DE69735939T2

DE69735939T2 - Fhit proteine und nukleinsäuren sowie darauf basierende verfahren

Info

Publication number: DE69735939T2
Application number: DE69735939T
Authority: DE
Inventors: M. Carlo Philadelphia CROCE; K. Frances Philadelphia HUEBNER
Original assignee: Thomas Jefferson University
Current assignee: Thomas Jefferson University
Priority date: 1996-02-09
Filing date: 1997-02-07
Publication date: 2007-01-25
Anticipated expiration: 2017-02-08
Also published as: ATE327326T1; US6774217B1; US20050074797A1; EP1795203A3; DE69735939D1; US6242212B1; WO1997029119A1; AU2262197A; EP0892809B1; EP0892809A1; JP2000502570A; US7220834B2; US20040265316A1; US20070178105A1; EP0892809A4; EP1795203A2

Description

Diese Erfindung wurde zum Teil mit der Unterstützung durch die Regierung gemacht, mit den vom National Cancer Institute unter den Nummern CA51083, CA39860, CA21124 und CA56336 zuerkannten Stipendien. Die Regierung hat gewisse Rechte an der Erfindung.
1. EINLEITUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleotidsequenzen der FHIT Tumorsuppressorgene und Aminosäuresequenzen der von ihnen codierten Proteine sowie Derivate und Analoga derselben und Antikörper hierfür. Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der Nucleotidsequenzen der FHIT-Gene und der Aminosäuresequenzen der von ihnen codierten Proteine sowie der Derivate und Analoga derselben und der Antikörper hierfür als diagnostische und therapeutische Reagenzien für den Nachweis und die Behandlung von Krebs. Die vorliegende Erfindung betrifft auch therapeutische Zusammensetzungen, umfassend Fhit-Proteine, Derivate oder Analoga derselben, Antikörper hierfür, Nucleinsäuren, die die Fhit-Proteine, Derivate oder Analoga codieren, und FHIT Antisense-Nucleinsäuren.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Krebs bleibt eines der schwerwiegendsten Gesundheitsprobleme in Amerika und ist der Grund für eine beträchtliche Zahl von Todesfällen und erhebliche Gesundheitskosten der Gesellschaft. Die Tumorgenese bei Menschen ist ein komplexer Prozess, der die Aktivierung von Oncogenen und die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen mit sich bringt (Bishop, 1991, Cell 64:235-248). Tumorsuppressorgene bei Menschen sind identifiziert worden durch Untersuchungen von genetischen Änderungen, die bei Krebszellen auftreten (Ponder, 1990, Trends Genet. 6:213-218; Weinberg, 1991, Science 254:1138-1146).
Es gibt einen engen Zusammenhang zwischen bestimmten chromosomalen Abnormitäten, z.B. chromosomalen Translokationen, Inversionen und Deletionen, und gewissen Arten von Malignität, die darauf hinweisen, dass derartige Abnormitäten eine verursachende Rolle bei Krebs haben können. Chromosomale Abnormitäten können zu Genfusion führen, woraus chimäre Oncoproteine resultieren, wie es z.B. bei der Mehrzahl der Tumoren beobachtet wird, bei denen myeloische Abstammung (myeloid lineage) beteiligt ist. Alternativ können chromosomlae Abnormitäten durch ihre direkte Nachbarschaft zu einem regulatorischen Element, das in hämatopoetischen Zellen aktiv ist, zur Deregulierung von Protooncogenen führen, wie es z.B. bei der Translokation beobachtet wird, die bei lymphozytischer Abstammung (lymphocytic lineage) auftritt (Virgilio et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9275-9279). Deletionen können den Verlust von Tumorsuppressorgenen verursachen, was zu Malignität führt.
Nicht-zufällige chromosomale Translokationen sind charakteristisch für die meisten menschlichen hämatopoetischen Malignitäten (Haluska et al., 1987, Ann. Rev. Genet. 21: 321-345) und können an einigen massiven Tumoren (Croce, 1987, Cell 49:155-156) beteiligt sein. In B- und T-Zellen treten chromosomale Translokationen und Inversionen oft als Folge von Fehlern während des normalen Rekombinationsprozesses der Gene für Immunoglobuline (Ig) oder T-Zellrezeptoren (TCR) auf. Diese Umlagerungen bringen Enhancer-Elemente der Ig- oder TCR-Gene in direkte Nachbarschaft zu Oncogenen, deren Expression dann dereguliert wird (Croce, 1987, Cell 49:155-156). In der Mehrzahl der Fälle treten die Umlagerungen, die bei lymphoiden Malignitäten beobachtet wurden, zwischen zwei unterschiedlichen Chromosomen auf.
Der TCL-1 Locus auf Chromosom 14, Bande q32.1, ist häufig beteiligt an den chromosomalen Translokationen und Inversionen mit den T-Zellrezeptorgenen, die beobachtet werden bei einigen postthymischen Arten von T-Zell-Leukämien und Lymphonen, einschließlich T-Prolymphozytenleukämien (T-PLL) (Brito-Babapulle und Catovsky, 1991, Cancer Genet. Cytogenet. 55:1-9), akuten und chronischen Leukämien, die mit dem Immunschwäsche-Syndrom Ataxia teleangiectasia (AT) (Russo et al., 1988, Cell 53:137-144; Russo et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:602-606) in Verbindung gebracht werden, und adulter T-Zell-Leukämie (Virgilio et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9275-9279).
1979 wurde bei einer großen italo-amerikanische Familie in Boston beobachtet, eine konstitutionale reziprokale t(3;8) (p14.2;q24) Chromosomen-Translokation zu übertragen (Cohen et al., 1979, N. Engl. J. Med. 301:592-595; Wang und Perkins, 1984, Cancer Genet. Cytogenet. 11:479-481), die in die Familie mendelte mit frühem Ausbruch von bilateralem und multifokalem Klarzell-Nierenkarzinom (clear cell renal carcinoma (RCC)). Nachfolgende cytogenetische Untersuchungen von einigen familiären Tumoren zeigte, dass die Tumoren das Derivat(8)-Chromosom (derivative 8 chromosome) verloren hatten, das die translozierte Region 3p14-pter trägt; dementsprechend waren die Tumoren homozygot für alle Loci telomerisch zum Bruch bei 3p14.2 (Li et al., 1993, Annals of Internal Medicine 118:106-111). Es wurde vorgeschlagen, dass die Translokation die Expression eines Tumorsuppressorgens beeinflusst (Cohen et al., 1979, N. Engl. J. Med. 301:592-595) und einige Forscher suchten nach Suppressorgen-Kandidaten. Wir hatten das Gen der Protein-Tyrosin-Phosphatase γ (protein tyrosine phosphatase gamma gene (PTPRG)) als einen Tumorsuppressorgen-Kandidaten vorgeschlagen (LaForgia et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5036-5040), und dass die Mehrzahl der Klarzell-RCCs einen Verlust der Heterozygosität einer 0.5 Mb Region, die die Translokation flankiert, zeigen (Lubinski et al., 1994, Cancer Res. 54:3710-3713; Druck et al., 1995, Cancer Res. 55:5348-5355), obwohl wir keine Abweichungen in dem restlichen PTPRG-Gen beobachteten. Die Region 3p14.2 ist auch enthalten bei Deletionen in zahlreichen anderen Tumorarten, einschließlich Nasen-Rachen-Karzinomen (Nasopharynxkarzinomen (nasopharyngeal carcinomas)) (Lo et al., 1994, Int. J. Oncol. 4:1359-1364).
Der Translokationsbruchpunkt t(3;8) wurde kloniert und ein 3 kb Transcript eines Kandidaten für ein Tumorsuppressorgen wurde nachgewiesen unter Verwendung einer Sonde aus [einem Bereich] nahe des Bruchpunkts (Boldog et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8509-8513); weitere Details, die dieses Transcript betreffen, sind nicht berichtet worden trotz einer späteren Publikation von dieser Gruppe, die dieses Thema betrifft und über ein YAC-Contig von etwa 6 Mb DNA berichtet, das sich über den Translokationsbruchpunkt 3p14.2 3;8 erstreckt (Boldog et al., 1994, Genes, Chromosomes & Cancer 11:216-221). Es wurde auch vorgeschlagen, dass es bei 3p14.2 kein Suppressorgen geben könnte, sondern die Translokation t(3;8) in der Tat ein Mechanismus ist, um das von Hippel-Lindau-Gen, ein Tumorsuppressorgen bei 3p25, zu verlieren (Gnarra et al., 1994, Nature Genet. 7:85-90).
Eine weitere cytogenetische Markierung in der Chromosomenregion 3p14.2 ist die häufigste der konstitutiven Aphidicolininduzierbaren fragilen Stellen, FRA3B, die cytogenetisch ununterscheidbar von der Translokation t(3;8) ist (Glover et al., 1988, Cancer Genet. Cytogenet. 31:69-73). Fragile Stellen, von denen in Menschen über 100 beschrieben worden sind (für eine Übersicht, siehe Sutherland, 1991, Genet. Anal. Tech. Appl. 8:1616-166), sind Regionen des menschlichen Genoms, die cytogenetisch nachweisbare Lücken zum Vorschein bringen, wenn sie spezifischen Reagenzien oder Kultivierungsbedingungen ausgesetzt sind; mehrere Folat-sensitive, vererbbare, X-verbundene und autosomale fragile Stellen sind instabilen CCG- oder CGG-Repeats zugeordnet worden (Yu et al., 1991, Science 252:1179-1181; Kremer et al., 1991, Science 252, 1711-1714; Verkerk et al., 1991, Cell 65:905-914; Fu et al., 1991, Cell 67:1047-1058), und für eine von diesen, FRA11B bei 11q23.3, befindet sich der CCG-Repeat innerhalb der 5'-untranslatierten Region des CBL2-Gens, einem bekannten Protooncogen (Jones et al., 1995, Nature 376:145-149). Auch steht diese fragile Stelle, FRA11B, in Zusammenhang mit dem Jacobsen (11q-) Syndrom, wodurch eine direkte Verbindung zwischen einer fragilen Stelle und einem in vivo Chromosomenbruch aufgezeigt wird (Jones et al., 1994, Hum. Mol. Genet. 3:2123-2130). Weil die induzierten fragilen Stellen Lücken oder Brüchen in Chromosomen ähneln, ist häufig spekuliert worden, dass fragile Stellen Stellen für die chromosomale Umlagerung bei Krebs sein könnten (Yunis und Soreng, 1984, Science 226:1199-1204). Für früher identifizierte fragile Stellen konnte auch gezeigt werden, dass sie hypermethyliert sind (Knight et al., 1993, Cell 74:127-134); deshalb könnte die Methylierung einer fragilen Stelle im regulatorischen Bereich eines Tumorsuppressorgens den Verlust der Transcription des Suppressorgens verursachen und, wie früher angemerkt, als ein "Schlag" im Prozess der Tumorgenese dienen (Jones et al., 1995, Nature 376:145-149). Diese Autoren schlugen auch vor, dass ein wichtiger Beitrag der Expression von fragilen Stellen bei der Tumorgenese darin bestehen könnte, die Inzidenz von Chromosomendeletionen während der Tumorgenese zu erhöhen.
Die Region FRA3B ist durch Untersuchungen von mehreren Gruppen unter Verwendung von Nagetier/Mensch-Hybriden skizziert worden; Hybridzellen, enthaltend das humane Chromosom 3 oder 3 und X, mit einem Hamster Hintergrund, wurden mit Aphidicolin oder 6-Thioguanin behandelt (um Hybride auszuwählen, die das X-Chromosom verloren hatten) und Subklone ausgewählt. Subklone, die Teile von Chromosom 3 mit offensichtlichen Brüchen in der Region 3p14-p21 enthielten, wurden bezüglich des Verlustes oder Erhalts von spezifischen 3p-Markern charakterisiert, um die Position der 3p14-21-Brüche zu bestimmen (LaForgia et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5036-5040, LaForgia et al., 1993, Cancer Res. 53:3118-3124; Paradee et al., 1995, Genomics 27:358-361).
Veränderungen von Oncogenen und Tumorsuppressorgenen bei kleinzelligem Bronchialkarzinom (small cell lung cancer (SCLC)) und nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom (non-small cell lung cancer (NSCLC)) sind beschrieben worden, wobei das häufigste Ziel Veränderungen von p53 (Takahashi et al., 1989, Science 246:491-494; Chiba et al., 1990, Oncogene 5:1603-1610; Mitsudomi et al., 1992, Oncogene 7:171-180) und Retinoblastom (Harbour et al., 1988, Science 241:353-357; Xu et al., 1994, J. Natl. Cancer Inst. 86:695-699) Gene und allelische Deletionen des kurzen Arms von Chromosom 3 (3p) (Kok et al., 1987, Nature 330:578-581; Naylor et al., 1987, Nature 329:451-454; Rabbitts et al., 1989, Genes Chrom. Cancer 1:95-105) sind. Zusätzlich zu cytogenetisch sichtbaren Deletionen (Whang-Peng et al., 1982, Science 215:181-182; Testa et al., 1994, Genes Chrom. Cancer 11:178-194), wurde ein Verlust der Heterozygosität (loss of heterozygosity (LOH)) bei Loci auf 3p für nahezu 100% der SCLC (Kok et al., 1987, Nature 330:578-581; Naylor et al., 1987, Nature 329:451-454; Brauch et al., 1987, N. Engl. J. Med. 317:1109-1113; Yokota et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:9252-9256) und für 50% oder mehr der NSCLC (Brauch et al., 1987, N. Engl. J. Med. 317:1109-1113; Yokota et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:9252-9256; Rabbitts et al., 1990, Genes Chrom. Cancer 2:231-238; Hibi et al., 1992, Oncogene 7:445-449; Yokoyama et al., 1992, Cancer Res. 52:873-877; Horio et al., 1993, Cancer Res. 53:1-4) berichtet, wodurch das Vorhandensein von wenigstens einem Tumorsuppressorgen in dieser chromosomalen Region stark suggeriert wird.
Jedoch hat die Beobachtung, dass allelische Verluste oft das meiste von 3p betreffen, die Isolierung des/der beteiligten Gens/Gene erschwert. Kandidaten-Loci wurden identifiziert, wie z.B. das von Hippel-Lindau-Gen, lokalisiert bei 3p25, für das nachfolgend festgestellt wurde, dass es in Lungenkrebs-Zelllinien selten mutiert ist (Sekido et al., 1994, Oncogene 9:1599-1604). Von anderen in einer Region innerhalb von 3p21 lokalisierten Loci wurde berichtet, dass sie Stellen wiederkehrender homozygoter Deletionen bei SCLC sind (Daly et al., 1993, Oncogene 8:1721-1729; Kok et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6071-6075; Kok et al., 1994, Cancer Res. 54:4183-4187). Darüber hinaus legte die Übertragung von subchromosomalen Fragmenten der Region 3p21.3-p21.2 auf Tumor-Zelllinien eine Tumorsuppressoraktivität nahe (Killary et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10877-10881; Daly et al., 1993, Oncogene 8:1721-1729). Proximalere Deletionen in der Region 3p12-14 sind auch berichtet worden (Rabbitts et al., 1989, Genes Chrom. Cancer 1:95-105; Rabbitts et al., 1990, Genes Chrom. Cancer 2:231-238; Daly et al., 1991, Genomics 9:113-119).
Lungenkrebs ist weltweit eine Hauptursache von Todesfällen und die allgemeine Überlebensrate hat sich in den letzten 20 Jahren nicht wesentlich verbessert. Trotz des Erfolgs, der bei der primären Vorbeugung erreicht wurde, ist Lungenkrebs immer noch ein überwältigendes medizinisches und soziales Problem. Sogar in der Kohorte der Ex-Raucher bleibt die Lungenkrebs-Häufigkeit, als eine Folge des akkumulierten Schadens, für mehrere Jahre hoch und es gibt ein objektives Bedürfnis für Strategien, die darauf gerichtet sind, die Krebstodesfälle bei Individuen, die mit dem Rauchen aufgehört haben, zu reduzieren.
Es bleibt ein unerfülltes Bedürfnis, die Gene zu isolieren und zu charakterisieren, die mit Krebs des Verdauungsstrakts und anderen Krebsarten in Verbindung gebracht werden, um sie als ein Diagnostikum und therapeutisches/prophylaktisches Reagenz bei dem Nachweis, der Behandlung und Vorbeugung derartiger Krebsarten zu verwenden.
Die vorstehende Zitierung einer Referenz soll nicht als Eingeständnis ausgelegt werden, dass eine derartige Referenz Stand der Technik für die vorliegende Erfindung ist.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleotidsequenzen von FHIT-Genen und Aminosäuresequenzen der von ihnen codierten Fhit-Proteine sowie Derivate (z.B. Fragmente) und Analoga derselben, und Antikörper hierfür. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Nucleinsäuren, die hybridisierbar an oder komplementär zu den vorhergehenden Nucleotidsequenzen sind sowie äquivalente Nucleinsäuresequenzen, die für ein Fhit- Protein codieren. In einer spezifischen Ausführungsform sind die FHIT-Gene und -Proteine humane Gene und Proteine.
Mutationen (insbesondere Deletionen) von FHIT-Gensequenzen werden mit Speiseröhren-, Magen-, Dickdarm-, Nierenkrebs und anderen Krebsarten in Verbindung gebracht.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Expressionsvektoren, die für ein Fhit-Protein, ein Derivat oder ein Analogon desselben codieren, sowie Wirtszellen, die die Expressionsvektoren, die für das Fhit-Protein, Derivat oder Analogon desselben codieren, enthalten. Wie es hier verwendet wird, soll "FHIT" mit Bezug auf das FHIT-Gen verwendet werden, wohingegen "Fhit" mit Bezug auf das Proteinprodukt des FHIT-Gens verwendet werden soll.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der Nucleotidsequenzen der FHIT-Gene und Aminosäuresequenzen der von ihnen codierten Fhit-Proteine als diagnostische Reagenzien oder für die Herstellung von diagnostischen Mitteln, nützlich für den Nachweis von Krebs oder präcancerogenen Zuständen oder hyperproliferativen Störungen, insbesondere jene, die mit chromosomalen oder molekularen Abnormitäten, insbesondere bei 3p14.2, und/oder verminderten Expressionsleveln, oder der Expression von funktionsgestörten Formen des Fhit-Proteins in Verbindung gebracht werden. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der Nucleotidsequenzen der FHIT-Gene und Aminosäuresequenzen der von ihnen codierten Fhit-Proteine als therapeutische/prophylaktische Mittel bei der Behandlung/Vorbeugung von Krebs, insbesondere in Zusammenhang mit chromosomalen oder molekularen Abnormitäten bei 3p14.2, und/oder verminderten Expressionsleveln, oder der Expression von funktionsgestörten Formen des Fhit-Proteins.
Die Erfindung betrifft auch Fhit-Derivate und -Analoga der Erfindung, die funktional aktiv sind, d.h. sie sind fähig, eine oder mehr bekannte funktionelle Aktivitäten zu zeigen, die mit dem vollständigen (Wildtyp) Fhit-Protein in Verbindung gebracht werden. Derartige funktionelle Aktivitäten beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Antigenität [die Fähigkeit, an einen Anti-Fhit Antikörper zu binden (oder mit Fhit um die Bindung zu konkurrieren)], Immunogenität (die Fähigkeit, einen Antikörper zu erzeugen, der an Fhit bindet), und die Fähigkeit, an einen Rezeptor/Liganden oder ein Substrat für Fhit zu binden (oder mit Fhit um die Bindung zu konkurrieren), und die Fähigkeit mit Fhit zu multimerisieren.
Die Erfindung betrifft ferner Fragmente (und Derivate und Analoga derselben) von Fhit, die ein oder mehr Domänen eines Fhit-Proteins umfassen, z.B. die Histidin-Triade (histadine triade), und/oder die Antigenität eines Fhit-Proteins bewahren (d.h. sie sind fähig, von einem Anti-Fhit Antikörper gebunden zu werden).
Die hierin offenbarten Sequenzen von FHIT-Genen und -Proteinen, und Antikörper gegen derartige Proteinsequenzen, können in Tests zur Krebsdiagnose verwendet werden, z.B. von Tumoren des Verdauungstrakts oder der Atemwege, die in Verbindung gebracht werden mit chromosomalen oder molekularen Abnormitäten bei 3p14.2 und/oder verminderten Leveln an oder verminderter Aktivität von Fhit-Protein, indem eine Verminderung der FHIT Wildtyp-mRNA bei einer Probe aus einem Patienten nachgewiesen oder gemessen wird, oder indem bei einer Probe aus einem Patienten eine Verminderung der Level oder Aktivität von Fhit-Protein nachgewiesen oder gemessen wird, oder indem ein(e) anomale(s) DNA, mRNA oder Protein nachgewiesen wird.
Das hierin offenbarte Fhit-Protein, oder Derivate oder Analoga desselben, kann für die Herstellung von Anti-Fhit Antikörpern verwendet werden, wobei die Antikörper als Diagnostika in Immunoassays zum Nachweis oder zur Messung von Fhit-Protein in einer Probe aus einem Patienten verwendet werden können. Beispielsweise können Anti-Fhit Antikörper für den diagnostischen Nachweis oder Messung von Fhit-Protein in biopsierten Zellen und Geweben verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch therapeutische Zusammensetzungen, umfassend Fhit-Proteine, Derivate oder Analoga derselben, Antikörper hierfür, und Nucleinsäuren, die für Fhit-Proteine, Derivate oder Analoga codieren, und FHIT Antisense-Nucleinsäuren.
Die vorliegende Erfindung findet Verwendung in Therapie- und Diagnostizierverfahren und Zusammensetzungen, die auf Fhit-Proteinen und Nucleinsäuren basieren. Therapeutische Verbindungen der Erfindung beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf, Fhit-Proteine und Analoga und Derivate (einschließlich Fragmente) derselben; Antikörper hierfür; Nucleinsäuren, die für die Fhit-Proteine, Analoga oder Derivate codieren, und FHIT Anitsense-Nucleinsäuren.
Die vorliegende Erfindung findet Verwendung in Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung von Störungen mit Überproliferation (z.B. Krebs und hyperproliferative Störungen), indem Verbindungen, die die Fhit-Aktivität fördern (z.B. Fhit, ein Agonist von Fhit; Nucleinsäuren, die für Fhit codieren), verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung findet auch Verwendung in Verfahren zur Vorbeugung und Behandlung von Störungen mit Überproliferation, wobei der Patient hemizygot für eine dominant-negative FHIT-Mutation ist, indem Verbindungen, die spezifisch der FHIT Nucleinsäure- oder Protein-Mutante entgegenwirken (z.B. Antikörper oder Antisense-Nucleinsäuren, spezifisch für die Mutante), verabreicht werden.
Tiermodelle, Diagnostizierverfahren und Screeningverfahren für die Prädisposition für Störungen, und Verfahren zur Identifizierung von Fhit-Agonisten und -Antagonisten, werden von der Erfindung auch bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung von Fhit-Proteinen, Derivaten und Analoga, wie z.B. durch rekombinante Mittel.
In einer bestimmten Ausführungsform der Erfindung, die als ein Beispiel in Abschnitt 6 beschrieben ist, wird eine humane FHIT-Sequenz offenbart und gezeigt, dass sie bei verschiedenen Krebsarten mutiert ist.
4. BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A–1B. Organisation des FHIT-Gens relativ zu 3p14.2 FRA3B und Translokationsstellen. Ein Schema der normalen Region 3p14.2 ist gezeigt (A) mit der chromosomalen Region (nicht im Maßstab), wiedergegeben durch die obere Linie mit Positionen von STS-Markern (Position von D3S1234 relativ zu dem Gen ist nicht bekannt), FRA3B, wiedergegeben durch den Bruch c13 des Hybrids und dem gezeigten Translokationsbruchpunkt t(3;8). Der gestrichelte Teil gibt die Region an, die an den homozygoten Deletionen in Tumor- Zellinien beteiligt ist. Drei der zur Entwicklung der vorstehenden Marker verwendeten YAC-Klone, Kartierungs- (Map) und Cosmid-Contig sind gezeigt; das Cosmid-Contig unterhalb und die Verteilung der Exons in dem FHIT-Transcript ist unterhalb des Contig gezeigt. Schwarze und gepunktete Boxen stellen codierende bzw. nicht-codierende Exons dar; Sterne zeigen Exons mit Start- und Stopcodons an. Ein Exon (E5) befindet sich innerhalb der definierten homozygot entfernten Region. Exons 1 (E1), 2 (E2) und 3 (E3) befinden sich zentromerisch zu dem Translokationsbruch t(3;8) und Exon 4 (E4) und 6-10 (E6-E10) flankieren die homozygot entfernte Region an den Zentromer- bzw. Telomerseiten. Die Organisation von Arten von anomalen Transcripten aus Tumor-Zellinien sind in Teil B abgebildet, wobei zick-zack Bereiche Insertionen einer neuen Sequenz, gewöhnlich repetitiv, in die anomalen Transcripte darstellen. CCL234 und 235 sind Zellinien, die aus Dickdarmkarzinom stammen, bei denen eine homozygote Deletion in der fragilen Region nicht nachgewiesen wurde. Bei CCL234 RNA wurde durch RT-PCR Amplifikation und Sequenzierung nur ein FHIT-Transcript mit abnormer Größe nachgewiesen; für das kürzere Transcript konnte gezeigt werden, dass es aus dem Spleißen von Exon 3 bis Exon 5 resultiert, unter Auslassung des nicht-codierenden Exon 4, wobei der codierende Bereich intakt bleibt. Mit CCL235-RNA als Templat-RNA wurden offenbar normale und anomale RT-PCR-Produkte amplifiziert, wobei das anomale Produkt aus dem Spleißen von Exon 4 bis Exon 8 mit einem repetitiven Insert von 140 bp (beisteuernd ein Met-Codon im Leserahmen) zwischen E4 und E8 resultierte. RT-PCR Amplifikation einer RNA aus HeLa-Zellen, einer aus Zervikalkarzinom stammenden Zelllinie, die eine Deletion oder eine Umlagerung von DNA nahe der Translokation t(3;8) zeigte, brachte Produkte mit normaler und anomaler Größe zum Vorschein, wobei das kleinste Produkt aus dem Spleißen von Exon 4 bis Exon 9 resultierte. RT-PCR Ampli fikation von RNA aus KatoIII, einer aus Magenkarzinom stammenden Zelllinie mit diskontinuierlichen Deletionen, an denen der Locus D3S1481 und ein etwa 50 kbp Bereich zwischen Exons 5 und 6 beteiligt ist, die offenbar alle FHIT-Exons intakt lässt, resultierte in nur einem Produkt mit anomaler Größe, dem Exons 4 bis 7 fehlen, wobei ein 86 bp Repeat, insertiert stromabwärts (downstream) von Exon 3, ein Met-Codon im Leserahmen beisteuert. Die Amplifikation des RT-Produktes aus HT29, einer aus Dickdarmkrebs stammenden Zelllinie mit einer großen Deletion (~200 kbp, etwa die Größe des YAC 648D4), die Exon 5 beinhaltete, gab nur ein Produkt mit anomaler Größe, das aus dem Spleißen von Exon 3 bis Exon 7 resultierte. Zahlreiche andere aus Tumoren erhaltene Zellinien aus Lungenkarzinom (1/3 getestet), Osteosarkom (1/1), NPC (3/3), Eierstock-Karzinom (2/2), und hämatopoietischen (4/5) Tumoren, zeigten anomale FHIT-Transcriptionsprodukte. Die Zelllinie RF48 aus einem Magenkarzinom ohne Deletion zeigte ein normal großes Produkt, wie es auch eine lymphoblastoide Linie mit der Translokation t(3;8), ein Melanom (WM1158) und eine aus Nierenkarzinom (RC17) stammende Zelllinie taten. Andere Linien mit Deletion (AGS, LS180, LoVo) oder ohne Deletion (Colo320), die aus Dickdarm- oder Magenkarzinom stammen, zeigten anomale Reverse Transcriptase-Polymerase-Kettenreaktions (reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)) -produkte (nicht gezeigt).
2A–2B. Struktur von normalen und anomalen FHIT-cDNAs. Die Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1) und die vorhergesagte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:2) des FHIT-Gens sind gezeigt (A), wobei die Positionen der Exons durch Pfeilspitzen oberhalb der Sequenz angezeigt sind und Positionen von bei der Nested-PCR und RACE-Reaktionen verwendeten Primern durch Pfeile unterhalb der Sequenz angezeigt sind. Eine schematische Darstellung von einigen der anomalen Transcripte, die in nicht-kultivierten Tumorgeweben von Verdauungsorganen beobachtet wurden, sind in B gezeigt. Nur Transcripte, die eine Deletion der codierenden Sequenz zeigten, sind in Tabelle 3 gezeigt. Die obere Linie in B zeigt die Karte der intakten FHIT-cDNA. Die dicken und dünnen Balken zeigen die codierenden bzw. untranslatierten Bereiche. Die Positionen von Spleißstellen sind durch nach unten gerichtete Pfeile gezeigt, entsprechend den oberhalb in A gezeigten Nucleotidnummern. Den Transcripten der Klasse I fehlt Exon 5, während Transcripte der Klasse II Exon 5 behalten, aber allgemein Exon 8 verlieren. Bei den Transcripten mit Sternen wurden Insertionen verschiedener Längen stromabwärts von Exon 4 beobachtet. E1-10 zeigen Exons 1-10 an.
3A–3C. Expression des FHIT-Gens in normalen Geweben und Tumoren. Northern-Blot (A, B) und RT-PCR Analyse (C) von normaler und aus Tumor stammender FHIT-mRNA. Tafel A zeigt einen Northern-Blot von normalen mRNAs (2 μg/Spur) aus Milz (Spur 1), Thymus (Spur 2), Prostata (Spur 3), Hoden (Spur 4), Eierstock (Spur 5), Dünndarm (Spur 6), Dickdarm (Schleimhaut (mucosal lining)) (Spur 7), und peripheren Blutleukozyten (Spur 8), hybridisiert mit der FHIT cDNA-Sonde. Tafel B zeigt einen Northern-Blot von mRNAs (2 μg/Spur) aus normalem Dünndarm (Spur 1) und mRNAs von aus Tumor stammenden Zellinien: KatoIII (Spur 2), HK1 (Spur 3), LoVo (Spur 4), CNE2 (Spur 5), CNE1 (Spur 6), Colo320 (Spur 7), LS180 (Spur 8), hybrisiert mit der FHIT cDNA-Sonde (Tafel B, oberer Teil). Der gleiche Blot wurde mit einer β-Actin cDNA-Sonde hybridisiert (Tafel B, unterer Teil). Tafel C zeigt amplifizierte Produkte, beobachtet nach Nested-RT-PCR Amplifikation von mRNAs aus passenden nicht-kultivierten Tumorgeweben (T) und normalen (N) Geweben der gleichen Patienten (J4, 9625, 5586, E37, E32, E3), oder nur mRNAs aus Tumorgeweben (J9, J7, J3, J1, E3). Pfeilspitzen zeigen die Positionen der amplifizierten Produkte mit einer abnormen DNA-Sequenz. Die Details der DNA-Sequenzen der entsprechenden Transcripte sind in Tabelle 2 und 2B gezeigt. Weiße Punkte in den Tumorspuren zeigen die Position von Transcripten mit normaler DNA-Sequenz.
4A–4B. (A) Anordnung (alignment) von Aminosäuresequenzen von Proteinen der HIT-Familie und Translation von FHIT-cDNAs. Die Anordnung wurde durchgeführt unter Verwendung von BOXSHADE Version 3.0. Eine schwarze Schraffierung zeigt zwei oder mehr identische Reste bei einer Position an; eine graue Schraffierung zeigt Ähnlichkeit an. PAPH1 (SEQ ID NO:3) (Zugangs-Nr. (accession #) U32615) und CAPH1 (SEQ ID NO:4) (Zugangs-Nr. U28374) bezeichnen die asymmetrischen Diadenosin-5',5'''-P1,P4-tetraphosphat-Hydrolasen (diadenosine 5',5'''-P1, P4 tetraphosphate asymmetric hydrolases (aph1)) aus S. pombe und S. cerevisiae. PHIT (SEQ ID NO:6) zeigt das HIT-Familienmitglied aus dem Cyanobakterium Synechococcus Sp. (Zugangs-Nr. P32084) an, BHIT (SEQ ID NO:5), den Hemmer von Proteinkinase C (protein kinase C inhibitor) aus B. Taurus (Rind; Zugangsnr. P16436)), MHIT (SEQ ID NO:7) aus M. hyorhinis (Mycoplasma, Zugangs-Nr. M37339), YHIT (SEQ ID NO:8) aus S. cerevisiae (Zugangs-Nr. Q04344); das Fhit-Protein ist über eine Länge von 109 Aminosäuren 69% ähnlich zu dem S. pombe (PAPH1) Gen. (B) In vitro Translationsprodukte aus rekombinanten Plasmiden, enthaltend unterschiedliche Allele des FHIT-Gens: pFHIT1 mit einer Deletion des nicht-codierenden Exons 4 (Spur 1); pFHIT2 mit einer Insertion von 72 bp zwischen Exons 4 und 5 (Spur 2); pFHIT3 mit einem Wildtyp FHIT, dem Exon 1 fehlt (Spur 3); pFHIT, das vollständige Wildtyp-Gen in Bluescript (Spur 4); Kontrollreaktion, in vitro Translation aus dem Vektor pBCAH, der einen Teil der extrazellulären Region des PTPRG-Gens (vorhergesagtes Molekulargewicht 40 kDa) trägt (Spur 5).
5. Organisation des FHIT-Gens relativ zu dokumentierten Chromosomenbrüchen in der fragilen Region 3p14.2. Ein FHIT-Allel ist zerstört in allen Translokationsträgern der t(3;8)-Familie, wobei Exons 1, 2 und 3 auf dem Derivat(3)-Chromosom verbleiben und Exons 4-10, einschließlich der gesamten codierenden Region, auf das Derivat(8)-Chromosom transloziert werden, wie vorstehend illustriert. Die Hybrid-Zelllinie, c13, mit einem de novo FRA3B-Bruch, direkt telomerisch zu Exon 5, hat das meiste der FHIT codierenden Region verloren. Die KatoIII-Zellen behalten offenbar alle FHIT-Exons, aber codieren nur für ein abnormes Transcript, dem Exons 4-7 fehlen, und können deshalb kein Fhit-Protein herstellen. Die MB436- und HT29-Zellen haben beide Exon 5 durch Deletion unterschiedlicher Abschnitte der fragilen Region verloren.
6. Hydrophilitäts-Diagramm der abgeleiteten Proteinsequenz von FHIT (SEQ ID NO:2), aufgezeichnet unter Verwendung des Programms PEPPLOT der Wisconsin GCG Software zur DNA- und Proteinanalyse.
7. Ausdruck der Nucleotidsequenz R50713 (SEQ ID NO:9), ausgerichtet an der FHIT cDNA-Sequenz (cDNA 7F1) (SEQ ID NO:1) und der Nucleotidsequenz R11128 (SEQ ID NO:77). Die FHIT codierende Region beginnt bei Nucleotid 363 und endet bei Nucleotid 812.
8. Translation aller drei Leserahmen, sowohl in 5'- als auch 3'-Richtung, der EST-Sequenz R50713. 5'3'-Leserahmen (Frame) 1: SEQ ID NOS:10-15 und 76; 5'3'-Leserahmen 2: SEQ ID NOS:16-19; 5'3'-Leserahmen 3: SEQ ID NOS:20-25; 3'5'-Lese rahmen 1: SEQ ID NOS:26-31; 3'5'-Leserahmen 2: SEQ ID NOS:32-36; 3'5'-Leserahmen 3: SEQ ID NOS:37-40.
9. Translation aller drei Leserahmen, sowohl in 5'- als auch 3'-Richtung, der EST-Sequenz R11128. 5'3'-Leserahmen 1: SEQ ID NOS:41-44; 5'3'-Leserahmen 2: SEQ ID NOS:45-48; 5'3'-Leserahmen 3: SEQ ID NOS:49-56; 3'5'-Leserahmen 1: SEQ ID NOS:57-58; 3'5'-Leserahmen 2: SEQ ID NOS:59-64; 3'5'-Leserahmen 3: SEQ ID NOS:65-68.
10A–10B. (A) Anordnung der Hydrolasesequenz Ap4A (U32615) (SEQ ID NO:69) von Hefe (S. pombe) mit FHIT cDNA (cDNA 7F1) -Sequenz (SEQ ID NO:1). (B) Ergebnis der Suche nach homologen Teilstücken zwischen U32615 und cDNA 7F1.
11A–11B. Expression des FHIT-Gens bei kleinzelligem Bronchialkarzinom (SCLC). (A) Expression des FHIT-Gens durch Nested RT-PCR Analyse bei SCLC-Tumoren (T) und passenden normalen (N) Geweben. Fall 83L zeigt eine Zelllinie an, die aus dem Tumor 83T etabliert wurde. Die Größen der amplifizierten Produkte sind rechts gezeigt. (B) Eine schematische Darstellung der anomalen Transcripte von Typ I und II, beobachtet in Tumorgewebe von SCLCs. Die obere Linie zeigt die intakte FHIT cDNA-Sequenz. Die dicken und dünnen Balken zeigen die codierenden bzw. untranslatierten Bereiche. Die Positionen der Spleißstellen sind durch nach unten gerichtete Pfeile gezeigt, entsprechend der Nucleotidnummerierung. Transcripten vom Typ I fehlen Exons 4 bis 6, während Transcripten vom Typ II Exons 4 bis 8 fehlen.
12A–12D. Expression des FHIT-Gens bei kleinzelligem Bronchialkarzinom und Sequenzen von FHIT-Transcripten. (A) Amplifizierte Produkte von FHIT, beobachtet nach "Nested RT- PCR" von mRNA aus Tumorgeweben (T) und normalen (N) Geweben von Fall 45 und aus Tumorproben (T), normalen (N) Proben und Proben aus Zelllinie (L) von Fall 83. Pfeilspitzen zeigen die Größen der amplifizierten Produkte. (B) Sequenzen von abnormen Transcripten des Typs I und II, beobachtet bei SCLCs. Pfeile zeigen Zusammenschlüsse zwischen Exons 3 und 4 in dem Wildtyp-Transcript (WT), zwischen Exons 3 und 7 in den abnormen Transcripten des Typs I und zwischen Exons 3 und 9 in den abnormen Transcripten des Typs II an. WT-Sequenz: SEQ ID NO:78. Typ I-Sequenz: SEQ ID NO:79. Typ II-Sequenz: SEQ ID NO:80.
13A–13B. Expression des FHIT-Gens bei nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom (NSCLC) und Sequenzen von FHIT-Transcripten. (A) Expression des FHIT-Gens durch "Nested RT-PCR" Analyse bei NSCLC-Tumoren (T) und damit gepaarten normalen (N) Geweben. Pfeilspitzen zeigen die amplifizierten abnormen Produkte an. (B) Sequenzen der abnormen Transcripte, beobachtet bei NSCLC-Fällen 2, 3 und 17. Pfeile zeigen den Zusammenschluss der Exons 4 bis 5 bei den Wildtyp-Produkten der Fälle 2 und 17 (2WT, 17WT) an und von Exon 3 bis 4 im Wildtyp-Produkt von Fall 3 (3WT) an. 2A zeigt den Zusammenschluss zwischen Exons 4 und 9 in dem abnormen Produkt von Fall 2, 3A zeigt den Zusammenschluss zwischen Exons 3 und 8 in dem abnormen Produkt von Fall 3, und 17A zeigt die Verknüpfung zwischen Exons 4 und 8 in dem abnormen Produkt von Fall 17. WT-Sequenz: SEQ ID NO:81. 3WT-Sequenz: SEQ ID NO:82. 17WT-Sequenz: SEQ ID NO:83. 2A-Sequenz: SEQ ID NO:84. 3A-Sequenz: SEQ ID NO:85. 17A-Sequenz: SEQ ID NO:86.
5. DETAILLIERTE BECHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleotidsequenzen von FHIT-Genen und Aminosäuresequenzen der von ihnen codierten Fhit-Proteine sowie Derivate und Analoga derselben, und Antikörper hierfür.
Wie mittels unterem Beispiel beschrieben, haben die gegenwärtigen Erfinder ein humanes FHIT-Gen isoliert und charakterisiert, das an Speiseröhren-, Magen-, Dickdarm-, Nierenkrebs und anderen Krebsarten beteiligt ist. Mutationen bei FHIT-Gensequenzen, die zum Verlust der FHIT-Genfunktion führen, hängen mit Krebs zusammen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung von FHIT-Genen und verwandten Nucleinsäuren und die von ihnen codierten Proteine oder Derivate oder Analoga derselben, und Antikörper hierfür, in Assays zum Nachweis von Krankheitszuständen, die mit chromosomalen oder molekularen Abnormitäten und/oder gesteigerter Expression von FHIT zusammenhängen, wie z.B. Krebs. Die vorliegende Erfindung betrifft auch therapeutische Zusammensetzungen, umfassend Fhit-Proteine, Derivate oder Analoga derselben, Antikörper hierfür, Nucleinsäuren, die für Fhit-Proteine, Derivate oder Analoga codieren, und FHIT Antisense-Nucleinsäuren.
Die FHIT-Gensequenz kann eine natürliche oder in Form einer Variante vorkommende Sequenz aus einer oder mehreren unterschiedlichen Spezies sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Wirbeltier, Säugetier, Rind, Huhn, Schwein, Pferd, Nagetier und Mensch, oder aus irgendeiner Quelle, gleich ob natürlich, synthetisch oder rekombinant. In einer spezifischen hierin beschriebenen Ausführungsform ist die FHIT-Gensequenz eine humane Sequenz. Das Fhit-Protein kann das in natürlich vorkommender Form oder einer Variantenform in einer oder mehreren unterschiedlichen Spezies vorhandene sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Säugetier, Rind, Huhn, Schwein, Pferd, Nagetier und Mensch, oder aus irgendeiner Quelle, gleich ob natürlich, synthetisch oder rekombinant. In einer spezifischen hierin beschriebenen Ausführungsform ist das Fhit-Protein ein humanes Protein.
