DE69535634T2

DE69535634T2 - Modulatoren der funktion des fas/ap01 rezeptors

Info

Publication number: DE69535634T2
Application number: DE69535634T
Authority: DE
Inventors: David Wallach; Mark Moscow BOLDIN; E.-Dep. Membrane Res. and Biophysics VARFOLOMEEV; Igor Mett
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1994-12-15
Filing date: 1995-12-14
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2015-12-15
Also published as: FI121273B; NO972716L; HK1007248A1; EP0871645A1; JP3787355B2; KR100536394B1; CA2207815C; EP0871645A4; CN1169729A; FI972457A0; NO972716D0; PT871645E; WO1996018641A1; CY2586B2; AU4602296A; FI972457A; ES2292172T3; NO324725B1; CA2207815A1; AU706401B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist allgemein im Gebiet der Rezeptoren, die zur TNF/NGF-Superfamilie von Rezeptoren gehören, und der Kontrolle ihrer biologischen Funktionen angesiedelt. Die TNF/NGF-Superfamilie von Rezeptoren umfasst Rezeptoren wie die p55- und p75-Tumornekrosefaktor-Rezeptoren (TNF-R) und den FAS-Liganden-Rezeptor (auch FAS/APO1 oder FAS-R genannt und wird im Folgenden FAS-R genannt) und andere. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Protein, das hier als MORT-1 (auch HF-1 genannt) bezeichnet wird, welches an die intrazelluläre Domäne (IC) des FAS-R bindet (diese intrazelluläre Domäne wird als FAS-IC bezeichnet), wobei dieses neue Protein in der Lage ist, die Funktion des FAS-R zu modulieren. Weiterhin ist MORT-1 auch zur Selbstassoziation in der Lage und kann von selbst zelluläre Cytotoxizität aktivieren. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Herstellung und die Verwendungen von MORT-1.
Es sollte angemerkt werden, dass HF-1 (die ursprüngliche Bezeichnung) und MORT-1 (die derzeit verwendete Bezeichnung) beide durchgängig innerhalb der Beschreibung verwendet werden und dasselbe Protein bezeichnen.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
Tumor-Nekrose-Faktor (TNF-α) und Lymphotoxin (TNF-β) (im Folgenden TNF, bezieht sich sowohl auf TNF-α als auch auf TNF-β) sind multifunktionelle proinflammatorische Cytokine, die hauptsächlich durch mononucleäre Phagocyten gebildet werden, welche viele Wirkungen auf Zellen haben (Wallach, D. (1986) in: Interferon 7 (Ion Gresser, Hrsg.), S. 83-122, Academic Press, London, und Beutler und Cerami (1987)). Sowohl TNF-α als auch TNF-β initiieren ihre Wirkungen durch Bindung an spezifische Zelloberflächenrezeptoren. Einige der Wirkungen sind wahrscheinlich für den Organismus von Vorteil: sie können zum Beispiel Tumorzellen oder Virus-infizierte Zellen zerstören und die antibakteriellen Aktivitäten von Granulocyten verstärken. Auf diese Weise trägt TNF zur Verteidigung des Organismus gegen Tumoren und Infektionserreger und zur Erholung nach Verletzung bei. Daher kann TNF als Antitumormittel verwendet werden, wobei es bei dieser Anwendung an Rezeptoren auf der Oberfläche von Tumorzellen bindet und dadurch die Ereignisse initiiert, die zum Tod der Tumorzellen führen. TNF kann auch als antiinfektiöses Mittel verwendet werden.
Sowohl TNF-α als auch TNF-β haben jedoch schädliche Wirkungen. Es gibt Hinweise darauf, dass die Überproduktion von TNF-α eine wesentliche pathogene Rolle bei einigen Erkrankungen spielen kann. Daher sind die Wirkungen von TNF-α primär auf das Gefäßsystem mittlerweile bekannt dafür, dass sie eine wesentliche Ursache für die Symptome des septischen Schocks sind (Tracey et al., 1986). Bei einigen Erkrankungen kann TNF einen starken Gewichtsverlust (Cachexie) durch Unterdrückung der Aktivitäten der Adipocyten und durch Auslösung von Anorexie verursachen und TNF-α wurde daher Cachetin genannt. Er wurde auch als Vermittler der Gewebeschädigung bei rheumatischen Erkrankungen beschrieben (Beutler und Cerami, 1987) und als ein wesentlicher Vermittler der Schädigungen, die bei Graftversus-Host-Reaktionen beobachtet werden (Piquet et al., 1987). Zusätzlich ist TNF bekannt dafür, dass er an Entzündungsprozessen und an vielen anderen Erkrankungen beteiligt ist.
Zwei unterschiedliche, unabhängig voneinander exprimierte Rezeptoren, die p55- und p75-TNF-R, welche sowohl TNF-α als auch TNF-β spezifisch binden, initiieren und/oder vermitteln die vorstehend erwähnten biologischen Wirkungen von TNF. Diese beiden Rezeptoren haben strukturell verschiedene intrazelluläre Domänen, was nahe legt, dass sie unterschiedlich signalisieren (vgl. Hohmann et al., 1989, Engelmann et al., 1990, Brockhaus et al., 1990, Leotscher et al., 1990, Schall et al., 1990, Nophar et al., 1990, Smith et al., 1990 und Heller et al., 1990). Die zellulären Mechanismen, zum Beispiel die verschiedenen Proteine und möglicherweise andere Faktoren, welche an der intrazellulären Signalisierung der p55- und p75-R beteiligt sind, müssen jedoch noch aufgeklärt werden (in PCT/US95/05854 und wie auch hierin nachstehend dargelegt wird, werden zum ersten Mal neue Proteine beschrieben, die in der Lage sind, an die p75IC und p55IC zu binden). Es ist diese intrazelluläre Signalisierung, welche üblicherweise nach der Bindung des Liganden, d. h. TNF (α oder β), an den Rezeptor, der für den Beginn der Reaktionskaskade verantwortlich ist, auftritt, die schließlich zu der beobachteten Antwort der Zelle auf TNF führt.
Was die vorstehend erwähnte zellzerstörende Wirkung von TNF betrifft, wird diese Wirkung in den meisten der bisher untersuchten Zellen hauptsächlich durch den p55-TNF-R ausgelöst. Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne (Ligandenbindungsdomäne) des p55-TNF-R können selbst die zellzerstörende Wirkung auslösen (vgl. EP 412486 ), welche mit der Effektivität von Rezeptor-Kreuzvernetzung durch die Antikörper korreliert, von der angenommen wird, das sie der erste Schritt zur Erzeugung des intrazellulären Signalisierungsprozesses ist. Weiterhin haben Mutationsuntersuchungen (Brakebusch et al., 1992, Tartaglia et al., 1993) gezeigt, dass die biologische Funktion des p55-TNF-R von der Integrität seiner intrazellulären Domäne abhängt und entsprechend wurde vorgeschlagen, dass die Initiierung der intrazellulären Signalisierung, die zu der zellzerstörenden Wirkung von TNF führt, als Folge der Assoziation von zwei oder mehr intrazellulären Domänen des p55-TNF-R führt. Außerdem tritt TNF (α und β) als Homotrimer auf und als solches wurde es dafür vorgeschlagen, die intrazelluläre Signalisierung über den p55-TNF-R durch seine Fähigkeit, an Rezeptormoleküle zu binden und diese quer zu vernetzen, d. h. Rezeptor-Aggregation zu verursachen, zu induzieren. In PCT/US95/05854 und auch hier nachstehend wird beschrieben, wie die p55IC und die p55DD selbst assoziieren und in einer ligandenunabhängigen Art und Weise TNF-assoziierte Wirkungen in Zellen zu induzieren können.
Ein anderes Mitglied der TNF/NGF-Superfamilie von Rezeptoren ist der FAS-Rezeptor (FAS-R), welcher auch das Fas-Antigen genannt wurde, ein Zelloberfiächenprotein, das in verschiedenen Geweben exprimiert wird und Homologie mit einer Anzahl von Zelloberflächenrezeptoren einschließlich TNF-R und NGF-R aufweist. Der FAS-R vermittelt Zelltod in Form von Apoptose (Itoh et al., 1991) und scheint als negativer Selektor autoreaktiver T-Zellen zu dienen, d. h. während der Reifung von T-Zellen vermittelt FAS-R den apoptotischen Zelltod von T-Zellen, welche Selbst-Antigene erkennen. Es wurde auch gefunden, dass Mutationen im FAS-R-Gen (Ipr) eine lymphoproliferative Erkrankung in Mäusen verursacht, die der menschlichen Autoimmunerkrankung systemischer Lupus erythematodes (SLE) ähnelt (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). Der Ligand für den FAS-R scheint ein Zelloberflächen-assoziiertes Molekül zu sein, das unter anderem von Killer-T-Zellen (oder cytotoxischen T-Lymphocyten – CTLs) getragen wird, und daher sind, wenn solche CTLs mit Zellen, die FAS-R tragen, in Kontakt kommen, sie in der Lage, einen apoptotischen Zelltod der FAS-R-tragenden Zellen zu induzieren. Weiterhin wurde ein monoclonaler Antikörper hergestellt, der spezifisch für FAS-R ist, wobei dieser monoclonale Antikörper in der Lage ist, apoptotischen Zelltod in FAS-R-tragenden Zellen, einschließlich Mauszellen, welche mit den menschlichen FAS-R codierender cDNA transformiert sind, zu induzieren (Itoh et al., 1991).
Es wurde ebenfalls herausgefunden, dass verschiedene andere normale Zellen außer T-Lymphocyten den FAS-R auf ihrer Oberfläche exprimieren und durch Stimulierung dieses Rezeptors abgetötet werden können. Es wird vermutet, dass die unkontrollierte Induktion eines solchen Abtötungsprozesses zur Gewebeschädigung bei verschiedenen Erkrankungen, zum Beispiel zur Zerstörung von Leberzellen bei der akuten Hepatitis, beitragen kann. Entsprechend kann das Finden von Wegen zur Unterdrückung der cytotoxischen Aktivität von FAS-R therapeutisches Potenzial haben.
Im Gegensatz dazu können, da ebenfalls herausgefunden wurde, dass bestimmte maligne Zellen und HIV-infizierte Zellen den FAS-R auf ihrer Oberfläche tragen, Antikörper gegen FAS-R oder der FAS-R-Ligand verwendet werden, um die durch FAS-R vermittelten cytotoxischen Wirkungen in diesen Zellen auszulösen und dadurch ein Mittel zur Bekämpfung solcher bösartigen Zellen oder HIV-infizierten Zellen bereitzustellen (vgl. Itoh et al., 1991). Das Finden von noch anderen Wegen zur Verstärkung der cytotoxischen Aktivität von FAS-R kann daher auch therapeutisches Potenzial haben.
Es ist seit langem als Notwenigkeit erachtet worden, einen Weg zur Modulation der zellulären Antwort auf TNF (α oder β) und FAS-R-Ligand bereitzustellen, zum Beispiel ist es in pathologischen Situationen, wie vorstehend erwähnt, in denen TNF oder FAS-R-Ligand überexprimiert wird, wünschenswert, die durch TNF- oder FAS-R-Ligand induzierten zellzerstörenden Wirkungen zu hemmen, während es in anderen Situationen, z. B. Wundheilungsanwendungen, wünschenswert ist, die TNF-Wirkung zu verstärken, oder es ist im Fall von FAS-R in Tumorzellen oder in HIV-infizierten Zellen wünschenswert, die durch FAS-R vermittelte Wirkung zu verstärken.
Einige Ansätze wurden von den Erfindern durchgeführt (vgl. zum Beispiel die europäischen Anmeldungen Nr. EP 186833 , EP 308378 , EP 398327 und EP 412486 ), um die zerstörerischen Wirkungen von TNF durch Hemmung der Bindung von TNF an seine Rezeptoren unter Verwendung von anti-TNF-Antikörpern oder durch Verwendung löslicher TNF-Rezeptoren (welche im Wesentlichen lösliche extrazelluläre Domänen der Rezeptoren sind), um mit der Bindung von TNF an die zelloberflächengebundenen TNF-R zu konkurrieren, zu regulieren. Weiterhin wurden von den Erfindern Ansätze auf der Basis, dass die TNF-Bindung an seine Rezeptoren für die durch TNF induzierten zellulären Wirkungen benötigt wird, durchgeführt (vgl. zum Beispiel IL 101769 und das entsprechende EP 568925 ), um die TNF-Wirkung durch Modulation der Aktivität der TNF-R zu modulieren. Kurz beschrieben betrifft EP 568925 ( IL 101769 ) ein Verfahren zur Modulation der Signaltransduktion und/oder der Spaltung in TNF-R, wobei Peptide oder andere Moleküle entweder mit dem Rezeptor selbst interagieren können oder mit Effektorproteinen, die mit dem Rezeptor interagieren, wodurch die normale Funktion von der TNF-R moduliert wird. In EP 568925 wird die Konstruktion und die Charakterisierung von verschiedenen mutierten p55-TNF-R mit Mutationen in den extrazellulären, transmembranen und intrazellulären Domänen des p55-TNF-R beschrieben. Auf diesem Weg wurden Regionen innerhalb der vorstehenden Domänen des p55-TNF-R als essenziell für das Funktionieren des Rezeptors, d. h. die Bindung des Liganden (TNF) und die nachfolgende Signaltransduktion und die intrazelluläre Signalisierung, welche schließlich zu den beobachteten TNF-Wirkungen auf die Zellen führt, identifiziert. Weiterhin werden auch einige Ansätze zur Isolierung und Identifizierung von Proteinen, Peptiden und anderen Faktoren beschrieben, welche in der Lage sind, an verschiedene Regionen in den vorstehenden Domänen des TNF-R zu binden, wobei die Proteine, Peptide und anderen Faktoren bei der Regulierung oder Modulation der Aktivität des TNF-R beteiligt sein können. Einige Ansätze zur Isolierung und Clonierung der solche Proteine oder Peptide codierenden DNA-Sequenzen, zur Konstruktion von Expressionsvektoren zur Herstellung dieser Proteine und Peptide und zur Erzeugung von Antikörpern oder Fragmenten davon, welche mit dem TNF-R oder mit den vorstehenden Proteinen und Peptiden, welche an verschiedene Regionen des TNF-R binden, interagieren, werden ebenfalls in EP 568925 dargelegt. EP 568925 spezifiziert jedoch weder die tatsächlichen Proteine und Peptide, welche an die intrazellulären Domänen der TNF-R (z. B. p55-TNF-R) binden, noch beschreibt es den Hefe-Zwei-Hybrid-Ansatz zur Isolierung und Identifizierung solcher Proteine oder Peptide, welche an die intrazellulären Domänen von TNF-R binden. Entsprechend gab es davor keine Offenbarung von Proteinen oder Peptiden, die in Lage sind, die intrazelluläre Domäne des FAS-R zu binden.
