UA75565C2 - Фармацевтична сполука для стимулювання ангіогенезу (варіанти), фармацевтична сполука для інгібування ангіогенезу (варіанти) та спосіб модулювання ангіогенезу з їх використанням - Google Patents

Abstract

Винахід належить до фармацевтичних сполук для стимулювання ангіогенезу, які містять вірусний або невірусний вектор експресії, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує активний Src-білок (тирозинкіназу), який має будь-який амінокислотний залишок у кодоні 527, за винятком тирозину, серину або треоніну, та фармацевтичних сполук для інгібування ангіогенезу, які містять вірусний або невірусний вектор експресії, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує неактивний Src-білок, у якому відсутня кіназна активність, та який є Src 251 або К295М білком. Також описано спосіб модулювання ангіогенезу у тканині, пов’язаній зі станом захворювання, за допомогою вказаних фармацевтичних сполук.

Description

Опис винаходу

У цій заявці заявлений ефект винаходу, описаного у попередній заявці (на патент США з серійним номером 60/087,220, поданій 29 травня 1998р.|), яка включена до опису винаходу шляхом посилання, як і всі інші посилання, що згадуються тут.

Цей винахід в основному стосується галузі медицини і зокрема способів та сполук для модулювання ангіогенезу тканин з використанням протеїну тирозинкінази 5гс, різновидів бгс та нуклеїнових кислот, що їх кодують. 70 Ангіогенез (розвиток кровоносних судин - прим. перекладача) є процесом васкуляризації тканин, пов'язаним з вростанням новоутворених кровоносних судин у тканину, який також іноді називають неоваскуляризацією. Цей процес викликається інфільтрацією ендотеліальних клітин і клітин гладких м'язів. Вважається, що цей процес відбувається одним з трьох шляхів: судини можуть відростати від судин, які існували раніше, розвиток нових судин може виникати від клітин-попередників (васкулогенез), або існуючі невеличкі судини можуть збільшуватися 19 в діаметрі |Віоса еї а/ї., Віоспі. Віорпуз Асіа, 1032:89-118(1990)).

Ангіогенез є важливим процесом при зростанні новонароджених, але він є важливим також при загоєнні ран і при патогенезі величезної кількості клінічних захворювань, включаючи запалення тканин, артрит, зростання пухлин, діабетичну ретинопатію, переродження плям на роговиці при неоваскуляризації сітківки і подібні стани.

Ці клінічні прояви, пов'язані з ангіогенезом, одержали назву ангіогенних захворювань |БоЇїКтап еї аї.,

Всієпсе, 235:442-447 (1987)). Ангіогенезу звичайно немає в дорослих або зрілих тканинах, хоча він все-таки відбувається при загоєнні ран та у циклі зростання жовтого тіла. |Див, наприклад, Мозез еї аї., Зсіепсе, 248:1408-1410 (1990)).

Було припущено, що інгібування ангіогенезу може виявитися корисною терапією для обмеження зростання пухлин. Було запропоновано здійснювати інгібування ангіогенезу шляхом: (1) інгібування звільнення с "ангіогенних молекул", наприклад, таких, як оФРФ (основний фактор росту фібробластів), (2) нейтралізації Ге) ангіогенних молекул, наприклад, шляхом використання анти-В-оОФРФ антитіл, (3) використання інгібіторів рецептора вітронектину АкВ з, та (4) інгібування реакції ендотеліальних клітин на ангіогенні стимули. Цей останній підхід привернув увагу, і (БоїКтап ей аїЇ., Сапсег Віоіоду. 3:89-96 (1992) описали кілька інгібіторів реакції ендотеліальних клітин, включаючи інгібітор колагенази, інгібітори відновлення базальної о мембрани, ангіостатичні стероїди, отримані з грибків інгібітори ангіогенезу, тромбоцитарний фактор 4, «0 тромбоспондин, ліки від артриту, наприклад, такі, як О-пеніциламін та тіомалат золота, аналоги вітаміну 03, альфа-інтерферон та інші, які можуть бути використані для інгібування ангіогенезу. Про додаткові о запропоновані інгібітори ангіогенезу (див. Віоой еї аї!., Віосп. Віорпуз Асіа, 1032:89-118 (1990); Мозев еї (З аІ., Зсіепсе, 248:1408-1410 (1990); Іпрдрег еї аї., Га Іпмеві. 89:44-51 (1988) та патенти США МоМо5 092 885, 5 4112 946,5 192 744, 5 202 352, 5 753 230 та 5 766 591). Жодний з інгібіторів ангіогенезу, описаних у - попередніх посиланнях, не пов'язаний з Зго-білками.

Щоб відбувся ангіогенез, ендотеліальні клітини повинні спочатку деградувати та взаємодіяти з базальною мембраною кровоносних судин подібно тому, як це роблять клітини пухлин під час інвазії та утворення метастаз. «

Раніше винахідники повідомляли про те, що ангіогенез залежить від взаємодії між васкулярними інтегринами З та білками позаклітинного матриксу |ВгооК5 еї а, Зсіепсе, 264:569-571 (1994)). Крім того, повідомлялося про с те, що запрограмована смерть (апоптоз) ангіогенних васкулярних клітин викликається взаємодією, яка може бути

Із» інгібована певними антагоністами васкулярного інтегрину А уВз (ВгооКе еї аї., Сеїї, 79 1157-1164 (1994).

Зовсім нещодавно винахідники повідомили про те, що зчеплення металопротеїнази-2 матриксу (мПМ-2) з рецептором вітронектину (АМВз) може бути інгібоване шляхом використання антагоністів А МВз, що, отже, інгібує ферментативну функцію протеїнази |Вгоокз еї а/!., СеїІ, 85:683-693 (1996). 7 Цей винахід спрямований на модулювання ангіогенезу у тканинах за допомогою тирозинкінази 5гс, яка тут у сл загальному вигляді називається 5гс.

Розглядаються сполуки та способи модулювання ангіогенезу в тканині, пов'язаній з яким-небудь і-й захворюванням. Тканину, яку необхідно вилікувати від захворювання, обробляють сполукою, що містить кількість

Ге»! 20 Зго-білка, достатню для модулювання ангіогенезу. Сполука, що містить Зго-білок, може містити очищений білок, біологічно активні білкові фрагменти, отриманий рекомбінуванням 5го-білок або фрагменти білків або злиті з сл них білки, або вектори експресії генів/нуклеїнової кислоти для експресії Зго-білків.

Коли 5го-білок інактивується або пригнічується, модулювання являє собою інгібування ангіогенезу. Коли

Зго-білок є активним або активується, модулювання являє собою посилення ангіогенезу. 25 Тканина, яку буде піддано лікуванню, може бути будь-якою тканиною, для якої є бажаним модулювання

ГФ) ангіогенезу. Інгібування ангіогенезу є корисним при лікуванні ураженої тканини там, де відбувається шкідлива неоваскуляризація. Прикладові тканини включають запалені тканини, тверді пухлини, метастази, тканини, у яких о відбувається рестеноз, і подібні їм тканини.

Посилення є корисним при лікуванні пацієнтів з ішемічними кінцівками, у яких спостерігається погана 60 циркуляція у кінцівках, викликана діабетичними або іншими станами. Пацієнти з хронічними ранами, що не загоюються і для яких, отже, можуть виявитися корисними збільшення проліферації клітин судин та неоваскуляризація, можуть також бути вилікувані.

Найкращим є використання Згсо-білка, що містить модифікований ланцюжок амінокислоти, який описується тут. Тут описані кілька особливо корисних модифікованих 5го-білків та їхня експресія. бо Таким чином, у цьому винаході розглядається фармацевтична сполука для стимулювання ангіогенезу в тканині-мішені ссавців, яка містить вірусний або невірусний вектор переносу генів, який містить нуклеїнову кислоту та фармацевтично придатний носій або наповнювач, причому вищевказана нуклеїнова кислота має сегмент нуклеїнової кислоти, який кодує Згсо-білок а вищевказаний Зго-білок має залишок будь-якої амінокислоти в кодоні 527, за винятком тирозину, серину або треоніну.

Також описується фармацевтичний препарат для інгібування ангіогенезу в тканині-мішені ссавців, який містить вірусний або невірусний вектор переносу генів, що містить нуклеїнову кислоту та фармацевтично придатний носій або наповнювач, причому вищевказана нуклеїнова кислота має сегмент нуклеїнової кислоти, який кодує білок іс. у якому відсутня активність кінази. 70 На кресленнях, які складають частину цього опису:

Фіг.1 є послідовністю КДНК С-5гс курчати, яка є повною кодованою послідовністю з видаленими інтронами, що вперше було описано |ТаКеуа еї аї., СеїЇ, 32:881-890 (1983). Цю послідовність можна знайти під інвентарним номером 900844 генного банку. Послідовність містить 1759 нуклеотидів, а кодуюча частина білка починається та закінчується відповідно в положеннях нуклеотидів 112 та 1713.

Фіг.2 є кодованою послідовністю залишку амінокислоти с-5гс курчати кодуючої послідовності, показаної на

Фіг1.

Фіг.З є послідовністю кКДНК с-Згс людини, вперше описаною |Вгаешпіпдег еї аїЇ.,, Ргос. Май. Асай. зсі.,

БА, 88:10411-10415 (1991)). Цю послідовність можна знайти під інвентарним номером Х59932 Х71157 генного банку. Послідовність містить 2187 нуклеотидів, а кодуюча частина білка починається та закінчується відповідно 2о В положеннях нуклеотидів 134 та 1486.

Фіг.4 є кодованою послідовністю залишку амінокислоти с-бгс людини кодуючої послідовності, показаної на

Фіг.3.

На Фіг.5 показана активація ендогенного Згс за допомогою оФРФ або ФРСЕ (фактору росту судинного ендотелію - прим. перекладача), описана в прикладі 4. У верхній частині фігури показані результати аналізу сч гв Кінази іп міїго із згорнутою активацією ендогенного с-Зго за допомогою оФРФ або ФРСЕ. У нижній частині фігури приведений відбиток аналізу кінази, досліджуваний за допомогою анти-5гс антитіла як контролю навантаження і) для еквівалентного вмісту Згс та імуноглобуліну.

На Фіг.б показаний вплив ретровірусної генної експресії с-Згс А на ангіогенез у хоріоналантоїсній мембрані (ХАМ) курчати, описаний у прикладі 4. ХАМ дев'ятидобових курчат піддавали впливу ЗРВСП-5гсо А ю зо (активно мутованого с-Згс) (ЗРВСП - здатний до реплікації вірус саркоми птахів, прим, перекладача), або контрольних ретровірусів ЗРВСП-ЗФБ (ЗФБ - зелений флуоресцентний білок; флуоресцентний белок-індикатор), ісе) або буфера протягом 72г. Рівень ангіогенезу був визначений так, як це показано на Фіг.бА, причому ю репрезентативні мікрофотознімки (з чотириразовим збільшенням) на Фіг.6В, які відповідають кожному етапу лікування, були зроблені за допомогою стереомікроскопа. о

На Фіг.7 показана ретровірусна експресія с-Згс А при активації фосфорилування васкулярної активованої ї- мітогеном протеїнкінази (АМП кінази). На Фіг.7А показані екстракти тканин ХАМ 10-денних курчат, які піддавали впливу ФРСЕ або ФМА (форболміристатацетату) протягом 30 хвилин або інфікували ретровірусом С-5гс А протягом 48 годин. ВЛ означає відсутність лікування. Імунопреципітат 5гс утворили з еквівалентних кількостей загального екстракту протеїну та піддали імунокомплексному аналізу кіназної активності іп йо з « Використанням /злитого білка КФА-Г-5-Т (де КФА -кіназа з фокальною адгезією, а Г-5-Ї о- з с глютатіон-5-трансфераза, прим, перекладача) як субстрат, піддавали електрофорезу та переносили до нітроцелюлози. Аліквоти вищевказаних лізатів цілих тканин також вимірювали на ендогенне фосфорилування ;» ПРСК (позаклітинної регульованої сигналом кінази) за допомогою імуноблотингу з анти-фосфо-ПРСК антитілом.

На Фіг.7В показані 10-денні ХАМ, які були інфіковані контрольними ЗРВСП або ЗРВСП, що містили 5гс А. Через два дні ХАМ препарували, зберігали при кріогенній температурі у кріоконсерванті ОСТ та розділяли на частини -І по 4мкм. Частини офарбили з використанням імунної мітки анти-фосфорилованим антитілом ПРСК ("Нью Інгліш

Байолабз"), промили та визначили за допомогою протикролячого кон'югованого з ФІТЦ (ФІТЦ - флуоресцеїн о ізотіоціанат, прим, перекладача) вторинного антитіла цапа. Флуоресцентні образи були зафіксовані камерою на с охолоджуваних приладах із зарядовим зв'язком ("Принстон Інст.").

На Фіг.8 показані вибіркові вимоги до активності 5гс під час ангіогенезу, викликаного ФРСЕ, але не оФРФ.

Ме, ХАМ дев'ятиденних курчат піддавали впливу ЗРВСОП-Зго 251 або контрольних ЗРВСОП-ЗФБ ретровірусів, або сп буфера протягом 20 годин, а потім інкубували протягом ще 72 годин при оФРФ або ФРСЕ або у їх відсутності.

Рівень ангіогенезу вимірювали на Фіг.8А, як це було описано вище, та стереомікроскопом були зроблені репрезентативні мікрофотознімки (з шестиразовим збільшенням), як показано на Фіг.88. На Фіг.8С показана ов пляма, зондована Анти-Згс антитілом для підтвердження експресії Зго 251 у трансфікованих клітинах у порівнянні з контрольною обробкою.

Ф) На Фіг.9 показані результати ретровірусної доставки ЗРВСП-Згс 251 до пухлини людини. Фіг9А є ка мікрофотознімком, на якому показаний фрагмент медулобластомної пухлини людини, інфікований ЗРВСП-ЗФБ (З3ФБ - зелений флуоресцентний протеїн). експресія ЗФБ у якій відбувається виключно в кровоносних судинах бо пухлини (розмірна стрілка), як було виявлено при оптичному розсіченні за допомогою співфокусного лазерного сканувального мікроскопа "Віо Кай" (смуга -500мкм). На Фіг.9В зображені дані досліджень пухлин, оброблених шляхом місцевої аплікації ретровірусу, яким було дозволено зростати протягом від З до 6 днів, після чого вони були резектовані, і була визначена їхня волога вага. Дані подані як середня зміна ваги пухлин (від початкової ваги пухлини 50 міліграмів) ї/- СЗП з 2 реплікацій. На Фіг9С зображений репрезентативний мікрофотознімок 65 медулобластомних пухлин, вилучених з ембріонів хірургічним шляхом (смуга -35О0мкм). Нижні панелі є сильно збільшеними видами кожної пухлини, що детально показують судинну мережу кожної пухлини (смуга -З35Омкм).