Wie hierin definiert kann ein Fhit-Derivat ein Fragment oder eine Aminosäurevariante (z.B. ein Insertions-, Substitutions- und/oder Deletionsderivat) der in 2A gezeigten Fhit-Sequenz sein, solange das Fragment oder die Aminosäurevariante fähig ist, ein oder mehr funktionelle Aktivitäten zu zeigen, die mit einem vollständigen Fhit-Protein in Verbindung gebracht werden. Derartige funktionelle Aktivitäten beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf, Antigenität, d.h. die Fähigkeit, an einen Anti-Fhit Antikörper zu binden, Immunogenität, d.h. die Fähigkeit, einen Antikörper zu erzeugen, der fähig ist, ein Fhit-Protein zu binden; die Fähigkeit, die Zellproliferation oder das Tumorwachstum zu hemmen; die Fähigkeit, an ein Substrat für Fhit zu binden (oder mit Fhit um die Bindung zu konkurrieren); die Fähigkeit, mit Fhit zu mltimerisieren; und, möglicherweise, Ap4A-Aktivität oder eine andere Diadenosin-Hydrolase-Aktivität. Die Erfindung stellt Fragmente eines Fhit-Proteins bereit, die aus wenigstens 10 Aminosäuren, oder aus wenigstens 25 Aminosäuren, oder aus wenigstens 50Aminosäuren, oder aus wenigstens 100 Aminosäuren bestehen. Nucleinsäuren, die für derartige Derivate oder Analoga codieren, sind ebenfalls im Rahmen der Erfindung umfasst. Eine bevorzugte Variante eines Fhit-Proteins ist eine, deren Aminosäuresequenz wenigstens 70% Homologie aufweist, eine besonders bevorzugte Variante eines Fhit-Proteins ist eine, deren Aminosäuresequenz wenigstens 80% Homologie aufweist, und eine weitere besonders bevorzugte Variante eines Fhit-Proteins ist eine, deren Aminosäuresequenz wenigstens 90% Homologie zu dem natürlich vorkommenden Fhit-Protein über wenigstens 25, wenigstens 50, wenigstens 75, wenigstens 100, oder wenigstens 147 (vollständig) aufeinander folgende Aminosäuren der FHIT-Aminosäuresequenz aufweist. Wie hierin verwendet, bezeichnet Aminosäuresequenz-Homologie Aminosäuresequenzen, die identische Aminosäurereste haben, oder Aminosäuresequenzen, die konservative Änderungen bei Aminosäureresten enthalten. In einer weiteren Ausführungsform ist ein zu FHIT homologes Protein eines, das die vorhergehenden Prozentsätze für Sequenzen, die mit dem natürlich vorkommenden Fhit-Protein über die aufgezählten Längen von Aminosäuren identisch sind, aufweist. Proteine, die durch Nucleinsäuren codiert werden, die unter nicht-stringenten, mäßig stringten oder stringenten Bedingungen an ein FHIT-Gen hybridisieren können, werden auch bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung findet auch Verwendung bei Therapie- und Diagnostizierverfahren und Zusammensetzungen, die auf Fhit-Proteinen und -Nucleinsäuren und Anti-Fhit Antikörpern basieren. Die Erfindung findet Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung von Störungen mit Überproliferation (z.B. Krebs und hyperproliferative Störungen), indem Verbindungen, die die Fhit-Aktivität fördern (z.B. Fhit-Proteine und funktional aktive Analoga und Derivate (einschließlich Fragmenten) derselben; Nucleinsäuren, die für Fhit-Proteine, Analoga oder Derivate codieren, Agonisten von Fhit) verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung findet auch Verwendung in Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Störungen mit Überproliferation, wobei das Subjekt hemizygot für eine dominant-negative FHIT-Mutation ist, indem dem Subjekt Verbindungen verabreicht werden, die spezifisch der dominant negativen Funktion der Mutante des FHIT-Gens oder -Proteins entgegenwirken, oder diese hemmen (z.B. Antikörper oder Fhit Antisense-Nucleinsäuren, spezifisch für die Mutante).
Tiermodelle, Diagnostizierverfahren und Screeningverfahren für die Prädisposition für Störungen werden von der Erfindung auch bereitgestellt.
5.1. DIE FHIT CODIERENDEN SEQUENZEN
FHIT-cDNA, genomische Sequenzen und Sequenzen komplementär dazu sind FHIT-Nucleinsäuren, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden. In einer spezifischen Ausführungsform wird hierin eine FHIT cDNA-Sequenz bereitgestellt, der somit jedwede Introns fehlen. Daran hybridisierbare Sequenzen, vorzugsweise ohne Introns, werden auch bereitgestellt. Nucleinsäuren, die DNA oder RNA von Exonsequenzen von FHIT umfassen, werden auch bereitgestellt; in verschiedenen Ausführungsformen sind wenigstens 15, 25 oder 50 aufeinander folgende Nucleotide von FHIT-Exonsequenzen in der Nucleinsäure. Auch beinhaltet im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Nucleinsäuren, die FHIT-cDNA oder -RNA umfassen und aus wenigstens 8 Nucleotiden, wenigstens 15 Nucleotiden, wenigstens 25 Nucleotiden, wenigstens 50 Nucleotiden, wenigstens 100 Nucleotiden, wenigstens 200 Nucleotiden, oder wenigstens 350 Nucleotiden bestehen. In verschiedenen Ausführungsformen werden Nucleinsäuren bereitgestellt, die weniger als 2000, weniger als 500, weniger als 275, weniger als 200, weniger als 100, oder weniger als 50 Basen (oder bp, falls doppelsträngig) sind. In verschiedenen Ausführungsformen sind die Nucleinsäuren weniger als 300 kb, 200 kb, 100 kb, 50 kb, oder 10 kb. Nucleinsäuren können einzelsträngig oder doppelsträngig sein. In spezifischen Ausführungsformen werden isolierte Nuclein säuren bereitgestellt, die wenigstens 15 aufeinander folgende Nucleotide der FHIT codierenden Sequenzen umfassen, die aber nicht alles oder einen Teil irgendeines FHIT-Introns umfassen. In einer spezifischen Ausführungsform umfasst die Nucleinsäure wenigstens ein FHIT codierendes Exon (Exon 5, 6, 7, 8 oder 9). In einer weiteren Ausführungsform fehlt der Nucleinsäure im wesentlichen das FHIT-Intron zwischen Exon 5 und 6, enthält aber Exon 5 und wenigstens ein anderes FHIT codierendes Exon, ausgewählt aus Exon 6, Exon 7, Exon 8 und Exon 9. In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst die Nucleinsäure wenigstens ein FHIT-Exon, ausgewählt aus Exon 1, 2, 3, 4 und 5, und enthält wenigstens ein FHIT-Exon, ausgewählt aus Exon 6, 7, 8, 9 und 10, und hat vorzugsweise eine Größe von weniger als 10 kb. In einer bevorzugten Ausführungsform treten die FHIT-Exonsequenzen in der Nucleinsäure in der Reihenfolge auf, in der sie im Genom auftreten; in einer alternativen Ausführungsform treten die Exonsequenzen nicht in der gleichen Reihenfolge auf. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Nucleinsäure alle FHIT-Exons (Exons 1-10) oder alle FHIT codierenden Exons (Exons 5-9) in aufeinander folgender Weise, und enthält deshalb keine Introns. In noch einer weiteren spezifischen Ausführungsform enthält die Nucleinsäure, die die Exonsequenzen des FHIT-Gens umfasst, keine Sequenzen eines flankierenden genomischen Gens (d.h. 5' oder 3' zu dem FHIT-Gen im Genom). In einer spezifischen Ausführungsform wird hierin eine genomische FHIT-Sequenz bereitgestellt, die somit Introns enthält.
Die Erfindung stellt auch einzelsträngige Oligonucleotide zur Verwendung als Primer in PCR bereit, die ein Fragment, das eine FHIT-Sequenz enthält, amplifizieren, z.B. ein Oligonucleotid, das die Sequenz eines hybridisierbaren Teils (mindestens ~8 Nucleotide) eines FHIT-Gens hat, und ein weiteres Oligonucleotid, das das reverse Komplement zu einer Sequenz stromabwärts in demselben Strang des FHIT-Gens aufweist, so dass jedes Oligonucleotid die Synthese in einer Richtung auf das andere zu betreiben kann. Die Oligonucleotide haben vorzugsweise eine Länge in dem Bereich von 10-35 Nucleotiden.
Die vollständige cDNA-Sequenz für humanes FHIT ist in 2A (SEQ ID NO: 1) abgebildet, wobei sich der codierende Bereich derselben über die Nucleotide der Nummern 1-441 der 2A erstreckt. Die Sequenzanalyse der FHIT-cDNA von 2A bringt einen offenen Leserahmen von 441 Nucleotiden zum Vorschein, der für ein Protein mit 147 Aminosäuren (SEQ ID NO:2) codiert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann irgendeine Polynucleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz eines FHIT-Genprodukts codiert, verwendet werden, um rekombinante Moleküle zu erzeugen, die die Expression von FHIT steuern. Beinhaltet im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Nucleinsäuren, die aus mindestens 8 Nucleotiden bestehen, die als Sonden oder Primer (d.h. ein hybridisierbarer Teil) für den Nachweis oder die Amplifikation von FHIT brauchbar sind.
In einer hierin offenbarten spezifischen Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Nucleinsäureseqeunez des humanen FHIT-Gens. In einer bevorzugten, aber nicht einschränkenden, Ausführung der Erfindung ist eine humane FHIT-cDNA Sequenz jene, die in Plasmid p7F1, wie es bei der ATCC mit der zugewiesenen ATTC-Zugangsnummer (ATCC Accession Number) 69977 hinterlegt ist, vorhanden ist. Eine derartige Sequenz kann kloniert und sequenziert werden, zum Beispiel, wie es im unteren Abschnitt 6 beschrieben ist. Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuresequenzen, die hybridisierbar an oder komplementär zu den vorhergehenden Sequenzen oder darin äquivalent zu den vorhergehenden Sequenzen sind, dass die äquivalenten Nucleinsäuresequenzen auch für ein Proteinprodukt codieren, das funktionelle Aktivität von FHIT zeigt.
Zusätzlich sind unten Nucleinsäuren beschrieben, die für Fragmente und Derivate von FHIT codieren.
Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuren, die hybridisierbar an oder komplementär zu den vorstehend beschriebenen Nucleinsäuren, die FHIT-Sequenzen umfassen, sind. In spezifischen Ausführungen werden Nucleinsäuren bereitgestellt, die eine Sequenz umfassen, die wenigstens zu 10, 25, 50, 100 oder 200 Nucleotiden oder dem gesamten codierenden Bereich eines FHIT-Gens komplementär sind. In einer spezifischen Ausführungsform wird eine Nucleinsäure bereitgestellt, die an eine FHIT-Nucleinsäure, oder an eine Nucleinsäure, die für ein FHIT-Derivat codiert, unter schwach stringenten Bedingungen hybridisierbar ist. Als ein Beispiel und nicht als Beschränkung sind Verfahren, die derartige schwach stringenten Bedingungen verwenden, wie folgt (siehe auch Shilo und Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792): Filter, die DNA enthalten, werden für 6 h bei 40°C in einer Lösung, enthaltend 35% Formamid, 5 × SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.1% PVP, 0.1% Ficoll, 1% BSA, und 500 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA vorbehandelt. Hybridisierungen werden in derselben Lösung ausgeführt, mit den folgenden Modifiktionen: 0.02 PVP, 0.02 Ficoll, 0.2% BSA, 100 μg/ml Lachssperma-DNA, 10% (wt/Vol) Dextransulfat und 5-20 × 10⁶ cpm ³²P-markierte Sonde wird verwendet. Filter werden in der Hybridisierungsmischung für 18-20 h bei 40°C inkubiert, und dann für 1.5 h bei 55°C in einer Lösung, enthaltend 2 × SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA und 0.1% SDS, gewaschen. Die Waschlösung wird ersetzt mit frischer Lösung und die Inkubation für weitere 1.5 h bei 60°C fortgesetzt. Die Filter werden trocken getupft und einer Autoradiographie unterzogen. Falls notwendig, werden die Filter ein drittes Mal bei 65-68°C gewaschen und erneut auf Film aufgelegt. Andere schwach stringente Bedingungen, die verwendet werden können, sind im Fachgebiet bekannt (wie sie, zum Beispiel, bei cross-Spezies Hybridisierungen eingesetzt werden).
In einer weiteren spezifischen Ausführungsform wird eine Nucleinsäure bereitgestellt, die unter hochstringenten Bedingungen an eine FHIT-Nucleinsäure hybridisierbar ist (siehe unten).
In einer bevorzugten Ausführung wird Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet, um eine gewünschte Nucleinsäuresequenz in einer Bibliothek oder aus einer Gewebequelle zu amplifizieren, indem Oligonucleotid-Primer verwendet werden, die bekannte FHIT-Sequenzen wiedergeben. Derartige Primer können verwendet werden, um Sequenzen von Interesse aus einer RNA- oder DNA-Quelle zu amplifizieren, vorzugsweise einer cDNA-Bibliothek. PCR kann ausgeführt werden, zum Beispiel, durch Verwendung eines Perkin-Elmer Cetus Thermocyclers und Taq-Polymerase (Gene Amp^TM). Die zu amplifizierende DNA kann mRNA oder cDNA oder genomische DNA aus irgendeiner eukaryotischen Spezies beinhalten. Für die Verwendung in den PCR-Reaktionen kann man auswählen, mehrere unterschiedliche degenerierte Primer zu synthetisieren. Es ist auch möglich, die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen, die beim Anlagerungsschritt der PCR-Reaktionen verwendet werden, zu variieren, um höhere oder niedrigere Grade an Sequenzhomologie zwischen dem zu klonierenden FHIT-Gen und dem bekannten FHIT-Gen zu gestatten. Andere Mittel für die Primer-abhängige Amplifikation von Nucleinsäuren sind den Fachleuten bekannt und können verwendet werden.
Nach einer erfolgreichen Amplifikation eines Abschnitts eines FHIT-Gens (z.B. einer allelischen oder polymorphen Variante oder Spezies, homolog zu einem bekannten FHIT-Gen) kann der Abschnitt molekular kloniert und sequenziert werden, und als eine Sonde verwendet werden, um einen vollständigen cDNA- oder genomischen Klon zu isolieren. Dies wiederum erlaubt die Bestimmung der vollständigen Nucleotidsequenz des Gens, die Analyse seiner Expression und die Herstellung seines Proteinprodukts für die funktionelle Analyse, wie unten beschrieben. Auf diese Weise können zusätzliche Gene identifiziert werden, die für Fhit-Proteine codieren. Alternativ kann das FHIT-Gen der vorliegenden Erfindung durch ein Exon Trapping-System isoliert werden, indem genomische DNA verwendet wird (Nehls et al., 1994, Oncogene 9(8):2169-2175; Verna et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21(22):5198:5202; Auch et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18(22):6743-6744).
Potentiell kann eine beliebige eukaryotische Zelle als Nucleinsäurequelle für die molekulare Klonierung des FHIT-Gens dienen. Die Nucleinsäuresequenzen, die FHIT codieren, können z.B. aus Mensch, Schwein, Rind, Katze, Affe, Pferd, Hund, Nagetier sowie zusätzlichen Primatenquellen isoliert werden. Die DNA kann durch im Fachgebiet bekannte Standardverfahren erhalten werden, zum Beispiel, aus klonierter DNA (z.B. eine "DNA-Bibliothek"), durch chemische Synthese, durch Klonierung von cDNA, oder durch Klonierung von genomischer DNA, oder Fragmenten derselben, gereinigt aus einer erwünschten Zelle. (Siehe, zum Beispiel, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Glover, D. M. (Hrsg.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Bd. I, II.) Klone, die aus genomischer DNA gewonnen wurden, können regulatorische und Intron DNA-Bereiche zusätzlich zu den codierenden Regionen enthalten, während Klone, die aus cDNA gewonnen wurden, nur FHIT-Exonsequenzen enthalten werden. Gleich aus welcher Quelle, sollte das Gen molekular in einen für die Vermehrung des Gens geeigneten Vektor kloniert werden. In einer bestimmten Ausführungsform sind Zellen aus Niere oder Magen oder Lunge eine bevorzugte Nucleinsäurequelle für die Isolierung von FHIT-Gensequenzen.
Bei der molekularen Klonierung des Gens aus genomischer DNA werden DNA-Fragmente erzeugt, von denen einige das gewünschte Gen codieren werden. Die DNA kann an spezifischen Stellen unter Verwendung von verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten werden. Alternativ kann man DNAse in der Gegenwart von Mangan verwenden, um die DNA zu fragmentieren, oder die DNA kann physisch zerschnitten werden, wie zum Beispiel, durch Ultraschall (sonication). Die linearen DNA-Fragmente können dann durch Standardverfahren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Agarose- und Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Säulenchromatographie, nach Größe getrennt werden.
Sobald die DNA-Fragmente erzeugt sind, kann die Identifizierung der spezifischen DNA-Fragmente, die das gewünschte Gen enthalten, auf zahlreiche Weise erreicht werden. Ein FHIT-Gen der vorliegenden Erfindung oder dessen spezifische RNA, oder ein Fragment derselben, wie z.B. eine Sonde oder ein Primer, kann, zum Beispiel, isoliert und markiert werden und dann in Hybridisierungsassays verwendet werden, um ein erzeugtes FHIT-Gen nachzuweisen (Benton, W. und Davis, R., 1977, Science 196:180; Grunstein, M. und Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961). Diese DNA-Fragmente, die eine substantielle Sequenzhomologie zu der Sonde aufweisen, werden unter hochstringenten Bedingungen hybridisieren. Der Ausdruck "hochstringente Bedingungen", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet die Hybridisierungsbedingungen, die (1) zum Waschen eine niedrige Ionenstärke und hohe Temperaturen einsetzen, zum Beispiel, 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% SDS bei 50°C; (2) während der Hybridisierung ein Denaturierungsmittel, wie z.B. Formamid, einsetzen, zum Beispiel 50% (Vol/Vol) Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C; oder (3) 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt's Lösung, Ultraschall-behandelte (sonicated) Lachssperma-DNA (salmon sperm DNA) (50 g/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C, mit Waschungen bei 42°C in 0,2 × SSC und 0,1% SDS.
Es ist auch möglich, das passende Fragment durch Restriktionsenzymverdau(e) und Vergleich der Fragmentgrößen mit jenen, die gemäß einer bekannten Restriktionskarte erwartet werden, zu identifizieren. Ferner kann die Selektion auf der Grundlage der Eigenschaften der Gene ausgeführt werden. Alternativ kann das Vorhandensein des Gens durch Assays nachgewiesen werden, die auf den physikalischen, chemischen, oder immunologischen Eigenschaften seines exprimierten Produkts basieren. Zum Beispiel können cDNA-Klone, oder genomische DNA-Klone, die die geeigneten mRNAs als Hybrid selektionieren, ausgewählt werden, die ein Protein herstellen, das ähnliche oder identische elektrophoretische Migration, isoelektrisches Fokusierungsverhalten, Karten eines proteolytischen Verdaus (proteolytic digestion maps), Bindungsaktivität oder antigene Eigenschaften aufweist, wie es für FHIT bekannt ist. Alternativ kann das Fhit-Protein durch Bindung von einem markierten Antikörper an die mutmaßlich FHIT-exprimierenden Klone identifiziert werden, z.B. in einem Verfahren nach Art eines ELISA (Enzym-gekoppelter Immunadsorptionstest (enzyme-linked immunosorbent assay)).
Das FHIT-Gen kann auch durch mRNA Selektion mittels Nucleinsäurehybridisierung, gefolgt von in vitro Translation, identifiziert werden. In diesem Verfahren werden Fragmente verwendet, um durch Hybridisierung komplementäre mRNAs zu isolieren. Derartige DNA-Fragmente können verfügbare, gereinigte FHIT-DNA eines weiteren FHIT-Gens darstellen. Immunopräzipitationsanalyse oder funktionelle Tests der in vitro Translationsprodukte der isolierten Produkte der isolierten mRNAs identifiziert die mRNA und darum die komplementären DNA-Fragmente, die die gewünschten Sequenzen enthalten. Darüber hinaus können spezifische mRNAs durch Adsorption von Polysomen, isoliert aus Zellen an immobilisierten Antikörpern, die spezifisch gegen Fhit-Protein gerichtet sind, ausgewählt werden. Eine radioaktiv-markierte FHIT-cDNA kann unter Verwendung der ausgewählten mRNA (aus den adsorbierten Polysomen) als ein Templat synthetisiert werden. Die radioaktiv-markierte mRNA oder cDNA kann dann als eine Sonde verwendet werden, um die FHIT DNA-Fragmente zwischen anderen genomischen DNA-Fragmenten zu identifizieren.
Alternativen zur Isolierung der genomischen FHIT-DNA umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, chemische Synthese der Gensequenz selbst aus einer bekannten Sequenz oder verwandeln der cDNA in mRNA, die das Fhit-Protein codiert. Z.B. kann für die cDNA-Klonierung des FHIT-Gens brauchbare RNA aus Zellen isoliert werden, die FHIT exprimieren, z.B. Zellen aus Niere oder Magen oder Lunge. Andere Verfahren sind dem Fachmann bekannt und sind im Rahmen der Erfindung umfasst.
Das identifizierte und isolierte Gen kann dann in einen geeigneten Klonierungsvektor insertiert werden. Eine große Anzahl im Fachgebiet bekannter Vektor-Wirtsysteme kann verwendet werden. Mögliche Vektoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Plasmide oder modifizierte Viren; das Vektorsystem muss aber kompatibel zu der verwendeten Wirtszelle sein. Derartige Vektoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Bakteriophagen, wie z.B. Lambda-Derivate, oder Plasmide, wie z.B. PBR322 oder pUC Plasmid-Derivate oder den Bluescript Vektor (Stratagene). Die Insertion in einen Klonierungsvektor kann, zum Beispiel, erreicht werden durch Ligation des DNA-Fragments in einen Klonierungsvektor, der komplementäre kohäsive Enden aufweist. Falls jedoch die komplementären Restriktionsschnittstellen, die verwendet wurden, um die DNA zu fragmentieren, in dem Klonierungsvektor nicht vorhanden sind, können die Enden der DNA-Moleküle enzymatisch modifiziert werden. Alternativ kann irgendeine gewünschte Stelle hergestellt werden, indem Nucleotidsequenzen (Linker) an die DNA-Enden ligiert werden; diese ligierten Linker können spezifische chemisch synthetisierte Oligonucleotide umfassen, die Erkennungssequenzen für Restriktionsendonucleasen codieren. In einem alternativen Verfahren kann der geschnittene Vektor und das FHIT-Gen durch Anlagerung von Homopolymeren an die entsprechenden Enden (homopolymeric tailing) modifiziert werden. Rekombinante Moleküle können durch Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation oder andere dem Fachmann bekannte Verfahren in die Wirtszellen eingeführt werden, so dass viele Kopien der Gensequenz erzeugt werden.
In einem alternativen Verfahren kann das gewünschte Gen nach der Insertion in einen geeigneten Klonierungsvektor mit einem "Shotgun"-Ansatz identifiziert und isoliert werden. Eine Anreicherung des gewünschten Gens, z.B. durch Größenfraktio nierung, kann vor der Insertion in den Klonierungsvektor vorgenommen werden.
In spezifischen Ausführungsformen ermöglicht die Transformation von Wirtszellen mit rekombinanten DNA-Molekülen, die das isolierte FHIT-Gen, cDNA oder synthetisierte DNA-Sequenz enthalten, die Erzeugung vielfacher Kopien des Gens. Somit kann das Gen durch Wachstum der Transformanten, Isolierung der rekombinanten DNA-Moleküle aus den Transformanten und, wenn notwendig, Gewinnung des insertierten Gens aus der isolierten rekombinanten DNA in großen Mengen erhalten werden.
Oligonucleotide, die einen Teil der FHIT codierenden oder nicht-codierenden Sequenzen enthalten, oder für einen Teil des Fhit-Proteins codieren (z.B. Primer zur Verwendung in PCR) können durch im Fachgebiet allgemein bekannte Standardverfahren synthetisiert werden. Derartige Oligonucleotide haben vorzugsweise eine Größe in dem Bereich von 8 bis 25 Nucleotiden. In einer spezifischen Ausführungsform haben derartige Oligonucleotide hierin eine Größe in dem Bereich von 15 bis 25 Nucleotiden oder 15 bis 35 Nucleotiden.
Die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellten FHIT-Sequenzen beinhalten jene Nucleotidsequenzen, die im wesentlichen für die gleichen Aminosäuresequenzen codieren, wie sie in natürlichen Fhit-Proteinen gefunden werden und jenen codierten Aminosäuresequenzen mit funktional äquivalenten Aminosäuren sowie jenen, die für andere Fhit-Derivate oder -Analoga codieren, wie unten für Fhit-Derivate und -Analoga beschrieben.
5.2. EXPRESSION DES FHIT-GENS
Gemäß der vorliegenden Erfindung können Nucleotidsequenzen, die für ein Fhit-Protein, ein Derivat, z.B. ein Fragment, oder ein Analogon desselben, codieren, in einen geeigneten Expressionsvektor, d.h. einen Vektor, der die notwendigen Elemente zur Transcription und Translation der insertierten Protein codierenden Sequenz enthält, zur Erzeugung rekombinanter DNA-Moleküle, die die Expression eines Fhit-Proteins steuern, insertiert werden. Derartige FHIT-Polynucleotidsequenzen sowie andere Polynucleotide oder ihre Komplemente können auch verwendet werden in Nucleinsäure-Hybridisierungsassays,Southern- und Northern-Blot Analyse, usw. In einer spezifischen Ausführungsform wird ein humanes FHIT-Gen, oder eine Sequenz, die für einen funktional aktiven Teil eines humanen FHIT-Gens codiert, exprimiert. In noch einer weiteren Ausführungsform wird ein Derivat oder Fragment eines humanen FHIT-Gens exprimiert.
Wegen der dem genetischen Code innewohnenden Degeneration werden andere DNA-Sequenzen, die für eine im wesentlichen gleiche oder funktional äquivalente Fhit-Aminosäuresequenz codieren, von der Erfindung umfasst. Derartige DNA-Sequenzen beinhalten jene, die fähig sind, an die humane FHIT-Sequenz unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren.
Abgeänderte DNA-Sequenzen, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, beinhalten Deletionen, Hinzufügungen oder Substitutionen von unterschiedlichen Nucleotidresten, die zu einer Sequenz führen, die für das gleiche oder ein funktional äquivalentes Genprodukt codiert. Das Genprodukt selbst kann Deletionen, Hinzufügungen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb der FHIT-Sequenz enthalten, die zu einer stillen Änderung führen und somit ein funktional äquivalentes Fhit-Protein herstellen. Derartige Aminosäuresubstitutionen können auf der Grundlage von Ähnlichkeit in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilizität und/oder der amphipatischen Beschaffenheit der beteiligten Reste erfolgen. Zum Beispiel beinhalten negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren beinhalten Lysin und Arginin; Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophilizitätswerten beinhalten die folgenden: Leucin, Isoleucin, Valin; Glycin, Alanin; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Phenylalanin, Tyrosin.
Die DNA-Sequenzen der Erfindung können konstruiert werden, um eine codierende FHIT-Sequenz für verschiedenste Zwecke zu ändern, beinhaltend, aber nicht beschränkt auf, Änderungen, die die Prozessierung und Expression des Genprodukts modifizieren. Zum Beispiel können unter Verwendung von Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, z.B. ortsspezifische Mutagenese (site-directed mutagenesis), Mutationen eingefügt werden, um neue Restriktionsschnittstellen einzuführen, usw.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine FHIT-Genseqeuenz oder ein Derivat derselben mit einer nicht-FHIT-Sequenz ligiert, um für ein chimäres Fusionsprotein zu codieren. Ein Fusionsprotein kann auch konstruiert werden, um eine Spaltstelle zu enthalten, die sich zwischen einer FHIT-Sequenz und der nicht-Fhit-Proteinsequenz befindet, so dass das Fhit-Protein von der nicht-FHIT-Einheit abgespalten werden kann. In einer spezifischen Ausführungsform besteht die in dem Fusionsprotein vorhandene Fhit-Aminosäuresequenz aus wenigstens 10 aufeinder folgenden Aminosäuren, wenigstens 25 aufeinder folgenden Aminosäuren, wenigstens 50 aufeinder folgenden Aminosäuren, wenigstens 75 aufeinder folgenden Aminosäuren, wenigstens 100 aufeinder folgenden Aminosäuren oder wenigstens 147 Aminosäuren (vollständig) der Fhit-Proteinsequenz.
In einer abgewandelten Ausführungsfrom der Erfindung wird die codierende Sequenz von einem FHIT unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten chemischen Verfahren gänzlich oder teilweise synthetisiert. Siehe, zum Beispiel, Caruthers et al., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-233; Crea und Horn, 1980, Nuc. Acids Res. 9(10):2331; Matteucci und Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21:719; und Chow und Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9(12):2807-2817. Alternativ könnte das Protein selbst unter Verwendung chemischer Verfahren zur vollständigen oder teilweisen Synthese einer Fhit-Aminosäuresequenz hergestellt werden. Peptide können, zum Beispiel, durch Festphasen-Verfahren (solid phase techniques) synthetisiert werden, vom Harz abgespalten werden, und durch präparative Hochleistungs-Flüssigchromatographie (high performance liquid chromatography) gereinigt werden. (z.B., siehe Creighton, 1983, Proteins Structures And Molecular Principles, W.H. Freeman und Co., N.Y. S. 50-60). Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide kann durch Aminosäureanalyse oder Sequenzierung bestätigt werden (z.B. das Verfahren des Edman-Abbaus; siehe Creighton, 1983, Proteins, Structures And Molecular Principles, W.H. Freeman und Co., N.Y., S. 34-49).
Um ein biologisch aktives Fhit-Protein oder Derivat desselben zu exprimieren, wird eine Polynucleotidsequenz, die für ein Fhit-Protein codiert, oder ein Derivat derselben, in einen geeigneten Expressionsvektor, d.h. einen Vektor, der die notwendigen Elemente für die Transcription und Translation der insertierten codierenden Sequenz enthält, insertiert. Die FHIT-Genprodukte sowie Wirtszellen oder Zellinien, transfiziert oder transformiert mit rekombinanten FHIT-Expressions vektoren, können für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden. Diese beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, die Erzeugung von Antikörpern (d.h. monoklonal oder polyklonal), die ein Fhit-Protein immunospezifisch binden. Anti-Fhit Antikörper können beim Nachweisen oder Messen von Fhit-Proteinleveln in Patientenproben verwendet werden.
5.2.1. EXPRESSIONSSYSTEME
Verfahren, die den Fachleuten bekannt sind, können verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die eine FHIT codierende Sequenz und geeignete Transcriptions/Translations-Kontrollsignale enthalten. Diese Verfahren beinhalten in vitro Verfahren mit rekombinanter DNA (in vitro recombinant DNA techniques), synthetische Verfahren und in vivo Rekombination/genetische Rekombination. Siehe, zum Beispiel, die in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates und Wiley Interscience, N.Y. beschriebenen Verfahren.
Eine Vielzahl von Wirt/Expression-Vektorsystemen kann verwendet werden, um eine FHIT codierende Sequenz zu exprimieren. Diese beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien, die mit rekombinanter Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformiert sind, Expressionsvektoren, die eine FHIT codierende Sequenz enthalten, Hefe, die mit rekombinanten Hefe-Expressionsvektoren, enthaltend eine FHIT codierende Sequenz, transformiert ist; Insektenzell-Systeme, infiziert mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z.B. Baculovirus), enthaltend eine FHIT codierende Sequenz; Pflanzenzell-Systeme, infiziert mit rekom binanten Virus-Expressionsvektoren (z.B., Blumenkohlmosaik-Virus (cauliflower mosaic virus), CaMV; Tabakmosaik-Virus (tobacco mosaic virus), TMV) oder transformiert mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid), enthaltend eine FHIT codierende Sequenz; oder Tierzell-Systeme. Die Expressionselemente von diesen Systemen unterscheiden sich in ihrer Stärke und ihren Spezifitäten. Abhängig von dem verwendeten Wirt/Vektor-System kann irgendeines von einer Anzahl geeigneter Transcriptions- und Translationselemente, einschließlich konstitutiven und induzierbaren Promotoren, in dem Expressionsvektor verwendet werden. Wenn die Klonierung in bakteriellen Systemen erfolgt, können, zum Beispiel, induzierbare Promotoren, wie z.B. pL aus Bakteriophage λ, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac Hybridpromotor) und dergleichen, verwendet werden; wenn die Klonierung in Insektenzell-Systeme erfolgt, können Promotoren, wie z.B. der Polyhedrin-Promotor von Baculovirus, verwendet werden; wenn die Klonierung in Pflanzenzell-Systeme erfolgt, können Promotoren, die aus dem Genom von Pflanzenzellen stammen (z.B. Hitzeschock-Promotoren; der Promotor für die kleine Untereinheit von RUBISCO; der Promotor für das Chlorophyll a/b-Bindungsprotein) oder aus Pflanzenviren (z.B. der 35S RNA-Promotor von CaMV; der Hüllprotein-Promotor von TMV (the coat protein promoter of TMV) verwendet werden; wenn die Klonierung in Säugetierzell-Systeme erfolgt, können Promotoren, die aus dem Genom von Säugetierzellen stammen (z.B. Metallothionein-Promotor) oder aus Säugetierviren (z.B. der späte Adenovirus-Promotor (adenovirus late promoter); der Vaccinia-Virus Promotor 7.5 K (vaccinia virus 7.5 K promoter) verwendet werden; wenn Zellinien erzeugt werden, die mehrere Kopien einer FHIT-DNA enthalten, können Vektoren, basierend auf SV40, BPV und EBV, mit einem geeigneten selektionierbaren Marker verwendet werden.
Bei bakteriellen Systemen kann eine Anzahl von Expressionsvektoren vorteilhaft ausgewählt werden, abhängig von der beabsichtigten Verwendung des exprimierten Fhit-Proteins. Wenn, zum Beispiel, große Mengen an Fhit-Protein zur Erzeugung von Antikörpern hergestellt werden sollen, können Vektoren erwünscht sein, die die Expression von großen Mengen an Fusionsprotein-Produkten, die einfach zu reinigen sind, regeln. Derartige Vektoren beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, den E. coli Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), in welchem die FHIT codierende Sequenz in den Vektor im Leserahmen mit dem lac Z codierenden Bereich ligiert sein kann, so dass ein AS-lac Z-Hybridprotein hergestellt wird; pIN-Vektoren (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509); und dergleichen. pGEX-Vektoren können auch verwendet werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutathion S-Transferase (GST) zu exprimieren (Smith und Johnson, 1988, Gene 7:31-40). Allgemein sind derartige Fusionsproteine löslich und können aus lysierten Zellen leicht gereinigt werden durch Adsorption an Glutathion-Agarosekugeln, gefolgt von Elution in der Gegenwart von freiem Glutathion. Die pGEX-Vektoren sind so entworfen, dass sie Thrombin oder Faktor Xa Protease Spaltstellen enthalten, so dass die klonierten Polypeptide von Interesse von der GST Einheit befreit werden können.
Bei Hefe kann eine Anzahl von Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, verwendet werden. Für eine Übersicht, siehe Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 2, 1988, Hrsg. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13; Grant et al., 1987, Expression und Secretion Vektors for Yeast, in Methods in Enzymology, Hrsg. Wu & Grossman, 1987, Acad. Press, N.Y. 153:516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Bd. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3; und Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y. 152: 673-684; und The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Bd. I und II.
In Fällen, in denen Pflanzen-Expressionsvektoren verwendet werden, kann die Expression einer FHIT codierenden Sequenz durch irgendeinen von einer Anzahl von Promotoren getrieben werden. Zum Beispiel können virale Promotoren verwendet werden, wie z.B. die Promotoren 35S RNA und 19S RNA von CaMV (Brisson et al., 1984, Nature 310:511-514), oder der Hüll-protein-Promotor von TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6:307-311); alternativ können Pflanzen-Promotoren, wie z.B. die kleine Untereinheit von RUBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglie et al., 1984, Science 224:838-843); oder Hitzeschock-Promotoren, z.B. Sojabohnen Hsp17.5-E oder Hsp17.3-B (Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565), verwendet werden. Diese Konstrukte können in Pflanzenzellen eingeführt werden unter Verwendung von Ti-Plasmiden, Ri-Plasmiden, Pflanzenvirus-Vektoren, direkter Transformation von DNA, Mikroinjektion, Elektroporation, usw. Für Übersichten über derartige Verfahren, siehe, zum Beispiel, Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, S. 421-463; und Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2. Aufl., Blackie, London, Kap. 7-9.
Ein alternatives Expressionssystem, das verwendet werden kann, um ein FHIT-Gen zu exprimieren, ist ein Insektensystem. In einem derartigen System wird Kernpolyhedrosis-Virus Autographa californica (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV)) als ein Vektor zur Expression fremder Gene verwendet. Das Virus wächst in Zellen von Spodoptera frugiperda. Eine FHIT codierende Sequenz kann in nicht-lebenswichtige Bereiche (zum Beispiel das Polyhedrin-Gen) des Virus kloniert werden und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (zum Beispiel den Polyhedrin-Promotor) gestellt werden. Der erfolgreiche Einbau einer FHIT codierenden Sequenz wird zur Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und der Herstellung von nicht-eingeschlossenem (non-occluded) rekombinantem Virus (d.h. Virus, dem die durch das Polyhedrin-Gen codierte Proteinhülle fehlt) führen. Diese rekombinanten Viren werden dann erwendet, um Zellen von Spodoptera frugiperda zu infizieren, in denen das eingebaute Gen exprimiert wird. (siehe, z.B., Smith et al., 1983, J. Virol. 46:584; Smith, U.S. Pat.-Nr. 4,215,051).
In Säugetier-Wirtszellen kann eine Anzahl von Expressionssystemen auf viraler Basis benutzt werden. In Fällen, in denen ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, kann eine FHIT codierende Sequenz an einen adenoviralen Transcriptions/Translations-Steuerungskomplex (adenovirus transcription/translation control complex), z.B., den späten Promotor und die dreiteilige Leitsequenz (tripartite leader sequence). Dieses chimäre Gen kann dann in das Adenvirus-Genom durch in vitro oder in vivo Rekombination eingebaut werden. Der Einbau in einen nicht-lebenswichtigen Bereich des viralen Genoms (z.B. Region E1 oder E3) führt zu einem rekombinanten Virus, das lebensfähig und in der Lage ist, FHIT in infizierten Wirten zu exprimieren (siehe, zum Beispiel, B., Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659). Alternative kann der Vaccinia Promotor 7,5 K verwendet werden (Siehe, z.B., Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927-4931).
Spezifische Initiierungssignale können für eine effiziente Translation einer eingebauten FHIT codierenden Sequenz auch benötigt werden. Diese Signale beinhalten das ATG-Initiationscodon und angrenzende Sequenzen. In Fällen, in denen ein gesamtes FHIT-Gen, einschließlich seines eigenen Initiationscodons und angrenzenden Sequenzen, in den geeigneten Expressionsvektor eingebaut wird, können zusätzliche Translationssteuerungssignale nicht erforderlich sein. Jedoch müssen in Fällen, in denen nur ein Teil einer FHIT codierenden Sequenz eingebaut wird, der das 5'-Ende fehlt, exogene Translationssteuerungssignale, einschließlich des ATG-Initiationscodons, bereitgestellt werden. Des Weiteren muss sich das Initiationscodon mit der FHIT codierenden Sequenz in einem Leseraster befinden, um die Translation des gesamten Inserts zu gewährleisten. Diese exogenen Translationssteuerungssignale und Initiationscodons können verschiedenartigen Ursprungs sein, sowohl natürlichen als auch synthetischen. Die Effizienz der Expression kann erhöht werden durch die Aufnahme von geeigneten Transcritpions-Verstärkerelementen (transcription enhancer elements), Transcriptions-Terminatoren, usw. (siehe Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544).
Darüber hinaus kann ein Wirtszellstamm ausgewählt werden, der die Expression der insertierten Sequenzen moduliert oder modifiziert und das Genprodukt in der spezifisch gewünschten Weise prozessiert. Deratige Modifikationen (z.B. Phosphorylierung) und Prozessisierung (z.B. Spaltung) von Proteinprodukten können für die Funktion des Proteins wichtig sein. Unterschiedliche Wirtszellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen für die post-translationale Prozessie rung und Modifikation von Proteinen. Geeignete Zellinien oder Wirtsysteme können ausgewählt werden, um die korrekte Modifikation und Prozessierung des exprimierten fremden Proteins zu gewährleisten. Dafür können eukaryotische Wirtszellen, die die zelluläre Maschinerie für die richtige Prozessierung des primären Transcripts, und die Phosphorylierung des Genprodukts besitzen, verwendet werden. Derartige Säugetier-Wirtszellen beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38, usw.
Für die langfristige Produktion von rekombinanten Proteinen mit hoher Ausbeute wird stabile Expression bevorzugt. Zum Beispiel können Zellinien, die ein Fhit-Protein stabil exprimieren, konstruiert werden. Statt Expressionsvektoren zu verwenden, die virale Replikationsursprünge enthalten, können Wirtszellen mit FHIT-DNA transformiert werden, die durch geeignete Expressionssteuerungselemente (z.B. Promotor, Verstärker (enhancer), Sequenzen, Transcriptions-Terminatoren, Polyadenylierungsstellen, usw.) und einen selektierbaren Marker kontrolliert werden. Nach der Einführung von fremder DNA kann den konstruierten Zellen gestattet werden, für 1-2 Tage in einem angereichertem Medium zu wachsen, und dann werden sie in ein Selektionsmedium überführt. Der selektionierbare Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht Resistenz gegenüber der Selektion und erlaubt den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und zu wachsen, um Foci zu bilden, die wiederum kloniert und in Zellinien ausgedehnt werden können. Dieses Verfahren kann vorteilhaft verwendet werden, um Zellinien zu konstruieren, die Fhit-Protein exprimieren. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Fhit-Proteins bereit, umfassend die Kultivierung einer Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Expressionsvektor, der für ein Fhit-Protein codiert, transformiert ist, so dass das Fhit-Protein von der Zelle exprimiert wird, und die Gewinnung des exprimierten Fhit-Proteins.
