SK287330B6 - Použitie Src proteínu alebo nukleovej kyseliny obsahujúcej nukleotidovú sekvenciu kódujúcu Src proteín na prípravu farmaceutickej kompozície na moduláciu angiogenézy - Google Patents

Abstract

Opisuje sa použitie Src proteínu alebo nukleovej kyseliny obsahujúcej nukleotidovú sekvenciu kódujúcu Src proteín na prípravu farmaceutickej kompozície na moduláciu angiogenézy v tkanive, ktoré je poškodené angiogénnym ochorením alebo stavom. Inhibícia angiogenézy sa uskutočňuje pomocou neaktívneho Src proteínu alebo nukleových kyselín, ktoré ho kódujú. Potenciovanie angiogenézy sa uskutočňuje pomocou aktívneho Src proteínu alebo nukleových kyselín, ktoré ho kódujú. Nukleová kyselina je včlenená do lipozómu alebo do retrovírusového vektora schopného exprimovať nukleotidovú sekvenciu.

Description

Predkladaný vynález sa vo všeobecnosti týka medicíny a konkrétne použitia Src proteínu alebo nukleovej kyseliny obsahujúcej nukleotidovú sekvenciu kódujúcu Src proteín na prípravu farmaceutickej kompozície na moduláciu angiogenézy pomocou proteínu tyrozínkinázy Src, variantov Src a nukleových kyselín, ktoré ich kódujú.

Doterajší stav techniky

Angiogenéza predstavuje proces vaskularizácie tkaniva, ktorý zahrnuje rast novo sa vytvárajúcich krvných ciev dovnútra tkaniva a označuje sa taktiež ako neovaskularizácia. Tento proces je sprostredkovaný infiltráciou endoteliálnych buniek a buniek hladkého svalstva. Predpokladá sa, že tento proces postupuje ktoroukoľvek z nasledujúcich troch ciest: cievy môžu „vyrásť pučaním“ už z existujúcich ciev, vývin ciev de novo môže započať z prekurzorových buniek (vaskulogenéza), alebo existujúce malé cievy môžu zväčšiť svoj priemer. Blood a kol., Biochim. Biophys. Acta, 1032: 89-118 (1990).

Angiogenéza je dôležitým procesom neonatálneho rastu, ale je dôležitá taktiež pri hojení rán a v patogenéze širokého spektra klinicky závažných ochorení, vrátane zápalu tkanív, artritídy, rastu nádorov, diabetickej retinopatie, degenerácie žltej škvrny následkom neovaskularizácie dúhovky a podobných stavov. Tieto klinické prejavy súvisiace s angiogenézou sa označujú ako angiogénne ochorenia. Folkman a kol., Science, 235: 442-447 (1987). Angiogenéza sa zvyčajne nevyskytuje v dospelých alebo zrelých tkanivách, hoci sa vyskytuje pri hojení rán a pri rastovom cykle žltého telieska. Pozri napríklad Moses a kol., Science, 248: 1408-1410(1990).

Predpokladá sa, že inhibícia angiogenézy by bola vhodnou terapiou na obmedzenie rastu nádorov. Navrhlo sa, že k inhibícii angiogenézy dochádza (1) inhibíciou uvoľňovania „angiogénnych molekúl“, ako je bFGF (bázický fibroblastový rastový faktor), (2) neutralizáciou angiogénnych molekúl, napríklad pomocou anti-3bFGF protilátok, (3) použitím inhibítorov vitronektínového receptora α_νβ₃ a (4) inhibíciou odpovede endoteliálnych buniek na angiogénne stimuly. Práve posledne menovanej stratégii sa venovala pozornosť, pričom Folkman a kol., Cancer Biology, 3: 89-96 (1992) opísali niekoľko inhibítorov odpovede endoteliálnych buniek, vrátane kolagenázového inhibítora, inhibítorov obnovy bazálnej membrány, angiostatických steroidov, inhibítorov angiogenézy získaných z plesní, doštičkového faktora 4, trombospondínu, liekov proti artritíde, ako je D-penicilamín a tiomalát zlata, analógov vitamínu D₃, alfa-interferónu a podobných inhibítorov, ktoré by sa mohli použiť na inhibíciu angiogenézy. Ďalšie navrhované inhibítory angiogenézy opísali vo svojich prácach Blood a kol., Biochim. Biophys. Acta, 1032: 89-118 (1990), Moses a kol., Science, 248: 1408-1410 (1990), Ingber a kol., Lab. Invest., 59: 44-51 (1988) a sú opísané v patentoch USA č. 5 092 885, 5 112 946, 5 192 744, 5 202 352, 5 753 230 a 5 766 591. Žiadny z inhibítorov angiogenézy, ktoré sa opísali v predchádzajúcich literárnych odkazoch, nezahrnuje Src proteíny.

Na to, aby došlo k angiogenéze, endoteliálne bunky musia najprv degradovať bazálnu membránu krvnej cievy a prejsť cez ňu podobným spôsobom, aký využívajú nádorové bunky počas invázie a tvorby metastáz.

Predkladatelia už predtým opísali, že angiogenéza závisí od interakcie medzi cievnymi integrínmi a proteínmi extracelulámeho matrixu. Brooks a kol., Science, 264: 569-571 (1994). Okrem toho sa zistilo, že programovaná smrť bunky (apoptóza) sa v prípade angiogénnych vaskulárnych buniek iniciuje interakciou, ktorú by bolo možné inhibovať istými antagonistami cievneho integrínu α_νβ₃. Brooks a kol., Celí, 79: 1157-1164 (1994). Nedávno predkladatelia zistili, že väzba matrixovej metaloproteinázy-2 (MMP-2) s vitronektínovým receptorom (α_νβ₅) sa môže inhibovať pomocou α_νβ₅ antagonistov, čím sa inhibuje i enzymatická funkcia tejto proteinázy. Brooks a kol., Celí, 85: 683-693 (1996).

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález sa zaoberá použitím Src proteínu alebo nukleovej kyseliny obsahujúcej nukleotidovú sekvenciu kódujúcu Src proteín na prípravu farmaceutickej kompozície na moduláciu angiogenézy.

Uvažuje sa o kompozíciách a spôsoboch modulácie angiogenézy v tkanive súvisiacom s chorobným stavom. Kompozícia zahrnujúca množstvo Src proteínu modulujúce angiogenézu sa podáva do tkaniva, kde sa má liečiť chorobný stav, ktorý reaguje na moduláciu angiogenézy. Táto kompozícia poskytujúca Src proteín môže obsahovať purifikovaný proteín, biologicky aktívne proteínové fragmenty, rekombinantne produkovaný Src proteín alebo proteínové fragmenty, alebo fuzne proteíny, alebo expresné vektory vo forme génu alebo nukleovej kyseliny na expresiu Src proteínu.

V prípade, keď je Src proteín inaktivovaný alebo inhibovaný, táto modulácia sa prejaví inhibíciou angiogenézy. V prípade, keď Src proteín je aktívny alebo aktivovaný, táto modulácia sa prejaví potenciáciou angiogenézy.

Tkanivom, ktoré sa má liečiť, môže byť ktorékoľvek tkanivo, v ktorom je modulácia angiogenézy výhodná. V prípade inhibicie angiogenézy je výhodné liečiť choré tkanivo, v ktorom dochádza k zhubnej neovaskularizácii. Medzi typické príklady takýchto tkanív patrí zapálené tkanivo, tuhé nádory, metastázy, tkanivá podliehajúce restenóze a podobné tkanivá.

V prípade potenciácie angiogenézy je výhodné liečiť pacientov s ischemickými končatinami, u ktorých dochádza k nedostatočnej cirkulácii v končatinách následkom cukrovky alebo iných stavov. Liečiť sa môžu taktiež pacienti s chronickými ranami, ktoré sa nehoja, a preto môžu títo pacienti profitovať z nárastu vaskulámej bunkovej proliferácie a neovaskularizácie.

Obzvlášť výhodným je použitie Src proteínu obsahujúceho modifikovanú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá sa tu opisuje. Zverejňuje sa tu tiež niekoľko obzvlášť výhodných modifikovaných Src proteinov a ich expresia.

Takže predkladaný vynález obsahuje farmaceutickú kompozíciu na stimuláciu angiogenézy v cieľovom cicavčom tkanive zahrnujúcu prenos génov na báze vírusového alebo nevírusového vektora obsahujúceho nukleovú kyselinu, pričom spomínaná nukleová kyselina má segment nukleovej kyseliny, ktorý kóduje src proteín, pričom spomínaný src proteín má na mieste kodónu 527 akýkoľvek aminokyselinový zvyšok okrem tyrozínu, serínu alebo treonínu, a táto farmaceutická kompozícia sa nachádza vo farmaceutický prijateľnom nosiči alebo vehikule.

Opisuje sa taktiež farmaceutická kompozícia na inhibiciu angiogenézy v cieľovom cicavčom tkanive zahrnujúca vírusový alebo nevírusový vektor na prenos génov obsahujúci nukleovú kyselinu, pričom spomínaná nukleová kyselina má segment nukleovej kyseliny, ktorý kóduje src proteín, pričom spomínaný src proteín nemá žiadnu kinázovú aktivitu, a táto farmaceutická kompozícia sa nachádza vo farmaceutický prijateľnom nosiči alebo vehikule.

Prehľad obrázkov na výkresoch

V obrázkoch tvoriacich časť tohto podania:

Obrázok 1 predstavuje cDNA sekvenciu kuracieho c-Src, ktorá je úplnou kódujúcou sekvenciou s deletovanými intrónmi tak, ako ju po prvýkrát opísali Takeya a kol., Celí, 32: 881-890 (1983). Táto sekvencia je dostupná cez prístupové číslo génovej banky (GenBank Accession Number) J00844. Táto sekvencia obsahuje 1759 nukleotidov, pričom časť kódujúca tento proteín začína nukleotidom v polohe 112 a končí nukleotidom v polohe 1713.

Obrázok 2 predstavuje kódovanú sekvenciu aminokyselinových zvyškov kuracieho c-Src na základe kódujúcej sekvencie zobrazenej na obrázku 1.

Obrázok 3 predstavuje cDNA sekvenciu ľudského c-Src tak, ako ju po prvýkrát opísali Braeuninger a kol., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 10411-10415 (1991). Táto sekvencia je dostupná cez prístupové číslo génovej banky (GenBank Accession Number) X59932 X71157. Táto sekvencia obsahuje 2187 nukleotidov, pričom časť kódujúca tento proteín začína nukleotidom v polohe 134 a končí nukleotidom v polohe 1486.

Obrázok 4 predstavuje kódovanú sekvenciu aminokyselinových zvyškov ľudského c-Src na základe kódujúcej sekvencie zobrazenej na obrázku 3.

Obrázok 5 zobrazuje aktiváciu endogénneho Src pomocou bFGF alebo VEGF tak, ako sa to opisuje v príklade 4. Horná časť obrázka znázorňuje výsledky in vitro stanovenia kinázy s násobkami aktivácie endogénneho c-Src buď pomocou bFGF, alebo VEGF. Spodná časť obrázka znázorňuje výsledky blotu stanovenia kinázy, pričom ako kontrola ekvivalentného obsahu Src a IgG sa použila anti-Src protilátka.

Obrázok 6 zobrazuje účinok retrovírusom sprostredkovaného prenosu génu c-Src A na angiogenézu v kuracej chorioalantoidnej membráne (CAM) tak, ako sa to opisuje v príklade 4. CAM z deväťdňových kurčiat sa na 72 hodín vystavili účinku retrovírusu s RCAS-Src A (aktívny mutovaný c-Src) alebo kontrolnému retrovírusu s RCAS-GFP (zelený fluorescenčný proteín; fluorescenčný indikátorový proteín) alebo účinku tlmivého roztoku. Rozsah angiogenézy sa kvantifikoval tak, ako je to zobrazené na obrázku 6A a na typických mikrofotografiách (4x) na obrázku 6B, ktoré sa získali pomocou stereomikroskopu, pričom každá zodpovedá príslušnému variantu pokusu.

Obrázok 7 zobrazuje retrovírusovú expresiu c-Src A v prípade fosforylácie aktivujúcej vaskulámu MAP kinázu. Na obrázku 7A sú zobrazené tkanivové extrakty z 10 dňových kuracích CAM, ktoré sa na 30 minút vystavili účinku VEGF alebo PMA, alebo ktoré sa infikovali c-Src A retrovírusom 48 hodín. NT znamená bez ovplyvnenia. Src sa imunoprecipitoval z ekvivalentných množstiev celkového proteínového extraktu a podrobil sa in vitro imunostanoveniu kinázy pomocou fúzneho proteínu FAK-GST ako substrátu, s následnou elektroforézou a prenosom na nitrocelulózu. V alikvotných dieloch spomínaných lyzátov celého tkaniva sa merala taktiež endogénna fosforylácia ERK pomocou imunoblotovania s anti-fosfo-ERK protilátkou. Na obrázku 7B sú zobrazené 10-dňové CAM, ktoré sa infikovali kontrolným RCAS alebo RCAS obsahujúcim SRC A. Po dvoch dňoch sa CAM odstránili, konzervovali sa chladom v OCT a rezali sa na 4 pm rezy. Rezy sa kontrastovali protilátkou proti fosforylovanému ERK (New England Biolabs), premyli sa a vyhodnocovali sa pomocou kozej anti-králičej sekundárnej protilátky s konjugovaným FITC. Fluorescenčné snímky sa zaznamenali pomocou chladenej CCD kamery (Princeton Inst.).

Obrázok 8 zobrazuje selektívnu potrebu Src aktivity počas angiogenézy indikovanej VEGF na rozdiel od angiogenézy indikovanej bFGF. 9-dňové kuracie CAM sa vystavili účinku retrovírusu RCAS-Src 251 alebo kontrolnému retrovírusu RCAS-GFP, alebo účinku tlmivého roztoku na 20 hodín a potom sa ďalej inkubovali 72 hodín v prítomnosti alebo neprítomnosti bFGF alebo VEGF. Rozsah angiogenézy sa kvantifikoval na obrázku 8A tak, ako sa to opísalo a typické mikrofotografie (6x) zobrazené na obrázku 8B sa získali pomocou stereomikroskopu. Na obrázku 8C je zobrazený blot získaný s anti-Src protilátkou na potvrdenie expresie Src 251 v transfekovaných bunkách v porovnaní s kontrolnými ovplyvneniami.

Obrázok 9 zobrazuje výsledky retrovírusového prenosu RCAS-Src 251 do ľudských nádorov. Na obrázku 9A je mikro fotografia, ktorá zobrazuje fragment ľudského meduloblastómového nádoru infikovaného RCAS-GFP (RCAS-zelený fluorescenčný proteín) exprimujúcim GFP výhradne v nádorových krvných cievach (šípka) tak, ako sa to zobrazilo na optických rezoch získaných pomocou konfokálneho rastrovacieho mikroskopu Bio Rad (úsečka = 500 pm). Obrázok 9B zobrazuje výsledky nádorov ovplyvnených topickou aplikáciou retrovírusu, pričom tieto nádory sa nechali rásť 3 alebo 6 dní. Potom sa odstránili a stanovila sa ich čerstvá hmotnosť. Výsledky sa vyjadrili ako stredná zmena hmotnosti nádoru (vychádzajúc z počiatočnej hmotnosti nádoru 50 mg) +/- SEM pre dve opakovania. Na obrázku 9C sú typické mikrofotografie meduloblastómových nádorov chirurgicky odstránených z embryí (úsečka = 350 pm). Spodná skupina snímok predstavuje veľké zväčšenia každého z týchto nádorov, detailne zobrazujúce vaskulatúru každého nádoru (úsečka = 350 pm). Šípka označuje porušenie krvnej cievy v nádoroch ovplyvnených RCAS-Src 251.

Obrázok 10 predstavuje schému reštrikčnej mapy vektorového konštruktu RCASBP (RCAS).

Detailný opis vynálezu

A. Definície

Aminokyselinový zvyšok: aminokyselina vytvorená po chemickom štiepení (hydrolýze) polypeptidu v miestach jeho peptidových väzieb. Aminokyselinové zvyšky, ktoré sa tu opisujú, sú výhodne v „L“ izomémej forme. Ale zvyšky v „D“ izomémej forme môžu nahradiť ľubovoľné L-aminokyselinové zvyšky, pokiaľ si polypeptid zachová požadovanú funkčnú vlastnosť. NH₂ označuje voľnú aminoskupinu prítomnú na amino-konci polypeptidu. COOH označuje voľnú karboxylovú skupinu prítomnú na karboxy-konci polypeptidu. Dodržiava sa štandardné názvoslovie polypeptidov (opísané v J. Biol. Chem., 243: 3552-3559 (1969) a prijaté na 37 CFR § 1 822(b)(2)).

Je potrebné všimnúť si, že všetky sekvencie aminokyselinových zvyškov sa tu zobrazujú vzorcami, ktorých ľavá a pravá orientácia je v zaužívanom smere od amino-konca ku karboxy-koncu. Ďalej by sa malo poznamenať, že pomlčka na začiatku alebo na konci sekvencie aminokyselinových zvyškov indikuje peptidovú väzbu s ďalšou sekvenciou tvorenou jedným alebo viacerými aminokyselinovými zvyškami.

Polypeptid: označuje lineárnu postupnosť aminokyselinových zvyškov, ktoré sú navzájom spojené peptidovou väzbou medzi alfa-aminoskupinou a karboxyskupinou nasledujúceho aminokyselinového zvyšku.

Peptid: tak ako sa tu používa, označuje lineárnu postupnosť nie viac ako 50 aminokyselinových zvyškov, ktoré sú navzájom spojené tak, ako je tomu v polypeptide.

Cyklický peptid: označuje zlúčeninu, ktorá má kruhovú štruktúru s heteroatómom, a ktorá zahrnuje niekoľko amidových väzieb tak, ako je tomu v typickom peptide. Cyklický peptid môže byť lineárnym peptidom, ktorý sa uzatvoril do kruhu podľa orientácie hlava-päta, a v ktorom N-koniec lineárneho peptidu vytvoril amidovú väzbu s koncovým karboxylátom lineárneho peptidu, alebo cyklický peptid môže obsahovať kruhovú štruktúru, v ktorej je polymér homodetný alebo heterodetný a zahrnuje amidové väzby a/alebo iné väzby potrebné na uzavretie kruhu, ako sú disulfidové mostíky, tioesterové, tioamidové, guanidínové a podobné väzby.

Proteín: označuje lineárnu postupnosť viac ako 50 aminokyselinových zvyškov, ktoré sú navzájom spojené tak, ako je tomu v polypeptide.

Fúzny proteín: označuje polypeptid obsahujúci aspoň dve odlišné polypeptidové domény spojené („fuzované“) typickou peptidovou väzbou, pričom tieto dve domény zodpovedajú peptidom, ktoré sa v prírode nenachádzajú navzájom spojené.

Syntetický peptid: označuje chemicky vytvorený reťazec aminokyselinových zvyškov viazaných spolu peptidovými väzbami, pričom takýto reťazec neobsahuje prirodzene sa vyskytujúce proteíny a ich fragmenty.

B. Všeobecné ustanovenia

Predkladaný vynález sa vo všeobecnosti týka zistenia, že angiogenéza je sprostredkovaná Src proteínom tyrozínkinázy, a že angiogenéza sa môže modulovať poskytnutím aktívnych alebo neaktívnych Src proteínov, ktoré potenciujú respektíve inhibujú angiogenézu.

Toto zistenie je dôležité vzhľadom na úlohu, ktorú angiogenéza, tvorba nových krvných ciev, zohráva v rôznych chorobných procesoch. V prípade, keď tkanivá súvisiace s chorobou vyžadujú na svoj rast angiogenézu, je výhodné angiogenézu inhibovať a týmto spôsobom inhibovať tiež rast chorého tkaniva. V prípade, keď sa na rast a hojenie poškodeného tkaniva vyžaduje angiogenéza, je výhodné potenciovať alebo podporiť angiogenézu a týmto spôsobom napomôcť tiež hojeniu a rastu tkaniva.

Inhibícia angiogenézy bude znižovať zhubné vplyvy choroby v tom prípade, keď rast nových krvných ciev je príčinou, alebo prispieva k patológii súvisiacej s chorobu postihnutým tkanivom. Inhibíciou angiogenézy je možné zasiahnuť do danej choroby, zlepšiť jej symptómy a v niektorých prípadoch chorobu vyliečiť.

Príklady tkaniva súvisiaceho s chorobou a neovaskularizáciou, ktoré profitujú z inhibičnej modulácie angiogenézy, zahrnujú reumatoidnú artritídu, diabetickú retinopatiu, zápalové ochorenia, restenózu a podobne. Tam, kde je rast zhubného tkaniva podmienený rastom nových krvných ciev, bude inhibícia angiogenézy znižovať zásobovanie tkaniva krvou, a tým prispeje k redukcii množstva tkaniva závislého od krvného zásobovania. Príklady zahrnujú rast nádorov, v prípade ktorých je neovaskularizácia trvalou požiadavkou na to, aby mohol nádor rásť viac ako do hrúbky niekoľkých milimetrov, ako i na to, aby sa založili tuhé nádorové metastázy.

Tam, kde sa predpokladá, že rast nových ciev prispeje k hojeniu tkaniva, bude potenciácia angiogenézy napomáhať hojeniu. Príklady zahrnujú liečbu pacientov s ischemickými končatinami, u ktorých dochádza k nedostatočnej cirkulácii v končatinách následkom cukrovky alebo iných stavov. Uvažuje sa taktiež o pacientoch s chronickými ranami, ktoré sa nehoja, a preto by títo pacienti mohli profitovať z nárastu delenia vaskulámych buniek a z neovaskularizácie.

Spôsoby predkladaného vynálezu sú účinné sčasti preto, že terapia je vysoko selektívna pre angiogenézu, a nie pre ostatné biologické procesy.

Ako sa už opísalo, angiogenéza zahrnuje rôzne procesy, ktorých súčasťou je neovaskularizácia tkaniva, vrátane „vyrastania pučaním“, vaskulogenézy, alebo zväčšovania priemeru cievy, pričom všetky tieto procesy angiogenézy sú ovplyvnené Src proteínom. Predpokladá sa, že s výnimkou hojenia traumatických rán, tvorby žltého telieska a embryogenézy, sa väčšina procesov angiogenézy spája s chorobnými procesmi, a preto je použitie predkladaných terapeutických spôsobov selektívne pre toto ochorenie a nemá zhubné vedľajšie účinky.

C. Src proteíny

Proteín tyrozínkinázy Src vhodný na použitie v predkladanom vynáleze sa môže líšiť v závislosti od zamýšľaného použitia. Pojmy „Src proteín“ alebo „Src“ sa používajú na spoločné označovanie rôznych foriem proteínu tyrozínkinázy Src, ktorý sa tu opisuje, či v aktívnej, alebo neaktívnej forme.

Pojem „aktívny Src proteín“ označuje ktorúkoľvek z mnohých foriem Src proteínu, ktorá potenciuje angiogenézu. Opisujú sa tu stanovenia na meranie potenciácie angiogenézy, ale nemali by sa považovať za obmedzujúce. Proteín sa považuje za aktívny, ak je rozsah angiogenézy väčší aspoň o 10 %, výhodne o 25 % a ešte výhodnejšie väčší o 50 % v porovnaní s kontrolou, v prípade ktorej sa do stanovenia nepridal žiadny Src proteín. Výhodným stanovením na meranie potenciácie je CAM stanovenie pomocou vírusového vektora RCAS tak, ako sa to opisuje v príkladoch uskutočnenia vynálezu, v prípade ktorého sa angiogénny index počíta zratávaním miest vetvenia. Výhodný aktívny Src proteín má taktiež tyrozínkinázovú aktivitu. Typické príklady aktívnych Src proteínov sa opisujú v príkladoch uskutočnenia vynálezu a zahrnujú Src-A.