Розмірна стрілка вказує на руйнацію кровоносних судин у пухлинах, оброблених ЗРВСП-5гс 251.

Фіг.10 є діаграмою, що ілюструє карту векторної обмежувальної конструкції ЗРВСП-ВР (ЗРВСП).

А. Визначення

Амінокислотний залишок: Амінокислота, утворена при хімічному перетравленні (гідролізі) поліпептиду по його пептидних зв'язках. Амінокислотні залишки, що описуються тут, знаходяться переважно в ізомерній формі |.

Проте залишки в ізомерній формі О можуть бути заміщені будь-якими І-амінокислотними залишками, якщо пептидом зберігається бажана функціональна властивість. МН » позначає вільну аміногрупу, яка присутня на аміно-кінці поліпептиду. СООН позначає вільну карбоксильну групу, яка присутня на карбокси-кінці поліпептиду 7/о Згідно зі стандартною номенклатурою поліпептиду |що описано в ..Віоі.Спет., 243:3552-59 (1969) та прийнято в 37 Кодексі федеральних нормативних актів, 51. 822(8Х(23|.

Слід зазначити, що всі послідовності амінокислотних осадів представлені тут формулами, ліві та праві орієнтації яких знаходяться в умовному напрямку від аміно-кінця до карбокси-кінця. Крім того, слід зазначити, що тире на початку або кінці послідовності амінокислотних осадів вказує на пептидний зв'язок з наступною послідовністю одного або більш амінокислотних осадів.

Поліпептид: позначає лінійну групу амінокислотних осадів, пов'язаних один з одним пептидними зв'язками між альфа-аміногрупами та карбоксигрупами суміжних амінокислотних осадів.

Пептид: у його використанні в цьому описі позначає лінійну групу з не більш ніж 50 амінокислотними осадами, пов'язаними один з одним, як у поліпептиді.

Циклічний пептид: позначає сполуку, яка має кільцеву структуру, що включає кілька амідних зв'язків, як у типовому пептиді. Циклічний пептид може являти собою гомодетичний циклічний пептид, сполучений "головою до хвоста", або може містити гетеродетичну кільцеву структуру, у якій кільце замикається дисульфідними мостами. лактамними мостами, тіоефірами, тіоамідами, гуанідинами і подібними зв'язками.

Білок: позначає лінійну групу з більш ніж 50 амінокислотними осадами, пов'язаними один з одним, як у сч ов поліпептиді.

Злитий білок: позначає поліпептид, який містить принаймні два різних поліпептидних домени, оперативно (8) сполучених типовим пептидним зв'язком ("злитих"). причому ці два домени відповідають пептидам, які в природі в злитій формі не зустрічаються.

Синтетичний пептид: позначає отриманий хімічним способом ланцюг амінокислотних осадів, пов'язаний ю зо пептидними зв'язками, який внаслідок цього вільний від білків, які зустрічаються в природі, та їхніх фрагментів.

В. Загальний аналіз ікс,

Цей винахід в основному стосується відкриття того, що ангіогенез опосередкованим чином викликається ю протеїном тирозинкіназою Згс, і що ангіогенез можна модулювати шляхом забезпечення активних або неактивних білків Згс для посилення або пригнічення ангіогенезу, відповідно. Щео,

Це відкриття є важливим внаслідок тієї ролі, яку ангіогенез, або утворення нових кровоносних судин, грає ї- в різноманітних процесах захворювань. Якщо тканини, пов'язані зі станом хвороби, потребують ангіогенезу для свого зростання, то бажано інгібувати ангіогенез і, таким чином, інгібувати зростання уражених тканин. Якщо ушкоджена тканина потребує ангіогенезу для свого зростання та загоєння, то бажано посилювати ангіогенез або сприяти йому і, таким чином, сприяти загоєнню та зростанню тканини. «

Якщо зростання нових кровоносних судин є причиною патології або сприяє патології, пов'язаній з ураженою з с тканиною, то інгібування ангіогенезу знижує шкідливий ефект захворювання. Шляхом інгібування ангіогенезу

Й можна втручатися у хід захворювання, покращувати симптоми, а в деяких випадках і виліковувати и?» захворювання.

Приклади тканин, пов'язаних з захворюванням та неоваскуляризацією, для яких буде корисним інгібуюче Модулювання ангіогенезу, включають тканини, уражені ревматоїдним артритом, діабетичною ретинопатією, -І запальними захворюваннями, рестенозом і тому подібними захворюваннями. Якщо зростання нових кровоносних судин є потрібним для підтримання зростання шкідливої тканини, то інгібування ангіогенезу знизить о кровопостачання в тканині і, таким чином, сприятиме зниженню маси тканини, яка залежить від кровопостачання. с Приклади включають зростання пухлин у тих випадках, коли неоваскуляризація є постійною умовою зростання пухлини в товщину на декілька міліметрів та для утворення твердих метастаз пухлини.

Ме. Якщо зростання нових кровоносних судин сприяє загоєнню тканини, і о стимулювання ангіогенезу допомагає сп в лікуванні. Приклади включають лікування хворих з ішемічними кінцівками, у яких спостерігається погана циркуляція в кінцівках, викликана діабетами або іншими станами. Також розглядається лікування хворих з хронічними ранами, які не загоюються і для яких, отже, може бути корисним підвищення проліферації клітин судин та неоваскуляризація.

Способи згідно з цим винаходом є частково ефективними, оскільки лікування Її високо вибірковим для

Ф) ангіогенезу, але не для інших біологічних процесів. ка Як було описано вище, ангіогенез включає ряд процесів, пов'язаних з неоваскуляризацією у тканині, включаючи "пророщення", васкулогенез або збільшення судин, причому на всі ці процеси ангіогенезу впливає во Зго-білок. Вважається, що більшість процесів ангіогенезу пов'язані з процесами захворювань, за винятком лікування травматичних ран, утворення жовтого тіла та ембріогенезу, отже, ці терапевтичні методи є вибірковими щодо захворювання і не мають шкідливих побічних ефектів.

С. Зго-білки

Білок тирозинкіназа Згс, який використовується у цьому винаході, може бути різним в залежності від 65 передбачуваного використання. Терміни "Зго-білок" або "Зіс" використовуються для позначення різноманітних форм білків тирозинкінази Згс, що описуються тут, як в активній, так і в неактивній формі.

"Активний Згсо-білок" позначає будь-яку форму з ряду форм 5Зго-білків, яка посилює ангіогенез. Тут описані дослідження з вимірювання посилення ангіогенезу, які не варто тлумачити як обмежувальні. Білок вважається активним, якщо рівень ангіогенезу більше принаймні на 1095, краще на 25905, і ще краще на 5095, ніж контрольний рівень, при якому в досліджувану систему не добавляли 5гсо. Найкращим дослідженням для вимірювання посилення є дослідження ХАМ з використанням вірусного вектора ЗРВСП, як це описано в Прикладах, у яких індекс ангіогенезу обчислюється шляхом підрахунку точок розгалуження. У кращому випадку активний Зго-білок проявляє також тирозинкіназну активність. Зразкові активні Зго-білки описані в Прикладах та включають Згс-А. "Неактивний Зго-білок' позначає будь-яку форму з ряду форм бЗБго-білків, яка інгібує ангіогенез. Тут 7/0 описані дослідження з вимірювання інгібування ангіогенезу, які не варто тлумачити як обмежувальні. Білок вважається неактивним, якщо рівень ангіогенезу менше принаймні на 1095, краще на 2595, і ще краще на 50905, ніж контрольний рівень, при якому в досліджувану систему не добавляли екзогенний Згс. Найкращим дослідженням для вимірювання інгібування є дослідження ХАМ з використанням вірусного вектора ЗРВСП. як це описано в Прикладах, у яких індекс ангіогенезу обчислюється шляхом підрахунку точок розгалуження. У 7/5 кращому випадку неактивний Зго-білок проявляє також знижену тирозинкіназну активність. Зразкові неактивні

Зго-білки описані в Прикладах та включають Згсо-251.

Зго-білок, який є корисним для цього винаходу, може бути отриманий будь-яким з ряду способів, включаючи виділення з природних джерел, включаючи тканини, одержання шляхом експресії рекомбінантної ДНК та очищення тощо. Зго-білок можна також одержати іп зйш шляхом уведення системи генної терапії до тканини, яка 2о нас цікавить, яка потім зробить експресію білка у тканині.

Ген, який кодує Зго-білок, може бути виготовлений рядом способів, відомих у цій галузі техніки, і цей винахід не слід тлумачити як обмежувальний у цьому відношенні. Наприклад, широким відомим є те, що природна історія Зго-білка містить ряд гомологів ссавців, птахів, вірусів та інших видів, і ген може легко бути клонований з використанням методу клонування кДНК з будь-якої тканини, що експресує білок. Найкращим сч білком Згс для використання у винаході є клітинний білок, такий, як гомологи ссавців або птахів, позначені с-Зго. Найкращим у деяких випадках є с-5го людини. (8)

О. Молекули рекомбінантної ДНК та системи експресії для експресії Зго-білка.

У винаході описано кілька особливо корисних для цього винаходу послідовностей нуклеотидів. Ці послідовності включають такі послідовності, які кодують Бго-білок корисний для цього винаходу, та ю зо різноманітні сегменти ДНК, молекули рекомбінантної ДНК (рДНК) та вектори, сконструйовані для експресії

Зго-білка. ісе)

Молекули (сегменти) ДНК згідно з цим винаходом, отже, можуть містити послідовності, які кодують цілі ю структурні гени, фрагменти структурних генів і одиниці транскрипції, як це тут буде описано далі.

Кращим сегментом ДНК є нуклеотидна послідовність, яка кодує Зго-білок, як це було визначено тут, або його о біологічно активний фрагмент. ча

Послідовність амінокислотних залишків та нуклеотидна послідовність найкращого білка с-Згс описані в

Прикладах.

Кращий сегмент ДНК кодує послідовність амінокислотних залишків, яка є значною мірою такою самою, як послідовність амінокислотних залишків або її частини, що відповідають описаному тут Зго-білку, і переважно в « основному складається з неї. Репрезентативні та найкращі сегменти ДНК далі описані в Прикладах. з с Послідовність амінокислотних залишків білка або поліпептиду безпосередньо пов'язана через генетичний код . з послідовністю дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) структурного гена, що кодує білок. Таким чином, и?» структурний ген або сегмент ДНК може бути визначений на підставі послідовності амінокислотних залишків, тобто білка або поліпептиду, який він кодує.

Важливою і добре відомою особливістю генетичного коду є його надмірність. Тобто, для більшості -І амінокислот, що використовуються для утворення білків, більш, ніж один кодуючий нуклеотидний триплет (кодон) може кодувати конкретний амінокислотний залишок або позначати його. Отже, ряд різних нуклеотидних 1 послідовностей може кодувати конкретну послідовність амінокислотних залишків. Такі нуклеотидні послідовності с вважаються функціонально еквівалентними, оскільки вони можуть призводити до утворення однієї і тієї ж самої послідовності амінокислотних залишків у всіх організмах. Іноді до складу наданої нуклеотидної послідовності

Ме. може входити метильований різновид пурину або піримідину. Проте такі метилування ніяк не впливають на с відносини кодування.

Нуклеїновою кислотою є будь-який нуклеотид або фрагмент нуклеїнової кислоти, незалежно від того, чи є він полірибонуклеотидом або полідезоксирибонуклеотидом, тобто РНК або ДНК, або їхніми аналогами. У найкращих ов варіантах реалізації цього винаходу молекула нуклеїнової кислоти знаходиться у формі сегмента дуплексної

ДНК, тобто фрагменту ДНК, хоча в деяких методологіях молекулярної біології найкращими вважаються (Ф) одноланцюгові ДНК або РНК. ка Сегменти ДНК отримують рядом засобів, включаючи методи хімічного синтезу та рекомбінантні підходи, краще шляхом клонування або ланцюгової реакції полімерази (ЛРП). Фрагменти ДНК, які кодують частини во Зго-білка, легко можуть бути синтезовані хімічними засобами, наприклад, фосфотриефірним методом |Майцеиссі еї аІ,, У. Ат. Спет. бос, 103:3185-3191, 1981), або з використанням автоматизованих методів синтезу. Крім того, великі сегменти ДНК можна легко приготувати за допомогою добре відомих методів, таких, як синтез групи олігонуклеотидів, що визначають сегмент ДНК, за яким слідує гібридизація та лігування олігонуклеотидів для побудування повного сегмента. Альтернативні методи включають виділення кращого сегмента ДНК шляхом ЛРП б5 пари олігонуклеотидних праймерів, використаних з бібліотеки кКДНК, що, як вважається, містить члени, які кодують Зго-білок.

Безсумнівно, за допомогою хімічного синтезу будь-які необхідні модифікації можуть бути отримані лише шляхом заміни відповідних основ на ті, які кодують нативну послідовність амінокислотних залишків. Цей метод добре відомий і може бути легко застосований для одержання різних інших "модифікованих" Зго-білків, описаних 8-0 ТУТ.

Більш того, сегменти ДНК, які складаються головним чином з структурних генів, які кодують Згсо-білок, можуть бути згодом модифіковані, як при сайт-специфічному або випадковому мутагенезі, для впровадження будь-яких необхідних заміщень. 1. Клонування гена 5гс 70 Ген Згс може бути клонований з придатного джерела геномної ДІЖ або матричної РНК (мРНК) різноманітними біохімічними методами. Клонування цих генів може бути здійснено згідно з загальними методами, описаними у Прикладах, і так, як відомо у цій галузі техніки.

Джерела нуклеїнових кислот для клонування гена 5гс, придатні для використання у способах згідно з цим винаходом, можуть містити геномну ДНК або матричну РНК (мРНК) у вигляді бібліотеки кДНК, з тканини, яка, як /5 вважається, експресує ці білки. Найкращою тканиною є тканина легенів людини, хоча можна використовувати і будь-яку іншу придатну тканину.

