NO327610B1 - Farmasoytisk sammensetning omfattende et aktivt Src-protein eller et oligonukleotid som koder for det samme samt anvendelser derav. - Google Patents

Description

Teknisk område

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en farmasøytiske sammensetning som omfatter et aktivt Src-protein eller et oligonukleotid som koder for det samme og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient, hvor nevnte protein er i stand til å potensiere angiogenese i et vev assosiert med en sykdomstilstand. Videre vedrører oppfinnelsen anvendelse av nevnte protein eller oligonukleotid for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for potensiering av angiogenese i et vev assosiert med en sykdomstilstand.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Angiogenese er en prosess med vev-vaskularisasjon som involverer vekst av nye utviklende blodkar i et vev, og benevnes også neo-vaskularisasjon. Prosessen medieres ved infiltrasjon av endoteliale celler og glatte muskelceller. Prosessen antas å foregå på en av tre måter: karene kan skyte ut fra tidligere forekommende kar, nyutvikling av kar kan begynne fra forløperceller (vaskulogenese) eller eksisterende små kar kan forstørres i diameter. Blood et al., Biophvs. acta. 1032:89-118 (1990).

Angiogenese er en viktig prosess i neonatal vekst, men er også viktig ved sårheling og ved patogenese av en lang rekke forskjellige kliniske sykdommer inklusive vevsinflammasjon, artritt, tumorvekst, diabetisk retinopati, makular degenerering ved neovaskularisasjon av retina og liknende tilstander. Disse kliniske manifestasjoner assosiert med angiogenese omtales som angiogene sykdommer. Folkman et al., Science, 235:442-447 (1987). Angiogenese er generelt fraværende i voksende eller modne vev, selv om den opptrer ved sårheling og i vekstsyklusen for corpus luteum. Se for eksempel Moses et al., Science. 248:1408-1410 (1990).

Det er foreslått at inhibering av angiogenese ville være en nyttig terapi for å begrense tumorvekst. Inhibering av angiogenese er foreslått ved (1) inhibering av frigivelse av "angiogene molekyler" som for eksempel bFGF (basisk fibroblast vekstfaktor), (2) nøytralisasjon av angiogene molekyler, som for eksempel ved bruk av anti-|3bFGF-antistoffer,

(3) bruk av inhibitorer for vitronektinreseptor avP3, og

(4) inhibering av endotelial cellerespons overfor angiogene stimuli.

Den siste strategi har fått oppmerksomhet og Folkman et al., Cancer Biologv. 3:89-96

(1992), har beskrevet flere endoteliale celleresponsinhibitorer, inklusive kollagenaseinhibitor, basalmembran-omgrupperings ("turnover")-inhibitorer, angiostatiske steroider, fungalavledede angiogeneseinhibitorer, blodplate 4, trombospondin, artrittmedisiner som D-peniccilamin og gull-tiomalat, vitamin D3-analoger, alfa-interferon, og liknende som kunne anvendes for inhibering av angiogenese. For ytterligere foreslåtte inhibitorer av angiogenese, se Blood et al., Bioch. Biophvs. Acta. 1032:80-118 (1990), Moses et al., Science. 248:1408-1410 (1990), Ingber et al, Lab. Invest.. 59:44-51 (1988) og US patentskrift nr. 5.092.885, 5.112.946, 5.193.744, 5.202,352, 5.753.230 og 5.766.591. Ingen av de inhibitorer for angiogenese som er beskrevet i de foregående referanser invovlerer Src-proteiner.

For at angiogenese skal opptre må endoteliale celler først nedbrytes og krysse blodkar-basalmembranen på en liknende måte som anvendt av tumorceller under invasjon og metasasedannelse.

Oppfinnerne har tidligere rapportert at angiogenese avhenger av interaksjonen mellom vaskulære integriner og ekstracellulære matriksproteiner. Brooks et al., Science. 264:569-571 (1994). Det ble videre rapportert at programmert celledød (apoptose) av angiogene vaskulære celler initieres ved interaksjonen, som ville bli inhibert av visse antagonister av det vaskulære integrin ctvpY Brooks et al., Cell. 79:1157-1164 (1994). Mer nylig har oppfinnerne rapportert at bindingen av matriksmetalloproteinase-2 (MMP-2) til vitronektinreseptor (avPs) kan inhiberes ved bruk av avPs antagonister, og derved inhibere den enzymatiske funksjon av proteinasen. Brooks et al, cell. 85:683-693 (1996).

Fra Nature, vol. 375,1995, side 577-580 er det kjent hvordan VEGF, en kraftig angiogen faktor, blir aktivert av c-Src. Det er i nevnte publikasjon antydet at inhibitorer av tyrosinkinaser kan anvendes i forbindelse med anti-angiogen terapi.

Videre er det i Kidney International, vol.51, 1997, side 110-118 vist forsøk med villtype c-Src, v-Src (konstitutivt aktiv) og en Src kinase med en mutasjon i aminosyreposisjon 295 (inaktivert kinase domene). Samtlige varianter er klonet i en retroviral vektor.

W09819686 omtaler metoder for å behandle vaskulære skader, slik som genterapi omfattende mutanter av gener som har betydning for signaloverføring, deriblant Src. Anvendelse av liposomer eller andre lipidbaserte systemer for avlevering av substans til målcellen er foreslått.

Oppsummering av oppfinnelsen

Et første aspekt ved foreliggende oppfinnesle vedrører en farmasøytiske sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter et aktivt tyrosin kinase Src-protein, også generisk benevnte heri som Src-protein, eller et oligonukleotid som har en nukleotidsekvens som er i stand til å utrykke nevnte protein og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient, hvor nevnte protein er i stand til å potensiere angiogenese i et vev assosiert med en sykdomstilstand.

Et andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et aktivt Src-protein eller et oligonukleotid som har en nukleotidsekvens som er i stand til å utrykke nevnte protein for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for potensiering av angiogenese i et vev assosiert med en sykdomstilstand.

Blandingen som tilveiebringer Src-proteinet kan inneholde renset protein, biologisk aktive proteinfragmenter, rekombinant fremstilt Src-protein eller proteinrfagmenter eller fusjonsproteiner, eller gen/nukleinsyre-ekspresjonsvektorer for uttrykking av et Src-protein.

For potensiering er det nyttig å behandle pasienter med iskemiske lemmer hvori der er dårlig sirkulasjon i lemmene fra diabetiske eller andre tilstander. Pasienter med kroniske sår som ikke helbredes og som derfor kunne ha fordel av økning i vaskulær cellepro-liferasjon og neovaskularisasjon kan likeledes behandles.

Kort beskrivelse av tegningene

Tegningene utgjør en del av denne fremstilling:

FIG. 1 er en cDNA-sekvens av kylling c-Src som er den fullstendige kodingssekvens med intronene deletert som først beskrevet av Takeya et al., Cell, 32:881-890

(1983). Sekvensen kan fåes fra GenBank Accession Number J00844.

Sekvensen inneholder 1759 nukleotider med den proteinkodende del begynnende ved og avsluttende ved de respektive nukleotidposisjoner 112 og 1713. FIG. 2 viser aminosyrerestsekvensen til kylling c-Src som kodes av sekvensen vist i

FIG. 1.

FIG. 3 er en cDNA-sekvens av human c-Src som først beskrevet av Braeuninger et al.,

Proe. Nati. Acad. Sei.. USA. 88:10411-10415 (1991). Sekvense kan fåes gjennom GenBank Accession Number X59932 X71157. Sekvensen inneholder 2187 nukleotider hvor den proteinkodende del begynner og slutter ved respektive nukleotidposisjoner 134 og 1486. FIG. 4 viser aminosyreresekvensen av human c-Src som kodes av sekvensen vist i

FIG. 3.

FIG. 5 illustrerer aktivering av endogen Src ved bFGF eller vEGF som beskrevet i Eksempel 4. Toppdelen av figuren indikerer resultatene av en in vitro kinaseprøve med antall gangers aktivering av endogen c-Src ved enten bFGF og VEGF. Bunnen av figuren er kinaseprøven blottingsprobet med et anti-Src-antistoff som en "loading" kontroll for ekvivalent Src- og IgG-innhold. FIG. 6 illustrerer virkningen av retrovirusmediert genekspresjon av c-Src A på

angiogenese i kylling CAM som beskrevet i Eksempel 4. Ni dager gamle CAM ble eksponert for RCAS-Src A (aktivt m utert c-Src) eller kontroll RCAS-GFP (Green Fluorescent Protein; et fluorescerende indikatorprotein) retrovirus elelr buffer i 72 timer. Nivået av angiogenese ble kvantifisert som vist i FIG. 6A

med representative mikrofotografier (4x) i Fig. 6B tilsvarende hver behandling tatt med et stereomikroskop.

FIG. 7 illustrerer retroviraekspresjon av c-Src A i aktiverende vaskulær MAP-kinasefosforylasjon. FIG. 7A viser vevsekstrakter av 10 dager gamle kylling CAM som var blitt eksponert for VEGF eller PM A i 30 minutter eller infisert med c-Src A-retrovirus i 48 timer. NT står for ingen behandling. Src ble immunoresipitert fra ekvivalente mengder av totalt protein ekstrahert og underkastet en in vitro immun kompleks kinaseanalyse ved bruk av et FAK-GST-fusjonsprotein som et substrat, elektroforesebehandlet og overført til nitrocellulose. Delprøver av ovennevnte hele vevlysater ble også mål på endogen ERK-fosforylasjon ved immunoblotting med et antifosfo-ERK-antistoff. FIG. 7B viser 10 dager gamle CAM som var infisert med enten "simulert" RCAS eller RCAS inneholdende SRC a. Etter to dager ble CAM obdusert, kryokonservert i OCT og snittet med 4 um tykkelse. Snittene ble immunofarget med et anti-fosforylert ERK-antistoff (New England Biolabs), vasket og detektert med et geit-anti-kanin FITC-konjugert sekundært antistoff. Fluorescerende bilder ble tatt på et avkjølt CCD-kamera (Princeton Inst.).

FIG. 8 illustrerer det selektive krav for Src-aktivitet under VEGF, men ikke bFGF-indusert angiogenese. Ni dager gamle kylling CAM ble eksponert for RCAS-Src 251 eller kontroll RCAS-GFP retrovirus eller buffer i 20 timer og deretter inkubert i ytterligere 72 timer i nærvær eller fravær av bFGF eller VEGF.

Nivået for angiogenese vises kvantifisert i Fig. 8A som bskrevet i det foregående, og representative mikrofotografier (6x) ble tatt med stereomikroskop som vist i FIG. 8B. FIG. 8C viser en blotting probet med et anti-Src-antistoff for å bekrefte uttrykkingen av Src 251 i transfekterte celler i sammenlikning med simulerte behandlinger. Fig. 9 illsutrerer resultatene av retroviral tilførsel av RCAS-Src 251 to humane tumorer. FIG. 9 A er et mikrofotografi som viser human medulloblastom tumorfragment infisert med RCAS-GFP (RCAS-Green Fluorescent Protein) som uttrykker GFP eksklusivt i tumorblodkarene (pilspiss) som påvist ved optisk snitting med et Bio Rad laser konfokalt scanningsmikroskop (bar=500 |j,m). FIG. 9B avbilder data fra tumorer behandlet med topisk påføring av retrovirus, som fikk vokse i 3 eller 6 dager hvoretter de på nytt ble snittet opp og våtvekter bestemt. Data er uttrykt som midlere endring i tumorvekt (fra 50 mg tumor utgangsvekt) +/- SFM (standard feilmiddel) av 2 replikater. FIG. 9C avbilder i representative mikrofotografier medulloblastomtumorer kirurgisk fjernet fra embryoene (bar=350 \ im). De nedre avbildinger er avbildinger av hver tumor med stor forstørrelse som viser vaskulaturen av hver tumor i detalj (bar=350 (am). Pilspissen indikerer blodkarbrudd i RCAS-Src251-behandlede tumorer. FIG. 10 er et diagram som illustrerer et restriksjonskart av RCASBP (RCAS)

vektorkonstruksj onen.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

A. Definisjoner

Aminosvrerest: En aminosyrerest dannet ved kjemisk oppslutning (hydrolyse) av et polypeptid ved dets peptidbindinger. Aminsyrerestene beskrevet heri er foretrukket i den "L"-isomere form. Imidlertid kan den "D"-isomere form erstatte en hvilken som helst L-aminosyrerest, så lenge som den ønskede funksjonelle egenskap bibeholdes i polypeptidet. NH2-refererer til den fri aminogruppe tilstede ved aminosenden av et polypeptid. COOH refererer til den fri karboksygruppe tilstede ved karboksyenden av et polypeptid. Dette er i samsvar med standard polypeptidnomenklatur (beskrevet i J. Biol. Chem.. 243:3552-59 (1969) og adoptert ved 37 CFR §1.822(b)(2)).

