JP4806487B2 - チロシンキナーゼＳｒｃを使用する血管形成の変調に有効な方法及び組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般的には医薬の分野に関する。より詳細には、タンパク質チロシンキナーゼＳｒｃ、Ｓｒｃの変異体及びそれらをコードする核酸を使用して組織の血管形成を変調する方法及び組成物に関する。
【０００２】
（発明の背景）
血管形成（アンギオゲネシス）は、組織中で発生している新しい血管の増殖を含む組織血管分布のプロセスであり、血管新生とも呼ばれる。このプロセスには内皮細胞及び平滑筋細胞の浸潤が介在する。このプロセスは以下の３つの行程、即ち、先在する血管から血管が萌芽し得る行程、前駆細胞から血管のｄｅ ｎｏｖｏ発生が生じる行程（脈管形成、バスキュロゲネシス）、または、既存の小血管の内径が拡張し得る行程、のいずれかによって進行すると考えられている。Ｂｌｏｏｄら，Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０３２：８９−１１８（１９９０）。
【０００３】
血管形成は、新生児の成長の重要なプロセスであるが、また、創傷の治癒においても、組織炎症、関節炎、腫瘍増殖、糖尿病性網膜症、網膜の血管新生による黄斑変性などの状態のような多様な臨床疾患の病理発生においても重要である。血管形成に関連するこれらの臨床徴候を血管形成性疾患と呼ぶ。Ｆｏｌｋｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：４４２−４４７（１９８７）。一般に成人の組織または成熟組織には血管形成が存在しないが、創傷の治癒中及び黄体成長サイクル中には血管形成が生じる。例えばＭｏｓｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１４０８−１４１０（１９９０）参照。
【０００４】
血管形成の阻害が腫瘍増殖を抑制する有効な治療方法になるであろうと提唱された。（１）ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）のような“血管新生分子”の放出の阻害、（２）抗βｂＦＧＦ抗体の使用などによる血管新生分子の中和、（３）ビトロネクチン受容体αｖβ３のインヒビターの使用、及び、（４）血管形成刺激に対する内皮細胞応答の阻害、によって血管形成を阻害することが提案された。この最後の戦略が注目され、Ｆｏｌｋｍａｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３：８９−９６（１９９２）は、コラゲナーゼインヒビター、基底膜代謝回転インヒビター、血管静止ステロイド、菌類由来の血管形成インヒビター、血小板第４因子、トロンボスポンジン、Ｄ−ペニシラミン及び金チオマレートのような関節炎薬、ビタミンＤ３類似体、アルファ−インターフェロンなどのような血管形成の阻害に使用できる複数の内皮細胞応答インヒビターを記載している。その他の提案された血管形成インヒビターに関しては、Ｂｌｏｏｄら，Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０３２：８９−１１８（１９９０）、Ｍｏｓｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１４０８−１４１０（１９９０）、Ｉｎｇｂｅｒら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５９：４４−５１（１９８８）及び米国特許第５，０９２，８８５号、第５，１１２，９４６号、第５，１９２，７４４号、第５，２０２，３５２号、第５，７５３，２３０号及び第５，７６６，５９１号を参照するとよい。上記の参考文献に記載された血管形成インヒビターはいずれもＳｒｃタンパク質を含有していない。
【０００５】
血管形成を誘発するためには、腫瘍細胞が侵襲及び転移形成中に使用する方法と同様の方法で最初に内皮細胞が血管基底膜を分解しこの膜を貫通しなければならない。
【０００６】
血管形成が血管インテグリンと細胞外マトリックスタンパク質との相互作用に依存するという説は従来から報告されていた。Ｂｒｏｏｋｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：５６９−５７１（１９９４）。更に、血管形成性血管細胞のプログラムされた細胞死（アポトーシス）がこの相互作用によって開始されること、及び、この相互作用は血管インテグリンαｖβ３のある種のアンタゴニストによって阻害されることが報告された。Ｂｒｏｏｋｓら，Ｃｅｌｌ，７９：１１５７−１１６４（１９９４）。より最近には、ビトロネクチン受容体（αｖβ５）に対するマトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）の結合をαｖβ５アンタゴニストを使用して阻害し、これによって該プロテイナーゼの酵素機能を阻害できることが報告された。Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃｅｌｌ，８５：６８３−６９３（１９９６）。
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、チロシンキナーゼＳｒｃによる組織中の血管形成の変調に関する。本文中ではチロシンキナーゼＳｒｃを総称的にＳｒｃと呼ぶ。
【０００８】
疾患状態に関連する組織中の血管形成を変調する組成物及び方法が検討されている。血管形成の変調に応答する疾患状態に対しては、血管形成を変調し得る量のＳｒｃタンパク質を含む組成物を治療すべき組織に投与する。Ｓｒｃタンパク質を供給する組成物は、精製されたタンパク質、生物学的に活性のタンパク質フラグメント、組換え産生されたＳｒｃタンパク質もしくはタンパク質フラグメントまたはその融合タンパク質、または、Ｓｒｃタンパク質を発現する遺伝子／核酸発現ベクターを含有し得る。
【０００９】
Ｓｒｃタンパク質が不活性化されるかまたは阻害される場合、変調は血管形成の阻害である。Ｓｒｃタンパク質が活性であるかまたは活性化される場合、変調は血管形成の増進である。
【００１０】
治療すべき組織は、血管形成の変調が望まれる任意の組織でよい。血管形成の阻害は、有害な血管新生が生じている疾患組織の治療に有効である。代表的な組織は、炎症を生じた組織、固形腫瘍、転移部、再発狭窄症の危険がある組織などである。
【００１１】
血管形成の増進は、糖尿病またはその他の疾患によって四肢の循環不良に陥った四肢虚血のある患者の治療に有効である。また、癒合しない慢性創傷があり従って血管細胞の増殖及び血管新生の亢進によって有利な効果が与えられる患者の治療に有効である。
【００１２】
本文中に記載のような修飾アミノ酸配列を含むＳｒｃタンパク質の使用が特に好ましい。幾つかの特に有効な修飾Ｓｒｃタンパク質及びその発現を本文中に開示する。
【００１３】
本発明はまた、核酸を含有するウイルス性または非ウイルス性の遺伝子導入ベクターと医薬として許容される担体または賦形剤とから成り、上記核酸がｓｒｃタンパク質をコードする核酸セグメントを有しており、該ｓｒｃタンパク質がコドン５２７にチロシン、セリンまたはトレオニン以外の任意のアミン酸残基を有することを特徴とする、ターゲット哺乳類組織中の血管形成を促進する医薬組成物を包含する。
【００１４】
本発明はまた、核酸を含有するウイルス性または非ウイルス性の遺伝子導入ベクターと医薬として許容される担体または賦形剤とから成り、上記核酸がキナーゼ活性をもたないｓｒｃタンパク質をコードする核酸セグメントを有していることを特徴とする、ターゲット哺乳類組織中の血管形成を阻害する医薬組成物を提供する。
【００１５】
（図面の簡単な説明）
図面は本文の開示の一部を形成する。
【００１６】
図１は、Ｔａｋｅｙａら，Ｃｅｌｌ，３２：８８１−８９０（１９８３）によって最初に記載されたイントロンの欠失した完全コーディング配列を表すニワトリｃ−ＳｒｃのｃＤＮＡ配列である。この配列はＧｅｎＢａｎｋから登録番号Ｊ００８４４で入手できる。該配列は１７５９ヌクレオチドを含み、タンパク質コーディング部分はそれぞれ１１２位で開始し、１７１３位で終結する。
【００１７】
図２は、図１に示すコーディング配列でコードされたニワトリｃ−Ｓｒｃのアミノ酸残基配列である。
【００１８】
図３は、Ｂｒａｅｕｎｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：１０４１１−１０４１５（１９９１）によって最初に記載されたヒトｃ−ＳｒｃのｃＤＮＡ配列である。この配列はＧｅｎＢａｎｋから登録番号Ｘ５９９３２ Ｘ７１１５７で入手できる。該配列は２１８７ヌクレオチドを含み、タンパク質コーディング部分はそれぞれ１３４位で開始し、１４８６位で終結する。
【００１９】
図４は、図３に示すコーディング配列でコードされたヒトｃ−Ｓｒｃのアミノ酸残基配列である。
【００２０】
図５は、実施例４に記載のようなｂＦＧＦまたはＶＥＧＦによる内因性Ｓｒｃの活性化を示す。図の上部は、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦによる内因性ｃ−Ｓｒｃのｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの結果を活性化倍率と共に示す。図の下部は、均等なＳｒｃ及びＩｇＧの含量に対してローディングコントロールとして抗−Ｓｒｃ抗体でプローブしたキナーゼアッセイブロットを示す。
【００２１】
図６は、実施例４に記載のようなニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）中の血管形成に対するレトロウイルス介在ｃ−Ｓｒｃ Ａ遺伝子発現の効果を示す。９日齡のニワトリＣＡＭをＲＣＡＳ−Ｓｒｃ Ａ（活性突然変異ｃ−Ｓｒｃ）またはコントロールＲＣＡＳ−ＧＦＰ（緑色系蛍光タンパク質；蛍光性指示タンパク質）レトロウイルスまたはバッファに７２時間接触させた。図６Ａは血管形成レベルの定量を示し、図６Ｂは立体顕微鏡で撮影した各処理サンプルの代表的顕微鏡写真（４×）に対応する。
【００２２】
図７は、血管ＭＡＰキナーゼリン酸化を活性化するｃ−Ｓｒｃ Ａのレトロウイルス発現を示す。図７Ａは、ＶＥＧＦもしくはＰＭＡに３０分間接触させたかまたはｃ−Ｓｒｃ Ａレトロウイルスを４８時間感染させた１０日齡のニワトリＣＡＭの組織抽出物を示す。ＮＴは処理せずを表す。Ｓｒｃを均等量の全タンパク質抽出物から免疫沈降させ、ＦＡＫ−ＧＳＴ融合タンパク質を基質として用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫複合体キナーゼアッセイで処理し、電気泳動させ、ニトロセルロースフィルターに転移させた。上記の全組織溶解物のアリコートの内因性ＥＲＫリン酸化を抗−ホスホ−ＥＲＫ抗体でイムノブロッティングすることによって測定した。図７Ｂは、擬似ＲＣＡＳまたはＳＲＣ Ａを含有するＲＣＡＳを感染させた１０日齡のＣＡＭを示す。２日後、ＣＡＭを摘出し、ＯＣＴ中で凍結保存し、４μｍで切開した。切片を抗リン酸化ＥＲＫ抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で免疫染色し、洗浄し、ヤギ抗−ウサギＦＩＴＣ−コンジュゲート第二抗体で検出した。冷却したＣＣＤカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔ．）で蛍光像を撮影した。
【００２３】
図８は、ｂＦＧＦでなくＶＥＧＦに誘発された血管形成中のＳｒｃ活性に対する選択要求を示す。９日齡のニワトリＣＡＭをＲＣＡＳ−Ｓｒｃ ２５１またはコントロールＲＣＡＳ−ＧＦＰレトロウイルスまたはバッファに２０時間接触させ、次いでｂＦＧＦまたはＶＥＧＦの存在下または非存在下で更に７２時間インキュベートした。図８Ａは、上述のように定量した血管形成レベルを示し、図８Ｂは、立体顕微鏡で撮影した代表的顕微鏡写真（６×）を示す。図８Ｃは、トランスフェクト細胞中のＳｒｃ ２５１の発現を確認するために抗−Ｓｒｃ抗体でプローブしたブロットを擬似処理に比較して示す。
【００２４】
図９は、ヒト腫瘍に対するＲＣＡＳ−Ｓｒｃ ２５１のレトロウイルス性デリバリーの結果を示す。図９Ａは、Ｂｉｏ Ｒａｄレーザー共焦点走査型顕微鏡で光学セクショニング（ｂａｒ＝５００μｍ）によって検出した腫瘍血管（矢印）中でＧＦＰだけを発現するＲＣＡＳ−ＧＦＰ（ＲＣＡＳ−緑色系蛍光タンパク質）に感染させたヒト髄芽細胞腫フラグメントを示す顕微鏡写真である。図９Ｂは、レトロウイルスの局所塗布によって処理し、３日間または６日間増殖させた後、切除し、湿潤重量を計量した腫瘍から得られたデータを示す。データは２つの重複サンプルの腫瘍重量の平均変化（初期腫瘍重量５０ｍｇからの変化）±ＳＥＭとして表される。図９Ｃは、胚から外科的に摘出された髄芽細胞腫の顕微鏡写真（ｂａｒ＝３５０μｍ）を表す。下段パネルは各腫瘍の脈管構造を詳細に示す各腫瘍の高倍率写真である（ｂａｒ＝３５０μｍ）。矢印はＲＣＡＳ−Ｓｒｃ２５１−処理腫瘍中の血管破壊を示す。
【００２５】
図１０は、ＲＣＡＳＢＰ（ＲＣＡＳ）ベクター構築物の制限マップを示す概略図である。
【００２６】
（詳細な説明）
Ａ．定義
アミノ酸残基：ポリペプチドをそのペプチド結合の処で化学消化（加水分解）するときに形成されるアミノ酸。本文中に記載のアミノ酸残基は好ましくは“Ｌ”異性体の形態である。しかしながら、ポリペプチドが所望の機能的特性を維持している限り、任意のＬ−アミノ酸残基を“Ｄ”異性体形態で置換できる。ＮＨ２はポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を意味する。ＣＯＯＨは標準ポリペプチド命名法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５９（１９６９）に記載され３７ ＣＦＲ §１．８２２（ｂ）（２）に採用された命名法）に従ってポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を意味する。
【００２７】
本文中の全部のアミノ酸残基配列は、左右方向がアミノ末端からカルボキシ末端に向かう慣用の方向で示される式によって表されることに注目されたい。更に、アミノ酸残基配列の起点または終点のダッシュ記号は１つまたは複数のアミノ酸残基の別の配列に対するペプチド結合を示す。
【００２８】
ポリペプチド：この用語は、隣合うアミノ酸残基のアルファ−アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに結合されたアミノ酸残基の直鎖状配列を意味する。
【００２９】
ペプチド：本文中で使用されたこの用語は、例えば１つのポリペプチド中の約５０個以下のアミノ酸残基が互いに結合された直鎖状配列を意味する。
【００３０】
環状ペプチド：この用語は、例えば典型的なペプチド中に複数のアミド結合を含む環構造を有する化合物を意味する。環状ペプチドは、“ヘッド−ツー−テイル”ホモデチック環状ペプチドでもよく、または、ジスルフィド架橋、ラクタム架橋、チオエステル、チオアミド、グアニジノ及び同様の結合によって環が閉鎖されたヘテロデチック環構造を含んでもよい。
【００３１】
タンパク質：この用語は、例えば１つのポリペプチド中の５０個を上回る数のアミノ酸残基が互いに結合された直鎖状配列を意味する。
【００３２】
融合タンパク質：この用語は、典型的なペプチド結合によって作動可能に連結された（“融合した”）少なくとも２個の異なるポリペプチドドメインを含むポリペプチドを意味する。この場合、２個のドメインは天然には融合形態で見出されないペプチドに対応する。
【００３３】
合成ペプチド：この用語は、ペプチド結合によって互いに結合されたアミノ酸残基の化学的に産生された鎖であって天然に産生するタンパク質及びそのフラグメントを含まないものを意味する。
【００３４】
Ｂ．一般的考察
本発明は一般的には、血管形成にはチロシンキナーゼＳｒｃタンパク質が介在しており、活性または不活性のＳｒｃタンパク質を供給することによって血管形成がそれぞれ増進または阻害されるように血管形成を変調できるという知見に関する。
【００３５】
多様な疾患のプロセスに血管形成、即ち新しい血管の形成が役割を担っているのでこの知見は重要である。疾患状態に関連する組織がその増殖のために血管形成を必要とする場合、血管形成を阻害しこれによって罹病組織の増殖を阻害するのが望ましい。傷害された組織がその増殖及び治癒のために血管形成を必要とする場合、血管形成を増進または促進しこれによって組織の治癒及び増殖を促進するのが望ましい。
【００３６】
新しい血管の増殖が罹病組織に関連する病理の原因であったりまたは一因であったりする場合、血管形成の阻害によって疾患の有害な効果を抑制し得る。血管形成を阻害することによって、疾患に介入し、症状を軽減し、いくつかの場合には疾患の治療に成功し得る。
【００３７】
血管形成を阻害するという変調から有利な効果を得る疾患関連組織及び血管新生関連組織の例としては、リューマチ様関節炎、糖尿病性網膜症、炎症性疾患、再発狭窄症などがある。有害組織の増殖を助長するために新しい血管の増殖が必要な場合、血管形成の阻害によって組織への血液供給が減少し、これは、血液供給要求に基づく組織集団の縮小に寄与する。この例としては、腫瘍が数ミリメートル以上の厚さに増殖するため及び固形腫瘍の転移が成立するために血管新生が絶えず要求されるような腫瘍の増殖がある。
【００３８】
新しい血管の増殖が組織の治癒に寄与する場合には、血管形成の増進が治癒を支援する。この例は、糖尿病またはその他の状態が原因で四肢の循環不良に陥った四肢虚血患者の治療である。また、癒合しない慢性創傷があり従って血管細胞の増殖及び血管新生の亢進から有利な効果を得る患者も治療対象として考えることができる。
【００３９】
本発明方法の有効性は部分的には、治療方法が血管形成に対して高度に選択性であり他の生物学的プロセスには選択性でないという理由に基づく。
【００４０】
上述のように、血管形成は、“血管萌芽”、血管形成または血管拡張などのような組織の血管新生が関与する多様なプロセスを含む。これらの血管形成プロセスはすべてＳｒｃタンパク質によって行われる。
【００４１】
外傷的創傷治癒、黄体形成及び胚形成を例外として、大多数の血管形成プロセスは疾患プロセスに関連すると考えられる。従って、本発明の治療方法は疾患選択性であり、有害な副作用を有していない
Ｃ．Ｓｒｃタンパク質
本発明で使用するチロシンキナーゼＳｒｃタンパク質は所期用途に応じて種々のものを利用できる。「Ｓｒｃタンパク質」又は「Ｓｒｃ」なる用語は本明細書に記載する活性又は不活性形態の各種チロシンキナーゼＳｒｃタンパク質を意味する。
【００４２】
「活性Ｓｒｃタンパク質」とは血管形成を促進する各種Ｓｒｃタンパク質の任意のものを意味する。本明細書には血管形成の促進を測定するアッセイを記載するが、これに限定するものではない。血管形成レベルがＳｒｃをアッセイ系に加えない対照レベルよりも少なくとも１０％、好ましくは２５％、より好ましくは５０％高い場合にタンパク質は活性であるとみなす。促進を測定するアッセイとしては、実施例に記載するようにＲＣＡＳウイルスベクターを使用し、分岐点を数えることにより血管形成指数を計算するＣＡＭアッセイが好ましい。好ましい活性Ｓｒｃタンパク質はチロシンキナーゼ活性も示す。活性Ｓｒｃタンパク質の例については実施例に記載するが、例えばＳｒｃ−Ａである。
【００４３】
「不活性Ｓｒｃタンパク質」とは血管形成を阻害する各種Ｓｒｃタンパク質の任意のものを意味する。本明細書には血管形成の阻害を測定するアッセイを記載するが、これに限定するものではない。血管形成レベルが外因性Ｓｒｃをアッセイ系に加えない対照レベルよりも少なくとも１０％、好ましくは２５％、より好ましくは５０％低い場合にタンパク質は不活性であるとみなす。阻害を測定するアッセイとしては、実施例に記載するようにＲＣＡＳウイルスベクターを使用し、分岐点を数えることにより血管形成指数を計算するＣＡＭアッセイが好ましい。好ましい不活性Ｓｒｃタンパク質はチロシンキナーゼ活性の低下も示す。不活性Ｓｒｃタンパク質の例については実施例に記載するが、例えばＳｒｃ−２５１である。
【００４４】
本発明で有用なＳｒｃタンパク質は組織等の天然源からの単離、組換えＤＮＡ発現と精製による生産等の各種方法の任意の方法で生産することができる。Ｓｒｃタンパク質は遺伝子治療系を目的組織に導入した後、同タンパク質をこの組織で発現させることにより「ｉｎ ｓｉｔｕ」提供することもできる。
【００４５】
Ｓｒｃタンパク質をコードする遺伝子は当技術分野で公知の各種方法により作製することができ、本発明はこの点で限定するものではない。例えば、Ｓｒｃの自然史は哺乳動物、トリ、ウイルス等の種からの種々の相同体を含むことが周知であり、その遺伝子はタンパク質を発現する任意組織からｃＤＮＡクローニング法を使用して容易にクローニングできる。本発明で使用するのに好ましいＳｒｃは哺乳動物又はトリ相同体等の細胞性タンパク質ｃ−Ｓｒｃである。ヒトｃ−Ｓｒｃが特に好ましい。
【００４６】
Ｄ．Ｓｒｃタンパク質の発現用組換えＤＮＡ分子及び発現系
本発明は本発明で特に使用する数種のヌクレオチド配列について記載する。これらの配列は本発明で有用なＳｒｃタンパク質をコードする配列と、Ｓｒｃタンパク質を発現させるために構築した種々のＤＮＡセグメント、組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子及びベクターを含む。
【００４７】
従って、本発明のＤＮＡ分子（セグメント）は本明細書に詳述する完全構造遺伝子、構造遺伝子のフラグメント及び転写単位をコードする配列を含むことができる。
【００４８】
好ましいＤＮＡセグメントの１例は本明細書に定義するＳｒｃタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は生物学的に活性なそのフラグメントである。
【００４９】
好ましいｃ−Ｓｒｃのアミノ酸残基配列及びヌクレオチド配列は実施例に記載する。
【００５０】
好ましいＤＮＡセグメントは本明細書に記載するＳｒｃタンパク質に対応するアミノ酸残基配列又はその部分に実質的に同一であり、好ましくはこのような配列又は部分から主に構成されるアミノ酸残基配列をコードする。代表例な好ましいＤＮＡセグメントは実施例に詳述する。
【００５１】
タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸残基配列は遺伝暗号を介してこのタンパク質をコードする構造遺伝子のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列に直接相関する。従って、構造遺伝子又はＤＮＡセグメントはこの構造遺伝子又はＤＮＡセグメントがコードするアミノ酸残基配列即ちタンパク質又はポリペプチドにより表すことができる。
【００５２】
遺伝暗号の重要な周知特徴はその重複である。即ち、タンパク質を構成するために使用されるアミノ酸の大半は２種以上のコーディングヌクレオチドトリプレット（コドン）が特定アミノ酸残基をコード又は指定できる。従って、多数の異なるヌクレオチド配列が特定アミノ酸残基配列をコードする場合がある。このようなヌクレオチド配列は全生物で同一アミノ酸残基配列を生じ得るので機能的に等価であるとみなされる。場合により、所与ヌクレオチド配列にプリン又はピリミジンのメチル化変異体が含まれる場合もある。しかし、このようなメチル化はいずれにせよコーディング関係には影響しない。
【００５３】
核酸はポリリボヌクレオチドであるかポリデオキシリボヌクレオチドであるか、即ちＲＮＡであるかＤＮＡであるかを問わず任意ポリヌクレオチドもしくは核酸フラグメント又はその類似体である。好ましい態様では、核酸分子は２本鎖ＤＮＡのセグメント即ちＤＮＡセグメントの形態であるが、分子生物学法によっては１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡが好ましい場合もある。
【００５４】
ＤＮＡセグメントは化学合成法や組換えアプローチを含む多数の手段により作製されるが、クローニング又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作製することが好ましい。Ｓｒｃタンパク質の部分をコードするＤＮＡセグメントは化学的方法（例えばＭａｔｔｅｕｃｃｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５−３１９１，１９８１のホスホトリエステル法）や自動合成法を使用して容易に合成することができる。また、ＤＮＡセグメントを規定する１群のオリゴヌクレオチドの合成後にオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションとライゲーションにより完全セグメントを構築するなどの周知方法により、もっと大きいＤＮＡセグメントを容易に作製することができる。別法として、Ｓｒｃタンパク質をコードするメンバーを含むと考えられるｃＤＮＡライブラリーで使用されるオリゴヌクレオチドブライマー対を使用してＰＣＲにより好ましいＤＮＡセグメントを単離することもできる。
【００５５】
当然のことながら、化学合成の間に単に天然アミノ酸残基配列をコードする塩基を適当な塩基に置換することにより任意の所望修飾を加えることができる。この方法は周知であり、本明細書に記載する種々多様の「修飾」Ｓｒｃタンパク質の生産に容易に適用することができる。
【００５６】
更に、Ｓｒｃタンパク質をコードする構造遺伝子から主に構成されるＤＮＡセグメントを部位特異的又はランダム突然変異誘発等により後期修飾し、所望の任意置換を導入することができる。
【００５７】
１．ｓｒｃ遺伝子のクローニング
ｓｒｃ遺伝子は適当なゲノムＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）源から種々の生化学的方法によりクローニングすることができる。これらの遺伝子のクローニングは当技術分野で公知の通り、実施例に記載する一般法により実施することができる。
【００５８】
本発明の方法で使用するのに適したｓｒｃ遺伝子をクローニングするための核酸源としては、これらのタンパク質を発現すると考えられる組織からのｃＤＮＡライブラリー形態のゲノムＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が挙げられる。好ましい組織はヒト肺組織であるが、任意の他の適当な組織も使用できる。
【００５９】
好ましいクローニング法では、標準方法を使用してｃＤＮＡライブラリーを作製し、本明細書に記載するヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマー対を使用してＰＣＲ増幅によりＳｒｃをコードするヌクレオチド配列を単離する。あるいは、本明細書に記載する核酸配列に基づくハイブリダイゼーションプローブを使用して慣用核酸ハイブリダイゼーション法によりｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーから所望ｃＤＮＡクローンを同定及び単離することもできる。Ｓｒｃをコードする適当な核酸を単離及びクローニングする他の方法は当業者に自明である。
【００６０】
２．発現ベクター
Ｓｒｃタンパク質をコードするＤＮＡセグメントを含む組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）は本明細書に記載するように作製することができる。特に、ＤＮＡセグメントをコードするＳｒｃにベクターを作動的に（インフレーム、発現可能に）連結することにより、発現可能なｒＤＮＡを作製することができる。従って、組換えＤＮＡ分子は自然界に通常は同時に存在しないヌクレオチド配列の少なくとも２種の核酸を含むハイブリッドＤＮＡ分子である。
【００６１】
ＤＮＡセグメントを作動的に連結するベクターの選択は、当技術分野で周知の通り、所望の機能的性質（例えばタンパク質発現）と形質転換しようとする宿主細胞に直接依存する。本発明の実施時に使用するのに適したベクターはこのベクターを作動的に連結するＤＮＡセグメントに含まれる構造遺伝子を少なくとも複製し、好ましくは発現させることも可能である。
【００６２】
原核及び真核発現ベクターの両者がベクター構築分野の当業者に周知であり、Ａｕｓｅｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）や、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８９）に記載されている。これらの文献は本明細書中に引用する一般組換えＤＮＡ法の多くも記載している。
【００６３】
１態様において、利用可能なベクターは原核レプリコン、即ち組換えＤＮＡ分子で形質転換した原核宿主細胞（例えば細菌宿主細胞）においてこの組換えＤＮＡ分子を染色体外に自律複製及び維持することが可能なＤＮＡ配列を含む。このようなレプリコンは当技術分野で周知である。更に、原核レプリコンを含む態様は、その発現により形質転換細菌宿主に薬物耐性を付与する遺伝子も含む。典型的な細菌薬物耐性遺伝子はアンピシリン又はトラサイクリン耐性を付与する遺伝子である。
【００６４】