Daher wäre es wünschenswert, wenn es gewünscht wird, die Wirkung von TNF oder FAS-R-Ligand zu hemmen, die Menge oder die Aktivität von TNF-R oder FAS-R an der Zelloberfläche zu verringern, während eine Erhöhung der Menge oder der Aktivität von TNF-R oder FAS-R gewünscht würde, wenn eine verstärkte Wirkung von TNF oder FAS-R-Ligand gefragt ist. Dazu wurden die Promotoren von p55-TNF-R und p75-TNF-R sequenziert, analysiert und einige Schlüsselsequenzmotive wurden gefunden, die spezifisch für verschiedene Transkriptionsregulationsfaktoren sind und so kann die Expression dieser TNF-R auf der Ebene ihrer Promotoren kontrolliert werden, d. h. eine Hemmung der Transkription von den Promotoren für eine Verringerung der Zahl der Rezeptoren und eine Erhöhung der Transkription von den Promotoren für eine Erhöhung der Zahl der Rezeptoren (vgl. IL 104355 und IL 109633 ). Berichte über entsprechende Untersuchungen bezüglich der Kontrolle des FAS-R auf der Ebene des Promotors des FAS-R-Gens stehen noch aus.
Weiterhin sollte erwähnt werden, dass, während es bekannt ist, dass Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-Rezeptoren und der strukturell verwandte Rezeptor FAS-R in Zellen nach Stimulierung mit von Leukocyten produzierten Liganden zerstörerische Aktivitäten auslösen, die zu ihrem eigenen Tod führen, die Mechanismen dieses Auslösers noch kaum verstanden werden. Mutationsuntersuchungen weisen darauf hin, dass im FAS-R und im p55-TNF-Rezeptor (p55-R) an der Signalisierung, die zur Cytotoxizität führt, bestimmte Regionen innerhalb ihrer intrazellulären Domänen beteiligt sind (Brakebusch et al., 1992, Tartaglia et al., 1993, Itoh und Nagata, 1993). Diese Regionen (die „Todesdomänen") haben Sequenzähnlichkeiten. Die „Todesdomänen" von FAS-R und p55-R neigen zur Selbstassoziation. Ihre Selbstassoziation fördert offensichtlich jene Rezeptoraggregation, welche für die Initiation der Signalisierung notwendig ist (vgl. PCT/US95/05854 sowie Song et al., 1994, Wallach et al., 1994, Boldin et al., 1995) und bei hohem Niveau der Rezeptorexpression kann sie zur Auslösung einer ligandenunabhängigen Signalisierung führen ( PCT/US95/05854 und Boldin et al., 1995).
Daher wurden vor PCT/US95/05854 und vor der vorliegenden Erfindung keine Proteine bereitgestellt, welche die Wirkung von Liganden, die zur TNF/NGF-Superfamilie gehören, wie die Wirkung von TNF oder FAS-R-Ligand, auf Zellen durch Vermittlung des intrazellulären Signalisierungsprozesses regulieren können, wobei die Signalisierung wahrscheinlich zu einem großen Teil durch die intrazellulären Domänen (ICs) der Rezeptoren, die zur TNF/NGF-Superfamilie gehören, wie jene der TNF-R, d. h. die intrazellulären p55- und p75-TNF-R-Domänen (p55IC beziehungsweise p75IC), sowie FAS-IC reguliert wird.
Entsprechend ist es ein Ziel der Erfindung Proteine bereitzustellen, die MORT-1 oder Fragmente davon sind, welche in der Lage sind, an die intrazelluläre Domäne des FAS-R zu binden, wobei von den Proteinen derzeit angenommen wird, dass sie am intrazellulären Signalisierungsprozess, der durch Bindung von FAS-Ligand an seinen Rezeptor initiiert wird, beteiligt sind. Das erfindungsgemäße MORT-1-Protein oder Fragmente davon unterscheiden sich von den FAS-IC-bindenden Proteinen, die in früher erwähnten Anmeldungen beschrieben werden.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, Antagonisten (z. B. Antikörper) gegen diese FAS-IC-bindenden Moleküle bereitzustellen, die MORT-1 oder Fragmente davon sind, welche verwendet werden können, um den Signalisierungsprozess zu hemmen, wenn gewünscht, wenn solche FAS-IC-bindenden Proteine positive Signaleffektoren sind (d. h. sie induzieren Signalisierung), oder um den Signalisierungsprozess zu verstärken, wenn gewünscht, wenn solche FAS-IC-bindende Proteine negative Signaleffektoren sind (d. h. sie hemmen die Signalisierung).
Noch ein anderes Ziel der Erfindung ist es, solche MORT-1-Proteine oder Fragmente zu verwenden, um zusätzliche Proteine oder Faktoren zu isolieren und charakterisieren, welche zum Beispiel weiter stromabwärts am Signalisierungsprozess beteiligt sind, und/oder um andere Rezeptoren weiter stromaufwärts im Signalisierungsprozess zu isolieren und identifizieren, an welche diese MORT-1-Proteine, Analoge, Fragmente und Derivate binden (z. B. andere FAS-R oder verwandte Rezeptoren) und an deren Funktion sie daher auch beteiligt sind.
Außerdem ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, das vorstehend erwähnte MORT-1-Protein oder Fragmente als Antigene für die Präparation von polyclonalen und/oder monoclonalen Antikörpern dagegen zu verwenden. Die Antikörper wiederum können zum Beispiel zur Reinigung des neuen MORT-1-Proteins aus verschiedenen Quellen wie Zellextrakten oder transformierten Zelllinien verwendet werden.
Weiterhin können diese Antikörper zu diagnostischen Zwecken verwendet werden, z. B. zur Identifizierung von Erkrankungen, die mit dem abnormalen Funktionieren zellulärer Wirkungen, die durch den FAS-R-Rezeptor vermittelt werden, einhergehen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, Arzneimittel, umfassend das vorstehende MORT-1-Protein oder Fragmente, sowie Arzneimittel, umfassend die vorstehend erwähnten Antikörper oder andere hier beschriebene Antagonisten, bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung haben wir ein neues Protein gefunden, welches in der Lage ist, an die intrazelluläre Domäne des FAS-R zu binden. Dieses FAS-IC-bindende Protein kann als ein Vermittler oder Modulator der FAS-R-Ligandenwirkung auf Zellen durch Vermittlung oder Modulierung des intrazellulären Signalisierungsprozesses, welcher üblicherweise nach Bindung des FAS-R-Liganden an der Zelloberfläche abläuft, fungieren.
Dieses neue Protein wurde HF1 oder MORT-1 (für „Mediator of Receptor Toxicity", „Vermittler der Rezeptortoxizität") genannt und es hat zusätzlich zu seiner FAS-IC-bindenden Spezifität andere Charakteristika (vgl. Beispiel 1), zum Beispiel hat es eine Region, die homolog zu den „Todesdomänen" (DD)-Regionen vom p55-TNF-R und FAS-R (p55-DD und FAS-DD) ist und dadurch ist es auch zur Selbstassoziation in der Lage ist. MORT-1 ist auch in der Lage, selbst eine zelluläre Cytotoxizität zu aktivieren, eine Aktivität, die möglicherweise mit seiner Fähigkeit zur Selbstassoziation zusammenhängt. Es wurde nun auch herausgefunden, dass die Koexpression der Region in MORT-1 (HF1), welche die „Todesdomänen"-Homologiesequenz (MORT-DD, vorhanden im C-terminalen Teil von MORT-1) enthält, den durch Fas induzierten Zelltod stark beeinträchtigt, wie es von seiner Fähigkeit, an die „Todesdomäne" von FAS-IC zu binden, erwartet würde. Weiterhin wurde unter denselben experimentellen Bedingungen gefunden, dass die Koexpression des Teils von MORT-1, der nicht die MORT-DD-Region enthält (der N-terminale Teil von MORT-1, Aminosäuren 1-117, „MORT-1 Kopf") zu keinerlei Beeinträchtigung des durch FAS induzierten Zelltodes und wenn überhaupt zu einer geringfügig erhöhten FAS-induzierten zellulären Cytotoxizität führt.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz, codierend ein hier MORT-1 bezeichnetes Protein oder Fragmente davon, bereit, von denen alle in der Lage sind, an die intrazelluläre Domäne des FAS-Liganden-Rezeptors (FAS-IC) zu binden oder mit ihr zu interagieren.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz bereit, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

(a) einer cDNA-Sequenz, abgeleitet aus der codierenden Region eines nativen MORT-1-Proteins,
(b) DNA-Sequenzen, welche in der Lage sind, an eine cDNA aus (a) unter mäßig stringenten Bedingungen zu hybridisieren, und welche ein biologisch aktives, an die intrazelluläre Domäne von FAS-R bindendes Protein codieren, und
(c) DNA-Sequenzen, welche dem genetischen Code folgend gegenüber den DNA-Sequenzen, wie in (a) und (b) definiert degeneriert sind und welche ein biologisch aktives, die intrazelluläre Domäne von FAS-R bindendes Protein codieren.

Eine spezifische Ausführungsform der vorstehenden erfindungsgemäßen DNA-Sequenz ist eine das MORT-1-Protein codierende DNA-Sequenz, umfassend die in 4 dargestellte Sequenz.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein MORT-1-Protein oder Fragmente davon bereit, welche durch eine beliebige der vorstehenden erfindungsgemäßen Sequenzen codiert werden, wobei die Proteine oder Fragmente davon in der Lage sind, an die intrazelluläre Domäne des FAS-R zu binden oder mit ihr zu interagieren.
Eine spezifische Ausführungsform des vorstehenden erfindungsgemäßen Proteins ist das MORT-1-Protein mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz, die in 4 dargestellt wird.
Ebenfalls durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden Vektoren, welche das vorstehende erfindungsgemäße MORT-1-Protein oder Fragmente codieren und welche die vorstehende erfindungsgemäße DNA-Sequenz enthalten, wobei diese Vektoren in der Lage sind, in geeigneten eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtszellen exprimiert zu werden; transformierte eukaryontische oder prokaryontische Wirtszellen, enthaltend solche Vektoren; und ein Verfahren zur Herstellung des MORT-1-Proteins unter Bedingungen, die für die Expression der Proteine oder Fragmente geeignet sind, zur posttranslationalen Modifikation des Proteins, wie sie für das Erhalten des Proteins notwendig sind, und zur Extraktion des exprimierten Proteins oder der exprimierten Fragmente aus dem Kulturmedium der transformierten Zellen oder aus Zellextrakten der transformierten Zellen.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung auch Antikörper oder aktive Derivate oder Fragmente davon bereit, welche spezifisch für das erfindungsgemäße MORT-1-Protein oder Fragmente davon sind.