Det skal bemerkes at alle aminosyrerestsekvenser er representert heri ved formler hvis venstre- og høyre-orientering er i den konvensjonelle retning fra aminoenden til karboksyenden. Det skal videre bemerkes at en tankestrek ved begynnelsen av eller slutten av en aminosyrerestsekvens indikerer en peptidbinding til en ytterligere sekvens av en eller flere aminosyrerester.

Polypeptid: refererer til en lineær serie av aminosyrerester forbundet til hverandre ved hjelp av peptidbindinger mellom alpha-aminogruppen og karboksygruppen i tilliggende aminosyrerester.

Peptid: som anvendt heri refererer til en lineær serie på ikke mer enn omtrent 50 aminosrester forbundet den ene til den andre som i et polypeptid.

Cvklisk peptid: refererer til en forbindelse med en heteroatom ringstruktur som inkluderer flere amidbindinger som i et typisk peptid. Det cykliske peptid kan være et "hode til hale" ringsluttet lineært polypeptid hvori n-enden av et lineært peptid har dannet en amidbinding med det c-terminale karboksylat av det lineære peptid, eller det kan inneholde en ringstruktur hvori polymeren er homodetisk eller heterodetisk og omfatter amidbindinger og/eller andre bindinger for å lukke ringen, som disulfidbroer, tioestere, tioamider, guanidino og liknende bindinger.

Protein: refererer til en lineær serie på mer enn 50 aminosyrerester forbundet den ene til den andre som i et polypeptid.

Fusjonsprotein: refererer til et polypeptid inneholdende minst to forskjellige polypeptiddomener operativt sammenknyttet ved hjelp av en typisk peptidbinding ("fusjonert"), hvor de to domener tilsvarer peptider som ikke finnes fusjonert i naturen.

Syntetisk peptid: refererer til en kjemisk fremstilt kjede av aminosyrerester sammenknyttet ved hjelp av peptidbindinger som er fri for naturlig forekommende proteiner og fragmenter derav.

B. Generelle betraktninger

Den foreliggende oppfinnelse vedrører generelt den oppdagelse at angiogenese medieres av tyrosin kinase Src-proteinet og at angiogenese kan moduleres ved å tilveiebringe enten aktive eller inaktive Src-proteiner for henholdsvis potensiering eller inhibering av angiogense.

Denne oppdagelse er viktig på grunn av den rolle som angiogenese, d.v.s. dannelse av nye blodkar, spiller i en rekke forskjellige sykdomsprosesser. Hvor vev assosiert med en sykdomstilstand krever angiogenese for vevsvekst er det ønskelig å inhibere angiogenese og derved inhibere den sykelige vevsvekst. Hvor skadet vev krever angiogenese for vevsvekst og er det ønskelig å potensiere eller fremme angiogenese og derved fremme vevshelbredelse og vekst.

Hvor veksten av nye blodkar er grunnen til eller bidrar til patologien assosiert med et sykt vev vil inhibisjon av angiogenese redusere de skadelige virkninger av sykdommen. Ved inhibering av angiogenese kan man intervenere i sykdommen, lette symptomene og i noen tilfeller helbrede sykdommen.

Eksempler på vev assosiert med sykdom og neovaskularisasjon som vil ha fordel av inhiberende modulasjon av angiogenese inkluderer reumatoid artritt, diabetisk retinopati, inflammatoriske sykdommer, restenose og liknende. Hvor veksten av nye blodkar kreves for å understøtte veksten av et skadelig vev, vil inhibisjon av angiogenese redusere blodtilførselen til vevet og derved bidra til reduksjon i vevmassen basert på blodtilførselskravene. Eksempler inkluderer vekst av tumorer hvor neovaskularisasjon er et kontinuerlig krav for at tumoren skal vokse utover et fåtall millimeter i tykkelse og for etableirng av faste tumormetastaser.

Hvor veksten av nye blodkar antas å bidra til heling av vev vil potensiering av angiogenese fremme heling. Eksempler inkluderer behandling av pasienter med iskemiske lemmer hvori der er dårlig sirkulasjon i lemmene fra diabetes eller andre tilstander. Også medomfattet er pasienter med kroniske sår som ikke heles og som derfor kunne ha fordel fra økningen i vaskulær celleformering og neovaskularisasjon.

Anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelse er effektive delvis på grunn av at terapien er meget selektiv for angiogenese og ikke for andre biologiske prosesser.

Som tidligere beskrevet inkluderer angiogenese en rekke forskjellige prosesser som involverer neovaskularisasjon av et vev inklusive "spiring", vaskulogenese, eller karforstørrelse, idet alle disse angiogeneseprosesser påvirkes av Src-protein. Med unntakelse av traumatisk sårhelbredelse, corpus luteum-dannelse og embryogenese, er det antatt at hovedandelen av angiogeneseprosesser er assosiert med sykdomsprosesser og derfor er bruken av de foreliggende terapeutiske metoder selektive for sykdommen og har ikke skadelige bivirkninger.

C. Src-proteiner

Et tyrosin kinase Src-protein kan variere avhengig av den tilsiktede bruk. Betegnelsene "Src-protein" eller "Src" anvendes for kollektivt å refererere til de forskjellige former av tyrosin kinase Src-protein beskrevet heri, enten i aktive eller inaktive former.

Et "aktivt Src-protein" refererer til hvilke som helst av en rekke forskjellige former av

Src-protein som potensierer angiogenese. Forsøk på å måle potensiering av angiogenese er beskrevet heri. Et protein anses aktivt hvis nivået av angiogenese er minst 10% større, foretrukket 25% større, og mer foretrukket 50% større enn et kontrollnivå hvor ikke noe Src tilsettes til prøvesystemet. Den foretrukne analyse for måling av potensiering er CAM-analysen ved bruk av RCAS-viral vektor som beskrevet i eksemplene hvori den angiogene indeks beregnes ved å telle forgreningspunkter. Et foretrukket aktivt Src-protein fremviser også tyrosin kinaseaktivitet. Eksempelvise aktive Src-proteiner er beskrevet i eksemplene og inkluderer Src-A.

Et "inaktivt Src-protein" refererer til hvilke som helst av en rekke forskjellige former av Src-protein som inhiberer angiogenese. Analyser for å måle inhibering av angiogenese er beskrevet heri. Et protein betraktes som inaktivt hvis nivået av angiogenese er minst 10% lavere, foretrukket 25% lavere, og mer foretrukket 50% lavere enn et kontrollnivå hvor ikke noe eksogent Src tilsettes analysesystemet. Den foretrukne prøve for måling av inhibering er CAM-analysen ved bruk av RCAS-viral vektor som beskrevet i eksemplene hvori den angiogene indeks beregnes ved å telle forgreningspunkter. Et foretrukket inaktivt Src-protein fremviser også redusert tyrosinkinaseaktivitet. Eksempelvise inaktive Src-proteiner er beskrevet i eksemplene og inkluderer Src-251.

Et Src-protein nyttig ved den foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved hjelp av en hvilken som helst av en rekke forskjellige metoder inklusive isolering fra naturlige kilder inklusive vev, produksjon ved rekombinant DNA-ekspresjon og rensing, og liknende. Src-protein kan også tilveiebringes "in situ" ved innføring av et genterapisystem til vevet av interesse som så uttrykker proteinet i vevet.

Et gen som koder for et Src-protein kan fremstilles ved hjelp av en rekke forskjellige metoder kjent på området. For eksmepel er den naturlige historie av Src vel kjent til å inkludere en rekke forskjellige homologer fra mammalia, fugle, virale og liknende arter, og genet kan lett klones ved bruk av cDNA-kloningsmetoder fra et hvilket som helst vev som uttrykker proteinet. Et foretrukket Src for bruk ved oppfinnelsen er et cellulært protein, som for eksempel de mammalia- eller fuglehomologer som betegnes c-Src. Særlig foretrukket er human c-Src. D. Rekombinante DNA-molekyler og ekspresjonssystemer for ekspresjon av et

Src-proten

Oppfinnelsen beskriver flere nukleotidsekvenser av særlig nytte ved den foreliggende oppfinnelse. Disse sekvenser inkluderer sekvenser som koder for et Src-protein nyttig ved oppfinnelsen og forskjellige DNA-segmenter, rekombinante DNA (rDNA) molekyler og vektorer konstruert for ekspresjon av Src-protein.

DNA-molekyler (segmenter) ifølge denne oppfinnelse kan derfor omfatte sekvenser som koder for hele strukturelle gener, fragmenter av strukturelle gener, og transkripsjonsenheter som videre beskrevet heri.

Et foretrukket DNA-segment er en nukleotidsekvens som koder for et Src-protein som definert heri, eller biologisk aktivt fragment derav.

Aminosyrerestsekvensen og nukleotidsekvensen av et foretrukket c-Src er beskrevet i eksemplene.

Et foretrukket DNA-segment koder for en aminosyrerestsekvens som vesentlig er den samme som, og foretrukket essensielt består av en aminosyrerestsekvens eller deler derav tilsvarende et Src-protein beskrevet heri. Representative og foretrukne DNA-segmenter er videre beskrevet i eksemplene.

Aminosyrerestsekvensen av et protein eller polypeptid er direkte relatert via den genetiske kode til deoksyribonukleinsyre (DNA) sekvensen av det strukturelle gen som koder for proteinet. Et strukturelt gen eller DNA-segment kan således defineres på basis av aminosyrerestsekvensen, d.v.s. det protein eller polypeptid for hvilket det koder.

Et viktig og velkjent trekk ved den genetiske kode er dens degenererte karakter. Det vil si at for de fleste av aminosyrene anvendt for fremstilling av proteiner kan mer enn en kodende nukleotidtriplett (kodon) kode for eller designere en spesiell aminosyrerest. Et antall forskjellige nukleotidsekvenser kan derfor kode for en spesiell aminosyrerestsekvens. Slike nukleotidsekvenser er ansett som funksjonelt ekvivalente ettersom de kan resultere i produksjon av den samme aminosyrerestsekvens i alle organismer. Leilighetsvis kan en metylert variant av et purin eller pyrimidin innlemmes i en gitt nukleotidsekvens. Slike metyleringer påvirker imidlertid ikke på noen måte kodingsforholdet.

En nukleinsyre er et hvilket som helst polynukleotid eller nukleinsyrefragment, uansett om det er et polyribonukleotid eller polydeoksyribonukleotid, d.v.s. RNA eller DNA, eller analoger derav. I foretrukne utførelsesformer er et nukleinsyremolekyl i form av et segment av dupleks DNA, d.v.s. et DNA-segment, selv om det for bestemte molekylære biologiske metodologier foretrekkes enkelttrådet DNA eller RNA.

DNA-segmenter fremstilles ved hjelp av et antall midler inklusive kjemiske syntesemetoder og rekombinante metoder, foretrukket ved kloning eller ved polymerase-kjedereaksjon (PCR). DNA-segmenter som koder for deler av et Src-protein kan lett syntetiseres ved hjelp av kjemiske metoder, for eksempel fosfotriestermetoden til Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191,1981, eller ved å anvende automatiserte syntesemetoder. I tillegg kan større DNA-segmenter lett fremstilles ved hjelp av velkjente metoder, som for eksempel syntese av en gruppe av oligonukleotider som definerer DNA-segmentet, etterfulgt av hybridisering og ligasjon av oligonukleotider for å bygge det fullstendige segment. Alternative metoder inkluderer isolasjon av et foretrukket DNA-segment ved hjelp av PCR med et par av oligonukleotidprimere anvendt på et cDNA-bibliotek antatt å inneholde komponenter som koder for et Src-protein.

Selvfølgelig kan ved kjemisk syntese hvilke som helst ønskede modifikasjoner foretas enkelt ved å substituere de riktige baser for de baser som koder for den native aminosyrerestsekvens. Denne metode er vel kjent og kan lett anvendes for produksjon av flere av de forskjellig "modifiserte" Src-proteiner beskrevet heri.