Eine Anzahl von Selektionssystemen kann verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Thymidinkinase von Herpes simplex-Virus (herpes simplex virus thymidine kinase) (Wigler et al., 1977, Cell 11:223); Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026), und Adenin-Phosphoribosyltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22:817); diese Gene können eingesetzt werden in TK-, HGPRT- bzw. APRT-Zellen. Auch Anti-Metaboliten Resistenz kann verwendet werden als Grundlage einer Selektion auf DHFR, die Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); GPT, die Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); Neo, das Resistenz gegen das Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); und Hygro, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Kürzlich wurden weitere selektionierbare Gene beschrieben, nämlich trpB, das den Zellen gestattet, Indol anstelle von Tryptophan zu benutzen; hisD, das den Zellen erlaubt, Histinol anstelle von Histidin zu benutzen (Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047); und ODC (Ornithin-Decarboxylase), die Resistenz gegen den Ornithin-Decarboxylase Hemmer, 2-(Difluoromethyl)-DL-ornithin, DFMO verleiht (McConlogue, L., 1987, in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg.).
5.2.2. IDENTIFIKATION VON TRANSFEKTANDEN ODER TRANSFORMANDEN, DIE FHIT EXPRIMIEREN
Die Wirtszellen, die die codierende Sequenz enthalten und das biologisch aktive Genprodukt exprimieren, können durch mindestens vier allgemeine Methoden identifiziert werden; (a) DNA-DNA oder DNA-RNA Hybridisierung; (b) das Vorhandensein oder die Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen; (c) Bestimmung des Transcriptionsniveaus, wie es durch die Expression der FHIT-mRNA Transcripte in der Wirtszelle gemessen wird; und (d) Nachweis des Genprodukts, wie es durch Immunoassay oder durch dessen biologische Aktivität ermittelt wird.
Bei der ersten Methode kann das das Vorhandensein der FHIT codierenden Sequenz, die in den Expressionsvektor insertiert ist, unter Verwendung von Sonden, umfassend Nucleotidsequenzen, die homolog zu der FHIT codierenden Sequenz bzw. Teilen oder Derivaten derselben sind, durch DNA-DNA oder DNA-RNA Hybridisierung nachgewiesen werden.
Bei der zweiten Methode kann das System rekombinanter Expressionsvektor/Wirtszelle identifiziert und selektioniert werden, basierend auf dem Vorhandensein oder der Abwesenheit bestimmter "Marker"-Genfunktionen (z.B. Thymidinkinase-Aktivität, Resistenz gegen Antibiotika, Resistenz gegen Methotrexat, Transformationsphänotyp, Einschlußkörperbildung bei Baculovirus, usw.). Zum Beispiel können rekombinante Zellen, die die FHIT codierende Sequenz enthalten, durch die Abwesenheit der Marker-Genfunktion identifiziert werden, wenn die humane FHIT codierende Sequenz innerhalb einer Markergensequenz des Vektors eingebaut ist. Alternativ kann ein Markergen in Tandem mit einer FHIT-Sequenz positioniert werden, unter der Kontrolle desselben oder eines unterschiedlichen Promotors, verwendet, um die Expression der FHIT codierenden Sequenz zu steuern. Die Expression des Markers als Antwort auf die Induktion oder Selektion zeigt die Expression der FHIT codierenden Sequenz an.
Bei der dritten Methode kann die Transcriptionsaktivität eines FHIT-Gens durch Hybridisierungsassays bestimmt werden. Zum Beispiel kann RNA isoliert und durch Northern-Blot unter Verwendung einer Sonde mit Sequenzhomologie zu einer FHIT codierenden Sequenz oder transcribierten nicht-codierenden Sequenz oder bestimmten Teilen derselben analysiert werden. Alternativ kann die gesamte Nucleinsäure der Wirtszelle extrahiert werden und quantitativ auf Hybridisierung an derartige Sonden getestet werden.
Bei der vierten Methode können die Level eines Fhit-Proteinprodukts immunologisch bestimmt werden, zum Beispiel durch Western-Blots, Immunoassays, wie z.B. Radioimmuno-Präzipitation, Enzym-gekoppelten Immunnachweisen (ELISAs) und dergleichen.
5.3. REINIGUNG DES EXPRIMIERTEN GENPRODUKTS
Sobald eine Rekombinante, die die FHIT-Gensequenz exprimiert, identifiziert ist, kann das Genprodukt analysiert werden. Dies wird erreicht durch Assays, die auf den physikalischen oder funktionalen Eigenschaften des Produkts basieren, einschließlich radioaktiver Markierung des Produkts, gefolgt von Analyse durch Gelelektrophorese, Immunoassay oder anderen Nachweisverfahren, die dem Fachmann bekannt sind.
Sobald das Fhit-Protein identifiziert ist, kann es durch Standardverfahren isoliert und gereinigt werden, einschließlich Chromatographie (z.B Ionenaustausch-, Affinitäts- und Größen- (sizing) Säulenchromatographie), Zentrifugation, unterschiedlicher Löslichkeit oder irgendeinem anderen Standardverfahren zur Reinigung von Proteinen. Die funktionellen Eigenschaften können unter Verwendung irgendeines geeigneten Assays evaluiert werden.
Alternativ kann sobald ein von einer Rekombinante hergestelltes Fhit-Protein identifiziert ist, die Aminosäuresequenz aus der Nucleotidsequenz des chimären Gens, das in der Rekombinante enthalten ist, abgeleitet werden. Als Folge davon kann das Protein durch im Fachgebiet bekannte chemische Standardverfahren synthetisiert werden (siehe, z.B., Hunkapiller et al., 1984, Nature 310:105-111).
In einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhalten derartige Fhit-Proteine, ob durch Verfahren mit rekombinanter DNA oder chemische Syntheseverfahren hergestellt, als eine primäre Aminosäuresequenz, alles oder einen Teil der Aminosäuresequenz wie sie im wesentlichen in 2A (SEQ ID NO:2) abgebildet ist, sowie Fragmente und andere Derivate, und Analoga derselben, sind aber nicht auf jene beschränkt.
5.4. ERZEUGUNG VON ANTIKÖRPERN GEGEN Fhit
Gemäß der Erfindung können das Fhit-Protein, dessen Fragmente oder andere Derivate, oder Analoga derselben, als ein Immunogen verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die ein derartiges Immunogen erkennen. Derartige Antikörper beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, polyklonale, monoklonale, chimäre, Single-Chain, Fab-Fragmente, und eine Fab-Expressionsbibliothek. In einer spezifischen Ausführungsform werden Antikörper gegen ein humanes Fhit-Protein hergestellt.
Verschiedene im Fachgebiet bekannte Verfahren können für die Herstellung polyklonaler Antikörper gegen ein Fhit-Protein oder Derivat oder Analogon verwendet werden. Für die Herstellung eines Antikörpers können verschiedene Wirtstiere durch Injektion des natürlichen Fhit-Proteins oder einer synthetischen Version, oder einem Derivat (z.B. Fragment) derselben, immunisiert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Kanninchen, Mäuse, Ratten usw. Verschiedene Adjuvanzien können verwendet werden, um die Immunantwort zu verstärken, abhängig von der Wirtspezies, und einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Freund's (vollständig und unvollständig), Mineralgele, wie z.B. Aluminumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie z.B. Lysolecithin, pluronische (pluronic) Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Schlüssellochschnecken (keyhole limpet) Hämocyanine, Dinitrophenol, und potentiell nützliche humane Adjuvantien, wie z.B. BCG (Bacillus Calmette-Guérin) und Corynebacterium parvum.
Für die Herstellung monoklonaler Antikörper, die gegen ein Fhit-Protein oder Analogon desselben gerichtet sind, kann jedes Verfahren verwendet werden, das die Produktion von Antikörpermolekülen mittels kontinuierlicher Zellinien in Kultur ermöglicht. Zum Beispiel das ursprünglich von Kohler und Milstein (1975, Nature 256:495-497) entwickelte Hybridomaverfahren, sowie das Triom-Verfahren, das Hybridoma-Verfahren mit humanen B-Zellen (human B-cell hybridoma technique) (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), und das EBV-Hybridoma-Verfahren, um humane monoklonale Antikörper herzustellen (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies und Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). In einer zusätzlichen Ausführungsform der Erfindung können monoklonale Antiörper in keimfreien Tieren (germ-free animals) unter Verwendung neuester Technologie (PCT/US90/02545) hergestellt werden. Gemäß der Erfindung können humane Antikörper verwendet werden und können erhalten werden durch Verwendung humaner Hybridome (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030) oder durch Transformation humaner B-Zellen mit EBV-Virus in vitro (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies und Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96). In der Tat können gemäß der Erfindung Verfahren verwendet werden, die für die Produktion von "chimären Antikörpern" entwickelt wurden (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454), indem Gene aus einem Maus-Antikörpermolekül, spezifisch für FHIT, mit Genen aus einem humanen Antikörpermolekül mit geeigneter biologischer Aktivität zusammengespleißt werden; derartige Antikörper sind im Rahmen dieser Erfindung umfasst.
Gemäß der Erfindung können für die Produktion von Single-Chain-Antikörpern beschriebene Verfahren (U.S. Pat.-Nr. 4,946,778) angepasst werden, um Fhit-spezifische Single-Chain-Antikörper herzustellen. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung benutzt die für die Produktion von Fab-Expressionsbibliotheken beschriebenen Verfahren (Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281), um die schnelle und einfache Identifizierung von monoklonalen Fab-Fragmenten mit der gewünschten Spezifität für Fhit-Proteine, Derivative oder Analoga zu gestatten.
In einer spezifischen Ausführungsform wird ein Molekül als Immunogen verwendet, das ein Fragment des Fhit-Proteins umfasst. Nachdem angenommen wird, dass hydrophile Bereiche sehr wahrscheinlich antigene Determinanten enthalten, wird, zum Beispiel, ein Peptid, das einen hydrophilen Teil eines Fhit-Proteins enthält oder diesem entspricht, vorzugsweise als Immunogen verwendet.
Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können durch bekannte Verfahren erzeugt werden. Derartige Fragmente, ohne darauf beschränkt zu sein, beinhalten zum Beispiel: das F(ab')₂-Fragment, das durch Pepsin-Verdau des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann; die Fab'-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')₂-Fragments erzeugt werden können, und die Fab-Fragmente, die durch Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden können.
Bei der Produktion der Antikörper kann die Durchmusterung (Screening) nach dem gewünschten Antikörper durch im Fachgebiet bekannte Verfahren erreicht werden, z.B. ELISA (Enzym-gekoppelter Immunadsorptionstest (enzyme-linked immunosorbent assay). Um zum Beispiel Antikörper auszuwählen, die eine spezifische Domäne eines Fhit-Proteins erkennen, kann man erzeugte Hybridome auf ein Produkt testen, das an ein Fhit-Fragment bindet, das eine derartige Domäne enthält. Für die Auswahl eines Antikörpers, der spezifisch für humanes Fhit ist, kann man die Auswahl treffen auf der Basis einer positiven Bindung an humanes Fhit und dem Scheitern einer Bindung an, zum Beispiel, Maus-Fhit.
Die vorstehenden Antikörper können in den im Fachgebiet bekannten Verfahren, die die Lokalisierung und Aktivität der Proteinsequenzen der Erfindung betreffen, verwendet werden, z.B. zur Darstellung dieser Proteine, Messung von Leveln derselben in geeigneten physiologischen Proben, in diagnostischen Verfahren, usw.
5.5. STRUKTUR DES FHIT-GENS UND -PROTEINS
Die Struktur des FHIT-Gens und -Proteins kann durch verschiedene im Fachgebiet bekannte Verfahren analysiert werden.
5.5.1. GENETISCHE ANALYSE
Die klonierte DNA oder cDNA, die dem FHIT-Gen entspricht, kann analysiert werden durch Verfahren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Southern-Hybridisierung (Southern, E.M., 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517), Northern-Hybridisierung (siehe, z.B., Freeman et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4094-4098), Restriktionskartierung (restriction endonuclease mapping) (Maniatis, T., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), und DNA-Sequenzanalyse. Polymerase-Kettenreaktion (PCR; U.S. Pat.-Nrn. 4,683,202, 4,683,195, und 4,889,818; Gyllenstein et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7652-7656; Ochman et al., 1988, Genetics 120:621-623; Loh et al., 1989, Science 243:217-220), gefolgt von Southern-Hybridisierung mit einer FHIT-spezifischen Sonde kann den Nachweis des FHIT-Gens in DNA aus verschiedenen Zellarten gestatten. In einer Ausführungsform kann Southern-Hybridisierung verwendet werden, um die genetische Verbindung (genetic linkage) von FHIT zu bestimmen. PCR, gefolgt von einem Hybridisierungsassay kann auch verwendet werden, um FHIT-RNA oder 3p14.2 chromosomale oder molekulare Abnormitäten nachzuweisen oder zu ermitteln. Northern-Hybridisierungsanalyse kann verwendet werden, um die Expressionslevel des FHIT-Gens zu bestimmen. Andere Assays sind in Abschnitt 5.11. beschrieben. Verschiedene Zellarten, zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung oder Aktivität können auf FHIT-Expression getestet werden. Die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen, sowohl für Southern- als auch Northern-Hybridisierung, oder Dot-Blots, kann manipuliert werden, um den Nachweis von Nucleinsäuren mit dem gewünschten Verwandschaftsgrad (degree of relatedness) zu der spezifischen verwendeten FHIT-Sonde zu gewährleisten.
Restriktionskartierung kann verwendet werden, um die genetische Struktur des FHIT-Gens grob zu bestimmen. Restriktionskarten, die durch Spaltung mit Restriktionsendonucleasen erhalten wurden, können durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt werden.
DNA-Sequenzanalyse kann durch irgendein im Fachgebiet bekanntes Verfahren durchgeführt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, das Verfahren von Maxam und Gilbert (1980, Meth. Enzymol. 65:499-560), das Sanger Dideoxyverfahren (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463), die Verwendung von T7 DNA-Polymerase (Tabor und Richardson, U.S. Pat. No. 4,795,699), oder die Verwendung eines automatisierten DNA-Sequenators (z.B., Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Die cDNA-Sequenz eines repräsentativen FHIT-Gens umfasst die Sequenz, wie sie im wesentlichen in 2A (SEQ ID NO: 1) abgebildet ist, und in Abschnitt 6 unten beschrieben ist.
5.5.2. PROTEINANALYSE
Die Aminosäuresequenz des Fhit-Proteins kann durch Ableitung aus der DNA-Sequenz oder, alternativ, durch direkte Sequenzierung des Proteins, z.B., mit einem automatisierten Aminosäure-Sequencer, erhalten werden. Die Aminosäuresequenz eines repräsentativen Fhit-Proteins umfasst die Sequenz, wie sie im wesentlichen in 2A (SEQ ID NO: 2) abgebildet ist, und in Abschnitt 6 unten ausführlich besprochen wird, abgebildet ist, wobei das gezeigte reife repräsentative Protein mit Aminosäurenummern 1-147 bezeichnet ist.
Die Fhit-Proteinsequenz kann ferner durch eine Hydrophilitätsanalyse (Hopp, T. und Woods, K., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824) charakterisiert werden. Ein Hydrophilitätsprofil kann verwendet werden, um die hydrophoben und hydrophilen Bereiche des Fhit-Proteins und die entsprechenden Bereiche der Gensequenz, die für derartige Bereiche codieren, zu identifizieren.
Sekundärstruktur-Analyse (Chou, P. und Fasman, G., 1974, Biochemistry 13:222) kann auch gemacht werden, um Bereiche des Fhit-Proteins zu identifizieren, die spezifische Sekundärstrukturen ausbilden.
Manipulation, Translation, und Sekundärstruktur-Vorhersage, sowie die Vorhersage und Abbildung eines offenen Leserahmens können auch unter Verwendung von im Fachgebiet erhältlichen Computer-Softwareprogrammen erreicht werden.
Andere Verfahren zur Strukturanalyse können auch eingesetzt werden. Diese beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Röntgenkristallographie (Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13) und Computer-Modeling (Fletterick, R, und Zoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics und Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
5.6. FHIT-PROTEINE, DERIVATE UND ANALOGA
Die Erfindung betrifft ferner Fhit-Proteine und Derivate (einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Fragmente) und Analoga des Fhit-Proteins. Nucleinsäuren, die für Fhit-Proteinderivate und Proteinanaloga codieren, werden auch bereitgestellt. Moleküle, die Fhit-Proteine oder Derivate umfassen, werden auch bereitgestellt. In einer Ausführungsform werden die Fhit-Proteine von den in Abschnitt 5.1. oben beschriebenen Nucleinsäuren codiert. In bestimmten Ausführungen sind die Proteine, Derivate oder Analoga Fhit-Proteine von Tieren.
Die Herstellung und Verwendung von Derivaten und Analoga, die verwandt zu Fhit sind, werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst. In einer spezifischen Ausführungsform ist das Derivat oder Analogon funktional aktiv, d.h. fähig, eine oder mehr funktionelle Aktivitäten, die mit einem vollständigen Wildtyp Fhit-Protein in Verbindung gebracht werden, zu zeigen. Als ein Beispiel: Derartige Derivate oder Analoga, die die gewünschte Immunogenität oder Antigenität haben, können, zum Beispiel, verwendet werden in Immunoassays, zur Immunisierung, zur Hemmung der Fhit-Aktivität, usw. Als weiteres Beispiel werden derartige Derivate und Analoga bereitgestellt, die Hydrolaseaktivität haben. Derivate und Analoga, die eine gewünschte Fhit-Eigenschaft von Interesse (z.B. Hemmung der Zellproliferation, Tumorhemmung) behalten oder, alternativ, denen eine gewünschte Fhit-Eigenschaft von Interesse fehlt oder diese hemmen, können als Induktoren (inducers) bzw. Hemmer (inhibitors) einer derartigen Eigenschaft und ihrer physiologischen Entsprechungen verwendet werden. Eine spezifische Ausführungsform betrifft ein Fhit-Fragment, das von einem Anti-Fhit Antikörper gebunden werden kann. Derivate oder Analoga von Fhit können getestet werden auf die gewünschte Aktivität durch im Fachgebiet bekannte Verfahren, einschließlich der unten beschriebenen Tests (assays), aber nicht auf diese beschränkt.
Insbesondere können Fhit-Derivate hergestellt werden durch Änderung der FHIT-Sequenzen mittels Substitutionen, Hinzufügungen oder Deletionen, die funktional äquivalente Moleküle bereit stellen. Wegen der Degeneration der codierenden Nucleotidsequenzen können andere DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen für die gleiche Aminosäuresequenz wie ein FHIT-Gen codieren, in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Nucleotidsequenzen, umfassend vollständige oder Teile der FHIT-Gene, die durch die Substitution unterschiedlicher Codons, die für einen funktional äquivaleten Aminosäurerest innerhalb der Sequenz codieren, geändert sind und somit eine stille Änderung erzeugen. Gleichermaßen beinhalten die Fhit-Derivate der Erfindung, sind aber nicht beschränkt auf, jene, die als eine primäre Aminosäuresequenz die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz eines Fhit-Proteins enthalten, einschließlich geänderter Sequenzen, in denen Reste innerhalb der Sequenz durch funktional äquivalente Aminosäurereste substituiert sind, und somit eine stille Änderung erzeugen. Zum Beispiel können ein oder mehr Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure ähnlicher Polarität, die sich als ein funktionales Äquivalent verhält, substituiert sein, was zu einer stillen Änderung führt. Ersatz für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz kann ausgewählt werden aus anderen Mitgliedern der Klasse, zu der die Aminosäure gehört. Zum Beispiel beinhalten die unpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die neutralen polaren Aminosäuren beinhalten Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren beinhalten Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren beinhalten Asparaginsäure und Glutaminsäure.
In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung werden Proteine bereitgestellt, die aus einem Fragment eines Fhit-Proteins, bestehend aus wenigstens 10 (aufeinander folgenden) Aminosäuren des Fhit-Proteins, bestehen oder dieses umfassen. In anderen Ausführungsformen besteht das Fragment aus wenigstens 20 oder 50 Aminosöuren des Fhit-Proteins. In spezifischen Ausführungsformen sind derartige Fragmente nicht größer als 35, 100 oder 140 Aminosäuren. Derivate oder Analoga von Fhit beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, jene Moleküle, die Bereiche umfassen, die im wesentlichen homolog zu Fhit oder Fragmenten desselben sind (z.B. in verschiedenen Ausführungsformen, wenigstens 60% oder 70% oder 80% oder 90% oder 95% Identität über eine Aminosäuresequenz identischer Größe, oder beim Vergleich mit einer angeordneten Sequenz (aligned Sequenz), bei der die Anordnung (alignment) mit einem im Fachgebiet bekannten Computerprogramm für Homologie erfolgt) oder deren codierende Nucleinsäure fähig ist, unter stringenten, schwach stringenten oder nicht-stringenten Bedingungen an eine codierende FHIT-Sequenz zu hybridisieren.
Die Fhit-Derivate und Analoga der Erfindung können durch verschiedene im Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt werden. Die Manipulationen, die zu ihrer Produktion führen, können auf Gen- oder Proteinebene erfolgen. Zum Beispiel kann die klonierte FHIT-Gensequenz durch irgendeine von zahlreichen im Fachgebiet bekannten Strategien (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, N.Y.) modifiziert werden. Die Sequenz kann an geeigneten Stellen mit Restriktionsendonuclease(n) gespalten werden, gefolgt von weiterer enzymatischer Modifikation, falls gewünscht, isoliert und ligiert in vitro. Bei der Produktion des Gens, das für ein Derivat oder Analogon von Fhit codiert, sollte beachtet werden, zu gewährleisten, dass das modifizierte Gen innerhalb des gleichen Translations-Leserahmens wie Fhit verbleibt, ununterbrochen von Translations-Stopsignalen, in der Genregion, in der für die gewünschte Fhit-Aktivität codiert wird.
Zusätzlich kann die für Fhit codierende Nucleinsäuresequenz in vitro oder in vivo mutiert wurde, um Translations-, Initiations- und/oder Terminationssequenzen hervorzubringen und/oder zu zerstören, oder um Variationen in den codierenden Bereichen zu erzeugen und/oder neue Stellen für Restriktionsendonucleasen zu bilden oder vorher vorhandene zu zerstören, um die weitere in vitro Modifikation zu erleichtern. Jedes im Fachgebiet bekannte Mutageneseverfahren kann verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, chemische Mutagenese, in vitro ortsspezifische (site-directed) Mutagenese (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem 253:6551), usw.
Manipulationen der Fhit-Sequenz können auch auf Proteinebene erfolgen. Im Rahmen der Erfindung umfasst sind Fhit-Proteinfragmente oder andere Derivate oder Analoga, die während oder nach der Translation unterschiedlich modifiziert werden, z.B. durch Glykosilierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Amidierung, Derivatisierung durch bekannte Schutz-/Blockierungsgruppen, proteolytische Spaltung, Kopplung an ein Antikörpermolekül oder andere zelluläre Liganden, usw. Irgendeine von zahlreichen chemischen Modifikationen kann durch bekannte Verfahren ausgeführt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, spezifische chemische Spaltung durch Cyanogenbromid, Trypsin, Chymotrypsin, Papain, V8-Protease, NaBH₄; Acetylierung, Formylierung, Oxidation, Reduktion; metabolische Synthese in der Gegenwart von Tunicamycin; usw.
Darüber hinaus können Analoga und Derivate von Fhit chemisch synthetisiert werden. Zum Beispiel kann ein Peptid, das einem Teil eines Fhit-Proteins entspricht, das die gewünschte Domäne (siehe Abschnitt 5.6.1.) umfasst, oder das die gewünschte Aktivität in vitro vermittelt, durch Verwendung eines Peptidsynthesizers synthetisiert werden. Des Weiteren können, falls gewünscht, nicht-klassische Aminosäuren oder chemische Aminosäureanaloga als Ersatz (substitution) oder Hinzufügung in die Fhit-Sequenz eingebaut werden. Nicht-klassische Aminosäuren beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, die D-Isomere der gewöhnlichen Aminosäuren, α-Aminoisobuttersäure, 4-Aminobuttersäure, ABu, 2-Aminobuttersäure, γ-ABu, ε-Ahx, 6-Aminohexansäure, Aib, 2-Aminoisobuttersäure, 3-Aminopropionsäure, Ornithin, Norleucin, Norvalin, Hydroxyprolin, Sarcosin, Citrullin, Cysteinsäure, t-Butylglycin, t-Butylalanin, Phenylglycin, Cyclohexylalanin, β-Alanin, Fluoraminosäuren, Designer-Aminosäuren, wie z.B. β-Methylaminosäuren, Ca-Methylaminosäuren, Nα-Methylaminosäuren und Aminosäureanaloga im Allgemeinen. Des Weiteren können die Aminosäuren D (rechtsdrehend) oder L (linksdrehend) sein.
In einer spezifischen Ausführungsform ist das Fhit-Derivat ein chimäres, oder Fusions-, Protein, umfassend ein Fhit-Protein oder ein Fragment desselben (vorzugsweise bestehend aus wenigstens einer Domäne oder einem Motif des Fhit-Proteins, oder mindestens 10 Aminosäuren des Fhit-Proteins), das an seinem Amino- oder Carboxy-Terminus über eine Peptidbindung mit einer Aminosäuresequenz eines unterschiedlichen Proteins verbunden ist. In einer Ausführungsform wird ein derartiges chimäres Protein hergestellt durch rekombinante Expression einer für das Protein codierenden Nucleinsäure (umfassend eine FHIT codierende Sequenz, die im Leseraster mit einer codieren den Sequenz für ein unterschiedliches Protein verbunden ist). Ein derartiges chimäres Produkt kann hergestellt werden, indem geeignete Nucleinsäuresequenzen, die für die gewünschten Aminosäuresequenzen codieren, durch im Fachgebiet bekannte Verfahren, im richtigen codierenden Rahmen, aneinander ligiert werden, und das chimäre Produkt durch im Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren exprimiert wird. Alternativ kann ein derartiges chimäres Produkt durch Protein-Syntheseverfahren hergestellt werden, z.B., durch Verwendung eines Peptidsynthesizers. Chimäre Gene, umfassend Teile von FHIT, die an irgendeine heterologe Protein codierende Sequenz fusioniert sind, können konstruiert werden.
In einer weiteren spezifischen Ausführungsform ist das Fhit-Derivat ein Molekül, umfassend eine zu einem Fhit-Protein homologen Bereich. Beispielsweise kann, in verschiedenen Ausführungsformen, ein erster Proteinbereich als "homolog" zu einem zweiten Proteinbereich betrachtet werden, wenn die Aminosäuresequenz des ersten Bereichs wenigstens 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, oder 95% identisch ist, beim Vergleich mit irgendeiner Sequenz in dem zweiten Bereich mit einer gleichen Anzahl von Aminosäuren wie der im ersten Bereich enthaltenen Anzahl, oder beim Vergleich zu einer angeordneten Sequenz des zweiten Bereichs, die mit einem im Fachgebiet bekannten Computerprogramm für Homologie angeordnet wurde. Zum Beispiel kann ein Molekül ein oder mehr Bereiche umfassen, die homolog zu einer Fhit-Domäne (siehe Abschnitt 5.6.1.) oder einem Teil derselben oder einem vollständigen Fhit-Protein sind.
5.7. ASSAYS FÜR FHIT-PROTEINE, DERIVATE UND ANALOGA
Die funktionelle Aktivität von Fhit-Proteinen, Derivaten und Analoga kann durch verschiedene Verfahren getestet werden.
Zum Beispiel können in einer Ausführungsform, bei der man die Fähigkeit testet, an Anti-Fhit Antikörper zu binden oder mit Wildtyp Fhit um die Bindung zu konkurrieren, verschiedene im Fachgebiet bekannte Immunoassays verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, kompetitive und nicht-kompetitive Testsysteme, die Verfahren, wie z.B. Radioimmunoassays, ELISA (Enzym-gekoppelter Immunoadsorptionstest), "Sandwich"-Immunoassays, immunoradiometrische Assays, Geldiffusions-Präzipitationsreaktionen, Immunodiffusionsassays, in situ Immunoassays (zum Beispiel unter Verwendung von kolloidalem Gold, Enzym- oder Radioisotop-Markern), Western-Blots, Präzipitationsreaktionen, Agglutinierungsassays (z.B., Gel-Agglutinierungsassays, Hämagglutinierungsassays), Komplement-Fixierungsassays, Immunfluoreszenz-Assays, Protein A-Assays, und Immunelektrophorese-Assays, usw. In einer Ausführungsform wird Antikörperbindung nachgewiesen durch den Nachweis einer Markierung auf dem primären Antikörper. In einer anderen Ausführungsform wird der primäre Antikörper durch den Nachweis der Bindung eines sekundären Antikörpers oder eines Reagenz an den den primären Antikörper nachgewiesen. In einer weiteren Ausführungsform wird der sekundäre Antikörper markiert. Viele Mittel zum Nachweis der Bindung in einem Immunoassay sind im Fachgebiet bekannt und sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform, bei der ein Fhit-Bindungsprotein identifiziert wird, kann die Bindung getestet werden, z.B. durch im Fachgebiet bekannte Mittel.
Sollte ein Fhit-Protein Hydrolaseaktivität besitzen, können in einer weiteren Ausführungsform Hydrolase-Assays verwendet werden, um die Fhit-Hydrolaseaktivität zu messen. Derartige Assays können mit im Fachgebiet bekannten Verfahren ausgeführt werden.
Darüber hinaus können im Fachgebiet bekannte Assays verwendet werden, um die Fähigkeit, die Zellproliferation zu hemmen, in vitro oder in vivo, nachzuweisen oder zu messen.
Andere Verfahren sind dem Fachmann bekannt und sind im Rahmen der Erfindung umfasst.
5.8. THERAPEUTISCHE VERWENDUNGEN: BEHANDLUNG UND VORBEUGUNG VON STÖRUNGEN, DIE ZELL-ÜBERPROLIFERATION MIT SICH BRINGT
Die Erfindung findet Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung von verschiedenen Krankheiten und Störungen durch Verabreichung einer therapeutischen Verbindung (hierin als "Therapeutikum" bezeichnet). Derartige "Therapeutika" beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf: Fhit-Proteine und Analoga und Derivate (einschließlich Fragmenten) derselben (z.B. wie vorstehend beschrieben); Antikörper hierfür (wie vorstehend beschrieben); Nucleinsäuren, die für die Fhit-Proteine, Analoga oder Derivate codieren (z.B. wie vorstehend beschrieben); und FHIT-Agonisten, und Antagonisten von Mutanten von FHIT-Genen oder -Proteinen (mutant FHIT genes or proteins) (z.B., Antikörper oder Antisense-Nucleinsäuren). Störungen, die Zell-Überproliferation mit sich bringt, werden behandelt oder es wird ihnen vorgebeugt durch Verabreichung eines Therapeutikums, das die Fhit-Funktion fördert, behandelt oder vorgebeugt. Das obige ist in den folgenden Unterabschnitten detailliert beschrieben.
Allgemein wird die Verabreichung von Produkten einer Ursprungsspezies oder Speziesreaktivität (in dem Fall von Antikörpern), d.h. die gleiche Spezies wie die des Patienten, bevorzugt. Somit wird ein humanes Fhit-Protein, Derivat oder Analogon, oder eine Nucleinsäure, oder ein Antikörper gegen ein humanes Fhit-Protein oder eine humane Antisense-Nucleinsäure, therapeutisch oder prophylaktisch einem menschlichen Patienten verabreicht.
Zusätzliche Beschreibungen und Quellen für Therapeutika, die erfindungsgemäß verwendet werden können, können hierin in Abschnitten 5.1. bis 5.7. gefunden werden.
Ein FHIT-Polynucleotid und dessen Fhit-Proteinprodukt können verwendet werden für therapeutische/prophylaktische Zwecke für Krankheiten, an denen Zell-Überproliferation beteiligt ist, sowie für andere Störungen, die in Zusammenhang stehen mit chromosomalen Translokationen oder Inversionen oder molekularen Abnormitäten, die in Zusammenhang stehen mit dem FHIT-Locus und/oder verminderter Expression von Wildtyp FHIT-RNA oder -Protein und/oder Expression einer Mutante von FHIT-RNA oder -Protein (mutant FHIT-RNA or protein) und/oder Expression einer Mutante von FHIT-RNA oder -Protein. Ein FHIT-Polynucleotid und dessen Fhit-Proteinprodukt können allein oder in Kombination mit anderen Therapeutika, die nützlich bei der Behandlung von Krebs und anderen hyperproliferativen und dysproliferativen Störungen sind, verwendet werden für therapeutische/prophylaktische Zwecke.
Krankheiten und Störungen, an denen Zell-Überproliferation beteiligt ist, werden behandelt oder es wird ihnen vorgebeugt durch Verabreichung eines Therapeutikums, das die Fhit- Funktion fördert (d.h. erhöht oder liefert). Beispiele für ein derartiges Therapeutikum beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Fhit-Proteine, Derivate oder Fragmente, die funktional aktiv sind, insbesondere aktiv bei der Hemmung der Zellproliferation (z.B. wie gezeigt in in vitro Assays oder in Tiermodellen), und Nucleinsäuren, die für ein Fhit-Protein oder ein funktional aktives Derivat oder Fragment desselben codieren (z.B. zur Verwendung in der Gentherapie). Andere Therapeutika, die verwendet werden können, z.B. Fhit-Agonisten, können unter Verwendung von in vitro Assays oder Tiermodellen identifiziert werden, wobei Beispiele für diese unten beschrieben sind.
Therapeutika, die die Fhit-Funktion fördern, werden therapeutisch (einschließlich prophylaktisch) verabreicht: (1) bei Krankheiten oder Störungen, die eine Abwesenheit von oder einen verminderten (relativ zum normalen oder gewünschten) Level an funktionalem Fhit-Protein mit sich bringen, zum Beispiel, bei Patienten, bei denen das Fhit-Protein fehlt, genetisch defekt, biologisch inaktiv oder vermindert aktiv ist, oder vermindert exprimiert wird; oder (2) bei Krankheiten oder Störungen, bei denen in vitro (oder in vivo) Assays die Nützlichkeit einer Verabreichung von Fhit-Agonist anzeigen. Die Abwesenheit von oder ein verminderter Level an Fhit-Protein oder -Funktion kann einfach nachgewiesen werden, z.B. durch Entnahme einer Gewebeprobe bei einem Patienten (z.B. aus Biopsiegewebe) und deren in vitro Untersuchung auf Level an RNA oder Protein, Struktur und/oder Aktivität der/des exprimierten FHIT-RNA oder Fhit-Proteins (siehe Abschnitt 5.11. unten für Assays, die zur Diagnose verwendet werden). Viele Standardverfahren aus dem Fachgebiet können somit eingesetzt werden, einschlißlich, aber nicht beschränkt auf, Immunoassays, um Fhit-Protein nachzuweisen und/oder sichtbar zu machen (z.B. Western-Blot, Immunpräzipitation, gefolgt von Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Immuncytochemie, usw.) und/oder Hybridisierungsassays, um Fhit-Expression nachzuweisen durch Nachweis und/oder sichtbar machen von FHIT-mRNA oder -cDNA (z.B. Northern-Assays, Dot-Blots, in situ Hybridisierung und, vorzugsweise, jene Assays, die in Abschnitt 5.11. beschrieben sind.), usw.
Krankheiten und Störungen, die Zell-Überproliferation mit sich bringen, und die behandelt werden können oder denen vorgebeugt werden kann, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Malignitäten, prämaligne Zustände (z.B. Hyperplasie, Metaplasie, Dysplasie), benigne (gutartige) Tumore, hyperproliferative Störungen, benigne dysproliferative Störungen, usw. Beispiele für diese sind unten näher ausgeführt.
5.8.1. MALIGNITÄTEN
Malignitäten und verwandte Störungen, die durch Verabreichung eines Therapeutikums, das die Fhit-Funktion fördert (z.B. ein vollständiges Fhit-Protein oder ein funktionales Derivat desselben oder eine Nucleinsäure, die für die vorstehenden codiert) behandelt werden können oder denen vorgebeugt werden kann, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, jene, die in Tabelle 1 aufgeführt sind (für eine Übersicht über derartige Krankheiten, siehe Fishman et al., 1985, Medicine, 2. Aufl., J.B. Lippincott Co., Philadelphia):
Tumoren des Verdauungstrakts, einschleißlich, aber nicht beschränkt auf, Speiseröhren-, Magen-, Dickdarm- und kolorektaler Krebs können behandelt oder kann vorgebeugt werden. Krebsarten der Atemwege, wie z.B. Arten von Lungenkrebs (z.B. kleinzelliges Bronchialkarzinom) und Nasen-Rachen-Karzinom, können behandelt oder kann vorgebeugt werden. Malignität oder dysproliferative Änderungen (wie z.B. Metaplasien und Dysplasien) oder hyperproliferative Störungen in Kopf, Nacken, Gebärmutterhals, Niere, Magen, Haut, Eierstock, Blase, Brust, Dickdarm, Lunge oder Gebärmutter, können behandelt oder kann vorgebeugt werden. Sarkom oder Leukämie können behandelt oder kann vorgebeugt werden.
Osteosarkom oder Nierenzellkarzinom können behandelt oder kann vorgebeugt werden.
5.8.2. PRÄMALIGNE ZUSTÄNDE
Die Therapeutika der vorliegenden Erfindung, die Fhit-Aktivität fördern, können auch verabreicht werden, um prämaligne Zustände zu behandeln und um der Entwicklung zu einem neoplastischen oder malignen Zustand, einschließlich der in Tabelle 1 aufgeführten, aber nicht auf jene beschränkt, vorzubeugen. Eine derartige prophylaktische oder therapeutische Verwendung ist angezeigt bei Zuständen, von denen bekannt ist oder vermutet wird, der Entwicklung zu einer Neoplasie oder Krebs voranzugehen, insbesondere, wenn nicht-neoplastisches Zellwachstum, bestehend aus Hyperplasie, Metaplasie oder, ganz besonders, Dysplasie stattgefunden hat (für eine Übersicht über derartige abnorme Wachstumszustände, siehe Robbins und Angell, 1976, Basic Pathology, 2. Aufl., W.B. Saunders Co., Philadelphia, S. 68-79). Hyperplasie ist eine Form der kontrollierten Zellproliferation, die eine Erhöhung der Zellzahl in einem Gewebe oder Organ mit sich bringt, ohne signifikante Veränderung der Struktur oder Funktion. Nur als ein Beispiel, endometriale Hyperplasie geht Korpskrebs (endometrial cancer) oft voraus. Metaplasie ist eine Form des kontrollierten Zellwachstums, bei der eine Art einer adulten oder vollständig differenzierten Zelle eine andere Art einer adulten Zelle ersetzt. Metaplasie kann in Epithel- oder Bindegewebszellen auftreten. Atypische Metaplasie bringt ein irgendwie ungeordnetes metaplastisches Epithel (disorderly metaplastic epithelium) mit sich. Dysplasie ist häufig ein Vorläufer von Krebs und wird hauptsächlich in den Epithelen gefunden; es ist die am stärksten ungeordnete Form von nicht-neoplastischem Zellwachstum, die einen Verlust an individueller Zelluniformität und der architektonischen Orientierung von Zellen mit sich bringt. Dysplastische Zellen haben oft abnorm große, tief gefärbte Kerne, und zeigen Pleomorphismus. Dysplasie tritt charakteristisch dort auf, wo chronische Reizung oder Entzündung existiert, und wird oft im Gebärmutterhals, den Atemwegen, Mundhöhle und Gallenblase gefunden.
Ein Patient, in dessen DNA eine Mutation des FHIT-Gens nachgewiesen wird, insbesondere eine Deletion, und ganz besonders eine homozygote Mutation, ist dadurch bestimmt, eine Prädisposition für Krebs zu haben und wird behandelt durch Verabreichung eines Fhit-Proteins oder einem funktionalen Derivat desselben oder einer Nucleinsäure, die für dasselbe codiert (Gentherapie).
Alternativ oder zusätzlich zu dem Vorhandensein von abnormem Zellwachstum, gekennzeichnet als Hyperplasie, Metaplasie oder Dysplasie, kann das Vorhandensein von einem oder mehr Merkmalen eines veränderten Phänotyps, oder von einem malignen Phänotyp, gezeigt von einer Zellprobe aus einem Patienten in vivo oder in vitro, die Wünschbarkeit einer prophylaktischen/therapeutischen Verabreichung eines Therapeutikums, das die Fhit-Funktion fördert, anzeigen. Wie oben erwähnt, beinhalten derartige Merkmale eines veränderten Phänotyps Änderungen der Morphologie, losere Substrat-Anheftung, Verlust der Kontakthemmung, Verlust der Verankerungsabhängigkeit, Proteasefreisetzung, gesteigerten Zuckertransport, verminderten Serumbedarf, Expression fetaler Antigene, Verschwinden des 250 000 Dalton Zelloberflächen-Proteins, usw. (siehe auch ib., S. 84-90 für Merkmale, die mit einem veränderten oder malignen Phänotyp in Verbindung gebracht werden).
Leukoplakia, eine gutartig erscheinende hyperplastische oder dysplastische Läsion des Epithels, oder Bowen-Krankheit (Bowen's disease), ein Karzinom in situ, sind präneoplastische Läsionen, die auf die Erwünschtheit einer prophylaktischen Intervention hindeuten.
Fibrozystische Erkrankung (zystische Hyperplasie, Mammadysplasie (mammary dysplasia), insbesondere Adenosis (benigne Epithelhyperplasie)) ist ein Hinweis auf die Erwünschtheit einer prophylaktischen Intervention.
