기인함을 시사한다.
상기 실시예 및 수반되는 기술은 설명을 위한 것이며, 본 발명을 제한하고자하는 것은 아니다. 본 발명의 범위는 또한 기탁된 양태가 본 발명의 특정한 양태의 하나의 설명으로서 간주되기 때문에 기탁된 세포주에 의해 제한되지 않는다. 기능적으로 균등한 모든 세포주는 본 발명의 범위내에 포함된다. 물질의 기탁은 본원에 포함된 설명이 본 발명의 최상의 양태가 포함되는 본 발명의 특정한 양태를 실시하기에 부적합하다는 것을 구성하지 않으며, 또한 이것이 나타내는 특정한 설명으로 특허청구범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 실제로, 본원에 제시되고 기술된 것들 이외에 본 발명의 다양한 변화는 상기 기술로부터 당업자에게 자명한 것이며, 첨부된 특허청구범위내에 포함될 것이다.
Claims (38)
- 약제학적 조성물이 맥관형성 조절에 의해 질환을 치료하는데 사용할 수 있음을 나타내는 라벨(label)을 포함하는 팩키징재 및 이러한 팩키징재내에 함유되어 있는 것으로서, Src 단백질 또는 이러한 단백질을 발현시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함하고 질환과 관련된 조직내에서 맥관형성을 조절할 수 있는 약제학적 조성물을 포함하는 제품.
- 제1항에 있어서, Src 단백질이 활성 Src 단백질이고, 조절 작용이 맥관형성을 증강시키는 제품.
- 제2항에 있어서, 활성 Src 단백질이 Src A인 제품.
- 제2항에 있어서, 조직의 순환이 불량한 제품.
- 제1항에 있어서, 티로신 키나제 Src 단백질이 불활성 Src 단백질이고, 조절 작용이 맥관형성을 억제하는 제품.
- 제5항에 있어서, 불활성 Src 단백질이 Src 251 또는 Src K295M인 제품.
- 제5항에 있어서, 조직이 염증을 일으키고, 질환이 관절염 또는 류마티스성 관절염인 제품.
- 제5항에 있어서, 조직이 충실성 종양 또는 충실성 종양 전이체인 제품.
- 제8항에 있어서, 투여가 화학요법과 병행하여 수행되는 제품.
- 제5항에 있어서, 조직이 망막 조직이고, 질환이 망막증, 당뇨병성 망막증 또는 황반 변성인 제품.
- 제5항에 있어서, 조직이 관상 맥관형성술 부위이고, 질환이 망막증인 제품.
- 제1항에 있어서, 투여가 정맥내 투여, 경피 투여, 활액내 투여, 근육내 투여 또는 경구 투여를 포함하는 제품.
- 제1항에 있어서, 투여가 단일 용량의 정맥내 투여를 포함하는 제품.
- 제1항에 있어서, 약제학적 조성물이 리포좀을 추가로 포함하는 제품.
- 제1항에 있어서, 약제학적 조성물이 뉴클레오타이드 서열을 발현시킬 수 있는 바이러스 발현 벡터를 포함하는 제품.
- 제1항에 있어서, 약제학적 조성물이 뉴클레오타이드 서열을 발현시킬 수 있는 비-바이러스 발현 벡터를 포함하는 제품.
- 질환과 관련된 조직에 Src 단백질 또는 이러한 단백질을 발현시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 상기 조직내에서 맥관형성을 조절하는 방법.
- 제17항에 있어서, Src 단백질이 활성 Src 단백질이고, 조절 작용이 맥관형성을 증강시키는 방법.
- 제18항에 있어서, 활성 Src 단백질이 Src A인 방법.
- 제18항에 있어서, 조직의 순환이 불량한 방법.
- 제17항에 있어서, Src 단백질이 불활성 Src 단백질이고, 조절 작용이 맥관형성을 억제하는 방법.
- 제21항에 있어서, 불활성 Src 단백질이 Src 251 또는 Src K295M인 방법.
- 제21항에 있어서, 조직에 염증이 있고, 질환이 관절염 또는 류마티스성 관절염인 방법.
- 제21항에 있어서, 조직이 충실성 종양 또는 충실성 종양 전이체인 방법.
- 제24항에 있어서, 투여가 화학요법과 병행하여 수행되는 방법.
- 제21항에 있어서, 조직이 망막 조직이고, 질환이 망막증, 당뇨병성 망막증 또는 황반 변성인 방법.
- 제21항에 있어서, 조직이 관상 맥관형성술 부위이고, 조직이 망막증에 걸릴 위험에 직면한 방법.
