JP2000502570A

JP2000502570A - Ｆｈｉｔタンパク質および核酸ならびにそれに基づく方法

Info

Publication number: JP2000502570A
Application number: JP9528665A
Authority: JP
Inventors: クロース，カルロ，エム．; ヒューブナー，フランシス，ケイ．
Original assignee: トーマスジェファーソンユニバーシティー
Priority date: 1996-02-09
Filing date: 1997-02-07
Publication date: 2000-03-07
Also published as: ATE327326T1; US6774217B1; US20050074797A1; EP1795203A3; DE69735939D1; US6242212B1; WO1997029119A1; DE69735939T2; AU2262197A; EP0892809B1; EP0892809A1; US7220834B2; US20040265316A1; US20070178105A1; EP0892809A4; EP1795203A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、FHIT遺伝子のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列、それらの誘導体および類似体、ならびに該タンパク質に対する抗体に関する。FHIT遺伝子配列は細胞の過増殖を伴う疾患（特に消化管の悪性疾患）において突然変異を起こしている。本発明はさらに、細胞の過増殖と関連した疾病状態を検出および治療するための診断薬および治療薬としてのFHIT遺伝子およびそれによりコードされるタンパク質の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 FHIT タンパク質および核酸ならびにそれに基づく方法本出願は、1996年２月９日付けの係属中の米国特許出願第08/598,873号（その全体を参考としてここに組み入れる）の一部継続出願である。本発明は、米国立がん研究所により授与された認可番号CA51083 、CA39860 、 CA21124 およびCA56336 のもとに政府の支援を得て一部行われたものである。米国政府は本発明に対していくらかの権利を有する。１．序文本発明は、腫瘍抑制FHIT遺伝子のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列、その誘導体および類似体ならびにそれに対する抗体に関する。本発明は、腫瘍の検出および治療のための診断薬および治療薬としての、FHIT遺伝子のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列、その誘導体および類似体ならびにそれに対する抗体の使用に関する。本発明はまた、Fhitタンパク質、その誘導体もしくは類似体、それに対する抗体、Fhitタンパク質をコードする核酸、その誘導体もしくは類似体、またはFHITアンチセンス核酸を含有する治療用組成物に関する。２．発明の背景腫瘍は依然として米国では最も重大な医療問題の一つであり、社会において相当の死亡および医療コストを占めている。ヒトでの腫瘍形成はオンコジーンの活性化と腫瘍抑制遺伝子の失活を伴う複雑なプロセスである(Bishop，1991，Cell6 4:235-248)。ヒトの腫瘍抑制遺伝子は腫瘍細胞で生じる遺伝子変化の研究を通して同定されてきた(Ponder，1990，Trends Genet．6:213-218; Weinberg，1991,S cience 254:1138-1146)。特定の染色体異常（例えば、染色体の転座、逆位および欠失）とあるタイプの悪性疾患の間には密接な関係があり、このことは、この種の異常が腫瘍プロセスにおいて原因的役割を果たし得ることを示している。染色体異常は遺伝子融合へ導き、これは骨髄系統に関係している腫瘍の大部分に観察されるようなキメラ・オンコタンパク質をもたらす。あるいはまた、染色体異常は造血細胞で活動している調節エレメントにプロトオンコジーンを並置させることでプロトオンコジーンの脱調節と結び付いており、これはリンパ球系統で起こる転座において観察される(Virgilioら，1993，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:9275-9279)。欠失は悪性疾患へと至らせる腫瘍抑制遺伝子の欠損を引き起こす。非ランダム染色体転座は大部分のヒト造血悪性疾患に特徴的であり(Haluskaら，1987，Ann．Rev．Genet．21:321-345)、また、一部の固形腫瘍に関係している可能性がある(Croce，1987，Cell 49:155-156)。Ｂ細胞およびＴ細胞では、染色体の転座および逆位は、多くの場合、免疫グロブリン（Ｉｇ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の遺伝子の正常な組換え過程での誤りの結果として起こる。こうした再編成(rearrangement)はＩｇまたはＴＣＲ遺伝子のエンハンサーエレメントをオンコジーンに並置させる。そうするとオンコジーンの発現が脱調節される。大部分のケースでは、リンパ様悪性疾患で観察される再編成は２つの異なる染色体間で起こる。第14染色体のq32.1バンド上のTCL-1 遺伝子座は、しばしば、Ｔ前リンパ球性白血病(T-PLL)（Brito-Babapulle & Catovsky，1991，Cancer Genet．Cytogenet .55:1-9）、免疫不全症候群毛細管拡張性運動失調(AT)と関連した急性および慢性白血病(Russoら，1988，Cell 53:137-144; Russoら，1989，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 86:602-606)および成人Ｔ細胞白血病(Virgilioら，1993，Proc．Nat l.Acad．Sci．USA 90:9275-9279)を含めて、重症の胸腺後タイプのＴ細胞白血病およびリンパ腫において観察される、Ｔ細胞受容体遺伝子との染色体転座および逆位に関係している。 1979年に、ボストン在住のイタリア系アメリカ人の大家族は、初期に発症する両側性で多病巣性の明細胞腎臓癌(RCC)を有するこの家族において分離された、構成的な相互t(3;8)(p14.2;q24)染色体転座(Cohenら，1979，N．Engl．J．Med.3 01:592-595; Wang & Perkins，1984，Cancer Genet．Cytogenet．11:479-481)を遺伝していることが観察された。いくつかの家族性腫瘍の細胞遺伝学的追跡調査研究から、腫瘍は転座3p14-pter領域を担う派生第８染色体を欠失していることが実証され、したがって、腫瘍は3p14.2切断の末端小粒側(telomeric)の全遺伝子座に対してホモ接合であった(Liら，1993，Annals of Internal Medicine11 8:106-111)。転座は腫瘍抑制遺伝子の発現に影響を及ぼすことが示唆され(Cohen ら，1979，N．Engl．J．Med．301:592-595)、そして数人の研究者らが候補抑制遺伝子を探し求めてきた。我々は、候補腫瘍抑制遺伝子としてプロテインチロシンホスファターゼガンマ遺伝子(PTPRG)を提案し(LaForgiaら，1991,Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 88:5036-5040)、大多数の明細胞 RCCが転座に隣接する0.5Mb 領域のヘテロ接合性の欠損を示すことを提起した(Lubinski ら，1994,Cancer Re s．54:3710-3713; Druck ら，1995，Cancer Res．55:5348-5355)が、我々は残りのPTPRG 遺伝子の異常を観察しなかった。3p14.2領域は鼻咽頭腫瘍を含めた多数の他のタイプの腫瘍の欠失中にも含まれている(Lo ら，1994，Int．J.Oncol．4: 1359-1364）。 t(3;8)転座の切断点がクローニングされ、この切断点の近傍に由来するプローブを用いて候補腫瘍抑制遺伝子の３kb転写物が検出された(Boldog ら，1993,Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 90:8509-8513)。この転写物に関する更なる詳細は、この主題に関してこのグループから発表された、3p14.2 3;8転座切断点に架かる約６MbのＤＮＡのＹＡＣコンティグ(contig)を報告する後続の刊行物にもかかわらず、報告されていない(Boldog ら，1994，Genes，Chromosomes & Cancer 11:2 16-221)。さらに、3p14.2には抑制遺伝子が存在せず、実際、t(3;8)転座は3p25 にある腫瘍抑制遺伝子 von Hippel-Lindau遺伝子を失うための作用機構であると提唱された(Gnarra ら，1994，Nature Genet．7:85-90)。染色体領域3p14.2中のもう一つの細胞遺伝学的ランドマークは、構成的アフィジコリン誘導性脆弱部位(fragile site)のうちで最も知られた FRA3Bであり、これはt(3;8)転座と細胞遺伝学的に区別できない(Glover ら，1988，Cancer Genet .Cytogenet．31:69-73)。脆弱部位［ヒトでは100 を超える脆弱部位が記載されている(Sutherland，1991，Genet．Anal．Tech．Appl．8:1616-166)]は、特殊な試薬または培養条件にさらしたとき、細胞遺伝学的に検出可能なギャップを出現するヒトゲノムの領域である。いくつかの、葉酸感受性で、遺伝性の、Ｘ連鎖性および常染色体脆弱部位は不安定なCCG またはCGG 反復配列に局在しており(Yu ら， 1991，Science 252:1179-1181; Kremer ら，1991，Science 252，1711-1714;Ver kerk ら，1991，Cell 65:905-914; Fu ら，1991，Cell 67:1047-1058)、これらのうちの一つ、11q23.3 にあるFRA11Bについては、CCG 反復配列が既知のプロトオンコジーンCBL2遺伝子の5'非翻訳領域内に存在する(Jonesら，1995，Nature37 6:145-149)。また、この脆弱部位FRA11Bはヤコブセン(11q-)症候群と関係があり、このことは脆弱部位とin vivo 染色体切断との直接的関連を示している(Jones ら，1994，Hum．Mol．Genet．3:2123-2130)。誘導された脆弱部位は染色体中のギャップまたは切断点に似ているので、しばしば脆弱部位は腫瘍における染色体再編成部位であり得ると考えられてきた(Yunis & Soreng，1984，Science226:11 99-1204)。さらに、以前に同定された脆弱部位は過メチル化されることも示されており(Knight ら，1993，Cell 74:127-134)、したがって、腫瘍抑制遺伝子調節領域中の脆弱部位のメチル化は腫瘍抑制遺伝子の転写の低下を引き起こし、以前に指摘されたように(Jonesら，1995，Nature 376:145-149)、腫瘍形成過程で「ヒット」(hit)として作用する可能性がある。これらの著者はまた、腫瘍形成における脆弱部位発現の重要な寄与は、腫瘍形成中の染色体欠失の出現率を増加させることであり得ると提起した。 FRA3B 領域は、げっ歯類−ヒトハイブリッドを用いていくつかのグループの研究により詳述されている。ハムスターのバックグラウンドに対してヒトの第３染色体または第３およびＸ染色体を保持するハイブリッド細胞を、（Ｘ染色体を欠失しているハイブリッドを選択するため）アフィジコリンまたは６-チオグアニンで処理し、サブクローンを選択した。第３染色体の部分と領域3p14-p21に明らかな切断をもつサブクローンを特異的な3pマーカーの欠失または保持について同定し、3p14-21 切断位置を決定した(LaForgia ら，1991，Proc．Natl．Acad.Sci ．USA 88:5036-5040; LaForgia ら，1993，Cancer Res．53:3118-3124;Paradee ら，1995，Genomics 27:358-361)。小細胞肺癌(SCLC)および非小細胞肺癌(NSCLC)におけるオンコジーンおよび腫瘍抑制遺伝子の変異が記載されており、最も頻度の多い標的はp53 遺伝子の変異 (Takahashiら，1989，Science 246:491-494; Chibaら，1990，Oncogene 5:1603- 1610; Mitsudomi ら，1992，Oncogene 7:171-180)および網膜芽細胞腫遺伝子の変異(Harbourら，1988，Science 241:353-357; Xu ら，1994，J．Natl．CancerI nst．86:695-699)および第３染色体の短腕(3p)の対立遺伝子欠失(Kokら，1987,N ature 330:578-581; Naylorら，1987，Nature 329:451-454; Rabbittsら，1989, Genes Chrom．Cancer 1:95-105)である。細胞遺伝学的に可視的な欠失に加えて( Whang-Peng ら，1982，Science 215:181-182; Testaら，1994，Genes Chrom.Can cer 11:178-194)、3p上の遺伝子座でのヘテロ接合欠損(LOH)がSCLCのほぼ100％に(Kokら，1987，Nature 330:578-581; Naylorら，1987，Nature 329:451-454; Brauchら，1987，N．Engl．J．Med．317:1109-1113; Yokotaら，1987,Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 84:9252-9256)、そしてNSCLC の50％以上に報告されており( Brauch ら，1987，N．Engl．J．Med．317:1109-1113; Yokotaら，1987,Proc．Na tl．Acad．Sci．USA 84:9252-9256; Rabbitts ら，1990，Genes Chrom.Cancer 2 :231-238; Hibi ら，1992，Oncogene 7:445-449; Yokoyamaら，1992,Cancer Res ．52:873-877; Horio ら，1993，Cancer Res．53:1-4)、この染色体領域に少なくとも１つの腫瘍抑制遺伝子が存在することが強く示唆される。しかしながら、対立遺伝子欠損はしばしば3pの大部分を巻き込むという観察から、関与遺伝子の単離が妨げられてきた。3p25に位置するvon-Hippel Lindau 遺伝子のような候補遺伝子座が同定されているが、この遺伝子はその後肺癌細胞系ではめったに突然変異を起こさないことが見いだされた(Sekido ら，1994,Oncog ene 9:1599-1604)。3p21内の領域に位置する他の遺伝子座は、SCLCで頻発するホモ接合欠失の部位であることが報告された(Daly ら，1993，Oncogene 8:1721-17 29; Kok ら，1993，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:6071-6075; Kokら，1994， Cancer Res．54:4183-4187)。さらに、領域3p21.3-p21.2のサブ染色体断片の腫瘍細胞系への転移は腫瘍抑制活性を示唆している(Killaryら，1992，Proc.Natl ．Acad．Sci．USA 89:10877-10881; Daly ら，1993，Oncogene 8:1721-1729)。3 p12-14 領域でのより近位の欠失も報告されている(Rabbitts ら，1989,Genes Ch rom．Cancer 1:95-105; Rabbittsら，1990，Genes Chrom．Cancer 2:231-238; D aly ら，1991，Genomics 9:113-119)。肺癌は全世界的に上位の死亡原因となっており、全体的な生存率はここ２０年で顕著には改善されていない。一次予防により達成された成功にもかかわらず、肺癌は依然として圧倒的な医療・社会問題となっている。禁煙者のグループにおいてさえ、肺癌の発生率は蓄積された損傷の結果数年間は高いままであり、禁煙した個体の癌死亡率を低下させることを目的とした戦略の客観的な必要性が存在する。かかる癌の検出、治療および予防において診断薬および治療／予防薬として使用するための消化管の癌や他の癌と関連した遺伝子を単離して特徴づける、まだ実現されていない必要性が存在している。上記の文献の引用は、このような文献が本発明に対する先行技術であることを容認するものであると解釈されるべきでない。３．発明の概要本発明は、FHIT遺伝子のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるFHIT タンパク質のアミノ酸配列、その誘導体（例えば、断片）および類似体、ならびにそれに対する抗体に関する。本発明はさらに、前記のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるまたは相補的な核酸、ならびにFHITタンパク質をコードする均等な核酸配列に関する。特定の態様において、FHIT遺伝子およびタンパク質はヒトの遺伝子およびタンパク質である。 FHIT遺伝子配列の突然変異（特に、欠失）は食道、胃、結腸、腎臓および他の癌と関連がある。本発明はまた、FHITタンパク質、その誘導体または類似体をコードする発現ベクター、ならびにFHITタンパク質、その誘導体または類似体をコードする発現ベクターを含有する宿主細胞に関する。本明細書中で用いる「FHIT」はFHIT遺伝子に関して用いられ、一方、「Fhit」はFHIT遺伝子のタンパク質産物に関して用いられる。本発明はさらに、癌もしくは前癌状態または過増殖性疾患、特に染色体または分子の異常（中でも、3p14.2の位置での異常）および／またはFhitタンパク質の発現レベルの低下または該タンパク質の機能不全形態の発現と関連した疾患、の検出に有用な診断薬としての、またはかかる診断薬の製造におけるFHIT遺伝子のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるFhitタンパク質のアミノ酸配列の使用に関する。本発明はさらに、癌、特に3p14.2での染色体または分子の異常および／またはFhitタンパク質の発現レベルの低下または該タンパク質の機能不全形態の発現と関連した癌、の治療／予防における治療／予防薬としてのFHIT遺伝子のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるFhitタンパク質のアミノ酸配列の使用に関する。本発明はまた、機能的に活性な、すなわち、全長（野生型）Fhitタンパク質と関係のある既知の機能活性を１以上示すことができる、本発明のFhit誘導体および類似体に関する。このような機能活性としては、抗原性［抗Fhit抗体と結合する（または、かかる結合に関してFhitと競合する）能力］、免疫原性（Fhitと結合する抗体を生成する能力）、およびFhitの受容体／リガンドまたは基質と結合するか（または、かかる結合に関してFhitと競合する）能力、およびFhitと多量体化する能力が挙げられるが、これらに限らない。本発明はさらに、Fhitタンパク質の１以上のドメイン(例：ヒスタジン三連構造(triad))を含み、かつ／またはFhitタンパク質の抗原性を保持する（すなわち、抗Fhit抗体により結合され得る）Fhitタンパク質の断片（およびその誘導体ならびに類似体）に関する。本明細書中で開示するFHIT遺伝子およびタンパク質配列、ならびに該タンパク質配列に対する抗体は、3p14.2での染色体または分子異常および／またはFhitタンパク質レベルもしくは活性の低下と関連した癌（例えば消化管や気道の腫瘍）を、患者サンプル由来のFHIT野生型ｍＲＮＡの減少を検出または測定することにより、または患者サンプル由来のFhitタンパク質のレベルもしくは活性の低下を検出または測定することにより、または異常なFhitＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくはタンパク質を検出することにより診断するアッセイにおいて使用することができる。本明細書中で開示するFhitタンパク質またはその誘導体もしくは類似体は、患者サンプル中のFhitタンパク質を検出または測定するためにイムノアッセイで診断上用いられる抗Fhit抗体の産生のために使用することができる。抗Fhit抗体は例えば生検細胞および組織中のFhitタンパク質を検出または測定する目的で診断上用いられる。本発明はさらに、Fhitタンパク質、その誘導体もしくは類似体、それに対する抗体、またはFhitタンパク質、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸、またはFHITアンチセンス核酸を含有する治療用組成物に関する。本発明はさらに、Fhitタンパク質または核酸に基づいた治療および診断方法ならびに組成物に関する。本発明の治療用化合物としては、Fhitタンパク質、その誘導体（断片を含む）もしくは類似体；それに対する抗体；Fhitタンパク質、誘導体もしくは類似体をコードする核酸、またはFHITアンチセンス核酸が含まれるが、これらに限らない。本発明は、Fhit活性を促進する化合物（例えば、Fhit、Fhitのアゴニスト、Fh itをコードする核酸）を投与することによる過増殖性疾患（例えば、癌および高増殖性疾患）の予防または治療方法を提供する。本発明はまた、FHIT変異型核酸またはタンパク質を特異的に中和する化合物（例えば、該変異型に特異的な抗体またはアンチセンス核酸）を投与することによる過増殖性疾患（ただし、該患者はドミナントネガティブFHIT突然変異に対して半接合性である）の予防および治療方法を提供する。モデル動物、疾患にかかりやすい素因の診断方法およびスクリーニング方法、ならびにFhitアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法も本発明により提供される。本発明はさらに、例えば組換え手段による、Fhitタンパク質、誘導体および類似体の産生方法に関する。第６節の実施例に記載される本発明の特定の態様では、ヒトFHIT配列が開示され、いろいろな癌において突然変異を起こしていることが示される。４．図面の説明図１Ａ−１Ｂ： 3p14.2 FRA3Bに対するFHIT遺伝子の構成および転座部位。正常な3p14.2領域のスキームをＡに示す。染色体領域（一定の比例に応じて描いたものではない）はSTS マーカーの位置（該遺伝子に対するD3S1234 の位置は知られてない）と共に最上部の線で表され、FRA3Bはハイブリッドc13 切断で表され、そしてt(3;8)転座切断点も示される。破線部分は腫瘍細胞系においてホモ接合欠失に関与した領域を表す。上記マーカーをマップするのに用いた３種のYAC クローンおよびコスミドコンティグが示されるが、コスミドコンティグを下に、そしてFHIT転写物中のエキソンの分布をコンティグの下に示す。黒色のボックスと点線入りのボックスはそれぞれコードエキソンと非コードエキソンを表す。星印は開始および停止コドンをもつエキソンを示す。１つのエキソン(E5)は規定されたホモ接合欠失領域内にある。エキソン１(E1)、２(E2)および３(E3)はt(3;8)転座切断の動原体側にあり、そしてエキソン４(E4)および６〜10(E6〜E10)はそれぞれ動原体側および末端小粒側のホモ接合欠失領域に隣接している。腫瘍細胞系からの異常な転写物のタイプの構成をＢに示す。ジグザグ領域は異常な転写物への新しい配列（通常は反復配列）の挿入を表す。CCL234および235 は結腸癌由来の細胞系であり、脆弱領域中のホモ接合欠失は検出されなかった。CCL234のＲＮＡでは、異常な大きさのFHIT転写物のみがRT-PCR増幅および配列決定により検出された。より短い転写物はエキソン３からエキソン５までのスプライシングにより生ずることがわかった。非コードエキソン４が欠失され、コード領域は無傷のまま残る。鋳型としてCCL235のＲＮＡを用いると、明らかに正常なRT-PCR産物と異常なRT-PCR産物が増幅され、異常な産物はエキソン４からエキソン８までのスプライシングから生じ、E4とE8の間に140 bpの反復インサート（同じ読み枠のMet コドンを与える）を有する。HeLa細胞（t(3;8)転座近くのＤＮＡの欠失または再編成を示す子宮頸癌由来の細胞系）由来のＲＮＡのRT-PCR増幅は正常および異常な大きさの産物を出現させ、最小の産物はエキソン４からエキソン９までのスプライシングから生ずる。KatoIII（D3S1481 遺伝子座およびエキソン５とエキソン６の間の約50 kbp領域を含む不連続な欠失をもつ胃癌由来の細胞系）由来のＲＮＡのRT-PCR増幅は、エキソン４〜７を欠失している異常な大きさの産物のみをもたらした。エキソン３の下流に挿入された86bpの反復配列は同じ読み枠のMet コドンを与える。HT29［大きな欠失（約200kbp、648D4 YAC の大きさとほぼ同じ）があり、エキソン５を含む結腸癌由来の細胞系］は、エキソン３からエキソン７までのスプライシングから生じる異常な大きさの産物のみを与えた。肺癌（試験した３種のうちの１種）、骨肉腫(1/1)、NPC(3/3)、卵巣癌(2/2)および造血腫瘍(4/5)から誘導される多数の他の腫瘍由来細胞系は異常なFHIT転写産物を示した。欠失のない胃癌由来のRF48細胞系は正常な大きさの産物を示し、t( 3;8)転座があるリンパ芽球系、メラノーマ(WM1158)および腎臓癌(RC17)由来の細胞系も同様であった。欠失のある(AGS，LS180，LoVo)または欠失のない(Colo320 )他の結腸癌および胃癌由来の細胞系は、異常な逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)産物を示した（データは示してない）。図２Ａ−２Ｂ：正常および異常なFHIT ｃＤＮＡの構造。FHIT遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）をＡに示す。エキソンの位置は配列の上の矢で示し、ネステッドPCR およびRACE反応で用いたプライマーの位置は配列の下の矢で示す。消化管の非培養腫瘍組織で観察された異常な転写物のいくつかの模式図をＢに示す。表３にコード配列の欠失を示した転写物のみを示す。Ｂにおける最上部の線は無傷のFHIT ｃＤＮＡの地図を示す。太線と細線はそれぞれコード領域と非翻訳領域を示す。スプライス部位の位置はＡに示したヌクレオチド番号に従って下向きの矢印で示す。クラスＩ転写物はエキソン５を欠失しており、一方、クラスII転写物はエキソン５を保持しているが総じてエキソン８を失っている。星印をつけた転写物では、エキソン４の下流に種々の長さの挿入が観察された。E1〜10はエキソン１〜10を示す。図３Ａ−３Ｃ：正常組織および腫瘍でのFHIT遺伝子の発現。正常および腫瘍由来のFHIT-ｍＲＮＡのノーザンブロット（Ａ，Ｂ）およびRT-PCR分析（Ｃ）。パネルＡは、FHIT ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた、脾臓（レーン１）、胸腺（レーン２）、前立腺（レーン３）、精巣（レーン４）、卵巣（レーン５）、小腸（レーン６）、結腸（粘膜ライニング）（レーン７）、および末梢血白血球（レーン８）由来の正常ｍＲＮＡ（２μg/レーン）のノーザンブロットを示す。パネルＢは、FHIT ｃＤＮＡプローブ（パネルＢ、上）とハイブリダイズさせた、正常な小腸（レーン１）由来のｍＲＮＡ（２μg/レーン）および腫瘍由来の細胞系、すなわち、KatoIII（レーン２）、HK1（レーン３）、LoVo（レーン４）、CNE2（レーン５）、CNE1（レーン６）、Colo320（レーン７）、LS180（レーン８）由来のｍＲＮＡのノーザンブロットを示す。同一のブロットをβ-アクチンｃＤＮＡプローブ（パネルＢ、下）とハイブリダイズさせた。パネルＣは、同一患者（J4，9625，5586，E37，E32，E3）の一致した非培養腫瘍（Ｔ）および正常（Ｎ）組織に由来するｍＲＮＡ、または腫瘍組織のみ（J9，J7 ,J3，J1，E3）に由来するｍＲＮＡのネステッドRT-PCR増幅後に観察された増幅産物を示す。矢は異常なＤＮＡ配列をもつ増幅産物の位置を示す。対応する転写物のＤＮＡ配列の詳細を表２および図２Ｂに示す。腫瘍レーン中の白点は正常なＤＮＡ配列をもつ転写物の位置を示す。図４Ａ−４Ｂ：（Ａ）HITファミリーのタンパク質のアミノ酸配列とFHITｃＤＮＡの翻訳物とのアライメント。アライメントはBOXSHADEバージョン3.0 を用いて行った。黒色の陰影はその位置での２以上の同一の残基を示し、灰色の陰影は類似性を示す。PAPH1（配列番号３）（受託番号U32615）およびCAPH1（配列番号４）（受託番号U28374）はS．pombeおよびS．cerevisiaeのジアデノシン5',5' ''-P1,P4 テトラホスフェート非対称ヒドロラーゼ(aph1)を表す。PHIT（配列番号６）はシアノバクテリアSynechococcus Sp.（受託番号P32084）由来のHITファミリーメンバーを示し、BHIT（配列番号５）はB．Taurus（ウシ；受託番号P1643 6）由来のプロテインキナーゼＣ阻害剤を示し、MHIT（配列番号７）はM．hyorhi nis（マイコプラズマ；受託番号M37339）由来であり、YHIT（配列番号８）はS． cerevisiae（受託番号Q04344）由来である。Fhitタンパク質は109アミノ酸の長さにわたりS．pombe(PAPH1)遺伝子に対して69％の類似性を有する。（Ｂ）FHIT 遺伝子の異なる対立遺伝子を含む組換えプラスミドからのin vitro翻訳産物。すなわち、非コードエキソン４の欠失があるpFHIT1（レーン１）；エキソン４と５の間に72bpのインサートを含むpFHIT2（レーン２）；エキソン１を欠失している野生型FHITを含むpFHIT3（レーン３）；Bluescript中のpFHIT全長野生型遺伝子（レーン４）；対照反応、PTPRG 遺伝子の細胞外領域の一部を保持するpBCAHベクターからのin vitro翻訳物（推定分子量 40kDa）。図５： 3p14.2脆弱領域中の立証された染色体切断部に対するFHIT遺伝子の構造。１つのFHIT対立遺伝子をt(3;8)ファミリーのすべての転座キャリアーにおいて破壊する。エキソン１、２および３は派生第３染色体上に残存し、全コード領域を含むエキソン４〜10は上に示したように派生第８染色体に転座される。エキソン５のちょうど末端小粒側にde novo FRA3B切断をもつハイブリッド細胞系c13 はFHITコード領域の大部分を欠失している。KatoIII細胞は明らかに全部の FHITエキソンを保持するが、エキソン４〜７を欠く異常な転写物のみをコードし、したがってFhitタンパク質を産生できない。MB436およびHT29細胞はどちらも、脆弱領域の異なるセグメントの欠失によりエキソン５を失っている。図６：ＤＮＡおよびタンパク質分析用のWisconsin GCG ソフトウェアのPEPP LOT プログラムを用いてプロットした、Fhit推定タンパク質配列（配列番号２）の親水性プロット。図７： FHIT ｃＤＮＡ配列(cDNA 7F1)（配列番号１）およびR11128ヌクレオチド配列（配列番号77）とアライメントさせたR50713ヌクレオチド配列（配列番号９）のプリントアウト。FHITコード領域はヌクレオチド363 で開始し、ヌクレオチド812 で終わる。図８： R50713 EST配列の5'方向と3'方向での３つすべてのリーディングフレームでの翻訳。5'3'フレーム１：配列番号10〜15および76；5'3'フレーム２：配列番号16〜19；5'3'フレーム３：配列番号20〜25；3'5'フレーム１：配列番号26 〜31；3'5'フレーム２：配列番号32〜36;3'5'フレーム３：配列番号37〜40。図９： R11128 EST配列の5'方向と3'方向での３つすべてのリーディングフレームでの翻訳。5'3'フレーム１：配列番号41〜44および76；5'3'フレーム２：配列番号45〜48；5'3'フレーム３：配列番号49〜56；3'5'フレーム１：配列番号57 〜58；3'5'-フレーム２：配列番号59〜64；3'5'フレーム３：配列番号65〜68。図10Ａ−10Ｂ：（Ａ）酵母(S．pombe)Ap4A ヒドロラーゼ配列(U32615)とFHI T ｃＤＮＡ配列(cDNA 7F1)（配列番号１）とのアライメント。（Ｂ）U32615とcD NA 7F1の間の相同領域の検索の結果。図11Ａ−11Ｂ：小細胞肺癌(SCLC)におけるFHIT遺伝子の発現。（Ａ）SCLC腫瘍（Ｔ）および合致させた正常（Ｎ）組織におけるネステッドRT-PCR分析による FHIT遺伝子の発現。ケース 83Lは腫瘍 83Tから樹立された細胞系を示す。増幅産物の大きさを右側に示す。（Ｂ）SCLCの腫瘍組織で観察されたタイプＩおよびII の異常な転写物の模式図。最上部の線は無傷のFHIT ｃＤＮＡ配列を示す。太線と細線はそれぞれコード領域と非翻訳領域を示す。スプライス部位の位置はヌクレオチド番号に従って下向きの矢印で示す。タイプＩ転写物はエキソン４〜６を欠失しており、一方、タイプII転写物はエキソン４〜８を欠失している。図12Ａ−12Ｂ：小細胞肺癌におけるFHIT遺伝子の発現およびFHIT転写物の配列。（Ａ）ケース45の腫瘍（Ｔ）および正常（Ｎ）組織由来のｍＲＮＡ、およびケース83の腫瘍（Ｔ）、正常（Ｎ）および細胞系（Ｌ）サンプル由来のｍＲＮＡのネステッドRT-PCR後に観察されたFHIT増幅産物。矢印は増幅産物の大きさを示す。（Ｂ）SCLCで観察されたタイプＩおよびIIの異常な転写物の配列。矢印は野生型転写物(WT)中のエキソン３と４の間、タイプＩの異常な転写物中のエキソン３と７の間、およびタイプIIの異常な転写物中のエキソン３と９の間の接合部を示す。WT配列：配列番号78。タイプＩ配列：配列番号79。タイプII配列：配列番号80。図13Ａ−13Ｂ：非小細胞肺癌(NSCLC)におけるFHIT遺伝子の発現およびFHIT 転写物の配列。（Ａ）NSCLC腫瘍（Ｔ）および対応する正常（Ｎ）組織におけるネステッドRT-PCR分析によるFHIT遺伝子の発現。（Ｂ）NSCLCケース２、３および17で観察された異常な転写物の配列。矢印はケース２および17の野生型産物(2 WT，17WT)中のエキソン４から５の接合部、およびケース３の野生型産物(3WT)中のエキソン３から４の接合部を示す。2Aはケース２の異常な産物中のエキソン４と９の間の接合部を示し、3Aはケース３の異常な産物中のエキソン３と８の間の接合部を示し、そして17A はケース17の異常な産物中のエキソン４と８の間の接合部を示す。WT配列：配列番号81。3WT 配列：配列番号82。17WT配列：配列番号 83。2A配列：配列番号84。3A配列：配列番号85。17A配列：配列番号86。５．発明の詳細な説明本発明は、FHIT遺伝子のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるFhit タンパク質のアミノ酸配列、その誘導体および類似体、ならびにそれに対する抗体に関する。以下の実施例で述べるように、本発明者らは、食道、胃、結腸、腎臓および他の癌と関連があるヒトFHIT遺伝子を単離し特徴づけた。FHIT遺伝子機能の欠損へと至らせるFHIT遺伝子配列の突然変異は癌と関係している。本発明はさらに、染色体または分子の異常および／またはFHITの発現増加と関連した疾病状態（例えば、癌）を検出するためのアッセイにおける、またはかかる疾病状態の治療／予防における、FHIT遺伝子または関連ヌクレオチド配列、それによりコードされるタンパク質またはその誘導体もしくは類似体、またはそれに対する抗体の使用に関する。本発明はまた、Fhitタンパク質、その誘導体もしくは類似体、それに対する抗体、またはFhitタンパク質、その誘導体もしくは類似体をコードする核酸、またはFHITアンチセンス核酸を含有する治療用組成物に関する。 FHIT遺伝子配列はさまざまな種（脊椎動物、哺乳動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、げっ歯類およびヒトを含むが、これらに限らない）の１つに由来するもので、天然配列もしくは変異型であってよく、また、天然、合成、組換えのいずれの供給源から得られるものでもよい。ここに記載する特定の態様では、FHIT遺伝子配列はヒト配列である。Fhitタンパク質はさまざまな種（哺乳動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、げっ歯類およびヒトを含むが、これらに限らない）の１つに存在するもので、天然型もしくは変異型であってよく、また、天然、合成、組換えのいずれの供給源から得られるものでもよい。ここに記載する特定の態様では、Fhitタンパク質はヒトタンパク質である。本明細書中で定義されるFhit誘導体とは、図２Ａに示したFhit配列の断片またはアミノ酸変異体（例えば、挿入、置換および／または欠失誘導体）であり得、ただし、該断片またはアミノ酸変異体は全長Fhitタンパク質と関係した機能活性を１以上示すことができるものである。このような機能活性としては、抗原性（抗Fhit抗体と結合する能力）、免疫原性（Fhitタンパク質と結合できる抗体を生成する能力）、細胞増殖または腫瘍増殖を阻止する能力、Fhitの基質と結合するか（または、かかる結合に関してFhitと競合する）能力、Fhitと多量体化する能力、および、おそらく、Ap4Aまたは他のジアデノシンヒドロラーゼ活性が挙げられるが、これらに限らない。