原核レプリコンを含むベクターは構造遺伝子で形質転換した細菌宿主細胞（例えば大腸菌）においてこの構造遺伝子の発現（転写及び翻訳）を誘導することが可能な原核プロモーターも含むことができる。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼの結合と転写を可能にするＤＮＡ配列により形成される発現制御エレメントである。本発明のＤＮＡセグメントを挿入するのに好都合な制限部位を含むプラスミドベクターは、一般に細菌宿主に適合可能なプロモーター配列を含む。このようなベクタープラスミドの典型例はＢｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から市販されているｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されているｐＲＳＥＴ、並びにＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）から市販されているｐＰＬ及びｐＫＫ２２３である。
【００６５】
真核細胞に適合可能な発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に適合可能な発現ベクターを使用しても本発明の組換えＤＮＡ分子を形成することができる。真核細胞発現ベクターは当技術分野で周知であり、数種の業者から市販されている。一般に、このようなベクターとしては所望ＤＮＡセグメントの挿入に好都合な制限部位を含むものが提供される。このようなベクターの典型例はｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ＃３１２５５）、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、実施例に記載する好適ベクター、並びに同種の真核発現ベクターである。
【００６６】
本発明の関連で特に好ましい遺伝子発現系は、遺伝子送達成分即ち遺伝子を目的組織に送達することが可能な成分を含む。利用可能なベクターは所望タンパク質を発現し、予め選択されたターゲット組織に感染させる特徴をもつように構築した「感染性」ベクター（例えば組換えＤＮＡウイルス、アデノウイルス又はレトロウイルスベクター）である。本明細書に記載する複製コンピテントトリ肉腫ウイルス（ＲＣＡＳ）が特に好ましい。
【００６７】
組換えウイルス又はウイルスエレメントを利用して発現を誘導する哺乳動物細胞系を構築することができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを使用する場合には、ポリペプチドのコーディング配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば後期プロモーターと３部分リーダー配列）に連結する。その後、このキメラ遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入する。ウイルスゲノムの非必須領域（例えばＥ１又はＥ３領域）に挿入すると、感染宿主でポリペプチドを発現することが可能な生存可能な組換えウイルスが得られる（例えばＬｏｇａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１：３６５５−３６５９（１９８４）参照）。あるいは、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターを使用してもよい（例えばＭａｃｋｅｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９：７４１５−７４１９（１９８２）； Ｍａｃｋｅｔｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４９：８５７−８６４（１９８４）； Ｐａｎｉｃａｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９：４９２７−４９３１（１９８２）参照）。染色体外エレメントとして複製する能力をもつウシパピローマウイルスに基づくベクターが特に有用である（Ｓａｒｖｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１：４８６（１９８１））。このＤＮＡをターゲット細胞に導入した直後に、プラスミドは細胞当たり約１００〜２００コピーまで複製する。挿入したｃＤＮＡを転写するためにプラスミドを宿主の染色体に組込む必要がないので、高レベルの発現が得られる。これらのベクターはｎｅｏ遺伝子等の選択マーカーをプラスミドに加えることにより安定的発現に使用することができる。あるいは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、発現を誘導することが可能なベクターとして使用できるようにレトロウイルスゲノムを改変してもよい（Ｃｏｎｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１：６３４９−６３５３（１９８４））。非限定的な例としてメタロチオネインＩＩＡプロモーターや熱ショックプロモーター等の誘導プロモーターを使用して高レベル発現を達成することもできる。
【００６８】
近年、ヒト卵巣癌をもつヌードマウスでラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターに比較してサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより誘導されるチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子治療による長期生存が研究されている。アデノウイルスを介してＣＭＶプロモーターにより誘導される単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子治療の細胞死滅効力はＲＳＶにより誘導される治療に比較して２〜１０倍有効であることが判明した（Ｔｏｎｇら，１９９９，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １８（１）：９３−９７）。低レベル発現後に高レベル発現の誘導を必要とする遺伝子治療に用いるキメラプロモーターの設計も報告されている（Ｓｕｚｕｋｉら，１９９６，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１８８３−１８９３）。
【００６９】
組換えタンパク質の長期高収率生産には安定的発現が好ましい。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適当な発現調節エレメント（例えばプロモーター及びエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）と選択マーカーにより制御されるｃＤＮＡで宿主細胞を形質転換することができる。上述のように、組換えプラスミドにおける選択マーカーは選択耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体に安定的に組込み、増殖してフォーカスを形成し、細胞系にクローニングして拡張できるようにする。
【００７０】
例えば、外来ＤＮＡの導入後に構築細胞を集積培地で１〜２日間増殖させた後、選択培地に移す。多数の選択系を使用することができ、例えば非限定的な例として、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ，１１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，４８：２０２６（１９６２））、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら，Ｃｅｌｌ，２２：８１７（１９８０））遺伝子を夫々ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−又はａｐｒｔ−細胞で使用することができる。また、代謝阻害剤耐性付与遺伝子を選択基準として使用することもでき、例えばメトトレキセート耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７７：３５６７（１９８０）； Ｏ’Ｈａｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７８：１５２７（１９８１））、ミコフェノール酸耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７８：２０７２（１９８１））、アミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９８１））、及びハイグロマイシン耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら，Ｇｅｎｅ，３０：１４７（１９８４））の遺伝子が挙げられる。近年では他の選択遺伝子も記載されており、即ちトリプトファンの代わりにインドールを細胞に利用させるｔｒｐＢ、ヒスチジンの代わりにヒスチノールを細胞に利用させるｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８５：８０４（１９８８））及びオルニチンデカルボキシラーゼインヒビターである２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ Ｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編，（１９８７））も記載されている。
【００７１】
ヒト遺伝子治療を目的とする主要ベクターはレトロウイルスから誘導される（Ｗｉｌｓｏｎ，１９９７，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７（Ｓｕｐ．１）：３１−３２； Ｂａｎｋら，１９９６，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １８（１２）：９９９−１００７； Ｒｏｂｂｉｎｓら，１９９８，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８０（１）：３５−４７）。遺伝子導入とアンチセンス治療を治療に利用できる可能性により、種々の組織を治療するために多数のベクター系が開発されている（血管系、Ｓｔｅｐｈａｎら，１９９７，Ｆｕｎｄａｍ．Ｃｌｉｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１（２）：９７−１１０； Ｆｅｌｄｍａｎら，１９９７，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：３９１−４０４； Ｖａｓｓａｌｌｉら，１９９７，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ，Ｒｅｓ．３５（３）：４５９−６９； Ｂａｅｋら，１９９８，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８２（３）：２９５−３０５； 腎臓、Ｌｉｅｎら，１９９７，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．Ｓｕｐｐｌ．６１：Ｓ８５−８； 肝臓、Ｆｅｒｒｙら，１９９８，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（１４）：１９７５−８１； 筋肉、Ｍａｒｓｈａｌｌら，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．８（３）３６０−５）。これらの組織に加え、ヒト遺伝子治療の重要なターゲットは腫瘍自体と関連組織を含めた癌である（Ｒｕｎｎｅｂａｕｍ，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１７（４Ｂ）：２８８７−９０； Ｓｐｅａｒら，１９９８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．４（２）：１３３−４７）。
【００７２】
本発明の方法で使用するのに容易に適応可能なウイルス遺伝子治療ベクター系の具体例を以下に簡単に説明する。レトロウイルス送達は近年、ＦｅｄｅｒｓｐｉｅｌとＨｕｇｈｅｓ（１９９８，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５２：１７９−２１４）により記載されており、特にトリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）レトロウイルスファミリーについて記載されている（Ｆｅｄｅｒｓｐｉｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９３：４９３１（１９９６）； Ｆｅｄｅｒｓｐｉｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：１１２４１（１９９４））。更に、ＡＬＶとマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）を含むレトロウイルスベクターがＳｖｏｂｏｄａ（１９９８，Ｇｅｎｅ ２０６：１５３−１６３）により記載されている。
【００７３】
改変レトロウイルス／アデノウイルス発現系は本発明の方法の実施に容易に適応させることができる。例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）系はＫａｒａｖａｎａｓら，１９９８，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２８：７−３０に記載されている。アデノウイルス発現系はＶｏｎ ＳｅｇｇｅｒｎとＮｅｍｅｒｏｗによりＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｅｒｎａｄｅｚ ＆ Ｈｏｅｆｆｌｅｒ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９９，第５章、１１２〜１５７頁）に記載されている。
【００７４】
タンパク質発現系はｉｎ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｔｒｏの両者で有効に利用できることが実証されている。例えば、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）アンプリコンベクターによりヒト扁平上皮細胞癌に効率的に遺伝子導入できることが記載されている（Ｃａｒｅｗら，１９９８，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１７６：４０４−４０８）。単純ヘルペスウイルスは神経系への遺伝子導入に使用されている（Ｇｏｉｎｓら，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．３（Ｓｕｐ．１）：Ｓ８０−８）。ＨＳＶ−ＴＫを使用したターゲット特定自殺ベクターは実質腫瘍で試験されている（Ｓｍｉｌｅｙら，１９９７，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（８）：９６５−７７）。１型単純ヘルペスウイルスベクターは結腸癌細胞で癌遺伝子治療に使用されている（Ｙｏｏｎら，１９９８，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２２８（３）：３６６−７４）。トランスフェクション時間を延ばすためにハイブリッドベクターが開発されており、例えば肝細胞の治療用としてＨＳＶ／ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ハイブリッドが開発されている（Ｆｒａｅｆｅｌら，１９９７，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３（１２）：８１３−８２５）。
【００７５】
ワクシニアウイルスはそのゲノムが大型であるため、ヒト遺伝子治療用に開発されている（Ｐｅｐｌｉｎｓｋｉら，１９９８，Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．７（３）：５７５−８８）。プリンヌクレオシドピロホスホリラーゼを発現するチミジンキナーゼ欠失ワクシニアウイルスを腫瘍特定遺伝子治療ベクターとして使用することが記載されている（Ｐｕｈｌｍａｎら，１９９９，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：６４９−６５７）。
【００７６】
アデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ）をヒト遺伝子治療で使用することが記載されているが、ＡＡＶは哺乳動物細胞で最適複製及びパッケージングにヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス又はヘルペスウイルス）を必要とする（Ｓｎｏｅｃｋら，１９９７，Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．５（６）：５１４−２０； Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（５）：４７０−５）。しかし、感染性組換えＡＡＶのｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングが報告されており、この系は非常に有望になっている（Ｄｉｎｇら，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１１６７−１１７２）。同種指向性レトロウイルスレセプターｃＤＮＡをＡＡＶにより導入すると、樹立一次ヒト細胞の同種指向性レトロウイルス形質導入を実現できることが報告されている（Ｑｉｎｇら，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１（７）：５６６３−５６６７）。ヒト野生型ｐ５３を発現するＡＡＶベクターを使用する癌遺伝子治療が実証されている（Ｑａｚｉｌｂａｓｈら，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６７５−６８２）。ＡＡＶベクターを使用した血管細胞への遺伝子導入も報告されている（Ｍａｅｄａら，１９９７，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓ．３５：５１４−５２１）。ＡＡＶは肝臓特異的遺伝子治療に適したベクターであることが実証されている（Ｘｉａｏら，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１２）：１０２２２−６）。ＡＡＶベクターを脳組織と中枢神経系の遺伝子治療に使用することも実証されている（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎら，１９９８，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．７９３（１−２）：１６９−７５； Ｄｕｒｉｎｇら，１９９８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５（６）：８２０−７）。更にＡＡＶベクターは肺の遺伝子治療とヒト嚢胞性線維症上皮細胞への遺伝子導入に関してアデノウイルスベクター（ＡｄＶ）と比較検討されている（Ｔｅｒａｍｏｔｏら，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８９０４−１２）。
【００７７】
レトロウイルスプロデューサー細胞の中間生成により機能的組込型になる非組込型ＡｄＶを作製するために有用な量の各ウイルスを含むキメラＡｄＶ／レトロウイルス遺伝子治療ベクター系も記載されている（Ｆｅｎｇら，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５（９）：８６６−７０； Ｂｉｌｂａｏら，１９９７，ＦＡＳＥＢ Ｊ １１（８）：６２４−３４）。この強力な新世代遺伝子治療ベクターはターゲット特定癌遺伝子治療に応用されている（Ｂｉｌｂａｏら，１９９８，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４５１：３６５−７４）。ｐ５３を発現するＡｄＶを１回注射するだけでヒト前立腺癌細胞の皮下腫瘍小節の増殖が抑制された（Ａｓｇａｒｉら，１９９７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７１（３）：３７７−８２）。進行した非小細胞肺癌をもつ患者にＡｄＶにより野生型ｐ５３を遺伝子導入することが記載されている（Ｓｃｈｕｌｅｒら，１９９８，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：２０７５−２０８２）。この癌はＡｄＶベクターによるｐ５３遺伝子置換療法の対象にもなっている（Ｒｏｔｈら，１９９８，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５（３ Ｓｕｐｐｌ ８）：３３−７）。ＡｄＶによりｐ５３を遺伝子導入すると、内皮細胞分化と血管形成がｉｎ ｖｉｖｏ抑制される（Ｒｉｃｃｉｏｎｉら，１９９８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（６）：７４７−５４）。転移メラノーマの免疫療法としてメラノーマ抗原ｇｐ７５をアデノウイルスにより発現させることも記載されている（Ｈｉｒｓｃｈｏｗｉｔｚら，１９９８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９７５−９８３）。ＡｄＶはヒト細胞の同種指向性レトロウイルス感染を助長し、レトロウイルス感染効率を増加する（Ｓｃｏｔｔ−Ｔａｙｌｏｒら，１９９８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（５）：６２１−９）。ＡｄＶベクターは血管平滑筋細胞（Ｌｉら，１９９７，Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．Ｊ．（Ｅｎｇｌ）１１０（１２）：９５０−４）、扁平上皮細胞癌細胞（Ｇｏｅｂｅｌら，１９９８，Ｏｔｏｌａｒｙｎｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ １１９（４）：３３１−６）、食道癌細胞（Ｓｅｎｍａｒｕら，１９９８，Ｉｎｔ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７８（３）：３６６−７１）、メサンギウム細胞（Ｎａｈｍａｎら，１９９８，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｍｅｄ．４６（５）：２０４−９）、グリア細胞（Ｃｈｅｎら，１９９８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３５０４−７）、及び動物関節（Ｉｋｅｄａら，１９９８，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２５（９）：１６６６−７３）への遺伝子導入に使用されている。より最近では、カテーテルを用いたＡｄＶベクターによる心膜遺伝子導入が実証されている（Ｍａｒｃｈら，１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２２（１ Ｓｕｐｐｌ １）：１２３−９）。適正な制御遺伝子エレメントをもつＡｄＶ系を上手く操作すると、調節可能なｉｎ ｖｉｖｏターゲット遺伝子発現がＡｄＶにより可能になる（Ｂｕｒｃｉｎら，１９９９，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９６（２）：３５５−６０）。
【００７８】
ヒト遺伝子治療用αウイルスベクターが開発され、シンドビスウイルス及びセムリキ森林熱ウイルスに由来するベクターで使用可能な発現カセットで形質転換するのに適したパッケージング細胞系も開発されている（Ｐｏｌｏら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９６：４５９８−４６０３）。非細胞変性フラビウイルスレプリコンＲＮＡに基づく系も開発されている（Ｖａｒｎａｖｓｋｉら，１９９９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２５５（２）：３６６−７５）。自殺ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を含むシンドビスウイルスベクターが腫瘍細胞への細胞特異的ターゲティングに使用されている（Ｉｉｊｉｍａら，１９９８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８０（１）：１１０−８）。
【００７９】
ヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）に基づくレトロウイルスベクターも遺伝子治療ベクターとして期待されている（Ｔｒｏｂｒｉｄｇｅら，１９９８，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：２５１７−２５２５）。フォーミーウイルスベクターは自殺遺伝子治療用に設計されている（Ｎｅｓｔｌｅｒら，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４（１１）：１２７０−７）。組換えマウスサイトメガロウイルス及びプロモーター系も高レベル発現用ベクターとして使用されている（Ｍａｎｎｉｎｇら，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．７３（１）：３１−９； Ｔｏｎｇら，１９９８，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １８（１）：９３−７）。
【００８０】
センダイウイルスに基づくベクターの作製により非分裂細胞への遺伝子送達が実現可能になった（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら，１９９８，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ５４（１）：６１−８）。
【００８１】
非分裂体細胞の形質転換を実現するために、レンチウイルスベクターも検討されている。複製欠損ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくベクターを使用した嚢胞性線維症の遺伝子治療が記載されている（Ｇｏｌｄｍａｎら，１９９７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：２２６１−２２６８）。レンチウイルスベクターにより肝臓及び筋肉に送達した遺伝子の持続発現も報告されている（Ｋａｆｒｉら，１９９７，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７（３）：３１４−７）。しかし、安全性の問題が大きく、改良ベクターの開発が急速に進んでいる（Ｋｉｍら，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（２）：９９４−１００４）。ＨＩＶ ＬＴＲ及びＴａｔを検討すると、ベクターを開発するためのゲノムの編成に関する重要な情報が得られる（Ｓａｄａｉｅら，１９９８，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５４（２）：１１８−２８）。このため、今日では有効なＨＩＶに基づくベクターの遺伝要件が十分に理解されるようになった（Ｇａｓｍｉら，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（３）：１８２８−３４）。自己不活化ベクター又は条件パッケージング細胞系が記載されている（例えばＺｕｆｆｅｒｙら，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１２）：９８７３−８０； Ｍｉｙｏｓｈｉら，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１０）：８１５０−７； Ｄｕｌｌら，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３−７１； 及びＫａｕｌら，１９９８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４９（１）：１６７−７４）。ＨＩＶベクターによるヒトリンパ球及びＣＤ３４＋細胞の効率的形質導入が報告されている（Ｄｏｕｇｌａｓら，１９９９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（６）：９３５−４５； Ｍｉｙｏｓｈｉら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３（５４０２）：６８２−６）。ネコ免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）レンチウイルスベクターによる非分裂ヒト細胞の効率的形質導入が記載されており、ＨＩＶに基づくベクターの使用に付随する安全性の問題を最小限にしている（Ｐｏｅｓｃｈｌａら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４（３）：３５４−３５７）。ＦＩＶベクターによるヒト血液単核細胞の生産的感染が報告されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（３）：２４９１−８）。
