CZ302918B6 - Farmaceutický prostredek pro lécení chorobných stavu modulováním angiogeneze v tkáni - Google Patents

Abstract

Rešení popisuje zpusoby modulování angiogeneze ve tkáních spojených s chorobnými stavy pomocí modifikovaných proteinu Src nebo nukleotidových sekvencí schopných tyto proteiny exprimovat. Zvlášte je popsáno použití konstitutivne aktivovaného proteinu Src k potenciaci angiogeneze a inaktivního proteinu Src k inhibici angiogeneze.

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se obecně týká lékařství a specificky se vztahuje k farmaceutickým prostředkům pro léčení chorobných stavů modulováním angiogeneze v tkáních pomocí proteinu tyrozinkinázy Src.

Dosavadní stav techniky

Angiogeneze je proces vytváření cév v tkáních, který zahrnuje růst nově se vyvíjejících krevních cév ve tkáni, který je také označován jako neovaskularizace. Proces je zprostředkován infiltrací buněk výstelky a buněk hladkých svalů. Má se za to, že proces probíhá některým ze tří způsobů. Cévy mohou vypučet z dříve existujících cév, nově vznikající cévy mohou vznikat z prekurzorových buněk (vaskulogeneze) nebo u již existujících malých cév se může zvětšit jejich průměr. Blood a kol., Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990).

Angiogeneze je důležitým procesem při novorozeneckém růstu, ale je také důležitá při hojení ran a v patogenezi velkého množství klinických nemocí včetně zánětu tkáně, artritidy, nádorového růstu, diabetického onemocnění sítnice, skvrnité degenerace sítnice a podobných stavů. Tyto klinické projevy spojené s angiogenezí jsou označovány jako angiogenní nemoci. Folkman a kol., Science, 235:442—447 (1987). Angiogeneze se obecně nevyskytuje u dospělých nebo zralých tkání, ačkoli nastává při hojení ran a v průběhu růstového cyklu žlutého tělíska. Viz například Moses a kol., Science, 248:1408-1410 (1990).

Bylo předpokládáno, že inhibice angiogeneze by mohla být užitečnou terapií při omezení nádorového růstu. Bylo předpokládáno, že inhibici angiogeneze je možno provést (1) inhibici uvolňování „angiogenních molekul“ jako je bFGF (basic fibroblast growth factor - růstový faktor základních fibroblastů), (2) neutralizací angiogenních molekul, jako je použití protilátek proti pbFGF, (3) použitím inhibitorů vitronektinových receptorů α_νβ₃, a (4) inhibici odpovědi buněk výstelky na angiogenní stimuly. Tato posledně uvedená strategie získala pozornost a Folkman a kol., Cancer Biology, 3:89-96 (1992) popsal několik inhibitorů odpovědi výstelkových buněk, včetně inhibitoru kolagenázy, inhibitorů metabolizmu bazální membrány, angiostatických steroidů, inhibitorů angiogeneze odvozených z hub, faktoru 4 krevních destiček, trombospondinu, léků proti artritidě, jako jsou D-penicilamin a zlatá sůl thiomalátu, analogy vitaminu D3, cx-interferon a podobně, které mohou být použity pro inhibici angiogeneze. Pro další předpokládané inhibitory angiogeneze viz Blood a kol., Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990), Moses a kol., Science, 248:1408-1410 (1990), Inberg a kol., Lab. Invest., 59:44-51 (1988) a patenty US 5 092 885, 5 112 946, 5 192 744, 5 202 352, 5 753 230 a 5 766 591. Žádné inhibitory angiogeneze popsané v předcházejících odkazech nezahrnují Src proteiny.

Aby mohla nastat angiogeneze, výstelkové buňky musí napřed rozložit základní membránu krevních cév a projít skrz ni podobným způsobem, jaký používají nádorové buňky v průběhu invaze a vytváření metastázy.

Drive bylo popsáno, že angiogeneze závisí na interakci mezi cévními integriny a proteiny extracelulámí základní hmoty. Brooks a kol,, Science, 264:569-571 (1994), Dále bylo popsáno, že programovaná smrt buňky (apoptóza) angiogenních cévních buněk je započata interakcí, která by byla inhibována jistými antagonisty cévního integrinu α_νβ₃. Brools a kol., Cell, 79:1157-1164 (1994). Nedávno bylo popsáno, že vazba matrixové metaloproteinázy-2 (MMP-2) kvitronektinovému receptorů (θνβ₅) může být inhibována pomocí antagonistů α_νβ₅, a tím inhibována enzymatická fimkce proteinázy. Brools a kol., Cell, 85:683-693 (1996).

-1 CZ 902918 B6

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká farmaceutického prostředku pro použití v potenciaci angiogeneze v cílové savčí tkáni spojené s chorobným stavem vybraným ze skupiny obsahující slabý krevní oběh, ischemii končetin a chronická poranění, přičemž prostředek obsahuje virový nebo nevirový expresní vektor obsahující nukleotidovou sekvenci schopnou exprimovat protein Src mající v poloze 527 jakýkoli aminokyselinový zbytek kromě tyrosinu, šeřinu nebo threoninu.

io Předkládaný vynález je zaměřen na modulaci angiogeneze v tkáních za pomoci tyrozinkinázy Src, která je zde také obecně označována jako Src.

Jsou popsány farmaceutické prostředky a použití pro modulaci angiogeneze v tkáních, které jsou spojeny s chorobnými stavy. Prostředek obsahující takové množství Src proteinu, které moduluje angiogenezi, je podáno ke tkáni, která má být léčena z chorobného stavu, který odpovídá na modulaci angiogeneze. Prostředek poskytující Src protein může obsahovat čištěný protein, biologicky aktivní fragmenty proteinu, rekombinantním způsobem vytvořený Src protein nebo proteinové fragmenty nebo jejich fúzní proteiny, nebo expresní vektory pro expresi Src proteinu.

Když je Src protein inaktivován nebo inhibován, modulace je inhibicí angiogeneze. Když je Src protein aktivní nebo aktivován, modulace je potenciaci angiogeneze.

Tkáň, která má být léčena, může být jakákoli tkáň, ve které je modulace angiogeneze žádoucí. Pomocí inhibice angiogeneze je vhodné léčit nemocnou tkáň, kde probíhá zhoubná neovaskulari25 zace. Příkladem takových tkání jsou zanícené tkáně, solidní nádory, metastáze, tkáně ve kterých probíhá restenóza a tkáně podobné.

Pomocí potenciace angiogeneze je vhodné léčit pacienty s ischemÍckými končetinami v nichž probíhá slabá cirkulace, jako za diabetických a jiných stavů. Tímto způsobem je též možno léčit pacienty s chronickými zraněními, která se ne hojí, a proto mohou mít užitek ze zvýšení proliferace cévních buněk a neovaskularizace.

Zvláště výhodné je použití Src proteinu, obsahujícího modifikovanou aminokyselinovou sekvenci, které je zde popsáno. Je zde popsáno několik zvláště užitečných modifikovaných Src proteinů ajejich exprese.

Předkládaný vynález také zahrnuje farmaceutický prostředek pro stimulaci angiogeneze v cílové savčí tkáni, který obsahuje virový nebo nevirový vektor pro přenos genů, který obsahuje nukleotidovou kyselinu a farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipient; uvedená nukleová kyselina obsahuje segment nukleové kyseliny kódující Src protein, který obsahuje v poloze 527 jakýkoli aminokyselinový zbytek, mimo tyrozinu, šeřinu nebo threoninu.

Také je předvídán farmaceutický prostředek pro inhibicí angiogeneze v cílové savčí tkáni, který obsahuje virový nebo nevirový vektor pro přenos genů, který obsahuje nukleovou kyselinu a far45 maceuticky přijatelný nosič nebo excipient; uvedená nukleová kyselina obsahuje segment nukleové kyseliny kódující Src protein, který nemá kinázovou aktivitu.

Detailní popis vynálezu

A. Definice

Aminokyselinový zbytek: aminokyselina vytvořená vlivem chemického štěpení (hydrolýzy) polypeptidu a jeho peptidických vazeb. Aminokyselinové zbytky zde popisované jsou převážně v „L“ izomerické formě. Avšak zbytky v izomerické formě „D“ je možno substituovat za který-2CZ 902918 B6 kol i L-aminokysetinový zbytek, pokud si polypeptid zachová požadovanou funkční vlastnost. NH₂ označuje volnou aminoskupinu, která je přítomna na aminovém konci polypeptidů. COOH označuje volnou karboxyskupinu, která je přítomna na karboxylovém konci polypeptidů, čímž je dodržováno standardní názvosloví polypeptidů (popsané v J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) a přijaté v 37 CFR§ 1.822(b)(2)).

Je nutno poznamenat, že všechny sekvence aminokyselinových zbytků jsou zde prezentované vzorci, jejichž pravolevá orientace je v běžně používaném směru pro aminový konec akarboxylový konec. Dále pomlčka na začátku nebo konci sekvence aminokyselinových zbytků znamená peptidickou vazbu k další sekvenci jednoho nebo více aminokyselinových zbytků.

Polypeptid: označuje lineární uspořádání aminokyselinových zbytků vzájemně spojených peptidickými vazbami mezi α-am i no skupinou a karboxylovou skupinou sousedících aminokyselinových zbytků.

Peptid: zde označuje lineární uspořádání ne více než asi 50 aminokyselinových zbytků, vzájemně spojených stejně jako v polypeptidů.

Cyklický peptid: označuje sluučeuinii s kruhovou strukturou, která zahrnuje několik amidových vazeb, stejných jako v typickém peptidu. Cyklický peptid může být homodetický peptid typu „hlava-ocas“, nebo může obsahovat heterodetickou kruhovou strukturu, v níž je kruh uzavřen mezi disulfídické můstky, laktamové můstky, thioestery, thioamidy, guanidinové a podobné vazbyProtein: označuje lineární uspořádání více než 50 aminokyselinových zbytků, vzájemně spojených stejně jako v polypeptidů.

Fúzní protein: označuje polypeptid obsahující alespoň dvě různé polypeptidové domény operativně vázané typickou peptidickou vazbou („fúzované“), přičemž tyto dvě domény odpovídají peptidům, které nebyly v přírodě nalezeny fúzované.

Syntetický peptid: označuje chemicky vytvořený řetězec aminokyselinových zbytků, vzájemně spojených peptidickou vazbou, ve kterém se nenacházejí přirozeně se vyskytující proteiny ajejich fragmenty.

B. Všeobecné úvahy

Předložený vynález se obecně týká objevu, že angiogeneze je zprostředkována proteinem tyrozinkinázou Src, a že angiogeneze může být modulována poskytnutím buď aktivních nebo inaktivních proteinů Src pro potenciování, popřípadě inhibování angiogeneze.

Tento objev je důležitý pro roli, kterou angiogeneze, tvorba nových krevních cév, hraje v různých chorobných procesech. Tam kde tkáně, spojené s chorobným stavem, vyžadují pro svůj růst angiogenezi, tam je žádoucí angiogenezi potlačit a tím inhibovat i růst chorobné tkáně. Tam kde zraněná tkáň vyžaduje angiogenezi pro tkáňový růst a hojení, tam je žádoucí potenciovat nebo podpořit angiogenezi a tím podpořit hojení tkáně a její růst

Tam kde růst nových krevních cév je příčinou nebo přispívá k patologii, spojené s nemocnou tkání, inhibice angiogeneze snižuje zhoubné vlivy nemoci. Pomocí inhibice angiogeneze je možno zasáhnout do vývoje nemoci, zlepšit příznaky a v některých případech nemoc léčit.

Příklady tkání, spojených s nemocí a neovaskularizací, které budou mít užitek z inhibiční modulace angiogeneze zahrnují revmatickou artritidu, diabetickou retinopatii, zánětlivé nemoci, restenózu a podobně. Tam kde růst nových krevních cév je vyžadován pro podporu růstu zhoubné tkáně, inhibice angiogeneze sníží dodávání krve do tkáně a tím přispěje ke snížení hmoty tkáně,

-3 CZ 902918 B6 založené na požadavcích dodávání krve. Mezi příklady patří růst nádorů, kde je neovaskularizace stálým požadavkem proto, aby nádor vyrostl na více než několik milimetrů a pro založení pevných nádorových metastází.

Tam kde růst nových krevních cév přispívá k hojení tkáně, tam potenciování angiogeneze hojení napomáhá. Mezi příklady patří léčení pacientů s ischemickýmí končetinami, ve kterých dochází ke slabé cirkulaci z důvodu diabetů nebo za jiných stavů. Je také zamýšleno léčení pacientů s chronickými ránami, které se nehojí a proto mohou mít užitek ze zvýšení proliferace cévních buněk a z neovaskularizace.

io

Použití popsané v předloženém vynálezu je účinné, protože terapie je vysoce selektivní pro angiogenezi a ne pro jiné biologické procesy.

Jak bylo popsáno dříve, angiogeneze obsahuje řadu procesů, které zahrnují neovaskularizaci tkání včetně „vypučeni’¹, vaskulogeneze nebo zvětšení cév, všechny tyto procesy angiogeneze jsou ovlivněny proteinem Src.

S výjimkou hojení traumatických poranění, tvorby žlutého tělíska a embryogeneze se má za to, že většina procesů angiogeneze je spojena s chorobnými procesy. Proto jsou předložené léčebné metody selektivní pro nemoci a nemají škodlivé vedlejší účinky.

C. Src proteiny

Protein tyrozinkináza Src, používaný v předloženém vynálezu, se může měnit v závislosti na zamýšleném použití. Termíny „protein Src“ nebo „Src“ jsou použity pro označení různých forem proteinů tyrozin kinázy Src zde popsaných, buď v aktivních nebo inaktivních formách.