Videre kan DNA-segmenter hovedsakelig bestående av strukturelle gener som koder for et Src-protein deretter modifiseres, som for eksempel ved sete-rettet eller tilfeldig mutagenese, for å innføre hvilke som helst ønskede substitusjoner.

1. Kloning av et Src-gen

Et Src-gen ifølge oppfinnelsen kan klones fra en passende kilde for genomisk-DNA eller budbringer-RNA (mRNA) ved hjelp av en rekke forskjellige biokjemiske metoder. Kloning av disse gener kan gjennomføres ifølge de generelle metoder som er beskrevet i eksemplene og som kjent på området.

Kilder for nukleinsyrer for kloning av et Src-gen egnet for bruk ved metodene ifølge oppfinnelsen kan inkludere genomisk-DNA eller budbringer-RNA (mRNA) i form av et cDNA-bibliotek, fra et vev antatt å uttrykke disse proteiner. Et foretrukket vev er human lungevev, selv om hvilket som helst annet egnet vev kan anvendes.

En foretrukket kloningsmetode innebærer fremstillingen av et cDNA-bibliotek ved bruk av standardmetoder, og isolering av den Src-kodende nukleotidsekvens ved hjelp av PCR-amplifikasjon ved bruk av parrede oligonukleotidprimere basert på nukleotidsekvensene beskrevet heri. Alternativt kan de ønskede cDNA-kloner identifiseres og isoleres fra et cDNA eller genomisk bibliotek ved konvensjonelle nukleinsyrehybridiseringsmetoder ved bruk av en hybridiseringsprobe basert på nukleinsyresekvensene beskrevet heri. Andre metoder for isolering og kloning av egnede Src-kodende nukleinsyrer vil lett innsees av den fagkyndige på området.

2. Ekspresjonsvektorer

Oppfinnelsen medomfatter et rekombinant DNA-molekyl (rDNA) inneholdende et DNA-segment som koder for et Src-protein som beskrevet heri. En uttrykkbar rDNA kan fremstilles ved operativt (i ramme, uttrykkbart) å knytte en vektor til et Src-kodende DNA-segment ifølge den foreliggende oppfinnelse. Således er et rekombinant DNA-molekyl et hybrid-DNA-molekyl omfattende minst to nukleinsyrer av nukleotidsekvenser som normalt ikke finnes sammen i naturen.

Valget av vektor hvortil et DNA-segment ifølge den foreliggende oppfinnelse knyttes operativt avhenger direkte, som vel kjent på dette området, av de funksjonelle egenskaper som ønskes, f.eks. proteinekspresjon, og vertcellen som skal transformeres. Dette er typiske betraktninger ved metodologien for å konstruere rekombinante DNA-molekyler. En vektor som tas i betraktning ved den foreliggende oppfinnelse er i det minste i stand til å dirigere replikasjonen og foretrukket også ekspresjonen, av et strukturert gen inkludert i vektor-DNA-segmentene, hvortil den er operativt knyttet.

En person med vanlig fagkyndighet innen vektorkonstruksjon vil være fortrolig med både prokaryotiske og eukaryotiske ekspresjonsvektorer, og slike er beskrevet av Ausebel, et al., i Current Protocols in Molecular Biology. Wilev and Sons, New York

(1993) og av Sambrook et al., Molecular Clonin<g>: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, (1989). Disse referanser beskriver også mange av de generelle rekombinante DNA-metoder som det er referert til heri.

I en utførelsesform inkluderer vektoren som anvendes i foreliggende oppfinnelse et prokaryotisk replikon, d.v.s. en DNA-sekvens med evne til å dirigere autonom replikasjon og opprettholdelse av det rekombinante DNA-molekyl ekstrakromosomalt i en prokaryotisk vertcelle, som for eksempel en bakterievertcelle transformert dermed. Slike replikoner er vel kjent innen området. I tillegg inkluderer også de utførelsesformer som inkluderer et prokaryotisk replikon også et gen hvis ekspresjon medfører medikamentresistens til en bakterievert transformert dermed. Typiske bakterielle gener for medikamentresistens er dem som gir resistens mot ampicillin eller tetracyklin.

De vektorer som inkluderer et prokaryotisk replikon kan også inkludere en prokaryotisk promoter i stand til å dirigere ekspresjonen (transkripsjon og translasjon) av et strukturelt gen i en bakterievertcelle, som for eksempel E. coli. transformert dermed. En promoter er et ekspresjonskontrollelement dannet av en DNA-sekvens som tillater at det opptrer binding av RNA-polymerase og transkripsjon. Promotersekvenser som er forlikelige med bakterieverter tilveiebringes typisk i plasmidvektorer inneholdende passende restriksjonsseter for innsetting av et DNA-segment ifølge den foreliggende oppfinnelse. Typisk for slike vektorplasmider er pUC8, pUC9, pbR322 og pBR329 som kan fås fra Biorad Laboratories, (Richmond, CA), pRSET som kan fåes fra

Invitrogen(San Diego, CA) og pPL og pKK223 som kan fåes fra Pharmacia, Piscataway,

N.J.

Ekspresjonsvektorer som er forlikelige med eukaryotiske celler, foretrukket dem som er forlikelig med virveldyrceller, kan også anvendes for å danne de rekombinante DNA-molekyler som anvendes i den foreliggende oppfinnelse. Eukaryotiske celle-ekspresjonsvektorer er vel kjent på området og kan fås fra flere kommersielle kilder. Typisk tilveiebringes slike vektorer inneholdende passende restriksjonsseter for insetting av det ønskede DNA-segment. Typisk for slike vektorer er pSVL og pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-l/pML2d (International Biotechnologies, Inc.), pTDTl (ATCC, # 31255), pRc/CMV (Invitrogen, Inc.), den foretrukne vektor beskrevet i eksemplene, og liknende eukaryotiske ekspresjonsvektorer.

Et særlig foretrukket system for genekspresjon inkluderer en gentilførselskomponent, d.v.s. evnen til å tilføre genet til vevet av interesse. Egnede vektorer er "infeksiøse" vektorer som for eksempel rekombinante DNA-virus, adenovirus eller retrovirusvektorer som konstrueres til å uttrykke det ønskede protein og ha trekk som tillater infeksjon av forut valgte målvev. Særlig foretrukket er det replikasjonskompetente fuglesarkomvirus (RCAS) beskrevet heri.

Mammaliacellesystemer som utnytter rekombinante virus eller virale elementer for å dirigere ekspresjon kan konstrueres. For eksempel, når det anvendes adenovirus-ekspresjonsvektorer, kan den kodende sekvens av et polypeptid ligeres til et adenovirus transkripsjons/translasjonskontroHkompleks, f.eks. den siste promoter og trepartite ledersekvens. Dette kimeriske gen kan så settes inn i adenovirusgenomet ved in vitro eller in vivo rekombinasjon. Innskyting i en ikke-essensiell region av det virale genom (f.eks. region El eller E3) vil resultere i et rekombinant virus som er levedyktig og i stand til å uttrykke polypeptidet i infiserte verter (f.eks. se Logan et al., Proe. Nati. Acad. Sei.. USA. 81:3655-3659 (1984)). Alternativt kan det anvendes vaccinia virus 7.5K promoter (f.eks. se Mackett et al.. Proe. Nati. Acad. Sei.. USA 79:7415-7419

(1982); Mackett et al., J. Virol.. 49:857-864 (1984); Panicali et al., Proe. Nati. Acad. Sei.. USA. 79:4927-4931 (1982)). Av særlig interesse er vektorer basert på bovine papillomvirus som har evnen til å replikeres som ekstrakromosomale elementer (Sarver et al.. Mol. Cell. Biol. 1:486 (1981)). Kort etter innføringen av dette DNA i målcellene replikerer plasmidet til omtrent 100 til 200 kopier pr celle. Transkripsjon av det innskutte cDNA krever ikke integrasjon av plasmidet i vertens kromosom slik at det gir et høyt ekspresjonsnivå. Disse vektorer kan anvendes for stabil ekspresjon ved å inkludere en selekterbar markør i plasmidet, som for eksempel neogenet. Alternativt kan det retrovirale genom modifiseres for bruk som en vektor i stand til å innføre og dirigere ekspresjonen av den polypeptidkodende nukleotidsekvens i vertceller (Cone et al., Proe. Nati. Acad. Sei.. USA. 81:6349-6353 (1984)). Høynivåekspresjon kan også oppnås ved bruk av induserbare promotere, inkluderende, men ikke begrenset til metallotionin HA-promoter og varmesjokkpromoterer.

Nylig er overlevelse av cytomegalovirus (CMV) promoter versus Rous sarkomvirus (RSV) promoter-drevet tymidin kinase (TK) genterapi i hårløse mus med en human ovarial cancer blitt undersøkt. Celledrepende effektivitet ved adenovirusmediert CMV-promoterdrevet herpes simplex virus TK-genterapi ble funnet å være 2 til 10 ganger mer effektiv enn RSV-drevet terapi (Tong et al., 1999, Hvbridoma 18(l):93-97). Konstruksjonen av kimeriske promotere for genterapianvendelser, som krever lavnivåekspresjon etterfulgt av induserbar høynivåekspresjon er også beskrevet i (Suzuki et al., 1996, Human Gene Therapy 7:1881-1893).

For langvarig, høyutbytteproduksjon av rekombinante proteiner foretrekkes stabil ekspresjon. Snarere enn å bruke ekspresjonsvektorer som inneholder virale kilder for replikasjon kan vertceller transformeres med et cDNA kontrollert ved hjelp av passende ekspresjonskontollelementer (f.eks. promoter- og forsterkersekvenser, transkripsjons-terminatorer, polyadenylasjonsseter, etc.) og en selekterbar markør. Som nevnt i det foregående gir den selekterbare markør i det rekombinante plasmid resistens til seleksjonen og tillater celler stabilt å integrere plasmidet i sine kromosomer og vokse til å danne foki som i sin tur kan klones og ekspanderes til cellelinjer.

For eksempel, etter innføringen av fremmed DNA, kan konstruerte celler få vokse i 1-2 dager i et anriket medium og så overføres til et selektivt medium. Et antall seleksjonssystemer kan anvendes, inklusive, men ikke begrenset til, herpes simplex virus tymidin kinase (Wigler et al., Cell. 11:223 (1977)), hypoksantin-guaninfosforibosyl-transferase (Szybalska et al, Proe. Nati. Acad. Sei.. USA 48:2026

(1962)), og adeninfosforibosyltransferase (Lowy et al., Cell. 22:817 (1980)) gener, som kan anvendes i henholdsvis tk", hgprt" eller aprt" celler. Antimetabolitt resistensgivende gener kan også anvendes som basis for seleksjon; for eksempel genene for dhfr som gir resistens til metotreksat (Wigler et al., Proe. Nati. Acad. Sei.-. USA. 77:3567 (1980); 0'Hare et al., Proe. Nati. Acad. Sei.. USA. 78:1527 (1981); gpt, som gir resistens for mykofenolsyre (Mulligan et al, Proe. Nati. Acad. Sei.. USA. 78:2072, (1981)); neo, som gir resistens til aminoglykosidet G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol.. 150:1

(1981)); og hygro, som gir resistens til hygromycin (Santerre et al., Gene. 30:147

(1984)). Nylig er det beskrevet ytterligere selekterbare gener, nemlig trpB, som tillater at celler kan utnytte indol i stedet for tryptofan; hisD, som tillater at celler kan anvendes histinol i stedet for histidin (Hartman et al., Proe. Nati. Acad. Sei.. USA. 85:804

(1988)); og ODC (ornitin dekarboksylase) som gir resistens til orinitin dekorboksylase-inhibitor, 2-(difluorometyl)-DL-ornitin, DFMO (McConlogue L., I: Current communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory utg., (1987)).

De prinsipale vektorer tiltenkt human genterapi er avledet fra retroviral opprinnelse.