Durch noch einen anderen Aspekt der Erfindung werden verschiedene Verwendungen und Verfahren der vorstehenden DNA-Sequenzen oder der Proteine, welche dadurch codiert werden, gemäß der Erfindung bereitgestellt, welche unter anderem verwenden:

(i) eine Verwendung von einem oder mehreren erfindungsgemäßen MORT-1-Proteinen oder Fragmenten, von denen alle in der Lage sind, an die intrazelluläre Domäne des FAS-R zu binden oder seine Aktivität zu modulieren, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation der Wirkung des FAS-R-Liganden auf Zellen, die einen FAS-R tragen, wobei die ein oder mehreren MORT-1-Proteine oder Fragmente in einer Form in Zellen eingeführt werden, die für die intrazelluläre Verabreichung geeignet ist, oder wobei eine DNA-Sequenz, codierend ein oder mehrere Proteine oder Fragmente, in Form eines geeigneten Expressionsvektors in Zellen eingeführt wird, welcher die Sequenz trägt, wobei der Vektor in der Lage ist, die Insertion der Sequenz in die Zellen in einer Art und Weise zu bewirken, dass die Sequenz in den Zellen exprimiert wird;
(ii) eine Verwendung von MORT-1 oder Fragmenten davon, von denen alle in der Lage sind, an die intrazelluläre Domäne des FAS-R zu binden und seine Aktivität zu modifizieren, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulierung der Wirkung des FAS-R-Liganden auf Zellen, wobei das MORT-1 oder Fragmente in einer Form in Zellen eingeführt werden, die für die intrazelluläre Verabreichung davon geeignet ist, oder wobei eine DNA-Sequenz, codierend MORT-1 oder Fragmente, in Form eines geeigneten Vektors, welcher die Sequenz trägt, in Zellen eingeführt wird, wobei der Vektor in der Lage ist, die Insertion der Sequenz in die Zellen in einer Art und Weise zu bewirken, dass die Sequenz in den Zellen exprimiert wird;
(iii) eine Verwendung wie bei (ii), vorstehend, wobei die Zellen mit einem rekombinanten Tiervirusvektor transfiziert sind, umfassend die Schritte der:
(a) Konstruktion eines rekombinanten Tiervirusvektors, der eine Sequenz, welche ein virales Oberflächenprotein (Ligand) codiert, welches in der Lage ist, an einen spezifischen Zelloberflächenrezeptor an der Oberfläche einer FAS-R tragenden Zelle zu binden, und eine zweite Sequenz trägt, welche ein Protein codiert, ausgewählt aus erfindungsgemäßem MORT-1-Protein und Fragmenten, und welche in der Lage ist, wenn sie in den Zellen exprimiert wird, die Aktivität von FAS-R zu modulieren, und
(b) Infektion der Zellen mit dem Vektor aus (a);
(iv) eine Verwendung von erfindungsgemäßen Antikörpern oder aktiven Derivaten oder Fragmenten davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation der Wirkung von FAS-R-Ligand auf Zellen, welche einen FAS-R tragen, wobei die Verwendung die Anwendung einer geeigneten Zusammensetzung, enthaltend die Antikörper, aktiven Fragmente oder Derivate davon, bei den Zellen umfasst, wobei, wenn die MORT-1-Proteine oder Teile davon von den Zellen auf den extrazellulären Oberflächen exponiert werden, die Zusammensetzung für die extrazelluläre Anwendung zubereitet wird, und wenn die MORT-1-Proteine intrazellulär sind, die Zusammensetzung für die intrazelluläre Anwendung zubereitet wird;
(v) eine Verwendung einer Oligonucleotidsequenz, codierend eine Antisensesequenz von zumindest einem Teil der erfindungsgemäßen MORT-1-Sequenz, wobei die Oligonucleotidsequenz in der Lage ist, die Expression des MORT-1-Proteins zu blockieren, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation der Wirkung von FAS-R-Ligand auf Zellen, welche einen FAS-R tragen;
(vi) eine Verwendung wie bei (v), vorstehend, wobei die Zellen mit einem rekombinanten Tiervirusvektor transfiziert sind, umfassend die Schritte der:
(a) Konstruktion eines rekombinanten Tiervirusvektors, der eine Sequenz, welche ein virales Oberflächenprotein (Ligand) codiert, welches in der Lage ist, an einen spezifischen Zelloberflächenrezeptor an der Oberfläche einer FAS-R tragenden Zelle zu binden, und eine zweite Sequenz trägt, welche eine Oligonucleotidsequenz ist, codierend eine Antisensesequenz von zumindest einem Teil der erfindungsgemäßen MORT-1-Sequenz, wobei die Oligonucleotidsequenz in der Lage ist, die Expression des MORT-1-Proteins zu blockieren, wenn sie mittels des Virus in die Zellen eingeführt wird; und
(b) Infektion der Zellen mit dem Vektor aus (a);
(vii) eine Verwendung eines rekombinanten Tiervirusvektors, welcher eine Sequenz, die ein virales Oberflächenprotein codiert, welches in der Lage ist, an einen Tumor-Zelloberflächenrezeptor oder an einen Oberflächenrezeptor einer HIV-infizierten Zelle oder an einen Rezeptor zu binden, der von anderen erkrankten Zellen getragen wird, und eine Sequenz trägt, welche ein Protein codiert, ausgewählt aus dem erfindungsgemäßen MORT-1-Protein und Fragmenten, und welche, wenn sie in den Tumor-, HIV-infizierten oder anderen erkrankten Zellen exprimiert wird, in der Lage ist, diese Zelle abzutöten, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Tumorzellen oder HIV-infizierten Zellen oder anderen erkrankten Zellen, umfassend:
(a) die Konstruktion und
(b) die Infektion der Tumor- oder HIV-infizierten oder anderer krankhafter Zellen mit dem Vektor aus (a);
(viii) eine Verwendung eines Vektors, codierend eine Ribozymsequenz, die in der Lage ist, mit einer zellulären mRNA-Sequenz, codierend ein erfindungsgemäßes MORT-1-Protein, zu interagieren, zur Herstellung eines Arzneimittels zu Modulation der Wirkung von FAS-R-Ligand auf Zellen, wobei das Arzneimittel in einer Form in die Zellen eingeführt wird, welche die Expression der Ribozymsequenz in den Zellen erlaubt, und wobei, wenn die Ribozymsequenz in den Zellen exprimiert wird, sie mit der zellulären mRNA-Sequenz interagiert und die mRNA-Sequenz spaltet, was zur Hemmung der Expression des MORT-1-Proteins in den Zellen führt:
(ix) eine Verwendung, ausgewählt aus einer beliebigen der vorstehenden Verwendungen, wobei das MORT-1-Protein oder die MORT-1-codierende Sequenz mindestens den Teil des MORT-1-Proteins umfasst, der spezifisch an die FAS-IC bindet, oder zumindest den Teil der MORT-1 codierenden Sequenz, der den Teil des MORT-1-Proteins codiert, der spezifisch an die FAS-IC bindet;
(x) ein Verfahren zur Isolierung und Identifizierung eines Proteins, das in der Lage ist, an die intrazelluläre Domäne von FAS-R zu binden, umfassend die Anwendung des Verfahrens einer nicht stringenten Southern-Hybridisierung, gefolgt von PCR-Clonierung, in der eine erfindungsgemäße Sequenz oder Teile davon als Sonde verwendet werden, um Sequenzen aus einer cDNA- oder genomischen DNA-Bibliothek zu binden, die zumindest eine partielle Homologie dazu haben, wobei die gebundenen Sequenzen dann durch das PCR-Verfahren amplifiziert und cloniert werden, um Clone zu erhalten, welche Proteine mit zumindest partieller Homologie zu den erfindungsgemäßen Sequenzen codieren.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Arzneimittel zur Modulation der Wirkung des FAS-Liganden auf Zellen bereit, umfassend als Wirksubstanz eine beliebige von den nachfolgenden: (i) ein erfindungsgemäßes MORT-1-Protein, seine biologisch aktiven Fragmente oder ein Gemisch davon, (ii) einen rekombinanten Tiervirusvektor, der ein Protein codiert, welches in der Lage ist, an einen Zelloberflächenrezeptor zu binden, und der ein erfindungsgemäßes MORT-1-Protein oder seine biologisch aktiven Fragmente oder Analoge codiert, und (iii) eine Oligonucleotidsequenz, codierend eine Antisense-Sequenz der erfindungsgemäßen MORT-1-Sequenz, wobei die Oligonucleotidsequenz die zweite Sequenz des rekombinanten Tiervirusvektors aus (ii), vorstehend, sein kann.
Es sollte erwähnt werden, dass MORT-1 eine bestimmte Region hat, welche an FAS-IC bindet und eine andere bestimmte Region bindet, welche an der Selbstassoziation von MORT-1 beteiligt ist, und entsprechend können diese bestimmten Regionen oder Teile davon unabhängig voneinander verwendet werden, um andere Proteine, Rezeptoren etc. zu identifizieren, welche in der Lage sind, an MORT-1 oder an den FAS-R zu binden, und welche an MORT-1- oder FAS-abhängigen intrazellulären Signalisierungsprozessen beteiligt sind. Weiterhin kann MORT-1 andere Aktivitäten aufweisen, welche mit einer der vorstehenden bestimmten Regionen oder anderen Regionen von MORT-1 oder Kombinationen davon assoziiert sind, zum Beispiel enzymatische Aktivität, welche mit den von MORT-1 ausgehenden cytotoxischen Wirkungen auf Zellen zusammenhängen kann. Daher kann MORT-1 auch verwendet werden, um spezifisch andere Proteine, Peptide etc. zu identifizieren, welche an solchen zusätzlichen Aktivitäten, die mit MORT-1 assoziiert sind, beteiligt sein können.
Andere Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden ebenfalls bereitgestellt, so wie sie aus der nachstehenden genauen Beschreibung der Erfindung hervorgehen.
Es sollte angemerkt werden, dass die folgenden Begriffe „Modulierung der Wirkung von FAS-Ligand auf Zellen" und „Modulierung der MORT-1-Wirkung auf Zellen", soweit sie durchgängig verwendet werden, so verstanden werden sollen, dass sie eine in vitro- sowie in vivo-Behandlung umfassen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A und B sind Wiedergaben von Autoradiogrammen von SDS-PAGE-Gelen (10% Acrylamid), welche die Wechselwirkung zwischen HF-1 (MORT-1) und FAS-IC in vitro zeigen. 1A zeigt ein Kontrollautoradiogramm eines Immunpräzipitats der Proteine (aus Extrakten von HeLa-Zellen, die mit FLAG-HF1 (FLAG-MORT1)-Fusionsprotein oder mit der Luciferase-cDNA (Kontrolle) transfiziert sind, wobei die Immunpräzipitation mit dem anti-FLAG-Antikörper durchgeführt wird, und
1B zeigt ein Autoradiogramm eines repräsentativen Gels, das hergestellt wurde, um die Wechselwirkung zwischen HF1 und FAS-IC in vitro durch autoradiographische Untersuchung der Bindung von mit [³⁵S]-Methionin metabolisch markiertem HF1 zu beurteilen, welches in transfizierten HeLa-Zellen als Fusionsprotein mit dem FLAG-Octapeptid (FLAG-MORT1) an GST, menschlichem und Maus-GST-FAS-IC-Fusionsprotein (GST-huFAS-IC, GST-mFAS-IC) und GST-FAS-IC-Fusionsproteinen, in welchen die FAS-IC eine He zu Ala-Austauschmutation an Position 225 (GST-mFAS-IC I225A) enthielt, produziert wurde. Die [³⁵S]-markierten Proteine der HeLa-Zellen einschließlich des markierten FLAG-MORT1-Fusionsproteins, das zuerst extrahiert wurde, wurden der Wechselwirkung mit verschiedenen GST- und GST-FAS-IC-Proteinen (gebunden an Glutathion-Kügelchen) und dann einer SDS-PAGE unterzogen. Als Kontrollen wurden in allen Wechselwirkungsexperimenten Extrakte von HeLa-Zellen, die mit Luziferase transfiziert wurden, einer Wechselwirkung mit GST und GST-FAS-IC-Fusionsproteinen und einer SDS-PAGE unterzogen. Die 1A und B werden ebenfalls in Beispiel 1 beschrieben.
2A, B und C sind Wiedergaben von Autoradiogrammen von SDS-PAGE-Gelen (10% Acrylamid), auf denen verschiedene Immunpräzipitate aus transfizierten HeLa-Zellen getrennt wurden und welche die Wechselwirkung zwischen HF1 (MORT1) mit FAS-IC in vivo zeigen. Die HeLa-Zellen wurden mit DNA-Konstrukten transfiziert, welche codieren: HF1-FLAG (FLAG-MORT1)-Fusionsprotein allein, HF1-FLAG-Fusionsprotein und den menschlichen FAS-R (FLAG-MORT1 + Fas/AOP1) oder menschlichen FAS-R allein (Fas/APO1) (2A) oder HF1-FLAG-Fusionsprotein und menschliches p55R (FLAG-MORT1 + p55R) (2B) oder HF1-FLAG-Fusionsprotein und ein chimäres Fusionsprotein zwischen menschlichem FAS-R und p55R, in welchem die extrazelluläre Domäne des FAS-R durch die entsprechende Region von p55R ersetzt wurde (FLAG-MORT1 + p55-FAS-Chimäre), oder das Chimäre FAS-R-p55-R Fusionsprotein allein (p55-Fas-Chimäre) (2C). In allen Fällen wurden die transfizierten Zellen mit [³⁵S]-Cystein (20 μCi/ml) und [³⁵S]-Methionin (40 μCi/ml) metabolisch markiert und wurden einer Proteinextraktion unterzogen. Die Proteinextrakte aus den verschiedenen transfizierten Zellen wurden dann mit verschiedenen Antikörpern, nämlich anti-FLAG-, anti-FAS-, anti-p75-R- und anti-p55-R-Antikörper (αFLAG, αFAS, αp75-R und αp55-R in den 2A-C), immunpräzipitiert und einer SDS-PAGE unterzogen. Auf der linken Seite der 2A sind die Proteinbanden, entsprechend FAS-R (Fas/APO1) und HF1-FLAG (FLAG-MORT1) angezeigt; zwischen den 2A und B werden die relativen Positionen von Standard-Molekulargewichtsmarkern (in kDa) und auf der rechten Seite von 2C werden die Proteinbanden, entsprechend p55R und der p55-FAS-Chimäre, angezeigt. Die 2A-C werden ebenfalls in Beispiel 1 beschrieben.
3 zeigt eine Reproduktion eines Northern-Blots, in welchem poly-A⁺-RNA (0,3 μg) aus transfizierten HeLa-Zellen mit HF1-cDNA sondiert wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben.
4 stellt die vorläufige Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von HF1, wie in Beispiel 1 beschrieben, dar, in der die „Todesdomäne" unterstrichen ist, wie auch eine mögliche Translationsstartstelle, d. h. der unterstrichene Methioninrest an Position 49 (fett, unterstrichenes M). Das Sternchen zeigt das Translations-Stoppcodon an (Nucleotide 769-771). Am Anfang und in der Mitte jeder Zeile werden zwei Ziffern bereitgestellt, welche die relativen Positionen der Nucleotide und Aminosäuren der Sequenz hinsichtlich des Beginns der Sequenz (5'-Ende) zeigen, in welcher die erste Ziffer das Nucelotid bezeichnet und die zweite Ziffer die Aminosäure.
5 zeigt die Ergebnisse der Experimente zur Bestimmung des C-terminalen Endes von MORT-1, wobei 5 eine Reproduktion eines Autoradiogramms eines SDS-PAGE-Gels (10% Acrylamid) ist, auf welchem verschiedene MORT-1-FLAG-Fusionsprodukte getrennt wurden, die in HeLa-Zellen exprimiert und metabolisch mit [³⁵S]-Cystein und [³⁵S]-Methionin markiert wurden, gefolgt von Immunpräzipitation entweder mit monoclonalen anti-FLAG Antikörpern (M2) (Spuren 2, 4 und 6) oder als Kontrolle mit anti-p75-TNF-R-Antikörpern (#9) (Spuren 1, 3 und 5), wie in Beispiel 1 beschrieben.
(6A und B) stellt die ligandenunabhängige Auslösung von cytoziden Wirkungen in mit MORT-1 transfizierten Zellen grafisch dar, wobei die Zell-Lebensfähigkeit entweder mit dem Neutralrot-Aufnahmetest (6A) bestimmt wurde oder zur spezifischen Bestimmung der Lebensfähigkeit von Zellen, welche die transfizierte DNA exprimierten, eine Messung der Menge der plazentaren alkalischen Phosphatase, die ins Medium sekretiert wurde, erfolgte (6B). HeLa-Zellen wurden mit Tetracyclin-kontrollierten Expressionsvektoren, codierend HF1 (MORT1), menschliche FAS-IC, menschliche p55-IC oder Luciferase (Kontrolle), und in allen Fällen auch mit einer cDNA, codierend die sekretierte alkalische Phosphatase, welche die Beurteilung der Wirkung der transienten Expression dieser Proteine auf die Lebensfähigkeit der Zellen erlaubte, transfiziert. In beiden 6A und 6B stellen die offenen Kurven die transfizierten Zellen dar, die in Gegenwart von Tetracyclin (1 μg/ml, zur Blockierung der Expression) gezüchtet wurden, und die geschlossenen Kurven stellen die transfizierten Zellen dar, die in Abwesenheit von Tetracyclin gezüchtet wurden. Die 6A und 6B werden auch in Beispiel 1 beschrieben.