Pojem „neaktívny Src proteín“ označuje ktorúkoľvek z mnohých foriem Src proteínu, ktorá inhibuje angiogenézu. Opisujú sa tu stanovenia na meranie inhibície angiogenézy, ale nemali by sa považovať za obmedzujúce. Proteín sa považuje za neaktívny, ak je rozsah angiogenézy menší aspoň o 10 %, výhodne o 25 % a ešte výhodnejšie menší o 50 % v porovnaní s kontrolou, v prípade ktorej sa do stanovenia nepridal žiadny Src proteín. Výhodným stanovením na meranie potenciácie je CAM stanovenie pomocou vírusového vektora RCAS tak, ako sa to opisuje v príkladoch uskutočnenia vynálezu, v prípade ktorého sa angiogénny index počíta zratávaním miest vetvenia. Výhodný neaktívny Src proteín má taktiež zníženú tyrozínkinázovú aktivitu. Typické príklady neaktívnych Src proteínov sa opisujú v príkladoch uskutočnenia vynálezu a zahrnujú Src-251.

Src proteín, ktorý je výhodný pre predkladaný vynález, sa môže pripraviť ľubovoľným z mnohých spôsobov vrátane izolácie z prirodzených zdrojov vrátane tkaniva, produkciou pomocou expresie rekombinantnej DNA a purifikácie a podobne. Src proteín sa môže poskytnúť taktiež „in situ“ vnesením prostriedku na génovú terapiu do sledovaného tkaniva, pričom tento prostriedok potom exprimuje tento proteín v tomto tkanive.

Gén kódujúci Src proteín sa môže pripraviť rôznymi spôsobmi, ktoré sú známe v danej oblasti, a tento vynález by sa nemal považovať za obmedzujúci v tomto zmysle. Je napríklad dobre známe, že Src zahrnuje početné homológy z cicavcov, vtákov, vírusov a iných podobných druhov, a tento gén sa môže ľahko klonovať pomocou cDNA klonovacích spôsobov z ľubovoľného tkaniva, ktoré exprimuje tento proteín. Výhodným Src na použitie v tomto vynáleze je bunkový proteín, akým sú cicavčie alebo vtáčie homológy označené c-Src. Obzvlášť výhodným je ľudský c-Src.

D. Rekombinantné DNA molekuly a systémy expresie vhodné na expresiu Src proteínu

Tento vynález opisuje niekoľko nukleotidových sekvencií, ktoré majú osobitné použitie v predkladanom vynáleze. Tieto sekvencie zahrnujú sekvencie kódujúce Src proteín využiteľný v tomto vynáleze a rôzne segmenty DNA, molekuly rekombinantnej DNA (rDNA) a vektory skonštruované na expresiu Src proteínu.

DNA molekuly (segmenty) tohto vynálezu môžu preto zahrnovať sekvencie, ktoré kódujú celé štrukturálne gény, fragmenty štrukturálnych génov a transkripčné jednotky tak, ako sa to ďalej opisuje.

Výhodným segmentom DNA je nukleotidová sekvencia, ktorá kóduje Src proteín tak, ako sa tu definoval, alebo jeho biologicky aktívny fragment.

Sekvencia aminokyselinových zvyškov a nukleotidová sekvencia výhodného c-Src sa opisuje v príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Výhodný segment DNA kóduje sekvenciu aminokyselinových zvyškov, ktorá je v podstate rovnaká ako sekvencia aminokyselinových zvyškov zodpovedajúca tu opísanému Src proteínu, alebo ako jej časti, pričom je výhodné, ak tento výhodný segment DNA kóduje sekvenciu aminokyselinových zvyškov, ktorá v podstate pozostáva zo sekvencie aminokyselinových zvyškov zodpovedajúcej tu opísanému Src proteínu, alebo z častí tejto sekvencie. Typické a výhodné segmenty DNA sa ďalej opisujú v príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Sekvencia aminokyselinových zvyškov proteínu alebo polypeptidu je prostredníctvom genetického kódu v priamom vzťahu k sekvencií deoxyribonukleovej kyseliny (DNA) štrukturálneho génu, ktorý kóduje tento proteín. Takže štrukturálny gén alebo segment DNA sa môže definovať na základe sekvencie aminokyselinových zvyškov, t. j. na základe proteínu alebo polypeptidu, ktorý kóduje.

Dôležitou a dobre známou vlastnosťou genetického kódu je jeho redundantnosť. To znamená, že pre väčšinu aminokyselín, ktoré vytvárajú proteíny, existuje viac ako jeden kódujúci nukleotidový triplet (kodón), ktorý môže kódovať alebo určovať konkrétny aminokyselinový zvyšok. Preto konkrétnu sekvenciu aminokyselinových zvyškov môžu kódovať početné rôzne nukleotidové sekvencie. Takéto nukleotidová sekvencie sa považujú za funkčne rovnocenné, pretože ich výsledkom môže byť vytvorenie tej istej sekvencie aminokyselinových zvyškov vo všetkých organizmoch. Príležitostne sa do danej nukleotidovej sekvencie môže včleniť metylovaný variant purínu alebo pyrimidínu. Ale takéto metylácie žiadnym spôsobom neovplyvňujú kódovacie vzťahy.

Nukleovou kyselinou je akýkoľvek polynukleotid alebo fragment nukleovej kyseliny, či už ide o polyribonukleotid alebo o polydeoxyribonukleotid, t. j. RNA alebo DNA, alebo o ich analógy. Vo výhodných uskutočneniach je molekula nukleovej kyseliny vo forme segmentu tvoreného dvojvláknovou DNA, t. j. segmentu DNA, hoci v prípade istých molekuláme-biologických metodík sa uprednostňuje jednovláknová DNA alebo RNA.

Segmenty DNA sa pripravujú mnohými spôsobmi vrátane metód chemickej syntézy a rekombinantných prístupov, výhodne pomocou klonovania alebo pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). DNA segmenty, ktoré kódujú časti Src proteínu, sa môžu ľahko syntetizovať pomocou chemických postupov, napríklad pomocou fosfotriesterovej metódy, ktorú opísali Matteucci a kol., J. Am. Chem. Soc., 103: 3185-3191, 1981, alebo pomocou metód automatizovanej syntézy. Okrem toho sa väčšie DNA segmenty môžu ľahko pripraviť dobre známymi spôsobmi, ako je napríklad syntéza skupiny oligonukleotidov, ktorá určuje segment DNA, s následnou hybridizáciou a ligáciou oligonukleotidov na účely vytvorenia kompletného segmentu. Medzi alternatívne spôsoby patrí izolácia výhodného segmentu DNA pomocou PCR s použitím páru oligonukleotidových primárov na vyhľadanie úsekov, ktoré kódujú Src proteín, a ktoré sa môžu nachádzať v cDNA knižnici.

Samozrejme pomocou chemickej syntézy sa môžu vykonať akékoľvek výhodné modifikácie jednoduchým nahradením báz kódujúcich prirodzenú sekvenciu aminokyselín vhodnými bázami. Tento spôsob je dobre známy a môže sa ľahko aplikovať na prípravu rôznych navzájom sa líšiacich „modifikovaných“ Src proteínov, ktoré sa tu opisujú.

Navyše segmenty DNA, ktoré pozostávajú v podstate zo štrukturálnych génov kódujúcich Src proteín, sa môžu následne modifikovať miestne špecifickou alebo náhodnou mutagenézou, aby sa vniesli ľubovoľné žiaduce substitúcie.

1. Klonovanie Src génu

Src gén podľa tohto vynálezu sa môže klonovať z vhodného zdroja genómovej DNA alebo mediátorovej RNA (mRNA) rôznymi biochemickými metódami. Klonovanie týchto génov sa môže uskutočniť podľa všeobecných spôsobov opísaných v príkladoch uskutočnenia vynálezu a podľa znalostí v danej oblasti.

Zdroje nukleových kyselín na klonovanie Src génu vhodného na použitie v spôsoboch podľa tohto vynálezu môžu zahrnovať genómovú DNA alebo mediátorovú RNA (mRNA) vo forme cDNA knižnice z tkaniva, v ktorom sa predpokladá, že dochádza k expresii týchto proteinov. Výhodným tkanivom je ľudské tkanivo pľúc, hoci použiť sa môže tiež iné vhodné tkanivo.

Výhodný spôsob klonovania zahrnuje prípravu cDNA knižnice pomocou štandardných spôsobov a izoláciu nukleotidovej sekvencie kódujúcej Src pomocou PCR amplifikácie s použitím párových oligonukleotidových primérov založených na nukleotidových sekvenciách, ktoré sa tu opísali. Pri alternatívnom spôsobe sa žiaduce cDNA klony môžu identifikovať a izolovať z cDNA alebo z genómovej knižnice pomocou bežných spôsobov hybridizácie nukleovej kyseliny s použitím hybridizačnej sondy na základe sekvencií nukleovej kyseliny, ktoré sa tu opísali. Pre odborníkov v danej oblasti sú zrejmé ďalšie spôsoby izolácie a klonovania vhodných nukleových kyselín kódujúcich src.

Expresné vektory

V tomto vynáleze sa uvažuje o rekombinantnej molekule DNA (rDNA) obsahujúcej segment DNA, ktorý kóduje tu opísaný Src proteín. rDNA vhodná na expresiu sa môže pripraviť pomocou funkčného (vo fáze čítacieho rámca, exprimovateľného) spojenia vektora so segmentom DNA kódujúcim Src podľa predkladaného vynálezu. To znamená, že rekombinantná DNA molekula je hybridnou molekulou zahrnujúcou aspoň dve nukleové kyseliny s nukleotidovými sekvenciami, ktoré sa za normálnych okolností spolu v prírode nevyskytujú.

Ako je v tejto oblasti známe, výber vektora, na ktorý sa funkčne naviaže segment DNA podľa predkladaného vynálezu, záleží priamo od požadovaných funkčných vlastností, napr. od expresie proteínu a od hostiteľskej bunky, ktorá sa má transformovať. Ide o typické záležitosti, ktoré sa v oblasti konštruovania rekombinantných molekúl DNA berú do úvahy. Vektor, o ktorom sa uvažuje v predkladanom vynáleze, musí byť schopný aspoň riadiť replikáciu, a výhodne taktiež expresiu štrukturálneho génu, ktorý je zahrnutý v segmentoch vektorovej DNA, s ktorými je funkčne spojený.

Odborník v oblasti konštrukcie vektorov pozná tak prokaryotické, ako aj eukaryotické expresné vektory, ktoré opisujú Ausebel a kol., v „Current protocols in molecular biology“, Wiley and Sons, New York (1993) a Sambrook a kol., „Molecular cloning: A laboratory manual“, Cold Spring Harbor Laboratory (1989). V týchto citáciách sa opisujú taktiež mnohé zo všeobecných metód rekombinantnej DNA, ktoré sa tu citujú.

V jednom uskutočnení vektor, o ktorom sa uvažuje v prekladanom vynáleze, zahrnuje prokaryotický replikón, t. j. sekvenciu DNA, ktorá má schopnosť riadiť anonymnú replikáciu a udržať rekombinantnú molekulu DNA v extrachromozomálnej forme v prokaryotickej hostiteľskej bunke, akou je bakteriálna hostiteľská bunka transformovaná týmto replikónom. Takéto replikóny sú dobre známe v danej oblasti. Okrem toho, tie uskutočnenia, ktoré zahrnujú prokaryotický replikón, zahrnujú taktiež gén, ktorého expresia dáva bakteriálnemu hostiteľovi transformovanému týmto replikónom rezistenciu na antibiotiká. Typickými bakteriálnymi génmi rezistencie na antibiotiká sú gény poskytujúce rezistenciu na ampicilín alebo tetracyklín.

Tie vektory, ktoré zahrnujú prokaryotický replikón, môžu obsahovať taktiež prokaryotický promótor, ktorý je schopný riadiť túto expresiu (transkripciu a transláciu) štrukturálneho génu v bakteriálnej hostiteľskej bunke, ako je E. coli, ktorá sa transformovala týmto replikónom. Promótor predstavuje regulačný prvok expresie tvorený sekvenciou DNA, ktorá umožňuje väzbu RNA polymerázy a uskutočnenie transkripcie. Promótorové sekvencie, ktoré sú kompatibilné s bakteriálnymi hostiteľmi, sa zvyčajne poskytujú v plazmidových vektoroch obsahujúcich vhodné reštrikčné miesta na inzerciu segmentu DNA podľa predkladaného vynálezu. Typickým príkladom takýchto vektorových plazmidov sú pUC8, pUC9, pBR322 a pBR329, ktoré sú dostupné od Biorad Laboratories (Richmond, CA), pRSET dostupný od Invitrogen (San Diego, CA) a pPL a pKK223 dostupné od Pharmacia, Piscataway, N.J.

Na vytvorenie rekombinantnej molekuly DNA podľa predkladaného vynálezu sa môžu použiť taktiež expresné vektory kompatibilné s eukaryotickými bunkami, výhodne tie, ktoré sú kompatibilné s bunkami stavovcov. Expresné vektory eukaryotických buniek sú v danej oblasti dobre známe a sú dostupné z niekoľkých komerčných zdrojov. Zvyčajne takéto poskytnuté vektory obsahujú vhodné reštrikčné miesta na inzerciu žiaduceho segmentu DNA. Typickým príkladom takýchto vektorov sú pSVL apKSV-10 (Pharmacia), pBPV-l/pML2d (Intemational Biotechnologies, Inc.), pTDTl (ATCC, č. 31255), pRc/CMV (Invitrogen, Inc.), výhodný vektor opísaný v príkladoch uskutočnenia vynálezu a podobné eukaryotické expresné vektory.

Obzvlášť výhodný systém génovej expresie v kontexte tohto vynálezu zahrnuje prostriedok na prenos génov, to znamená schopnosť prenesenia génu do sledovaného tkaniva. Vhodnými vektormi sú „infekčné“ vektory, ako sú rekombinantné DNA vírusy, adenovírusové alebo retrovírusové vektory, ktoré sa geneticky upravujú tak, aby exprimovali požadovaný proteín, a aby mali vlastnosti, ktoré umožňujú infekciu dopredu vybraných cieľových tkanív. Obzvlášť výhodným je replikačne kompetentný vírus vtáčieho sarkómu (RCAS), ktorý sa tu opisuje.

Metódami génového inžinierstva sa môžu pripraviť cicavčie bunkové systémy, ktoré na riadenie expresie využívajú rekombinantné vírusy alebo vírusové elementy. Napríklad v prípade použitia adenovírusových ex presných vektorov sa kódujúca sekvencia polypeptidu môže spojiť ligáciou s edenovírusovým komplexom regulujúcim transkripciu/transláciu, napr. s neskorým promótorom a s vedúcou sekvenciou zloženou z troch častí. Tento chimérický gén sa potom môže vložiť inzerciou do adenovírusového genómu pomocou in vitro alebo in vivo rekombinácie. Výsledkom inzercie do neesenciálnej oblasti vírusového genómu (napr. oblasť El alebo E3) bude rekombinantný vírus, ktorý je životaschopný a exprimuje tento polypeptid v infikovaných hostiteľoch (napr. Logan a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 3655-3659 (1984)). Ako alternatíva sa môže použiť 7,5K promótor vírusu kravských kiahní (napr. Mackett a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79: 7415-7419 (1982); Mackett a kol., J. Virol., 49: 857-864 (1984); Panicali a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79: 4927-4931 (1982)). Obzvlášť zaujímavé sú vektory na báze bovinného papilomavírusu, ktoré majú schopnosť replikovať sa ako extrachromozomálne elementy (Sarver a kol., Mol. Celí. Biol., 1: 486 (1981)). Krátko po vstupe tejto DNA do cieľových buniek sa plazmid replikuje na približne 100 až 200 kópií na bunku. Transkripcia inzerciou vloženej cDNA si nevyžaduje integráciu tohto plazmidu do chromozómu hostiteľa, vďaka čomu sa dosahuje vysoká hladina expresie. Tieto vektory sa môžu použiť na stabilnú expresiu tým, že sa do plazmidu vloží marker vhodný na selekciu, akým je neo gén. V opačnom prípade sa retrovírusový genóm môže modifikovať tak, aby bol použiteľný ako vektor, ktorý je schopný vniesť nukleotidovú sekvenciu kódujúcu proteín a riadiť expresiu tejto sekvencie v hostiteľských bunkách (Cone a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 6349-6353 (1984)). Vysoká hladina expresie sa môže dosiahnuť taktiež pomocou indukovateľných promótorov, vrátane, ale bez obmedzenia, metalotionín IIA promótora a promótorov tepelného šoku.

V poslednom čase sa študovalo dlhodobé prežívanie holých myší s ľudským karcinómom ovárií, ktoré sa liečili génovou terapiou na báze tymidínkinázy (TK) riadenej cytomegalovírusovým (CMV) promótorom alebo promótorom vírusu Rousovho sarkómu (RSV). Účinnosť usmrcovania buniek adenovírusom sprostredkovanou génovou terapiou na báze TK vírusu herpes simplex riadeného CMV promótorom bola 2 až 10 krát efektívnejšia v porovnaní s terapiou riadenou RSV promótorom. (Tong a kol., 1999, Hybridoma 18(1): 93-97). Opísal sa taktiež návrh chimérických promótorov na aplikácie génovej terapie, ktoré si vyžadujú nízke hladiny expresie s následnou indukovateľnou vysokou hladinou expresie (Suzuki a kol., 1996, Human Gene Therapy 7: 1883-1893).

V prípade dlhodobej produkcie rekombinantných proteínov s vysokými výťažkami sa uprednostňuje stabilná expresia. Namiesto použitia expresných vektorov obsahujúcich vírusové začiatky replikácie sa hostiteľské bunky môžu transformovať cDNA, ktorá sa reguluje vhodnými regulačnými prvkami expresie (napr. promótorové a enhancerové sekvencie, terminátory transkripcie, polyadenylačné miesta atď.) a markerom vhodným na selekciu. Ako sa uviedlo, marker vhodný na selekciu, ktorý je prítomný v tomto rekombinantnom plazmide poskytuje rezistenciu na selekciu a umožňuje bunkám natrvalo integrovať tento plazmid do svojich chromozómov a rásť, vytvárajúc pritom kolónie, ktoré sa môžu následne klonovať a z nich sa môžu vytvoriť bunkové línie.

Napríklad po včlenení cudzorodej DNA sa geneticky upravené bunky môžu nechať rásť 1-2 dni v obohatenom médiu a potom sa prenesú na selekčné médium. Použiť sa môžu mnohé systémy na selekciu vrátane, ale bez obmedzenia, génov pre tymidínkinázu vírusu herpes simplex (Wigler a kol., Celí, 11: 223 (1997)), hypoxantín-guanínfosforybozyltransferázu (Szylabska a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 48: 2026 (1962)) a adenínfosforibozyltransferázu (Lowy a kol., Celí, 22: 817 (1980)), ktoré sa môžu použiť v prvom prípade pre bunky tk, v druhom prípade pre bunky hgprt a v poslednom prípade pre bunky aprt. Ako základ selekcie sa môžu použiť taktiež gény poskytujúce rezistenciu na antimetabolity, napríklad gény pre dhfr, ktoré poskytujú rezistenciu na metotrexát (Wigler a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77: 3567 (1980); O’Hare a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78: 1527 (1981); gpt, ktorý poskytuje rezistenciu na kyselinu mykofenolovú (Mulligan a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78: 2072 (1981); neo, ktorý poskytuje rezistenciu na aminoglykozid G-418 (Colberre-Garapin a kol., J. Mol. Biol., 150: 1 (1981); a hygro, ktorý poskytuje rezistenciu na hygromycín (Santerre a kol., Gene, 30: 147 (1984)). V poslednom čase sa opísali ďalšie gény vhodné na selekciu, menovite trpB, ktorý umožňuje bunkám využívať indol namiesto tryptofánu; hisD, ktorý umožňuje bunkám využívať histinol namiesto histidínu (Hartman a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 804 (1988)); a ODC (omitíndekarboxyláza), ktorá poskytuje rezistenciu na inhibítor omitíndekarboxylázy, 2-(difluórmetyl)-DL-omitín, DFMO (McConlogue L., v: „Current communications in molecular biology“, Cold Spring Harbor Laboratory ed., (1987)).

Hlavné vektory, o ktorých sa uvažuje v prípade ľudskej génovej terapie, sa odvodzujú z retrovírusového základu. (Wilson, 1997, Clin. Exp. Immunol. 107(sup. 1): 31-32; Bank a kol., 1996, Bioessays 18(12): 999-1007; Robbins a kol., 1998, Pharmacol. Ther. 80(1): 35-47). Terapeutický potenciál terapie na báze prenosu génov a „antisense terapie“ stimuloval vývoj mnohých vektorových systémov na liečbu rôznych tkanív, (cievy, Stephan a kol., 1997, Fundam. Clin. Pharmacol. 11(2): 97-110; Feldman a kol., 1997, Cardiovasc. Res. 35(3): 391-404; Vassalli a kol., 1997, Cardiovasc. Res. 35(3): 459-469; Baek a kol., 1998, Circ. Res. 82(3): 295-305; obličky, Lien a kol., 1997, Kidney Int. Suppl. 61: S85-88; pečeň, Ferry a kol., 1998, Hum. Gene Ther., 9(14): 1975-1981; svaly, Marshall a kol., 1998, Curr. Opn. Genet. Dev. 8(3): 360-365). Okrem týchto tkanív je dôležitým cieľom ľudskej génovej terapie rakovina, buď samotný nádor, alebo tkanivá, ktoré sú s ním spojené. (Runnebaum, 1997, Anticancer Res. 17(4B): 2887-2890; Spear a kol., 1998, J. Neurovirol. 4(2): 133-147).

Špecifické príklady vírusových vektorových systémov na génovú terapiu, ktoré sú ľahko použiteľné v metódach predkladaného vynálezu sa stručne opisujú v nasledujúcom texte. Prenos génov na báze retrovírusov nedávno prehľadne opísali Federspiel a Hughes (1998, Methods in Celí Biol. 52: 179-214), kde sa konkrétne opisuje vírus vtáčej leukózy (ALV) z čeľade retrovírusov (Federspiel a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93: 4931 (1996); Federspiel a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 11241 (1994)). Retrovírusové vektory, vrátane ALV a myšieho vírusu leukémie (MLV) ďalej opisuje Svoboda (1998, Gene 206: 153-163).

Modifikované expresné systémy na báze retrovírusov/adenovírusov sa môžu ľahko prispôsobiť pre spôsoby predkladaného vynálezu. Napríklad systémy myšieho vírusu leukémie (MLV) prehľadne spracovali Karavanas a kol., 1998, Crit. Rev. in Oncology/Hematology 28: 7-30. Systémy expresie na báze adenovírusov prehľadne spracovali Von Seggem a Nemerow v „Gene expression systems (ed. Femandez & Hoeffler, Academic Press, San Diego, CA, 1999, kapitola 5, strany 112-157).

Ukázalo sa že expresné systémy proteínov sú účinne použiteľné in vivo ako aj in vitro. Opísal sa napríklad efektívny prenos génu do ľudských nádorov skvamóznych buniek pomocou amplikónového vektora na báze vírusu herpes simplex (HSV) typ 1. (Carew a kol., 1998, Am. J. Surg. 176: 404-408). Vírus herpes simplex sa použil na génový prenos do nervového systému. (Goins a kol., 1997, J. Neurovirol. 3 (Sup. 1): S80-88). Na tuhých nádoroch sa testovali cielené samovražedné vektory pomocou HSV-TK. (Smiley a kol.,

1997, Hum. Gene Ther. 8(8): 965-977). Na génovú terapiu karcinómových buniek hrubého čreva sa použil vektor na báze vírusu herpes simplex typ 1. (Yoon a kol., 1998, Ann. Surg. 228(3): 366-374). Na predĺženie času transfekcie sa vyvinuli hybridné vektory, vrátane hybridov HSV/AAV (vírus spojený s adenovírusom) použitých na liečbu hepatocytov. (Fraefel a kol., 1997, Mol. Med. 3(12): 813-825).