本発明は少なくとも10アミノ酸、または少なくとも 25アミノ酸、または少なくとも50アミノ酸、または少なくとも100アミノ酸からなるFhitタンパク質の断片を提供する。このような誘導体または類似体をコードする核酸も本発明の範囲内である。好ましいFhitタンパク質変異体は、FHITアミノ酸配列の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、または少なくとも147（全長）の連続アミノ酸にわたり、天然のFhitタンパク質に対して少なくとも70％のアミノ酸配列相同性を有するものであり、特に好ましい Fhitタンパク質は少なくとも80％のアミノ酸配列相同性を有するものであり、他の特に好ましいFhitタンパク質変異体は少なくとも90％のアミノ酸配列相同性を有するものである。本明細書中で用いるアミノ酸配列相同性とは、同一のアミノ酸残基をもつアミノ酸配列またはアミノ酸残基の保存的変化を含むアミノ酸配列のことである。他の態様において、FHIT相同タンパク質は前記長さのアミノ酸にわたり天然のFHITタンパク質と同一の配列を前記パーセントで含むものである。非ストリンジェント条件、適度のストリンジェント条件、またはストリンジェント条件のもとでFHIT遺伝子とハイブリダイズできる核酸によりコードされるタンパク質も提供される。本発明はまた、Fhitタンパク質もしくは核酸または抗Fhit抗体に基づいた治療および診断方法ならびに組成物に関する。本発明は、Fhit活性を促進する化合物（例えば、Fhitタンパク質およびその機能的に活性な類似体および誘導体（断片を含む）；Fhitタンパク質、類似体または誘導体をコードする核酸、Fhitのアゴニスト）を投与することによる過増殖性疾患（例えば、癌および高増殖性疾患）の治療または予防を提供する。本発明はさらに、Fhit変異型遺伝子またはタンパク質のドミナントネガティブ機能を特異的に中和するまたは抑制する化合物（例えば、該変異型に特異的な抗体またはFhitアンチセンス核酸）を患者（ただし、該患者はFhitドミナントネガティブ突然変異に対して半接合性である）に投与することによる過増殖性疾患の治療または予防方法を提供する。モデル動物、疾患にかかりやすい個体素因の診断方法およびスクリーニング方法も本発明により提供される。 5.1. FHIT コード配列 FHIT ｃＤＮＡ、ゲノム配列およびそれに相補的な配列は本発明により提供されるFHIT核酸である。特定の態様では、FHIT ｃＤＮＡ配列が提供され、かくしてイントロンを欠失している。それにハイブリダイズできる配列（好ましくはイントロンを欠くもの）も提供される。FHIT ＤＮＡまたはＲＮＡエキソン配列を含む核酸も提供される。各種の態様では、FHITエキソン配列の少なくとも15、25 または50の連続ヌクレオチドが核酸中に存在する。少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、または少なくとも350ヌクレオチドからなるFHIT ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸も本発明の範囲内に含まれる。各種の態様では、塩基（二本鎖であれば、bp）が2,000未満、500 未満、275 未満、200 未満、100 未満、または50未満である核酸が提供される。各種の態様において、核酸は300 kb、200 kb、100 kb、50kb、または10kb 未満である。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよい。特定の態様では、FHITコード配列の少なくとも15の連続ヌクレオチドを含むが、FHITイントロンの全部または一部を含まない、単離された核酸が提供される。特定の態様において、核酸は少なくとも１つのFHITコードエキソン（エキソン５，６，７，８または９）を含んでなる。別の態様では、核酸はエキソン５と６の間のFHITイントロンを実質的に欠失しているが、エキソン５と少なくとも１つの他のFHITコードエキソン（エキソン６、エキソン７、エキソン８およびエキソン９の中から選択される）をなおも含んでいる。さらに別の態様では、核酸はエキソン１、２、３、４および５の中から選択される少なくとも１つのFHITエキソンを含み、かつエキソン６、７、８、９および10の中から選択される少なくとも１つのFHITエキソンを含み、好ましくは大きさが10kb未満である。好ましい態様において、FHITエキソン配列はそれらがゲノム中に存在する順序で核酸中に存在し、これとは別の態様では、エキソン配列は同じ順序では存在しない。他の態様では、核酸は全部のFHITエキソン（エキソン１〜10）または全部のFHITコードエキソン（エキソン５〜９）を連続的な様式で含み、かくしてイントロンを欠失している。さらに他の特定の態様では、FHIT遺伝子エキソン配列を含む核酸はゲノムフランキング遺伝子（すなわち、ゲノム中のFHIT遺伝子の5'側または3'側）の配列を含まない。特定の態様では、 FHITゲノム配列（したがって、イントロンを含む）が提供される。さらに、本発明は、FHIT配列含有断片を増幅するプライマーとしてＰＣＲで使用するための一本鎖オリゴヌクレオチドを提供し、例えば、FHIT遺伝子のハイブリダイズ可能な部分（少なくとも約８ヌクレオチド）の配列をもつオリゴヌクレオチドと、FHIT遺伝子の同一鎖中の下流配列の逆相補配列をもつもう一つのオリゴヌクレオチド（かくして、各オリゴヌクレオチドプライマーは他方に向かう方向で合成する）を提供する。オリゴヌクレオチドは好ましくは長さが10〜35ヌクレオチドの範囲である。ヒトFHITの全長ｃＤＮＡ配列は図２Ａ（配列番号１）に示してあり、そのコード領域は図２Ａのヌクレオチド番号１〜441 にわたっている。図２ＡのFHIT ｃＤＮＡの配列分析から、147 個のアミノ酸からなるタンパク質（配列番号２）をコードしている441 個のヌクレオチドのオープンリーディングフレームが明らかにされた。本発明に従うと、FHIT遺伝子産物のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列はどれも、Fhitの発現を指令する組換え分子を作製するために使用することができる。FHITの検出または増幅においてプローブまたはプライマーとして有用な少なくとも８ヌクレオチド（すなわち、ハイブリダイズ可能な部分）からなる核酸は本発明の範囲内に含まれる。ここに記載する特定の態様では、本発明はヒトFHIT遺伝子の核酸配列に関する。本発明の好適な（しかし制限するものではない）実施形態では、ヒトFHITｃＤＮＡ配列はATCCに寄託されて受託番号69977を指定されたプラスミドp7F1中に存在するものである。このような配列は、例えば以下の第６節に記載するように、クローニングして塩基配列を決定することができる。本発明はまた、前記配列にハイブリダイズ可能な核酸配列、または前記配列に相補的な核酸配列、または均等な核酸配列がFhit機能活性を示すタンパク質産物をコードするという点で前記配列に均等な核酸配列に関する。 FHITの断片および誘導体をコードする核酸を以下でさらに説明する。本発明はまた、FHIT配列を含む上記核酸にハイブリダイズ可能なまたは相補的な核酸に関する。特定の実施形態では、FHIT遺伝子の少なくとも10、25、50、10 0 もしくは200 ヌクレオチドまたは全コード領域に相補的な配列を含む核酸が提供される。特定の態様では、低ストリンジェント条件下で、FHIT核酸またはFhit 誘導体をコードする核酸にハイブリダイズできる核酸が提供される。例を挙げると（制限ではない）、このような低ストリンジェント条件を用いる手順は次のとおりである（Shilo & Weinberg，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:67 89-6792 も参照のこと）。ＤＮＡを含むフィルターを、35% ホルムアミド、5XSS C、50mM Tris-HCl（pH7.5）、5mM EDTA、0.1% PVP、0.1% Ficoll 、1% BSAおよび500μtg/ml変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で40℃で６時間予備処理する。ハイブリダイゼーションを同じ溶液中で、ただし次のような変更を加えて行う。すなわち、0.02% PVP 、0.02% Ficoll、0.2% BSA、100μg/ml変性サケ精子ＤＮＡ、10%(w/v)デキストラン硫酸、および5-20×10⁶cpmの³²P-標識プローブを使用する。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中で40℃で18〜20時間インキュベートし、次に2X SSC、25mM Tris-HCl（pH7.4）、5mM EDTAおよび0.1%SDS を含む溶液中で55℃で1.5時間洗浄する。洗浄液を新しい洗浄液に取り替え、60 ℃でさらに1.5時間インキュベートする。フィルターにブロッティングし、乾燥し、オートラジオグラフィーのために露光する。必要ならば、65〜68℃でフィルターの３回目の洗浄を行い、フィルムに再露光する。使用できる他の低ストリンジェント条件は（例えば、種間ハイブリダイゼーションに使用されるように）当技術分野で公知である。別の特定の態様では、高ストリンジェント条件下でFHIT核酸にハイブリダイズできる核酸が提供される（下記参照）。好ましい実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、既知のFH IT配列を表すオリゴヌクレオチドプライマーによりライブラリー中のまたは組織源由来の所望の核酸配列を増幅する。このようなプライマーを用いると、ＲＮＡまたはＤＮＡ源（好ましくは、ｃＤＮＡライブラリー）から対象の配列を増幅することができる。ＰＣＲを行うには、例えば、Perkin-Elmer CetusサーマルサイクラーおよびTaq ポリメラーゼ(Gene Amp^TM)を用いる。増幅されるＤＮＡには真核生物種由来のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡが含まれる。ＰＣＲ反応で使用するために、いくつかの異なる縮重プライマーを合成することを選ぶことができる。また、クローン化されるFHIT遺伝子と既知のFHIT遺伝子の間のより高いまたはより低いヌクレオチド配列相同性を可能にするために、ＰＣＲ反応を開始するのに用いたハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えることが可能である。核酸のプライマー依存性増幅の他の手段も当業者に知られており、それらも使用可能である。 FHIT遺伝子のセグメント（例えば、既知FHIT遺伝子の対立遺伝子もしくは多型変異体または種相同体）をうまく増幅した後で、そのセグメントを分子クローニングし、配列を決定し、完全なｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離するためのプローブとして利用する。次いで、これは、以下に記載するような、その遺伝子の完全なヌクレオチド配列の決定、その発現の分析、および機能分析のためのそのタンパク質産物の産生を可能にするだろう。このようにして、Fhitタンパク質をコードする追加の遺伝子を同定することができる。あるいはまた、本発明のFH IT遺伝子は、ゲノムＤＮＡを用いて、エキソン・トラッピング・システムにより単離することもできる(Nehlsら，1994，Oncogene 9(8):2169-2175; Vernaら，19 93，Nucleic Acids Res．21(22):5198-5202; Auch ら，1990，Nucleic AcidsRes ．18(22):6743-6744)。おそらく、真核細胞はどれもFHIT遺伝子の分子クローニングのための核酸源として利用することができる。FHITをコードする核酸配列は例えばヒト、ブタ、ウシ、ネコ、トリ、ウマ、イヌ、げっ歯類および追加の霊長類源から単離しうる。ＤＮＡは、例えばクローン化ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から、当技術分野で公知の一般的手順により、化学合成により、ｃＤＮＡクローニングにより、または所望の細胞から精製されたゲノムＤＮＡまたはその断片のクローニングにより得られる。（例えば、Sambrookら，1989，Molecular Cloning，ALa boratory Manual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York; Glover，D.M．編，1985，DNA Cloning: A PracticalApproa ch，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K．Vol．I，II を参照のこと。）ゲノムＤＮＡから誘導されたクローンはコード領域に加えて調節およびイントロンＤＮＡ領域を含み、一方、ｃＤＮＡから誘導されたクローンはFHITエキソン配列のみを含むだろう。供給源がなんであれ、遺伝子はそれを増やすための適当なベクターに分子クローニングされる。特定の態様において、FHIT遺伝子配列を単離するための好適な核酸源は腎臓、胃または肺の細胞から得られる。ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングでは、ＤＮＡ断片を生成させるが、そのうちの幾つかは所望の遺伝子をコードするだろう。ＤＮＡは種々の制限酵素を使って特定の部位で切断する。あるいはまた、マンガンの存在下でDNAse を使ってＤＮＡを断片化したり、ＤＮＡを物理的に、例えば音波処理により、剪断することもできる。次に、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動およびカラムクロマトグラフィーを含むがこれらに限らない一般的方法により、線状ＤＮＡ断片を大きさに従って分離する。ＤＮＡ断片が生成されたら、所望の遺伝子を含む特定のＤＮＡ断片を多くの方法で同定することができる。例えば、本発明のFHIT遺伝子もしくはその特異的ＲＮＡ、またはプローブやプライマーのようなその断片を単離し、標識し、その後生成されたFHIT遺伝子を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用する(Benton，W．& Davis，R.，1977，Science 196:180; Grunstein，M.& Hogness，D.，1975，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 72:3961)。プローブに対して実質的な配列相同性を有するＤＮＡ断片が高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするだろう。本明細書中で用いる「高ストリンジェント条件」という語は、(1)洗浄のために低イオン強度および高温、例えば、0.015M NaCl/0.0015Mクエン酸ナトリウム/0.1% SDS を50℃で用いる、(2)ハイブリダイゼーションの間ホルムアミドのような変性剤を用いる、例えば、0.1%ウシ血清アルブミン/0.1% Ficoll/0.1% ポリビニルピロリドン/750mM NaCl，75mM クエン酸ナトリウムを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)と共に50%(v/v)ホルムアミドを42℃で用いる、または(3)50% ホルムアミド、5 x SSC（0.75M NaCl，0.075M ピロリン酸ナトリウム）、5 x Denhardt溶液、音波処理したサケ精子DNA(50g/ml)、0.1% SD Sおよび10% デキストラン硫酸を42℃で用い、0.2 x SSC および0.1% SDS中42℃ で洗浄する、というハイブリダイゼーション条件を意味する。また、適切な断片は、制限酵素消化および断片の大きさと既知の制限地図により予想された大きさとの比較により同定することも可能である。遺伝子の性質に基づいて更なる選択を行うこともできる。あるいはまた、遺伝子の存在はその発現産物の物理的、化学的または免疫学的性質に基づくアッセイにより検出することができる。例えば、電気泳動移動度、等電点電気泳動挙動、タンパク質分解消化地図、結合活性または抗原性の性質がFHITについて知られている性質と類似しているかまたは同一であるタンパク質を産生するｃＤＮＡクローン、またはゲノムＤＮＡクローン（適切なｍＲＮＡをハイブリッド選択する）を選択することができる。あるいはまた、FHITタンパク質は、例えばELISA(酵素結合イムノソルベントアッセイ)型の手法により、推定上のFHIT発現クローンと標識抗体との結合により同定することもできる。 FHIT遺伝子はまた、核酸ハイブリダイゼーションによるｍＲＮＡ選択と、これに続くin vitro翻訳により同定することもできる。この手法では、断片を用いるハイブリダイゼーションにより相補的ｍＲＮＡを単離する。このようなＤＮＡ断片は他のFHIT遺伝子の入手可能な精製FHIT ＤＮＡでありうる。単離されたｍＲＮＡのin vitro翻訳産物の免疫沈降分析または機能的アッセイにより、ｍＲＮＡ、それゆえ、所望の配列を含む相補的ＤＮＡ断片が同定される。さらに、特定のｍＲＮＡは細胞から単離されたポリソームをFHITタンパク質に対する固定化抗体に吸着させることで選択することができる。選択したｍＲＮＡ（吸着したポリソームから）を鋳型として用いて放射標識FHIT ｃＤＮＡを合成し得る。その後、放射標識したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡをプローブとして用いて、他のゲノムＤＮＡ断片の中からFHIT ＤＮＡ断片を同定する。 FHITゲノムＤＮＡを単離するための別法には、既知配列から遺伝子配列自体を化学合成すること、またはｃＤＮＡをFHITタンパク質をコードするｍＲＮＡにすることが含まれるが、これらに限らない。例えば、FHIT遺伝子のｃＤＮＡクローニングに有用なＲＮＡは、FHITを発現する細胞、例えば腎臓、胃または肺の細胞から単離することができる。その他の方法も当業者に知られており、それらも本発明の範囲内である。同定し単離した遺伝子は次に、適当なクローニングベクターに挿入される。当技術分野で公知の多数のベクター-宿主系を使用できる。可能なベクターにはプラスミドや修飾ウイルスが含まれるが、ベクター系は用いる宿主細胞と適合するものでなければならない。このようなベクターとして、ラムダ誘導体のようなバクテリオファージ、またはpBR322またはpUC プラスミド誘導体またはBluescript ベクター(Stratagene)のようなプラスミドが挙げられるが、これらに限らない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的接着末端をもつクローニングベクターにＤＮＡ断片を連結することで達成される。しかし、ＤＮＡの断片化に用いた相補的制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合は、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に修飾することができる。あるいはまた、ＤＮＡ末端にヌクレオチド配列（リンカー）を連結して所望の部位を生成させてもよい。これらの連結リンカーは制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学合成オリゴヌクレオチドを含む。別法として、開裂したベクターとFHIT遺伝子をホモポリマーテーリングにより修飾してもよい。組換え分子は、多コピー数の遺伝子配列が生成されるように、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションまたは当業者に公知の他の方法により宿主細胞に導入することができる。別法として、所望の遺伝子を同定し、「ショットガン」法で適当なクローニングベクターに挿入した後単離することができる。所望の遺伝子の富化（例えば、大きさに基づく分画化による）をクローニングベクターへの挿入前に行ってもよい。特定の実施形態において、単離されたFHIT遺伝子、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ配列を組み込む組換えＤＮＡ分子による宿主細胞の形質転換は、遺伝子の多コピー数を生成させる。かくして、形質転換体を増殖させ、該形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、必要に応じて、単離した組換えＤＮＡから挿入遺伝子を回収することにより遺伝子を大量に得ることができる。 FHITコードまたは非コード配列の一部を含むオリゴヌクレオチド、またはFHIT タンパク質の一部をコードするオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲで用いるプライマー）は、当技術分野で公知の一般的方法により合成することができる。このようなオリゴヌクレオチドは８〜25ヌクレオチドの範囲の大きさであることが好ましい。特定の実施形態では、このようなオリゴヌクレオチドは15〜25ヌクレオチドまたは15〜35ヌクレオチドの範囲の大きさである。本発明により提供されるFHIT配列は、天然Fhitタンパク質と実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、および機能的に同等のアミノ酸を有するそれらのコード化アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、ならびにFhit 誘導体および類似体に関して以下で説明するような、他のFhit誘導体または類似体をコードするヌクレオチド配列を含むものである。５．２．FHIT 遺伝子の発現本発明にしたがって、FHIT タンパク質の発現を目的とする組換えＤＮＡ分子産生のため、適切な発現ベクター、すなわち挿入されるタンパク質をコードする配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクター中に、FHIT タンパク質、誘導体、例えばフラグメント、またはそれらの類似体をコードするヌクレオチド配列を挿入することができる。こうしたFHIT ポリヌクレオチド配列は、他のポリヌクレオチドまたはそれらの補体と同様に、核酸ハイブリダイズアッセイ、サザンおよびノーザンブロット分析その他においても使用することができる。特定の態様において、ヒト FHIT 遺伝子、またはヒト FHIT 遺伝子の機能的に活性な部分をコードする配列が発現される。また別の態様において、ヒト FHIT 遺伝子の誘導体またはフラグメントが発現される。遺伝子コードの固有の縮重のため、実質的に同一のまたは機能的に等価な FHI T アミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列は本発明の範囲内である。こうしたＤＮＡ配列として、ストリンジェント条件下でヒト FHIT 配列とハイブリダイズしうるものが含まれる。本発明にしたがって使用することができる変更されたＤＮＡ配列として、結果的に同一のまたは機能的に等価な遺伝子産物をコードする配列である、別々のヌクレオチド残基の欠失、付加または置換が含まれる。遺伝子産物自身が機能的に等価な FHIT タンパク質を生産するサイレントな変化になるような、FHIT 配列中のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含んでいてもよい。こうしたアミノ酸の置換は関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒的性質の類似性に基づいて実施することができる。例えば、負荷電アミノ酸としてアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正荷電アミノ酸としてリジンおよびアルギニンが含まれ、類似の親水性値を有する非荷電極性末端基(hea d group)を有するアミノ酸として、ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；フェニルアラニン、チロシンが含まれる。 FHIT コード配列の末端を種々変更するために、本発明のＤＮＡ配列を遺伝子操作することができる。これらとして、限定するわけではないが、遺伝子産物のプロセシングおよび発現を修飾する変更が含まれる。例えば、新規な制限部位を挿入するための、部位特異的突然変異誘発など、当業界で周知の手法を使用して、突然変異を導入すること、その他である。本発明の別の態様において、FHIT 遺伝子配列またはそれらの誘導体を非 FHIT 配列に連結して、キメラ融合タンパク質をコードさせる。FHIT タンパク質を非F HIT 部分(moiety)から切断することができるようにするため、FHIT 配列と非 FH IT タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように、融合タンパク質をもまた遺伝子操作することができる。特定の態様において、融合タンパク質中に存在する FHIT アミノ酸配列は FHIT タンパク質配列の隣接アミノ酸10以上、隣接アミノ酸25以上、隣接アミノ酸50以上、隣接アミノ酸75以上、隣接アミノ酸10 0以上、またはアミノ酸147 （全長）以上で構成される。本発明のある別の態様において、当業界で周知の化学的方法を使用して、FHI Ｔコード配列を全部または部分的に合成する。例えば、Caruthers ら、1980,Nuc .Acids Res.Symp.Ser.7:215-233；Crea and Horn,1980,Nuc.Acids Res.9(10):23 31;Matteucci and Caruthers,1980,Tetrahedron Letters 21:719；およびChow a nd Kempe,1981,Nuc.Acids Res.9(12):2807-2817 を参照されたい。あるいは、FH IT アミノ酸配列の全部または一部を合成するため、化学的方法を使用してタンパク質自体を製造することもできる。例えば、ペプチドを固相技術によって合成し、樹脂から切断し、調製用高性能液体クロマトグラフィーによって精製することができる（例えば、Creighton,1983,Proteins Structures And Molecular Pri nciples,W.H.Freeman and Co.,N.Ypp.50-60参照）。合成されたペプチドの組成をアミノ酸分析または配列決定によって確認することができる（例えば、Edman 分解法；Creighton,1983,Proteins Structures And Molecular Principles,W.H. Freeman and Co.,N.Ypp.34-49参照）。生物学的に活性な FHIT タンパク質またはその誘導体を発現させるため、適切な発現ベクター、すなわち挿入されるコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクター中に、FHIT タンパク質またはその誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を挿入する。FHIT 遺伝子産物および組換え FHIT 発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞または細胞系は各種の目的のために使用することができる。これらの中に、限定するわけではないが、FHIT タンパク質に免疫特異的に結合する抗体（すなわち、モノクローナルまたはポリクローナル）を産生させるものが含まれる。被験者サンプル中の FHIT タンパク質の検出またはレベルの測定において、抗 FHIT 抗体を使用することができる。５．２．１．発現系 FHIT コード配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために、当業者に周知の方法を使用することができる。これらの方法として、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術およびin vivo 組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Sambrookら、1989,Molecular Cloning,A Laborator yManual 2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Yおよび Ausubel ら、1989, Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and W iley Interscience,N.Y.を参照されたい。 FHIT コード配列を発現させるため、各種の宿主−発現ベクター系を利用することができる。これらとして、限定するわけではないが、FHIT コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；FHIT コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；などの微生物、FHIT コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；FHITコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）を感染させるかまたは組換えプラスミド発現ベクター（例えばTiプラスミド）で形質転換させた植物細胞系；または動物細胞系が含まれる。これらの系の発現要素はその強度および特異性が異なっている。利用する宿主／ベクター系に応じて、構成的および誘導性プロモーターを含む多数の好適な転写および翻訳要素のいずれをも発現ベクター中で使用することができる。例えば、細菌系中でクローン化する場合、バクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）などの誘導性プロモーターを使用することができる；昆虫系中でクローン化する場合、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターを使用することができる；植物細胞系中でクローン化する場合、植物細胞のゲノムから誘導されるプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター；RUBISCO の小サブユニットのためのプロモーター；クロロフィルa/b結合タンパク質のためのプロモーター）または植物ウイルスからのプロモーター（例えば、CaMＶの 35SＲＮＡプロモーター；TMVのコートタンパク質プロモーター）を使用することができる；哺乳動物細胞系中でクローン化する場合、哺乳動物細胞のゲノムから誘導されるプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスからのプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス 7.5 Ｋプロモーター）を使用することができる；FHITＤＮＡの多数のコピーを含有する細胞系を産生させる場合、適切な選別可能なマーカーを有するSV40-、BPV-およびEBV-に基づくベクターを使用することができる。細菌系においては、発現される FHIT タンパク質の使用目的に応じて、好都合な多数の発現ベクターを選択することができる。例えば、抗体の産生のために大量の FHIT タンパク質を製造しようとする場合、そのまま精製することができる高レベルの融合タンパク質産物の発現を導くベクターが望ましい。こうしたベクターとして限定するわけではないが、E.coli発現ベクターpUR278（Rutherら、19 83,EMBO J.2:1791）（このベクターでは、ハイブリッドAS-lac Ｚタンパク質が産生されるように、ベクターのlac Ｚをコードする領域を有するフレーム内に FHIT コード配列を連結することができる）；PINベクター類（Inouye ＆ Inouye ,1985,Nucleic acids Res.13:3101-3109；Van Heeke ＆ Schuster,1989,J.Biol. Chem.264:5503-5509）；などが含まれる。pGEXベクターもまたグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）を有する融合タンパク質として外来のポリペプチドを発現させるのに使用することができる（Smith and Johnson,1988,Gene 7:31-40 ）。一般に、これらの融合タンパク質は可溶性で、溶解細胞からグルタチオン− アガロースビーズに吸着させた後、遊離グルタチオンの存在下で溶離させることによって、容易に精製することができる。pGEXベクターは、目的のクローン化ポリペプチドが GST 部分分子から放出されるために、トロンビンまたは因子 Xa プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。酵母においては、構成的または誘導性プロモーターを含有する多数のベクターを使用することができる。総説として、以下の文献を参照されたい：Current Pr otocols in Molecular Biology,Vol.2,1988,Ed.Ausubel ら、Greene Publish.As soc.＆ Wiley Interscience,Ch.13；Grant ら、1987,Expression and Secretion Vectors for Yeast,in Methods in Enzymology,Ed.Wu ＆ Grossman,1987,Acad. Press,N.Y.153:516-544;Glover,1986,DNA Cloning,Vol.II,IRL Press,Wash.,D.C .,Ch.3；およびBitter,1987,Heterologous Gene Expression in Yeast,Methods in Enzymology,Eds.Berger ＆ Kimmel,Acad.Press,N.Y.152:673-684; および Th e Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces,1982,Eds.Strathern ら、Co ld Spring Harbor Press,Vols.I and II。植物発現ベクターを使用する場合、多数のプロモーターのいずれによっても、 FHIT コード配列の発現を行なわせることができる。例えば、CaMV の 35SＲＮＡおよび 19SＲＮＡプロモーター（Brissonら、1984,Nature 310:511-514）、または TMV のコートタンパク質プロモーター（Takamatsuら、1987,EMBO J.6:307-31 1）を使用することができる；あるいは、RUBISCO の小サブユニット（Coruzzi ら、1984,EMBO J.3:1671-1680；Broglieら、1984,Science 224:838-843）；または例えば大豆hsp17.5-Eまたはhsp17.3-Bなどの熱ショックプロモーター（Gurley ら、1986,Mol.Cell.Biol.6:559-565）のような植物プロモーターを使用することができる。Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションその他を使用して、これらの構築物を植物細胞中に導入することができる。こうした技術の総説として、例えば、Weissbach ＆ Weissbach,1988,Methods for Plant Molecular Bi ology,Academic Press,NY,Section VIII,pp.421-463；およびGrierson ＆ Corey ,1988,Plant Molecular Biology,2d Ed.,Blackie,London,Ch.7-9、を参照されたい。 FHIT 遺伝子を発現させるために使用することができる別の発現系として昆虫系がある。こうした系の１つにおいて、外来遺伝子を発現させるベクターとして、Autographa californica核多角体ウイルス（AcNPV）を使用する。このウイルスは Spodoptera frugiperda細胞中で増殖する。FHIT コード配列をこのウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）中にクローン化し、AcNPV プロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置く。FHIT コード配列の挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子が不活性化され、非閉鎖性(non-occlu de d)組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされるタンパク質コートを欠失したウイルス）が生成する。次に、これらの組換えウイルスを使用して、Spodoptera frugiperda 細胞に感染させると、この細胞中で挿入遺伝子が発現する（例えば、Smith ら、1983,J.Virol.46:584；Smith,米国特許第 4, 215,051号参照）。哺乳動物宿主細胞においては、多数のウイルスに基づく発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスの１つを使用する場合、FHIT コード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三部分(tripartite)リーダー配列、に連結することができる。次に、このキメラ遺伝子を in vitro または in vivo 組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入する。