【００８２】
多くのウイルスベクターは取り扱いにくく、ＤＮＡ感染能が限られているが、これらの制限と欠点に対する対策が検討されている。例えば、遺伝子材料の操作とウイルスベクターの作製を簡略化するために、簡略ウイルスパッケージング細胞系以外に、ヒトヘルペスウイルス、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）及びエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）から誘導されるミニウイルスベクターが開発されている（Ｗａｎｇら，１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０（１２）：８４２２−８４３０）。アダプタープラスミドはヘルパー非依存性レトロウイルスベクターへの外来ＤＮＡ挿入を簡略化することが既に報告されている（１９８７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１（１０）：３００４−３０１２）。
【００８３】
ウイルスベクターは唯一の遺伝子治療手段ではなく、数種の非ウイルスベクターも記載されている。上皮増殖因子／ＤＮＡ多元系（ＥＧＦ／ＤＮＡ）の使用に基づくターゲット特定非ウイルス遺伝子送達ベクターは効率的且つ特異的な遺伝子送達を実現することが示されている（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ，１９９８，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１８：３２４１−３２４６）。カチオンリポソームを使用した血管系及びＣＮＳの遺伝子治療が実証されている（Ｙａｎｇら，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ １４（５）：２８１−９７）。カチオンリポソームを使用した膵炎の一過性遺伝子治療も実施されている（Ｄｅｎｈａｍら，１９９８，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２２７（６）：８１２−２０）。遺伝子送達用としてキトサンに基づくベクター／ＤＮＡ複合体も有効であることが示されている（Ｅｒｂａｃｈｅｒら，１９９８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５（９）：１３３２−９）。３元系に基づく非ウイルスＤＮＡ送達ベクターも記載されている（Ｋｉｍら，１９９８，５３（１−３）：１７５−８２）。ウイルス粒子で被覆したリポソーム複合体も遺伝子導入を実施するために使用されている（Ｈｉｒａｉら，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４１（１）：１１２−８）。
【００８４】
チミジンキナーゼ遺伝子をコードする非ウイルスＴ７ベクターの直接腫瘍注射による癌遺伝子治療も実証されている（Ｃｈｅｎら，１９９８，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：７２９−７３６）。直接注射遺伝子導入にはプラスミドＤＮＡの作製が重要である（Ｈｏｒｎら，１９９５，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６（５）：６５６−７３）。改変プラスミドベクターが特に直接注射に応用されている（Ｈａｒｔｉｋｋａら，１９９６，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７（１０）：１０２５−１７）。
【００８５】
このように、多種多様の遺伝子導入／遺伝子治療ベクター及び構築物が当技術分野で公知である。これらのベクターは本発明の方法での使用に容易に適応できる。組換えＤＮＡ／分子生物学技術を使用する適当な操作により作動的に連結したＳｒｃ（活性又は不活性）を選択発現／送達ベクターに挿入すると、本発明の実施に利用可能な多数の等価ベクターを作製することができる。
【００８６】
Ｅ．血管形成の調節のための方法
本発明は疾病過程または状態に伴う組織における血管形成の調節のための方法を提供し、したがって血管形成に依存している組織での事象に影響を与える。一般的に、本方法は疾病仮定または状態に伴う組織に、血管形成調節量のＳｒｃタンパク質または活性化または不活性化Ｓｒｃを発現する核酸ベクターを投与することを含む。
【００８７】
本明細書で記述するように、任意の様々な組織または組織化された組織を含む器官は、皮膚、筋肉、消化管、結合組織、関節、骨および血管が血管形成刺激で侵入することのできる同様の組織を含む疾患状態において、血管形成を補助できる。
【００８８】
本発明の原理は本発明はすべての哺乳動物に関して効果的であることを示し、その哺乳動物は用語「患者」に含まれることを意図しているが、その多くの実施様態において本発明によって処置された患者は、望ましくはヒト患者である。この文脈において、哺乳動物は血管形成を含む疾病に関連した組織の処置が好ましいような任意の哺乳動物種、特に農業および家畜哺乳動物種を含むことが理解される。
【００８９】
したがって本方法は患者に、本発明の方法を実施する場合において治療的有効量のＳｒｃタンパク質またはＳｒｃタンパク質を発現するＤＮＡベクターを含む生理学的に寛容な組成物を投与することを含む。
【００９０】
Ｓｒｃタンパク質の投与のための投与量範囲はさらに本明細書に記載のように、タンパク質の形態およびその効力に依存する。この投与量は血管形成および血管形成によって仲介される疾患症状が改善されるような望ましい効果を生じるのに十分である。しかしながら投与量は、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全などの副作用を引き起こすほど多くすべきではない。一般的に、投与量は患者の年齢、状態、性別および患者での疾患の程度によって変化し、当業者によって容易に決定できる。投与量はまた任意の合併症の事象によって個々の医者によって調整されうる。
【００９１】
治療的有効量はＳｒｃタンパク質または（活性化または不活性化）ｓｒｃタンパク質をコードする核酸の量であり、治療している組織での血管形成の検出可能な調節、すなわち血管形成調節量を産出するのに十分である。血管形成の調節は本明細書で記述したようなＣＡＭアッセイによって、または当業者に周知の他の方法によって測定しうる。
【００９２】
Ｓｒｃタンパク質またはＳｒｃタンパク質を発現する核酸ベクターは、注射で、または超過時間緩やかな点滴によって非経口的に投与できる。処置する組織は典型的には全身投与によって体に注入し、したがってほとんど治療組成物の静脈内投与によって可能であり、他の組織および送達方法がよく熟慮されうる。したがって、本発明の組成物は静脈、腹腔内、筋肉内、皮下、海綿内、経皮で投与でき、また蠕動性方法によって送達しうる。
【００９３】
Ｓｒｃタンパク質またはＳｒｃタンパク質を発現する核酸ベクターを含んでいる治療組成物は従来通り、たとえば単位投与量の注射によってのように静脈内に投与できる。本発明の治療組成物に関して使用される場合の語「単位投与量」は対象に対する一体的投与量として好ましい独立した単位をさし、それぞれの単位は、必要な希釈剤、すなわち担体または賦形剤との結合による望ましい治療的効果を産出するように計算された、所定の量の活性物質を含む。
【００９４】
１つの実施様態において、試薬を静脈内に単一投与量で投与した。局所投与を直接の注射によって、または解剖学的に単離した区画を利用し、標的器官系の微小循環、循環系の再灌流、または疾患組織に関連した血管系の標的領域の一時的閉塞に基づいたをカテーテルを単離することにより行いことができる。
【００９５】
組成物を、治療に効果的な量で投与処方に適用可能な方法で投与した。投与する量および時期は処置する対象、活性成分を使用するための対象の系の受容力および望ましい治療的効果の程度に依存する。投与するのに必要な活性成分の正確な量は担当医者の判断に依存し、それぞれの個人に対して特有である。しかしながら、全身投与に対する適切な投与量範囲は本明細書に開示されており、投与経路に依存する。投与のための好ましい色素も変えることができるが、しかしその後引き続く注射または他の投与によって１時間以上の間隔での繰り返し投与が続く初期投与によって類型化される。あるいは、ｉｎ ｖｉｖｏ治療のために明記した範囲での血中濃度を保持するのに十分な連続的な静脈内点滴が意図される。
【００９６】
１．血管形成の阻害
血管形成の阻害は血管形成性疾患と呼ばれる様々な疾患で重要である。このような疾患には、免疫および非免疫炎症のような炎症障害、慢性関節リウマチ症および乾癬、糖尿病性網膜症のような血管の不適合で不適当な浸潤、血管形成緑内障、再狭窄、アテローム性動脈硬化症プラークおよび骨粗鬆症での毛細管増殖および固形腫瘍、固形腫瘍転移、血管線維腫、水晶体後線維増殖症、血管腫、カポージ肉腫および腫瘍増殖を補助するために新生血管形成が必要な類似の腫瘍のような腫瘍関連障害が含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
したがって、疾患状態に関連している組織での血管形成を阻害する方法は疾患の症状を改善し、疾患に依存しながら、疾患の治療に貢献できる。１つの実施様態において、本発明は疾患状態に関連している組織での血管形成それ自身の阻害を意図している。組織での血管形成の規模およびしたがって本法によって行われる阻害の規模は様々な方法によって評価されうる。
【００９８】
したがって、１つの関連した実施様態において、処置する組織は炎症を起こしている組織であり、阻害する血管形成は炎症組織の新生血管形成が起こっている炎症組織血管形成である。この型において、本方法は、慢性関節炎リウマチ症の患者のような関節炎組織での、免疫または非免液炎症組織での、乾癬組織等での血管形成の阻害を意図する。
【００９９】
他の関連する実施様態において、処置する組織は糖尿病性網膜症、黄斑変性または血管形成緑内障のような網膜疾患を持つ患者の網膜組織であり、阻害する血管形成は網膜組織の新血管形成が存在する網膜組織血管形成である。
【０１００】
さらなる関連した実施様態において、処置する組織は、固形腫瘍、転移、皮膚癌、乳癌、血管種または血管線維腫および類似の癌を持つ患者の腫瘍組織であり、阻害すべき血管形成は腫瘍組織の新血管形成の存在する腫瘍組織血管形成である。本方法によって処置可能な典型的な固形腫瘍組織には、肺、膵臓、乳、直腸、喉頭、卵巣および類似の組織が含まれる。腫瘍増殖において重要な役割を新血管形成が果たしていることから、腫瘍組織血管形成の阻害が特に好ましい。腫瘍組織の新血管形成がない場合、腫瘍組織は必要な栄養を得られず、増殖が遅くなり、さらなる増殖が終わり、退行し、最終的には結果として腫瘍の殺傷となる壊死となる。
【０１０１】
言い換えると、本発明は本方法によって腫瘍血管形成を阻害することにより、腫瘍新血管形成を阻害する方法を提供する。同様に、本発明は血管形成阻害方法を実施することにより腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。
【０１０２】
本方法はまた、（１）転移癌細胞が原発腫瘍から出ていけるように、それらの形成が原発腫瘍の血管形成を必要とすること、および（２）その第２の部位での確立が転移の増殖を補助するために心血管形成を必要とすることから、転移の形成に対して特に効果的でもある。
【０１０３】
関連する実施様態において、本発明は、固形癌に対して転移の確立を制御するために行った従来の化学療法のような他の治療との組合せで本方法を実施することを意図する。腫瘍組織への血液供給および栄養の供給により血管形成の回復を誘導することで、毒性攻撃へ応答するであろう腫瘍組織において、化学療法の摂生後に血管形成を阻害することが好ましいが、血管形成抑制剤の投与は典型的に化学療法の間または後に行う。さらに、転移に対する予防として、固形腫瘍を取り除いた手術後、血管形成阻害方法を処置することが望ましい。
【０１０４】
腫瘍新血管形成の阻害に適用する本方法の範囲では、本方法はまた腫瘍組織増殖の阻害、腫瘍転移形成の阻害および確立した腫瘍の退行のために適用できる。
【０１０５】
再狭窄は血管形成の成功を阻害する経皮管腔通過冠状血管形成の部位の組織内への平滑筋細胞（ＳＭＣ）遊走および増殖の工程である。再狭窄の間のＳＭＣの遊走および増殖は本方法にて阻害される血管形成の工程と考えることができる。したがって、本発明はまた、血管形成工程にある患者での本方法による血管形成を阻害することによる再狭窄の阻害をも意図する。再狭窄の阻害のために、冠状血管壁が再狭窄の危険性があることから、典型的には約２から約２８日間、より典型的には処理後およそ最初の１４日間、不活性チロシンキナーゼが典型的に再狭窄処理後に投与される。
【０１０６】
疾患状態に関連する組織での血管形成を阻害するための、したがって血管形成関連疾患の処置のために方法を実施するための本方法は、血管形成が起こっているまたは起こる危険性のある組織を、治療に効果的な量の不活性化Ｓｒｃタンパク質またはこのタンパク質を発現するベクターを含む組成物と接触させることを含む。
【０１０７】
治療組成物との最初の接触後７日間ほどで血管形成の阻害と腫瘍退行が起こった。活性化Ｓｒｃタンパク質への追加的なまたは引き延ばされた曝露は７日間から６週間の間が好ましく、好ましくは約１４から２８日間である。
【０１０８】
２．血管形成の増強
血管形成の促進または増強が望ましい場合において、活性化Ｓｒｃタンパク質の組織への投与が有用である。投与の経路および時期は本明細書以上で阻害について記述した方法と類似である。
【０１０９】
Ｆ．治療組成物
本発明は本明細書で記述した治療的な方法を行うために有用な治療組成物を意図する。本発明の治療組成物には、活性成分としてその中に溶解または分散される本明細書で記述したようなＳｒｃタンパク質またはＳｒｃタンパク質を発現できるベクターと共に、生理学的に寛容な担体が含まれる。好ましい実施様態において、治療組成物は、治療の目的で哺乳動物またはヒト患者に投与したときに免疫原性ではない。
【０１１０】
本明細書で使用する時、用語「医薬的に許容可能な」、「生理学的に寛容な」およびそれらの文法的変化語は、それらが組成物、担体、希釈剤および薬剤を指す場合、交換可能に使用され、この物質が悪心、めまい、胃逆流などの望ましくない生理学的効果の産出なしに、哺乳動物へまたは哺乳動物上に投与できることを表す。
【０１１１】
その中に溶解されたか分散された活性化成分を含む薬理学的組成物の調製は当技術分野で周知であり、処方に基づいて限定する必要なない。典型的にはそのような組成物は液体溶液または懸濁液いずれかような注射可能なものとして調製し、しかし、使用前に液体中に溶液または懸濁液として適当である固体形態も調製できる。調製品は乳化してもよく、またはリポソーム組成物として存在することも可能である。
【０１１２】
活性成分は医薬的に許容可能で活性成分と適合性のある賦形剤と、本明細書で記載の治療的方法での使用に適切な量で混合できる。適切な賦形剤は、たとえば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールまたは類似物およびそれらの組合せである。さらに、所望であれば、組成物は少量の加湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝液剤および活性成分の効果を増強する類似物などの補助物質を含んでよい。
【０１１３】
本発明の治療組成物は、その中に任意の塩の形態成分の医薬的に許容可能な塩を含んでよい。医薬的に許容可能な塩には、たとえば塩化水素またはリン酸などの無機塩または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機塩で形成される（ポリペプチドの遊離アミノ基と形成した）酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシ基で形成された塩はまた、たとえばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄水酸化物などのような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から由来しうる。
【０１１４】
活性成分に対する生理学的に寛容な担体は当技術分野で周知である。液体担体の例は、活性成分および水以外に何の物質も含まないか、または生理学的ｐＨ値、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水のような両方でのリン酸ナトリウムのような緩衝液を含む無菌水性溶液である。またさらに、水性担体は、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムのような１つ以上の緩衝塩、デキストロース、ポリエチレングリコールおよび他の溶液を含みうる。
【０１１５】
液体組成物はまた水に加えた、および水を排除した液相をも含みうる。そのような追加的な液相の例は、グリセリン、綿実油のような植物油および水油エマルションである。
【０１１６】
治療組成物は血管形成調節量の本発明のＳｒｃタンパク質、または有効量のＳｒｃタンパク質を発現するのに十分な組換え体ＤＮＡ発現ベクターを含み、典型的には総処置組成物の重量あたり少なくとも０．１重量パーセントのＳｒｃタンパク質の量を含むように処方される。重量パーセントはＳｒｃタンパク質の総組成物に対する重量の比である。したがって、たとえば０．１重量パーセントは１００グラムの総組成物あたり０．１グラムのＳｒｃタンパク質である。ＤＮＡ発現ベクターについて、投与された量は発現ベクターの特性、処置される組織および同様の考慮に依存する。
【０１１７】
Ｇ．製造物品
本発明はまた、本発明のＳｒｃを提供するためのラベル付け容器である製造の物品を意図する。包装材料を含む製造物品は処置する疾患状態のために好ましいラベル付けおよび包装材料内に含まれる医薬剤を含む。
【０１１８】
製造物品中の医薬剤はＳｒｃタンパク質を提供するために適切である本発明の任意の組成物であり、開示された指示に従って本明細書で記述したような薬理学的に許容可能な形態で処方される。したがって、組成物はＳｒｃタンパク質またはＳｒｃタンパク質を発現することの可能なＤＮＡ分子を含むことができる。製造物品は単一または複数投与量どちらかで、本明細書で示された状態の処置での使用に十分な量の医薬剤を含む。
【０１１９】
包装材料は、たとえば血管形成の阻害または増強によって補助される状態および本明細書で開示された類似の状態を処置するために、その中に含まれる医薬剤の使用を示唆するラベルを含む。ラベルはさらに使用のための指示および売買に必要であろうような関連した情報をも含む。包装材料は医薬剤の保存のための容器を含んでよい。
【０１２０】
本明細書で使用するとき、用語、包装材料はガラス、プラスチック、紙、ホイールおよび固定化した装置内に医薬剤を保持できる類似物のような材料を指す。したがって、たとえば包装材料は、医薬剤を含有している薬理学的組成物を含むために使用した、プラスチックまたはガラスバイアル、薄板化包皮等の容器であり得る。
【０１２１】
好ましい実施様態において、包装材料には、製造物品の内容物およびそこに含まれている医薬剤の使用を示している明確な表現であるラベルを含む。
【０１２２】
実施例
本発明に関する以下の実施例は例示であり、もちろん本発明を特に制限するように解釈されるべきでない。さらに、現在知られており、後に発展する、当業者の範囲内であるそのような本発明の変形は、本明細書の以下で請求する本発明の意図の範囲内であることが考えられる。
【０１２３】
１．ｃ−Ｓｒｃ発現構築物の調製
本発明の方法による血管形成の調節に有用な発現構築物の調製のために、ｃ−Ｓｒｃ ｃＤＮＡを操作し、発現構築物／ベクター内に挿入した。
【０１２４】
野生型（すなわち内因性）チキンｃ−ＳｒｃをコードするｃＤＮＡ配列を図１（配列番号２）に示し、コードされるアミノ酸残基配列を図２（配列番号３）に示す。コードされたタンパク質配列はｃＤＮＡヌクレオチド位置１１２から１７１３まで翻訳される。ヒトｃ−Ｓｒｃ ｃＤＮＡ（配列番号４）の核酸配列に相当する核酸配列およびコードされたアミノ酸残基（配列番号５）配列をそれぞれ図３および４に示す。ヒトタンパク質配列について、コードする配列は、ｃＤＮＡのヌクレオチド位置１３４から１４８６で始まる。
【０１２５】
野生型と同様にいくつかの変異ｃ−Ｓｒｃ ｃＤＮＡを調製した。変異ｃ−Ｓｒｃ構築物をＫａｐｌａｎら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１３：４７４５−４７５６（１９９４）によって記述されたような部位特異的変異誘発によって調製した。本発明の方法で使用するための変異ｃ−Ｓｒｃタンパク質をコードする変異ｃ−Ｓｒｃ構築物は、Ｌａｐｌａｎら，ｉｄに記述されている。Ｋａｐｌａｎらは本発明の実施に有用なさまざまな変異ｃ−Ｓｒｃ構築物およびコードされたタンパク質を記述している。たとえば、Ｋａｐｌａｎらはその図１で、ＳｒｃＡおよびＳｒｃ２５１を含むいくつかのチキンｃ−ｓｒｃ対立遺伝子の産物を描写している。
【０１２６】
血管形成を調節するｃ−Ｓｒｃ機能の２つの部類が記述されている。すでに論議したように、１つの部類は血管形成を増加させるＳｒｃ分子を含み、したがって活性タンパク質であると考えられる。様々な変異体と共に野生型Ｓｒｃが本発明で血管形成を誘導することが示されている。その血管増殖を誘導する、したがってインビボでの腫瘍重量を増加させる能力に関してこの文脈で機能する野生型ｃ−ｓｒｃの１つの好ましい変異体は、アミノ酸（ａａ）残基位置５２７のチロシン５２７をフェニルアラニンに転化する点変異を持つＳｒｃＡ変異体である。この部位は通常ｃ−Ｓｒｃキナーゼによる負の調節の部位であり、キナーゼＣＳＫとして呼ばれる。ＣＳＫが野生型ｓｒｃのａａ５２７をリン酸化するとき、このタンパク質は不活性化する。しかしながら、変異体ＳｒｃＡでは、調節チロシンはフェニルアラニンに変更されており、したがって構造上（すなわち永久的に）リン酸化による不活性化の対象ではない活性なタンパク質を提供する。
【０１２７】
ｓｒｃでの変異はまた血管形成への逆の調節効果を持つことも示されてきており、血管形成の刺激の代わりにそれを阻害する。そのような変異体は不活性ｓｒｃ変異という。この阻害活性を提供する変異を持つタンパク質はまたそれらが新血管形成を阻害する優勢劣性Ｓｒｃタンパク質としてよばれ、Ｓｒｃの内因性活性からの結果、同様に増殖因子刺激による増強したＳｒｃ活性を含む。したがって本発明の野生型ｃ−ｓｒｃの特定の変異はまた、その血管増殖を阻害し、そしてたとえばしたがってインビボで腫瘍重量を減少させる能力に関して優性陰性として機能できる。
【０１２８】
そのような好ましい阻害ｃ−Ｓｒｃタンパク質には、ただＳｒｃの最初の２５１アミノ酸のみが発現しているＳｒｃ２５１を含む。この構築体は全キナーゼ領域を欠き、したがって「キナーゼ死（ｋｉｎａｓｅ ｄｅａｄ）」ｓｒｃタンパク質とよぶ。第２の構造は、リジンアミノ酸残基２９５をメチオニンに変異させたＳｒｃ（Ｋ２９５Ｍ）変異である。このキナーゼ領域での点変異はＡＴＰ結合を防止し、また血管細胞および腫瘍細胞信号および増殖に関連したキナーゼ依存性Ｓｒｃ機能を阻害する。
【０１２９】
たとえば、残基５２７での変異は得られた変異アミノ酸残基がチロシン、セリンまたはメチオニンである限り、本発明は、結果として望まし位置でのかわりのアミノ酸の存在が望ましい活性、血管形成促進調節活性を持つタンパク質となるであろうことを意図する。
【０１３０】
点変異に関しては、望ましい阻害活性または刺激活性の結果となる任意の変異体が本発明での使用のために意図されている。ｓｒｃタンパク質の望ましい調節効果がそのままである限りは、望ましいｓｒｃタンパク質（変異体またはその断片）を発現したアミノ酸タグ、抗原性エピトープ、蛍光タンパク質または他のそのようなタンパク質またはペプチド結合をさせている融合タンパク質構築物をも意図する。
【０１３１】
【表１】
【０１３２】
本発明で使用するための１つの好ましい発現構築物はＲＣＡＳＢＰ（Ａ）構築物（配列番号１）である。この発現ベクターはタイターの改善のための増強したブライアンポリメラーゼ（ＢＰ）をもつ連続した複製応答鳥類肉腫ウイルスを基にしており、正常鳥類細胞に発現しているＡ型包皮糖タンパク質に特異的である（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５２：１７９−２１４（１９９７）で概説されている。またＨｕｇｈｅｓら，１９８７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３００４−３０１２； Ｆｅｋｅｔｅ ＆ Ｃｅｐｋｏ，１９９３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．１３（４）：２６０４−２６１３： Ｉｔｏｈら，１９９６，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：２９１−３００； Ｓｔｏｔｔら，１９９８．Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：６６０−６６６も参照のこと）。ＲＣＡＳＢＰ（Ａ）の完全な配列（配列番号１）を付属した配列表に記し、構築物の制限酵素マップを図１０に描写し、本明細書ではＲＣＡＳとよぶ。
【０１３３】
元々のＳｒｃ２５１構築物は、ＮＩＨのＨａｒｏｌｄ Ｖａｒｍｕｓの研究室にてＰａｍ Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ博士によってサブクローン化された。簡単に記すと、その発現のためのｓｒｃ ｃＤＮＡ配列のクローン化を、ＮｏｔＩ−ＢｓｔＢＩ−ＮｏｔＩ制限酵素部位を含んでいるリンカーをＳｒｃ２５１の５’末端の固有ＮｏｔＩ部位に挿入して行った。Ｓｒｃは３’末端に固有のＣｌａＩ部位を持つ。ＢｓｔＢＩおよびＣｌａＩでのＳｒｃ２５１の消化によりＢｓｔＢＩ−ＣｌａＩ断片を生成し、ついでＲＣＡＳＢＰ（Ａ）上のＣｌａＩ部位に連結した。ＢｓｔＢＩ突出部はＣｌａＩで再切断しないＣｌａＩ突出部との連結を可能にする。本発明の実施での使用に適切なｓｒｃ構築物は、Ｓｒｃ２５１を含むＲＣＡＳベクターをＮｏｔＩおよびＣｌａＩでまず消化することで上記ベクター内で容易に入手し（ＤＡＭ＋バックグラウンド中）、同様に消化したＳｒｃ ｃＤＮＡの挿入を可能にする。したがって、Ｓｒｃ２５１を含むこの最初のＲＣＡＳＢＰ（Ａ）構築物をさらに、上でおよびＫａｐｌａｎら，（１９９４，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．１３（２０）：４７４５−４７５６）に記述されたようなすべての他のＳｒｃ構築物を、Ｓｒｃ２５１構築物を介して生成したＮｏｔＩ−ＣｌａＩ断片によってＲＣＡＳＢＰ（Ａ）内にサブクローン化するのに使用した。ｃＤＮＡ内に望ましいｃ−ｓｒｃ変異体を産出するために、当業者によく知られている標準部位特異的変異誘発手法を使用した。望ましい変異を挿入するように設計したＰＣＲプライマーをまたひき続クローニング工程を容易にするために制限部位も設計した。核酸配列をコードするＳｒｃの全セグメントを、チキン、ヒトおよびＳｒｃの同様な類似物の公知のｃＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲ増幅技術および引き続く新規構築物の形成を介して核酸構築物より検出した。
【０１３４】
本発明の１つの実施様態において、ｓｒｃ核酸を増幅するために使用した３’ＰＣＲプライマーはまたインフレーム配列についてコードする。このプライマーの使用により９Ｅ１０−ｍｙｃエピトープタグを続くＳｒｃ構築物のカルボキシル末端へ加えた。
【０１３５】
以下のアミノ酸をＳｒｃのアミノ酸２５１の後に加え、９Ｅ１０−ｍｙｃエピトープタグを含むベクター構築物を生成した。ＶＤＭＥＱＫＬＩＡＥＥＤＬＮ（配列番号６）。２つの別々のＰＣＲをそれぞれの構築物で実施し、同様の結果を得た。ＰＣＲによって構築したすべての変異体構築物をまたＰＣＲによって配列決定し、クローンの予期したＤＮＡ配列を確認した。本発明の発現系での使用のための野生型および変異Ｓｒｃ ｃＤＮＡはまた、ヒトと同様鳥類のｓｒｃおよび様々なキナーゼ死および活性化変異形を販売しているＵｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹより入手した。
【０１３６】