Кращий метод клонування включає готування бібліотеки КДНК з використанням стандартних методів та виділення нуклеотидної послідовності, що кодує бгс, шляхом посилення ЛРП з використанням пари олігонуклеотидних праймерів на підставі описаних тут нуклеотидних послідовностей. В іншому варіанті бажані

Клони КДНК можуть бути ідентифіковані та виділені з КДНК або геномної бібліотеки звичайними методами гібридизації нуклеїнової кислоти з використанням зонда гібридизації на підставі описаних тут послідовностей нуклеїнової кислоти. Інші методи виділення та клонування придатних нуклеїнових кислот, які кодують Згс, є достатньо очевидними для спеціалістів у цієї галузі техніки. 2. Вектори експресії сч

Молекула рекомбінантної ДНК (рДНК), яка містить сегмент ДНК, що кодує 5го-білок, може бути отримана так, як описується тут. Зокрема, експресована рДНК може бути отримана шляхом оперативного (у рамці та і) експресивного) зчеплення вектора з сегментом ДНК, що кодує 5гс. Таким чином, молекула рекомбінантної ДНК є гібридною молекулою ДНК, що містить принаймні дві нуклеїнові кислоти з нуклеотидних послідовностей, які звичайно в природі разом не зустрічаються. ю зо Вибір вектора, з яким оперативно зчіплюється сегмент ДНК, безпосередньо залежить, як відомо в цій галузі техніки, від бажаних функціональних властивостей, наприклад, експресії білків, та клітини-хазяїна, яку слід со трансформувати. Вектор, який є придатним для використання при реалізації цього винаходу, є принаймні ю спроможним до спрямовування реплікації, а також краще до експресії структурного гена, включеного до сегментів ДНК вектору, з якими він оперативно зчіплюється. о

Вектори як прокаріотичної, так й еукаріотичної експресії знайомі будь-якому фахівцю з середнім рівнем ї- знань у галузі векторних конструкцій і описані (Аизере! еї аї., в Ситепі РгоїосоЇв іп Моїіесшіаг Віоіоду,

Мміеу апа Зопв, Нью-Йорк (1993) і Затьгоок еї аї., Моіесціаг Сіопіпуд: А І арбогаїогу Мапиаї, "Колд Спрінг Хабор

Лебореторі" ("Соїй Зргіпд Нагрог І арогайогу"), (1989). У цих посиланнях також описано багато загальних методів рекомбінантної ДНК, на які тут є посилання. «

В одному з варіантів реалізації винаходу придатний вектор містить прокаріотичний реплікон, тобто пт») с послідовність ДНК, яка має здатність спрямовувати автономну реплікацію і підтримання молекули рекомбінантної ДНК позахромосомно в прокаріотичній клітині-хазяїні, такій, як бактеріальна клітина-хазяїн, ;» трансформованій за її допомогою. Такі реплікони є добре відомими у цій галузі техніки. Крім того, ті варіанти реалізації винаходу, які включають прокаріотичний реплікон, також включають і ген. експресія якого надає лікарську стійкість до бактеріального хазяїна, трансформованого за його допомогою. Типові бактеріальні гени -І лікарської стійкості - це ті, які дають стійкість до ампіциліну або тетрацикліну.

Ті вектори, що містять прокаріотичний реплікон, можуть також містити прокаріотичний промотор, спроможний о спрямовувати експресію (транскрипцію і трансляцію) структурного гена в бактеріальній клітині-хазяїні, с наприклад, такій, як Е. соїї, трансформованій за його допомогою. Промотор - це керуючий елемент експресії, утворений послідовністю ДНК, який дозволяє відбуватися зв'язуванню РНК полімерази і транскрипції.

Ме, Послідовності промоторів, сумісні з бактеріальними хазяїнами, звичайно утворюються в плазмідних векторах, які сп містять зручні сайти рестрикції для вставки сегмента ДНК згідно з цим винаходом. Такими типовими плазмідними векторами є рОС8б рис, рВК322 та рВК329, які можна отримати в "Байорад Лебораторіз" ("Віоїад

І арогаюгіевз"), Річмонд, Каліфорнія, рРК5ЕТ, який можна отримати в "Інвітроген" ("Іпмігодеп"), Сан-Дієго, в Каліфорнія, а також рР'. та рКкК223, які можна отримати в "Фармасія" ("Рнагтасіа"), Піскатавей, Нью-Джерсі.

Вектори експресії, сумісні з еукаріотичними клітинами, краще - сумісні з хребетними клітинами, також

Ф) можуть бути використані для утворення молекул рекомбінантної ДНК згідно з цим винаходом. Вектори експресії ка еукаріотичних клітин добре відомі у цій галузі техніки і можуть бути отримані з кількох промислових джерел.

Звичайно такі вектори поставляються з вмістом зручних сайтів рестрикції для вставки бажаного сегмента ДНК. бо Типовими такими векторами є рЗМІ. та ркзМ-10 ("Фармасія") ("Рнагтасіа"), рВРМ-т1/рМІ2а (Інтернешнл

Байотекнолоджіз, Інк.") (Іпіегпайопа! Віоїесппоіодіез, Іпс), рТОТІ (Американська колекція типових культур,

Мо31255). рКс/СММ ("Інвітроген, Інк") (Іпмігодеп, Іпс), кращий вектор, який описаний в Прикладах, і подібні еукаріотичні вектори експресії.

Найкраща система для експресії генів в контексті цього винаходу містить компонент доставки гена, тобто 65 можливість доставки гена до тканини, яка нас цікавить. Придатними є "Інфекційні" вектори, наприклад, такі, як віруси рекомбінантної ДНК, вектори аденовірусів або ретровірусів, що дозволяють інфікувати попередньо вибрані тканини-мішені. Найкращим є вірус спроможної до реплікації саркоми птахів (СРСП), описаний тут.

Можна створити системи клітин ссавців, які використовують рекомбінантні віруси або вірусні елементи для спрямовування експресії. Наприклад, при використанні аденовірусних векторів експресії кодуюча послідовність поліпептиду може бути лігована з комплексом управління транскрипцією/трансляцією аденовірусу, наприклад, останній промотор та трійчаста лідерна послідовність. Цей химерний ген може потім бути вставлений у геном аденовірусу шляхом рекомбінації іп мійго або іп мімо. Наслідком вставки в несуттєву область вірусного геному (наприклад, область Е1 або ЕЗ) буде виникнення рекомбінантного вірусу, який є життєздатним та спроможним до експресії поліпептиду в інфікованих хазяїнах |наприклад, див. Іодап еї аїЇ.,, Ргос. Май. Асай. зЗсі. О5А, 7/0 81:3655-3659 (1984)). Іншим чином, можна використовувати промотор вірусу коров'ячої віспи 7.5К |наприклад, див. Маскей еї аїЇ., Ргос. Май. Асай. з5сі, ОБА. 79:7415-7419 (1982); МасКей еї аї., 9. МігоІї.,, 49:857-864 (1984); Рапісаїї еї аїЇ., Ргос. Май). Асайд. Зсі,, ОБА, 79:4927-4931 (1982)). Особливий інтерес представляють вектори, засновані на вірусі бичачої папіломи, яку мають здібність до реплікації як екстрахромосомні елементи

ІзЗагмег еї аї., Мої. СеїІ. Віоі., 1:486 (1981). Безпосередньо після введення цієї ДНК у клітині-мішені /5 плазміда реплікує приблизно від 100 до 200 копій на клітину. Транскрипція введеної кКДНК не потребує інтеграції плазміди до хромосому клітини-хазяїна, що, таким чином, забезпечує високий рівень експресії. Ці вектори можуть бути використані для стійкої експресії шляхом включення селектованого маркера в плазміду, наприклад, ген песо. В іншому варіанті геном ретровірусу може бути модифікований для використання як вектор, спроможний впроваджувати та спрямовувати експресію нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, в Клітині-хазяїні |(Сопе еї аї., Ргос. Май. Асай. Зсі, ОА, 81:6349-6353 (1984)), Експресії високого рівня можна також досягти шляхом використання індукованих промоторів, включаючи промотор ІА металотіонін і промотори теплового шоку, але не обмежуючись лише ними.

Останнім часом вивчалося довгострокове виживання промотору цитомегаловірусу (ЦМВ) у порівнянні з стимульованою промотором вірусу саркоми Руса (ВСР) генною терапією тимідинкіназою (ТК) у "голих" мишей, сч о Заражених раком яєчників людини. Було виявлено, що ефективність вбивання клітин стимульованого промотором ЦМВ аденовірусного простого герпесу в порівнянні з генною терапією ТК у 2-10 рази перевищує і) ефективність терапії, стимульованої ВСР |(Топод еї аї., 1999, Нубгідота. 18(1):93-97). Також була описана модель химерних промоторів для застосування в генній терапії, для яких потрібна експресія низького рівня, за якою слідує експресія високого рівня |(Зи2икі еї аі., 1996, Нитап Сепе ТПпегару, 7:1883-1893). ю зо Для довгострокового високопродуктивного побудування рекомбінантних білків віддають перевагу стабільній експресії. Замість того, щоб використовувати вектори експресії, які містять вірусні початки реплікації, ісе) клітини-хазяїни можуть бути перетворені кКДНК, регульованою відповідними елементами контролю експресії ю (наприклад. послідовності промотору та енхансеру, термінатори транскрипції, сайти поліаденілування тощо) і селектованим маркером. Як згадувалося вище, селектований маркер у рекомбінантній плазміді надає стійкість о

Зв ДО селекції і дозволяє клітинам стабільно інтегрувати плазміду до своїх хромосом та зростати, створюючи ї- осередки, які. в свою Чергу, можуть бути клоновані та перетворені у лінії клітин.

Наприклад, після введення чужорідної ДНК сконструйованим клітинам може бути дозволено зростати протягом 1-2 днів у збагачених середовищах, після чого їх переспрямовують у вибірні середовища. Можна використовувати ряд систем селекції, включаючи (але не обмежуючись лише ними) гени тимідинкінази вірусу « простого герпесу МУідіег еї аї., Сей, 11:223 (1977)), гіпоксантин-гуанін-фосфорибозілтрасферази |Згураївка пт) с еї а, Ргос. Май. Асай. Зсі.,, США, 48:2026 (1962)| та аденінфосфорибозилтрансферази | оуу еї аї., Сеї, . 22:817 (1980)), які можна використовувати в клітинах їкК, порі та арії відповідно. Крім того, як основу для и? селекції можна використовувати гени-антиметаболіти, які надають стійкість; наприклад, гени для ант, що надає стійкість до метатрексату |МУідіег еї аіЇ, Ргос. Май. Асад. Зсі,, США, 77:3567 (1980); О'Наге еї аї.,, Ргос.

Май. Асай. Зсі, США, 78:1527 (1981)); орі, що надає стійкість до мікофенолової кислоти |Миїїдап еї аї., -І Ргос. Май. Асай. Зсі, США, 78:2072 (1981)); пео, що надає стійкість до аміноглікозиду 0-418

ІСоІрегте-Сагаріп еї аї., У. Мої. Віоі., 150:1 (1981)); та пудго, що надає стійкість до гігроміцину (Запіете 1 еї аІ,, Сепе, 30:147 (1984)). Нещодавно були описані додаткові селектовані гени, а саме ігрВ, який дозволяє с клітинам використовувати індол замість триптофану; пізО, який дозволяє клітинам використовувати гістинол замість гістидину ІНагтап еї а), Ргос. Май. Асай. Зсі, США, 85:804 (1988); та ОДдКк

Ме, (орнітиндекарбоксилаза), яка надає стійкість до інгібітору орнітиндекарбоксилази, сп 2-(дифторметил)-ОІ -орнітину, ДФМО (МеСопіодие ІГ., в кн.: "Сучасні системи передачі в молекулярній біології", під ред. "Колд Спрінг Харбор Лебораторі" ("Соїа Зргіпд Нагбог І арогайогу") (1987)).

Основні вектори, розглянуті для генної терапії людини, виводять з ретровірусних джерел |М/іЇзоп, 1997,

Сіїп. Ехр. Іттипої. 107 (Додаток 1 ) 31-32; ВапК еї аї., 1996, Віоезвзауз, 18(12):999-1007; Кобрбріпз еї аї., 1998, РНагтасої. Тпег., 80(1):35-47Ї1. Терапевтичний потенціал переносу генів та десенсибілізуючої терапії

Ф) стимулював розвиток багатьох векторних систем для лікування ряду тканин (судинної мережи, |(З(ернап еї аї., ка 1997, Рипдат. Сійп. РНагпгтасої., 11(2):97-110; Реідтап еї аїЇ., 1997, Сагаіомазс. Кев. 35(3):391-404; Магззаїїї еї аЇ,, 1997, Сагаімуавс. Кев., 35(3):459-69; Ваек еї аї.,, 1998, Сігс. Кев.. 82(3)295-305|; нирки, (Шіеп еї во аі.,, 1997, Кідпеу Іпб Зиррі., 61.585-8)|; печінки, |(Регпу еї аїЇ., 1998, Нит Сепе Тег, 9(143: 1975-81; м'язів, Магзпаї! ек аі!., 1998, Си. Орп. Сепеї. Юем., 8(3):360-5). Крім цих тканин, важливою мішенню генної терапії людини є рак, як сама пухлина, так і пов'язані з нею тканини (|Кипперацт, 1997, Апіісапсег Кезв., 17(48):2887-90. Зреаг еї аї., 1998, 9. Меийгоміго!., 4(2): 133-47).

Нижче стисло описуються конкретні приклади векторних систем вірусної генної терапії, які легко 6б5 пристосовуються для використання в способах згідно з цим винаходом. Перенос ретровірусних генів був нещодавно проаналізований ГРедегзрієї та Нидпез (1998, Меїйодз іп Се! ВіоіІ.,, 52:179-214), які, зокрема,

описали сім'ю ретровірусів вірусу лейкозу птахів (ВЛП) (ГРедегзрієЇ еї аїЇ., Ргос. Май. Асай. Зсі, США, 93:4931 (1996); Редегерієї еї аїЇ., Ргос. Май. Асай. зЗсі, США, 91:11241 (19943). Ретровірусні вектори, включаючи ВЛП і вірус лейкемії мишей (ВЛМ), пізніше були описані Зморода (1998, Сепе, 206:153-1631.

Модифіковані системи ретровірусної/аденовірусної експресії можуть бути легко пристосовані для реалізації способів згідно з цим винаходом. Наприклад, системи вірусу лейкемії мишей (ВЛМ) розглянуті Кагамапаз еї аї., 1998, Стії, Кеу. іп ОпсоІоду/Нетайоіоду, 28:7-30Ї1. Системи аденовірусної експресії розглянуті Моп Зеддегп та

Метегом у кн.: "Системах експресії генів" (під ред. Фернандеза та Хофлера, "Академік Пресе". ("Асадетіс

Ргезв"), Сан Діего, Каліфорнія, 1999, гл.5, стор.112-157). 70 Було продемонстровано, що системи експресії білків можуть бути ефективно використані як іп мімо, так і іп міго. Наприклад, був описаний ефективний перенос генів у лускатоклітинну пухлину людини амплікон-вектором вірусу простого герпесу (ВПГ) типу 1 (Сагеум еї аї., 1998, Ат. 9. Зиго., 176:404-408)|. Вірус простого герпесу використовують для переносу генів у нервову систему |Соїпз еї аіЇ., 1997, 9. МеишгомігоІ., З (Додаток 1 ):580-8Ї. Спрямовані суїцидальні вектори з використанням ВПГ-ТК були протестовані на твердих пухлинах 7/5 ІЗтйеу еї а, 1997, Нит. Сепе ТНег., 8(8):965-771. Вектор вірусу простого герпесу типу 1 використовували для генної терапії раку на клітинах карциноми ободової кишки |(Мооп еї аї!., 1998, Апп. Зига., 228(3):366-74|.