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域 E1 または E3 ）に挿入された結果、感染宿主中で生存して FHIT を発現することができる組換えウイルスが生成する（例えば、Logan ＆ Shenk,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3655 -3659、参照）。あるいは、ワクシニア 7.5 Ｋプロモーターを使用してもよい（例えば、Mackett ら、1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:7415-7419；Mackett ら、1984,J.Virol.49:857-864；Panicali ら、1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:4 927-4931、参照）。挿入された FHIT コード配列の有効な翻訳のためには、特異的な開始シグナルも必要となることがある。これらのシグナルとして、ATG 開始コドンおよび隣接配列が含まれる。それ自体の開始コドンおよび隣接配列を含む全 FHIT 遺伝子が適切な発現ベクター中に挿入される場合は、その他の翻訳制御シグナルは必要でないと考えられる。しかし、FHIT コード配列の5'末端を欠失した部分のみが挿入される場合は、ATG 開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを供給する必要がある。さらに、全挿入物の翻訳を確実にするためには、その開始コドンがFHIT コード配列のリーディングフレームに接していなければならない。これらの外来性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然および合成ともに各種の起源のものとすることができる。適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、その他を含ませることによって、発現の効果が増強される（Bittner ら、1987,Met hods in Enzymol.153:516-544、参照）。その他、挿入された配列の発現をモジュレートする、あるいは遺伝子産物を所望の特定の形に修飾またはプロセシングするような宿主細胞株を選択することもできる。タンパク質産物のこうした修飾（例えばリン酸化）およびプロセシング（例えば切断）はタンパク質の機能にとって重要となることがある。タンパク質の翻訳後プロセシングおよび修飾については、それぞれの宿主細胞が特徴的および特異的な機構を有している。発現された外来のタンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするため、適切な細胞系または宿主系を選択することができる。このためには、一次転写物の適切なプロセシングおよび遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を保有している真核宿主細胞を使用することができる。こうした哺乳動物宿主細胞として、限定するわけではないが、CHO，VERO，BHK,HeL a，COS，MDCK，293，WI38その他が含まれる。組換えタンパク質の長期にわたる高収率での製造のためには、安定した発現が好ましい。例えば、FHIT タンパク質を安定して発現する細胞系を遺伝子操作することができる。ウイルス起源の複製部分を含有する発現ベクターを使用するよりも、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、その他）および選別可能なマーカーによって制御されたFHITＤＮＡで宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、遺伝子操作された細胞を富化培地中で1-2 日間増殖させ、次に選別用培地に移す。組換えプラスミド中の選別可能なマーカーによって選別に対する抵抗性が与えられ、そして細胞の染色体中にプラスミドが安定して集積され、増殖して増殖巣を形成し、次にこれがクローン化されて細胞系中に広がることができる。この方法は FHIT タンパク質を発現する細胞系を遺伝子操作するために好都合に使用される。本発明は、FHIT タンパク質をコードする組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して、その細胞によって FHIT タンパク質が発現されるようにした宿主細胞を増殖させて、発現された FHIT タンパク質を回収することを含む、組換え FHIT タンパク質を製造する方法を提供するものである。多数の選別系を使用することができ、これらとして限定するわけではないが以下のものが含まれる；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら、1977 ,Cell 11:223）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska ＆ Szybalski,1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:2026）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら、1980,Cell 22:817）遺伝子をそれぞれtk-，hgprt-，またはaprt-細胞中で使用することができる。また、以下のものについて選別の基礎として代謝拮抗物質抵抗性を使用することができる；メトトレキセートに対する抵抗性を与える dhfr（Wigler ら、1980,Nml.Acad.Sci. USA 77:3567；O'Hare ら、1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527）；マイコフェノール酸に対する抵抗性を与える gpt（Mulligan ＆ Berg,1981,Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA 78:2072 ）；アミノグリコシド G-418 に対する抵抗性を与える neo （Colberre-Garapin ら、1981,J.Mol.Biol.150:1）；およびヒグロマイシンに対する抵抗性を与える hygro（Santerre ら、1984,Gene 30:147）。最近、以下のさらに別の選別可能な遺伝子が記述された；細胞にトリプトファンの代わりにインドールを利用させる trpB ；細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用させる hisD（Hartman ＆ Mulligan,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8047）；およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、2-(ジフルオロメチル)-DL-オルニチン、DFMOに対する抵抗性を与える ODC（オルニチンデカルボキシラーゼ）（Mc Conlogue,L.,1987,In:Current Communications in Molecular Biology,Cold Spr ing Harbor Laboratory,Ed.）。５．２．２．FHIT を発現するトランスフェクタントまたは形質転換細胞の同定コード配列を含有し、生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞を少なくとも次の４つの一般的な方法によって同定することができる；（ａ）ＤＮＡ− ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション；（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または不存在；（ｃ）宿主細胞中での FHITｍＲＮＡ転写物の発現によって測定される転写レベルの評価；および（ｄ）イムノアッセイまたはその生物活性によって測定される遺伝子産物の検出。第１の方法において、それぞれ FHIT コード配列に相同なヌクレオチド配列またはそれらの部分若しくは誘導体を含むプローブを使用し、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションによって、発現ベクター中に挿入された FHIT コード配列の存在を検出することができる。第２の方法において、ある種の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する抵抗性、メトトレキセートに対する抵抗性、形質転換の表現型、バキュロウイルス中での閉鎖体(occlusion body)の形成、その他）の存在または不存在に基づいて、組換えベクター／宿主系を同定および選別することができる。例えば、ヒト FHIT コード配列をベクターのあるマーカー遺伝子配列内に挿入した場合、FHIT コード配列を含有する組換え細胞はそのマーカー遺伝子の機能の不存在によって同定することができる。あるいは、FHIT コード配列の発現を制御するために使用したものと同一または異なるプロモーター制御下で、マーカー遺伝子を FHIT 配列と縦列形態で置くことができる。誘導または選別に応答したそのマーカーの発現は FHIT コード配列の発現を示している。第３の方法において、FHIT 遺伝子の転写活性をハイブリダイゼーションアッセイによって評価することができる。例えば、ＲＮＡを単離して、FHIT コード配列または転写された非コード配列に相同な配列あるいはそれらの特定の部分を有するプローブを使用するノーザンブロットによって分析することができる。あるいは、宿主細胞の全核酸を抽出してこれらのプローブに対するハイブリダイゼーションについて定量的にアッセイしてもよい。第４の方法において、例えば、ウェスタンブロット、放射性免疫沈降、酵素結合イムノアッセイなどのイムノアッセイによって、FHIT タンパク質生成物のレベルを免疫学的に評価することができる。５．３．発現遺伝子産物の精製一旦FHIT遺伝子の配列を発現する組換え体が同定されれば、該遺伝子産物が分析できる。このことは、その産物の放射性標識とその後のゲル電気泳動、イムノアッセイまたは当業者に公知の他の検出法を始めとする、その産物の物理的特性または機能的特性に基づくアッセイにより達成される。一旦FHITタンパク質が同定されれば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、および分別(sizing)カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度を始めとする標準法、もしくは他の何れかのタンパク質精製の標準法によりそれを単離および精製してよい。機能的特性は何れかの適切なアッセイを用いて評価してもよい。別法として、一旦組換え体により産生されたFHITタンパク質が同定されれば、該組換え体中に含まれるキメラ遺伝子の核酸配列から該タンパク質のアミノ酸配列を推定することができる。その結果として、該タンパク質を当該技術分野において公知の標準化学法により合成することができる(例えば、Hunkapillerら，19 84，Nature 310:105-111)。本発明の実施態様では、組換えＤＮＡ法によって産生されたものであれ、または化学合成法によって産生されたものであれ、かかるFHITタンパク質としては、限定されるものではないが、一次アミノ酸配列として、図２Ａ（配列番号：２）に示されたごとき実質的に全ての、もしくは一部のアミノ酸配列、並びにフラグメントおよび他の誘導体、並びにその類似体を含有するものが含まれる。５．４．Fhit に対する抗体の作製本発明によれば、Fhitタンパク質、そのフラグメントまたは他の誘導体、もしくはその類似体を免疫原として用いて、かかる免疫原を認識する抗体を作製してもよい。かかる抗体としては、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、FabフラグメントおよびFab発現ライブラリーが含まれる。特定の実施態様では、ヒト Fhitタンパク質に対する抗体が作製される。 Fhitタンパク質または誘導体または類似体に対するポリクローナル抗体の作製のためには、当該技術分野において公知の種々の手順を用いてよい。抗体の作製のためには、限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどを始めとする種々の宿主動物を、天然のFhitタンパク質または合成型、もしくはその誘導体（例えば、フラグメント）を注射することにより免疫感作させる。宿主の種により、限定されるものではないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのごとき無機ゲル、リゾレシチンのごとき界面活性物質、プルロニック(pluronic)ポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、油性乳剤、カサガイヘモシアニン、ジニトロフェノール並びにBCG（Calmette-Guerin杆菌）およびco rynebacterium parvumのごとき潜在的に有用なヒトアジュバントを含む種々のアジュバントを用いて免疫応答を増強してよい。 Fhitタンパク質配列またはその類似体に対するモノクローナル抗体の作製のためには、培養における連続的細胞株による抗体分子の作製のために供する方法を用いてよい。例えば、KohlerおよびMilstein(1975，Nature 256:495-497)により最初に開発されたハイブリドーマ法、並びにヒトモノクローナル抗体を作製するためのトリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(Kozborら，1983，Immunolog y Today 4:72)、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法(Coleら，1985，in Monoclona l Antibodies andCancer Therapy，Alan R．Liss，Inc.,pp.77-96)。本発明のさらなる実施態様では、モノクローナル抗体は最近の技術を利用して、無菌動物で作製できる（PCT／US90／02545）。本発明によれば、ヒト抗体を用いてよく、ヒトハイブリドーマを用いることによるか(Coteら，1983，Proc.Natul．Acad．Sci ．USA 80:2026-2030)、またはin vitroにてEBVウイルスを用いてヒトＢ細胞を形質転換することによるかして(Coleら，1985,in Monoclonal Antibodies and Can cer Therapy，Alan R．Liss，Inc.,pp.77-96)それを得ることができる。実際は、本発明に従い、FHITに特異的なマウス抗体分子からの遺伝子を適した生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングすることにより、「キメラ抗体」の作製のために開発された技術(Morrisonら，1984，Proc，Natl．Acad．Sci．USA 81:6851-68 55; Neubergerら，1984，Nature 312:604-608; Takebeら，1985，Nature 314:45 2-454)を用いることができ、かかる抗体は本発明の範囲内である。本発明によれば、一本鎖抗体の作製に関して記載した技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用してFhit特異的一本鎖抗体を作製できる。本発明のさらなる実施態様はFab発現ライブラリーの構築に関して記載された技術(Huseら，19 89，Science 246:1275-1281)を利用して、Fhitタンパク質、誘導体または類似体に対して所望の特異性をを有するモノクローナルFabフラグメントを迅速かつ容易に同定させるものである。特定の実施態様では、Fhitタンパク質のフラグメントを含む分子を免疫原として用いる。例えば、親水性領域が恐らく抗原決定基を含むと信じられているので、Fhitタンパク質の親水性タンパク質に相当するか、またはそれを含むペプチドを免疫原として用いるのが好ましい。その分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは公知の技術により作製することができる。例えば、かかるフラグメントとしては、限定されるものではないが、その抗体分子のペプシン消化により作製できるＦ（ab’）₂フラグメント、Ｆ（ab'）₂フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより作製できる Fab’フラグメント、ならびにパパインおよび還元剤での抗体分子の処理により作製できるFabフラグメントが含まれる。抗体の産生において、所望の抗体についてのスクリーニングは、当該技術分野において公知の方法、例えばＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）により達成できる。例えば、Fhitタンパク質の特異的ドメインを認識する抗体を選択するためには、かかるドメインを含有するFhitフラグメントに結合する産物に対して作製されたハイブリドーマを分析すればよい。ヒトFhitに対して特異的な抗体の選択のためには、ヒトFhitに明確に結合し、かつ例えばマウスFhitには結合しないことに基づき選抜することができる。前記抗体を本発明のタンパク質配列の位置決定および活性に関して当該技術分野において公知の方法に、例えばこれらタンパク質のイメージング(imaging)、適当な生理学的サンプル、診断法におけるそのレベルの測定のためなどに用いることができる。５．５．FHIT 遺伝子およびタンパク質の構造 FHIT遺伝子およびタンパク質の構造は当該技術分野で公知の種々の方法により分析できる。５．５．１．遺伝子分析 FHIT遺伝子に相当するクローン化ＤＮＡまたはｃＤＮＡは、限定されるものではないが、サザンハイブリダイゼーション(Southern E.M.，1975，J．Mol.Biol ．98:503-517)、ノーザンハイブリダイゼーション(例えば、Freemanら，1983，P roc．Natl．Acad．Sci．USA 80:4094-4098参照)、制限エンドヌクレアーゼマッピング(Maniatis，T.，1982，Molecular Cloning，A Laboratory，Cold Springs Harbor，New York)、およびＤＮＡ配列分析を始めとする方法により分析できる。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR；米国特許第4,683,202号、第4,683,195号および第4,889,818号；Gyllensteinら，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:7652-7 656；Ochmanら，1988，Genitics 120:621-623；Lohら，1989，Science 243:217- 220）とその後のFHIT特異的プローブを用いたサザンハイブリダイゼーションは、種々の細胞型からののＤＮＡ中のFHIT遺伝子の検出を可能にする。一つの実施態様では、サザンハイブリダイゼーションを用いてFHITの遺伝的連鎖を決定してよい。また、PCRとその後のハイブリダイゼーション検定を用いて、FHITＲＮＡまたは3p14.2染色体もしくは分子の異常性を検出または測定してもよい。ノーザンハイブリダイゼーション検定を用いてFHIT遺伝子の発現レベルを測定してもよい。他のアッセイは５．１１節に記載している。種々の発達段階また活性段階の種々の細胞型を FHIT発現に関して試験することができる。サザンおよびノーザンの両ハイブリダイゼーションもしくはドットブロットについてのハイブリダイゼーション条件の緊縮度(stringency)を操作して、用いた特異的FHITプローブに対して好ましい程度の関連性を持つ核酸を確実に決定することができる。制限エンドヌクレアーゼマッピングを用いてFHIT遺伝子の遺伝子構造の概略を決定することができる。制限エンドヌクレアーゼ切断によって得られた制限地図はＤＮＡ配列分析により確認することができる。ＤＮＡ配列分析は、限定されるものではないが、MaxamおよびGilbert(1980，M eth．Enzymol．65:499-560)の方法、Sangerジデオキシ法(Sangerら，1977，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 74:5463)、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの使用(TaborおよびRichardson,米国特許第４，７９５，６９９号、または自動ＤＮＡシークエネーター(sequenator)の使用（例えば、Applied Biosystems，Foster city，CA）を始めとする当該技術分野において公知の何れの技術によって行われてもよい。代表的なFHIT遺伝子のｃＤＮＡ配列は実質的に図２Ａ（配列番号：１）に示され、後記第６節に記載されたたごとき配列を含む。５．５．２．タンパク質分析 Fhitタンパク質のアミノ酸配列はＤＮＡ配列からの推測により、もしくは別法としては、例えば自動アミノ酸シーケンサーを用いたタンパク質の直接の配列決定により得ることができる。代表的なFhitタンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸番号１−１４７により示される代表的成熟タンパク質を伴い、実質的に図２Ａ（配列番号：２）で示され、後記第６節に詳述されたごとき配列を含む。親水性分析(Hopp，T.およびWoods，K.，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 7 8:3824)によりFhitタンパク質配列をさらに特徴付けることができる。親水性プロフィールを用いて、Fhitタンパク質の疎水性値域および親水性領域、並びにかかる領域をコードする遺伝子配列の相当領域を同定することができる。また、二次構造分析(Chou，P.およびFasman，G.，1974，Biochemistry 13:222 )を行って、特異的二次構造を仮定するFhitタンパク質の領域を同定することもできる。操作、翻訳および二次構造の推定、並びにオープンリーディングフレームの推定およびプロッティングを当該技術分野で利用可能なコンピュータソフトウエアプログラムを用いて達成することもできる。また他の構造分析法を利用することもできる。これらには、限定されるものではないが、Ｘ線結晶学(Engstom，A.，1974，Biochem．Exp．Biol．11:7-13)およびコンピュータモデリング(Fletterick，R.およびZoller,M．（編），1986，Com puter Graphics and Molecular Modeling，in Current Communications in Mole cular Biology，Cold Spring Harbor Labortory，Cold Spring Harbor，New Yor k)が含まれる。の動物モデル系でも用いることができる。５．６．Ｆｈｉｔ蛋白質、誘導体および類似体さらに本発明はＦｈｉｔ蛋白質および誘導体（限定されるものではないが断片を含む）並びにＦｈｉｔ蛋白質の類似体に関する。また、Ｆｈｉｔ蛋白質誘導体をコードする核酸および蛋白質類似体も提供する。また、Ｆｈｉｔ蛋白質または誘導体を含む分子も提供する。一つの具体例では、該Ｆｈｉｔ蛋白質は前記５．１節に記載したＦｈｉｔ核酸によりコードされる。ある態様では、該蛋白質、誘導体または類似体は動物のＦｈｉｔ蛋白質のものである。Ｆｈｉｔに関する誘導体および類似体の作製および使用は本発明の範囲内にある。具体例では、該誘導体または類似体は機能的に活性がある、すなわち、全長、野生型Ｆｈｉｔ蛋白質に付随する１以上の機能活性を発現することができる。一例として、所望の免疫原性または抗原性を有するかかる誘導体または類似体を、例えば、イムノアッセイに、免疫感作に、Ｆｈｉｔ活性の阻害などに用いることができる。もう一つの例として、加水分解酵素活性を有するかかる誘導体または類似体を提供する。注目する所望のＦｈｉｔ特性を保持した、またはそうでなければ欠如した、あるいは阻害する誘導体または類似体を、かかる特性およびその生理学的関連のそれぞれインデューサーもしくはインヒビターとして用いることができる。具体例は抗−Ｆｈｉｔ抗体により結合可能なＦｈｉｔ断片に関するものである。Ｆｈｉｔの誘導体または類似体は、限定されるものではないが、後記のアッセイを始めとする当該技術分野において公知の手順により、所望の活性について試験することができる。特に、Ｆｈｉｔ誘導体は、機能的同等分子を提供する置換、付加もしくは欠失によりＦＨＩＴ配列を改変することにより作出できる。核酸コーディング配列の縮重のため、ＦＨＩＴ遺伝子と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を本発明の実施に用いてもよい。これらは、限定されるものではないが、配列中に機能的同等アミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって改変され、かくしてサイレント変異が生じるＦＨＩＴ遺伝子の全てまたは一部を含む。同様に、本発明のＦｈｉｔ誘導体は、限定されるものではないが、一次アミノ酸配列として、そこで機能的同等アミノ酸残基が配列中の残基と置換し、結果としてサイレント変異が生じる改変配列を始めとするＦｈｉｔ蛋白質のアミノ酸配列の全てまたは一部を含有するものを含む。例えば、配列中の１以上のアミノ酸残基を機能的同等体として作用する同一の極性を持つ別のアミノ酸で置換し、その結果サイレント変異を得ることができる。配列中のアミノ酸の置換基はそのアミノ酸が属するクラスの他の種から選択すればよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷を持つ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷を持つ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。本発明の特定の具体例では、Ｆｈｉｔ蛋白質の少なくとも１０個の（連続した）アミノ酸から構成されるＦｈｉｔ蛋白質の断片から成るか、またはそれを含む蛋白質を提供する。他の具体例では、該断片はＦｈｉｔ蛋白質の少なくとも２０または５０個のアミノ酸から構成される。具体例では、かかる断片は３５、１００または１４０アミノ酸より長くはない。Ｆｈｉｔの誘導体または類似体は、限定されるものではないが、Ｆｈｉｔに対して実質的に相同な領域またはその断片（例えば、種々の具体例では、同定サイズ、すなわちそこでその整列が当該技術分野において公知のコンピュータホモロジープログラムによってなされる整列配列に比較した場合のアミノ酸配列にわたって少なくとも６０％または７０％または８０％または９０％または９５％一致）を含む分子、またはそのコードする核酸がストリンジェント条件下、適度のストリンジェント条件下、またはストリンジェントでない条件下で、コーディングＦＨＩＴ配列とハイブリダイズすることができる分子を含む。本発明のFhit誘導体および類似体は当該技術分野において公知の種々の方法によって作製できる。結果的にそれらが産生される操作を遺伝子または蛋白質レベルで起こすことができる。例えば、クローン化ＦＨＩＴ遺伝子配列は当該技術分野において公知の多くの戦略(Maniatis,T.，1990，Molecular Cloning，A Labor atory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor， New York)の何れによっても改変することができる。制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な部位で該配列を切断し、次いで所望によりさらに酵素的に改変し、単離し、イン・ビトロで連結することができる。Ｆｈｉｔの誘導体または類似体をコードする遺伝子の作製においては、所望のＦｈｉｔ活性がコードされる遺伝子領域中において、翻訳停止シグナルにより妨害されないＦｈｉｔとして同一の翻訳リーディングフレーム内に改変遺伝子が確実に留まるよう注意すべきである。さらには、Ｆｈｉｔがコードする核酸配列をイン・ビトロまたはイン・ビボで変異誘発して、翻訳、開始および／または終結配列を創出または破壊することや、コーディング領域における変異を創出、および／または新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成する、もしくは先在のものを破壊して、イン・ビトロでの修飾をさらに促進することができる。限定されるものではないが、化学的突然変異誘発、イン・ビトロ位置指定突然変異誘発(Hutchinson，C.ら，1978，J．Biol． Chem 253:6551)などを始めとする当該技術分野において公知の何れの突然変異誘発法を用いることができる。また、Ｆｈｉｔ配列の操作を蛋白質レベルで行ってもよい。翻訳中または翻訳後に種々に修飾される（例えば、グルコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／遮断基による誘導体化、蛋白質分解切断、抗体分子または他の細胞内リガンドとの結合などによる）Ｆｈｉｔ蛋白質断片または他の誘導体もしくは類似体は本発明の範囲内に含まれる。多くの化学的修飾の何れを、限定されるものではないが、ブロモシアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ₄による特異的化学的切断；アセチル化、フォルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在化での代謝合成などを始めとする、公知の技術により行ってよい。さらに、Ｆｈｉｔの誘導体または類似体は化学的に合成できる。例えば、所望のドメインを含む（第５．６．１節参照）、またはイン・ビトロで所望の活性を仲介するＦｈｉｔ蛋白質の一部に相当するペプチドをペプチドシンセサイザーの使用によって合成することができる。さらに、所望により、非分類アミノ酸または化学的アミノ酸類似体をＦｈｉｔ配列への置換または付加として導入することができる。非分類アミノ酸としては、限定されるものではないが、通常アミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソブチル酸、４−アミノブチル酸、Ａｂｕ、２−アミノブチル酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２− アミノイソブチル酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ− ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸のごときデザイナーアミノ酸、および一般的なアミノ酸類似体が挙げられる。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）でありうる。具体例では、Ｆｈｉｔ誘導体は、異なる蛋白質のアミノ酸配列とのペプチド結合を介してそのアミノ−またはカロボキシ−末端で連結されたＦｈｉｔ蛋白質またはその断片を含む（好ましくは少なくともＦｈｉｔ蛋白質のドメインまたはモチーフ、あるいはＦｈｉｔ蛋白質の少なくとも１０個のアミノ酸から成る）キメラ、もしくは融合蛋白質である。一つの具体例では、かかるキメラ蛋白質は蛋白質をコードする核酸（異なる蛋白質に対するコーディング配列とフレーム内で結合されたＦｈｉｔコーディング配列を含む）の組換え体発現によって産生される。かかるキメラ産物は、当該技術分野において公知の方法によって適当なコーディングフレーム内で、所望のアミノ酸配列をコードする適当な核酸配列を互いに連結し、次いで当該技術分野で一般的に公知の方法によって該キメラ産物を発現させることにより作製できる。別法として、かかるキメラ産物を蛋白質合成法により、例えば、ペプチドシンセサイザーの使用により作製してもよい。何れの異種蛋白質をコードする配列と融合させたＦｈｉｔの一部を含むキメラ遺伝子を構築してもよい。もう一つの具体例では、該Ｆｈｉｔ誘導体はＦｈｉｔ蛋白質と相同性を持つ領域を含む分子である。例示の手段により、種々の具体例では、第一の領域に含まれる数と等しい数のアミノ酸を持つ第二の領域の任意の配列と比較した場合、もしくは当該技術分野において公知のコンピュータホモロジープログラムによって整列された第二の配列の整列配列と比較した場合、第一の領域のアミノ酸配列が少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％または９５％一致するとき、第一の蛋白質領域を第二の蛋白質領域に対して「相同である」とみなすことができる。例えば、分子はＦｈｉｔドメイン（第５．６．１節参照）またはその一部あるいは全長Ｆｈｉｔ蛋白質に対して相同な１以上の領域を含んでよい。５．７．Ｆｈｉｔ蛋白質、誘導体および類似体のアッセイＦｈｉｔ蛋白質、誘導体および類似体の機能活性は種々の方法によってアッセイすることができる。例えば、抗−Ｆｈｉｔ抗体との結合に関する野生型Ｆｈｉｔ結合する能力または競合する能力についてアッセイする一つの具体例では、限定されるものではないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射線検定法、ゲル内拡散沈降素反応、免疫拡散検定法、ｉｎｓｉｔｕイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位元素標識を用いる）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集検定法（例えば、ゲル凝集検定法、赤血球凝集検定法）、補体結合検定法、免疫蛍光検定法、蛋白質Ａ検定法および免疫電気泳動検定法などの方法を用いる競合的、非競合的アッセイ系を始めとする当該技術分野において公知の種々のイムノアッセイを用いることができる。一つの具体例では、抗体結合を一次抗体上の標識を検出することにより検出する。もう一つの具体例では、該一次抗体を一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより検出する。さらなる具体例では、該二次抗体を標識する。イムノアッセイにおける結合を検出するために多くの方法が当該技術分野において公知であり、それは本発明の範囲内である。Ｆｈｉｔ蛋白質が同定されるもう一つの具体例では、該結合は例えば、当該技術分野で十分公知の手段によって検定できる。Ｆｈｉｔ蛋白質が加水分解酵素活性を有するはずであるもう一つの具体例では、加水分解酵素アッセイを用いてＦｈｉｔ加水分解酵素活性を測定することができる。かかるアッセイは当該技術分野で十分公知の方法によって行うことができる。さらには、当該技術分野において公知のアッセイを用いてイン・ビトロまたはイン・ビボで細胞増殖を阻害する能力を検出または測定することができる。他の方法は当業者に公知であり、本発明の範囲内である。５．８．治療用途：細胞の過増殖に関与する障害の治療および予防本発明は治療化合物（本明細書では「治療薬」という）の投与により種々の疾病および障害の治療または予防を提供する。かかる「治療薬」には、限定されるものではないが、Ｆｈｉｔ蛋白質および類似体およびその誘導体（断片を含む）（例えば、本明細書に前記したごとき）；それに対する抗体（本明細書に前記したごとき）；Ｆｈｉｔ蛋白質、類似体または誘導体（例えば、本明細書に前記したごとき）をコードする核酸；並びに突然変異ＦＨＩＴ遺伝子または蛋白質のＦｈｉｔアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、抗体またはアンチセンス核酸）が含まれる。好ましい具体例では、細胞の過増殖を伴う障害はＦｈｉｔ機能を誘導する治療薬の投与により治療または予防される。前記は下記のサブセクションで詳述される。一般的に、患者の種と同一種である種の起源または（抗体の場合は）種の反応性を持つ産物を投与することが好ましい。かくしてこのましい具体例では、ヒトＦｈｉｔ蛋白質、誘導体または類似体、もしくは核酸、もしくはヒトＦｈｉｔ蛋白質またはヒトＦＨＩＴアンチセンス核酸に対する抗体を治療的または予防的にヒト患者に投与する。本発明に従って使用できる治療薬のさらなる記載および供給源は本明細書の第５．１節ないし第５．７節に見出される。ＦＨＩＴポリヌクレオチドおよびそのＦｈｉｔ蛋白質産物を、細胞の過増殖を伴う疾病、並びにＦＨＩＴ遺伝子座に関する染色体の転座または逆位または分子異常、および／または野生型ＦＨＩＴＲＮＡまたは蛋白質の発現の低下、および／または変異型ＦＨＩＴＲＮＡまたは蛋白質の発現、および／または変異型ＦＨＩＴＲＮＡまたは蛋白質の発現に関連する他の障害に対する治療／予防目的のために使用することができる。ＦＨＩＴポリペプチドおよびそのＦＨＩＴ蛋白質産物を単独または癌および過増殖または不全増殖障害の治療に有用な他の治療薬と併用して治療／予防目的に使用してもよい。細胞の過増殖を伴う疾病および障害を、Ｆｈｉｔ機能を誘導する（例えば、増加させるまたは供給する）治療薬の投与により治療／予防する。かかる治療薬の例としては、限定されるものではないが、機能的に活性を持つ、特に細胞の過増殖の阻害に活性を持つ（例えば、イン・ビトロアッセイで、または動物モデルで証明されたごとき）、Ｆｈｉｔ蛋白質、誘導体または断片、並びにＦｈｉｔ蛋白質をコードする核酸または機能的に活性を持つその誘導体もしくは断片（例えば、遺伝子治療への使用のための）が拳げられる。用いることができる他の治療薬、例えばＦｈｉｔアゴニストは後記の例、イン・ビトロアッセイまたは動物モデルを用いて同定できる。