7 ist eine graphische Darstellung der Wirkungen von verschiedenen Teilen des MORT-1-Proteins auf die cytotoxische Wirkung auf Zellen, die durch FAS-R vermittelt wird, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem Aspekt ein neues Protein, MORT-1 (HF1), welches in der Lage ist, an die intrazelluläre Domäne des FAS-R-Rezeptors, einem Mitglied der TNF/NGF-Superfamilie, zu binden und wird daher als Vermittler oder Modulator von FAS-R angesehen, der zum Beispiel beim Signalisierungsprozess, welcher durch die Bindung von FAS-Ligand an FAS-R initiiert wird, eine Rolle spielt. Die erfindungsgemäßen Aminosäure- und DNA-Sequenzen von MORT-1 stellen auch neue Sequenzen dar; sie tauchen nicht in den Datenbanken „GENEBANK" oder „PROTEIN BANK" für DNA- oder Aminosäuresequenzen auf.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung die DNA-Sequenz, codierend das MORT-1-Protein, und das MORT-1-Protein, das durch die DNA-Sequenzen codiert wird.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung auch DNA-Sequenzen, welche biologisch aktive Fragmente des MORT-1-Proteins codieren, und die durch sie codierten Fragmente. Die Herstellung solcher Fragmente erfolgt durch Standardverfahren (vgl. zum Beispiel Sambrook et al., 1989), in welchem in den das MORT-1 Protein codierenden DNA-Sequenzen ein oder mehrere Codons deletiert, addiert oder durch andere substituiert sein können, um Analoge zu erhalten, die mindestens einen Austausch von einer Aminosäure im Vergleich zum nativen Protein aufweisen. Akzeptable Analoge, welche hier offenbart werden, sind solche, die mindestens die Fähigkeit der Bindung an die intrazelluläre Domäne des FAS-R beibehalten oder die eine beliebige andere Fähigkeit zur Bindung oder eine enzymatische Aktivität vermitteln können, z. B. Analoge, welche die FAS-IC binden, aber die nicht signalisieren, d. h. sie binden nicht an einen/ein weiter stromabwärts liegenden/s Rezeptor, Protein oder anderen Faktor oder sie katalysieren keine signalabhängige Reaktion. Auf einem solchen Weg können Analoge hergestellt werden, welche eine sogenannte dominant-negative Wirkung haben, nämlich ein Analog, welches entweder einen Defekt in der Bindung an FAS-IC oder in der nachfolgenden Signalisierung nach einer solchen Bindung hat. Solche Analoge können zum Beispiel verwendet werden, um die Wirkung von FAS-Ligand durch Kompetition mit den natürlichen FAS-IC-bindenden Proteinen zu hemmen. Ähnlich können die sogenannten dominant-positiven Analoge hergestellt werden, welche dazu dienen würden, die Wirkung von FAS-Ligand zu verstärken. Diese würden dieselben oder bessere FAS-IC-Bindungseigenschaften und dieselben oder bessere Signalisierungseigenschaften wie/als die natürlichen FAS-IC-bindenden Proteine haben. In einer analogen Art und Weise können biologisch aktive Fragmente von MORT-1 hergestellt werden, wie vorstehend hinsichtlich der Analoge von MORT-1 erwähnt wurde. Geeignete Fragmente von MORT-1 sind solche, welche die FAS-IC-Bindungsfähigkeit beibehalten oder welche eine beliebige andere Bindungs- oder enzymatische Aktivität, wie vorstehend erwähnt wurde, vermitteln können. Entsprechend können MORT-1-Fragmente hergestellt werden, welche eine dominant-negative oder eine dominant-positive Wirkung, wie vorstehend erwähnt wurde, hinsichtlich der Analoge haben. Es sollte erwähnt werden, dass diese Fragmente eine spezielle Klasse der erfindungsgemäßen Analoge darstellen, sie sind nämlich definierte Teile von MORT-1, abgeleitet aus der vollständigen MORT-1-Sequenz, wobei ein jeder solcher Anteil oder Fragment eine beliebige der vorstehend erwähnten, gewünschten Aktivitäten aufweist. Ähnlich können Derivate, welche hier offenbart werden, durch Standardmodifizierungen der Seitengruppen von einem oder mehreren Aminosäureresten des MORT-1-Proteins, seiner Analoge oder Fragmente oder durch Konjugation des MORT-1-Proteins, seiner Analoge oder Fragmente an ein anderes Molekül, z. B. einen Antikörper, ein Enzym, einen Rezeptor etc., wie sie im Fachgebiet wohlbekannt sind, hergestellt werden.
Das neue MORT-1-Protein oder seine Fragmente haben eine Anzahl möglicher Verwendungen, zum Beispiel:

(i) Sie können verwendet werden, um die Funktion von FAS-R-Ligand in Situationen nachzuahmen oder zu verstärken, in denen eine verstärkte FAS-R-Ligandenwirkung gewünscht wird, wie bei Antitumor-, entzündungshemmenden und Anti-HIV-Anwendungen, wobei die durch FAS-R-Ligand induzierte Cytotoxizität gewünscht wird. In diesem Fall können das MORT-1-Protein oder seine Fragmente, welche die FAS-R-Ligandenwirkung, d. h. die cytotoxische Wirkung, verstärken, durch Standardverfahren, die an sich bekannt sind, eingeführt werden. Zum Beispiel ist ein System zur spezifischen Einführung dieses Proteins in Zellen notwendig, da das MORT-1-Protein intrazellulär ist und es nur in die Zellen eingeführt werden sollte, in denen die FAS-R-Ligand-Wirkung gewünscht ist. Ein Weg, um dies zu tun, ist die Schaffung eines rekombinanten Tiervirus, z. B. eines, der von Vaccinia abgeleitet ist, mit der DNA, von welcher die folgenden beiden Gene eingeführt werden soll: das Gen, das einen Liganden codiert, der an Zelloberflächenproteine bindet, die spezifisch durch die Zellen exprimiert werden, z. B. solche wie das AIDS (HIV)-Virus gp120-Protein, welches spezifisch an einige Zellen bindet (CD4-Lymphocyten und verwandte Leukämien), oder ein beliebiger anderer Ligand, der spezifisch an Zellen bindet, die einen FAS-R tragen, so dass der rekombinante Virusvektor in der Lage ist, solche FAS-R tragenden Zellen zu binden, und das das MORT-1-Protein codierende Gen. Daher wird die Expression des Zelloberflächenbindungsproteins an der Oberfläche des Virus den Virus spezifisch zur Tumorzelle oder zu einer anderen FAS-R-tragenden Zelle bringen, wonach die MORT-1-Protein codierende Sequenz mittels Virus in die Zellen eingeführt wird und sobald sie in den Zellen exprimiert wird, führt sie zur Verstärkung der FAS-R-Ligandenwirkung, was zum Tod der Tumorzellen oder anderer FAS-R-tragender Zellen führt, die abgetötet werden sollen. Die Konstruktion eines solchen rekombinanten Tiervirus erfolgt mit Standardverfahren (vgl. zum Beispiel Sambrook et al., 1989). Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Sequenzen des MORT-1-Proteins in Form von Oligonucleotiden einzuführen, welche von den Zellen absorbiert und darin exprimiert werden können. Eine weitere Möglichkeit ist die Modifizierung des Verfahrens von Lin et al., in Journal of Biological Chemistry, Bd. 270, Nr. 24, S. 14255-14258, 1995.
(ii) Sie können verwendet werden, um die Wirkung von FAS-R-Ligand zu hemmen, z. B. in Fällen wie Gewebeschädigung bei septischem Schock, Graft-versus-Host-Abstoßung oder akuter Hepatitis, bei denen es gewünscht wird, die durch FAS-R-Ligand induzierte intrazelluläre FAS-R-Signalisierung zu blockieren. In dieser Situation ist es möglich, zum Beispiel durch Standardverfahren Oligonucleotide mit der Antisense-codierenden Sequenz für das MORT-1-Protein in die Zellen einzuführen, welche effektiv die Translation von das MORT-1-Protein codierenden mRNAs und dadurch seine Expression blockieren und zur Hemmung der FAS-R-Ligandenwirkung führen würden. Solche Oligonucleotide können unter Verwendung der vorstehenden rekombinanten Virusmethode in die Zellen eingeführt werden, wobei die zweite Sequenz, die vom Virus getragen wird, die Oligonucieotidsequenz ist. Eine andere Möglichkeit ist die Verwendung von Antikörpern, die spezifisch für das MORT-1-Protein sind, zur Hemmung seiner intrazellulären Signalisierungsaktivität. Noch ein anderer Weg zur Hemmung der FAS-R-Ligandenwirkung ist die unlängst entwickelte Ribozym-Methode. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle, welche spezifisch RNAs spalten. Ribozyme können so manipuliert werden, dass sie Ziel-RNAs der Wahl spalten, z. B. die das erfindungsgemäße MORT-1-Protein codierenden mRNAs. Solche Ribozyme hätten eine für MORT-1-mRNA spezifische Sequenz und wären in der Lage, mit ihr zu interagieren (komplementäre Bindung), gefolgt von der Spaltung der mRNA, was zu einer Verringerung (oder dem vollständigen Verlust) der Expression des MORT-1-Proteins führen würde, wobei der Spiegel der verringerten Expression vom Spiegel der Ribozym-Expression in der Zielzelle abhängig ist. Um die Ribozyme in die Zellen der Wahl einzuführen (z. B. solche, die FAS-R tragen), kann ein beliebiger geeigneter Virus verwendet werden, z. B. Plasmid, Tiervirus (Retrovirus)-Vektoren, welche üblicherweise zu diesem Zweck verwendet werden (vgl. auch (i), vorstehend, wo der Virus als zweite Sequenz eine die Ribozymsequenz der Wahl codierende cDNA trägt). (Für Ribozyme betreffende Übersichten, Verfahren etc., vgl. Chen et al., 1992, Zhao und Pick, 1993, Shore et al., 1993, Joseph und Burke, 1993, Shimayama et al., 1993, Cantor et al., 1993, Barinaga, 1993, Crisell et al., 1993 und Koizumi et al., 1993).
(iii) Sie können verwendet werden, um andere Proteine, welche in der Lage sind, an sie zu binden, z. B. andere Proteine, die am intrazellulären Signalisierungsprozess beteiligt sind und die stromabwärts der intrazellulären Domäne des TNF-R oder FAS-R liegen, zu isolieren, identifizieren und clonieren. Zum Beispiel kann das MORT-1-Protein, und zwar die es codierende DNA-Sequenz, im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet werden (vgl. Beispiel 1, nachstehend), in welchem die Sequenz des MORT-1-Proteins als „Köder" verwendet wird, um andere Sequenzen („Beute"), codierend Proteine, die an das MORT-1-Protein binden können, aus cDNA- oder genomischen DNA-Genbanken zu isolieren, zu clonieren und zu identifizieren. Auf demselben Weg kann auch bestimmt werden, ob das erfindungsgemäße MORT-1-Protein an andere zelluläre Proteine binden kann, z. B. an andere Rezeptoren der TNF/NGF-Superfamilie von Rezeptoren.
(iv) Das MORT-1-Protein oder seine Fragmente können auch verwendet werden, um andere Proteine derselben Klasse, d. h. solche, die an die intrazelluläre Domäne von FAS-R oder an funktionell verwandte Rezeptoren binden und am intrazellulären Signalisierungsprozess beteiligt sind, zu isolieren, zu identifizieren und zu clonieren. In dieser Anwendung kann das vorstehend erwähnte Hefe-Zwei-Hybrid-System oder ein unlängst entwickeltes System unter Verwendung einer nicht-stringenten Southern-Hybridisierung, gefolgt von PCR-Clonierung (Wilks et al., 1989), verwendet werden. In der Veröffentlichung von Wilks et al. wird die Identifizierung und Clonierung von zwei mutmaßlichen Protein-Tyrosin-Kinasen durch Anwendung von nicht-stringenter Southern-Hybridisierung, gefolgt von Clonierung mittels PCR, basierend auf der bekannten Sequenz des Kinasemotivs, einer angenommenen Kinasesequenz, beschrieben. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der Sequenz des MORT-1-Proteins jene von verwandten, die intrazelluläre Domäne von FAS-R bindenden Proteine zu identifizieren und clonieren.
(v) Noch ein anderer Ansatz zur Nutzung des erfindungsgemäßen MORT-1-Proteins oder von seinen Fragmenten ist es, sie in Verfahren der Affinitätchromatographie zu verwenden, um andere Protein oder Faktoren zu isolieren oder identifizieren, an die sie zu binden in der Lage sind, z. B. andere Rezeptoren, die mit FAS-R verwandt sind, oder andere Proteine oder Faktoren, die am intrazellulären Signalisierungsprozess beteiligt sind. In dieser Anwendung kann das erfindungsgemäße MORT-1-Protein oder seine Fragmente individuell an Affinitätchromatographie-Matrizes angeheftet werden und dann mit Zellextrakten oder isolierten Proteinen oder Faktoren, von denen angenommen wird, dass sie am intrazellulären Signalisierungsprozess beteiligt sind, in Kontakt gebracht werden. Nach dem Affinitätschromatographieverfahren können die anderen Proteine oder Faktoren, welche an das erfindungsgemäße MORT-1-Protein oder Fragmente binden, eluiert, isoliert und charakterisiert werden.
(vi) Wie vorstehend erwähnt wird, können das erfindungsgemäße MORT-1-Protein oder seine Fragmente auch als Immunogene (Antigene) verwendet werden, um spezifische Antikörper dagegen zu erzeugen. Diese Antikörper können auch zum Zwecke der Reinigung des MORT-1-Proteins entweder aus Zellextrakten oder aus transformierten Zelllinien, die MORT-1, seine Analoge oder Fragmente produzieren, verwendet werden. Weiterhin können diese Antikörper zu diagnostischen Zwecken zur Identifizierung von Erkrankungen verwendet werden, die mit dem abnormalen Funktionieren des FAS-R-Ligand-Systems in Zusammenhang stehen, z B. von zu stark oder zu wenig aktivem FAS-R-Ligand induzierte zelluläre Wirkungen. Daher, sollten solche Erkrankungen mit einem fehlfunktionierenden intrazellulären Signalisierungssystem unter Beteiligung des MORT-1-Proteins in Zusammenhang stehen, würden solche Antikörper als wichtiges diagnostisches Werkzeug dienen.
(vii) MORT-1 kann auch als indirekter Modulator einer Anzahl anderer Proteine durch seine Fähigkeit zur Bindung anderer intrazellulärer Proteine (die sogenannten MORT-1-Bindungsproteine, vgl. nachstehend) verwendet werden, wobei andere intrazelluläre Proteine wieder andere intrazelluläre Proteine oder eine intrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins direkt binden. Ein Beispiel für ein solches Protein oder eine solche intrazelluläre Domäne ist der wohlbekannte p55-TNF-Rezeptor, dessen intrazelluläre Signalisierung durch eine Anzahl von Proteinen moduliert wird, welche direkt an seine intrazelluläre Domäne binden (vgl. ebenfalls anhängige IL 109632 ). In der Tat haben wir ein solches MORT-1-Bindungsprotein isoliert (vgl. nachstehend und Beispiel 2), welches an die intrazelluläre Domäne des p55-TNF-Rezeptors bindet.

Zum Zwecke der Modulierung dieser anderen intrazellulären Proteine oder der intrazellulären Domänen von Transmembranproteinen kann MORT-1 auf eine Anzahl von Wegen, wie sie hier vorstehend in (ii) erwähnt wurden, in die Zellen eingeführt werden.
Es sollte auch erwähnt werden, dass die Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung des erfindungsgemäßen MORT-1-Proteins unter Verwendung eines beliebigen der wohlbekannten Standard-Screeningverfahren durchgeführt werden können. Zum Beispiel wurde eines dieser Screeningverfahren, das Hefe-Zwei-Hybrid-Verfahren, wie es hier dargelegt wird (Beispiel 1), verwendet, um das erfindungsgemäße MORT-1-Protein zu identifizieren. In ähnlicher Weise können, wie vorstehend und nachstehend erwähnt wird, andere Verfahren angewendet werden, wie Affinitätschromatographie, DNA-Hybridisierungsverfahren etc., wie sie im Fachgebiet wohlbekannt sind, um das erfindungsgemäße MORT-1-Protein zu isolieren, zu identifizieren und zu charakterisieren, um zusätzliche Proteine, Faktoren, Rezeptoren etc. zu isolieren, zu identifizieren und zu charakterisieren, welche in der Lage sind, an das erfindungsgemäße MORT-1-Protein zu binden.