Гібридні вектори були удосконалені для збільшення періоду трансфекції, включаючи гібриди (ВПГ/ААВ) (аденоасоційований вірус) для лікування гепатоцитів (Егаеєгеї! еї аі!., 1997, Мої. Мед., 3(12):813-8251.

Вірус коров'ячої віспи був удосконалений для генної терапії людини завдяки своєму великому геному 2о МКРеріїпзкі еф а. 1998, Зига. Опсої. Сп. М. Ат., 7(3):2575-88). Було описане використання вірусу коров'ячої віспи з видаленою тимідинкіназою з експресією пуринової нуклеозидпірофосфорилази як вектору генної терапії, спрямованої на пухлину (РийІтанп еї аї., 1999, Нитап Сепе Тнегару, 10:649-657|.

Було описане використання аденоасоційованого вірусу 2 (ААВ) в генній терапії людини, проте ААВ потребує допоміжного вірусу (наприклад, аденовірусу або вірусу герпесу) для оптимальної реплікації та упаковування в сч об Клітинах ссавців. І|Зпоеск еї аї., 1997, Ехр. Мернигоі, 5(6):514-20; Каріпом/й2 еї а. 1998, Сит. Орп.

Віоїесппої., 9(5):470-5Ї1. Проте було описане упаковування іп міго інфекційного рекомбінантного ААВ, що, тим і) самим, зробило цю систему значно більш перспективною (|Оіпо еї аї!., 1997, Сзепе Тпегару, 4:1167-1172). Було показано, що викликана ААВ передача кДНК екотропічного ретровірусного рецептора уможливлює екотропічну трансдукцію ретровірусу сталих та початкових клітин людини |Сіпо еї аі., 1997, У. Мігоіоду, 71(7):5663-5667). («З зо Була продемонстрована генна терапія раку з використанням вектора ААВ, що експресував роЗ3 людини природного типу (Оаліїрази еї аіЇ., 1997, Сепе ТПегару, 4:675-682). Також було показано передачу гена в ісе) судинні клітини з використанням ААВ векторів (Маеаа еї аї., 1997, Сагаіомазсціаг Кез., 35:514-521|. ААВ був ю показаний як придатний вектор для генної терапії, спрямованої на печінку |Хіао еї аїЇ, 1998, У. Мігої., 72(12)3: 10222-6Ї. Були описані вектори ААВ для застосування в генній терапії тканин мозку та центральної о нервової системи |СпатрБбегіїп еї аіЇ.,, 1998, Вгаіп Кев., 793(1-2): 169-755; Юигіпд еї аі., 1998, Сепе Тпегару, ї- 5(6):"820-7|. Також вектори ААВ були порівняні з аденовірусними векторами (АдВ) для генної терапії легенів та передавання до клітин епітелію людини з міхуровим фіброзом |Тегатоїйо еї аї., 1998, 9. Мігої, 72(11):8904-12).

Векторні системи генної терапії химерними аденовірусами та ретровірусами включають корисні властивості кожного вірусу для створення неінтегрованого аденовірусу, який стає функціонально інтегрованим за допомогою « проміжного утворення ретровірусної клітини-продуцента (Гепу еї а), 1997, Маї. Віобесппоіоду, 15(9):866-70: з с Віїрао еї аїЇ.,, 1997, РАБЕВ .., 11(8):624-34) Це могутнє нове покоління векторів генної терапії було . пристосовано для цілеспрямованої генної терапії раку |ІВіїрао еї аІ., 1998, Адм. Ехр. Меа. Віої, 451:365-74). и?» Разова ін'єкція аденовірусу з експресією р5З інгібувала зростання вузликів підшкірної пухлини знесилених ракових клітин людини (Аздагі еї аі., 1997, Іпб у. Сапсег, 71(3):377-82) Було описане генне перенесення натурального р53. викликане аденовірусами, у пацієнтів з пізньою стадією раку легенів з великими клітинами -І ІзспШег еї аї., 1998, Нитап Сепе ТНегару, 9:2075-20821. Цей же вид раку був об'єктом терапії заміщенням гена роЗ за допомогою векторів аденовірусів |(Коїй еї а), 1998. Зетіп. ОпсоіІ., 25 (3 Додаток 8):33-7)|. Генний о перенос р53 за допомогою аденовірусів інгібує диференціацію ендотеліальних клітин та ангіогенез іп мімо с ІКіссіопі еї аЇ,, 1998, Сепе ТПег., 5(6):747-54) Була також описана викликана аденовірусами експресія 5р антигену меланоми др75 як імунотерапія метастатичної меланоми |Нігеспом/й» еї а, 1998, Сепе ТНегару.

Ме, 5:975-983). Аденовірус полегшує інфікування клітин людини екотропічним ретровірусом та підвищує сп ефективність ретро вірусної інфекції (Зсой-Тауїог еї аЇ,, 1998, Сепе Тег, 5(5):621-9). Вектори аденовірусів використовували для генного перенесення до васкулярних клітин гладких м'язів (Гі еї аі., 1997, Спіп. Меа. .. (Епаї.), 100(12):950-4), клітин плоскоклітинного раку ((Соере! еї аїЇ., 1998, ОюІагупо! Неай Меск зига., дво 119(4):331-6), клітин раку стравоходу |Зептаги еї а, 1998, Іпб У. Сапсег, 78(3):366-71), мезангіальних клітин |(Майтап еї аї., 1998, 9. Іпмевід. Мей., 46(5):204-9), гліальних клітин |Спеп еї аїЇ.. 1998, Сапсег

Ф) Кевз., 58(16):3504-7| та до суглобів тварин Ц(ІКеда еї аїЇ., 1998, 9. КПпецйтайю! 25(9): 1666-73). Зовсім ка нещодавно було продемонстроване перикардіальне генне перенесення за допомогою катетера, викликане векторами АсМ ІМагсп еї аї.,, 1999, Сііп. СагаїфІ.,, 22(1, Додаток 1): 123-9). Маніпулювання системою бо аденовірусів відповідними регулюючими генетичними елементами уможливлює регульовану цілеспрямовану генну експресію за допомогою аденовірусу іп мімо (Вигсіп ег аїІ., 1999, РМАБЗ (О5А), 96(2)355-60)1.

Вектори альфа-вірусів були вдосконалені для застосування в генній терапії людини з лініями клітин упаковування, придатними для трансформації касетами експресії. придатними для використання з вірусом

Сіндбіс та векторами вірусного походження Семліки Форест |Роїо еї аі., 1999, Ргос. Май). Асай. Зсі., США, 65 96:4598-4603). Були також розроблені флавівірусні репликонові системи на основі РНК, які не відносяться до захворювання клітин (МагааузКі еї аїЇ., 1999, Мігоіоду, 255(2):366-75|. Вектори вірусу сінбіс, які містять ген-самогубець ВПГ-ТК, використовувалися для спрямовування до конкретних клітин пухлини |іта еї аї., 1998,

Іпї. У. Сапсег, 80(1): 110-8).

Ретровірусні вектори на основі пінистого вірусу людини (ПВЛ) є також перспективними як вектори генної терапії ПтоБгідде еї а), 1998, Нитап Зепе Тпегару. 9:2517-2525). Вектори опінистих вірусів були сконструйовані для терапії генами-самогубцями |МевзЦег ей аїЇ., 1997, Сепе Тпег., 4(11): 1270-7).

Рекомбінантний цитомегаловірус мишей та системи промоторів також використовувалися як вектори для експресії високого рівня (Маппіпао еї а/ї., 1998, у). Мігої. Мейй., 73(І):31-9; Топа еї а!., 1998, Нубгідота, 18(1):93-7).

Доставка генів до клітин, які не діляться, стала здійсненною завдяки утворенню векторів на основі вірусу 70 Сендай |Макапівні еї аї., 1998, 93. СопігоЇеа Кеїеазе, 54(1):61-81І.

В інших спробах уможливити трансформацію соматичних клітин, що не діляться, були досліджені лентивірусні вектори. Була описана генна терапія фіброзно-кістозної дегенерації з використанням вектора на основі вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ) з відсутністю реплікації |СоЇдтап еї аї., 1997, Нитап Сепе Тпегару, 8:2261-2268|. Була також продемонстрована тривала експресія генів, які доставляються в печінку та м'язи /5 лентивірусними векторами (Каїі еї аі., 1997, Маї. Сепеї, 17(3)314-7). Проте переважає турбота про безпеку, і розробка удосконалених векторів йде швидкими темпами (Кіт еї аї., 1998, 9. Мігоі., 72(2):994-10041.

Дослідження І ТК-послідовності (довгого кінцевого повтору) ВІЛ і білка Таї надає важливу інформацію про структуру геному для розробки векторів |(Задаїє еї аї., 1998, 9. Міго!., 72(2):994-1004). Таким чином, зараз є краще зрозумілими генетичні вимоги до ефективного вектора на основі ВІЛ (Сазті еї аї., 1999, у). Мігої., 2о 73(3): 1828-34) Були описані вектори, які самоінактивуються, або умовні лінії клітин упаковування

Інаприклад, 2цШШегу еї аї., 1998, 9. МігоІ.,, 72(12):9873-80; Міуовзпі еї аї., 1998. 9. МігоіІ., 72(10):8150-7;

ОМШІ ей аїЇ., 1998, у. МігоІЇ.,, 72(11):8463-71; та Каш еї аї, 1998, Мігоїюду, 249(1): 1167-74). Була продемонстрована ефективна трансдукція лімфоцитів людини і клітин СОЗ4А- векторами ВІЛ ІЮоцдіаз еї аї., 1999,

Нит. Сепе ТНег., 10(6):935-45; Міуозпі еї аїЇ.,, 1999, Зсіепсе, 283(5402):682-6) Була описана ефективна сч ов трансдукція клітин людини, які не діляться, лентивірусними векторами вірусу імунодефіциту кішок (ВІК), яка мінімізує турботи про безпеку при використанні векторів на основі ВІЛ (|Роезсніа еї аї, 1998, Маїйцге Медаісіпе, і) 4(3):354-357|. Було продемонстровано продуктивне інфікування мононуклеарних клітин крові людини векторами

ВІК Юоппзюгп еї аї., 1999, ). Мігої. 73(3):2491-8).

Оскільки з багатьма вірусними векторами важко поводитися, і спроможність до вставки ДНК обмежена, ю зо дослідження були спрямовані на ці обмеження та недоліки. Наприклад, крім спрощених вірусних ліній клітин упаковування, для полегшення маніпулювання генетичним матеріалом та створення вірусних векторів були ікс, розроблені мінівирусні вектори, отримані з вірусу герпесу людини, вірусу простого герпесу типу І (ВПГ-1) та ю вірусу Епштейна-Барра (ВЕБ) |(МУапо еї аї., 1996, 9. Мігоіоду, 70(12):8422-8430). Раніше було продемонстровано, що адапторні плазміди спрощують вставку чужорідної ДНК у ретровірусні вектори, незалежні від о вірусів-помічників (1987, 9. Мігоїоду. 61(10):3004-30121). ї-

Вірусні вектори не є єдиним засобом здійснення генної терапії, оскільки було також описано кілька невірусних векторів. Було продемонстровано, що результатом дії спрямованого невірусного вектора генної доставки на основі використання полісплетення епідермального фактора росту (ЕФР) та ДНК (ЕФР/ДНК) є ефективна та конкретна доставка генів |Стів(апо, 1998, Апіісапсег Кев., 18:3241-3246). Була продемонстрована «

Генна терапія судинної мережі та ЦНС з використанням катіонних ліпосом (Мапа еї а!., 1997, ). Мешгоїгаита, з с 14(5):281-97| Була також здійснена короткочасна генна терапія панкреатиту з використанням катіонних ліпосом . ІОСеппат еї аї., 1998, Апп. Зи!ига., 227(6):812-20). Було продемонстровано, що ефективними для генної доставки є и?» комплекси вектора на основі хітозану та ДНК ІЕграснег еї а!., 1998, Рпапт. Кез., 15(9): 1332-9). Був описаний невірусний вектор доставки ДНК на основі триплексної системи |Кіт еї аї!., 1998, 53(1-3): 175-82). Комплекси

Ліпосом, покритих частками вірусів, також використовувалися для здійснення генного переносу |Нігаї еї аї., -І 1997, Віоспет. Віорпуз. Кев. Соттип., 241(1): 112-8).

Була продемонстрована генна терапія раку прямими ін'єкціями в пухлину невірусного вектора 17, який кодує 1 ген тимідинкінази (Спеп еї а!., 1998, Нитап Сепе ТПегару, 9:729-736). Готування плазмідної ДНК є важливим для с генного переносу прямими ін'єкціями |Ногп еї аі., 1995, Нит. Сепе ТПег., 6(5):656-73)|. Модифіковані плазмідні 5р вектори були пристосовані конкретно для прямих ін'єкцій ІНагікка еї а/ї., 1996, Нит. Сзепе ТПег., 7(10): 1205-17.

Ме, Таким чином, у цій галузі техніки відсомий широкий ряд векторів та конструкцій генного переносу/генної сп терапії. Ці вектори можна легко пристосувати для використання в способах згідно з цим винаходом. Шляхом відповідного маніпулювання з використанням технологій рекомбінантної ДНК/молекулярної біології для вставки оперативно зчепленого Згс (як активного, так і неактивного) в обраний вектор експресії/доставки можна ов утворити багато еквівалентних векторів для реалізації цього винаходу.

Е. Способи модулювання ангіогенезу

Ф) Цей винахід забезпечує спосіб модулювання ангіогенезу у тканині, пов'язаній з процесом або станом ка захворювання, за допомогою чого в тканині здійснюються ті процеси, що залежать від ангіогенезу. Взагалі цей спосіб включає застосування до тканини, пов'язаної з процесом або станом захворювання, сполуки, яка містить бо достатню для модулювання ангіогенезу кількість Зго-білка або вектора нуклеїнової кислоти, шо здійснює експресію активного або неактивного 5гс.

Як описано тут, в будь-якій з ряду тканин або органів, що складаються з органічних тканин, може бути підтриманий ангіогенез в станах захворювання, включаючи шкіру, м'язи, кишки, сполучну тканину, суглоби, кістки і подібні тканини, у яких можуть виникати кровоносні судини при впливі ангіогенних стимулів. 65 Краще, якщо пацієнт, якого лікують згідно з цим винаходом у багатьох варіантах його реалізації, є людиною, хоча слід розуміти, що основні принципи винаходу вказують на те, що винахід є ефективним стосовно всіх ссавців, які, як передбачається, повинні бути включені до терміну "пацієнт" У цьому контексті розуміється, що до поняття "ссавець" включені усі види ссавців, для яких є бажаним лікування тканини, пов'язаної з захворюваннями, з якими пов'язаний ангіогенез, зокрема, види сільськогосподарських та свійських ссавців.