具体例では、（１）Ｆｈｉｔ機能性蛋白質のまたはＦｈｉｔ機能レベルの不在または（正常または所望のレベルに比べて）低下を伴う疾病または障害において、例えば、Ｆｈｉｔ蛋白質が欠如している、遺伝的に欠失した、生物学的に不活性または異常に不活発な（underactive）、もしくは発現しない(underexpressed)患者において、もしくは（２）イン・ビトロ（またはイン・ビボ）アッセイがＦｈｉｔアゴニスト投与の有用性を示す疾病または障害において、Ｆｈｉｔ機能を誘導する治療薬を（予防のためも含めて）治療的に投与する。Ｆｈｉｔ蛋白質または機能の不在またはレベルの低下は、例えば、患者の組織サンプル（例えば、生検組織から）を得、次いでイン・ビトロでそれをＲＮＡまたは蛋白質レベル、構造および／または発現したＦｈｉｔＲＮＡまたは蛋白質の活性に関して検定することにより容易に検出できる（後記の第５．１１節診断に用いられるアッセイ参照）。かくして、限定されるものではないが、Ｆｈｉｔ蛋白質を検出および／または視覚化するためのイムノアッセイ（例えば、ウエスタンブロット、免疫沈降法に続くドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学など）、および／またはＦｈｉｔｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを検出および／または視覚化することによりＦｈｉｔ発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび好ましくは第５．１１節に記載されたアッセイ）などを始めとする、当該技術分野で標準的な多くの方法が使用できる。治療または予防できる細胞の過増殖を伴う疾病および障害としては、限定されるものではないが、悪性腫瘍、前悪性症状（例えば、過形成、化生、異形成）、良性腫瘍、過増殖性障害、良性不全増殖障害などが挙げられる。これらの例としては下記に詳述する。５．８．１．悪性腫瘍 Fhit機能（例えば、全長Fhitタンパク質またはその機能的誘導体または前記のものをコードする核酸）を誘導する治療薬の投与により治療または予防可能な悪性腫瘍および関連障害としては、限定されるものではないが、表１に挙げられたものが含まれる（かかる障害の総論についてはFishmanら，1985，Medicine，第２版，J.B．Lippincott Co.，Philadelphia）。表１悪性腫瘍および関連障害白血病急性白血病急性リンパ性白血病急性骨髄性白血病骨髄芽球性前骨髄芽球性骨髄単球性単球性赤白血病慢性白血病慢性骨髄性（顆粒球性）白血病慢性リンパ性白血病真性赤血球増加症リンパ腫ホジキン病非ホジキン病多発性骨髄腫ヴァルデンストレームマクログロブリン血症Ｈ鎖病固形腫瘍肉腫および癌繊維肉腫粘液肉腫脂肪肉腫軟骨肉腫骨原性肉腫骨肉腫脊索腫血管肉腫内皮肉腫リンパ管肉腫リンパ管内皮肉腫滑膜腫中皮腫ユーイング腫平滑筋肉腫横紋筋肉腫結腸癌結腸直腸癌脾臓癌胸癌卵巣癌前立腺癌扁平上皮癌基底細胞癌腺癌汗腺癌皮脂腺癌乳頭状癌乳頭状腺癌嚢胞腺癌髄様癌気管支原生癌腎細胞癌肝癌胆汁管癌絨毛癌精上皮腫胎生期癌ヴィルムス腫頸部癌子宮癌精巣癌肺癌小細胞肺癌非小細胞肺癌膀胱癌上皮癌神経膠腫星状細胞腫髄芽腫頭蓋咽頭腫脳室上衣細胞腫松果体腫血液芽細胞腫聴神経腫乏突起神経膠腫髄膜腫黒色腫神経芽種網膜芽腫鼻咽腔癌食道癌具体例では、限定されるものではないが、食道、胃、結腸および結腸直腸癌を始めとする消化管癌を治療または予防する。もう一つの具体例では、胚癌（例えば、小細胞肺癌）および鼻咽腔癌のごとき気管癌を治療または予防する。さらに他の具体例では、悪性腫瘍または不全増殖変異（変質形成および異形成のごとき）または過増殖障害が頭部、首、頸部、腎臓、胃、皮膚、卵巣、膀胱、胸部、結腸、肺または子宮で治療または予防される。他の具体例では、肉腫または白血病を治療または予防する。もう一つの特定の具体例では、骨肉腫または腎細胞腫を治療または予防する。５．８．２．前悪性症状また、Fhit活性を誘導する本発明の治療薬を投与して前悪性症状を治療し、限定されるものではないが、表１に挙げた障害を始めとする新形成または悪性状態への進行を回避することができる。かかる予防または治療用途は前記した新形成または癌への進行について公知のまたは予測される症状において、特に、過形成、変質形成、または最も特定には異形成からなる非新形成的細胞増殖が生じた場合に指示される（かかる異常増殖症状の総論についてはRobbinsおよびAngell，1 976，Basic Pathology，第二版，編，W.B．Sauders Co.，Philadelphia，pp.68- 79を参照のこと）。過形成とは、構造または機能に有意な改変なく、組織または器官中の細胞数の増加に関する制御された細胞増殖の形態である。一例として、子宮内膜の過形成はしばしば子宮内膜の癌の前に起こる。変質形成とは、そこである腫の成熟または十分に分化した細胞が別の成熟細胞に置き換わる、制御された細胞増殖の形態である。変質形成は上皮細胞または連結組織細胞で生じ得る。不規則な変質形成は多少無秩序な変質形成の上皮を示す。異形成はしばしば癌の兆候となり、主に上皮中に認められ、個々の細胞の均一性および細胞の構造上の並びを欠いた、非新形成的細胞増殖の最も無秩序な形態である。異形成細胞はしばしば異常に大きく、核が濃く染まり、多能性を発現する。異形成は特徴的には、慢性刺激または炎症が存在するところに生じ、しばしば頸部、気道、口腔、および胆嚢に見られる。本発明の好ましい具体例では、患者のＤＮＡでFHIT遺伝子において突然変異、特に欠失、さらに特定にはホモ接合性突然変異が検出され、それにより患者が癌に対する素因を持つことが決定され、次いでFhitタンパク質またはその機能的誘導体または同をコードする核酸の投与により治療される（遺伝子治療）。過形成、変質形成、または異形成として特徴付けられた異常細胞増殖の存在とは別に、もしくはそれに加えて、イン・ビボで示されたまたは患者由来の細胞サンプルによりイン・ビトロで示された形質転換した表現型、もしくは悪性の表現型の１以上の特性が存在することにより、Fhit機能を誘導する治療薬の治療的／予防的投与の妥当性を示すことができる。前記したごときに、形質転換した表現型のかかる特性としては、形態変異、よりルーズな下層付着、接触阻害の欠如、足場依存性の欠如、プロテアーゼの放出、糖輸送の増加、血清要求性の低下、胎児抗原の発現、２５０，０００ダルトンの細胞表面タンパク質の消失などが挙げられる（同上、形質転換したまた悪性の表現型に関連する特徴についての８４ −９０頁も参照のこと）。具体例では、白斑症、上皮の良性と思われる過形成領域または異形成領域、もしくはボーエン病、ｉｎｓｉｔｕ癌は、予防薬の介入の妥当性を示す前新形成領域である。もう一つの具体例では、繊維嚢胞症（嚢胞性の過形成、乳房異形成、特に腺障害（良性上皮過形成））が予防薬の介入の妥当性を示す。他の具体例では、悪性腫瘍に対して予め処置した以下の１以上の因子を発現する患者を、有効量の治療薬を投与することにより治療する：悪性腫瘍に関連する染色体転座（例えば、慢性骨髄性白血病に対するフィラデルフィア染色体、小胞性リンパ腫に対するｔ（１４；１８）など）、家族性ポリープ症またはガードナー症候群（結腸癌の前兆の可能性がある）、良性モノクローナルガンマグロブリン異常（多形性骨髄腫の前兆の可能性がある）、およびメンデルの（遺伝子）遺伝パターンを示す癌または前癌性疾病を有する人の一親等（例えば、結腸の家族性ポリープ症、ガードナー症候群、遺伝性外骨腫、多内分泌腺腫症、アミロイド産生およびクロム親和細胞種を伴う髄様甲状腺癌、ポイツ−ジェガーズ症候群、ボン・レクリングホーセン(Von Recklinghausen)の神経線維腫症、網膜芽腫、頸動脈小体腫瘍、皮膚黒色癌、眼球内黒色癌、色素性乾皮症、毛細血管拡張性運動失調、チェディアック−東症候群、白皮症、ファンコーニ無形性貧血、ブルーム症候群；RobbinsおよびAngell，1976，Basic Pathology,第二版編，W.B．Saun ders Co.，Philadelphia，pp.112-113参照など)。具体例では、本発明の治療薬をヒト患者に投与して、胸部、結腸、肺、胃または子宮癌、もしくは黒色種または肉腫への進行を回避する。５．８．３．過増殖性および増殖異常障害本発明のもう一つの具体例では、Fhit活性を誘導する治療薬が、過増殖性もしくは良性の増殖異常障害の治療もしくは予防のために使用される。具体例は良性腫瘍、繊維性嚢胞、および組織肥大（例えば、前立腺肥大）の治療もしくは予防に向けられる。具体例では、腸ポリープ、結腸ポリープ、もしくは食道形成異常の患者が治療薬の投与によって処置される。５．８．４．遺伝子療法特定の実施態様では、遺伝子療法として、Fhitタンパク質もしくはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸を投与してFhit機能を増進させる。遺伝子療法とは、核酸を患者に投与することにより行われる治療法をいう。 FHITポリヌクレオチドは、癌のごとき染色体３ｐ１４．２の異常性、および／または野生型FHIT ＲＮＡもしくはタンパク質の発現の低下に関連する種々の病状の治療に用いられる。FHIT遺伝子配列を細胞に導入することにより、遺伝子療法を利用して、機能的FHIT ＲＮＡもしくはタンパク質の発現不全に関連する症状を治療してよい。従って、本発明は、治療上有効な量の機能的Fhitタンパク質をコードする核酸を、染色体３ｐ１４．２の異常に関連する病状に苦しむ哺乳動物に投与することを特徴とする、染色体３ｐ１４．２の異常に関連する病状に苦しむ哺乳類における、染色体３ｐ１４．２の異常に関連する病状を治療する方法を提供する。本発明のこの具体例では、核酸は自身がコードするタンパク質を産生し、そのタンパク質がFhit機能を促進することにより治療学的効果を仲介し、それによって、例えば腫瘍もしくは癌の出現または進行を阻害する。当該技術分野において利用可能な何れの遺伝子療法も、本発明において使用することができる。実施例の方法は、以下に記載する。遺伝子療法の方法の総括的な総説は、Goldspielら，1993，ClinicalPharmacy 12:488-505；WuおよびWu，1991，Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev，1993，Ann ．Rev．Pharmacol．Toxicol．32:573-596；Mulligan,1993，Science 260:926-93 2;MorganおよびAnderson，1993，Ann．Rev.Biochem．62:191-217；May，1993，T IBTECH 11(5):155-215を参照。当該組換えＤＮＡ技術の分野において一般的に知られている、使用可能な方法は、Ausubelら（編），1993，Current Protocols in Molecular Biology，J ohn Wiley & Sons，NY；およびKriegler，1990，Gene Transfer and Expression ，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY.に記載されている。好ましい態様では、該治療薬は適切な宿主中でFhitタンパク質またはフラグメントまたはそのキメラタンパク質を発現する、発現ベクターの一部分であるFHIT 核酸を含有する。特に、かかる核酸は該FHITをコードする領域に作動可能なように連結されたプロモーターを持ち、該プロモーターは誘導可能もしくは構成的であり、かつ所望により組織特異的である。もう一つの特定の具体例では、FHITコード配列および他の任意の所望の配列が、ゲノムの所望の位置での相同組換えを誘導する領域にはさまれている核酸分子が使用され、かくして該FHIT核酸の染色体内における発現が供される（KollerおよびSmithies，1989，Proc．Natl．Acad .Sci．USA 86:8932-8935；Zijlstraら，1989，Nature 342:435-438）。該核酸の患者への送達は、患者が該核酸もしくは核酸保有ベクターに直接曝露される場合のように直接的なものであってもよいし、もしくは、まずin vitroにおいて該核酸で細胞を形質転換させ、次いで該患者に移植する場合のように間接なものであってもよい。これら２種類の試みはそれぞれin vivoもしくはex vivo 遺伝子療法として知られている。具体例では、該核酸はイン・ビボにて直接投与され、コードされた産物を生産するために発現させる。これは、当該技術分野において公知の多くの方法、例えば適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築し、次いで、例えば欠損または弱毒化したレトロウイルスもしくは他のウイルスベクターを使用して感染させることによって、それが細胞内に来るよう投与することにより、（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、もしくは裸のＤＮＡを直接注射することにより、もしくは超微粒子衝撃法（例えば、遺伝子銃；Biolistic，Dupont）の使用により、もしくは脂質または細胞表面受容体またはトランスフェクション試薬による被覆、リポソーム、超微粒子、またはマイクロカプセルへの被包により、もしくは核に入り込むことが知られているペプチドに結合させてそれを投与することにより、リガンドに結合させてそれを投与し、受容体により媒介されるエンドサイトーシスを行わせることなどにより（例えば、WuおよびWu，1987，J．Biol．Chem．262 :4429-4432参照）（これは、該受容体を特異的に発現する標的細胞タイプに対して使用できる）達成できる。もう一つの具体例では、そのリガンドがエンドソームを破砕するための融合誘導ウイルス性ペプチドを含有する、核酸−リガンド複合体を形成させて、該核酸のリポソーム分解を避けることができる。さらにもう一つの具体例では、イン・ビボにおいて、特異的な受容体を標的にすることにより、該核酸を細胞特異的な取り込みおよび発現のための標的とすることができる（例えば、１９９２年４月１６日付けのＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／０６１８０（ Wuら）；１９９２年１２月２３日付けのＷＯ９２／２２６３５（Wilsonら）；１９９２年１１月２６日付けのＷＯ９２／２０３１６（Findeisら）；１９９３年７月２２日付けのＷＯ９３／１４１８８（Clarkeら）；１９９３年１０月１４日付けのＷＯ９３／２０２２１（Young）参照）。別法として、相同組換えにより該核酸を発現のために細胞内に導入し、次いで宿主細胞のＤＮＡ内に組み込むことができる（Kollerおよび Smithies，1989，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:8 932-8935；Zijlstraら，1989，Nature 342:435-438）。具体例では、該FHIT核酸を含有するウイルスベクターを使用する。例えば、レトロウイルスベクターを使用できる（Millerら，1993，Meth.Enzymol．217:581- 599）。これらレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングや宿主細胞ＤＮＡへの組込みには必要のないレトロウイルス配列を欠失するように修飾されて来た。遺伝子療法で使用される該FHIT核酸は、ベクター中でクローン化され、このことにより遺伝子を患者に送達することが容易となる。レトロウイルスベクターに関してのさらなる詳細は、Boesenら，1994，Biotherapy 6:291-3 02に見出すことができ、それは化学療法に対して幹細胞の耐性をより高めるために、造血幹細胞へｍｄｒ１遺伝子を送達するためのレトロウイルスベクターの使用について記載している。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を示した他の参照文献としては：Clowesら，1994，J．Clin．Invest．93:644-651；Kiemら，1994，Blood 83:1467-1473；SalmonsおよびGunzberg，1993，Human Gene Ther apy 4:129-141；GrossmanおよびWilson，1993，Curr．Opin．in Genetics and D evel．3:110-114がある。アデノウイルスは遺伝子療法に使用可能な、その他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、呼吸器上皮に遺伝子を送達するために特に魅力的な伝達体である。本来、アデノウイルスは、呼吸器上皮に感染し、そこで軽症の疾病を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達系のためのその他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染できるという利点を持っている。KozarskyおよびWilson，1993，Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503には、アデノウイルスに基づく遺伝子療法の総論が述べられている。Boutら，1994，Human Gene Therapy 5:3-10においては、アカゲザルの呼吸器上皮に遺伝子を導入するためのアデノウイルスベクターの使用が説明されている。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用の他の実例は、Rosenfeldら，1991，Science 252:431-434；Rosenfeldら，1992，Cell 68 :143-155；およびMastrangeliら，1993，J．Clin.Invest．91:225-234に見出すことができる。また、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も遺伝子療法における使用のために提案されている（Walshら，1993 Proc．Soc．Exp．Biol．Med．204:289-300）。また、ヘルペスウイルスも使用できる。遺伝子療法に対するその他の試みには、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、もしくはウイルス感染のごとき方法により、組織培養中の細胞に遺伝子を導入することを含むものである。通常、導入法としては細胞への選択可能なマーカーの導入がある。次いで該細胞は、導入された遺伝子を取り込み、発現している細胞を単離するための選別にかけられる。次いで、それらの細胞は患者に送達される。この具体例では、該核酸は、イン・ビボでの得られた組換え細胞の投与の前に細胞に導入される。かかる導入は、限定されるものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、該核酸配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子転移法、微小細胞媒介遺伝子転移法、スフェロプラスト融合などを含む当該技術分野において公知の何れの方法によって行われてもよい。外来遺伝子を細胞に導入するための多くの技術が当該技術分野において公知であり（例えば、LoefflerおよびBehr，1993，Meth．Enzymol．217:559-618；Cohenら，1993 ，Meth．Enzymol．217:618-644；Cline，1985，Pharmac．Ther．79:69-92参照）、受容細胞に必要な発生(development)および生理学的機能が損なわれない限り、本発明に従って使用し得る。該技術は、該核酸が該細胞によって発現可能であり、好ましくは遺伝されてその子孫細胞によっても発現可能なように、該核酸の細胞への安定した導入をもたらすはずである。得られた組換え細胞は、当該技術分野において公知の種々の方法により患者に送達することができる。好ましい実施態様では、上皮細胞が注射される（例えば皮下注射）。もう一つの実施態様では、組換え皮膚細胞を皮膚移植片として患者に適用してよい。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞もしくは造血先祖細胞）は静脈投与されることが好ましい。使用のために計画される細胞の量は、所望の作用、患者の病状などに依存し、当業者により決定することができる。遺伝子療法の目的で核酸を導入することができる細胞は、何れの所望の利用可能な細胞タイプをも包含し、限定されるものではないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、繊維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のごとき血液細胞；種々の幹細胞もしくは先祖細胞、特に造血幹細胞もしくは造血先祖細胞（例えば、骨髄、臍帯血、抹消血液、胎児肝臓などから得られるごとき）を含む。好ましい実施態様では、遺伝子療法に使用される細胞は患者の自己細胞である。組換え細胞が遺伝子療法に使用される実施態様では、FHIT核酸を細胞に導入し、該細胞もしくはその子孫細胞によって発現させ、次いで該組み換え細胞を治療学的効果のためにイン・ビボで投与する。特定の実施態様では、幹細胞もしくは先祖細胞が使用される。イン・ビトロで単離し、維持できる何れの幹および／もしくは先祖細胞も、本発明のこの実施態様に従って使用することが潜在的に可能である。かかる幹細胞には、限定されるものではないが、血液幹細（ＨＢＣ）、皮膚および消化管の内層細胞のごとき上皮組織の幹細胞、胚の心筋細胞、肝臓幹細胞（１９９４年４月２５日付けＰＣＴ国際公開ＷＯ９４／０８８９８）および神経幹細胞（StempleおよびAnderson，1992，Cell，71:973-985）が含まれる。上皮幹細胞（ＥＳＣ）もしくはケラチノサイトは、公知の手順（Rheiwald，19 80，Meth．Cell Bio．21A:229）により、皮膚および消化管の上層細胞のごとき組織から得ることができる。皮膚のごとき層を形成する上皮組織においては、基底層に最も近い層である、胚細胞層中の幹細胞の有糸分裂により、再生が起こる。消化管の内層細胞中の幹細胞は、この組織の迅速な再生速度を提供する。患者もしくは供与者の皮膚または消化管の内層細胞から得られたＥＳＣもしくはケラチノサイトは組織培養で増殖させることができる（Rheinwald，1980，Meth．Cel l Bio．21A:229；PittelkovおよびScott，1986，Mayo Clinic Proc．61:771）。該ＥＳＣがドナーにより提供された場合、宿主対移植片の反応性を抑制するための方法（例えば、適度な免疫抑制を促進するための照射、薬物もしくは抗体投与）もまた使用できる。造血幹細胞（ＨＳＣ）に関しては、本発明のこの実施態様において、ＨＳＣのイン・ビトロにおける単離、増殖および維持を提供する何れの技術でも使用できる。これが達成され得る技術には、（ａ）将来の宿主もしくは供与者から単離された骨髄細胞由来のＨＳＣ培養物の単離および樹立、もしくは（ｂ）（同種内または異種間であってよい）予め樹立された、長期培養ＨＳＣの使用が含まれる。非自己のＨＳＣは、将来の宿主／患者の移植免疫反応を抑制する方法と併用されることが好ましい。本発明の実施態様では、ヒト骨髄細胞は後腸骨稜から吸引用針を用いて得ることができる（例えば、Kodoら，1984 J．Clin．Invest．73:137 7-1384参照）。本発明の好ましい実施態様では、該ＨＳＣは高濃度もしくは実質的に純粋な形態で作製することができる。かかる高濃度は、長期培養の前、長期培養中もしくはその後に達成されてもよいし、当該技術分野において公知の他の何れの技術を用いて達成されてもよい。例えば部分的に変更したＤｅｘｔｅｒ細胞培養法（Dexterら，1977，J．CellPhysiol．91:335）、Ｗｉｔｌｏｃｋ−Ｗｉｔｔｅの培養法（WitlockおよびWitte，1982，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79: 3608-3612）を用いることにより、骨髄細胞の長期培養を確立および維持することができる。ある特定の実施態様では、遺伝子療法の目的で導入される該核酸は、作動可能なようにコーディング領域に連結した誘導性のプロモーターを含み、その結果、適当な転写誘発剤の存在または不在を制御することにより、該核酸の発現を制御が可能になる。 Fhitタンパク質もしくはその機能的誘導体をコードする核酸を送達させるために用いられる別の方法は、第５．８．５節に記載されている。 5.8.5 過剰増殖障害の治療および予防のための優性ネガティブFHIT変異に対する拮抗また本発明は、変異型FHIT遺伝子もしくは蛋白質（野生型のFHITまたはFhitではなく）に特異的に拮抗する（アンタゴニストを投与する）ことにより、患者が半接合のFHIT変異（おそらく優性ネガティブFHIT変異）を有する過剰増殖障害（例えば、癌、過増殖性障害）を治療もしくは予防する方法をも提供する。例えば、本明細書の第5.11.節および第６節に記載された方法により、患者由来のサンプル中の正常型および変異型双方のFHIT ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）もしくはＲＮＡの存在を観察することによりFHIT変異の半接合が検出できる。例えば、１つの特定の実施態様では、該変異体型FHIT遺伝子の発現を阻害するが野生型FHIT遺伝子は阻害しない有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。例えば、患者における半接合性FHIT変異が、少なくとも１以上のFHITエクソンの促なくとも一部分の欠失である場合、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、欠失により形成された、変異型FHIT遺伝子に存在するが野生型FHIT遺伝子には存在しない接合部と相補的にハイブリダイズできる配列を含む得る。かくして、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、野生型FHIT ｃＤＮＡにおいては本来隣接が認められない、２つのエクソン由来の隣接配列と相補性のある配列を含む。もう一つの特定の実施態様では、治療的にもしくは予防的に該半接合性Fhit変異型蛋白質に特異的に拮抗する抗体を使用することができる。例えば、かかる抗体は、野生型Fhit蛋白質においては本来は隣接しない配列の融合によって形成されたFhit欠失変異体のエピトープを特異的に認識することができる。治療の目的で、Fhit変異型蛋白質を、野生型Fhit蛋白質ではなくFhit変異型蛋白質の活性を中和する抗−Fhit抗体を作製するための免疫原として使用することができる。従って、本発明は、治療上有効量の、異常性FHIT遺伝子または蛋白質に特異的な抗 −Fhit抗体を、FHIT異常に関連する病状に苦しむ哺乳類に投与することを夫君でなる、FHIT異常に関連する病状に苦しむ哺乳類において、FHIT異常に関連する病状を治療する方法を提供する。もう一つの特定の実施態様では、特にそのような変異が優性ネガティブなものであると考えられている場合、該変異体を“ノックアウト”する（作用を阻害する）目的で、患者の変異型FHIT遺伝子との相同組換えを特異的に促進するように、FHIT配列に隣接する非−FHIT配列から成る組換え核酸を患者に導入する。アンチセンスオリゴヌクレオチドについては、以下にさらに詳細に記載されている。 5.8.5.1.変異型FHIT遺伝子発現のアンチセンス調節特定の実施態様では、FHITアンチセンス核酸の使用により、FhitもしくはFHIT の変異型の機能が特異的に阻害される。本発明は、変異型Fhitをコードする遺伝子またはｃＤＮＡに対してアンチセンスである、少なくとも６ヌクレオチドの核酸の治療的もしくは予防的使用を提供する。本明細書で使用されるFHIT「アンチセンス」核酸とは、（ポリＡ尾部のごとき非特異的配列に対するもの以外）いくつかの配列の相補性により、FHIT ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）もしくはその変異形態の一部とハイブリダイズできる核酸をいう。該アンチセンス核酸はFHIT ｍＲＮＡのコーディングおよび／または非コーディング領域に対して相補的であってよい。かかるアンチセンス核酸は、優性ネガティブ変異型Fhit機能を阻害する治療薬として有用性を有し、前記第5.8.節およびそのサブセクションに記載したような障害の治療もしくは予防に使用できる。本発明のアンチセンス核酸は、二本鎖もしくは一本鎖の、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはそれらの修飾体もしくは誘導体であるオリゴヌクレオチドであってよく、それは細胞に直接投与されてもよいし、または導入された外来配列の転写により細胞内で産生されてもよい。さらに本発明は、第5.10節に記載されたごとく、製剤学上許容しうる担体中に本発明のFHITアンチセンス核酸の有効量を含む医薬組成物を提供する。もう一つの実施態様では、本発明は、本発明のFHITアンチセンス核酸を含む組成物を有効量にて該細胞に与えることを含んでなる、原核生物もしくは真核生物細胞におけるFHIT変異型核酸配列の発現を特異的に阻害する方法に関する。該FHITアンチセンス核酸は少なくとも６個のヌクレオチド、好ましくはオリゴヌクレオチドを含む(６〜約50個の範囲のオリゴヌクレオチド)。具体的態様において、該オリゴヌクレオチドは少なくとも10個のヌクレオチド、少なくとも15個のヌクレオチド、もしくは少なくとも100個のヌクレオチド、少なくとも200個のヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、もしくはそれらのキメラ混合物、、誘導体または修飾体であってよく、一本鎖もしくは二本鎖であってもよい。該オリゴヌクレオチドは塩基部分、糖部分、もしくはリン酸骨格で修飾することができる。該オリゴヌクレオチドはペプチド、もしくは細胞膜を通過する輸送を容易にする試薬（例えば、Letsingerら，1989，Proc.Natl ．Acad．Sci．U.S.A．86:6553-6556；Lemaitreら，1987，Proc．Natl．Acad.Sci ．84:648-652；1988年12月15日公開のＰＣＴ国際公開第WO88/09810参照）もしくは血液−脳関門の輸送を容易にする試薬（例えば、1988年４月25日公開のＰＣＴ国際公開第WO89/10134号参照）、もしくはハイブリダイゼーション−トリガー切断剤（例えば、Krolら，1988，BioTechniques 6:958-976参照）、もしくは挿入試薬（例えば、Zon，1988，Pharm．Res．5:539-549参照）のごとき他の付加物質群を含んでもよい。本発明の好ましい態様では、FHITアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供され、好ましくは一本鎖ＤＮＡが提供される。最も好ましい態様では、かかるオリゴヌクレオチドは、FHIT遺伝子欠失変異体における、最も好ましくはヒトFHIT遺伝子突然変異体における通常は隣接しない２つの配列の接合部に対してアンチセンスな配列を含有する。該オリゴヌクレオチドは当該技術分野で一般的に公知の置換基によりその構造上の何れの位置で修飾されてもよい。該FHITアンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、５− フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β− Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１ −メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５− メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）Ｗおよび２，６−ジアミノプリンよりなる群から選択される少なくとも１つの修飾塩基部分を含んでよい。もう一つの実施態様では、該オリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む群から選択される少なくとも１つの修飾糖部分を含む。さらにもう一つの実施態様では、該オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタールまたはその類似体よりなる群から選択される少なくとも１つの修飾ホスフェート骨格を含む。さらにもう一つの実施態様では、該オリゴヌクレオチドはα−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、そこで通常のβ−ユニットに反してその鎖が互いに平行に走る、相補的ＲＮＡと特異的２本鎖ハイブリッドを形成する(Gautierら，1987，Nucl.Acids Res．15:6625-6641)。該オリゴヌクレオチドは別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーショントリガー架橋因子、輸送因子、ハイブリダイゼーション−トリガー切断因子などに結合させてもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは当該技術分野において公知の標準的方法により、例えば、（Biosearch，Applied Biosystemsなどから商業的に入手できるごとき）自動ＤＮＡ合成機の使用により合成してもよい。これらには、例えば固相ホスホルアミダイト化学合成のごとき当該技術分野で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成するための技術が含まれる。例としては、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはSteinら(1988，Nucl．Acids Res．16:3209)の方法により合成してよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御細孔ガラスポリマー支持体の使用により調製することができる（Sarinら，1988，Proc．N atl.Acad．Sci．U.S.A．85:7448-7451)など。別法として、ＲＮＡ分子を、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のイン・ビトロおよびイン・ビボ転写により作製してよい。かかるＤＮＡ配列を、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターのごとき適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター組み込んだ多種多様なベクターに組み込んでもよい。別法として、使用されるプロモーターに応じて構成的にまたは誘導可能なようにアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築体を細胞系へ安定に導入することもできる。具体例では、該FHITアンチセンスオリゴヌクレオチドは触媒性ＲＮＡ、すなわちリボザイムを含む（例えば、1990年10月４日公表のＰＣＴ国際特許WO90 /11364；Sarverら，1990，Science 247:1222-1225参照）。リボザイムとは、ＲＮＡの特異的切断を触媒する能力を持つ酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機構は、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続くエンドヌクレオチド分解切断を含む。変異型FHIT ＲＮＡ配列のエンドヌクレオチド分解切断を特異的かつ効果的に触媒する、工学的に作製されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は本発明の範囲内である。任意の可能性あるＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位も、ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣの配列を含むリボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることにより最初に同定される。一旦同定されれば、該切断部位を含有する標的遺伝子の領域に相当する15〜20個のリボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列を、該オリゴヌクレオチド配列を不適切なものにする可能性がある二次構造のごとき推定される構造特性に関して評価してよい。また、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの受け易さを試験することにより、候補となる標的の適合性を評価してもよい。もう一つの実施態様では、該オリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド(Inoueら，1987，Nucl．Acids Res．15:6131-6148)、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(Inoueら，1987，FEBS Lett．215:327-330)である。別の実施態様では、本発明のFHITアンチセンス核酸は外来配列からの転写により細胞内で産生される。例えば、ベクターをイン・ビボにて導入して、それを細胞に取り込ませ、その細胞内で該ベクターまたはその一部を転写させ、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生させることができる。かかるベクターは該FH ITアンチセンス核酸をコードする配列を含むであろう。かかるベクターはエピソームに留まるか、または染色体に組み込まれ、それが転写可能な限り所望のアンチセンスＲＮＡを産生する。