Termín „aktivní protein Src“ označuje kteroukoli z řady forem proteinu Src, které zesilují angiogenezi. Testy pro měření zesílení angiogeneze jsou zde popsány a nejsou chápány jako omezují30 cí. Protein je považován za aktivní, pokud je úroveň angiogeneze alespoň o 10 % vyšší, s výhodou o 25 % vyšší a ještě výhodněji o 50 % vyšší, nežje úroveň kontrolní, kdy není do pokusného systému přidán žádný Src. Výhodným testem pro měření potenciování je CAM test za použití virového vektoru RCAS, jak je popsáno v příkladech, v nichž je angiogenní index vypočítáván z počtu výběžků. Výhodný aktivní protein Src vykazuje rovněž tyrozinkinázovou aktivitu, Příkla35 dy aktivních Src proteinů jsou popsány v příkladech a zahrnují Src-A.

Termín „inaktivní protein Src“ označuje kteroukoli z řady forem proteinu Src, které potlačují angiogenezi. Testy pro měření inhibice angiogeneze jsou zde popsány a nejsou chápány jako omezující. Protein je považován za inaktivní, pokud je úroveň angiogeneze alespoň o 109 % nižší, s výhodou o 25 % nižší a ještě výhodněji o 50 % nižší, nežje úroveň kontrolní, kdy není do pokusného systému přidán žádný vnější Src. Výhodným testem pro měření inhibice je CAM test za použití virového vektoru RCAS jak je popsáno v příkladech, v nichž je angiogenní index vypočítáván z počtu výběžků. Výhodný inaktivní protein Src vykazuje rovněž sníženou tyrozinkinázovou aktivitu. Příklady inaktivních Src proteinů jsou popsány v příkladech a zahrnují

Src-251.

Protein Src, použitelný v předloženém vynálezu, může být produkován jakoukoli z množství metod, včetně izolace z přírodních zdrojů, jako jsou tkáně, produkci pomocí exprese rekombinantní DNA a purifikací a podobně. Protein Src může také být poskytnut „in šitu“ tím, že do zájmové tkáně je vnesen systém genové terapie, který potom v tkáni tento protein exprimuje.

Gen kódující protein Src může být připraven řadou metod v tomto oboru známých a vynález není v tomto ohledu míněn jako omezující. Například o skupině přírodních Src je známo, že jsou dobře popsány a zahrnují řadu homo logů savčích, ptačích, virových a podobných druhů a gen může být snadno klonován za pomoci DNA klonujících postupů ze kterékoli tkáně, která tento

-4CZ 902918 B6 protein exprimuje. Výhodným Src pro použití ve vynálezu je buněčný protein, jako je savčí nebo ptačí homolog uvedeného c-Src.

D. Rekombinantní DNA molekuly a expresní systémy pro expresi proteinu Src.

Vynález popisuje několik nukleotidových sekvencí, zvláště vhodných pro použití v předloženém vynálezu. Tyto sekvence zahrnují sekvence, které kódují protein Src vhodný pro použití ve vynálezu a různé DNA segmenty, molekuly rekombinantní DNA (rDNA) a vektory, konstruované pro expresi proteinu Src.

DNA molekuly (segmenty), které jsou předmětem předloženého vynálezu, mohou tedy obsahovat sekvence, které kódují celé strukturální geny, fragmenty strukturálních genů a transkripční jednotky, jak je zde dále popsáno.

Výhodným DNA segmentem je nukleotidová sekvence, která kóduje protein Src, jak je zde definováno nebo jeho biologicky aktivní fragment.

Sekvence aminokyselinových zbytků a nukleotidové sekvence výhodného c-Src je popsána v příkladech.

Výhodný DNA segment kóduje sekvenci aminokyselinových zbytků v podstatě shodnou a s výhodou obsahující v podstatě sekvenci aminokyselinových zbytků nebo jejich část, která odpovídá zde popsanému proteinu Src. Reprezentativní a výhodné DNA segmenty jsou popsány dále v příkladech.

Sekvence aminokyselinových zbytků proteinu nebo polypeptidu je přímo úměrná přes genetický kód sekvenci deoxyribonukleové kyseliny (DNA) strukturálního genu, který protein kóduje. Tedy strukturální gen nebo DNA segment může být definován pomocí sekvence aminokyselinových zbytků, např. proteinu nebo polypeptidu, který je jím kódován.

Důležitým a dobře známým rysem genetického kódu je jeho redundance. To jest, pro většinu aminokyselin, používaných pro tvorbu proteinů, existuje více než jeden kódující nukleotidový triplet, který jej kóduje nebo označuje určitý aminokyselinový zbytek. Proto může více různých nukleotidových sekvencí kódovat sekvenci určitých aminokyselinových zbytků. Takové nukleotidové sekvence jsou považovány za funkčně ekvivalentní, protože mohou vést k produkci téže sekvence aminokyselinových zbytků u všech organizmů. Případně mohou být do dané nukleotidové sekvence inkorporovány methylované varianty purinu nebo pyrimidinu, avšak takové methylace žádným způsobem kódování neovlivňují.

Nukleová kyselina je jakýkoli polynukleotid nebo fragment nukleové kyseliny, ať se jedná o polyribonukleotid nebo polydeoxyribonukleotid, např. RNA nebo DNA nebo jejich analogy. Ve výhodných provedeních je nukleová kyselina ve formě segmentu dvoj řetězcové DNA, např. segment DNA, třebaže pro jisté molekulárně biologické postupy je výhodná jednořetězcová DNA nebo RNA.

DNA segmenty jsou vytvářeny různými způsoby, včetně chemických syntetických metod a rekombinantních postupů, s výhodou klonováním nebo pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). DNA segmenty, které kódují části proteinu Src, mohou být snadno syntetizovány chemickými technikami, například pomocí fosfodiesterové metody podle Matteuci a kol., J. Am. Chem. Soc., 103:3185-3191, 1981, nebo pomocí automatizovaných syntetických postupů. Dále i větší segmenty DNA mohou být snadno připraveny pomocí dobře známých metod, jako je syntéza skupiny oíigonukleotidů, které definují segment DNA, následovaná hybrid izací a ligací olígonukleotidů, aby se pořídil úplný segment. Alternativní metody zahrnují izolaci výhodného segmentu DNA metodou PCR pomocí páru oligonukleotidových primerů, aplikovaných na cDNA knihovnu, u níž se předpokládá, že obsahuje části kódující protein Src.

-5CZ 902918 B6

Ovšem pomocí chemické syntézy mohou být připraveny jakékoli požadované modifikace, jednoduše substituováním vhodných bází za ty, které kódují přirozené sekvence aminokyselinových zbytků. Tato metoda je dobře známa a je ji možno snadno aplikovat při přípravě různých, vzá5 jemně se lišících, modifikovaných Src proteinů, kteréjsou zde popsány.

Dále mohou být segmenty DNA, sestávající v podstatě ze strukturálních genů kódujících protein Src, následovně modifikovány buď pomocí cílené nebo náhodné mutageneze, aby byly jakkoli vneseny požadované mutace.

io

1. Klonování Src genu

Gen pro Src je možno klonovat z vhodného zdroje genomové DNA nebo messenger RNA (mRNA) pomocí řady biochemických metod. Klonování těchto genů může být provedeno podle obecných metod, popsaných v příkladech a v oboru známých.

Zdroje nukleových kyselin pro klonování Src genu, vhodných pro použití v postupech tohoto vynálezu, mohou zahrnovat genomovou DNA nebo messenger RNA (mRNA) ve formě cDNA knihovny, připravené ze tkáně u níž se předpokládá, že tyto proteiny exprimuje. Výhodnou tkání je lidská plicní tkáň, třebaže může být použita kterákoli jiná vhodná tkáň.

Výhodná klonovací metoda zahrnuje přípravu cDNA knihovny pomocí standardních metod a izolaci nukleotidové sekvence, kódující Src, PCR amplifikací pomocí párovaných oligo-nukleotidových primerů, kteréjsou založeny na zde popsaných sekvencích. Jinou možností je, že požadova25 né cDNA klony mohou být identifikovány a izolovány z cDNA nebo genomové knihovny běžnými metodami hybridizace sekvencí nukleové kyseliny, přičemž použitá hybridizační sonda je založena na zde popsaných sekvencích. Jiné metody izolace a klonování vhodných nukleových kyselin kódujících Src, jsou snadno zřejmé osobám se zkušeností v oboru.

io 2. Expresní vektory

Rekombinantní DNA molekuly (rDNA), obsahující DNA segment kódující Src protein, mohou být vytvářeny tak, jak je zde popsáno. Zvláště exprimovatelné rDNA mohou být vytvářeny operativním (se shodným čtecím rámcem, exprimující) připojením vektoru k DNA segmentu, který kóduje Src. Rekombinantní molekula DNA je tedy hybridní molekula, obsahující alespoň dvě nukleové kyseliny z nukleotidových sekvencí, které se normálně nenalézají v přírodě společně.

Výběr vektoru, k němuž je segment DNA operativně připojen, závisí přímo, jak je v oboru dobře známo, na žádaných funkčních vlastnostech, např. expresi proteinu, a hostitelské buňce, která bude transformována. Vektor vhodný pro použití při praktické realizaci předloženého vynálezu je schopen alespoň řízení replikace a s výhodou také exprese strukturálních genů, zahrnutých v segmentech vektorové DNA, k nimž je operativně připojen.

Jak prokaryotické tak eukaryotické expresní vektory jsou dobře známé osobám se zkušeností v oboru konstrukce vektorů a jsou popsány v Ausubel a kol., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York (1993) a v Sambook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989). V těchto odkazech je také popsáno mnoho obecných metod rekombinace DNA, kteréjsou zde uváděny.

Jedno provedení obsahuje jako vhodný vektor prokaryotický replikon, což je DNA sekvence, která má schopnost řídit autonomní replikaci a udržení molekuly rekombinantní DNA v extrachromozomálním stavu v prokaryotické hostitelské buňce, jako je bakteriální hostitelská buňka, tímto vektorem transformovaná. Takové replikony jsou v oboru dobře známé. Navíc taková provedení, která obsahují prokaryotický replikon, také obsahují gen, jehož exprese propůjčuje

-6CZ 902918 B6 bakteriální buňce, která je tímto replikonem transformována, rezistenci proti léku. Typické geny bakteriální lékové rezistence jsou ty, které propůjčují rezistenci k ampicilinu nebo tetracyklinu.

Takové vektory, které obsahují prokaryotický replikon, mohou též obsahovat prokaryotický promotor, schopný řídit expresi (transkripci a translaci) strukturálního genu v bakteriální hostitelské buňce, tímto vektorem transformované, jako je E. coli. Promotor je kontrolní element exprese, tvořený DNA sekvencí, která dovoluje vazbu RNA polymerázy a zahájení transkripce. Promotorové sekvence, které jsou slučitelné s bakteriálními hostiteli, jsou typicky poskytovány plazmidovými vektory obsahujícími vhodná restrikční místa pro vložení segmentu DNA, který je předmětem předloženého vynálezu. Z takovýchto plazmidových vektorů jsou typické pUC8, pUC9, pBR322 a pBR329, které jsou dostupné od Biorad Laboratories (Richmond, CA), pRSET dostupný od Invitrogen (San Diego, CA) a pPL a pKK223, dostupné od Pharmacia, Piscataway. N.J.

Expresní vektory, které jsou slučitelné s eukaryotickými buňkami, s výhodou slučitelné s buňkami obratlovců, také mohou být použity pro vytvoření molekul rekombinantních DNA, které jsou předmětem předloženého vynálezu. Expresní vektory pro eukaryotické buňky jsou v oboru dobře známé ajsou dostupné z několika komerčních zdrojů. Typicky jsou dodávány takové vektory, které obsahují vhodná restrikční místa pro vložení žádoucího segmentu DNA. Z takovýchto vektorů jsou typické pSVL a pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-l/pML2d (International Biotechnologies, lne.), pTDTl (ATCC, #31255), pRc/CMV (Invitrogen, lne.), což jsou výhodné vektory popsané v příkladech, a jiné podobné expresní eukaryotické vektory.

Zvláště výhodný systém pro expresi genu v kontextu tohoto vynálezu obsahuje gen dodávací složku, tj. má schopnost dodat gen do požadované tkáně. Vhodnými vektory jsou „infekční“ vektory, jako jsou rekombinantní DNA viry, adenovirové nebo retrovirové vektory, které jsou sestaveny pro expresi požadovaného proteinu a mají vlastnosti, které umožňují infekci předem vybraných cílových tkání. Zvláště výhodná je replikace zde popsaného kompetentního ptačího sarkoma viru (RCAS),

Je možno připravit systémy savčích buněk, které využívají pro řízení exprese rekombinantní viry nebo virové elementy. Například při použití adenovirových expresních vektorů je možno připojit kódující sekvenci polypeptidů k adenovirovému transkripčně/translačnímu kontrolnímu komplexu, např. k pozdnímu promotoru a tripartitní vedoucí sekvenci. Tento chimémí gen může být vložen do adenovirového genomu pomocí in vitro nebo in vivo rekombinace. Výsledkem vložení do neesenciální oblasti virového genomu (např. oblasti El nebo E3) bude rekombinantní virus, který je životaschopný a schopný exprimovat polypeptid v infikovaných hostitelích (např. viz Logan a kol., Proč. Nati. Acad. Sci„ USA, 81:3655-3659 (1984)). Jinou možností je použít 7,5K promotor viru vakcinie (např. viz Mackett a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 79:7415-7419 (1982); Mackett a kol., J. Virol., 49:857-864 (1984); Panicali a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 79:4927-4931 (1982)). Zvláště zajímavé jsou vektory založené na hovězím papiloma viru, které mají schopnost se replikovat jako extrachromozomální elementy (Sarver a kol„ Mol. Cell Biol., 1:486 (1981)). Krátce po vstupu této DNA do cílových buněk se plazmid replikuje asi na 100 až 200 kopií na buňku. Transkripce vložené cDNA nevyžaduje integraci plazmidu do hostitelského chromozómu, čímž je dosažena vysoká úroveň exprese. Tyto vektory lze použít pro stabilní expresi tím, že je do plazmidu zařazen selektovaný markér, jako je gen neo. Jinou možností je modifikovat retrovirový genom, aby bylo možno jej použít jako vektor schopný vnesení a řízení exprese polypeptid kódujících nukleotidových sekvencí v hostitelské buňce (Cone a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 81:6349-6353 (1984)). Vysoké úrovně exprese také může být dosaženo použitím indukovatelných promotorů, mimo jiné promotoru pro metalothionin IIA a heat shock promotorů.