Таким чином, цей спосіб включає прописування пацієнту терапевтично ефективної кількості фізіологічно придатної сполуки, що містить Зго-білок або вектор ДНК для експресії Зго-білка для реалізації способів згідно з цим винаходом.

Дози для прописування 5го-білка змінюються в залежності від форми білка та його ефективності, як тут 7/0 описується далі. Кількість дози є достатньо великою для забезпечення бажаного ефекту, при якому ангіогенез та симптоми захворювання, пов'язані з розвитком кровоносних судин, поліпшуються. Проте дози не повинні бути настільки великі, щоб викликати несприятливі побічні ефекти, наприклад, синдроми підвищеної грузькості, набряк легенів, закупорку серцевих судин тощо. Взагалі, доза залежить від віку, статі. стану пацієнта, ступеня розвитку хвороби пацієнта і може бути легко визначена спеціалістом у цій галузі. У випадку будь-яких /5 ускладнень доза також може регулюватися особистим лікарем.

Терапевтично ефективна кількість складає таку кількість Зго-білка або нуклеїнової кислоти, яка кодує (активний або неактивний) Згсо-білок, достатній для здійснення помітного модулювання ангіогенезу у тканинах, підданих лікуванню, тобто кількість, достатню для модулювання ангіогенезу. Модулювання ангіогенезу може бути обмірено аналізом ХАМ, як тут описано, або будь-якими іншими методами, відомими спеціалісту у цій галузі 2о техніки.

Зго-білок або вектор нуклеїнової кислоти, який експресує Зго-білок, можна назначати парентеральним способом шляхом ін'єкції або шляхом поступового вливання протягом часу. Хоча звичайно тканина тіла, яка потребує лікування, може бути доступна шляхом систематичного лікування, і, отже, частіше усього обробляється шляхом внутрішньовенних вливань терапевтичних сполук, розглядаються й інші тканини та засоби доставки. с об Таким чином, сполуки згідно з цим винаходом можуть бути введені внутрішньовенним, внутрішньочеревним, внутрішньом'язовим, підшкірним, внутрішньопорожнинним та крізьшкірним шляхом і можуть бути доставлені і) перистальтичними засобами.

Терапевтичні сполуки, які містять Зго-білок або вектор нуклеїнової кислоти, який експресує Зго-білок, звичайно можна ввести внутрішньовенним шляхом, як, наприклад, при ін'єкції разової дози. Термін "разова доза" ю

Зо бтосовно до терапевтичної сполуки згідно з цим винаходом позначає фізично дискретні одиниці, які є придатними як одиничні дози для суб'єкта, причому кожна одиниця містить заздалегідь визначену кількість ікс, активного компонента, визначеного для одержання бажаного терапевтичного ефекту у поєднанні з необхідним ю розріджувачем; тобто носієм або наповнювачем.

В одному з кращих варіантів реалізації цього винаходу реагент вводиться єдиною дозою внутрішньовенним о

Зв ШЛЯХОМ. Локальне введення може бути здійснене шляхом прямої ін'єкції або шляхом використання анатомічно ї- ізольованих відділів, які ізолюють мікроциркуляцію систем органа-мішені, реперфузію системи циркуляції, або тимчасову закупорку на основі катетера областей-мішеней судинної мережі, пов'язаної з хворими тканинами.

Сполуки водяться способом, сумісним з формулою дози та в терапевтично ефективній кількості Кількість та час введення залежить від об'єкта, який піддається лікуванню, спроможності систем об'єкта до вживання « активного інгредієнта та ступеню бажаного терапевтичного ефекту. Точна кількість активного інгредієнта, пт») с необхідна для введення, залежить від думки спеціаліста та є індивідуальною для кожного пацієнта Проте придатні діапазони дози для систематичного застосування тут розкриті і залежать від шляху введення. Придатні з режими введення також різноманітні, але типізовані за початковим введенням, після якого слідують повторні введення доз з інтервалом в 1 або більш годин шляхом наступної ін'єкції або іншого виду введення. В альтернативному варіанті розглядаються постійні внутрішньовенні вливання, достатні для підтримання -І концентрації в крові в межах, зазначених для лікування іп мімо. 1. Інгібування ангіогенезу. о Інгібування ангіогенезу є важливим при різноманітних захворюваннях, які називаються ангіогенними с захворюваннями. Такі захворювання включають, не обмежуючись лише цим, запальні розлади, наприклад, 5ор алергічне і неалергічне запалення, хронічний суглобний ревматизм та псоріаз, розлади, пов'язані з

Ме. невідповідною або невчасною інвазією судин, наприклад, діабетичну ретинопатію, неоваскулярну глаукому, сп рестеноз, капілярну проліферацію в атеросклеротичних бляшках та остеопороз, і розлади, пов'язані з раком, наприклад, тверду пухлину, метастази твердої пухлини, ангіофіброми, ретролентальну фіброплазію, гемангіоми, саркому Капоші і подібні ракові захворювання, які потребують неоваскуляризації для підтримання зростання

Б ПУХЛИНИ.

Таким чином, методи, які інгібують ангіогенез у тканині, пов'язаній із станом захворювання, покращують

Ф) симптоми захворювання і, в залежності від захворювання, можуть сприяти лікуванню хвороби. В одному варіанті ка реалізації у винаході розглядається інгібування ангіогенезу, по суті, у тканині, пов'язаній із станом захворювання. Ступінь ангіогенезу у тканині, а отже, і ступінь інгібування, досягнутий за допомогою сучасних 60 методів, може бути оцінений рядом способів.

Так, в одному з варіантів реалізації винаходу тканиною, яку необхідно вилікувати, є запалена тканина, і ангіогенезом, який необхідно інгібувати, є ангіогенез запаленої тканини там, де спостерігається неоваскуляризація запаленої тканини. У цьому класі спосіб розглядає інгібування ангіогенезу в артричних тканинах, наприклад, у пацієнтів з хронічним суглобним ревматизмом, в алергічних та неалергічних запаленнях б5 тканин, у псоріатичних тканинах тощо.

В іншому варіанті реалізації винаходу тканиною, яку необхідно вилікувати, є тканина сітківки пацієнта з захворюванням сітківки, наприклад, діабетичною ретинопатією, виродженням плям або неоваскулярної глаукоми, та ангіогенезом, який необхідно інгібувати, є ангіогенез тканини сітківки там, де спостерігається неоваскуляризація тканини сітківки.

У додатковому варіанті реалізації винаходу тканиною, яку необхідно вилікувати, є тканина пухлини пацієнта з твердою пухлиною, метастазами, раком шкіри, раком грудей, гемангіомою або ангіофібромою, та подібними видами раку, і ангіогенезом, який необхідно інгібувати, є ангіогенез тканини пухлини там, де спостерігається неоваскуляризація тканини пухлини. Типові тканини твердої пухлини, які піддаються лікуванню за допомогою сучасних методів, включають тканини легенів, підшлункової залози, грудей, товстої кишки, гортані, яєчників і 70 подібні тканини. Інгібування ангіогенезу тканин пухлини є найкращим варіантом реалізації винаходу внаслідок важливої ролі, яку відіграє неоваскуляризація у зростанні пухлини. При відсутності неоваскуляризації тканин пухлини тканина пухлини не одержує необхідних живильних речовин, уповільнює зростання, припиняє додаткове зростання, регресує і, в кінцевому рахунку, перетворюється на некротичну, що призводить до загибелі пухлини.

Іншими словами, у цьому винаході передбачений спосіб інгібування неоваскуляризації пухлини шляхом інгібування ангіогенезу пухлини згідно з сучасними методами. Аналогічним чином у винаході передбачений спосіб інгібування зростання пухлини шляхом реалізації методів інгібування ангіогенезу.

Ці способи також особливо ефективні проти створення метастаз внаслідок того, що (1) їхнє утворення потребує васкуляризації первинної пухлини, щоб метастатичні клітини рака могли покинути первинну пухлину та (2) їхнє утворення в повторному осередку потребує неоваскуляризації для підтримання зростання метастаз.

В одному з варіантів реалізації цього винаходу у ньому передбачена реалізація способу разом з іншими методами лікування, наприклад, традиційною хіміотерапією, спрямованою проти твердої пухлини і призначено, для контролю утворення метастаз. Застосування інгібітору ангіогенезу звичайно здійснюється під час або після хіміотерапії, хоча бажано інгібувати ангіогенез після режиму хіміотерапії в той час, коли тканина пухлини буде реагувати на токсичну атаку стимулюванням ангіогенезу для відновлення шляхом подачі крові та с Живильних речовин до тканини пухлини. Крім того, бажано призначати способи інгібування ангіогенезу після хірургічного втручання, при якому тверда пухлина була видалена як профілактика проти метастаз. і)

Оскільки ці сучасні методи використовуються для інгібування неоваскуляризації пухлини, їх можна також застосовувати і для інгібування зростання тканин пухлини, для інгібування утворення метастаз пухлини і для регресії утворених пухлин. ю зо Рестеноз є процесом міграції клітин гладкої мускулатури (КІМ) та проліферації в тканину в місці підшкірної транспорожнинної коронарної пластичної операції на судинах, що утрудняє досягнення успіху при ісе) пластичній операції на судинах. Міграцію та проліферацію КГМ під час рестенозу можна розглядати як процес ю ангіогенезу, який можна інгібувати за допомогою сучасних методів. Отже, у винаході також розглядається інгібування у пацієнта рестенозу шляхом інгібування ангіогенезу згідно з сучасними методами, за яким слідують о зв процедури операції на судинах. Для інгібування рестенозу звичайно призначають інактивовану тирозинкіназу ї- після процедури операції на судинах внаслідок ризику рестенозу для стінок коронарних судин, звичайно протягом від 2 до 28 днів, а більш звичайно - протягом перших 14 днів після операції.

Цей метод інгібування ангіогенезу у тканинах, пов'язаних із станом захворювання, а. отже, і реалізації методів лікування захворювань, пов'язаних із ангіогенезом, включає контакт тканини, у якій відбувається « ангіогенез, або яка знаходиться під ризиком виникнення ангіогенезу, із сполукою, що містить терапевтично в с ефективну кількість інактивованого 5гсо-білка або вектора експресії цього білка.

Інгібування ангіогенезу і регресія пухлини відбувається через 7 днів після початкового контакту з ;» терапевтичною сполукою. Додаткова або більш тривала взаємодія з інактивним білком Згс краще триває протягом від 7 днів до 6 тижнів, краще від 14 до 28 днів. 2. Посилення ангіогенезу -І У випадках, в яких бажано підтримувати або стимулювати ангіогенез, корисно призначати до тканини активний Зго-білок. Засоби та час призначення сумісні з методами. описаними вище для інгібування ангіогенезу. о Е. Терапевтичні сполуки с У цьому винаході розглядаються терапевтичні сполуки, корисні для реалізації описаних тут терапевтичних 5р Методів. Терапевтичні сполуки згідно з цим винаходом містять фізіологічно придатний носій разом з білком 5гс

Ме. або вектором, здатним до експресії Зго-білка, як описано тут, розчиненим або розподіленим у ньому як активний сп компонент. У кращому варіанті реалізації винаходу терапевтична сполука не є імуногенною при призначенні ссавцям або людям у терапевтичних цілях.

При використанні тут терміни "фармацевтично припустимий", "фізіологічно придатний" та їхні граматичні ов варіанти у відношенні сполук, носіїв, розчинників та реагентів використовуються взаємозамінним чином і означають, що ці матеріали можна призначати ссавцям без виникнення небажаних фізіологічних ефектів, таких, (Ф, як нудота запаморочення, розлад шлунка тощо. ка Готування фармакологічної сполуки, що містить активні інгредієнти, розчинені або розподілені в неї, є добре відомим у цій галузі техніки і не потребує обмеження на основі формули. Звичайно такі сполуки готують у бо вигляді ін'єкцій рідин або суспензій, проте можна приготувати і тверді форми, придатні для розчинення або суспензування в рідині перед використанням. Препарат можна також емульгувати або представити у вигляді ліпосомної сполуки.

Активний інгредієнт можна змішати з наповнювачами, які є фармацевтично прийнятними і сумісними з активним інгредієнтом, і в кількостях, придатних для використання в описуваних тут терапевтичних методах. 65 Придатними наповнювачами є, наприклад, вода, соляний розчин, декстроза, гліцерин, етанол або подібні їм наповнювачі та їхні комбінації. Крім того, при необхідності сполука може містити незначні кількості допоміжних речовин, наприклад, агентів, що змочують або емульгують, рН-буферних агентів і тому подібних речовин, що посилюють ефективність активного інгредієнта.

Терапевтична сполука згідно з цим винаходом може містити фармацевтично припустимі солі з будь-яких солетворних компонентів. Фармацевтично припустимі солі включають солі з додаванням кислот (утворені вільними аміногрупами поліпептиду), які утворюються такими неорганічними кислотами, як, наприклад, соляна або фосфорна кислоти, або такими органічними кислотами, як, наприклад, оцтова, винна, мигдальна тощо. Солі, утворені вільними карбоксильними групами, можуть бути також отримані з неорганічних основ, наприклад, таких, як гідроксиди натрію, калію, амонію кальцію або заліза, та органічних основ, наприклад, таких, як 70 ізопропіламін, триметиламін 2-2-етиламіноетанол, гістидин, прокат тощо.

Фізіологічно придатні носи для активних інгредієнтів добре відомі в цій галузі техніки. Зразковими рідкими носіями є стерильні водяні розчини, які не містять ніяких інших речовин, крім активних інгредієнтів та води, або містять буфер, наприклад фосфат натрію з фізіологічним значенням рнН, фізіологічний соляний розчин або обидва наприклад, у вигляді фосфат-буферного соляного розчину. Крім того, водяні носії можуть містити більш однієї буферної солі, а також такі солі, як хлориди натрію та калію, декстроза, поліетиленгліколь та інші розчини.

Рідкі сполуки можуть також містити рідкі фази крім води або замість її. Прикладами таких додаткових рідких фаз є гліцерин, рослинні олії, наприклад, бавовняна олія, та водомасляні емульсії.

Терапевтична сполука містить достатню для модулювання ангіогенезу кількість Зго-білка згідно з цим 2о винаходом або достатнього вектору експресії рекомбінантної ДНК для експресії ефективної кількості Зго-білка, і звичайно має такий склад, що містить принаймні 0,1 вагових відсотка Зго-білка від ваги всієї терапевтичної сполуки. Ваговий відсоток є ваговим співвідношенням Зго-білка та всієї сполуки. Таким чином, наприклад, 0,1 вагових відсотка складає О,1г Зго-білка на 100г всієї сполуки. Для векторів експресії ДНК призначувана кількість залежить від властивостей вектора експресії, тканини, яку треба піддати лікуванню, і подібних сч Міркувань. с. Виріб і)

У винаході також розглядається виріб, який є маркірованим контейнером для забезпечення Згсо-білка згідно з цим винаходом. Виріб включає пакувальний матеріал, забезпечений відповідним маркіруванням із вказівкою стана захворювання, який потрібно вилікувати, і фармацевтичним агентом, що міститься всередині пакувального (у зо матеріалу.