(Wilson, 1997, Clin. Exp. Immunol. 107fSup. l):31-32; Bank et al., 1996, Bioessavs

18(12):999-1007; Robbins et al., 1998, Pharmacol. Ther. 80(l):35-47). Det terapeutiske potensiale for genoverføirngsterapi og antisensterapi har stimulert utviklingen av mange vektorsystemer for behandling av en rekke forskjellige vev. (Vasculature, Stephan et al., 1997, Fundam. Clin. Pharmacol. 11(2):97-110; Feldman et al., 1997, Cardiovas. Res. 35(3):391.404; Vassalli et al., 1997, Cardiovasc. Res. 35(3):459-69; Baek et al., 1998, Circ. Res. 82(3):295.305; nyre, Lien et al., 1997, Kidnev Int. Su<pp>l. 61 :S85-8; lever, Ferry et al., 1998, Human Gene Ther. 9(14^:1975-81: muskel, Marshall et al., 1998, Curr. Opn. Genet. Dev. 8(3):360-5). I tillegg til disse vev er et kritisk mål for human genterapi cancer, enten selve tumoren eller assosierte vev. (Runnebaum, 1997, Anticancer Res. 17(4B):2887-90: Spear et al., 1998, J. Neurovirol. 4(2):133-47).

Spesifikke eksempler på viral genterapi-vektorsystemer som lett kan tilpasses for bruk ved anvednelsen ifølge den foreliggende oppfinnelse er kort beskrevet i det følgende. Retroviral gentilførsel er nylig studert av Federspiel og Huges (1998), Methods in Cell Biol. 52:179-214) som spesielt beskriver fugle-leukosevirus (ALV) retrovirus-familie (Federspiel et al., Proe. Nati. Acad. Sei.. USA. 93:4931 (1996); Federspiel et al., Proe. Nati. Acad. Sei.. USA. 91:11241 (1994)). Retrovirale vektorer, inklusive ALV og muse-leukemivirus (MLV) er videre beskrevet av Svoboda (1998, Gene 206:153-163).

Modifiserte retrovirale/adenovirale ekspresjonssystemer kan lett tilpasses for utøvelse ved anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelse. For eksempel er muse-leukemivirus (MLV) systemer vurdert av Karavanas et al., 1998, Crit. Rev.- in Pncology/ Hematology 28:7-30. Adenovirusekspresjonssystemer er vurdert av Von Seggern og Nemerow i Gene Expression Systems ( utg. Fernandes & Hoeffler, Academic Press, San Diego, CA, 1999, kapittel 5, sider 112-157).

Proteinekspresjonssystemer er vist å være til effektiv nytte både in vivo og in vitro. For eksempel er effektiv genoverføring av et herpes simplex virus (HSV) type 1 amplikonvektor til humane skiveepitelcellekarsinomer beskrevet (Carew et al., 1998, Am.. J. Surg. 176:404-408). Herpes simplex virus har vært anvendt for genoverføring til nervesystemet. (Goins et al., 1997, J. Neurovirol. 3 (Syp. l):S80-8). Målinnrettede suisidale vektorer, ved bruk av HSV-TK, er testet på faste tumorer. (Smiley et al., 1997, Hum. Gene Ter. 8(8):965-77). Herpes simplex virus type 1 vektor har vært anvendt for cancer-genterapi på kolon-karsinomceller (Yoon et al., 1998, Ann. Sur<g>. 228(3):366-74). Hybride vektorer har vært utviklet for å forlenge transfeksjonsperioden, inklusive HSV/AAV (adeno-assosiert virus) hybrider for behandling av hepatocytter. (Fraefel et al., 1997. Mol. Med. 3(12):813-825).

Vaccinia-virus er blitt utviklet for human genterapi på grunn av dets store genom.

(Peplinski et al., 1998. Sur<g.> Oncol. Clin. N. Am. 7(3):575-88). Thymidinkinasedeletert vaccinia-virus som uttrykker purin-nukleosid-pyrofosforylase er blitt beskrevet for bruk som en tumorrettet genterapivektor (Puhlman et al., 1999, Human Gene Therapv 10:649-657).

Adeno-assosiert virus 2 (AAV) er blitt beskrevet for bruk i human genterapi, men AAV krever et hjelpervirus (som f.eks. adenovirus eller herpesvirus) for optimal replikasjon og pakking i mammaliaceller. (Snoeck et al., 1997, Exp. Nephrol. 5(6):514-20; Rabinowitz et al., 1998, Curr. Opn. Biotechnol. 9(5V.470-5). In vitro pakking av et infeksisøst rekombinant AAV er imidlertid beskrevet og gjør dette system mye mer lovende (Ding et al., 1997, Gene Therapv 4:1167-1172). Det er blitt vist at den AAV-medierte overføring av ekotrop retrovirusreseptor-cDNA tillater ekotrop retroviral transduksjon av etablerte og primære humanceller (Qing et al., 1997, J. Virology 71(7):5663-5667). Cancer-genterapi ved bruk av en AAV-vektor som uttrykker human villtype p53 er blitt demonstrert. (Qazilbash et al., 1997, Gene Thera<p>v 4:675-682). Genoverføring inn i vaskulære celler ved bruk av AAV-vektorer er også blitt vist (Maeda et al., 1997, Cardiovaskular Res. 35:514-521). AAV er blitt påvist som en egnet vektor for lever-rettet genterapi. (Xiao et al., 1998, J. Virol. 72(12): 10222-6). AAV-vektorer er blitt påvist for bruk i genterapi av hjernevev og sentralnervesystemet (Chamberlin et al., 1998, Brains Res. 793(l-2):169-75; During et al., 1998, Gene Therapv 5(6):820-7). AAV-vektorer er også blitt sammenliknet med adenovirusvektorer (AdV) for genterapi av lungen og overføring til humane cystisk fibrose epiteliale celler.

(Teramoto et al., 1998, J. Virol. 72(11):8904-12).

Kimerisk AdV/retroviral genterapi-vektorsystemer som innlemmer de nyttige kvaliteter av hvert virus for å skape et ikke-integrativt AdV som gjøres funksjonelt integrativt via den intermediære generasjon av en retroviral produser-celle. (Feng et al-, 1997, Nat. Biotechnoloev 15(9(:866-70; Bilbao et al., 1997. FASEB J 11(8):624-34). Denne kraftige nye generasjon av genterapivektor er blitt tilpasset for målrettet cancergenterapi (Bilbao et al., 1998. Adv. Exp. Med. Biol. 451:365-74). Enkel injeksjon av AdV-uttrykkende p53 inhiberte vekst av subkutane tumornoduler av human prostrate cancerceller. (Asgari et al., 1997, Int. J. Cancer 71(3):377-82). AdV-mediert genoverføring av villtype p53 i pasienter med fremskreden ikke-småcellet lungecancer er blitt beskrevet. (Schuler et al., 1998, Human Gene Therapv 9:2075-2082). Denne samme cancer er blitt underkastet p53 generstatningsterapi mediert ved AdV-vektorer.

(Roth et al., 1998, Semin. Oncol. 25(3 Suppl 8);33-7). AdV-mediert genoverføring av p53 inhiberer endoterial celledifferensiering og angiogenese in vivo. (Riccioni et al., 1998, Gene Ther. 5(6):747-54). Adenovirus-mediert uttrykking av melanom antigen gp75 som immunterapi for metastatisk melanom er også beskrevet. (Hirschowitz et al., 1998, Gene Therapv 5:975-983). AdV letter infeksjon av humane celler med ekotropt retrovirus og øker effektiviteten av retroviral infeksjon (Scott-Taylor, et al., 1998, Gene Ther. 5(5):621-9). AdV-vektorer har vært anvendt for genoverføring til vaskulære galtte muskelceller (Li et al., 1997, Chin. Med. J. ( Engl) 110(12'):950-4). skvamøse celle-karsinomceller (Goebel et al., 1998, Otolarvnol Head Neck Surg 119(4):331-6), øsofagale cancerceller (Senmaru et al., 1998, Int. J. Cancer 78(3):366-71), mesangial celler (Nahman et al, 1998, J. Investi<g>. Med. 46(5)204-9), gliale celler (Chen et al., 1998, Cancer Res. 58(16):3504-7). og til leddene i dyr (flceda et al., 1998, J. Rheumatol. 25(9): 1666-73). Mer nylig er kateterbasert perikardial genoverføring mediert ved AcV-vektorer demonstrert (March et al., 1999, Clin Cardiol. 22(1 Suppl 1): 123-9). Manipulasjon av AdV-systemet med de riktige kontrollerende genetiske elementer tillater den AdV-medierte regulerbare mål-genekspresjon in vivo. (Burcin et al., 1999, PNAS ( USA) 96(2):355-60).

Alpha-virusvektorer er blitt utviklet for human genterapianvendelser, med pakkende cellelinjer egnet for transformasjon med ekspresjonskassetter egnet for bruk med sinbis-virus og Semliki Forest virusavledede vektorer. (Polo et al., 1999, Proe. Nati. Acad. Sei.. USA. 96:4598-4063). Dcke-cytopatisk flavivirus replikon RNA-baserte systemer er også blitt utviklet. (Varnavski et al., 1999, Virology 255(2):366-75). Suisid HSV-TK-gen inneholdende sinbis-virusvektorer har vært anvendt for cellespesifikk målretting inn i tumorceller. (Iijima et al., 1998, Int. J. Cancer 80(1): 110-8).

Retrovirale vektorer basert på human skumaktig ("foamy") virus (HFV) viser seg også lovende som genterapivektorer (Trobridge et al., 1998, Human Gene Therapv 9:2517-2525). Skumaktige virusvektorer er blitt konstruert for suisidal genterapi (Nestler et al., 1997, Gene Ther. 4(11): 120-7). Rekombinant muse-cytomegalovirus og promoter-systemer har også vært anvendt som vektorer for høynivåekspresjon (Manning et al., 1998, J. Virol. Meth. 73(l):31-9; Tong et al., 1998, Hvbridoma 18(l):93-7).

Gentilførsel inn i ikke-delende celler er blitt gjort mulig ved utvikling av Sendai-virusbaserte vektorer. (Nakanishi et al., 1998, J. Controlled Release 54(l):61-8).

I andre forsøk på å muliggjøre transformasjon av ikke-delende somatiske celler, er lentivirale vektorer blitt undersøkt. Genterapi av cystisk fibrose ved bruk av en replikasjondefektivt human immunodefisiensvirus (HIV) basert vektor har vært beskrevet. (Goldman et al., 1997, Human Gene Therapv 8:2261-2268). Vedholdende ekspresjon av gener innført i lever og muskel ved hjelp av lentivirale vektorer har også vært vist Kafri et al., 1997, Nat. Genet. 17(3):314-7). Sikkerhetshensyn er imidlertid overveiende og forbedret vektorutvikling skjer raskt. (Kim et al., 1998, J. Virol. 72(2):994-1004). Undersøkelse av HIV LTR og Tat gir viktig informasjon om organiseringen av genomet for utvikling av vektorer. (Sadaie et al., 1998, J. Med. Virol. 54(2): 118-28). De genetiske krav for en effektiv HIV-basert vektor er således nå bedre forstått. (Gasmi et al., 1999, J. Virol. 73(3): 1828-34). Selvinaktiverende vektorer, eller kondisjonale pakkende cellelinjer er blitt beskrevet. (For eksempel Zufferey et al., 1998, J. Virol. 72(12):9873-80; Miyoshi et al., 1998, J. Virol. 72(10):8150-7; Dull et al., 1998, J. Virol. 72(11):8463-1; og Kaul et al., 1998, Virology 249(1): 167-74). Effektiv transduksjon av humane lymfocytter og CD34+-celler ved hjelp av HIV-vektorer er blitt vist. (Douglas et al. 1999, Hum Gene Ther. 10(6):935-45; Miyoshi et al., 1999, Science 283(5402):682-6). Effektiv transduksjon av ikke-delende humane celler ved hjelp av katte-immunodefisiensvirus (FIV) lentiviral vektorer er blitt beskrevet, noe som nedsetter sikkerhetsbekymringene ved bruk av HIV-baserte vektorer. (Poeschla et al., 1998, Nature Medicine 4(3):354-357). Produktiv infeksjon av humant blod-mononukleære celler ved FIV-vektorer er blitt vist. (Johnston et al., 1999, J. Virol. 73(3):2491-8).