Nedávno bylo studováno dlouhodobé přežívání u nahých myší nesoucích rakovinu lidského vaječníku, při terapii genem thymidinkinázy (TK), který byl řízen buď promotorem cytomegalovíru (CMV) nebo promotorem viru Rousova sarkomu (RSV). Bylo zjištěno, že účinnost zabíjení

-7 CZ 902918 B6 buněk adenovirem pří terapii TK genem herpetického viru, zprostředkovaná CMV promotorem je 2 až 1 Okřát vyšší, než při řízení promotorem RSV. (Tong a kok, 1999, Hybridoma 19(1):93-97). Bylo též popsáno navrhování chimemích promotorů pro aplikování genové terapie, kdy je vyžadována nízká úroveň exprese posléze následovaná indukovatelnou expresí o vysoké úrovni.

(Suzuki a kol., Human Gene Therapy 7:1883-1893).

Pro dlouhodobou produkci rekombinantních proteinů na vysoké úrovni je výhodná stabilní exprese. Spíše než expresními vektory, které obsahují virové počátky replikace, mohou být hostitelské buňky transformovány cDNA kontrolovanou vhodnými expresními kontrolními elementy (např. io sekvence promotorů a sekvence zesilovačů transkripce, transkripční terminátory, polyadenylační místa atd.) a selektovatelnými markéry. Jak bylo zmíněno výše, selektované markéry v rekombinantním plazmidu propůjčují rezistenci k selekci a umožňují buňkám stabilně integrovat plazmid do svých chromozomů a při růstu vytvářet foky, které pak mohou být klonovány a převedeny na buněčné linie.

Například po vnesení cizí DNA může být umožněn transformovaným buňkám růst 1 až 2 dny v obohaceném médiu a potom jsou přeneseny do selekčního média. Lze použít řadu selekčních systémů, mimo jiné geny pro thymidinkinázu herpetického viru (Wigler a kol., Cell, 11:223 (1977)), hypoxantin-guanin-fosforibozyltransferázu (Szybalska a kol., Proč. Nati. Acad. Sci.,

USA, 48:2026 (1962)) a adeninfosforibozyltransferázu (Lowy a kol., Cell, 22:817 (1980)), které mohou být použity v tk , hgprt“ a aprt” buňkách. Jako základ selekce mohou být použity geny, které propůjčují rezistenci k antimetabolitům; například geny pro dhfr, který propůjčuje rezistenci k methotrexátu (Wigler a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 77:3567 (1980); O’Hara a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 78:1527 (1981); gpt, který propůjčuje rezistenci ke kyselině myko25 fenolové (Mulligan a kol., Proč. Nati. Acad. Sci,, USA, 78:2072 (1981)); neo, který propůjčuje rezistenci k aminoglykozidu G-418 (Colberre-Garapin a kol., J. Mol. Biol., 150:1 (1981)) a hygro, který propůjčuje rezistenci khygromycinu (Santerre a kok, Gene, 30:147 (1984)). Nedávno byly popsány další selektovatelné geny, zvláště trpB, který umožňuje buňce zpracovávat indol na místo tryptofanu; hisD, který umožňuje buňce zpracovávat histínol na místo histi30 dinu (Hartman a kok, Proč. Nati. Acad. Sci, USA, 85:804 (1988)) a ODC (omitindekarboxyláza), který propůjčuje rezistenci k inhibitoru omitindekarboxylázy, 2-dífluormethyl)-DL-omitinu, DFMO (McConlogue L., v: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed., (1987)).

Základní vektory, se kterými se počítá pro lidskou genovou terapii, jsou retrovirového původu. (Wilson, 1997, Clin. Exp. Immunol. 107(dopk 1):31-32; Bank a kok, 1996, Bioassays 18(12):999-1007; Robbins a kok, 1998, Pharmacol. Ther. 80(1):35^17). Terapeutický potenciál genového přenosu a antisense terapie stimuloval vývoj mnoha vektorových systémů pro léčení různých tkání (cévní systém, Stephan a kok, 1997, Fundam. Clin. Pharmacol, 11(2):97-110;

Feldman a kok, 1997, Cardiovasc. Res. 35(3):391-404; Vassali a kok, 1997, Cardiovasc. Res. 35(3):459-69; Baek a kok, Circ. Res. 82(3):295-305; ledviny, Lien a kok, 1997, Kidney Int. Suppk 61 :S85-8; játra, Ferry a kok, 1998, Hum. Gene Ther. 9(14): 1975-81; sval, Marshall a kok, 1998, Curr. Opn. Genet. Dev. 8(3):360-5). Vedle těchto tkání je důležitým cílem pro lidskou genovou terapii rakovina, a to buď nádor samotný nebo tkáně s ním související. (Runne45 baum, 1997, Anticancer Res. 17(4B):2887-90; Spear a kok, 1998, J. Neurovirok 4(2):133-47).

Specifické příklady vektorových systémů pro virovou genovou terapii, které jsou snadno přizpůsobitelné pro použití v metodách, které jsou předmětem předloženého vynálezu, jsou krátce popsány níže. Dodávání genů pomocí retrovírů bylo nedávno souhrnně zpracováno v Federspiel a Hughes (1998, Methods in Cell Bíok 52:179-214), kde je popisována zvláště retrovírová rodina viru ptačí leukózy (ALV) (Federspiel a kok, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 91:11241 (1994). Retrovirové vektory, včetně ALV a viru myší leukémie (MLV) jsou dále popsány Svobodou (1998, Gene 206; 153-163).

-8CZ 902918 B6

Modifikované retrovirové/adenovirové expresní systémy mohou být snadno adaptovány pro praktické uplatnění metod, které jsou předmětem předloženého vynálezu. Například systémy viru myší leukémie (MLV) jsou souhrnně zpracovány v Karavanas a kok, 1998, Crit. Rev. In Oncology/Hematology 28:7-30. Adenovirové expresní systémy jsou souhrnně zpracovány v Von s Seggem a Nemerow, Gene Expression Systems (vyd. Femandez & Hoeffler, Academie Press,

San Diego, CA, 1999, kapitola 5, str. 112 až 157).

Pro proteinové expresní systémy bylo ukázáno, že mají efektivní použití jak in vivo tak in vitro. Například byl popsán účinný přenos genu do lidského karcinomu dlaždicových buněk, kdy byl io jako vektor použit amplikon herpes simplex viru (HSV) typu 1. (Carew a kol., 1998, Am. J. Surg.

176:404-408). Herpes simplex virus byl použit pro přenos genu do nervového systému. (Goins a kol, 1997, J. Neurovirol. 3 (dopl. l):S80-8). Cílené sebevražedné vektory, používající HSVTK, byly testovány na pevných nádorech. (Smiley a kol., 1997, Hum. Gene Ther. 8(8):965-77). Vektor herpes simplex viru typu l byl použit pro genovou terapii rakovinných buněk karcinomu tlustého střeva. (Yoon a kol., 1998, Ann. Surg. 228(3):366-74). Byly vyvinuty hybridní vektory, aby byla prodloužena délka doby transfekce, včetně hybridů HSV/AAV (virus spojený s adenovírem) pro léčení hepatocytů. (Fraefel a kol., 1997, Mol. Med. 3(12):812-825).

i i-nani incv i

Virus vaft-vime oyi vyvinut pro použití v lidské genove terapii pro svůj velký genem, (Pep 20 a kol., 1998, Surg. Onkol. Clin. N. Am. 7(3):575-88). Bylo popsáno použití viru vakcinte, ze kterého byla odstraněna thymidinkináza a který exprímuje nukleosidpyrofosforylázu, jako vektoru pro řízenou genovou terapii nádorů. (Puhlman a kol., 1999, Human Gene Therapy, 10:649-657).

Bylo popsáno použití viru 2, spojeného s adenovirem (AAV 2) pro lidskou genovou terapii, avšak AAV vyžaduje v savčích buňkách pro svoji optimální replikaci a zabalení do partikule pomocný virus (jako je adenovirus nebo herpesvirus). (Snoeck a kol., 1997, Exp. Nephrol. 5(6):514-20; Rabinowitz a kol., 1998, Curr. Opn. Biotechnol. 9(5)470-5). Avšak bylo popsáno in vitro zabalení infekčních rekombinantních AAV, které činí tento systém mnohem slibnější. (Ding a kol., 1997, Gene Therapy 4:1167-1172). Bylo ukázáno, že přenos cDNA pro receptor ekotropního retroviru, zprostředkovaný AAV, umožňuje transdukci ekotropního retroviru jak do zavedených tak primárních lidských buněk. (Qing a kol., 1997, J. Virology, 71(7):5663-5667). Byla také ukázána genová terapie rakoviny za pomoci vektoru AAV, který exprímuje standardní typ lidského p53. (Qazilbash a kol., 1997, Gene Therapy 4:675-682). Také byl publikován přenos genu do cévních buněk pomocí vektorů AAV. (Maede a kol., 1997, Cardiovascular Res,

35:514-521). U AAV bylo demonstrováno, že je vhodným vektorem pro genovou terapii, zaměřenou na játra. (Xiao a kol., J. Virol. 72(12):10222-6). Bylo ukázáno použití vektorů AAV pro genovou terapii mozkových tkání a centrálního nervového systému. (Chamberlin a kol., Brain Res. 793(1-2): 169-75; During a kol., 1998, Gene Therapy 5(6):820-7). Vektory AAV byly také porovnány s vektory adenovirovými (AdV), co se týká použití pro genovou terapii plic a pro pře40 nos do lidských epiteliálních buněk s cystickou fibrózou. (Teramoto a kol., 1998, J. Virol. 72(11):8904-12).

Chimemí vektorové systémy AdV/retrovirus pro genovou terapii, které zahrnují užitečné vlastnosti každého z virů, tvoří neintegrující se AdV, který se stane opět integrujícím prostřednictvím mezigenerace buněk, produkujících retrovirus. (Feng a kol., 1997, Nat. Biotechnology 15(9):866-70; Bilbao a kol., 1997, FASEB J. 11(8):624-34). Tato nová výkonná generace vektorů pro genovou terapii byla adaptována pro cílenou genovou terapii rakoviny. (Bilbao a kol., 1998, Adv. Exp. Med. Biol, 451:365-74). Jedna injekce AdV, exprimujícího p53, inhibovala růst podkožních nádorových uzlíků lidských buněk rakoviny prostaty. (Asgari a kol., 1997, Int.

J. Cancer 71(3):377-82). Byl popsán přenos genu pro standardní typ p53 pacientům s pokročilou rakovinou velkých plicních buněk pro standardní typ p53 pacientům s pokročilou rakovinou velkých plicních buněk, prostřednictvím AdV. (Schuler a kol., 1998, Human Gene Therapy 9:20752082). Stejný typ rakoviny byl předmětem terapie pomocí zaměnění genu pro p53, které bylo zprostředkováno vektory AdV. (Roth a kol., 1998, Semin. Onkol. 25(3 dopl. 8):33-7). Přenos genu pro p53, který byl zprostředkován AdV, inhibuje diferenciaci výstelkových buněk a tvorbu

-9CZ 902918 B6 cév in vivo. (Riccioni a kol., 1998, Gene Ther. 5(6):747-54). Byla též popsána adenovirem zprostředkovaná exprese melanomového antigenu gp75, jako imunoterapie pro rnetastatický melanom. (Hirschowitz a kol., 1998, Gene Therapy 5:975-983). AdV usnadňuje infekci lidských buněk ekotropním retrovirem a zvyšuje účinnost retrovirové infekce. (Scott-Taylor, a kok, 1998,

Gene Ther. 5(5):621-9). AdV vektory byly použity pro přenos genů do cévních buněk hladkých svalů (Li a kol., 1997, Chin. Med. J. (Engl) 110(12):950-4), karcinomu dlaždicových buněk (Goebel a kol., 1998, Otolarynol. Head Neck Surg. 119(4):331-6), nádorových buněk jícnu (Senmaru a kol., 1998, Int. J. Canccr 78(3):366-71), mesangiálních buněk (Nahman a kol., 1998,

J. Investig. Med. 46(5):204-9), gliových buněk (Chen a kol., 1998, Cancer Res. 58(16):3504-7) io a do kloubů živočichů (Ikeda a kol., 1998, J. Rheumatol. 25(9):1666-73). V nedávné době byl ukázán pomocí katétru přenos genu do osrdeěníku, zprostředkovaný vektory AcV. (March a kok, 1999, Clin. Cardiol. 22(1 dopl. 1):123-9). Úprava AdV systému pomocí vhodných kontrolních genetických elementů umožňuje AdV zprostředkovanou, regulovatelnou expresi cílového genu in vivo. (Burcin a kol., 1999, PNAS (IJSA) 96(2):355-60).

Alfavirové vektory byly vyvinuty pro aplikaci lidské genové terapie spolu s buněčnými liniemi pro balení virových částic, které je možno použít pro transformaci pomocí expresních kazet, které jsou vhodné pro použití s vektory, odvozenými od viru Síndbis a viru Semliki Forest. (Polo a kol., 1999, Proč. Nati, Acad. Sci., USA, 96:4598 4603). Byly též vyvinuty necytopatické systé20 my, založené na RNA replikonu flaviviru. (Vamavski a kol., 1999, Virology 255(2):366-75). Vektory založené na viru s ind bis, obsahující sebevražedný gen pro HSV-TK, byly použity pro buněčné specifické zaměření do nádorových buněk. (lijima a kol., 1998, Int. J. Cancer 80(1):110-8).

Retrovirové vektory, založené na lidském foamy viru (HFV), se také ukazují jako slibné vektory pro genovou terapii. (Trobridge a kol., 1998, Human Gene Therapy 9:2517-2525). Vektory foamy viru byly navrženy pro sebevražednou genovou terapii. (Nestler a kol., 1997, Gene Ther. 4(11):1270-7). Rekombinantní myší cytomegalovirus a promotérové systémy byly také použity jako vektory pro vysokou úroveň exprese. (Manning a kol., 1998, J. Virol. Meth. 73(1):31-9;

TongakoL, 1998, Hybridoma 18(1):93-7).