- 제17항에 있어서, 투여가 정맥내 투여, 경피 투여, 활낭액내 투여, 근육내 투여 또는 경구 투여를 포함하는 방법.
- 제17항에 있어서, 투여가 단일 용량의 정맥내 투여를 포함하는 방법.
- 제17항에 있어서, 약제학적 조성물이 리포좀을 추가로 포함하는 방법.
- 제17항에 있어서, 약제학적 조성물이 뉴클레오타이드 서열을 발현시킬 수 있는 바이러스 발현 벡터를 포함하는 방법.
- 제17항에 있어서, 약제학적 조성물이 뉴클레오타이드 서열을 발현시킬 수 있는 비-바이러스 발현 벡터를 포함하는 방법.
- 527번 코돈에 티로신, 세린 또는 트레오닌을 제외한 임의의 아미노산 잔기를 포함하는 Src 단백질을 암호화하는 핵산 단편을 갖는 핵산을 함유하는 바이러스 유전자 전달 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는, 포유동물의 표적 조직내에서 맥관형성을 촉진시키기 위한 약제학적 조성물.
- 527번 코돈에 티로신, 세린 또는 트레오닌을 제외한 임의의 아미노산 잔기를 포함하는 Src 단백질을 암호화하는 핵산 단편을 갖는 핵산을 함유하는 비-바이러스 유전자 전달 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는, 포유동물의 표적 조직내에서 맥관형성을 촉진시키기 위한 약제학적 조성물.
- 키나제 활성을 갖지 않는 Src 단백질을 암호화하는 핵산 단편을 갖는 핵산을 함유하는 바이러스 유전자 전달 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는, 포유동물의 표적 조직내에서 맥관형성을 억제하기 위한 약제학적 조성물.
- 키나제 활성을 갖지 않는 Src 단백질을 암호화하는 핵산 단편을 갖는 핵산을 함유하는 비-바이러스 유전자 전달 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는, 포유동물의 표적 조직내에서 맥관형성을 억제하기 위한 약제학적 조성물.
- 527번 코돈에 티로신, 세린 또는 트레오닌을 제외한 임의의 아미노산 잔기를 포함하는 Src 단백질의 치료학적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는, 포유동물의 표적 조직내에서 맥관형성을 촉진시키기 위한 약제학적 조성물.
- 키나제 활성을 갖지 않는 Src 단백질을 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 배합된 상태로 포함하는, 포유동물의 표적 조직내에서 맥관형성을 억제하기 위한 약제학적 조성물.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8722098P | 1998-05-29 | 1998-05-29 | |
| US60/087,220 | 1998-05-29 | ||
| PCT/US1999/011780 WO1999061590A1 (en) | 1998-05-29 | 1999-05-28 | Methods and compositions useful for modulation of angiogenesis using tyrosine kinase src |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20010085261A true KR20010085261A (ko) | 2001-09-07 |
Family
ID=22203825
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020007013490A KR20010085261A (ko) | 1998-05-29 | 1999-05-28 | 티로신 키나제 Ｓｒｃ를 사용하는, 맥관형성의 조절에유용한 방법 및 조성물 |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7585841B2 (ko) |
| EP (1) | EP1082415B1 (ko) |
| JP (1) | JP4806487B2 (ko) |
| KR (1) | KR20010085261A (ko) |
| CN (1) | CN1304567C (ko) |
| AT (1) | ATE506073T1 (ko) |
| AU (1) | AU762955C (ko) |
| BR (1) | BR9910787A (ko) |
| CA (1) | CA2330025C (ko) |
| CZ (1) | CZ302918B6 (ko) |
| DE (1) | DE69943374D1 (ko) |
| DK (1) | DK1082415T3 (ko) |
| ES (1) | ES2361659T3 (ko) |
| HK (1) | HK1041289A1 (ko) |
| HU (1) | HU227985B1 (ko) |
| MX (1) | MXPA00011821A (ko) |
| NO (1) | NO327610B1 (ko) |
| PT (1) | PT1082415E (ko) |
| RU (1) | RU2222342C2 (ko) |
| SK (1) | SK287330B6 (ko) |
| TR (1) | TR200100430T2 (ko) |
| UA (1) | UA75565C2 (ko) |
| WO (1) | WO1999061590A1 (ko) |
| ZA (1) | ZA200007321B (ko) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69943374D1 (de) * | 1998-05-29 | 2011-06-01 | Us Government | Verfahren zur modulation der angiogenese mittels der tyrosin kinase src |
| US20030130209A1 (en) * | 1999-12-22 | 2003-07-10 | Cheresh David A. | Method of treatment of myocardial infarction |
| US6685938B1 (en) * | 1998-05-29 | 2004-02-03 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for modulation of angiogenesis and vascular permeability using SRC or Yes tyrosine kinases |
| US6297258B1 (en) * | 1998-09-29 | 2001-10-02 | American Cyanamid Company | Substituted 3-cyanoquinolines |
| EP1250155B1 (en) * | 1999-12-22 | 2008-04-16 | The Scripps Research Institute | Angiogenesis and vascular permeability modulators and inhibitors |
| US7485414B2 (en) | 2002-08-30 | 2009-02-03 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of angiogenesis |
| US20080280987A1 (en) * | 2006-08-31 | 2008-11-13 | Desai Neil P | Methods of inhibiting angiogenesis and treating angiogenesis-associated diseases |
| CN101541319B (zh) * | 2006-10-31 | 2013-09-18 | 托莱多大学 | Src和Src家族激酶的Na+/K+-ATP酶特异性肽抑制剂/激活剂 |
| DE102007037008B4 (de) * | 2007-08-06 | 2015-09-10 | Siemens Aktiengesellschaft | Diagnosesubstanz zur Anwendung in einem Verfahren zur Bestimmung der Aggressivität eines Prostatatumors |