かかるベクターは当該技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技術により構築することができる。ベクターはプラスミド、ウイルスまたは哺乳類細胞での複製および発現のために用いられる当該技術分野において公知の他のものであってよい。該FHITアンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞で働く当該技術分野において公知の何れのプロモーターによるものでもよい。かかるプロモーターは誘導可能または構成的であり得る。かかるプロモーターとしては、限定されるものではないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域(BernoistおよびChambon，1981，Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列中に含まれるプロモーター(Yamamotoら，1980，Cell 22:7 87-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら，1981，Proc．Natl ．Acad．Sci．U.S.A．78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brin sterら，1982，Nature 296:39-42)などがある。本発明のアンチセンス核酸はFHIT遺伝子、好ましくはヒト変異型FHIT遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に対して相補的な配列を含む。しかしながら、絶対的な相補性は好ましいけれども必要ではない。本明細書でいう「ＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的な」配列とは、該ＲＮＡとハイブリダイズして安定した二重らせんを形成できるに十分な相補性を有する配列を意味する：かくして二重らせんFHITアンチセンス核酸の場合には、該二重らせんＤＮＡの一本鎖を試験してよく、もしくは三重らせん形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズ能力は相補性の程度およびそのアンチセンス核酸の長さの双方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、より多くの塩基がFHIT ＲＮＡと誤対合し、それは安定した二重らせん（また、あり得る場合として三重らせん）を含み、また依然としてそれを形成する。当業者ならばハイブリダイズした複合体の融点を求めるための標準的な手順の使用により誤対合の許容程度を確認することができる。該FHITアンチセンス核酸を用いて変異型FHIT ＲＮＡを発現することが示された細胞種の悪性腫瘍または過増殖性障害を治療（もしくは予防）することができる。かかる発現について試験可能な悪性腫瘍、新形成および前−新形成細胞としては、限定されるものではないが、前掲の第5.8.節で記載したものが含まれる。好ましい具体例では、一本鎖ＤＮＡアンチセンスFHITオリゴヌクレオチドが用いられる。 FHIT ＲＮＡを発現する悪性（特に、腫瘍）細胞種は、当該技術分野において公知の種々の方法によって同定することができる。かかる方法には、限定されるものではないが、FHIT−特異的核酸とのハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、in sit uハイブリダイゼーションによる）、該細胞種由来のＲＮＡのイン・ビトロでのF hit蛋白質へと翻訳される能力を観察することなどが含まれる（第5.11.節の診断ついて記載したアッセイを参照）。好ましい態様において、患者からの初代腫瘍組織は、治療の前に、FHIT発現についてアッセイできる。医薬上許容される担体中に有効量のFHITアンチセンス核酸を含有する本発明の医薬組成物を、そのアンチセンス核酸により特異的に拮抗される変異型FHIT ＲＮＡを発現するタイプである悪性腫瘍を有する患者に投与することができる。特定の病状または症状の治療に有効であろうFHITアンチセンス核酸の量は該病状または症状の性質に依存すると考えられ、標準的な臨床技術により決定できる。可能であれば、イン・ビトロにて、次いでヒトにおける試験および使用に先立ち通常の動物モデル系にて、治療される腫瘍種のアンチセンス細胞毒性を測定しておくことが望ましい。特定の実施態様では、FHITアンチセンス核酸を含む医薬組成物をリポソーム、微粒子またはマイクロカプセルを介して投与する。本発明の種々の実施態様では、かかる組成物を使用してFHITアンチセンス核酸の徐を達成することが有用であると考えられる。ある特定の実施形態では、特異的に認識できる腫瘍抗原に対する抗体により標的化されたリポソームを利用することが望ましいと考えられる(Leonettiら，1990，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 87:2448-2451; Renneisenら，1990，J．Biol．Chem.265:16337-1634 2)。本発明の特定の実施態様では、アンチセンスFHITオリゴヌクレオチドまたは患者に存在する変異型FHIT遺伝子または特異的に拮抗する抗−Fhit抗体をFHIT遺伝子療法（野生型Fhit機能の投与）または機能的Fhit蛋白質またはアゴニスト）と併用して患者に投与することができる。 5.9.治療または予防の有用性の実証本発明のFHITポリヌクレオチド、FHIT蛋白質産物、それらの誘導体および類似体、およびそれらに対する抗体、およびアンチセンス核酸を、所望の治療および予防活性に関して、イン・ビボで試験することができる。例えば、かかる化合物をヒトで試験する前に、限定されるものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどを含む適切な動物モデル系で試験することができる。イン・ビボでの試験の場合、ヒトへの投与に先立ち、当該技術分野において公知の何れの動物モデル系でも用いることができる。５．１０．治療／予防方法および組成物本発明は、有効量の治療薬、すなわち本発明のＦＨＩＴ核酸、ＦＨＩＴ蛋白質、それらの誘導体または類似体、またはそれらに対する抗体を被検者に投与することによる治療および予防する方法を提供する。好ましい態様では、該治療薬は、実質的に精製されている。該被験者は、好ましくは動物であり、限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ニワトリなどのごとき動物が含まれ、好ましくは哺乳類であり、最も好ましくはヒトである。該被験者は、胎児、子供、または成人であり得る。具体例では、該被験者はヒトでない哺乳類である。その治療薬が核酸を含む場合に使用できる処方および投与法は、前記の第５．８．４節および第５．８．５．１節に記載されている。さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書の下記に記載されるものの中から選択できる。種々の送達系が公知であり、例えば、リポソーム、超微粒子、マイクロカプセルへの被包、組換え細胞による発現、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば、WuおよびWu，1987，J．Biol.Chem.262:4429-4432参照）、レトロウィルスまたは他のベクターなどの一部としての治療用核酸の構築が本発明の治療薬の投与に使用できる。導入方法としては、限定されるものではないが、皮膚内、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、鼻腔内、および経口経路が挙げられる。化合物は何れの都合のよい経路によって、例えば、点滴またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、経口粘膜、直腸および腸の粘膜など）からの吸収によって投与されてよく、他の生物学的に活性のある薬剤とともに投与してもよい。投与は、全身または局所であってよい。さらに、脳室内および鞘内注射を含む、任意の適切な経路により、本発明の医薬組成物を中枢神経系へ導入することが望ましく、脳室内注射は、例えばオマヤレザバーのごときレザバーに取り付けた脳室内カテーテルによって補助され得る。具体例では、本発明の医薬組成物を局所的に、治療を必要とする領域へ投与することが望ましく、これは、例えば、限定されるものではないが、手術中の局部点滴によって、例えば手術後の傷の手当てに関連する局所外用薬によって、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、または移植によって達成されてよい。該移植は、シアラスチック(sialastic)膜のごとき膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状物質からなる。一つの具体例では、投与は、悪性腫瘍または新形成もしくは前−新形成組織のその部位（または前者の部位）への直接の注射によってもよい。具体例では、治療薬が蛋白質をコードする核酸治療薬である場合に、該核酸は適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築し、それが細胞内に来るように例えばレトロウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、または直接注射によって、または微粒子衝撃（例えば遺伝子銃、Biolistic，Dupont ）、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤での被覆の使用によりそれを投与することによって、あるいは核に入ることが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合してそれを投与することによって（例えば、 Joliotら、1991，Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ-88:1864-1868など参照）、イン・ビボにて投与してそれらがコードする蛋白質の発現を促進することができる。別法として、核酸治療薬を細胞内に導入し、相同組換えによって、発現のための宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。また本発明は、医薬組成物を提供する。かかる組成物は治療上有効量の治療薬、および医薬上許容される担体および賦形剤を含む。かかる担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられる。該担体および組成物は滅菌可能である。処方は、投与形態に適合させるべきである。該組成物はまた、所望により、少量の浸潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。該組成物は液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤、または散剤であってよい。該組成物は従来の結合剤およびトリグリセリドのごとき担体と共に坐剤として処方することができる。経口処方には、医薬級のマンニトール、ラクトース、でん粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのごとき標準的な担体を含んでよい。好ましい具体例では、該組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合させた医薬組成物として慣例法によって処方される。典型的には、静脈内投与用の組成物は滅菌した等張緩衝溶液である。必要であれば、該組成物はまた、可溶化剤および注射の部位の痛みを和らげるためのリグノカインのごとき局所麻酔剤を含んでもよい。一般に、該成分は別々にかまたは単位投与形で、例えば、有効剤の量を示すアンプルまたはカプセルのごとき密封容器中の凍結乾燥散剤または水を含まない濃縮物として、共に混合されるかの何れかで供給される。該組成物を点滴として投与する場合には、それは、滅菌した医薬級の水または生理食塩水を含む点滴瓶で調剤される得る。該組成物を注射により投与する場合には、投与に先立ち成分を混合するために、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供できる。本発明の治療薬は中性または塩の形態として処方され得る。医薬上許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されたもののごとき遊離アミノ基を用いて形成されたもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されたもののごとき遊離カルボキシル基を用いて形成されたものが挙げられる。特定の障害または症状の治療に有効である本発明の治療薬の量は、該障害または症状の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、イン・ビトロでのアッセイが、最適な投与量範囲の同定を助けるために所望により使用されてよい。また、処方に用いられる正確な投与量は、投与経路および疾病または障害の重篤度に依存するであろうし、開業医の診断および各患者の状況に従って決定されるべきである。しかしながら、静脈内投与のための適切な投与量範囲は、一般に、体重１キログラム当たり有効化合物が約２０−５００マイクログラムである。鼻腔内投与のための適切な投与量範囲は、一般に、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重ないし１ｍｇ／ｋｇ体重である。イン・ビトロまたは動物モデル試験系から誘導した投与量−反応曲線から、有効量を外挿すればよい。一般に坐剤は０．５重量％ないし１０重量％の範囲で有効成分を含み、経口処方は、好ましくは１０％ないし９５％の有効成分を含む。また本発明は、本発明の医薬組成物の１以上の成分で満たした１以上の容器からなる医薬パックまたはキットを提供する。所望により、かかる容器に付随して、医薬または生物学的生成物の製造、使用または販売を取り締まる政府機関によって規定された形態での通告が可能であり、その通告はヒトへの投与のための製造、使用または販売の代理店による承認を反映させている。５．１１．診断上の使用ＦＨＩＴポリヌクレオチドおよびそれに対して相補性のある核酸、そのＦｈｉｔ蛋白質生成物、その断片、およびそれに対する抗体が、細胞の過剰増殖に関与する障害、並びに染色体の転座および逆位またはＦＨＩＴ遺伝子に関連した分子の異常、および／または野生型ＦＨＩＴＲＮＡまたは蛋白質の発現の低下に関連する他の障害を診断する目的で用いることができる。またかかる分子は、種々の症状、疾病、および変異型ＦＨＩＴ転写物の発現に関連する障害を検出し、予測し、診断し、または監視し、あるいはそれらの処置を監視するために、イムノアッセイのごとき診断アッセイに用いることができる。従って、具体例では、（実験的に決定したごとき、またはかかるサンプルの標準レベルとして公知であるごとき、患者からまたは他の人からの）類似の病気でないサンプル中でのＦＨＩＴ発現に関する患者サンプルにおいて、組織中の癌または前悪性変化、または過増殖または良性の増殖異常障害を、１以上の変異型ＦＨＩＴ転写物の存在を、単独でまたは野生型ＦＨＩＴ転写物の発現における低下と組み合わせて検出することにより診断する。診断目的では、ＦＨＩＴポリヌクレオチドを、病状における変異型ＦＨＩＴ遺伝子発現の検出に用いてよい。被験者または患者は、動物、例えば哺乳類であり、好ましくはヒトであり、胎児、子供、または成人であってよい。後記に例示するごとくに、ＦＨＩＴ遺伝子配列は癌に関連しており、特にＦＨＩＴ遺伝子内の転座および欠失に関連している。具体例では、野生型Ｆｈｉｔ蛋白質、野生型ＦＨＩＴＲＮＡ、またはＦｈｉｔ機能活性の減少レベルを検出することによって、またはＦｈｉｔの発現または活性の低下または優勢ネガティブ効果を引き起こす、ＦＨＩＴＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または蛋白質（例えば、ＦＨＩＴ核酸中の転座または欠失、ＦＨＩＴ遺伝子または蛋白質中の切断、野生型Ｆｈｉｔに関するヌクレオチドまたはアミノ酸配列における変化）における突然変異を検出することにより、細胞の過剰増殖に関与する疾病および障害を診断することが可能であり、またはそれらの疑わしい存在をスクリーニングすることが可能であり、またはかかる障害が現れる素質を検出することが可能である。かかる疾病および障害としては、限定されるものではないが、第５．８節およびその次の節に記載されたものが含まれる。例によって、Ｆｈｉｔ蛋白質のレベルをイムノアッセイによって検出し、ＦＨＩＴＲＮＡのレベルをハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロット、ドットブロット）またはＲＴ −ＰＣＲによって検出し、ＦＨＩＴ核酸中の転座、欠失、および点突然変異を、患者から得たＦＨＩＴゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの配列を決定する、ＦＨＩＴ遺伝子の少なくともほとんどに及ぶ断片を生じさせることが好ましいプライマーを用いるサザンブロッティング、ＲＦＬＰ分析、ｃＤＮＡのＰＣＲによって検出することができる。好ましい具体例では、患者のサンプル中のＦＨＩＴｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）または蛋白質のレベルを検出または測定、あるいは大きさおよび／または配列により分析し、そこで被験者が異常なレベル、大きさまたは配列を被験者が持っている、もしくは悪性または過増殖性障害が現れる素質を持っていることを示す。そこでのレベルの低下は、身体の一部由来のまたは事情次第で悪性または過増殖性障害を持たない被験者由来の類似サンプル中に存在するレベルに対する相対的なものである。ＦＨＩＴ遺伝子配列は、染色体または分子の異常性、例えばＦＨＩＴ遺伝子を含む転座、逆位および欠失の結果生じる病状の検出のために診断として用いられてよい。少なくとも８個のヌクレオチド、少なくとも１５個のヌクレオチド、少なくとも２５個のヌクレオチド、少なくとも５０個のヌクレオチド、少なくとも１００個のヌクレオチド、少なくとも２００個のヌクレオチド、少なくとも３００個のヌクレオチド、および好ましくは５００個より少ないヌクレオチドのＦＨＩＴヌクレオチド配列、および第５．１節に記載されている核酸を含む核酸が、ＦＨＩＴ遺伝子配列の検出および測定のためのハイブリダイゼーションアッセイにおいてプローブとして用いられ得る。ＦＨＩＴ遺伝子、ｃＤＮＡ、または相補鎖にハイブリダイズ可能である、５キロベース以下の、１０キロベース以下の、２５キロベース以下の、５０キロベース以下の、または７０キロベース以下の核酸は、ＦＨＩＴヌクレオチド配列の検出および測定のためのハイブリダイゼーションアッセイにおいてプローブとして用いることができる。例として、ＦＨＩＴＤＮＡ配列を、ハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、ＦＨＩＴ発現の異常性を診断するために患者のサンプルについてのｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを含むサザンまたはノーザン分析に用いることができる。ハイブリダイゼーションアッセイは、前記したごとくにＦＨＩＴ発現および／または活性における異常な変化に関連する悪性腫瘍を検出、予測、診断、または監視するために用いることができる。特に、かかるハイブリダイゼーションアッセイは、ハイブリダイゼーションが起こり得るような条件下で、核酸を含むサンプルをＦＨＩＴＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡとハイブリダイズすることが可能な核酸プローブと接触させ、次いで結果起こる何れのハイブリダイゼーションをも検出または測定することを特徴とする方法によって行われる。特に、ハイブリダイゼーションアッセイは、患者のサンプル由来のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡをＦＨＩＴプローブにハイブリダイズさせ、次いで結果生じたハイブリダイズした核酸の大きさおよび／または配列を分析することにより、変異型ＦＨＩＴｍＲＮＡの発現に関連する異常性の存在を検出するのに用いることができる。例えば、用いることのできるアッセイとしては、限定されるものではないが、ノーザンブロット、ドットブロットなどが挙げられる。特定のハイブリダイゼーションアッセイには、図２Ａに示される全長ｃＤＮＡ配列までの少なくとも１５個のヌクレオチドを有するＦＨＩＴ遺伝子プローブを用いた、患者のサンプルのノーザンブロット分析がある。他のハイブリダイゼーションアッセイとしては、抗−ＦＨＩＴ抗体またはＦＨＩＴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを用いた、患者のサンプルのｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析がある。かかる技術は当該技術分野においては周知であり、事実多くの市販されている診断キットの基礎となっている。具体例では、癌または他の細胞過剰増殖の障害（例えば、前記第５．８．１− ５．８．３節において記載されているもの）を、患者から誘導したサンプル中のＦＨＩＴ遺伝子またはその生成ＲＮＡにおける変異を検出することによって、診断または予測する。該変異は、転座、欠失、挿入または置換／点突然変異であり得る。好ましい具体例では、該変異とは少なくとも１つのコーディングエキソン（すなわち、エキソン５、６、７、８または９）、好ましくはエキソン５またはエキソン８の全てまたは一部の欠失である。好ましい具体例では、該欠失は同型接合性欠失である。もう一つの具体例では、該突然変異は患者のＦＨＩＴＲＮＡにおいて、エキソン８の上流のフレームシフトを引き起こすか、またはそうでなければエキソン８の野生型オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の欠失を引き起こす突然変異である。他の具体例では、該突然変異はＦＨＩＴＲＮＡまたはｃＤＮＡにおけるエキソン７配列へのエキソン３配列の融合の結果であるＦＨＩＴエキソン４−６の欠失であるか、または該突然変異はＦＨＩＴＲＮＡまたはｃＤＮＡにおけるエキソン９配列へのエキソン３配列の融合の結果であるＦＨＩＴエキソン４−８の欠失である。もう１つの具体例では、検出される突然変異はＦＨＩＴ遺伝子のコーディング領域への挿入またはエキソン４の下流での挿入、またはエキソン４と５との間の５’非コーディング領域内での挿入である。具体例では、ＦＨＩＴ遺伝子コーディング配列における突然変異は、被験者由来の異常な大きさのＦＨＩＴｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ（すなわち、ＦＨＩＴＲＮＡまたはｃＤＮＡは、（ＦＨＩＴ突然変異、例えば、約１．１ｋｂ転写物と関連する癌を有していないまたは前処置されていない正常な個体中に存在するまたは存在することが期待される）野生型ＦＨＩＴＲＮＡとは異なる大きさを有する）を検出することによって検出される。もう１つの具体例では、診断または予測は被験者由来の異常な大きさのＦＨＩＴｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ、並びに被験者中の１つのＦＨＩＴ対立遺伝子の欠失を検出することによって行われる。プライマー依存性核酸増幅法におけるプライマーとして有用である、少なくとも８ないし２５個のヌクレオチドからなるＦＨＩＴのポリヌクレオチド配列は、患者のサンプル中の変異型ＦＨＩＴゲノムまたはＲＮＡ配列の検出に用いてよい。本発明において有用なプライマー依存性核酸増幅法には、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、競合ＰＣＲ、環状プローブ反応、およびリガーゼ連鎖反応が含まれる。かかる技術は、当業者にとっては周知である。本発明の好ましい核酸増幅法は、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）(Siebertら、1992,Nature 359:557-558)である。本発明の特定の具体例では、プライマー依存性核酸増幅法に用いるための一対のプライマーの各プライマーを、ゲノムＦＨＩＴヌクレオチド配列の異なるエキソンから選択する。例えば、一対のプライマーの一方のプライマーをＦＨＩＴゲノム配列のエキソン１から選択する場合には、第二のプライマーはＦＨＩＴゲノム配列のエキソン２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択されよう。もう１つの例としては、一対のプライマーの一方のプライマーをＦＨＩＴゲノム配列のエキソン２から選択する場合には、第二のプライマーはＦＨＩＴゲノム配列のエキソン１、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される。得られた増幅ゲノムヌクレオチド配列は、増幅したイントロン配列を含み、かつ、増幅したイントロン配列を含まない増幅ｃＤＮＡヌクレオチド配列よりも大きい。同様に、欠失突然変異を有する増幅ｃＤＮＡ配列は、結果として生じる増幅配列の大きさの違いによって増幅した野生型配列と区別することができる(該欠失突然変異体はより短い増幅断片を生じる)。ｃＤＮＡヌクレオチド配列の増幅に関しては、該プライマー配列は、検出可能な増幅ヌクレオチド配列を提供するために十分に遠く離れたエキソン配列から選択されるべきである。具体例では、癌または他の細胞増殖の障害またはそれらに対する疾患素質は、以下のようなＦＨＩＴ遺伝子内の突然変異を検出することによって、被験者において検出または診断される：患者の組織または細胞のＲＮＡを含むサンプルを得、該ＲＮＡを当該技術分野において一般に知られている方法によってｃＤＮＡに逆転写させ、好ましくはこの工程に続いてｃＤＮＡ内のＦＨＩＴコーディング配列からなる断片を増幅させ、増幅した断片内のＦＨＩＴコーディング配列内の１以上の突然変異を検出する。該増幅は、当該技術分野において公知の何れの適切な方法によるものであってもよく、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる。ＲＴ−ＰＣＲは、ゲノム中のＦＨＩＴ遺伝子のサイズが大きい（＞５００ｋｂ）ために好ましく、それはゲノムサンプル由来のほとんどのＦＨＩＴエキソンを含む単断片を増幅できなくする一方で、かかる断片の増幅はｃＤＮＡサンプルから容易に達成される。ＰＣＲに用いるためのプライマーは、互いに向かうポリメラーゼによって合成を誘導する上流および下流プライマーであり、好ましくは８− ３５個のヌクレオチドの範囲であり、好ましくはＦＨＩＴｍＲＮＡ中の１０− ２，０００個のヌクレオチドの範囲で分断されている。好ましい具体例では、各々のプライマーはＦＨＩＴ遺伝子のエキソンの中にまたはＦＨＩＴ遺伝子のエキソン（に対して５’または３’）に隣接する２００個のヌクレオチドの中に含まれたハイブリダイズ可能な配列を含む。具体例では、第一プライマーは（好ましくはそれに対してエキソン４または５’の配列を含む）エキソン５に対して５’ でハイブリダイズし、第二プライマーは（野生型ＦＨＩＴｃＤＮＡ由来の増幅断片がエキソン５を含むように）エキソン５と６との間のイントロンに対して他の鎖５’でハイブリダイズする。もう一つの具体例では、第二のプライマーは、エキソン６に対する他の鎖５’でハイブリダイズする。他の具体例では、第一および第二プライマーはそれぞれ、エキソン４の３’末端に対する反対鎖５’およびエキソン８に対する５’；エキソン４の３’末端に対する５’およびエキソン９に対する５’；およびエキソン１に対する５’およびエキソン１０に対する５ ’でハイブリダイズし、その結果増幅された断片は、それらがｃＤＮＡ中に存在するべきハイブリダイズするプライマー間に通常存在するエキソン配列を含むであろう。かくして、例えば、前記した例において、ＰＣＲプライマー対はそれぞれ、ＦＨＩＴエキソン５、エキソン５に加えてエキソン６、エキソン４およびエキソン８の３’末端の間の配列、エキソン４およびエキソン９の３’末端の間の配列、およびエキソン１ないし１０を含む野生型ＦＨＩＴｃＤＮＡの断片を増幅するのに適応させる。ｃＤＮＡ中に１以上の突然変異が存在することを、（野生型ＦＨＩＴ転写物によって産生されたそれらの断片と比較して）異常な大きさの（好ましくは増幅した）断片を検出することによって、例えば、アガロースゲル電気泳動またはカラムクロマトグラフィーによるごときサイズ分離にｃＤＮＡをかけることによって検出することができる。好ましい具体例では、ｃＤＮＡ中に１以上の突然変異が存在することを、ｃＤＮＡの、またはさらに好ましくは、ｃＤＮＡから増幅して単離した断片の配列決定によって検出する。該増幅断片を、当該技術分野において公知の方法、例えば、アガロースゲル電気泳動およびゲルバンドおよび／またはカラムクロマトグラフィーからの回収によって単離することができる。かかる配列決定は、当該技術分野において一般的に知られている標準法によって行うことができ、自動であっても手動であってもよい。さらなる具体例では、患者由来のＦＨＩＴ遺伝子またはｍＲＮＡ中の突然変異を、当該技術分野において一般的に知られている他の方法、例えば、ノーザンハイブリダイゼーションによって検出することができる。例として、限定されるものではないが、患者の組織由来のＲＮＡをゲル電気泳動によって分離し、濾紙または他の固相に移し、標識したＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。次いでハイブリダイズしたＲＮＡを、該標識を検出することによって視覚化する。好ましくは、ＦＨＩＴｃＤＮＡの異なる部分由来の多数のＤＮＡプローブが用いられる。もう１つの具体例では、サザンハイブリダイゼーションをＦＨＩＴＤＮＡ中の総突然変異を検出するのに用いることができる。例えば、患者から単離したゲノムＤＮＡをゲル電気泳動によって分離し、濾紙または他の固相に移し、ＦＨＩＴプローブ（例えば、検出可能な標識に添えたＦＨＩＴ遺伝子配列を含むオリゴヌクレオチド）とハイブリダイズさせる。好ましくは、ＦＨＩＴプローブの多様性を用い、各々のコーディングエキソン内の配列とハイブリダイズ可能であり、特に好ましくは、プローブを含めてエキソン５内の配列とハイブリダイズ可能である。もう１つの具体例では、ＦＨＩＴ遺伝子内の転座を、当該技術分野において一般的に知られている方法によって検出する。例えば、好ましい具体例では、患者由来のＦＨＩＴゲノムＤＮＡ、または、好ましくはＦＨＩＴｃＤＮＡ（例えば、全ポリＡｍＲＮＡのｃＤＮＡ）を、疑わしい転座接合部にわたって合成を誘導するプライマーの使用によりＰＣＲにかける。例えば、１つのプライマーは染色体３（好ましくはエキソン４のＦＨＩＴ遺伝子上流内、例えばエキソン１、２または３内の配列）にハイブリダイズ可能な配列を有し得、１つのプライマーは染色体８（転座事象の下流）とハイブリダイズ可能な配列を有し得る。断片の増幅は、染色体３と８との間の転座の存在を示す。プライマーで誘導することによりＰＣＲを行うことに加えてまたはそれに代えて、ＦＨＩＴ遺伝子内に配列を有する各々は（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーに関する前記の記載を参照）、少なくとも１つのＦＨＩＴ対立遺伝子がそれらの間の転座という事象によって破壊されないプライマー配列を含む場合にのみ、増幅断片が生じるいう結果になる。ＦＨＩＴ遺伝子中の同型接合性突然変異（両対立遺伝子における突然変異）の検出は、ＦＨＩＴ遺伝子中の（１つの対立遺伝子の）半接合性突然変異よりも、癌の存在、または癌になる素質のさらに厳しい指表であると考えられる。本明細書で用いられるごとくに、使用可能な患者のサンプルには、限定されるものではないが、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイに用いることができる新鮮なまたは凍結した組織サンプル、検体由来の細胞または組織および、一般にＦＨＩＴ核酸を測定または定量または分析するアッセイにおいて用いることができる核酸を含む患者サンプルが挙げられる。本発明のＦＨＩＴ遺伝子配列は、染色体３ｐ１４．２の異常、特に染色体８との転座および欠失を検出する診断に用いられ得る。従って本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列に相補性のある８ないし２５個のヌクレオチド、好ましくは１８ないし２５個のヌクレオオチドを有する第一プライマー、およびＦＨＩＴ遺伝子に対して末端小粒側または動原体側の領域に相補性のある第二プライマーを用いてサンプル中の標的配列を増幅させる工程(ここで、増幅した標的配列の存在が異常を示す)、その結果生じた何れの増幅標的配列をも検出する工程を含む、サンプル中の3p14.2異常を示す又は含む標的配列を検出する方法を提供する。また本発明は、増幅した標的配列の存在が、患者における癌または前癌状態の存在を示す変異型ＦＨＩＴ転写物を示す前記方法に従い、染色体３ｐ１４．２の異常を検出することを特徴とする、患者における染色体３ｐ１４．２の異常に関連する悪性腫瘍を診断する方法を提供する。結果として得られた増幅標的配列を、ゲル電気泳動で検出し、染色体３ｐ１４．２の異常を含まない正常サンプルまたは標準サンプルと比較する。ゲノムＤＮＡ標的配列の増幅は、長いＰＣＲ生成物を発生させることを要すると考えられる。長いＰＣＲ生成物を発生させるＰＣＲ技術は、Science(1994) 263:1564-1565に記載されている。長いＰＣＲ生成物を発生させるＰＣＲキットは、Perkin ElmerおよびTakara Shuzo Co.，Lt dから入手できる。また本発明は、少なくともエキソン１、２、３または４の中から選択したおよび少なくともエキソン７、８または９の中から選択したＦＨＩＴｃＤＮＡ配列、またはそれに絶対的に相補性のある配列を含む、１０キロベース以下の核酸プローブでサンプルをハイブリダイズさせ、次いでサンプル中のプローブと標的配列との間に結果起こる何れのハイブリダイゼーションの量をも検出または測定する工程を特徴とする、核酸サンプルにおいて染色体３ｐ１４．２の異常の少なくとも一部を示すまたは含む（それによって細胞の過剰増殖の障害の存在またはその疾病にかかる素質を示す）標的ヌクレオチド配列を検出する方法を提供する。別法として、該プローブはＦＨＩＴｃＤＮＡの少なくとも３１０個の隣接ヌクレオチド、またはＦＨＩＴｃＤＮＡコーディング配列の少なくとも２６６個の隣接ヌクレオチドを含む。サンプル中のプローブと標的配列との間に結果として生じるハイブリダイゼーションをゲル電気泳動を用いて検出することができ、異常を含まない正常サンプルまたは標準物質由来の標的配列と比較することができる。また本発明は、患者において増幅した標的配列の存在が悪性腫瘍の存在を示す前記の方法に従って、該ＦＨＩＴ異常を検出することを特徴とする、患者におけるＦＨＩＴ異常に関連する悪性腫瘍を診断する方法を提供する。ハイブリダイゼーションプローブと標的配列との間の絶対的な相補性は、好ましくはあるが、必要ではない。本明細書でいう「少なくとも一部に相補性がある」配列とは、核酸とハイブリダイズすることができ、安定なハイブリダイゼーション複合体を形成するに十分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度および核酸の長さの双方に依存する。一般に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、より多くの塩基がＦＨＩＴＲＮＡと誤対合し、安定な二重らせん（またはあり得る場合として三重らせん）を含みかつ形成し得る。当業者ならばハイブリダイズした複合体の融点を測定するための標準的な手段を用いることにより、誤対合の許容程度を確認することができる。本発明のさらなる態様は、ＦＨＩＴ遺伝子配列およびＦＨＩＴ蛋白質の検出または測定のための診断キットに関する。診断用途のためのキットが提供され、それは１以上の容器に抗−Ｆｈｉｔ抗体を含み、所望により該抗体に対する標識された結合パートナーを含む。別法として、該抗−Ｆｈｉｔ抗体を（検出可能なマーカー、例えば化学発光、酵素、蛍光、または放射性部分で）標識することができる。キットはまた、１以上の容器にＦＨＩＴＲＮＡをハイブリダイズすることが可能な核酸プローブを含むものを提供する。従って、本発明は、容器内に１０キロベース以下のプローブを含み、そしてエキソン１、２、３または４の少なくとも１つおよびエキソン７、８または９の少なくとも１つからなるＦＨＩＴｃＤＮＡ配列、またはその相補体からなる化合物を含む診断キットを提供する。別法として、該プローブは、ＦＨＩＴｃＤＮＡの少なくとも３１０個の隣接ヌクレオチド、またはＦＨＩＴｃＤＮＡコーディング配列の少なくとも２６６個の隣接ヌクレオチドを含む。別法として、本発明は、１以上の容器に少なくとも８ないし３５個、好ましくは８ないし２５個の一対のプライマー、少なくとも１つの該プライマーが配列番号１またはその相補体とハイブリダイズ可能であり、その中で該プライマーが増幅反応におけるｃＤＮＡ合成を誘導することが可能であるヌクレオチドを含む診断キットを提供する。具体例では、キットは１以上の容器にＦＨＩＴ核酸の少なくとも一部の適切な反応条件下で、（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、Innisら，1990，PCR Protocols,Academic Pr ess,Inc.，San Diego，CA参照）、リガーゼ連鎖反応（欧州特許第３２０，３０８号参照）、Ｑβレプリカーゼの使用、環状プローブ反応、または当該技術分野において公知の他の方法によって）増幅を誘導することが可能である一対のプライマー（例えば、８ないし３５個の大きさの範囲であるヌクレオチド）を含み得る。