Vpravování genů do nedělících se buněk se usnadnilo vytvořením vektorů, založených na viru Sendai. (Nakanishi a kol., J. Controlled Release 54(1 ):61-8).

V jiných pokusech transformovat nedělící se somatické buňky, byly použity vektory, připravené z lentivirů. Byla popsána genová terapie cystické fibrózy, pomocí vektoru založeného na viru lidské imunodeficience (HIV), který je defektní ve své replikaci. (Goldman a kol., 1997, Human Gene Therapy 8:2261-2268). Také byla předvedena trvalá exprese genů, dopravených do jater a svalu pomocí lentivirových vektorů. (Kafri a kok, 1997, Nat. Genet. 17(3):314-7). Avšak pře40 vládající jsou požadavky bezpečnosti a rychle probíhá vývoj dokonalejšího vektoru. (Kim a kol.,

1998, J. Virol. 72(2):994-1004). Výzkum HIV LTL a Tat poskytuje pro vyvíjené vektory důležité informace o organizaci genomu. (Sadaie a kol., 1998, J. Med. Virol. 54(2):118-28). Tak jsou nyní lépe pochopeny genetické požadavky na účinné vektory, založené na HIV. (Gasmi a kol.,

1999, J. Virol. 73(3):1828-34). Byly popsány vektory, které se samy inaktivují nebo buněčné linie, které sestavují virové partikule pouze za určitých podmínek, (například Zuffery akoL,

1998, J. Virol. 72(12):9873-80; Miyoshi a kol., 1998, J. Virol. 72(10):8150-7; Duli a kol., 1998, J. Virol. 72(1 1):8463-71 a Kaul a kol., Virology 249(1):167-74). Byla ukázána účinná transdukce lidských lymfocytů a buněk CD34+ pomocí HIV vektorů. (Douglas a kol., 1999, Hum. Gene Ther. 10(6):935 45; Miyoshi a kol., 1999, Science 283(5402):682-6). Byla popsána účinná trans50 dukce nedělících se lidských buněk pomocí lentivirových vektorů z viru kočičí imunodeficience (FfV), který minimalizuje bezpečnostní obavy, spojené s použitím vektorů založených na HIV. (Poeschla a kol., 1998, Nátuře Medicine 4(3):354-357). Byla ukázána produktivní infekce lidských krevních mononukleámích buněk pomocí FIV vektorů. Johnston a kol., 1999, J. Virol. 73(3):2491-8).

- 10CZ 902918 B6

Zatímco s mnoha virovými vektory je obtížné zacházení a jejich kapacita pro vloženou DNA je omezená, tato omezení a nevýhody se začaly řešit. Například vedle jednoduchých buněčných linií, které vytvářejí virové partikule, byly pro zjednodušení manipulace s genetickým materiálem a vytváření virových vektorů, vyvinuty minivirové vektory, odvozené od lidského herpetického viru typu 1 (HSV-1) a od viru Epstein-Barrové (EBV). (Wang a kol., 1996. J, Virology 70(12):8422-8430). Již dříve byly ukázány adaptorové plazmidy, pomocí nichž je usnadněno vkládání cizí DNA do retrovirových vektorů, nezávislých na pomocném viru. (1987, J. Virology 61(10):3004-3012).

Virové vektory nejsou jedinými prostředky pro zvýšení účinnosti genové terapie, protože bylo také popsáno několik vektorů nevirového typu. Bylo ukázáno, že výsledkem použití cíleného nevirového vektoru dopravujícího gen, založeného na použití polyplexu epidermální růstový faktor/DNA (EGF/DNA), je účinné a specifické dopravení genu. (Cristiano, 1998, Anticancer Res., 18:3241-3246). Byla předvedena genová terapie cévního zásobení a CNS za pomoci kationtových lipozomů. (Yand a kol., 1997, J. Neurotrauma 14(5):281-97). Přechodná genová terapie zánětu slinivky břišní byla také provedena pomocí kationtových lipozomů. (Denham a kol., 1998, Ann. Surg. 227(6):812-20). Bylo ukázáno, že pro dopravu genů jsou účinné komplexy DNA s vektory založenými na chitosanu. (Erbacher a kol., 1998, Pharm. Res. 15(9):1332-9). Byly popsány uěviiové vekíuiy, uOpíaVující DNA, založené na tť mlavrn/Qm Tkf im n Lrvl í|J1V^VTWI11 y » *- » · » i «

1998, 53(1-3):175-82). Pro účinný přenos genu byly také použity lipozomové komplexy, pokryté virovými Částicemi (Hirai a kol., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 241(1): 112-8).

Byla předvedena léčba rakoviny genovou terapií tak, že přímo do nádoru byla aplikována injekce nevirového T7 vektoru kódujícího thymidinkinázu. (Chen a kok, 1998, Human Gene Therapy 9:729-736). Příprava plazmidové DNA je pro přenos genu pomocí přímého injektování důležitá. (Hom a kok, Hum. Gen Ther. 6(5):656-73). Pro přímé injektování byly adaptovány pozměněné plazmidové vektory. (Hartikka a kol., 1996, Hum. Gen. Ther. 7(10):1205-17).

Je tedy zřejmé, že v oboru je známo množství vektorů a konstruktů pro přenos genů a genovou terapii. Tyto vektory je možno snadno přizpůsobit pro použití v metodách, které jsou předmětem předloženého vynálezu. Pro praktické uskutečnění předloženého vynálezu může být vytvořeno mnoho rovnocenných vektorů a pomocí vhodné manipulace za použití technik rekombinantní DNA a molekulární biologie může být do vybraného expresního/dopravovacího vektoru vložen a operativně připojen Src (buď aktivní nebo inaktivní).

E. Metody pro modulaci vytváření cév

Vynález poskytuje prostředky pro použití v modulaci vytváření cév ve tkáni spojené s procesem nemoci nebo stavem nemoci a tím pro ovlivňování dějů v tkáni, která je závislá na vytváření cév. Obecně taková metoda obsahuje to, že tkáni spojené s procesem nemoci nebo stavem nemoci je podán prostředek, obsahující takové množství proteinu Src, které je schopno modulovat vytváření cév, nebo vektor z nukleové kyseliny, který exprimuje aktivní nebo inaktivní Src.

Jak je zde popsáno, kterákoli množství tkání nebo orgánů, složených z organizovaných tkání, může za podmínek nemoci podporovat vytváření cév, ať se jedná o kůži, sval, střevo, pojivovou tkáň, klouby, kosti a podobné tkáně, do nichž mohou krevní cévy pronikat na základě angiogenních stimulů.

Pacient léčený na základě předloženého vynálezu je v mnoha konkrétních provedeních tohoto vynálezu povětšinou lidský pacient, je však třeba vzít na vědomí, že principy vynálezu naznačují, že vynález je účinný s ohledem na všechny savce, kteří jsou také míněny zahrnout do termínu „pacient“. V tomto kontextu se má za to, že termín savec zahrnuje kterékoli savčí druhy, u nichž je při léčení tkáně spojené s nemocí žádoucí vytváření cév, zvláště se jedná o zemědělské a domácí savčí druhy.

- 11 CZ 902918 B6

Metoda tedy obsahuje při praktickém provádění postupů, které jsou předmětem předloženého vynálezu to, že je pacientovi podáno léčebné množství fyziologicky tolerovatelného prostředku, obsahujícího protein Src nebo DNA vektor pro expresi proteinu Src.

Rozsahy dávek vhodných pro podávání proteinu Src závisí na formě proteinu a na jeho síle účinku, jak je zde dále popsáno. Dávkové množství jsou dostatečně velká, aby byl dosažen požadovaný účinek, při němž je zlepšeno vytváření cév, případně příznaky nemoci, zprostředkované vytvářením cév. Dávka by nicméně neměla být tak vysoká, aby způsobila nepříznivé vedlejší účinky, jako jsou příznaky hyperviskozity, otok plic, selhání srdce, způsobené městnáním krve a podobně. Obecně se bude dávkování měnit v závislosti na věku, stavu a pohlaví pacienta, na rozsahu nemoci pacienta, a může být snadno určena osobami se zkušeností v oboru. Dávkování může být také upraveno lékařem v případě jakékoli komplikace.

Terapeuticky účinné množství je takové množství proteinu Src nebo nukleové kyseliny kódující (aktivní nebo inaktivní) protein Src, které postačuje ke vzniku detekovatelné modulace angiogeneze v léčené tkáni, tj. angiogenezi modulující množství. Modulace angiogeneze může být měřena testem CAM, který je zde popsán nebo jinými metodami, známými osobám se zkušeností v oboru.

zo Protein Src nebo vektor z nukleové kyseliny, exprimující protein Src, mohou být podány parenterálně pomocí injekce nebo postupnou infúzí v průběhu určitého časového období. Třebaže tkáň, která má být léčena, je v typickém případě dosažitelná v těle pomocí systémového podání, a proto je nejčastěji léčena pomoct intravenózního podávání terapeutického prostředku, jsou rovněž uvažovány jiné tkáně a způsoby podávání. Prostředky, které jsou předmětem předloženého vynálezu, mohou být tedy podávány intravenózně, intraperitoneálně, intramuskulámě, subkutánně, do dutin, dermálně a mohou být podávány peristaltickými způsoby.

Terapeutické prostředky, obsahující protein Src nebo vektor z nukleové kyseliny, exprimující protein Src, mohou být běžně podávány intravenózně, jako je například injekce jednotkové dávní ky. Termín ,jednotlivá dávka“^-, když je použit s odkazem na terapeutický prostředek, který je předmětem předloženého vynálezu, označuje fyzikálně oddělené jednotky, vhodné jako jednotka dávkování pro subjekt léčení, přičemž každá jednotka obsahuje předem určené množství aktivního materiálu, vypočtené tak, aby dalo vznik požadovanému léčebnému účinku, ve spojení s požadovaným ředidlem; tj.nosičem nebo masťovým základem.

V jednom výhodném provedení je reagens podán intravenózně jako jedna dávka. Místní podání může být provedeno buď přímou injekcí nebo využitím výhody izolovaných oddělení, izolování oběhových systémů cílových orgánů, vpouštění do oběhového systému nebo dočasné uzavření cílových cévních oblastí, spojených s nemocnou tkání, uskutečněné pomocí katétru.

Prostředky jsou podávány v terapeuticky účinném množství a způsobem, který odpovídá předepsanému dávkování. Množství, které má být podáno a jeho Časové rozložení, závisí na léčeném subjektu, schopnosti systému léčeného subjektu využít aktivní složku a na stupni požadovaného léčebného účinku. Přesná množství účinné složky, které je vyžadováno, závisí na rozhodnutí lékaře a je zvláštní pro každého jedince. Jsou zde však popsány vhodné dávkové rozsahy pro systémovou aplikaci a ty závisí na způsobu podání. Vhodné režimy pro podávání jsou také různé, ale typicky se jedná o počáteční podání, po kterém následují opakované dávky v jednohodinových nebo vícehodinových intervalech, buď formou následujících injekcí nebo jiného způsobu podání.

- 12 CZ 902918 B6

Jinou možností je kontinuální intravenózní infuze, postačující k udržení koncentrací v krvi v takovém rozsahu, který je předpokládán pro in vivo terapii.

1. Potlačení angiogeneze

Potlačení angiogeneze je důležité při řadě nemocí, označovaných jako angiogenní nemoci. Mezi takové nemoci patří mimo jiné zánětlivé nemoci jako jsou imunní a neimunnt zánět, chronický kloubní revmatizmus a lupénka, nemoci spjaté s nevhodnou či ne včasnou invazí cév, jako je diabetická retinopatie, neovaskulámí glaukom, restenóza, kapilární proliferace v atherosklerotických plácích a osteoporóza, a poruchy spjaté s rakovinou, jako jsou pevné nádory, metastázy pevných nádorů, angiofibromy, retrolentikulámí fibroplázie, hemangiomy. Kapsiho sarkom a podobné rakoviny, které vyžadují, aby byl neovaskularizací podpořen růst nádoru.

Metody, které potlačují angiogenezi v tkáních spjatých s chorobným stavem, tedy zmírňují příznaky nemoci a v závislosti na jejím druhu, mohou přispět k jejímu léčení. V jednom provedení vynález předpokládá potlačení angiogeneze v tkáni spjaté s chorobným stavem. Rozsah angiogeneze v tkáni a tedy rozsah potlačení dosaženého předkládanými metodami, může být zhodnocen řadou různých metod.

V jednom podobném provedení je tkání, která má být léčena, zanícená tkáň a angiogeneze, která má být potlačena, je angiogeneze v zanícené tkáni, kde probíhá v zanícené tkáni neovaskularizace. V této skupině metoda předpokládá potlačení angiogeneze v artritických tkáních, jako u pacientů s chronickým kloubním revmatizmem, v imunních nebo neimunních zánětlivých tkáních, v tkáni lupénky a podobně.

V jiném podobném provedení je tkání, která má být léčena, tkáň sítnice u pacienta s nemocí sítnice, jako jsou diabetická retinopatie, makulámí degenerace nebo neovaskulámí glaukom a angiogeneze, která má být potlačena, je angiogeneze v tkáni sítnice, kde probíhá neovaskularizace v tkáni sítnice.

V dalším podobném provedení je tkání, která má být léčena, nádorová tkáň pacienta s pevným nádorem, metastázy, rakovina kůže, rakovina prsu, hemangiom nebo angiofibrom a podobná rakovina a angiogeneze, která má být potlačena, je angiogeneze v tkáni nádoru, kde probíhá neovaskularizace nádorové tkáně. Mezi typické pevné nádorové tkáně, které je možno léčit pomocí předložených metod, patří plicní tkáň, tkáň slinivky, tkáň prsu, tkáň tlustého střeva, tkáň hrtanu, tkáň vaječníku a tkáně podobné. Inhibice angiogeneze v nádorové tkáni je zvláště výhodná, protože neovaskularizace hraje v nádorovém růstu důležitou roli. Pokud v nádorové tkáni neprobíhá neovaskularizace, tkáň nádoru nedostává požadované živiny, zpomaluje se její růst, zastavuje se další růst, dochází k regresi a nakonec se nádorová tkáň stává nekrotickou a výsledkem je zničení nádoru.