Na ľudskú génovú terapiu sa vyvinul vírus kravských kiahní z dôvodu jeho veľkého genómu. (Peplinski a kol., 1998, Surg. Oncol. Clin. N. Am. 7(3): 575-588). Opísalo sa použitie vírusu kravských kiahní s deletovanou tymidínkinázou, exprimujúceho pyrofosforylázu purínových nukleozidov, ako vektora na génovú terapiu zameranú na nádory. (Puhlman a kol., 1999, Human Gene Therapy 10: 649-657).

Opísalo sa použitie vírusu spojeného s adenovírusom 2 (AAV) ako vektora na génovú terapiu ľudí, ale AAV vyžaduje pomocný vírus (ako je adenovírus alebo herpes vírus) kvôli optimálnej replikácii avbaľovaniu v cicavčích bunkách. (Snoeck a kol., 1997, Exp. Nephrol. 5(6): 514-520; Rabinowitz a kol.,

1998, Curr. Opn. Biotechnol. 9(5): 470-475). Zverejnilo sa však in vitro vbaľovanie infekčného rekombinantného AAV, čo dáva tomuto systému oveľa väčšie šance. (Ding a kol., 1997, Gene Therapy 4: 1167-1172). Dokázalo sa, že prenos cDNA ekotropického receptora retrovírusu sprostredkovaný AAV umožňuje ekotropickú retrovírusovú transdukciu založených a primárnych ľudských buniek. (Qing a kol.,

1997, J. Virology 71(7): 5663-5667). Zdokumentovala sa génová terapia zhubných nádorov pomocou AAV vektora exprimujúceho ľudský divý typ p53. (Qazilbash a kol., 1997, Gene Therapy 4: 675-682). Opísal sa taktiež prenos génu do vaskulámych buniek pomocou AAV vektorov. (Maeda a kol., 1997, Cardiovascular Res. 35: 514-521). AAV sa ukázal byť vhodným vektorom na génovú terapiu zameranú na pečeň. (Xiao a kol., 1998, J. Virol. 72(12): 10222-10226). Dokázalo sa, že AAV vektory sú vhodné na génovú terapiu mozgových tkanív a centrálneho nervového systému. (Chamberlin a kol., 1998, Brain Res. 793(1-2): 169-175; During a kol., 1998, Gene Therapy 5(6):820-827). AAV vektory sa taktiež porovnali s adenovírusovými vektormi (AdV) v prípade génovej terapie pľúc a v prípade prenosu do epiteliálnych buniek ľudskej cystickej fibrózy. (Teramoto ^a kol., 1998, J. Virol. 72(11): 8904-8912).

Zverejnil sa chimérický AdV/retrovírusový vektorový systém na génovú terapiu, ktorý zahrnuje výhodné vlastnosti každého z týchto vírusov, pričom vytvára neintegrujúci sa AdV, ktorý sa udržuje ako funkčne integrujúci prostredníctvom prechodného vytvorenia bunky produkujúcej retrovírusy. (Feng a koL, Í997, Nat. Biotechnology 15(9): 866-870; Bilbao a kol., 1997, FASEB J. 11(8): 624-634). Táto nová veľmi účinná generácia vektorov na génovú terapiu sa upravila na cielenú génovú terapiu zhubných nádorov. (Bilbao a kol.,

1998, Adv. Exp. Med. Biol. 451: 365-374). Jedna injekcia AdV exprimujúceho p53 inhibovala rast podkožných nádorových uzlín z ľudských nádorových buniek prostaty. (Asgari a kol., 1997, Int. J. Cancer 71(3): 377-382). AdV sprostredkoval prenos divého typu génu p53 u pacientov s pokročilou rakovinou pľúc. (Schuler a kol., 1998, Human Gene Therapy 9: 2075-2082). Ten istý druh rakoviny sa liečil pomocou terapie založenej na výmene génup53 sprostredkovanej AdV vektormi. (Roth a kol., 1998, Semin. Oncol. 25(3 Suppl 8): 33-37). Prenos génu p53 sprostredkovaný AdV inhibuje diferenciáciu endoteliálnych buniek a angiogenézu in vivo. (Riccioni a kol., 1998, Gene Ther. 5(6): 747-754). Opísala sa taktiež imunoterapia metastázujúceho melanómu na základe adenovírusom sprostredkovanej expresie melanómového antigénu gp75. (Hirschowitz a kol., 1998, Gene Therapy 5: 975-983). AdV umožňuje infekciu ľudských buniek ekotropickými retrovírusmi a zvyšuje účinnosť retrovírusovej infekcie. (Scott-Taylor, a kol., 1998, Gene Ther. 5(5): 621-629). AdV vektory sa použili na prenos génov do vaskulámych buniek hladkého svalstva. (Li a kol., 1997, Chin. Med. J. (Engl) 110(12): 950-954), nádorových skvamóznych buniek (Goebel a kol., 1998, Otolarynol Head

Neck Surg 119(4): 331-336), ezofageálnych nádorových buniek (Senmaru a kol., 1998, Int J. Cancer 78(3): 366-371), mezangiálnych buniek (Nahman a kol., 1998, J. Investig. Med. 46(5): 204-209), gliových buniek (Chen a kol., 1998, Cancer Res. 58(16): 3504-3507) a do kĺbov zvierat (Ikeda a kol., 1998, J. Rheumatol. 25(9): 1666-1673). V poslednom čase sa zdokumentoval perikardiálny prenos génov pomocou katétru sprostredkovaný AcV vektormi. (March a kol., 1999, Clin. Cardiol. 22(1 Suppl 1): 123-129). Genetická manipulácia AdV systému vhodnými regulačnými genetickými elementmi umožňuje regulovateľnú cielenú génovú expresiu sprostredkovanú AdV in vivo. (Burcin a kol., 1999, PNAS (USA) 96(2): 355-360).

Na aplikácie ľudskej génovej terapie sa vyvinuli alfavírusové vektory s vbaľovacími bunkovými líniami, ktoré sú vhodné na transformáciu expresnými kazetami vhodnými na použitie s vektormi odvodenými zo Sindis vírusu a Semliki Forest vírusu. (Polo a kol., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96: 4598-4603). Vyvinuli sa taktiež necytopatické flavivírusové systémy na báze RNA replikónu. (Vamavski a kol., 1999, Virology 255(2): 366-375). Na bunkovo špecifický cielený prenos do nádorových buniek sa použili sinbis vírusové vektory obsahujúce samovražedný HSV-TK gén. (Iijima a kol., 1998, Int. J. Cancer 80(1): 110-118).

Ako sľubné vektory na génovú terapiu sa ukazujú taktiež retrovírusové vektory na báze ľudského penového vírusu (HFV). (Trobridge a kol., 1998, Human Gene Therapy 9: 2517-2525). Vektory na báze ľudského penového vírusu sa navrhli na terapiu samovražednými génmi. (Nestler a kol., 1997, Gene Ther. 4(11): 1270-1277). Ako vektory s vysokou úrovňou expresie sa použili taktiež rekombinantné myšacie cytomegalovírusové apromótorové systémy. (Manning a kol., 1998, J. Virol. Meth. 73(1): 31-39; Tong a kol., 1998, Hybridoma 18(1): 93-97).

Prenos génov do nedeliacich sa buniek sa stal možným vďaka generácii vektorov na báze Sendai vírusu. (Nakanishi a kol., 1998, J. Controlled Release 54(1): 61-68).

V rámci ďalších snažení o uskutočnenie transformácie nedeliacich sa somatických buniek sa skúmali lentavírusové vektory. Opísala sa génová terapia cystickej fibrózy pomocou vektora na báze vírusu ľudskej imunodeficiencie (HIV) neschopného replikácie. (Goldman a kol., 1997, Human Gene Therapy 8: 2261-2268). Zdokumentovala sa taktiež pretrvávajúca expresia génov prenesených do pečene a svalov lentavírusovými vektormi. (Kafri a kol., 1997, Nat. Genet. 17(3): 314-317). Ale vzhľadom na prevládajúce znepokojenie týkajúcemu sa bezpečnosti rýchlo napreduje vývoj zlepšených vektorov. (Kim a kol., 1998, J. Virol. 72(2): 994-1004). Výskumom LTR a Tat HIV sa zistili dôležité informácie o organizácii tohto genómu na vývoj vektorov. (Sadaie a kol., 1998, J. Med. Virol. 54(2): 118-128). Preto teraz lepšie poznáme genetické požiadavky na účinný vektor na báze HIV. (Gasmi a kol., 1999, J. Virol. 73(3): 1828-1834). Opísali sa vektory, ktoré sa inaktivujú alebo kondicionálne vbaľovacie bunkové línie, (napríklad Zuffery a kol., 1998, J. Virol. 72(12): 9873-9880; Miyoshi a kol., 1998, J. Virol. 72(10): 8150-8157; Duli a kol., 1998, J. Virol. 72(11): 8463-8471; a Kaul a kol., 1998, Virology 249(1): 167-174). Zverejnila sa účinná transdukcia ľudských lymfocytov a buniek CD34+ pomocou HIV vektorov. (Douglas a kol., 1999, Hum. Gene Ther. 10(6): 935-945; Miyoshi a koľ, 1999, Science 283(5402): 682-686). Opísala sa účinná transdukcia nedeliacich sa ľudských buniek lentivírusovými vektormi na báze vírusu mačacej imunodeficiencie (FIV), v prípade ktorej sa minimalizujú obavy týkajúce sa bezpečnosti pri použití vektorov na báze HIV. (Poeschla a kol., 1998, Náture Medicíne 4(3): 354-357). Zdokumentovala sa produktívna infekcia ľudských mononukleámych buniek FIV vektormi. (Johnston a kol., 1999, J. Virol. 73(3): 2491-2498).

Keďže práca s mnohými vírusovými vektormi je obtiažna a kapacita pre vloženú DNA je obmedzená, poukázalo sa na tieto obmedzenia a nevýhody. Vyvinuli sa napríklad minivírusové vektory odvodené z ľudského herpes vírusu, vírusu herpes simplex typ 1 (HSV-1) a z Epstein-Barrovej vírusu (EBV), ktoré sa okrem zjednodušených vbaľovacích bunkových línií vyznačujú zjednodušenou manipuláciou s genetickým materiálom a zjednodušenou tvorbou vírusových vektorov. (Wang a kol., 1996, J. Virology 70(12): 8422-8430). Predtým sa dokázalo, že adaptorové plazmidy zjednodušujú inzerciu cudzej DNA do retrovírusových vektorov nezávislých od helpera (1987, J. Virology 61(10): 3004-3012).

Vírusové vektory nie sú jedinými prostriedkami na účinnú génovú terapiu, pretože sa opísalo taktiež niekoľko nevírusových vektorov. Zistilo sa, že výsledkom cieleného nevírusového vektorového prenosu génov založeného na použití multikomplexu epidermálneho rastového faktora/DNA (EGF/DNA) bol účinný a špecifický génový prenos. (Cristiano, 1998, Anticancer Res. 18: 3241-3246). Génová terapia cievneho systému a CNS sa vykonala pomocou katiónových lipozómov. (Yang a kol., 1997, J. Neurotrauma 14(5): 281-297). Prechodná génová terapia pankreatídy sa taktiež vykonala pomocou katiónových lipozómov. (Denham a kol., 1998, Ann. Surg. 227(6): 812-820). Dokázalo sa, že na prenos génov sú účinné komplexy vektora na báze chitózanu/DNA. (Erbacher a kol., 1998, Pharm. Res. 15(9): 1332-1339). Opísal sa nevírusový vektor prenosu DNA na báze systému s terciámym komplexom. (Kim a kol., 1998, 53(1-3): 175-182). Na uskutočnenie génového prenosu sa použili taktiež lipozómové komplexy pokryté vírusovými časticami. (Hirai a kol., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 241(1): 112-118).

Zdokumentovala sa génová terapia zhubných nádorov priamym injekčným podaním nevírusového vektora T7, kódujúceho tymidínkinázový gén, do zhubného nádoru. (Chen a kol., 1998, Human Gene Therapy 9: 729-736). Izolácia plazmidovej DNA je dôležitá na prenos génov priamym injekčným podaním. (Hom a kol.,

1995, Hum. Gene Ther. 6(5): 656-673). Modifikované plazmidové vektory sa špecificky upravili na priame injekčné podanie. (Hartikka a kol., 1996, Hum. Gene Ther. 7(10): 1205-1217).

Takže v danej oblasti je známe široké spektrum vektorov a konštruktov na prenos génov/génovú terapiu. Tieto vektory sa môžu ľahko upraviť pre spôsoby predkladaného vynálezu. Na inzerciu funkčne spojeného Src (aktívneho alebo neaktívneho) do vybraného vektora na expresiu/prenos sa môže vhodnou manipuláciou pomocou techník rekombinantnej DNA a molekulovej biológie vytvoriť mnoho ekvivalentných vektorov použiteľných pri praktickom uskutočnení predkladaného vynálezu.

E. Spôsoby modulácie angiogenézy

Tento vynález poskytuje spôsob modulácie angiogenézy v tkanive, ktoré je postihnuté chorobným procesom alebo stavom, a tým pádom ovplyvňuje deje prebiehajúce v tkanive, ktoré závisia od angiogenézy. Vo všeobecnosti tento spôsob zahrnuje podanie kompozície do tkaniva, ktoré je postihnuté chorobným procesom alebo stavom, pričom táto kompozícia zahrnuje angiogenézu modulujúce množstvo Src proteínu alebo vektora na báze nukleovej kyseliny, ktorý exprimuje aktívny alebo neaktívny Src, v súlade so spôsobmi podľa tohto vynálezu.

Ako sa tu opisuje, pri chorobných stavoch môže podporovať angiogenézu ktorékoľvek z mnohých tkanív alebo orgánov pozostávajúcich z organizovaných tkanív, vrátane pokožky, svalu, čreva, spojivového tkaniva, kĺbov, kostí a podobných tkanív, do ktorých môžu vnikať krvné cievy na základe angiogénnych stimulov.

Liečeným pacientom, ktorý sa lieči v predkladanom vynáleze a v jeho mnohých uskutočneniach, je výhodne človek, hoci je nutné pochopiť, že princípy tohto vynálezu naznačujú, že tento vynález je účinný vo vzťahu ku všetkým cicavcom, ktoré sa mienia zahrnúť pod pojem „pacient“. V tejto súvislosti sa pod pojmom cicavec rozumie ktorýkoľvek druh cicavca, v prípade ktorého sa vyžaduje liečba ochorenia spojeného s angiogenézou, obzvlášť poľnohospodárske a domáce druhy cicavcov.

Takže tento spôsob zahrnuje podanie terapeuticky účinného množstva fyziologicky tolerovateľnej kompozície obsahujúcej Src protein alebo DNA vektor na expresiu Src proteínu pacientovi pri praktickom uskutočňovaní spôsobov tohto vynálezu.

Rozsahy dávok podávaného Src proteínu závisia od formy tohto proteínu a od jeho účinnosti tak, ako sa tu ďalej opisuje, a predstavujú množstvá dostatočne veľké na to, aby sa dosiahol výhodný efekt, pri ktorom sa zlepší angiogenéza, ako aj symptómy choroby sprostredkované angiogenézou. Dávka by nemala byť tak veľká, aby vyvolala nežiaduce vedľajšie účinky, ako sú syndrómy hyperviskozity, pľúcny edém, kongestívne zlyhanie srdca a podobne. Vo všeobecnosti sa bude dávka líšiť v závislosti od veku, stavu, pohlavia a rozsahu ochorenia pacienta a môže ju stanoviť odborník v danej oblasti. V prípade akejkoľvek komplikácie sa táto dávka môže upraviť taktiež konkrétnym lekárom.

Terapeuticky účinným množstvom je množstvo Src proteínu, alebo nukleovej kyseliny kódujúcej (aktívny alebo neaktívny) src protein, ktoré je dostatočné na dosiahnutie merateľnej modulácie angiogenézy v tkanive, ktoré sa lieči, t. j. množstvo modulujúce angiogenézu. Modulácia angiogenézy sa môže merať pomocou CAM stanovenia tak, ako sa tu opisuje, alebo inými spôsobmi, ktoré sú známe odborníkom v danej oblasti.

Src protein alebo vektor na báze nukleovej kyseliny exprimujúci Src protein sa môže podať parenterálne pomocou injekcie alebo postupne infúziou. Hoci tkanivo, ktoré sa má liečiť, sa môže v tele väčšinou dosiahnuť pomocou systémového podania, a preto sa najčastejšie lieči intravenóznym podaním terapeutických kompozícií, iné tkanivá a spôsoby podania sa zvažujú v prípade, keď je pravdepodobnosť, že cieľové tkanivo obsahuje cieľovú molekulu. Takže kompozície podľa tohto vynálezu sa môžu podávať intravenózne, intraperitoneálne, intramuskuláme, subkutánne, intrakavitálne, transdermálne a môžu sa taktiež podávať pomocou peristaltických prostriedkov.

Terapeutické kompozície obsahujúce Src protein alebo vektor na báze nukleovej kyseliny, ktorý exprimuje Src, sa zvyčajne podávajú intravenózne, ako napríklad injekčným podaním jednotkovej dávky. Keď sa pojem Jednotková dávka“ použije v súvislosti s terapeutickou kompozíciou predkladaného vynálezu, označuje fyzicky samostatné jednotky vhodné ako jednotkové dávky pre jedinca, pričom každá dávka obsahuje dopredu stanovené množstvo aktívneho materiálu vypočítané tak, aby sa želaný terapeutický efekt dosiahol spolu s nutným diluentom, t. j. nosičom alebo vehikulom.

V jednom výhodnom uskutočnení sa tento reagent podáva intravenózne vo forme jednej dávky. Lokalizované podanie sa môže dosiahnuť pomocou priameho injekčného podania alebo využitím anatomicky izolovaných kompartmentov, izolovaním mikrocirkulácie cieľových orgánových systémov, reperfuziou v cirkulujúcom systéme alebo dočasnou oklúziou cieľových vaskulámych oblastí spojených s chorým tkanivom pomocou katétra.

Kompozície sa podávajú spôsobom, ktorý je v súlade s formuláciou dávky a zároveň v terapeuticky účinnom množstve. Množstvo, ktoré sa má podať a čas podania závisí od jedinca, ktorý sa má liečiť, od schopnosti systému jedinca zužitkovať aktívnu zložku a od stupňa želaného terapeutického výsledku. Presné množstvá aktívnej zložky, ktorú je nutné podať, závisia od lekárovho zváženia a sú jedinečné pre každého jedinca. Vhodné rozsahy dávok na systémové podanie sa tu však zverejňujú a závisia od cesty podania. Navzá11 jom sa líšia taktiež vhodné režimy podávania, ale tieto sú typicky tvorené počiatočným podaním a následnými opakovanými dávkami podanými v jednohodinových alebo niekoľkohodinových intervaloch vo forme následného injekčného alebo iného podania. Alebo sa uvažuje o použití kontinuálnej intravenóznej infúzie, ktorá je dostatočná na udržanie koncentrácií v krvi v rozsahoch stanovených pre in vivo terapie.

1. Inhibícia angiogenézy

Existujú rôzne ochorenia, pri ktorých sa predpokladá dôležitosť inhibicie angiogenézy, a tie sa označujú ako angiogénne ochorenia, medzi ktoré okrem iných patria taktiež zápalové poruchy, ako je imunitný a neimunitný zápal, chronický kĺbový reumatizmus a psoriáza, poruchy spojené s neprimeranou alebo nevhodnou inváziou ciev, ako je diabetická retinopatia, neovaskulárny glaukóm, restenóza, kapilárna proliferácia v aterosklerotických plátoch a osteoporóza, a poruchy spojené so zhubným nádorom, akým sú tuhé nádory, tuhé nádorové metastázy, angiofibrómy, retrolentikuláma fíbroplázia, Kaposiho sarkóm a podobné zhubné nádory, ktoré si vyžadujú neovaskularizáciu, kvôli podpore rastu nádoru.

Spôsoby inhibujúce angiogenézu v tkanive súvisiacom s chorobou zlepšujú symptómy ochorenia a v závislosti od ochorenia môžu prispievať k jej liečbe. V jednom uskutočnení vynálezu sa uvažuje o inhibícii samotnej angiogenézy v tkanive súvisiacom s chorobou. Rozsah angiogenézy v tkanive, a preto tiež rozsah inhibície dosiahnutý predkladanými spôsobmi, sa môže vyhodnocovať rozličnými spôsobmi.

V príbuznom uskutočnení je tkanivom, ktoré sa má liečiť, zapálené tkanivo a angiogenézou, ktorá sa má inhibovať, je angiogenéza zapáleného tkaniva, kde dochádza k neovaskularizácii zapáleného tkaniva. V tejto časti sa uvažuje o spôsobe inhibicie angiogenézy v artritických tkanivách, ako je tomu u pacientov s chronickým artikulámym reumatizmom, v tkanivách s imunitným alebo neimunitný zapálom, v psoriatickom tkanive a podobne.

V ďalšom príbuznom uskutočnení je tkanivom, ktoré sa má liečiť, tkanivo očnej sietnice pacienta s ochorením sietnice, akým je diabetická retinopatia, degenerácia žltej škvrny alebo neovaskulárny glaukóm a angiogenézou, ktorá sa má inhibovať, je angiogenéza tkaniva očnej sietnice, kde dochádza k neovaskularizácii retinálneho tkaniva.

V ďalšom príbuznom uskutočnení je tkanivom, ktoré sa má liečiť, nádorové tkanivo pacienta s tuhým nádorom, metastázami, rakovinou kože, rakovinou prsníka, hemangiómom alebo angiofibrómom a s podobným zhubným nádorom, a angiogenézou, ktorá sa má inhibovať, je angiogenéza nádorového tkaniva tam, kde dochádza k neovaskularizácii nádorového tkaniva. Medzi typické tkanivá s tuhými nádormi, ktoré je možné liečiť predkladanými spôsobmi, patria tkanivá pľúc, pankreasu, prsníka, hrubého čreva, laryngeálne tkanivá, ováriové a podobné tkanivá. Inhibícia angiogenézy nádorových tkanív je obzvlášť výhodným uskutočnením vynálezu, z dôvodu dôležitej úlohy, ktorú má neovaskularizácia pri raste nádoru. V prípade neprítomnosti neovaskularizácie nádorového tkaniva, toto nádorové tkanivo nedostáva požadované živiny, spomaľuje sa jeho rast, ďalší rast prestáva, podlieha regresii a v konečnom dôsledku sa stáva nekrotickým, výsledkom čoho je odumretie tohto nádoru.

Inými slovami povedané, predkladaný vynález poskytuje spôsob inhibicie nádorovej neovaskularizácie pomocou inhibicie nádorovej angiogenézy podľa predložených spôsobov. Tento vynález podobne poskytuje spôsob inhibicie nádorového rastu uskutočnením spôsobov inhibicie angiogenézy.

Tieto spôsoby sú taktiež obzvlášť účinné proti tvorbe metastáz, pretože (1) ich tvorba si vyžaduje vaskularizáciu primárneho nádoru preto, aby nádorové bunky budúcich metastáz mohli opustiť nádor a (2) ich založenie na sekundárnom mieste si vyžaduje neovaskularizáciu na podporu rastu metastáz.