Mens mange virale vektorer er vanskelig å håndtere og kapasiteten for innsatt DNA begrenset, er disse begrensninger og mangler blitt forsøkt avhjulpet. For eksempel, i tillegg til forenklede virale pakkende cellelinjer er minivirale vektorer, avledet fra humant herpes virus, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) og Epstein-Barr virus (EBV) blitt utviklet for å forenkle håndteringen av genetisk materiale og generering av virale vektorer. (Wang et al., 1996, J. Viroloev 70(12):8422-8430). Adaptorplasmider er tidligere blitt vist å forenkle insetting av fremmed DNA i hjelper-uavhengige retrovirale vektorer. (1987, J. Viroloev 61(10):3004-3012).

Virale vektorer er ikke de eneste midler for å gjennomføre genterapi, ettersom flere ikke-virale vektorer også er blitt beskrevet. En ikke-målrettet ikke-viral gentilførselsvektor basert på bruken av epidermal vekstfaktor ("Epidermal Growth Factor")/DNA polyplex (EGF/DNA) er blitt vist å resultere i effektiv og spesifik gentilførsel. (Cristiano, 1998, Anticancer Res. 18:3241-3246). Genterapi av vaskulaturen og CNS er blitt vist ved bruk av cationiske liposomer. (Yang et al., 1997, J. Neurotrauma 14(5):281-97). Transient genterapi av pankreatitt er også blitt fullført ved bruk av kationiske liposomer. (Denham et al., 1998, Ann. Surg. 227(6):812-20). Kitosanbasert vektor/DNA-komplekser for gentilførsel er også blitt vist å være effektive. (Erbacher et al., 1998, Pharm. Res. 15(9): 1332-9). En ikke-viral DNA-tilførselsvektor basert på et terplex-system er også blitt beskrevet (Kim et al., 1998, 53(1-3): 175-82). Viruspartikkelbelagte liposomkomplekser har også vært anvendt for å gjennomføre genoverføring (Hirai et al., 1997, Biochem. Bioph<y>s, Res. Commun. 241(l):112-8).

Cancer-genterapi ved direkte tumorinjeksjoner av ikke-viralt T7-vektor som koder for et tymidin-kinasegen er blitt vist. (Chen et al., 1998, Human Gene Thera<p>v 9:729-736). Plasmid-DNA-rfemstilling er viktig for direkte injeksjon-genoverføring. (Horn et al., 1995, Hum. Gene Ther. 6(5'):656-73V Modifiserte plasmidvektorer er blitt tilpasset spesifikt for direkte injeksjon. (Hartikka et al., 1996, Hum. Gene Ther. (7(10):1205-17V

Således er en lang rekke forskjellige genoverførings/genterapivektorer og konstruksjoner kjent på området. Disse vektorer blir lett tilpasset for bruk ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse. Med den passende behandling ved bruk av rekombinant DNA/molekylær biologimetode til å sette inn operativt knyttet Src (enten aktivt eller inaktivt) inn i den valgte ekspresjons/tilførselsvektor, kan mange ekvivalente vektorer for utøvelse av den foreliggende oppfinnelse genereres.

E. Metoder for modulering av angiogenese

Oppfinnelsen tilveiebringer en farmasøytisk sammensetning for potensiering av angiogenese i et vev assosiert med en sykdomstilstand. Generelt omfatter behandlingen at vevet som er assosiert med en sykdomsprosess eller tilstand tilføres en blanding omfattende en angiogenesepotensierende mengde av et Src-protein eller en nukleinsyrevektor.

Som beskrevet deri kan hvilke som helst av en rekke forskjellige vev, eller organer bestående av organisert vev, underholde angiogenese i sykdomstilstander inklusive hud, muskler, innvoller, bindevev, ledd, ben og liknende vev, hvori blodkar kan invadere etter angiogene stimuli.

Pasienten som behandles ved den foreliggende oppfinnelse i sine mange utførelsesformer er ønskelig en human pasient, selv om det skal forstås at oppfinnelsens prinsipper indikerer at oppfinnelsen er effektiv med hensyn til alle mammalia, som menes å inkluderes i betegnelsen "pasient". I denne sammenheng skal mammalia forstås å inkludere hvilke som helst mammalia-spesies, hvori behandling av vev assosiert med sykdommer som involverer angiogenese er ønskelig, særlig landbruks- og tamme mammaliaspesies.

Doseområdene for tilførselen av et Src-protein avhenger av formen av proteinet og dets potens, som beskrevet videre heri, og er mengder som er store nok til å frembringe den ønskede virkning hvori angiogenese og sykdomssymptomene mediert ved angiogenesen avhjelpes. Dosen bør ikke være så stor at den bevirker skadelige bivirkninger, som hyperviskositetssyndromer, pulmonær edem, kongestiv hjertesvikt og liknende. Generelt vil dosen variere med alder, tilstand, kjønn og alvorligheten av sykdommen i pasienten og kan bestemmes av en fagkyndig på området. Dosen kan også reguleres av den enkelte lege i tilfellet av enhver komplikasjon.

En terapeutisk effektiv mengde er en mengde av Src-protein, eller nukleinsyre som koder for (aktivt eller inaktivt) Src-protein, tilstrekkelig til å frembringe en målbar potensiering av angiogenese i vevet som behandles, d.v.s. en angiogenesepotensierende mengde. Potensiering av angiogenese kan måles ved hjelp av CAM-analyse som beskrevet heri, eller ved hjelp av andre metoder kjent for den fagkyndige på området.

Src-protein- eller nukleinsyrevektoren som uttrykker Src-proteinet kan tilføres parenteralt med injeksjon eller ved gradvis infusjon over tid. Selv om vevet som skal behandles typisk kan nås i kroppen ved systemisk tilførsel og derfor oftest blir behandlet ved intravenøs tilførsel av terapeutiske blandinger, er andre vev og tilførselsmåter påtenkt hvor der er en sannsynlighet for at det målsøkte vev inneholder målmolekylet. Således kan blandinger ifølge oppfinnelsen tilføres intravenøst, intraperitonialt, intramuskulært, subkutant, intrakavitetsmessig, transdermalt og kan tilføres ved jelp av peristaltiske midler.

De terpeutiske blandinger inneholdende et Src-protein- eller nukleinsyrevektor som uttrykker Src-proteinet kan konvensjonelt tilføres intravenøst, som for eksempel ved injeksjon av en enhetsdose. Betegnelsen "enhetsdose" når den anvendes med henvisning til en terapeutisk blanding ifølge den foreliggende oppfinnelse refererer til fysisk separate enheter egnet som enhetsdoser for individidet, idet hver enhet inneholder en forut bestemt mengde av aktivt materiale beregnet til å frembringe den ønskede terapeutiske virkning i assosiasjon med det nødvendige fortynninsmiddel, d.v.s. bærer-eller konsistensmiddel.

Ved en foretrukket utførelsesform tilføres reagenset intravenøst i en enkelt dose. Lokalisert tilførsel kan gjennomføres ved direkte injeksjon eller ved å benytte fordelen med anatomisk isolerte avdelinger, isolering av mikrosirkulasjonen i målorgansystemer, reperfusjon i et sirkulerende system, eller kateterbasert temporær okklusjon av målregioner av vaskulator assosiert med sykdomsangrepet vev.

Blandingene tilføres på en måte som er forlikelig med dosesammensetningen og i en terapeutisk effektiv mengde. Den mengde som skal tilføres og tidsforløpet avhenger av det individ som skal behandles, kapasiteten av individets system til å utnytte den aktive bestanddel, og graden av terapeutisk virkning som ønskes. Nøyaktige mengder av aktiv bestanddel som det er nødvendig å tilføre avhenger av legens skjønn og er spesielle for hvert individ. Egnede doseområder for systemisk tilførsel er imidlertid angitt heri og avhenger av tilførselsmåten. Egnede regimer for tilførsel er også variable, men typeangis ved en initial tilførsel fulgt av gjentatte doser med en eller flere timers intervall ved en etterfølgende injeksjon eller annen tilførsel. Alternativt er kontinuerlig intravenøs infusjon tilstrekkelig til å opprettholde konsentrasjoner i blodet i områdene angitt for in vivo terapier påtenkt.

2. Potensiering av angiogenese

I tilfeller hvor det er ønskelig å fremme eller potensiere angiogenese er tilføresel av et aktivt Src-protein til vevet nyttig.

F. Terapeutiske blandinger

Den foreliggende oppfinnelse medomfatter terapeutiske blandinger nyttig for utøvelse av de terapeutiske anvendelsene beskrevet heri. Terapeutiske blandinger ifølge den foreliggende oppfinnelse inneholder en fysiologisk tålbar bærer sammen med et Src-protein eller vektor i stand til å uttrykke et Src-protein som beskrevet heri, oppløst eller dispergert deri som en aktiv bestanddel. Med en foretrukket utførelsesform er det terapeutiske blanding ikke immunogen når den tilføres en pattedyr- eller human-pasient for terapeutiske formål.

Som anvendt heri anvendes betegnelsene "farmasøytisk tålbar", "fysiologisk tålbar" og grammatiske variasjoner derav, når de refererer til blandinger, bærere, fortynningsmidler og reagenser, om hverandre og representerer at materialene kan tilføres til eller på et pattedyr uten frembringelse av uønskede fysiologiske virkninger som kvalme, matthet, maveubehag og liknende.

Fremstillingen av en farmakologisk blanding som inneholder aktive bestanddeler oppløst eller dispergert deri er vel forstått på området og behøver ikke begrenses ut fra sammensetningen. Typisk fremstilles slike blandinger som injiserbare enten som flytende oppløsninger eller suspensjoner, men faste former egnet for oppløsning eller suspensjoner i væske før bruken kan også fremstilles. Preparatet kan også emulgeres eller bringes til å foreligge som en liposom blanding.

Den aktive bestanddel kan blandes med konsistensmidler som er farmasøytisk tålbare og forlikelige med den aktive bestanddel og i mengder egnet for bruk ved de terapeutiske anvedelser beskrevet heri. Egnede konsistensmidler er for eksempel vann, saltløsning, dekstrose, glyserol, etanol eller liknende og kombinasjoner derav. I tillegg kan blandingene om ønsket inneholde mindre mengder av hjelpestoffer som fukte- eller emulgeringsmidler, pH-buffermidler og liknende som øker effektiviteten av den aktive bestanddel.

Den terapeutiske blanding ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan inkludere farmasøytisk tålbare salter av komponentene deri. Farmasøytisk tålbare salter inkluderer syreaddisjonssaltene (dannet med de fri aminogrupper i polypeptidet) som dannes med uorganiske syrer som for eksempel saltsyre eller fosforsyre, eller slike organiske syrer som eddiksyre, vinsyre, mandelsyre og liknende. Salter dannet med de fri karboksylgrupper kan også avledes fra uorganiske baser som for eksempel natrium, kalium, ammonium, kalsium eller ferrhydroksider, og slike organiske baser som isopropylamin, trimetylamin, 2-etylaminoetanol, histidin, prokain og liknende.

Fysiologisk tålbare bærere er vel kjent på området. Eksempler på flytende bærere er sterile vandige oppløsninger som ikke inneholder noen materialer i tillegg til de aktive bestanddeler og vann, eller inneholder en buffer som natriumfosfat med fysiologisk pH-verdi, fysiologisk saltløsning eller begge deler, som fosfatbufret saltløsning. Ennå ytterligere kan vandige bærere inneholde mer enn ett buffersalt, såvel som salter som natrium- eller kaliumklorider, dekstrose, polyetylenglykol og andre soluter.

Flytende blandinger kan også inneholde flytende faser i tillegg til og for eksklusjon av vann. Eksempler på slike ytterligere flytende faser er glyserol, vegetabilske oljer som bomullsfrøolje, og vann-olje-emulsjoner.

En terapeutisk blanding inneholder en angiogenesepotensierende mengde av et Src-protein ifølge den foreliggende oppfinnelse, eller tilstrekkelig rekombinant DNA-ekspresjonsvektor for å uttrykke en effektiv mengde av Src-protein, typisk sammensatt til å inneholde en mengde på minst 0.1 vekt% Src-protein regnet i forhold til vekten av den totale terapeutiske blanding. Vekt% er her forholdet mellom vekt av Src-protein og total blanding. Således er for eksempel 0.1 vekt% 0.1 gram Src-protein pr 100 gram total blanding. For DNA-ekspresjonsvektorer avhenger den tilførte mengde av egenskapene av ekspresjonsvektoren, det vev som skal behandles og liknende betraktninger.

G. Produksjonsartikkel

En produksjonsartikkel er en merket beholder inneholdende et Src-protein ifølge oppfinnelsen. En produksjonsartikkel omfatter emballasjemateriale og et farmasøytisk middel inneholdt i emballasjematerialet.