また本発明は、少なくとも１つのプライマーが配列番号１またはその補体とハイブリダイズ可能であり、そこで１つのプライマーがＦＨＩＴ遺伝子に対して末端小粒側または動原体側に局在しているＤＮＡ配列とハイブリダイズ可能である、診断キットを提供する。もう一つの具体例では、該キットは、診断アッセイに用いるため前記したごときプライマー対を含む。具体例では、該容器の前記した化合物の１つが、検出可能なようにラベルすることができる。キットは所望によりさらに、例えば標準物質または対照として用いるために、容器内に所定量の精製Ｆｈｉｔ蛋白質または核酸を含む。本発明の増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、競合ＰＣＲおよび競合逆転写酵素ＰＣＲ(Clementiら、1994，Genet Anal Tech Appl 11(1);1-6およびSiebertら、1992，Nature 359:557-558)、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡプローブおよびＲＮａｓｅ(ID Biomedical)を用いて標的配列を増幅させる環状プローブ反応、リガーゼ連鎖反応(Wuら、1989，Genemicｓ 4:560-569)であってよい。特定の具体例では、ＦＨＩＴの位置に関連する染色体異常を、１９９２年１１月１２日付けのＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／１９７７５号に記載されているごとくに検出することができる。具体例では、ハイブリダイゼーションアッセイに用いられるＦＨＩＴプローブは、検出可能なように標識される。かかる標識は当該技術分野において公知の何れのものであってもよく、限定されるものではないが、放射性標識、蛍光標識、ビオチン、化学発光性標識などが含まれる。用いるアッセイがプライマーを使用する具体例では、少なくとも１つのプライマーを検出可能なように標識することができる。もう１つの具体例では、プライマー対の１つが例えば磁気ビーズを捕捉するために提供する部分と結合する。抗−ＦＨＩＴ抗体を作製し、診断に用いて、患者サンプル中の変異型Ｆｈｉｔ蛋白質の存在および／または野生型Ｆｈｉｔ蛋白質の不在を検出し、それによって細胞の過剰増殖の障害のごとき染色体３ｐ１４．２の異常に関連する病状を同定してもよい。例えば、１つの具体例では、抗−Ｆｈｉｔ抗体と結合するアッセイによって変異型Ｆｈｉｔ蛋白質を検出または測定する場合、当該技術分野において公知の種々のイムノアッセイを用いることができ、限定されるものではないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射線検定法、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散検定法、（例えば、コロイド状金、酵素または放射性同位体標識を用いる）ｉｎｓｉｔｕイムノアッセイ、ウェスタンブロット、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、沈降反応、凝集検定法（例えば、ゲル凝集検定法、血球凝集検定法）、補体結合検定法、免疫蛍光検定法、蛋白質Ａ検定法、および免疫電気泳動検定法などが含まれる。１つの具体例では、一次抗体上の標識を検出することによって抗体結合を検出する。もう１つの具体例では、一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合を検出することによって一次抗体を検出する。さらなる具体例では、二次抗体が標識される。イムノアッセイにおける結合を検出するための当該技術分野において公知の多くの方法は、本発明の範囲内である。特に、かかるイムノアッセイを、免疫特異的結合が起こり得るような条件下で患者から誘導したサンプルを抗−Ｆｈｉｔ抗体と接触させ、次いで該抗体による何れの免疫特異的結合の量をも検出または測定することを特徴とする方法によって行う。具体例では、Ｆｈｉｔ蛋白質に対する抗体を用いて、ＦＨＩＴ蛋白質のレベルの上昇が病状を示すＦＨＩＴ蛋白質の存在について、患者の組織または血清サンプルをアッセイすることができる。本発明の１つの具体例では、該ＦＨＩＴ蛋白質を患者サンプルの免疫細胞化学によって検出および測定する。もう１つの具体例では、ＦＨＩＴ蛋白質またはＲＮＡのレベルを測定するアッセイを用いて、ＦＨＩＴの発現の増加に関連する疾病の治療を監視することができる。例えば、治療前に判明したレベルに比較しての治療後のＦＨＩＴＲＮＡまたは蛋白質のレベルの低下が、治療に対する好ましい応答を示すと考えられる。治療後のかかるレベルの増加は、治療に対する不十分な応答を示すと考えてよい。Ｆｈｉｔ蛋白質配列の検出に関して、本発明の診断キットは、１以上の容器に、所望により検出可能なように標識することができる抗−Ｆｈｉｔ抗体を含む。異なる具体例では、該キットは容器に抗体の標識された特異的結合部分を含む。本明細書で用いられる検出可能な標識とは、直接的にまたは間接的に検出可能なシグナルを提供する何れの標識をも意味し、例えば、酵素、放射性標識分子、蛍光分子、粒子、化学発光体、酵素基質、または補因子、酵素阻害剤、または磁気粒子が含まれる。本発明において検出可能な標識として有用な酵素の例としては、アルカリ性ホスファターゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼが挙げられる。種々の方法が注目する蛋白質に検出可能な標識を結合させるために利用でき、例えば、注目する蛋白質に酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼを結合させるための４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロ−フェニルスルホンのごとき二機能性試薬を使用が含まれる。次いで、結合した酵素を検出可能である反応生成物を生じる基質と反応させる。本発明は、免疫特異的結合が起こり得るような条件下で、患者サンプルを抗−Ｆｈｉｔ抗体と接触させ、次いで該抗体による何れの免疫特異的結合の量をも検出または測定することを特徴とする、患者サンプルにおいてＦｈｉｔ蛋白質を検出する方法を提供する。また該方法は好ましくは、該蛋白質を大きさの分画および／または配列決定にかけることを特徴とする。サンプルは、ＦＨＩＴ蛋白質、例えば組織切片を含む患者由来のいかなるサンプルであってもよい。病状を診断する際に、Ｆｈｉｔ蛋白質、誘導体および類似体の機能的活性を種々の方法によってアッセイしてよい。従って、本発明はまた、患者由来のサンプルにおいて変異型Ｆｈｉｔ蛋白質の発現を検出し、そこで変異型Ｆｈｉｔ蛋白質の存在が患者におけるＦＨＩＴ異常に関連する悪性腫瘍または他の障害の存在を示すことを特徴とする、患者において染色体３ｐ１４．２（ＦＨＩＴ）異常に関連する悪性腫瘍または他の障害を診断する方法を提供する。本発明の具体例では、細胞の過剰増殖の障害の出生前診断またはそれに対する前処置を行う。例えば、妊婦から最初に組織（例えば、血液細胞）を得ることができる。１人以上の妊婦がＦＨＩＴ突然変異を有している場合、かくして子によるこの突然変異の遺伝の可能性がることが示唆される場合には、次いで羊水穿刺または胎児の組織を採取するいくつかの他の方法を行って胎児の細胞を得、次いで前記したごとき方法（例えば、変異型ＦＨＩＴＲＮＡを検出するためのＲＴ −ＰＣＲ）によってＦＨＩＴ変異型ＤＮＡまたはＲＮＡまたは蛋白質の存在に関して試験することができる。もう１つの具体例では、ＦＨＩＴ蛋白質またはＲＮＡ発現のレベルを、疾病の進行を示す初期の被験者から誘導したサンプル中に存在するものと比較して、変異型Ｆｈｉｔ蛋白質またはＲＮＡ発現の出現または増加、および／または野生型Ｆｈｉｔ蛋白質またはＲＮＡ発現の減少または消失と共に、疾病の設定または監視のために用いてよい。病状へのＦｈｉｔ蛋白質の効果を変えるための、抗体、ペプチドまたは他の分子を監視し得る。例えば、ＦＨＩＴ遺伝子配列またはＦｈｉｔ蛋白質配列の発現を、前記に、例えば本発明のＦＨＩＴヌクレオチド配列、Ｆｈｉｔ蛋白質配列、それらの誘導体または類似体、またはそれらに対する抗体、またはアンチセンス核酸からなる治療組成物の投与の前と後の双方で記載したように検出し得る。もう１つの具体例では、ＦＨＩＴ突然変異、特に同型接合性のものの存在を、細胞の過剰増殖の障害を有する患者の障害の治療または再発に対する不利な結果の指示薬として用いることができる。他の方法も当業者においては公知であり、本発明の範囲内である。５．１２．Ｆｈｉｔアゴニストおよびアンタゴニストに関するスクリーニングまた、ＦＨＩＴ核酸、蛋白質および誘導体をＦＨＩＴ核酸、蛋白質または誘導体と特異的に結合する分子を検出するためのスクリーニングアッセイにおける用途を持ち、かくしてＦｈｉｔのアゴニストまたはアンタゴニスト、特にかくして細胞増殖に影響を及ぼす分子としての潜在的な用途を持つ。好ましい具体例では、かかるアッセイを行い、抗癌剤または薬剤開発ののための鉛化合物としての潜在的実用性を持つ分子に関してスクリーニングする。かくして本発明はＦＨＩＴ核酸、蛋白質または誘導体と特異的に結合する分子を検出するためのアッセイを提供する。例えば、ＦＨＩＴ核酸を発現する組換え細胞を用いて、これらのアッセイでＦｈｉｔ蛋白質を組換えにより生産し、Ｆｈｉｔ蛋白質に結合する分子に関してスクリーニングすることができる。分子（例えば、推定されるＦｈｉｔの結合パートナー）を結合へと導く条件の下でＦｈｉｔ蛋白質（またはその断片）と接触させ、次いでＦｈｉｔ蛋白質と特異的に結合する分子を同定する。同様の方法を用いてＦｈｉｔ誘導体または核酸に結合する分子に関してスクリーニングすることもできる。前記を実施するのに使用可能な方法は当該技術分野で一般的に公知である。本発明の具体例では、Ｆｈｉｔ蛋白質および／またはＦｈｉｔ蛋白質を発現する細胞株を用いて抗体、ペプチドまたはＦＨＩＴ蛋白質に結合するその他の分子に関してスクリーニングすることができ、かくしてそれはＦＨＩＴ蛋白質のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る。例えば、優性ネガティブ突然変異Ｆｈｉｔ蛋白質の活性を中立化する能力を持つ抗−Ｆｈｉｔ抗体を用いて、癌のごとき細胞の過増殖に関連する病状を阻害または予防してもよい。組換えにより発現した変異型Ｆｈｉｔ蛋白質を伴う有機またはペプチドライブラリーのスクリーニングは、変異型Ｆｈｉｔ蛋白質の活性を阻害するよう機能する治療分子の同定に有用であり得る。次いで、野生型Ｆｈｉｔ蛋白質に対するスクリーニングを行い、変異型Ｆｈｉｔ蛋白質に対して特異的なアンタゴニスト、すなわち、野生型Ｆｈｉｔ蛋白質を阻害（または結合）しないものに関して選択することができる。合成でまたは自然に生じる産物は、当業者にとっては慣例と考えられる多くの方法でスクリーニングすることができる。例としては、ランダムまたは組み合わせペプチドのごとき多様性ライブラリーまたは非ペプチド性ライブラリーをＦｈｉｔに特異的に結合する分子に関してスクリーニングすることができる。多くのライブラリーが当該技術分野において公知であり、例えば、化学合成ライブラリー、組換え体（例えば、ファージ・ディスプレー・ライブラリー）およびイン・ビトロの翻訳に基づくライブラリーを使用することができる。化学的に合成したライブラリーの例としては、Fodorら,1991，Sciencｅ251:76 7-773; Houghtenら，1991，Nature 354:84-86; Lamら，1991, Nature 354:82-84; Medynski，1994，Bio/Techno1ogy 12:709-719; Gallopら，1 994，J．Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251; 0h1meyerら，1993，Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 90:10922-10926; Erbら，1994，Ｐroc．Nat1．Acad．Sci．U SA 91:11422-11426; Houghtenら，1992，Biotechniques 13:412; Jayawickreme ら，1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:1614-1618; Salmonら，1993，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 90:11708-11712; ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９３／２０２４２；およびBrennerおよびLerner，1992，Proc．Nat1．Acad．Sci．USA 89:538 1-5383がある。ファージ・ディスプレー・ライブラリーの例としては、ScottおよびSmith，19 90，Science 249:386-390; Devlinら，1990，Science，249:404-406; Christian ，R.B.，ら，1992，J．Mol．Biol．227:711-718; Lenstra，1992，J．Immunol． Meth．152:149-157; Kayら，1993，Gene 128:59-65; および１９９４年８月１８日付けのＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１８３１８に記載されたものがある。イン・ビトロでの転写に基づくライブラリーとしては、限定されるものではないが、１９９１年４月１８日付けのＰＣＴ国際公開第ＷＯ９１／０５０５８；およびMattheakisら，1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:9022-9026に記載されてものが挙げられる。非ペプチド性ライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Buninら，1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:4708-4712参照）が使用に適用できる。また、ペプトイド(peptoid)ライブラリー(Simonら，1992，Proc．N atl．Acad．Sci．USA 89:9367-9371)を用いることもできる。そこでペプチドにおけるアミドの機能性が過メチル化されて化学的に形質転換された組み合わせライブラリーを生じる、使用可能な他のライブラリーの例としてはOstreshら，(19 94，Proc．Nat1．Acad．Sci．USA 91:11138-11142)により記載されたものがある。ライブラリーのスクリーニングは一般的に公知の種々の方法の何れによっても達成できる。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する以下の参照文献を参照：Parm1eyおよびSmith，1989，Adv．Exp．Med．Biol．2 51:215-218; ScottおよびSmith，1990，Science 249:386-390; Fowlkesら，1992 ，BioTechniques 13:422-427; Oldenburgら，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．US A 89:5393-5397; Yuら，1994，Ce1176:933-945; Staudtら，1988，Science 241: 577-580; Bockら，1992,Nature 355:564-566; Tuerkら，1992，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA ８9:6988-6992; Ellingtonら，1992，Nature 355:850-852;米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９号および米国特許第５，１９８，３４６号、全てLadnerら; RebarおよびPabo，1993，Science 263:6 71-673;およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１８３１８号。具体例では、スクリーニングは、ライブラリーメンバーを固相に固定化したＦｈｉｔ蛋白質（または核酸もしくは誘導体）と接触させ、次いで該蛋白質（または核酸もしくは誘導体）と結合するライブラリーメンバーを回収することにより行うことができる。「パンニング」技術と呼ばれるかかるスクリーニング法の例としては、ParmleyおよびSmith，1988，Gene 73:305-318; Fowlkesら，1992，Bi oTechniques 13:422-427;ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１８３１８;および本明細書の前記で引用された参照文献中の例として記載されたものがある。もう一つの具体例では、酵母中で相互作用する蛋白質を選択するためのツウハイブリッド系(FieldsおよびSong，1989，Nature 340:245-246;Chienら，1991，P roc．Natl．Acad．Sci．USA 88:9578-9582)を用いてＦｈｉｔ蛋白質または誘導体と特異的に結合する分子を同定することができる。５．１３．動物モデルまた、本発明は動物モデルも提供する。一つの具体例では、細胞の過増殖に関与する疾病および障害のための動物モデル（例えば、第５．８．１．節に記載されたごとき）が提供される。かかる動物は、最初に、その染色体中のＦＨＩＴ遺伝子と（好ましくは異種配列、例えば抗生物質耐性遺伝子の挿入により）生物学的に不活性にされた外来ＦＨＩＴ遺伝子との間の相同組換えを誘導することにより作出される。好ましい態様では、この相同組換えは、胚誘導幹（ＥＳ）細胞を、挿入により不活性化されたＦＨＩＴ遺伝子を含むベクターで形質転換し、その結果相同組換えを起こさせ、次いで該ＥＳ細胞を胚盤胞に注入し、該胚盤胞を養育母に移植し、次いで、そこでＦＨＩＴ遺伝子が不活性化されたキメラ動物（「ノックアウト動物」）を誕生させることにより行われる(Capecchi，1989，Science 244:1288-1292参照 )。該キメラ動物を繁殖させてさらにノックアウト動物を作出することができる。かかる動物はマウス、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウシなどであってよく、ヒトでない哺乳類であることが好ましい。具体例では、ノックアウトマウスが作出される。かかるノックアウト動物は、細胞の過増殖に関与する疾病または障害（例えば、悪性腫瘍）を発達させるまたは発達しやすくすると予期され、かくして、例えば過増殖（例えば、腫瘍形成）を阻害する能力に関して分子（例えば、可能性のある抗癌治療薬）をスクリーニングまたは試験し、かくしてかかる疾病または障害を治療または予防するための、かかる疾病および障害の動物モデルとしての用途があり得る。本発明異なる具体例では、優性ネガティブ突然変異ＦＨＩＴ遺伝子を組み込み、発現するトランスジェニック動物は細胞の過増殖に関与する疾病および障害の動物モデルとしての用途を持つ。かかる動物を用いて優性ネガティブ突然変異体を特異的に阻害する能力に関して分子をスクリーニングまたは試験し、かくしてかかる疾病および障害を治療または予防することができる。６．染色体３ｐ１４．２脆弱部位および腎臓癌に関連する転座切断点にわたるヒトＦＨＩＴ遺伝子は、消化管癌においては異常である本明細書に記載したごとくに、発明者らは食道癌、胃癌、結腸癌、腎臓癌およびその他の癌に関与するヒト遺伝子を単離、同定した。脆弱部位遺伝子座、ＦＲＡ３Ｂを含む染色体３ｐ１４．２の２００−３００キロベース（ｋｂ）領域が、多形性の腫瘍由来細胞株での同型接合性欠失、および食道癌、胃癌、結腸癌、腎臓癌およびその他の癌での半接合性欠失に関与している。この２００− ３００キロベース領域にわたるコスミドコンティグからのエキソンの増幅により、偏在性１．１キロベース転写物およびＨＩＴファミリーのもう一つのメンバーであるプロテインキナーゼＣインヒビター遺伝子と相同性を持つ１６．８ｋＤａの蛋白質をコードする亜鉛結合ヒスチジントリアド遺伝子ファミリーのメンバーであるヒトＦＨＩＴ遺伝子の同定を可能にする。ＦＨＩＴ遺伝子座は、腎臓明細胞癌に関連する３ｐ１４．２転座切断点に対して動原体側にマッピングされるほとんど翻訳されない３つの５’エキソンを持ち、残りのエキソンが、この転座切断点に対して末端小粒側にマッピングされ、同型接合的に欠失した脆弱領域であるＦＲＡ３Ｂ内にある第一アミノ酸コーディングエキソンであるエキソン５、および癌細胞で一般的に欠失する領域およびＦＲＡ３Ｂ領域に対して末端小粒側にマッピングされるエキソン６−１０を持つ、少なくとも５００キロベースにわたって配置される１０の小エキソンから構成される。ＦＨＩＴ遺伝子座の異常型転写物がおよそ５０％の食道癌、胃癌および結腸癌で見られ、家族性ｔ（３；８）腎臓癌は該転座による破壊によりＦＨＩＴ対立遺伝子の一つを欠いていた。通常、異常型のＦＨＩＴ転写物は、しばしばＦｈｉｔ蛋白質をコードできなかった転写物を生じる結果となるエキソン５または８を欠く異常なスプライシングから生じた。かくして、Ｆｈｉｔ蛋白質の欠損を生じる結果となる３ｐ１４．２およびＦＲＡ３Ｂでの染色体の異常性は、いくつかの重要なヒト癌種の阻害および／または進行に関与する。６．１．結果コスミドコンティグ６４８Ｄ４コスミドライブラリーから、図１に示したごとくに、初めに同型接合的に欠失した領域にわたって配置されるＢＥ７５８−６、Ａ６ＵＲＡ、Ａ３、および１３００Ｅ３プローブを用いてクローンを選択した。次いでコスミド末端クローンを単離し、コスミドスクリーニングの次の工程に用いた。開始ＳＴＳ（ＤＮＡ配列タグ）およびコスミドＤＮＡ鋳型を用いてコスミド末端から確立した新しいもののＰＣＲ増幅によりコスミドマップを構築した。さらに、各々の新たなＳＴＳをＹＡＣコンティグ（図１Ａにも示される）に対して、同型接合性欠失を持つ細胞株および染色体３の一部を保持している齧歯類−ヒトハイブリッドに対して試験した(LaForgiaら，1993，Cancer Res．53:3118-3124; Druckら，1995 ，Cancer Res．55:5348-5355；Bullrichら,1995，Cytogenet.Cell Genet.70:250 -254)。同型接合的に欠失した領域にわたるコンティグ中に６種のコスミドが構築された。発明者らが脆弱領域という同型接合的に欠失した領域をより正確に定義するためには、ＰＴＰＲＧ遺伝子座からＤ３Ｓ１２３４の染色体領域にわたる、コスミドウォーキングおよびエキソントラッピングから誘導した４２ＳＴＳマーカーを、従前にマーカーのサブセットを用いて試験した細胞株由来の１１種の癌中に存在するかどうかＰＣＲ増幅により試験した（データは示さず；Lisitsynら，1995 ，Proc．Natl．Acad．Sci.USA 92:151-155）。結腸癌由来ＬｏＶｏ、ＨＴ２９およびＳＷ４８０、並びに胃癌由来ＡＧＳ細胞株は図１Ａの最上行の点線部分によって示したごとき、同一の大きさの欠失を示した。結腸癌由来ＬＳ１８０および胸部癌由来ＭＤＡ−ＭＢ４３６細胞は、この同一領域にわたり、ほとんどのマーカーを欠くがいくつかは保持し、不連続な欠失を示した。胃癌由来ＫａｔｏＩＩＩ細胞は明らかに、Ｄ３Ｓ１４８１マーカーおよびＡＰ４／５からＤ３Ｓ２９７７までの脆弱領域の末端小粒部分を欠損している(図１Ａ参照)。鼻咽腔癌（ＮＰＣ）由来のＨＫＩ細胞は、Ｄ３Ｓ１４８１とＡＰ４／５マーカーの間の領域を欠損しており、一方、他のＮＰＣ由来細胞株であるＣＮＥ２は、ｔ（３；８）付近の領域およびＤ３Ｓ１４８１とＤ３Ｓ２９７７の間の領域を含む不連続な欠失を有していた。またヒーラ細胞もｔ（３；８）付近およびＤ３Ｓ１４８１とＡＰ４／５の間の一つの欠失領域を伴う不連続欠失を示した。ほとんどのマーカーを用いてＮＰＣ由来ＣＮＥ１細胞を試験したが、欠失は検出されなかった。かくして、ｔ（３；８）、ＦＲＡ３Ｂ遺伝子座およびコスミドコンティグによって覆われた同型接合性欠失領域の周辺に多くの異なる腫瘍関連３ｐ１４．２染色体切断点が存在する。ｃＤＮＡの単離図１Ａに示された同型接合性欠失にわたる６種のコスミドを該欠失領域内の遺伝子を同定する目的でエキソントラッピング実験に用いた。推定のトラップされたエキソンを配列決定し、ＯＲＮＬＧＲＡＩＬサーバーのＧＲＡＩＬ２を用いて配列を分析した。いくつかのトラップされたエキソンをＧｒａｉｌ２によるエキソンと認め、ヒト組織のスペクトルからポリＡ⁺ＲＮＡのノーザンブロットにプローブとして用いた。さらに、トラップされたエキソンの配列をヌクレオチド配列データベースと比較した。コスミド７６サブクローン（ｃ７６、図１Ａ）からトラップした一つのエキソンは、ワシントン大学−メルクＥＳＴプロジェクトによって寄託された胸部（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ ♯Ｒ５３１８７および＃Ｒ８６３１３）並びに胎児肝臓および脾臓（＃Ｒ１１１２８）ライブラリー由来のｃＤＮＡ配列の数と一致していた。この配列から設計された２３塩基対（ｂｐ）のオリゴヌクレオチドプライマー（図２Ａ、プライマーＸ８）をプライマー伸張に用いて、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）(Rapid amplicati on of cDN Aends)反応（Ｍａｒａｔｈｏｎ^TMｃＤＮＡ増幅キット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によるｃＤＮＡの５’伸張産物を得た。検出されたＲＡＣＥ反応からの最長産物（３７０ｂｐ）は、種々の正常組織に由来するｍＲＮＡのノーザンブロット分析によって１．１ｋｂのｍＲＮＡを偏在して発現した。このサイズはプローブとして同一のＤＮＡ断片を用いて正常結腸ｃＤＮＡライブラリーから単離された最大のｃＤＮＡクローンの長さと同一である。この全長クローンのＤＮＡ配列分析により、（図２Ａ）３５０ｂｐを上回る長い５’非翻訳領域に続く開始メチオニンコドン並びにコザックの規則に適合する周辺配列、１４７個のアミノ酸のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、３’非翻訳領域、ポリアデニル化コンセンサス配列およびポリＡ尾部が明らかになった。エキソンサイズは広範に変化し、例えばエキソン５は１２０個のヌクレオチドを有し、エキソン６は１４６個のヌクレオチドを有し、またエキソン７は３０個のヌクレオチドを有する。図２Ａを参照すれば、エキソン１は−３６２ないし−２１３のヌクレオチド数からなり、エキソン２は−２１２ないし−１６４のヌクレオチド数からなり、エキソン３は−１６３ないし−１１１のヌクレオチド数からなり、エキソン４は−１１０ないし−１８のヌクレオチド数からなり、エキソン５は−１７ないし１０３のヌクレオチド数からなり、エキソン６は１０４ないし２４９のヌクレオチド数からなり、エキソン７は２５０ないし２７９のヌクレオチド数からなり、エキソン８は２８０ないし３４８のヌクレオチド数からなり、エキソン９は３４９ないし４４９のヌクレオチド数からなり、またエキソン１０は４５０ないし７３３のヌクレオチド数からなる。Ｆｈｉｔ蛋白質に対する親水性プロットを行い、図６に示している。このＦＨＩＴｃＤＮＡ並びにＥＳＴデータベースからの一致配列を翻訳させ、次いでオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）アミノ酸配列（図２Ａ）を該蛋白質データベースと比較した。５’方向の最長ＥＳＴは、（ＦＨＩＴエキソン７、エキソン８およびエキソン９の３’末端に見られる配列を含む）Ｒ５０７１３であった。３’方向の最長ＥＳＴは、（エキソン２の半分およびエキソン３− ６で見られる配列を含む）Ｒ１１１２８であった。ＥＳＴＲ５３１８７は、エキソン２からエキソン５の一部のＦＨＩＴｃＤＮＡ配列と一致する２９７個のヌクレオチドを含む、ＦＨＩＴｃＤＮＡに相当する配列の最長スパンを有していた。コンピュータサーチにより検索されたデータベースにおける最良の一致の中で、この２９７個のヌクレオチド配列がＦＨＩＴｃＤＮＡ配列と一致する最長の伸張であった。２番目に最長の一致はエキソン６の末端の前の３塩基までのエキソン２内で始まるＦＨＩＴｃＤＮＡ配列と一致する２８７個のヌクレオチドを持つＥＳＴ１１１２８中に認められる。ＦＨＩＴｃＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ７Ｆ１）およびＲ１１１２８ヌクレオチド配列を用いて整列されたＲ５０７１３ヌクレオチド配列のプリントアウトは図７に示されている。注意すべきこととしては、Ｒ５３１８７もＲ１１１２８ヌクレオチド配列も、あるいは何れの他の多くのＥＳＴ配列も、ＦＨＩＴ蛋白質コーディング領域にわたるということである。また、両方向における、３つのリーディングフレームの全てにおけるＲ５０７１３およびＲ１１１２８配列の翻訳は、図８および９にそれぞれ示され、図８または９に示される翻訳配列からはＦｈｉｔ蛋白質配列を推定できない。次いで、全長ＦＨＩＴｃＤＮＡプローブを組織のスペクトル由来のｍＲＮＡを有するノーザンブロットとハイブリダイズさせた。図３Ａに示すごとくに、該ｃＤＮＡは１．１−ｋｂの転写物を偏在して発現すると推定された。ｃＤＮＡのその領域のゲノムマップとの相関最初にトラップされたエキソン由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてコスミド７６からイントロン配列を作製した。それらの配列を純に用いてプライマーおよびプローブを調製し、図１Ａで示されたごとくに、欠失を伴う癌細胞株由来のコスミド、ＹＡＣｓおよびＤＮＡ上にエキソンをマッピングした（図１ＡのＥ５）。次いで、ｃＤＮＡを鋳型として用い、エキソン５の上流および下流のエキソンをひとまとめに扱うオリゴヌクレオチドプライマー対を用いてｃＤＮＡ断片を増幅し、コスミドコンティグ上で５’および３’フランキングエキソンをマッピングするためのプローブとして働かせた。これらのプローブについて、エキソン５のｃＤＮＡ配列５’および３’は同型接合性欠失を覆う６４８Ｄ４コスミドコンティグ内にないことが示された。かくして、図１Ａに示されたごとくに、脆弱領域欠失に対して動原体側および末端小粒側に拡張されたＹＡＣｓ８５０Ａ６および７５０Ｆ１由来のコスミドライブラリーはそれぞれ、５’および３’ｃＤＮＡプローブフランキングエキソン５を用いて調製され、スクリーニングされた。次いで、残りのエキソンを含むコスミドを用いて、ｃＤＮＡプライマーを用いてイントロン配列を誘導し、図１Ａに示されるごとくに該遺伝子の構造を決定した。該ｃＤＮＡは３つのＹＡＣクローン（図１Ａ）間に配置された１０個のエキソンからなった：エキソン１ないし４はＹＡＣクローン８５０Ａ６に対してマッピングされ、エキソン５は３つ全てのＹＡＣクローンに存在し、またエキソン６ないし１０はＹＡＣクローン７５０Ｆ１に対してマッピングされた。腫瘍由来細胞株において、エキソン５のみが同型接合性欠失の領域内に、すなわちＹＡＣクローン６４８Ｄ４内にあった。図２Ａおよび２Ｂに詳細に示されたごとくに、ＯＲＦのコーディング領域はエキソン５で始まり、エキソン９で終わっていた。最も興味深いことには、該遺伝子の最初の３つのエキソン（Ｅ１、Ｅ２およびＥ３）は、ＹＡＣＤＮＡおよびｔ（３；８）切断およびＦＲＡ３Ｂ切断由来の染色体３の一部をを有するハイブリッド由来のＤＮＡ由来のこれらのエキソンの増幅によって決定されたごとくに、ｔ（３；８）切断に対して動原体側に、ｔ（３；８）切断間に、またＰＴＰＲＧ遺伝子の５’末端にマッピングされた。アミノ酸配列データベースにおける相同性の検索は、設計されたＨＩＴ蛋白質である、ヒスチジントリアドモチーフを有する蛋白質群に対して有意な相同性を示した(Seraphin，1992，J．DNA Sequencing & Mapping 3:177-179)。設計された脆弱ヒスチジントリアド遺伝子(Fragile Hi stidin Triad gene)、すなわちＦＨＩＴ遺伝子であるヒト遺伝子に対するｃＤＮＡの推定アミノ酸配列を、他のＨＩＴファミリーのメンバーと比較して図４Ａに示す。ＦＨＩＴ蛋白質の最高の相同性（−５０％一致）は、それぞれエス・ポンベ(S．pombe)およびエス・セレビシエ(S．cerevisiae)で同定されたＰＡＰＨ１およびＣＡＰＨ１として図４Ａで示される酵母ジアデノシン加水分解酵素（ａｐｈｌｓ）に対するものである（Huangら，1995，Biochem．J．312:925-932)。ＦＨＩＴ（ｃＤＮＡ７Ｆ１）を伴う酵母(S．pombe)Ａｐ４Ａ加水分解酵素（ＰＡＰＨ１）配列（Ｕ３２６１５）は図１０Ａに示される。広範囲の相同性はなかった。発明者らが酵母加水分解酵素とＦＨＩＴ核酸配列間の相同性伸張に関してコンピュータ検索を行った場合、結果として図１０Ｂに示される小領域の核酸の相同性が得られた。ＨＩＴファミリー蛋白質に対するコンセンサス配列は、図４Ａの下方のアミノ酸配列で示される。要約すると、酵母ＡＰ４Ａ加水分解酵素遺伝子に対するヒト同族体遺伝子であってよいＦＨＩＴ遺伝子は、ｔ（３；８）、ＦＲＡ３Ｂおよび腫瘍細胞に特異的な一般欠失領域を含む５００ｋｂｐを超える領域にわたっている。ＦＨＩＴ遺伝子の発現発明者らはＢＥ７５８−６遺伝子座およびマイクロサテライトマーカーＤ３Ｓ１３００を種々の腫瘍由来細胞株で、またｔ（３；８）とＤ３Ｓ１２３４遺伝子座との間の領域に、しばしばＤ３Ｓ１３００を含む高頻度の対立遺伝子欠失が検出される胃癌および結腸癌の本発明者らのＬＯＨ研究で一般的に欠失している領域内に配置した（図１Ａ参照）。今、第一のコーディングエキソンであるエキソン５に近接するＦＨＩＴ遺伝子座内にＢＥ７５８−６およびＤ３Ｓ１３００遺伝子座の双方が位置していることは、非培養腫瘍並びに腫瘍由来細胞株においてＦＨＩＴ遺伝子が欠失の標的であることを示唆した。腫瘍由来細胞におけるＦＨＩＴ転写物についての分析を始めるため、腫瘍由来細胞株および正常組織に由来するｍＲＮＡをノーザン分析によって研究した。脆弱領域に明確な欠失を持つあるいは持たない正常組織および多くのＮＰＣ、結腸癌および胃癌由来細胞株由来のポリＡ⁺ＲＮＡをノーザンブロットでＦＨＩＴｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションに関して試験した（図３ＡおよびＢ）。脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸および抹消血リンパ球について図３Ａで示したごとくに、試験した全てのヒト組織でＦＨＩＴ遺伝子の低レベルの発現が生じた。主要な転写物は約１．１ｋｂ、より長い転写物は約５ｋｂであり、それらはいくつかのブロットでかろうじて検出できるかできないかというものであった。その１．１ｋｂの転写物は、全長ｃＤＮＡのサイズに一致するので、より長い転写物は十分にプロセッシングを受けていない前駆体ＲＮＡであると説明し得る。いくつかのノーザンブロットで肺、小腸および結腸により多く存在することが明らかであるプロセッシングを受けていないと推定されるＲＮＡを伴う、脳、心臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓由来のｍＲＮＡで同様の転写物が見られた。脆弱領域内に公知の同型接合性欠失を持つ腫瘍由来細胞株からのｍＲＮＡは、かろうじて検出可能なレベル（図３Ｂ、レーン２−４、それぞれＫａｔｏＩＩＩ、ＨＫＩおよびＬｏＶｏｍＲＮＡ）からほとんど正常レベル（レーン８、ＬＳ１８０）、正常な小腸のｍＲＮＡに匹敵するレベル（レーン１）までの種々のレベルのＦＨＩＴ転写物を発現した。発明者らがかろうじて検出可能なＦＨＩＴｍＲＮＡを発現したと説明した相同性欠失を持つＮＰＣ細胞株（ＣＮＥ２、ＨＫ１：図３Ｂ、レーン５、３）および持たないもの（ＣＮＥ１：図３Ｂ、レーン６）に着目してほしい。ＮＰＣ由来細胞株、ＣＮＥ２は可能性のあるより小さな転写物を発現し（図３Ｂ、レーン５）、一方、欠失を持たない結腸直腸癌由来細胞株Ｃｏｌｏ３２０は、サイズだけが野生型転写物の存在を意味するのではないことに気付くべきであるが、明らかに正常なサイズのＦＨＩＴ転写物を発現した（図３Ｂ、レーン７）。いくつかのエキソンは非常に小さいので(例えば、エキソン７は３０個のヌクレオチド、エキソン２は４９個のヌクレオチド、エキソン３は５３個のヌクレオチド)、約１．１ｋｂバンドは欠いている１以上小エキソンを持つ転写物を収容することができた。ノーザン分析の一つの結果は、特異的な腫瘍由来細胞株において転写物のサイズまたは存在量と相同性欠失の検出の間には直接の関係はないことであり、このことは利用可能なマーカーで検出されたいくつかの腫瘍細胞株に小さな欠失が存在してもよいことを示唆している。腫瘍由来ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびｃＤＮＡ配列分析欠失および非欠失腫瘍細胞株由来のＦＨＩＴ転写物における異常性を捜すために、発明者らは方法に記載したごとくに、（ｄＴ）₁₇プライマーを用いてｍＲＮＡを逆転写させ、５’および３’プライマーを用いて増幅させ、次いでプライマーを用いてオリジナルプライマー内に再増幅させた（ネスティッドＰＣＲ）。プライマーの位置は図２Ａに示す。増幅された産物をアガロースゲル上で分離させ、次いで正常サイズを持つ断片および異常型の断片をそのゲルから切り取り、配列決定した（異常型バンドの例は図３Ｃの非培養腫瘍のｍＲＮＡに関して示され、腫瘍細胞株由来のＰＴ−ＰＣＲ産物は非常に類似していた。）腫瘍由来細胞株は明確な正常サイズのバンドと１以上の異常型バンドの双方を発現した。異常型バンドの配列決定により多くの異常型産物が明らかになり、そのいくつかの例は図１Ｂに示されている。結腸腫瘍由来ＣＣＬ２３５およびＣＣＬ２３４細胞株は試験したＳＴＳマーカーの欠失を示さなかったが、示されたごとくに、双方とも異常型転写物を示し、加えてＣＣＬ２３５は正常サイズの産物も発現していた。