Ein Patient, der einen oder mehr der folgenden prädisponierenden Faktoren für Malignität zeigt, wird durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines Therapeutikums behandelt: eine chromosomale Translokation, die mit einer Malignität verbunden ist (z.B. das Philadelphia-Chromosom für chronische myelogene Leukämie, t(14;18) für follikuläre Lymphome, usw.), familiäre Polyposis oder Gardner-Syndrom (mögliche Vorläufer von Dickdarmkrebs), benigne monoklonale Gammopathie (ein möglicher Vorläufer von multiplem Myelom), und eine Verwandschaft ersten Grades mit Personen, die Krebs haben oder eine präkanzerogene Erkrankung, die ein Mendelsches (genetisch) Vererbungsmuster zeigen (z.B. familiäre Polyposis des Dickdarms, Gardner-Syndrom,erbliche Exostose (hereditary exostosis), Polyendokrine Adenomatose, Calcitoninom (medullary thyroid carcinoma) mit Amyloidproduktion und Phäochromozytom (pheochromocytoma), Peutz-Jeghers-Syndrom, Neurofibromatose von Recklinghausen, Retinoblastom, Karotiskörpertumor (carotid body tumor), kutanes Melanokarzinom (cutaneous melanocarcinoma), intraokuläres Melanokarzinom (intraocular melanocarcinoma), Xeroderma pigmentosum, Ataxia telangiectasia, Chediak-Higashi-Syndrom, Albinismus, aplastische Fanconi-Anämie (Fanconi's aplastic anemia), und Bloom-Syndrom (Bloom's syndrome); siehe Robbins und Angell, 1976, Basic Pathology, 2. Aufl., W.B. Saunders Co., Philadelphia, S. 112-113) usw.)
Ein Therapeutikum der Erfindung wird einem menschlichen Patienten verabreicht, um der Progression zu Brust-, Dickdarm-, Lungen-, Magen- oder Gebärmutterkrebs, oder Melanom oder Sarkom vorzubeugen.
5.8.3. HYPERPROLIFERATIVE UND DYSPROLIFERATIVE STÖRUNGEN
Ein Therapeutikum, das die Fhit-Aktivität fördert, kann verwendet werden, um hyperproliferative oder benigne dysproliferative Störungen zu behandeln oder diesen vorzubeugen, speziell, um benigne Tumore, fibrozystische Zustände und Gewebehypertrophie (tissue hypertrophy) (z.B. Prostata-Hyperplasie (prostatic hyperplasia)) zu behandeln oder diesen vorzubeugen. Ein Patient mit einem Darmpolyp (intestinal polyp), Dickdarmpolyp (colon polyp), oder Speiseröhrendysplasie (esophageal dysplasia) kann durch Verabreichung eines Therapeutikums behandelt werden.
5.8.4. GENTHERAPIE
Nucleinsäuren, umfassend eine Sequenz, die für ein Fhit-Protein oder ein funktionales Derivat desselben codiert, können mittels Gentherapie verabreicht werden, um die Fhit-Funktion zu fördern. Gentherapie bezeichnet eine Therapie, die durch die Verabreichung einer Nucleinsäure an ein Subjekt durchgeführt wird.
Ein FHIT-Polynucleotid kann bei der Behandlung von verschiedenen Krankheitszuständen, die mit Abnormitäten des Chromosoms 3p14.2 verbunden sind, wie z.B. Krebsarten und/oder verminderte Expression der/des Wildtyp FHIT-RNA oder -Proteins. Durch Einführung der FHIT-Gensequenzen in Zellen kann Gentherapie verwendet werden, um Zustände zu behandeln, die mit der minder-Expression von funktionaler(m) FHIT-RNA oder -Protein verbunden sind. Dementsprechend findet die vorliegende Erfindung Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Krankheitszustands, der mit einer Chromosom 3p14.2 Abnormität in einem Säugetier, das unter einem Krankheitszustand leidet, der mit einer Chromosom 3p14.2 Abnormität verbunden ist, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Nucleinsäure, die für ein funktionales Fhit-Protein codiert, an ein Säugetier, das unter einem Krankheitszustand leidet, der mit einer Chromosom 3p14.2 Abnormität verbunden ist. Die Nucleinsäure stellt das von ihr codierte Protein her, das durch Förderung der Fhit-Funktion eine therapeutische Wirkung vermittelt, wodurch, z.B., das Auftreten oder die Progression eines Tumors oder von Krebs gehemmt wird.
Irgendeines der im Fachgebiet verfügbaren Gentherapie-Verfahren kann verwendet werden. Beispielhafte Verfahren sind unten beschrieben.
Für allgemeine Übersichten über Gentherapieverfahren, siehe Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu und Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; und Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215). Im Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren mit rekombinanter DNA, die verwendet werden können, sind beschrieben in Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; und Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY.
Das Therapeutikum kann eine FHIT-Nucleinsäure sein, die Teil eines Expressionsvektors ist, der ein Fhit-Protein oder Fragment oder chimäres Protein derselben in einem geeigneten Wirt exprimiert. Insbesondere hat eine derartige Nucleinsäure einen Promotor, der funktional mit der FHIT codierenden Region verbunden ist, wobei dieser Promotor induzierbar oder konstitutiv sein kann, und, optional, Gewebe-spezifisch. Ein Nucleinsäuremolekül, in welchem die FHIT codierenden Sequenzen und irgendwelche anderen gewünschten Sequenzen von Regionen flankiert werden, die die homologe Rekombination an einer ewünschten Stelle im Genom fördern, und somit die intrachromosomale Expression der FHIT-Nucleinsäure ermöglichen (Koller und Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438) kann verwendet werden.
Ein Patient kann die Nucleinsäure entweder direkt empfangen, wobei in diesem Fall der Patient direkt mit der Nucleinsäure oder einem Nucleinsäure-tragendem Vektor in Berührung kommt, oder indirekt, wobei in diesem Fall Zellen zuerst in vitro mit der Nucleinsäure transformiert werden und dann in den Patienten transplantiert werden. Diese zwei Herangehensweisen sind als in vivo bzw. ex vivo Gentherapie bekannt.
Die Nucleinsäure kann direkt in vivo verabreicht werden, wo sie exprimiert wird, um das codierte Produkt herzustellen. Dies kann erreicht werden durch irgendeines von zahlreichen im Fachgebiet bekannten Verfahren, z.B. indem es als Teil eines geeigneten Nucleinsäure-Expressionsvektors konstruiert wird und so verabreicht wird, dass es intrazellulär wird, z.B. durch Infektion unter Verwendung eines defekten oder abgeschwächten retroviralen Vektors oder einem anderem viralen Vektor (siehe U.S. Pat.-Nr. 4,980,286), oder durch direkte Injektion von nackter DNA, oder durch Verwendung einer Bombadierung mit Mikropartikeln (microparticle bombardment) (z.B., eine Genpistole (gene gun); Biolistic, Dupont), oder Beschichtung mit Lipiden oder Zelloberflächenrezeptoren oder Transfektionsmitteln, Einschluss in Liposomen, Mikropartikeln oder Mikrokapseln, oder durch seine Verabreichung in Verbindung mit einem Peptid, das bekannt ist, in den Kern einzudringen, durch Verabreichung in Verbindung mit einem Liganden, der der Rezeptor-vermittelten Endozytose unterworfen ist (siehe z.B., Wu und Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432) (der verwendet werden kann, um auf Zelltypen zu zielen, die spezifisch die Rezeptoren exprimieren), usw. Ein Nucleinsäure-Ligand-Komplex kann gebildet werden, in welchem der Ligand ein fusogenes virales Peptid umfasst, um Endosomen zu stören, wodurch die Nucleinsäure den lysosomalen Abbau vermeiden kann. Die Nucleinsäure kann in vivo als Ziel für eine zellspezifische Aufnahme und Expression verwendet werden, indem auf einen spezifischen Rezeptor gezielt wird (siehe, z.B., PCT Veröffentlichungen WO 92/06180 datierend vom 16. Apr. 1992 (Wu et al.); WO 92/22635 datierend vom 23. Dez. 1992 (Wilson et al.); WO92/20316 datierend vom 26. Nov. 1992 (Findeis et al.); WO93/14188 datierend vom 22. Jul. 1993 (Clarke et al.), WO 93/20221 datierend vom 14. Okt. 1993 (Young)). Alternativ kann die Nucleinsäure intrazellulär eingeführt werden und durch homolge Rekombination innerhalb der Wirtszell-DNA für die Expression integriert werden (Koller und Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438).
Ein viraler Vektor, der die FHIT-Nucleinsäure enthält, kann verwendet werden. Zum Beispiel kann ein retroviraler Vektor verwendet werden (siehe Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599). Diese retroviralen Vektoren sind modifiziert worden, um die retroviralen Sequenzen zu zerstören, die nicht notwendig sind zum Verpacken des viralen Genoms und für die Integration in Wirtszell- DNA. Die FHIT-Nucleinsäure, die bei der Gentherapie verwendet werden soll, wird in den Vektor kloniert, wodurch die Einbringung des Gens in einen Patienten erleichtert wird. Mehr Details über retrovirale Vektoren können gefunden werden in Boesen et al., 1994, Biotherapy 6:291-302, der die Verwendung eines retroviralen Vektors zur Einbringung des mdr1-Gens in hämatopoietische Stammzellen beschreibt, um die Stammzellen resistenter gegen Chemotherapie zu machen. Andere Literaturstellen, die die Verwendung von retroviralen Vektoren bei der Gentherapie illustrieren, sind: Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Kiem et al., 1994, Blood 83:1467-1473; Salmons und Gunzberg, 1993, Human Gentherapie 4:129-141; und Grossman und Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics und Devel. 3:110-114.
Adenoviren sind andere virale Vektoren, die bei der Gentherapie verwendet werden können. Adenoviren sind besonders attraktive Vehikel für die Einbringung von Genen in Atemwegsepithele. Adenoviren infizieren von Natur aus Atemwegsepithele, wobei sie milde Erkrankungen hervorrufen. Andere Ziele für Adenovirus-basierte Einbringungssysteme sind Leber, das Zentrale Nervensystem, Endothelzellen, und Muskel. Adenoviren haben den Vorteil, dass sie fähig sind, nicht-teilende Zellen zu infizieren. Kozarsky und Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics und Development 3:499-503 präsentieren eine Übersicht über Gentherapie auf Basis von Adenovirus. Bout et al., 1994, Human Gene Therapie 5:3-10 demonstrierten die Verwendung von Adenovirus-Vektoren, um Gene auf die Atemwegsepithele von Rhesus-Affen zu übertragen. Andere Beispiele für die Verwendung von Adenoviren bei der Gentherapie können gefunden werden in Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155; und Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234.
Adeno-assoziierter Virus (AAV) ist auch zur Verwendung bei der Gentherapie vorgeschlagen worden (Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300. Herpesviren können auch verwendet werden.
Ein weiterer Ansatz für die Gentherapie benutzt die Übertragung eines Gens auf Zellen in Gewebekultur durch derartige Verfahren wie Elektroporation, Lipofektion, Calciumphosphat-vermittelte Transfektion, oder virale Infektion. Gewöhnlich beinhaltet das Übertragungsverfahren die Übertragung eines selektionierbaren Markers auf die Zellen. Die Zellen werden dann einer Selektion unterworfen, um jene Zellen zu isolieren, die das übertragene Gen aufgenommen haben und es exprimieren. Jene Zellen werden dann in einen Patienten eingebracht.
Die Nucleinsäure kann vor der in vivo Verabreichung der resultierenden rekombinanten Zelle in eine Zelle eingeführt werden,. Eine derartige Einführung kann durch irgendein im Fachgebiet bekanntes Verfahren ausgeführt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Infektion mit einem viralen oder Bakteriophagen-Vektor, enthaltend die Nucleinsäuresequenzen, Zellfusion, Chromosomen-vermittelten Gentransfer, Mikrozell-vermittelten Gentransfer, Sphäroblastenfusion, usw. Zahlreiche Verfahren zur Einführung von fremden Genen in Zellen sind im Fachgebiet bekannt (siehe z.B., Loeffler und Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618; Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29:69-92) und können gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, dass die notwendigen Entwicklungs- und physiologischen Funktionen der Empfängerzellen nicht zerstört sind. Die Verfahren sollten die stabile Übertragung der Nucleinsäure auf die Zelle ermöglichen, so dass die Nucleinsäure von der Zelle exprimiert werden kann und vorzugsweise von den Zellnachkommen geerbt und exprimiert werden kann.
Die resultierenden rekombinanten Zellen können durch zahlreiche im Fachgebiet bekannte Verfahren in einen Patienten eingeführt werden. Epitheliale Zellen können injiziert werden, z.B. subkutan. Rekombinante Hautzellen können als Hauttransplantat bei dem Patienten Anwendung finden. Rekombinante Blutzellen (z.B. hämatopoietische Stamm- oder Vorläuferzellen) werden vorzugsweise intravenös verabreicht. Die Menge der zur Verwendung vorgesehenen Zellen hängt ab von der gewünschten Wirkung, Patientenzustand, usw. und kann von einem Fachmann bestimmt werden.
Zellen, in die eine Nucleinsäure für gentherapeutische Zwecke eingeführt werden kann, umfassen jeden gewünschten, verfügbaren Zelltyp und beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, epitheliale Zellen, endotheliale Zellen, Keratinozyten, Fibroblasten, Muskelzellen, Hepatozyten; Blutzellen, wie z.B. T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen, Neutrophile, Eosinophile, Megakaryozyten, Granulozyten; verschiedene Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere hämatopoietische Stamm- oder Vorläuferzellen, z.B., wie erhalten aus dem Knochenmark, Nabelschnurblut, peripherem Blut, fetaler Leber, usw.
Die zur Gentherapie verwendete Zelle kann autolog für den Patienten sein.
Wenn rekombinante Zellen bei der Gentherapie verwendet werden, wird eine FHIT-Nucleinsäure so in die Zellen eingeführt, dass sie von den Zellen oder deren Nachkommen exprimiert werden kann, und die rekombinanten Zellen werden dann in vivo für die therapeutische Wirkung verabreicht. Stamm- oder Vorläuferzellen können verwendet werden. Beliebige Stamm- und/oder Vorläuferzellen, die isoliert und in vitro erhalten werden können, können gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung potentiell verwendet werden. Derartige Stammzellen beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, hämatopietische Stammzellen (HSC), Stammzellen von epithelialen Geweben, wie z.B. der Haut und der Darmschleimhaut, embryonalen Herzmuskelzellen, Leberstammzellen (PCT Veröffentlichung WO 94/08598, datierend vom 28. Apr. 1994), und neuralen Stammzellen (Stemple und Anderson, 1992, Cell 71:973-985).
Epitheliale Stammzellen (ESCs) oder Keratinozyten können durch bekannte Verfahren erhalten werden aus Geweben, wie z.B. der Haut und der Darmschleimhaut (Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229). In epithelialem Schichtgewebe (stratified epithelial tissue), wie z.B. der Haut, erfolgt die Erneuerung innerhalb der germinalen Schicht, der zur Basalmembran nähesten Schicht, durch Mitose von Stammzellen. Stammzellen innerhalb der Darmschleimhaut ermöglichen eine schnelle Erneuerung dieses Gewebes. ESCs oder Keratinozyten, erhalten aus der Haut oder Darmschleimhaut eines Patienten oder Spenders, können in Zellkultur gezüchtet werden (Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229; Pittelkow und Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771). Falls die ESCs von einem Spender bereitgestellt werden, kann auch ein Verfahren zur Unterdrückung der Transplantatabstoßung durch den Wirt (host versus graft reactivity) (z.B. Bestrahlung, Verabreichung von Arzneimittel oder Antikörper zur Förderung gemäßigter Immunsuppression) verwendet werden.
Betreffend die hämatopoietischen Stammzellen (HSC), kann in dieser Ausführungsform der Erfindung ein beliebiges Verfahren, das die Isolierung, Vermehrung und den Erhalt von HSC in vitro ermöglicht, verwendet werden. Verfahren, mit denen dies erreicht werden kann, beinhalten: (a) die Isolierung und Etablierung von HSC-Kulturen aus Knochenmarkzellen, isoliert aus dem zukünftigen Wirt oder einem Spender, oder (b) die Verwendung von bereits früher etablierten Langzeit HSC-Kulturen, die allogen oder xenogen sein können. Nicht-autologe HSC werden vorzugsweise in Verbindung mit einem Verfahren zur Unterdrückung der durch Transplantation ausgelösten Immunreaktionen (transplantation immune reactions) des zukünftigen Wirts/Patienten verwendet. Humane Knochenmarkzellen können aus dem hinterem Beckenkamm (posterior iliac crest) durch Nadel-aspiration (needle aspiration) erhalten werden (siehe, z.B., Kodo et al., 1984, J. Clin. Invest. 73:1377-1384). Die HSCs können hochangereichert oder in nahezu reiner Form hergestellt werden. Diese Anreicherung kann vor, während oder nach der Langzeit-Kultivierung erreicht werden, und kann durch ein beliebiges im Fachgebiet bekanntes Verfahren durchgeführt werden. Langzeit-Kulturen von Knochenmarkzellen können etabliert und erhalten werden, indem, zum Beispiel, modifizierte Dexter-Zellkulturverfahren (Dexter et al., 1977, J. Cell Physiol. 91:335) oder Witlock-Witte Kulturverfahren (Witlock und Witte, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3608-3612) verwendet werden.
Die für gentherapeutische Zwecke einzuführende Nucleinsäure kann einen induzierbaren Promotor umfassen, der so funktional mit der codierenden Region verbunden ist, dass die Expression der Nucleinsäure steuerbar ist, indem das Vorhandensein oder die Abwesenheit des geeigneten Transcriptionsaktivators (inducer of transcription) gesteuert wird.
Weitere Verfahren, die angepasst werden können, um sie zur Einführung einer Nucleinsäure, die für ein Fhit-Protein oder ein funktionales Derivat desselben codiert, zu verwenden, sind in Abschnitt 5.8.5. beschrieben.
5.8.5. BEKÄMPFUNG DOMINANT-NEGATIVER FHIT-MUTATIONEN ZUR BEHANDLUNG VON ODER VORBEUGUNG VOR STÖRUNGEN MIT ÜBERPROLIFERATION
Die Erfindung findet auch Verwendung bei Verfahren zur Behandlung von oder Vorbeugung vor Störungen mit Überproliferation (disorders of overproliferation) (z.B. Krebs, hyperproliferative Störungen), in welchen der Patient eine hemizygote FHIT-Mutation aufweist (vermutlich eine dominant-negative FHIT-Mutation), indem die Mutante des FHIT-Gens oder -Proteins (und nicht Wildtyp FHIT oder Fhit) spezifisch bekämpft wird (Verabreichung eines Antagonisten an [die Mutante]). Hemizygotie für eine FHIT-Mutation kann durch die Beobachtung des Vorhandenseins von sowohl normaler als auch Mutanten FHIT-DNA (z.B. cDNA) oder -RNA in einer Probe aus einem Patienten nachgewiesen werden, z.B., durch Verfahren wie sie hier in Abschnitten 5.11. und 6 beschrieben sind.
Zum Beispiel wird eine wirksame Menge eines Antisense-Oligonucleotids, das die Expression der Mutante des FHIT-Gens hemmt, und nicht das Wildtyp FHIT-Gen, verbabreicht. Falls die hemizygote FHIT-Mutation in dem Patienten eine Deletion von mindestens einem Teil von einem oder mehr FHIT-Exons ist, kann das Antisense-Oligonucleotid eine hybridisierbare Sequenz umfassen, die komplementär zu dem Zusammenschluss ist, der durch die Deletion gebildet wird, wobei dieser Zusammenschluss in der Mutante des FHIT-Gens aber nicht dem Wildtyp FHIT-Gen vorhanden ist. Somit umfasst das Antisense-Oligonucleotid eine Sequenz, die komplementär zu aufeinander folgenden Sequenzen von zwei Exons ist, die von Natur aus in Wildtyp FHIT-cDNA nicht aufeinander folgend auftreten.
Ein Antikörper kann therapeutisch oder prophylaktisch verwendet werden, um die hemizygote Mutante des Fhit-Proteins spezifisch zu bekämpfen. Zum Beispiel kann ein derartiger Antikörper ein Epitop in einer Fhit-Deletionsmutante, gebildet durch die Fusion von Sequenzen, die von Natur aus in Wildtyp Fhit-Protein nicht aufeinander folgen, spezifisch erkennen. Für therapeutische Zwecke kann eine Mutante eines Fhit-Proteins als Immunogen verwendet werden, um Anti-Fhit Antikörper herzustellen, die die Aktivität der Mutante des Fhit-Proteins und nicht des Wildtyp Fhit-Proteins neutralisieren. Dementsprechend findet die vorliegende Erfindung Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines Krankheitszustands, der mit einer FHIT-Abnormität in einem Säugetier, das unter diesem Krankheitszustand, der mit einer FHIT-Abnormität verbunden ist, leidet, verbunden ist, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Anti-Fhit Antikörpers, spezifisch für das abnorme FHIT-Gen oder -Protein, an ein Säugetier, das unter einem Krankheitszustand leidet, der mit einer FHIT-Abnormität verbunden ist.
Eine rekombinante Nucleinsäure, bestehend aus nicht-FHIT Sequenzen, so flankiert von FHIT-Sequenzen, dass sie die spezifische homologe Rekombination mit einer Mutante eines FHIT-Gens in einem Patienten fördert, kann in den Patienten eingeführt werden, um die Mutante "auszuknocken" (die Wirkung [der Mutante] zu hemmen), besonders, wenn von einer derartigen Mutante angenommen wird, eine dominant-negative zu sein.
Antisense-Oligonucleotide sind unten detaillierter beschrieben.
5.8.5.1. ANTISENSE-REGULIERUNG DER GENEXPRESSION VON MUTANTEN FHIT
Die Funktion einer Mutante von Fhit oder FHIT kann spezifisch gehemmt werden durch Verwendung von FHIT Antisense-Nucleinsäuren. Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäuren aus wenigstens sechs Nucleotiden bereit, die "antisense" zu einem Gen oder cDNA sind, die für eine Mutante von Fhit codieren. Eine FHIT "Antisense"-Nucleinsäure wie sie hierin verwendet wird, bezeichnet eine Nucleinsäure, die aufgrund einer gewissen Sequenz-Komplementarität (anders als zu nicht-unspezifischen Sequenzen, wie z.B. einen polyA Schwanz) fähig ist, an einen Teil einer FHIT-RNA (vorzugsweise mRNA) oder einer Mutantenform derselben zu hybridisieren. Die Antisense-Nucleinsäure kann komplementär zu einem codierenden und/oder nicht codierenden Bereich einer FHIT-mRNA sein. Derartige Antisense-Nucleinsäuren finden Anwendung als Therapeutika, die die Fhit-Funktion einer dominant-negativen Mutante hemmen, und können bei der Behandlung von oder Vorbeugung vor Störungen, wie oben in Abschnitt 5.8. und dessen Unterabschnitten beschrieben, verwendet werden.
Die Antisense-Nucleinsäuren der Erfindung können Oligonucleotide sein, die doppelsträngig oder einzelsträngig sind, RNA oder DNA oder eine Modifikation oder ein Derivat derselben, die direkt an eine Zelle verabreicht werden können, oder die intrazellulär durch Transcription von exogenen, eingeführten Sequenzen hergestellt werden können.
Die Erfindung stellt ferner pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die eine wirksame Menge der FHIT Antisense-Nucleinsäuren der Erfindung in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen, wie in Abschnitt 5.10. beschrieben.
Die Erfindung findet Verwendung in Verfahren zur Hemmung der Expression, die spezifisch für eine Mutante einer FHIT-Nucleinsäuresequenz in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle ist, umfassend die Bereitstellung einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, umfassend eine FHIT Antisense-Nucleinsäure der Erfindung, für die Zelle.
Die FHIT Antisense-Nucleinsäuren bestehen aus wenigstens sechs Nucleotiden und sind vorzugsweise Oligonucleotide (im Bereich von 6 bis etwa 50 Oligonucleotiden). In spezifischen Ausführungen hat das Oligonucleotid wenigstens 10 Nucleotide, wenigstens 15 Nucleotide, wenigstens 100 Nucleotide, oder wenigstes 200 Nucleotide. Die Oligonucleotide können DNA oder RNA oder chimäre Mischungen oder Derivate oder modifizierte Versionen derselben sein, einzelsträngig oder doppelsträngig. Das Oligonucleotid kann an der Baseneinheit, Zuckereinheit oder dem Phosphatrückgrat modifiziert werden. Das Oligonucleotid kann andere hinzugefügte Gruppen beinhalten, wie z.B. Peptide, oder Mittel, die den Transport durch die Zellmembran (siehe, z.B., Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; PCT Veröffentlichungs-Nr. WO 88/09810, veröffentlicht am 15. Dez. 1988) oder die Blut-Hirn-Schranke (siehe, z.B., PCT Veröffentlichungs-Nr. WO 89/10134, veröffentlicht am 25. Apr. 1988) erleichtern, Mittel, die Spaltung durch Hybridisierung auslösen (hybridizationtriggered cleavage agents) (siehe, z.B., Krol et al., 1988, BioTechniques 6:958-976) oder Interkalationsmittel (siehe, z.B., Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549).
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wird ein FHIT Antisense-Oligonucleotid bereitgestellt, vorzugsweise einzelsträngige DNA. In einer äußerst bevorzugten Ausführung umfasst ein derartiges Oligonucleotid eine Sequenz, "antisense" zu einem Zusammenschluss von zwei normalerweise nicht aufeinander folgenden Sequenzen in einer Deletionsmutante eines FHIT-Gens, am stärksten bevorzugt eine Mutante eines humanen FHIT-Gens. Das Oligonucleotid kann an einer beliebigen Stelle auf seiner Struktur mit generell im Fachgebiet bekannten Substituenten modifiziert sein.
Das FHIT Antisense-Oligonucleotid kann wenigstens eine modifizierte Baseneinheit umfassen, die ausgewählt wird aus der Gruppe, beinhaltend, aber nicht beschränkt auf, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, β-D-Galactosylqueuosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, β-D-Mannosylqueuosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure(v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queuosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyl uracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure(v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w, und 2,6-Diaminopurin.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Oligonucleotid wenigstens eine modifizierte Zuckereinheit, ausgewählt aus der Gruppe, beinhaltend, aber nicht beschränkt auf, Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose.
In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst das Oligonucleotid wenigstens ein modifiziertes Phosphatrückgrat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Phosphorthioat, Phosphordithioat, Phosphoramidothioat, Phosphoramidat, Phosphordiamidat, Methylphosphonat, Alkylphosphotriester und Formacetal oder einem Analogon derselben.
In noch einer weiteren Ausführungsform ist das Oligonucleotid ein α-anomeres Oligonucleotid. Ein α-anomeres Oligonucleotid bildet spezifisch doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in der, im Gegensatz zu den gewöhnlichen β-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641).
Das Oligonucleotid kann mit einem weiteren Molekül konjugiert sein, z.B., einem Peptid, einem Mittel, das Vernetzung durch Hybridisierung auslöst (hybridization triggered cross-linking agent), einem Transportmittel, einem Mittel, das Spaltung durch Hybridisierung auslöst (hybridization-triggered cleavage agent), usw.
Oligonucleotide der Erfindung können durch im Fachgebiet bekannte Standardverfahren synthetisiert werden, z.B. durch Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesizers (wie sie z.B. kommerziell erhältlich sind von Biosearch, Applied Biosystems, usw.). Diese beinhalten im Fachgebiet bekannte Verfahren zur chemischen Synthese von Oligodesoxyribonucleotiden, wie z.B. chemische Festphasensynthese mit Phosphoramidit. Als Beispiele: Phosphorthioat-Oligonucleotide können durch das Verfahren von Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16:3209) synthetisiert werden, Methylphosphonat-Oligonucleotide können hergestellt werden durch Verwendung von gekörnten porösen Glas- Polymerträgern (controlled pore glass polymer supports) (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451), usw. Alternativ können RNA-Moleküle erzeugt werden durch in vitro und in vivo Transcription von DNA-Sequenzen, die für die Antisense-RNA Moleküle codieren. Derartige DNA-Sequenzen können eingebaut werden in eine große Vielzahl von Vektoren, die geeignete RNA Polymerase-Promotoren, wie z.B. den T7 oder SP6 Polymerase-Promotor, einschließen. Alternativ können Antisense-cDNA-Konstrukte, die Antisense-RNA konstitutiv oder induzierbar synthetisieren, abhängig von dem verwendeten Promotor, stabil in Zellinien eingeführt werden.
In einer spezifischen Ausführungsform umfasst das FHIT Antisense-Oligonucleotid katalytische RNA, oder ein Ribozym (siehe, z.B., PCT Internationale Veröffentlichung WO 90/11364, veröffentlicht am 4. Okt. 1990; Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225). Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die fähig sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Der Wirkmechanismus eines Ribozyms umfasst die sequenzspezifische Hybridisierung des Ribozym-Moleküls an komplementäre Ziel-RNA, gefolgt von einer endonucleolytischen Spaltung. Im Rahmen der Erfindung umfasst sind entwickelte Ribozym-Moleküle mit Hammerkopf-Motiv (hammerhead motif ribozyme molecules), die spezifisch und effizient die endonucleolytische Spaltung von Mutanten FHIT RNA-Sequenzen katalysieren.
Spezifische Ribozym-Spaltstellen innerhalb irgendeines potentiellen RNA-Ziels werden anfänglich indentifiziert durch Absuchen des Zielmoleküls nach Ribozym-Spaltstellen, die die folgenden Sequenzen beinhalten: GUA, GUU und GUC. Sobald sie identifiziert sind, können kurze RNA-Sequenzen aus 15 bis 20 Ribonucleotiden, die dem Bereich des Zielgens, der die Spaltstelle enthält, entsprechen, bewertet nach vorausgesagten strukturellen Eigenschaften, wie z.B. eine Sekundärstruktur, die die Oligonucleotidsequenz ungeeignet machen kann, bewertet werden. Die Eignung der Zielkandidaten kann auch durch das Testen ihrer Zugänglichkeit für die Hybridisierung mit komplementären Oligonucleotiden bewertet werden, indem der Schutz gegen Ribonuclease getestet wird.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Oligonucleotid ein 2'-O-Methylribonucleotid (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148), oder ein chimäres RNA-DNA Analogon (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330).
In einer alternativen Ausführungsform wird die FHIT Antisense-Nucleinsäure der Erfindung intrazellulär durch Transcription einer exogenen Sequenz hergestellt. Zum Beispiel kann ein Vektor in vivo so eingeführt werden, dass er von einer Zelle aufgenommen wird, wobei der Vektor oder ein Teil desselben innerhalb der Zelle Transcribiert wird, wodurch eine Antisense-Nucleinsäure (RNA) der Erfindung hergestellt wird. Ein derartiger Vektor würde eine Sequenz enthalten, die für die FHIT Antisense-Nucleinsäure codiert. Ein derartiger Vektor kann episomal vorliegen oder chromosomal integriert werden, solange er transcribiert werden kann, um die gewünschte Antisense-RNA herzustellen. Derartige Vektoren können mittels rekombinanter DNA-Technologie, Standardverfahren im Fachgebiet, konstruiert werden. Vektoren können sein, Plasmide, Viren oder andere im Fachgebiet bekannte, die für die Replikation und Expression in Säugetierzellen verwendet werden. Die Expression der Sequenz, die für die FHIT Antisense-RNA codiert, kann durch irgendeinen im Fachgebiet bekannten Promotor erfolgen, der in Säugetierzellen, vorzugsweise humanen, funktioniert. Derartige Promotoren können induzierbar oder konstitutiv sein. Derartige Promotoren beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf: die SV40 frühe Promotorregion (SV40 early promoter region) (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290:304-310), den Promotor, der in dem langen 3'-terminalen Repeat des Rous-Sarkom-Virus enthalten ist (Yamamoto et al., 1980, Zelle 22:787-797), den Herpes Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothioningens (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42), usw.
Die Antisense-Nucleinsäuren der Erfindung umfassen eine Sequenz, die komplementär zu wenigstens einem Teil eines RNA-Transcripts eines FHIT-Gens ist, vorzugsweise einer Mutante eines humanen FHIT-Gens. Absolute Komplementarität, obwohl bevorzugt, wird jedoch nicht benötigt. Eine Sequenz, die "wenigstens zu einem Teil einer RNA komplementär ist", wie sie hierin erwähnt wird, bedeutet eine Sequenz mit ausreichender Komplementarität, um in der Lage zu sein, mit der RNA zu hybridisieren und einen stabilen Duplex zu bilden; in dem Fall von doppelsträngigen FHIT Antisense-Nucleinsäuren, kann ein Einzelstrang der Duplex-DNA so getestet werden, oder ein Test auf Triplexbildung kann gemacht werden. Die Hybridisierungsfähigkeit wird sowohl von dem Grad der Komplementarität als auch von der Länge der Antisense-Nucleinsäure abhängen. Allgemein, je länger die hybridisierende Nucleinsäure ist, desto mehr Basenfehlpaarungen mit einer FHIT-RNA kann sie enthalten und immer noch ein stabiles Duplex bilden (oder Triplex, wie es der Fall sein kann). Ein Fachmann kann ein tolerierbares Maß an Fehlpaarung durch Verwendung von Standardverfahren zur Bestimmung des Schmelzpunkts des Hybridisierungskomplexes feststellen.
Die FHIT Antisense-Nucleinsäuren können verwendet werden, um Malignitäten oder hyperproliferative Störungen eines Zelltyps zu behandeln (oder diesen vorzubeugen), für den gezeigt wurde, dass er mutante FHIT-RNA exprimiert. Maligne, neoplastische, und prä-neoplastische Zellen, die auf eine derartige Expression getestet werden können, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, jene, die in Abschnitt 5.8. oben beschrieben sind. Ein einzelsträngiges Antisense-Oligonucleotid für FHIT-DNA (DNA antisense FHIT oligonucleotide) kann verwendet werden.
Maligne (besonders Tumor) Zelltypen, die FHIT-RNA exprimieren, können durch verschiedene im Fachgebiet bekannte Verfahren identifiziert werden. Derartige Verfahren beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Hybridisierung mit einer FHIT-spezifischen Nucleinsäure (z.B. durch Northern-Hybridisierung, Dot-Blot Hybridisierung, in situ Hybridisierung), Beobachten der Fähigkeit der RNA des Zelltyps, in vitro in ein Fhit-Protein translatiert zu werden, usw. (siehe die zur Diagnose beschriebenen Assays in Abschnitt 5.11.). In einer bevorzugten Ausführung kann vor der Behandlung ein Test mit primärem Tumorgewebe, das aus einem Patienten stammt, auf die Expression von FHIT gemacht werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung, umfassend eine wirksame Menge von einer FHIT Antisense-Nucleinsäure in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, können einem Patienten mit einer Malignität, die von einer Art ist, die eine Mutante einer FHIT-RNA exprimiert, die von der Antisense-Nucleinsäure spezifisch bekämpft wird, verabreicht werden.
Die Menge einer FHIT Antisense-Nucleinsäure, die für die Behandlung eines bestimmten Krankheitszustands wirksam sein wird, wird von der Natur des Krankheitszustands oder der Beschwerden abhängen, und kann durch klinische Standardverfahen bestimmt werden. Wo es möglich ist, ist es wünschenswert, die Antisense-Cytotoxizität des zu behandelnden Tumortyps in vitro zu bestimmen, und dann in nützlichen Tiermodellen, bevor es bei Menschen getestet und verwendet wird.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend FHIT Antisense-Nucleinsäuren, können verabreicht werden mittels Liposomen, Mikropartikeln, oder Mikrokapseln. Es kann nützlich sein, derartige Zusammensetzungen zu verwenden, um die verzögerte Abgabe der FHIT Antisense-Nucleinsäuren zu erreichen. Es kann erwünscht sein, Liposomen einzusetzen, die mittels Antikörpern auf spezifisch identifizierbare Tumorantigene abzielen (Leonetti et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2448-2451; Renneisen et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:16337-16342).
Antisense FHIT-Oligonucleotide oder Anti-Fhit Antikörper, die spezifisch eine in einem Patienten vorhandene Mutante eines FHIT-Gens oder -Proteins bekämpfen, können dem Patienten verabreicht werden zusammen mit einer Verabreichung einer FHIT-Gentherapie (Verabreichung einer Wildtyp Fhit-Funktion) oder funktionalem Fhit-Protein oder Agonisten an den Patienten.
5.9. DEMONSTRATION DER THERAPEUTISCHEN ODER PROPHYLAKTISCHEN NÜTZLICHKEIT
Die FHIT-Polynucleotide, Fhit-Proteinprodukte, Derviate und Analoga derselben, und Antikörper hierfür, und Antisense-Nucleinsäuren der Erfindung können in vivo auf die gewünschte therapeutische oder prophylaktische Aktivität getestet werden. Zum Beispiel können derartige Verbindungen, bevor sie bei Menschen getestet werden, in geeigneten Tiermodellsystemen getestet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Ratten, Mäuse, Hühner, Kühe, Affen, Kaninchen, usw. Für das in vivo Testen vor der Verabreichung an Menschen kann ein beliebiges im Fachgebiet bekanntes Tiermodellsystem verwendet werden.
5.10. THERAPEUTISCHE/PROPHYLAKTISCHE VERFAHREN UND ZUSAMMENSETZUNGEN
Die Erfindung findet Verwendung bei Verfahren zur Behandlung und Prophylaxe durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines Therapeutikums, d.h. ein(e) erfindungsgemäße(s) FHIT-Nucleinsäure, Fhit-Protein, Derivat oder Analogon derselben, oder ein Antikörper hierfür, an ein Subjekt. In einer bevorzugten Ausführung ist das Therapeutikum im Wesentlichen gereinigt. Das Subjekt ist vorzugsweise ein Tier, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Tiere, wie z.B. Kühe, Schweine, Hühner, usw., und ist vorzugsweise ein Säugetier, und am stärksten bevorzugt ein Mensch. Das Subjekt kann ein Fötus, Kind oder Erwachsener sein.
Ein nicht-menschliches Säugetier kann das Subjekt sein.
Formulierungen und Verfahren zur Verabreichung, die eingesetzt werden können, wenn das Therapeutikum eine Nucleinsäure umfasst, sind in den Abschnitten 5.8.4 und 5.8.5.1 oben beschrieben; weitere geeignete Formulierungen und Verabreichungswege können aus den hierin nachfolgend beschriebenen ausgewählt werden.
Verschiedene Einbringungssysteme sind bekannt und können verwendet werden, um ein Therapeutikum der Erfindung zu verabreichen, z.B. Einschluss in Liposomen, Mikropartikeln, Mikrokapseln, Expression durch rekombinante Zellen, Rezeptorvermittelte Endocytose (siehe z.B. Wu und Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), Konstruktion einer therapeutischen Nucleinsäure als Teil eines retroviralen oder anderen Vektors, usw. Verfahren zur Einführung beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, intradermale, intramuskuläre, intraperitonale, intravenöse, subkutane, intranasale und orale Wege. Die Verbindungen können auf irgendeinem passenden Weg verabreicht werden, z.B. durch Infusion oder Bolus-Injektion, durch Resorption durch epitheliale oder mukokutane Schleimhäute (z.B. Mundschleimhaut, rektale und intestinale Schleimhaut, usw.) und kann zusammen mit anderen biologisch aktiven Mitteln verabreicht werden. Die Verabreichung kann systemisch oder lokal erfolgen. Darüber hinaus kann es erwünscht sein, die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung auf irgendeinem geeigneten Weg in das zentrale Nervensystem einzuführen, einschließlich intraventrikulärer und intrathekaler Injektion; intraventrikuläre Injektion kann erleichtert werden durch einen intraventrikulären Katheter, z.B., angebracht an ein Reservoir, wie z.B. ein Ommaya-Reservoir.
Es kann erwünscht sein, die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung lokal in dem Bereich, der Behandlung benötigt, zu verabreichen; dies kann erreicht werden durch, zum Beispiel, und nicht als Beschränkung, lokale Infusion während einer Operation, topische Anwendung, z.B. in Verbindung mit einem Wundverband nach einer Operation, durch Injektion, mittels eines Katheters, mittels eines Zäpfchens oder mittels eines Implantats, wobei dieses Implantat aus einem porösen, nicht-porösen oder gelatinösen Material, einschließlich Membranen, wie z.B. Membranen aus Polydimethylsiloxan (Sialastik), oder Fasern. Die Verabreichung kann durch direkte Injektion an der Stelle (oder ehemaligen Stelle) eines malignen Tumors oder neoplastischen oder prä-neoplastischen Gewebes erfolgen.
Wenn das Therapeutikum eine Nucleinsäure ist, die für ein therapeutisches Protein codiert, kann die Nucleinsäure in vivo verabreicht werden, um die Expression des von ihr codierten Proteins zu fördern, indem sie als ein Teil eines geeigneten Nucleinsäureexpressionsvektors konstruiert wird und so verabreicht wird, dass sie intrazellulär wird, z.B. durch Verwendung eines retroviralen Vektors (siehe US Patent-Nr. 4,980,286), oder durch direkte Injektion, oder durch Verwendung einer Bombardierung mit Mikropartikeln (z.B. einer Genpistole; Biolistic, Dupont), oder Beschichtung mit Lipiden oder von Zelloberflächenrezeptoren oder Transfektionsmitteln, oder durch seine Verabreichung in Verbindung mit einem Homeobox-artigen (homeobox-like) Peptid, das bekannt ist, in den Kern einzudringen (siehe z.B. Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), usw. Alternativ kann ein Nucleinsäure-Therapeutikum intrazellulär eingeführt werden und für die Expression in die Wirtszell-DNA durch homologe Rekombination integriert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit. Derartige Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge eines Therapeutikums und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Hilfsstoff. Ein derartiger Träger beinhaltet, ist aber nicht beschränkt auf, Salzlösung (saline), gepufferte Salzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerol, Ethanol und Kombinationen derselben. Der Träger und die Zusammensetzung können steril sein. Die Formulierung sollte zur Verabreichungsart passen.