Weiterhin sollte ebenfalls erwähnt werden, dass unter den Charakteristika von MORT-1 seine Fähigkeit an die FAS-IC zu binden und auch seine Fähigkeit zur Selbstassoziation ist. MORT-1 ist auch in der Lage, von sich aus eine zelluläre Cytotoxizität zu aktivieren, eine Aktivität, die mit seiner Fähigkeit zur Selbstassoziation in Zusammenhang steht. Es scheint (vgl. Beispiel 1), dass der Teil von MORT-1, der an FAS-IC bindet, sich von dem Teil von MORT-1 unterscheidet, der an seiner Selbstassoziation beteiligt ist. MORT-1 kann auch andere Aktivitäten haben, welche eine Funktion der vorstehend erwähnten bestimmten Teile des MORT-1-Moleküls oder anderer Teile des Moleküls oder Kombinationen beliebiger dieser Teile sind. Diese anderen Aktivitäten können enzymatisch sein oder die Bindung anderer Proteine betreffen (z. B. MORT-1-Bindungsproteine oder andere Rezeptoren, Faktoren etc.). Daher kann MORT-1 bei den vorstehenden Verfahren zur Modulierung der FAS-R-Ligandenwirkungen oder seiner eigenen durch MORT-1 vermittelten zellulären Wirkungen verwendet werden oder es kann zur Modulierung von anderen zellulären Signalisierungsprozessen, die mit anderen Rezeptoren, Faktoren etc. in Zusammenhang stehen, verwendet werden.
Genauer gesagt kann durch diesen Aspekt der Erfindung das MORT-1 codierende DNA-Molekül selbst und Mutationen davon (d. h. codierend Analoge oder aktive Fraktionen von MORT-1) für die Gentherapie (d. h. wie in den vorstehend dargelegten Verwendungen (i) und (ii)) zur Modulierung der Aktivität des FAS-R (oder Modulierung oder Vermittlung der FAS-Ligand-Wirkung auf Zellen) verwendet werden. Außerdem können, da MORT-1 auch eine cytotoxische Wirkung auf Zellen hat, diese MORT-1 oder mutiertes MORT-1 codierenden DNA-Moleküle auch zur Gentherapie zur Modulierung der Wirkung von MORT-1 in Zellen verwendet werden (ebenfalls wie in den vorstehenden Verwendungen (i) und (ii)). In diesen Gentherapieanwendungen kann MORT-1 auf drei Arten verwendet werden:

(a) das vollständige MORT-1-Protein oder seine aktiven Fragmente, welche sowohl die FAS-IC- als auch die MORT-1-Bindungsfähigkeit haben (d. h. sie enthalten die beiden Regionen von MORT-1, von denen eine an der Bindung an FAS-IC und die andere an der Selbstassoziation von MORT-1 beteiligt ist), können verwendet werden, um die mit FAS-R und MORT-1 einhergehenden Wirkungen zu modulieren;
(b) der Teil von MORT-1 und aktive Fragmente dieses Teils, welcher an FAS-IC bindet, kann zur Induktion einer „dominant negativen" Wirkung auf FAS-IC, d. h. zur Hemmung der durch FAS-R vermittelten zellulären Wirkungen, oder zur Induktion einer „Funktionsgewinn"-Wirkung auf FAS-IC, d. h. zur Verstärkung der durch FAS-R vermittelten zellulären Wirkungen verwendet werden, und
(c) der Teil von MORT-1 und aktive Fraktionen dieses Teils, der spezifisch an MORT-1 bindet, kann zur Induktion von „dominant negativen" oder „Funktionsgewinn"-Wirkungen auf MORT-1, d. h. entweder zur Hemmung oder zur Verstärkung von mit MORT-1 assoziierten zellulären Wirkungen, verwendet werden.

Wie in der vorstehenden Verwendung (vi) dargelegt wird, kann das MORT-1-Protein verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die für MORT-1 spezifisch sind. Diese Antikörper oder Fragmente davon können verwendet werden, wie es im Nachstehenden genauer dargelegt wird, wobei es so verstanden werden sollte, dass in diesen Anwendungen die Antikörper oder die Fragmente davon die für MORT-1 spezifischen sind.
Soweit es die hier durchgehend erwähnten Antikörper betrifft, wird der Begriff „Antikörper" so gemeint, dass polyclonale Antikörper, monoclonale Antikörper (mAk), chimäre Antikörper, anti-Idiotyp (anti-Id)-Antikörper gegen Antikörper, die in löslicher oder gebundener Form markiert werden können, sowie Fragmente davon, die durch ein beliebiges bekanntes Verfahren bereitgestellt werden, wie, ohne darauf beschränkt zu sein, enzymatische Spaltung, Peptidsynthese oder rekombinante Verfahren, eingeschlossen werden.
Polyclonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen aus Seren von Tieren, die mit einem Antigen immunisiert wurden. Ein monoclonaler Antikörper enthält eine im Wesentlichen homogene Population von Antikörpern, die spezifisch für Antigene sind, wobei die Populationen im Wesentlichen ähnliche Epitop-Bindungsstellen enthalten. mAk können durch dem Fachmann bekannte Verfahren erhalten werden. Vgl. zum Beispiel Köhler und Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975), US-Patent Nr. 4,376,100 , Ausubel et al., Hrsg., Harlow und Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laborstory (1988) und Colligan et al., Hrsg., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. und Wiley Interscience N. Y. (1992, 1993), deren Inhalt hier vollständig durch Bezugnahme eingebunden wird. Solche Antikörper können aus einer beliebigen Immunglobulinklasse einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, GILD und beliebige Subklassen davon sein. Ein Hybridom, das einen erfindungsgemäßen mAk produziert, kann in vitro, in situ oder in vivo gezüchtet werden. Die Produktion hoher Titer von mAk in vivo oder in situ macht dies zum derzeit bevorzugten Produktionsverfahren.
Chimäre Antikörper sind Moleküle, von denen verschiedene Anteile aus verschiedenen Tierspezies abgeleitet sind, wie solche, welche die variable Region aus einem murinen mAk und eine konstante Region eines menschlichen Immunglobulins haben. Chimäre Antikörper werden primär verwendet, um die Immunogenität bei der Anwendung zu verringern und die Ausbeuten bei der Produktion zu erhöhen, zum Beispiel wenn murine mAk höhere Ausbeuten aus Hybridomen haben, aber höhere Immunogenität in Menschen, werden solche chimären Mensch/murinen mAk verwendet. Chimäre Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind im Fachgebiet bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984), Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984), Boulianne et al., Nature 312: 643-646 (1984), Cabilly et al., europäische Patentanmeldung 125023 (veröffentlicht am 14. November, 1984), Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985), Taniguchi et al., europäische Patentanmeldung 171496 (veröffentlicht am 19. Februar, 1985), Morrison et al., europäische Patentanmeldung 173494 (veröffentlicht am 5. März, 1986), Neuberger et al., PCT-Anmeldung WO 8601533 (veröffentlicht am 13. März, 1986), Kudo et al., europäische Patentanmeldung 184187 (veröffentlicht am 11. Juni, 1986), Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986), Robinson et al., internationale Patentanmeldung Nr. WO 8702671 (veröffentlicht am 7. May, 1987), Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443 (1987), Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218 (1987), Retter et al., Science 240: 1041-1043 (1988) und Harlowe und Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, vorstehend.
Ein anti-idiotypischer (anti-Id)-Antikörper ist ein Antikörper, welcher einzigartige Determinanten erkennt, die im Allgemeinen mit der Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers assoziiert sind. Ein Id-Antikörper kann durch Immunisierung eines Tiers derselben Art und desselben genetischen Typs (z. B. ein Mausstamm) als Quelle des mAk erzeugt werden, wobei der mAk, an den ein anti-Id bindet, hergestellt wird. Das immunisierte Tier wird die idiotypischen Determinanten des Immunisierungsantikörpers durch Produktion eines Antikörpers gegen diese idiotypischen Determinanten (den anti-Id-Antikörper) erkennen und darauf antworten. Vgl. zum Beispiel US-Patent Nr. 4,699,880 .
Der anti-Id-Antikörper kann auch als ein „Immunogen" verwendet werden, um eine Immunantwort in noch einem anderen Tier zu induzieren, wodurch ein sogenannter anti-anti-Id-Antikörper erzeugt wird. Der anti-anti-Id kann epitopisch identisch zum ursprünglichen mAk sein, welcher den anti-Id induzierte. Daher ist es unter Verwendung von Antikörpern gegen die idiotypischen Determinanten eines mAk möglich, andere Clone zu identifizieren, die Antikörper identischer Spezifität exprimieren.
Entsprechend können erfindungsgemäße mAk, die gegen das MORT-1-Protein oder Fragmente davon erzeugt werden, verwendet werden, um anti-Id-Antikörper in geeigneten Tieren wie BALB/c-Mäusen zu induzieren. Milzzellen aus solchen immunisierten Mäusen werden verwendet, um anti-Id-Hybridome zu produzieren, welche anti-Id-mAk sekretieren. Weiterhin können die anti-Id-mAk an einen Träger wie KLH (keyhole limpet hemocyanin) gekoppelt und verwendet werden, um zusätzliche BALB/c-Mäuse zu immunisieren. Seren aus diesen Mäusen enthalten anti-anti-Id-Antikörper, welche die Bindungseigenschaften des ursprünglichen mAk haben, der spezifisch für ein Epitop des vorstehenden MORT-1-Proteins, von Analog, Fragmenten oder Derivaten ist.
Die anti-Id-mAk haben daher ihre eigenen idiotypischen Epitope oder „Idiotope", die strukturell ähnlich dem beurteilten Epitop sind, wie GRB-Protein-α.
Der Begriff „Antikörper" ist auch so gemeint, dass er sowohl intakte Moleküle sowie Fragmente davon wie zum Beispiel Fab und F(ab)₂, welche in der Lage sind, Antigen zu binden, einschließt. Fab und F(ab')₂-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment des intakten Antikörpers, sie werden schneller aus dem Kreislauf entfernt und können weniger unspezifische Gewebebindung haben als ein intakter Antikörper (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).
Es wird anerkannt, dass Fab und F(ab')₂ und andere Fragmente der Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, für den Nachweis und die Quantifizierung des MORT-1-Proteins gemäß der hier offenbarten Verfahren für intakte Antikörpermoleküle verwendet werden können. Solche Fragmente werden typischerweise durch proteolytische Spaltung unter Verwendung von Enzymen wie Papain (um Fab-Fragmente zu produzieren) oder Pepsin (um F(ab')₂-Fragmente zu produzieren) hergestellt.
Über einen Antikörper wird gesagt, dass er ein Molekül „zu binden in der Lage" ist, wenn er in der Lage ist, mit dem Molekül spezifisch zu reagieren, um dadurch das Molekül an den Antikörper zu binden. Der Begriff „Epitop" wird so gemeint, dass es sich auf den Anteil eines Moleküls bezieht, der durch einen Antikörper gebunden und ebenfalls durch jenen Antikörper erkannt werden kann. Epitope oder „antigene Determinanten" bestehen üblicherweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen wie Aminosäuren oder Zucker-Seitenketten und haben spezifische dreidimensionale strukturelle Charakteristika sowie spezifische Ladungs-Charakteristika.
Ein „Antigen" ist ein Molekül oder ein Teil eines Moleküls, das durch einen Antikörper gebunden werden kann und zusätzlich in der Lage ist, ein Tier anzuregen einen Antikörper zu erzeugen, der in der Lage ist, an ein Epitop dieses Antigens zu binden. Ein Antigen kann ein oder mehr als ein Epitop haben. Die spezifische Reaktion, auf die vorstehend Bezug genommen wird, soll anzeigen, dass das Antigen in einer hochselektiven Art und Weise mit seinem entsprechenden Antikörper reagiert und nicht mit der Vielzahl anderer Antikörper, welche durch andere Antigene hervorgerufen werden können.
Die Antikörper, einschließlich Fragmente von Antikörpern, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können verwendet werden, um MORT-1 quantitativ oder qualitativ in einer Probe nachzuweisen oder um die Anwesenheit von Zellen nachzuweisen, die das erfindungsgemäße MORT-1 exprimieren. Dies kann durch Immunfluoreszenzverfahren unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern (vgl. Nachstehendes), gekoppelt mit lichtmikroskopischen, durchflusscytometrischen oder fluorometrischen Nachweisen, erreicht werden.
Die für die vorliegende Erfindung nützlichen Antikörper (oder Fragmente davon) können histologisch wie in der Immunfluoreszenz oder in der Immunelektronenmikroskopie für den in situ-Nachweis des erfindungsgemäßen MORT-1-Proteins angewendet werden. Ein in situ-Nachweis kann durch Entnahme einer histologischen Probe von einem Patienten und Bereitstellung des markierten erfindungsgemäßen Antikörpers gegen eine solche Probe erreicht werden. Der Antikörper (oder das Fragment) wird vorzugsweise durch Anwendung des markierten Antikörpers (oder Fragments) auf eine biologische Probe oder durch Überschichtung derselben bereitgestellt. Durch die Verwendung eines solchen Verfahrens ist es möglich, nicht nur die Anwesenheit von MORT-1 zu bestimmen, sondern auch seine Verteilung im untersuchten Gewebe. Bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung wird der Fachmann leicht erkennen, dass ein breite Vielfalt von histologischen Verfahren (wie Färbeverfahren) so modifiziert werden kann, dass ein solcher in situ-Nachweis erreicht werden kann.
Solche Tests für das erfindungsgemäße MORT-1 umfassen typischerweise das Inkubieren einer biologischen Probe wie einer biologischen Flüssigkeit, eines Gewebeextrakts, frisch geernteter Zellen wie Lymphocyten oder Leukocyten oder Zellen, welche in Gewebekultur inkubiert worden sind, in Gegenwart eines nachweisbar markierten Antikörpers, der in der Lage ist, das MORT-1-Protein zu erkennen und den Nachweis des Antikörpers durch eine beliebige Anzahl von im Fachgebiet wohlbekannten Verfahren.