V príbuznom uskutočnení sa v tomto vynáleze uvažuje o používaní tohto spôsobu liečby spolu s ostatnými terapiami, ako je bežná chemoterapia namierená proti tuhým nádorom a zameraná na reguláciu zakladania metastáz. Podávanie inhibítora angiogenézy sa obyčajne uskutočňuje počas chemoterapie alebo po nej, hoci výhodné je inhibovať angiogenézu po chemoterapeutickom režime, a to v čase, keď nádorové tkanivo odpovedá na toxické útoky indukciou angiogenézy v snahe o regeneráciu prostredníctvom zásobovania nádorového tkaniva krvou a živinami. Okrem toho je liečba inhibítormi angiogenézy výhodná po chirurgickom zákroku, pri ktorom sa odstránili tuhé nádory, ako profylaxia tvorby metastáz.

Doposiaľ sa predkladané spôsoby týkali inhibicie nádorovej neovaskularizácie, ale tieto spôsoby sa môžu uplatniť pri inhibícii rastu nádorového tkaniva, inhibícii tvorby nádorových metastáz a pri regresii už založených nádorov.

Restenóza je proces, pri ktorom dochádza k migrácii buniek hladkého svalstva (SMC) a k ich deleniu v mieste perkutánnej transluminámej koronárnej angioplastiky, čo obmedzuje úspech angioplastiky. Migrácia a delenie SMC počas restenózy sa môže považovať za proces angiogenézy, ktorý sa inhibuje predkladanými spôsobmi. Preto sa tento vynález zaoberá taktiež inhibíciou restenózy pomocou inhibicie angiogenézy podľa predkladaných spôsobov po vykonaní angioplastiky u pacienta. Na inhibíciu restenózy sa inaktivovaná tyrozínkináza obyčajne podáva po vykonaní angioplastiky z dôvodu rizika restenózy steny koronárnej cievy, obyčajne približne 2 až približne 28 dní a typickejšie približne prvých 14 dní po vykonaní zákroku.

Predkladaný spôsob inhibície angiogenézy v tkanive súvisiacom s chorobou, a teda i používania spôsobov liečby ochorení súvisiacich s angiogenézou, zahrnuje dosiahnutie tkaniva, v ktorom sa angiogenéza vyskytuje, alebo je riziko, že sa tam vyskytne, pomocou kompozície, ktorá zahrnuje terapeuticky účinné množstvo inaktivovaného Src proteínu alebo vektora exprimujúceho tento proteín.

K inhibícii angiogenézy a regresii nádorov dochádza už od siedmeho dňa po počiatočnom kontakte s touto terapeutickou kompozíciou. Je výhodné, ak ďalšie, alebo predĺžené vystavenie účinku inaktívneho Src proteínu trvá od 7 dní po 6 týždňov, výhodnejšie približne 14 až 28 dní.

2. Potenciácia angiogenézy

V prípadoch, keď je žiaduce podporovať alebo potenciovať angiogenézu, je výhodným podanie aktívneho Src proteínu do tohto tkaniva. Cesty a čas podania sú porovnateľné so spôsobmi opísanými v prípade inhibície angiogenézy.

F. Terapeutické kompozície

V predkladanom vynáleze sa uvažuje o terapeutických kompozíciách vhodných na používanie v terapeutických spôsoboch, ktoré sa tu opísali. Terapeutické kompozície predkladaného vynálezu obsahujú fyziologicky prijateľný nosič spolu so Src proteínom alebo s vektorom schopným exprimovať tento Src proteín tak, ako sa tu opisuje, pričom je v tomto nosiči rozpustený alebo dispergovaný ako aktívna zložka. Vo výhodnom uskutočnení nie je táto terapeutická kompozícia imunogénna, keď sa podáva cicavčiemu alebo ľudskému pacientovi z terapeutických dôvodov.

Pojmy „farmaceutický prijateľný“, „fyziologicky tolerovateľný“ ako aj ich gramatické obmeny, tak, ako sa tu používajú, označujú kompozície, nosiče, diluenty a reagenty, pričom sa tieto pojmy používajú zameniteľné, čo znamená, že tieto látky je možné podávať cicavcovi bez vzniku nežiaducich fyziologických účinkov, ako je zvracanie, závrate, bolesti žalúdka a podobne.

Príprava farmakologickej kompozície obsahujúcej aktívne zložky, ktoré sú v nej rozpustené alebo dispergované, je v danej oblasti veľmi dobre známa a nemusí sa obmedzovať z dôvodu formulácie. Obyčajne sa takéto kompozície pripravujú ako injekčné formulácie vo forme kvapalných roztokov alebo suspenzií, ale môžu sa pripraviť taktiež tuhé formy vhodné na prípravu roztoku alebo suspenzií, ktoré sa pred použitím zmiešajú s tekutinou. Prípravky môžu byť taktiež v emulzifikovanej forme alebo vo forme lipozómovej kompozície.

Aktívna zložka sa môže zmiešať s vehikulami, ktoré sú farmaceutický prijateľné a kompatibilné s aktívnou zložkou, v množstvách vhodných na použitie v terapeutických spôsoboch, ktoré sa tu opisujú. Vhodnými vehikulami sú napríklad voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol, etanol alebo podobné látky a ich kombinácie. Navyše, ak je to potrebné, kompozícia môže obsahovať malé množstvá pomocných látok, ako sú zvlhčovacie alebo emulgačné činidlá, pufrovacie činidlá a podobné aditíva, ktoré zvyšujú účinnosť aktívnej zložky.

Terapeutická kompozícia predkladaného vynálezu môže zahrnovať farmaceutický prijateľné soli týchto zložiek. Farmaceutický prijateľné soli zahrnujú soli vznikajúce po pridaní kyseliny (vytvorené s voľnými aminoskupinami polypeptidu), ktoré sa tvoria s anorganickými kyselinami, ako je napríklad kyselina chlorovodíková alebo kyselina fosforečná, alebo s takými organickými kyselinami, ako je kyselina octová, vínna, mandľová a podobne. Soli vytvorené s voľnými karboxylovými skupinami sa môžu taktiež odvodiť z anorganických zásad, ako je napríklad hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid amónny, hydroxid vápenatý alebo hydroxid železitý, a z takých organických zásad, ako je izopropylamín, trimetylamín, 2-etylaminoetanol, histidín, prokaín a podobne.

Fyziologicky tolerovateľné nosiče sú v danej oblasti dobre známe. Typickými príkladmi tekutých nosičov sú sterilné vodné roztoky, ktoré neobsahujú žiaden iný materiál okrem aktívnych zložiek a vody, alebo obsahujú tlmivý roztok, ako je fosforečnan sodný s hodnotou fyziologického pH, alebo fyziologický roztok alebo oba tieto nosiče, ako je napríklad fyziologický roztok NaCl tlmený fosfátom. Vodné nosiče môžu navyše obsahovať viac ako jednu tlmivú soľ, ako i soli, ako je chlorid sodný a chlorid draselný, dextrózu, polyetylénglykol a iné rozpustné látky.

Tekuté kompozície môžu okrem vody obsahovať taktiež iné tekuté fázy, pričom tieto tekuté fázy môžu byť prítomné taktiež namiesto vody. Typickým príkladom takýchto ďalších tekutých fáz je glycerín, rastlinné oleje, ako je bavlníkový olej, a emulzie vody s olejom.

Terapeutická kompozícia obsahuje angiogenézu modulujúce množstvo Src proteínu predkladaného vynálezu, alebo vyhovujúci expresný vektor na báze rekombinantnej DNA na expresiu účinného množstva Src proteínu, ktorý je obyčajne formulovaný tak, aby obsahoval množstvo zodpovedajúce aspoň 0,1 hmotnostného percenta Src proteínu z celkovej hmotnosti terapeutickej kompozície. Hmotnostné percento je hmotnostný pomer Src proteínu k celkovej kompozícii. Takže, napríklad, 0,1 hmotnostného percenta predstavuje 0,1 gramu Src proteínu na 100 gramov celkovej kompozície. V prípade DNA expresných vektorov závisí podané množstvo od vlastností expresného vektora, tkaniva, ktoré sa má liečiť a od podobných okolností, ktoré sa berú do úvahy.

G. Podukt

V tomto vynáleze sa taktiež uvažuje o produkte, ktorým je označená nádobka poskytujúca Src proteín tohto vynálezu. Produkt zahrnuje obalový materiál a farmaceutické činidlo, ktoré sa nachádza vnútri obalového materiálu.

Farmaceutickým činidlom v uvedenom produkte je ktorákoľvek kompozícia predkladaného vynálezu, ktorá je vhodná na poskytnutie Src proteínu, a ktorá je formulovaná do farmaceutický prijateľnej formy tak, ako sa tu opisuje podľa zverejnených opisov. Takže táto kompozícia môže zahrnovať Src proteín alebo molekulu DNA, ktorá je schopná exprimovať Src proteín. Priemyselný výrobok obsahuje také množstvo farmaceutického činidla, ktoré je dostatočné na liečbu stavu, ktorý sa tu opísal, buď v jednej, alebo niekoľkých dávkach.

Obalový materiál zahrnuje označenie, ktoré udáva použitie farmaceutického činidla, ktoré je v ňom obsiahnuté, napr. na liečbu stavov, ktoré sa zlepšujú inhibíciou alebo potenciáciou angiogenézy, a podobných stavov, ktoré sa tu zverejnili. Označenie môže ďalej obsahovať návod na použitie a príbuzné informácie, tak ako si to bude vyžadovať uvedenie na trh. Obalový materiál môže zahrnovať nádobku (nádobky) na uskladnenie farmaceutického činidla.

Pojem obalový materiál tak, ako sa tu používa, označuje materiál, ako je sklo, plast, papier, fólia a podobne, ktorý je schopný udržať farmaceutické činidlo v uzavretom priestore. Takže napríklad, obalovým materiálom môžu byť plastické alebo sklené nádobky so závitom, laminované vrecká a podobné nádobky, ktoré zvyčajne obsahujú farmaceutickú kompozíciu obsahujúcu farmaceutické činidlo.

Vo výhodných uskutočneniach zahrnuje obalový materiál štítok, na ktorom je konkrétny opis obsahu produktu a použitia farmaceutického činidla, ktoré sa v ňom nachádza.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady týkajúce sa tohto vynálezu sú názornými príkladmi a nemali by sa samozrejme považovať za príklady špecificky limitujúce tento vynález. Navyše, také variácie vynálezu, ktoré sú známe teraz, alebo sa zistia neskôr, a ktoré budú v rámci vedomostí odborníka v danej oblasti, sa majú považovať za variácie spadajúce do rámca predkladaného vynálezu, na ktorý sa tu uplatňuje nárok.

Príklad 1

Príprava c-Src expresných konštruktov

Na prípravu expresných konštruktov využiteľných na moduláciu angiogenézy pomocou spôsobov predkladaného vynálezu sa pripravila c-Src cDNA, ktorá sa inzerciou vložila do expresného konštruktu/vektora.

cDNA sekvencia kódujúca divý typ (t. j. endogénny) kuracieho c-Src (t. j. endogénny Src) zobrazená na obrázku 1 (sekvencia č. 2) kóduje sekvenciu aminokyselinových zvyškov zobrazenú na obrázku 2 (sekvencia č. 3). Kódovaná sekvencia proteínu sa prepisuje z nukleotidov cDNA v polohe 112 až 1713. Sekvencia nukleovej kyseliny zodpovedajúca sekvencii nukleovej kyseliny ľudskej c-Src cDNA zobrazenej na obrázku 3 (sekvencia č. 4) kóduje sekvenciu aminokyselinových zvyškov zobrazenú na obrázku 4 (sekvencia č. 5). V prípade sekvencie ľudského proteínu, kódujúca sekvencia cDNA sa nachádza medzi nukleotidmi v polohe 134 až 1486.

Pripravil sa divý typ, ako aj početné mutované c-Src cDNA. Konštrukty mutovaného c-Src sa pripravili pomocou miestne špecifickej mutagenézy tak, ako to opísali Kaplan a kol., EMBO J. 13: 4745-4756 (1994). Konštrukty mutovanej c-Src kódujúcej mutované c-Src proteíny využiteľné v spôsoboch podľa predkladaného vynálezu opísali Kaplan a kol., EMBO J. 13: 4745-4756 (1994). Títo autori opisujú rôzne konštrukty mutovanej c-Src a kódované proteíny využiteľné pri uskutočňovaní tohto vynálezu. Napríklad Kaplan a kol. zverejnili na svojom obrázku 1 niekoľko produktov pochádzajúcich z kuracích c-Src alel, vrátane SrcA a Src251.

V predkladanom vynáleze sa opisujú dva typy funkcie c-Src pri modelovaní angiogenézy. Tak, ako sa už uviedlo, v prípade prvej kategórie ide o Src molekuly, ktoré zvyšujú angiogenézu a preto sa považujú za aktívne proteíny. V predkladanom vynáleze sa opisuje, že divý typ Src ako aj rôzne mutácie indukujú angiogenézu. Výhodnou mutáciou divého c-src, ktorá indukuje rast krvných ciev a tým pádom zvyšuje hmotnosť nádoru in vivo v súlade s týmto opisom, je mutant Src A. Mutant Src A má bodovú mutáciu na aminokyselinovom (aa) zvyšku v polohe 527, ktorá mení tyrozín 527 na fenylalanín. Toto miesto je za normálnych okolností miestom negatívnej regulácie c-Src kinázou, označovanou ako CSK kináza. Keď CSK fosforyluje aa527 divého src, tento proteín sa inaktivuje. Ale v prípade mutovaného Src A dochádza zámenou regulačného ty rozínu na fenylalanín k jeho zmene na trvalo (t. j. permanentne) aktívny proteín, ktorý nepodlieha inaktivácii fosforyláciou.

Zistilo sa, že mutácie v src majú taktiež opačný modulačný vplyv na angiogenézu, pričom namiesto jej stimulácie angiogenézu inhibujú. Takéto mutácie sa označujú ako inaktívne src mutácie. Proteíny s mutáciami, ktoré im poskytujú túto inhibičnú aktivitu, sa taktiež označujú ako dominantne negatívne Src proteíny, pretože inhibujú neovaskularizáciu, vrátane tej, ktorá je výsledkom endogénnej aktivity Src, ako aj zvýšenej Src aktivity, ktorá je výsledkom stimulácie rastovými faktormi. Takže isté mutácie divého c-src predkladaného vynálezu môžu pôsobiť taktiež ako dominantne negatívne vzhľadom na ich schopnosť zablokovať rast krvných ciev a tým pádom napríklad znížiť hmotnosť nádoru in vivo.

Medzi takéto výhodné inhibičné c-Src proteíny patrí Src 251, v prípade ktorého sa exprimuje iba prvých 251 aminokyselín. Tomuto konštruktu chýba celá kinázová doména a preto sa označuje ako „bezkinázový“ src proteín. Druhým konštruktom je Src (K295M) mutácia, pri ktorej došlo k mutácii aminokyselinového zvyšku lyzínu 295 na metionín. Táto bodová mutácia v kinázovej doméne zabraňuje naviazaniu ATP a blokuje taktiež Src funkcie závislé od kinázy, ktoré sa týkajú bunkovej signalizácie a delenia vaskulámych a nádorových buniek.

Napríklad v prípade mutácie zvyšku 527, pokiaľ nie je výsledným mutovaným aminokyselinovým zvyškom tyrozín, serín alebo treonín, v predkladanom vynáleze sa uvažuje o tom, že výsledkom prítomnosti vymenenej aminokyseliny vo výhodnej polohe bude Src proteín s požadovanou aktívnou modulačnou aktivitou podporujúcou angiogenézu.

Čo sa týka bodových mutácii, za využiteľnú v tomto vynáleze sa pokladá akákoľvek mutácia, výsledkom ktorej je výhodná inhibičná alebo stimulačná aktivita. Uvažuje sa taktiež o konštruktoch fuznych proteínov, ktoré v sebe kombinujú výhodný src proteín (jeho mutáciu alebo fragment) s exprimovanými aminokyselinovými tagmi, antigénnymi epitopmi, s fluorescenčným proteínom alebo inými takýmito proteínmi alebo peptidmi, pokiaľ sa zachová neporušený výhodný modulačný efekt src proteínu.

Tabuľka 1

Src/mutácia	Src funkcia	Vplyv na angiogenézu
c-Src	+ aktívny	stimuluje
SrcA (T527F)	+ aktívny	stimuluje
Src527 (bodová)	+ aktívny	stimuluje
Src251	- inaktívny	inhibuje
Src (skrátený)	- inaktívny	inhibuje
Src (K295M)	- inaktívny	inhibuje
Src295 (bodová)	- inaktívny	inhibuje

Výhodným expresným konštruktom využiteľným v predkladanom vynáleze je RCASBP(A) konštrukt (sekvencia č. 1). Tento expresný vektor je založený na sérii replikačne kompetentných vírusov vtáčieho sarkómu s aktívnejšou Bryanovou polymerázou (BP) kvôli zlepšenému titru, pričom je špecifický pre A typ glykoproteínu vírusového obalu a exprimuje sa v normálnych vtáčích bunkách (prehľad v Methods in Celí Biology, 52: 179-214 (1997); pozri tiež, Hughes a kol., 1987, J. Virol. 61: 3004-3012; Fekete & Cepko, 1993, Mol. Cellular Biol. 13(4): 2604-2613; Itoh a kol., 1996, Development 122: 291-300; aStott a kol., 1998, BioTechniques 24: 660-666). Úplná sekvencia RCASBP(A) (sekvencia č. 1) je uvedená v pripojenom zozname sekvencií a reštrikčná mapa tohto konštruktu je znázornená na obrázku 10 a označuje sa tu ako RCAS.

Pôvodný konštrukt Src 251 subklonovala Dr. Pam Schwartzberg, NIH v laboratóriu Dr. Harolda Varmusa. Stručne zhrnuté, klonovanie src cDNA sekvencie kvôli jeho expresii sa uskutočnilo pomocou inzercie linkeru obsahujúceho reštrikčné miesta Not I-BstBl-Not I do jedinečného Not I miesta na 5’ konci Src 251. Src má jedinečné Cla I miesto na 3’ konci. Enzymatickým štiepením Src 251 sBsrBl a Cla I sa vytvoril BstBl-Clal fragment, ktorý sa potom spojil ligáciou s Cla I miestom na RCASBP(A). Prečnievanie BstBl umožňuje ligáciu s Cla I prečnievaním, ktoré sa nebude znovu štiepiť Cla I. Src konštrukty vhodné na uskutočnenie predkladaného vynálezu sa ľahko získavajú v spomínanom vektore najprv pomocou štiepenia RCAS vektora obsahujúceho Src 251 s Not I a Cla I (v DAM + pozadie), aby sa tak umožnila inzercia podobne štiepených Src cDNA. Preto sa tento počiatočný RCASBP(A) konštrukt obsahujúci Src 251 použil ďalej na subklonovanie všetkých ostatných Src konštruktov tak, ako sa to opísalo tu avKaplan a kol. (1994, The EMBO J. 13(20): 4745-4756), do RCASBP(A) cez Not I-Cla I fragment vytvorený v procese prípravy Src 251 konštruktu. Na vytvorenie žiaducich c-src mutácií v cDNA sa použili štandardné postupy na cielenú mutagenézu, ktoré sú známe odborníkom v tejto oblasti. PCR priméry navrhnuté s cieľom zabudovať výhodné mutácie sa taktiež navrhli s reštrikčnými miestami, aby tak umožnili nasledujúce klonovacie kroky. Celé segmenty sekvencií nukleovej kyseliny kódujúcej Src sa odstránili deléciou z nukleovej kyseliny konštruktov pomocou postupov PCR amplifikácie na základe známych cDNA sekvencií kuracích, ľudských a podobných homológov Src s následnou tvorbou nových konštruktov.

V jednom uskutočnení tohto vynálezu kóduje 3’ PCR primér použitý na amplifikáciu nukleových kyselín src taktiež sekvenciu prítomnú vo fáze čítacieho rámca. Použitím tohto priméru sa ku karboxykoncu následného Src konštruktu pridá 9E10-myc epitopový tag.

Na vytvorenie vektorových konštruktov obsahujúcich 9E10-myc epitopový tag sa po Src aminokyseline 215 pridali nasledujúce aminokyseliny: VDMEQKLIAEEDLN (sekvencia č. 6). Vykonali sa dve samostatné PCR pre každý konštrukt a získali sa podobné výsledky. Všetky mutantné konštrukty vytvorené pomocou PCR sa taktiež sekvenovali pomocou PCR, aby sa potvrdila predpokladaná DNA sekvencia týchto klonov. Src cDNA molekuly divého typu ako aj mutované molekuly využiteľné v prípade expresných systémov predkladaného vynálezu sú dostupné taktiež od Upstate Biotech Laboratories, Lake Placid, NY, kde sa predáva vtáčí ako aj ľudský src, a niekoľko bezkinázových mutovaných foriem a mutovaných foriem s aktivovanou kinázou.

Medzi alternatívne expresné vektory využiteľné na expresiu Src proteínov predkladaného vynálezu patria taktiež adenovírusové vektory tak, ako sa opísali v patentoch USA č. 4 797 368, 5 173 414, 5 436 146, 5 589 377 a 5 670 488. Medzi alternatívne spôsoby prenosu modulačných Src proteínov patrí prenos Src cDNA pomocou nevírusového vektorového systému, ktorý sa opísal v patente USA č. 5 675 954 a prenos samotnej cDNA vo forme nahej DNA tak, ako sa to opísalo v patente USA č. 5 589 466. Prenos konštruktov podľa tohto vynálezu sa neobmedzuje na topickú aplikáciu vírusového vektora, ako sa to opisuje ďalej v CAM systéme stanovenia. Napríklad preparáty obsahujúce vírusový vektor sa podávajú taktiež intravenózne na účely systémového podania pre cievny systém. Tieto vektory je možné usmerniť taktiež na miesta so zvýšenou neovaskularizáciou napríklad pomocou injekcie lokalizovanej do nádoru.

Uvažuje sa tiež o prenose in vitro exprimovaných proteínov po expresii a purifikácii vybraného Src proteínu pomocou spôsobov vhodných na prenos proteínov alebo polypeptidov. Jeden z takýchto spôsobov zahrnuje lipozómový systém prenosu, ako sa opísal v patentoch USA č. 4 356 167, 5 580 575, 5 542 935, a 5 643 599. Odborníci v danej oblasti poznajú ďalšie systémy prenosu vektorov a proteínov, ktoré sú využiteľné na expresiu a/alebo prenos Src proteínov predkladaného vynálezu.

Príklad 2

Charakterizácia neovplyvnenej kuracej chorioalantoickej membrány (CAM)

A. Príprava CAM

Angiogenéza sa v kuracej chorioalantoickej membráne (CAM) môže indukovať po tom, čo normálna embryonálna angiogenéza vyústila do tvorby vyvinutých krvných ciev. Ukázalo sa, že angiogenéza sa indukuje ako odpoveď na špecifické cytokíny alebo nádorové fragmenty tak, ako to opísali Leibovich a kol., Náture, 329: 630 (1987) a Ausprunk a kol., Am. J. Pathol., 79: 597 (1975). CAM sa pripravili z kuracích embryí na účely následnej indukcie angiogenézy a jej inhibície. Desaťdňové kuracie embryá sa získali z Mclntyre Poultry (Lakeside, CA) a inkubovali sa pri 37 °C a 60 % vlhkosti. Do škrupiny sa urobila malá dierka na konci vajca priamo nad vzduchovou bublinou pomocou malej vŕtačky (Dremel, Division of Emerson Electric Co., Racine, WI). Druhá dierka sa vyvŕtala na širšom konci vajca v oblasti bez embryonálnych krvných ciev, ktorá sa predtým zistila presvietením vajca. Cez prvú dierku sa vytvoril podtlak, ktorý spôsobil oddelenie CAM (chorioalantoickej membrány) od membrány škrupiny a vytvorila sa falošná vzduchová bublina nad CAM. Nad poklesnutou CAM sa do škrupiny vyrezal štvorcový otvor s rozmermi 1,0 centimetra (cm) x 1,0 cm pomocou malej rezačky (Dremel). Malý otvor umožňoval priamy prístup k CAM ležiacej pod ním.