Řečeno jinými slovy, předložený vynález poskytuje prostředek pro použití pro inhibicí neovaskularizace v nádoru tím, že je potlačena tvorba cév v nádoru za pomoci předložených metod. Podobně vynález poskytuje pro použití ve způsobu, jehož pomocí je možno potlačit růst nádoru tím, že se použijí metody potlačující angiogenezi.

Metody jsou také zvláště účinné proti tvorbě metastáz, neboť 1) jejich tvorba vyžaduje vaskularizaci primárního nádoru, takže metastatické rakovinné buňky mohou opustit primární nádor a 2) jejich založení na druhotném místě vyžaduje neovaskularizací, aby byl podpořen růst těchto metastází.

V podobném provedení vynález předpokládá uplatnění metod ve spojení s jinými postupy léčby, jako je běžná chemoterapie, namířená proti pevným nádorům a na kontrolu zakládání metastází. Podání inhibitorů angiogeneze je typicky provedeno buď v průběhu nebo po chemoterapii, třebaže je výhodné potlačit angiogenezi po chemoterapeutickém režimu v době, kdy bude nádorová

- 13 CZ 902918 B6 tkáň odpovídat na toxický zásah indukováním angiogeneze, aby došlo k jejímu zotavení tím, že bude nádorové tkáni poskytnut přísun krve a živin. Dále je výhodné uplatnit metody potlačení angiogeneze po operaci, kdy byly pevné nádory vyjmuty, jako prevenci proti metastázím.

Předložené metody se sice aplikují pro inhibici neovaskularizace v nádoru, ale mohou být také použity pro potlačení růstu nádorové tkáně, pro inhibici tvorby nádorových metastáz a pro regresi již založených nádorů.

Restenózaje proces migrace buněk hladkého svalu (SMC) a jejich proliferace vtkáni na místě io perkutánní plastiky věnčitých cév, čímž je její úspěšnost ohrožena. Migrace a proliferace SMC v průběhu restenózy je možno považovat za proces angiogeneze, která je inhibována předloženými metodami. Proto je v předloženém vynálezu také uvažována inhibice restenózy tím, že je u pacienta po procesu angioplastiky inhibována angiogeneze metodami, které jsou předmětem předloženého vynálezu. Pro inhibici restenózy je běžně po procesu angioplastiky podávána inaktivovaná tyrokináza, protože u stěny věnčitých cév existuje riziko restenózy, a to běžně od

2. do 28. dne a ještě běžněji v prvních 14 dnech po zákroku.

Předložená metoda pro potlačení angiogeneze ve tkáních spjatých s chorobným stavem a proto také pro praktické použití metod léčení nemocí spojených s angiogenezí, zahrnuje kontaktování tkáně v níž probíhá angiogeneze nebo u které je riziko, že k jejímu vzniku dojde, s prostředkem, který obsahuje terapeuticky účinné množství inaktivovaného proteinu Src nebo vektor, který tento protein exprimuje.

K. potlačení angiogeneze a k regresi nádoru dochází již 7 dní po počátečním kontaktu s léčebným prostředkem. Další nebo prodloužené vystavení inaktivovanému proteinu Src je výhodné po dobu 7 dní až 6 týdnů, s výhodou 14 až 28 dní.

2. Zesílení angiogeneze

V případech kdy je žádoucí podpořit nebo zesílit angiogenezí, je užitečné podávání aktivního proteinu Src do tkáně. Cesty a časový rozvrh podávání jsou srovnatelné s metodami, které jsou zde výše popsány pro inhibici.

F. Léčebné prostředky

Předložený vynález o léčebných prostředcích užitečných pro praktické provádění zde popsaných léčebných metod. Léčebné prostředky, které jsou předmětem předloženého vynálezu, obsahují fyziologicky tolerovatelné množství nosiče společně s proteinem Src nebo vektorem, který je schopný exprimovat protein Src, jak je zde popsáno, rozpuštěným nebo dispergovaným v něm jako aktivní složku. Ve výhodném provedení není léčebný prostředek imunogenní, když je podán savci nebo lidskému pacientu za léčebným účelem.

Termíny „farmaceuticky přijatelný“, „fyziologicky přijatelný“ a jejich gramatické variace, ať již označují prostředky, nosiče, ředidla a reagencie, jsou používány zaměnitelně a označují, že mate45 riály jsou schopny být podávány savci bez toho, že by dávaly vznik nežádoucím fyziologickým účinkům, jako je nevolnost, závrať, zdvihání žaludku a podobně.

Příprava fármakologického prostředku, který obsahuje aktivní složky v něm rozpuštěné nebo dispergované je v oboru dobře známa. Běžně jsou takové prostředky připravené jako injekční prostředky, buď jako tekuté roztoky nebo suspenze, avšak mohou být také připravovány v pevných formách, vhodných pro rozpuštění nebo suspendování v tekutině těsně před použitím. Přípravky mohou být také ve formě emulze nebo jako lipozómový prostředek.

Aktivní složka může být smíchána s nosiči, které jsou farmaceuticky přijatelné a slučitelné s aktivní složkou ajsou přítomné v množstvích, která jsou vhodná pro použití v léčebných meto-14CZ 902918 B6 dách, které jsou zde popsány. Vhodnými nosiči jsou například voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol, ethanol a podobné a jejich kombinace. Dále, pokud je to žádoucí, mohou prostředky obsahovat malá množství pomocných látek, jako jsou zvlhčovači nebo emulgační činidla, činidla pufrující pH a podobné, které zvyšují účinnost aktivních složek.

Léčebné prostředky, které jsou předmětem předloženého vynálezu, mohou zahrnovat farmaceuticky přijatelné soli kterékoli své složky, kteráje schopna soli vytvářet. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují kyselé adiční soli (vytvářené volnými aminoskupinami polypeptidů), které jsou tvořeny anorganickými solemi jako jsou například kyseliny chlorovodíková nebo kyselina fosforečná, nebo jako jsou organické kyseliny, jako jsou kyselina octová, kyselina vinná, kyselina mandlová a podobně. Soli tvořené volnými karboxylovými skupinami mohou být také odvozeny od anorganických zásad, jako jsou například sodík, draslík, čpavek, vápník nebo hydroxidy železa, a od takových organických zásad, jako jsou například izopropylamin, trimethylamin, 2 ethvlaminoethanol, histidin, prokain a podobně.

Fyziologicky přijatelné nosiče pro aktivní složky jsou v oboru dobře známé. Příklady tekutých nosičů jsou sterilní vodné roztoky, které neobsahují žádné látky kromě aktivních složek a vody, nebo obsahují pufr, jako je fosforečnan sodný s fyziologickou hodnotou pH, fyziologický solný roztok nebo obojí, jako je fosforečnanem pilířovaný fyziologický roztok. Ještě dále mohou vodné nosiče obsahovat více než jednu pufrující sůl, rovněž soli jako jsou chlorid sodný nebo chlorid draselný, dextróza, polyethylenglykol nebo roztoky jiných látek.

Tekuté prostředky mohou také obsahovat tekuté fáze buď vedle vody nebo při vyloučení vody. příklady takových dalších tekutých fází jsou glycerin, rostlinné oleje, jako je bavlníkový olej, a emulze voda-olej.

Léčebný prostředek obsahuje takové množství proteinu Src, který je předmětem předloženého vynálezu, které moduluje angiogenezi, nebo takový rekombinantní DNA expresní vektor, který postačuje k expresi účinného množství proteinu Src, běžné složení je takové, že obsahuje alespoň

0,1 hmotnostního procenta proteinu Src vzhledem k celkové hmotnosti léčebného prostředku.

Hmotnostní procento je poměr hmotnosti proteinu Src k celkové hmotě prostředku. Tak například 0,1 hmotnostního procenta je 0,1 gramu proteinu Src na 100 gramů celkového prostředku. U DNA vektorů závisí podané množství na vlastnostech expresního vektoru, tkáně kteráje léčena a podobných ohledech.

G. Výrobek

Vynález také předpokládá výrobek, kterým je označená nádoba pro dodávání proteinu Src, který je předmětem předloženého vynálezu. Výrobek zahrnuje balicí materiál, opatřený vhodným ozna40 cením chorobného stavu, který bude léčen a farmaceutického činidla, obsaženého uvnitř.

Farmaceutické činidlo ve výrobku je jakýkoli z prostředků, které jsou předmětem předloženého vynálezu, vhodné pro poskytnutí proteinu Src A které je sestaveno ve farmaceuticky přijatelné formě, jak je zde popsáno. Prostředek tedy může obsahovat protein Src nebo molekulu DNA, která je schopna protein Src exprimovat. Výrobek obsahuje takové množství farmaceutického činidla, které je postačující pro použití při léčení zde popsaných stavů, buď v jedné nebo ve větším množství dávek.

Obalový materiál obsahuje označení, které popisuje použití farmaceutického činidla v něm obsa50 ženého, např. pro léčení chorobných stavů pomocí inhibice nebo posílení angiogeneze. Označení může dále obsahovat návod k použití a podobné informace, které mohou být požadovány pro prodej. Obalový materiál může obsahovat nádobu (nádoby) pro uložení farmaceutického činidla.

Termín obalový materiál, jak je zde používán, označuje materiál jako je sklo, umělou hmotu, 55 papír, aíobal a podobně, který je schopen uchovat uvnitř sebe farmaceutické činidlo. Tak napří- 15CZ 902918 B6 klad může být obalovým materiálem umělá hmota nebo skleněná lahvička, laminované obaly a podobné nádoby, které se používají pro uchovávání farmaceutických prostředků, obsahujících farmaceutické činidlo.

Ve výhodných provedeních obsahuje obalový materiál označení, které zřetelně popisuje obsah výrobku a použití farmaceutického činidla v něm obsaženého.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 je DNA sekvence kuřecího sSrc, která je kompletní kódující sekvencí s odstraněnými introny, jak bylo poprvé popsáno v Takeya a kol., Cell, 32:881-890 (1983). Sekvence je přístupná v GenBank pomocí přístupového čísla J00844. Sekvence obsahuje 1759 nukleotidů, přičemž Část kódující protein začíná a končí na nukleotidových pozicích 112 respektive 1713.

Obrázek 2 je kódovaná aminokyselinová sekvence kuřecího c-Src z kódující sekvence uvedené na obrázku 1.

Obrázek 3 je cDNA sekvence lidského c-Src, který byl poprvé popsán v Braeunínger a kol.,

Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 88:10411-10415 (1991). Sekvence je přístupná v GenBank pomocí přístupového čísla X59932 X71157. Sekvence obsahuje 2187 nukleotidů, přičemž část kódující protein začíná a končí na nukleotidových pozicích 134 respektive 1486.

Obrázek 4 je kódovaná aminokyselinová sekvence lidského c-Src z kódující sekvence uvedené na obrázku 3.

Obrázek 5 znázorňuje aktivaci endogenního Src pomocí bFGF nebo VEGF, jak je popsáno v příkladu 4. Horní část obrázku ukazuje výsledky in vitro kinázového testu aktivace endogenního Src bud¹ pomocí bFGF nebo VEGF. Na spodní části obrázku je blot kinázového testu, na který byla jo jako sonda použita protilátka proti Src jako kontrola nanášení srovnatelného obsahu Src A IgG.

Obrázek 6 znázorňuje účinek genové exprese c-Src A zprostředkované retrovirem na angíogenezí v chorioalantoidní membráně kuřete (CAM), jak je popsáno v příkladu 4. CAM od devět dní starých kuřat byly vystaveny retroviru RCAS-Src A (aktivně mutovaný c-Src) nebo retroviru

RCAS-GFP (zeleně fluoreskující protein; fluoreskující indikátorový protein) nebo pufru po dobu 72 hodin. Úroveň angiogeneze byla kvantifikována tak, jak je ukázáno na obrázku 6A pomocí reprezentativních mikrofotografií (4x) na obrázku 6B, odpovídajících každému jednotlivému působení, fotografovanému pomocí stereomikroskopu.

Obrázek 7 znázorňuje expresi c-Src A zprostředkovanou retrovirem na aktivaci fosfory láce cévní MAP kinázou. Obrázek 7A ukazuje tkáňové extrakty z CAM od deset dní starých kuřat, které byly vystaveny po dobu 30 minut VEGF nebo PMA, nebo infikovány c-Src A retrovirem po dobu 48 hodin. NT znamená neopracovaný vzorek. Src byl imunoprecipitován zodpovídajícího množství celkového proteinového extraktu a podroben in vitro kinázovému testu imunního kom45 plexu za použití fúzního proteinu FAK-GST jako substrát, elektroforézován a přenesen na nitrocelulózu. U alikvotú výše uvedených celkových tkáňových lyzátú byla také měřena endogenní ERK fosfory láce pomocí imunoglobulinu s protilátkou proti fosfory láze ERK. Obrázek 7 A ukazuje tkáňové extrakty z CAM od deset dní starých kuřat, které byly infikovány buď s RCAS nebo s RCAS, obsahujícím Src A. Po dvou dnech byly CAM rozřezány, uchovány za chladu v OCT a nařezány na tloušťku 4 μπι. Řezy byly imunologicky obarveny pomocí protilátky proti fosforylovanému ERK (New England Biolabs), opláchnuty a detekovány pomocí sekundární kozí protíkráliČí protilátky, konjugované s FITC. Fluorescenční obrázky byly snímány chlazenou CCD kamerou (Princeton Inst.).

- 16CZ 902918 B6

Obrázek 8 znázorňuje selektivní požadavky na Src aktivitu během angiogeneze indukované VEGF, ale nikoli angiogeneze indukované bFGFD. CAM od devět dní starých kuřat byly vystaveny retroviru RCAS-Src 251 nebo kontrolnímu retroviru RCAS-GFP nebo pufru po dobu 20 hodin a potom inkubovány po dalších 72 hodin v přítomnosti nebo nepřítomnosti bFGF nebo VEGF. Úroveň angiogeneze byla kvantifikována na obrázku 8A tak, jak bylo popsáno výše, a pomocí stereomikroskopu byly pořízeny reprezentativní mikrofotografie (6x), které jsou ukázány na obrázku 8B. Obrázek 8C ukazuje blot, na kterém byla jako sonda použita protilátka proti Src, aby byla potvrzena exprese Src 251 v transfekovaných buňkách ve srovnání s předstíraným infikováním.