本発明のＳｒｃタンパク質の発現での使用のための他の発現ベクターはまた、米国特許第４，７９７，３６８号、第５，１７３，４１４号、第５，４３６，１４６号、第５，５８９，３７７号および第５，６７０，４８８号で記載されたようなアデノウイルスベクターを含む。Ｓｒｃ調節タンパク質の送達の他の方法には、米国特許第５，６７５，９５４号に記載のような非ウイルスベクター系でのＳｒｃ ｃＤＮＡの送達および米国特許第５，５８９，４６６号に記載のような裸のままのＤＮＡとしてのｃＤＮＡそれ自身の送達が含まれる。本発明の構築物の送達はまた、以下ＣＡＭアッセイ系で記述したようなウイルスベクターの局所投与に限定されない。たとえば、ウイルスベクター調製品はまた、血管床内への全身送達のために静脈床内に注射される。これらのベクターはまたたとえば例として腫瘍の局所注入による新血管形成の増加部位へ目標を定めうる。
【０１３７】
インビトロで発現したタンパク質は、タンパク質またはポリペプチドの送達に有効な方法で選択されたＳｒｃタンパクの発現と精製に続いて送達することが意図されている。そのような方法の１つは、米国特許第４，３５６，１６７号、第５，５８０，５７５号、第５，５４２，９３５号、第５，６４３，５９９号に記述されているようなリポソ−ム送達系を含む。その他のベクターやタンパク質送達系は本発明のＳｒｃタンパクの発現および／または送達で用いるために当業者に周知である。
【０１３８】
２．未処理のヒヨコ漿膜（ＣＡＭ）の特性化
Ａ．ＣＡＭの調製
血管形成は、完全に分化した血管の形成に帰着する通常の初期血管形成後にヒヨコ漿膜（ＣＡＭ）に誘導されうる。血管形成はＬｅｉｂｏｖｉｃｈら，Ｎａｔｕｒｅ，３２９：６３０（１９８７）およびＡｕｓｐｒｕｎｋら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，７９：５９７（１９７５）で記述されているように、特異的なサイトカインあるいは腫瘍断片への応答として誘導されることが示されている。ＣＡＭをヒヨコの胎児から、その後の血管形成と、その阻害のために調製した。１０日齢のヒヨコ胎児をＭｃｌｎｔｙｒｅ Ｐｏｕｌｔｒｙ（Ｌａｋｅｓｉｄｅ、ＣＡ）から得、３７℃、湿度６０％でインキュベートした。小型クラフトドリル（Ｄｒｅｍｅｌ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｍｅｒｓｏ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏ．Ｒａｃｉｎｅ ＷＩ）を用いて、卵の端の気嚢の上をまっすぐに殻を通して小さな穴をあけた。二番目の穴を、あらかじめ卵をろうそくの灯に照らして調べた胎児の血管のない領域で卵の広い側面上にあけた。元の穴に負の圧力をかけ、ＣＡＭ（漿膜）を殻膜から引き離し、ＣＡＭのまわりに偽性の気嚢を生み出した。小型モデル摩擦輪（Ｄｒｅｍｅｌ）を用いて、滴下したＣＡＭのまわりの殻を通って１．０ｃｍ×１．０ｃｍ四方の窓を切り取った。この小さな窓は下にあるＣＡＭに直接接触させておいた。
【０１３９】
得られたＣＡＭ調製品は、次に、胎児の新血管形成への影響を評価するために用いられたモデルに関連するＣＡＭに付加的な処理をせずに、胚形成の６日目、活性新血管形成で標識された段階であるいは血管形成が静まる胚形成の１０日目で用いた。後者の調製品をしたがって本発明で、以下に述べるようにサイトカイン処理あるいは腫瘍接触への応答で回復血管形成の誘導のために用いた。
【０１４０】
３．ＣＡＭ血管形成アッセイ
Ａ．増殖因子に誘発される血管形成
血管形成はサイトカインあるいは増殖因子により誘発されることが示されている。
【０１４１】
ハンクスバランス食塩水（Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＨＢＳＳ、ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、あるいは２μｇ／ｍの組換え体塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）あるいは血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を含むＨＢＳＳで飽和した５ｍｍ×５ｍｍ Ｗｈａｔｍａｎフィルターディスク（Ｗｈａｔｍａｎ Ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ＮＯ．１）を血管を避け、窓をテープで貼り付けた領域で、９日または１０日どちらかのヒヨコ胎児のＣＡＭ上に置くことにより、血管形成を誘発した。他濃度の増殖因子もまた、血管増殖の誘導に効果的である。アンタゴニストの静脈注射による血管形成阻害の起こる場所のアッセイのために、最初に繊維芽細胞成長増殖培地中１−２μｇ／ｍｌのｂＦＧＦあるいはＶＥＧＦで血管形成を誘発した。７２時間後に血管形成を光学顕微鏡で監視した。
【０１４２】
Ｂ．胎児血管形成
胎児新血管の正常な形成における血管形成阻害の影響を評価するためのＣＡＭ調製品は先に述べたような６日目ヒヨコ胎児である。発生のこの段階では、血管は新たな増殖をうけ、本発明のＳｒｃタンパク質による血管形成の調節を評価するのに有用な系を提供する。ＣＡＭ系は、アッセイを胎児の９日目あるいは１０日目よりもむしろ６日目で行うということをのぞいて、上で述べたように調製した。
【０１４３】
４．ＣＡＭアッセイで測定された血管形成の調節
血管形成におけるＳｒｃタンパク質の影響を評価するため、以下のアッセイを、１０日齢ヒヨコＣＡＭ調製品で行った。実施例１で記述したように準備した５μｇのＲＣＡＳ構成物をヒヨコ不滅化繊維芽細胞株ＤＦ−１（Ｍｉｎｎ．のＤｏｕｇ Ｆｏｓｔｅｒよりいただいた）にトランスフェクトした。この細胞株は初期ヒヨコ胎児繊維芽細胞と同様ウイルス産出能を持つが、ＤＦ−１細胞株はより高い力価を産出した。血清を含まないＣＬＭ培地（構成物：ＤＭＳＯを含むＦ−１０培地塩基、葉酸、グルタミン酸、ＭＥＭビタミン溶液）中、サブコンフレントのＤＦ−１産出細胞株からウイルス性の上清を回収した。３５ｍｌのウイルス性上清を、４℃、２２．０００ｒｐｍ、２時間の超遠心分離で濃縮した。これらの濃縮したウイルス性沈殿物を、血清を含まないＣＬＭ培地でもとの量の１／１００に希釈し、分割し、−８０℃で保存した。ＲＣＡＳ−ＧＦＰと呼ばれる、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしているヌクレオチド配列を持つ対照ウイルスベクターの段階希釈物を、４８から７２時間保温した初期ヒヨコ胎児繊維芽細胞に感染させることにより力価を評価した。以下の濃度を定常的に得られたウイルスストックの力価は１０８ｌ．ｕ．／ｍｌを超えた。ウイルスストックを用いたＣＡＭアッセイのために、９５％エタノール中３０分間、３ｍｇ／ｍｌコルチゾンアセテートを浸した直径６ｍｍのコルチゾン浸漬Ｗｈａｔｍａｎフィルターディスクを用意した。ディスクを層流フードで乾燥し、次いでディスクごと２０μｌのウイルスストックに１０分間浸漬した。これらのディスクを９日目あるいは１０日目のヒヨコ胎児のＣＡＭに接触させ、セロファンテープで貼り付け、３７℃で１８−２４時間インキュベートした。ついでモックＰＢＳまたは増殖因子のどちらかを５μｇ／ｍｌの濃度で、ＣＡＭ組織に対するウイルスの付加的な増加としての適当なウイルスストック２０μｌ中のＣＡＭに加えた。７２時間後、ＣＡＭを回収し、ディスクの下にあるＣＡＭ中の分岐点の数の両盲目計測により決定された血管形成性指標の変化を試験した。キナーゼアッセイのために、ディスクに下の組織をＲＩＰＡ中に回収し、電動摩砕機で均質化し、全タンパク質の等価量から免疫沈降し、ＦＡＫ−ＧＳＴ融合タンパク質を基質として用いたインビトロキナーゼアッセイにかけた。免疫蛍光研究のために、ディスクの下にあるＣＡＭ組織をＯＣＴ中に凍結し、低温保存的に、４μｍに切断し、１分間アセトンで固定し、通常の３％ヤギ血清中で１時間保温し、次いで、先に記述されたように（Ｅｌｉｃｅｉｒｉら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１４０：１２５５−１２６３（１９９８））一次ウサギ抗リン酸化ＥＲＫ抗体中でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、蛍光二次抗体で検出した。
【０１４４】
Ａ．ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦによる内因性Ｓｒｃの活性化
血管形成の調節でのＳｒｃ活性化における増殖因子の効果を査定するために、以下のアッセイを行った。２時間ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦ（２μｇ／ｍｌ）に暴露した１０日齢ヒヨコＣＭＡ組織抽出物を溶解させた。内因性Ｓｒｃを等量の総タンパク質より免疫沈降し、基質としてＧＳＴ融合タンパク質を用いたインビトロ免疫複合キナーゼアッセイにかけ、電気泳動し、ニトロセルロースに移した。
【０１４５】
アッセイの結果をＳｒｃ活性の増加は、ＣＡＭアッセイでの基準Ｓｒｃ活性の表示である未処理（モック）サンプルと比較して、ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦどちらかでのゲルの密度の増加における証拠である図５に示した。ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦ両方がＣＡＭに存在する内因性Ｓｒｃ活性の約２倍の増加に帰着した。上記キナーゼアッセイブロットをまた、同等のＳｒｃおよびＩｇＧ含量に対するローディング対照として抗Ｓｒｃ抗体でプローブ化した。
【０１４６】
Ｂ．ヒヨコＣＡＭでの血管形成におけるＳｒｃＡのレトロウイルス仲介遺伝子発現の影響
以下のアッセイをＣＭＡ調製品での血管形成における変異Ｓｒｃタンパク質の影響を査定するために行った。このアッセイのために、９日齢ヒヨコＣＡＭをＲＣＡＳ−ＳｒｃＡまたはＲＣＡＳ−ＧＦＰ発現レトロウイルスまたは緩衝液に上述したプロトコールの後７２時間暴露した。
【０１４７】
血管形成のレベルが上述のように定量され、このアッセイの結果を図６Ａに示した。代表的な顕微鏡写真（４×）を図６Ｂに示したようにステレオ顕微鏡でとった。基準内因性Ｓｒｃ活性をおよそ５０の血管形成指数とした。一方、チロシンからフェニルアラニンにアミノ酸残喜一５２７での点変異を持つレトロウイルスベクター発現ＲＣＡＳ−ＳｒｃＡで処理したＣＡＭはおよそ９０の血管形成指数の血管形成増強（誘導）となった。Ｓｒｃ−Ａ仲介血管形成の増強はまた図６Ｂで示した顕微鏡写真であきらかである。
【０１４８】
Ｃ．レトロウイルスのＳｒｃＡ発現は、血管ＭＡＰキナーゼリン酸化を活性化する
増殖因子ＶＥＧＦおよびＰＭＡと比較したＳｒｃＡの、血管ＭＡＰキナーゼリン酸化に対する効果も、上記およびここで記載したアッセイ手順に従って評価した。ＶＥＧＦまたはＰＭＡ（匹敵する濃度の別のマイトジェン）に３０分間曝露した１０日齢のヒヨコＣＡＭの組織抽出物を、ＳｒｃＡ発現レトロウイルスで４８時間感染させたものと比較した。次いで、Ｓｒｃを等量の全タンパク質抽出物から免疫沈降し、基質としてＦＡＫ−ＧＳＴ融合タンパク質を使用してインビトロ免疫複合体キナーゼアッセイにかけ、電気泳動し、ニトロセルロースに移した。
【０１４９】
このアッセイの結果は図７Ａに示し、ここで、非処置ＣＡＭ（ＮＴ）は、基線内因性Ｓｒｃ媒介血管ＭＡＰキナーゼリン酸化を示す。ＶＥＧＦおよびＰＭＡは両方共、基線の約２倍の増加をもたらした。これに対し、ＳｒｃＡは非処置サンプルで見られるものの約５−１０倍活性を増強した。
【０１５０】
上記の全組織溶解液のアリコートは、図７Ｂに示したように、抗ホスホＥＲＫ抗体でイムノブロットすることにより、内因性ＥＲＫリン酸化についても測定した。この評価のために、１０日齢のＣＡＭを、偽ＲＣＡＳまたはＳＲＣ Ａを発現するＲＣＡＳで感染させた。２日後、ＣＡＭを解剖し、ＯＣＴに凍結保存し、４μｍに切片化した。切片を抗リン酸化ＥＲＫ抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で免疫染色し、洗浄し、ヤギ抗ウサギＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体で検出した。蛍光イメージを冷却ＣＣＤカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔ．）で捕獲した。顕微鏡写真により、偽対照と比べてＳｒｃＡ処置調製物での免疫蛍光の増強が示される。
【０１５１】
Ｄ．ｂＦＧＦではなくＶＥＧＦ誘導血管形成中のＳｒｃ活性の選択的要求
増殖因子誘導血管形成に対するＳｒｃ調節活性の効果を評価するために、以下のアッセイを実施した。９日齢のヒヨコＣＡＭを、前記したＳｒｃ２５１またはＳｒｃ Ｋ２９５Ｍと称されるドミナントネガティブなＳｒｃ変異を発現するレトロウイルスベクター調製物に曝露した。ＲＣＡＳ−Ｓｒｃ２５１または対照ＲＣＡＳ−ＧＦＰレトロウイルスまたは緩衝液ＣＡＭＳを２０時間処理し、次いでさらに７２時間ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦの存在下または非存在下でインキュベートした。
【０１５２】
上記のように定量した血管形成のレベルは、図８Ａに示す。図８Ｂに示される、代表的な顕微鏡写真（６×）は、立体顕微鏡で撮影した。図８Ｃは、抗Ｓｒｃ抗体でプローブしたブロットを示し、偽処置と比較したトランスフェクト細胞でのＳｒｃ２５１発現を確認する。
【０１５３】
上記のアッセイの結果は、ＲＣＡＳ−ＧＦＰ対照の存在下でのｂＦＧＦおよびＶＥＧＦ処置ＣＡＭＳの両方が、偽または非処置ＣＡＭ調製物で見られるＳｒｃ媒介基線血管形成以上の血管形成を誘導したことを示す。発現されたドミナントネガティブな変異体Ｓｒｃ２５１は、ＶＥＧＦ誘導血管形成を基線レベルまで阻害するのに効果的であったが、ｂＦＧＦ媒介血管形成の阻害には効果的でなかった。図８Ｂで示した顕微鏡写真は図８Ａで示したデータを写真で確認する。従って、レトロウイルス発現Ｓｒｃ２５１は、血管形成がＶＥＧＦで誘導される場合、効果的な血管形成阻害剤である。
【０１５４】
下記の実施例に記載した他の血管形成モデルと共に本発明のＳｒｃタンパク質を適用することは本発明により考えられる。
【０１５５】
５．インビボウサギ眼モデルアッセイにより測定したＳｒｃ修飾因子による腫瘍組織増殖の退行
増殖因子誘導血管形成に対するＳｒｃ修飾因子の効果は、眼の角膜により例示されるような天然に透明な構造で観察できる。新規血管は、豊富な血液供給のある角膜の縁から、通常血液供給のない角膜中心へと増殖する。ｂＦＧＦなどの血管形成刺激物質は、角膜に適用すると、角膜の縁からの新規血管の増殖を誘導する。角膜に適用した血管形成アンタゴニストは、角膜の縁からの新規血管の増殖を阻害する。従って、角膜は、内皮細胞の侵入を通して、角膜の縁から、容易に見える硬いコラーゲン濃縮角膜組織への血管形成を受ける。ウギ眼モデルアッセイはそれ故、眼の角膜に直接化合物を埋め込んだ後の、直接的な血管形成の刺激および阻害の観察のインビボモデル提供する。
【０１５６】
Ａ．インビボウサギ眼モデルアッセイ
１）増殖因子により誘導される血管形成
血管形成は、増殖因子ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦによりインビボウサギ眼モデルアッセイで誘導され、以下の章で記載する。
【０１５７】
ａ．増殖因子を含むハイドロンペレットおよびモノクローナル抗体の調製
増殖因子を含むハイドロンポリマーペレットは、Ｄ’Ａｍａｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：４０８２−４０８５（１９９４）により調製する。個々のペレットは、増殖因子を安定化し、周辺組織へのゆっくりとした放出を確かにするスクラルフェート（Ｃａｒａｆｅｔ、Ｍａｒｉｏｎ Ｍｅｒｒｅｌｌ Ｄｏｗ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に別々に結合した６５０ｎｇの増殖因子を含む。さらに、前記の所望のＳｒｃ発現レトロウイルスを含むハイドロンペレットを調製する。ペレットは、その表面に２．５ｍｍの穴を穿孔した特別に調製したテフロンペグに鋳造する。約１２μｌの鋳造物質を各ペグに入れ、一晩無菌フード中で重合する。次いでペレットを紫外線照射により滅菌する。次いで、Ｓｒｃタンパク質の効果を前記のように評価する。
【０１５８】
６．キメラマウス：ヒトアッセイにより測定した、Ｓｒｃ修飾因子による腫瘍組織増殖のインビボ退行
インビボキメラマウス：ヒトモデルを、ＳＣＩＤマウスの皮膚の一部をヒト新生児包皮で置換することにより作成する。インビボキメラマウス：ヒトモデルは、本質的にＹａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：９８６−９９６（１９９３）に記載のように調製する。簡潔には、２ｃｍ２平方領域の皮膚をＳＣＩＤマウス（６−８週令）から外科的に除去し、ヒト包皮と置換する。マウスを麻酔し、剪毛により腹側部の各側の５ｃｍ２領域から毛を除去する。２つの２ｃｍ２の環状移植床を、筋膜までの全厚の皮膚を除去することにより調製する。ヒト新生児包皮から得た同サイズの全厚ヒト皮膚移植片を創傷床に配置し、縫合する。移植片をバンドエイドで覆い、皮膚に縫合する。ミクロ細孔布巻尺も創傷に適用する。
【０１５９】
Ｍ２１−Ｌヒト黒色腫細胞系またはＭＤＡ２３．１乳癌細胞系（ＡＴＣＣ ＨＴＢ２６；ｍＡｂ ＬＭ６０９との組織切片の免疫反応性によりαβ３陰性）を使用して、ＳＣＩＤマウス上のヒト皮膚移植片上に充実ヒト腫瘍を形成する。５×１０６Ｍ２１−ＬまたはＭＤＡ２３．１細胞の単一細胞懸濁液を、ヒト皮膚移植片に皮内注射する。次いで、マウスを２−４週間観察し、測定可能なヒト腫瘍を増殖させる。
【０１６０】
測定可能な腫瘍が確立した後、本発明のレトロウイルス調製物またはＰＢＳをマウス尾静脈に注射する。２−３週間後、腫瘍を切出し、重量および組織学により分析する。次いで、本発明の発現されたＳｒｃタンパク質の腫瘍に対する効果を評価する。
【０１６１】
７．ＣＡＭアッセイにより測定したＳｒｃ修飾因子によるヒト腫瘍組織増殖のインビトロ退行
腫瘍増殖は血管形成に依存する（Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９２；Ｗｅｉｄｎｅｒら、１９９１；Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４ｂ）。事実、近年の報告により、腫瘍増殖はＶＥＧＦ受容体アンタゴニストの抗血管形成効果に感受性であることが示唆される（Ｋｉｍら、１９９３）。それ故、我々は、キナーゼ欠失Ｓｒｃ２５１の送達による血管形成の抑制が、ＶＥＧＦを産生しほとんどｂＦＧＦを産生しないことが知られる高度に血管形成性の腫瘍である、ヒト髄芽腫（ＤＡＯＹ）の増殖に影響を及ぼすかどうかを調べた（データは示していない）。
【０１６２】
３および６日のＤＡＯＹ髄芽腫腫瘍増殖アッセイを、本質的に前記したようにヒヨコＣＡＭで実施した（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４）。１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０中で培養した５×１０６ＤＡＯＹ細胞を洗浄し、１０日齢の胚のＣＡＭに接種し、ＤＡＯＹ腫瘍断片を産生した。７日後、５０ｍｇの腫瘍断片を解剖し、別の１０日齢の胚に再度接種し、さらに３または６日間、対照ＲＣＡＳ−ＧＦＰレトロウイルス、ＲＣＡＳ−Ｓｒｃ２５１または偽処置を局所適用（２５μｌ）してインキュベートした。指針として感染腫瘍の全組織共焦点イメージングを使用して、我々は、この局所アプローチで、腫瘍断片付近およびその中でＲＣＡＳ作成物の有意な発現があることを決定できた。腫瘍切除および秤量を二重盲検様式で実施し、容易に規定できる充実腫瘍塊のみを除去した（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４）。３または６日後の湿潤腫瘍重量を最初の重量と比較し、腫瘍重量の比率変化を各群について決定した。
【０１６３】
これらの腫瘍は容易にＣＡＭ上で増殖し、活発な血管形成をもたらし（図９）、トリ特異的ＲＣＡＳレトロウイルスの使用によりトリ由来腫瘍脈管構造を選択的に標的化できる。
【０１６４】
図９は、ヒヨコＣＡＭ上で増殖しているヒト腫瘍に、ＲＣＡＳ−Ｓｒｃ２５１をレトロウイルスにより送達すると腫瘍増殖は逆転することを示す結果を示す。図９Ａは、上記したようにヒヨコ胚のＣＡＭ上で増殖したヒト髄芽腫を示す。ＲＣＡＳ−ＧＦＰまたはＲＣＡＳ−Ｓｒｃ２５１を含むレトロウイルスを、５０ｍｇ以上の前以て確立された腫瘍に局所適用した。ＧＦＰを発現するＲＣＡＳ−ＧＦＰで感染した髄芽腫腫瘍断片の代表的な顕微鏡写真により、バイオラッドレーザー共焦点走査顕微鏡（バー＝５００μｍ）を用いた光学切片化により検出した腫瘍血管での排他的な発現（矢印）が判明する。図９Ｂは、３または６日間増殖させ、その後切除し湿潤重量を決定した上記のように処置した腫瘍の結果を示す。データは、２つの複製物の腫瘍重量の平均変化（５０ｍｇの腫瘍開始重量から）＋／−標準誤差として表す。ＲＣＡＳ−Ｓｒｃ２５１は、腫瘍増殖に対する有意な影響を３日後（＊、Ｐ＜０．００２）および６日後（＊＊、Ｐ＜０．０５）に示した。図９Ｃは、胚から外科的に除去した髄芽腫腫瘍の代表的な立体顕微鏡写真をオリンパス立体顕微鏡（バー＝３５０μｍ）で撮影したことを示す。（下のパネル）各腫瘍の高倍率顕微鏡写真は詳細に各腫瘍の脈管構造を示す（バー＝３５０μｍ）。矢印は、ＲＣＡＳ−Ｓｒｃ２５１処置腫瘍での血管破壊を示す。
【０１６５】
結果は、Ｓｒｃ２５１を含むＲＣＡＳの、前以て確立された髄芽腫への送達により、腫瘍感染血管での選択的ウイルス発現が生じ（図９Ａ）、これは最終的に６日間以内にこれらの腫瘍の退行をもたらす（図９Ｂ）。重要なことに、Ｓｒｃ２５１を含むウイルスで処置した動物の腫瘍関連血管は重度に破壊し、対照動物の腫瘍血管と比べて数が少なかった（図９Ｃ）。ＲＣＡＳ−ＧＦＰ感染腫瘍は腫瘍脈管構造にのみＧＦＰ局在を示すという事実は、レトロウイルス送達Ｓｒｃ２５１で観察された抗腫瘍効果は抗血管形成特性に起因することを示唆する。
【０１６６】
前記の実施例およびそれに伴う記載は説明的なものであり、限定するものではない。本発明はまた、提出された細胞系により範囲を限定されない。なぜなら提出された実施形態は本発明の１つの態様の１つの説明として捉えられるからである。機能的に等価のいずれの細胞系も本発明の範囲内にある。物質の提出は、ここに含まれる記述が、その最善の形態を含む、本発明の任意の態様の実践を可能とするに不十分であるという承認にはならず、また、請求の範囲を、それが示す特定の説明に限定するとは解釈されない。実際、本明細書で示され記載されたものに加えて本発明の様々な修飾が、前記から当業者には明らかとなり、添付の請求の範囲内に該当する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｔａｋｅｙａら，Ｃｅｌｌ，３２：８８１−８９０（１９８３）によって最初に記載されたイントロンの欠失した完全コーディング配列を表すニワトリｃ−ＳｒｃのｃＤＮＡ配列である。この配列はＧｅｎＢａｎｋから登録番号Ｊ００８４４で入手できる。該配列は１７５９ヌクレオチドを含み、タンパク質コーディング部分はそれぞれ１１２位で開始し、１７１３位で終止する。
【図２】 図１に示すコーディング配列でコードされたニワトリｃ−Ｓｒｃのアミノ酸残基配列である。
【図３】 Ｂｒａｅｕｎｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：１０４１１−１０４１５（１９９１）によって最初に記載されたヒトｃ−ＳｒｃのｃＤＮＡ配列である。この配列はＧｅｎＢａｎｋから登録番号Ｘ５９９３２ Ｘ７１１５７で入手できる。該配列は２１８７ヌクレオチドを含み、タンパク質コーディング部分はそれぞれ１３４位で開始し、１４８６位で終止する。
【図４】 図３に示すコーディング配列でコードされたヒトｃ−Ｓｒｃのアミノ酸残基配列である。
【図５】 実施例４に記載のようなｂＦＧＦまたはＶＥＧＦによる内因性Ｓｒｃの活性化を示す。図の上部は、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦによる内因性ｃ−Ｓｒｃのｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの結果を活性化倍率と共に示す。図の下部は、均等なＳｒｃ及びＩｇＧの含量に対してローディングコントロールとして抗−Ｓｒｃ抗体でプローブしたキナーゼアッセイブロットを示す。
【図６】 実施例４に記載のようなニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）中の血管形成に対するレトロウイルス介在ｃ−Ｓｒｃ Ａ遺伝子発現の効果を示す。９日齡のニワトリＣＡＭをＲＣＡＳ−Ｓｒｃ Ａ（活性の突然変異ｃ−Ｓｒｃ）またはコントロールＲＣＡＳ−ＧＦＰ（緑色系蛍光タンパク質；蛍光性指示タンパク質）レトロウイルスまたはバッファに７２時間接触させた。図６Ａは血管形成レベルの定量を示し、図６Ｂは立体顕微鏡で撮影した各処理サンプルの代表的顕微鏡写真（４×）に対応する。
【図７】 血管ＭＡＰキナーゼリン酸化を活性化しているｃ−Ｓｒｃ Ａのレトロウイルス発現を示す。図７Ａは、ＶＥＧＦもしくはＰＭＡに３０分間接触させたかまたはｃ−Ｓｒｃ Ａレトロウイルスを４８時間感染させた１０日齡のニワトリＣＡＭの組織抽出物を示す。ＮＴは処理せずを表す。Ｓｒｃを均等量の全タンパク質抽出物から免疫沈降させ、ＦＡＫ−ＧＳＴ融合タンパク質を基質として用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫複合体キナーゼアッセイで処理し、電気泳動させ、ニトロセルロースフィルターに転移させた。上記の全組織溶解物のアリコートの内因性ＥＲＫリン酸化を抗−ホスホ−ＥＲＫ抗体でイムノブロッティングすることによって測定した。図７Ｂは、擬似ＲＣＡＳまたはＳＲＣ Ａを含有するＲＣＡＳを感染させた１０日齡のＣＡＭを示す。２日後、ＣＡＭを摘出し、ＯＣＴ中で凍結保存し、４μｍで切開した。切片を抗リン酸化ＥＲＫ抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で免疫染色し、洗浄し、ヤギ抗−ウサギＦＩＴＣ−コンジュゲート第二抗体で検出した。冷却したＣＣＤカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔ．）で蛍光像を撮影した。
【図８】 ｂＦＧＦでなくＶＥＧＦに誘発された血管形成中のＳｒｃ活性に対する選択要件を示す。９日齡のニワトリＣＡＭをＲＣＡＳ−Ｓｒｃ ２５１またはコントロールＲＣＡＳ−ＧＦＰレトロウイルスまたはバッファに２０時間接触させ、次いでｂＦＧＦまたはＶＥＧＦの存在下または非存在下で更に７２時間インキュベートした。図８Ａは、上述のように定量した血管形成レベルを示し、図８Ｂは、立体顕微鏡で撮影した代表的顕微鏡写真（６×）を示す。図８Ｃは、トランスフェクト細胞中のＳｒｃ ２５１の発現を確認するために抗−Ｓｒｃ抗体でプローブしたブロットを擬似処理に比較して示す。
【図９】 ヒト腫瘍に対するＲＣＡＳ−Ｓｒｃ ２５１のレトロウイルス性デリバリーの結果を示す。図９Ａは、Ｂｉｏ Ｒａｄレーザー共焦点走査型顕微鏡で光学セクショニング（ｂａｒ＝５００μｍ）によって検出した腫瘍血管（矢印）中でＧＦＰだけを発現するＲＣＡＳ−ＧＦＰ（ＲＣＡＳ−緑色系蛍光タンパク質）に感染させたヒト髄芽細胞腫フラグメントを示す顕微鏡写真である。図９Ｂは、レトロウイルスの局所塗布によって処理し、３日間または６日間増殖させた後、切除し、湿潤重量を計量した腫瘍から得られたデータを示す。データは２つの重複サンプルの腫瘍重量の平均変化（初期腫瘍重量５０ｍｇからの変化）±ＳＥＭとして表される。図９Ｃは、胚から外科的に摘出された髄芽細胞腫の顕微鏡写真（ｂａｒ＝３５０μｍ）を表す。下段パネルは各腫瘍の脈管構造を詳細に示す各腫瘍の高倍率写真である（ｂａｒ＝３５０μｍ）。矢印はＲＣＡＳ−Ｓｒｃ２５１−処理腫瘍中の血管破壊を示す。
【図１０】 ＲＣＡＳＢＰ（ＲＣＡＳ）ベクター構築物の制限マップを示す概略図である。
【配列表】
（発明の分野）
本発明は一般的には医薬の分野に関する。より詳細には、タンパク質チロシンキナーゼＳｒｃ、Ｓｒｃの変異体及びそれらをコードする核酸を使用して組織の血管形成を変調する方法及び組成物に関する。
【０００２】
（発明の背景）
血管形成（アンギオゲネシス）は、組織中で発生している新しい血管の増殖を含む組織血管分布のプロセスであり、血管新生とも呼ばれる。このプロセスには内皮細胞及び平滑筋細胞の浸潤が介在する。このプロセスは以下の３つの行程、即ち、先在する血管から血管が萌芽し得る行程、前駆細胞から血管のｄｅ ｎｏｖｏ発生が生じる行程（脈管形成、バスキュロゲネシス）、または、既存の小血管の内径が拡張し得る行程、のいずれかによって進行すると考えられている。Ｂｌｏｏｄら，Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０３２：８９−１１８（１９９０）。
【０００３】