| CA2755121A1 (en) | 2009-03-13 | 2010-09-16 | Neil P. Desai | Combination therapy with thiocolchicine derivatives |
| RU2539859C2 (ru) * | 2013-05-06 | 2015-01-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт орошаемого овощеводства и бахчеводства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИОБ РАСХН) | Способ производства цукатов из кабачков различной степени спелости |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5264618A (en) * | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
| WO1998016638A1 (en) * | 1995-10-13 | 1998-04-23 | The Rockefeller University | Consolidated ligands with increased affinities and methods of use thereof |
| US6335010B1 (en) * | 1996-11-08 | 2002-01-01 | University Of California At San Diego | Gene therapy in coronary angioplasty and bypass |
| DE69943374D1 (de) * | 1998-05-29 | 2011-06-01 | Us Government | Verfahren zur modulation der angiogenese mittels der tyrosin kinase src |
| GB2341182A (en) * | 1998-09-01 | 2000-03-08 | Yamanouchi Uk Ltd | Protein comprising amino acid sequences having SH3 domain binding activity and nuclear localisation activity |
-
1999
- 1999-05-28 DE DE69943374T patent/DE69943374D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-28 CN CNB998090735A patent/CN1304567C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-28 EP EP99924535A patent/EP1082415B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-28 CZ CZ20004435A patent/CZ302918B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-05-28 AU AU41013/99A patent/AU762955C/en not_active Ceased
- 1999-05-28 BR BR9910787-2A patent/BR9910787A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-05-28 PT PT99924535T patent/PT1082415E/pt unknown
- 1999-05-28 AT AT99924535T patent/ATE506073T1/de active
- 1999-05-28 CA CA002330025A patent/CA2330025C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-28 DK DK99924535.0T patent/DK1082415T3/da active
- 1999-05-28 WO PCT/US1999/011780 patent/WO1999061590A1/en not_active Application Discontinuation
- 1999-05-28 JP JP2000550976A patent/JP4806487B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-28 ES ES99924535T patent/ES2361659T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-28 HU HU0102614A patent/HU227985B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1999-05-28 MX MXPA00011821A patent/MXPA00011821A/es not_active IP Right Cessation
- 1999-05-28 KR KR1020007013490A patent/KR20010085261A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-05-28 UA UA2000127086A patent/UA75565C2/uk unknown
- 1999-05-28 TR TR2001/00430T patent/TR200100430T2/xx unknown
- 1999-05-28 RU RU2000133327/15A patent/RU2222342C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-05-28 SK SK1811-2000A patent/SK287330B6/sk not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-11-28 NO NO20006026A patent/NO327610B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-12-08 ZA ZA200007321A patent/ZA200007321B/xx unknown
-
2002
- 2002-04-15 HK HK02102827A patent/HK1041289A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-09-19 US US11/230,995 patent/US7585841B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7585841B2 (en) | Methods and compositions useful for modulation of angiogenesis using tyrosine kinase Src | |
| AU781444B2 (en) | Angiogenesis and vascular permeability modulators and inhibitors | |
| US20060040853A1 (en) | Methods and compositions useful for modulation of angiogenesis using protein kinase Raf and Ras | |
| MXPA02006207A (en) | Angiogenesis and vascular permeability modulators and inhibitors | |
| ZA200201761B (en) | Methods and compositions useful for modulation of angiogenesis using protein kinase Raf and Ras. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| J301 | Trial decision |
Free format text: TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20060919 Effective date: 20070821 |