ＨＴ２９およびＫａｔｏＩＩＩ細胞株は双方とも同型接合性欠失を示したが、ＫａｔｏＩＩＩ細胞株は、図１Ｂに示されたごとくに、同型接合的欠失領域の末端小粒部分であって、エキソン４および５、または該異常型ＲＴ−ＰＣＲ産物の全てを欠いているエキソンであるエキソン６の領域を含まない領域の欠失をしました。また、他の多くの腫瘍由来細胞株も図１Ｂに模式的に示されたものと同様の異常型ＲＴ−ＰＣＲ産物を発現した（データは示さず）。非培養腫瘍由来の同様の異常型産物の詳細な記載は表２および図２に与えられている。１０ケースの非培養食道癌、９ケースの胃癌および８ケースの結腸癌を分析し、各々５、５および３ケースで異常型転写物を観察した（表２および３に要約、また図２Ｂに図示）。１ FHIT遺伝子のコーディング配列を含む異常型転写物は全て図３Ｂに示される。Alu、Alu反復、FS、フレームシフト；NS、有意でない相同性；Ex、エキソン。２アステリスク（^*）を付けたケースでは、コーディング領域配列の改変がみられない正常型転写物も観察された。３欠失の最初のおよび最後のヌクレオチドの位置を図２Ａの核酸番号に従って示す。４全ての挿入位置はエキソン４の下流であった。５ Fhit蛋白質と共にフレーム内にコードされる推定蛋白質を示す：HIＴ（＋）、HITモチーフを持つ蛋白質；HIT（−）、HITモチーフを持たない蛋白質；−、フレーム中に蛋白質がない。異常なｃＤＮＡの配列分析によってエキソン４と９との間の種々の領域が存在しないことが明らかになったが（表３および図２Ｂ）、一方、同一器官からの正常組織ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびｃＤＮＡ配列分析は、コーディング領域配列の何れの変化をも示さなかった（表２、Ｅ３、Ｅ１２、Ｅ１１３、Ｅ３７、Ｊ１、Ｊ４、Ｊ９、９６２５、５５８６、９５７５）。異常な転写物を伴う１３ケースのうち８ケースにおいて、正常な大きさの転写物もまた認められた（図３Ｃ；Ｅ３、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ３７、９６２５、９５７５、Ｊ７およびＪ９；Ｅ１２および９５７５、示されていない）、一方、１３ケースのうち５ケースにおいては正常な大きさの転写物は検出されなかった（図３Ｃ、Ｊ３、Ｊ４）かまたはかろうじて検出された（図３Ｃ、Ｅ３２、５５８６、Ｊ１）。異常な転写物のほとんどにおいて、転写物の欠失部分の始まりおよび末端がスプライス部位と一致し（図２Ｂ）、このことはｃＤＮＡ欠失が適切な欠失FHITエキソンを含むまたはとり囲むゲノム領域の欠失の結果生じることを示唆した。この異常な転写物は２つのグループ（クラスＩおよびＩＩ、図２Ｂ）に大別できる：クラスＩ転写物はエキソン５を欠き、 FHIT ＯＲＦの開始メチオニンコドンを有し、その結果ＯＲＦの欠失を生じる；クラスＩＩ転写物は完全な開始メチオニンコドンを有するが、９５７５ｂを除いてはエキソン８を含まず、エキソン６の後にフレームシフトを示した。かくして、全てのクラスＩＩ転写物では、エキソン８の野生型ＯＲＦ、ヒスチジントリアド(triad)含有ドメインは存在しない。さらに、クラスＩＩ転写物のいくつかは、エキソン８の欠失のみを示し（図２Ｂ；Ｅ３、Ｅ１２ａ、９６２５ａ、９５７５ａ、Ｊ９ａ）、このことはエキソン８が欠失の標的であったことを示唆している。エキソン８はヒスチジントリアドモチーフをコードするので、異常な転写物の主要な画分を構成するクラスＩおよびクラスＩＩ転写物は双方とも十分に機能する蛋白質をコードできないようである。しかしながら、フレーム中にエキソン６のメチオニン（Ｍｅｔ）コドンが存在し（図２Ｂ参照）、いくつかの場合には挿入がフレーム中にＭｅｔを与え(示されていない)、かくして異常な転写物の大部分は、表３に示すごときHITドメインを有するまたは有さない蛋白質を部分的にコードすることが可能であった。FHIT遺伝子から誘導されていない種々の長さのＤＮＡの挿入がいくつかの転写物において認められ、挿入はエキソン４の下流においてのみ見出された（表３、５５８６ａ、５５８６ｂ、９６２５、Ｊ３、Ｊ４）。異常な転写物の少数グループは、完全長ＯＲＦを保持したが、エキソン４を欠いており（表３、Ｊ１ａ）、またはエキソン４と５との間の５’非コーディング領域に７２ｂｐのＤＮＡ配列の挿入を有していた（表３、Ｅ３７ａ、および図１Ｂ）。かかる挿入がＯＲＦの翻訳に影響を及ぼす可能性がある。全コーディング領域を保持した野生型ＦＨＩＴｃＲＮＡおよび腫瘍特異的転写物から誘導された種々のｃＲＮＡがイン・ビトロで翻訳されるかどうかを決定するために、数種の組換えプラスミドを構築し、それぞれはＴ７プロモーター由来のＦＨＩＴ遺伝子下流を含み、第一の非コーディングエキソンを欠く。ｐＦＨＩＴ１プラスミドは、ＣＣＬ２３２結腸癌細胞株由来のエキソン４を欠く異常なｃＤＮＡを運んだ。プラスミドｐＦＨＩＴ２は、エキソン４とエキソン５との間に７２ｂｐの挿入を有する食道腫瘍Ｅ３７由来のｃＤＮＡを運んだ。ｐＦＨＩＴ３プラスミドは、エキソン１を欠く野生型ＦＨＩＴ遺伝子を含んだ。該構築物をウサギ網状赤血球ライゼートによるイン・ビトロでの翻訳に用いた。翻訳産物（図４Ｂ）の分析は、それぞれのｃＤＮＡ構築物から翻訳した推定される１６．８ｋＤａ蛋白質を示した。ＦＨＩＴ蛋白質ＦＨＩＴｃＤＮＡによって推定された蛋白質配列は、エス・ポンベ（S.pombe ）ジアデノシン５’，５’’’Ｐ¹、Ｐ⁴テトラホスフェートヒドロラーゼ、ａｐｈ１（Huangら、1995，Biochem．J．312:925-932）と、ＰＡＰＨ１がエス・ポンベ（S．pombe）配列を表す図４Ａでアミノ酸整列を示したとき、非常に類似している（ＮＣＢＩＢＬＡＳＴサーバーによって計算すると、５７／１０９のアミノ酸一致、７６／１０９すなわち６９％の類似性）。エス・ポンベ（S．pombe）ａｐｈ１酵素を、該酵素の精製、Ｎ−末端のアミノ酸の配列決定およびｃＤＮＡを部分的に増幅するためのプライマーの設計によってクローン化し、次いで全長ゲノムおよび１．２ｋｂｐのｃＤＮＡをクローン化し、配列決定および翻訳した(Huangら、1995，Biochem．J．312:925-932)。同様の方法により、ヒト加水分解酵素（ＡＰＨ１）がクローン化され、配列決定され次いで翻訳されているが(Thornsら、1995，Biochem.J.311:717-721)、驚くほどに、エス・ポンベ（S．pombe）ａｐｈ１遺伝子にもＦＨＩＴ遺伝子にも似ていない。高等真核生物は１本の１６−２１ｋＤａＡｐ４Ａ非対称ピロホスホヒドロラーゼ(Thornsら、1995，Biochem．J.311:717-721に引用)を有しているらしいので、かくしてＦＨＩＴ遺伝子はエス・ポンベ（S．pombe）ａｐｈ１酵素のヒト同族体であろうけれども、ヒトＡＰＨ１酵素であるかどうかは明らかではない。該ＦＨＩＴ遺伝子はまた、エス・セレビシエ（S．cerevisiae）ａｐｈ１遺伝子産物（図４Ａ中のＣＡＰＨ１）と、ＦＨＩＴアミノ酸配列の４９と１０２との間の５０個のアミノ酸において４０％の一致および６２％の類似性を持ち、かつＨＩＴドメインにおいてより高い類似性を有して非常に似ている。図４Ａ中の他の蛋白質または仮定の蛋白質は、全てＨＩＴ遺伝子ファミリーのメンバーであり、原核生物、酵母および哺乳類中に存在する蛋白質のファミリーは、Seraphin，1992，DNA Sequencing & Mapping 3:177-179に記載されている。該ファミリーの記号の特徴はヒスチジントリアドであり（最も一般にはＫＶＫＶＮ、ＦＨＩＴ蛋白質のアミノ酸９４−９８、図４Ａ）、それはＢＨＩＴの場合に関して（図４Ａ）ウシ蛋白質キナーゼＣの阻害剤（ＰＫＣＴ１）は亜鉛結合部位として示されている(Pearsanら、1990，J．Bio1．Chem．２５５:4583-459 1;Mozierら、1991, FEBS 279:14-18)。Ｆｈｉｔ蛋白質産物は、Ｆｈｉｔアミノ酸１２−１００にわたるウシＰＫＣＴ１蛋白質と、ＮＣＢＩＢＬＡＳＴによって計算すると３９％しか類似していない。かくして、該ＦＨＩＴ遺伝子はヒトＰＫＣＴ１遺伝子ではないようである。他のＨＩＴ遺伝子の機能はそれゆえまだわかっていない。さらに、ファミリーメンバーの構造の特徴は、広範囲にわたっては研究されていない。ＰＫＣＴ１蛋白質は、２３％のαらせんおよび４２％のβ コンホメーション（３１％のβシートおよび１１％のβターン）の推定含量を有し(Pearsonら、1990，J．Biol．Chem．265:4583-4591)、ヒスチジントリアドを含む保存領域および上流領域はほとんどのランダムコイルがＨＩＴドメインβシートを有するβシートコンホメーションで改変していることが推定された。このコンホメーションはＦｈｉｔ蛋白質中では保存され得る。また、ＨＩＴドメインは塩基性および疎水性のアミノ酸からなり、ＰＫＣＴ１蛋白質に関して示唆されるごとくに、蛋白質内部に埋め込まれていることが期待されよう（Pearsonら、1 990，J．Biol．Chem．265:4583-4591)。６．２．考察癌の脆弱部位の意味は、数年来の考察の対象であり、FRA3Bとt(3;8)転座の染色体部位が、3p14.２でほぼ一致していることは、特に興味深い点であった。FRA 3Bは構成的である。すなわち、ＤＮＡポリメラーゼαの作用を阻害する、約0.4 μＭのアフィジコリンで末梢血リンパ球を処理した後には、全ての個体で、中期の約70％で、染色体領域3p14.2に特徴的なギャップが観察される。従って、ギャップの誘導のための構造的な基礎は、全ての個体に存在している。3p14.2バンドの中で、誘導されたギャップのいくつかは、染色体の切断を表しており、切断はおそらく約200〜300キロ塩基の領域の染色質内のいくつかの部位に起こっていることも知られている(Paradee et al.，1995，Genomics 27: 358-361)。従って、ギャップおよび切断に関与している配列は、脆弱領域内の複数の部位に生じている可能性がある。X、FRAXA、FRAXE、FRAXFの葉酸感受性脆弱部位のような他の脆弱部位では、ギャップのための構造的な基礎は、CCGまたはCGGトリプレット反復の様々な長さであると考えられ、不完全な反復は完全な反復よりも安定である(C hung et al.，1993，Nature Genet．5:254-258)。これらの脆弱部位は、脆弱性の単一の部位であると考えられる。FRA3Bは、実際には、小さい染色体領域内の異なる脆弱部位の集合を表しているため、おそらく、最も一般的な脆弱部位であると考えられる。ハイブリッド細胞の FRA3Bにおける切断の原因となっている特異的な配列は、開示されていないが、本発明者らは、多くの腫瘍由来細胞系が、明確な不連続なホモ接合性欠失を示すことを見出した。図５は、3p14.2における様々な型の染色体切断の関係、および FHIT遺伝子と切断との相対的な構造を示す。図５を参照すると、KatoIII胃癌由来細胞における染色体の切断および欠失では、コーディング領域が完全に残されているが、本発明者らは、この細胞系に唯一の異常な FHIT転写産物を見出した。従って、明らかでない染色体異常が、Kat oIII細胞およびその他の癌細胞における正常な転写の欠如の原因であるに違いない。一つの可能性としては、FHIT遺伝子のホモ接合性欠失をもたない部分に、半接合性の変化をもつ、２つの FHIT対立遺伝子がKatoIIIに存在していることが考えられる。もう一つの可能性としては、エキソン近傍の変化がスプライシングに影響を与えていることが考えられる。さらに、いくつかの癌由来細胞系および未培養腫瘍は、FHIT転写産物の非コーディング領域に変化を有する転写産物を示した。これらの転写産物は、翻訳のための網状赤血球溶解物を用いた共役系で、転写され、完全長タンパクへと翻訳された（図４Ｂ）。しかし、おそらく、それらの起源の癌細胞では、エキソン４の欠失または新たな配列の挿入が、Fhitタンパクの発現に影響を与えていると考えられる。FHIT遺伝子が、両対立遺伝子の不活化を伴う古典的な抑制遺伝子として作用するのであれば、もう一つの問題は、 CCL235(大腸)、A549(肺)、HeLa(子宮頸)のような癌由来細胞系のRT-PCR増幅産物の中に、異常な産物と共に、正常な大きさの転写産物が存在することである。多くの場合、Fhitタンパク質の一部をコードしている異常な転写産物は、正常なFh itタンパク質の機能を阻害するかもしれない。これらの細胞系由来の正常な大きさの転写産物は、完全には配列決定されていないため、実際には、正常な転写産物ではないかもしれない。多くの未培養腫瘍も、異常な産物および正常な大きさの産物を示し、そして、配列決定で、これらの正常な大きさの産物のいくつかが実際に野生型産物であることが示された。これらの場合、正常な転写産物は、混在していた正常な細胞に由来したのかもしれない。本発明者らは、まだ、いずれの FHIT転写産物のコーディング領域にも点突然変異を観察していない。おそらく、このことは、異常な FHIT遺伝子が通常欠失の結果であるということを示している。ＤＮＡポリメラーゼαの作用を阻害するアフィジコリンは、正常中期に FRA3B 領域に観察されるギャップおよび切断を誘導する。従って、消化管の腫瘍および本発明者らが研究した腫瘍細胞系において、異常な転写および機能的Fhitタンパク質の欠如をもたらすゲノムの欠失は、これらの臓器が、ニコチン、カフェイン、おそらくアルコールおよびその他の既知の発癌物質のような、ＤＮＡ複製を阻害する他の因子に曝されたことにより誘導されたのかもしれない。興味深いことに、亜鉛の不足は、ヒト(Yang,1980,Cancer Res.40:2633-2644)およびラット（F onget al.，1978，J.Natl.Cancer Inst．61:145-150）における食道癌の高い発生率と関係しており、亜鉛の不足は、食道の上皮細胞の増殖を引き起こす可能性がある(Yang et al.，1987，J.Natl.Cancer Inst．79:1241-1246)。従って、亜鉛の不足は、Fhitタンパク質の欠如と類似しており、Fhitタンパク質の機能には、結合した亜鉛が必要であるのかもしれない。従って、亜鉛結合部位であると推定されているHITモチーフを有する、 FHIT遺伝子エキソン８が、数多くの消化管の腫瘍における欠失の標的であることは、興味深い。この3p14.2の領域が、CCGまたはCGGトリプレットの反復を含んでいるか否かはまだ明らかになっていないが、特徴決定されている稀な遺伝性葉酸感受性脆弱部位と、一般的な構成的アフィジコリン脆弱部位との間には違いがあるため、おそらく脆弱の基礎は異なっていると予想される。現在までに、本発明者らは、脆弱領域のテロメア部分に多くの A1u反復が存在しており(図示せず)、この同じ一般的に欠失している領域に(TAA)₁₅反復が存在しており、その反復数は極めて様々であることを見いだしている。おそらく、その領域には、この型の他のトリプレット反復が存在する。また、コスミドS8の約９キロ塩基対の配列決定された部分（脆弱部位のテロメア部分、図１Ａを参照のこと）にも、いくつかの A1u反復およびLINEエレメントが見出された。配列決定された領域のヌクレオチド含量は、 AおよびT残基が57.4％であり、一方、FHIT ｃＤＮＡのヌクレオチド含量は、AおよびT残基が48％であった。AおよびTの含量が高いことは、特に酵母における、いくつかの特徴決定されたＤＮＡ複製開始点の特徴であり、実際、高等生物の複製開始点は同定されていないが、A1u反復は複製と関連していると推測されている。FHIT遺伝子自体のもう一つの注目すべき特徴は、ほぼ全てのエキソンが、スプライス・アクセプター部位の通常の配列である、AGなる配列で終わっている点である。この脆弱領域には異常なスプライシングが多く見られることから、その領域には、スプライス・アクセプター部位と類似の配列が特に豊富であることが推測できよう。興味深いことに、本発明者らは、以前に、マウスＬ細胞にホモ接合性欠失が存在し、それにはマウス Ptprg遺伝子のいくつかのＮ末端エキソンが含まれていることを見出した(Wary et al.，1993，Cancer Res．53:1498-1502)。そして、パサック（Pathak）ら（1995，Cancer Genet.Cytogenet．83:172-173）は、マウスの大腸癌および乳癌ならびにメラノーマが、Ptprg（Wary et al.，1993，Cancer Res．53:1498-1502）およびおそらく Fhitの遺伝子座がマッピングされているマウス第１４染色体の近接領域に異常を有していることを示した。数多くの細胞系のＲＮＡ由来の FHIT遺伝子RT-PCR産物の研究から、FHIT遺伝子異常が、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌および結腸癌のような気道および消化管の癌のみならず、おそらく、卵巣癌、子宮頚癌、肺癌、骨肉腫およびいくつかの白血病においても重要であることが示唆され、また、膀胱癌および乳癌細胞系が、脆弱領域にホモ接合性欠失を示した(Lisitsyn et al.，1995，Proc．Natl．Acad.S ci．USA 92:151-155；および本発明者らのデータ)。従って、これらの型の未培養腫瘍を、FHIT遺伝子異常について試験する必要がある。 FHIT遺伝子が、3p14.2における家族性RCC転座切断により破壊されること、そして転座／FRA3B領域が、ほとんどの散発性明細胞RCCにおける対立遺伝子欠損の標的であることから、明細胞RCCも、FHIT遺伝子異常に関与していると予想される(Druck et al.，1995,Cancer Res,55:5348-5355)。FHITのORFは、エキソン５〜９に含まれており、t(3;8)ファミリーにおいては第８染色体に転座しているため、両方の対立遺伝子がまだ一部または全部の組織で発現している可能性がある。本発明者らは、0RF内に２、３個の多型を見出したが、t(3;8)リンパ芽球細胞系における２つの対立遺伝子 FHIT転写産物を区別できるものは見出されていない(データは示していない)。もし、FHIT遺伝子の破壊が、このファミリーにおける抑制遺伝子への最初の「ヒット」であるならば、第二のFHIT対立遺伝子は、t( 3;8)腫瘍で変化しているはずである。FHIT遺伝子にはまだ点突然変異が検出されていないため、t(3;8)RCCにおけるFHIT遺伝子の変化を探索するための最良の方法は、この研究において未培養腫瘍について行ったように、FHIT逆転写産物を増幅することである。本発明者らは、全て散発性腫瘍である、２つのRCC細胞系および２つの未培養RCC由来のＲＮＡについて、この実験を行い、正常な大きさの産物を観察した。これについては、まだクローニングおよび配列決定は行われていない。また、脆弱領域におけるSTSマーカーのサブセットを用いて、RCCにホモ接合性欠失は見出されていない。にもかかわらず、FHIT遺伝子がいくつかの散発性RCCに関与していないとすれば、それは驚くべきことである。 FHIT遺伝子は、おそらく広範に発現しているため、多くの異なる臓器、おそらく主に消化管、またはもしかすると主に上皮細胞層を有する臓器の、特異的な組織について腫瘍抑制遺伝子として働いていたとしても驚くべきことではない。異常な FHIT対立遺伝子を示す型の腫瘍の他の共通の特徴は、それらが主に、環境的な発癌遺伝子に直接曝されている臓器であるということかもしれない。FHIT遺伝子の異常を示す型の腫瘍のいくつかは、中国におけるNPC、東南アジアにおける胃癌のように、地球上の限定された領域において極めて高い頻度で起こり、環境的な要因が作用していることが多い。ラッスール（Rassool）ら（1992,Am.J.H um.Genet．50: 1243-1251）の以前の実験により示されているように、中国のNPC の促進におけるEBVの役割は、FRA3B領域にウイルスＤＮＡが取り込まれることによるのかもしれない。このことは、培養細胞における誘導された脆弱部位へは外因性ＤＮＡが取り込まれやすくなっているかもしれないことを示す。同様に、子宮頚癌に関連しているヒト・パピローマウイルスは、FRA3Bの誘導を促進し、子宮癌における3p上のへテロ接合の欠如（Yokota et al.,1989,CancerRes．49:359 8-3601）およびおそらくは FHIT遺伝子の不活化の原因となっているかもしれない。おそらく、破壊されたFHIT遺伝子を有するt(3;8)ファミリーは、曝されている環境的因子の特定の型により、大腸癌または食道癌ではなく、腎臓癌を発症する。本発明者らは、FHIT遺伝子が、S.pombeおよびS.cerevisiaeのAp₄A加水分解酵素と極めて相同性が高いことを見出した。ジアデノシン、Ap₄Aの特異的な役割は解明されておらず(Huang et al.，1995，Biochem.J．312:925-932)、Ap₄A加水分解酵素活性が、これらのタンパク質の唯一のin vivoの機能であるのか、または主要なものであるのかすらも明らかでない。S.cerevisiaeにおけるS.pombeaphl の発現は、増殖を阻害することはなかったが、理由は不明であるが、S.pombeの酵素は高レベルでは発現しなかった(Huang et al.，1995，Biochem.J.312:925-9 32)。HITファミリーの他のメンバーの機能は、ほとんど知られていない。もし、 FHIT遺伝子が実際に、Ap₄A加水分解酵素として同定されたS.pombe aphl遺伝子の同種であるならば、酵母とヒトとの間で遺伝子が高度に保存（69％相同）されていることは、重要な機能を示唆している。FHIT遺伝子がAp₄Aヒドロラーゼをコードしているとしても、していないとしても、S.pombeおよびS.cerevisiaeの加水分解酵素のノックアウトおよび他の型の突然変異を研究することは、Fhitタンパク質の機能を理解する上で有用であろう。細胞が熱、酸化、およびＤＮＡ傷害などの代謝ストレスに適応できる能力を、 Ap₄Aジアデノシンが、細胞内制御分子として制御することを示す証拠がいくつか存在する。従って、Ap₄Aのレベルが正常から逸脱することにより、細胞は、遺伝子の傷害を引き起こす発癌物質またはウイルスにより与えられる環境的なストレスに適応できなくなる可能性がある。６．３．材料および方法組織および細胞系食道、結腸および胃の原発癌の患者由来の、マッチングした正常組織および癌組織を手術直後に得た。ＤＮＡの調製前に、腫瘍を切開し、正常な組織を除去した。多くの細胞系をATCCから得た。RC腎細胞系はＥ．ラッティメ(E.Lattime)の好意により提供された。ＲＮＡ抽出および逆転写全ｍＲＮＡおよびポリA⁺mＲＮＡを、それぞれ、RNAzolキット（TelTest，Inc. 、テキサス州）またはFastTrack Kit（Invitrogen）を用いて、細胞系および組織から抽出した。組織からｍＲＮＡを得るには、新鮮な標本を切除した直後に凍結させ、ｍＲＮＡを抽出するまで、-85℃または液体窒素中に保存した。ＲＮＡは、エタノール下ペレットとして、またはRNAseを含まない水中に溶解させて保存し、-70℃に維持した。逆転写は、30μｌの最終容量の50 mM トリス塩酸pH 8. 3、75 mMKCl、３mM MgCl₂、10 mM DTT)２μM dNTP、500 ngオリゴdT、600ユニット MMLV-RT(BRL)、40ユニット RNasin（Promega）および２μｇＲＮＡ中で行った。この反応液を37℃で90分間インキュベートし、５分間沸騰させた。ＤＮＡ配列解析ｃＤＮＡ、ゲノムクローンおよび推定エキソンは、ベクター隣接配列に特異的なプライマー（T3、T7など）および様々な合成オリゴヌクレオチドを用いて、配列決定した。RT-PCR産物は、低融点アガロースからバンドを切り出し、カラムクロマトグラフィー（Qiagen、Chatsworth、CA）で精製した後、直接配列決定した。二本鎖プラスミド、PCR産物およびファージまたはコスミドのゲノムクローンの配列決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems,Inc(ABI)）を用いて行った。反応生成物を電気泳動させ、373または 377ＤＮＡシーケンサー(ABI)で記録した。配列は、GCG、BLAST、およびGRAILソフトウェアを用いて解析した。PCR 増幅プローブ、PCR産物およびRT-PCR産物を生成するためのオリゴヌクレオチドは、コンピューター・プログラム・オリゴ4.0（National Biosciences）を用いて設計した。サザンブロット用のプローブは、結果に示されているような、様々な FHIT特異的プライマーを用いて、PCR増幅により作製した。いくつかのプライマーの配列および位置を図２Ａに示す。 PCR反応は、1〜100 ngの鋳型、20〜40 ngのプライマー、10 mMトリス塩酸pH8. 3、50 mM KCl 0.1mg/mlゼラチン、15 mM MgCl₂、200〜600 mM dNTPおよび0.5〜2 .5ユニットTaqポリメラーゼ(ABI)を用いて、12.5または25μｌの最終容量で行った。増幅は、Parkin-Elmer Cetusサーマルサイクラーにて、94℃30秒間（変性）、特定のプライマー対により変化するが60℃30秒間（アニーリング）、および72 ℃30〜45秒間（伸長）を30サイクル繰り返して行った。PCR産物は、低融点アガロースゲルを臭化エチジウムで染色することにより可視化した。増幅されたＤＮＡのバンドをゲルから切り出し、標識または配列決定のため精製した。ＤＮＡ調製およびサザンブロットハイブリダイゼーション通常の方法を用いて、細胞のＤＮＡを単離し、サザンブロットを調製した。プローブを[³²P]-dCTP（NEN）でランダムプライミングにより標識し、0.75Ｍ NaCl 、50％ホルムアミド中、42℃で一晩、メンブレンにハイブリダイズさせた。メンブレンの最終的な洗浄は、0.1×SCCおよび0.1％SDS中65℃で30分間行った。ハイブリダイズさせたフィルターを、１〜72時間、増感スクリーンを用いてXAR-2 Ｘ線フィルム（Kodak）へ感光させた。YAC の同定本発明者ら、および他者（Boldog et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90: 8509-8513; Bo1dog et al.，1994，Genes Chrom.Cancer 11:216-221; Wilke eta l.，1994，Genomics 22:319-326; Michaelis et al.，1995，Cancer Genet.Cyto genet．81:1-12; Kastury et al.，1996，Genomics,印刷中）は、以前に、 Genothon mega YACライブラリー由来の850A6クローンが、D3S1300マーカーおよびD3S1481マーカーを含むことを見出した(Roche et al.,1994,Hum.Mol.Genet.3: 215)。重複YACは、Genethonデータベースの情報を解析することにより同定した。領域特異的STSの同定 850A6 YACを用いた本発明者らの研究から、多数のSTSが利用可能であった。A6 URAマーカーは、850A6 URA末端由来であり、A3は、850A6の Alu−ベクタレット（vectorette）増幅断片である。BE758-6およびD3S1480増幅断片を、末端配列が得られたファージ・ゲノムクローンを選択するためのプローブとして使用し、配列をタグ付けした。D3S1300のファージ・ゲノムクローンは、850A6ファージライブラリーから選択し、末端クローンD1300E3を単離した。他のD3SおよびWIマーカー・プライマー対は、Research Geneticsより入手したか、またはWIデータベースに提供されている配列から合成した。648D4 YAC由来のファージ・ゲノムサブクローンの配列決定から、(TAA)₁₅トリヌクレオチド反復を見出し、遺伝子座ph1 3と命名した。AP4/5 STSは、648D4 YACのコスミド・サブクローンの部分配列決定に由来した。コスミド・マッピングアガロースゲル中の酵母ＤＮＡを含む高分子量YACをSau3AI酵素で部分分解し、コスミドベクターへサブクローニングした。このコスミドライブラリーを、まず、この領域に既にマッピングされているSTSに由来するＤＮＡプローブでスクリーニングした。新規なSTSを発見し、コスミドライブラリーを再スクリーニングするためのプローブとして用いるため、コスミドベクターに隣接する挿入ＤＮＡの末端を配列決定した。エキソンの捕捉およびｃＤＮＡクローニングコスミドＤＮＡをSau3AI酵素で部分分解し、1.0％アガロースゲル上を泳動させ、２kbpより大きい断片を切り出し、そして取扱説明書に従って、pSPLベクターへサブクローニングし、COS-7細胞にトランスフェクトした。ベクターのスプライス部位間に捕捉されたＤＮＡインサートを、ベクター(GIBCO/BRL)と共に供給されたプライマーにより配列決定した。エキソン特異的プライマー（X8、ヌクレオチド-19位〜-41位）およびRACE反応キット（Clontech）を用いて、全ヒト胎児脳ｃＤＮＡをPCR増幅することにより、ｃＤＮＡを５’方向に伸長させた。正常結腸ｃＤＮＡライブラリーは、Clontechから購入した。FHIT エキソンのマッピング FHIT遺伝子のエキソン−イントロン接合部のゲノム配列は、ｃＤＮＡに由来するプライマーを用いて陽性コスミドを配列決定することにより決定した。FHIT遺伝子の各エキソンの位置は、YACを含む各エキソンに由来するプライマーを用い、鋳型として第３染色体ハイブリッドＤＮＡを用いてPCR増幅することにより決定した。エキソン５に隣接するｃＤＮＡプローブを得るために用いたプライマー配列は、５’隣接エキソンについては、5’TCTGCTCTGTCCGGTCACA3’（配列番号7 0）(ヌクレオチド-355位〜-337位)およびプライマーX8(図２Ａに示されている) ；３’隣接エキソンについては、5’ATGTCCTTGTGTGCCCGCT3’（配列番号71）（ヌクレオチド105位〜123位）および3D2（図２Ａ参照）であった。ノーザンブロット法およびハイブリダイゼーション mRNA２μｇを、１×MOPS緩衝液および2.2Mホルムアルデヒド中の1.5％アガロースゲルを通して電気泳動し、正に荷電した膜へ標準的な方法でブロットした。多数の正常組識mRNAのノーザンブロットフィルターは、カリフオルニア州パロアルトのクローンテック社(Clontech)から購入した。ハイブリダイゼーション用FH IT cDNAプローブは、次のプライマーのペア、すなわち5'-TGAGGACATGTCGTTCAGAT TTGG-3'(配列番号72)、nuc.#-7から17；および5'-CTGTGTCACTGAAAGTAGACC-3'(配列番号73)、nuc.#449から429、を用いたPCR増幅用のテンプレートとしてFHIT cD NAを使用して得た。プローブを[³²P]-dCTPによるランダムプライミングで標識化し、２×10⁶cpm/mlを各々のフィルターへハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、SSPE緩衝液（５×SSPE、10×デンハート溶液、0.1mg/mlのキャリアーDNA、50％のホルムアミド、２％のSDS）中において42℃で16時間行った。最後の洗浄は、増強スクリーンの両側でXAR-2フィルム（コダック社）へ−80℃で曝露する前に、0.1×SSC、0.1％SDS中で、50℃、30分間行った。 nested RT-PCRおよびcDNAの配列決定まずcDNAストランドを合成し、各生成物１μlを図2Aに示すような5U2および3D 2プライマーを用い、標準的条件下、５％のジメチルスルフォキシドと0.5mMのスペルミジンとを含む10μｌ反応容量中で、95℃で２０秒間、60℃で30秒間そして 72℃で１分間の30サイクルを行うPCR増幅の第一ラウンドに供した。反応生成物１μlを20倍に希釈した後、反応容量を30μlとしたこと以外は上記と同じ条件下において、nestedプライマー5U1および3D1（図2Aに示す）を用いた第二ラウンドのPCR増幅に供した。このPCR生成物を1.5％アガロースゲルに流し、エチジウムブロマイドで染色し、精製し、そのうちの2.5ngを5U1プライマーを用いて配列決定した。 in vitro転写および翻訳 FHIT遺伝子を含むDNAの３つの異なる断片を、オリゴヌクレオチドであるUR5(5 '-CTGTAAAGGTCCGTAGTG-3'(配列番号74)、nuc.#-171から−154まで、図2A)および O6(5'-CTGTGTCACTGAAAGTAGACC-3'(配列番号75)、ｎuc.#429-449の逆補体（rever se complement))を用いたPCRにより得た。増幅はOmni Gene Thermal Cyclerを用い、最終容量100μlの10mMのトリス−HCl(pH8.9)、50mMのKCl 1.5mMのMgCl₂、20 0μMのデオキシヌクレオチドトリホスフェート、10ngのRT-PCR生成物および2.5U のTaqポリメラーゼ中で行った。25サイクルのPCRは、94℃で１分間、52℃で１分間および72℃で45秒間の伸長工程から成っていた。PCR生成物を、TAクローニングシステム（インヴィトロジェン社）を用いてPCRIIプラスミドの中へ別々に挿入した。T7プロモータの制御下で正常型FHITおよび異常型遺伝子を含む組換えベクターを配列させ、そしてin vitroの転写および翻訳に用いた。 in vitro転写と翻訳反応は、1/2容量のウサギ網状赤血球溶解物、１μgの組換えプラスミドDNA、10UのT7ポリメラーゼ、20μMのアミノ酸混合物(メチオニン不含)、40μMの³⁵s-メチオニン（アマーシャム社）および40UのRNasinリボヌクレアーゼインヒビターを含む50μlの最終容量の中でTnT共役網状赤血球システム（プロメガ社）により行った。反応は、30℃で90分間行った。合成されたタンパク質を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびオートラジオグラフィーで分析した。７．3p14.2のFHIT遺伝子は、肺ガン中では異常である FHIT遺伝子は、腎臓細胞ガン腫のファミリーでみられるt(3;8)染色体転座によって分裂し、種々のヒトのガンから誘導された細胞系中の標的ホモ接合体欠失およびFRA3B脆弱部位を含んでいる。本明細書の第６章に記載の研究は、FHIT遺伝子異常は一次性の消化管ガンでしばしば発生することを示している。染色体３の短腕（short arm）の欠失はきわめて高い頻度で、そして肺ガン発生の初期に発生し、このことはこの染色体領域が肺ガンの発達に関する決定的な遺伝子を含有していることを示唆している。本発明者らは染色体バンド3p14.2にあるFHIT遺伝子を単離し、それがFRA3B脆弱部位を含んでいることを見出した。この遺伝子は腎臓細胞ガン腫のファミリーで見られるt(3;8)転座で分裂し、そして種々のヒトの悪性腫瘍において対立遺伝子の損失を示す領域に存在する。第７章に記載のこの研究において、本発明者らは発ガン性物質への曝露（carcinogen ic exposure）に関連するガン、すなわち小細胞および非小細胞型の肺ガンにおけるFHIT遺伝子の役割を分析した。59例の腫瘍および対応する正常肺組識の分析は、FHIT転写物の逆転写、ついで生成物のPCR増幅と配列決定とにより行った；遺伝子に影響を与える対立遺伝子の欠失はマイクロサテライト多型分析（micros atellite polymorphisms analysis）によって調べた。約80％の小細胞肺腫瘍と4 0％の非小細胞肺ガンは、FHITのRNA転写物の異常を示し、また88％の腫瘍はFHIT 対立遺伝子の欠失を示した。異常な肺腫瘍転写物は、FHIT遺伝子の２つ又はそれ以上のエキソンを欠如している。また異常転写物を示すケースはすべて、FHIT遺伝子の１つの対立遺伝子を欠失していた。この結果は、ほとんどすべてのSCLCおよびNSCLCの大部分におけるこの遺伝子の異常性を示しており、それは肺ガン発生におけるFHIT遺伝子の重大な役割を示唆している。 7.1．結果 RT-PCRおよびcDNA配列分析小細胞肺ガン(SCLC) 腫瘍および正常組織からのFHIT転写物における異常性を研究するため、本発明者らは方法のところで述べたようにしてmRNAを逆転写しそしてnested PCRによってcDNAを増幅した。一次性腫瘍サンプル14例および細胞系１例（83L）について研究をおこなった。２例においては、対応する正常な肺実質もまた分析した。RT -PCRで分析した14例のうち11例（７９％）は、異常転写物の存在を示した（図11 )。一次性腫瘍からの増幅転写物の分析は、常に−360bp（タイプＩ）と−250bp( タイプII)の２つの異常なバンドの存在を示した。７例においてはタイプＩとタイプIIの両方の異常転写物を示し、一方、４例においてはタイプＩのバンドのみを示した。腫瘍に由来する細胞系(図12、83L)の場合と同じように２つのサンプル（図IIA、107；図12A、45）においては、正常なサイズの転写物は検出されず、これに対し他の９例においては種々の強度の正常サイズのバンドが観察された。ある一人の患者（図12A、８３）について本発明者らは、一次性腫瘍、腫瘍由来細胞系および正常肺検体について試験した。正常な肺では正常な転写物のみが検出されたのに対し、一次性腫瘍では正常サイズ転写物と共にタイプＩとIIの異常転写物を示すとともに、腫瘍由来の細胞系はタイプＩ異常転写物および〜420b pの新しいバンド（図12）を示し、これば多分in vitro継代培養によって発生したものであろう。従って、この細胞系の細胞遺伝学的分析は、二動原体および三動原体の染色体、テロメア対合ならびに二重微小染色体の存在が広範な染色体の不安定性により生じることを明らかにした。染色体３のペインティングプローブ(painting probe) についてのFISH分析は、3pアームの3p14-21の切断点との転座（データは示してない）を含むこの染色体のいくつかの構造的再構成の発生を示した。興味あることには、細胞系においては、正常サイズの転写物は検出不能であり、これは一次性腫瘍で観察された正常サイズ生成物は腫瘍検体に侵入する正常細胞の存在を反映するものであることを示唆している。異常および正常サイズのバンドをアガロースゲル上で分離し、切断しそして配列決定した(図12B)。