Obrázek 9 znázorňuje výsledky podávání retroviru RCAS-Src 251 do lidského nádoru. Obrázek 9A je mikrofotografie, která ukazuje fragment lidského meduloblastomu infikovaného s RCASGFP (RCAS-zeleně fluoreskující protein), který exprimuje GFP výlučně v krevních cévách nádoru (šipky), jakje detekováno laserovým scanning mikroskopem Bio Rad (čárka = 500 pm). Obrázek 9B ukazuje údaje od nádorů, místně opracovaným retrovirem, které byly ponechány růst 3 až 6 dní, po kterých byly vyříznuty a zjištěny jejich váhy. Údaje jsou vyjádřeny jako průměrná změna váhy nádoru (od výchozí váhy nádoru 50 mg) ± SEM ze dvou paralelních vzorků. Obrázek 9C ukazuje na reprezentativních mikrofotografiích medu lob lastomové nádory chirurgicky odstraněné z embryí (čárka je 350 pm). Na spodních panelech jsou vysoká zvětšení pohledu na každý nádor, která detailně ukazují cévní zásobení v každém nádoru (čárka je 350pm). Šipka dolů označuje prasklinu krevní cévy v nádorech opracovaných RCAS-Src 251.

Obrázek 10 je diagram ukazující restrikční mapu vektorového konstruktu RCASBP (RCAS).

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady, týkající se tohoto vynálezu jsou ilustrativní a neměly by však být chápány doslova, jako že specificky omezují vynález.

Příklad 1: Příprava konstruktů exprimujících c—Src

Pro přípravu exprimujících konstruktů, vhodných pro modulaci angiogeneze metodami, které jsou předmětem předloženého vynálezu, je cDNA c-Src manipulována a vložena do exprimujíeího konstruktu/vektoru.

Sekvence cDNA kódující standardní typ (tj. endogenní) kuřecího c-Src je ukázána na obrázku 1 (SEQ ID NO.:2) (sekvence číslo: 2), spolu škodovanou aminokyselinovou sekvencí, uvedenou na obrázku 2 (SEQ ID NO.:3). Kódovaná proteinová sekvence je přeložena od cDNA nukleotidových pozicí 112 do 1713. Sekvence nukleové kyseliny odpovídající sekvenci nukleové kyseliny lidského c-Src cDNA (SEQ ID NO.:4) a sekvence kódovaných aminokyselinových zbytků (SEQ ID NO.:5) jsou ukázány na obrázku 3, popřípadě obrázku 4. U lidské proteinové sekvence začíná kódující sekvence v cDNA na nukleotidové pozici 134 až 1486.

Byly připraveny standardní typ a rovněž řada mutovaných c-Src cDNA. Mutované cDNA konstrukty byly připraveny pomocí cílené mutageneze, jak je popsáno v Kaplan a kol., EMBO J. 13:4745-4756 (1994). Mutované c-Src konstrukty pro kódování mutovaných c-Src proteinů používaných v metodách, které jsou předmětem předloženého vynálezu, jsou popsány v Kaplan a kol., tamtéž. Kaplan a kol. popisují různé mutované c-Src konstrukty a kódované proteiny, vhodné pro praktické provádění tohoto vynálezu. Například Kaplan a kol. popisují několik produktů kuřecích c-Src Alel, včetně Src A a Src 251, na svém obrázku 1.

Jsou popsány dvě kategorie c-Src, které fungují při modulaci angiogeneze. Jak bylo již dříve diskutováno, jedna kategorie obsahuje molekuly Src, které zvyšují angiogenezi a jsou tedy

- 17CZ 902918 B6 považovány za aktivní proteiny. Pro standardní typ Src spolu s řadou různých mutací je v předloženém vynálezu ukázáno, žc indikuje angiogenezi. Jednou z výhodných mutant standardního typu c-Src, která funguje v tomto smyslu pokud se týká její schopnost indukovat růst krevních cév a proto in vivo zvyšovat hmotnost nádoru, je mutanta Src A, která má bodovou mutaci v pozici aminokyselinového zbytku 527, která změnila tyrozin na fenylalanin. Toto místo je normálně místem pro negativní regulaci pomocí c-Src kinázy, označované jako kináza CSK. Když CSK fosforyluje aminokyselinu 527 v standardním typu Src, je protein inaktivován. Avšak v mutovaném Src A je regulační tyrozin přeměněn na fenylalanin, čímž je protein změněn na konstitutivně (tj. neustále) aktivní protein, nepodléhající inaktívaci pomocí fosforylace.

i o

Bylo také ukázáno, že mutace v Src mají také opačný modulační účinek na angiogenezi, inhibují angiogenezi namísto aby ji stimulovaly. Takové mutace jsou označovány jako inaktivní mutace Src. Proteiny mající mutace, které propůjčují tuto inhibiční aktivitu, jsou také označovány jako dominantně negativní proteiny Src protože inhibují neovaskularizaci, včetně té, která pochází z endogenní aktivity Src anebo od zvýšené aktivity Src, způsobené stimulací růstovým faktorem. Určité mutanty standardního typu c-Src, které jsou předmětem předloženého vynálezu, tedy mohou také fungovat jako dominantně negativní, pokud se týká její schopnosti blokovat růst krevních cév a například proto in vivo snižovat hmotnost nádoru.

Takový výhodný inhibující protein c-Src zahrnuje Src 251, ve kterém je exprimováno pouze prvních 251 aminokyselin Src. Tento konstrukt postrádá celou kinázovou doménu a je proto označován jako „kinase dead“ - pro kinázu mrtvý — Src protein. Druhým konstruktem je mutace Src (K295M), v níž je zbytek aminokyseliny lyzinu 295 mutován na methionin. Tato bodová mutace v kinázové doméně zabraňuje vazbě ATP a také blokuje funkce Src, závislé na kínáze, které mají vztah k signalizaci a množení cévních buněk a nádorových buněk.

Například při mutaci zbytku 527, pokud výsledný mutovaný aminokyselinový zbytek není tyrozin, serin nebo threonin, předložený vynález počítá s tím, že přítomnost alternativní aminokyseliny na požadované pozici bude mít za následek vznik proteinu Src s požadovanou aktivní modu30 lační aktivitou, která zesiluje angiogenezi.

Pokud se týká bodových mutací, kterákoli mutace jejímž výsledkem je požadovaná inhibiční nebo stimulační aktivita, je považována za vhodnou pro použití v rámci tohoto vynálezu. Konstrukce fúzních proteinů, které kombinují požadované Src proteiny (mutace nebo jejich fragmenty) s exprimovanými aminokyselinovými značkami, antigenními epitopy, fluorescenčními proteiny nebojinými takovými proteiny nebo peptidy, jsou také považovány za vhodné pro použití, pokud požadovaný modulační účinek proteinu Src tím není ovlivněn.

Tabulka I

Src/mutace	Src/funkce	Účinek na angiogenezi
c-Src	+ aktivní	stimuluje
Src A(T527F)	+ aktivní	stimuluje
Src 527 (bodová)	+ aktivní	stimuluje
Src 251	- inaktivní	inhibuje
Src (zkrácený)	- inaktivní	inhibuje
Src (K295M)	- inaktivní	inhibuje
Src 295 (bodová)	- inaktivní	inhibuje

Jedním výhodným exprimovaným konstruktem, vhodným pro použití v rámci předloženého vynálezu, je konstrukt RCASBP(A) (SEQ IDNO.:1). Tento expresní vektor je založen na sérii replikujících se virů ptačího sarkomu se zesílenou Bryanovou polymerázou (BP) kvůli zvýšení

- 18CZ 902918 B6 titru a je specifický pro A typ obalového glykoproteinu, exprimovaného na normálních ptačích buňkách (přehled viz v Methods in Cell Biology, 52:179-214 (1997); viz též Hughes a kol., 1987, J. Virol. 61:3004-3212; Fekete & Čepko, 1993, Mol. Cellular Biol. 13(4):2604-2613; ítoh a kol., 1996, Development 122:291300 a Stott a kok, 1998, BioTechniques 24:660-666). Kom5 pletní sekvence RCASBP(A) (SEQ ID NO.: 1) je uvedena v přiloženém seznamu sekvencí a restrikční mapa konstruktu je uvedena jako obrázek 10 a je zde označována jako RCAS.

Původní konstrukt Src 251 byl klonován Dr. Pam Schwartzbergovou v laboratoři Dr. Harolda Varmuse v NIH. Krátce řečeno, klonování sekvence Src cDNA bylo kvůli její expresi provedeno vložením linkeru obsahujícího restrikční místa Not I-Bst I-Not I do jedinečného Not I místa na 5’konci Src 251. Src má na svém 3’konci jedinečné místo pro Cla I. Štěpením Src 251 pomocí BstBl a Cla I je vytvořen fragment BstBl-Cla I, který je potom připojen do místa Cla 1 v RCASBP(A). Přesah BstBl umožňuje takové spojení s Cla 1 přesahem, které nelze opětně štěpit Cla I. Konstrukty Src, vhodné pro použití při uskutečnění předloženého vynálezu, je možno snadno získat ve výše uvedeném vektoru tím, že po počátečním rozštěpení vektoru RCAS, obsahujícího Src 251 pomocí Not I a Cla I (na DAM+pozadí), je umožněno vložení podobně štěpené Src cDNA. Proto byl tento počáteční konstrukt RCASBP(A) obsahující Src 251, použit dále pro subklonování všech dalších Src konstruktů, jak bylo popsáno výše a též v Kaplan a kol. (1964, The EMBO J. 13(20):4745^+756). do RCASBr(A) přes Not Í-Cla Ϊ fragment, vytvořený při konstrukci Src 251. Pro vytvoření žádoucích mutací v c- Sre cDNA byly použity standardní postupy cílené mutageneze, kteréjsou dobře známé osobám se zkušeností v oboru. PCR primery navržené pro zabudování žádaných mutací byly navrženy rovněž s restrikčními místy, které usnadnily následující klonovací kroky. Celé úseky sekvencí nukleové kyseliny kódující Src jsou odstraněny z nukleové kyseliny konstruktů pomocí PCR ampliftkačních technik, založených na známých cDNA sekvencích kuřecího, lidského a podobných homologů Src A následující tvorbou nových konstruktů.

V jednom provedení předloženého vynálezu 3’ PCR přiměř, použitý pro množení nukleové kyseliny Src, kóduje také sekvenci pro synchronizaci Čtecích rámců. Použitím tohoto primeru je ke karboxylovému konci následujícího Src konstruktu přidán označující epitop 9E10-myc.

Následující aminokyseliny byly přidány za aminokyselinu 251 v Src, aby byly vytvořeny konstrukty vektorů, obsahující označující epitop 9E10-myc: VDMEQKLIAEEDLN (SEQ IDNO.:6). Pro každý konstrukt byly provedeny dvě oddělené PCR a byly získány podobné výsledky. V šech35 ny mutované konstrukty získané pomocí PCR byly také pomocí PCR sekvenovány, aby byla potvrzena předpověděná DNA sekvence klonů. Standardní typ a mutované Src cDNA, vhodné pro použití v expresních systémech předloženého vynálezu, jsou též dostupné v Upstate Biotech Laboratories, Lake Placid, NY, která prodává ptačí a rovněž lidský Src, a několik „kinase dead“ a aktivovaných mutovaných forem.

Alternativní expresní vektory, vhodné pro použití při exprimování proteinů Src, kteréjsou předmětem předloženého vynálezu, zahrnují také adenovirové vektory, jak jsou popsány v patentech US 4 797 368, 5 173 41, 5 436 146, 5 589 377 a 5 670 488. Alternativní metody pro podávání modulačních proteinů Src zahrnují podávání Src cDNA pomocí nevirových vektorových systé45 mů, jak je popsáno v patentu US 5 675 957 a dodávání samotné cDNA ve formě nahé DNA, jak je popsáno v patentu US 5598 466. Podávání konstruktů, které jsou předmětem předloženého vynálezu, také není omezeno na místní aplikaci virového vektoru, jak je popsáno v testu CAM dále. Například preparáty virových vektorů jsou také při systémovém podávání podávány injekčně intravenózně do cévního řečiště. Takové vektory je též možno směrovat do míst se zvý50 šenou neovaskularizací, například že jsou místně injektovány do nádoru.

U proteinů exprimovaných in vitro je také předpokládáno jejich dodávání po expresi a purifikaci vybraných proteinů Src pomocí metod, vhodných pro dodávání proteinů a polypeptidů. Jedna z takových metod obsahuje lipozómové dodávací systémy, jak jsou popsány v patentech

US 4 356 167, 5 580 575, 5 542 935 a 5 643 599. Osobám se zkušeností v oboru jsou rovněž

-19 CZ 902918 B6 známy jiné vektorové systémy a systémy dodávající protein, které jsou vhodné pro expresi anebo dodávání proteinu Src, které jsou předmětem předloženého vynálezu.

Příklad 2. Charakterizace intaktní kuřecí chorioalantoidní membrány (CAM)

A. Příprava CAM

Angiogeneze může být indukována na kuřecí chorioalantoidní membráně (CAM) poté, co norio mální embryonální angiogeneze vytvořila zralé krevní cévy. Bylo ukázáno, že angiogenezí je možno indukovat jako odpověď na specifické cytokiny nebo fragmenty nádoru, jak je popsáno v Leibovich a kol., Nátuře, 329:630 (1987) a v Ausprunk a kol., Am. J. Pathol., 79:597 (1975).