Die Zusammensetzung kann, falls gewünscht, auch geringe Mengen an Netzmitteln oder Emulgatoren oder pH-Puffermitteln enthalten. Die Zusammensetzung kann eine flüssige Lösung, Suspension, Emulsion, Tablette, Pille, Kapsel, Formulierung zur verzögerten Freisetzung oder Pulver sein. Die Zusammensetzung kann als ein Zäpfchen mit üblichen Bindemitteln und Trägern, wie z.B. Triglyceriden, formuliert sein. Eine orale Formulierung kann pharmazeutisch reine Standardträger, wie z.B. Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat, usw. enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zusammensetzung gemäß Routineverfahren als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert, die für eine intravenöse Verabreichung an einen Menschen angepasst ist. Typischerweise sind Zusammensetzungen für eine intravenöse Verabreichung Lösungen in einem sterilen isotonischen wässrigen Puffer. Wenn nötig, kann die Zusammensetzung auch ein Solubilisierungsmittel und ein Lokalanästhetikum, wie z.B. Lidocain (lignocaine) zur Milderung des Schmerzes an der Injektionsstelle enthalten. Allgemein werden die Inhaltsstoffe entweder getrennt oder zusammengemischt in Form einer Dosierungseinheit geliefert, zum Beispiel, als ein trockenes lyophilisiertes Pulver oder wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch abgedichteten Behältnis, wie z.B. einer Ampulle oder Packung, die die Menge des Wirkstoffs anzeigen. Wenn die Zusammensetzung als Infusion verabreicht werden soll, kann sie mit einer Infusionsflasche, enthaltend steriles Wasser oder Salzlösung mit einem pharmazeutischen Reinheitsgrad, abgegeben werden. Wenn die Zusammensetzung durch Injektion verabreicht wird, kann eine Ampulle mit sterilem Wasser für die Injektion oder Salzlösung bereitgestellt werden, so dass die Inhaltsstoffe vor der Verabreichung gemischt werden können.
Die Therapeutika der Erfindung können als Salze oder in neutraler Form formuliert sein. Pharmazeutisch verträgliche Salze beinhalten jene, die mit freien Amino-Gruppen gebildet werden, wie z.B. jene, die erhalten werden mit Salzsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, usw., und jenen, die mit freien Carboxyl-Gruppen gebildet werden, wie z.B. jenen, die erhalten werden mit Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Eisenhydroxiden, Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain, usw.
Die Menge an Therapeutikum der Erfindung, die bei der Behandlung einer bestimmten Störung oder eines bestimmten Zustandes wirksam sein wird, wird von der Natur der Störung oder des Zustandes abhängen, und kann durch klinische Standardverfahren bestimmt werden. Optional können darüber hinaus in vitro Tests eingesetzt werden, die helfen, die optimalen Dosierungsbereiche zu identifizieren. Die genaue Dosis, die in der Formulierung eingesetzt werden soll, wird auch abhängen von dem Verabreichungsweg und der Schwere der Krankheit oder Störung, und sollte entsprechend dem Urteil eines praktischen Arztes und den Umständen jedes Patienten bestimmt werden. Jedoch betragen allgemein geeignete Dosierungsbereiche zur intravenösen Verabreichung etwa 20-500 Mikrogramm der aktiven Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht. Geeignete Dosierungsbereiche für die intranasale Verabreichung betragen allgemein etwa 0,01 pg/kg Körpergewicht bis 1 mg/kg Körpergewicht. Wirksame Dosen können aus Dosis-Antwortkurven, die aus in vitro oder Tiermodelltestsystemen erhalten wurden, extrapoliert werden.
Zäpfchen enthalten im Allgemeinen den Wirkstoff in einem Bereich von 0,5 bis 10 Gew.-%; orale Formulierungen enthalten vorzugsweise 10% bis 95% Wirkstoff.
Die Erfindung stellt auch ein pharmazeutisches Paket oder einen Kit bereit, umfassend ein oder mehr Behältnisse, gefüllt mit einem oder mehr der Inhaltsstoffe der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung. Optional kann (einem) derartigen(m) Behälter(n) eine Mitteilung beigefügt sein, in der Form, die von einer Regierungsbehörde, die die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von Arzneimitteln oder biologischen Produkten reguliert, vorgeschrieben ist, wobei die Mitteilung die Zulassung zur Herstellung, Verwendung oder für den Verkauf zur Verabreichung an Menschen durch die Behörde wiedergibt.
5.11 DIAGNOSTISCHE VERWENDUNGEN
Ein FHIT-Polynucleotid und dazu komplementäre Nucleinsäuren, dessen Fhit-Proteinprodukt, Fragmente derselben, und Antikörper hierfür können verwendet werden für diagnostische Zwecke für Störungen, an denen die Überproliferation von Zellen beteiligt ist, sowie für andere Störungen, die mit chromosomalen Translokationen und Inversionen verbunden sind, oder molekularen Abnormitäten, die mit dem FHIT-Gen und/oder verminderter Expression von Wildtyp FHIT-RNA oder -Protein verbunden sind.
Derartige Moleküle können auch in diagnostischen Assays verwendet werden, wie z.B. Immunoassays zum Nachweis, zur Prognose, Diagnose oder Überwachung verschiedener Zustände, Krankheiten und Störungen, die mit der Expression von Transcripten von Mutanten von FHIT verbunden sind, oder zur Beobachtung der Behandlung derselben. Entsprechend wird in spezifischen Ausführungsformen Krebs oder prämaligne Veränderungen oder hyperproliferative oder benigne disproliferative Störungen in Gewebe diagnostiziert, indem das Vorhandensein von einem oder mehr Transcripten einer Mutante von FHIT, allein oder zusammen mit einer Verringerung der Expression von Wildtyp FHIT-Transcript, in Proben, die aus einem Patienten stammen, relativ zu der FHIT-Expression in einer analogen nicht-krankhaften Probe (aus dem Patienten oder einer anderen Person, wie experimentell bestimmt oder als ein Standard-Level in derartigen Proben bekannt), nachgewiesen wird. Für diagnostische Zwecke kann ein FHIT-Polynucleotid verwendet werden, um die Expression einer Mutante eines FHIT-Gens in Krankheitszuständen nachzuweisen.
Das Subjekt oder der Patient ist ein Tier, z.B. ein Säugetier, und ist vorzugsweise ein Mensch und kann ein Fötus, Kind oder ein Erwachsener sein.
Wie unten illustriert, wird die FHIT-Gensequenz mit Krebsarten in Verbindung gebracht, insbesondere in Verbindung gebracht mit Translokationen und Deletionen innerhalb des FHIT-Gens. In spezifischen Ausführungsformen können Krankheiten und Störungen, die Zell-Überproliferation mit sich bringen, diagnostiziert werden, oder ihr vermutetes Vorhandensein kann überprüft werden, oder eine Prädisposition für die Entwicklung derartiger Störungen kann nachgewiesen werden, indem ein verminderter Level an Wildtyp Fhit-Protein, Wildtyp FHIT-RNA oder funktioneller Fhit-Aktivität nachgewiesen wird, oder durch den Nachweis von Mutationen in FHIT-RNA, -DNA, -cDNA, oder -Protein (z.B. Translokation oder Deletionen in FHIT-Nucleinsäuren, Verkürzungen des FHIT-Gens oder -Proteins, Veränderungen in der Nucleotid- oder Aminosäuresequenz im Vergleich zu Wildtyp Fhit), die eine Verminderung der Expression oder Aktivität von Fhit oder eine dominant-negative Wirkung verursachen. Derartige Krankheiten und Störungen beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, jene, die in Abschnitt 5.8. und dessen Unterabschnitten beschrieben sind. Beispielsweise, Fhit-Proteinlevel können durch Immunoassay nachgewiesen werden, FHIT-RNA-Level können durch Hybridisierungsassays (z.B. Northern-Blots, Dot-Blots) oder RT-PCR nachgewiesen werden, Translokationen, Deletionen und Punktmutationen in FHIT-Nucleinsäuren können nachgewiesen werden durch Southern-Blot, RFLP-Analyse, PCR von cDNA unter Verwendung von Primern, die vorzugsweise ein Fragment erzeugen, das sich wenigstens über einen Großteil des FHIT-Gens erstreckt, Sequenzierung der genomischen DNA oder cDNA von FHIT, erhalten aus dem Patienten, usw.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Level einer FHIT-mRNA (oder cDNA) oder Fhit-Protein in einer Probe, erhalten aus einem Patienten, nachgewiesen oder gemessen oder analysiert mittels Größe und/oder Sequenz, wobei abnorme Level, Größe oder Sequenz anzeigen, dass das Subjekt eine Malignität oder hyperproliferative Störung hat, oder eine Prädisposition zur Entwicklung davon aufweist; wobei sich die verminderten Level auf die in einer analogen Probe aus einem Teil des Körpers oder aus einem Subjekt ohne Malignität oder hyperproliferative Störung vorhandenen Level beziehen, wie es der Fall sein kann.
FHIT-Gensequenzen können diagnostisch zum Nachweis von Krankheitszuständen verwendet werden, die aus chromosomalen oder molekularen Abnormitäten resultieren, z.B. Translokationen, Inversionen und Deletionen, an denen das FHIT-Gen beteiligt ist. Nucleinsäuren, umfassend FHIT -Nucleotidsequenzen von wenigstens 8 Nucleotiden, wenigstens 15 Nucleotiden, wenigstens 25 Nucleotiden, wenigstens 50 Nucleotiden, wenigstens 100 Nucleotiden, wenigstens 200 Nucleotiden, wenigstens 300 Nucleotiden, und vorzugsweise weniger als 500 Nucleotiden, und die in Abschnitt 5.1 beschrieben Nucleinsäuren können als Sonden in Hybridisierungsassays für den Nachweis und die Ermittlung von FHIT-Gensequenzen verwendet werden. Nucleinsäuren von nicht mehr als 5 Kilobasen, von nicht mehr als 10 Kilobasen, nicht mehr als 25 Kilobasen, nicht mehr als 50 Kilobasen oder nicht mehr als 70 Kilobasen, die an ein FHIT-Gen, -cDNA oder einen komplementären Strang hybridisierbar sind, können als Sonden in Hybridisierungsassays zum Nachweis und zur Ermittlung von FHIT-Nucleotidsequenzen verwendet werden. Als ein Beispiel, die FHIT DNA-Sequenz kann in Hybridisierungsassays verwendet werden, z.B. Southern- oder Northern-Analyse, einschließlich in situ Hybridisierungsassays von Patientenproben, um Abnormitäten der FHIT-Expression zu diagnostizieren. Hybridisierungsassays können verwendet werden, um Malignitäten nachzuweisen, zu prognostizieren, zu diagnostizieren, oder zu beobachten, die mit anomalen Veränderungen der FHIT-Expression und/oder Aktivität, wie oben beschrieben, verbunden sind. Ein derartiger Hybridisierungsassay wird insbesondere durch ein Verfahren ausgeführt, umfassend das Kontaktieren einer Probe, die eine Nucleinsäure enthält, mit einer Nucleinsäuresonde, die fähig ist, an FHIT-DNA (z.B. cDNA) oder -RNA zu hybridisieren, unter solchen Bedingungen, dass Hybridisierung erfolgen kann, und das Nachweisen oder die Ermittlung irgendeiner resultierenden Hybridisierung. Hybridisierungsassays können insbesondere verwendet werden, um das Vorhandensein von Abnormitäten, die mit der Expression einer Mutante von einer FHIT-mRNA verbunden sind, durch Hybridisierung einer mRNA oder cDNA aus einer Patientenprobe an eine FHIT-Sonde und Analyse mittels Größe und/oder Sequenz der resultierenden hybridisierten Nucleinsäuren nachzuweisen. Tests (Assays), die verwendet werden können, beinhalten zum Beispiel, sind aber nicht beschränkt auf, Northern-Blots, Dot-Blots, usw. Ein bestimmter Hybridisierungstest ist die Northern-Blot-Analyse einer Patientenprobe unter Verwendung von FHIT-Gensonden aus wenigstens 15 Nucleotiden bis zu der vollständigen cDNA-Sequenz, gezeigt in 2A. Ein anderer Hybridisierungstest ist die in situ Hybridisierungsanalyse einer Patientenprobe unter Verwendung von Anti-Fhit Antikörpern oder FHIT-Nucleotidhybridiserungssonden. Derartige Verfahren sind im Fachgebiet bekannt und sind sogar die Grundlage von vielen kommerziell erhältlichen Diagnose-Kits.
In einer spezifischen Ausführungsform wird Krebs oder eine andere Störung mit Zell-Überproliferation (z.B. die in Abschnitten 5.8.1-5.8.3 oben beschriebenen) diagnostiziert oder prognostiziert, indem eine Mutation in dem FHIT-Gen oder seiner hergestellten RNA in einer aus einem Patienten stammenden Probe nachgewiesen wird. Die Mutation kann eine Translokation, Deletion, Insertion oder Substitution/Punktmutation sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Mutation eine Deletion eines vollständigen oder einem Teil von wenigstens einem codierenden Exon (d.h. Exon 5, 6, 7, 8 oder 9), vorzugsweise Exon 5 oder Exon 8. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Deletion eine homozygote Deletion. In einer anderen Ausführungsform ist die Mutation eine Mutation, die eine Verschiebung des Leserahmens (frameshift) stromaufwärts von Exon 8 verursacht, oder anderenfalls einen Verlust des offenen Leserahmens (ORF) von Exon 8 des Wildtyps in der FHIT-RNA des Patienten verursacht.
In anderen spezifischen Ausführungsformen ist die Mutation eine Deletion der Exons 4-6 von FHIT, was zu einer Fusion der Sequenzen von Exon 3 mit den Sequenzen von Exon 7 in einer FHIT-RNA oder -cDNA führt, oder die Mutation ist eine Deletion der Exons 4-8 von FHIT, was zu einer Fusion der Sequenzen von Exon 3 mit den Sequenzen von Exon 9 in einer FHIT-RNA oder -cDNA führt.
In einer weiteren bestimmten Ausführungsform ist die Mutation, die nachgewiesen wird, eine Insertion in einen codierenden Bereich des FHIT-Gens oder eine Insertion stromabwärts von Exon 4, oder eine Insertion in den 5'-nicht-codierenden Bereich zwischen Exon 4 und 5. In einer spezifischen Ausführungsform wird die Mutation in der codierenden Sequenz des FHIT-Gens nachgewiesen, indem eine FHIT-cDNA oder -mRNA aus dem Subjekt mit anomaler Größe nachgewiesen wird (d.h. eine FHIT-RNA oder -cDNA, die eine unterschiedliche Größe als die Wildtyp FHIT-RNA (die in normalen Individuen, die keinen Krebs oder keine Prädisposition für Krebs haben, der mit einer FHIT-Mutation verbunden ist, vorhanden ist oder deren Vorhandensein erwartet wird, z.B. das ~1,1 kb Transcript).
In einer weiteren Ausführungsform wird die Diagnose oder Prognose ausgeführt durch den Nachweis einer aus dem Subjekt stammenden FHIT-cDNA oder -mRNA mit anomaler Größe sowie dem Verlust von einem FHIT-Allel in dem Subjekt.
Polynucleotidsequenzen von FHIT, bestehend aus wenigstens 8 bis 25 Nucleotiden, die als Primer in Primer-abhängigen Verfahren zur Nucleinsäureamplifikation nützlich sind, können für den Nachweis von Mutanten von genomischen oder RNA-Sequenzen von FHIT in Patientenproben verwendet werden. Primer-abhängige Verfahren zur Nucleinsäureamplifikation, die bei der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Polymerase-Kettenreaktion (PCR), kompetitive PCR, zyklische Reaktion mit einer Sonde (cyclic probe reaction) und Ligase-Kettenreaktion (ligase chain reaction, LCR). Derartige Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Ein bevorzugtes Verfahren zur Nucleinsäureamplifikation der vorliegenden Erfindung ist reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR) (Siebert et al., 1992, Nature 359:557:558).
In einer bestimmten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird jeder Primer eines Primerpaars für die Verwendung in einem Primer-abhängigen Verfahren zur Nucleinsäureamplifikation ausgewählt aus einem unterschiedlichen Exon der genomischen FHIT-Nucleotidsequenzen. Falls, z.B., ein Primer eines Primerpaars aus der genomischen Sequenz des Exon 1 von FHIT ausgewählt wird, wird der zweite Primer aus der genomischen Sequenz von Exon 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 von FHIT ausgewählt. Als ein anderes Beispiel: wenn ein Primer eines Primerpaars aus der genomischen Sequenz von Exon 2 von FHIT ausgewählt wird, wird der zweite Primer aus der genomischen Sequenz von Exon 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 von FHIT ausgewählt. Die resultierenden amplifizierten genomischen Nucleotidsequenzen werden amplifizierte Intronsequenzen enthalten und größer sein als amplifizierte cDNA-Nucleotidsquenzen, die keine Intronsequenzen enthalten werden. Ebenso können amplifizierte cDNA-Sequenzen mit einer Deletionsmutation von amplifizierten Wildtyp-Sequenzen aufgrund des Größenunterschieds der resultierenden amplifizierten Sequenzen (die Deletionsmutante wird ein kürzeres amplifiziertes Fragment erzeugen) unterschieden werden. Für die Amplifikation von cDNA- Nucleotidsequenzen sollten die Primersequenzen aus Exonsequenzen ausgewählt werden, die ausreichend weit auseinander liegen, um eine nachweisbare amplifizierte Nucleotidsequenz bereitzustellen.
In einer spezifischen Ausführungsform wird Krebs oder eine andere Störung der Zellproliferation oder eine Prädisposition dafür in einem Subjekt nachgewiesen oder diagnostiziert, indem (eine) Mutation(en) innerhalb des FHIT-Gens wie folgt nachgewiesen wird/werden: Eine Probe, enthaltend RNA aus Gewebe oder Zellen, stammend aus einem Patienten, wird bereitgestellt, und die RNA wird durch im Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren revers transcribiert in cDNA; vorzugsweise folgt diesem Schritt die Amplifikation von Fragmenten, umfassend FHIT codierende Sequenzen innerhalb der cDNA und dem Nachweis von einer oder mehr Mutationen innerhalb der FHIT codierenden Sequenzen in dem amplifizierten Fragment. Die Amplifikation kann durch irgendein im Fachgebiet bekanntes Verfahren erfolgen und erfolgt vorzugsweise durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Bevorzugt wird RT-PCR aufgrund der großen Größe (> 500 kb) des FHIT-Gens im Genom, was es unmöglich macht, ein einzelnes Fragment, das die meisten Exons von FHIT enthält, aus einer genomischen Probe zu amplifizieren, wohingegen die Amplifikation eines derartigen Fragments aus einer cDNA-Probe leicht geschafft werden kann. Die Primer zur Verwendung in einer PCR sind stromaufwärts und stromabwärts Primer, die die Synthese mittels einer Polymerase aufeinander zu betreiben können, und sind vorzugsweise in dem Bereich von 8-35 Nucleotiden, vorzugsweise getrennt durch einen Bereich von 10-2000 Nucleotiden in der FHIT-mRNA. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst jeder Primer eine hybridisierbare Sequenz, die in einem Exon des FHIT-Gens oder innerhalb von 200 Nucleotiden, die ein Exon des FHIT-Gens flankieren (5' oder 3' dazu), enthalten ist. In einer spezifischen Ausführungsform hybridisiert der erste Primer 5' zu Exon 5 (vorzugsweise enthaltend die Sequenzen von Exon 4 oder 5' dazu) und der zweite Primer hybridisiert an den anderen Strang 5' zu dem Intron zwischen Exons 5 und 6 (so dass ein amplifiziertes Fragment aus Wildtyp FHIT-cDNA Exon 5 enthalten würde). In einer weiteren spezifischen Ausführungsform hybridisiert der zweite Primer an den anderen Strang 5' zu Exon 6. In anderen spezifischen Ausführungsformen hybridisieren die ersten bzw. zweiten Primer an gegenüberliegende Stränge 5' zu dem 3'-Terminus von Exon 4 und 5' zu Exon 8; 5' zu dem 3'-Terminus von Exon 4 und 5' zu Exon 9; und 5' zu Exon 1 und 5' zu Exon 10, so dass die resultierenden amplifizierten Fragmente die Exonsequenzen enthalten würden, die normalerweise zwischen den Stellen an die die Primer hybridisieren vorhanden sind, sofern sie in der cDNA vorhanden sind. Somit sind, z.B., in den vorhergehenden Beispielen die PCR Primerpaare angepasst, um ein Fragment der Wildtyp FHIT-cDNA zu amplifizieren, das Exon 5, Exon 5 plus Exon 6, Sequenzen zwischen dem 3'-Terminus von Exon 4 und Exon 8, Sequenzen zwischen dem 3'-Terminus von Exon 4 und Exon 9 bzw. Exon 1 bis 10 umfasst. Das Vorhandensein von einer oder mehr Mutationen in der cDNA kann nachgewiesen werden, indem ein (vorzugsweise amplifiziertes) Fragment mit anomaler Größe (verglichen mit jenen Fragmenten, die von einem Wildtyp FHIT-Transcript hergestellt werden) nachgewiesen wird, zum Beispiel, indem die cDNA einer Größentrennung, wie z.B. durch Agarose-Gelelektrophorese oder Säulenchromatographie, unterzogen wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Vorhandensein von einer oder mehr Mutationen in der cDNA nachgewiesen durch Sequenzierung der cDNA, oder stärker bevorzugt, der amplifizierten isolierten Fragmente aus der cDNA. Die amplifizierten Fragmente können durch im Fachgebiet bekannte Verfahren isoliert werden, zum Beispiel, Agarose-Gelelektrophorese und Gewinnung aus der Gelbande und/oder Säulenchromatographie. Eine derartige Sequenzierung kann durch im Fachgebiet allgemein bekannte Standardverfahren ausgeführt werden, und kann automatisiert oder manuell erfolgen.
In noch einer weiteren spezifischen Ausführungsform (kann eine) können Mutation(en) in dem FHIT-Gen oder -mRNA aus einem Patienten nachgewiesen werden durch andere im Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren, zum Beispiel, Northern-Hybridisierung. Als Beispiel aber nicht als Einschränkung: RNA aus einem Gewebe eines Patienten wird durch Gelelektrophorese getrennt, auf einen Filter oder eine andere Festphase transferiert und mit markierten DNA-Sonden hybridisiert. Die hybridisierten RNAs werden dann visualisiert durch Nachweis des Markers. Vorzugsweise werden zahlreiche DNA-Sonden aus unterschiedlichen Teilen der FHIT-cDNA verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform kann Southern-Hybridisierung verwendet werden, um Groß-Mutationen (gross mutations) in FHIT-DNA nachzuweisen. Zum Beispiel: genomische DNA, isoliert aus einem Patienten, getrennt durch Gelelektrophorese, transferiert auf einen Filter oder eine andere Festphase und hybridisiert mit einer FHIT-Sonde (z.B. einem Oligonucleotid, enthaltend eine FHIT-Gensequenz, angebracht an einem nachweisbaren Marker. Vorzugsweise wird eine Vielzahl von FHIT-Sonden verwendet, die an Sequenzen innerhalb von jedem der codierenden Exons hybridisierbar sind, und besonders bevorzugt, enthaltend (eine) Sonde(n), hybridisierbar an Sequenzen innerhalb von Exon 5.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Translokation innerhalb des FHIT-Gens durch allgemein im Fachgebiet bekannte Verfahren nachgewiesen. Zum Beispiel wird in einer bevorzugten Ausführungsform eine Probe, umfassend genomische FHIT-DNA oder, vorzugsweise, FHIT-cDNA (z.B. cDNA von vollständiger PolyA-mRNA) aus einem Patienten, einer PCR unter Verwendung von Primern, die die Synthese über den vermuteten Translokationszusammenschluss hinweg betreiben, unterzogen. Zum Beispiel kann ein Primer eine Sequenz aufweisen, die an Chromosom 3 (vorzugsweise innerhalb des FHIT-Gens stromaufwärts von Exon 4, zum Beispiel, eine Sequenz innerhalb von Exon 1, 2 oder 3) hybridisierbar ist, und ein [anderer] Primer kann eine Sequenz aufweisen, die an Chromosom 8 (stromabwärts des Translokationsereignisses) hybridisierbar ist; die Amplifikation eines Fragments zeigt das Vorhandensein einer Translokation zwischen den Chromosomen 3 und 8 an. Zusätzlich oder alternativ wird die Durchführung einer PCR durch das Betreiben mit Primern, von denen jeder eine Sequenz innerhalb des FHIT-Gens besitzt (siehe z.B. die obere Beschreibung bezüglich Primern für RT-PCR), nur zu einem amplifizierten Fragment führen, wenn wenigstens in einem FHIT-Allel die Primersequenzen ohne Unterbrechung durch ein Translokationsereignis zwischen diesen enthalten sind.
Der Nachweis von homozygoten Mutationen (Mutationen in beiden Allelen) in FHIT-Genen wird als ein stärkeres Anzeichen für das Vorhandensein von, oder eine Prädisposition für, Krebs erachtet als hemizygote Mutationen (von einem Allel) in FHIT-Genen.
Wie hierin verwendet, beinhalten Patientenproben, die verwendet werden können, ohne darauf beschränkt zu sein, frische oder gefrorene Gewebeproben, die in in situ Hybridisierungsassays verwendet werden können; Zellen oder Gewebe aus Biopsin und, allgemein, Patientenproben, die Nucleinsäuren enthalten, die in Assays verwendet werden können, die FHIT-Nucleinsäure ermitteln oder quantifizieren oder analysieren können.
Die FHIT-Gensequenzen der vorliegenden Erfindung können diagnostisch verwendet werden zum Nachweis von Chromosom 3p14.2 Abnormitäten, insbesondere, Translokationen mit Chromosom 8 und Deletionen. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Zielsequenz bereit, die eine Abnormität in Chromosom 3p14.2 in einer aus einem Patienten stammenden Probe anzeigt oder beinhaltet, umfassend die Schritte: Amplifikation der Zielsequenz in der Probe unter Verwendung eines ersten Primers aus 8 bis 25 Nucleotiden, vorzugsweise 18-25 Nucleotiden, die komplementär zu der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 sind, und einem zweiten Primer, der komplementär zu einer Region ist, die zu dem FHIT-Gen telomerisch oder zentromerisch ist, und den Nachweis irgendeiner resultierenden amplifizierten Zielsequenz, wobei das Vorhandensein der amplifizierten Zielsequenz ein Anzeichen für die Abnormität ist. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Diagnose einer Malignität bereit, die mit Abnormitäten in Chromosom 3p14.2 in einem Patienten verbunden ist, umfassend das Nachweisen der Abnormität von Chromosom 3p14.2 gemäß dem vorstehenden Verfahren, bei dem das Vorhandensein einer amplifizierten Zielsequenz, die bezeichnend für eine Mutante eines Transcripts von FHIT ist, das Vorhandensein von Krebs oder einem präcancerogenen Zustand in dem Patienten anzeigt. Die resultierende amplifzierte Zielsequenz kann mit Gelelektrophorese nachgewiesen werden und verglichen werden mit einer normalen Probe oder einem Standard, die/der eine Abnormität von Chromosom 3p14.2 nicht enthält. Die Amplifikation von genomischen DNA-Zielsequenzen kann die Erzeugung langer PCR-Produkte erfordern. PCR-Verfahren zur Erzeugung langer PCR-Produkte sind beschrieben in Science (1994) 263:1564-1565; PCR-Kits zur Erzeugung langer PCR-Produkte sind erhältlich von Perkin Elmer und Takara Shuzo Co., Ltd. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweis einer Nucleotidzielsequenz bereit, die bezeichnend für eine Abnormität von Chromosom 3p14.2 ist oder wenigstens einen Teil von dieser beinhaltet (dadurch bezeichnend für das Vorhandensein von oder eine Prädisposition für eine Störung mit Zell-Überproliferation) in einer Nucleinsäureprobe, umfassend die Schritte des Hybridisierens der Probe mit einer Nucleinsäuresonde von nicht mehr als 10 Kilobasen, umfassend cDNA-Sequenzen von FHIT, ausgewählt aus wenigstens Exon 1, 2, 3 oder 4 und ausgewählt aus wenigstens Exon 7, 8 oder 9, oder einer dazu absolut komplementären Sequenz, und das Nachweisen oder Ermitteln der Menge von irgendeiner resultierenden Hybridisierung zwischen der Sonde und der Zielsequenz innerhalb der Probe. Alternativ umfasst die Sonde wenigstens 310 aufeinander folgende Nucleotide einer FHIT-cDNA, oder wenigstens 266 aufeinander folgende Nucleotide von codierenden cDNA-Sequenzen von FHIT.
Die resultierende Hybridisierung zwischen der Sonde und der Zielsequenz innerhalb der Probe kann nachgewiesen werden unter Verwendung von Gelelektrophorese und kann verglichen werden mit einer Zielsequenz aus einer normalen Probe oder einem Standard, die/der die Abnormität nicht enthält. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Diagnose einer Malignität bereit, die mit einer FHIT-Abnormität in einem Patienten verbunden ist, umfassend das Nachweisen dieser FHIT-Abnormität gemäß dem vorstehenden Verfahren, in welchem das Vorhandensein der amplifizierten Zielsequenz das Vorhandensein einer Malignität in dem Patienten anzeigt. Vollständige Komplementarität zwischen einer Hybridisierungssonde und einer Zielsequenz, obwohl bevorzugt, ist nicht notwendig. Eine Sequenz, die "komplementär zu wenigstens einem Teil von" ist, wie sie hierin erwähnt wird, bedeutet eine Sequenz mit ausreichender Komplementarität, um in der Lage zu sein, mit der Nucleinsäure zu hybridisieren und einen stabilen Hybridisierungskomplex zu bilden. Die Fähigkeit zu hybridisieren wird sowohl von dem Grad der Komplimentarität als auch der Länge der Nucleinsäure abhängen. Allgemein, je länger die hybridisierende Nucleinsäure, desto mehr Basenfehlpaarungen mit einer FHIT-RNA kann sie enthalten und immer noch ein stabiles Duplex (oder Triplex, wie es der Fall sein kann) bilden. Ein Fachmann kann ein tolerierbares Maß an Fehlpaarung durch Verwendung von Standardverfahren zur Bestimmung des Schmelzpunktes des Hybridisierungskomplexes feststellen.
Eine zusätzliche Ausführung der vorliegenden Erfindung betrifft Diagnostik-Kits für den Nachweis oder die Messung von FHIT-Gensequenzen und Fhit-Protein. Kits für die diagnostische Verwendung, die in einem oder mehr Behältern einen Anti-Fhit Antikörper umfassen und, optional, einen markierten Bindungspartner für den Antikörper, werden bereitgestellt. Alternativ kann der Anti-Fhit Antikörper markiert werden (mit einem nachweisbaren Marker, z.B. einer chemolumineszierenden, enzymatischen, fluoreszierenden oder radioaktiven Einheit).
Ein Kit, der in einem oder mehr Behältern eine Nucleinsäuresonde umfasst, die zur Hybridisierung an FHIT-RNA fähig ist, wird auch bereitgestellt. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung einen Diagnostik-Kit bereit, der eine Verbindung, umfassend eine Sonde von nicht mehr als 10 Kilobasen und umfassend cDNA-Sequenzen von FHIT, umfassend wenigstens eines aus Exon 1, 2, 3 oder 4 und wenigstens eines aus Exon 7, 8 oder 9; oder deren Komplement, in einem Behälter umfasst. Alternativ umfasst die Sonde mindestens 310 aufeinander folgende Nucleotide einer FHIT-cDNA, oder mindestens 266 aufeinander folgende Nucleotide von codierenden Sequenzen einer FHIT-cDNA. Alternativ stellt die vorliegende Erfindung einen Diagnostik-Kit bereit, umfassend, in einem oder mehr Behältern, ein Paar von Primern aus wenigstens 8-35, vorzugsweise 8-25, Nucleotiden, wobei mindestens einer dieser Primer an SEQ ID NO:1 oder deren Komplement hybridisierbar ist und wobei diese Primer fähig sind, die cDNA-Synthese in einer Amplifikationsreaktion zu betreiben. In einer spezifischen Ausführungsform kann ein Kit in einem oder mehr Behältern ein Paar von Primern (z.B. jeder in dem Größenbereich von 8-35 Nucleotiden) umfassen, die fähig sind, die Amplifikation [z.B. durch Polymerase-Kettenreaktion (siehe z.B. Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CA), Ligase-Kettenreaktion (siehe EP 320,308 ), Verwendung von Qβ-Replikase, cyclische Reaktion mit einer Sonde oder andere im Fachgebiet bekannte Verfahren] unter geeigneten Reaktionsbedingungen von mindestens einem Teil einer FHIT-Nucleinsäure zu betreiben. Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Diagnostik-Kit bereit, in dem mindestens einer der Primer an SEQ ID NO: 1 oder deren Komplement hybridisierbar ist und in dem einer der Primer an eine DNA-Sequenz hybridisierbar ist, die sich telomerisch oder zentromerisch zu dem FHIT-Gen befindet. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Kit ein Primerpaar, wie z.B. oben beschrieben, zur Verwendung in Diagnose-Assays. In einer spezifischen Ausführungsform kann eine der vorhergehenden Verbindungen des Behälters nachweisbar markiert sein. Optional kann ein Kit kann in einem Behälter ferner eine vorbestimmte Menge eines gereinigten Fhit-Proteins oder einer gereinigten FHIT-Nucleinsäure umfassen, z.B. zur Verwendung als Standard oder Kontrolle.
Die Amplifikationsreaktion der vorliegenden Erfindung kann sein, eine Polymerase-Kettenreaktion, kompetititve PCR und kompetitive reverse Transcriptase-PCR (Clementi et al., 1994, Genet Anal Tech Appl 11(1):1-6 und Siebert et al., 1992, Nature 359:557-558); cyclische Reaktion mit einer Sonde, die die Amplifikation einer Zielsequenz unter Verwendung einer RNA/DNA Hybridsonde und RNase erlaubt (ID Biomedical); Ligase-Kettenreaktion (Wu et al., 1989, Genomics 4:560-569). In einer bestimmten Ausführungsform kann die chromosomale Abnormität, die mit einem FHIT-Locus in Verbindung steht, nachgewiesen werden, wie es in PCT Veröffentlichung Nr. WO92/19775, datierend vom 12. November 1992 beschrieben ist. In einer spezifischen Ausführungsform ist die FHIT-Sonde, die in einem Hybridisierungsassay verwendet wird, nachweisbar markiert. Eine derartige Markierung kann irgendeine im Fachgebiet bekannte sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, radioaktive Markierungen, fluoreszierende Markierungen, Biotin, chemilumineszierende Markierungen, usw.
In einer spezifischen Ausführungsform, bei der Primer in dem verwendeten Assay eingesetzt werden, kann wenigstens ein Primer nachweisbar markiert sein. In einer weiteren Ausführungsform ist ein Primer eines Paars an eine Einheit angehängt, die das Einfangen ermöglicht, z.B. eine magnetische Perle.
Anti-Fhit Antikörper können erzeugt und diagnostisch verwendet werden, um das Vorhandensein einer Mutante eines Fhit-Proteins in Patientenproben nachzuweisen und/oder die Abwesenheit von Wildtyp Fhit-Protein, wodurch Krankheitszustände, die mit Abnormitäten von Chromosom 3p14.2 verbunden sind, wie z.B. Störungen mit Zell-Überproliferation, identifiziert werden.
Zum Beispiel können in einer Ausführungsform, bei der man Mutanten von Fhit-Protein durch das Testen auf Bindung an Anti-Fhit Antikörper nachweist oder ermittelt, verschiedene im Fachgebiet bekannte Immunoassays verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, kompetitive und nicht-kompetitive Testsysteme unter Verwendung von Verfahren, wie z.B. Radioimmunoassays, ELISA (Enzym-gekoppelter Immunoadsorptionstest), "Sandwich"-Immunoassays, immunoradiometrische Assays, Geldiffusions-Präzipitationsreaktionen, Immunodiffusionsassays in situ Immunoassays (z.B. unter Verwendung von kolloidalem Gold, Enzym oder Radioisotop-Markierungen), Western-Blots, in situ-Hybridisierungen, Präzipitationsreaktionen, Agglutinierungsassays (z.B. Gel-Agglutinierungsassays, Hämagglutinierungsassays), Komplement-Fixierungsassays, Immunfluoreszenzassays, Protein A-Assays und Immunelektrophorese-Assays usw. In einer Ausführungsform wird Antikörperbindung nachgewiesen durch den Nachweis einer Markierung auf dem primären Antikörper. In einer anderen Ausführungsform wird der primäre Antikörper durch den Nachweis der Bindung eines sekundären Antikörpers oder eines Reagenz an den primären Antikörper nachgewiesen. In einer weiteren Ausführungsform wird der sekundäre Antikörper markiert. Viele Mittel zum Nachweis der Bindung in einem Immunoassay sind im Fachgebiet bekannt und werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst. Ein derartiger Immunoassay wird insbesondere durch ein Verfahren ausgeführt, das das Kontaktieren einer aus einem Patienten stammenden Probe mit einem Anti-Fhit Antikörper unter solchen Bedingungen, das immunospezifische Bindung stattfinden kann, und das Nachweisen oder Messen der Menge irgendeiner immunospezifischen Bindung durch den Antikörper umfasst. In einer spezifischen Ausführungsform kann ein Antikörper gegen ein Fhit-Protein verwendet werden, um ein Patientengewebe oder eine Serumprobe auf das Vorhandensein eines Fhit-Proteins zu testen, wobei ein gesteigerter Level an Fhit-Protein ein Anzeichen für einen krankhaften Zustand ist. In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird das Fhit-Protein in einer Patientenprobe immuncytochemisch nachgewiesen oder gemessen. In einer weiteren Ausführungsform können Tests zur Messung der Level von Fhit-Protein oder -RNA verwendet werden, um die Therapie einer Krankheit, die mit der gesteigerten Expression von FHIT verbunden ist, zu beobachten. Zum Beispiel kann eine Verminderung der Level von FHIT-RNA oder -Protein nach der Therapie im Vergleich zu dem vor der Therapie gefundenen Level ein Anzeichen für eine günstige Antwort auf die Therapie sein. Ein Anstieg derartiger Level nach einer Therapie kann bezeichnend für eine schlechte Antwort auf die Therapie sein.
Zum Nachweis von Fhit-Proteinsequenzen umfasst ein Diagnostik-Kit der vorliegenden Erfindung in einem oder mehr Behältern einen Anti-Fhit Antikörper, der optional nachweisbar markiert sein kann. In einer unterschiedlichen Ausführungsform kann der Kit in einem Behälter einen markierten spezifischen Bindungsteil eines Antikörpers umfassen. Der Ausdruck nachweisbare Markierung, wie er hierin erwähnt wird, bezieht sich auf eine beliebige Markierung, die ein direkt oder indirekt nachweisbares Signal bereitstellt und beinhaltet, z.B. Enzyme, radiomarkierte Moleküle, fluoreszierende Moleküle, Partikel, chemolumineszierende Moleküle (chemiluminesors), Enzymsubstrate oder Cofaktoren, Enzymhemmer (enzyme inhibitors) oder magnetische Partikel. Beispiele für Enzyme, die in der vorliegenden Erfindung nützlich als nachweisbare Marker sind, beinhalten alkalische Phosphatase (alkaline phosphatase) und Meerrettich-Peroxidase (horse radish peroxidase). Eine Vielzahl von Verfahren zum Anbringen der nachweisbaren Marker an Proteine von Interesse stehen zur Verfügung und beinhalten z.B. die Verwendung eines bifunktionellen Mittels, wie z.B. 4,4'-Difluor-3,3'-dinitrophenylsulfon, zum Befestigen eines Enzyms, z.B. Meerrettich-Peroxidase, an ein Protein von Interesse. Das befestigte Enzym kann dann mit einem Substrat reagieren, wodurch ein Reaktionsprodukt erhalten wird, das nachweisbar ist. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis eines Fhit-Proteins in einer Patientenprobe bereit, umfassend das Kontaktieren der Patientenprobe mit einem Anti-Fhit Antikörper unter solchen Bedingungen, dass eine immunspezifische Bindung erfolgen kann, und das Nachweisen oder Messen der Menge irgendeiner immunspezifischen Bindung durch den Antikörper. Das Verfahren umfasst vorzugsweise auch, das Protein einer Größentrennung und/oder Sequenzbestimmung zu unterwerfen.
Als Probe kann irgendeine Probe aus einem Patienten dienen, die Fhit-Protein enthält, z.B. Gewebeschnitte (tissue sections).
Bei der Diagnose von Krankheitszuständen kann die funktionelle Aktivität eines Fhit-Proteins, von Derivaten und Analoga durch verschiedene Verfahren getestet werden. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Diagnose einer Malignität oder einer anderen Störung bereit, die mit Abnormitäten von Chromosom 3p14.2 in einem Patienten verbunden sind, umfassend das Nachweisen der Expression einer Mutante eines Fhit-Proteins in einer aus dem Patienten stammenden Probe, wobei das Vorhandensein einer Mutante eines Fhit-Proteins ein Anzeichen ist für das Vorhandensein einer Malignität oder einer anderen Störung, die mit FHIT-Abnormitäten in dem Patienten verbunden ist.
In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung wird eine pränatale Diagnose einer Störung mit Zell-Überproliferation oder einer Prädisposition dafür ausgeführt. Zum Beispiel kann man zuerst Gewebe (z.B. Blutzellen), das aus einem werdenden Elternteil stammt, bereitstellen. Falls einer oder mehr der werdenden Elternteile eine FHIT-Mutation aufweist, und somit eine mögliche Erblichkeit dieser Mutation durch den Nachwuchs anzeigt, kann dann eine Fruchtwasseruntersuchung (amniocentesis) oder ein anderes Verfahren für fötale Gewebeproben ausgeführt werden, um fötale Zellen zu erhalten, die dann auf das Vorhandensein einer Mutante von FHIT-DNA oder -RNA oder -Protein getestet werden können durch Verfahren, wie oben beschrieben (z.B. RT-PCR, um eine Mutante von FHIT-RNA nachzuweisen).