Det farmasøytiske middel i en produksjonsartikkel er hvilke som helst av blandingene ifølge den foreliggende oppfinnelse egnet for å tilveiebringe et Src-protein og sammensatt i en farmasøytisk tålbar form som beskrevet heri ifølge de angitte indikasjoner. Blandingen kan således omfatte et Src-protein eller et DNA-molekyl som er i stand til å uttrykke et Src-protein. Produksjonsartikkelen inneholder en mengde farmasøytisk middel tilstrekkelig for bruk ved behandling av en tilstand angitt heri, enten i enhetsdoseform eller i form av flere doser.

Emballasjematerialet omfatter en merking som angir bruken av det farmasøytiske

middel inneholdt deri, for eksempel for behandling av tilstander assistert ved inhibering eller potensiering av angiogenese og liknende tilstander omhandlet heri. Merkingen kan videre inkludere instruksjoner for bruk og relatert informasjon som kan være nødvendig for markedsføring. Emballasjematerialet kan inkludere en eller flere beholdere for

lagring av det farmasøytiske middel.

Som anvendt heri refererer betegnelsen emballasjemateriale til et materiale som glass, plast, papir, folie og liknende i stand til å holde et farmasøytisk middel innenfor faste grenser. Emballasjematerialet kan for eksempel være hetteglass av plast eller glass, laminerte konvolutter og liknende beholdere anvendt for å inneholde en farmasøytisk blanding som inkluderer i det farmasøytiske middel.

I foretrukne utførelsesformer inkluderer emballasjematerialet en etikett som er et konkret uttrykk som beskriver innholdet av produksjonsartikkelen og bruken av det farmasøytiske middel inneholdt deri.

Eksempler

De følgende eksempler som vedrører denne oppfinnelse er illustrerende. Videre skal slike variasjoner av oppfinnelsen, som nå er kjent eller utvikles senere, og som ville være innenfor oversikten av en fagkyndig på området, betraktes som fallende innenfor rammen for den foreliggende oppfinnelse som er angitt i de etterfølgende patentkrav.

1. Fremstilling av c-Src-ekspresjonskonstruksjoner

For å fremstille ekspresjonskonstruksjonene nyttig ved potensiering av angiogenese ved anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelse, blir c-Src cDNA manipulert og innført i en ekspresjonskonstruksj on/vektor.

cDNA-sekvensen som koder for villtype (d.v.s. endogent) kylling c-Src er vist i FIG. 1 (SEQ ID NO.:2) med den kodede aminosyrerestsekvens vist i Fig. 2 (SEQ ID NO.:3). Den kodede proteinsekvens er translatert fra cDNA-nukleotidposisjonene 112 til 1713. Nukleinsyresekvensen tilsvarende nukleinsyresekvensen av human c-Src cDNA (SEQ ID NO.:4) og de kodede aminosyrerester (SEQ ID NO.:5) sekvenser er vist i henholdsvis FIG. 3 og 4. For den humane proteinsekvens begynner den kodende sekvens ved nukleotidposisjon 134 til 1486 av cDNA.

Villtype såvel som et antall muterte c-Src cDNA ble fremstilt. Muterte c-Src-konstruksjoner ble fremstilt ved seterettet mutagenese som beskrevet av Kaplan et al., EMBOJ., 13:4745-4756 (1994). De muterte c-Src-kontruksjoner for koding av muterte c-Src-proteiner for anvendelse ifølge den foreliggende oppfinnelse er beskrevet i Kaplan et al. Id Kaplan et al. beskriver forskjellige muterte c-Src-konstruksjoner og kodede proteiner til nytte ved utøvelsen av denne oppfinnelse. For eksempel avbilder Kaplan et al. flere produkter av kylling c-Src-alleler i deres FIG. 1, inklusive SrcA og Src251. Det er to kategorier av c-Src-funksjon for å modulere angiogenese. Som drøftet tidligere inneholder en kategori Src-molekyler som øker angiogenese og er således ansett å være aktive proteiner. Villtype-Src sammen med forskjellige mutasjoner er ved den foreliggende oppfinnelse vist å indusere angiogenese. En foretrukket mutasjon av villtype-c-Src som virker i denne forbindelse med hensyn til sin evne til å indusere blodkarvekst og derfor øke tumorvekt in vivo er Src A-mutanten med en punktmutasjon ved aminosyre (aa) restposisjon 527 som endrer tyrosin 527 til fenylalanin. Dette setet er normalt et sete for negativ regulering av c-Src-kinase, referert til som kinase-CSK. Når CSK fosforylerer aa527 i villtype-Src, inaktiveres proteinet. I mutert Src A, er regulatortyrosinet omdannet til fenylalanin slik at proteinet blir et konstitutivt (d.v.s. permanent) aktivt protein som ikke er utsatt for inaktivering ved fosforylasjon.

Mutasjoner i Src er også blitt vist å ha den motsatte modulerende virkning på angiogenese og inhibere angiogenese i stedet for å stimulere denne. Slike mutasjoner er referert til som inaktive Src-mutasjoner. Proteiner med mutasjon som gir denne inhiberende aktivitet er også referert som dominant negative Src-proteiner ved at det inhiberer neovaskularisasjon, inklusive den som resulterer fra endogen aktivitet av Src såvel som forsterket Src-aktivitet som resulterer fra vekstfaktorstimulasjon. Således kan visse mutasjoner av villtype-Src ifølge den foreliggende oppfinnelse også virke som dominant negative med hensyn til deres evne til å blokkere blodkarvekst, og for eksempel derfor øke tumorvekt in vivo.

Slikt foretrukket inhiberende c-Src-protein inkluderer Src 251 hvori bare de første 251 aminosyrer av Src uttrykkes. Denne konstruksjon mangler hele kinasedomenet og er derfor referert til som et "kinasedødt" Src-protein. En annen konstruksjon er Src (K295M) mutasjonen hvori lysinaminosyreresten 295 er mutert til en metioninrest. Denne punktmutasjon i kinasedomenet forhindrer ATB-binding og blokkerer også kinaseavhengige Src-funksjoner relatert til karcelle- og tumorcelle-signalering og formering.

For eksempel, for mutasjonen ved resten 527, så lenge som den resulterende muterte aminosyrerest ikke er tyrosin, serin eller treonin, medomfatter den foreliggende oppfinnelse at nærværet av en alternativ aminosyre ved den ønskede posisjon vil resultere i et Src-protein med en ønsket aktiv, angiogenesefremmende modulatorisk aktivitet.

Med hensyn til punktmutasjonene er en hvilken som helst mutasjon som resulterer i den ønskede stimulerende aktivitet medomfattet for anvendelse i denne oppfinnelsen. Fusjonsproteinkonstruksjoner som kombinerer det ønskede Src-protein (mutasjon eller fragment derav) med uttrykte aminosyremerkinger, antigene epitoper, fluorescerende protein, eller annet slikt protein eller peptider er også medomfattet, så lenge som den ønskede potensierende virkning av Src-proteinet er intakt.

En foretrukket ekspresjonskonstruksjon for bruk ved den foreliggende oppfinnelse er RCASBP(A)-konstruksjon (SEQ DD NO.:l). Denne ekspresjonsvektor er basert på en serie av replikasjonskompetente fugle-sarkomvirus med en forbedret Bryan-polymerase (BP) for forbedret titer, og er spesifikk for A-type kappe-glykoproteinet uttrykt på normale fugleceller (oversikt i Methods in Cell Biology, 52:179-214 (1997); se også, Hughes et al., 1987, J. Virol. 61:3004-3012; Fekete & Cepko, 1993, Mol. Cellular Biol. 13(4):2604-2613; Itoh et al., 1996, Development 122:291-300; og Stott et al., 1998, BioTechniques 24:660-666). Den fullstendige sekvens av RCASBP(A) (SEQ ID NO.:l) er gitt i den vedføyde sekvensoversikt og et restriksjonskart av konstruksjonen er avbildet som FIG. 10, heri referert til som RCAS.

Den opprinnelige Src 251-konstruksjon ble subklonet av Dr. Pam Schwartzberg, ved NIH i laboratoriet til Dr. Harold Varmus. Kort sagt ble kloning av en Src cDNA-sekvens for ekspresjon derav fullført ved å innsette en linker inneholdende Not I-BstBl-Not I-restriskjonsseter inn i et unikt Not I-sete i 5'-enden av Src 251. Src har et unikt Cia I-sete ved 3'-enden. Kutting av Src 251 med BstBl og Cia I genererte et BstBl-Cla I-fragment som så ble ligert inn i Cia I-setet på RCASBP(A). Et BstBl overheng tillater ligasjon med et Cia I-overheng som ikke vil bli kuttet på ny med Cia I. Src-konstruksj onene egnet for bruk ved utøvelse av den foreliggende oppfinnelse oppnås lett i den ovennevnte vektor ved først å behandle RCAS-vektoren inneholdende Src 251 med Not I og Cia I (i en DAM+-bakgrunn) for å tillate innskudd av et tilsvarende kuttet Src cDNA. Derfor ble denne initiale RCASBP(A)-konstruksjon inneholdende Src 251 videre anvendt for å subklone alle andre Src-konstruksjoner som beskrevet i det foregående og i Kaplan et al. (1994, TheEMBO J. 13(20):4745-4756), inn i RCASBP(A) via et Not I-Cla I-fragment generert ved hjelp av Src 251-konstruksjonen. For å fremskaffe de ønskede c-Src-mutasjoner i cDNA ble det anvendt seterettet mutageneseprosedyrer som den vanlige fagkyndige på området vil være fortrolig med. PCR-primere bestemt til å innlemme de ønskede mutasjoner ble også konstruert med restriksjonsseter for å lette etterfølgende kloningstrinn. Hele segmentet av Scr-kodende nukleinsyresekvenser deleteres fra nukleinsyrekonstruksjonene ved hjelp av PCR-amplifikasjonsmetoder basert på de kjente cDNA-sekvenser i kylling-, human- og liknende homologer av Src og etterfølgende dannelse av nye konstruksjoner.

Ved en utførelsesform av oppfinnelsen vil 3' PCR-primeren anvendt for å forsterke Src-nukleinsyrene også kode for en i-rammesekvens. Bruk av denne primer tilføyer en 9E10-myc-epitopmerking to karboksylenden av den følgende Src-konstruksjon.

De følgende aminosyrer ble tilføyd etter aminosyren 251 i Src for å generere vektorkonstruksjoner inneholdende 9E10-myc-epitopmerkingen: VDMEQKLIAEEDLN (SEQ ID NO.:6). To separate PCR ble gjennomført for hver konstruksjon og liknende resultater ble oppnått. Alle mutantkonstruksjoner konstruert ved hjelp av PCR ble også sekvensert av PCR til å bekrefte forutsagt DNA-sekvens av kloner. Villtype og muterte Src cDNA for bruk ved ekspresjonssystemene for den foreliggende oppfinnelse kan også fås fra Upstate Biotech Laboratories, Lake Placid, NY som selger fugle- såvel som human-Src, og flere kinase-døde og -aktiverte muterte former.

Alternative ekspresjonsvektorer for bruk ved uttrykking av Src-proteinene ifølge den foreliggende oppfinnelse inkluderer også adenovirale vektorer som beskrevet i US patentskrifter 4.797.368, 5.173.414, 5.436.146, 5.589.377 og 5.670.488. Alternative metoder for tilførsel av de Src-modulatoriske proteiner inkluderer tilførsel av Src cDNA med et ikke-viralt vektorsystem som beskrevet i US patentskrift 5.675.954 og tilførsel av selve cDNA som nakent DNA som beskrevet i US patentskrift 5.589.466. Tilførsel av konstruksjoner ifølge oppfinnelsen er heller ikke begrenset til topisk påføring av en viral vektor som beskrevet i CAM-analysesystemet i det følgende. For eksempel blir virale vektorpreparater også injisert intravenøst for systemisk tilførsel i det vaskulære leie. Disse vektorer kan også målrettes til seter med økt neovaskularisasjon ved lokalisert injeksjon av en tumor, som et eksempel.