Výsledný CAM preparát sa potom použil buď na šiesty deň embryogenézy, teda v štádiu, v ktorom dochádza k aktívnej neovaskularizácii, a to bez ďalšieho ovplyvnenia CAM, čím sa vytvoril model vhodný na zhodnotenie účinkov na embryonálnu neovaskularizáciu, alebo sa CAM preparát použil na desiaty deň embryogenézy, keď sa angiogenéza ukončila. Posledne spomínaný preparát sa tak použil v tomto vynáleze na indukciu obnovenej angiogenézy, ktorá bola odpoveďou na ovplyvnenie cytokínmi alebo na kontakt s nádorom tak, ako sa to opisuje ďalej.

Príklad 3

Stanovenie angiogenézy v CAM

A. Angiogenéza indukovaná rastovými faktormi

Ukázalo sa, že angiogenéza sa môže indukovať cytokínmi alebo rastovými faktormi.

Angiogenéza sa indukovala umiestnením kúskov filtračného papiera Whatman (filtračný papier Whatman č. 1) s rozmermi 5 milimetrov (mm) x 5 mm saturovaných „Hanks Balanced Sált Solution“ (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) alebo HBSS s obsahom 2 mikrogramov/mililiter (pg/ml) rekombinantného bázického fibroblastového rastového faktora (bFGF) alebo vaskulámeho endoteliálneho rastového faktora (VEGF) (Genzyme, Cambridge, MA). Saturované kúsky filtračného papiera sa umiestnili na CAM 9 alebo 10 dňového kuracieho embrya v oblasti bez krvných ciev a následne sa otvory zalepili páskou. Na indukciu rastu krvných ciev boli účinné taktiež iné koncentrácie rastových faktorov. Pri stanoveniach, v ktorých sa inhibícia angiogenézy vyhodnocovala pomocou intravenózneho injekčného podania antagonistov, sa angiogenéza najprv indukovala pridaním 1-2 pg/ml bFGF alebo VEGF do rastového média fibroblastov. Angiogenéza sa monitorovala fotomikroskopiou po 72 hodinách.

B. Embryonálna angiogenéza

CAM preparátom, na ktorom sa zisťovali účinky inhibítorov angiogenézy na prirodzenú tvorbu embryonálnej vaskulatúry, bolo 6-dňové kuracie embryo tak, ako sa to opísalo už predtým. V tomto štádiu vývinu dochádza k de novo rastu krvných ciev, a preto je vhodným systémom na stanovenie modulácie angiogenézy Src proteínmi predkladaného vynálezu. CAM systém sa pripravil tak, ako sa to opísalo, s tým rozdielom, že sa toto stanovenie uskutočnilo na šiesty deň embryogenézy, a nie na deviaty alebo desiaty deň.

Príklad 4

Modulovanie angiogenézy merané pomocou CAM stanovenia

Na zistenie vplyvu Src proteínov na angiogenézu sa vykonali nasledujúce stanovenia na CAM preparátoch z 10-dňových kurčiat. Nesmrteľná kuracia fibroblastová línia DF-1 (dar od Doug Fostera, University of Minnesota) sa transfekovala 5 pg RCAS konštruktov, ktoré sa pripravili tak, ako sa to opísalo v príklade 1. Táto bunková línia ako aj primáme fibroblasty kuracieho embrya boli schopné produkovať vírus, ale bunková línia DF-1 produkovala titre. Supematanty obsahujúce vírusy sa pozbierali zo zhromaždených produkčných bunkových línií DF-1 v CLM médiu neobsahujúcom sérum (zloženie: základné médium F-10 s pridaným DMSO, kyselinou listovou, kyselinou glutámovou a vitamínovým roztokom MEM). Tridsaťpäť ml supematantu obsahujúceho vírusy sa zakoncentrovalo ultracentrifugovaním pri 4 °C trvajúcim 2 hodiny pri 22 000 otáčkach za minútu. Tieto koncentrované pelety obsahujúce vírusy sa opäť rozsuspendovali v 1/100 pôvodného objemu CLM média bez séra, suspenzia sa rozdelila na rovnaké diely a uložila sa pri -80 °C. Po inkubácii primárnych fibroblastov kuracích embryí trvajúcej 48 - 72 hodín sa určil titer pomocou infekcie spôsobenej postupne riedeným kontrolným vírusovým vektorom, ktorý má sekvenciu nukleotidov kódujúcu zelený fluorescenčný proteín (GFP), a ktorý sa tu označuje ako RCAS-GFP. Po zakoncentrovaní titre získaných vírusových výťažkov bežne prekračovali 10⁸ I.u./ml. Na CAM stanovenie s použitím vírusových výťažkov sa pripravili okrúhle kúsky filtračného papiera Whatman s priemerom 6 mm nasiaknuté 30 minút v kortizónacetáte (3 mg/ml) v 95 % etanole. Tieto kúsky filtračného papiera sa sušili v digestore a potom sa napustili 10 minút vírusovým výťažkom pridaným v množstve 20 μΐ na každý kúsok papiera. Tieto kúsky filtračného papiera sa aplikovali na CAM 9 alebo 10-dňových kuracích embryí a uzatvorili sa pomocou celofánovej pásky a inkubovali sa 18-24 hodín pri 37 °C. Potom sa k CAM pridal buď kontrolný PBS, alebo rastové faktory v koncentrácii 5 pg/ml v 20 μΐ objeme vhodného vírusového výťažku, čo slúžilo ako ďalšia dávka vírusu pre CAM tkanivo. Po 72 hodinách sa CAM odobrali a sledovali sa zmeny angiogénneho indexu, ktorý sa stanovoval pomocou dvojitého slepého počítania počtu miest vetvenia v CAM, ktorá ležala pod kúskom filtračného papiera. Na stanovenie kinázy sa tkanivo, ktoré sa nachádzalo pod kúskom filtračného papiera odobralo a vložilo do RIPA, homogenizovalo sa pomocou homogenizátora poháňaného motorom a Src získaný imunoprecipitáciou z ekvivalentných množstiev celkového proteínu sa použil na in vitro stanovenie kinázy pomocou fuzneho proteínu FAK-GST ako substrátu. CAM tkanivo nachádzajúce sa pod kúskom filtračného papiera sa odobralo na imunofluorescenčné sledovanie a zamrazilo sa v kryoprezervačnej látke OCT, rezalo sa na rezy s hrúbkou 4 μιη, ktoré sa fixovali 1 minútu v acetóne, potom sa inkubovali 1 hodinu v 3 % normálnom kozom sére s následnou inkubáciou v primárnej králičej protilátke proti fosforylovanej ERK tak, ako sa to predtým opísalo (Eliceiri a kol., J. Celí Biol., 140: 1255-1263 (1998), potom sa premyli v PBS a vyhodnocovali sa pomocou fluorescenčnej sekundárnej protilátky.

A. Aktivácia endogénneho Src pomocou bFGF alebo VEGF

Na stanovenie vplyvov rastových faktorov na Src aktivitu pri modulovaní angiogenézy sa vykonali nasledujúce stanovenia. Tkanivové extrakty z 10-dňových kuracích CAM, ktoré sa vystavili účinku bFGF alebo VEGF (2 pg/ml) sa nechali 2 hodiny lyžovať. Endogénny Src sa získal imunoprecipitáciou z ekvivalentných množstiev extraktu celkových proteínov a použil sa na in vitro imunostanovenie kinázy pomocou fúzneho proteínu FAK-GST ako substrátu, a po elektroforéze sa preniesol na nitrocelulózu.

Výsledky tohto stanovenia sú uvedené na obrázku 5, kde je nárast Src aktivity zjavný podľa zvýšenej denzity tohto gélu vo vzorkách ovplyvnených s bFGF alebo VEGF v porovnaní s neovplyvnenými (kontrolnými) vzorkami, ktorých ukazovateľom je v tomto CAM stanovení základná Src aktivita. Výsledkom pôsobenia bFGF ako aj VEGF bol približne dvojnásobný nárast endogénnej aktivity prítomnej v CAM. Blot spomínaného stanovenia kinázy sa taktiež sledoval v prítomnosti protilátky proti Src, čo sa použilo ako kontrola pridaného množstva ekvivalentného obsahu Src a IgG.

B. Vplyv génovej expresie Src A sprostredkovanej retrovírusom na angiogenézu v kuracej CAM

Nasledujúce stanovenie sa vykonalo na zistenie vplyvu mutovaných Src proteínov na angiogenézu v CAM preparátoch. Pri tomto stanovení sa 9-dňové kuracie CAM vystavili na 72 hodín účinku retrovírusov exprimujúcich RCAS-Src A alebo RCAS-GFP, alebo účinku tlmivého roztoku podľa opísaného protokolu.

Výsledky tohto stanovenia sú zobrazené na obrázku 6A, kde sa hladina angiogenézy kvantifikovala tak, ako sa to opísalo. Typické mikrofotografíe (4x) sa nafotili cez stereomikroskop tak, ako je to uvedené na obrázku 6B. Základná endogénna Src aktivita má angiogénny index približne 50. Na druhej strane výsledkom ovplyvnenia CAM retrovírusovým vektorom exprimujúcim RCAS-Src A, ktorý má bodovú mutáciu v polohe aminokyselinového zvyšku 527 meniacu tyrozín na fenylalanín, bolo zvýšenie (indukcia) angiogenézy s angiogénnym indexom približne 90. Zvýšenie angiogenézy sprostredkované Src-A je zrejmé taktiež z fotografií uvedených na obrázku 6B.

C. Retrovírusová expresia Src A aktivuje fosforyláciu vaskulámej MAP kinázy

Stanovil sa taktiež vplyv Src A na fosforyláciu vaskulámej MAP kinázy a porovnal sa s vplyvom rastových faktorov VEGF a PMA podľa postupov stanovení, ktoré sa opísali a uvádzajú sa tiež na tomto mieste. Tkanivové extrakty z 10-dňových kuracích CAM vystavených účinku VEGF alebo PMA (ďalší mitogén v porovnateľnej koncentrácii) na 30 minút sa porovnali s extraktmi z CAM, ktoré sa infikovali 48 hodín retrovírusom exprimujúcim Src A. Src sa získal imunoprecipitáciou z ekvivalentných množstiev extraktu celkových proteínov a použil sa na in vitro imunostanovenie kinázy pomocou fúzneho proteínu FAK-GST ako substrátu, a po elektroforéze sa preniesol na nitrocelulózu.

Výsledky tohto stanovenia sú zobrazené na obrázku 7A, kde neovplyvnené CAM (NT) majú základnú hladinu endogénnej fosforylácie vaskulámej MAP kinázy sprostredkovanej Src. Výsledkom pôsobenia VEGF a PMA bolo približne dvojnásobné zvýšenie tejto základnej hladiny. Na druhej strane Src A zvýšilo túto aktivitu približne 5 až 10-krát v porovnaní s hladinou prítomnou v neovplyvnených vzorkách.

V alikvotných častiach spomínaných lyzátov celého tkaniva sa merala taktiež endogénna fosforylácia ERK pomocou imunoblotovacej analýzy s anti-fosfo-ERK protilátkou tak, ako je to zobrazené na obrázku 7B. Na toto stanovenie sa 10-dňové CAM infikovali s kontrolným RCAS alebo s RCAS, ktorý exprimoval Src A. Po dvoch dňoch sa CAM odstránili, konzervovali sa zmrazením v OCT a rezali sa na rezy s hrúbkou 4 pm. Rezy sa značili anti-fosfo-ERK protilátkou (New England Biolabs), premyli sa a detekcia sa vykonala s kozou anti-králičou sekundárnou protilátkou s konjugovaným FITC. Fluorescenčné snímky sa zaznamenali pomocou chladenej CCD kamery (Princeton Inst.). Tieto mikrofotografíe naznačujú zvýšenú imunofluorescenciu v prípade preparátov ovplyvnených Src-A v porovnaní so slepými kontrolami.

D. Selektívna potreba Src aktivity počas angiogenézy indukovanej VEGF, nie všakbFGF

Na stanovenie účinku modulačnej aktivity Src na angiogenézu indukovanú rastovými faktormi sa vykonali nasledujúce stanovenia. Deväťdňové kuracie CAM sa vystavili účinku preparátu obsahujúcemu retrovírusový vektor, ktorý exprimuje dominantne negatívnu Src mutáciu označovanú ako Src 251 alebo Src K295M tak, ako sa to predtým opísalo. Na CAM sa pôsobilo 20 hodín retrovírusom RCAS-Src 251 alebo kontrolným RCAS-DFP retrovírusom, alebo tlmivým roztokom a potom sa inkubovali ďalších 72 hodín v prítomnosti alebo neprítomnosti bFGF alebo VEGF.

Rozsah angiogenézy, kvantifikovaná tak, ako sa opísalo, je zobrazená na obrázku 8A. Typické mikrofotografíe (6x), uvedené na obrázku 8B, sa nasnímali pomocou stereomikroskopu. Na obrázku 8C je blot, na ktorý sa pôsobilo anti-Src protilátkou, aby sa potvrdila expresia Src 251 v transfekovaných bunkách v porovnaní s kontrolnými pokusmi.

Výsledky týchto opísaných stanovení naznačujú, že bFGF ako aj VEGF v prítomnosti kontrolného retrovírusu RCAS-GFP indukovali angiogenézu v CAM, ktorá prevyšovala základnú angiogenézu sprostredkovanú Src, ktorú je možno pozorovať v kontrolných alebo neovplyvnených CAM preparátoch. Exprimovaný dominantne negatívny mutant Src 251 účinne inhiboval angiogenézu indukovanú VEGF a spôsobil jej pokles späť na základnú rozsah, ale neinhiboval angiogenézu indukovanú bFGF. Mikrofotografíe uvedené na obrázku 8B potvrdzujú údaje zobrazené na obrázku 8A. To znamená, že Src 251 exprimovaný retrovírusom je účinným inhibítorom angiogenézy, keď sa angiogenéza indukovala s VEGF.

V predkladanom vynáleze sa uvažuje o aplikácii Src proteínov tohto vynálezu na iné modely angiogenézy, ktoré sa opisujú v nasledujúcich príkladoch.

Príklad 5

Regresia rastu nádorového tkaniva spôsobená Src modulátormi meraná in vivo stanovením na modeli králičích očí

Vplyv Src modulátorov na angiogenézu indukovanú rastovými faktormi sa môže sledovať na prirodzene priehľadných štruktúrach, typickým príkladom ktorých je rohovka oka. Nové krvné cievy rastú z okraja rohovky, ktorý má bohaté zásobovanie krvou, smerom do stredu rohovky, ktorý nemá za normálnych okolností krvné zásobovanie. Stimulátory angiogenézy, ako je bFGF, indukujú po aplikácii do rohovky rast nových krvných ciev z okraja tejto rohovky. Po aplikácii antagonistov angiogenézy do rohovky dochádza k inhibícii rastu nových krvných ciev z okraja rohovky. Takže v rohovke dochádza k angiogenéze prostredníctvom invázie endoteliálnych buniek z okraja rohovky do tvrdého, kolagénom vyplneného tkaniva rohovky, čo je ľahko pozorovateľné. Stanovenie pomocou modelu králičích očí preto poskytuje in vivo model na priame pozorovanie stimulácie a inhibície angiogenézy, ku ktorej dochádza po implantácii zlúčenín priamo do rohovky oka.

A. In vivo stanovenie na modeli králičích očí

1) Angiogenéza indukovaná rastovými faktormi

Angiogenéza sa indukovala rastovými faktormi bFGF alebo VEGF na in vivo modeli králičích očí tak, ako sa to opisuje v nasledujúcich častiach.

a) Príprava hydrónových peliet obsahujúcich rastový faktor a monoklonálne protilátky

Hydrónové polyméme pelety, ktoré obsahujú rastový faktor, sa pripravujú tak, ako to opísali D’Amato a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 4082-4085 (1994). Jednotlivé pelety obsahujú 650 ng rastových faktorov samostatne naviazaných k sukralfátu (Carafet, Marion Merell Dow Corporation) na stabilizáciu tohto rastového faktora a na zaistenie jeho pomalého uvoľňovania do okolitého tkaniva. Okrem toho sa pripravili hydrónové pelety, ktoré obsahovali požadovaný retrovírus exprimujúci Src tak, ako sa to predtým opísalo. Tieto pelety sa odlievali v špeciálne pripravených teflónových formách, do povrchu ktorých sa vyryla 2,5 mm dutinka. Približne 12 μΐ odlievaného materiálu sa umiestnilo do každej formy a polymerizovalo sa cez noc v sterilnom digestore. Pelety sa potom sterilizovali ultrafialovým žiarením. Vplyv Src proteínov sa potom stanovil tak, ako sa to predtým opísalo.

Príklad 6

Regresia rastu nádorového tkaniva in vivo spôsobená Src modulátormi meraná v chimerickom myšom: ľudskom stanovení

In vivo chimérický myší: ľudský model sa vytvoril výmenou časti pokožky SCID myši za ľudskú novorodeneckú predkožku. In vivo chimérický myší: ľudský model sa pripravil v podstate tak, ako to opísali Yan a kol., J. Clin. Invest., 91: 986-996 (1993). Stručne opísané, 2 cm² štvorcovej plochy pokožky sa chirurgicky odstránilo z SCID myši (6-8 týždňov starej) a nahradili sa ľudskou predkožkou. Myš sa znecitlivila a z každej strany bočnej abdominálnej oblasti sa jej oholila srsť na ploche 5 cm². Odstránením celej hrúbky pokožky smerom k fascii sa pripravili dve okrúhle lôžka pre štep s plochou 2 cm². Rovnako veľké štepy ľudskej pokožky sa odobrali z ľudskej novorodeneckej predkožky v jej úplnej hrúbke a umiestnili sa do ranových lôžok, kde sa prišili. Step sa prikryl s náplasťou Band-Aid, ktorá sa prišila ku koži. Na prekrytie rany sa použila taktiež plátená lepiaca páska Micropore.

Na vytvorenie tuhých ľudských nádorov na ľudských pokožkových štepoch na SCID myšiach sa použila ľudská melanómová bunková línia M21-L alebo bunková línia MDA 23.1 rakoviny prsníka (ATCC HTB 26; neprítomnosť α_νβ₃ sa zistila testom imunoreaktivity rezov tkaniva s monoklonálnou protilátkou LM609). Suspenzia voľných buniek obsahujúca 5xl0⁶ buniek M21-L alebo buniek MDA 23.1 sa intradermálnou injekciou podala do štepu ľudskej pokožky. Myši sa potom sledovali 2 až 4 týždne, aby sa umožnil rast merateľných ľudských nádorov.

Po založení merateľného nádoru sa potom myši do chvostovej žily intravenózne podala injekcia s retrovírusovými preparátmi podľa tohto vynálezu alebo s PBS. Po 2 až 3 týždňoch sa nádory odobrali a zistila sa ich hmotnosť a histológia. Potom sa stanovil vplyv exprimovaných Src proteínov podľa predkladaného vynálezu na tieto nádory.

Príklad 7

Regresia rastu ľudského nádorového tkaniva in vitro spôsobená Src modulátormi meraná pomocou CAM stanovenia

Rast nádoru závisí od angiogenézy (Folkman, 1992; Weidner a kol, 1991; Brooks a kol., 1994b). V súčasnosti publikované práce naznačujú, že rast nádoru je citlivý na antiangiogénne účinky antagonistov VEGF receptora (Kim a kol., 1993). Preto sa skúmalo, či potlačenie angiogenézy prenosom Src 251 s deletovanou kinázou ovplyvní rast ľudského meduloblastómu (DAOY), vysoko angiogénneho nádoru, ktorý je známy tým, že produkuje VEGF a len veľmi málo bFGF (údaje sa neuvádzajú).

Stanovenia rastu 3 a 6 dňového DAOY meduloblastómového nádoru sa vykonali na kuracej CAM v podstate tak, ako sa to predtým opísalo (Brooks a kol., 1994). 5 x 10⁶ DAOY buniek kultivovaných v RPMI 1640 obsahujúcom 10 % fetálne teľacie sérum sa premylo a umiestnilo na CAM 10 dňového embrya, aby sa vytvorili fragmenty DAOY nádoru. Po 7 dňoch sa 50 mg nádorové fragmenty odstránili a umiestnili sa na ďalšie 10 dňové embryo a inkubovali sa ďalšie 3 alebo 6 dní, pričom sa súčasne topicky aplikoval (25 μΐ) kontrolný retrovírus RCAS-GFP, retrovírus RCAS-Src 251 alebo slepá kontrola. Pomocou konfokálneho zobrazovania celého tkaniva infikovaných nádorov, ktoré slúžilo ako orientačná metóda, sa zistilo, že pri použití tohto topického spôsobu došlo k signifíkantnej expresii RCAS konštruktov okolo a vnútri tohto nádorového fragmentu. Nádory sa odstránili a zvážili sa dvojitým slepým spôsobom, pričom sa odstraňovala iba ľahko identifikovateľná hmota tuhého nádoru (Brooks a kol., 1994). Čerstvé hmotnosti nádorov po 3 alebo 6 dňoch sa porovnali s počiatočnou hmotnosťou a stanovila sa percentuálna zmena hmotnosti nádoru v každej sledovanej skupine.

Tieto nádory ľahko rastú na CAM a vytvárajú aktívnu angiogenézu (obrázok 9), čo umožňuje, aby sa nádorová vaskulatúra vtáčieho pôvodu stala selektívnym cieľom pre RCAS retrovírus špecifický pre vtáky.

Na obrázku 9 sa uvádzajú výsledky, ktoré ukazujú, že retrovírusový prenos RCAS-Src 251 do ľudských nádorov rastúcich na kuracej CAM zvrátil nádorový rast. Obrázok 9A zobrazuje ľudské meduloblastómy, ktoré rástli na CAM kuracích embryí tak, ako sa to opísalo. Retrovírus obsahujúci RCAS-GFP alebo RCAS-Src 251 sa topicky aplikoval na nádory, ktoré už boli založené a boli väčšie ako 50 mg. Na typickej mikrofotografii fragmentu meduloblastómového nádoru infikovaného RCAS-GFP, ktorý exprimuje GFP, je zobrazená výlučná expresia v nádorových krvných cievach (šípka) tak, ako sa to stanovilo na optických rezoch zhotovených laserovým konfokálnym rastrovacím mikroskopom Bio Rad (úsečka = 500 μηι). Na obrázku 9B sú zobrazené výsledky nádorov ovplyvnených rovnako ako sa opísalo, pričom tieto nádory sa nechali rásť 3 alebo 6 dní, potom sa odstránili a stanovila sa ich čerstvá hmotnosť. Výsledky sú uvedené ako priemerná zmena hmotnosti nádoru (vychádzajúc z počiatočnej hmotnosti 50 mg) +/- SEM dvoch opakovaní. RCAS-Src 251 mal signifíkantný vplyv na rast nádoru po 3 dňoch (*, P<0,002) a po 6 dňoch (**, P<0,05). Na obrázku 9C sú zobrazené typické mikrofotografie meduloblastómových nádorov chirurgicky odstránených z týchto embryí, ktoré sa nasnímali stereomikroskopom Olympus (úsečka = 350 pm). (Spodná skupina obrázkov) Mikrofotografia veľkého zväčšenia každého nádoru detailne zobrazuje vaskulatúru každého nádoru (úsečka = 350 pm). Šípka označuje porušenie krvnej cievy v nádoroch ovplyvnených RCAS-Src 251.