In einer weiteren Ausführungsform können die Expressionslevel von Fhit-Protein oder -RNA verwendet werden, um die Erkrankung einzuschätzen oder zu beobachten, wobei das Auftreten von oder ein Anstieg der Expression von Mutanten Fhit-Protein oder -RNA, und/oder eine Verminderung von oder der Verlust von der Expression von Wildtyp Fhit-Protein oder -RNA im Vergleich zu der in einer Probe, die zu einem früheren Zeitpunkt aus dem Subjekt erhalten wurde, vorhandenen [Menge], ein Fortschreiten der Erkrankung anzeigt.
Die Fähigkeit von Antikörpern, Peptiden oder anderen Molekülen, die Wirkung von Fhit-Protein auf Krankheitszustände zu modulieren, kann beobachtet werden. Zum Beispiel kann die Expression von FHIT-Gensequenzen oder Fhit-Proteinsequenzen nachgewiesen werden, wie oben beschrieben, sowohl vor als auch nach Verabreichung einer therapeutischen Zusammensetzung, z.B. umfassend eine FHIT-Nucleotidsequenz, Fhit-Proteinsequenz, Derivat oder Analogon derselben, oder einen Antikörper hierfür, oder eine Antisense-Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Vorhandensein von (einer) FHIT-Mutation(en), besonders von homozygoten, als Indikator für ein nachteiliges Ergebnis der Therapie oder das Wiederauftreten der Störung in Patienten mit Störungen mit Zell-Überproliferation verwendet werden.
Andere Verfahren sind dem Fachmann bekannt und im Rahmen dieser Erfindung umfasst.
5.12. SCREENING NACH Fhit-AGONISTEN UND -ANTAGONISTEN
FHIT-Nucleinsäuren, -Proteine, und Derivate finden auch Verwendung in Screeningassays, um Moleküle nachzuweisen, die spezifisch an FHIT-Nucleinsäuren, Proteine oder Derivate binden, und haben somit potentielle Verwendung als Agonisten oder Antagonisten von Fhit, besonders Moleküle, die auf diese Art die Zell-Proliferation beeinflussen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden derartige Assays durchgeführt, um nach Molekülen mit potentieller Nützlichkeit als Anti-Krebsarzneimittel oder als Leitverbindungen für die Arzneimittelentwicklung zu screenen. Die Erfindung stellt somit Assays bereit, um Moleküle nachzuweisen, die spezifisch an FHIT-Nucleinsäuren, -Proteine oder Derivate binden. Zum Beispiel können rekombinante Zellen, die FHIT-Nucleinsäuren exprimieren, verwendet werden, um Fhit-Proteine in diesen Assays rekombinant herzustellen, um nach Molekülen zu screenen, die an ein Fhit-Protein binden. Moleküle (z.B. mutmaßliche Bindungspartner von Fhit) werden unter für die Bindung förderlichen Bedingungen mit dem Fhit-Protein (oder einem Fragment desselben) in Kontakt gebracht, und dann werden Moleküle identifiziert, die spezifisch an das Fhit-Protein binden. Ähnliche Verfahren können verwendet werden, um nach Molekülen zu screenen, die an Fhit-Derivate oder -Nucleinsäuren binden. Verfahren, die verwendet werden können, um die vorhergehenden auszuführen, sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
In einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein Fhit-Protein und/oder eine Zelllinie, die ein Fhit-Protein exprimiert, verwendet werden, um nach Antikörpern, Peptiden oder anderen Molekülen zu screenen, die an das Fhit-Protein binden und somit als Agonisten oder Antagonisten von Fhit-Protein wirken können. Zum Beispiel können Anti-Fhit Antikörper, die zur Neutralisierung der Aktivität einer dominant-negativen Mutante eines Fhit-Proteins fähig sind, verwendet werden, um einen Krankheitszustand, der mit Zell-Überproliferation verbunden ist, wie z.B. Krebs, zu hemmen oder diesem vorzubeugen.
Das Screening von organischen oder Peptid-Bibliotheken mit einer rekombinant exprimierten Mutante eines Fhit-Proteins kann nützlich sein zur Identifizierung von therapeutischen Molekülen, die als Hemmer der Aktivität einer Mutante eines Fhit-Proteins funktionieren. Das Screening gegen Wildtyp Fhit-Protein kann dann ausgeführt werden, um Antagonisten auszuwählen, die spezifisch für die Mutante des Fhit-Proteins sind, d.h. die das Wildtyp Fhit-Protein nicht hemmen (oder binden). Synthetische und natürlich auftretende Produkte können auf zahlreiche Weisen, die vom Fachmann als Routine erachtet werden, gescreent werden.
Als ein Beispiel, Bibliotheken mit Diversität (diversity libraries), wie z.B. Zufalls- oder kombinatorische Peptid- oder Nicht-Peptid-Bibliotheken, können auf Moleküle gescreent werden, die spezifisch an Fhit binden. Viele Bibliotheken, die verwendet werden können, sind im Fachgebiet bekannt z.B. chemisch synthetisierte Bibliotheken, rekombinante (z.B. von Phagen präsentierte Bibliotheken (phage display libraries) und Bibliotheken, die auf in vitro Translation basieren (in vitro translation-based libraries).
Beispiele für chemisch synthetisierte Bibliotheken sind beschrieben in Fodor et al., 1991, Science 251:767-773; Houghten et al., 1991, Nature 354:84-86; Lam et al., 1991, Nature 354:82-84; Medynski, 1994, Bio/Technology 12:709-710; Gallop et al., 1994, J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251; 15 Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426; Houghten et al., 1992, Biotechniques 13:412; Jayawickreme et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618; Salmon et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712; PCT Veröffentlichung Nr. WO 93/20242; und Brenner und Lerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383.
Beispiele für von Phagen präsentierte Bibliotheken sind beschrieben in Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin et al., 1990, Science, 249:404-406; Christian, R.B., et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:711-718); Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152:149-157; Kay et al., 1993, Gene 128:59-65; und PCT Veröffentlichung Nr. WO 94/18318, datierend vom 18. August 1994.
Bibliotheken, die auf in vitro Translation basieren, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, jene, beschrieben in PCT Veröffentlichung Nr. WO 91/05058, datierend vom 18. April, 1991; und Mattheakis et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026.
Als Beispiele für Nicht-Peptid-Bibliotheken kann eine Benzodiazepin-Bibliothek (siehe z.B. Bunin et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712) zur Verwendung angepasst werden. Peptoid-Bibliotheken (Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371) können auch verwendet werden. Ein weiteres Beispiel für eine Bibliothek, die verwendet werden kann, bei der die Amid-Funktionalitäten in Peptiden permethyliert worden sind, um eine chemisch veränderte kombinatorische Bibliothek zu erzeugen, wird von Ostresh et al. (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142) beschrieben.
Das Screening der Bibliotheken kann durch irgendeines von einer Vielzahl von allgemein bekannten Verfahren erreicht werden. Siehe z.B. die folgenden Literaturstellen, die das Screening von Peptid-Bibliotheken offenbaren: Parmley and Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218; Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Fowlkes et al., 1992; BioTechniques 13:422-427; Oldenburg et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397; Yu et al., 1994, Cell 76:933-945; Staudt et al., 1988, Science 241:577-580; Bock et al., 1992, Nature 355:564-566; Tuerk et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992; Ellington et al., 1992, Nature 355:850-852; U.S. Patent Nr. 5,096,815, U.S. Patent Nr. 5,223,409, und U.S. Patent Nr. 5,198,346, alle für Ladner et al.; Rebar und Pabo, 1993, Science 263:671-673; und PCT Veröffentlichung Nr. WO 94/18318.
In einer spezifischen Ausführungsform kann das Screening ausgeführt werden, indem die Bibliotheksmitglieder mit einem Fhit-Protein (oder einer Nucleinsäure oder einem Derivat), das auf einer festen Phase immobilisiert ist, in Kontakt gebracht werden und jene Bibliotheksmitglieder gesammelt werden, die an das Protein (oder die Nucleinsäure oder das Derivat) binden. Beispiele für derartige Screening-Verfahren, die als "panning"-Verfahren bezeichnet werden, sind beispielsweise beschrieben in Parmley and Smith, 1988, Gene 73:305-318; Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13:422-427; PCT Veröffentlichung Nr. WO 94/18318; und in vorstehend zitierten Literaturstellen.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Zwei-Hybrid-System zur Selektion von interagierenden Proteinen in Hefe (Fields and Song, 1989, Nature 340:245-246; Chien et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582) verwendet werden, um Moleküle zu identifizieren, die spezifisch an ein Fhit-Protein oder Derivat binden.
5.13. TIERMODELLE
Die Erfindung stellt auch Tiermodelle bereit.
In einer Ausführungsform werden Tiermodelle für Erkrankungen und Störungen, an denen Zell-Überproliferation beteiligt ist (z.B. wie in 5.8.1. beschrieben) bereitgestellt. Ein derartiges Tier kann anfänglich hergestellt werden durch Förderung der homologen Rekombination zwischen einem FHIT-Gen in seinem Chromosom und einem exogenen FHIT-Gen, das biologisch inaktiv gemacht wurde (vorzugsweise durch Insertion einer heterologen Sequenz, z.B. einem Antibiotika-Resistenzgen). In einer bevorzugten Ausführung wird diese homologe Rekombination ausgeführt durch Transformation von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen), mit einem Vektor, der das durch Insertion inaktivierte FHIT-Gen enthält, so dass homologe Rekombination erfolgt, gefolgt vom Injizieren der ES-Zellen in eine Blastocyste und dem Implantieren der Blastocyste in eine Pflegemutter, gefolgt von der Geburt des chimären Tieres ("knockout-Tier"), in dem ein FHIT-Gen inaktiviert worden ist (siehe Capecchi, 1989, Science 244:1288-1292). Das chimäre Tier kann vermehrt werden, um zusätzliche knockout-Tiere herzustellen. Derartige Tiere können Mäuse, Hamster, Schafe, Schweine, Rinder, usw. sein, und sind vorzugsweise nicht-humane Säugetiere. In einer spezifischen Ausführungsform wird eine knockout-Maus hergestellt.
Von derartigen knockout-Tieren wird erwartet, dass sie Krankheiten oder Störungen, an denen Zell-Überproliferation beteiligt ist (z.B. Malignität), entwickeln oder prädisponiert für die Entwicklung von diesen sind und somit Verwendung als Tiermodelle für derartige Krankheiten und Störungen haben können, z.B. um Moleküle (z.B. potentielle Anti-Krebstherapeutika) auf die Fähigkeit, die Überproliferation (z.B. Tumorbildung) zu hemmen, zu screenen oder zu testen, und somit derartige Krankheiten oder Störungen zu behandeln oder diesen vorzubeugen.
In einer unterschiedlichen Ausführungsform der Erfindung finden transgene Tiere, die eine dominant-negative Mutante eines FHIT-Gens eingebaut haben und exprimieren, Verwendung als Tiermodelle für Krankheiten und Störungen, an denen Zell-Überproliferation beteiligt ist. Derartige Tiere können verwendet werden, um Moleküle auf ihre Fähigkeit, die dominant-negative Mutante spezifisch zu inhibieren, zu screenen oder zu testen, und somit derartige Krankheiten und Störungen zu behandeln oder diesen vorzubeugen.
6. DAS HUMANE FHIT-GEN, DAS SICH ÜBER DIE FRAGILE STELLE DES CHROMOSOMS 3p.14.2 UND DEN MIT NIERENKARZINOM IN VERBINDUNG GEBRACHTEN TRANSLOKATIONSBRUCHPUNKT ERSTRECKT, IST ABNORM BEI KREBSARTEN DES VERDAUUNGSTRAKTS
Wie hierin beschrieben, haben wir ein humanes Gen isoliert und charakterisiert, das an Speiseröhren-, Magen-, Dickdarm-, Nierenkrebs und anderen Krebsarten beteiligt ist. Eine 200-300 Kilobasen (kb) Region von Chromosom 3p14.2, einschließlich dem Locus der fragilen Stelle FRA3B, ist beteiligt an homozygoten Deletionen in vielen aus Tumor stammenden Zelllinien und an hemizygoten Deletionen in Speiseröhren-, Magen-, Dickdarm-, Nierenkrebs und anderen Krebsarten. Die Exonamplifikation aus einem Cosmid-Contig, das diese 200-300 Kilobasenregion abdeckte, erlaubte die Identifizierung des humanen FHIT-Gens, einem Mitglied der Zink-bindenden Histidintriade-Genfamilie (zinc-binding histidine triad gene family), die für ein ubiquitäres 1,1 KilobasenTranscript und ein 16,8 kDa Protein mit Homologie zu einem Proteinkinase C Inhibitorgen, einem weiteren Mitglied der HIT-Familie, codiert.
Der FHIT-Locus ist zusammengesetzt aus 10 kleinen Exons, die über wenigstens 500 Kilobasen verteilt sind, wobei die drei 5' am meisten untranslatierten Exons zentromerisch an das Klarzellnierenkarzinom, das mit dem Translokationsbruchpunkt 3p14.2 verbunden ist, anschließen; die verbleibenden Exons schließen sich telomerisch zu diesem Translokationsbruchpunkt an, wobei Exon 5 das erste Aminosäure-codierende Exon, in die homozygot deletierte fragile Region, FRA3B, fällt und Exons 6-10 telomerisch an die gewöhnlich deletierte Region der Tumorzelle und die Region FRA3B anschließen. Anomale Transcripte des FHIT-Locus wurden in etwa 50% der Speiseröhren-, Magen- und Dickdarmkarzinome gefunden, und die familiären t(3;8)-Nierenkarzinome haben aufgrund von Zerstörung durch die Translokation ein FHIT-Allel verloren.
Die anomalen FHIT-Transcripte resultierten gewöhnlich aus abnormem Spleißen, das oft Exon 5 oder 8 deletierte, und zu Transcripten führte, die kein Fhit-Protein codieren konnten. Somit sind die Abnormitäten des Chromosoms bei 3p14.2 und FRA3B, die zum Verlust des Fhit-Proteins führen, beteiligt an der Initiierung und/oder der Progression von mehreren wichtigen Arten von humanem Krebs.
6.1. ERGEBNISSE
Das Cosmid-Contig
Aus der Cosmid-Bibliothek 648D4 wurden, unter Verwendung der Sonden BE758-6, A6URA, A3 und 1300E3, anfänglich Klone ausgewählt, die über die homozygot deletierte Region verteilt waren, wie in 1A gezeigt. Cosmid-Endklone wurden dann isoliert und für die nächste Runde des Cosmid-Screenings verwendet. Die Cosmid-Karte wurde zusammengefügt durch PCR-Amplifikation der Ausgangs-STSs (sequenzmarkierte Stellen von DNA (DNA sequence tags)) und neue wurden aus den Cosmid-Enden unter Verwendung von Cosmid DNA-Templaten entwickelt. Zusätzlich wurde jedes neue STS getestet gegen das YAC-Contig (auch in 1A gezeigt), gegen Zelllinien mit homozygoten Deletionen und Nagetier/Mensch-Hybriden, die Teile von Chromosom 3 behalten (LaForgia et al., 1993, Cancer Res. 53:3118-3124; Druck et al., 1995, Cancer Res. 55:5348-5355; Bullrich et al., 1995, Cytogenet. Cell Genet. 70:250-254). Sechs Cosmide wurden zu einem Contig zusammengefügt, das die homozygot deletierte Region abdeckte.
Um die homozygot deletierte Region, die wir als die fragile Region bezeichnen, genauer zu definieren, wurden 42 STS-Marker, die sich über die chromosomale Region von dem PTPRG-Locus zu D3S1234 erstreckte, erhalten aus "Cosmid-Walking" und "Exon-Trapping", in elf aus Krebs stammenden Zelllinien, die vorher mit einer Untergruppe von Markern getestet wurden, durch PCR-Amplifikation auf das Vorhandensein getestet (Daten nicht gezeigt; und Lisitsyn et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:151-155).
Aus Dickdarmkarzinom stammende LoVo, HT29 und SW480 und aus Magenkarzinom stammende AGS Zelllinien zeigten ähnlich große Deletionen, wie z.B. durch den punktierten Teil der oberen Linie in 1A abgebildet. Aus Dickdarmkarzinom stammende LS180 und aus Brustkarzinom stammende MDA-MB436 Zellen zeigten diskontinuierliche Deletionen, die dieselbe Region abdeckten, wobei die meisten Marker fehlten aber einige behalten wurden. Die aus Margenkarzinom stammenden KatoIII Zellen schienen den D3S1481-Marker und den telomerischen Teil der fragilen Region verloren zu haben, von AP4/5 bis D3S2977 (siehe 1A). Die Zellen HK1, die aus einem Nasen-Rachenkarzinom (NPC) stammten, hatten die Region zwischen D3S1481 und dem Marker AP4/5 verloren, während CNE2, eine weitere aus NPC stammende Zelllinie eine diskontinuierliche Deletion hatte, die eine Region nahe t(3;8) und die Region zwischen D3S1481 und D3S2977 beinhaltete. HeLa Zellen zeigten auch diskontinuierliche Deletionen mit einer deletierten Region nahe t(3;8) und zwischen D3S1481 und AP4/5. Die aus NPC stammenden CNE1 Zellen wurden mit den meisten Markern ohne den Nachweis einer Deletion getestet. Somit gibt es viele unterschiedliche Tumorassoziierte 3p14.2 Chromosomenbruchpunkte, die t(3;8), den FRA3B-Locus und die homozygot deletierte Region, die von dem Cosmid Contig abgedeckt wird, umgeben.
Isolierung der cDNAs
Die sechs Cosmide, die die homozygote Deletion abdecken, gezeigt in 1A, wurden in "Exon-Trapping" Experimenten verwendet, die darauf gerichtet waren, Gene innerhalb der deletierten Region zu identifizieren. Mutmaßlich erfasste Exons wurden sequenziert und die Sequenzen unter Verwendung von GRAIL 2 auf dem ORNL GRAIL Server analysiert. Mehrere erfasste Exons wurden von Grail 2 als Exons erkannt und wurden als Sonden bei Northern-Blots von Poly A⁺-RNA aus einem Spektrum von humanen Geweben verwendet. Zusätzlich wurden die Sequenzen der erfassten Exons mit Nucleotidsequenz-Datenbanken verglichen. Ein Exon, erfasst aus einem Cosmid 76 Subklon (c76, 1A) stimmte mit einer Reihe von cDNR-Sequenzen aus Bibliotheken von Brust (Genbank Zugangs-Nr. R53187 und Nr. R86313) und fötaler Leber und Milz (Nr. R11128) überein, eingereicht von dem Washington University-Merck EST-Projekt. Ein 23 Basenpaar (bp) Oligonucleotid-Primer, entwickelt aus dieser Sequenz (2A, Primer X8), wurde bei der Primer-Verlängerung verwendet, um ein 5'-verlängertes Produkt der cDNA mittels einer RAcE (Rapid amplification of cDNA ends)-Reaktion (Marathon^TM cDNA Amplifikations-Kit, Clontech) zu erhalten. Das längste Produkt (370 bp) aus der RACE-Reaktion wies eine ubiquitär exprimierte 1,1-kb mRNA durch Northern-Blot-Analyse von mRNAs aus verschiedenen normalen Geweben nach. Die Größe war ähnlich der Länge des größten cDNA-Klons, der aus einer cDNA-Bibliothek für normalen Dickdarm unter Verwendung des gleichen DNA-Fragments als Sonde isoliert wurde. Die DNA-Sequenzanalyse dieses Volllängen-Klons (2A) brachte eine lange 5'-untranslatierte Region von mehr als 350 bp, gefolgt von einem Methionin-Initiationscodon und einer umgebenden Sequenz, die die Kozak-Regel erfüllte, einen offenen Leserahmen (ORF) von 147 Aminosäuren, eine 3'-untranslatierte Region, eine Polyadenylierungskonsensussequenz und einen Poly A-Schwanz zum Vorschein. Die Exongrößen variierten stark, z.B. Exon 5 mit 120 Nucleotiden, Exon 6 mit 146 Nucleotiden und Exon 7 mit 30 Nucleotiden. Mit Bezug auf 2A: Exon 1 besteht aus den Nucleotiden der Nummern -362 bis -213; Exon 2 besteht aus den Nucleotiden der Nummern -212 bis -164; Exon 3 besteht aus Nucleotiden der Nummern -163 bis -111; Exon 4 besteht aus Nucleotiden der Nummern -110 bis -18; Exon 5 besteht aus Nucleotiden der Nummern -17 bis 103; Exon 6 besteht aus Nucleotiden der Nummern 104 bis 249; Exon 7 besteht aus Nucleotiden der Nummern 250 bis 279; Exon 8 besteht aus Nucleotiden der Nummer 280 bis 348; Exon 9 besteht aus Nucleotiden der Nummer 349 bis 449 und Exon 10 besteht aus Nucleotiden der Nummern 450 bis 733.
Ein Diagramm der Hydrophilität (hydrophilicity plot) wurde für das Fhit-Protein erstellt und ist in 6 gezeigt.
Diese FHIT-cDNA sowie die passenden Sequenzen aus der EST-Datenbank wurden translatiert und Aminosäuresequenzen (2A) der offenen Leserahmen (ORF) mit den Protein-Datenbanken verglichen. Der längste EST in der 5'-Richtung war R50713 (der eine Sequenz enthielt, die am 3'-Ende von Exon 7, Exon 8 und Exon 9 von FHIT gefunden wird). Der längste EST in der 3'-Richtung war R11128 (der eine Sequenz enthält, die zur Hälfte in Exon 2 und in Exons 3-6 gefunden wird). EST R53187 erstreckte sich über den längsten Bereich von Sequenzen, die der FHIT-cDNA entsprechen, einschließlich 297 Nucleotiden, die identisch zu der FHIT cDNA-Sequenz von Exon 2 bis zu einem Teil von Exon 5 sind. Unter den besten Treffern in der Datenbank, herausgeholt durch Computersuchen, war diese 297 Nucleotidsequenz das längste Stück, das identisch mit der cDNA-Sequenz von FHIT war. Das nächst längste identische Stück wurde in EST 11128 gefunden, das 287 identische Nucleotide zu der FHIT cDNA-Sequenz aufwies, beginnend innerhalb von Exon 2 bis 3 Basen vor das Ende von Exon 6. Ein Ausdruck der Nucleotidsequenz von R50713, ausgerichtet an der cDNA-Sequenz von FHIT (cDNA 7F1) und der Nucleotidsequenz R11128, ist in 7 gezeigt. Wie bemerkt werden wird, erstreckt sich weder die Nucleotidsequenz von R53187 noch die von R11128 oder irgendeine der zahlreichen anderen EST-Sequenzen über die vollständige codierende Region des Fhit-Proteins. Auch die Translationen der Sequenzen von R50713 und R11128 in allen drei Leserahmen und in beiden Richtungen sind in 8 bzw. 9 gezeigt und aus keiner der in 8 oder 9 gezeigten translatierten Sequenzen kann die Sequenz des Fhit-Proteins abgeleitet werden.
Die vollständige cDNA-Sonde von FHIT wurde dann an Northern-Blots hybridisiert, die mRNA aus einem Spektrum von Geweben trugen. Wie in 3A gezeigt, wies die cDNA das ubiquitär exprimierte 1.1-kb Transcript nach.
Beziehung zwischen der cDNA und der Genomkarte der Region
Oligonucleotid-Primer aus dem anfangs erfassten Exon wurden verwendet, um Intronsequenzen aus Cosmid 76 zu erzeugen; diese Sequenzen wurden wiederum verwendet, um Primer und Sonden herzustellen, um das Exon (E5 in 1A) auf den Cosmiden, YACs und DNA aus Krebszelllinien mit Deletionen zu kartieren, wie in 1A illustriert. Unter Verwendung von cDNA als Templat wurden dann Oligonucleotidprimerpaare, die die Exons stromaufwärts und stromabwärts von Exon 5 umklammerten, verwendet, um cDNA-Fragmente zu amplifizieren, die als Sonden für die Kartierung der 5'- und 3'-flankierenden Exons auf dem Cosmid-Contig dienen sollten; diese Sonden bewiesen, dass die cDNA-Sequenzen 5' und 3' von Exon 5 sich nicht in dem Cosmid-Contig 648D4 befanden, das die homozygoten Deletionen abdeckte. Deshalb wurden Cosmid-Bibliotheken aus den YACs 850A6 und 750F1, die sich zentromerisch bzw. telomerisch zu den Deletionen der fragilen Region erstrecken, wie in 1A gezeigt, hergestellt und mit den 5' und 3' cDNA-Sonden, die Exon 5 flankieren, gescreent. Cosmide, die die übrigen Exons enthalten, wurden dann verwendet, um Intronsequenzen unter Verwendung von cDNA-Primern zu gewinnen, und die Struktur des Gens wurde bestimmt, wie in 1A gezeigt. Die cDNA bestand aus 10 Exons, die zwischen 3 YAC-Klonen (1A) verteilt waren; Exons 1 bis 4 wurden erfasst auf YAC-Klon 850A6, Exon 5 war in allen drei YAC-Klonen vorhanden, und Exons 6 bis 10 wurden auf YAC-Klon 750F1 erfasst. Nur Exon 5 fiel in die Region der homozygoten Deletion bei aus Tumor stammenden Zelllinien, d.h. innerhalb von YAC-Klon 648D4. Der codierende Bereich des ORF begann in Exon 5 und endete in Exon 9, wie in 2A und 2B im Detail gezeigt.
Interessanterweise wurden die ersten drei Exons (E1, E2 und E3) des Gens zentromerisch zu dem t(3;8)-Bruch, zwischen dem t(3;8)-Bruch und dem 5'-Ende des PTPRG-Gens kartiert, wie bestimmt durch Amplifikation von diesen Exons aus den YAC-DNAs und DNAs, die aus Hybriden gewonnen wurden, und Teile von Chromosom 3, stammend aus dem t(3;8)-Bruch und einem FRA3B-Bruch, tragen (Daten nicht gezeigt). Somit wurde dieses Gen ein überzeugender Kandidat für eine Beteiligung bei der Initiierung von familiärem RCCs, weil eine Kopie des Gens durch die Translokation zerstört wird.
Die Homologiesuche in Aminosäuresequenz-Datenbanken zeigte eine signifikante Homologie zu einer Gruppe von Proteinen, die ein Histidin-Triade-Motiv aufweisen, benannt als HIT-Proteine (Seraphin, 1992, J. DNA Sequencing & Mapping 3:177-179). Die vorhergesagte Aminosäuresequenz der cDNA für das humane Gen, benannt als fragiles Histidin-Triade (Fragile Histidine Triad) -Gen oder FHIT-Gen, ist in 4A im Vergleich zu den anderen Mitgliedern der HIT-Familie gezeigt. Die höchste Homologie des Fhit-Proteins (~50% Identität) besteht zu den Diadenosin-Hydrolasen (aph1s) von Hefe, in 4A als PAPH1 und CAPH1 gezeigt, die in S. pombe bzw. S. cerevisiae identifiziert wurden (Huang et al., 1995, Biochem. J. 312:925-932). Eine Anordnung der Hefe (S. pombe) Ap4A-Hydrolase (PAPH1) Sequenz (U32615) mit FHIT (cDNA 7F1) ist in 10A gezeigt. Es besteht keine extensive Homologie. Als eine Suche nach homologen Abschnitten zwischen der Hydrolase aus Hefe und den FHIT-Nucleotidsequenzen, mit dem Computer ausgeführt wurde, war das Ergebnis ein kleiner Bereich von Nucleotid-Homologie, gezeigt in 10B. Die Konsensussequenz für die Proteine der HIT-Familie ist unter den Aminosäuresequenzen in 4A gezeigt.
Kurz zusammengefasst, das FHIT-Gen, das das verwandte humane Gen zu dem Hydrolasegen Ap₄A aus Hefe sein kann, erstreckt sich über einen Bereich von > 500 kbp, der t(3;8), FRA3B und eine Tumorzell-spezifische, gewöhnlich deletierte, Region beinhaltet.
Expression des FHIT-Gens
Der Locus BE758-6 und Mikrosatelliten-Marker D3S1300 wurden innerhalb der Region platziert, die in einer Vielzahl von Zelllinien, die aus Tumor stammen, häufig fehlt. Die LOH-Untersuchung (LOH study) von Magen- und Dickdarmtumoren wies eine große Häufigkeit allelischer Deletion in der Region zwischen t(3;8) und dem D3S1234-Locus nach, an der oft D3S1300 beteiligt war (siehe 1A). Also legte die Lokalisierung der Loci von sowohl BE758-6 als auch D3S1300 innerhalb des Locus des FHIT-Gens, nahe zu dem ersten codierenden Exon, Exon 5, nahe, dass das FHIT-Gen das Ziel für eine Deletion in unkultivierten Tumoren sowie aus Tumor stammenden Zelllinien war. Um eine Analyse der FHIT-Transcripte in Zellen zu beginnen, die aus Tumor stammen, wurden mRNAs aus normalen Geweben und von Zelllinien, die aus Tumor stammen, durch Northern-Analyse untersucht.
Poly A⁺-RNA aus normalen Geweben und eine Anzahl von Zelllinien, die aus NPC-, Dickdarm- und Magentumor stammten, mit und ohne offensichtlichen Deletionen in der fragilen Region, wurden auf Hybridisierung an die FHIT-cDNA in Northern-Blots getestet (3A und B).
Ein niedriger Expressionslevel des FHIT-Gens trat in allen getesteten humanen Geweben auf, wie in 3A für Milz, Thymus, Prostata, Hoden, Eierstock, Dünndarm, Dickdarm und periphere Blutlymphozyten gezeigt. Das Haupttranscript war ~1,1 kb mit einem längeren Transcript von ~5 kb, das kaum nachweisbar war und in einigen Blots nicht nachgewiesen werden konnte. Da das 1,1 kb-Transcript mit der Größe der vollständigen cDNA übereinstimmt, könnte das längere Transcript eine Vorläufer-RNA darstellen, die nicht vollständig prozessiert ist. Ähnliche Transcripte wurden in mRNA aus Hirn, Herz, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Bauchspeicheldrüse beobachtet, wobei die mutmaßlich unprozessierte RNA in Lunge, Dünndarm und Dickdarm in einigen Northern-Blots häufiger aufzutreten schien.
mRNAs von aus Tumor stammenden Zelllinien mit bekannten homozygoten Deletionen in der fragilen Region zeigten verschiedene FHIT-Transcriptlevel (3B), von kaum nachweisbar (3B, Spuren 2-4, KatoIII, HKI- bzw. LoVo-mRNA) bis zu einem nahezu normalen Level (Spur 8, LS180) im Vergleich zu normaler mRNA aus Dünndarm (Spur 1).
Zu beachten ist, dass die NPC-Zelllinien mit (CNE2, HK1; 3B, Spuren 5, 3) und ohne (CNE1; 3B, Spur 6) belegten homozygoten Deletionen, FHIT-mRNA kaum nachweisbar exprimierten. Die aus NPC stammende Zelllinie CNE2 zeigte ein mögliches kleineres Transcript (3B, Spur 5), während Colo320, eine aus einem kolorektalen Karzinom stammende Zelllinie ohne eine Deletion, ein offenbar normal großes FHIT-Transcript zeigte (3B, Spur 7), obwohl beachtet werden sollte, dass die Größe allein das Vorhandensein eines Wildtyp-Transcripts nicht impliziert. Die ~1,1 kb-Banden könnten Transcripte beherbergen, denen ein oder mehr kleine Exons fehlen, da mehrere Exons sehr klein sind, z.B. Exon 7, 30 Nucleotide, Exon 2, 49 Nucleotide, Exon 3, 53 Nucleotide. Eine Folgerung aus der Northern-Analyse ist, das es keine direkte Beziehung zwischen der Häufigkeit des Auftretens oder der Größe eines Transcripts und dem Nachweis von homozygoten Deletionen in spezifischen aus Tumor stammenden Zelllinien gibt, was nahe legt, dass es in einigen Tumorzelllinien kleine Deletionen geben kann, die mit den vorhandenen Markern nicht nachgewiesen worden sind.
RT-PCR und cDNA-Sequenzanalyse von aus Tumor stammender mRNA
Um nach Abnormitäten in FHIT-Transcripten aus deletierten und nicht-deletierten Tumorzelllinien zu suchen, wurden mRNAs mit (dT)₁₇-Primer revers-Transcribiert, die cDNA mit 5'- und 3'-Primern amplifiziert und dann unter Verwendung von Primern innerhalb der Originalprimer ("Nested-PCR") erneut amplifiziert (reamplified), wie bei den Methoden beschrieben. Die Positionen der Primer sind in 2A gezeigt. Die amplifizierten Produkte wurden auf Agarosegelen getrennt und Fragmente mit anomaler und normaler Größe wurden aus den Gelen ausgeschnitten und sequenziert (Beispiele für anomale Banden sind in 3C für mRNAs von unkultivierten Tumoren gezeigt; RT-PCR-Produkte aus den Tumorzelllinien waren sehr ähnlich). Die aus Tumor stammenden Zelllinien zeigten Produktmuster, die von nur einem amplifizierten Transcript mit offenbar normaler Größe bis zu zahlreichen anomalen Banden ohne eine Bande mit normaler Größe reichten. Einige aus Tumor stammende Zelllinien zeigten sowohl eine Bande mit offenbar normaler Größe als auch eine oder mehr anomale Banden. Die Sequenzierung der anomalen Banden brachte zahlreiche abnorme Produkte zum Vorschein, von denen einige Beispiele in 1B illustriert sind. Aus Dickdarmtumor stammende Zelllinien CCL235 und CCL234 zeigten keine Deletion für die getesteten STS-Marker, aber beide zeigten anomalen Transcripte, wie dargestellt, wobei CCL235 zusätzlich ein Produkt mit normaler Größe zeigt. Beide Zelllinien, HT29 und KatoIII, zeigten eine homozygote Deletion, aber die KatoIII-Zelllinie zeigte eine Deletion des telomerischen Teils der homozygot deletierten Region und nicht von der Region, die Exons 4 und 5 enthält, und auch nicht von der Region von Exon 6, Exons, die in dem anomalen Produkt der RT-PCR alle fehlen, wie in 1B illustriert. Zahlreiche andere aus Tumor stammende Zelllinien zeigten auch anomale RT-PCR-Produkte, ähnlich zu denen, die schematisch in 1B gezeigt sind (Daten nicht gezeigt). Detaillierte Beschreibungen von ähnlichen anomalen Produkten aus unkultivierten Tumoren (3C) sind in Tabelle 2 und 2B angegeben.
Zehn Fälle unkultivierter Speiseröhren-, neun von Magen- und acht von Dickdarmtumoren wurden analysiert, und anomale Transcripte wurden in 5, 5 bzw. 3 Fällen beobachtet (zusammengefasst in Tabellen 2 und 3 und illustriert in 2B).
Die Sequenzanalysen der anomalen cDNAs brachten die Abwesenheit von verschiedenen Regionen zwischen den Exons 4 und 9 (Tabelle 3 und 2B) zum Vorschein, während die RT-PCR und cDNA-Sequenzanalysen von mRNAs aus normalem Gewebe der gleichen Organe keine Änderungen der Sequenz des codierenden Bereichs zeigten (Tabelle 2, E3, E12, E113, E37, J1, J4, J9, 9625, 5586, 9575). In 8 von 13 Fällen mit anomalen Transcripten wurden auch Transcripte mit normaler Größe beobachtet (3C; E3, E12, E13, E37, 9625, 9575, J7 und J9; E12 und 9575, nicht gezeigt), während in 5 von 13 Fällen keine normal großen Transcripte nachgewiesen wurden (3C, J3, J4), oder kaum nachgewiesen wurden (3C, E32, 5586, J1). In den meisten der anomalen Transcripte stimmte der Anfang und das Ende der deletierten Teile des Transcripts mit Spleißstellen überein (2B), was nahe legt, dass die cDNA-Deletionen aus dem Verlust von genomischen Regionen, die die betreffenden verlorenen FHIT-Exons enthalten oder umgeben, resultieren. Die anomalen Transcripte können in zwei Gruppen (Klasse I und II, 2B) eingeteilt werden: Transcripten der Klasse I fehlt Exon 5, das das Methionin-Initiationscodon des FHIT-ORF aufweist, was zum Verlust des ORF führt; Transcripte der Klasse II haben ein intaktes Methionin-Initiationscodon aber beinhalten nicht Exon 8, mit Ausnahme von 9575b, das eine Leserahmenverschiebung nach Exon 6 zeigte. Somit ist in allen Transcripten der Klasse II der Wildtyp-ORF von Exon 8, die Histidin-Triade enthaltende Domäne, nicht vorhanden. Des Weiteren zeigten einige der Klasse II-Transcripte nur den Verlust von Exon 8 (2B; E3, E12a, 9625a, 9575a, J9a), was nahe legt, dass Exon 8 das Ziel für die Deletion war. Da Exon 8 für das Histidin-Triade-Motiv codiert, ist es wahrscheinlich, dass weder Transcripte der Klasse 2 noch der Klasse II, die den Hauptanteil der anomalen Transcripte ausmachen, ein vollständig funktionales Protein codieren können. Jedoch gibt es in Exon 6 ein Methionin (Met)-Codon im Leserahmen (siehe 2B) und in einigen Fällen tragen Insertionen ein Met im Leserahmen bei (nicht gezeigt); somit konnte die Mehrzahl der anomalen Transcripte für Teilproteine mit oder ohne HIT-Domäne codieren, wie in Tabelle 3 angegeben. In einigen Transcripten wurden Insertionen mit verschiedenen Längen von DNA, die nicht aus dem FHIT-Gen stammt, beobachtet; Insertionen wurden nur stromabwärts von Exon 4 gefunden (Tabelle 3, 5586a, 5586b, 9625, J3, J4). Eine kleine Gruppe von anomalen Transcripten behielt intakte Volllängen-ORFs, ihnen fehlte aber Exon 4 (Tabelle 3, J1a) oder sie hatten eine 72 bp Insertion einer DNA-Sequenz in dem 5'-untranslatierten Bereich zwischen Exon 4 und 5 (Tabelle 3, E37a und 1B). Es ist möglich, dass derartige Insertionen die Translation des ORF beeinträchtigen.
Um zu bestimmen, ob die Wildtyp FHIT-cDNA und verschiedene aus Tumor-spezifischen Transcripten stammende cDNAs, die den gesamten codierenden Bereich behielten, in vitro translatiert werden konnten, wurden mehrere rekombinante Plasmide konstruiert, von denen jedes ein FHIT-Gen stromabwärts von dem T7-Promotor enthielt und denen das erste nicht-codierende Exon fehlte. Das Plasmid pFHIT1 trug eine anomale cDNA, der Exon 4 fehlt, aus der Dickdarmzelllinie CCL234. Plasmid pFHIT2 trug eine cDNA aus Speiseröhrentumor E37 mit einer 72 bp Insertion zwischen Exon 4 und Exon 5. Das Plasmid pFHIT3 enthielt ein Wildtyp FHIT-Gen, dem Exon 1 fehlt. Die Konstrukte wurden für die in vitro Translation durch Kaninchen-Retikulozyten-Lysat verwendet. Die Analyse der Translationsprodukte (4B) zeigte das vorhergesagte 16,8 kDa Protein, das von jedem cDNA-Konstrukt translatiert wurde.
Das Fhit-Protein
Die aus der FHIT-cDNA vorhergesagte Proteinsequenz ist sehr ähnlich (57/109 identische Aminosäuren; 76/109 oder 69% Ähnlichkeit, wie berechnet durch den NCBI BLAST Server) zu der Diadenosin 5', 5'''-P¹, P⁴-Tetraphosphathydrolase, aph1, aus S. pombe (Huang et al., 1995, Biochem. J. 312:925-932), wie in der Aminosäureanordnung in 4A gezeigt, bei der PAPH1 die S. pombe Sequenz darstellt.
Das Enzym aph1 von S. pombe wurde kloniert durch Reinigung des Enzyms, Aminosäuresequenzierung des N-Terminus und dem Entwurf von Primern, um eine partielle cDNA zu amplifizieren; die vollständige genomische und eine cDNA von 1,2 kbp wurden dann kloniert, sequenziert und translatiert (Huang et al. 1995, Biochem. J. 312:925-932). Durch ähnliche Verfahren ist eine humane Hydrolase (APH1) kloniert, sequenziert und translatiert worden (Thorne et al., 1995, Biochem. J. 311:717-721) und, überraschenderweise, gleicht sie weder dem aph1-Gen von S. pombe noch dem FHIT-Gen. Da höhere Eukaryonten eine einzelne 16-21 kDa asymmetrisch Pyrophosphohydrolase Ap₄A zu besitzen scheinen (zitiert in Thorne et al., 1995, Biochem. J. 311:717-721), ist es somit nicht klar, ob das FHIT-Gen ein humanes APH1-Enzym ist, obwohl es ein zu dem Enzym aph1 von S. pombe verwandtes humanes Enzym sein kann.