Die biologische Probe kann mit einer/m Festphasenunterlage oder -träger wie Nitrocellulose oder einer/m anderen festen Unterlagen oder Träger, die/der in der Lage sind, Zellen, Zellpartikel oder lösliche Proteine zu immobilisieren, behandelt werden. Die Unterlage oder der Träger kann dann mit geeigneten Puffern gewaschen werden, gefolgt von einer Behandlung mit einem nachweisbar markierten Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, wie vorstehend erwähnt. Festphasenunterlage oder -träger können dann ein zweites Mal mit einem Puffer gewaschen werden, um den ungebundenen Antikörper zu entfernen. Die Menge der gebundenen Markierung auf der festen Unterlage oder dem festen Träger kann dann mit konventionellen Mitteln nachgewiesen werden.
Mit „Festphasenunterlage", „Festphasenträger", „feste Unterlage", „fester Träger", „Unterlage" oder „Träger" wird eine beliebige Unterlage oder ein beliebiger Träger gemeint, der in der Lage ist, Antigen oder Antikörper zu binden. Wohlbekannte Unterlagen oder Träger umfassen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylonamlyasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Gabbros und Magnetit. Die Natur des Träger kann zum Zwecke der vorliegenden Erfindung entweder bis zu einem gewissen Grad löslich oder unlöslich sein. Das Unterlagenmaterial kann nahezu eine beliebige mögliche strukturelle Konfiguration haben, solange wie das gekoppelte Molekül in der Lage ist, ein Antigen oder einen Antikörper zu binden. Daher kann die Konfiguration der Unterlage oder des Trägers sphärisch wie in einem Kügelchen oder zylindrisch wie in der inneren Oberfläche eines Teströhrchens oder auf der äußeren Oberfläche eines Stäbchens sein. Alternativ kann die Oberfläche flach wie ein Blatt, Teststreifen etc. sein. Bevorzugte Unterlagen oder Träger umfassen Polystrolkügelchen. Der Fachmann kennt andere geeignete Träger zur Bindung von Antikörper oder Antigen oder ist in der Lage, diese durch Routine-Experimente zu ermitteln.
Die Bindungsaktivität einer bestimmten Charge eines erfindungsgemäßen Antikörpers, wie vorstehend erwähnt, kann gemäß wohlbekannter Verfahren bestimmt werden. Der Fachmann kann die wirksamen und optimalen Testbedingungen für jede Bestimmung mittels Durchführung von Routine-Experimenten bestimmen.
Andere solche Schritte wie Waschen, Rühren, Schütteln, Filtrieren und Ähnliches kann zu den Tests hinzugefügt werden, wie es gebräuchlich oder für die jeweilige Situation notwendig ist.
Einer der Wege, auf denen ein Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung nachweisbar markiert werden kann, ist durch Verknüpfung desselben mit einem Enzym und Verwendung in einem Enzym-Immuntest (EIA). Dieses Enzym wiederum reagiert, wenn es später einem geeigneten Substrat ausgesetzt wird, mit diesem Substrat in einer solchen Art und Weise, dass eine chemische Einheit produziert wird, die zum Beispiel durch spektrophotometrische, fluorometrische oder visuelle Mittel nachgewiesen werden kann. Enzyme, die verwendet werden können, um den Antikörper nachweisbar zu markieren, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Malatdehydrogenase, Staphylococcen-Nuclease, delta-5-Steroid-Isomerase, Hefe-Alkoholdehydrogenase, alpha-Glycerophosphat-Dehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucose-Oxidase, beta-Galactosidase, Ribonuclease, Uresse, Katalase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase und Acetylcholin-Esterase. Der Nachweis kann durch kolorimetrische Verfahren erreicht werden, welche ein chromogenes Substrat für das Enzym verwenden. Der Nachweis kann auch durch visuellen Vergleich des Ausmaßes der enzymatischen Reaktion eines Substrats im Vergleich mit ähnlich hergestellten Standards erreicht werden.
Der Nachweis kann unter Verwendung einer Vielzahl von anderen Immuntests erreicht werden. Zum Beispiel ist es durch radioaktive Markierung der Antikörper oder Antikörperfragmente möglich, R-PTPase unter Verwendung eines Radioimmuntests (RIA) nachzuweisen. Eine gute Beschreibung des RIA kann in Laborstory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology von Work T S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) mit besonderem Bezug auf das Kapitel mit dem Titel „An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques", von Chard, T., durch Bezugnahme hier eingebunden, gefunden werden. Das radioaktive Isotop kann durch solche Mittel wie die Verwendung eines γ-Zählgeräts oder eines Szintillationszählgeräts oder durch Autoradiographie nachgewiesen werden.
Es ist auch möglich, einen Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung mit einer Fluoreszenzverbindung zu markieren. Wenn der fluoreszenzmarkierte Antikörper dem Licht einer geeigneten Wellenlänge ausgesetzt ist, kann seine Anwesenheit aufgrund von Fluoreszenz nachgewiesen werden. Unter den am häufigsten verwendeten Fluoreszenzmarkierungsverbindungen sind Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Pycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Flourescamin.
Der Antikörper kann auch nachweisbar unter Verwendung von Fluoreszenz emittierendem Metall wie ¹⁵²E oder anderen der Lanthanidenserie markiert werden. Diese Metalle können an den Antikörper unter Verwendung solcher Metall-Chelatgruppen wie Diethylentriamin-Pentaessigsäure (EPTA) angeheftet werden.
Der Antikörper kann auch nachweisbar durch Kopplung an eine chemilumineszierende Verbindung nachweisbar markiert werden. Die Anwesenheit des chemilumineszenzmarkierten Antikörpers wird dann durch Nachweis der Anwesenheit von Lumineszenz bestimmt, die während des Verlaufs einer chemischen Reaktion entsteht. Beispiele besonders nützlicher Chemilumineszenz-Markierungsverbindungen sind Luminol, Isoluminol, theromatischer Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalsäureester.
In ähnlicher Weise kann eine Biolumineszenzverbindung verwendet werden, um den erfindungsgemäßen Antikörper zu markieren. Biolumineszenz ist ein Typ der Chemilumineszenz, der in biologischen Systemen gefunden wird, in denen ein katalytisches Protein die Effizienz der Chemilumineszenzreaktion erhöht. Die Anwesenheit eines biolumineszierenden Proteins wird durch Nachweis der Anwesenheit von Lumineszenz bestimmt. Wichtige Biolumineszenzverbindungen zum Zwecke der Markierung sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.
Ein erfindungsgemäßes Antikörpermolekül kann für die Anwendung in einem immunmetrischen Test, auch bekannt als ein „zweiseitiger" oder „Sandwich-Test", angepasst werden. In einem typischen immunmetrischen Test wird eine Menge eines unmarkierten Antikörpers (oder Fragment eines Antikörpers) an eine feste Unterlage oder einen festen Träger gebunden und eine Menge eines nachweisbar markierten löslichen Antikörpers wird zugegeben, um den Nachweis und/oder die Quantifizierung des ternären Komplexes, der zwischen dem Festphasenantikörper, dem Antigen und dem markierten Antikörper gebildet wird, zu erlauben.
Typischerweise und bevorzugt umfassen die immunmetrischen Tests „Vorwärts"-Test, in denen der an die feste Phase gebundene Antikörper zuerst mit der zu testenden Probe in Kontakt gebracht wird, wodurch das Antigen aus der Probe durch Bildung eines binären Festphasen-Antikörper-Antigen-Komplexes extrahiert wird. Nach einer geeigneten Inkubationszeitspanne wird die feste Unterlage oder der feste Träger gewaschen, um die Reste der flüssigen Probe, einschließlich des nicht umgesetzten Antigens, falls vorhanden, zu entfernen, und dann mit der Lösung, enthaltend eine unbekannte Menge des markierten Antikörpers (der als „Reportermolekül" dient), in Kontakt gebracht. Nach einer zweiten Inkubationszeit, die es dem markierten Antikörper erlaubt, mit dem Antigen, das an die feste Unterlage oder den festen Träger durch den unmarkierten Antikörper gebunden wird, einen Komplex zu bilden, wird die feste Unterlage oder der feste Träger ein zweites Mal gewaschen, um den nicht umgesetzten markierten Antikörper zu entfernen.
In einem anderen Typ von „Sandwich"-Test, der auch mit den erfindungsgemäßen Antigenen nützlich sein kann, werden sogenannte „simultane" oder „umgekehrte" Tests verwendet. Ein simultaner Test beinhaltet einen einzelnen Inkubationsschritt, bei dem der an die feste Unterlage oder den festen Träger gebundene Antikörper und der markierte Antikörper beide zur gleichen Zeit zu der getesteten Probe gegeben werden. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, wird die feste Unterlage oder der feste Träger gewaschen, um die Reste der flüssigen Probe und des nicht komplexierten markierten Antikörpers zu entfernen. Die Anwesenheit des markierten Antikörpers, der mit der festen Unterlage oder dem festen Träger assoziiert ist, wird dann wie im konventionellen „Vorwärts"-Sandwich-Test bestimmt.
Im „umgekehrten" Test wird die schrittweise Zugabe von zunächst einer Lösung des markierten Antikörpers zu der flüssigen Probe, gefolgt von der Zugabe des unmarkierten Antikörpers, der an eine feste Unterlage oder einen festen Träger gebunden ist, nach einem geeigneten Inkubationszeitraum, angewendet. Nach einer zweiten Inkubation wird die feste Phase in einer konventionellen Art und Weise gewaschen, um sie von Resten der getesteten Probe und der Lösung des nicht umgesetzten markierten Antikörpers zu befreien. Die Bestimmung des markierten Antikörpers, der mit einer festen Unterlage oder einem festen Träger assoziiert ist, wird dann wie in den „simultanen" oder „Vorwärts"-Tests bestimmt.
Das erfindungsgemäße MORT-1 kann dann durch ein beliebiges rekombinantes Standard-DNA-Verfahren hergestellt werden (vgl. zum Beispiel Sambrook et al., 1989), in dem geeignete eukaryontische oder prokaryontische Wirtszellen durch geeignete eukaryontische oder prokaryontische Vektoren, enthaltend die die Proteine codierenden Sequenzen, transformiert werden. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch solche Expressionsvektoren und transformierte Wirte für die Herstellung von erfindungsgemäßen Proteinen. Wie vorstehend erwähnt wird, umfassen diese Proteine auch ihre biologisch aktiven Fragmente und daher umfassen die sie codierenden Vektoren auch Vektoren, die Fragmente dieser Proteine codieren, und die transformierten Wirte umfassen jene, die solche Fragmente herstellen. Die hier offenbarten Derivate sind Derivate, die durch Standardmodifizierung der Proteine oder ihrer Analoge oder Fragmente hergestellt werden, die durch die transformierten Wirte hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Arzneimittel, umfassend rekombinante Tiervirusvektoren, codierend das MORT-1-Protein, wobei der Vektor auch ein Virus-Oberflächenprotein codiert, das in der Lage ist, Oberflächenproteine spezifischer Zielzellen (z. B. Krebszellen) zu binden, um die Einführung der MORT-1-Sequenz in die Zellen zu steuern. Andere Aspekte der Erfindung werden aus den folgenden Beispielen offensichtlich.
Die Erfindung wird nun in den folgenden, nicht einschränkenden Beispielen und den begleitenden Zeichnungen genauer beschrieben:
BEISPIEL 1: Clonierung und Isolierung des MORT-1-Proteins, welches an die intrazelluläre Domäne des FAS-R bindet
(i) Zwei-Hybrid-Screening und Zwei-Hybrid-β-Galactosidase-Expressionstest
Um die Proteine zu isolieren, die mit der intrazellulären Domäne des FAS-R in Wechselwirkung treten, wurde das Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet (Fields und Song, 1989, vgl. auch die ebenfalls anhängigen IL 109632 , 112002 und 112692 ). Kurz gesagt ist dieses Zwei-Hybrid-System ein auf Hefe basierender genetischer Test, um die spezifischen Wechselwirkungen zwischen Protein und Protein in vivo durch Wiederherstellung eines eukaryontischen transkriptionellen Aktivators wie GAL4 nachzuweisen, der zwei getrennte Domänen hat, eine DNA-bindende und eine Aktivierungsdomäne, wobei die Domänen, wenn sie exprimiert und miteinander verbunden werden, um ein wiederhergestelltes GAL4-Protein zu bilden, in der Lage sind, eine stromaufwärts liegende Aktivierungssequenz zu binden, die wiederum einen Promotor aktiviert, der die Expression eines Reportergens wie lacZ oder HIS3 kontrolliert, deren Expression in den gezüchteten Zellen leicht beobachtet werden kann. In diesem System werden die Gene für die Kandidaten der interagierenden Proteine in getrennte Expressionsvektoren cloniert. In einem Expressionsvektor wird die Sequenz des einen Kandidatenproteins in Phase mit der Sequenz der GAL4-DNA-Bindungsdomäne cloniert, um ein Hybridprotein mit der GAL4-DNA- Bindungsdomäne zu erzeugen, und im anderen Vektor wird die Sequenz des zweiten Kandidatenproteins in Phase mit der Sequenz der GAL4-Aktivierungsdomäne cloniert, um ein Hybridprotein mit der GAL4-Aktivierungsdomäne zu erzeugen. Die beiden Hybrid-Vektoren werden dann in einen Hefe-Wirtsstamm kotransformiert, wobei diese transformierten Wirtszellen (Kotransformanten), in welchen die zwei Hybrid-Proteine exprimiert werden und in der Lage sind, miteinander in Wechselwirkung zu treten, zur Expression des Reportergens in der Lage sein werden. Im Fall des lacZ-Reportergens werden die dieses Gen exprimierenden Wirtszellen eine blaue Farbe bekommen, wenn X-Gal zu den Kulturen zugegeben wird. Daher sind blaue Kolonien ein Hinweis für die Tatsache, dass die beiden clonierten Kandidatenproteine in der Lage sind, miteinander zu interagieren.
Unter Verwendung dieses Zwei-Hybrid-Systems wurde die intrazelluläre Domäne FAS-IC getrennt in den Vektor pGBT9 (die GAL4-DNA-Bindungssequenz tragend, bezogen bei CLONTECH, USA, vgl. Nachstehendes) cloniert, um Fusionsproteine mit der GAL4-DNA-Bindungsdomäne zu schaffen. Für die Clonierung von FAS-R in pGBT9 wurde ein Clon, codierend die cDNA-Sequenz des FAS-R in voller Länge (vgl. IL 111125 , ebenfalls anhängig) verwendet, aus dem die intrazelluläre Domäne (IC) mit Standardverfahren unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme ausgeschnitten und dann mit Standardverfahren isoliert und in den geöffneten pGBT9-Vektor in die entsprechende Region der multiplen Clonierungsstellen (MCS) mit den entsprechenden geeigneten Restriktionsenzymen inseriert wurde. Es sollte erwähnt werden, dass die FAS-IC von den Resten 175-319 des intakten FAS-R reicht, wobei dieser Anteil, enthaltend die Reste 175-319, die in den pGBT9-Vektor inserierte FAS-IC ist (vgl. auch IL 111125 ).