血管形成は、新生児の成長の重要なプロセスであるが、また、創傷の治癒においても、組織炎症、関節炎、腫瘍増殖、糖尿病性網膜症、網膜の血管新生による黄斑変性などの状態のような多様な臨床疾患の病理発生においても重要である。血管形成に関連するこれらの臨床徴候を血管形成性疾患と呼ぶ。Ｆｏｌｋｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：４４２−４４７（１９８７）。一般に成人の組織または成熟組織には血管形成が存在しないが、創傷の治癒中及び黄体成長サイクル中には血管形成が生じる。例えばＭｏｓｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１４０８−１４１０（１９９０）参照。
【０００４】
血管形成の阻害が腫瘍増殖を抑制する有効な治療方法になるであろうと提唱された。（１）ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）のような“血管新生分子”の放出の阻害、（２）抗βｂＦＧＦ抗体の使用などによる血管新生分子の中和、（３）ビトロネクチン受容体αｖβ３のインヒビターの使用、及び、（４）血管形成刺激に対する内皮細胞応答の阻害、によって血管形成を阻害することが提案された。この最後の戦略が注目され、Ｆｏｌｋｍａｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３：８９−９６（１９９２）は、コラゲナーゼインヒビター、基底膜代謝回転インヒビター、血管静止ステロイド、菌類由来の血管形成インヒビター、血小板第４因子、トロンボスポンジン、Ｄ−ペニシラミン及び金チオマレートのような関節炎薬、ビタミンＤ３類似体、アルファ−インターフェロンなどのような血管形成の阻害に使用できる複数の内皮細胞応答インヒビターを記載している。その他の提案された血管形成インヒビターに関しては、Ｂｌｏｏｄら，Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０３２：８９−１１８（１９９０）、Ｍｏｓｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１４０８−１４１０（１９９０）、Ｉｎｇｂｅｒら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５９：４４−５１（１９８８）及び米国特許第５，０９２，８８５号、第５，１１２，９４６号、第５，１９２，７４４号、第５，２０２，３５２号、第５，７５３，２３０号及び第５，７６６，５９１号を参照するとよい。上記の参考文献に記載された血管形成インヒビターはいずれもＳｒｃタンパク質を含有していない。
【０００５】
血管形成を誘発するためには、腫瘍細胞が侵襲及び転移形成中に使用する方法と同様の方法で最初に内皮細胞が血管基底膜を分解しこの膜を貫通しなければならない。
【０００６】
血管形成が血管インテグリンと細胞外マトリックスタンパク質との相互作用に依存するという説は従来から報告されていた。Ｂｒｏｏｋｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：５６９−５７１（１９９４）。更に、血管形成性血管細胞のプログラムされた細胞死（アポトーシス）がこの相互作用によって開始されること、及び、この相互作用は血管インテグリンαｖβ３のある種のアンタゴニストによって阻害されることが報告された。Ｂｒｏｏｋｓら，Ｃｅｌｌ，７９：１１５７−１１６４（１９９４）。より最近には、ビトロネクチン受容体（αｖβ５）に対するマトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）の結合をαｖβ５アンタゴニストを使用して阻害し、これによって該プロテイナーゼの酵素機能を阻害できることが報告された。Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃｅｌｌ，８５：６８３−６９３（１９９６）。
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、チロシンキナーゼＳｒｃによる組織中の血管形成の変調に関する。本文中ではチロシンキナーゼＳｒｃを総称的にＳｒｃと呼ぶ。
【０００８】
疾患状態に関連する組織中の血管形成を変調する組成物及び方法が検討されている。血管形成の変調に応答する疾患状態に対しては、血管形成を変調し得る量のＳｒｃタンパク質を含む組成物を治療すべき組織に投与する。Ｓｒｃタンパク質を供給する組成物は、精製されたタンパク質、生物学的に活性のタンパク質フラグメント、組換え産生されたＳｒｃタンパク質もしくはタンパク質フラグメントまたはその融合タンパク質、または、Ｓｒｃタンパク質を発現する遺伝子／核酸発現ベクターを含有し得る。
【０００９】
Ｓｒｃタンパク質が不活性化されるかまたは阻害される場合、変調は血管形成の阻害である。Ｓｒｃタンパク質が活性であるかまたは活性化される場合、変調は血管形成の増進である。
【００１０】
治療すべき組織は、血管形成の変調が望まれる任意の組織でよい。血管形成の阻害は、有害な血管新生が生じている疾患組織の治療に有効である。代表的な組織は、炎症を生じた組織、固形腫瘍、転移部、再発狭窄症の危険がある組織などである。
【００１１】
血管形成の増進は、糖尿病またはその他の疾患によって四肢の循環不良に陥った四肢虚血のある患者の治療に有効である。また、癒合しない慢性創傷があり従って血管細胞の増殖及び血管新生の亢進によって有利な効果が与えられる患者の治療に有効である。
【００１２】
本文中に記載のような修飾アミノ酸配列を含むＳｒｃタンパク質の使用が特に好ましい。幾つかの特に有効な修飾Ｓｒｃタンパク質及びその発現を本文中に開示する。
【００１３】
本発明はまた、核酸を含有するウイルス性または非ウイルス性の遺伝子導入ベクターと医薬として許容される担体または賦形剤とから成り、上記核酸がｓｒｃタンパク質をコードする核酸セグメントを有しており、該ｓｒｃタンパク質がコドン５２７にチロシン、セリンまたはトレオニン以外の任意のアミン酸残基を有することを特徴とする、ターゲット哺乳類組織中の血管形成を促進する医薬組成物を包含する。
【００１４】
本発明はまた、核酸を含有するウイルス性または非ウイルス性の遺伝子導入ベクターと医薬として許容される担体または賦形剤とから成り、上記核酸がキナーゼ活性をもたないｓｒｃタンパク質をコードする核酸セグメントを有していることを特徴とする、ターゲット哺乳類組織中の血管形成を阻害する医薬組成物を提供する。
【００１５】
（図面の簡単な説明）
図面は本文の開示の一部を形成する。
【００１６】
図１は、Ｔａｋｅｙａら，Ｃｅｌｌ，３２：８８１−８９０（１９８３）によって最初に記載されたイントロンの欠失した完全コーディング配列を表すニワトリｃ−ＳｒｃのｃＤＮＡ配列である。この配列はＧｅｎＢａｎｋから登録番号Ｊ００８４４で入手できる。該配列は１７５９ヌクレオチドを含み、タンパク質コーディング部分はそれぞれ１１２位で開始し、１７１３位で終結する。
【００１７】
図２は、図１に示すコーディング配列でコードされたニワトリｃ−Ｓｒｃのアミノ酸残基配列である。
【００１８】
図３は、Ｂｒａｅｕｎｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：１０４１１−１０４１５（１９９１）によって最初に記載されたヒトｃ−ＳｒｃのｃＤＮＡ配列である。この配列はＧｅｎＢａｎｋから登録番号Ｘ５９９３２ Ｘ７１１５７で入手できる。該配列は２１８７ヌクレオチドを含み、タンパク質コーディング部分はそれぞれ１３４位で開始し、１４８６位で終結する。
【００１９】
図４は、図３に示すコーディング配列でコードされたヒトｃ−Ｓｒｃのアミノ酸残基配列である。
【００２０】
図５は、実施例４に記載のようなｂＦＧＦまたはＶＥＧＦによる内因性Ｓｒｃの活性化を示す。図の上部は、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦによる内因性ｃ−Ｓｒｃのｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの結果を活性化倍率と共に示す。図の下部は、均等なＳｒｃ及びＩｇＧの含量に対してローディングコントロールとして抗−Ｓｒｃ抗体でプローブしたキナーゼアッセイブロットを示す。
【００２１】
図６は、実施例４に記載のようなニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）中の血管形成に対するレトロウイルス介在ｃ−Ｓｒｃ Ａ遺伝子発現の効果を示す。９日齡のニワトリＣＡＭをＲＣＡＳ−Ｓｒｃ Ａ（活性突然変異ｃ−Ｓｒｃ）またはコントロールＲＣＡＳ−ＧＦＰ（緑色系蛍光タンパク質；蛍光性指示タンパク質）レトロウイルスまたはバッファに７２時間接触させた。図６Ａは血管形成レベルの定量を示し、図６Ｂは立体顕微鏡で撮影した各処理サンプルの代表的顕微鏡写真（４×）に対応する。
【００２２】
図７は、血管ＭＡＰキナーゼリン酸化を活性化するｃ−Ｓｒｃ Ａのレトロウイルス発現を示す。図７Ａは、ＶＥＧＦもしくはＰＭＡに３０分間接触させたかまたはｃ−Ｓｒｃ Ａレトロウイルスを４８時間感染させた１０日齡のニワトリＣＡＭの組織抽出物を示す。ＮＴは処理せずを表す。Ｓｒｃを均等量の全タンパク質抽出物から免疫沈降させ、ＦＡＫ−ＧＳＴ融合タンパク質を基質として用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫複合体キナーゼアッセイで処理し、電気泳動させ、ニトロセルロースフィルターに転移させた。上記の全組織溶解物のアリコートの内因性ＥＲＫリン酸化を抗−ホスホ−ＥＲＫ抗体でイムノブロッティングすることによって測定した。図７Ｂは、擬似ＲＣＡＳまたはＳＲＣ Ａを含有するＲＣＡＳを感染させた１０日齡のＣＡＭを示す。２日後、ＣＡＭを摘出し、ＯＣＴ中で凍結保存し、４μｍで切開した。切片を抗リン酸化ＥＲＫ抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で免疫染色し、洗浄し、ヤギ抗−ウサギＦＩＴＣ−コンジュゲート第二抗体で検出した。冷却したＣＣＤカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔ．）で蛍光像を撮影した。
【００２３】
図８は、ｂＦＧＦでなくＶＥＧＦに誘発された血管形成中のＳｒｃ活性に対する選択要求を示す。９日齡のニワトリＣＡＭをＲＣＡＳ−Ｓｒｃ ２５１またはコントロールＲＣＡＳ−ＧＦＰレトロウイルスまたはバッファに２０時間接触させ、次いでｂＦＧＦまたはＶＥＧＦの存在下または非存在下で更に７２時間インキュベートした。図８Ａは、上述のように定量した血管形成レベルを示し、図８Ｂは、立体顕微鏡で撮影した代表的顕微鏡写真（６×）を示す。図８Ｃは、トランスフェクト細胞中のＳｒｃ ２５１の発現を確認するために抗−Ｓｒｃ抗体でプローブしたブロットを擬似処理に比較して示す。
【００２４】
図９は、ヒト腫瘍に対するＲＣＡＳ−Ｓｒｃ ２５１のレトロウイルス性デリバリーの結果を示す。図９Ａは、Ｂｉｏ Ｒａｄレーザー共焦点走査型顕微鏡で光学セクショニング（ｂａｒ＝５００μｍ）によって検出した腫瘍血管（矢印）中でＧＦＰだけを発現するＲＣＡＳ−ＧＦＰ（ＲＣＡＳ−緑色系蛍光タンパク質）に感染させたヒト髄芽細胞腫フラグメントを示す顕微鏡写真である。図９Ｂは、レトロウイルスの局所塗布によって処理し、３日間または６日間増殖させた後、切除し、湿潤重量を計量した腫瘍から得られたデータを示す。データは２つの重複サンプルの腫瘍重量の平均変化（初期腫瘍重量５０ｍｇからの変化）±ＳＥＭとして表される。図９Ｃは、胚から外科的に摘出された髄芽細胞腫の顕微鏡写真（ｂａｒ＝３５０μｍ）を表す。下段パネルは各腫瘍の脈管構造を詳細に示す各腫瘍の高倍率写真である（ｂａｒ＝３５０μｍ）。矢印はＲＣＡＳ−Ｓｒｃ２５１−処理腫瘍中の血管破壊を示す。
【００２５】
図１０は、ＲＣＡＳＢＰ（ＲＣＡＳ）ベクター構築物の制限マップを示す概略図である。
【００２６】
（詳細な説明）
Ａ．定義
アミノ酸残基：ポリペプチドをそのペプチド結合の処で化学消化（加水分解）するときに形成されるアミノ酸。本文中に記載のアミノ酸残基は好ましくは“Ｌ”異性体の形態である。しかしながら、ポリペプチドが所望の機能的特性を維持している限り、任意のＬ−アミノ酸残基を“Ｄ”異性体形態で置換できる。ＮＨ２はポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を意味する。ＣＯＯＨは標準ポリペプチド命名法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５９（１９６９）に記載され３７ ＣＦＲ §１．８２２（ｂ）（２）に採用された命名法）に従ってポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を意味する。
【００２７】
本文中の全部のアミノ酸残基配列は、左右方向がアミノ末端からカルボキシ末端に向かう慣用の方向で示される式によって表されることに注目されたい。更に、アミノ酸残基配列の起点または終点のダッシュ記号は１つまたは複数のアミノ酸残基の別の配列に対するペプチド結合を示す。
【００２８】
ポリペプチド：この用語は、隣合うアミノ酸残基のアルファ−アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに結合されたアミノ酸残基の直鎖状配列を意味する。
【００２９】
ペプチド：本文中で使用されたこの用語は、例えば１つのポリペプチド中の約５０個以下のアミノ酸残基が互いに結合された直鎖状配列を意味する。
【００３０】
環状ペプチド：この用語は、例えば典型的なペプチド中に複数のアミド結合を含む環構造を有する化合物を意味する。環状ペプチドは、“ヘッド−ツー−テイル”ホモデチック環状ペプチドでもよく、または、ジスルフィド架橋、ラクタム架橋、チオエステル、チオアミド、グアニジノ及び同様の結合によって環が閉鎖されたヘテロデチック環構造を含んでもよい。
【００３１】
タンパク質：この用語は、例えば１つのポリペプチド中の５０個を上回る数のアミノ酸残基が互いに結合された直鎖状配列を意味する。
【００３２】
融合タンパク質：この用語は、典型的なペプチド結合によって作動可能に連結された（“融合した”）少なくとも２個の異なるポリペプチドドメインを含むポリペプチドを意味する。この場合、２個のドメインは天然には融合形態で見出されないペプチドに対応する。
【００３３】
合成ペプチド：この用語は、ペプチド結合によって互いに結合されたアミノ酸残基の化学的に産生された鎖であって天然に産生するタンパク質及びそのフラグメントを含まないものを意味する。
【００３４】
Ｂ．一般的考察
本発明は一般的には、血管形成にはチロシンキナーゼＳｒｃタンパク質が介在しており、活性または不活性のＳｒｃタンパク質を供給することによって血管形成がそれぞれ増進または阻害されるように血管形成を変調できるという知見に関する。
【００３５】
多様な疾患のプロセスに血管形成、即ち新しい血管の形成が役割を担っているのでこの知見は重要である。疾患状態に関連する組織がその増殖のために血管形成を必要とする場合、血管形成を阻害しこれによって罹病組織の増殖を阻害するのが望ましい。傷害された組織がその増殖及び治癒のために血管形成を必要とする場合、血管形成を増進または促進しこれによって組織の治癒及び増殖を促進するのが望ましい。
【００３６】
新しい血管の増殖が罹病組織に関連する病理の原因であったりまたは一因であったりする場合、血管形成の阻害によって疾患の有害な効果を抑制し得る。血管形成を阻害することによって、疾患に介入し、症状を軽減し、いくつかの場合には疾患の治療に成功し得る。
【００３７】
血管形成を阻害するという変調から有利な効果を得る疾患関連組織及び血管新生関連組織の例としては、リューマチ様関節炎、糖尿病性網膜症、炎症性疾患、再発狭窄症などがある。有害組織の増殖を助長するために新しい血管の増殖が必要な場合、血管形成の阻害によって組織への血液供給が減少し、これは、血液供給要求に基づく組織集団の縮小に寄与する。この例としては、腫瘍が数ミリメートル以上の厚さに増殖するため及び固形腫瘍の転移が成立するために血管新生が絶えず要求されるような腫瘍の増殖がある。
【００３８】
新しい血管の増殖が組織の治癒に寄与する場合には、血管形成の増進が治癒を支援する。この例は、糖尿病またはその他の状態が原因で四肢の循環不良に陥った四肢虚血患者の治療である。また、癒合しない慢性創傷があり従って血管細胞の増殖及び血管新生の亢進から有利な効果を得る患者も治療対象として考えることができる。
【００３９】
本発明方法の有効性は部分的には、治療方法が血管形成に対して高度に選択性であり他の生物学的プロセスには選択性でないという理由に基づく。
【００４０】
上述のように、血管形成は、“血管萌芽”、血管形成または血管拡張などのような組織の血管新生が関与する多様なプロセスを含む。これらの血管形成プロセスはすべてＳｒｃタンパク質によって行われる。
【００４１】
外傷的創傷治癒、黄体形成及び胚形成を例外として、大多数の血管形成プロセスは疾患プロセスに関連すると考えられる。従って、本発明の治療方法は疾患選択性であり、有害な副作用を有していない
Ｃ．Ｓｒｃタンパク質
本発明で使用するチロシンキナーゼＳｒｃタンパク質は所期用途に応じて種々のものを利用できる。「Ｓｒｃタンパク質」又は「Ｓｒｃ」なる用語は本明細書に記載する活性又は不活性形態の各種チロシンキナーゼＳｒｃタンパク質を意味する。
【００４２】
「活性Ｓｒｃタンパク質」とは血管形成を促進する各種Ｓｒｃタンパク質の任意のものを意味する。本明細書には血管形成の促進を測定するアッセイを記載するが、これに限定するものではない。血管形成レベルがＳｒｃをアッセイ系に加えない対照レベルよりも少なくとも１０％、好ましくは２５％、より好ましくは５０％高い場合にタンパク質は活性であるとみなす。促進を測定するアッセイとしては、実施例に記載するようにＲＣＡＳウイルスベクターを使用し、分岐点を数えることにより血管形成指数を計算するＣＡＭアッセイが好ましい。好ましい活性Ｓｒｃタンパク質はチロシンキナーゼ活性も示す。活性Ｓｒｃタンパク質の例については実施例に記載するが、例えばＳｒｃ−Ａである。
【００４３】
「不活性Ｓｒｃタンパク質」とは血管形成を阻害する各種Ｓｒｃタンパク質の任意のものを意味する。本明細書には血管形成の阻害を測定するアッセイを記載するが、これに限定するものではない。血管形成レベルが外因性Ｓｒｃをアッセイ系に加えない対照レベルよりも少なくとも１０％、好ましくは２５％、より好ましくは５０％低い場合にタンパク質は不活性であるとみなす。阻害を測定するアッセイとしては、実施例に記載するようにＲＣＡＳウイルスベクターを使用し、分岐点を数えることにより血管形成指数を計算するＣＡＭアッセイが好ましい。好ましい不活性Ｓｒｃタンパク質はチロシンキナーゼ活性の低下も示す。不活性Ｓｒｃタンパク質の例については実施例に記載するが、例えばＳｒｃ−２５１である。
【００４４】
本発明で有用なＳｒｃタンパク質は組織等の天然源からの単離、組換えＤＮＡ発現と精製による生産等の各種方法の任意の方法で生産することができる。Ｓｒｃタンパク質は遺伝子治療系を目的組織に導入した後、同タンパク質をこの組織で発現させることにより「ｉｎ ｓｉｔｕ」提供することもできる。
【００４５】
Ｓｒｃタンパク質をコードする遺伝子は当技術分野で公知の各種方法により作製することができ、本発明はこの点で限定するものではない。例えば、Ｓｒｃの自然史は哺乳動物、トリ、ウイルス等の種からの種々の相同体を含むことが周知であり、その遺伝子はタンパク質を発現する任意組織からｃＤＮＡクローニング法を使用して容易にクローニングできる。本発明で使用するのに好ましいＳｒｃは哺乳動物又はトリ相同体等の細胞性タンパク質ｃ−Ｓｒｃである。ヒトｃ−Ｓｒｃが特に好ましい。
【００４６】
Ｄ．Ｓｒｃタンパク質の発現用組換えＤＮＡ分子及び発現系
本発明は本発明で特に使用する数種のヌクレオチド配列について記載する。これらの配列は本発明で有用なＳｒｃタンパク質をコードする配列と、Ｓｒｃタンパク質を発現させるために構築した種々のＤＮＡセグメント、組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子及びベクターを含む。
【００４７】
従って、本発明のＤＮＡ分子（セグメント）は本明細書に詳述する完全構造遺伝子、構造遺伝子のフラグメント及び転写単位をコードする配列を含むことができる。
【００４８】
好ましいＤＮＡセグメントの１例は本明細書に定義するＳｒｃタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は生物学的に活性なそのフラグメントである。
【００４９】
好ましいｃ−Ｓｒｃのアミノ酸残基配列及びヌクレオチド配列は実施例に記載する。
【００５０】
好ましいＤＮＡセグメントは本明細書に記載するＳｒｃタンパク質に対応するアミノ酸残基配列又はその部分に実質的に同一であり、好ましくはこのような配列又は部分から主に構成されるアミノ酸残基配列をコードする。代表例な好ましいＤＮＡセグメントは実施例に詳述する。
【００５１】
タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸残基配列は遺伝暗号を介してこのタンパク質をコードする構造遺伝子のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列に直接相関する。従って、構造遺伝子又はＤＮＡセグメントはこの構造遺伝子又はＤＮＡセグメントがコードするアミノ酸残基配列即ちタンパク質又はポリペプチドにより表すことができる。
【００５２】
遺伝暗号の重要な周知特徴はその重複である。即ち、タンパク質を構成するために使用されるアミノ酸の大半は２種以上のコーディングヌクレオチドトリプレット（コドン）が特定アミノ酸残基をコード又は指定できる。従って、多数の異なるヌクレオチド配列が特定アミノ酸残基配列をコードする場合がある。このようなヌクレオチド配列は全生物で同一アミノ酸残基配列を生じ得るので機能的に等価であるとみなされる。場合により、所与ヌクレオチド配列にプリン又はピリミジンのメチル化変異体が含まれる場合もある。しかし、このようなメチル化はいずれにせよコーディング関係には影響しない。
【００５３】
核酸はポリリボヌクレオチドであるかポリデオキシリボヌクレオチドであるか、即ちＲＮＡであるかＤＮＡであるかを問わず任意ポリヌクレオチドもしくは核酸フラグメント又はその類似体である。好ましい態様では、核酸分子は２本鎖ＤＮＡのセグメント即ちＤＮＡセグメントの形態であるが、分子生物学法によっては１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡが好ましい場合もある。
【００５４】
ＤＮＡセグメントは化学合成法や組換えアプローチを含む多数の手段により作製されるが、クローニング又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作製することが好ましい。Ｓｒｃタンパク質の部分をコードするＤＮＡセグメントは化学的方法（例えばＭａｔｔｅｕｃｃｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５−３１９１，１９８１のホスホトリエステル法）や自動合成法を使用して容易に合成することができる。また、ＤＮＡセグメントを規定する１群のオリゴヌクレオチドの合成後にオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションとライゲーションにより完全セグメントを構築するなどの周知方法により、もっと大きいＤＮＡセグメントを容易に作製することができる。別法として、Ｓｒｃタンパク質をコードするメンバーを含むと考えられるｃＤＮＡライブラリーで使用されるオリゴヌクレオチドブライマー対を使用してＰＣＲにより好ましいＤＮＡセグメントを単離することもできる。
【００５５】
当然のことながら、化学合成の間に単に天然アミノ酸残基配列をコードする塩基を適当な塩基に置換することにより任意の所望修飾を加えることができる。この方法は周知であり、本明細書に記載する種々多様の「修飾」Ｓｒｃタンパク質の生産に容易に適用することができる。
【００５６】
更に、Ｓｒｃタンパク質をコードする構造遺伝子から主に構成されるＤＮＡセグメントを部位特異的又はランダム突然変異誘発等により後期修飾し、所望の任意置換を導入することができる。
【００５７】
１．ｓｒｃ遺伝子のクローニング
ｓｒｃ遺伝子は適当なゲノムＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）源から種々の生化学的方法によりクローニングすることができる。これらの遺伝子のクローニングは当技術分野で公知の通り、実施例に記載する一般法により実施することができる。
【００５８】
本発明の方法で使用するのに適したｓｒｃ遺伝子をクローニングするための核酸源としては、これらのタンパク質を発現すると考えられる組織からのｃＤＮＡライブラリー形態のゲノムＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が挙げられる。好ましい組織はヒト肺組織であるが、任意の他の適当な組織も使用できる。
【００５９】
好ましいクローニング法では、標準方法を使用してｃＤＮＡライブラリーを作製し、本明細書に記載するヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマー対を使用してＰＣＲ増幅によりＳｒｃをコードするヌクレオチド配列を単離する。あるいは、本明細書に記載する核酸配列に基づくハイブリダイゼーションプローブを使用して慣用核酸ハイブリダイゼーション法によりｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーから所望ｃＤＮＡクローンを同定及び単離することもできる。Ｓｒｃをコードする適当な核酸を単離及びクローニングする他の方法は当業者に自明である。
【００６０】
２．発現ベクター
Ｓｒｃタンパク質をコードするＤＮＡセグメントを含む組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）は本明細書に記載するように作製することができる。特に、ＤＮＡセグメントをコードするＳｒｃにベクターを作動的に（インフレーム、発現可能に）連結することにより、発現可能なｒＤＮＡを作製することができる。従って、組換えＤＮＡ分子は自然界に通常は同時に存在しないヌクレオチド配列の少なくとも２種の核酸を含むハイブリッドＤＮＡ分子である。
【００６１】
ＤＮＡセグメントを作動的に連結するベクターの選択は、当技術分野で周知の通り、所望の機能的性質（例えばタンパク質発現）と形質転換しようとする宿主細胞に直接依存する。本発明の実施時に使用するのに適したベクターはこのベクターを作動的に連結するＤＮＡセグメントに含まれる構造遺伝子を少なくとも複製し、好ましくは発現させることも可能である。
【００６２】
原核及び真核発現ベクターの両者がベクター構築分野の当業者に周知であり、Ａｕｓｅｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）や、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８９）に記載されている。これらの文献は本明細書中に引用する一般組換えＤＮＡ法の多くも記載している。
【００６３】
１態様において、利用可能なベクターは原核レプリコン、即ち組換えＤＮＡ分子で形質転換した原核宿主細胞（例えば細菌宿主細胞）においてこの組換えＤＮＡ分子を染色体外に自律複製及び維持することが可能なＤＮＡ配列を含む。このようなレプリコンは当技術分野で周知である。更に、原核レプリコンを含む態様は、その発現により形質転換細菌宿主に薬物耐性を付与する遺伝子も含む。典型的な細菌薬物耐性遺伝子はアンピシリン又はトラサイクリン耐性を付与する遺伝子である。
【００６４】
原核レプリコンを含むベクターは構造遺伝子で形質転換した細菌宿主細胞（例えば大腸菌）においてこの構造遺伝子の発現（転写及び翻訳）を誘導することが可能な原核プロモーターも含むことができる。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼの結合と転写を可能にするＤＮＡ配列により形成される発現制御エレメントである。本発明のＤＮＡセグメントを挿入するのに好都合な制限部位を含むプラスミドベクターは、一般に細菌宿主に適合可能なプロモーター配列を含む。このようなベクタープラスミドの典型例はＢｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から市販されているｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されているｐＲＳＥＴ、並びにＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）から市販されているｐＰＬ及びｐＫＫ２２３である。
【００６５】
真核細胞に適合可能な発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に適合可能な発現ベクターを使用しても本発明の組換えＤＮＡ分子を形成することができる。真核細胞発現ベクターは当技術分野で周知であり、数種の業者から市販されている。一般に、このようなベクターとしては所望ＤＮＡセグメントの挿入に好都合な制限部位を含むものが提供される。このようなベクターの典型例はｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ＃３１２５５）、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、実施例に記載する好適ベクター、並びに同種の真核発現ベクターである。