Фармацевтичний агент у виробі є будь-якою зі сполук згідно з цим винаходом, придатною для забезпечення ікс,

Зго-білка та виготовленою у вигляді фармацевтично припустимої форми, як описано тут, відповідно до ю викладених показань. Таким чином, сполука може містити Зго-білок або молекулу ДНК, яка має спроможність до експресії Зго-білка. Виріб містить кількість фармацевтичного агента, достатню для використання у лікуванні о з5 зазначеного на упаковці стана, як в разових, так і в багатократних дозах. ча

Пакувальний матеріал містить етикетку, на якій зазначене використання фармацевтичного агента, що міститься у ньому, наприклад, для лікування станів, яким може сприяти інгібування або посилення ангіогенезу, та подібних викладених на ній станів. Етикетка може, крім того, включати інструкції з використання і іншу пов'язану інформацію, яка може знадобитися для продажу. Пакувальний матеріал може включати контейнер(и) « для Зберігання фармацевтичного агента. в с При використанні в цьому описі терміном "пакувальний матеріал" позначають такий матеріал, як скло, . пластмаса, папір, фольга та подібні матеріали, які можуть утримувати фіксувальними засобами фармацевтичний а агент. Таким чином, наприклад, пакувальний матеріал може бути пластмасовою або скляною пробіркою, багатошаровою обгорткою і подібними контейнерами, використовуваними для утримання фармацевтичної сполуки, яка містить фармацевтичний агент. -І У кращих варіантах реалізації винаходу пакувальний матеріал включає етикетку, яка є реальним описом вмісту виробу та використання фармацевтичного агента, який міститься в ньому. 1 Приклади с Наступні приклади, які відносяться до винаходу, є ілюстративними і, звичайно, не повинні тлумачитися як 5о такі, що зокрема обмежують винахід. Більш того, такі варіації винаходу, що відомі зараз або будуть розроблені

Ме, пізніше і які знаходяться в межах компетенції спеціаліста у цій галузі техніки, повинні розглядатися як такі, с що знаходяться в межах цього заявленого нижче винаходу. 1. Готування конструкцій експресії с-Згс

Для приготування конструкції експресії, корисної при моделюванні ангіогенезу за допомогою способів згідно дв З цим винаходом здійснюють маніпулювання кДНК с-5гс та її вставку в конструкцію/вектор експресії.

Послідовність КДНК, яка кодує натуральний (наприклад, ендогенний) с-Згс курчат, показана на Фіг.1 (ідент.

Ф) Мо посл.: 2), а кодована послідовність амінокислотних залишків показана на Фіг.2 (ідент. Мо посл.: 3). Кодовану ка білкову послідовність транслюють з нуклеотидних положень кКДНК 112 до 1713. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка відповідає послідовності нуклеїнової кислоти людської КДНК с-5гс (ідент. Мо посл.: 4), і кодовані во послідовності амінокислотних залишків (ідент. Мо посл.: 5) показані на Фіг.3 і 4 відповідно. Для білкової послідовності людини кодуюча послідовність починається в нуклеотидному положенні 134 до 1486 кКДНнК.

Були приготовлені натуральні, а також ряд видозмінених кКДНК с-5гс. Видозмінені конструкції с-5го були приготовлені шляхом сайт-специфічного мутагенезу, як це було |описано Каріап еї а), ЕМВО )., 13:4745-4576(1994)). Видозмінені конструкції с-Згс для кодування видозмінених білків с-бгс для використання у 65 способах згідно з цим винаходом (описані у Каріап еї аЇ. там же. Каріап еї а. описують різноманітні видозмінені конструкції с-Згс і кодовані білки, корисні для реалізації цього винаходу. |Наприклад, Каріап еї аІ.,, описують кілька алелів с-5гс курчат на їхній Фіг.1, включаючи 5Згс А і Зго251.

У цьому винаході описані дві категорії функції с-Згс для модулювання ангіогенезу. Як було описано раніше, одна категорія містить молекули 5гс, які посилюють ангіогенез і завдяки цьому вважаються активними білками. У цьому винаході продемонстровано, що натуральні 5гс разом з різноманітними мутаціями стимулюють ангіогенез.

Однією кращою мутацією натурального с-Згс, яка функціонує в цьому контексті щодо його спроможності стимулювати зростання кровоносних судин і, таким чином, підвищує вагу пухлини іп мімо, є мутант 5гс А, який має крапкову мутацію в положенні 527 амінокислотного залишку, яка змінює тирозин 527 на фенілаланін. Цей сайт є звичайно сайтом негативного регулювання кіназою с-Згс, називаною тут кіназою СК. Коли СК 7/0 фосфорилює амінокислоту 527 у натуральному згс, білок інактивується. Проте у видозміненому Згс А регулятивний тирозин перетворився на фенілаланін, таким чином, зробивши білок конститутивно (тобто постійно) активним білком, який не піддається інактивації фосфорилуванням.

Було також продемонстровано, що мутації гос мають протилежний модулюючий вплив на ангіогенез і інгібують ангіогенез замість його стимулювання. Такі мутації називаються неактивними мутаціями Згс. Білки, які мають мутацію, що надає їм інгібуючу дію, також називаються домінантними негативними Згс-білками, оскільки вони інгібують неоваскуляризацію, як в результаті ендогенної активності Згс, так і в результаті підвищеної активності гос внаслідок стимулювання фактора росту. Таким чином, певні мутації натурального с-Згс згідно з цим винаходом також можуть діяти як домінантні негативні білки щодо їхньої спроможності блокувати зростання кровоносних судин і, наприклад, внаслідок цього зменшувати вагу пухлини іп мімо.

Такий найкращий інгібуючий білок с-Згс включає Згс 251, у якому лише перші 251 амінокислот Згс піддаються експресії. У цій конструкції відсутній весь домен кінази, і тому її називають Зго-білюом "з мертвою кіназою".

Друга конструкція є мутацією Згс (К295М), у якій лізиновий амінокислотний залишок 295 мутує в метіонін. Ця крапкова мутація в домені кінази запобігає зв'язуванню аденозинтрифосфату, а також блокує залежні від кінази функції Згс, пов'язані з сигналізуванням та проліферацією васкулярних клітин і клітин пухлини. сч

Наприклад, для мутації в залишку 527, якщо одержуваний в результаті залишок видозміненої амінокислоти не є тирозином, серином або треоніном, в цьому винаході передбачається, що результатом присутності і) альтернативної амінокислоти в необхідному положенні є утворення бго-білка з необхідною активною модулюючою дією, яка сприяє ангіогенезу.

Щодо крапкових мутацій будь-яка мутація, результатом якої є необхідна інгібуюча або стимулююча ю зо активність, розглядається для використання у цьому винаході. Також розглядаються конструкції злитих білків, які комбінують необхідний Зго-білок (його мутацію або фрагмент) з експресованими кінцями амінокислот, ісе) антигенними детермінантами, флуоресцентним білком або будь-яким іншим білком або пептидами. якщо ю зберігається необхідний моделюючий вплив Згсо-білка.

ІС) з щі « 4 З с ;»

Однією кращою конструкцією експресії для використання в цьому винаході (конструкція ЗРВСОП-ВР'(А) (ідент. -І Мо посл.: 1). Цей вектор експресії заснований на ряді здатних до реплікації вірусів саркоми птахів з посиленою полімеразою Бріана (ПБ) для поліпшеного титру і є характерним для глікопротеїну оболонки типу А, 1 експресованого на нормальні клітини птахів (розглянуто в "Методах клітинної біології", 52:179-214 (1997). с див. також Нидпевз сеї аїЇ., 1987, 9. МігоЇ., 61:3004-3012; БРекейе та СерКко, 1993, Мої. Сеїїшаї Віо!., 13(4):2604-2613; Мой его а, 1996, ОЮОемеюортепі, 122:291-300; та БІОН еї аїЇ., 1998. ВіоТесппідіцев, б» 24:660-666)Ї. Повна послідовність ЗРВСОСП-ВР(А) (ідент. Мо опоел. 1) приведена в доданому переліку «п послідовностей, а рестрикційна карта конструкції зображена на Фіг.10 і називається тут ЗРВОСП.

Вихідна конструкція 5гсо 251 була субклонована доктором Пем Шварцберг в Національному інституті охорони здоров'я в лабораторії доктора Херольда Вармуса. Якщо стисло, то клонування послідовності КДНК Згс було здійснено шляхом вставки лінкера, який містить сайта рестрикції Мої І-ВвіВ1-Мої І, у єдиний центр Мої | у кінці 5' Зго 251. Згс має єдиний сайт Сіа І у кінці У Шляхом перетравлення Згс 251 з ВвіВ1 та Сіа | був (Ф) утворений фрагмент ВвіВ1-Сіа І який був потім лігований у сайт Сіа | на ЗРВСП-ВР(А). Виступ ВвіВ1

ГІ уможливлює лігування з виступом Сіа І, який не можна вдруге відрізати Сіа І. Конструкції Згс, придатні для використання при реалізації цього винаходу, можна легко одержати у вищевказаному векторі спочатку шляхом бр перетравлення вектора ЗРВСП, який містить Згс 251 з Мої | та Сіа І (у аденінметилазі ДНК ї- фон), щоб уможливити вставку перетравленої подібним чином кКДНК Згс. Отже, ця вихідна конструкція ЗРВСП-ВР(А), яка містить 5гс 251, далі використовувалася для субклонування всіх інших конструкцій Згс, |Як це було описано вище і у Каріап еї аї., (1994, Те ЕМВО )3., 13(20):4745-4756) у ЗРВСП-ВР(А) через фрагмент Мої І-Сіа І, утворений через конструкцію Згс. Для одержання необхідних мутацій с-5го у КДНК були використані стандартні ви процедури сайт-специфічного мутагенезу, знайомі спеціалісту в цій галузі техніки з середнім рівнем знань.

Праймери ЛРП, сконструйовані для введення необхідних мутацій, також були сконструйовані з сайтами рестрикції для полегшення наступних етапів клонування. Цілі сегменти кодуючих послідовностей нуклеїнової кислоти го видаляють з конструкції нуклеїнової кислоти за допомогою технологій ампліфікації ЛРП, заснованих на відомих послідовностях КДНК курчат, людини та подібних гомологів Згс і наступному утворенні нових конструкцій.

В одному варіанті реалізації цього винаходу праймер 3' ЛРП, використовуваний для ампліфікації нуклеїнових кислот Згс, також кодує послідовність у рамці. Використання цього праймера добавляє кінець антигенної детермінанти 9Е10-тус до карбоксильного кінця наступної конструкції 5гое.

Наступні амінокислоти були додані після амінокислоти 251 Згс для утворення векторних конструкцій, що 7/0 містять кінець антигенної детермінанти ЗЕ10-птус: МОМЕОКОАЕЕОІМ (ідент. Мо посл.: 6). Для кожної конструкції були проведені дві окремі ЛРП, і були отримані подібні результати. Всі конструкції-мутанти, сконструйовані

ЛРП, були також упорядковані ЛРП для закріплення прогнозованої послідовності ДІЇК клонів. Натуральні та мутовані кКДНК 5гс для використання в системах експресії згідно з цим винаходом також можна одержати в "Апстейт Байотек Лебораторіз" ("Орвіаіе Віоїесі І арогайогіев"), Лейк Плесід, Нью-Йорк, яка продає Згс птахів /5 та людини і кілька мутованих форм з мертвою кіназою та активованих форм.

Альтернативні вектори експресії для використання при експресії Зго-білків згідно і цим винаходом також включають аденовірусні вектори, як це |описано в патентах США МоМо4,797,368, 5,173,414, 5,436,146, 5,589,377 та 5,670,488). Альтернативні способи доставки модулюючих Бго-білків включають доставку кКДНК Згс за допомогою невіру спої векторної системи, |описаної в патенті США Мо5,675,954), та доставку самої кКДНК як 2о депротеїнизованої ДНК, (описану в патенті США Мое5,589,466). Доставка конструкцій згідно з цим винаходом також не обмежується локальним застосуванням вірусного вектора, як описується для системи аналізу ХАМ нижче. Наприклад, препарати вірусних векторів також упорскують внутрішньовенним шляхом для систематичної доставки в русло судини. Ці вектори також можуть бути спрямовані на центри підвищеної неоваскуляризації шляхом локалізованої ін'єкції, наприклад, в пухлину. сч

Експресовані іп мійго білки також розглядаються для їх доставки після експреси та очищення обраного

Зго-білка за допомогою способів, корисних для доставки білків або поліпептидів. Один з таких способів включає (8) системи доставки ліпосом, наприклад, такі, які були (описані в патентах США МоМо4,356,167, 5,580.575, 5,542,935 та 5,643.599). Інші системи доставки векторів та білків добре відомі спеціалістам у цій галузі техніки і середнім рівнем знань для використання для експресії та/або доставки Зго-білків згідно ї цим винаходом. ю зо 2. Характеризування необробленої хоріоалантоїсної мембрани (ХАМ) курчат

А. Приготування ХАМ ісе)

Ангіогенез може бути стимульований в хоріоалантоїсній мембрані (ХАМ) курчат після того, як внаслідок ю нормального зародкового ангіогенезу відбулося утворення зрілих кровоносних судин. Було продемонстровано, що ангіогенез може бути стимульований у відповідь на характерний цитокінез або фрагменти пухлини, як це о (описано І еїромісп еї аї., Майшге, 329:630 (1987) та А!йзргипК еї аїЇ.,, Ат. у). Раїйої., 79:594 (1975). ХАМ були ї- приготовлені з ембріонів курчат для наступного індукування ангіогенезу та його інгібування. Десятиденні ембріони курчат були отримані з птахофабрики "Макінтайр" (Лейксайд, Каліфорнія), інкубувалися при 37 С та вологості 6095. У шкаралупі з боку, прямо протилежного повітряному мішечку, був зроблений невеличкий отвір за допомогою невеличкого промислового свердла (фірми "Дремель", підрозділу компанії "Емерсон Електрик", «

Расін, Вайомінг). Другий отвір був просвердлений на широкій стороні яйця в ділянці, вільній від кровоносних шщ с судин ембріона, попередньо визначеній просвічуванням. До першого отвору був прикладений негативний тиск, й який призвів до відтягування ХАМ (хоріоналантоїсної мембрани) від мембрани шкаралупи та створення «» несправжньою повітряного мішечка над ХАМ. Було прорізано квадратне вікно 1х1см у шкаралупі над опущеною

ХАМ з використанням невеличкого модельного точильного кола (фірми "Дремель"). Це невеличке вікно дозволило здійснити безпосередній доступ до ХАМ, що лежить нижче. -І Утворений в результаті препарат ХАМ був використаний або після б днів ембріогенезу, стадії, яка характеризується активною неоваскуляризацією, без додаткового обробляння ХАМ, як модель для оцінки

Мн впливу на ембріональну неоваскуляризацію, або після 10 днів ембріогенезу, коли ангіогенез припинився. Таким 1 чином, останній препарат був використаний у цьому винаході для індукування відновленого ангіогенезу у

Відповідь на обробляння цитокіном або контакт з пухлиною, як описано нижче. б З. Аналіз ангіогенезу ХАМ сл А. Ангіогенез, викликаний факторами росту

Було показано, що ангіогенез може бути викликаний цитокінами або факторами росту.