Der vorstehende hybride (chimäre) Vektor wurde dann zusammen mit einer cDNA-Bibliothek aus menschlichen HeLa-Zellen, cloniert in den pGAD-GH-Vektor, der die GAL4-aktivierende Domäne trägt, in den HF7c-Hefe-Wirtsstamm kotransfiziert (alle vorstehend erwähnten Vektoren, pGBT9 und pGAD-GH, die cDNA-Bibliothek aus HeLa-Zellen tragend, und der Hefestamm wurden von Clontech Laborstories, Inc., USA, als Teil des MATCHMAKER Two-Hybrid System #PT1265-1 bezogen). Die kotransfizierten Hefen wurden auf ihre Fähigkeit, in Medium ohne Histidin (His^–-Medium) zu wachsen, selektiert, wobei die wachsenden Kolonien positive Transformanten anzeigen. Die selektierten Hefeclone wurden dann auf ihre Fähigkeit, das lacZ-Gen zu exprimieren, d. h. auf ihre LAC-Z-Aktivität, getestet und zwar durch Zugabe von X-Gal zum Kulturmedium, welches katabolisch umgesetzt wird, so dass ein blau gefärbtes Produkt durch β-Galactosidase, das Enzym, das durch das lacZ-Gen codiert wird, gebildet wird. Daher zeigen blaue Kolonien ein aktives lacZ-Gen an. Für die Aktivität des lacZ-Gens ist es notwendig, dass der GAL4-Transkriptionsaktivator in einer aktiven Form in den transformierten Clonen vorhanden ist, nämlich, dass die Gal4-DNA-bindende Domäne, codiert von dem vorstehenden Hybridvektor, mit der GAL4-Aktivierungsdomäne, codiert durch den anderen Hybridvektor, richtig kombiniert ist. Eine solche Kombination ist nur möglich, wenn die beiden Proteine, die mit jeder der GAL4-Domänen fusioniert sind, in der Lage sind, stabil miteinander in Wechselwirkung zu treten (zu binden). Daher sind die His⁺- und blue (LAC Z+)-Kolonien, die isoliert wurden, Kolonien, welche mit einem Vektor, der FAS-IC codiert, und einem Vektor, codierend ein Proteinprodukt mit Ursprung aus HeLa-Zellen, das in der Lage ist, stabil an FAS-IC zu binden, kotransfiziert wurden.
Die Plasmid-DNA aus den vorstehenden His⁺-, LAC-Z⁺-Hefekolonien wurde isoliert und in den E. coli-Stamm HB101 durch Standardelektroporationsverfahren übertragen, gefolgt von Selektion der Leu⁺- und Ampicillin-resistenten Transformanten, wobei diese Transformanten diejenigen sind, die den hybriden pGAD-GH-Vektor tragen, welcher die Amp^R und Leu²-codierenden Sequenzen trägt. Solche Transformanten sind daher Clone, welche die Sequenzen tragen, die neu identifizierte Proteine codieren, die in der Lage sind, an FAS-IC zu binden. Plasmid-DNA wurde dann aus diesen transformierten E. coli isoliert und erneut getestet durch:

(a) erneute Transformation mit dem ursprünglichen Hybridplasmid für die intrazelluläre Domäne von FAS-R (Hybrid pGTB9, FAS-IC tragend) in den Hefestamm HF7, wie vorstehend dargelegt. Als Kontrollen wurden Vektoren, die irrelevante Protein codierende Sequenzen tragen, z. B. pACT-Lamin oder pGBT9 allein, zur gemeinsamen Transformation mit dem FAS-IC-bindendes Protein (d. h. MORT-1)-codierenden Plasmid verwendet. Die kotransformierten Hefen wurden dann auf Wachstum auf His^–-Medium allein oder mit verschiedenen Spiegeln von 3-Aminotriazol getestet und
(b) erneute Transformation der Plasmid-DNA und des ursprünglichen FAS-IC-Hybrid-Plasmids und der Kontrollplasmide, die in (a) beschrieben werden, in Hefe-Wirtszellen des Stamms SFY526 und Bestimmung der LAC-Z⁺-Aktivität (Effektivität der β-Gal-Bildung, d. h. Bildung der blauen Farbe).

Die Ergebnisse der vorstehenden Tests zeigten, dass das Wachstumsmuster der Kolonien in His^–-Medium identisch mit dem Muster der LAC-Z-Aktivität wie sie durch die Farbe der Kolonie bestimmt wurde, war, d. h. His⁺-Kolonien waren ebenfalls LAC-Z⁺. Weiterhin wurde die LAC-Z-Aktivität in Flüssigkultur (bevorzugte Kulturbedingungen) nach der Transfektion der GAL4-DNA-Bindungsdomäne und der Hybride der Aktivierungsdomäne in die SFY526-Hefewirte untersucht, welche eine bessere LAC-Z-Induzierbarkeit mit dem GAL4-Transkriptionsaktivator als die der HF-7-Hefe-Wirtszellen haben.
Unter Verwendung der vorstehenden Verfahren wurde ein Protein namens HF1 und nun auch MORT-1 für „Mediator of Rezeptor-induced Toxicity" („Vermittler der Rezeptor-induzierten Toxizität") genannt identifiziert, isoliert und charakterisiert.
Weiterhin sollte erwähnt werden, dass in einer Anzahl der vorstehenden Zwei-Hybrid-β-Galactosidase-Expressionstests die Expression der β-Galaktosidase auch mit einem bevorzugten Filtertest untersucht wurde. Im Screening wurde für 5 von etwa 3 × 10⁶ cDNAs gefunden, dass sie die MORT-1-Insertion tragen. Die so isolierte clonierte MORT-1-cDNA-Insertionen wurden dann unter Verwendung von Standard-DNA-Sequenzierungsverfahren sequenziert. Die Aminosäuresequenz von MORT-1 wurde von der DNA-Sequenz abgeleitet. Die Nummerierung der Reste in den Proteinen, codiert durch die cDNA-Insertionen, ist wie in der Swiss-Prot-Datenbank. Deletionsmutanten wurden durch PCR und Punktmutationen durch Oligonucleotidvermittelte Mutagenese produziert (Current Protocols in Molec. Biol., 1994).
(ii) Induzierte Expression, metabolische Markierung und Immunpräzipitation von Proteinen
MORT-1, N-verknüpft an das FLAG-Octapeptid (FLAG-HF1, Eastman Kodak, New Haven, Ct., USA), Fas-IC, FAS-R, p55-R, eine Chimäre, umfassend die extrazelluläre Domäne von p55-R (Aminosäuren 1-168), fusioniert an die transmembrane und die intrazelluläre Domäne von FAS-R (Aminosäuren 153-319) und die Luziferase-cDNA, welche als Kontrolle dient, wurden in HeLa-Zellen exprimiert. Die Expression wurde unter Verwendung eines Tetracyclin-kontrollierten Expressionsvektors in einen HeLa-Zellclon (HtTA-1), der einen Tetracyclinkontrollierten Transaktivator exprimiert, durchgeführt (Gossen und Bujard, 1992, wie in PCT/US95/05854 beschrieben, vgl. auch Boldin et al., 1995). Die metabolische Markierung mit [³⁵S]-Methionin und [³⁵S]Cystein (DUPONT, Wilmington, De., USA und Amersham, Buckinghamshire, England) wurde 18 Stunden nach der Transfektion durch eine Inkubation für weitere 4 Std. bei 37°C in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium" ohne Methionin und Cystein, aber ergänzt mit 2% dialysiertem fötalem Kälberserum, durchgeführt. Die Zellen wurden dann in RIPA-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% Desoxycholat, 0,1% SDS und 1 mM EDTA) lysiert und das Lysat wurde durch Inkubation mit einem irrelevanten Kaninchen-Antiserum (3 μl/ml) und Protein-G-Sepharose-Kügelchen (Pharmacia, Uppsala, Schweden, 60 μl/ml) vorgeklärt. Immunpräzipitation wurde durch eine Inkubation für 1 Std. bei 4°C von Aliquots von 0,3 ml Lysat mit monoclonalen Maus-Antikörpern (5 μl/Aliquot) gegen das FLAG-Octapeptid (M2, Eastman Kodak), p55-R (#18 und #20, (Engelmann et al., 1990)) oder FAS-R (ZB4, Kamiya Southand Oaks, Ca., USA) oder mit vom Isotyp passenden Maus-Antikörpern als Kontrolle, gefolgt von einer weiteren Inkubation für 1 Std. mit Protein-G-Sepharose-Kügelchen (30 μl/Aliquot), durchgeführt.
(iii) In vitro-Bindung
Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionen mit dem Wildtyp- oder einem mutierten Fas-IC wurden hergestellt und an Glutathion-Agarose-Kügelchen adsorbiert (wie in IL 109632 , 111125 , 112002 , 112692 beschrieben, vgl. auch Boldin et al., 1995, Current Protocols in molecular biology, 1994, Frangioni und Neel, 1993). Die Bindung von metabolisch markiertem FLAG-HF1-Fusionsprotein an GST-Fas-IC wurde durch Inkubation der Kügelchen für 2 Std. bei 4°C mit Extrakten von HeLa-Zellen, die mit [35S]-Methionin (60 μCi/ml) metabolisch markiert wurden und die FLAG-HF1 exprimieren, untersucht. Die Extrakte wurden in einem Puffer, enthaltend 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% NP-40, 1 mM Dithiotreit, 1 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 20 μg/ml Aprotonin, 20 μg/ml Leupeptin, 10 mM Natriumfluorid und 0,1 mM Natriumvanadat (1 ml pro 5 × 10⁵ Zellen), präpariert.
(iv) Beurteilung der Cytotoxizität, die durch die induzierte Expression von HF1 ausgelöst wird
HF1-, Fas-IC-, p55-IC- und Luciferase-cDNAs wurden in einen durch Tetracyclin kontrollierten Expressionsvektor inseriert und in HtTA-1-Zellen (eine HeLa-Zelllinie) (Gossen und Bujard, 1992) zusammen mit der sekretierten placentaren alkalischen Phosphatase-cDNA unter Kontrolle des SV40-Promotors (der pSBC-2-Vektor (Dirks et al., 1993)) transfiziert. Der Zelltod wurde 40 Stunden nach der Transfektion untersucht, entweder durch den Neutralrot-Aufnahmetest (Wallach, 1984), oder zur spezifischen Untersuchung des Todes jener Zellen, welche die transfizierten cDNAs exprimieren, durch Bestimmung der Mengen der placentaren alkalischen Phosphatase (Berger et al., 1998), die in den letzten 5 Stunden der Inkubation in das Wachstumsmedium sekretiert wurde.
In einer anderen Serie von Experimenten zur Analyse der Region des MORT-1 (HF1)-Proteins, die an der Bindung an die FAS-IC beteiligt ist, wurden die folgenden Proteine transient in HeLa-Zellen, die einen durch Tetracyclin kontrollierten Transaktivator (HtTA-1) enthielten, unter Verwendung eines durch Tetracyclin kontrollierten Expressionsvektors (pUHD10-3) exprimiert: nur menschlicher FAS-R, menschlicher FAS-R sowie der N-terminale Teil von MORT-1 (Aminosäuren 1-117, der „MORT-1-Kopf"), menschlicher FAS-R sowie der C-terminale Teil von MORT-1, welcher seine „Todesdomänen"-Homologieregion enthält (Aminosäuren 130-245, das „MORT-1-DD", vgl. auch IL112742 ), FLAG-55.11 (Aminosäuren 309-900 von Protein 55.11, am N-Terminus an das FLAG-Oktapeptid fusioniert, wobei das 55.11-Protein ein p55-IC-spezifisches Bindungsprotein ist; vgl. auch IL 109632 ). 12 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen trypsiniert und in einer Konzentration von 30.000 Zellen/Vertiefung wieder ausgesät. Nach 24 Std. weiterer Inkubation wurden die Zellen für 6 Std. mit einem monoclonalen Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne des FAS-R (monoclonaler Antikörper CH-11, Oncor) in verschiedenen Konzentrationen (0,001-10 μg/ml monoclonaler Antikörper) in Gegenwart von 10 g/ml Cycloheximid behandelt. Die Zell-Lebensfähigkeit wurde dann durch den Neutralrot-Aufnahmetest bestimmt und die Ergebnisse wurden als % lebensfähige Zellen im Vergleich zu Zellen, die mit Cycloheximid allein (in Abwesenheit des monoclonalen anti-FAS-R-Antikörpers CH-11) inkubiert wurden, präsentiert.
(v) Northern- und Sequenzanalysen
Poly(A)⁺-RNA wurde aus Gesamt-RNA aus HeLa-Zellen isoliert (Oligotex-dT-mRNA-Kit, QIAGEN, Hilden, Deutschland). Die Northern-Analyse unter Verwendung der HF1-cDNA als Sonde wurde mit konventionellen Verfahren durchgeführt (wie in PCT/US95/05854 beschrieben, vgl. auch Boldin et al., 1995). Die Nucleotidsequenz von MORT-1 (HF1) wurde in beiden Richtungen durch das Didesoxy-Kettenterminationsverfahren bestimmt.
Die Ergebnisse (gezeigt in Tabelle 1 und 1-7), die aus den vorstehenden experimentellen Verfahren erhalten wurden, sind wie folgt: die Sequenzanalyse der MORT-1-cDNA, die durch das Zwei-Hybrid-Verfahren cloniert wurde, zeigte, dass sie ein neues Protein codiert (vgl. nachstehend). Die Anwendung des Zwei-Hybrid-Tests zur weiteren Beurteilung der Spezifität der Bindung dieses Proteins (MORT-1 für „Mediator of Receptor-induced Toxicity", „Vermittler der Rezeptor-induzierten Toxizität") an Fas-IC und zur Definition der besonderen Region in Fas-IC, an die es bindet, führte zu den folgenden Befunden (Tabelle 1): (a) das Protein bindet sowohl an menschlichen als auch an Maus-Fas-IC, aber nicht an einige andere getestete Proteine, einschließlich dreier Rezeptoren der TNF/NGF-Rezeptorfamilie (p55- und p75-TNF-Rezeptoren und CD40), (b) Austauschmutationen an Position 225 (Ile) in der „Todesdomäne" des FAS-R, für die gezeigt wurde, dass sie die Signalisierung sowohl in vitro als auch in vivo aufheben (die Ipr^cg-Mutation (Watanabe-Fukunaga et al., 1992, Itoh und Nagata, 1993) verhindern auch die Bindung von MORT-1 an die FAS-IC, (c) die MORT-1-Bindungsstelle in FAS-R kommt innerhalb der „Todesdomäne" dieses Rezeptors vor und (d) MORT-1 bindet an sich selbst. An dieser Selbstbindung und der Bindung von HF1 an FAS-R sind verschiedene Regionen des Proteins beteiligt. Ein Fragment von MORT-1, entsprechend den Resten 1-117, bindet an Volllängen-MORT-1, bindet jedoch nicht an sich selbst oder an die FAS-IC. Umgekehrt bindet ein Fragment, das den Resten 130-245 entspricht, an FAS-R, es bindet jedoch nicht an MORT-1 (Tabelle 1). Weiterhin ist es aus den Ergebnissen in Tabelle 1 ersichtlich, dass die „Todesdomänen"-Region von FAS-R für die FAS-IC-Selbstassoziation kritisch ist, so wie die „Todesdomänen"-Region von p55-R für die p55-IC-Selbstassoziation kritisch ist. Die Deletionen auf beiden Seiten dieser „Todesdomänen" beeinflussen nicht ihre Fähigkeit zur Selbstassoziation, während jedoch eine Deletion innerhalb dieser „Todesdomänen” die Selbstassoziation beeinflusst. Im Fall von MORT-1 hängt die Bindung von MORT-1 an FAS-IC auch von der vollständigen (ganzen) „Todesdomäne" des FAS-R ab, während sie jedoch nicht von den Regionen außerhalb der FAS-R-„Todesdomänen"-Region für die FAS-IC-Bindung abhängig ist.