【００６６】
本発明の関連で特に好ましい遺伝子発現系は、遺伝子送達成分即ち遺伝子を目的組織に送達することが可能な成分を含む。利用可能なベクターは所望タンパク質を発現し、予め選択されたターゲット組織に感染させる特徴をもつように構築した「感染性」ベクター（例えば組換えＤＮＡウイルス、アデノウイルス又はレトロウイルスベクター）である。本明細書に記載する複製コンピテントトリ肉腫ウイルス（ＲＣＡＳ）が特に好ましい。
【００６７】
組換えウイルス又はウイルスエレメントを利用して発現を誘導する哺乳動物細胞系を構築することができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを使用する場合には、ポリペプチドのコーディング配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば後期プロモーターと３部分リーダー配列）に連結する。その後、このキメラ遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入する。ウイルスゲノムの非必須領域（例えばＥ１又はＥ３領域）に挿入すると、感染宿主でポリペプチドを発現することが可能な生存可能な組換えウイルスが得られる（例えばＬｏｇａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１：３６５５−３６５９（１９８４）参照）。あるいは、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターを使用してもよい（例えばＭａｃｋｅｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９：７４１５−７４１９（１９８２）； Ｍａｃｋｅｔｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４９：８５７−８６４（１９８４）； Ｐａｎｉｃａｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９：４９２７−４９３１（１９８２）参照）。染色体外エレメントとして複製する能力をもつウシパピローマウイルスに基づくベクターが特に有用である（Ｓａｒｖｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１：４８６（１９８１））。このＤＮＡをターゲット細胞に導入した直後に、プラスミドは細胞当たり約１００〜２００コピーまで複製する。挿入したｃＤＮＡを転写するためにプラスミドを宿主の染色体に組込む必要がないので、高レベルの発現が得られる。これらのベクターはｎｅｏ遺伝子等の選択マーカーをプラスミドに加えることにより安定的発現に使用することができる。あるいは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、発現を誘導することが可能なベクターとして使用できるようにレトロウイルスゲノムを改変してもよい（Ｃｏｎｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１：６３４９−６３５３（１９８４））。非限定的な例としてメタロチオネインＩＩＡプロモーターや熱ショックプロモーター等の誘導プロモーターを使用して高レベル発現を達成することもできる。
【００６８】
近年、ヒト卵巣癌をもつヌードマウスでラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターに比較してサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより誘導されるチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子治療による長期生存が研究されている。アデノウイルスを介してＣＭＶプロモーターにより誘導される単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子治療の細胞死滅効力はＲＳＶにより誘導される治療に比較して２〜１０倍有効であることが判明した（Ｔｏｎｇら，１９９９，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １８（１）：９３−９７）。低レベル発現後に高レベル発現の誘導を必要とする遺伝子治療に用いるキメラプロモーターの設計も報告されている（Ｓｕｚｕｋｉら，１９９６，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１８８３−１８９３）。
【００６９】
組換えタンパク質の長期高収率生産には安定的発現が好ましい。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適当な発現調節エレメント（例えばプロモーター及びエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）と選択マーカーにより制御されるｃＤＮＡで宿主細胞を形質転換することができる。上述のように、組換えプラスミドにおける選択マーカーは選択耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体に安定的に組込み、増殖してフォーカスを形成し、細胞系にクローニングして拡張できるようにする。
【００７０】
例えば、外来ＤＮＡの導入後に構築細胞を集積培地で１〜２日間増殖させた後、選択培地に移す。多数の選択系を使用することができ、例えば非限定的な例として、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ，１１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，４８：２０２６（１９６２））、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら，Ｃｅｌｌ，２２：８１７（１９８０））遺伝子を夫々ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−又はａｐｒｔ−細胞で使用することができる。また、代謝阻害剤耐性付与遺伝子を選択基準として使用することもでき、例えばメトトレキセート耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７７：３５６７（１９８０）； Ｏ’Ｈａｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７８：１５２７（１９８１））、ミコフェノール酸耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７８：２０７２（１９８１））、アミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９８１））、及びハイグロマイシン耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら，Ｇｅｎｅ，３０：１４７（１９８４））の遺伝子が挙げられる。近年では他の選択遺伝子も記載されており、即ちトリプトファンの代わりにインドールを細胞に利用させるｔｒｐＢ、ヒスチジンの代わりにヒスチノールを細胞に利用させるｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８５：８０４（１９８８））及びオルニチンデカルボキシラーゼインヒビターである２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ Ｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編，（１９８７））も記載されている。
【００７１】
ヒト遺伝子治療を目的とする主要ベクターはレトロウイルスから誘導される（Ｗｉｌｓｏｎ，１９９７，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７（Ｓｕｐ．１）：３１−３２； Ｂａｎｋら，１９９６，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １８（１２）：９９９−１００７； Ｒｏｂｂｉｎｓら，１９９８，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８０（１）：３５−４７）。遺伝子導入とアンチセンス治療を治療に利用できる可能性により、種々の組織を治療するために多数のベクター系が開発されている（血管系、Ｓｔｅｐｈａｎら，１９９７，Ｆｕｎｄａｍ．Ｃｌｉｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１（２）：９７−１１０； Ｆｅｌｄｍａｎら，１９９７，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：３９１−４０４； Ｖａｓｓａｌｌｉら，１９９７，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ，Ｒｅｓ．３５（３）：４５９−６９； Ｂａｅｋら，１９９８，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８２（３）：２９５−３０５； 腎臓、Ｌｉｅｎら，１９９７，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．Ｓｕｐｐｌ．６１：Ｓ８５−８； 肝臓、Ｆｅｒｒｙら，１９９８，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（１４）：１９７５−８１； 筋肉、Ｍａｒｓｈａｌｌら，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．８（３）３６０−５）。これらの組織に加え、ヒト遺伝子治療の重要なターゲットは腫瘍自体と関連組織を含めた癌である（Ｒｕｎｎｅｂａｕｍ，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１７（４Ｂ）：２８８７−９０； Ｓｐｅａｒら，１９９８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．４（２）：１３３−４７）。
【００７２】
本発明の方法で使用するのに容易に適応可能なウイルス遺伝子治療ベクター系の具体例を以下に簡単に説明する。レトロウイルス送達は近年、ＦｅｄｅｒｓｐｉｅｌとＨｕｇｈｅｓ（１９９８，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５２：１７９−２１４）により記載されており、特にトリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）レトロウイルスファミリーについて記載されている（Ｆｅｄｅｒｓｐｉｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９３：４９３１（１９９６）； Ｆｅｄｅｒｓｐｉｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：１１２４１（１９９４））。更に、ＡＬＶとマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）を含むレトロウイルスベクターがＳｖｏｂｏｄａ（１９９８，Ｇｅｎｅ ２０６：１５３−１６３）により記載されている。
【００７３】
改変レトロウイルス／アデノウイルス発現系は本発明の方法の実施に容易に適応させることができる。例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）系はＫａｒａｖａｎａｓら，１９９８，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２８：７−３０に記載されている。アデノウイルス発現系はＶｏｎ ＳｅｇｇｅｒｎとＮｅｍｅｒｏｗによりＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｅｒｎａｄｅｚ ＆ Ｈｏｅｆｆｌｅｒ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９９，第５章、１１２〜１５７頁）に記載されている。
【００７４】
タンパク質発現系はｉｎ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｔｒｏの両者で有効に利用できることが実証されている。例えば、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）アンプリコンベクターによりヒト扁平上皮細胞癌に効率的に遺伝子導入できることが記載されている（Ｃａｒｅｗら，１９９８，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１７６：４０４−４０８）。単純ヘルペスウイルスは神経系への遺伝子導入に使用されている（Ｇｏｉｎｓら，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．３（Ｓｕｐ．１）：Ｓ８０−８）。ＨＳＶ−ＴＫを使用したターゲット特定自殺ベクターは実質腫瘍で試験されている（Ｓｍｉｌｅｙら，１９９７，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（８）：９６５−７７）。１型単純ヘルペスウイルスベクターは結腸癌細胞で癌遺伝子治療に使用されている（Ｙｏｏｎら，１９９８，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２２８（３）：３６６−７４）。トランスフェクション時間を延ばすためにハイブリッドベクターが開発されており、例えば肝細胞の治療用としてＨＳＶ／ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ハイブリッドが開発されている（Ｆｒａｅｆｅｌら，１９９７，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３（１２）：８１３−８２５）。
【００７５】
ワクシニアウイルスはそのゲノムが大型であるため、ヒト遺伝子治療用に開発されている（Ｐｅｐｌｉｎｓｋｉら，１９９８，Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．７（３）：５７５−８８）。プリンヌクレオシドピロホスホリラーゼを発現するチミジンキナーゼ欠失ワクシニアウイルスを腫瘍特定遺伝子治療ベクターとして使用することが記載されている（Ｐｕｈｌｍａｎら，１９９９，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：６４９−６５７）。
【００７６】
アデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ）をヒト遺伝子治療で使用することが記載されているが、ＡＡＶは哺乳動物細胞で最適複製及びパッケージングにヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス又はヘルペスウイルス）を必要とする（Ｓｎｏｅｃｋら，１９９７，Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．５（６）：５１４−２０； Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（５）：４７０−５）。しかし、感染性組換えＡＡＶのｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングが報告されており、この系は非常に有望になっている（Ｄｉｎｇら，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１１６７−１１７２）。同種指向性レトロウイルスレセプターｃＤＮＡをＡＡＶにより導入すると、樹立一次ヒト細胞の同種指向性レトロウイルス形質導入を実現できることが報告されている（Ｑｉｎｇら，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１（７）：５６６３−５６６７）。ヒト野生型ｐ５３を発現するＡＡＶベクターを使用する癌遺伝子治療が実証されている（Ｑａｚｉｌｂａｓｈら，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６７５−６８２）。ＡＡＶベクターを使用した血管細胞への遺伝子導入も報告されている（Ｍａｅｄａら，１９９７，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓ．３５：５１４−５２１）。ＡＡＶは肝臓特異的遺伝子治療に適したベクターであることが実証されている（Ｘｉａｏら，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１２）：１０２２２−６）。ＡＡＶベクターを脳組織と中枢神経系の遺伝子治療に使用することも実証されている（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎら，１９９８，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．７９３（１−２）：１６９−７５； Ｄｕｒｉｎｇら，１９９８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５（６）：８２０−７）。更にＡＡＶベクターは肺の遺伝子治療とヒト嚢胞性線維症上皮細胞への遺伝子導入に関してアデノウイルスベクター（ＡｄＶ）と比較検討されている（Ｔｅｒａｍｏｔｏら，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８９０４−１２）。
【００７７】
レトロウイルスプロデューサー細胞の中間生成により機能的組込型になる非組込型ＡｄＶを作製するために有用な量の各ウイルスを含むキメラＡｄＶ／レトロウイルス遺伝子治療ベクター系も記載されている（Ｆｅｎｇら，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５（９）：８６６−７０； Ｂｉｌｂａｏら，１９９７，ＦＡＳＥＢ Ｊ １１（８）：６２４−３４）。この強力な新世代遺伝子治療ベクターはターゲット特定癌遺伝子治療に応用されている（Ｂｉｌｂａｏら，１９９８，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４５１：３６５−７４）。ｐ５３を発現するＡｄＶを１回注射するだけでヒト前立腺癌細胞の皮下腫瘍小節の増殖が抑制された（Ａｓｇａｒｉら，１９９７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７１（３）：３７７−８２）。進行した非小細胞肺癌をもつ患者にＡｄＶにより野生型ｐ５３を遺伝子導入することが記載されている（Ｓｃｈｕｌｅｒら，１９９８，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：２０７５−２０８２）。この癌はＡｄＶベクターによるｐ５３遺伝子置換療法の対象にもなっている（Ｒｏｔｈら，１９９８，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５（３ Ｓｕｐｐｌ ８）：３３−７）。ＡｄＶによりｐ５３を遺伝子導入すると、内皮細胞分化と血管形成がｉｎ ｖｉｖｏ抑制される（Ｒｉｃｃｉｏｎｉら，１９９８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（６）：７４７−５４）。転移メラノーマの免疫療法としてメラノーマ抗原ｇｐ７５をアデノウイルスにより発現させることも記載されている（Ｈｉｒｓｃｈｏｗｉｔｚら，１９９８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９７５−９８３）。ＡｄＶはヒト細胞の同種指向性レトロウイルス感染を助長し、レトロウイルス感染効率を増加する（Ｓｃｏｔｔ−Ｔａｙｌｏｒら，１９９８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（５）：６２１−９）。ＡｄＶベクターは血管平滑筋細胞（Ｌｉら，１９９７，Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．Ｊ．（Ｅｎｇｌ）１１０（１２）：９５０−４）、扁平上皮細胞癌細胞（Ｇｏｅｂｅｌら，１９９８，Ｏｔｏｌａｒｙｎｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ １１９（４）：３３１−６）、食道癌細胞（Ｓｅｎｍａｒｕら，１９９８，Ｉｎｔ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７８（３）：３６６−７１）、メサンギウム細胞（Ｎａｈｍａｎら，１９９８，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｍｅｄ．４６（５）：２０４−９）、グリア細胞（Ｃｈｅｎら，１９９８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３５０４−７）、及び動物関節（Ｉｋｅｄａら，１９９８，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２５（９）：１６６６−７３）への遺伝子導入に使用されている。より最近では、カテーテルを用いたＡｄＶベクターによる心膜遺伝子導入が実証されている（Ｍａｒｃｈら，１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２２（１ Ｓｕｐｐｌ １）：１２３−９）。適正な制御遺伝子エレメントをもつＡｄＶ系を上手く操作すると、調節可能なｉｎ ｖｉｖｏターゲット遺伝子発現がＡｄＶにより可能になる（Ｂｕｒｃｉｎら，１９９９，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９６（２）：３５５−６０）。
【００７８】
ヒト遺伝子治療用αウイルスベクターが開発され、シンドビスウイルス及びセムリキ森林熱ウイルスに由来するベクターで使用可能な発現カセットで形質転換するのに適したパッケージング細胞系も開発されている（Ｐｏｌｏら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９６：４５９８−４６０３）。非細胞変性フラビウイルスレプリコンＲＮＡに基づく系も開発されている（Ｖａｒｎａｖｓｋｉら，１９９９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２５５（２）：３６６−７５）。自殺ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を含むシンドビスウイルスベクターが腫瘍細胞への細胞特異的ターゲティングに使用されている（Ｉｉｊｉｍａら，１９９８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８０（１）：１１０−８）。
【００７９】
ヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）に基づくレトロウイルスベクターも遺伝子治療ベクターとして期待されている（Ｔｒｏｂｒｉｄｇｅら，１９９８，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：２５１７−２５２５）。フォーミーウイルスベクターは自殺遺伝子治療用に設計されている（Ｎｅｓｔｌｅｒら，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４（１１）：１２７０−７）。組換えマウスサイトメガロウイルス及びプロモーター系も高レベル発現用ベクターとして使用されている（Ｍａｎｎｉｎｇら，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．７３（１）：３１−９； Ｔｏｎｇら，１９９８，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １８（１）：９３−７）。
【００８０】
センダイウイルスに基づくベクターの作製により非分裂細胞への遺伝子送達が実現可能になった（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら，１９９８，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ５４（１）：６１−８）。
【００８１】
非分裂体細胞の形質転換を実現するために、レンチウイルスベクターも検討されている。複製欠損ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくベクターを使用した嚢胞性線維症の遺伝子治療が記載されている（Ｇｏｌｄｍａｎら，１９９７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：２２６１−２２６８）。レンチウイルスベクターにより肝臓及び筋肉に送達した遺伝子の持続発現も報告されている（Ｋａｆｒｉら，１９９７，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７（３）：３１４−７）。しかし、安全性の問題が大きく、改良ベクターの開発が急速に進んでいる（Ｋｉｍら，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（２）：９９４−１００４）。ＨＩＶ ＬＴＲ及びＴａｔを検討すると、ベクターを開発するためのゲノムの編成に関する重要な情報が得られる（Ｓａｄａｉｅら，１９９８，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５４（２）：１１８−２８）。このため、今日では有効なＨＩＶに基づくベクターの遺伝要件が十分に理解されるようになった（Ｇａｓｍｉら，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（３）：１８２８−３４）。自己不活化ベクター又は条件パッケージング細胞系が記載されている（例えばＺｕｆｆｅｒｙら，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１２）：９８７３−８０； Ｍｉｙｏｓｈｉら，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１０）：８１５０−７； Ｄｕｌｌら，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３−７１； 及びＫａｕｌら，１９９８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４９（１）：１６７−７４）。ＨＩＶベクターによるヒトリンパ球及びＣＤ３４＋細胞の効率的形質導入が報告されている（Ｄｏｕｇｌａｓら，１９９９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（６）：９３５−４５； Ｍｉｙｏｓｈｉら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３（５４０２）：６８２−６）。ネコ免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）レンチウイルスベクターによる非分裂ヒト細胞の効率的形質導入が記載されており、ＨＩＶに基づくベクターの使用に付随する安全性の問題を最小限にしている（Ｐｏｅｓｃｈｌａら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４（３）：３５４−３５７）。ＦＩＶベクターによるヒト血液単核細胞の生産的感染が報告されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（３）：２４９１−８）。
【００８２】
多くのウイルスベクターは取り扱いにくく、ＤＮＡ感染能が限られているが、これらの制限と欠点に対する対策が検討されている。例えば、遺伝子材料の操作とウイルスベクターの作製を簡略化するために、簡略ウイルスパッケージング細胞系以外に、ヒトヘルペスウイルス、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）及びエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）から誘導されるミニウイルスベクターが開発されている（Ｗａｎｇら，１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０（１２）：８４２２−８４３０）。アダプタープラスミドはヘルパー非依存性レトロウイルスベクターへの外来ＤＮＡ挿入を簡略化することが既に報告されている（１９８７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１（１０）：３００４−３０１２）。