Ангіогенез був викликаний шляхом розміщення пластини фільтра Ватману 5 хомм (фільтрувальний папір

Ватману Мої), змоченої збалансованим соляним розчином Хенкса (ЗСРХ) ("ПБКО", Гренд Айленд, штат

Нью-Йорк) або ЗСРХ, що містить 2 мікрограма/мілілітр (мкг/мл) рекомбінантного основного фактора росту о фібробластів (ОФРФ) або фактору росту судинного ендотелію (ФРСЕ) ("Гензім", Кембридж, штат Масачусетс) на ко ХАМ 9- або 10-денного ембріона курчати у ділянці, віддаленій від кровоносних судин, і наступного запечатування вікон стрічкою. Інші концентрації факторів росту також ефективні для індукування зростання бо кровоносних судин. У спостереженнях, у яких інгібування ангіогенезу оцінюється внутрішньовенним введенням антагоністів, анпогенез спочатку індукується 1-2мкг/мл оФРФ або ФРСЕ у середовищі росту фібробластів.

Ангіогенез спостерігали за допомогою фотомікроскопа через 72 годин

В. Ангіогенез ембріона

Препаратом ХАМ для оцінювання впливу інгібіторів ангіогенезу на природне утворення нових судин ембріона 65 є б-денний ембріон курчати, як було описано вище. На цій стадії розвитку кровоносні судини проходять зростання де помо і, таким чином, забезпечують корисну систему для оцінювання модулювання ангіогенезу

Зго-білками згідно з цим винаходом. Систему ХАМ готують так, як описано вище, з тим винятком, що аналіз здійснюють на 6-й день ембріонального розвитку, а не на 9-й або 10-й день. 4. Модулювання ангіогенезу, виміряне у дослідженні ХАМ

Для оцінювання впливу Зго-білка на ангіогенез були проведені наступні дослідження препаратів ХАМ 10-денного курчати. П'ять мкг конструкцій ЗРВСП. приготовлених так, як описано в Прикладі 1, були піддані трансфекції в іморталізовану лінію фібробластів курчат ОБ-1 (дарунок Дуга Фостера, Університет Мінесоти). Ця лінія клітин, а також первинні фібробласти ембріона курчати були спроможні до утворення вірусу, проте лінія клітин ОБ-1 утворила більші титри. Плаваючі на поверхні віруси були зняті зі злитих ліній клітин-продуцентів у бЕл1У цитозольподібному середовищі, вільному від сироватки (склад: основне середовище Е-10, доповнене диметилсульфоксидом. фолієвою кислотою, глутаміновою кислотою і МЕМ вітамінний розчині. Тридцять п'ять мл суспензії вірусів були концентровані шляхом ультрацентрифугування при 4 «С протягом 2 годин на швидкості 22000об./хв. Ці концентровані вірусні гранули були знову суспензовані в об'ємі 11100 від початкового об'єму цитозольподібного середовища. вільного від сироватки, розділені на аліквоти та зберігалися при температурі 75 -809С. Титр був оцінений серійним розчиненням контрольного вірусного вектора, який має нуклеотидну послідовність, що кодує зелений флуоресціюючий білок (ЗФБ). який називається ЗРВСП-ЗФБ, зараження на первинних фібробластах ембріона курчати, що були інкубовані протягом 48-72 годин. Титри вірусних ліній, які були отримані після концентрації, регулярно перевищували 10 8 міжнародних одиниць на мл. Для дослідження

ХАМ з використанням вірусних ліній були підготовлені протягом ЗО хвилин у Змг/мл ацетату кортизону в 9595 етанолу фільтрувальні пластини Ватману діаметром бмм. змочені ацетатом кортизону. Пластини були висушені у витяжній шафі з ламінарним потоком, а потім вимочені протягом 10 хвилин у 2Омл вірусної лінії на кожну пластину. Ці пластини були притиснуті до ХАМ 9- або 10-денних ембріонів курчат і запечатані целофановою стрічкою та інкубовані при 372С протягом 18-24 годин. Потім у концентрації 5мкг/мл до ХАМ в об'ємі 20мкл відповідної вірусної лінії добавляли контрольний фосфатний буферний розчин (ФБР) або фактори росту як се додаткову підтримку вірусу в тканині ХАМ. Після 72 годин ХАМ були зібрані та перевірені на предмет зміни о ангіогенного показника, як визначено подвійним сліпим перераховуванням числа точок розгалуження в ХАМ, розташованій під пластиною. Для кіназних досліджень тканина, розташована під пластиною, була зібрана для радіоїмунопреципітаційного аналізу (РІПА), гомогенізована на моторизованому млині та Зго-імунопрециштовані з еквівалентної кількості всього білка та піддана кіназному дослідженню іп мйго з використанням злитого білка ІФ) кінази з фокальною адгезією та глутатіон-з-трансферази (КФА-Г-5-Т) як субстрату. Для імунофлуоресцентного «со вивчення тканина ХАМ. яка знаходилася під пластинами, була заморожена в кріоконсерванті ОСТ, розділена по 4мкм зафіксована в ацетоні протягом 1 хвилина, інкубована в 395 звичайній козячій сироватці протягом 1 години, ів) після чого інкубована в первинному антифосфорильованому антитпі ПРСК (позаклітинної регульованої сигналом ю кінази) кроля, як було описано вище (ГЕїЇїсеїп еї аї., у. Се! ВіоіІ., 140:1255-1263 (1998)), відмиті у ФБР (фосфатному буферному розчині - прим. перекладача) та визначені за допомогою повторного флуоресціюючого че антитіла.

А. Стимуляція ендогенного Згсо за допомогою оФРФ та ФРСЕ

Для оцінювання впливу факторів росту на активність 5гс у модулюванні анпогенезу були проведені такі « дослідження. Були розкладені екстракти тканини ХАМ 10-денних курчат, які були піддані впливу ОФРФ або ФРСЕ (2мкг/мл) протягом 2 годин Ендогенний 5гсо-білок був імунопреципітований з еквівалентної кількості загального ші с білка та підданий імунокомплексному кіназному дослідженню іп міїго з використанням злитого білка КФА-Г-5-Т як м субстрату, підданий електрофорезу та перенесений на нітроцелюлозу. ,» Результати дослідження приведені на Фіг.5, на якій очевидним є збільшення активності Згс в збільшеній густині гелю, обробленого оФРФ або ФРСЕ у порівнянні з необробленими (контрольними) зразками, які вказували на базову активність 5го-білка у дослідженні ХАМ. Обробляння і оФРФ, і ФРСЕ призводить до - збільшення присутньої в ХАМ ендогенної активності Зго-білка приблизно в два рази. Згадане вище кіназне сл дослідження бляшки також було проведено з використанням анти-5гс антитіла як контролю вмісту еквівалента

Згес та імуноглобуліну. о В. Вплив ретровірусної генної експресії 5гс А на ангіогенез ХАМ курчат бо 50 Наступне дослідження було проведено для оцінювання впливу видозмінених Зго-білків на ангіогенез в препараті ХАМ. Для цього дослідження ХАМ 9-денних курчат були піддані впливу ЗРВСП-5гс А або ЗРВСП-ЗФБ, сл що експресують ретровіруси, або буфера протягом 72 годин після описаної вище процедури.

Результати цього дослідження приведені на Фіг.бА, у якому рівень ангіогенезу був визначений так, як було описано вище. Характерні мікрофотознімки (з чотириразовим збільшенням) були зроблені стереомікроскопом, як показано на Фіг.6В. Основна лінія активності ендогенного 5Згс має ангіогенний показник приблизно 50. Навпаки, о ХАМ. оброблені експресованим ретровірусним вектором ЗРВСП-5гс А, який має крапкову мутацію у позиції 527 амінокислотного залишку від тирозину до фенілаланіну, що призвело до підвищення (індукування) ангіогенного їмо) показника ангіогенезу приблизно до 90. Підвищення ангіогенезу, викликаного Зго-А, також можна бачити на фотографіях, показаних на Фіг.6В. 60 С. Ретровірусна експресія гос А активує судинне активоване мітогеном протеїнкінази (АМП) фосфорилування

Вплив 5гс А в порівнянні з фактором росту ФРСЕ та ФМА на судинне АМП фосфорилування також було оцінено після процедур дослідження, описаних вище у цьому описі. Екстракти тканин ХАМ 10-денного курчати, піддані впливу ВЗФР або ФМА (другий мітоген у порівняній концентрації) протягом 30 хвилин, порівнювалися з екстрактами тканин, які зараджувалися ретровірусом, що експресує Зго-А, протягом 48 годин. Потім Згс був 65 імунопреципітований з еквівалентної кількості загального екстракту білка та підданий імунокомплексному кіназному дослідженню іп міго з використанням злитого білка КФА-Г-5-Т як субстрату, піддані електрофорезу та перенесені на нітроцелюлозу.

Результати цього дослідження приведені на Фіг.7А, де необроблені ХАМ (ВЛ) проявляли фосфорилування судинної АМП кінази за допомогою ендогенного Згс основної лінії. І ФРСЕ, і ФМА призводять приблизно до дворазового збільшення у порівнянні з основною лінією. Навпаки, 5го-А підвищував активність приблизно у від 5 до 10 разів у порівнянні з необробленими зразками.

Аліквоти вищезгаданих лізатів цілих тканин також були виміряні для ендогенного фосфорилування ПРСК шляхом імуноблотингу антифосфо-ПРСК антитілом, як показано на Фіг.7В. Для цього оцінювання ХАМ 10-денних курчат інфікували контрольними ЗРВСП або ЗРВСП, які експресували 5гс А. Через два дні ХАМ препарували, 7/о піддали заморожуванню в ОСТ та розрізали на частини 4мкм. Частини офарбили з використанням імунної мітки антифосфорилованим антитілом ПРОСК ("Нью Інгліш Байолабз"), промили та розпізнали за допомогою протикролячого кон'югованого з ФІТЦ вторинного антитіла цапа. Флуоресцентні образи були зафіксовані камерою на охолоджуваних приборах з зарядовим зв'язком (фірми "Прінстон Інст."). На мікрофотознімках показана підвищена імунофлуоресценція препаратами, обробленими Згс А, у порівнянні з контрольними /5 препаратами.

О. Вибіркові вимоги до активності Згс під час ангіогенезу, викликаного ВФРЕК, а не оФРФ

Для оцінювання впливу модулюючої активності Згс на стимульований фактором росту ангіогенез були зроблені такі аналізи. ХАМ дев'ятиденних курчат піддали впливу ретровірусного векторного препарату, який здійснював експресію домінуючої негативної мутації 5гс, називаної гос 251 або гос К295М, як було описано вище. Ретровіруси ЗРВСП-Зго 251 або контрольні ЗРВСП-ЗФБ або буферні ХАМ обробляли протягом 20 годин, а потім інкубували ще протягом 72 годин при наявності або відсутності ОФРФ або ВФРЕК.

Рівень ангіогенезу, виміряний так, як було описано вище, показаний на Фіг.8А Репрезентативні мікрофотознімки (з шестиразовим збільшенням), показані на Фіг8В. були зроблені за допомогою стереомікроскопа. На Фіг.8С показана пляма, зондована анти-5гс антитілом для підтвердження експресії 5гс 251 сч 2гв У трансфекцірованих клітинах у порівнянні з контрольним оброблянням.

Результати аналізу, описаного вище, вказують на те, що як ХАМ, оброблені оФРФ. так і ХАМ, оброблені і)

ФРСЕ при контрольних ЗРВСП-ЗФБ стимулювали ангіогенез у порівнянні з викликаним Згс базовим ангіогенезом, який спостерігався в контрольних або необроблених препаратах ХАМ. Експресований домінантний негативний мутант Згс 251 був ефективний при інгібуванні викликаного ФРСЕ ангіогенезу до базових рівнів, але ю зо не ефективний при інгібуванні ангіогенезу, викликаного оФРФ. Мікрофотознімки, показані на ФІГ.8В, наочно підтверджують дані, показані на Фіг8А. Таким чином, ретровірусно експресований Згс 251 є ефективним ісе) інгібітором ангіогенезу, коли ангіогенез викликаний ФРСЕ. ю

У цьому винаході розглядаються застосування Зго-білків згідно з цим винаходом в інших моделях ангіогенезу, описаних нижче у Прикладах. о 5. Регресія зростання тканин пухлини модуляторами 5гс, виміряна шляхом аналізу моделі ока кролика іп мімо ї-

Вплив модуляторів Згс на ангіогенез, стимульований фактором росту, можна спостерігати в природних прозорих структурах, прикладом яких є роговиця ока. Нові кровоносні судини ростуть від ободка роговиці, до якого йде велика притока крові, до центру роговиці, до якого звичайно притоки крові немає. Стимулятори ангіогенезу наприклад, оФРФ, при застосуванні до роговиці викликають зростання нових кровоносних судин від « ободка роговиці. Антагоністи ангіогенезу при застосуванні до роговиці інгібують зростання нових кровоносних пла) с судин від ободка роговиці. Таким чином, у роговиці відбувається ангіогенез за допомогою проникнення . ендотеліальних клітин від ободка роговиці до жорсткої колагенової тканини роговиці, що можна добре бачити. а Аналіз моделі ока кролика, отже, дає модель іп мімо для прямого спостереження за стимулюванням та інгібуванням ангіогенезу після введення сполук безпосередньо до роговиці ока.

А. Аналіз моделі ока кролика іп мімо -І 1) Ангіогенез, стимульований факторами росту

Ангіогенез стимулюється в аналізі моделі ока кролика іп мімо факторами росту ОФРФ або ФРСЕ та описується о у наступних розділах. с а) Готування таблеток гідрону, що містять фактор росту та моноклонові антитіла

Таблетки полімеру гідрон, які містять фактор росту, готують так, як це було |описано Б'Атай еї аїЇ.,

Ме, Ргос. Маї). Асад. Зсі., США, 91:4082-4085 (1994)). Окремі таблетки містять б5Онг факторів росту, по окремості сп пов'язаних з сукральфатом (компанії "Марафет, Марион Меррелл Доу Корпорейшн") для стабілізації фактора росту та забезпечення його повільного звільнення до навколишньої тканини. Крім того, таблетки гідрону готують із вмістом необхідного ретровірусу, що експресує 5гс, як було описано вище. Таблетки відливають у спеціально в Виготовлених тефлонових стрижнях, які мають просвердлену в поверхні серцевину в 2,5мм. Приблизно 12мкл матеріалу для виливки поміщають у кожний стрижень і полімеризують протягом ночі в стерильному ковпаку.