In vitro uttrykte proteiner er også medomfattet for tilførsel derav etter ekspresjon og rensing av det utvalgte Src-protein med metoder nyttige for tilførsel av proteiner eller plypeptider. En slik metode inkluderer liposom-tilførselssystemer, som for eksempel beskrevet i US patentskrift 4.356.167,. 5.580.575, 5.542.935 og 5.643.599. Andre vektor- og protein-tilførselssystemer er vel kjent for de vanlige fagkyndige på området for bruk ved ekspresjon og/eller tilførsel av Src-proteinene ifølge den foreliggende oppfinnelsen.

2. Karakterisasjon av ubehandlet kylling korioallantionmembran (CAM)

A. Fremstilling av CAM

Angiogenese kan induseres på kylling korioallantoinmembranen (CAM) etter at normal embryonisk angiogense har resultert i dannelsen av modne blodkar. Angiogenese er blitt vist å bli indusert i respons til spesifikke cytokiner eller tumorfragmenter som beskrevet av Leibovich et al., Nature. 329:630 (1987) og Ausprunck et al., Am. J. Pahtol.. 79:597

(1975). CAM ble fremstilt fra kyllingfostre for etterfølgende induksjon av angiogenese og inhibisjon derav. Ti dager gamle kyllingfostre ble oppnådd fra Mclntyre Poultry (Lakesdie, CA) og inkubert ved 37°C med 60% fuktighet. Et lite hull ble dannet gjennom skallet ved enden av egget direkte over luftsekken ved bruk av en hobbydrill (Dremel, Division of Emerson Electric Co. Racine WI). Et andre hull ble boret på bredsiden av egget i en region som var uten embryoniske blodkar bestemt på forhånd ved gjennomlysing av egget. Negativt trykk ble utøvet på det opprinnelige hull og dette resulterte i at CAM (korioallantoinmembranen) ble trukket bort fra skallmembranen og skapte en falsk luftsekk over CAM. Et 1,0 centimeter (cm) x 1.0 cm kvadraatisk vindu ble kuttet gjennom skallet over den nedhelte CAM ved bruk av en liten slipeskive (Dremel). Det lille vindu tillot direkte adgang til underliggende CAM. Det resulterende CAM-preparat ble enten anvendt etter 6 dager embryogenese, et trinn markert ved aktiv neovaskularisasjon, uten ytterligere behandling til CAM som avspeiler modellen anvendt for vurdering av virkninger på embryonisk neovaskularisasjon eller anvendt etter 10 dagers embryogenese hvor angiogenesen har opphørt. Det siste preparat ble så anvendt ved denne oppfinnelsen for å indusere fornyet angiogenese i respons til cytokinbehandling eller tumorkontakt som beskrevet i det følgende.

3. CAM angiogeneseforsøk

A. Angiogenese indusert av vekstfaktorer

Angiogenese er blitt vist å bli indusert av cytokiner eller vekstfaktorer.

Angiogenese ble indusert ved å anbringe en 5 millimeter (mm) X 5 mm Whatman filterskive (Whatman Filter papir nr. 1) mettet med Hanks balanserte saltoppløsing ("Hanks Balanced Salt Solution") (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) eller HBSS inneholdende 2 mikrogram/milliliter (ug/ml) rekombinant grunnfibroblastvekstfaktor (bFGF) eller vaskulær endotelialcellevekstfaktor (VEGF) (Genzyme, Cambridge, MA) på CAM av enten et 9 eller 10 dager gammelt kyllingfoster i en region som er uten blodkar og vinduene ble senere tettet med tape. Andre konsentrasjoner av vekstfaktorer er også effektive til å indusere blodkarvekst. For forsøk hvor inhibisjon av angiogenese evalueres med intravenøse injeksjoner av antagonister blir angiogenese først indusert med 1-2 ^g/ml bFGF eller VEGF i fibroblast dyrkingsmedium. Angiogenese ble overvåket ved hjelp av fotomikroskopi etter 72 timer.

B. Embryonisk angiogenese

CAM-preparatet for å bedømme virkningen av angiogeneseinhibitorer på den naturlige dannelse av embryonisk neovaskulatur er det 6 dagers embryoniske kyllingfoster som tidligere beskrevet. Ved dette trinn i utviklingen undergår blodkarene på nytt vekst og tilveiebringer således et nyttig system for å bedømme angiogenesemodulasjon ved hjelp av Src-proteinene ifølge den foreliggende oppfinnelse. CAM-systemet fremstilles som beskrevet i det foregående bortsett fra at forsøket gjennomføres ved embryonisk dag 6 i stedet for ved dag 9 eller 10.

4. Modulasjon av angiogenese som målt ved CAM-analysen

For å bedømme virkningen av Src-proteiner på angiogenese ble de følgende forsøk gjennomført på 10 dager gamle kylling CAM-preparater. Fem \ xg av RCAS-konstruksj onene fremstilt som beskrevet i Eksempel 1 ble overført i den kylling-immortaliserte firbroblastlinje, DF-1 (gave fra Doug Foster, U. Of Minn.)- Denne cellelinje såvel som primære kylling-embryofibroblaster var i stand til å frembringe virus, men DF-1-cellelinjen produserte høyere titere. Virale supernatanter ble samlet fra subkonfluente DF-l-produser-cellelinjer i serumfri-CLM-media [sammensetning: F-10 mediabase supplert med DMSO, folinsyre, glutaminsyre og MEM-vitaminoppløsning]. Trettifem ml viral supernatant ble konsentrert ved ultrasentirfugering ved 4°C i 2 timer ved 22.000 opm. Disse konsentrerte virale pellets ble oppslemmet på nytt i 1/100 av det opprinnelige volum i serumfri-CLM-media, delt i porsjoner og lagret ved -80°C. Titer ble bedømt ved seriefortynning av en kontroll-viralvektor med en nukleotidsekvens som koder for grønt fluorescerende protein (GFP), referert til som RCAS-GFP, infeksjon på primære kylling-embryofibroblaster som ble inkubert i 48-72 timer. Titere av viral stamme som ble oppnådd etter konsentrasjon oversteg rutinemessig 10 o I.u./ml. For CAM-prøven ved bruk av de virale stammer ble kortisonacetatbløtede Whatman filterskiver med diameter 6 mm fremstilt i 3 mg/ml kortisonacetat i 30 minutter i 95% etanol. Skivene ble tørket i et avtrekk med laminær strømning og deretter bløtlagt på 20 1^1 viral stamme pr skive i 10 minutter. Disse skiver ble påført CAM av 9 eller 10 dager gamle kyllingfostre og forseglet med cellofantape og inkubert ved 37°C i 18-24 timer. Deretter ble enten "narre"-PBS eller vekstfaktorer tilsatt i en konsentrasjon på 5 ug/ml til CAM i et 20 fal volum av den passende virusstamme som en ytterligere vedlike-holdene av virus til CAM-vevet. Etter 72 timer ble CAM høstet og undersøkt på endringer i den angiogene indeks som bestemt ved hjelp av dobbelt blindprøvetelling av antallet av forgreningspunkter i CAM som ligger under skiven. For kinaseanalyse ble vevet som ligger under skiven høstet i RIPA, homogenisert med en motorisert mølle og Src-immunopresipitert fra ekvivalente mengder totalt protein og underkastet en in vitro kinaseanalyse ved bruk av et FAK-GST-fusjonsprotein som et substrat. For immunofluorescensundersøkelsene ble CAM-vev som lå under skivene fryst iOCT, et kryokonserveirngsmiddel, snittet ved 4 ^m, fiksert i aceton i 1 minutt, inkubert i 3% normal geit-serum i 1 time, etterfulgt av en inkubasjon i primært kanin-antifosforylert ERK-antistoff som tidligere beskrevet i (Eliceiri et al., J. Cell Biol.. 140:1255-1263

(1998)), vasket i PBS og påvist med et fluorescerende sekundært antistoff.

A. Aktivering av endogent Ser med vFGF eller VEGF

For å bedømme virkningene av vekstfaktorer på Src-aktivitet ved modulering av angiogenese ble følgende forsøk gjennomført. Vevekstrakter av 10 dager gamle kylling-CAM som var blitt eksponert for bFGF eller VEGF (2 \ im/ m\) i 2 timer ble lysert. Endogent Src ble immunopresipitert fra ekvivalente mengder av totalt protein og underkastet et in vitro immunkompleks kinaseforsøk ved bruk av et FAK-GST-fusjonsprotein som et substrat, elektroforesert og overført til nitrocellulose.

Resultatene av forsøket er vist i FIG. 5 hvor økningen i Src-aktivitet er tydelig i den økte densitet av gelen med enten bFGF- eller VEGF-behandling som sammenliknet med ubehandlede prøver (blindprøver) som er indikative for basislinje Src-aktivitet i CAM-analysen. Både bFGF og vEGF resulterte i omtrent en 20 gangers økning av endogen Src-aktivitet tilstede i CAM. Den ovennevnte kinase-analyseblotting ble også probet med et anti-Src-antistoff som en "loading"-kontroll for ekvivalent Src- og IgG-innhold.

B. Virkning av retrovirusmediert genekspresjon av Src A på angiogenese i

kylling CAM

Den følgende prøve ble gjennomført for å bedømme virkningen av muterte Src-proteiner på angiogenese i CAM-preparatet. For analysen ble 9 dager gamle kylling CAM eksponert for RCAS-Src A eller RCAS-GFP som uttrykte retrovirus eller buffer i 72 timer ifølge den protokoll som er beskrevet i det foregående.

Resultatene av denne prøve er vist i FIG. 6A hvor nivået av angiogenese ble kvantifisert som beskrevet i det foregående. Representative mikrofotografier (4x) ble tatt med et stereomikroskop som vist i FIG. 6B. Basislinje endogent-Src-aktivitet hadde en angiogen indeks på omtrent 50.1 motsetning resulterte CAM behandlet med retroviral vektor-uttrykt RCAS-Src A som hadde en punktmutasjon ved aminosyrerestposisjon 527 fra en tyrosinrest til en fenylalaninrest i en økning (induksjon) av angiogenese av en angiogen indeks på omtrent 90. Økningen av Src-A-mediert angiogenese er også tydelig i fotografiene vist i FIG. 6B.

C. Retroviral ekspresjon av Src A aktiverer vaskulær MAP-kinasefosforylasjon

Virkninen av Src A som sammenliknet med vekstfaktorer VEGF og PMA på vaskulær MAP-kinasefosforylasjon ble også bedømt etter forsøksprosedyrene beskrevet i det foregående og heri. Ved ekstrakter av 10 dager gamle kylling CAM eksponert for VEGF eller PMA (et ytterligere mitogen ved en sammenliknbar konsentrasjon) i 30 minutter ble sammenliknet med dem som var infisert med Src A-uttrykkende retrovirus i 48 timer. Src ble så immunopresipitert fra ekvivalente mengder av total proteinekstrakt og underkastet en in vitro immunkompleks-kinaseanalyse ved bruk av et FAK-GST-fusjonsprotein som et substrat, elektroforesert og overført til nitrocellulose.

Resultatene av denne analyse er vist i FIG. 7A hvor ubehandlede CAM (NT) fremviser basislinjeendogent Src-mediert vaskulær MAP-kinasefosforylasjon. Både VEGF og PMA resulterte i en omtrent 2 gangers økning voer basislinje. I motsetning til dette forsterket Src A-aktiviteten omtrent 5 til 10 ganger utover den som sees med ubehandlede prøver.

Delmengder av de ovennevnte hele vevslysater ble også målt på endogen ERK-fosforylasjon ved immunoblotting med et anti-fosfo-ERK-antistoff som vist i FIG. 7B. For denne bedømmelse ble 10 dager gamle CAM infisert med enten simulert RCAS eller RCAS som uttrykker Src A. Etter to dager ble CAM obdusert, kryokonservert i OCT og snittet ved 4 \ xm. Snitt ble immunofarget med et anti-fosforylert ERK-antistoff (New England Biolabs), vasket og detektert med et geit-anti-kanin-FITC-konjugert sekundært antistoff. Fluorescerende bilder ble tatt på et avkjølt CCD-kamera (Princeton Inst). Mikrofotografiene indikerer økt immunofluorescens med Src A-behandlede preparater sammenliknet med simulerte kontroller.