【００８３】
ウイルスベクターは唯一の遺伝子治療手段ではなく、数種の非ウイルスベクターも記載されている。上皮増殖因子／ＤＮＡ多元系（ＥＧＦ／ＤＮＡ）の使用に基づくターゲット特定非ウイルス遺伝子送達ベクターは効率的且つ特異的な遺伝子送達を実現することが示されている（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ，１９９８，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１８：３２４１−３２４６）。カチオンリポソームを使用した血管系及びＣＮＳの遺伝子治療が実証されている（Ｙａｎｇら，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ １４（５）：２８１−９７）。カチオンリポソームを使用した膵炎の一過性遺伝子治療も実施されている（Ｄｅｎｈａｍら，１９９８，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２２７（６）：８１２−２０）。遺伝子送達用としてキトサンに基づくベクター／ＤＮＡ複合体も有効であることが示されている（Ｅｒｂａｃｈｅｒら，１９９８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５（９）：１３３２−９）。３元系に基づく非ウイルスＤＮＡ送達ベクターも記載されている（Ｋｉｍら，１９９８，５３（１−３）：１７５−８２）。ウイルス粒子で被覆したリポソーム複合体も遺伝子導入を実施するために使用されている（Ｈｉｒａｉら，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４１（１）：１１２−８）。
【００８４】
チミジンキナーゼ遺伝子をコードする非ウイルスＴ７ベクターの直接腫瘍注射による癌遺伝子治療も実証されている（Ｃｈｅｎら，１９９８，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：７２９−７３６）。直接注射遺伝子導入にはプラスミドＤＮＡの作製が重要である（Ｈｏｒｎら，１９９５，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６（５）：６５６−７３）。改変プラスミドベクターが特に直接注射に応用されている（Ｈａｒｔｉｋｋａら，１９９６，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７（１０）：１０２５−１７）。
【００８５】
このように、多種多様の遺伝子導入／遺伝子治療ベクター及び構築物が当技術分野で公知である。これらのベクターは本発明の方法での使用に容易に適応できる。組換えＤＮＡ／分子生物学技術を使用する適当な操作により作動的に連結したＳｒｃ（活性又は不活性）を選択発現／送達ベクターに挿入すると、本発明の実施に利用可能な多数の等価ベクターを作製することができる。
【００８６】
Ｅ．血管形成の調節のための方法
本発明は疾病過程または状態に伴う組織における血管形成の調節のための方法を提供し、したがって血管形成に依存している組織での事象に影響を与える。一般的に、本方法は疾病仮定または状態に伴う組織に、血管形成調節量のＳｒｃタンパク質または活性化または不活性化Ｓｒｃを発現する核酸ベクターを投与することを含む。
【００８７】
本明細書で記述するように、任意の様々な組織または組織化された組織を含む器官は、皮膚、筋肉、消化管、結合組織、関節、骨および血管が血管形成刺激で侵入することのできる同様の組織を含む疾患状態において、血管形成を補助できる。
【００８８】
本発明の原理は本発明はすべての哺乳動物に関して効果的であることを示し、その哺乳動物は用語「患者」に含まれることを意図しているが、その多くの実施様態において本発明によって処置された患者は、望ましくはヒト患者である。この文脈において、哺乳動物は血管形成を含む疾病に関連した組織の処置が好ましいような任意の哺乳動物種、特に農業および家畜哺乳動物種を含むことが理解される。
【００８９】
したがって本方法は患者に、本発明の方法を実施する場合において治療的有効量のＳｒｃタンパク質またはＳｒｃタンパク質を発現するＤＮＡベクターを含む生理学的に寛容な組成物を投与することを含む。
【００９０】
Ｓｒｃタンパク質の投与のための投与量範囲はさらに本明細書に記載のように、タンパク質の形態およびその効力に依存する。この投与量は血管形成および血管形成によって仲介される疾患症状が改善されるような望ましい効果を生じるのに十分である。しかしながら投与量は、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全などの副作用を引き起こすほど多くすべきではない。一般的に、投与量は患者の年齢、状態、性別および患者での疾患の程度によって変化し、当業者によって容易に決定できる。投与量はまた任意の合併症の事象によって個々の医者によって調整されうる。
【００９１】
治療的有効量はＳｒｃタンパク質または（活性化または不活性化）ｓｒｃタンパク質をコードする核酸の量であり、治療している組織での血管形成の検出可能な調節、すなわち血管形成調節量を産出するのに十分である。血管形成の調節は本明細書で記述したようなＣＡＭアッセイによって、または当業者に周知の他の方法によって測定しうる。
【００９２】
Ｓｒｃタンパク質またはＳｒｃタンパク質を発現する核酸ベクターは、注射で、または超過時間緩やかな点滴によって非経口的に投与できる。処置する組織は典型的には全身投与によって体に注入し、したがってほとんど治療組成物の静脈内投与によって可能であり、他の組織および送達方法がよく熟慮されうる。したがって、本発明の組成物は静脈、腹腔内、筋肉内、皮下、海綿内、経皮で投与でき、また蠕動性方法によって送達しうる。
【００９３】
Ｓｒｃタンパク質またはＳｒｃタンパク質を発現する核酸ベクターを含んでいる治療組成物は従来通り、たとえば単位投与量の注射によってのように静脈内に投与できる。本発明の治療組成物に関して使用される場合の語「単位投与量」は対象に対する一体的投与量として好ましい独立した単位をさし、それぞれの単位は、必要な希釈剤、すなわち担体または賦形剤との結合による望ましい治療的効果を産出するように計算された、所定の量の活性物質を含む。
【００９４】
１つの実施様態において、試薬を静脈内に単一投与量で投与した。局所投与を直接の注射によって、または解剖学的に単離した区画を利用し、標的器官系の微小循環、循環系の再灌流、または疾患組織に関連した血管系の標的領域の一時的閉塞に基づいたをカテーテルを単離することにより行いことができる。
【００９５】
組成物を、治療に効果的な量で投与処方に適用可能な方法で投与した。投与する量および時期は処置する対象、活性成分を使用するための対象の系の受容力および望ましい治療的効果の程度に依存する。投与するのに必要な活性成分の正確な量は担当医者の判断に依存し、それぞれの個人に対して特有である。しかしながら、全身投与に対する適切な投与量範囲は本明細書に開示されており、投与経路に依存する。投与のための好ましい色素も変えることができるが、しかしその後引き続く注射または他の投与によって１時間以上の間隔での繰り返し投与が続く初期投与によって類型化される。あるいは、ｉｎ ｖｉｖｏ治療のために明記した範囲での血中濃度を保持するのに十分な連続的な静脈内点滴が意図される。
【００９６】
１．血管形成の阻害
血管形成の阻害は血管形成性疾患と呼ばれる様々な疾患で重要である。このような疾患には、免疫および非免疫炎症のような炎症障害、慢性関節リウマチ症および乾癬、糖尿病性網膜症のような血管の不適合で不適当な浸潤、血管形成緑内障、再狭窄、アテローム性動脈硬化症プラークおよび骨粗鬆症での毛細管増殖および固形腫瘍、固形腫瘍転移、血管線維腫、水晶体後線維増殖症、血管腫、カポージ肉腫および腫瘍増殖を補助するために新生血管形成が必要な類似の腫瘍のような腫瘍関連障害が含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
したがって、疾患状態に関連している組織での血管形成を阻害する方法は疾患の症状を改善し、疾患に依存しながら、疾患の治療に貢献できる。１つの実施様態において、本発明は疾患状態に関連している組織での血管形成それ自身の阻害を意図している。組織での血管形成の規模およびしたがって本法によって行われる阻害の規模は様々な方法によって評価されうる。
【００９８】
したがって、１つの関連した実施様態において、処置する組織は炎症を起こしている組織であり、阻害する血管形成は炎症組織の新生血管形成が起こっている炎症組織血管形成である。この型において、本方法は、慢性関節炎リウマチ症の患者のような関節炎組織での、免疫または非免液炎症組織での、乾癬組織等での血管形成の阻害を意図する。
【００９９】
他の関連する実施様態において、処置する組織は糖尿病性網膜症、黄斑変性または血管形成緑内障のような網膜疾患を持つ患者の網膜組織であり、阻害する血管形成は網膜組織の新血管形成が存在する網膜組織血管形成である。
【０１００】
さらなる関連した実施様態において、処置する組織は、固形腫瘍、転移、皮膚癌、乳癌、血管種または血管線維腫および類似の癌を持つ患者の腫瘍組織であり、阻害すべき血管形成は腫瘍組織の新血管形成の存在する腫瘍組織血管形成である。本方法によって処置可能な典型的な固形腫瘍組織には、肺、膵臓、乳、直腸、喉頭、卵巣および類似の組織が含まれる。腫瘍増殖において重要な役割を新血管形成が果たしていることから、腫瘍組織血管形成の阻害が特に好ましい。腫瘍組織の新血管形成がない場合、腫瘍組織は必要な栄養を得られず、増殖が遅くなり、さらなる増殖が終わり、退行し、最終的には結果として腫瘍の殺傷となる壊死となる。
【０１０１】
言い換えると、本発明は本方法によって腫瘍血管形成を阻害することにより、腫瘍新血管形成を阻害する方法を提供する。同様に、本発明は血管形成阻害方法を実施することにより腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。
【０１０２】
本方法はまた、（１）転移癌細胞が原発腫瘍から出ていけるように、それらの形成が原発腫瘍の血管形成を必要とすること、および（２）その第２の部位での確立が転移の増殖を補助するために心血管形成を必要とすることから、転移の形成に対して特に効果的でもある。
【０１０３】
関連する実施様態において、本発明は、固形癌に対して転移の確立を制御するために行った従来の化学療法のような他の治療との組合せで本方法を実施することを意図する。腫瘍組織への血液供給および栄養の供給により血管形成の回復を誘導することで、毒性攻撃へ応答するであろう腫瘍組織において、化学療法の摂生後に血管形成を阻害することが好ましいが、血管形成抑制剤の投与は典型的に化学療法の間または後に行う。さらに、転移に対する予防として、固形腫瘍を取り除いた手術後、血管形成阻害方法を処置することが望ましい。
【０１０４】
腫瘍新血管形成の阻害に適用する本方法の範囲では、本方法はまた腫瘍組織増殖の阻害、腫瘍転移形成の阻害および確立した腫瘍の退行のために適用できる。
【０１０５】
再狭窄は血管形成の成功を阻害する経皮管腔通過冠状血管形成の部位の組織内への平滑筋細胞（ＳＭＣ）遊走および増殖の工程である。再狭窄の間のＳＭＣの遊走および増殖は本方法にて阻害される血管形成の工程と考えることができる。したがって、本発明はまた、血管形成工程にある患者での本方法による血管形成を阻害することによる再狭窄の阻害をも意図する。再狭窄の阻害のために、冠状血管壁が再狭窄の危険性があることから、典型的には約２から約２８日間、より典型的には処理後およそ最初の１４日間、不活性チロシンキナーゼが典型的に再狭窄処理後に投与される。
【０１０６】
疾患状態に関連する組織での血管形成を阻害するための、したがって血管形成関連疾患の処置のために方法を実施するための本方法は、血管形成が起こっているまたは起こる危険性のある組織を、治療に効果的な量の不活性化Ｓｒｃタンパク質またはこのタンパク質を発現するベクターを含む組成物と接触させることを含む。
【０１０７】
治療組成物との最初の接触後７日間ほどで血管形成の阻害と腫瘍退行が起こった。活性化Ｓｒｃタンパク質への追加的なまたは引き延ばされた曝露は７日間から６週間の間が好ましく、好ましくは約１４から２８日間である。
【０１０８】
２．血管形成の増強
血管形成の促進または増強が望ましい場合において、活性化Ｓｒｃタンパク質の組織への投与が有用である。投与の経路および時期は本明細書以上で阻害について記述した方法と類似である。
【０１０９】
Ｆ．治療組成物
本発明は本明細書で記述した治療的な方法を行うために有用な治療組成物を意図する。本発明の治療組成物には、活性成分としてその中に溶解または分散される本明細書で記述したようなＳｒｃタンパク質またはＳｒｃタンパク質を発現できるベクターと共に、生理学的に寛容な担体が含まれる。好ましい実施様態において、治療組成物は、治療の目的で哺乳動物またはヒト患者に投与したときに免疫原性ではない。
【０１１０】
本明細書で使用する時、用語「医薬的に許容可能な」、「生理学的に寛容な」およびそれらの文法的変化語は、それらが組成物、担体、希釈剤および薬剤を指す場合、交換可能に使用され、この物質が悪心、めまい、胃逆流などの望ましくない生理学的効果の産出なしに、哺乳動物へまたは哺乳動物上に投与できることを表す。
【０１１１】
その中に溶解されたか分散された活性化成分を含む薬理学的組成物の調製は当技術分野で周知であり、処方に基づいて限定する必要なない。典型的にはそのような組成物は液体溶液または懸濁液いずれかような注射可能なものとして調製し、しかし、使用前に液体中に溶液または懸濁液として適当である固体形態も調製できる。調製品は乳化してもよく、またはリポソーム組成物として存在することも可能である。
【０１１２】
活性成分は医薬的に許容可能で活性成分と適合性のある賦形剤と、本明細書で記載の治療的方法での使用に適切な量で混合できる。適切な賦形剤は、たとえば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールまたは類似物およびそれらの組合せである。さらに、所望であれば、組成物は少量の加湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝液剤および活性成分の効果を増強する類似物などの補助物質を含んでよい。
【０１１３】
本発明の治療組成物は、その中に任意の塩の形態成分の医薬的に許容可能な塩を含んでよい。医薬的に許容可能な塩には、たとえば塩化水素またはリン酸などの無機塩または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機塩で形成される（ポリペプチドの遊離アミノ基と形成した）酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシ基で形成された塩はまた、たとえばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄水酸化物などのような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から由来しうる。
【０１１４】
活性成分に対する生理学的に寛容な担体は当技術分野で周知である。液体担体の例は、活性成分および水以外に何の物質も含まないか、または生理学的ｐＨ値、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水のような両方でのリン酸ナトリウムのような緩衝液を含む無菌水性溶液である。またさらに、水性担体は、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムのような１つ以上の緩衝塩、デキストロース、ポリエチレングリコールおよび他の溶液を含みうる。
【０１１５】
液体組成物はまた水に加えた、および水を排除した液相をも含みうる。そのような追加的な液相の例は、グリセリン、綿実油のような植物油および水油エマルションである。
【０１１６】
治療組成物は血管形成調節量の本発明のＳｒｃタンパク質、または有効量のＳｒｃタンパク質を発現するのに十分な組換え体ＤＮＡ発現ベクターを含み、典型的には総処置組成物の重量あたり少なくとも０．１重量パーセントのＳｒｃタンパク質の量を含むように処方される。重量パーセントはＳｒｃタンパク質の総組成物に対する重量の比である。したがって、たとえば０．１重量パーセントは１００グラムの総組成物あたり０．１グラムのＳｒｃタンパク質である。ＤＮＡ発現ベクターについて、投与された量は発現ベクターの特性、処置される組織および同様の考慮に依存する。
【０１１７】
Ｇ．製造物品
本発明はまた、本発明のＳｒｃを提供するためのラベル付け容器である製造の物品を意図する。包装材料を含む製造物品は処置する疾患状態のために好ましいラベル付けおよび包装材料内に含まれる医薬剤を含む。
【０１１８】
製造物品中の医薬剤はＳｒｃタンパク質を提供するために適切である本発明の任意の組成物であり、開示された指示に従って本明細書で記述したような薬理学的に許容可能な形態で処方される。したがって、組成物はＳｒｃタンパク質またはＳｒｃタンパク質を発現することの可能なＤＮＡ分子を含むことができる。製造物品は単一または複数投与量どちらかで、本明細書で示された状態の処置での使用に十分な量の医薬剤を含む。
【０１１９】
包装材料は、たとえば血管形成の阻害または増強によって補助される状態および本明細書で開示された類似の状態を処置するために、その中に含まれる医薬剤の使用を示唆するラベルを含む。ラベルはさらに使用のための指示および売買に必要であろうような関連した情報をも含む。包装材料は医薬剤の保存のための容器を含んでよい。
【０１２０】
本明細書で使用するとき、用語、包装材料はガラス、プラスチック、紙、ホイールおよび固定化した装置内に医薬剤を保持できる類似物のような材料を指す。したがって、たとえば包装材料は、医薬剤を含有している薬理学的組成物を含むために使用した、プラスチックまたはガラスバイアル、薄板化包皮等の容器であり得る。
【０１２１】
好ましい実施様態において、包装材料には、製造物品の内容物およびそこに含まれている医薬剤の使用を示している明確な表現であるラベルを含む。
【０１２２】
実施例
本発明に関する以下の実施例は例示であり、もちろん本発明を特に制限するように解釈されるべきでない。さらに、現在知られており、後に発展する、当業者の範囲内であるそのような本発明の変形は、本明細書の以下で請求する本発明の意図の範囲内であることが考えられる。
【０１２３】
１．ｃ−Ｓｒｃ発現構築物の調製
本発明の方法による血管形成の調節に有用な発現構築物の調製のために、ｃ−Ｓｒｃ ｃＤＮＡを操作し、発現構築物／ベクター内に挿入した。
【０１２４】
野生型（すなわち内因性）チキンｃ−ＳｒｃをコードするｃＤＮＡ配列を図１（配列番号２）に示し、コードされるアミノ酸残基配列を図２（配列番号３）に示す。コードされたタンパク質配列はｃＤＮＡヌクレオチド位置１１２から１７１３まで翻訳される。ヒトｃ−Ｓｒｃ ｃＤＮＡ（配列番号４）の核酸配列に相当する核酸配列およびコードされたアミノ酸残基（配列番号５）配列をそれぞれ図３および４に示す。ヒトタンパク質配列について、コードする配列は、ｃＤＮＡのヌクレオチド位置１３４から１４８６で始まる。
【０１２５】
野生型と同様にいくつかの変異ｃ−Ｓｒｃ ｃＤＮＡを調製した。変異ｃ−Ｓｒｃ構築物をＫａｐｌａｎら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１３：４７４５−４７５６（１９９４）によって記述されたような部位特異的変異誘発によって調製した。本発明の方法で使用するための変異ｃ−Ｓｒｃタンパク質をコードする変異ｃ−Ｓｒｃ構築物は、Ｌａｐｌａｎら，ｉｄに記述されている。Ｋａｐｌａｎらは本発明の実施に有用なさまざまな変異ｃ−Ｓｒｃ構築物およびコードされたタンパク質を記述している。たとえば、Ｋａｐｌａｎらはその図１で、ＳｒｃＡおよびＳｒｃ２５１を含むいくつかのチキンｃ−ｓｒｃ対立遺伝子の産物を描写している。
【０１２６】
血管形成を調節するｃ−Ｓｒｃ機能の２つの部類が記述されている。すでに論議したように、１つの部類は血管形成を増加させるＳｒｃ分子を含み、したがって活性タンパク質であると考えられる。様々な変異体と共に野生型Ｓｒｃが本発明で血管形成を誘導することが示されている。その血管増殖を誘導する、したがってインビボでの腫瘍重量を増加させる能力に関してこの文脈で機能する野生型ｃ−ｓｒｃの１つの好ましい変異体は、アミノ酸（ａａ）残基位置５２７のチロシン５２７をフェニルアラニンに転化する点変異を持つＳｒｃＡ変異体である。この部位は通常ｃ−Ｓｒｃキナーゼによる負の調節の部位であり、キナーゼＣＳＫとして呼ばれる。ＣＳＫが野生型ｓｒｃのａａ５２７をリン酸化するとき、このタンパク質は不活性化する。しかしながら、変異体ＳｒｃＡでは、調節チロシンはフェニルアラニンに変更されており、したがって構造上（すなわち永久的に）リン酸化による不活性化の対象ではない活性なタンパク質を提供する。
【０１２７】
ｓｒｃでの変異はまた血管形成への逆の調節効果を持つことも示されてきており、血管形成の刺激の代わりにそれを阻害する。そのような変異体は不活性ｓｒｃ変異という。この阻害活性を提供する変異を持つタンパク質はまたそれらが新血管形成を阻害する優勢劣性Ｓｒｃタンパク質としてよばれ、Ｓｒｃの内因性活性からの結果、同様に増殖因子刺激による増強したＳｒｃ活性を含む。したがって本発明の野生型ｃ−ｓｒｃの特定の変異はまた、その血管増殖を阻害し、そしてたとえばしたがってインビボで腫瘍重量を減少させる能力に関して優性陰性として機能できる。
【０１２８】
そのような好ましい阻害ｃ−Ｓｒｃタンパク質には、ただＳｒｃの最初の２５１アミノ酸のみが発現しているＳｒｃ２５１を含む。この構築体は全キナーゼ領域を欠き、したがって「キナーゼ死（ｋｉｎａｓｅ ｄｅａｄ）」ｓｒｃタンパク質とよぶ。第２の構造は、リジンアミノ酸残基２９５をメチオニンに変異させたＳｒｃ（Ｋ２９５Ｍ）変異である。このキナーゼ領域での点変異はＡＴＰ結合を防止し、また血管細胞および腫瘍細胞信号および増殖に関連したキナーゼ依存性Ｓｒｃ機能を阻害する。
【０１２９】
たとえば、残基５２７での変異は得られた変異アミノ酸残基がチロシン、セリンまたはメチオニンである限り、本発明は、結果として望まし位置でのかわりのアミノ酸の存在が望ましい活性、血管形成促進調節活性を持つタンパク質となるであろうことを意図する。
【０１３０】
点変異に関しては、望ましい阻害活性または刺激活性の結果となる任意の変異体が本発明での使用のために意図されている。ｓｒｃタンパク質の望ましい調節効果がそのままである限りは、望ましいｓｒｃタンパク質（変異体またはその断片）を発現したアミノ酸タグ、抗原性エピトープ、蛍光タンパク質または他のそのようなタンパク質またはペプチド結合をさせている融合タンパク質構築物をも意図する。
【０１３１】
【表１】
本発明で使用するための１つの好ましい発現構築物はＲＣＡＳＢＰ（Ａ）構築物（配列番号１）である。この発現ベクターはタイターの改善のための増強したブライアンポリメラーゼ（ＢＰ）をもつ連続した複製応答鳥類肉腫ウイルスを基にしており、正常鳥類細胞に発現しているＡ型包皮糖タンパク質に特異的である（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５２：１７９−２１４（１９９７）で概説されている。またＨｕｇｈｅｓら，１９８７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３００４−３０１２； Ｆｅｋｅｔｅ ＆ Ｃｅｐｋｏ，１９９３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．１３（４）：２６０４−２６１３： Ｉｔｏｈら，１９９６，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：２９１−３００； Ｓｔｏｔｔら，１９９８．Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：６６０−６６６も参照のこと）。ＲＣＡＳＢＰ（Ａ）の完全な配列（配列番号１）を付属した配列表に記し、構築物の制限酵素マップを図１０に描写し、本明細書ではＲＣＡＳとよぶ。
【０１３３】
元々のＳｒｃ２５１構築物は、ＮＩＨのＨａｒｏｌｄ Ｖａｒｍｕｓの研究室にてＰａｍ Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ博士によってサブクローン化された。簡単に記すと、その発現のためのｓｒｃ ｃＤＮＡ配列のクローン化を、ＮｏｔＩ−ＢｓｔＢＩ−ＮｏｔＩ制限酵素部位を含んでいるリンカーをＳｒｃ２５１の５’末端の固有ＮｏｔＩ部位に挿入して行った。Ｓｒｃは３’末端に固有のＣｌａＩ部位を持つ。ＢｓｔＢＩおよびＣｌａＩでのＳｒｃ２５１の消化によりＢｓｔＢＩ−ＣｌａＩ断片を生成し、ついでＲＣＡＳＢＰ（Ａ）上のＣｌａＩ部位に連結した。ＢｓｔＢＩ突出部はＣｌａＩで再切断しないＣｌａＩ突出部との連結を可能にする。本発明の実施での使用に適切なｓｒｃ構築物は、Ｓｒｃ２５１を含むＲＣＡＳベクターをＮｏｔＩおよびＣｌａＩでまず消化することで上記ベクター内で容易に入手し（ＤＡＭ＋バックグラウンド中）、同様に消化したＳｒｃ ｃＤＮＡの挿入を可能にする。したがって、Ｓｒｃ２５１を含むこの最初のＲＣＡＳＢＰ（Ａ）構築物をさらに、上でおよびＫａｐｌａｎら，（１９９４，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．１３（２０）：４７４５−４７５６）に記述されたようなすべての他のＳｒｃ構築物を、Ｓｒｃ２５１構築物を介して生成したＮｏｔＩ−ＣｌａＩ断片によってＲＣＡＳＢＰ（Ａ）内にサブクローン化するのに使用した。ｃＤＮＡ内に望ましいｃ−ｓｒｃ変異体を産出するために、当業者によく知られている標準部位特異的変異誘発手法を使用した。望ましい変異を挿入するように設計したＰＣＲプライマーをまたひき続クローニング工程を容易にするために制限部位も設計した。核酸配列をコードするＳｒｃの全セグメントを、チキン、ヒトおよびＳｒｃの同様な類似物の公知のｃＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲ増幅技術および引き続く新規構築物の形成を介して核酸構築物より検出した。
【０１３４】
本発明の１つの実施様態において、ｓｒｃ核酸を増幅するために使用した３’ＰＣＲプライマーはまたインフレーム配列についてコードする。このプライマーの使用により９Ｅ１０−ｍｙｃエピトープタグを続くＳｒｃ構築物のカルボキシル末端へ加えた。
【０１３５】
以下のアミノ酸をＳｒｃのアミノ酸２５１の後に加え、９Ｅ１０−ｍｙｃエピトープタグを含むベクター構築物を生成した。ＶＤＭＥＱＫＬＩＡＥＥＤＬＮ（配列番号６）。２つの別々のＰＣＲをそれぞれの構築物で実施し、同様の結果を得た。ＰＣＲによって構築したすべての変異体構築物をまたＰＣＲによって配列決定し、クローンの予期したＤＮＡ配列を確認した。本発明の発現系での使用のための野生型および変異Ｓｒｃ ｃＤＮＡはまた、ヒトと同様鳥類のｓｒｃおよび様々なキナーゼ死および活性化変異形を販売しているＵｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹより入手した。
【０１３６】
本発明のＳｒｃタンパク質の発現での使用のための他の発現ベクターはまた、米国特許第４，７９７，３６８号、第５，１７３，４１４号、第５，４３６，１４６号、第５，５８９，３７７号および第５，６７０，４８８号で記載されたようなアデノウイルスベクターを含む。Ｓｒｃ調節タンパク質の送達の他の方法には、米国特許第５，６７５，９５４号に記載のような非ウイルスベクター系でのＳｒｃ ｃＤＮＡの送達および米国特許第５，５８９，４６６号に記載のような裸のままのＤＮＡとしてのｃＤＮＡそれ自身の送達が含まれる。本発明の構築物の送達はまた、以下ＣＡＭアッセイ系で記述したようなウイルスベクターの局所投与に限定されない。たとえば、ウイルスベクター調製品はまた、血管床内への全身送達のために静脈床内に注射される。これらのベクターはまたたとえば例として腫瘍の局所注入による新血管形成の増加部位へ目標を定めうる。
【０１３７】
インビトロで発現したタンパク質は、タンパク質またはポリペプチドの送達に有効な方法で選択されたＳｒｃタンパクの発現と精製に続いて送達することが意図されている。そのような方法の１つは、米国特許第４，３５６，１６７号、第５，５８０，５７５号、第５，５４２，９３５号、第５，６４３，５９９号に記述されているようなリポソ−ム送達系を含む。その他のベクターやタンパク質送達系は本発明のＳｒｃタンパクの発現および／または送達で用いるために当業者に周知である。
【０１３８】
２．未処理のヒヨコ漿膜（ＣＡＭ）の特性化
Ａ．ＣＡＭの調製