Ф) Потім таблетки стерилізують ультрафіолетовим випромінюванням. Вплив Згсо-білків потім оцінюють так, як це ка було описано вище. б. Регресія іп мімо зростання тканин пухлин модуляторами Зіс, виміряна шляхом аналізу химери во миша/людина

Модель химерної миші/людини іп мімо утворюють шляхом заміщення частини шкіри миші МТКІ (миші з тяжким комбінованим імунодефіцитом - прим, перекладача) крайньою плоттю новонароджених. Модель химерної миші/людини іп мімо готують в основному так, як це |описано Хап еї аї., 9. Сіїп. Іпмеві., 91:986-996 (1993)).

Якщо описати це стисло, то у миші МТКІ (6-8-тижневого віку) видаляють хірургічним шляхом шматочок шкіри 65 2см2 | заміщають його крайньою плоттю людини. Мишу знеболюють, і з кожної сторони бічної абдомінальної області на ділянці 5см? збривають шерсть. Два круглих прошарки для прищеплювання розміром 2см 7 готують шляхом видалення шкіри на всю товщину аж до фасції. Шматочки шкіри для прищеплювання повної товщини такого ж розміру, отримані з крайньої плоті новонароджених, поміщають на місця ран і пришивають на це місце.

Пересаджену тканину накривають пов'язкою "Бенд-Ейд" ("Вапа-Аїа"), яку пришивають до шкіри. На рану також накладають мікропористу тканинну стрічку.

Для утворення твердих пухлин людини на пересадженій мишам МТКІ людській шкірі використовують лінію клітин меланоми людини М21-Ї. або лінію клітин раку грудей МОА 23.1 (Американська колекція типових культур,

Банк пухлин людини, 26, АкВз, негативні у відношенні імунореактивності частин тканин тАбБ І Мб609). Однократну клітинну суспензію 5х109 клітин М21-Ї або МОА 23.1 упорскують підшкірним шляхом у пересаджену шкіру 70 людини. Потім у мишей протягом 2-4 тижнів спостерігали зростання вимірних людських пухлин.

Після утворення вимірної пухлини у вену в хвості миші вводили ретровірусні препарати згідно з цим винаходом або ФБР. Через 2-3 тижні пухлину вирізали та проаналізували за вагою та гістологією. Потім оцінили вплив експресованих 5го-білків згідно з цим винаходом на пухлини. 7. Регресія іп мімо зростання тканин пухлин модуляторами 5гс, виміряна шляхом аналізу ХАМ

Зростання пухлини залежить від ангіогенезу (БоЇКтап, 1992; МУеіїдпег еї аіЇ., 1991; ВгооКк5 еї аї., 1994).

Дійсно, в останніх повідомленнях припускається, що зростання пухлини є чутливим до антиангіогенного впливу антагоністів рецептора ФРСЕ (Кіт еї аї., 1993). Отже, ми досліджували, чи впливатиме інгібування ангіогенезу шляхом доставки Згс 251 з видаленою кіназою на зростання медулобластоми людини (АСУ), надангіогенної пухлини, яка, як відомо, утворює ФРСЕ і дуже малу кількість ОФРФ (дані не приводяться). 3- та 6-денні аналізи зростання пухлини медулобластоми ОДОУ здійснювалися на ХАМ курчат в основному таким чином, як було описано вище |Вгоокз еї а!., 1994). Клітини ОДОУ розміром 5х105, культивовані в ЕРМІ 1640, що містить 1095 телячої ембріональної сироватки, промили та пересадили на ХАМ 10-денного ембріона для утворення фрагментів пухлини ОАОУ. Через 7 днів 5Омг фрагментів пухлини розсікли і ще раз пересадили на інший 10-денний ембріон та інкубували протягом ще З або 6 днів з місцевим вживанням (25мкл) контрольного СМ ретровірусу ЗРВСП-ЗФБ, ЗРВСП-5Зго 251 або контрольного лікування. Шляхом використання конфокальної о візуалізації всієї тканини заражених пухлин як орієнтира ми змогли визначити, що відбулася значна експресія конструкцій ЗРВСП навколо та всередині фрагмента пухлини при цьому місцевому підході. Резекції І зважування пухлини здійснювали шляхом подвійного видалення наосліп тільки легко визначної маси твердої пухлини |ВгоокК85 еї аІ., 1994). Вологу вагу пухлин через З або б днів порівнювали з початковою вагою, і для кожної групи ІС о) визначили процентну зміну ваги пухлини.

Ці пухлини легко зростали в ХАМ і давали активний ангіогенез (Фіг.9). що дозволило нам вибірково ї-о націлитися на судинну мережу пухлини птахів шляхом використання ретровірусу ЗРВСП, характерного для ІС о) птахів.

На Фіг.9 зображені результати, які вказують на те, що ретровірусна доставка ЗРВСП-Згс 251 у людські й пухлини, які зростають на ХАМ курчат, перетворює зростання пухлини на її регресію. На Фіг.9А показані ї- медулобластоми людини, які були вирощені на ХАМ ембріонів курчат, як це було описано вище. Ретровірус, який містить ЗРВСП-ЗФБ або ЗРВСП-5гс 251, місцево застосовували до попередньо утворених пухлин, вага яких не перевищувала 5Омг. На репрезентативному мікрофотознімку фрагмента пухлини медулобластоми, « інфікованого ЗРВСП-ЗФБ, що експресує ЗФБ, показана вся експресія в кровоносних судинах пухлин (розмірна стрілка), визначена шляхом оптичного пошарового аналізу конфокальним сканувальним лазерним мікроскопом /- с "Віо Кай" (Віо Кай") (смуга -50Омкм). На Фіг.9В показані результати описаного вище лікування пухлин, яким а дозволили зростати протягом З або 6 днів, після їхньої резекції та вимірювання вологої ваги. Дані виражені як "» середня зміна ваги пухлини (у порівнянні з початковою вагою пухлини 5Омг) 1/- СЗП 2 реплікатів. ЗРВСП-5гс 251 мав значний вплив на зростання пухлини через З дня (", Р «0,002) та б дня (7, Р«0,05). На Фіг.9С показані репрезентативні стереомікрофотознімки пухлин медулобластоми, видалених хірургічним шляхом з ембріонів, які -і були зроблені за допомогою стереомікроскопа "Олімпус" (смуга З5Омкм) (нижня панель). На мікрофотознімку сл кожної пухлини з великим збільшенням докладно показана судинна мережа кожної пухлини (смуга -З5Омкм).

Розмірна стрілка вказує на розрив кровоносних судин в оброблених ЗРВСП-5гс251 пухлинах. 1 Результати показують, що наслідком доставки ЗРВСП, що містить біс 251, до попередньо утворених б 50 медулобластом стала вибіркова вірусна експресія в пов'язаних 5 пухлиною кровоносних судинах (Фіг.9А), що в остаточному підсумку призвело до регресії цих пухлин протягом шести днів (Фіг.98). Що важливо, пов'язані з сл пухлинами кровоносні судини у тварин, оброблених вірусом, який містить Згс 251, були сильно порвані, і їх було менше в порівнянні з судинами пухлини в контрольних тварин (Фіг.9С) Той факт, що інфіковані ЗРВСП-5гс 251 пухлини продемонстрували локалізацію ЗФБ тільки в судинній мережі пухлини, наводить на думку про те, що антипухлинний вплив. який спостерігався при ретровірусній доставці Згс 251, був викликаний його антиангіогенними властивостями. о Вищенаведені приклади та доданий опис є ілюстративними і не повинні тлумачитися як обмежувальні. Цей іме) винахід не слід обмежувати за його масштабами викладеними лініями клітин, оскільки викладений варіант реалізації, як передбачається, є однією з ілюстрацій одного з аспектів винаходу. Будь-яка лінія клітин, яка є 60 функціонально еквівалентною, не виходить за рамки винаходу. Виклад матеріалу не допускає припущення про те, що письмовий опис, приведений тут, є неадекватним для того, щоб уможливити реалізацію якогось з аспектів винаходу, включаючи найкращий режим його реалізації, і його не слід тлумачити як такий, що обмежує масштаби формній винаходу конкретною ілюстрацією, наданою у ній. Насправді різноманітні модифікації цього винаходу, крім тих, що були показані та описані тут, будуть очевидними для спеціалістів у цій галузі з вищенаведеного 65 опису і не виходитимуть за рамки доданої формули винаходу.

Claims (33)

Формула винаходу : о, . . .

1. Фармацевтична сполука для стимулювання ангіогенезу у тканині-мішені ссавців, яка містить терапевтичну кількість вірусного вектора експресії, що містить нуклеїнову кислоту та фармацевтично припустимий носій або наповнювач; причому вищевказана нуклеїнова кислота має сегмент нуклеїнової кислоти, який кодує Зго-білок (тирозинкіназу), а вищевказаний Згсо-білок має будь-який амінокислотний залишок у кодоні 527, за винятком 7/0 тирозину, серину або треоніну.

2. Фармацевтична сполука згідно з пунктом 1, у якій вищевказаний 5Згсо-білок є активним Згсо-білком.

3. Фармацевтична сполука згідно з пунктом 2, у якій вищевказаний активний 5гс-білок є Згс А.

4. Фармацевтична сполука згідно з пунктом 1, яка характеризується тим, що додатково містить ліпосому.

5. Фармацевтична сполука для стимулювання ангіогенезу у тканині-мішені ссавців, яка містить терапевтичну кількість невірусного вектора експресії, що містить нуклеїнову кислоту та фармацевтично припустимий носій або наповнювач; причому вищевказана нуклеїнова кислота має сегмент нуклеїнової кислоти, який кодує Зго-білок, а вищевказаний Згсо-білок має будь-який амінокислотний залишок у кодоні 527, за винятком тирозину, серину або треоніну.

6. Фармацевтична сполука згідно з пунктом 5, у якій вищевказаний Згс-білок є активним Згсо-білком.

7. Фармацевтична сполука згідно з пунктом 6, у якій вищевказаний активний 5гс-білок є Згс А.

8. Фармацевтична сполука згідно з пунктом 5, яка характеризується тим, що додатково містить ліпосому.

9. Фармацевтична сполука для інгібування ангіогенезу у тканині-мішені ссавців, яка містить терапевтичну кількість вірусного вектора експресії, що містить нуклеїнову кислоту та фармацевтично припустимий носій або наповнювач; причому вищевказана нуклеїнова кислота має сегмент нуклеїнової кислоти, який кодує Зго-білок, у сч ов якому відсутня кіназна активність.

10. Фармацевтична сполука згідно з пунктом 9, яка характеризується тим, що вищевказаний Згсо-білок є (о) неактивним 5гсо-білком.

11. Фармацевтична сполука згідно з пунктом 10, у якій вищевказаний неактивний 5гсо-білок є Зго 251 або Згс К295М. ю зо

12. Фармацевтична сполука згідно з пунктом 9, яка характеризується тим, що додатково містить ліпосому.

13. Фармацевтична сполука для інгібування ангіогенезу у тканині-мішені ссавців, яка містить терапевтичну іс), кількість невірусного вектора експресії, що містить нуклеїнову кислоту та фармацевтично припустимий носій або ю наповнювач; причому вищевказана нуклеїнова кислота має сегмент нуклеїнової кислоти, який кодує Зго-білок, у якому відсутня кіназна активність. іс)

14. Фармацевтична сполука згідно з пунктом 13, яка характеризується тим, що вищевказаний Зго-білок є чн неактивним 5гсо-білком.

15. Фармацевтична сполука згідно з пунктом 14, у якій вищевказаний неактивний 5гсо-білок є Зго 251 або Згс К295М.

16. Фармацевтична сполука згідно з пунктом 13, яка характеризується тим, що додатково містить ліпосому. « 20

17. Спосіб модулювання ангіогенезу у тканині, пов'язаній із станом захворювання, який включає з с застосування до цієї тканини фармацевтичної сполуки, що містить терапевтичну кількість вектора експресії, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує 5го-білок. :з»

18. Спосіб згідно з пунктом 17, у якому вищевказаний вектор експресії є ретровірусним вектором експресії.

19. Спосіб згідно з пунктом 17, у якому вищевказаний вектор експресії є невірусним вектором експресії.

20. Спосіб згідно з пунктом 17, у якому вищевказана фармацевтична сполука додатково містить ліпосому. -І

21. Спосіб згідно з пунктом 17, у якому вищевказане застосування включає застосування внутрішньовенним, крізьшкірним, внутрішньочеревним, внутрішньом'язовим або пероральним шляхом. о

22. Спосіб згідно з пунктом 17, у якому вищевказане застосування включає внутрішньовенне введення сл разової дози.

23. Спосіб згідно з пунктом 17, у якому вищевказаний Згсо-білок є активним 5бго-білком, і вищевказане (22) модулювання є стимулюванням ангіогенезу. с

24. Спосіб згідно з пунктом 23, у якому вищевказаний активний 5гс-білок є Згс А.

25. Спосіб згідно з пунктом 23, у якому вищевказана тканина має поганий кровообіг.

26. Спосіб згідно з пунктом 17, у якому вищевказаний бго-білок є неактивним Згсо-білком, і вищевказане Модулювання є інгібуванням ангіогенезу.

27. Спосіб згідно з пунктом 26, у якому вищевказаний неактивний 5го-білок є Згс 251 або Згс К295М. (Ф)

28. Спосіб згідно з пунктом 26, у якому вищевказана тканина знаходиться в стані запалення, і вищевказаний ГІ стан захворювання є артритом або ревматичним артритом.

29. Спосіб згідно з пунктом 26, у якому вищевказана тканина є солідною пухлиною або метастазами солідної бо Пухлини.

30. Спосіб згідно з пунктом 29, у якому вищевказане застосування здійснюють разом з хіміотерапією.

31. Спосіб згідно з пунктом 26, у якому вищевказана тканина є ретинальною тканиною, і вищевказаний стан захворювання є ретинопатією, діабетичною ретинопатією або дистрофією жовтої плями сітківки.

32. Спосіб згідно з пунктом 26, у якому вищевказана тканина знаходиться у місці коронарної пластичної 65 операції на судинах, і вищевказана тканина знаходиться під ризиком виникнення рестенозу.

33. Лікарський засіб для модулювання ангіогенезу у тканині-мішені ссавців, який містить фармацевтичну сполуку згідно з пунктами 1-16, розміщену в упаковці з етикеткою, на якій вказано, що ця фармацевтична сполука може бути застосована для лікування станів захворювання шляхом модулювання ангіогенезу. с щі 6) ІС) (Се) ІС) ІС) і - -

с . и? -І 1 1 ФО сл іме) 60 б5