C. Selektivt krav for Src-aktivitet under VEGF, men ikke for bFGE-indusert

angiogenese

For å bedømme virkningen av Src-modulatorisk aktivitet på vekstfaktorindusert angiogenese ble følgende forsøk gjennomført. Ni dager gamle kylling-CAM ble eksponert for det retrovirale vektorpreparat som uttrykte den dominante negative Src-mutasjon referert til som Src 251 eller Src K295M som tidligere beskrevet. RCAS-Src 251 eller kontroll-RCAS-GFP-retrovirus eller buffer CAM ble behandlet i 20 timer og deretter inkubert i ytterligere 72 timer i nærvær eller fravær av bFGF eller VEGF.

Angiogenesenivået, kvantifisert som beskrevet i det foregående, er vist i FIG. 8 A. Representative mikrofotografier (6x) vist i FIG. 8B ble tatt med et stereomikroskop.

FIG. 8C illustrerer en blotting probet med en anti-Src-antistoff for å bekrefte ekspresjonen av Src 251 i transfekterte celler sammenliknet med simulerte behandlinger.

Resultatene av forsøket beskrevet ovenfor indikerer at både bFGF og VEGF behandlede CAM i nærvær av RCAS-GFP-kontroller induserte angiogenese over den Src-medierte basislinje angiogenese som sees med simulerte eller ubehandlede CAM-preparater. Den uttrykte dominante negative mutant Src 251 var effektiv til å inhibere VEGF-indusert angiogenese tilbake til basislinjenivåer mens den ikke var effektiv til å inhibere bFGF-mediert angiogenese. Mikrofotografiene vist i FIG. 8B bekrefter billedmessig data vist i FIG. 8A. Retroviralt uttrykt Src 251 er således en effektiv angiogeneseinhibitor, når angiogenesen er indusert med VEGF.

5. Regresjon av tumorvevsvekst med Src-modulatorer som målt ved in vivo modellforsøk med kanin-øye

Virkningen av Src-modulatorer på vekstfaktorindusert angiogenese kan iakttas i naturlige transparente strukturer som eksemplifisert ved øyets kornea. Nye blodkar vokser fra kanten av kornea, som har en rikelig blodtilførsel, mot senter av kornea, som normalt ikke har en blodtilførsel. Stimulatorer av angiogenese, som bFGF, når de påføres kornea, induserer veksten av nye blodkar fra kanten av kornea. Antagonister for angiogenese, påført kornea, inhiberer veksten av nye blodkar fra kanten av kornea. Kornea undergår således angiogenese ved en invasjon av endoteliale celler fra kanten av korena inn i det tette kolagenfylte kornealvev som er lett synlig. Kanin-øyemodellforsøket tilveiebringer derfor en in vivo modell for den direkte observasjon av stimulasjon og inhibisjon av angiogenese etter implantering av forbindelser direkte i øyets kornea.

A. In vivo modellforsøk med kanin-øye

1) Angiogense indusert med vekstfaktorer

Angiogenese induseres i in vivo modellforsøket med kanin-øye med vekstfaktorer bfGF eller VEGF og er som beskrevet i de følgende avsnitt.

a. Fremstilling av " Hydron" pellets inneholdende vekstfaktor og monoklonale antistoffer

"Hydron" polymerpellets inneholdende vekstfaktor fremstilles som beskrevet av D'Amato, et al., Proe. Nati. Acad. Sei.. USA. 91:4082-4085

(1994). De individuelle pellets innholder 650 ng av vekstfaktorer separat

bundet til sukralfat (Carafet, Marion Merrell Dow Corporation) for å stabilisere vekstfaktoren og sikre dens langsomme frigivelse i det omgivende vev. I tilleg fremstilles "Hydron" pellets inneholdende et ønsket Src-uttrykkende retrovirus som tidligere beskrevet. Pelletene støpes i særlig preparerte Teflon-pinner som har et 2.5 mm hull boret inn i deres overflate. Omtrent 12 ul støpemateriale anbringes i hvert hull og polymeriseres over natten i et sterilt avtrekk. Pellets blir så sterilisert ved hjelp av ultrafiolett bestråling. Virkningene av Src-proteiner bedømmes så som tidligere beskrevet.

6. In vivo regresjon av tumorvevsvekst med Src-modulatorer som målt ved kimerisk mus: humananalyse

En in vivo kimerisk mus:human-modell genereres ved å erstatte en del av huden fra en SCID-mus med human neonatal forhud. Den in vivo kimeriske mus:huma-modell fremstilles essensielt som beskrevet i Yan, et al., J. Clin. Invest., 91:986.996 (1993). Kort sagt fjernes et 2 cm2 kvadratisk hudareal kirurgisk fra en SCID-mus (6-8 uker gammel) og erstattes med en human forhud. Musen bedøves og håret fjernes fra et 5 cm<2 >areal på hver side av den laterale abdominale region ved barbering. To sirkulære podeområder på 2 cm<2> fremstilles ved å fjerne den fulle tykkelse av huden nevnt til fascia. Humane hudpodinger med full tykkelse av den samme størrelse avledet fra human neonatal forhud anbringes på sårområdene og suturbindes på plass. Podingen dekkes med "Band-Aid" som suturbindes til huden. Tape av mikroporeduk påføres også for å dekke såret.

M21-L human melanom-cellelinjen eller MDA 23.1 brystkarsinom-cellelinjen (ATCC HTB 26; ctvP3 negativ ved immunoreaktivitet av vevseksjoner med mAb LM609), anvendes for å danne de faste humantumorer på humanhudpodingene på SCID-musene. En enkeltcellesuspensjon av 5 x IO<6> M21-L eller MDA 23.1-celler injiseres intradermalt i humanhudpodingen. Musene iakttas så i 2 til 4 uker for å tillate vekst av målbare humantumorer.

Etter at et målbar tumor er etablert blir retroviruspreparater ifølge den foreliggende oppfinnelse eller PBS injisert i musehalevenen. Etter en 2-3 ukers periode eksideres tumoren og analyseres på vekt og histologi. Virkningen av uttrykte Src-proteiner ifølge den foreliggende oppfinnelse på tumorene blir så bedømt.

7. In vitro regresjon av human tumorvevsvekst med Src-mulatorer som målt ved hjelp av CAM-analyse

Tumorvekst avhenger av angiogenese (Folkman, 1992; Weidner et al., 1991; Brooks et al., 1994b). Mer nylige rapporter foreslår faktisk at tumorvekst er mottakelig for de anti-angiogene virkninger av VEGF-reseptorantagonister (Kim et al., 1993). Derfor ble det undersøkt om undertrykking av angiogenese med tilførsel av kinasedeletert Src 251 ville innvirke på veksten av en human-medulloblastom (DAOY), en høyt angiogen tumor kjent å produsere VEGF og meget lite bFGF (data ikke vist). 3 og 6 dagers DAOY-medulloblastom-tumorvekstforsøk ble gjennomført i kylling-CAM hovedsakelig som tidligere beskrevet i (Brooks et al., 1994). 5 x IO<6> DAOY-celler dyrket i RPMI1640 inneholdende 10% fetalt kalveserum ble vasket og podet på CAM av et 10 dager gammelt foster for å frembringe DAOY-tumorfragmenter. Etter 7 dager ble 50 mg tumorfragmenter obdusert og podet på nytt på et ytterligere 10 dagers foster og inkubert i ytterligere 3 eller 6 dager med den topiske påføring (25 ul) av enten kontroll-RCAS-GFP-retrovirus, RCAS-Src 251, eller simulert behandling. Ved burk av det hele vev var man ved konfokal bildedannelse av infiserte tumorer som en guide i stand til å bestemme at der var signifikant ekspresjon av RCAS-konstruksjonene omkring og inne i tumorfragmentet med denne topiske metode. Tumorreseksjonering og veining ble gjennomført på en måte med dobbelte blindprøver som fjernet bare den lett definerbare faste tumormasse (Brooks et al., 1994). Vektene av våt tumor etter 3 eller 6 dager ble sammenliknet med initial vekt og prosentvis endring av tumorvekt bestemt for hver gruppe.

Disse tumorer vokser lett på CAM og frembringer aktiv angiogenese (FIG. 9) som tillater selektiv målretting av den fugle-avlede tumorvaskulatur ved bruk av en fugle-spesifikk RCAS-retrovirus.

FIG. 9 avbilder resultater som viser at retroviral tilførsel av RCAS-Src 251 til humantumorer som vokser på kylling CAM reverserer tumorvekst. FIG. 9A viser humane medulloblastomer som ble dyrket på CAM av kylling-fostre som beskrevet i det foregående. Retrovirus inneholdende RCAS-GFP eller RCAS-Src 251 ble topisk påført foretablerte tumorer større enn 50 mg. Et representativt mikrofotografi av et medulloblastom-tumorfragment infisert med RCAS-GFP-uttrykkende GFP viser eksklusiv ekspresjon i tumorblodkarene (pilpissen) som påvist ved optisk seksjonering med et Bio Rad-laserkonfokalt scanningmikroskop (bar=500 \ im). FIG. 9B viser resultatene fra tumorer behandlet som ovenfor og som fikk vokse i 3 eller 6 dager hvoretter de ble reseksjonert og våtvekter bestemt. Data er uttrykt som midlere endring i tumorvekt (fra de 50 mg tumorutgangsvekt) +/- standard feilmiddel (SEM) av 2 replikater. RCAS-Src 251 hadde en signifikant virkning på tumorvekst etter 3 dager (*, P< 0.002) og 6 dager (*, P<0.05). FIG. 9C viser at representative stereomikrografier av medulloblastomtumorer kirkurgisk fjernet fra fostrene ble tatt med et Olympus steromikroskop (bar=350 (im). (Lavere panel). Et mikrofotografi med høy forstørrelse av hver tumor viser vaskulaturen av hver tumor i detalj (bar=350 um). Pilspissen indikerer blodkarbrudd i RCAS-Src 251-behandlede tumorer.

Resultatene viser at tilførsel av RCAS inneholdende Src 251 for å forhåndsetablere medulloblstomer resulterte i selektiv viral ekspresjon i de tumorassosierte blodkar (FIG. 9A) og dette førte til slutt til regresjonen av disse tumorer innenfor tidforløpet på 6 dager (FIG. 9B). Viktig er det at de tumorassosierte blodkar i dyr behandlet med virus inneholdende Src 251 var alvorlig opprevet og færre i antall sammenliknet med tumorkarene i kontrolldyret (FIG. 9C). Det faktum at RCAS-GFP-infiserte tumorer viste GFP-lokalisasjon bare i tumorvaskulaturen antyder at anti-tumorvirkningene iakttatt med retroviralt tilført Src 251 skyldtes dets anti-angiogene egenskaper.

Den foregående skrevne fremstilling antas å være tilstrekkelig til å muliggjøre at en fagkyndig på området kan utøve oppfinnelsen. Deponeringen av materialet utgjør ikke en innrømmelse om at den skrevne fremstilling inneholdt heri er utilstrekkelig til å muliggjøre utøvelse av noe aspekt ved oppfinnelsen, inklusive den bestemte utførelsesform derav.

Claims (10)

1. Farmasøytiske sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et aktivt Src-protein eller et oligonukleotid som har en nukleotidsekvens som er i stand til å utrykke nevnte protein og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient, hvor nevnte protein er i stand til å potensiere angiogenese i et vev assosiert med en sykdomstilstand.

2. Farmasøytiske sammensetning ifølge krav 1, karakterisert v e d at det aktive Src-proteinet er Src A.

3. Farmasøytiske sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at vevet har dårlig sirkulasjon.

4. Anvendelse av et aktivt Src-protein eller et oligonukleotid som har en nukleotidsekvens som er i stand til å utrykke nevnte protein for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for potensiering av angiogenese i et vev assosiert med en sykdomstilstand.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvor det aktive Src-protein er Src A.

6. Anvendelse ifølge krav 4, hvor vevet har dårlig sirkulasjon.

7. Anvendelse ifølge krav 4, hvor nevnte nukleotid sekvens er inkorporert i retroviral ekspresj onsvektor.

8. Anvendelse ifølge krav 4, hvor nevnte nukleotid sekvens er inkorporert i en ikke-viral ekspresj onsvektor.

9. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 1, karakterisert v e d at nukleinsyren som koder for det aktive Src protein er inkorporert i en viral genoverføringsvektor og hvori nukleinsyren koder for SrcA.

10. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 1, karakterisert v e d at nukleinsyren som koder for det aktive Ser protein er inkorporert i en ikke-viral genoverføringsvektor og hvori nukleinsyren koder for SrcA.