異常バンドの配列分析は、タイプＩの転写物はFHIT cDN Ａ配列（ジーンバンク登録番号#u46922が付与される）の４から６までのエキソン（nt-111から249）の不存在に対応することを示し、FHIT cDNAの３と７とのエキソン間の結合を生じる。３と９とのエキソンの融合を生じる４から８までのエキソン（nt-111から348）の欠失は、タイプIIの転写物において見出された。異常転写物の各々において、融合結合はスプライス部位と一致していた。正常サイズのバンドの配列分析は、それらバンドは正常のFHIT cDNAを含有することを示し、それはたぶん腫瘍検体に侵入した正常細胞の寄与を反映するものであろう。いずれのタイプの異常転写物も、FHITのオープンリーディングフレームの開始メチオニンコドンを含有するエキソン５を欠如しており（第６章参照）、またタイプIIの転写物も高度に保存されたHITモチーフを含有するエキソン８を含む殆ど全コーディング領域を欠如しているので（第６章参照）、これらの異常融合転写物はFHIT機能の欠如をもたらすものと思われる。正常組織（４５および８３）から増幅した正常サイズのRT-PCR生成物の配列は、野生型のFHIT転写物の存在を明らかにした。非小細胞肺ガン（NSCLC） 45例の一次性NSCLC腫瘍および対応する正常肺実質サンプルからのRNAを、同様に調べた。45例の腫瘍のうち18例(40％)は異常RT-PCR生成物を生じた。これらの結果の詳細な記載を表４に要約する。表４ RT-PCR、配列決定およびNSCLCにおけるLOH結果Ｎ＝正常転写物Ａ＝異常転写物 △ 正常の肺実質では、del ex3→9 ° 分析した遺伝子座: D3S4103,(ph13),D3S1234,D3S1313,D3S1312 NE:評価せず NI:情報なしこれらの腫瘍の中に存在する転写物からのRT-PCR増幅生成物は、常に正常サイズの転写物を伴う一つまたは二つの異常バンドから成っていた(図13A)。同じ肺ガン症例からの対応する正常肺RNAは、対応する腫瘍で観察された異常生成物からのサイズの異なる異常生成物をもつ１例(表４の例３)以外はすべて、正常なFH IT生成物のみの存在を示した。異常フラグメントの配列分析は、４から８のエキソンを欠失したRT-PCR生成物を含み、３および９のエキソン(nt-111から348)の結合を生じさせる、４から９までの種々のエキソンを欠失した一連のRT-PCR生成物（表４および図13b）を示した。この生成物はエキソン３から７または８までが融合してエキソン４から６または７までが夫々欠如しており、さらにエキソン５からエキソン７または８までが欠如してエキソン４と８との間またはエキソン４と９との間が夫々結合しているものである。観察されたすべてのタイプの異常転写物は最初のコーディングエキソンであるエキソン５を欠如しており、かつ配列分析により特徴づけられる異常転写物の半数（6/12）もまたHITドメインを含むエキソン８の欠如を示した。これらの患者の正常組織からのRNAから増幅した正常サイズの転写物の配列分析は、正常なFHIT cDNA配列を示した。FHIT遺伝子のオープンリーディングフレームの外側にある450から460までのヌクレオチドからのエキソン10の初めの小さな選択的スプライス領域は、腫瘍の中および数名の患者の対応正常組織の中に存在する正常サイズの転写物の中に観察された。ヘテロ接合体欠失（L0H）の分析腫瘍サンプルにおける対立遺伝子の欠失を調べるために、FHIT遺伝子の内部の及びFHIT遺伝子に隣接する多型マイクロサテライトマーカーを増幅するプライマーを用いたPCRに基づくアプローチ行った。腫瘍からのDNAならびに28例のNSCL Cおよび７例のSCLCからの対応する正常組織を用い、FHIT遺伝子の内部のD3S4103 遺伝子座（ph13）（第６章参照）における対立遺伝子の欠失、ならびにFHIT遺伝子のフランキング領域、セントロメリック（3p14.2におけるD3S1312）（Druck e t al.，1995,Cancer Res.55:5348-5353）およびテロメリック（3p14.2におけるD 3S1234および3p14.3におけるD3S1313）に位置する遺伝子座（表５参照）における対立遺伝子の欠失についての分析を行った。表５ SCLCおよびNSCLCの3p14.2遺伝子座におけるL0H頻度遺伝子座D3S4103およびD3S1234におけるNSCLCサンプルLOHは、21の情報供与例のうち17例（81％）で見出された。これら二つの遺伝子座に影響する欠失の総頻度は88％（26の情報供与例のうち23例）であった。腫瘍13例のうち10例（76％）および11例のうち９例（81％）においてもまたD3S1312およびD3S1313遺伝子座において夫々L0Hが見られ、これはこの遺伝子領域における大きな欠失を示すものであった。SCLC症例においては、情報供与患者４例のうち３例がD3S4103およびD 3S1234でL0Hを示し、さらに情報供与患者５例のうち４例はこれら遺伝子座の少なくとも一つを欠失していた。異常FHIT転写物をもつ情報供与腫瘍12例のうち全部で12例（100％）が、検査した遺伝子座の一つまたはそれ以上において対立遺伝子の欠失を示していた。 7.2.考察 3p25、3p21.3-p21.2および3p12-p14.1を含む三つの別個の染色体3p領域は、一次性腫瘍における高い頻度での対立遺伝子の欠失に基づく肺ガンに含まれる遺伝子を有していると考えられ、これは細胞系から誘導された肺ガンにおけるホモ接合体欠失と定義される；これらの染色体領域における腫瘍抑制遺伝子を単離すべく小さな共通の欠失領域を決定するための大きな努力が払われた。 3pの欠失は、特に有用な遺伝子マーカーを構成する。何故ならば、それらマーカーは、例えば気管支異形成症や化生(Sundaresan et al., 1992, Oncogene 7:1 989-1997; Szzi et al., 1991, Cancer Res. 51:400-404; Hung et al., 1995,J AMA 273:558-563)のような肺ガン発生の初期段階において発生する旨の幾つかの研究が報告されているからである。さらに一次性SCLCにおける染色体3pでの対立遺伝子欠失は、好ましからぬ予後の要因であることが示唆されている(Horio et al., 1993, Cancer Res.53:1-4)。ここに開示した研究は、少なくとも80％のSCLCおよび40％のNSCLCにおいて3p1 4.2に位置するFHIT遺伝子の転写物において異常が発生すること、並びにそれら症例のうち88％は一つのFHIT対立遺伝子の欠失をも示すことを記載している。ne sted RT-PCR増幅はFHIT遺伝子転写物での内部変化のみを検出するものであろうから、これはSCLCおよびNSCLCにおけるFHIT遺伝子の関与の保守的な評価である。肺ガン転写物は、FHIT遺伝子の二つ以上のエキソンを欠失していた。NSCLCにおいては種々のパターンの異常転写物が検出されたが、SCLCにおいては増幅転写物は４から６のエキソンまたは４から８のエキソンが欠失していた。いずれのタイプにおいても開始メチオニンコドンを含むエキソン５の欠失をもたらし(第６章参照)、また第二のタイプでは高度に保存されたHITドメインを含むエキソン８の欠失を示している(第６章参照)。これらエキソンの欠失がもたらす結果は、インフレームフィットタンパク質（in-frame Fhit protein）が生産されないことである。一次性SCLCおよび腫瘍細胞系の２例は正常サイズの転写物を欠如しており、これはまた残りの症例においても充分には確認されなかった。さらに、一次性腫瘍の１例では二つの異常転写物と一つの正常転写物を示し、一方、この腫瘍から誘導された細胞系からは正常サイズの生成物は増殖されなかった。これらの所見は、SCLC RNAにおいては野生型の転写物は混合された正常細胞に由来するものであることを示唆するものである。 NSCLCからのRNAにおいては、異常なRT-PCR増幅生成物は正常サイズのRT-PCR増幅生成物よりも量が少ない場合があった。これについては、種々の遺伝的変化をもつ種々の細胞クローンの存在を生じさせる気管支「部位(field)」全体の発ガン物質への慢性的曝露の結果としておこる、これら新生物の異種の性質によって説明され得るであろうし、時には多面的な性質によっても説明され得るであろう (Kim et al., 1993, Am. J. Pathol. 142:307-317; Barsky et al.,1994, Mod. Pathol. 7:633-640; Ebina et al.，1994，Cancer Res. 54:2496-2503)。さらに、これら腫瘍サンプルは種々の量の正常な基質組織を含有していた（基質浸入は非小細胞腫瘍でおこることが知られている）(Rabbitts et al., 1989, Genes Ch rom. Cancer 1:95-105)。SCLC細胞系および幾つかのSCLC一次性検体に見られる完全な対立遺伝子欠失ならびにNSCLCにおける対立遺伝子の完全な欠失の欠如は、この解釈を支持するものである。異常転写物はまた野生型生成物よりも不安定である場合もあり得る。異常な腫瘍転写物を示す患者の対応正常組織において、本発明者等はPCRおよび配列分析によって正常なFHIT生成物を観察した。特に興味があったのは、後に腎臓細胞ガン腫に発達したところの１例の肺の粘液類表皮腫（mucoepidermoid carcinoma）のNSCLC患者（表４の例３）である。この患者の正常肺実質中において、エキソン４から８が欠失している異常転写物が検出された。この発見は、FHIT遺伝子内での構造変化は、肺ガンならびに腎臓ガンまたは他のタイプの多数の一次性腫瘍に発展する素因に関連しているという可能性を提起するものである。しかし、この変化は体性的に得られたものであろう。というのは、発ガン物質への曝露は、初期の前新生物障害においてもまた検出される種々の遺伝的変化の誘発による気管支上皮細胞の幾つかの部位での形質転換を誘発できるからである。小細胞および非小細胞の両タイプの肺ガンで見られる一つのFHIT対立遺伝子の高頻度（88％）の欠失は、注目すべき事である。本発明者等は、その症例での欠失の最小領域を決定できなかったけれども、これらの発見は、FHIT遺伝子の不活性化は１つの対立遺伝子の欠失のメカニズムによって発生し、さらに残りのものの発現を変えるという考え方を支持するものである。このモデルは、FHIT遺伝子が、たとえば欠失のような異常が点突然変異よりも頻繁であるような一般の脆弱領域のFRA3Bに及んでいるという観察と一致している。空気消化管（aerodigestive tract）のガンのような発ガン性物質への曝露と関連する腫瘍は、FHIT遺伝子の変化に特に感受的である。肺ガンはその病因の故に、タバコの煙に含まれているニコチンやベンゾ(a)ピレンのような変異原のようなDNA修復を妨げる物質の効果と、強力にかつ直接に関連するものと思われる。すなわち物理的、化学的および生物学的物質の結果としての脆弱部位を含む遺伝子の破損は、予期可能である。ガン患者の末梢血液リンパ球のFRA3B脆弱部位の発現性の研究が行われている；FRA3Bの発現は、常習的な喫煙によって影響されるようであり、そして極めて高度の発現が肺ガン患者において報告されている(Murata et al., 1992, Jpn. J. Hum. Genet. 37:205-213)。高いレベルの細胞内ジアデノシン5',5'''−P1,P4テトラホスフェート(Ap4A)が、G1-S境界で検出されており(Weinmann-Dorsch et al., 1984, Eur. J. Biochem . 138:179-185)、DNAポリメラーゼ活性の刺激におけるAp4Aの役割が報告されている(Baxi et al., 1994, Biochemistry 33:14601-14607)。FHIT遺伝子の機能の欠失は、Ap4Aの構成的蓄積をもたらし、そしてDNA合成と増殖の刺激をもたらすようである。すなわちFHIT機能の欠失は、消化管ガンおよび肺ガンの前駆物質である細胞の増殖を刺激することによって悪性プロセスを開始させ得る。 7.3．実験方法腫瘍 25例の腺ガン、19例の偏平上皮ガン、１例の粘液類表皮腫および14例の小細胞肺ガンを含む59例の腫瘍を、国立腫瘍研究所（Istituto Nazionale Tumori ）（イタリア、ミラノ）における外科的切除手術の肺ガン患者から得た。一つの細胞系（83L）を一つの小細胞腫瘍（83T）から樹立した。29例のNSCLCは第１期、９例は第２期、そして６例は第３期であった。腫瘍を、世界保健機関（World Health Organization）の「肺腫瘍組織学的タイプ」(1987)に従って組織学的に分類し、そして「対ガン国際連合」(International Union Against Cancer)の定める悪性腫瘍のTNM分類(1987)に従って各期に分けた。殆どの症例（59例のうち5 4例）は男性患者であり、試験を行った症例の平均年齢は63であった。対応する正常肺実質組織サンプルを、正常RNAおよびDNA源として、腫瘍から最も離れた部位からまたは異なったセグメントもしくは部分から採取した。 RNA抽出と逆転写腫瘍および正常検体を外科的切除の直後に冷凍し、−80℃で保存した。全mRNA を、グアニジニウム-LiCl分離法（Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY）またはRNA-STATキット（Tel TEST,Inc.,Texas）を用いることにより、凍結腫瘍または正常肺組織から抽出した。逆転写は、20μl容量の１×第一ストランド緩衝液( GIBCO)、10mMのDTT(GIBCO)、500μMのdNTP、50ng/μlのオリゴ-dT、0.3μg/μl のランダムプライマー、16.5UのRNAsin(PR0MEGA)、300UのスーパースクリプトUU (GIBCO)の中で行った。まずサンプルを95℃で５分間変性し、そして37℃で60分間インキュベーションした。酵素を94℃で５分間不活性化することにより反応を停止させた。反応液を30μlまで希釈し、そのうちの１μlを次のPCR増殖に用いた。 RT-PCRおよびcDNA配列決定１μlのcDNAを、0.8μMのプライマー5U2および3D2(第２章参照)、50μMの各dN TP(TAKARA)、１×PCR緩衝液ならびに1.25U Taqポリメラーゼ(TAKARA)を含有する 25μl容量の中で最初のPCR増幅を行った。このPCR反応は、95℃で３分間の最初の変性ならびに94℃で15秒間、62℃で30秒間、72℃で４５秒間および72℃で５分間の最終伸長の２５サイクルから成り、パーキンエルマーのPCRサーモサイクラーを用いて行った。増幅生成物はTE緩衝液で20倍に希釈し、その希釈反応生成物を上記の条件下でnestedプライマー5U1および3D1（第６章参照）を用い30サイクル行って第二回のPCR増幅を実施した。PCR生成物を、1.5％のエチジウムブロマイドで染色したメタフオールゲル(Metaphor gel)(FMC)で分離した。バンドをゲルから切り離し、DNAをQIAクイックゲル抽出キット（QIAGEN）を使って精製した。PCR生成物のサイズに応じて５〜50ngのcDN Aを、アプライドバイオシステムモデル(Applied Biosystems Models)373Aおよび 377DNA配列決定システムで配列分析をするためにジデオキシヌクレオチドターミネーション反応の化学的手段によりプライマー5U1と3D1とを用いて配列決定した。 L0H分析凍結した腫瘍および正常組織からのDNAを、標準的方法（Sambrook et al.,198 9, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab. Press , Plainview, NY）を用いて抽出した。対立遺伝子の欠失の分析は、PCＲに基づくアプローチで行った。多型マイクロサテライトマーカーを増幅するプライマーを、つぎの遺伝子座、すなわちFHIT遺伝子の内部のD3S4103(ph13)(3p14.2)(第６章参照)、ならびに該遺伝子に隣接するD3S1234(3p14.2)、D3S1313(3p14.3)およびD3S1312(3p14.2)に用いた。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、ゲノムデータベース（Genome Data Base）から入手できる。２0サイクルの増幅を、各々のプライマーに適切なアンニーリング温度である55℃〜60℃で行った。情報供与的の症例の場合は、もし対応する正常対立遺伝子に比べ、腫瘍DNAにおいて１つの対立遺伝子のオートラジオグラフのシグナルが約50％減少していれば、対立遺伝子の欠失を記録した。マイクロサテライトの不安定性を示す遺伝子座は、対立遺伝子の欠失には記録しなかった。8. 微生物の寄託プラスミドp7F1を保持し、pBluescript SK⁺ベクター（Stratagene社）内部へのBamHI-XbaI挿入物としての全長のFHIT cDNAを含有する大腸菌DH5α株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定によりメリーランド州20852、ロックヴィル、1201パークローンドライブのアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に1996年１月30日に寄託され、寄託番号69977として受理されている。本発明は、以上に記載の特定の実施態様によってその範囲が限定されるものではない。以上に記載のもの以外の本発明の様々な修飾は、以上の記載ならびに添付の図面から当業者には自明であろう。そのような修飾は、添付の請求の範囲の範囲内に入ると意図されている。以上に引用した種々の刊行物の開示内容は、参考としてそれらの全てが本明細書に組み込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/00 Ａ６１Ｋ 31/00 ６１９ 35/00 ６３５Ａ６１Ｋ 31/7088 31/70 ６２３ 38/00 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 19/00 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 5/10 21/08 15/01 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 15/02 ＺＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 21/08 5/00 ＢＣ１２Ｑ 1/68 15/00 ＥＡ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ヒューブナー，フランシス，ケイ. アメリカ合衆国 19103 ペンシルバニア州，フィラデルフィア，デランシーストリート 1829

Claims

【特許請求の範囲】１．精製されたFhitタンパク質。２．ヒトのタンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。３．図２Ａ（配列番号２）に示したアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のタンパク質。４．ATCCに寄託されて受託番号69977を指定されたプラスミドp7F1中のFHIT ＤＮＡ配列にハイブリダイズできる核酸によりコードされる、精製されたタンパク質。５．配列番号１のコード領域からなるヌクレオチド配列を有するＤＮＡにハイブリダイズできる核酸によりコードされる、精製されたタンパク質。６．ATCCに寄託されて受託番号69977を指定されたプラスミドp7F1によりコードされる、請求項２に記載のタンパク質。７．図２Ａ（配列番号２）に示したFhitタンパク質配列の少なくとも10の連続アミノ酸を含み、Fhitタンパク質の１以上の機能活性を示す、請求項３に記載のタンパク質の精製された誘導体。８．Fhitタンパク質に対する抗体により結合され得る、請求項７に記載の誘導体。９．請求項７に記載の誘導体を含んでなる分子。 10．請求項３に記載のFhitタンパク質に対して、147アミノ酸のアミノ酸配列にわたって、少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質。 11．細胞の増殖を抑制する、請求項７に記載の誘導体または類似体。 12．Fhitタンパク質ではない第２のタンパク質のアミノ酸配列に共有結合で融合された、少なくとも10アミノ酸からなるFhitタンパク質の断片を含んでなるキメラタンパク質。 13．Fhitタンパク質の断片が抗Fhit抗体により結合され得る断片である、請求項 12に記載のキメラタンパク質。 14．Fhitタンパク質と結合することができる抗体。 15．モノクローナルである、請求項14に記載の抗体。 16．Fhitタンパク質と結合することができる、請求項14に記載の抗体のフラグメントを含んでなる分子。 17．Fhitタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、100 kb未満の単離された核酸。 18．Fhitタンパク質が図２Ａ（配列番号２）に示した配列を有する、請求項17に記載の核酸。 19．ｃＤＮＡである、請求項17に記載の核酸。 20．請求項18に記載のヌクレオチド配列に完全に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸。 21．FHIT遺伝子のイントロンを欠失している、請求項17に記載の核酸。 22．Fhitタンパク質がヒトFhitタンパク質である、請求項17に記載の核酸。 23．ATCCに寄託されて受託番号69977を指定されたプラスミドp7F1中に含まれる FHITコード配列を含んでなる、単離された核酸。 24．ATCCに寄託されて受託番号69977を指定されたプラスミドp7F1中のFHIT ＤＮＡ配列にハイブリダイズできる、単離された核酸。 25．ストリンジェント条件下で、配列番号１のコード領域からなる配列を有するＤＮＡにハイブリダイズできる、100 kb未満の単離された核酸。 26．FHIT ｃＤＮＡまたはＲＮＡ配列の少なくとも310の連続ヌクレオチドを含み、2,000ヌクレオチド未満である、単離された核酸。 27．FHIT ｃＤＮＡまたはＲＮＡコード配列の少なくとも266の連続ヌクレオチドを含む、100 kb未満の単離された核酸。 28．(a)エキソン１、エキソン２、エキソン３およびエキソン４の中から選択される１以上のFHITエキソンのヌクレオチド配列、および(b)エキソン７、エキソン８およびエキソン９の中から選択される１以上のFHITエキソンのヌクレオチド配列、を含んでなる、100 kb未満の単離された核酸。 29．抗Fhit抗体により結合され得るFhitタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸。 30．請求項12に記載のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸。 31．請求項10に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸。 32．請求項17に記載の核酸を含む核酸ベクターを含有する組換え細胞。 33．請求項17に記載の組換え核酸を含有する細胞。 34．請求項28に記載の核酸を含む核酸ベクターを含有する組換え細胞。 35．請求項10に記載の核酸を含む核酸ベクターを含有する組換え細胞。 36．請求項32に記載の組換え細胞を増殖させて、コードされるFhitタンパク質を該細胞から発現させ、発現されたFhitタンパク質を回収することを含んでなる、Fhitタンパク質の産生方法。 37．請求項33に記載の組換え細胞を増殖させて、コードされるFhitタンパク質を該細胞から発現させ、発現されたFhitタンパク質を回収することを含んでなる、Fhitタンパク質の産生方法。 38．請求項34に記載の組換え細胞を増殖させて、コードされるタンパク質を該細胞から発現させ、発現されたタンパク質を回収することを含んでなる、Fhitタンパク質の産生方法。 39．請求項36に記載の方法の産物。 40．請求項37に記載の方法の産物。 41．治療に有効な量のFhitタンパク質および製剤学上許容される担体を含有する医薬組成物。 42．治療に有効な量の請求項３に記載のタンパク質および製剤学上許容される担体を含有する医薬組成物。 43．治療に有効な量の請求項５に記載のタンパク質および製剤学上許容される担体を含有する医薬組成物。 44．治療に有効な量の請求項７に記載のタンパク質および製剤学上許容される担体を含有する医薬組成物。 45．治療に有効な量の請求項12に記載のキメラタンパク質および製剤学上許容される担体を含有する医薬組成物。 46．治療に有効な量の請求項17に記載の核酸および製剤学上許容される担体を含有する医薬組成物。 47．治療に有効な量の請求項29に記載の核酸および製剤学上許容される担体を含有する医薬組成物。 48．治療に有効な量の請求項33に記載の組換え細胞および製剤学上許容される担体を含有する医薬組成物。 49．治療に有効な量の、変異型Fhitタンパク質と免疫特異的に結合するが野生型 Fhitタンパク質とは結合しない抗体、および製剤学上許容される担体を含有する医薬組成物。 50．治療に有効な量の、変異型Fhitタンパク質と免疫特異的に結合するが野生型 Fhitタンパク質とは結合しない抗体のフラグメントまたは誘導体、および製剤学上許容される担体を含有する医薬組成物。 51．染色体3p14.2突然変異と関連した疾病または障害を治療または予防する方法であって、そのような治療または予防を希望する被験者に、治療に有効な量の Fhit機能を促進する分子を投与する、ことを含んでなる方法。 52．前記疾病または障害が細胞の過増殖を伴う、請求項51に記載の方法。 53．前記疾病または障害が悪性疾患である、請求項52に記載の方法。 54．前記悪性疾患が消化管の悪性疾患である、請求項53に記載の方法。 55．前記疾病または障害が食道癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、肺癌、メラノーマ、鼻咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌および子宮癌よりなる群から選択される、請求項53に記載の方法。 56．被験者がヒトである、請求項52に記載の方法。 57．前記疾病または障害が前悪性状態、良性腫瘍、高増殖性疾患および良性増殖不全疾患よりなる群から選択される、請求項52に記載の方法。 58．Fhit機能を促進する分子が、Fhitタンパク質、細胞増殖の抑制活性を示すFh it誘導体または類似体、Fhitタンパク質をコードする核酸、および細胞増殖の抑制活性を示すFhit誘導体または類似体をコードする核酸よりなる群から選択される、請求項52に記載の方法。 59．Fhit機能を促進する分子が請求項３に記載のタンパク質である、請求項52に記載の方法。 60．半接合FHIT突然変異をもつ被験者において細胞の過増殖を伴う疾病または障害を治療または予防する方法であって、半接合FHIT突然変異をもち、かかる治療または予防を希望する被験者に、変異型FHIT遺伝子またはタンパク質を特異的に中和するが、野生型FHIT遺伝子またはタンパク質を実質的に中和しない分子を治療に有効な量で投与する、ことを含んでなる方法。 61．前記分子が被験者の変異型Fhitタンパク質と特異的に結合する抗体またはその結合領域を含む抗体誘導体である、請求項60に記載の方法。 62．前記分子が被験者の変異型FHIT ＲＮＡの発現を特異的に抑制するFHITアンチセンス核酸である、請求項60に記載の方法。 63．被験者に、Fhit機能を促進する分子を投与することをさらに含む、請求項60 に記載の方法。 64．前記分子が、野生型FHIT遺伝子とではなくゲノム変異型FHIT遺伝子との相同的組換えを促進するように、異種ヌクレオチド配列の両端にFHIT遺伝子部分が存在する核酸である、請求項60に記載の方法。 65．前記分子が、(a)少なくとも６ヌクレオチドからなり、(b)FHIT遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含み、そして(c)適度なストリンジェント条件下で該ＲＮＡ転写物とハイブリダイズできる、オリゴヌクレオチドである、請求項60に記載の方法。 66．少なくとも６ヌクレオチドからなり、FHIT遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含み、該ＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズできる、単離されたオリゴヌクレオチド、および製剤学上許容される担体を含有する医薬組成物。 67．(a)エキソン１、エキソン２、エキソン３およびエキソン４の中から選択される１以上のFHITエキソンのヌクレオチド配列、および(b)エキソン７、エキソン８およびエキソン９の中から選択される１以上のFHITエキソンのヌクレオチド配列を含んでなる第２の核酸に完全に相補的な配列を含んでなる、単離された第１の核酸。 68．Fhitタンパク質をコードする核酸配列の細胞内での発現を抑制する方法であって、該細胞に、少なくとも10ヌクレオチドからなり、細胞内でFHIT遺伝子のＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズできる配列を含む核酸の有効量を供給することを含んでなる方法。 69．細胞の過増殖を伴う疾病もしくは障害の存在、または該疾病もしくは障害を発症する素因を診断またはスクリーニングする方法であって、被験者由来のサンプル中のFhitタンパク質、FHIT ＲＮＡまたはFhit機能活性のレベルを検出または測定することを含んでなり、その際、該サンプル中のFhitタンパク質、 FHIT ＲＮＡまたはFhit機能活性のレベルが、該疾病もしくは障害または該疾病もしくは障害を発症する素因をもたない類似のサンプル中のFhitタンパク質、FHIT ＲＮＡまたはFhit機能活性のレベルと比べて低下している場合は、該疾病もしくは障害または該疾病もしくは障害を発症する素因が存在することを示す、上記方法。 70．細胞の過増殖を伴う疾病もしくは障害の存在、または該疾病もしくは障害を発症する素因を診断またはスクリーニングする方法であって、被験者から得られたFHIT ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質中の１以上の突然変異を検出することを含んでなり、その際、１以上の突然変異の存在が該疾病もしくは障害または該疾病もしくは障害を発症する素因の存在を示す、上記方法。 71．FHIT ＤＮＡまたはＲＮＡのエキソン中の突然変異が検出される、請求項70 に記載の方法。 72．FHIT ＤＮＡまたはＲＮＡコード配列中の突然変異が検出される、請求項71 に記載の方法。 73．前記突然変異がFHITコード配列の少なくとも一部の欠失である、請求項71に記載の方法。 74．前記突然変異がFHITエキソン５の少なくとも一部または全部の欠失である、請求項73に記載の方法。 75．前記突然変異が被験者においてFHIT ＲＮＡ中のエキソン８の野生型オープンリーディングフレームの欠失を引き起こす、請求項71に記載の方法。 76．前記突然変異が、野生型FHIT ＲＮＡと比べたとき、異常な大きさまたは配列のFHIT ＲＮＡの存在を検出することにより検出される、請求項71に記載の方法。 77．異常な大きさまたは異常な配列のFHIT ＲＮＡの存在が、被験者由来のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することを含む方法により検出される、請求項76に記載の方法。 78．前記ｃＤＮＡがFHITエキソン５を含む野生型FHIT ｃＤＮＡの断片を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応に付される、請求項77に記載の方法。 79．前記ｃＤＮＡがエキソン４の3'末端とエキソン８の間のFHITエキソン配列を含む野生型FHIT ｃＤＮＡの断片を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応に付される、請求項77に記載の方法。 80．被験者がヒト胎児である、請求項71に記載の方法。 81．被験者がヒト小児または成人である、請求項71に記載の方法。 82．前記突然変異が、被験者由来のＲＮＡまたはそれから作製されたｃＤＮＡを、ハイブリダイゼーションが起こる条件下で、FHIT ＲＮＡまたはｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズできる核酸プローブと接触させ、該ＲＮＡまたはｃＤＮＡと核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出するか、またはハイブリダイゼーションの量を測定することを含む方法により検出される、請求項71 に記載の方法。 83．前記突然変異が、被験者由来のタンパク質を含有するサンプルを、免疫特異的結合が起こる条件下で、抗Fhit抗体と接触させ、該抗体による免疫特異的結合を検出するか、または該結合の量を測定することを含む方法により検出される、請求項72に記載の方法。 84．前記突然変異が、被験者由来のFHIT ＲＮＡをin vitro翻訳にかけることを含む方法により検出される、請求項72に記載の方法。 85．１以上の容器内に、変異型Fhitタンパク質と特異的に結合する抗Fhit抗体、変異型FHIT遺伝子またはＲＮＡと特異的にハイブリダイズできる核酸プローブ、Fhitタンパク質をコードする核酸または細胞増殖の抑制活性を示すその誘導体、およびFhitタンパク質または細胞増殖の抑制活性を示すその誘導体よりなる群から選択される精製分子を含んでなるキット。 86．１以上の容器内に、FHIT ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の少なくとも一部の増幅を開始することができる一対の核酸プライマーを含んでなるキット。 87．前記プライマーがエキソン５を含む野生型FHIT ｃＤＮＡの断片を増幅できるように設計される、請求項86に記載のキット。 88．前記プライマーがエキソン５および６を含む野生型FHIT ｃＤＮＡの断片を増幅できるように設計される、請求項86に記載のキット。 89．前記プライマーがエキソン４の3'末端とエキソン８の間の配列を含む野生型 FHIT ｃＤＮＡの断片を増幅できるように設計される、請求項86に記載のキット。 90．前記プライマーがエキソン１〜10を含む野生型FHIT ｃＤＮＡの断片を増幅できるように設計される、請求項86に記載のキット。 91．容器内に治療に有効な量のFhitタンパク質を含んでなるキット。 92．Fhitタンパク質、機能的に活性なFhitタンパク質の断片、および該タンパク質または断片をコードする核酸よりなる群から選択されるリガンドと特異的に結合する分子の同定方法であって、 (a)該リガンドと多数の分子とを、該リガンドと該分子との結合に導く条件下で接触させ、そして (b)該リガンドと特異的に結合する該多数の分子中の１分子を同定する、ことを含んでなる方法。 93．Fhitタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする核酸を動物に導入することを含む方法の産物である組換え非ヒト動物。 94．前記核酸がそのゲノム内に遺伝的に含まれる、請求項93に記載の動物の子孫。 95．容器内に配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補体の2,000 ヌクレオチド以下で10ヌクレオチド以上の核酸からなる化合物を含んでなる診断用キット。 96．１以上の容器内に一対のプライマーを含んでなる診断用キットであって、各プライマーは15〜35ヌクレオチドからなり、該一対のプライマーの少なくとも１つは配列番号１またはその相補体にハイブリダイズすることができ、該一対のプライマーは核酸増幅反応においてＤＮＡ合成を開始させることができる、上記キット。 97．ATCCに寄託されて受託番号69977を有するプラスミドp7F1。 98．被験者において細胞の過増殖を伴う疾病をモニターする方法であって、被験者由来のサンプル中のFHIT ＲＮＡまたはｃＤＮＡまたはタンパク質の量を検出または測定することを含んでなり、その際、早期に被験者から得られたサンプル中に存在するものと比べて、変異型FHIT ＲＮＡまたはｃＤＮＡまたはタンパク質発現の増加、または野生型FHIT ＲＮＡまたはｃＤＮＡまたはタンパク質の低下が疾病の進行を示すものである、上記方法。 99．被験者において細胞の過増殖を伴う疾病の反対の治療結果または再発へ向かう個体素因を検出する方法であって、被験者のFHIT遺伝子の１以上の突然変異を検出することを含んでなる方法。 100.前記疾病または障害が消化管の悪性疾患である、請求項69または70に記載の方法。 101.前記疾病または障害が肺癌である、請求項69に記載の方法。 102.前記疾病または障害が肺癌である、請求項70に記載の方法。 103.前記疾病または障害が小細胞肺癌である、請求項102に記載の方法。 104.前記疾病または障害が非小細胞肺癌である、請求項102に記載の方法。 105.FHIT遺伝子の１つの対立遺伝子の欠損を検出することをさらに含み、前記疾病または障害が肺癌である、請求項72に記載の方法。 106.前記突然変異がFHIT ＤＮＡまたはＲＮＡ中の２以上のエキソンの欠失である、請求項73に記載の方法。 107.前記突然変異がFHITエキソン５の少なくとも全部の欠失である、請求項102 に記載の方法。 108.前記突然変異がFHIT ＲＮＡまたはｃＤＮＡ中のエキソン３配列のエキソン７配列への融合をもたらすFHITエキソン４〜６の欠失である、請求項102に記載の方法。 109.前記突然変異がFHIT ＲＮＡまたはｃＤＮＡ中のエキソン３配列のエキソン９配列への融合をもたらすFHITエキソン４〜８の欠失である、請求項102に記載の方法。