Tieto výsledky ukazujú, že výsledkom prenosu RCAS obsahujúceho Src 251 na už založené meduloblastómy bola selektívna expresia vírusu v krvných cievach spojených s týmto nádorom (obrázok 9A), čo v konečnom dôsledku viedlo k regresii týchto nádorov počas šiestych dní (obrázok 9B). Je dôležité, že došlo k vážnemu porušeniu krvných ciev spojených s nádorom pri zvieratách ovplyvnených vírusom obsahujúcim Src 251, a že týchto ciev bolo menej v porovnaní s počtom nádorových ciev kontrolných zvierat (obrázok 9C). Skutočnosť, že v nádoroch infikovaných RCAS-GFP sa GFP nachádzalo iba vo vaskulatúre nádoru naznačuje, že protinádorové účinky pozorované v prípade retrovírusom prenášaného Src sú výsledkom jeho antiangiogénnych vlastností.

Predchádzajúci opis vynálezu sa považuje za dostatočný, aby umožnil odborníkovi v danej oblasti použiť tento vynález v praxi. Rámec predkladaného vynálezu by sa nemal obmedzovať na uvádzanú bunkovú líniu, keďže toto uvedené uskutočnenie sa uvádza iba ako názorný príklad jedného aspektu tohto vynálezu a ktorákoľvek bunková línia, ktorá je funkčne ekvivalentná s uvádzanou líniou, patrí do rámca tohto vynálezu. Predchádzajúci opis materiálu nepripúšťa tvrdenie, že uvedený opis je nedostačujúci na to, aby umožnil použitie ktoréhokoľvek aspektu vynálezu v praxi, vrátane jeho najlepšieho spôsobu, a nemal by sa ani chápať ako opis limitujúci rámec patentových nárokov na špecifické príklady, ktoré tvoria tento opis. Okrem modifikácií, ktoré sa tu zobrazujú a opisujú, budú odborníkom v danej oblasti z predchádzajúceho opisu zrejmé tiež rôzne ďalšie modifikácie tohto vynálezu, ktoré spadajú do rozsahu priložených patentových nárokov.

Sekvenčný výpis <110> The Scripps Research Inštitúte et al.

<120> METHODS AND COMPOSITIONS USEFUL FOR MODULATION OF ANGIOGENESIS USING TYROSINE KINASE SRC <130> TSRI 651.1 <140> Not yet known <141> To be determined <150> 60/087,220 <151> 1998-05-29 <160> 6 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 11627 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Sequence :RCASBP(A) based on avian sarcoma vírus <220>

<221> misc_feature <222> (7649)..(11258) <223> pBR322 sequences <220>

<221>LTR <222> (7166)..(7494) <223> upstream <220>

<221>LTR <222> (1)..(101) <223> upstream (numbering begins at the upstream R) <220>

<221> misc_feature <222> (11394)..(11623) <223> U3 <220>

<221 > miscfeature <222>(1).. (21) <223>R <220>

<221> miscfeature <222> (22)..(101) <223> U5 <220>

<221> miscfeature <222> (102)..(119) <220>

<221>LTR <222> (7166)..(7494) <223> downstream <220>

<221 > miscfeature <222> (7166)..(7393) <223>U3 <220>

<221 > miscfeature <222> (7394)..(7414) <223>R <220>

<221> miscfeature <222> (7415)..(7494) <223> U5 <220>

<221> misc feature <222> (7154)..(7165) <223> PPT <220>

<221> miscfeature <222> (388)..(391) <223> splice donor (AGGT) <220>

<221> miscfeature <222> (5074)..(5077) <223> env splice acceptor (AGGC) <220>

<221> miscfeature <222> (6982)..(6985) <223> Clal splice acceptor (AGGA) <220>

<221> gene <222> (372)..(902) <223> gag pl9 <220>

<221> gene <222> (909)..(1094) <223> gag plO <220>

<221> gene <222> (1095)..(1814) <223> gag p27 <220>

<221> gene <222> (1843)..(2108) <223> gag pl2 <220>

<221> gene <222> (2109)..(2480) <223> gag pis <220>

<221> misc_signal <222> (2481)..(2483) <223> gag stop <220>

<221> gene <222> (2501)..(4216) <223>polRT <220>

<221> gene <222> (4217)..(5185) <223> pol IN <220>

<221> misc_signal <222> (5186)..(5188) <223> pol stop <220>

<221> gene <222> (5244). . (6263) <223> env gp85 <220>

<221> gene <222> (6264).. (6878) <223> env gp37 <220>

<221 > misc_signal <222> (6879)..(6881) <223> env stop <220>

<221> miscfeature <222> (7027) <223> Clal site/ the Clal site in gag is methylated in Dam+ strains and does not cut.

<400> 1

gccatttgac	cactcaccac	aEEggEgEgc	accEgggEEg	acggccggac	cgttgattcc	60
ctgacgacEa	cgagcacctg	caEgaagcag	aaggcttcaE	ttggtgaccc	cgacgtgaEa	120
gttagggaat	agEggEcggc	cacagacggc	gEggcgaEcc	EgtcEccatc	cgtcEcgEcE	180
atcgggaggc	gagEtcgaCg	acccEggtgg	agggggcEgc	ggcEEaggga	ggcagaagcE	240
gagtaccgtc	ggagggagcE	ccagggcccg	gagcgacEga	ccccĽgccga	gaactcagag	300
ggtcgtcgga	agacggagag	cgagcccgac	gaccacccca	ggcacgEcEE	tggtcggcct	360
gcggatcaag	caEggaagcc	gEcattaagg	EgaEEtcgEC	cgcgEgEaaa	acctattgcg	420
ggaaaaEcEc	tccttcEaag	aaggaaaccg	gggccaEgEt	gEcccEgEEa	caaaaggaag	480
ggtCgcetaE	gECEcccEca	gaEEEaEatE	cEccggggEc	ctgggaEccc	aEcacEgcgg	540
cgctctccca	gcgggcaaEg	gsactEggaa	aaEcgggaga	gttaaaaacc	tggggaEEgg	600
Ctttgggggc	atxgaaggcg	gctcgagagg	aacaggttac	atctgagcaa	gcaaagtttt	660
ggEEgggacE	agggggaggg	agggEctccc	ccccaggEcc	ggagEgcatc	gagaaaccag	720

ctacggagcg	gcgaatcgac	aaaggggagg	aggrgggaga	aacaactgtg	cagcgagatg	780
cgaagaEggc	gccagaggaa	gcggccacac	cEaaaaccgt	tggcacaEcc	Egctatcatt	840
gcggaacagc	tgttggctgc	aattgcgcca	ccgccacagc	ctcggcccct	cctccccctt	900
atgtggggag	Eggtttgtat	ccEtccctgg	cgggggtggg	agagcagcag	ggccagggag	960
ataacacgtc	tcggggggcg	gagcagccaa	gggaggagcc	agggcacgcg	ggtcaggccc	1020
ctgggccggc	cctgactgac	tgggcaaggg	taagggagga	gcttgcgagt	actggtccgc	1080
ccgtggtggc	catgcctgta	gtgattaaga	cagagggacc	cgcctggacc	cctctggagc	1140
caaaatEgat	cacaagactg	gctgatacgg	Ecaggaccaa	gggcttacga	tccccgatca	1200
ctatggcaga	agtggaagcg	cEcatgtcct	ccccgttgct	gccgcatgac	gtcacgaatc	1260
taatgagagt	gattttagga	cctgccccat	atgccttatg	gatggacgcť	tggggagtcc	1320
aactccagac	ggttatagcg	gcagccactc	gcgacccccg	acacccagcg	aacggtcaag	1380
ggcgggggga	acggaccaac	ttggatcgat	EaaagggcEE	agctgatggg	atggtgggca	1440
acccacaggg	tcaggccgca	Ľtattaagac	cgggggaatt	ggttgctatt	acggcgtcgg	1500
cEctccaggc	gtttagagaa	gttgcccggc	tggcggaacc	tgcaggtcca	tgggcggaca	1560

tcacgcaggg	accatctgag	tcctctgttg	attttgccaa	tcggcttata	i aaggcggttg	1620
aggggtcaga	tctcccgcct	tccgcgcggg	ctccggtgat	cattgactgc	í tttaggcaga	1680
agtcacagcc	agatattcag	cagcttatac	gggcagcacc	ctccacgctg	f accaccccag	1740
gagagataat	caaatatgtg	ctagacaggc	agaagattgc	ccctcttacg	’ gatcaaggca	1800
tagccgcggc	catgtcgtct	gctatccagc	ccttagttat	ggcagtagtc	aatagagaga	1860
gggatggaca	aactgggtcg	ggtggtcgtg	cccgagggct	ctgctacact	tgtggatccc	1920
cgggacatta	tcaggcacag	tgcccgaaaa	aacgaaagtc	aggaaacagc	cgtgagcgat	1980
gtcagctgtg	tgacgggatg	ggacacaacg	ctaaacagtg	taggaagcgg	gatggcaacc	2040
agggccaacg	cccaggaaga	ggcctccctt	cggggccgtg	gcccggccct	gagcagcctg	2100
ccgtctcgtt	agcgatgaca	atggaacata	aagatcgccc	cttggttagg	gtcattctga	2160
ctaacactgg	gagtcatcca	gtcaaacaac	gttcggtgta	tatcaccgcg	ctgttggact	2220
ccggagcgga	catcactatt	atttcggagg	aggattggcc	tactgattgg	ccggtggtgg	2280
acaccgcgaa	cccacagatc	catggcatag	gagggggaat	tcccatgcga	aaatcccggg	2340
atacgataga	ggtgggggtt	attaaccgag	acgggtcgtt	ggagcgaccc	ctgctcctct	2400
tccccgcagt	cgctatggtt	a9a999a9ta	tcctaggaag	agattgtctg	cagggcctag	2460
ggctccgctt	gacaaattta	tagggagggc	cactgttctc	actgttgcgc	tacatctggc	2520
tattccgctc	aaatggaagc	cagaccgcac	gcctgtgtgg	attgaccagt	ggcccctccc	2580
tgaaggtaaa	cttgtaggcc	taacgcaatt	agtggaaaaa	gaattacagt	taggacatat	2640
agagccctca	cttagttgtt	ggaacacacc	tgtttttcgt	gatccggaag	gcttccgggt	2700
cttatcgcct	atcgcatgat	ttgcgcgctg	ttaacgccaa	gcttgtccct	tttggggccg	2760
tccaacaggg	ggcgccagtt	ctctccgcgc	tcccgcgtgg	ctggcccctg	atggtcctag	2820
acctcaagga	tcgcttcttt	tctatccctc	ttgcggaaca	agatcgcgaa	gcttttgcat	2880
ttacgctccc	ctctgtgaat	aaccaggccc	ccgctcgaag	attccaatgg	aaggtcttgc	2940
cccaagggat	gacctgttct	cccaccatct	gtcagttggt	agtgggtcag	gtgctcgagc	3000
ccttgcgact	caagcaccca	gctctgcgca	tgttgcatta	tatggacgat	cttttgctag	3060
ccgcctcaag	tcatgatggg	ttggaagcgg	cagggaagga	ggttatcggt	acattggaaa	3120
gagccgggtt	cactatttcg	ccggataaga	tccagaggga	gcccggagta	caatatcttg	3180
ggtacaagCt	aggcagtacg	tatgtagcac	ccgtaggctt	ggtagcagaa	cccaggatag	3240
ccaccttgtg	ggacgttcaa	aagctggtgg	ggtcacttca	gtggcttcgc	ccagcgttag	3300
ggatcccgcc	acgactgatg	ggtccctttt	atgagcagCt	acgagggtca	gatcctaacg	3360
aggcgaggga	atggaatcta	gacatgaaaa	tggcctggag	agagatcgta	cagcttagca	3420
ctactgctgc	cttggaacga	tgggaccctg	cccagcctct	ggaaggagcg	gtcgctagat	3480
gtgaacaggg	ggcaataggg	gtccegggac	agggactgtc	cacacaccca	aggccatgtt	3540
tgtggttatt	ctccacccaa	cccaccaagg	cgtttactgc	ttggttagaa <	gtgctcaccc	3600
ttttgattac	taagctacgc	gcttcggcag	tgcgaacctt	tggcaaggag <	gttgatatcc	3660
tcctgttgcc	tgcatgcttc	cgggaggacc	ttccgctccc	ggaggggatc	ctgttagcac	3720
ttagggggtt	tgcaggaaaa	atcaggagta	gtgacacgcc	atctattttt gacattgcgc	3780

gtccaccgca tgtttctctg aaagtgaggg ttaccgacca ccctgtgccg ggacccactg 3840 tctttaccga cgcctcctca agcacccata aaggggtggt agtctggagg gagggcccaa 3900 ggtgggagat aaaagaaaca gttgatttgg gggcaagtgt acaacaactg gaggcacgcg 3960 ctgtggccat ggcacttctg ctgtggccga caacgcccac taatgtagtg actgactctg 4020 cgtttgttgc gaaaatgtta ctcaagatgg gacaggaggg agtcccgtct acagcggcgg4080 cttttatttt agaggatgcg ttaagccaaa ggtcagccat ggccgccgtt ctccacgtgc4140 ggagtcaccc tgaagtgcca gggtttttca cagaaggaaa tgacgtggca gatagccaag4200 ccacctttca agcgtatccc ttgagagagg ctaaagatct tcataccgct ctccatattg4260 gaccccgcgc gccatccaaa gcgtgtaata tatctatgca gcaggctagg gaggttgttc4320 agacctgccc gcactgtaat tcagcccctg cgctggaggc cggggtaaac cotaggggtt4380 tgggacccct acagatatgg cagacagact ttacgcttga gcctagaatg gctccccgtt4440 cctggctcgc tgttactgtg gacaccgcct catcagcgat agtcgtaact cagcatggcc4500 gtgttacacc ggttgctgca caacatcatt gggccacggc tatcgccgtt ttgggaagac4560 caaaggccat aaaaacagat aacgggtcct gcttcacgtc cagatccacg cgagagtggc 4620 tcgcgagatg ggggatagca cacaccaccg ggattccggg aaattcccag ggtcaagcta 4680 tggtagagcg ggccaaccgg ctcctgaaag ataagatccg tgtgctcgcg gagggggacg 4740

gctttatgaa	aagaatcccc	accagcaaac	agggggaact	attagccaag	gcaatgtatg	4800
ccctcaatca	ctttgagcgt	ggtgaaaaca	caaaaacacc	gatacaaaaa	cactggagac	4860
ctaccgttct	tacagaagga	cccccggtta	aaatacgaat	agagacaggg	gagcgggaaa	4920
aaggatggaa	cgtgctggtc	tggggacgag	gttatgccgc	tgtgaaaaac	agggacactg	4980
ataaggttat	ttgggtaccc	tctcggaaag	ttaaaccgga	tgtcacccaa	aaggatgagg	5040
tgactaagaa	agatgaggcg	agccctcttt	ttgcaggcat	ttctgactgg	ataccctggg	5100
aagacgagca	agaaggactc	caaggagaaa	ccgctagcaa	caagcaagaa	agacccggag	S160
aagacaccct	tgctgccaac	gagagctaat	tatattctca	ttattggtgt	cctggtcttg	5220
tgtgaggtta	cgggggcaag	agctgatgtc	cacttactcg	agcagccagg	gaacctttgg	5280
attacatggg	ccaaccgtac	aggccaaacg	gatttttgcc	tctctacaca	gtcagccacc	5340
tccccttttc	aaacatgttt	gataggtatc	ccgtccccta	tttccgaggg	tgattttaag	5400
ggatatgttt	ctgatacaaa	ttgcaccacc	ttgggaactg	atcggttagt	ctcgtcagcc	5460
gactttactg	gcggacctga	caacagtacc	accctcactt	atcggaaggt	ctcatgcttg	5520
ttgttaaagc	tgaatgtctc	tatgtgggat	gagccacctg	aactacagct	gttaggttcc	55B0
cagtctctcc	ctaacattac	taatattgct	cagatttccg	gtataaccgg	gggatgcgta	5640
ggcttcagac	cacaaggggt	tccttggtat	ctaggttggt	ctagacagga	ggccacgcgg	5700
tttctcccta	gacacccctc	tttctctaaa	tccacggaac	cgtttacagt	ggtgacagcg	5760
gataggcaca	atctttttat	ggggagtgag	tactgcggtg	catatggcta	cagattttgg	5820
aacatgtata	actgctcaca	ggtggggcgg	cagtaccgct	gtggtaatgc	gcgcacgccc	5880
cgcacgggtc	ttcctgaaat	ccagtgtaca	aggagaggag	gcaaatgggt	taatcaatca	5940
caggaaatta	atgagtcgga	gccgttcagc	tttacggtga	actgtacagc	tagtagtttg	6000
ggtaatgcca	gtgggtgttg	cggaaaagca	ggcacgattc	tcccgggaaa	gtgggtcgac	6060

agcacacaag gtagtttcac	caaaccaaaa	gcgctaccac	ccgcaatttt	cctcatttgt	6120
ggggatcgcg	r catggcaagg	aattcccagt	cgtccggtag	ggggcccctg	ctatttaggc	6180
aagcttacca	tgttagcacc	taagcataca	gatattctca	aggtgcttgt	caattcatcg	6240
cggacaggta	taagacgtaa	acgaagcacc	tcacacctgg	atgatacatg	ctcagatgaa	6300
gtgcagcttt	ggggtcctac	agcaagaatc	tttgcatcta	tcctagcccc	99gggtagca	6360
gccgcgcaag	ccttaagaga	aatcgagaga	ctagcctgtt	ggtccgttaa	acaggctaac	6420
ttgacaacat	cactcctcgg	ggacttattg	gatgatgtca	cgagtattcg	acacgcggtc	6480
ctgcagaacc	gagcggctat	tgacttctcg	• ctcctagc'tc	: acggccatgg	ctgtgaggac	6540
gttgccggaa	tgtgctgttt	caatttgagt	gatcagagtg	agcctataca	gaagaagttc	6600
cagctaatga	aggaacaCgt	caataagatc	ggcgtggata	gcgacctaat	tggaagttgg	6660
ctgcgaggac	tattcggggg	aataggagaa	tgggccgttc	atttgctgaa	aggactgctt	6720
ttggggcttg	tagttatttt	gttgctagta	gtgtgcctgc	cttgcctttt	gcaaatgtta	6780
tgcggtaata	ggagaaagac	gattaataac	tccatcagct	accacacgga	atataagaag	6840
ctgcaaaagg	cctgtgggca	gcctgaaagc	agaatagtat	aaggcagtac	atgggtggtg	6900
gtatagcgct	tgcgagtcca	tcgagcaagg	caggaaagac	agctattggt	aattgtgaaa	6960
tacgcttttg	tctgtgtgct	gcaggagctg	agctgactct	gctggtggcc	tcgcgtacca	7020
ctgtggcatc	gatgcgatgt	acgggccaga	tatacgcgta	tctgagggga	ctagggtgtg	7080
tttaggcgaa	aagcggggct	tcggttgtac	gcggttagga	gtccccttag	gatatagtag	7140
tttcgctttt	gcatagggag	ggggaaatgt	agtcttatgc	aatactcttg	tagtcttgca	7200
acatggtaac	gatgagttag	caacatgcct	tacaaggaga	gaaaaagcac	cgtgcatgcc	7260
gattggtgga	agtaaggtgg	tacgaccgtg	ccttattagg	aaggcaacag	acgggtctga	7320
catggattgg	acgaaccact	gaatcccgca	ttgcagagat	attgtattta	agtgcctagc	7380
tcgatacaat	aaacgccatt	tgaccattca	ccacattggt	gtgcacetgg	gttgatggcc	7440
ggaccgttga	ttccctgacg	actacgagca	cctgcatgaa	gcagaaggct	tcatctggtg	7500
accccgacgt	gatagttagg	gaatagtggt	cggccacaga	cggcgtggcg	atcctgtctc	7560
catccgtctc	gtctatcggg	aggcgacttc	gatgaccctg	gtggaggggg	ctgcggctta	7620
gggaggcaga	agctgagtac	cgtcggaggg	gatccacagg	acgggtgtgg	tcgccatgat	7680
cgcgtagtcg	atagtggctc	caagtagcga	agcgagcagg	actgggcggc	ggccaaagcg	7740
gtcggacagt	gctccgagaa	cgggcgcgca	tagaaattgc	atcaacgcat	atagcgctag	7800
cagcacgcca	tagtgactgg	cgatgccgtc	ggaatggacg	atatcccgca	agaggcccgg	7860
cagtaccggc	ataaccaagc	ctatgcctac	agcatccagg	gtgacggtgc	cgaggatgac	7920
gatgagcgca	ttgttagatt	tcatacacgg	tgcctgactg	cgttagcaat	ttaactgtga	7980

taaactaccg catcaaagctz ccaaacttgg ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 8040 acaattccae acattatacg agccggaagc ataaagtgta aaacctgggg tgcctaatga 8100

gtgagaattc	ttgaagacga	aagggcctcg	tgatacgcct	atttttatag	gttaatgtca	8160
tgataacaat	ggtttcttag	acgtcaggtg	gcacttttcg	gggaaatgtg	cgcggaaccc	8220
ctatttgttt	atttttctaa	atacattcaa	atatgtatcc	gctcatgaga	caataaccct	8280
gataaatgct	tcaataaĽat	tgaaaaagga	agagtzatgag	tattcaacat	ttccgtgtcg	8340
cccttattcc	cttttttgcg	gcatct tgcc	ĽtccCgtttt	tgctcaccca	gaaacgctgg	8400

tgaaagcaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 8460
tcaacagcgg	f taagatcctt	gagagttttc	gccccgaaga	acgttttcca	atgatgagca	8520
cttttaaagc	. cctgctatgt	ggcgcggtat	catcccgtgt	tgacgccggg	caagagcaac	8580
tcggtcgccg	' catacactat	tctcagaatg	acttggttga	gtactcacca	gtcacagaaa	8640
agcatcttac	: ggatggcatg	acagťaagag	aattatgcag	tgctgceata	accatgagtg	8700
ataacactgc	ggccaactta	cttctgacaa	cgatcggagg	accgaaggag	ctaaccgctt	8760
ttttgcacaa	catgggggat	catgtaactc	gccttgatcg	ttgggaaccg	gagctgaatg	8820
aagccatacc	aaacgacgag	cgegacacca	cgatgcctgc	agcaatggca	acaacgttgc	8B80
gcaaactatt	aactggcgaa	ctacttactc	tagcttcccg	gcaacaatta	atagaccgga	8940
tggaggcgga	taaagttgca	ggaccacttc	tgcgctcggc	ccttccggct	ggctggttta	9000
ttgctgataa	atctggagcc	ggtgagcgtg	ggtctcgcgg	tatcattgca	gcactggggc	9060
cagatggtaa	gccctcccgt	atcgtagtta	Cctacacgac	ggggagtcag	gcaactatgg	9120
atgaacgaaa	tagacagatc	gctgagatag	gtgcct.cact	gattaagcat	tggtaactgt	9180
cagaccaagt	ttactcaCat	atactttaga	ttgacttaaa	acttcatttt	taatttaaaa	9240
ggatctaggt	gaagatcctt	tttgacaatc	tcatgaccaa	aatcccttaa	cgtgagtttt	9300
cgttccactg	agcgtcagac	cccgtagaaa	agatcaaagg	atcttzcttga	gatccttttt	9360
ttctgcgcgt	aatctgctgc	ttgcaaacaa	aaaaaccacc	gctaccagcg	gtggtttgtt	9420
tgccggatca	agagctacca	actctttttc	cgaaggtaac	tggcttcagc	agagcgcaga	9480
taccaaatac	tgtccttcta	gCgtagccgt	agttaggcca	ccacttcaag	aactctgtag	9540
caccgcctac	atacctcgct	ctgctaatcc	tgttaccagt	ggctgctgcc	agtggcgata	9600
agtcgegtct.	taccgggttg	gactcaagac	gatagetacc	ggataaggcg	cagcggtcgg	9660
gctgaacggg	gggttcgtgc	acacagccca	gcttggagcg	aacgacccac	accgaactga	9720
gatacctaca	gcgtgagcca	tgagaaagcg	ccacgcttcc	cgaagggaga	aaggcggaca	9780
ggtatccggt	aagcggcagg	gtcggaacag	gagagcgcac	gagggagctt	ccagggggaa	9840
acgcctggta	tctttatagt	cctgCcgggt	ttcgccacct	ctgacttgag	cgtcgatttt	9900
tgtgatgctc	gtcagggggg	cggagcctat	ggaaaaacgc	cagcaacgcg	gcctttttac	9960
ggttcctggc	cttttgctgg	ccttttgctc	acatgttctt	tcctgcgtta	tcccctgatt	10020
ctgtggataa	ccgtattacc	gcctttgagt	gagctgatac	cgctcgccgc	agccgaacga	10080
ccgagcgcag	cgagtcagtg	agcgaggaag	cggaagagcg	cctgatgcgg	tattttctcc	10140
tcacgcatct	gtgcggtatc	tcacaccgca	tatggcgoao	tctcagtaca	atctgctctg	10200
atgccgcata	gttaagccag	tatacactcc	gctatcgcta	cgtgactggg	tcatggctgc	10260
gccccgacac	ccgccaacac	ccgctgacgc	gccctgacgg	gcctgtctgc	tcccggcatc	10320
cgcttacaga	caagctgtga	ccgtctccgg	gagctgcatg	tgtcagaggt	tttcaccgtc	10380
atcaccgaaa	cgcgcgaggc	agctgcggta	aagctcatca	gcgtggtcgt	gaagcgattc	10440
acagatgtct	gcctgttcat	ccgcgtccag	ctcgttgagt	ttctccagaa	gcgttaatgt	10500
ctggcttctg	ataaagcggg	ccatgttaag	ggcggttttt	tcctgtttgg	tcacttgatg	10560
cctccgtgta	agggggaatt	tctgttcatg	ggggtaatga	taccgatgaa	acgagagagg	10620
atgctcacga	tacgggttac	tgatgatgaa	catgcccggt	tactggaacg	ttgtgagggt	10680
aaacaactgg <	cggtatggat	gcggcgggac	cagagaaaaa	tcactcaggg	tcaatgdcag	10740

cgcttcgtta	atacagatgt	aggtgttcca	cagggtagcc	agcagcatcc	tgcgatgcag	10800
atccggaaca	taatggtgca	gggcgctgac	ttccgcgttt	ccagacttta	cgaaacacgg	10860
aaaccgaaga	ccattcatgt	tgttgctcag	gtcgcagacg	ttttgcagca	gcagtcgctt	10920
cacgttcgct	cgcgtatcgg	tgattcattc	tgctaaccag	taaggcaacc	ccgccagcct	10980
agccgggtcc	tcaacgacag	gagcacgatc	atgagcaccc	gtggccagga	cccaacgctg	11040
cccgagatgc	gccgcgtgcg	gctgctggag	atggcggacg	cgatggatat	gttctgccaa	11100
gggttggttt	gcgcattcac	agttctccgc	aagaattgat	tggctccaat	tcttggagtg	11160
gtgaatccgt	tagcgaggtg	ccgccggctt	ccattcaggt	cgaggtggcc	cggctccatg	11220
caccgcgacg	caacgcgggg	aggcagacaa	ggtatagggc	ggcgatgcga	tgtacgggcc	11280
agatatacgc	gtatctgagg	ggactagggt	gtgtttaggc	gaaaagcggg	gcttcggttg	11340
tacgcggtta	ggagtcccct	taggatatag	tagtttcgct	tttgcatagg	gagggggaaa	11400
tgtagtctta	tgcaatactc	ttgtagtctt	gcaacatggt	aacgatgagt	tagcaacatg	11460
ccttacaagg	agagaaaaag	caccgtgcat	gccgattggt	ggaagtaagg	tggtacgatc	11520
gtgccttatt	aggaaggcaa	cagacgggtc	tgacatggat	tggacgaacc	actgaattcc	11580
gcattgcaga	gatattgtat	ttaagtgcct	agctcgatac	aataaac		11627

<210>2 <211>1759 <212>DNA <213> Chicken <220>

<221> gene <222> (1)..(1759) <223> chicken c-SRC cDNA <220>

<221>CDS <222> (112)..(1710) <400> 2 tctgacaccc atctgcctgt ctgtctgtgt gctgcaggag ctgagctgac tctgctgtgg 60 cctcgcgtac cactgtggcc aggcggtagc tgggacgtgc agcccaccac c atg ggg 117

Met Gly

agc Ser

agc Ser

aag agc aag

ccc Pro

aag gac

ccc Pro

agc Ser

cag Gin

cgc Arg

cgg Arg 15

cgc Arg

agc Ser

ctg Leu

165

Lys 5

Ser

Lys

Lys

Asp 10

gag

cca

CCC

gac

agc

acc

cac

cac

999

gga

ttc

cca

gcc

tcg

cag

acc

213

Glu

Pro

Pro

Asp

Ser

Thr

His

His

Gly

Gly

Phe

Pro

Ala

Ser

Gin

Thr

20

25

30

CCC

aac

aag

aca

gca

gcc

ccc

gac

acg

cac

cgc

acc

ccc

agc

cgc

tcc

261

Pro

Asn

Lys

Thr

Ala

Ala

Pro

Asp

Thr

His

Arg

Thr

Pro

Ser

Arg

Ser

35

40

45

50

ttt

999

acc

gtg

gcc

acc

gag

ccc

aag

ctc

ttc

ggg

ggc

ttc

aac

act

309

Phe

Gly

Thr

Val

Ala

Thr

Glu

Pro

Lys

Leu

Phe

Gly Gly

Phe

Asn

Thr

55

60

65

tct Ser	gac acc Asp Thr	gtt acg Val Thr 70	tcg Ser	ccg cag pro Gin	cgt Arg 75	gcc ggg Ala Gly	gca ctg get ggc ggc
Ala Leu Ala Gly Gly
80
gtc	acc	act	ttc	gtg	get	ctc	tac	gac	tac	gag	tcc cgg act gaa acg
Val	Thr	Thr 85	Phe	Val	Ala	Leu	Tyr 90	Asp	Tyr	Glu	Ser Arg Thr Glu Thr 95
gac	ttg	tcc	ttc	aag	aaa	gga	gaa	ege	ctg	cag	att gtc aac aac acg
Asp	Leu 100	Ser	Phe	Lys	Lys	Gly 105	Glu	Arg	Leu	Gin	íle Val Asn Asn Thr 110
gaa	ggt	gac	tgg	tgg	ctg	get	cat	tcc	ctc	act	aca gga cag acg ggc
Glu 115	Gly	Asp	Trp	Trp	Leu 120	Ala	His	Ser	Leu	Thr 125	Thr Gly Gin Thr Gly 130
tac	atc	ccc	agt	aac	tat	gtc	gcg	ccc	tca	gac	tcc atc cag get gaa
Tyr	íle	Pro	Ser	Asn 135	Tyr	Val	Ala	Pro	Ser 140	Asp	Ser íle Gin Ala Glu 145
gag	tgg	tac	ttt	ggg	aag	atc	act	cgt	cgg	gag	tcc gag cgg ctg ctg
Glu	Trp	Tyr	Phe 150	Gly	Lys	íle	Thr	Arg 155	Arg	Glu	Ser Glu Arg Leu Leu 160
ctc	aac	ccc	gaa	aac	ccc	cgg	gga	acc	ttc	ttg	gtc cgg gag agc gag
Leu	Asn	Pro 165	Glu	Asn	Pro	Arg	Gly 170	Thr	Phe	Leu	Val Arg Glu Ser Glu 175
acg	aca	aaa	ggt	gcc	tat	tgc	ctc	tcc	gtt	tct	gac ttt gac aac gcc
Thr	Thr 180	Lys	Gly	Ala	Tyr	Cys 185	Leu	Ser	Val	Ser	Asp Phe Asp Asn Ala 190
aag	ggg	ctc	aat	gtg	aag	cac	tac	aag	atc	ege	aag ctg gac agc ggc
Lys 195	Gly	Leu	Asn	Val	Lys 200	His	Tyr	Lys	íle	Arg 205	Lys Leu Asp Ser Gly 210
ggc	ttc	tac	atc	acc	tca	ege	aca	cag	ttc	agc	agc ctg cag cag ctg
Gly	Phe	Tyr	íle	Thr 215	Ser	Arg	Thr	Gin	Phe 220	Ser	Ser Leu Gin Gin Leu 225
gtg	gcc	tac	tac	tcc	aaa	cat	get	gat	ggc	ttg	tgc cac ege ctg acc
Val	Ala	Tyr	Tyr 230	Ser	Lys	His	Ala	Asp 235	Gly	Leu	Cys His Arg Leu Thr 240
aac	gtc	tgc	ccc	acg	tcc	aag	ccc	cag	acc	cag	gga ctc gcc aag gac
Asn	Val	Cys 245	Pro	Thr	Ser	Lys	Pro 250	Gin	Thr	Gin	Gly Leu Ala Lys Asp 255
gcg	tgg	gaa	atc	ccc	cgg	gag	tcg	ctg	cgg	ctg	gag gtg aag ctg ggg
Ala	Trp 260	Glu	íle	Pro	Arg	Glu 265	Ser	Leu	Arg	Leu	Glu Val Lys Leu Gly 270
cag	ggc	tgc	ttt	gga	gag	gtc	tgg	atg	999	acc	tgg aac ggc acc acc
Gin 275	Gly	Cys	Phe	Gly	Glu 280	Val	Trp	Met	Gly	Thr 285	Trp Asn Gly Thr Thr 290
aga	gtg	gcc	ata	aag	act	ctg	aag	ccc	ggc	acc	atg tcc ccg gag gcc
Arg	Val	Ala	íle	Lys 295	Thr	Leu	Lys	Pro	Gly 300	Thr	Met Ser Pro Glu Ala 305
ttc	ctg	cag	gaa	gcc	caa	gtg	atg	aag	aag	ctc	cgg cat gag aag ctg
Phe	Leu	Gin	Glu 310	Ala	Gin	val	Met	Lys 315	Lys	Leu	Arg His Glu Lys Leu 320
gtt	cag	ctg	tac	gca	gtg	gtg	tcg	gaa	gag	ccc	atc tac atc gtc act
val	Gin	Leu 325	Tyr	Ala	Val	Val	Ser 330	Glu	Glu	Pro	íle Tyr íle Val Thr 335
gag	tac	atg	agc	aag	ggg	agc	ctc	ctg	gat	ttc	ctg aag gga gag atg
Glu	Tyr 340	Met	Ser	Lys	Gly	Ser 345	Leu	Leu	Asp	Phe	Leu Lys Gly Glu Met 350
ggc	aag	tac	ctg	cgg	ctg	cca	cag	ctc	gtc	gat	atg get get cag att
Gly 355	Lys	Tyr	Leu	Arg	Leu 360	Pro	Gin	Leu	Val	Asp i 365	Met Ala Ala Gin íle 370

357

405

453

501

549

97

645

693

741

789

837

885

933

981

1029

1077

1125

1173

1221

gca Ala

tcc ggc Ser Gly

atg gcc

tat Tyr

gtg Val

gag Glu

agg Arg

atg Met 380

aac Asn

tac gtg Tyr Val

cac ega gac

1269

Met

Ala 375

His

Arg Asp 385

ctg

cgg

gcg

gcc

aac

atc

ctg

gtg

ggg

gag

aac

ctg

gtg

tgc

aag

gtg

1317

Leu

Arg

Ala

Ala

Asn

íle

Leu

Val

Gly

Glu

Asn

Leu

Val

Cys

Lys

Val

390

395

400

get

gac

ttt

ggg

ctg

gca

cgc

ctc

atc

gag

gac

aac

gag

tac

aca

gca

1365

Ala

Asp

Phe

Gly

Leu

Ala

Arg

Leu

íle

Glu

Asp

Asn

Glu

Tyr

Thr

Ala

405

410

415

cgg

caa

ggt

gcc

aag

ttc

ccc

atc

aag

tgg

aca

gcc

ccc

gag

gca

gcc

1413

Arg

Gin

Gly

Ala

Lys

Phe

Pro

íle

Lys

Trp

Thr

Ala

Pro

Glu

Ala

Ala

420

425

430

ctc

tat

ggc

cgg

ttc

acc

atc

aag

tcg

gat

gtc

tgg

tcc

ttc

ggc

atc

1461

Leu

Tyr

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Lys

Ser

Asp

Val

Trp

Ser

Phe

Gly

íle

435

440

445

450

ctg

ctg

act

gag

ctg

acc

ačc

aag

ggc

cgg

gtg

cca

tac

cca

ggg

atg

1509

Leu

Leu

Thr

Glu

Leu

Thr

Thr

Lys

Gly

Arg

Val

Pro

Tyr

Pro

Gly

Met

455

460

465

gtc

aac

agg

gag

gtg

ctg

gac

cag

gtg

gag

agg

ggc

tac

cgc

atg

ccc

1557

Val

Asn

Arg

Glu

Val

Leu

Asp

Gin

Val

Glu

Arg

Gly

Tyr

Arg

Met

Pro

470

475

480

tgc

ccg

ccc

gag

tgc

ccc

gag

tcg

ctg

cat

gac

ctc

atg

tgc

cag

tgc

1605

Cys

Pro

Pro

Glu

Cys

Pro

Glu

Ser

Leu

His

Asp

Leu

Met

Cys

Gin

Cys

485

490

495

tgg

cgg

agg

gac

cct

gag

gag

cgg

ccc

act

ttt

gag

tac

ctg

cag

gcc

1653

Trp

Arg 500

Arg

Asp

Pro Glu

Glu Arg 505

Pro Thr

Phe

Glu Tyr 510

Leu

Gin Ala

ttc

ctg

gag

gac

tac

ttc

acc

tcg

aca

gag

ccc

cag

tac

cag

cct

gga

1701

Phe

Leu

Glu

Asp

Tyr

Phe

Thr

Ser

Thr

Glu

Pro

Gin

Tyr

Gin

Pro

Gly

515 520 S25 530 gag aac cta taggcctgga gctcctcctg gaccagaggc ctcgctgtgg ggtacaggg 1759 Glu Asn Leu <210>3 <211>533 <212> PRT <213> Chicken <400>3

Met 1

Gly

Ser

Ser Lys 5

Ser Lys

Pro Lys Asp 10

Pro

Ser

Gin Arg

Arg 15

Arg

Ser

Leu

Glu

Pro

Pro

Asp

Ser

Thr

His

His

Gly

Gly

Phe

Pro

Ala

Ser

20

25

30

Gin

Thr

Pro

Asn

Lys

Thr

Ala

Ala

Pro

Asp

Thr

His

Arg

Thr

Pro

Ser

35

40

45

Arg

Ser

Phe

Gly

Thr

Val

Ala

Thr

Glu

Pro

Lys

Leu

Phe

Gly

Gly

Phe

50

55

60

Asn

Thr

Ser

Asp

Thr

Val

Thr

Ser

Pro

Gin

Arg

Ala

Gly

Ala

Leu

Ala

65

70

75

80

Gly

Gly

Val

Thr

Thr

Phe

Val

Ala

Leu

Tyr

Asp

Tyr

Glu

Ser

Arg

Thr

85

90

95

Glu

Thr

Asp

Leu

Ser

Phe

Lys

Lys

Gly

Glu

Arg

Leu

Gin

íle

Val

Asn

100

105

110

Asn

Thr

Glu

Gly

Asp

Trp

Trp

Leu

Ala

His

Ser

Leu

Thr

Thr

Gly

Gin

115

120

125

Thr	Gly Tyr 130	íle	Pro Ser Asn 135	Tyr Val	Ala Pro Ser Asp Ser	íle Gin
14 0
Ala 14 5	Glu	Glu	Trp	Tyr	Phe 150	Gly	Lys	íle	Thr Arg Arg Glu Ser 155	Glu Arg 160
Leu	Leu	Leu	Asn	Pro 165	Glu	Asn	Pro	Arg	Gly Thr Phe Leu Val 170	Arg Glu 175
Ser	Glu	Thr	Thr 180	Lys	Gly	Ala	Tyr	Cys 1B5	Leu Ser Val Ser Asp 190	Phe Asp
Asn	Ala	Lys 195	Gly	Leu	Asn	Val	Lys 200	His	Tyr Lys íle Arg Lys 205	Leu Asp
Ser	Gly 210	Gly	Phe	Tyr	íle	Thr 215	Ser	Arg	Thr Gin Phe Ser Ser 220	Leu Gin
Gin 225	Leu	Val	Ala	Tyr	Tyr 230	Ser	Lys	His	Ala Asp Gly Leu Cys 235	His Arg 240
Leu	Thr	Asn	Val	Cys 245	Pro	Thr	Ser	Lys	Pro Gin Thr Gin Gly 250	Leu Ala 255
Lys	Asp	Ala	Trp 260	Glu	íle	Pro	Arg	Glu 265	. Ser Leu Arg Leu Glu 270	i Val Lys 1
Leu	Gly	Gin 275	Gly	Cys	Phe	Gly	Glu 280	Val	Trp Met Gly Thr Trp 285	Asn Gly
Thr	Thr 290	Arg	Val	Ala	íle	Lys 295	Thr	Leu	Lys Pró Gly Thr Met 300	Ser Pro
Glu 305	Ala	Phe	Leu	Gin	Glu 310	Ala	Gin	Val	Met Lys Lys Leu Arg 315	His Glu 320
Lys	Leu	Val	Gin	Leu 325	Tyr	Ala	Val	Val	Ser Glu Glu Pro íle 330	Tyr íle 335
Val	Thr	Glu	Tyr 340	Met	Ser	Lys	Gly	Ser 345	Leu Leu Asp Phe Leu 350	Lys Gly
Glu	Met	Gly 355	Lys	Tyr	Leu	Arg	Leu 360	Pro	Gin Leu Val Asp Met 365	Ala Ala
Gin	íle 370	Ala	Ser	Gly	Met	Ala 375	Tyr	Val	Glu Arg Met Asn Tyr 380	Val His
Arg 385	Asp	Leu	Arg	Ala	Ala 390	Asn	íle	Leu	Val Gly Glu Asn Leu 395	Val Cys 400
Lys	Val	Ala	Asp	Phe 405	Gly	Leu	Ala	Arg	Leu íle Glu Asp Asn 410	Glu Tyr 415
Thr	Ala	Arg	Gin 420	Gly	Ala	Lys	Phe	Pro 425	íle Lys Trp Thr Ala 430	Pro Glu
Ala	Ala	Leu 435	Tyr	Gly	Arg	Phe	Thr 440	íle	Lys Ser Asp Val Trp 445	Ser Phe
Gly	íle 450	Leu	Leu	Thr	Glu	Leu 455	Thr	Thr	Lys Gly Arg Val Pro 460	Tyr Pro
Gly 465	Met	Val	Asn	Arg	Glu 470	Val	Leu	Asp	Gin Val Glu Arg Gly 475	Tyr Arg 480
Met	Pro	Cys	Pro	Pro 485	Glu	Cys	Pro	Glu	Ser Leu His Asp Leu 490	Met Cys 495
Gin	Cys	Trp	Arg 500	Arg	Asp	Pro	Glu	Glu 505	Arg Pro Thr Phe Glu 510	Tyr Leu
Gin	Ala	Phe 515	Leu	Glu	Asp	Tyr	Phe 520	Thr	Ser Thr Glu Pro Gin 525	Tyr Gin

Pro Gly Glu Asn Leu

530 <210>4 <211> 2187 <212>DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> gene <222> (1)...(2187) <223> human c-SRC cDNA <220> <221>CDS <222> (134)..(1483) <400>4 gcgccgcgtc ccgcaggccg tgatgccgcc cgcgcggagg tggcccggac cgcagtgccc 60 caagagagct ctaatggtac caagtgacag gttggcttta ctgtgactcg gggacgccag 120 agctcctgag aag atg tca gca ata cag gcc gcc tgg cca tcc ggt aca 169

Met Ser Ala íle Gin Ala Ala Trp Pro Ser Gly Thr

5 10

gaa tgt Glu Cys

att íle 15

gcc aag tac aac ttc cac ggc act gcc gag cag gac ctg

217

Ala Lys

Tyr Asn Phe His Gly Thr 20

Ala

Glu 25

Gin

Asp Leu

ccc

ttc

tgc

aaa

gga

gac

gtg

ctc

acc

att

gtg

gcc

gtc

acc

aag

gac

265

Pro

Phe 30

Cys

Lys

Gly

Asp

Val 35

Leu

Thr

íle

Val

Ala 40

Val

Thr

Lys

Asp

ccc

aac

tgg

tac

aaa

gcc

aaa

aac

aag

gtg

ggc

cgt

gag

ggc

atc

atc

313

Pro 45

Asn

Trp

Tyr

Lys

Ala 50

Lys

Asn

Lys

Val

Gly 55

Arg

Glu

Gly

íle

íle 60

cca

gcc

aac

tac

gtc

cag

aag

cgg

gag

ggc

gtg

aag

gcg

ggt

acc

aaa

361

Pro

Ala

Asn

Tyr

Val 65

Gin

Lys

Arg

Glu

Gly 70

Val

Lys

Ala

Gly

Thr 75

Lys

ctc

agc

ctc

atg

cct

tgg

ttc

cac

ggc

aag

atc

aca

cgg

gag

cag

get

409

Leu

Ser

Leu

Met 80

Pro

Trp

Phe

His

Gly 85

Lys

íle

Thr

Arg

Glu 90

Gin

Ala

gag

cgg

ctt

ctg

tac

ccg

ccg

gag

aca

ggc

ctg

ttc

ctg

gtg

cgg

gag

457

Glu

Arg

Leu 95

Leu

Tyr

Pro

Pro

Glu 100

Thr

Gly

Leu

Phe

Leu 105

val

Arg

Glu

agc

acc

aac

tac

ccc

gga

gac

tac

acg

ctg

tgc

gtg

agc

tgc

gac

ggc

505

Ser

Thr 110

Asn

Tyr

Pro

Gly

Asp 115

Tyr

Thr

Leu

Cys

Val 120

Ser

Cys

Asp

Gly

aag

gtg

gag

cac

tac

cgc

atc

atg

tac

cat

gcc

agc

aag

ctc

agc

atc

553

Lys 125

Val

Glu

His

Tyr

Arg 130

íle

Met

Tyr

His

Ala 135

Ser

Lys

Leu

Ser

íle 140

gac

gag

gag

gtg

tac

ttt

gag

aac

ctc

atg

cag

ctg

gtg

gag

cac

tac

601

Asp

G1U

Glu

Val

Tyr 145

Phe

GlU

Asn

Leu

Met 150

Gin

Leu

Val

Glu

His 155

Tyr

acc

tca

gac

gca

gat

gga

ctc

tgt

acg

cgc

ctc

att

aaa

cca

aag

gtc

649

Thr

Ser

Asp

Ala 160

Asp

Gly

Leu

Cys

Thr 165

Arg

Leu

íle

Lys

Pro 170

Lys

Val

atg

gag

ggc

aca

gtg

gcg

gcc

cag

gat

gag

ttc

tac

cgc

agc

ggc

tgg

697

Met

Glu

Gly 175

Thr

Val

Ala

Ala

Gin 180

Asp

Glu

Phe

Tyr

Arg 185

Ser

Gly

Trp

gcc

ctg

aac

atg

aag

gag

ctg

aag

ctg

ctg

cag

acc

atc

ggg

aag

ggg

745

Ala

Leu 190

Asn

Met

Lys

Glu

Leu 19S

Lys

Leu

Leu i

Gin

Thr 200

íle

Gly

Lys

Gly

gag

ttc 1

gga

gac

gtg

atg

ctg i

ggc i

gat

tac i

ega .