CAM byly pro následující indukci angiogeneze a její inhibici připraveny z kuřecích embryí. Desetidenní kuřecí embrya byla získána od Mclntyre Poultry (Lakeside, CA) a inkubována při

37 °C v 60% vlhkosti. Na konci vajíčka byla pomocí malého vrtacího zařízení (Dremel, Division of Emerson Electric Co. Racine WI) přímo nad vzduchovým vakem vytvořena malá dírka. Druhá díra byla vyvrtána na široké straně vajíčka v oblasti, kde se nenacházejí embryonální krevní cévy, jak bylo předem určeno pomocí prosvícení vajíčka. Na původní díru byl aplikován podtlak, což mělo za následek odtažení CAM (chorioalantoidní membrány) od membrány pod skořápkou a vytvoření falešného vzduchového vaku nad CAM. Pomocí malého brusného kotouče (Dremel) bylo ve skořápce nad pokleslou CAM vyříznuto čtvercové okénko o rozměrech 1,0 centimetr (cm) x 1,0 cm. Malé okénko umožnilo přímý přístup k CAM, která se nachází pod ním.

Výsledné preparáty CAM byly potom použity buď v 6 dnech embryogeneze, což je období vyznačující se aktivní neovaskularizací, bez dalšího působení na CAM, která je pak modelem použitým pro hodnocení účinků na embryonální neovaskularizací, nebo byly použity v 10 dnech embryogeneze, kdy již angiogeneze skončila. Druhé uvedené preparáty byly tedy v předloženém vynálezu použity pro indukování obnovené angiogeneze, jako odpověď na působení cytokinů nebo kontakt s nádorem, jak je popsáno zde dále.

Příklad 3. Testování angiogeneze v CAM

A. Angiogeneze indukovaná růstovými faktory

Bylo ukázáno, že angiogeneze může být indukována cytokiny nebo růstovými faktory. Angiogeneze byla indukována umístěním kotoučku z Whatmanova filtračního papíru o rozměrech 5 milimetrů (mm) x 5 mm (Whatman Filter páper No. 1), nasyceného Hanksovým vyváženým solným roztokem (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) nebo HBSS, obsahujícím 2 mikrogramy/40 mililitr (gg/ml) rekombinantního růstového faktoru základních fibroblastů (bFGF) nebo růstového faktoru cévních výstelkových buněk (VEGF) (Genzyme, Cambridge, MA) na CAM kuřecích embryí starých buď 9 nebo 10 dní, v oblasti, kde se nenacházejí krevní cévy a poté bylo okénko uzavřeno páskou. Při indukování růstu krevních cév jsou účinné také jiné koncentrace růstových faktorů. V pokusech, kde byla hodnocena inhibice angiogeneze intravenózní mi injekcemi antago45 nistů, byla angiogeneze nejprve indukována pomocí 1 až 2 pg/ml bFGF nebo VEGF v růstovém médiu fibroblastů. Angiogeneze byla monitorována pomocí mikrofotografií po 72 hodinách.

B. Embryonální angiogeneze

Vhodnými preparáty CAM pro hodnocení vlivu inhibitorů angiogeneze na přirozené vytváření embryonální neovaskulatury je, jak bylo dříve popsáno, šestidenní kuřecí embryo. V tomto stádiu vývoje procházejí krevní cévy de novo růstem a tak poskytují vhodný systém pro hodnocení modulace angiogeneze proteiny Src, které jsou předmětem předloženého vynálezu. CAM systém je připraven tak, jak bylo popsáno dříve s tou výjimkou, že test je prováděn na šestidenních kuře55 cích embryích, a nikoli na devítidenních či desetidenních.

-20CZ 902918 B6

Příklad 4. Modulace angiogeneze měřená v CAM testu

Aby bylo možno zhodnotit účinek proteinů Src na angiogenezi, byly s CAM preparáty, přípravěs nými z 10 dní starých kuřat, provedeny následující pokusy. Pět mg konstruktů RCAS, připravených jak bylo popsáno v příkladu 1, bylo transfekováno do imortalizované linie kuřecích fibroblastů DF-1 (dar od Doug Fostera, University of Minnesota). Tato buněčná linie a rovněž primární kuřecí embryonální fibroblasty byly schopny produkovat virus, avšak buněčná linie DF-1 jej produkovala ve vyšších titrech. Virové supematanty byly sebrány zještě zcela nenarostlých kulH) tur produkční buněčné linie DF-1 v médiu CLM bez séra [složení: F10 základ média doplněný DMSO, kyselinou listovou, kyselinou glutamovou a vitaminovým roztokem MEM]. Třicet pět ml virového supematantu bylo koncentrováno ultracentrifugací při 4 °C po dobu 2 hodin při 22 000 otáčkách/minutu. Tyto koncentrované virové sedimenty byly resuspendovány v 1/100 původního objemu v médiu CLM bez séra, rozděleny na alikvoty a uloženy při -80 °C. Titr byl zjišťován pomocí sériového ředění kontrolního virového vektoru, který má nukleottdovou sekvenci kódující zeleně fluoreskující protein (GFP), označeného jako RCAS-GFP, infekce primárních kuřecích embryonálních fibroblastů, které byly inkubovány po dobu 48 až 72 hodin. Titry zásobních virových roztoků, které byly dosaženy po koncentraci běžně přesahovaly 10^s infekčních jednotek/mi. Pro CAM test, používající zásobní viiuvé lužíoky, byly připraveny oeíancm kortizonu napuštěné kotoučky po dobu 30 minut v 95% ethanolu. Kotoučky byly vysušeny v laminámím boxu a potom napuštěny 20 μΐ zásobních virových roztoků po dobu 10 minut. Tyto kotoučky byly aplikovány na CAM devítidenních nebo desetidenních kuřecích embryí, uzavřeny celofánovou páskou a inkubovány pri 37 °C po dobu 18 až 24 hodin. Potom byl kCAM přidán buď čistý PBS nebo PBS s růstovými faktory s koncentrací 5 pg/ml v objemu 20 μΐ vhodného zásobního virového roztoku, jako další posilovači dávka viru. Po 72 hodinách byly CAM odebrány a zjišťovány u nich změny angíogenetického indexu, které byly určeny dvojím nezávislým počítáním počtu míst, ve kterých dochází k větvení, v oblasti CAM ležící pod kotoučkem. Pro kinázové testy byla tkáň ležící pod kotoučkem odebrána v RIPA, homogenizována motorovým drtičem, Src byl imunoprecipitován z odpovídajících množství celkového proteinu a podroben in vitro kinázovému testu za pomoci fúzního proteinu FAK-GST jako substrátu. Pro imunofluorescenční studie byla tkáň CAM, ležící pod kotoučky, zmražena v kryoprezervačním činidle OCT, rozřezána na plátky silné 4 pm, fixována v acetonu po dobu 1 minuty, inkubována v 3% normálním kozím séru po dobu 1 hodiny, poté následovala inkubace v primární králičí protilátce proti fosforylovanému ERK jak bylo drive popsáno (Eliceri a kol., J. Cell Viol., 140:1255-1263 (1998), promyta v PBS a detekována pomocí sekundární fluorescenční protilátky.

A. Aktivace endogenního Src pomocí bFGF nebo VEGF

Aby bylo možno zhodnotit účinek růstových faktorů na modulaci angiogeneze pomocí aktivity

Src, byly provedeny následující testy. Tkáňové extrakty z CAM desetidenních kuřat, které byly vystaveny bFGF nebo VEGF nebo VEGF (2 pg/ml) po dobu 2 hodin, byly lyžovány. Endogenní Src byl imunoprecipitován z odpovídajících množství celkového proteinu a podroben in vitro testu s imunním komplexem kinázy za pomoci fúzního proteinu FAK-GST jako substrátu, elektroforézován a přenesen na nitrocelulózu.

Výsledky testu jsou uvedeny na obrázku 5, kde je zřetelné zvýšení Src Aktivity zřejmé ze zvýšené hustoty gelu po působení bFGF nebo VEGF, ve srovnání s kontrolními vzorky, které představují základní úroveň aktivity Src v CAM testu. Jak bFGF tak VEGF vyvolaly přibližně dvojnásobné zvýšení endogenní Src aktivity, přítomné v CAM. Na výše uvedeném blotu kinázového testu také byla jako kontrola naneseného množství, aby byl srovnatelný obsah Src A ígG, použita jako sonda protilátka proti Src.

-21 CZ 902918 B6

B. Účinek retrovirem zprostředkované exprese Src A na angiogenezi v kuřecí CAM

Následující test byl proveden, aby byl zhodnocen vliv mutovaných proteinů Src na angiogenezi v preparátech CAM. Při testu byly, podle protokolu popsaného výše, CAM z 9 dní starých kuřat vystaveny retrovirům exprimujícím RCASSrc A nebo RCAS-GFP nebo pufru po dobu 72 hodin.

Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obrázku 6A, kde byla úroveň angiogeneze kvantifikoK) vána tak, jak bylo popsáno výše. Reprezentativní mikrofotografie (4x) byly snímány stereomikroskopem a jsou ukázány na obrázku 6B. Základní úroveň endogenní Src Aktivity má angiogenetický index přibližně 50. Naopak CAM, na které bylo působeno retrovirovým vektorem exprimujícím RCAS Src A, který má bodovou mutaci aminokyselinového zbytku na pozici 527 z tyrozinu na fenylalanin, vykazovaly zvýšení (indukce) angiogeneze a angiogenetický index is dosáhl přibližně 90. Zvýšení angiogeneze, zprostředkované Src A, je také zřejmé na fotografiích, ukázaných na obrázku 6B.

C. Exprese Src pomocí retroviru aktivuje fosfory láci cévní MAP kinázou zo Vliv Src ve srovnání s růstovými faktory VEGF a PMA na fosfory láci cévní MAP kinázou bylo také hodnoceno pomocí testovacích postupů, popsaných výše a zde. Tkáňové extrakty z CAM desetidenních kuřat, které byty vystaveny VEGF nebo PMA (jiný mitogen ve srovnatelné koncentraci) po dobu 30 minut, byly porovnávány stěmi, které byly infikovány retrovirem exprimujíeím Src A po dobu 48 hodin. Src byl potom imunoprecipitován zodpovídajících množství celkového extraktu a podroben in vitro testu s imunním komplexem kinázy za pomoci fúzního proteinu FAK-GST jako substrátu, elektroforézován a přenesen na nitrocelulózu.

Výsledky testu jsou uvedeny na obrázku 7A, kde neopracované CAM (NT) vykazují základní hladinu fosfory láce cévní MAP kinázou, zprostředkovanou endogenním Src. Jak VEGF tak PMA vyvolaly přibližně dvojnásobné zvýšení nad základní úroveň. V kontrastu s tím Src A zvýšil aktivitu přibližně 5 až 1 Okřát nad úroveň neopracovaných vzorků.

U alíkvotů z výše uvedených tkáňových lyzátů byla také měřena fosfory láce endogenního ERK pomocí imunoblotingu s protilátkou proti fosforylovanému ERK, jak je ukázáno na obrázku 7B.

Pro toto stanovení byly CAM z desetidenních kuřat infikovány buď s kontrolním RCAS nebo s RCAS, který exprimuje Src A. Po dvou dnech byly CAM vyříznuty, zmraženy v OCT a rozřezány na plátky silné 4 pm. Řezy byly imunologicky barveny protilátkou proti fosforylovanému ERK (New Engiang Biolabs), opláchnuty a detekovány pomocí sekundární kozí protikráličí protilátky, konjugované s FITC. Fluorescenční obrázky byly snímány chlazenou CCD kamerou (Princeton Inst.). Mikrofotografie ukazují zvýšenou imunofluorescenci u preparátů na které bylo působeno Src A, ve srovnání se slepě infikovanými kontrolami.

D. Selektivní požadavky pro aktivitu Src během angiogeneze indukované VEGF, ne však během angiogeneze indukované bFGF

Aby bylo možno zhodnotit modulační aktivitu Src na angiogenezi indukovanou růstovým faktorem, byly provedeny následující pokusy. CAM z devítidenních kuřat byly vystaveny preparátu retrovirového vektoru, který exprimuje dominantně negativní mutaci Src, označenou jako Src 251 nebo Src K295M, jak bylo dříve popsáno. CAM byly vystaveny retrovirům RCAS-Src 251 nebo kontrolnímu RCAS-GFP nebo pufru po dobu 20 hodin a potom inkubovány dalších 72 hodin v přítomnosti nebo v nepřítomnosti bFGF nebo VEGF.

Úroveň angiogeneze, kvantifikovaná jak bylo výše popsáno, je ukázána na obrázku 8A. Reprezentativní mikrofotografie (6x), které jsou ukázány na obrázku 8B, byly snímány stereomikro55 skopem. Obrázek 8C ukazuje blot, na kterém byla jako sonda použita protilátka proti Src, který

-22CZ 902918 B6 potvrzuje expresi Src 251 v transfekovaných buňkách, ve srovnání se slepě infikovanými kontrolami.

Výsledky testu popsaného výše naznačují, že u CAM opracovaných jak bFGF tak VEGF v přítomnosti kontrolního RCAS-GFP, je indukována angiogeneze nad úroveň základní úrovně angiogeneze zprostředkované Src, která je vidět u preparátů slepě infikovaných CAM nebo u CAM neopracovaných růstovými faktory. Exprimovaná dominantně negativní mutace Src 251 byla účinná pri inhibování angiogeneze indukované VEGF zpět na základní úroveň, nebyla však účinná při inhibování angiogeneze indukované bFGF. Mikrofotografíe ukázané na obrázku 8B potvrzují údaje uvedené na obr. 8A. Src 251 exprimovaný retrovirem je účinným inhibitorem angiogeneze, pokud je angiogeneze indukována pomocí VEGF.

V tomto vynálezu je předpokládáno použití proteinů Src, které jsou předmětem tohoto vynálezu, s jinými modely angiogeneze, jak je popsáno dále v příkladech.