Das FHIT-Gen ist auch sehr ähnlich zu dem aph1-Genprodukt von S. cerevisiae (CAPH1 in 4A) mit 40% Identität und 62% Ähnlichkeit in den 50 Aminosäuren zwischen den Aminosäuren 49 und 102 der Aminosäuresequenz von FHIT und einer höheren Ähnlichkeit in der HIT-Domäne. Die anderen Proteine oder hypothetischen Proteine in 4A sind alle Mitglieder dieser HIT-Genfamilie, einer in Prokaryonten, Hefe und Säugetieren vorhandenen Familie von Proteinen, die von Seraphin, 1992, DNA Sequencing & Mapping 3:177-179 beschrieben wurde. Das Kennzeichen der Familie ist die Histidin-Triade (am häufigsten HVHVH, Aminosäuren 94-98 des Fhit-Proteins, 4A), für die im Falle von BHIT (4A), dem Hemmer der Proteinkinase C aus Rind (PKCI1), gezeigt wurde, eine Zinkbindungsstelle zu sein (Pearson et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:4583-4591; Mozier et al., 1991, FEBS 279:14-18). Das Fhit-Proteinprodukt ist dem PKCI1-Protein aus Rind nur zu 39% ähnlich, über die Aminosäuren 12-100 von Fhit, wie berechnet durch NCBI BLAST. Somit ist es nicht wahrscheinlich, dass das FHIT-Gen das humane PKCI1-Gen ist. Die Funktionen der anderen HIT-Gene sind bis jetzt nicht bekannt. Des Weiteren sind die strukturellen Eigenschaften der Familienmitglieder nicht ausführlich untersucht worden. Das PKCI1-Protein hat einen vorhergesagten Gehalt von 23% α-Helix und 42% β-Konformation (31% β-Faltblatt und 11% β-Schleifen) (Pearson et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:4583-4591); für die konservierte Region, einschließlich der Histidin-Triade und dem Bereich stromaufwärts, wurde vorhergesagt, vorwiegend eine alternierende Konformation aus Knäuel-Konformation (Random Coil) und β Faltblatt einzunehmen, mit der HIT-Domäne als β-Faltblatt. Diese Konformation kann in dem Fhit-Protein konserviert sein. Auch besteht die HIT-Domäne aus basischen und hydrophoben Aminosäuren und es kann vermutet werden, dass sie im Inneren des Proteins verborgen ist, wie für das PKCI1-Protein vorgeschlagen (Pearson et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:4583-4591).
6.2. DISKUSSION
Die Bedeutung der fragilen Stellen für Krebs gab seit Jahren Anlass zur Spekulation und die beinahe Übereinstimmung der chromosomalen Position von FRA3B und der Translokation t(3;8) bei 3p14.2 war besonders faszinierend. FRA3B ist konstitutiv; d.h., nach der Behandlung von peripheren Blutlymphozyten mit ~0,4 μM Aphidicolin, das die Wirkung der DNA-Polymerase a stört, werden die charakteristischen Lücken in der Chromosomenregion 3p14.2 in ~70% der Metaphasen aller Individuen beobachtet. Somit ist die strukturelle Grundlage für die Induktion von Lücken in allen Individuen vorhanden. Es ist auch bekannt, dass innerhalb der Bande 3p14.2 einige der induzierten Lücken Chromosomenbrüche darstellen, die möglicherweise an mehreren Stellen in einer ~200-300 Kilobasenregion des Chromatins erfolgen (Paradee et al., 1995, Genomics 27:358-361). Somit können die Sequenzen, die an Lücken und Brüchen beteiligt sind, bei mehr als einer Stelle innerhalb der fragilen Region auftreten. Bei anderen fragilen Stellen, wie z.B. den Folat-sensitiven fragilen Stellen FRAXA, FRAXE, FRAXF, auf X scheint die strukturelle Grundlage für die Lücken die variable Länge der CCG oder CGG Triplett-Wiederholungen (triplet repeats) zu sein und unvollkommene Wiederholungen sind stabiler als perfekte Wiederholungen (Chung et al., 1993, Nature Genet. 5:254-258); diese fragilen Stellen scheinen einzelne Stellen von Fragilität zu sein. Möglicherweise scheint FRA3B die häufigste fragile Stelle zu sein, weil sie eigentlich eine Sammlung von unterschiedlichen fragilen Stellen in einer kleinen chromosomalen Region darstellt. Die spezifischen für die Brüche bei FRA3B verantwortlichen Sequenzen in Hybridzellen sind nicht beschrieben worden, aber es wurde beobachtet, dass viele aus Tumor stammende Zelllinien offensichtliche diskontinuierliche homozygote Deletionen zeigen. Die Beziehung zwischen den verschiedenen Arten von Chromosomenbrüchen bei 3p14.2 und der Organisation des FHIT-Gens in Bezug auf die Brüche ist in 5 graphisch dargestellt. Zu beachten ist, dass in 5 die Chromosomenbrüche und Deletionen in den aus Magenkarzinom stammenden Zellen KatoIII, den codierenden Bereich intakt lassen, aber nur anomale FHIT-Transcripte in dieser Zelllinie beobachtet wurden. Somit müssen für das Fehlen einer normalen Transcription in KatoIII und anderen Tumorzellen chromosomale Abnormitäten verantwortlich sein, die nicht offensichtlich sind; eine Möglichkeit ist, dass in KatoIII zwei FHIT-Allele mit hemizygoten Änderungen in den nicht-homozygot deletierten Teilen der FHIT-Gene vorhanden sind. Eine weitere Möglichkeit ist, dass eine Änderung in Nähe zu einem Exon, das Spleißen beeinträchtigt. Zusätzlich zeigten einige aus Krebs stammende Zelllinien und unkultivierte Tumoren Transcripte mit Änderungen in nicht-codierenden Regionen des FHIT-Transcripts. Diese Transcripte wurden in einem gekoppelten System unter Verwendung eines Retikulozyten-Lysats für die Translation (4B) in vollständige Proteine Transcribiert und translatiert, aber vielleicht könnte in den Tumorzellen aus denen sie stammen, das Fehlen von Exon 4 oder die Insertion von neuen Sequenzen die Expression des Fhit-Proteins beeinträchtigen. Ein weiteres Rätsel ist das Vorhandensein von normal großen Transcripten zusammen mit anomalen Produkten bei den Produkten der RT-PCR Amplifikation der aus Tumor stammenden Zelllinien, wie z.B. CCL235 (Dickdarm), A549 (Lunge) und HeLa (zervikal), falls das FHIT-Gen als ein klassisches Supressorgen mit Inaktivierung von beiden Allelen wirkt. Es ist möglich, dass die anomalen Transcripte, die in den meisten Fällen für partielle Fhit-Proteine codieren könnten, mit der Funktion von einem normalen Fhit-Protein interferieren könnten. Die normal großen Produkte aus diesen Zelllinien sind bisher nicht vollständig sequenziert, und somit ist es möglich, dass sie in der Tat nicht die normalen Transcripte darstellen. Eine Anzahl der unkultivierten Tumore zeigte auch anomale und normal große Produkte und die Sequenzierung zeigte, dass einige von diesen normal großen Produkten tatsächlich Wildtyp-Produkte waren. In diesen Fällen können die normalen Transcripte aus untergemischten normalen Zellen stammen.
Bis jetzt wurden keine Punktmutationen in der codierenden Region von irgendeinem FHIT-Transcript beobachtet, was möglicherweise nahe legt, dass anomale FHIT-Gene gewöhnlich das Ergebnis von Deletionen sind.
Aphidicolin, das die Wirkung der DNA-Polymerase a hemmt, induziert die Lücken und Brüche, die in der Region FRA3B bei normalen Metaphasen beobachtet werden; somit könnten bei den Tumoren des Verdauungstrakts und den Tumorzelllinien, die untersucht wurden, die genomischen Deletionen, die zu einer anomalen Transcription und Verlust von funktionellem Fhit-Protein führen, induziert worden sein, indem diese Organe anderen Mitteln ausgesetzt waren, die mit der DNA-Replikation interferieren, wie z.B. Nikotin, Koffein, möglicherweise Alkohol und andere bekannte Karzinogene. Interessanterweise ist Zinkmangel bei Mensch (Yang, 1980, Cancer Res. 40:2633-2644) und Ratte (Fong et al. 1978, J. Natl. Cancer Inst. 61:145-150) mit großer Häufigkeit verbunden mit Speiseröhrentumoren; Zinkmangel kann die Proliferation der epithelialen Zellen, die die Speiseröhre auskleiden, hervorrufen (Yang et al., 1987, J. Natl. Cancer Inst. 79:1241-1246), somit ahmt Zinkmangel vielleicht den Verlust des Fhit-Proteins, das gebundenes Zink für seine Funktion benötigen kann, nach. Es ist deshalb interessant, das Exon 8 des FHIT-Gens, das das HIT-Motiv trägt, die vermutete Zinkbindungsstelle, ein Deletionsziel in zahlreichen Tumoren des Verdauungstrakts ist.
Ob diese Region von 3p14.2 wiederholte CCG oder CGG Triplets enthält oder nicht ist bisher nicht bekannt; aber weil es Unterschiede zwischen den seltenen geerbten Folat-sensitiven fragilen Stellen, die charakterisiert worden sind, und den allgemeinen, konstitutiven, fragilen Aphidicolin-Stellen gibt, sollte möglicherweise eine unterschiedliche Grundlage für die Fragilität erwartet werden. Bis jetzt wurde festgestellt, dass es viele Alu-Wiederholungen (Alu-repeats) in dem telomerischen Teil der fragilen Region gibt (nicht gezeigt) und es eine (TAA)₁₅-Wiederholung in derselben, gewöhnlich deletierten, Region gibt, für die die Anzahl der Wiederholungen äußerst variabel ist. Vielleicht existieren andere Triplett-Wiederholungen dieses Typs in der Region. Auch wurden bei 9 Kilobasenpaaren von sequenzierten Teilen des Cosmids S8 (telomerischer Teil der fragilen Region, siehe 1A) mehrere Alu-Wiederholungen und ein LINE-Element entdeckt. Der Nucleotidgehalt der sequenzierten Region betrug 57,4% A- und T-Reste, während der Nucleotidgehalt der FHIT-cDNA 48% A und T betrug. Ein hoher Gehalt an A und T ist charakteristisch für einige charakterisierte DNA-Replikationsursprünge, besonders in Hefe und, in der Tat, obwohl Replikationsursprünge höherer Eukaryonten nicht identifiziert worden sind, ist spekuliert worden, dass Alu-Wiederholungen mit der Replikation zusammenhängen können. Eine weitere bemerkenswerte Eigenschaft des FHIT-Gens selbst ist, dass nahezu alle Exons mit der Sequenz AG enden, die übliche Sequenz für Spleißakzeptor-Stellen. Basierend auf der Beobachtung von häufigem anomalen Spleißen in dieser fragilen Region, ist es verlockend zu spekulieren, dass die Region besonders reich an Sequenzen ist, die Spleißakzeptor-Stellen gleichen.
Interessanterweise wurde früher eine homozygote Deletion in L-Zellen aus Maus beobachtet, an der mehrere N-terminale Exons des Maus-Ptprg-Gens beteiligt sind (Wary et al., 1993, Cancer Res. 53:1498-1502), und Pathak et al. (1995, Cancer Genet. Cytogenet. 83:172-173) haben gezeigt, dass Maus Dickdarm- und Brusttumoren sowie Melanome Abnormitäten in der proximalen Region von Mauschromosom 14 haben, wo sich die Loci von Ptprg (Wary et al., 1993, Cancer Res. 53:1498-1502) und wahrscheinlich FHIT befinden.
Untersuchungen von RT-PCR-Produkten des FHIT-Gens aus RNA von zahlreichen Zelllinien legen nahe, dass Abnormitäten im FHIT-Gen nicht nur wichtig bei Tumoren der Atemwege und des Verdauungstrakts, wie z.B. Nasopharynx-, Speiseröhren-, Magen- und kolorektalen Karzinomen sein könnte, sondern möglicherweise auch bei Eierstock-, zervikalen und Lungentumoren, Osteosarkom und einigen Leukämien; auch eine Blasen- und Brustkarzinomzelllinie zeigten homozygote Deletionen in der fragilen Region (Lisitsyn et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:151-155; und unsere Daten). Somit sollten unkultivierte Tumoren von diesen Arten auf Abnormitäten des FHIT-Gens getestet werden.
Für Klarzell-RCCs kann auch vermutet werden, dass Anomalien des FHIT-Gens beteiligt sind, weil das FHIT-Gen bei der familiären RCC durch einen Tanslokationsbruch bei 3p14.2 unterbrochen ist und die Translokations/FRA3B-Region das Ziel für allelischen Verlust bei den meisten sporadischen Klarzell-RRCs ist (Druck et al., 1995, Cancer Res. 55:5348-5355). Da der FHIT-ORF in Exons 5 bis 9 enthalten ist, bei der t(3;8)-Familie auf Chromosom 8 transloziert, ist es möglich, dass in einigen oder allen Geweben noch immer beide Allele exprimiert werden könnten; wenige Polymorphismen innerhalb des ORF wurden gefunden, aber bisher keiner, der die zwei allelischen Transcripte von FHIT bei lymphoblastoiden Zelllinien t(3;8) unterscheidet (Daten nicht gezeigt). Falls die Zerstörung des FHIT-Gens der erste "Schlag" gegen ein Suppressorgen in dieser Familie ist, dann sollte das zweite FHIT-Allel bei t(3;8)-Tumoren verändert sein. Da bis jetzt keine Punktmutationen im FHIT-Gen nachgewiesen wurden, wäre die beste Art nach Änderungen des FHIT-Gens bei t(3;8)-RCCs zu suchen, das reverse FHIT-Transcript zu amplifizieren, wie es für unkultivierte Tumoren in dieser Studie erfolgt ist. Dieses Experiment wurde für RNA aus zwei RCC-Zelllinien und zwei unkultivierte RCCs, alle aus sporadischen Tumoren, gemacht und Produkte mit normaler Größe wurden beobachtet, die bisher nicht kloniert und sequenziert worden sind. Homozygote Deletionen in RCCs wurden unter Verwendung einer Teilmenge der STS-Marker in der fragilen Region bisher auch noch nicht beobachtet. Nichtsdestotrotz wäre es überraschend, wenn das FHIT-Gen nicht bei einigen sporadischen RCCs beteiligt ist.
Da das FHIT-Gen wahrscheinlich ubiquitär exprimiert wird, wäre es nicht überraschend, wenn es als ein Tumorsuppressorgen für spezifische Gewebe von vielen unterschiedlichen Organen, offenbar vorwiegend des Verdauungstrakts, oder vielleicht vorwiegend Organe mit Schleimhäuten aus epithelialen Zellen, dienen kann. Ein weiterer gemeinsamer Nenner der Tumorarten, die anomale FHIT-Allele zeigen, könnte sein, dass sie vorwiegend in Organen auftreten, die Umweltkarzinogenen direkt ausgesetzt sind; einige der Tumorarten, die Anomalien des FHIT-Gens zeigen, treten sehr häufig in begrenzten Regionen der Erdkugel auf, NPC in China, Magenkrebs in Südostasien, und oft sind Umweltfaktoren mit im Spiel. Eine mögliche Rolle für EBV bei der Förderung von chinesischen NPCs könnte eine virale DNA-Integration in die Region FRA3B sein, nahe gelegt durch die früheren Experimente von Rassool et al. (1992, Am. J. Hum. Genet. 50:1243-1251), die offenbar eine bevorzugte Integration von exogener DNA in induzierte fragile Stellen bei kultivierten Zellen zeigen. Ebenso könnten humane Papillomaviren, die mit zervikalen Karzinomen in Zusammenhang stehen, die Induktion von FRA3B fördern und zu dem Verlust der Heterozygosität auf 3p bei Gebärmutterkrebs (Yokota et al., 1989, Cancer Res. 49:3598-3601) und möglicherweise zur Inaktivierung des FHIT-Gens beitragen. Möglicherweise erliegen die Mitglieder der t(3;8)-Familie, die ein unterbrochenes FHIT-Gen tragen, aufgrund von spezifischen Arten von Umweltmitteln, denen sie ausgesetzt sind, eher Nierentumoren als Dickdarm- oder Speiseröhrentumoren.
Eine starke Ähnlichkeit zwischen dem FHIT-Gen und den Ap₄A-Hydrolasen von S. pombe und S. cerevisiae wurde beobachtet. Spezifische Rollen für Diadenosin, Ap₄A, sind nicht festgelegt worden (Huang et al., 1995, Biochem. J. 312:925-932) und es ist nicht klar, dass die Ap₄A-Hydrolaseaktivität die einzige oder sogar die Hauptfunktion von diesen Proteinen in vivo ist. Die Expression der aph1 aus S. pombe in S. cerevisiae hemmte das Wachstum nicht, aber aus unbekannten Gründen wurde das Enzym aus S. pombe nicht mit einem hohen Level exprimiert (Huang et al., 1995, Biochem. J. 312:925-932). Sehr wenig ist über die Funktion der anderen Mitglieder der HIT-Familie bekannt. Falls das FHIT-Gen tatsächlich verwandt zu dem aph1-Gen von S. pombe ist, das als eine Ap₄A-Hydrolase identifiziert wurde, dann legt die starke Konservierung (69% Ähnlichkeit) zwischen dem Gen aus Hefe und Mensch wichtige Funktionen nahe. Einerlei ob das FHIT-Gen eine Ap₄A-Hydrolase codiert oder nicht, ist es wahrscheinlich, dass die Untersuchung der "Hydrolase-Knockouts" von S. pombe und S. cerevisiae und andere Arten von Mutationen für das Verständnis der Funktionen des Fhit-Proteins nützlich sein werden.
Es gibt einen gewissen Vorschlag, dass Ap₄A-Diadenosin die Fähigkeit der Zellen, sich an metabolischen Stress, wie z.B. Hitze, Oxidation und DNA-Schaden, anzupassen, als ein intrazelluläres Regulatormolekül steuern könnte.
6.3. MATERIAL UND METHODEN
Gewebe und Zelllinien
Passende normale und kanzerogene Gewebe aus Patienten mit primären Speisenröhren-, Dickdarm- und Magenkarzinomen wurden unmittelbar nach der Operation erhalten. Tumore wurden präpariert, um normales Gewebe vor der Präparation von DNA zu entfernen. Viele Zelllinien wurden von der ATCC erhalten. Die Nieren-Zelllinien RC wurden freundlicherweise von E. Lattime bereitgestellt.
RNA Extraktion und reverse Transcription
Gesamt- und Poly A⁺-mRNA wurde unter Verwendung des RNAzol-Kits (TelTest, Inc., Texas) bzw. des FastTrack-Kits (Invitrogen) aus Zelllinien und Geweben extrahiert. Um mRNA aus Geweben zu erhalten, wurden frische Proben unmittelbar nach dem Herausschneiden gefroren und bei –85°C oder in flüssigem Stickstoff bis zur Extraktion der mRNA gelagert. RNA wurde als Pellet unter Ethanol oder solubilisiert in RNAse-freiem Wasser und bei –70°C aufbewahrt. Reverse Transcription wurde durchgeführt in 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 2 μM dNTPs, 500 ng Oligo-dT, 600 Units MMLV-RT (BRL), 40 Units RNasin (Promega) und 2 μg RNA in einem Endvolumen von 30 μl. Dieser Reaktionsansatz wurde bei 37°C für 90 min inkubiert und für 5 min gesiedet.
DNA Sequenzanalyse
cDNA, genomische Klone und mutmaßliche Exons wurden sequenziert unter Verwendung von Primern, spezifisch für flankierende Sequenzen des Vektors (T3, T7 usw.) und verschiedene synthetische Oligonucleotide. Produkte der RT-PCR wurden nach der Isolierung von Banden aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (low melt agarose) und Reinigung durch Säulenchromatographie (Qiagen, Chatsworth, CA) direkt sequenziert. Die Sequenzierung von doppelsträngigen Plasmiden, PCR-Produkten und genomischen Klonen von Phagen oder Cosmiden wurde durchgeführt unter Verwendung von Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, Inc. (ABI)); die Reaktionsprodukte wurden einer Elektrophorese unterzogen und dokumentiert auf dem 373 oder 377 DNA-Sequenzer (ABI). Die Sequenzen wurden analysiert unter Verwendung von GCG, BLAST und GRAIL Software.
PCR-Amplifikation
Die Oligonucleotide zur Erzeugung von Sonden, PCR-Produkten und Produkten aus RT-PCR wurden entworfen unter Verwendung des Computerprogramms Oligo 4.0 (National Biosciences). Für Southern-Blots wurden Sonden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung verschiedener FHIT-spezifischer Primer hergestellt, wie bei den Ergebnissen angegeben. Sequenzen und Positionen für einige Primer sind in 2A gezeigt.
PCR-Reaktionen wurden ausgeführt in einem Endvolumen von 12,5 oder 25 μl mit 1-100 ng Templat, 20-40 ng Primern, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 0,1 mg/ml Gelatine, 15 mM MgCl₂, 200-600 mM dNTPs und 0,5-2,5 Units Taq-Polymerase (ABI). Die Amplifikationen wurden durchgeführt in einem Perkin-Elmer Cetus Thermocycler über 30 Zyklen: 94°C für 30 s (zur Denaturierung), 60°C (variiert für spezifische Primerpaare) für 30 s (zur Anhybridisierung) und Verlängerung bei 72°C für 30-45 s. Die PCR-Produkte wurden in mit Ethidiumbromid gefärbten Gelen aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt sichtbar gemacht. Die Banden der amplifizierten DNA wurden aus den Gelen ausgeschnitten und für die Markierung oder Sequenzierung gereinigt.
DNA-Präparation und Southern-Blot-Hybridisierung
Zelluläre DNAs wurden isoliert und Sourthern-Blots unter Verwendung üblicher Verfahren präpariert. Die Sonden wurden markiert durch Random-Priming mit [³²P]-dCTP (NEN) und in 0,75 M NaCl, 50% Formamid bei 42°C über Nacht an Membranen hybridisiert. Die letzten Waschungen der Membranen erfolgten in 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 65°C für 30 min. Hybridisierte Filter wurden auf XAR-2 Röntgenfilm (Kodak) mit Intensivierungsschirmen für eine Zeit aufgebracht, die zwischen 1 bis 72 h variierte.
Identifizierung von YACs
Wir und andere (Boldog et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8509-8513; Boldog et al., 1994, Genes Chrom. Cancer 11:216-221; Wilke et al., 1994, Genomics 22:319-326; Michaelis et al., 1995, Cancer Genet. Cytogenet. 81:1-12; Kastury et al., 1996, Genomics, in press) haben früher identifiziert, dass der Klon 850A6 aus der Genethon mega YAC-Bibliothek die Marker D3S1300 und D3S1481 enthält (Roche et al., 1994, Hum. Mol. Genet. 3:215). Überlappende YACs wurden identifiziert durch die Analyse der Information der Genethon Datenbank.
Identifizierung von Regions-spezifischen STSs
Eine Anzahl von STSs wurde erhältlich aus unserer Arbeit mit dem YAC 850A6. Der Marker A6URA war aus dem URA-Ende von 850A6, A3 war aus einem amplifizierten Fragment einer Alu-Vektorette von 850A6; die amplifizierten Fragmente BE758-6 und D3S1480 wurden als Sonden verwendet, um genomische Phagenklone auszuwählen, von deren Ende Sequenzen erhalten wurden und Sequenzen markiert wurden. Ein genomischer Phagenklon für D3S1300 wurde ausgewählt aus der Phagen-Bibliothek 850A6 und Endklon D1300E3 isoliert. Andere Primerpaare von Marker D3S und WI wurden erhalten von Research Genetics oder wurden synthetisiert aus Sequenzen, bereitgestellt von der WI Datenbank. Bei der Sequenzierung eines genomischen Phagensubklons aus dem YAC 648D4 wurde eine (TAA)₁₅ Trinucleotid-Wiederholung gefunden und als Locus ph13 benannt; der STS AP4/5 wurde abgeleitet aus einer partiellen Sequenzierung von einem Cosmid-Subklon von YAC 648D4.
"Cosmid-Mapping"
YAC mit hohem Molekulargewicht, enthaltend DNA von Hefe in Agaroseblöckchen (agarose plugs) wurde teilweise mit dem Enzym Sau3AI gespalten und in einen Cosmid-Vektor subkloniert. Diese Cosmid-Bibliothek wurde anfänglich gescreent mit DNA-Sonden, die aus STSs stammten, die früher dieser Region zugeordnet worden sind. Die Enden der Insert-DNAs, die den Cosmid-Vektor flankieren, wurden sequenziert, um neue STSs zu finden, die als Sonden verwendet wurden, um die Cosmid-Bibliotheken erneut zu screenen.
Exon Trapping und cDNA Klonierung
Die Cosmid-DNAs wurden teilweise mit Enzym Sau3AI gespalten, auf einem 1,0% Agarosegel laufen gelassen und Fragmente, größer als 2 kbp, wurden ausgeschnitten und in den Vektor pSPL subkloniert und in COS-7 Zellen transfiziert, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die zwischen den Spleißstellen des Vektors erfassten DNA-Inserte wurden durch einen mit dem Vektor mitgelieferten Primer sequenziert (GIBCO/BRL). Die cDNA wurde durch PCR-Amplifikation einer vollständigen humanen fötalen Hirn-cDNA unter Verwendung eines Exon-spezifischen Primers (X8, Nucleotide der Nummern -19 bis -41) und einem RACE Reaktions-Kit (Clontech) in der 5'-Richtung verlängert. Die normale Dickdarm cDNA-Bibliothek wurde von Clontech erworben.
FHIT "Exon-Mapping"
Die genomischen Sequenzen der Exon/Intron-Zusammenschlüsse des FHIT-Gens wurden bestimmt durch Sequenzierung der positiven Cosmide mit Primern, die aus der cDNA stammten. Die Lokalisierung von jedem Exon des FHIT-Gens wurde bestimmt durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern, die aus jedem Exon stammten, mit YAC-DNAs und Hybrid-DNAs von Chromosom 3 als Templaten. Die verwendeten Primersequenzen, um cDNA-Sonden zu erhalten, die Exon 5 flankieren, waren: 5'TCTGCTCTGTCCGGTCACR3' (SEQ ID NO:70) (Nuc.-Nr. -355 bis -337) mit Primer X8 (gezeigt in 2A) für 5' flankierende Exons; 5'ATGTCCTTGTGTGCCCGCT3' (SEQ ID NO:71) (Nuc.-Nr. 105 bis 123) mit 3D2 (siehe 2A) für 3' flankierende Exons.
Northern-Blot und Hybridisierung
Zwei μg an mRNAs wurden einer Elektrophorese in einem 1,5% Agarosegel in 2,2 M Formaldehyd und 1 × MOPS-Puffer unterzogen und auf eine positiv geladene Membran durch Standardverfahren überführt. Northern-Blot-Filter von vielen mRNAs aus normalem Gewebe wurden erworben (Clontech, Palo Alto, CA). Die FHIT cDNA-Sonde für die Hybridisierung wurde erhalten, indem FHIT-cDNA als Templat für die PCR-Amplifikation mit dem folgenden Primerpaar verwendet wurde: 5'TGAGGACATGTCGTTCAGATTTGG3¹ (SEQ ID NO:72), Nuc.-Nr. -7 bis 17; und 5'CTGTGTCACTGAAAGTAGACC3' (SEQ ID NO: 73), Nuc.-Nr. 449 bis 429. Die Sonden wurden durch "Random-Priming" mit [³²P]-dCTP markiert und 2 × 10⁶ cpm/ml wurden auf jeden Filter hybridisiert. Die Hybridisierungen erfolgten bei 42°C für 16 Stunden in SSPE-Puffer (5 × SSPE, 10 × Denhardt's Lösung, 0,1 mg/ml Träger-DNA, 50% Formamid, 2% SDS). Die letzten Waschungen erfolgten in 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C für 30 min vor dem Auflegen auf XAR-2 Filme (Kodak) mit Intensivierungsschirmen auf beiden Seiten bei –80°C.
"Nested RT-PCR" und Sequenzierung der cDNAs
Erststrang-cDNAs wurden synthetisiert und 1 μl von jedem Produkt wurde einer ersten Runde einer PCR-Amplifikation mit 30 Zyklen bei 95°C für 20 sec, 60°C für 30 sec und 72°C für 1 min mit 5% Dimethylsulfoxid und 0,5 mM Spermidin in einem Reaktionsvolumen von 10 μl unter Standardbedingungen und unter Verwendung der Primer 5U2 und 3D2, angegeben in 2A, unterzogen. Nach einer 20-fachen Verdünnung wurde 1 μl des Reaktionsprodukts einer zweiten Runde einer PCR-Amplifikation unter Verwendung der "Nested-Primer" 5U1 und 3D1 (gezeigt in 2A) unter den oben erwähnten Bedingungen unterzogen, mit der Ausnahme, dass das Reaktionsvolumen 30 μl betrug. Die PCR-Produkte wurden auf 1,5% Agarosegelen laufen gelassen, mit Ethidiumbromid gefärbt, gereinigt und 2,5 ng unter Verwendung des Primers 5U1 sequenziert.
In vitro Transcription und Translation
Drei unterschiedliche Fragmente von DNA, enthaltend das FHIT-Gen, wurden erhalten durch PCR unter Verwendung der Oligonucleotide UR5 (5'CTGTAAAGGTCCGTAGTG3' (SEQ ID NO:74), Nuc.-Nr. -171 bis -154 in 2A) und 06 (5'CTGTGTCACTGAAAGTAGACC3' (SEQ ID NO:75), dem reversen Komplement von Nuc.-Nr. 429-449). Die Amplifikationen wurden durchgeführt in 10 mM Tris-HCl (pH 8,9), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 200 μM Desoxynucleotidtriphosphaten, 10 ng Produkten aus RT-PCR und 2,5 U Taq-Polymerase in einem Endvolumen von 100 μl unter Verwendung eines Omni Gene Thermal Cycler. 25 PCR-Zyklen, bestehend aus 94°C 1 min, 52°C 1 min und einem Verlängerungsschritt bei 72°C 45 sec. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung des TA Klonierungssystems (Invitrogen) gesondert in Plasmid PCRII insertiert. Rekombinante Vektoren, enthaltend das normale FHIT-Gen und anomale Gene unter der Kontrolle des T7-Promotors, wurden sequenziert und für die in vitro Transcription und Translation verwendet.
Die in vitro Transcriptions- und Translationsreaktionen wurden durchgeführt mittels TnT gekoppelten Retikulozytensystemen (Promega) in einem Endvolumen von 50 μl, enthaltend 1/2 Volumen Kaninchen-Retikulozyten-Lysat, 1 μg rekombinate Plasmid-DNA, 10 U T7-Polymerase, 20 μM Aminosäuremischung ohne Methionin, 40 μM ³⁵S-Methionin (Amersham) und 40 U RNasin-Ribonucleaseinhibitor. Die Reaktionen wurden ausgeführt für 90 min bei 30°C. Die synthetisierten Proteine wurden analysiert durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Autoradiographie.
7. DAS FHIT-GEN BEI 3p14.2 IST ABNORM BEI LUNGENKREBS
Das FHIT-Gen wird durch die chromosomale Translokation t(3;8) unterbrochen, beobachtet in einer Familie mit Nierenzellkarzinom, und enthält die fragile Stelle FRA3B und das Ziel von homozygoten Deletionen in verschiedenen humanen Zelllinien, die aus Krebs stammen. Die Untersuchung in Abschnitt 6 hiervon zeigt an, dass Abnormitäten des FHIT-Gens oft bei primären Krebsarten des Verdauungstrakts auftreten.
Deletionen des kurzen Arms von Chromosom 3 treten mit einer sehr großen Häufigkeit und in frühen Phasen der Lungenkrebsentwicklung auf, was nahe legt, dass diese chromosomale Region entscheidende Gene für die Entwicklung von Lungenkrebs enthält. Das FHIT-Gen wurde isoliert, auf der chromosomalen Bande 3p14.2 lokalisiert und es wurde gefunden, dass es die fragile Stelle FRA3B enthält. Das Gen ist unterbrochen bei der Translokation t(3;8), beobachtet in einer Familie mit Nierenzellkarzinom, und liegt in einer Region, die allelische Verluste bei verschiedenen humanen Malignitäten zeigt. In dieser Studie, in Abschnitt 7 hiervon, wurde die Rolle des FHIT-Gens in Krebsarten analysiert, die in Verbindung gebracht werden mit karzinogener Exposition, d.h., Lungenkrebs des Typs kleinzellig und nicht-kleinzellig. Die Analyse von 59 Tumoren und entsprechenden normalen Lungengeweben wurde durchgeführt mittels reverser Transcription des FHIT-Transcripts, gefolgt von PCR-Amplifikation und Sequenzierung der Produkte; allelische Verluste, die sich auf das Gen auswirken, wurden durch Analyse der Polymorphismen der Mikrosatelliten ausgewertet. Etwa 80% der kleinzelligen Lungentumoren und 40% von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs zeigten Abnormitäten in RNA-Transcripten von FHIT und 88% der Tumoren zeigten einen Verlust von FHIT-Allelen. Abnormen Transcripten von Lungentumor fehlen zwei oder mehr Exons des FHIT-Gens. Alle Fälle, die abnorme Transcripte zeigen, wiesen auch den Verlust von einem Allel des FHIT-Gens auf. Die Ergebnisse zeigen Abnormitäten dieses Gens bei nahezu allen SCLC und bei einem hohen Anteil von NSCLC, was eine entscheidende Rolle für das FHIT-Gen bei Lungenkrebsentwicklung nahe legt.
7.1. ERGEBNISSE
RT-PCR und cDNA Sequenzanalyse
Kleinzelliger Lungenkrebs (SCLC)
Um Abnormitäten in FHIT-Transcripten aus Tumoren und normalen Geweben zu untersuchen, wurden mRNAs revers Transcribiert und cDNAs durch "Nested-PCR" amplifiziert, wie bei den Methoden beschrieben. Vierzehn primäre Tumorproben und eine Zelllinie (83L) wurden untersucht. In zwei Fällen wurde auch übereinstimmendes normales Lungenparenchym analysiert. Elf von den 14 durch RT-PCR analysierten Fällen (79%) zeigten das Vorhandensein von abnormen Transcripten (11). Die Analyse der aus den primären Tumoren amplifizierten Transcripte brachte durchweg das Vorhandensein von zwei abnormen Banden von ~360 bp (Typ I) und ~250 bp (Typ II) zum Vorschein. Sieben Fälle zeigten sowohl abnorme Transcripte des Typs I als auch II, wohingegen vier Fälle nur die Bande des Typs I zeigten. In zwei Proben (11A, Fall 107; 12A, Fall 45) sowie in der aus Tumor stammenden Zelllinie (12A, Fall 83L) war das Transcript mit normaler Größe nicht nachweisbar, während in den anderen neun Fällen eine normal große Bande mit variierender Intensität beobachtet wurde.
Bei einem Patienten (12A, Fall 83) wurde der primäre Tumor, eine aus Tumor stammende Zelllinie und eine normale Lungenprobe untersucht. Während bei der normalen Lunge nur das normale Transcript nachgewiesen wurde, zeigte der primäre Tumor abnorme Transcripte des Typs I und II zusammen mit einem normal großen Transcript und die aus Tumor stammende Zelllinie zeigte ein abnormes Transcript des Typs I und eine neue Bande von ~420 bp (12), die wahrscheinlich nach der in vitro Subkultivierung erzeugt wurde. Dementsprechend brachte die cytogenetische Analyse dieser Zelllinie eine umfangreiche chromosomale Instabilität zum Vorschein, die zu dem Vorhandensein von dizentrischen und trizentrischen Chromosomen, telomerischen Assoziationen und "Double-Minutes" führt. FISH-Analyse von Chromosom 3 mit einer einfärbenden Sonde (painting probe) zeigt das Auftreten von mehreren strukturellen Umlagerungen dieses Chromosoms, einschließlich einer Translokation des 3p-Arms mit einem Bruchpunkt bei 3p14-21 (Daten nicht gezeigt). Interessanterweise war das normal große Transcript in der Zelllinie nicht nachweisbar, was nahe legt, dass das normal große Produkt, das in dem primären Tumor beobachtet wurde, das Vorhandensein von normalen Zellen widerspiegelte, die die Tumorprobe unterwandert hatten.
Abnorme und normal große Banden wurden getrennt auf Agarosegel, zugeschnitten und squenziert (12B). Die Sequenzanalyse der anomalen Bande brachte zum Vorschein, dass das Typ I-Transcript der Abwesenheit von Exons 4 bis 6 (nt -111 bis 249) der FHIT-cDNA-Sequenz (GenBank Zugangs-Nr. u46922, wird noch vergeben) entsprach, resultierend in einem Zusammenschluss zwischen Exons 3 und 7 der FHIT-cDNA. Ein Verlust der Exons 4 bis 8 (nt -111 bis 348), resultierend in einer Fusion der Exons 3 und 9, wurde in dem Transcript des Typs II gefunden. In jedem anomalen Transcript stimmten die Fusionszusammenschlüsse mit Spleißstellen überein.
Die Sequenzanalyse der normal großen Banden brachte zum Vorschein, dass sie die normale FHIT-cDNA enthalten, was möglicherweise den Beitrag von normalen Zellen widerspiegelt, die die Tumorproben unterwandert haben.
Da beiden Typen von anomalen Transcripten Exon 5 fehlte, das das Methionin-Initiationscodon des offenen Leserahmens von FHIT (siehe Abschnitt 6) enthält, und Transcripten vom Typ II auch nahezu der gesamte codierende Bereich fehlte, einschließlich Exon 8, das das hoch-konservierte HIT-Motiv enthält (siehe Abschnitt 6), ist es wahrscheinlich, dass die Ergebnisse von diesen anomalen FusionsTranscripten zu dem Verlust der FHIT-Funktion führen würden.
Die Sequenzierung von normal großem RT-PCR-Produkt, amplifiziert aus normalen Geweben (Fälle 45 und 83), brachte das Vorhandensein des Wildtyp FHIT-Transcripts zum Vorschein.
Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC)
Die RNA aus 45 pirmären NSCLC-Tumoren und passenden normalen Lungenparenchym-Proben wurden ebenso untersucht; 18 von 45 Tumoren (40%) zeigten anomale RT-PCR-Produkte. Eine detaillierte Beschreibung von diesen Ergebnissen ist in Tabelle 4 zusammengefasst.
Die amplifizierten RT-PCR-Produkte aus den Transcripten, die in diesen Tumoren vorhanden sind, bestanden aus einer oder zwei abnormen Banden, immer begleitet von einem normal großen Transcript (13A). Alle passenden RNAs normaler Lunge aus den selben Lungenkrebsfällen zeigten nur das Vorhandensein des normalen Fhit-Produkts mit Ausnahme von einem Fall (Fall 3 in Tabelle 4), der ein anomales Produkt zeigt, das sich in der Größe von dem in dem entsprechenden Tumor beobachteten anomalen Produkt unterschied. Die Sequenzanalyse des anomalen Fragments brachte eine Reihe von RT-PCR-Produkten mit Verlusten von verschiedenen Exons aus 4 bis 9 zum Vorschein (Tabelle 4 und 13B), einschließlich einem RT-PCR-Produkt, den Exons 4 bis 8 fehlen, resultierend in einer Zusammenfügung der Exons 3 und 9 (nt -111 bis 348), Produkten, denen die Exons 4 bis 6 oder 7 fehlen, wodurch Exon 3 an Exon 7 bzw. 8 fusioniert wird, und Produkte, denen Exon 5 bis Exon 7 oder 8 fehlt, resultierend in Zusammenschlüssen zwischen Exons 4 und 8 bzw. Exons 4 und 9. Allen beobachteten Typen von abnormen Transcripten fehlte Exon 5, das erste codierende Exon, und die Hälfte (6/12) der abnormen Transcripte, charakterisiert durch Sequenzanalyse, zeigten auch den Verlust von Exon 8, das die HIT-Domäne enthält. Die Sequenzanalyse des normal großen Transcripts, amplifiziert aus RNA von normalem Gewebe dieser Patienten, brachte eine normale FHIT cDNA-Sequenz zum Vorschein. Eine kleine alternativ gespleißte Region am Anfang von Exon 10, von Nucleotid 450 bis 460, außerhalb des offenen Leserahmens des FHIT-Gens, wurde in dem normal großen Transcript beobachtet, das in dem Tumor und in dem entsprechenden normalen Gewebe von mehreren Patienten vorhanden war.
Analyse des Verlustes der Heterozygosität (LOH; loss of heterozygosity)
Um nach allelischen Verlusten in Tumorproben zu suchen, wurde ein auf PCR-basierender Ansatz unter Verwendung von Primern, die polymorphe Mikrosatelliten-Marker, interne und flankierende, des FHIT-Gens amplifizieren, verwendet. DNA aus Tumor und entsprechenden normalen Geweben aus 28 NSCLC und 7 SCLC Fällen wurde analysiert auf allelische Verluste bei Locus D3S4103 (ph 13) (siehe Abschnitt 6), intern zu dem FHIT-Gen, und bei Loci, lokalisiert in den flankierenden Regionen, zentromerisch (D3S1312 bei 3p14.2) (Druck et al., 1995, Cancer Res. 55:5348-5353) und telomerisch (D3S1234 bei 3p14.2 und D3S1313 bei 3p14.3) zu dem FHIT-Gen. (Siehe Tabelle 5).
In NSCLC Proben wurde LOH bei den Loci D3S4103 und D3S1234 in 17 von 21 aufschlussreichen Fällen (81%) gefunden. Die kombinierte Häufigkeit von Verlusten, die diese zwei Loci betrifft, betrug 88% (23/26 von den aufschlussreichen Fällen). Zehn von 13 (76%) und 9 von 11 (81%) Tumore zeigten auch LOH bei Locus D3S1312 bzw. bei Locus D3S1313, was auf eine große Deletion in dieser genomischen Region hindeutet. Bei den SCLC Fällen zeigten 3 von 4 aufschlussreichen Patienten LOH bei D3S4103 und D3S1234, und 4 von 5 aufschlussreichen Fällen hatten mindestens einen von diesen Loci verloren. Insgesamt zeigten 12 von 12 (100%) der aufschlussreichen Tumore, die abnorme FHIT-Transcripte zeigten, allelische Verluste bei einem oder mehr der getesteten Loci.
7.2. DISKUSSION
Von drei getrennten chromosomalen Regionen von 3p, die 3p25, 3p21.3-p21.2 und 3p12-p14.1 beinhalten, wird auf der Grundlage der großen Häufigkeit eines allelischen Verlusts bei primären Tumoren und festgestellten homozygoten Deletionen in aus Lungenkrebs stammenden Zelllinien angenommen (ein) Gen(e) zu beherbergen, das/die an Lungenkrebs beteiligt ist/sind; umfangreiche Bemühungen wurden gemacht, um eine kleine gemeinsame Region des Verlustes zu definieren, um Tumorsuppressorgene in diesen chromosomalen Regionen zu isolieren.