ggg

aac

aaa <

gtc

gcc

793

Glu Phe Gly Asp Val 205

Met 210

Leu Gly Asp Tyr Arg 215

Gly Asn Lys

Val Ala 220

gtc

aag

tgc

att

aag

aac

gac

gcc

act

gcc

cag

gcc

ttc

: ctg

get

gaa

841

Val

Lys

Cys

íle

Lys 225

Asn

Asp

Ala

Thr

Ala 230

Gin

Ala

Phe

Leu

Ala 235

Glu

gcc

tca

gtc

atg

acg

caa

ctg

cgg

cat

age

aac

ctg

gtg

cag

ctc

ctg

889

Ala

Ser

Val

Met 240

Thr

Gin

Leu

Arg

His 245

Ser

Asn

Leu

Val

Gin 250

Leu

Leu

ggc

gtg

atc

gt/

gag

gag

aag

ggc

ggg

ctc

tac

atc

gtc

act

gag

tac

937

Gly

Val

íle 255

Val

Glu

Glu

Lys

Gly 260

Gly

Leu

Tyr

íle

Val 265

Thr

Glu

Tyr

atg

gcc

aag

ggg

age

ctt

gtg

gac

tac

ctg

cgg

tct

agg

ggt

cgg

tca

985

Met

Ala 270

Lys

Gly

Ser

Leu

Val 275

Asp

Tyr

Leu

Arg

Ser 280

Arg

Gly

Arg

Ser

gtg

ctg

ggc

gga

gac

tgt

ctc

ctc

aag

ttc

tcg

cta

gat

gtc

tgc

gag

1033

Val 285

Leu

Gly

Gly

Asp

Cys 290

Leu

Leu

Lys

Phe

Ser 295

Leu

Asp

Val

Cys

Glu 300

gcc

atg

gaa

tac

ctg

gag

ggc

aac

aat

ttc

gtg

cat

ega

gac

ctg

get

1081

Ala

Met

Glu

Tyr

Leu 305

Glu

Gly

Asn

Asn

Phe 310

Val

His

Arg

Asp

Leu 315

Ala

gcc

cgc

aat

gtg

ctg

gtg

tct

gag

gac

aac

gtg

gcc

aag

gtc

age

gac

1129

Ala

Arg

Asn

Val 320

Leu

Val

Ser

Glu

Asp 325

Asn

Val

Ala

Lys

Val 330

Ser

Asp

ttt

ggt

ctc

acc

aag

gag

gcg

tcc

age

acc

cag

gac

acg

ggc

aag

ctg

1177

Phe

Gly

Leu 335

Thr

Lys

Glu

Ala

Ser 340

Ser

Thr

Gin

Asp

Thr 345

Gly

Lys

Leu

cca

gtc

aag

tgg

aca

gcc

cct

gag

gcc

ctg

aga

gag

aag

aaa

ttc

tcc

1225

Pro

Val 350

Lys

Trp

Thr

Ala

Pro 355

Glu

Ala

Leu

Arg

Glu 360

Lys

Lys

Phe

Ser

act

aag

tct

gac

gtg

tgg

agt

ttc

gga

atc

ctt

ctc

tgg

gaa

atc

tac

1273

Thr 365

Lys

Ser

Asp

Val

Trp 370

Ser

Phe

Gly

íle

Leu 375

Leu

Trp

Glu

íle

Tyr 380

tcc

ttt

ggg

ega

gtg

cct

tat

cca

aga

att

ccc

ctg

aag

gac

gtc

gtc

1321

Ser

Phe

Gly

Arg

Val 385

Pro

Tyr

Pro

Arg

íle 390

Pro

Leu

Lys

Asp

Val 395

Val

cct

cgg

gtg

gag

aag

ggc

tac

aag

atg

gat

gcc

ccc

gac

ggc

tgc

ccg

1369

Pro

Arg

Val

Glu 400

Lys

Gly

Tyr

Lys

Met 405

Asp

Ala

Pro

Asp

Gly 410

Cys

Pro

ccc

gca

gtc

tat

gaa

gtc

atg

aag

aac

tgc

tgg

cac

ctg

gac

gcc

gcc

1417

Pro

Ala

Val 415

Tyr

Glu

Val

Met

Lys 420

Asn

Cys

Trp

His

Leu 425

Asp

Ala

Ala

atg

cgg

ccc

tcc

ttc

cta

cag

ctc

ega

gag

cag

ctt

gag

cac

atc

aaa

1465

Met

Arg 430

Pro

Ser

Phe

Leu

Gin 435

Leu

Arg

Glu

Gin

Leu 440

Glu

His

íle

Lys

acc	cac	gag	ctg	cac	ctg tgacggctgg cctccgcctg ggtcatgggc	1513
Thr	His	Glu	Leu	Hla	Leu
445					450

ctgtggggac tgaacctgga agatcatgga cctggtgccc ctgctcactg ggcccgagcc 1573

tgaactgagc	cccagcgggc	tggcgggcct	ttttcctgcg	tcccagcctg	cacccctccg	1633
gccccgtctc	tcttggaccc	acctgtgggg	cctggggagc	ccactgaggg	gccagggagg	1693
aaggaggcca	cggagcggga	ggcagcgccc	caccacgtcg	ggcttccctg	gcctcccgcc	1753
actcgccttc	ttagagtttt	attcctttcc	ttttttgaga	ttttttttcc	gtgtgtttat	1813
tttttattat	ttttcaagat	aaggagaaag	aaagtaccca	gcaaatgggc	attttacaag	1873
aagtacgaat	cttatttttc	ctgccctgcc	cgtgagggtg	ggggggaccg	ggcccctctc	1933
tagggacccc	tcgccccagc	ctcattcccc	attctgtgtc	ccatgtcccg	tgtctcctcg	1993
gtcgccccgt	gtttgcgctt	gaccatgttg	cactgtttgc	atgcgcccga	ggcagacgtc	2053
tgtcaggggc	ttggatttcg	tgtgccgctg	ccacccgccc	acccgccttg	tgagatggaa	2113
ttgtaataaa	ccacgccatg	aggacaccgc	cgcccgcctc	ggcgcttcct	ccaccgaaaa	2173
aaaaaaaaaa	aaaa					2187

<210>5 <21X>450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>5

Met 1

Ser

Ala

íle

Gin 5

Ala

Ala

Trp

Pro

Ser 10

Gly Thr

Glu

Cys

íle 15

Ala

Lys

Tyr

Asn

Phe 20

His

Gly

Thr

Ala

Glu 25

Gin

Asp

Leu

Pro

Phe 30

Cys

Lys

Gly

Asp

Val 35

Leu

Thr

íle

Val

Ala 40

Val

Thr

Lys

Asp

Pro 45

Asn

Trp

Tyr

Lys

Ala 50

Lys

Asn

Lys

Val

Gly 55

Arg

Glu

Gly

íle

íle 60

Pro

Ala

Asn

Tyr

Val 65

Gin

Lys

Arg

Glu

Gly 70

Val

Lys

Ala

Gly

Thr 75

Lys

Leu

Ser

Leu

Met 80

Pro

Trp

Phe

His

Gly 85

Lys

íle

Thr

Arg

Glu 90

Gin

Ala

Glu

Arg

Leu 95

Leu

Tyr

Pro

Pro

Glu 100

Thr

Gly

Leu

Phe

Leu 105

Val

Arg

Glu

Ser

Thr 110

Asn

Tyr

Pro

Gly

Asp 115

Tyr

Thr

Leu

Cys

Val 120

Ser

Cys

Asp

Gly

Lys 125

Val

Glu

His

Tyr

Arg 13 0

íle

Met

Tyr

His

Ala 135

Ser

Lys

Leu

Ser

íle 140

Asp

Glu

Glu

Val

Tyr 145

Phe Glu

Asn

Leu Met 150

Gin

Leu Val

Glu His 155

Tyr Thr Ser Asp Ala 160

Asp

Gly

Leu

Cys

Thr

Arg

Leu

íle

Lys

Pro

Lys

Val

Met

Glu

Gly Thr

165

170

175

Val

Ala

Ala

Gin

Asp

Glu

Phe

Tyr

Arg

Ser

Gly

Trp

Ala

Leu

Asn Met

180

185

190

Lys

Glu

Leu

Lys

Leu

Leu

Gin

Thr

íle

Gly

Lys

Gly

Glu

Phe

Gly

Asp

195

200

205

val

Met

Leu

Gly

Asp

Tyr

Arg

Gly

Asn

Lys

Val

Ala

val

Lys

Cys

íle

210

215

220

Lys

Asn

Asp

Ala

Thr

Ala

Gin

Ala

Phe

Leu

Ala

Glu

Ala

Ser

Val

Met

225

230

235

240

Thr

Gin

Leu

Arg

His

Ser

Asn

Leu

Val

Gin

Leu

Leu

Gly

Val

íle

Val

245

250

255

Glu

Glu

Lys

Gly

Gly

Leu

Tyr

íle

Val

Thr

Glu

Tyr

Met

Ala

Lys

Gly

260

265

270

Ser

Leu

Val

Asp

Tyr

Leu

Arg

Ser

Arg

Gly

Arg

Ser

Val

Leu

Gly

Gly

275

2B0

285

Asp

Cys

Leu

Leu

Lys

Phe

Ser

Leu

Asp

Val

Cys

Glu

Ala

Met

Glu

Tyr

290

295

300

Leu

Glu

Gly

Asn

Asn

Phe

Val

His

Arg

Asp

Leu

Ala

Ala

Arg

Asn

Val

305

310

315

320

Leu

Val

Ser

Glu

Asp

Asn

Val

Ala

Lys

Val

Ser

Asp

Phe

Gly

Leu

Thr

325

330

335

Lys

Glu

Ala

Ser

Ser

Thr

Gin

Asp

Thr

Gly

Lys

Leu

Pro

Val

Lys

Trp

340

345

350

Thr

Ala

Pro Glu Ala Leu Arg Glu

Lys

Lys

Phe

Ser Thr Lys 365

Ser

Asp

355

360

Val

Trp

Ser

Phe

Gly

íle

Leu

Leu

Trp

Glu

íle

Tyr

Ser

Phe

Gly

Arg

370

375

380

Val

Pro

Tyr

Pro

Arg

íle

Pro

Leu

Lys

Asp

Val

Val

Pro

Arg

Val

Glu

385

390

395

400

Lys

Gly

Tyr

Lys

Met

Asp

Ala

Pro

Asp

Gly

Cys

Pro

Pro

Ala

Val

Tyr

405

410

415

Glu

Val

Met:

Lys

Asn

Cys

Trp

His

Leu

Asp

Ala

Ala

Met

Arg

Pro

Ser

420

425

430

Phe

Leu

Gin

Leu

Arg

Glu

Gin

Leu

Glu

His

íle

Lys

Thr

His

Glu

Leu

435

440

445

His Leu

450 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Sequence:9E10-myc epitope tag <400>6

Val Asp Met Glu Gin Lys Leu íle Ala Glu Glu Asp Leu Asn

10

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (14)

1. Použitie Src proteínu alebo nukleovej kyseliny obsahujúcej nukleotidovú sekvenciu kódujúcu Src proteín na prípravu farmaceutickej kompozície na moduláciu angiogenézy v tkanive, ktoré je poškodené angiogénnym ochorením alebo stavom.

2. Použitie podľa nároku 1, v ktorom modulácia je potenciujúca angiogenézu a Src proteínom je aktívny Src protein.

3. Použitie podľa nároku 2, v ktorom aktívnym Src proteínom je SrcA.

4. Použitie podľa nároku 2, v ktorom ochorením alebo stavom je slabá cirkulácia.

5. Použitie podľa nároku 1, v ktorom modulácia je inhibujúca angiogenézu a Src proteínom je neaktívny Src protein.

6. Použite podľa nároku 5, v ktorom neaktívnym Src proteínom je Src251 alebo SrcK295M.

7. Použitie podľa nároku 5, v ktorom ochorením alebo stavom je artritída alebo reumatoidná artritída.

8. Použitie podľa nároku 7, v ktorom neaktívnym Src proteínom je Src251 alebo SrcK295M.

9. Použitie podľa nároku 5, v ktorom tkanivom je retinálne tkanivo a ochorením alebo stavom je retinopatia, diabetická retinopatia alebo makuláma degenerácia.

10. Použitie podľa nároku 9, v ktorom neaktívnym Src proteínom je Src251 alebo SrcK295M.

11. Použitie podľa nároku 5, v ktorom tkanivom je nádor alebo nádorová metastáza.

12. Použitie podľa nároku 11, v ktorom neaktívnym Src proteínom je Src251 alebo SrcK295M.

13. Použitie podľa nároku 1, v ktorom nukleová kyselina je včlenená do lipozómu.

14. Použitie podľa nároku 1, v ktorom nukleová kyselina je včlenená do retrovírusového vektora schopného exprimovať nukleotidovú sekvenciu.

10 výkresov

1 /10

SEKVENCIA c-DNA KURACIEHO C-Src (SEQ ID NO:2)

1 tctgacaccc atctgtctgt ctgtctgtgt gctgcaggag ctgagctgac tctgctgtgg

61 cctcgcgtac cactgtggcc aggcggtagc tgggacgtgc agcccaccac catggggagc

121 agcaagagca agcccaagga ccccagccag cgccggcgca gcctggagcc acccgacagc 181 acccaccacg ggggattccc agcctcgcag acccccaaca agacagcagc ccccgacacg 241 caccgcaccc ccagccgctc ctttgggacc gtggccaccg agcccaagct cttcgggggc 301 ttcaacactt ctgacaccgt tacgtcgccg cagcgtgccg gggcactggc tggcggcgtc 361 accactttcg tggctctcta cgactacgag tcccggactg aaacggactt gtccttcaag 421 aaaggagaac gcctgcagat tgtcaacaac acggaaggtg actggtggct ggctcattcc 481 ctcactacag gacagacggg ctacatcccc agtaactatg tcgcgccctc agactccatc 541 caggctgaag agtggtactt tgggaagatc actcgtcggg agtccgagcg gctgctgctc 601 aaccccgaaa acccccgggg aaccttcttg gtccgggaga gcgagacgac aaaaggtgcc 661 tattgcctct ccgtttctga ctttgacaac gccaaggggc tcaatgtgaa gcactacaag 721 atccgcaagc tggacagcgg cggcttctac atcacctcac gcacacagtt cagcagcctg 781 cagcagctgg tggcctacta ctccaaacat gctgatggct tgtgccaccg cctgaccaac 841 gtctgcccca cgtccaagcc ccagacccag ggactcgcca aggacgcgtg ggaaatcccc 901 cgggagtcgc tgcggctgga ggtgaagctg gggcagggct gctttggaga ggtctggatg 961 gggacctgga acggcaccac cagagtggcc ataaagactc tgaagcccgg caccatgtcc 1021 ccggaggcct tcctgcagga agcccaagtg atgaagaagc tccggcatga gaagctggtt 1081 cagctgtacg cagtggtgtc ggaagagccc atctacatcg tcactgagta catgagcaag 1141 gggagcctcc tggatttcct gaagggagag atgggcaagt acctgcggct gccacagctc 1201 gtcgatatgg ctgctcagat tgcatccggc atggcctatg tggagaggat gaactacgtg 1261 caccgagacc tgcgggcggc caacatcctg gtgggggaga acctggtgtg caaggtggct 1321 gactttgggc tggcacgcct catcgaggac aacgagtaca cagcacggca aggtgccaag 1381 ttccccatca agtggacagc ccccgaggca gccctctatg gccggttcac catcaagtcg 1441 gatgtctggt ccttcggcat cctgctgact gagctgacca ccaagggccg ggtgccatac 1501 ccagggatgg tcaacaggga ggtgctggac caggtggaga ggggctaccg catgccctgc 1561 ccgcccgagt gccccgagtc gctgcatgac ctcatgtgcc agtgctggcg gagggaccct 1621 gaggagcggc ccacttttga gtacctgcag gccttcctgg aggactactt cacctcgaca 1681 gagccccagt accagcctgg agagaaccta taggcctgga gctcctcctg gaccagaggc 1741 ctcgctgtgg ggtacaggg

OBR. 1

2/10

KÓDOVANÁ SEKVENCIA KURACIEHO c-Src PROTEÍNU (SEQ ID NO:3)

MGSSKSKPKDPSQRRRSLEPPDSTHHGGFPASQTPNKTAA PDTHRTPSRSFGTVATEPKLFGGFNTSDTVTSPQRAGALA GGVTTFVALYDYESRTETDLSFKKGERLQIVNNTEGDWWL AHSLTTGQTGYIPSNYVAPSDSIQAEEWYFGKITRRESER LLLNPENPRGTFLVRESETTKGAYCLSVSDFDNAKGLNVK HYKIRKLDSGGFYITSRTQFSSLQQLVAYYSKHADGLCHR LTNVCPTSKPQTQGLAKDAWEIPRESLRLEVKLGQGCFGE VWMGTÁVNGTTRVAIKTLKPGTMSPEAFLQEAQVMKKLRHE KLVQLYAWSEEPIYTVTEYMSKGSLLDFLKGEMGKYLRL PQLVDMAAQIASGMAYVERMNYVHRDLRAANILVGENL VCKVADFGLARLIEDNEYTARQGAKFPIKWTAPEAALYGR FnKSDVWSFGILLTELTTKGRVPYPGMVNREVLDQVERG YRMPCPPEGPESLHDLMCQCWRRDPEERPTFEYLQAFLE DYFTSTEPQYQPGENL

OBR. 2

3/10

SEKVENCIA c-DNA ĽUDSKÉHO c-Src (SEQ ID NO:4)

1 gcgccgcgtc ccgcaggccg tgatgccgcc cgcgcggagg tggcccggac cgcagtgccc 61 caagagagct ctaatggtac caagtgacag gttggcttta ctgtgactcg gggacgccag 121 agctcctgag aagatgtcag caatacaggc cgcctggcca tccggtacag aatgtattgc 181 caagtacaac ttccacggca ctgccgagca ggacctgccc ttctgcaaag gagacgtgct 241 caccattgtg gccgtcacca aggaccccaa ctggtacaaa gccaaaaaca aggtgggccg 301 tgagggcatc atcccagcca actacgtcca gaagcgggag ggcgtgaagg cgggtaccaa 361 actcagcctc atgccttggt tccacggcaa gatcacacgg gagcaggctg agcggcttct 421 gtacccgccg gagacaggcc tgttcctggt gcgggagagc accaactacc ccggagacta 481 cacgctgtgc gtgagctgcg acggcaaggt ggagcactac cgcatcatgt accatgccag 541 caagctcagc atcgacgagg aggtgtactt tgagaacctc atgcagctgg tggagcacta 601 cacctcagac gcagatggac tctgtacgcg cctcattaaa ccaaaggtca tggagggcac 661 agtggcggcc caggatgagt tctaccgcag cggctgggcc ctgaacatga aggagctgaa 721 gctgctgcag accatcggga agggggagtt cggagacgtg atgctgggcg attaccgagg 781 gaacaaagtc gccgtcaagt gcattaagaa cgacgccact gcccaggcct tcctggctga 841 agcctcagtc atgacgcaac tgcggcatag caacctggtg cagctcctgg gcgtgatcgt 901 ggaggagaag ggcgggctct acatcgtcac tgagtacatg gccaagggga gccttgtgga 961 ctacctgcgg tctaggggtc ggtcagtgct gggcggagac tgtctcctca agttctcgct 1021 agatgtctgc gaggccatgg aatacctgga gggcaacaat ttcgtgcatc gagacctggc 1081 tgcccgcaat gtgctggtgt ctgaggacaa cgtggccaag gtcagcgact ttggtctcac 1141 caaggaggcg tccagcaccc aggacacggg caagctgcca gtcaagtgga cagcccctga 1201 ggccctgaga gagaagaaat tctccactaa gtctgacgtg tggagtttcg gaatccttct 1261 ctgggaaatc tactcctttg ggcgagtgcc ttatccaaga attcccctga aggacgtcgt 1321 ccctcgggtg gagaagggct acaagatgga tgcccccgac ggctgcccgc ccgcagtcta 1381 tgaagtcatg aagaactgct ggcacctgga cgccgccatg cggccctcct tcctacagct 1441 ccgagagcag cttgagcaca tcaaaaccca cgagctgcac ctgtgacggc tggcctccgc 1501 ctgggtcatg ggcctgtggg gactgaacct ggaagatcat ggacctggtg cccctgctca 1561 ctgggcccga gcctgaactg agccccagcg ggctggcggg cctttttcct gcgtcccagc 1621 ctgcacccct ccggccccgt ctctcttgga cccacctgtg gggcctgggg agcccactga 1681 ggggccaggg aggaaggagg ccacggagcg ggaggcagcg ccccaccacg tcgggcttcc 1741 ctggcctccc gccäctcgcc ttcttagagt tttattcctt tccttttttg agattttttt 1801 tccgtgtgtt tattttttat tatttttcaa gataaggaga aagaaagtac ccagcaaatg 1861 ggcattttac aagaagtacg aatcttattt ttcctgtcct gcccgtgagg gtggggggga 1921 ccgggcccct ctctagggac ccctegcccc agcctcattc cccattctgt gtcccatgtc 1981 ccgtgtctcc tcggtcgcčc cgtgtttgcg cttgaccatg ttgcactgtt tgcatgcgcc 2041 cgaggcagac gtctgtcagg ggcttggatt tcgtgtgccg ctgccacccg cccacccgcc 2101 ttgtgagatg gaattgtaat aaaccacgcc atgaggacac cgccgcccgc ctcggcgctt 2161 cctccaccga aaaaaaaaaa aaaaaaa

OBR. 3

4/10

KÓDOVANÁ SEKVENCIA Í.UDSKÉHO c-Src PROTEÍNU (SEQ ID NO:5) MSAIQAAWPSGTECIAKYNFHGTAEQDLPFCKGDVLTIVAVTKD PNWYKAKNKVGREGIIPANYVQKREGVKAGTKLSLMPWFHGKIT REQAERLLYPPETGLFLVRESTNYPGDYTLCVSCDGKVEHYRIMY HASKLSIDEEVYFENLMQLVEHYTSDADGLCTRLIKPKVMEGTVA AQDEFYRSGWALNMKELKLLQTIGKGEFGDVMLGDYRGNKVAV KCIKNDATAQAFLAEASVMTQLRHSNLVQLLGVIVEEKGGLYrVTE YMAKGSLVDYLRSRGRSVLGGDCLLKFSLDVCEAMEYLEGNNFVH RDLAARNVLVSEDNVAKVSDFGLTKEASSTQDTGKLPVKWTAPEAL REKKFSTKSDVWSFGILLWEIYSFGRVPYPRIPLKDWPRVEKGYKM DAPDGCPPAVYEVMKNCWHLDAAMRPSFLQLREQLEHIKTHELHL