血管形成は、完全に分化した血管の形成に帰着する通常の初期血管形成後にヒヨコ漿膜（ＣＡＭ）に誘導されうる。血管形成はＬｅｉｂｏｖｉｃｈら，Ｎａｔｕｒｅ，３２９：６３０（１９８７）およびＡｕｓｐｒｕｎｋら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，７９：５９７（１９７５）で記述されているように、特異的なサイトカインあるいは腫瘍断片への応答として誘導されることが示されている。ＣＡＭをヒヨコの胎児から、その後の血管形成と、その阻害のために調製した。１０日齢のヒヨコ胎児をＭｃｌｎｔｙｒｅ Ｐｏｕｌｔｒｙ（Ｌａｋｅｓｉｄｅ、ＣＡ）から得、３７℃、湿度６０％でインキュベートした。小型クラフトドリル（Ｄｒｅｍｅｌ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｍｅｒｓｏ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏ．Ｒａｃｉｎｅ ＷＩ）を用いて、卵の端の気嚢の上をまっすぐに殻を通して小さな穴をあけた。二番目の穴を、あらかじめ卵をろうそくの灯に照らして調べた胎児の血管のない領域で卵の広い側面上にあけた。元の穴に負の圧力をかけ、ＣＡＭ（漿膜）を殻膜から引き離し、ＣＡＭのまわりに偽性の気嚢を生み出した。小型モデル摩擦輪（Ｄｒｅｍｅｌ）を用いて、滴下したＣＡＭのまわりの殻を通って１．０ｃｍ×１．０ｃｍ四方の窓を切り取った。この小さな窓は下にあるＣＡＭに直接接触させておいた。
【０１３９】
得られたＣＡＭ調製品は、次に、胎児の新血管形成への影響を評価するために用いられたモデルに関連するＣＡＭに付加的な処理をせずに、胚形成の６日目、活性新血管形成で標識された段階であるいは血管形成が静まる胚形成の１０日目で用いた。後者の調製品をしたがって本発明で、以下に述べるようにサイトカイン処理あるいは腫瘍接触への応答で回復血管形成の誘導のために用いた。
【０１４０】
３．ＣＡＭ血管形成アッセイ
Ａ．増殖因子に誘発される血管形成
血管形成はサイトカインあるいは増殖因子により誘発されることが示されている。
【０１４１】
ハンクスバランス食塩水（Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＨＢＳＳ、ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、あるいは２μｇ／ｍの組換え体塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）あるいは血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を含むＨＢＳＳで飽和した５ｍｍ×５ｍｍ Ｗｈａｔｍａｎフィルターディスク（Ｗｈａｔｍａｎ Ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ＮＯ．１）を血管を避け、窓をテープで貼り付けた領域で、９日または１０日どちらかのヒヨコ胎児のＣＡＭ上に置くことにより、血管形成を誘発した。他濃度の増殖因子もまた、血管増殖の誘導に効果的である。アンタゴニストの静脈注射による血管形成阻害の起こる場所のアッセイのために、最初に繊維芽細胞成長増殖培地中１−２μｇ／ｍｌのｂＦＧＦあるいはＶＥＧＦで血管形成を誘発した。７２時間後に血管形成を光学顕微鏡で監視した。
【０１４２】
Ｂ．胎児血管形成
胎児新血管の正常な形成における血管形成阻害の影響を評価するためのＣＡＭ調製品は先に述べたような６日目ヒヨコ胎児である。発生のこの段階では、血管は新たな増殖をうけ、本発明のＳｒｃタンパク質による血管形成の調節を評価するのに有用な系を提供する。ＣＡＭ系は、アッセイを胎児の９日目あるいは１０日目よりもむしろ６日目で行うということをのぞいて、上で述べたように調製した。
【０１４３】
４．ＣＡＭアッセイで測定された血管形成の調節
血管形成におけるＳｒｃタンパク質の影響を評価するため、以下のアッセイを、１０日齢ヒヨコＣＡＭ調製品で行った。実施例１で記述したように準備した５μｇのＲＣＡＳ構成物をヒヨコ不滅化繊維芽細胞株ＤＦ−１（Ｍｉｎｎ．のＤｏｕｇ Ｆｏｓｔｅｒよりいただいた）にトランスフェクトした。この細胞株は初期ヒヨコ胎児繊維芽細胞と同様ウイルス産出能を持つが、ＤＦ−１細胞株はより高い力価を産出した。血清を含まないＣＬＭ培地（構成物：ＤＭＳＯを含むＦ−１０培地塩基、葉酸、グルタミン酸、ＭＥＭビタミン溶液）中、サブコンフレントのＤＦ−１産出細胞株からウイルス性の上清を回収した。３５ｍｌのウイルス性上清を、４℃、２２．０００ｒｐｍ、２時間の超遠心分離で濃縮した。これらの濃縮したウイルス性沈殿物を、血清を含まないＣＬＭ培地でもとの量の１／１００に希釈し、分割し、−８０℃で保存した。ＲＣＡＳ−ＧＦＰと呼ばれる、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしているヌクレオチド配列を持つ対照ウイルスベクターの段階希釈物を、４８から７２時間保温した初期ヒヨコ胎児繊維芽細胞に感染させることにより力価を評価した。以下の濃度を定常的に得られたウイルスストックの力価は１０８ｌ．ｕ．／ｍｌを超えた。ウイルスストックを用いたＣＡＭアッセイのために、９５％エタノール中３０分間、３ｍｇ／ｍｌコルチゾンアセテートを浸した直径６ｍｍのコルチゾン浸漬Ｗｈａｔｍａｎフィルターディスクを用意した。ディスクを層流フードで乾燥し、次いでディスクごと２０μｌのウイルスストックに１０分間浸漬した。これらのディスクを９日目あるいは１０日目のヒヨコ胎児のＣＡＭに接触させ、セロファンテープで貼り付け、３７℃で１８−２４時間インキュベートした。ついでモックＰＢＳまたは増殖因子のどちらかを５μｇ／ｍｌの濃度で、ＣＡＭ組織に対するウイルスの付加的な増加としての適当なウイルスストック２０μｌ中のＣＡＭに加えた。７２時間後、ＣＡＭを回収し、ディスクの下にあるＣＡＭ中の分岐点の数の両盲目計測により決定された血管形成性指標の変化を試験した。キナーゼアッセイのために、ディスクに下の組織をＲＩＰＡ中に回収し、電動摩砕機で均質化し、全タンパク質の等価量から免疫沈降し、ＦＡＫ−ＧＳＴ融合タンパク質を基質として用いたインビトロキナーゼアッセイにかけた。免疫蛍光研究のために、ディスクの下にあるＣＡＭ組織をＯＣＴ中に凍結し、低温保存的に、４μｍに切断し、１分間アセトンで固定し、通常の３％ヤギ血清中で１時間保温し、次いで、先に記述されたように（Ｅｌｉｃｅｉｒｉら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１４０：１２５５−１２６３（１９９８））一次ウサギ抗リン酸化ＥＲＫ抗体中でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、蛍光二次抗体で検出した。
【０１４４】
Ａ．ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦによる内因性Ｓｒｃの活性化
血管形成の調節でのＳｒｃ活性化における増殖因子の効果を査定するために、以下のアッセイを行った。２時間ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦ（２μｇ／ｍｌ）に暴露した１０日齢ヒヨコＣＭＡ組織抽出物を溶解させた。内因性Ｓｒｃを等量の総タンパク質より免疫沈降し、基質としてＧＳＴ融合タンパク質を用いたインビトロ免疫複合キナーゼアッセイにかけ、電気泳動し、ニトロセルロースに移した。
【０１４５】
アッセイの結果をＳｒｃ活性の増加は、ＣＡＭアッセイでの基準Ｓｒｃ活性の表示である未処理（モック）サンプルと比較して、ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦどちらかでのゲルの密度の増加における証拠である図５に示した。ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦ両方がＣＡＭに存在する内因性Ｓｒｃ活性の約２倍の増加に帰着した。上記キナーゼアッセイブロットをまた、同等のＳｒｃおよびＩｇＧ含量に対するローディング対照として抗Ｓｒｃ抗体でプローブ化した。
【０１４６】
Ｂ．ヒヨコＣＡＭでの血管形成におけるＳｒｃＡのレトロウイルス仲介遺伝子発現の影響
以下のアッセイをＣＭＡ調製品での血管形成における変異Ｓｒｃタンパク質の影響を査定するために行った。このアッセイのために、９日齢ヒヨコＣＡＭをＲＣＡＳ−ＳｒｃＡまたはＲＣＡＳ−ＧＦＰ発現レトロウイルスまたは緩衝液に上述したプロトコールの後７２時間暴露した。
【０１４７】
血管形成のレベルが上述のように定量され、このアッセイの結果を図６Ａに示した。代表的な顕微鏡写真（４×）を図６Ｂに示したようにステレオ顕微鏡でとった。基準内因性Ｓｒｃ活性をおよそ５０の血管形成指数とした。一方、チロシンからフェニルアラニンにアミノ酸残喜一５２７での点変異を持つレトロウイルスベクター発現ＲＣＡＳ−ＳｒｃＡで処理したＣＡＭはおよそ９０の血管形成指数の血管形成増強（誘導）となった。Ｓｒｃ−Ａ仲介血管形成の増強はまた図６Ｂで示した顕微鏡写真であきらかである。
【０１４８】
Ｃ．レトロウイルスのＳｒｃＡ発現は、血管ＭＡＰキナーゼリン酸化を活性化する
増殖因子ＶＥＧＦおよびＰＭＡと比較したＳｒｃＡの、血管ＭＡＰキナーゼリン酸化に対する効果も、上記およびここで記載したアッセイ手順に従って評価した。ＶＥＧＦまたはＰＭＡ（匹敵する濃度の別のマイトジェン）に３０分間曝露した１０日齢のヒヨコＣＡＭの組織抽出物を、ＳｒｃＡ発現レトロウイルスで４８時間感染させたものと比較した。次いで、Ｓｒｃを等量の全タンパク質抽出物から免疫沈降し、基質としてＦＡＫ−ＧＳＴ融合タンパク質を使用してインビトロ免疫複合体キナーゼアッセイにかけ、電気泳動し、ニトロセルロースに移した。
【０１４９】
このアッセイの結果は図７Ａに示し、ここで、非処置ＣＡＭ（ＮＴ）は、基線内因性Ｓｒｃ媒介血管ＭＡＰキナーゼリン酸化を示す。ＶＥＧＦおよびＰＭＡは両方共、基線の約２倍の増加をもたらした。これに対し、ＳｒｃＡは非処置サンプルで見られるものの約５−１０倍活性を増強した。
【０１５０】
上記の全組織溶解液のアリコートは、図７Ｂに示したように、抗ホスホＥＲＫ抗体でイムノブロットすることにより、内因性ＥＲＫリン酸化についても測定した。この評価のために、１０日齢のＣＡＭを、偽ＲＣＡＳまたはＳＲＣ Ａを発現するＲＣＡＳで感染させた。２日後、ＣＡＭを解剖し、ＯＣＴに凍結保存し、４μｍに切片化した。切片を抗リン酸化ＥＲＫ抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で免疫染色し、洗浄し、ヤギ抗ウサギＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体で検出した。蛍光イメージを冷却ＣＣＤカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔ．）で捕獲した。顕微鏡写真により、偽対照と比べてＳｒｃＡ処置調製物での免疫蛍光の増強が示される。
【０１５１】
Ｄ．ｂＦＧＦではなくＶＥＧＦ誘導血管形成中のＳｒｃ活性の選択的要求
増殖因子誘導血管形成に対するＳｒｃ調節活性の効果を評価するために、以下のアッセイを実施した。９日齢のヒヨコＣＡＭを、前記したＳｒｃ２５１またはＳｒｃ Ｋ２９５Ｍと称されるドミナントネガティブなＳｒｃ変異を発現するレトロウイルスベクター調製物に曝露した。ＲＣＡＳ−Ｓｒｃ２５１または対照ＲＣＡＳ−ＧＦＰレトロウイルスまたは緩衝液ＣＡＭＳを２０時間処理し、次いでさらに７２時間ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦの存在下または非存在下でインキュベートした。
【０１５２】
上記のように定量した血管形成のレベルは、図８Ａに示す。図８Ｂに示される、代表的な顕微鏡写真（６×）は、立体顕微鏡で撮影した。図８Ｃは、抗Ｓｒｃ抗体でプローブしたブロットを示し、偽処置と比較したトランスフェクト細胞でのＳｒｃ２５１発現を確認する。
【０１５３】
上記のアッセイの結果は、ＲＣＡＳ−ＧＦＰ対照の存在下でのｂＦＧＦおよびＶＥＧＦ処置ＣＡＭＳの両方が、偽または非処置ＣＡＭ調製物で見られるＳｒｃ媒介基線血管形成以上の血管形成を誘導したことを示す。発現されたドミナントネガティブな変異体Ｓｒｃ２５１は、ＶＥＧＦ誘導血管形成を基線レベルまで阻害するのに効果的であったが、ｂＦＧＦ媒介血管形成の阻害には効果的でなかった。図８Ｂで示した顕微鏡写真は図８Ａで示したデータを写真で確認する。従って、レトロウイルス発現Ｓｒｃ２５１は、血管形成がＶＥＧＦで誘導される場合、効果的な血管形成阻害剤である。
【０１５４】
下記の実施例に記載した他の血管形成モデルと共に本発明のＳｒｃタンパク質を適用することは本発明により考えられる。
【０１５５】
５．インビボウサギ眼モデルアッセイにより測定したＳｒｃ修飾因子による腫瘍組織増殖の退行
増殖因子誘導血管形成に対するＳｒｃ修飾因子の効果は、眼の角膜により例示されるような天然に透明な構造で観察できる。新規血管は、豊富な血液供給のある角膜の縁から、通常血液供給のない角膜中心へと増殖する。ｂＦＧＦなどの血管形成刺激物質は、角膜に適用すると、角膜の縁からの新規血管の増殖を誘導する。角膜に適用した血管形成アンタゴニストは、角膜の縁からの新規血管の増殖を阻害する。従って、角膜は、内皮細胞の侵入を通して、角膜の縁から、容易に見える硬いコラーゲン濃縮角膜組織への血管形成を受ける。ウギ眼モデルアッセイはそれ故、眼の角膜に直接化合物を埋め込んだ後の、直接的な血管形成の刺激および阻害の観察のインビボモデル提供する。
【０１５６】
Ａ．インビボウサギ眼モデルアッセイ
１）増殖因子により誘導される血管形成
血管形成は、増殖因子ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦによりインビボウサギ眼モデルアッセイで誘導され、以下の章で記載する。
【０１５７】
ａ．増殖因子を含むハイドロンペレットおよびモノクローナル抗体の調製
増殖因子を含むハイドロンポリマーペレットは、Ｄ’Ａｍａｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：４０８２−４０８５（１９９４）により調製する。個々のペレットは、増殖因子を安定化し、周辺組織へのゆっくりとした放出を確かにするスクラルフェート（Ｃａｒａｆｅｔ、Ｍａｒｉｏｎ Ｍｅｒｒｅｌｌ Ｄｏｗ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に別々に結合した６５０ｎｇの増殖因子を含む。さらに、前記の所望のＳｒｃ発現レトロウイルスを含むハイドロンペレットを調製する。ペレットは、その表面に２．５ｍｍの穴を穿孔した特別に調製したテフロンペグに鋳造する。約１２μｌの鋳造物質を各ペグに入れ、一晩無菌フード中で重合する。次いでペレットを紫外線照射により滅菌する。次いで、Ｓｒｃタンパク質の効果を前記のように評価する。
【０１５８】
６．キメラマウス：ヒトアッセイにより測定した、Ｓｒｃ修飾因子による腫瘍組織増殖のインビボ退行
インビボキメラマウス：ヒトモデルを、ＳＣＩＤマウスの皮膚の一部をヒト新生児包皮で置換することにより作成する。インビボキメラマウス：ヒトモデルは、本質的にＹａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：９８６−９９６（１９９３）に記載のように調製する。簡潔には、２ｃｍ２平方領域の皮膚をＳＣＩＤマウス（６−８週令）から外科的に除去し、ヒト包皮と置換する。マウスを麻酔し、剪毛により腹側部の各側の５ｃｍ２領域から毛を除去する。２つの２ｃｍ２の環状移植床を、筋膜までの全厚の皮膚を除去することにより調製する。ヒト新生児包皮から得た同サイズの全厚ヒト皮膚移植片を創傷床に配置し、縫合する。移植片をバンドエイドで覆い、皮膚に縫合する。ミクロ細孔布巻尺も創傷に適用する。
【０１５９】
Ｍ２１−Ｌヒト黒色腫細胞系またはＭＤＡ２３．１乳癌細胞系（ＡＴＣＣ ＨＴＢ２６；ｍＡｂ ＬＭ６０９との組織切片の免疫反応性によりαβ３陰性）を使用して、ＳＣＩＤマウス上のヒト皮膚移植片上に充実ヒト腫瘍を形成する。５×１０６Ｍ２１−ＬまたはＭＤＡ２３．１細胞の単一細胞懸濁液を、ヒト皮膚移植片に皮内注射する。次いで、マウスを２−４週間観察し、測定可能なヒト腫瘍を増殖させる。
【０１６０】
測定可能な腫瘍が確立した後、本発明のレトロウイルス調製物またはＰＢＳをマウス尾静脈に注射する。２−３週間後、腫瘍を切出し、重量および組織学により分析する。次いで、本発明の発現されたＳｒｃタンパク質の腫瘍に対する効果を評価する。
【０１６１】
７．ＣＡＭアッセイにより測定したＳｒｃ修飾因子によるヒト腫瘍組織増殖のインビトロ退行
腫瘍増殖は血管形成に依存する（Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９２；Ｗｅｉｄｎｅｒら、１９９１；Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４ｂ）。事実、近年の報告により、腫瘍増殖はＶＥＧＦ受容体アンタゴニストの抗血管形成効果に感受性であることが示唆される（Ｋｉｍら、１９９３）。それ故、我々は、キナーゼ欠失Ｓｒｃ２５１の送達による血管形成の抑制が、ＶＥＧＦを産生しほとんどｂＦＧＦを産生しないことが知られる高度に血管形成性の腫瘍である、ヒト髄芽腫（ＤＡＯＹ）の増殖に影響を及ぼすかどうかを調べた（データは示していない）。
【０１６２】
３および６日のＤＡＯＹ髄芽腫腫瘍増殖アッセイを、本質的に前記したようにヒヨコＣＡＭで実施した（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４）。１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０中で培養した５×１０６ＤＡＯＹ細胞を洗浄し、１０日齢の胚のＣＡＭに接種し、ＤＡＯＹ腫瘍断片を産生した。７日後、５０ｍｇの腫瘍断片を解剖し、別の１０日齢の胚に再度接種し、さらに３または６日間、対照ＲＣＡＳ−ＧＦＰレトロウイルス、ＲＣＡＳ−Ｓｒｃ２５１または偽処置を局所適用（２５μｌ）してインキュベートした。指針として感染腫瘍の全組織共焦点イメージングを使用して、我々は、この局所アプローチで、腫瘍断片付近およびその中でＲＣＡＳ作成物の有意な発現があることを決定できた。腫瘍切除および秤量を二重盲検様式で実施し、容易に規定できる充実腫瘍塊のみを除去した（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４）。３または６日後の湿潤腫瘍重量を最初の重量と比較し、腫瘍重量の比率変化を各群について決定した。
【０１６３】
これらの腫瘍は容易にＣＡＭ上で増殖し、活発な血管形成をもたらし（図９）、トリ特異的ＲＣＡＳレトロウイルスの使用によりトリ由来腫瘍脈管構造を選択的に標的化できる。
【０１６４】
図９は、ヒヨコＣＡＭ上で増殖しているヒト腫瘍に、ＲＣＡＳ−Ｓｒｃ２５１をレトロウイルスにより送達すると腫瘍増殖は逆転することを示す結果を示す。図９Ａは、上記したようにヒヨコ胚のＣＡＭ上で増殖したヒト髄芽腫を示す。ＲＣＡＳ−ＧＦＰまたはＲＣＡＳ−Ｓｒｃ２５１を含むレトロウイルスを、５０ｍｇ以上の前以て確立された腫瘍に局所適用した。ＧＦＰを発現するＲＣＡＳ−ＧＦＰで感染した髄芽腫腫瘍断片の代表的な顕微鏡写真により、バイオラッドレーザー共焦点走査顕微鏡（バー＝５００μｍ）を用いた光学切片化により検出した腫瘍血管での排他的な発現（矢印）が判明する。図９Ｂは、３または６日間増殖させ、その後切除し湿潤重量を決定した上記のように処置した腫瘍の結果を示す。データは、２つの複製物の腫瘍重量の平均変化（５０ｍｇの腫瘍開始重量から）＋／−標準誤差として表す。ＲＣＡＳ−Ｓｒｃ２５１は、腫瘍増殖に対する有意な影響を３日後（＊、Ｐ＜０．００２）および６日後（＊＊、Ｐ＜０．０５）に示した。図９Ｃは、胚から外科的に除去した髄芽腫腫瘍の代表的な立体顕微鏡写真をオリンパス立体顕微鏡（バー＝３５０μｍ）で撮影したことを示す。（下のパネル）各腫瘍の高倍率顕微鏡写真は詳細に各腫瘍の脈管構造を示す（バー＝３５０μｍ）。矢印は、ＲＣＡＳ−Ｓｒｃ２５１処置腫瘍での血管破壊を示す。
【０１６５】
結果は、Ｓｒｃ２５１を含むＲＣＡＳの、前以て確立された髄芽腫への送達により、腫瘍感染血管での選択的ウイルス発現が生じ（図９Ａ）、これは最終的に６日間以内にこれらの腫瘍の退行をもたらす（図９Ｂ）。重要なことに、Ｓｒｃ２５１を含むウイルスで処置した動物の腫瘍関連血管は重度に破壊し、対照動物の腫瘍血管と比べて数が少なかった（図９Ｃ）。ＲＣＡＳ−ＧＦＰ感染腫瘍は腫瘍脈管構造にのみＧＦＰ局在を示すという事実は、レトロウイルス送達Ｓｒｃ２５１で観察された抗腫瘍効果は抗血管形成特性に起因することを示唆する。
【０１６６】
前記の実施例およびそれに伴う記載は説明的なものであり、限定するものではない。本発明はまた、提出された細胞系により範囲を限定されない。なぜなら提出された実施形態は本発明の１つの態様の１つの説明として捉えられるからである。機能的に等価のいずれの細胞系も本発明の範囲内にある。物質の提出は、ここに含まれる記述が、その最善の形態を含む、本発明の任意の態様の実践を可能とするに不十分であるという承認にはならず、また、請求の範囲を、それが示す特定の説明に限定するとは解釈されない。実際、本明細書で示され記載されたものに加えて本発明の様々な修飾が、前記から当業者には明らかとなり、添付の請求の範囲内に該当する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｔａｋｅｙａら，Ｃｅｌｌ，３２：８８１−８９０（１９８３）によって最初に記載されたイントロンの欠失した完全コーディング配列を表すニワトリｃ−ＳｒｃのｃＤＮＡ配列である。この配列はＧｅｎＢａｎｋから登録番号Ｊ００８４４で入手できる。該配列は１７５９ヌクレオチドを含み、タンパク質コーディング部分はそれぞれ１１２位で開始し、１７１３位で終止する。
【図２】 図１に示すコーディング配列でコードされたニワトリｃ−Ｓｒｃのアミノ酸残基配列である。
【図３】 Ｂｒａｅｕｎｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：１０４１１−１０４１５（１９９１）によって最初に記載されたヒトｃ−ＳｒｃのｃＤＮＡ配列である。この配列はＧｅｎＢａｎｋから登録番号Ｘ５９９３２ Ｘ７１１５７で入手できる。該配列は２１８７ヌクレオチドを含み、タンパク質コーディング部分はそれぞれ１３４位で開始し、１４８６位で終止する。
【図４】 図３に示すコーディング配列でコードされたヒトｃ−Ｓｒｃのアミノ酸残基配列である。
【図５】 実施例４に記載のようなｂＦＧＦまたはＶＥＧＦによる内因性Ｓｒｃの活性化を示す。図の上部は、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦによる内因性ｃ−Ｓｒｃのｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの結果を活性化倍率と共に示す。図の下部は、均等なＳｒｃ及びＩｇＧの含量に対してローディングコントロールとして抗−Ｓｒｃ抗体でプローブしたキナーゼアッセイブロットを示す。
【図６】 実施例４に記載のようなニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）中の血管形成に対するレトロウイルス介在ｃ−Ｓｒｃ Ａ遺伝子発現の効果を示す。９日齡のニワトリＣＡＭをＲＣＡＳ−Ｓｒｃ Ａ（活性の突然変異ｃ−Ｓｒｃ）またはコントロールＲＣＡＳ−ＧＦＰ（緑色系蛍光タンパク質；蛍光性指示タンパク質）レトロウイルスまたはバッファに７２時間接触させた。図６Ａは血管形成レベルの定量を示し、図６Ｂは立体顕微鏡で撮影した各処理サンプルの代表的顕微鏡写真（４×）に対応する。
【図７】 血管ＭＡＰキナーゼリン酸化を活性化しているｃ−Ｓｒｃ Ａのレトロウイルス発現を示す。図７Ａは、ＶＥＧＦもしくはＰＭＡに３０分間接触させたかまたはｃ−Ｓｒｃ Ａレトロウイルスを４８時間感染させた１０日齡のニワトリＣＡＭの組織抽出物を示す。ＮＴは処理せずを表す。Ｓｒｃを均等量の全タンパク質抽出物から免疫沈降させ、ＦＡＫ−ＧＳＴ融合タンパク質を基質として用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫複合体キナーゼアッセイで処理し、電気泳動させ、ニトロセルロースフィルターに転移させた。上記の全組織溶解物のアリコートの内因性ＥＲＫリン酸化を抗−ホスホ−ＥＲＫ抗体でイムノブロッティングすることによって測定した。図７Ｂは、擬似ＲＣＡＳまたはＳＲＣ Ａを含有するＲＣＡＳを感染させた１０日齡のＣＡＭを示す。２日後、ＣＡＭを摘出し、ＯＣＴ中で凍結保存し、４μｍで切開した。切片を抗リン酸化ＥＲＫ抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で免疫染色し、洗浄し、ヤギ抗−ウサギＦＩＴＣ−コンジュゲート第二抗体で検出した。冷却したＣＣＤカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔ．）で蛍光像を撮影した。
【図８】 ｂＦＧＦでなくＶＥＧＦに誘発された血管形成中のＳｒｃ活性に対する選択要件を示す。９日齡のニワトリＣＡＭをＲＣＡＳ−Ｓｒｃ ２５１またはコントロールＲＣＡＳ−ＧＦＰレトロウイルスまたはバッファに２０時間接触させ、次いでｂＦＧＦまたはＶＥＧＦの存在下または非存在下で更に７２時間インキュベートした。図８Ａは、上述のように定量した血管形成レベルを示し、図８Ｂは、立体顕微鏡で撮影した代表的顕微鏡写真（６×）を示す。図８Ｃは、トランスフェクト細胞中のＳｒｃ ２５１の発現を確認するために抗−Ｓｒｃ抗体でプローブしたブロットを擬似処理に比較して示す。
【図９】 ヒト腫瘍に対するＲＣＡＳ−Ｓｒｃ ２５１のレトロウイルス性デリバリーの結果を示す。図９Ａは、Ｂｉｏ Ｒａｄレーザー共焦点走査型顕微鏡で光学セクショニング（ｂａｒ＝５００μｍ）によって検出した腫瘍血管（矢印）中でＧＦＰだけを発現するＲＣＡＳ−ＧＦＰ（ＲＣＡＳ−緑色系蛍光タンパク質）に感染させたヒト髄芽細胞腫フラグメントを示す顕微鏡写真である。図９Ｂは、レトロウイルスの局所塗布によって処理し、３日間または６日間増殖させた後、切除し、湿潤重量を計量した腫瘍から得られたデータを示す。データは２つの重複サンプルの腫瘍重量の平均変化（初期腫瘍重量５０ｍｇからの変化）±ＳＥＭとして表される。図９Ｃは、胚から外科的に摘出された髄芽細胞腫の顕微鏡写真（ｂａｒ＝３５０μｍ）を表す。下段パネルは各腫瘍の脈管構造を詳細に示す各腫瘍の高倍率写真である（ｂａｒ＝３５０μｍ）。矢印はＲＣＡＳ−Ｓｒｃ２５１−処理腫瘍中の血管破壊を示す。
【図１０】 ＲＣＡＳＢＰ（ＲＣＡＳ）ベクター構築物の制限マップを示す概略図である。
【配列表】
Claims (13)
- 疾患状態に関連する組織中の血管形成を阻害するための医薬組成物であって、Ｓｒｃ ２５１タンパク質を発現し得るヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする医薬組成物。
- 前記組織に炎症があり、前記状態が関節炎またはリューマチ様関節炎であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記組織が固形腫瘍または固形腫瘍転移であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物の投与が化学療法と共に行われることを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。
- 前記組織が網膜組織であり、前記状態が網膜症、糖尿病性網膜症または黄斑変性であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記組織が冠状血管形成部位に存在し、前記状態が再発狭窄症であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物の投与が、静脈内、経皮、滑液嚢内、筋肉内または経口投与であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物の投与が単一用量の静脈内投与から成ることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が更にリポソームを含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が前記ヌクレオチド配列を発現させ得るウイルス性発現ベクターを含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が前記ヌクレオチド配列を発現させ得る非ウイルス性発現ベクターを含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
- 核酸を含むウイルス性遺伝子導入ベクターと医薬として許容される担体または賦形剤とから成り、前記核酸がＳｒｃ ２５１タンパク質をコードする核酸セグメントを有していることを特徴とするターゲット哺乳類組織中の血管形成を阻害するための医薬組成物。
- 核酸を含む非ウイルス性遺伝子導入ベクターと医薬として許容される担体または賦形剤とから成り、前記核酸がＳｒｃ ２５１をコードする核酸セグメントを有していることを特徴とするターゲット哺乳類組織中の血管形成を阻害するための医薬組成物。
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