Deletionen von 3p stellen besonders nützliche genetische Marker dar, da mehrere Studien berichtet haben, dass sie in den frühen Phasen der Lungenkrebsentwicklung auftreten, wie z.B. bronchiale Dysplasie und Metaplasie (Sundaresan et al., 1992, Oncogene 7:1989-1997; Sozzi et al., 1991, Cancer Res. 51:400-404; Hung et al., 1995, JAMA 273:558-563). Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass der allelische Verlust auf Chromosom 3p in primärem SCLC einen Faktor für eine ungünstige Prognose darstellt (Horio et al., 1993, Cancer Res. 53:1-4).
Die hierin offenbarte Untersuchung beschreibt das Auftreten der Abnormitäten in Transcripten des FHIT-Gens, das bei 3p14.2 lokalisiert ist, bei mindestens 80% von SCLC und 40% von NSCLC, wobei 88% der Fälle auch den Verlust von einem FHIT-Allel zeigen. Da die "Nested RT-PCR" Amplifikation nur interne Änderungen bei den Transcripten des FHIT-Gens nachweisen würde, ist dies eine konservative Schätzung für die Beteilung des FHIT-Gens bei SCLC und NSCLC.
Den LungentumorTranscripten fehlten zwei oder mehr Exons des FHIT-Gens. Während in NSCLCs ein variierendes Muster von abnormen Transcripten nachgewiesen wurde, fehlten den amplifizierten Transcripten bei SCLCs entweder Exons 4 bis 6 oder Exons 4 bis 8. Beide Typen führen zum Verlust von Exon 5, das das Methionin-Initiationscodon (siehe Abschnitt 6) enthält, wobei der zweite Typ auch den Verlust von Exon 8 zeigt, das die hoch-konservierte HIT-Domäne (siehe Abschnitt 6) enthält. Die Folge des Verlusts von diesen Exons ist, dass kein Fhit-Protein im Leserahmen hergestellt werden konnte.
Zwei Fällen von primärer SCLC und einer Tumorzelllinie fehlte das normal große Transcript, das auch in den übrigen Fällen unterrepräsentiert war. Darüber hinaus zeigte ein primärer Tumor zwei abnorme Transcripte und ein normales Transcript, während ein normal großes Produkt aus der aus diesem Tumor etablierten Zelllinie nicht amplifiziert wurde. Diese Beobachtungen legen nahe, dass in der SCLC RNA das Wildtyp-Transcript von untergemischten normalen Zellen stammen könnte.
In RNAs aus NSCLCs waren die abnormen amplifizierten Produkte der RT-PCR manchmal weniger häufig als die normal großen amplifizierten Produkte der RT-PCR. Eine mögliche Erklärung könnte die heterogene, oft multifokale Natur von diesen Noeplasmen sein, die als eine Folge der chronischen Exposition des gesamten bronchialen "Felds" gegenüber Karzinogenen entstehen, resultierend in dem Vorhandensein von unterschiedlichen Zellklonen, die unterschiedliche genetische Veränderungen tragen (Kim et al., 1993, Am. J. Pathol. 142:307-317; Barsky et al., 1994, Mod. Pathol. 7:633-640; Ebina et al., 1994, Cancer Res. 54:2496-2503). Darüber hinaus enthielten die Tumorproben verschiedene Mengen an normalem stromalem Gewebe (es ist bekannt, dass stromale Unterwanderung in nicht-kleinzelligen Tumoren auftritt) (Rabbitts et al., 1989, Genes Chrom. Cancer 1:95-105). Der vollständige Allelverlust, der bei SCLC-Zelllinien und in mehreren primären SCLC-Proben beobachtet wird und das Fehlen eines vollständigen Verlustes von Allelen in NSCLC stützt diese Interpretation. Es ist auch möglich, dass die abnormen Transcripte weniger stabil als das Wildtypprodukt sind.
In dem korrespondierenden normalen Gewebe von Patienten, die abnorme TumorTranscripte zeigen, wurde ein normales Fhit-Produkt mittels PCR und Sequenzanalyse beobachtet.
Von besonderem Interesse war ein NSCLC Patient (Fall 3 aus Tabelle 4) mit einem mukoepidermoiden Karzinom der Lunge, der anschließend ein Nierenkarzinom entwickelte. In dem normalen Lungenparenchym dieses Patienten wurde ein abnormes Transcript nachgewiesen, dem Exons 4 bis 8 fehlen. Dieser Fund schafft die Möglichkeit, dass eine konstitutionale Änderung innerhalb des FHIT-Gens mit einer Prädisposition zur Entwicklung von sowohl Lungen- als auch Nierenkrebs oder anderen Arten von primären multiplen Tumoren verbunden sein könnte. Jedoch könnte diese Änderung somatisch erworben worden sein, weil die Karzinogenexposition Umwandlungen in mehreren Gebieten des bronchialen Epithels durch die Induktion von unterschiedlichen genetischen Änderungen induzieren kann, die auch in frühen präneoplastischen Läsionen nachweisbar sind.
Die große Häufigkeit (88%) des Verlustes von einem FHIT-Allel, beobachtet in Lungentumoren von sowohl kleinzelligem als auch nicht-kleinzelligem Typ, ist beachtenswert. Obwohl wir in unseren Fällen keine minimale Region für einen Verlust bestimmt haben, unterstützen diese Funde die Idee, dass die Inaktivierung des FHIT-Gens durch einen Mechanismus von Verlust des einen Allels und geänderter Expression des Verbleibenden erfolgt sein könnte.
Dieses Modell ist vereinbar mit der Beobachtung, dass das FHIT-Gen sich über eine weit verbreitete fragile Region, FRA3B, erstreckt, bei der Abnormitäten, wie z.B. Deletionen häufiger sein könnten als Punktmutationen. Tumoren, die mit Karzinogenexposition verbunden sind, wie z.B. Krebsarten des Atmenwegs/Verdauungs- (aerodigestive) Trakts könnten besonders empfänglich für Änderungen des FHIT-Gens sein. Aufgrund seiner Etiologie ist es wahrscheinlich, dass Lungenkrebs stark und direkt mit den Wirkungen von Mitteln, die mit der DNA-Replikation interferieren, wie z.B. Nikotin und Mutagene wie Benzo(a)pyren, enthalten in Zigarettenrauch, verbunden ist. Der Bruch in einer fragilen Stelle, die ein Gen enthält, als Folge von physikalischen, chemischen und biologischen Mitteln, kann somit erwartet werden. Die Expressivität der fragilen Stelle FRA3B in peripheren Blutlymphozyten von Patienten mit Krebs ist untersucht worden; die Expression von FRA3B schien durch gewohnheitsmäßiges Tabakrauchen beeinflusst zu sein und eine signifikant höhere Expression wurde bei Lungenkrebspatienten berichtet (Murata et al., 1992, Jpn. J. Hum. Genet. 37:205-213).
Hohe Level an intrazellulärem Diadenosin-5', 5'''-P1, P4-tetraphosphat (Ap4A) sind bei der G1-S Grenze nachgewiesen worden (Weinmann-Dorsch et al., 1984, Eur. J. Biochem. 138:179-185) und eine Rolle für Ap4A bei der Stimulation der DNA-Polymeraseaktivität ist vorgeschlagen worden (Baxi et al., 1994, Biochemistry 33:14601-14607). Es scheint einleuchtend, dass der Verlust der Funktion des FHIT-Gens zur konstitutiven Akkumulation von AP4A und zur Stimulation von DNA-Synthese und Proliferation führen könnte. Somit könnte der Verlust der FHIT-Funktion den malignen Prozess initiieren, indem die Proliferation der Zellen, die Vorläufer für Krebs des Verdauungstrakts und Lungenkrebs sind, stimuliert werden.
7.3. EXPERIMENTELLE VERFAHREN
Tumore
Die 59 Tumore, einschließlich 25 Fällen von Adenokarzinomen, 19 Plattenepithelkarzinomen, 1 mukoepidermoiden Karzinom und 14 kleinzelligen Bronchialkarzinomen, wurden erhalten aus operativ resektierten Lungenkrebspatienten beim Istituto Nazionale Tumori (Mailand, Italien). Eine Zelllinie (83L) wurde etabliert aus einem kleinzelligen Tumor (83T). Neunundzwanzig NSCLCs waren in Stadium I, 9 in Stadium II und 6 in Stadium III. Die Tumore wurden histologisch klassifiziert gemäß der histologischen Typisierung von Lungentumoren durch die Weltgesundheitsorganisation (1987) und eingeteilt gemäß der TNM Klassifikation für maligne Tumore, festgelegt durch die Internationale Union gegen Krebs (1987). Die meisten Fälle (54 aus 59) waren aus männlichen Patienten und das Durchschnittsalter der Fälle bei der Vorstellung war 63 Jahre. Passende Gewebeproben von normalem Lungenparenchym wurden an der von einem Tumor am weitesten entfernten Stelle oder in einem unterschiedlichen Abschnitt oder Lappen entnommen, als eine Quelle für die normale RNA und DNA.
RNA EXTRAKTION UND REVERSE TRANSCRIPTION
Tumor- und normale Proben wurden unmittelbar nach der operativen Resektion gefroren und bei –80°C gelagert. Gesamt-mRNA wurde unter Verwendung einer Guanidinium-LiCl Trennung (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) oder des RNA-STAT-Kits (Tel TEST, Inc., Texas) aus gefrorenem Tumor und normalem Lungengewebe extrahiert. cDNA wurde synthetisiert aus 1 μg Gesamt-RNA. Reverse Transcription wurde durchgeführt in einem Volumen von 20 μl von 1 × Erststrangpuffer (GIBCO), 10 mM DTT (GIBCO), 500 μM dNTPs, 50 ng/μl Oligo-dT, 0,3 μg/μl Random Primern, 16,5 U RNAsin (PROMEGA), 300 U Superscript II (GIBCO). Die Proben wurden zuerst für 5 min bei 95°C denaturiert und bei 37°C für 60 min inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt durch Inaktivierung des Enzyms bei 94°C für 5 min. Der Reaktionsansatz wurde auf 30 μl verdünnt und 1 μl wurde für die anschließende PCR-Amplifikation verwendet.
RT-PCR und cDNA Sequenzierung
1 μl der cDNA wurde verwendet für ein erste PCR-Amplifikation, durchgeführt in einem Volumen von 25 μl, enthaltend 0,8 μM Primer 5U2 und 3D2 (siehe Abschnitt 6), 50 μM von jedem dNTP (TAKARA), 1 × PCR-Puffer und 1,25 U Taq Polymerase (TAKARA). Die PCR-Reaktion bestand aus einer anfänglichen Denaturierung bei 95°C für 3 min und 25 Zyklen mit 15 sec bei 94°C, 30 sec bei 62°C und 45 sec bei 72°C und einer letzten Verlängerung von 5 min bei 72°C unter Verwendung eines Perkin Elmer PCR Thermocyclers. Das amplifizierte Produkt wurde 20-fach in TE-Puffer verdünnt und 1 μl des verdünnten Reaktionsprodukts wurde einer zweiten Runde von PCR-Amplifikation unter Verwendung von "Nested-Primern" 5U1 und 3D1 (siehe Abschnitt 6) für 30 Zyklen unter den vorstehenden Bedingungen unterworfen. Die PCR-Produkte wurden aufgetrennt auf 1,5% Metaphorgel (FMC), gefärbt mit Ethidiumbromid. Banden wurden aus Gelen geschnitten und DNA wurde unter Verwendung eines QIA Quick Gelextraktions-Kits (QIAGEN) gereinigt. 5-50 ng der cDNA, abhängig von der Größe der PCR-Produkte, wurden unter Verwendung der Primer 5U1 und 3D1 mittels Dideoxynucleotid-Terminationsreaktionschemie für Sequenzanalyse in den DNA-Sequenziersystemen von Applied Biosystems Modell 373A und 377 sequenziert.
LOH Analyse
DNAs aus gefrorenem Tumor und normalen Geweben wurden extrahiert unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual. Col Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Die Analyse von allelischen Verlusten wurde unter Verwendung eines PCR-basierten Ansatzes durchgeführt. Primer, die polymorphe Mikrosatelliten-Marker amplifizieren, wurden verwendet für die folgenden Loci: D3S4103 (ph13) (3p14.2) intern für das FHIT-Gen (siehe Abschnitt 6), D3S1234 (3p14.2), D3S1313 (3p14.3) und D3S1312 (3p14.2) flankieren das Gen. Die Sequenz von allen Oligonucleotidprimern wird über die Genomdatenbank erhältlich sein. Zwanzig Zyklen zur Amplifikation wurden bei einer Anhybridisierungstemperatur von 55°-60°C ausgeführt, wie geeignet für jeden Primer.
Für aufschlussreiche Fälle wurde der allelische Verlust gezählt, falls das autoradiographische Signal von einem Allel bei der Tumor-DNA etwa 50% reduziert war, im Vergleich zu dem entsprechenden normalen Allel. Die Loci, die Instabilität bei Mikrosatelliten zeigen, wurden für den allelischen Verlust nicht gezählt.
8. HINTERLEGUNG DER MIKROORGANISMEN
E. coli Stamm DH5α, der das Plasmid p7F1 trägt, enthaltend eine vollständige FHIT-cDNA als ein BamHI-XbaI Insert in dem pBluescript SK⁺-Vektor (Stratagene), wurde am 30. Januar 1996 bei der American Type Culture Collection, 1201 Parlawn Drive, Rockville, Maryland 20852, gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer 69977.
Die vorliegende Erfindung soll durch die hierin beschriebenen spezifischen Ausführungsformen in ihrem Umfang nicht limitiert werden. Tatsächlich werden verschiedene Modifikationen der Erfindung, zusätzlich zu jenen hierin beschriebenen, dem Fachmann aus der vorhergehenden Beschreibung und den begleitenden Figuren offenbar werden. Es ist beabsichtigt, dass derartige Modifikationen in den Umfang der angefügten Ansprüche fallen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte FHIT-Nucleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer Nucleinsäure mit weniger als 100 kb, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein Fhit-Protein codiert, das die in 2A (SEQ ID NO: 2) abgebildete Aminosäuresequenz hat; (b) einer Nucleinsäure, umfassend die FHIT codierende Sequenz, enthalten in Plasmid p7F1, wie bei der ATCC mit der bestimmten Zugangsnummer 69977 hinterlegt. (c) einer Nucleinsäure, die für ein Fhit-Protein codiert und an die FHIT DNA-Sequenz in Plasmid p7F1, wie bei der ATCC mit der bestimmten Zugangsnummer 69977 hinterlegt, unter hochstringenten Bedingungen, umfassend 50% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C, hybridisierbar ist, wobei das Fhit-Protein eine funktionelle Aktivität aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Fähigkeit, die Zellproliferation zu hemmen, der Fähigkeit, das Tumorwachstum zu hemmen, der Fähigkeit, an ein Substrat für Fhit zu binden, und Diadenosin-Hydrolase-Aktivität; (d) einer Nucleinsäure mit weniger als 100 kb, die an eine DNA mit einer Nucleotidsequenz, bestehend aus wenigstens Exon 6 oder Exon 7 der codierenden Region der SEQ ID NO: 1, unter stringenten Bedingungen, umfassend 50% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C, hybridisierbar ist; (e) einer Nucleinsäure, umfassend wenigstens 310 aufeinanderfolgende Nucleotide der FHIT cDNA-Sequenz der SEQ ID NO:1, wobei die Nucleinsäure aus weniger als 2000 Nucleotiden besteht und ferner wenigstens Exon 7 der SEQ ID NO: 1 umfasst; (f) einer Nucleinsäure mit weniger als 100 kb, umfassend wenigstens 266 aufeinanderfolgende Nucleotide der codierenden FHIT cDNA-Sequenz der SEQ ID NO: 1, und ferner wenigstens Exon 7 der SEQ ID NO: 1 umfasst; (g) einer Nucleinsäure mit weniger als 100 kb, umfassend: (1) die Nucleotidsequenz von einem oder mehr FHIT Exons, ausgewählt aus Exon 1, Exon 2, Exon 3 und Exon 4; und (2) die Nucleotidsequenz von einem oder mehr FHIT Exons, ausgewählt aus Exon 7, Exon 8 und Exon 9, wobei diese Exons ausgewählt werden aus der codierenden FHIT cDNA-Sequenz der SEQ ID NO: 1; (h) einer Nucleinsäure, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für wenigstens 10 aufeinanderfolgende Aminosäuren eines Fhit-Proteins codiert, wobei das Fhit-Protein die in 2A abgebildete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) hat und eine oder mehr funktionelle Aktivitäten des Fhit-Proteins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Fähigkeit, die Zellproliferation zu hemmen, der Fähigkeit, das Tumorwachstum zu hemmen, der Fähigkeit, an ein Substrat für Fhit zu binden, und Diadenosin-Hydrolase-Aktivität, zeigt; (i) einer Nucleinsäure, die für ein chimäres Protein codiert, umfassend wenigstens 10 aufeinanderfolgende Aminosäuren der Fhit Proteinsequenz, abgebildet in 2A (SEQ ID NO: 2), das über eine kovalente Bindung mit einer Aminosäuresequenz eines zweiten Proteins fusioniert ist, wobei das zweite Protein kein Fhit-Protein ist, und wobei das chimäre Protein eine oder mehr funktionelle Aktivitäten des Fhit-Proteins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Fähigkeit, die Zellproliferation zu hemmen, der Fähigkeit, das Tumorwachstum zu hemmen, der Fähigkeit, an ein Substrat für Fhit zu binden, und Diadenosin-Hydrolase-Aktivität, zeigt; (j) einer Nucleinsäure, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein Protein codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 70% Identität zu dem Fhit-Protein aufweist, das die in 2A (SEQ ID NO: 2) abgebildete Sequenz hat, wobei der Prozentsatz an Identität über eine Aminosäuresequenz von 147 Aminosäuren bestimmt wird, und wobei das Protein eine oder mehr funktionelle Aktivitäten eines Fhit-Proteins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Fähigkeit, die Zellproliferation zu hemmen, der Fähigkeit, das Tumorwachstum zu hemmen, der Fähigkeit, an ein Substrat für Fhit zu binden, und Diadenosin-Hydrolase-Aktivität, zeigt; (k) einer Nucleinsäure, umfassend die codierende Sequenz, die in Plasmid p7F1, wie bei der ATCC mit der bestimmten Zugangsnummer 69977 hinterlegt, enthalten ist.
Nucleinsäure aus Anspruch 1, die eine cDNA ist.
Isolierte Nucleinsäure, umfassend eine Nucleotidsequenz, die komplementär zu der Nucleotidsequenz aus Anspruch 1 ist.
Nucleinsäure aus Anspruch 1, der Introns des FHIT-Gens fehlen.
Nucleinsäure aus Anspruch 1, wobei das Fhit-Protein ein humanes Fhit-Protein ist.
Isoliertes RNA-Transcript der Nucleinsäure aus irgendeinem der Ansprüche 1-5.
Protein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem gereinigten Fhit-Protein mit der Aminosäuresequenz, die in 2A (SEQ ID NO: 2) abgebildet ist; (b) einem gereinigten Protein, das durch eine Nucleinsäure codiert wird, die unter hochstringenten Bedingungen an die FHIT DNA-Sequenz in Plasmid p7F1, wie bei der ATCC mit der bestimmten Zugangsnummer 69977 hinterlegt, hybridisierbar ist, wobei die Bedingungen 50% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C umfassen, und wobei das Protein eine funktionelle Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Fähigkeit, die Zellproliferation zu hemmen, der Fähigkeit, das Tumorwachstum zu hemmen, der Fähigkeit, an ein Substrat für Fhit zu binden, und Diadenosin-Hydrolase-Aktivität, aufweist; (c) einem gereinigten Protein, das durch eine Nucleinsäure codiert wird, die unter hochstringenten Bedingungen an eine DNA hybridisierbar ist, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die aus der codierenden Region der SEQ ID NO: 1 besteht, wobei die Bedingungen 50% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C umfassen, und wobei das Protein eine funktionelle Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Fähigkeit, die Zellproliferation zu hemmen, der Fähigkeit, das Tumorwachstum zu hemmen, der Fähigkeit, an ein Substrat für Fhit zu binden, und Diadenosin-Hydrolase-Aktivität, aufweist; (d) einem gereinigten Protein, das durch Plasmid p7F1, wie bei der ATCC mit der bestimmten Zugangsnummer 69977 hinterlegt, codiert wird; (e) einem gereinigten Protein, das wenigstens 10 aufeinanderfolgende Aminosäuren der Fhit Proteinsequenz, abgebildet in 2A (SEQ ID NO: 2), umfasst und eine oder mehr funktionelle Aktivitäten eines Fhit-Proteins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Fähigkeit, die Zellproliferation zu hemmen, der Fähigkeit, das Tumorwachstum zu hemmen, der Fähigkeit, an ein Substrat für Fhit zu binden, und Diadenosin-Hydrolase-Aktivität, zeigt; (f) einem Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz, die wenigstens 70% Identität zu dem Fhit-Protein aufweist, das die in 2A (SEQ ID NO: 2) abgebildete Aminosäuresequenz hat, wobei der Prozentsatz an Identität über eine Aminosäuresequenz von 147 Aminosäuren bestimmt wird, und wobei das Protein eine oder mehr funktionelle Aktivitäten eines Fhit-Proteins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Fähigkeit, die Zellproliferation zu hemmen, der Fähigkeit, das Tumorwachstum zu hemmen, der Fähigkeit, an ein Substrat für Fhit zu binden, und Diadenosin-Hydrolase-Aktivität, zeigt; (g) einem chimären Protein, umfassend wenigstens 10 aufeinanderfolgende Aminosäuren der Fhit Proteinsequenz, abgebildet in 2A (SEQ ID NO: 2), das über eine kovalente Bindung mit einer Aminosäuresequenz eines zweiten Proteins, das kein Fhit-Protein ist, fusioniert ist, wobei das chimäre Protein eine oder mehr funktionelle Aktivitäten eines Fhit-Proteins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Fähigkeit, die Zellproliferation zu hemmen, der Fähigkeit, das Tumorwachstum zu hemmen, der Fähigkeit, an ein Substrat für Fhit zu binden, und Diadenosin-Hydrolase-Aktivität, zeigt; und (h) einem Antikörper, der das Fhit-Protein, das die in 2A (SEQ ID NO: 2) abgebildete Aminosäuresequenz hat, bindet.
Rekombinante Zelle, enthaltend einen Nucleinsäurevektor, der die Nucleinsäure aus Anspruch 1 umfasst.
Zelle, enthaltend die rekombinante Nucleinsäure aus Anspruch 1.
Zelle aus Anspruch 9, wobei die rekombinante Nucleinsäure eine Nucleotidsequenz, die für ein Fhit-Protein, das die in 2A (SEQ ID NO: 2) abgebildete Aminosäuresequenz hat, codiert, und einen Promoter, der funktional mit der der Nucleotidsequenz verbunden ist, umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Fhit-Proteins, umfassend das Wachstum der rekombinanten Zelle aus Anspruch 8 oder 9, so dass das codierte Fhit-Protein von der Zelle exprimiert wird, und die Gewinnung des exprimierten Fhit-Proteins.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Nucleinsäure aus Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Protein aus Anspruch 7 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die rekombinante Zelle aus Anspruch 9 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Molekül, das die Fhit-Funktion zur Verwendung als Arzneimittel bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit oder Störung, die mit einer Chromosom 3p14.2-Mutation in einem Subjekt verbunden ist, fördert, wobei das Molekül ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Fhit-Protein, das die in 2A (SEQ ID NO: 2) abgebildete Aminosäuresequenz hat; (b) einer isolierten Nucleinsäure mit weniger als 100 kb, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein Fhit-Protein codiert, das die in 2A (SEQ ID NO: 2) abgebildete Aminosäuresequenz hat; und (c) einem Fragment eines Fhit-Proteins, bestehend aus wenigstens 10 Aminosäuren, das eine funktionelle Aktivität aufweist, die mit einem Fhit-Protein verbunden ist, wobei die funktionelle Aktivität ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Antigenität, Immunogenität, der Fähigkeit, die Zellproliferation zu hemmen, der Fähigkeit, das Tumorwachstum zu hemmen, der Fähigkeit, an ein Substrat für Fhit zu binden, der Fähigkeit, mit Fhit zu multimerisieren, und Diadenosin-Hydrolase-Aktivität.
Molekül nach Anspruch 15 zur Verwendung als Arzneimittel bei der Behandlung einer Krankheit oder Störung, die Zell-Überproliferation mit sich bringt.
Molekül nach Anspruch 16 zur Verwendung als Arzneimittel bei der Behandlung einer Krankheit oder Störung, die eine Malignität ist.
Molekül nach Anspruch 17 zur Verwendung als Arzneimittel bei der Behandlung einer Krankheit oder Störung, die eine Malignität des Verdauungstrakts ist.
Molekül nach Anspruch 17 zur Verwendung als Arzneimittel bei der Behandlung einer Krankheit oder Störung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Speiseröhrenkrebs, Magenkrebs, Nierenkarzinom, Blasenkrebs, Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Lungenkrebs, Melanom, Nasen-Rachen-Karzinom, Osteosarkom, Eierstockkrebs und Gebärmutterkrebs.
Molekül nach irgendeinem der Ansprüche 15-19 zur Verwendung als Arzneimittel bei der Behandlung eines humanen Subjekts.
Molekül nach Anspruch 16 zur Verwendung als Arzneimittel bei der Behandlung einer Krankheit oder Störung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus prämalignen Zuständen, benignen Tumoren, hyperproliferativen Störungen und benignen dysproliferativen Störungen.
Molekül, das spezifisch einer Mutante des FHIT-Gens in einem Subjekt entgegenwirkt, aber nicht einem Wildtyp FHIT-Gen, das die Sequenz der SEQ ID NO: 1 hat, entgegenwirkt, zur Verwendung als Arzneimittel bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit oder Störung, die Zell-Überproliferation in einem Subjekt mit einer hemizygoten FHIT-Muatation mit sich bringt, wobei das Molekül eine FHIT Antisense-Nukleinsäure ist, die spezifisch die Expression einer Mutante der FHIT-RNA hemmt.
Molekül nach Anspruch 22 zur gemeinsamen Verwendung mit einem Molekül, das die Fhit-Funktion fördert, wobei das Molekül, das die Fhit-Funktion fördert, ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Fhit-Protein, das die in 2A (SEQ ID NO: 2) abgebildete Aminosäuresequenz hat,; (b) einer isolierten Nucleinsäure mit weniger als 100 kb, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein Fhit-Protein codiert, das die in 2A (SEQ ID NO: 2) abgebildete Aminosäuresequenz hat; und (c) einem Fragment eines Fhit-Proteins, bestehend aus wenigstens 10 Aminosäuren, das eine funktionelle Aktivität aufweist, die mit einem Fhit-Protein verbunden ist, wobei die funktionelle Aktivität ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Antigenität, Immunogenität, der Fähigkeit, die Zellproliferation zu hemmen, der Fähigkeit, das Tumorwachstum zu hemmen, der Fähigkeit, an ein Substrat für Fhit zu binden, der Fähigkeit, mit Fhit zu multimerisieren, und Diadenosin-Hydrolase-Aktivität.
Molekül nach Anspruch 22, das ein Oligonucleotid ist, das: (a) aus wenigstens sechs Nucleotiden besteht; (b) eine Sequenz umfasst, die zu wenigstens sechs Nucleotiden eines RNA-Transcripts des FHIT-Gens komplementär ist, wobei das FHIT-Gen die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 hat; und (c) an das RNA-Transcript unter hochstringenten Bedingungen, umfassend 50% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C, hybridisierbar ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein isoliertes Oligonucleotid, das: (a) aus wenigstens sechs Nucleotiden besteht; (b) eine Sequenz umfasst, die zu wenigstens sechs Nucleotiden eines RNA-Transcripts des FHIT-Gens komplementär ist, wobei das FHIT-Gen die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 hat; und (c) an das RNA-Transcript unter hochstringenten Bedingungen, umfassend 50% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C, hybridisierbar ist; und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Protein, wie beschrieben in Anspruch 7, oder ein Molekül, wie beschrieben in Anspruch 15 oder 22, zur Verwendung als Arzneimittel.
Verfahren zur Hemmung der Expression einer Nucleinsäuresequenz, die für ein Fhit-Protein codiert, das die in 2A abgebildete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) hat, in einer Zelle, umfassend, der Zelle in vitro eine Nucleinsäure bereitzustellen, die wenigstens 10 Nucleotide umfasst, und ferner eine Sequenz umfasst, die spezifisch an ein RNA-Transcript eines FHIT-Gens hybridisierbar ist, wobei das FHIT-Gen die Sequenz von SEQ ID NO: 1 in der Zelle hat.
Verfahren zur Diagnose oder zum Screening für das Vorhandensein von, oder einer Prädisposition für die Entwicklung, einer Krankheit oder Störung, die Zell-Überproliferation in einem Subjekt mit sich bringt, umfassend das Nachweisen oder Messen des Levels von: (a) einem Fhit-Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2; (b) einer FHIT-RNA mit der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder deren Komplement; oder (c) einer funktionellen Aktivität von Fhit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Antigenität, Immunogenität, der Fähigkeit, die Zellproliferation zu hemmen, der Fähigkeit, das Tumorwachstum zu hemmen, der Fähigkeit, an ein Substrat für Fhit zu binden, der Fähigkeit, mit Fhit zu multimerisieren, und Diadenosin-Hydrolase-Aktivität; in einer Probe, die aus dem Subjekt stammt, wobei eine Abnahme des Levels an Fhit-Protein, FHIT-RNA oder funktioneller Aktivität von Fhit in der Probe, im Verhältnis zu dem Level an Fhit-Protein, FHIT-RNA oder funktioneller Aktivität von Fhit, der in einer entsprechenden Probe, die nicht die Krankheit oder Störung, oder eine Prädisposition für die Entwicklung der Krankheit oder Störung aufweist, gefunden wird, das Vorhandensein von, oder eine Prädisposition für die Entwicklung, der Krankheit oder Störung anzeigt.
Verfahren zur Diagnose oder zum Screening für das Vorhandensein von, oder einer Prädisposition für die Entwicklung, einer Krankheit oder Störung, die Zell-Überproliferation in einem Subjekt mit sich bringt, umfassend das Nachweisen von: (a) einer oder mehr Mutationen in der FHIT-DNA oder -RNA mit der abgebildeten Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 1, oder deren Komplement; oder (b) einer oder mehr Mutationen in einem Fhit-Protein mit der abgebildeten Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2; in einer Probe, die aus dem Subjekt stammt, wobei das Vorhandensein von der einen oder mehr Muatationen das Vorhandensein von, oder eine Prädisposition für die Entwicklung, der Krankheit oder Störung anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei eine Mutation in einem Exon der FHIT-DNA oder -RNA nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei eine Mutation in der codierenden Sequenz der FHIT-DNA oder -RNA nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Mutation eine Deletionsmutante der codierenden Sequenz von FHIT oder einem Teil derselben ist.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Mutation eine Deletionsmutante des Exons 5 von FHIT ist.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Mutation das Fehlen des offenen Leserahmens von Exon 8 des Wildtyps in der FHIT-RNA in dem Subjekt verursacht.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Mutation durch das Nachweisen des Vorhandendenseins einer FHIT-RNA mit abweichender Größe oder Sequenz im Vergleich zur Wildtyp FHIT-RNA nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei das Vorhandendensein der FHIT-RNA mit abweichender Größe oder Sequenz durch ein Verfahren nachgewiesen wird, das das reverse-Transcribieren der RNA aus dem Subjekt in cDNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei die cDNA einer Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Oligonucleotid-Primern unterworfen wird, wobei jeder Primer aus einer Nucleotidsequenz von 15-35 aufeinanderfolgenden Basen der SEQ ID NO: 1 oder deren Komplement besteht, und wobei die Primer angepasst sind, ein Fragment der Wildtyp FHIT-cDNA, umfassend Exon 5 von FHIT, zu amplifizieren.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei die cDNA einer Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Oligonucleotid-Primern unterworfen wird, wobei jeder Primer aus einer Nucleotidsequenz von 15-35 aufeinanderfolgenden Basen der SEQ ID NO: 1 oder deren Komplement besteht, und wobei die Primer angepasst sind, ein Fragment der Wildtyp FHIT-cDNA, umfassend FHIT Exon-Sequenzen zwischen dem 3'-Terminus des Exons 4 und Exon 8, zu amplifizieren.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 29-38, wobei das Subjekt ein humaner Fötus ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 29-38, wobei das Subjekt ein humanes Kind oder Erwachsener ist.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Mutation nachgewiesen wird durch ein Verfahren, umfassend: (a) Kontaktieren der RNA aus dem Subjekt, oder daraus hergestellter cDNA, mit einer Nucleinsäuresonde, die unter hochstringenten Bedingungen, umfassend 50% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C, spezifisch an FHIT-RNA oder -cDNA mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 hybridisiert; und (b) Nachweisen oder Messen der Menge von irgendeiner Hybridisierung zwischen der RNA oder cDNA und der Nucleinsäuresonde.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Mutation durch ein Verfahren nachgewiesen wird, das umfasst: die FHIT-RNA aus dem Subjekt einer in vitro Translation zu unterwerfen.
Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, wobei die Krankheit oder Störung eine Malignität des Verdauungstrakts ist.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Krankheit oder Störung Lungenkrebs ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Krankheit oder Störung Lungenkrebs ist.
Verfahren nach Anspruch 45, wobei die Krankheit oder Störung kleinzelliges Bronchialkarzinom (small cell lung carcinoma) ist.
Verfahren nach Anspruch 45, wobei die Krankheit oder Störung nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom ist.
Verfahren nach Anspruch 31, das ferner das Nachweisen des Verlustes von einem Allel des FHIT-Gens umfasst, und wobei die Krankheit oder Störung Lungenkrebs ist.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Mutation eine Deletion von zwei oder mehr Exons in der FHIT-DNA oder -RNA ist.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Mutation eine Deletion von wenigstens dem gesamten Exon 5 von FHIT ist.
Verfahren nach Anspruch 49, wobei die Mutation eine Deletion der Exons 4-6 von FHIT ist, die zu einer Fusion der Exon 3 Sequenzen mit den Exon 7 Sequenzen in der FHIT-RNA oder -cDNA führt.
Verfahren nach Anspruch 49, wobei die Mutation eine Deletion der Exons 4-8 von FHIT ist, die zu einer Fusion der Exon 3 Sequenzen mit den Exon 9 Sequenzen in der FHIT-RNA oder -cDNA führt.
Verfahren zur Beobachtung einer Krankheit, die Zell-Überproliferation in einem Subjekt mit sich bringt, umfassend das Nachweisen oder Messen der Menge von: (a) einer FHIT-RNA oder -cDNA mit der abgebildeten Sequenz SEQ ID NO: 1 oder deren Komplement; oder (b) einem Fhit-Protein mit der abgebildeten Sequenz SEQ ID NO: 2; in einer Probe, die aus dem Subjekt stammt, wobei eine Zunahme von Mutanten FHIT-RNA, -cDNA oder Proteinexpression, oder eine Abnahme oder der Verlust von Wildtyp FHIT-RNA, oder -cDNA oder Protein, im Vergleich zu der in einer Probe, die zu einem früheren Zeitpunkt aus dem Subjekt erhalten wurde, vorhandenen [Menge], ein Fortschreiten der Krankheit anzeigt.
Verfahren zum Nachweis einer Prädisposition bezüglich eines nachteiligen therapeutischen Ergebnisses, oder bezüglich des Wiederauftretens einer Störung, die Zell-Überproliferation in einem Subjekt mit sich bringt, umfassend das Nachweisen von einer oder mehr Mutationen in einem FHIT-Gen, wie abgebildet in SEQ ID NO: 1, in einer Probe, die aus dem Subjekt stammt.
Verfahren zum Auffinden eines Moleküls, das spezifisch an einen Liganden bindet, der ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: (1) einem Fhit-Protein mit der Aminosäuresequenz, die in 2A (SEQ ID NO: 2) abgebildet ist; (2) einem Fragment eines Fhit-Proteins, bestehend aus wenigstens 10 Aminosäuren, das eine funktionelle Aktivität aufweist, die mit einem Fhit-Protein verbunden ist, wobei die funktionelle Aktivität ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Antigenität, Immunogenität, der Fähigkeit, die Zellproliferation zu hemmen, der Fähigkeit, das Tumorwachstum zu hemmen, der Fähigkeit, an ein Substrat für Fhit zu binden, der Fähigkeit, mit Fhit zu multimerisieren, und Diadenosin-Hydrolase-Aktivität; und (3) einer Nucleinsäure, die für das Fhit-Protein gemäß (1) oder das Fragment gemäß (2) codiert, umfassend: (a) das Kontaktieren dieses Liganden mit einer Vielzahl von Molekülen unter Bedingungen, die der Bindung zwischen diesem Liganden und einem oder mehr der Moleküle dienlich sind; und (b) das Auffinden eines Moleküls innerhalb dieser Vielzahl, das spezifisch an diesen Liganden bindet.
Kit, der in einem oder mehr Behältern ein gereinigtes Molekül umfasst, das ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer Nucleinsäuresonde, die unter hochstringenten Bedingungen, umfassend 50% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C, spezifisch an eine Mutante eines FHIT-Gens oder -RNA hybridisiert, wobei das FHIT-Gen oder -RNA die Sequenz der SEQ ID NO: 1 hat; und (b) einer Nucleinsäure, codierend für: (i) ein Fhit-Protein mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wobei dieses Protein die Zell-Proliferation wirksam hemmt; oder (ii) ein Fragment eines Fhit-Proteins, umfassend wenigstens 10 Aminosäuren der SEQ ID NO: 2, wobei dieses Fragment die Zell-Proliferation wirksam hemmt.
Kit, der in einem oder mehr Behältern ein Primerpaar umfasst, wobei jeder Primer aus einer Nucleotidsequenz von 15-35 aufeinanderfolgenden Basen der SEQ ID NO: 1 oder deren Komplement besteht, und wobei die Primer fähig sind, die Amplifikation eines Fragments einer FHIT codierenden Sequenz der SEQ ID NO: 1 oder deren Komplement zu Stande zu bringen.
Kit nach Anspruch 57, wobei die Primer so angepasst sind, dass sie fähig sind, ein Fragment der Wildtyp FHIT-cDNA, umfassend Exon 5, zu amplifizieren.
Kit nach Anspruch 57, wobei die Primer so angepasst sind, dass sie fähig sind, ein Fragment der Wildtyp FHIT-cDNA, umfassend Exons 5 und 6, zu amplifizieren.
Kit nach Anspruch 57, wobei die Primer so angepasst sind, dass sie fähig sind, ein Fragment der Wildtyp FHIT-cDNA, umfassend Sequenzen zwischen dem 3'-Terminus des Exons 4 und Exon 8, zu amplifizieren.
Kit nach Anspruch 57, wobei die Primer so angepasst sind, dass sie fähig sind, ein Fragment der Wildtyp FHIT-cDNA, umfassend Exons 1 bis 10, zu amplifizieren.
Kit, der ein Fhit-Protein aus Anspruch 7, (a) bis (g), oder einen Antikörper, der an ein Fhit-Protein bindet, aus Anspruch 7(h), in einem Behälter umfasst.
Diagnostik-Kit, der in einem Behälter eine Verbindung umfasst, die eine Nucleinsäure von nicht mehr als 2000 Nucleotiden umfasst und wenigstens 10 Nucleotide der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder deren Komplement umfasst.
Diagnostik-Kit, der in einem oder mehr Behältern ein Primerpaar umfasst, wobei jeder Primer aus einer Nucleotidsequenz von 15-35 aufeinanderfolgenden Basen der SEQ ID NO: 1 oder deren Komplement besteht, und wobei die Primer an SEQ ID NO: 1 oder deren Komplement hybridisierbar sind, und wobei diese Primer fähig sind, die DNA-Synthese in einer Nucleinsäure-Amplifikationsreaktion zu Stande zu bringen.
Rekombinantes nicht-humanes Tier, das das Produkt eines Verfahrens ist, das das Einführen einer Nucleinsäure in das Tier umfasst, wobei die Nucleinsäure codiert für: (a) ein Fhit-Protein, das die in 2A (SEQ ID NO: 2) abgebildete Aminosäuresequenz hat; (b) einem Fragment eines Fhit-Proteins, bestehend aus wenigstens 10 Aminosäuren, wobei das Fragment eine funktionelle Aktivität aufweist, die mit einem Fhit-Protein verbunden ist, wobei die funktionelle Aktivität ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Antigenität, Immunogenität, der Fähigkeit, die Zellproliferation zu hemmen, der Fähigkeit, das Tumorwachstum zu hemmen, der Fähigkeit, an ein Substrat für Fhit zu binden, der Fähigkeit, mit Fhit zu multimerisieren, und Diadenosin-Hydrolase-Aktivität.
Nachkomme des Tiers aus Anspruch 65, wobei die Nucleinsäure vererbt in dessen Genom enthalten ist.
Plasmid p7F1, wie bei der ATCC unter der Zugangsnummer 69977 hinterlegt.
Isolierte FHIT-Nucleinsäure, wie in Anspruch 1 beansprucht, zur Verwendung als Arzneimittel.
Isolierte FHIT-Nucleinsäure, wie in Anspruch 68 zur Verwendung als Arzneimittel beansprucht, für die Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit oder Störung, die Zell-Überproliferation mit sich bringt.
Isolierte FHIT-Nucleinsäure, wie in Anspruch 1 beansprucht, die eine rekombinante oder synthetische Nucleinsäure ist.
Protein, wie in Anspruch 7 beansprucht, zur Verwendung als Arzneimittel.
Protein, wie in Anspruch 71 zur Verwendung als Arzneimittel beansprucht, für die Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit oder Störung, die Zell-Überproliferation mit sich bringt.
Protein, wie in Anspruch 7 beansprucht, das ein rekombinantes oder synthetisches Protein ist.