Příklad 5. Regrese růstu nádorové tkáně vlivem Src modulátorů, měřená in vivo modelovým testem s králičím okem

Účinek Src modulátorů na angiogenezi indukovanou růstovým faktorem, je možno pozorovat na přirozeně průhledných strukturách, jako je oční rohovka. Nové krevní cévy rostou z okraje rohovky, který je bohatý na krevní zásobení, směrem ke středu rohovky, který normálně krevní zásobení nemá. Stimulátory angiogeneze. jako je bFGF, pokud jsou aplikovány na rohovku, indukují růst nových krevních cév z jej ího okraje. V rohovce tak probíhá angiogeneze, způsobená vnikáním výstelkových buněk od okraje rohovky do tuhé, kolagenem naplněné rohovkové tkáně, která je snadno viditelná. Model králičího oka proto poskytuje in vivo model pro přímé pozorování stimulace a inhibice angiogeneze, následujících po implantaci sloučenin přímo na oční rohovku.

A. In vivo model králičího oka

1) Angiogeneze indukovaná růstovými faktory

Angiogeneze je u in vivo testu na modelu králičího oka indukována růstovými faktory bFGF nebo VEGF a je popsána v následujících odstavcích, a) Příprava hydronových pelet

Hydronové polymerové pelety obsahující růstový' faktor a monoklonální protilátky jsou připraveny jak je popsáno v D’Amato a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 91:4082-4085 (1994). Jednotlivé pelety obsahují 650 ng růstových faktorů jednotlivě vázaných na sukralfát (Carafet, Marion Merrell Dow Corporation), aby byl růstový faktor stabilizován a zajištěno jeho pomalé uvolňování do okolní tkáně. Dále jsou připraveny hydronové pelety, obsahující požadovaný retrovirus, který exprimuje Src, jak bylo dříve popsáno. Pelety jsou vytvářeny ve speciálně připravených teflonových formách, které mají na svém povrchu vyvrtány 2,5 mm otvory. Přibližně 12 μΙ výchozího materiálu je umístěno do každé formy a ponecháno polymerovat přes noc ve sterilní digestoři. Pelety jsou sterilizovány pomocí UV ozařování. Účinky Src proteinů jsou potom hodnoceny tak, jak bylo dříve popsáno.

Příklad 6. In vivo regrese růstu nádorové tkáně vlivem Src modulátorů, měřená testem chimerní myš/člověk

In vivo model chimémí myš/člověk je vytvořen záměnou částí kůže od myší SCID za lidskou novorozeneckou předkožku. In vivo model chimémí myš/člověk je vytvořen v podstatě tak, jak

-23 CZ 902918 Bó byl popsán v Yan a kol., J. Clin. Invest. 91:986-996 (1993). Krátce řečeno, z myši SCID je chirurgicky odebrána oblast 2 cm² kůže (myši staré 6 až 8 týdnů) aje zaměněna lidskou předkožkou. Myši je ve stavu narkózy oholena srst po obou stranách břišní oblasti na ploše 5 cm². Jsou připravena dvě místa pro štěpy velké 2 cm² tím, zeje odstraněna kůže v celé tloušťce až k pováz5 ce. Štěpy lidské kůže o plné tloušťce jsou ve stejné velikosti připraveny z lidské novorozenecké předkožky, jsou umístěny na rány a přišity na místo. Štěp je překryt Band-Aid, který je přišitý ke kůži. Na zakrytí rány je též použita mikroporézní páska.

Buněčná linie M21-L z lidského melanomu nebo buněčná linie MDA 23.1 z prsního karcinomu to (ATCCHTB 26; α_νβ₃ negativní podle imunoreaktivity tkáňových řezů s MAB LM609) jsou použity pro vytvoření pevných nádorů na štěpech lidské kůže na myších SCID. Suspenze 5 x

10⁶ jednotlivých buněk M21-L nebo MDA 23.1 je podáno intradermálně do lidských kožních štěpů. Myši jsou potom pozorovány po dobu 2 až 4 týdnů, aby byl umožněn vzrůst měřitelných lidských nádorů.

Poté co vznikne měřitelný nádor, je myši do ocasní žíly vstříknut buď retrovirový přípravek, který je předmětem předloženého vynálezu, nebo PBS. Po období 2 až 3 týdnů je nádor vyříznut a analyzována jeho hmotnost a histologie. Potom je zhodnocen vliv exprimovaných proteinů Src, které jsou předmětem předloženého vynálezu, na nádory.

Příklad 7. In vivo regrese růstu lidské nádorové tkáně vlivem Src modulátorů, měřená CAM testem

Růst nádoru je závislý na angiogenezí (Folkman, 1992; Weidner a kol., 1991; Brooks a kol., 1994b). Skutečně nedávné zprávy naznačují, že nádorový růst je citlivý k anti-angiogenním účinkům antagonistů VEGF receptoru (Kim a kol., 1993). Proto jsme zkoumali zda potlačení angiogeneze pomocí podání Src 251 s odstraněným místem pro kinázu, by mohlo ovlivnit růst lidského meduloblastomu (DAOY), vysoce angiogenního nádoru o němž je známo, že produkuje VEGF a velmi málo bFGF (údaje nejsou ukázány).

Třídenní a šestidenní testy růstu meduloblastomového nádoru DAOY byly provedeny na kuřecí CAM v podstatě tak, jak bylo dříve popsáno (Brooks a kol., 1994). 5 x 10^ΰ DAOY buněk kultivovaných v médiu RPMI 1640, které obsahuje 19 % fetálního telecího séra, bylo promyto a vyseto na CAM z desetidenního embrya, aby vytvořily fragmenty DAOY nádoru. Po 7 dnech byly odříznuty 50 mg fragmenty, znovu vysety na jiné desetidenní embryo a inkubovány po dobu dalších tří nebo šesti dnů s místní aplikací (25 μΐ) buď kontrolního retroviru RCAS-GFP, RCASSrc 251 nebo byly jen zdánlivě opracovány. Za použití konfokálního zobrazení celé tkáně infikovaných nádorů jako vodítka, jsme byli schopni určit, že zde za tohoto místního přístupu při apli40 kaci docházelo k výrazné expresi RCAS konstruktů kolem a uvnitř nádorových fragmentů. Vyříznutí nádoru a jeho vážení bylo provedeno podle principu dvojitého slepého testu, přičemž byla odstraněna pouze snadno definovatelná hmota pevného nádoru (Brooks a kol., 1994). Vlhké hmotnosti nádoru po 3 nebo 6 dnech byly porovnány s počáteční hmotností a pro každou skupinu bylo určeno procento změny hmotnosti nádoru.

Tyto nádory snadno rostou na CAM a vyvolávají aktivní angiogenezí (obrázek 9), což nám umožňuje selektivně zacílit na cévní zásobní nádorů ptačího původu pomocí specifického ptačího RCAS retroviru.

Obrázek 9 znázorňuje výsledky, které ukazují, že dodávání RCAS-Src 251 pomocí retroviru do lidských nádorů, které rostou na kuřecí CAM, zpomaluje nádorový růst. Obrázek 9A ukazuje lidské meduloblastomy, které rostly na CAM kuřecích embryí, jak bylo popsáno výše. Retrovirus obsahující RCAS-GFP nebo RCAS-Src 251 byl místně aplikován na předem vytvořené nádory větší než 50 mg. Reprezentativní mikrofotografie fragmentu meduloblastomového nádoru infiko55 váného RCAS-GFP, který exprimuje GFP, odhaluje expresi výlučně v krevních cévách nádoru

-24CZ 902918 B6 (šipka), jakje detekováno na optických řezech pomocí BioRad laserového konfokálního skenovacího mikroskopu (čárka = 500 pm). Obrázek 9B ukazuje výsledky z nádorů opracovaných jak bylo výše popsáno, které byly ponechány růst 3 nebo 6 dní, po nichž byly vyříznuty a byla určena jejich vlhká hmotnost. Údaje jsou vyjádřeny jako průměrná změna hmotnosti nádoru (od počáteční hmotnosti nádoru, která byla 50 pg) ± SEM ze dvou opakovaných měření. RCAS-Src 251 má výrazný vliv na růst nádoru po třech dnech (*, P < 0,002) a 6 dnech (**, P < 0,05). Obrázek 9C ukazuje reprezentativní mikrofotografie meduloblastomových nádorů chirurgicky odstraněných z embryí, které byly snímány stereomikroskopem Olympus (čárka = 350 pm). Na dolním panelu jsou mikrofotografie o vysokém zvětšení od každého nádoru, které v každém nádoru detailně ukazují jeho cévní zásobení (čárka = 350 pm). Šipka ukazuje prasklinu krevní cévy v nádoru léčeném pomocí RCAS-Src 251.

Výsledky ukazují, že podání RCAS obsahujícího Src 251 k předem vytvořeným meduloblastům má za následek selektivní virovou expresi v krevních cévách, které souvisí s nádorem (obrázek 9A) a to nakonec vedlo k regresi těchto nádorů během časového rozpětí šesti dnů (obrázek 9B). Je důležité, že krevní cévy souvisící s nádorem byly u živočichů léčených pomocí viru obsahujícího Src 251 silně popraskané a byl jich menší počet ve srovnání s nádorovými cévami u kontrolních živočichů (obrázek 9C). Skutečnost, že nádory infikované RCAS-GFP vykazovaly lokalizaci GFP pouze v cévním zásobení nádoru naznačuje, že protinádorové účinky pozorované u retrovirem dodávaného Src 251, byly způsobeny jeho angiogenními vlastnostmi.

Předcházející příklady a doprovodný popis jsou ilustrativní a nemají být brány jako omezující. Předložený vynález také nemůže být omezen na rozsah buněčných linií, které jsou k dispozicí, protože se jedná o jednu ilustraci jednoho aspektu vynálezu. Jakákoli buněčná linie, která je funkčně rovnocenná, spadá do rozsahu tohoto vynálezu. Uložení materiálu nezakládá důvod k předpokladu, že zde obsažený popis není postačující k tomu, aby bylo podle něho možno uskutečnit prakticky kterýkoli rys vynálezu, včetně jeho nejlepších způsobů provedení, ani nesmí být chápán tak, že omezuje rozsah nároků pouze na specifické příklady, které představuje. Opravdu budou osobám se zkušeností v oboru, na základě předchozího popisu zřejmé různé modifikace vynálezu vedle těch, které jsou zde ukázány a popsány, a ty budou též spadat do rozsahu připojených nároků.

Claims (21)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický prostředek pro použití v potenciaci angiogeneze v cílové savčí tkáni spojené s chorobným stavem vybraným ze skupiny obsahující slabý krevní oběh, ischemíi končetin a chronická poranění, vyznačující se tím, že obsahuje virový nebo nevirový expresní vektor obsahující nukleotidovou sekvenci schopnou exprimovat protein Src mající SEQ ID NO:3, ve které byl zbytek v poloze 527 nahrazen jakýmkoli aminokyselinovým zbytkem kromě tyrosinu, šeřinu nebo threoninu.
2. 2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že vektor je geny přenášející virový vektor, přičemž prostředek dále obsahuje farmaceutický přijatelný nosič nebo excipient.
3. 3. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že proteinem Src je Src A mající SEQ ID NO:3 zahrnující mutaci Y527F.
4. 4. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že tkáň je tkání se slabým krevním oběhem.

   -25 CZ 902918 B6
5. 5. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že prostředek je určen pro intravenózní, transdermální, intrasynoviální, intramuskulární nebo orální podávání.
6. 6. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že prostředek je

   5 určen pro podání jednotlivé intravenózní dávky.
7. 7. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že prostředek dále obsahuje lipozómy.

   io
8. 8. Použití Src majícího SEQIDNO:3, ve které byl zbytek v poloze 527 nahrazen jakýmkoli aminokyselinovým zbytkem, kromě tyrozinu, šeřinu a threoninu nebo nukleotidové sekvence schopné exprimovat tento protein Src pro přípravu farmaceutického prostředku pro potenciaci angiogeneze vtkáni spojené schorobným stavem vybraným ze skupiny obsahující slabý krevní oběh, ischemti končetin a chronická poranění.
9. 9. Použití podle nároku 8, kde protein Src je Src A mající SEQIDNO:3 zahrnující mutaci Y527F.
10. 10. Použití podle nároku 8, kde tkání je tkáň se slabým krevním oběhem.
11. 11. Použití ínaktívního proteinu Src nebo nukleotidové sekvence schopné exprese inaktivního proteinu Src, kde inaktivní protein Src je vybrán z Src proteinu majícího SEQ IDNO:3 zkrácenou na prvních 251 aminokyselin a Src proteinu majícího SEQ ID NO:3 s mutací K295M pro přípravu farmaceutického prostředku pro inhibici angiogeneze v tkáni spojené s chorobným sta25 vem vybraným ze skupiny obsahující artritidu, revmatickou artritidu, solidní nádor, metastázu solidního nádoru, retínopatii, diabetickou retinopatii, makulámí degeneraci, restenózu a zánětlivá onemocnění.
12. 12. Použití podle nároku 11, kde tkání je zanícená tkáň a stavem je artritida nebo revmatická

    30 artritida.
13. 13. Použití podle nároku 11, kde tkání je tkáň solidního tumoru nebo metastáza solidního nádoru.

    35
14. 14. Použití podle nároku 13, kde farmaceutický prostředek je určen pro podání ve spojení s chemoterapií.
15. 15. Použití podle nároku 11, kde tkání je retinová tkáň a stavem je retinopatie, diabetická retinopatie nebo makulámí degenerace.
16. 16. Použití podle nároku 11, kde tkání je tkáň na místě koronární angioplastiky a tkáň s rizikem reste nózy.
17. 17. Použití podle nároku 8 nebo 11, kde prostředek je určen pro intravenózní, transdermální,

    45 intrasynoviální, intramuskulární nebo orální podání.
18. 18. Použití podle nároku 8 nebo 11, kde prostředek je určen pro podání jednotlivé intravenózní dávky.

    50
19. 19. Použití podle nároku 8 nebo 11, kde prostředek dále obsahuje lipozómy.
20. 20. Použití podle nároku 8 nebo 11, kde prostředek obsahuje retrovirový expresní vektor, který je schopný exprese uvedené nukleotidové sekvence.

    -26CZ 902918 B6
21. 21. Použití podle nároku 8 nebo 11, kde prostředek obsahuje nevirový expresní vektor, který je schopen exprese uvedené nukleotidové sekvence.

    18 stránek sekvencí +

    10 výkresů