Tabelle 1 Wechselwirkung von MORT-1 mit FAS-IC und Selbstassoziation von MORT-1 in transformierten Hefen: Beurteilung durch einen Zwei-Hybrid-β-Galactosidase-Expressionstest
In der vorstehenden Tabelle 1 wird die Wechselwirkung der Proteine, die durch die Gal4-DNA-Bindungsdomänen- und Aktivierungsdomänenkonstrukte (pGBT9 und pGAD-GH) codiert werden, in transfizierten SFY526-Hefen dargestellt, wie sie durch den β-Galactosidase-Expressionsfiltertest beurteilt wurde. Die DNA-Bindungsdomänen-Konstrukte umfassten vier Konstrukte der menschlichen Fas-IC, vier Konstrukte der Maus-Fas-IC, einschließlich zweier Konstrukte in voller Länge mit Austauschmutationen von He zu Leu oder Ile zu Ala an Position 225 (I225N beziehungsweise I225A) und drei HF1 (MORT-1)-Konstrukte, wobei alle diese Konstrukte schematisch auf der linken Seite der Tabelle gezeigt werden. Die Aktivierungsdomänen-Konstrukte umfassten drei HF1-Konstrukte, wobei der HF1-Anteil wie in den DNA-Bindungsdomänenkonstrukten ist, und ein Konstrukt von menschlicher Fas-IC in voller Länge, wobei der Fas-IC-Anteil derselbe ist wie im vorstehenden DNA-Bindungsdomänen-Konstrukt. Die intrazellulären Domänen des menschlichen p55-TNF-Rezeptors (p55-IC Reste 206-426), des menschlichen CD40 (CD40-IC, Reste 216-277) und des menschlichen p75-TNF-Rezeptors (p75-IC, Reste 287-461) sowie Lamin-, Cyclin D- und „leere" Gal4 (pGBT9)-Vektoren dienten als Negativkontrollen in Form von DNA-Bindungsdomänenkonstrukten. SNF1 und SNF4 dienten als Positivkontrollen in Form von DNA-Bindungsdomänen (SNF1) und Aktivierungsdomänen (SNF4)-Konstrukte. „Leere" Gal4-Vektoren (pGAD-GH) dienten auch als Negativkontrollen in Form von Aktivierungsdomänen-Konstrukten (für mehr Details betreffend p55-IC und p75-IC vgl. auch PCT/US95/05854 ). Die Symbole „++" und „+" bezeichnen die Entwicklung einer starken Färbung innerhalb von 30 beziehungsweise 90 min des Tests und „–" bezeichnet keine Entwicklung einer Farbe innerhalb von 24 Std.. Kombinationen, für die keine Bewertung abgegeben wird, wurden nicht getestet.
Die Expression von HF1 (MORT-1)-Molekülen, die an ihrem N-Terminus mit dem FLAG-Octapeptid (FLAG-HF1) fusioniert sind, ergaben in HeLa-Zellen Proteine von vier verschiedenen Größen – etwa 27, 28, 32 und 34 kDa. In (1A und B) werden die Ergebnisse gezeigt, welche die Wechselwirkung von HF1 mit Fas-IC in vitro zeigen. Wie vorstehend in der Beschreibung der 1A und B erwähnt wird, ist 1A eine Reproduktion eines Kontroll-Autoradiogramms eines Immunpräzipitats von Proteinen aus Extrakten von HeLa-Zellen, die mit dem FLAG-HF1 (FLAG-MORT1)-Fusionsprotein oder mit Luciferase-cDNA als Kontrolle transfiziert wurden, wobei die Immunpräzipitation mit dem anti-FLAG-Antikörper (αFLAG) durchgeführt wurde. 1B ist eine Reproduktion eines Autoradiogramms, das die Wechselwirkung in vitro zwischen HF1 und FAS-IC zeigt, worin HF1 in Form von mit [³⁵S]-Methionin metabolisch markierten HF1-FLAG-Fusionsproteinen, die aus Extrakten von transfizierten HeLa-Zellen erhalten wurden, vorliegt und die FAS-IC in Form von menschlichem und Maus-GST-FAS-IC-Fusionsproteinen einschließlich einem mit einer Austauschmutation an Position 225 in der FAS-IC vorliegt, wobei alle GST-FAS-IC-Fusionsproteine in E. coli produziert wurden. Die GST-Fusionsproteine wurden vor der Wechselwirkung mit den Extrakten, enthaltend das HF1-FLAG-Fusionsprotein, an Glutathionkügelchen angeheftet und nach dieser Wechselwirkung wurde eine SDS-PAGE durchgeführt. Daher wurde die in vitro-Wechselwirkung durch Untersuchung der Bindung von mit [³⁵S]-Methionin metabolisch markiertem HF1, das in transfizierten HeLa-Zellen als Fusionsprotein mit dem FLAG-Octapeptid (FLAG-HF1) hergestellt wurde, an GST, eine GST-Fusion mit dem menschlichem und Maus-Fas-IC (GST-huFas-IC, GST-mFas-IC) oder an eine GST-Fusion mit der Fas-IC, enthaltend eine Ile zu Ala-Austauschmutation an Position 225, durch Autoradiographie nach SDS-PAGE bewertet. Wie es aus 1B ersichtlich wird, zeigten alle vier FLAG-HF1-Proteine die Fähigkeit, nach Inkubation mit einem GST-Fas-IC-Fusionsprotein an Fas-IC zu binden. Im Hefe-Zwei-Hybrid-Test (Tabelle 1) band HF1 nicht an ein GST-Fas-IC-Fusionsprotein mit einem Austausch an der Ipr^cg-Mutationstelle (I225A).
Die durch die FLAG-HF1-cDNA codierten Proteine zeigten auch eine Fähigkeit, an die intrazelluläre Domäne von FAS-R zu binden, sowie an die intrazelluläre Domäne der FAS-R-Chimäre, deren extrazelluläre Domäne durch die von p55-R (p55-FAS) ersetzt wurde, wenn sie mit diesen Rezeptoren in HeLa-Zellen koexprimiert wurden. In den (2A, B, C) werden die Ergebnisse gezeigt, welche die Wechselwirkung von HF1 mit FAS-IC in transfizierten HeLa-Zellen, d. h. in vivo, zeigen. Wie vorstehend in der Beschreibung der 2A, B, C erwähnt wird, sind diese Figuren Reproduktionen von Autoradiogrammen von Immunpräzipitaten von verschiedenen transfizierten HeLa-Zellen, welche die in vivo-Wechselwirkung und die Spezifität der Wechselwirkung zwischen HF1 und FAS-IC in Zellen zeigen, die mit Konstrukten, welche diese Proteine codieren, kotransfiziert sind. Daher wurde das FLAG-HF1-Fusionsprotein in HeLa-Zellen allein oder zusammen mit dem menschlichen FAS-R, der FAS-R-Chimäre, in welcher die extrazelluläre Domäne von FAS-R durch die entsprechende Region im menschlichen p55-R (p55-FAS) ersetzt wurde, oder mit dem menschlichen p55-R als Negativkontrolle exprimiert und metabolisch mit [³⁵S]-Cystein (20 μCi/ml) und [³⁵S]-Methionin (40 μCi/ml) markiert. Kreuz-Immunpräzipitation von HF1 mit dem koexprimierten Rezeptor wurde unter Verwendung der angegebenen Antikörper (2A-C) durchgeführt. Wie aus den 2A-C hervorgeht, ist FLAG-HF1 in der Lage, an die intrazelluläre Domäne von FAS-R zu binden, sowie an die intrazelluläre Domäne einer FAS-R-p55-R-Chimäre mit der extrazellulären Domäne von p55-R und der intrazellulären Domäne von FAS-R, wenn er mit diesen Rezeptoren in den HeLa-Zellen koexprimiert wird (vgl. die 3 mittleren Spuren in 2A beziehungsweise die 3 linken Spuren in 2C). Weiterhin führte die Immunpräzipitation von FLAG-HF1 aus Extrakten der transfizierten Zellen auch zur Präzipitation des koexprimierten FAS-R (2A) oder der koexprimierten p55-FAS-Chimere (2C). Umgekehrt führte die Immunpräzipitation dieser Rezeptoren zur Kopräzipitation von FLAG-HF1 (2A und 2C).
Eine Northern-Analyse unter Verwendung der HF1-cDNA als Sonde zeigte ein einzelnes hybridisierendes Transkript in HeLa-Zellen. 3 zeigt eine Reproduktion eines Northern-Blots, in dem poly(A)⁺-RNA (0,3 μg) aus transfizierten Zellen mit der HF1-cDNA hybridisiert wurde. Die Größe dieses Transkripts (etwa 1,8 kB) ist ähnlich der von HF1-cDNA (etwa 1702 Nucleotide).
In einer Sequenzanalyse wurde herausgefunden, dass die cDNA einen offenen Leserahmen von etwa 250 Aminsäuren enthält. 4 zeigt die vorläufige Nucleotid- und die abgeleitete Aminosäuresequenz von HF1, in welcher das „Todesdomänen"-Motiv unterstrichen ist, so wie ein Met-Rest als möglicher Start (Position 49, fett, unterstrichenes M) und das Translations-Stoppcodon (das Sternchen unter dem Codon an Position 769-771) unterstrichen sind. Dieses „Todesdomänen"-Motiv hat Homologie mit den bekannten p55-R- und FAS-R-„Todesdomänen"-Motiven (p55DD und FAS-DD). Um das genaue c-terminale Ende von HF1 zu bestimmen und um Hinweise betreffend das genaue N-terminale Ende (Met-Rest am Anfang) von HF1 zu erhalten, wurden zusätzliche Experimente wie folgt ausgeführt:
Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren wurde eine Anzahl von Konstrukten, codierend die HF1-Moleküle, die an ihrem N-Terminus mit dem FLAG-Octapaptid (FLAG-HF1) fusioniert sind, konstruiert und in HeLa-Zellen unter metabolischer Markierung der exprimierten Proteine unter Verwendung von ³⁵S-Cystein und ³⁵S-Methionin exprimiert (vgl. Vorstehendes bezüglich 5B). Die HF1-FLAG-Moleküle wurden durch die folgenden cDNAs, enthaltend verschiedene Anteile der HF1-codierenden Sequenz, codiert:

i) Die FLAG-Octapeptid-cDNA, verknüpft mit dem 5'-Ende der HF1-cDNA, von welcher die Nucleotide 1-145 (vgl. 4) deletiert wurden,
ii) Die FLAG-Octapeptid-cDNA, verknüpft mit dem 5'-Ende der HF1-cDNA in voller Länge (vgl. vorstehendes FLAG-HF1-Konstrukt bezüglich 1B)
iii) Die FLAG-Octapeptid-cDNA, verknüpft mit dem 5'-Ende der HF1-cDNA, von welcher die Nucleotide 1-145 sowie die Nucleotide 832-1701 (vgl. 4) deletiert wurden und das Codon GCC an Position 142-144 zu TCC mutiert wurde, um den Start der Translation an dieser Stelle zu verhindern.

Nach der Expression der vorstehenden HF1-FLAG-Fusionsprodukte wurde eine Immunpräzipitation, wie vorstehend erwähnt, unter Verwendung von entweder monoclonalen anti-FLAG-Antikörpern (M2) oder als Kontrolle anti-p75-TNF-R-Antikörper (#9) ausgeführt, gefolgt von SDS-PAGE (10% Acrylamid) und Autoradiographie. Die Ergebnisse werden in 5 gezeigt, welche eine Reproduktion eines Autoradiogramms ist, auf dem die vorstehend erwähnten HF1-FLAG-Fusionsproteine getrennt wurden, wobei die Proben auf jede Spur des Gels wie folgt geladen wurden:
Spuren 1 und 2: HF1-FLAG-Fusionsprotein, codiert durch die FLAG-Octapeptid-cDNA, verknüpft mit dem 5'-Ende der HF1-cDNA, von der die Nucleotide 1-145 deletiert wurden.
Spuren 3 und 4: HF1-FLAG-Fusionsprotein, codiert durch die FLAG-Octapeptid-cDNA, verknüpft mit dem 5'-Ende der HF1-cDNA in voller Länge.
Spuren 5 und 6: HF1-FLAG-Fusionsprotein, codiert durch die FLAG-Octapeptid-cDNA, verknüpft mit dem 5'-Ende der HF1-cDNA, von der die Nucleotide 1-145 sowie 832-1701 deletiert wurden und GCC an Position 142-144 zu TCC mutiert wurde, um den Start der Translation an dieser Stelle zu verhindern.
Die Immunpräzipitationen wurden mit monoclonalen anti-FLAG-Antikörpern für die Proben in den Spuren 2, 4 und 6 und anti-p75-TNF-R-Antikörpern für die Proben in den Spuren 1, 3 und 5 durchgeführt.
Aus dem Autoradiogramm von 5 ist ersichtlich, dass die Identität der Produktgrößen in den Spuren 2 und 4 bestätigt, dass die Nucleotide 769-771 die Stelle der Translationstermination für HF1 ist, d. h. dieses Codon repräsentiert ein Stoppsignal und wird durch ein Sternchen in 4 angezeigt. Weiterhin weist das Auftreten einer breiten Bande in Spur 6, welche allerdings zwei Translationsprodukte repräsentiert (wie man es auf dem Gel erkennen kann, aber dadurch dass sie stark markiert sind, werden sie zu einer einzelnen Bande im Autoradiogramm), darauf hin, dass das Auftreten von zwei zusätzlichen Produkten (die breiten Banden höheren Molekulargewichts) in den Spuren 2 und 4 die Initiation der Translation sowohl am N-Terminus des FLAG-HF1-Fusionsmoleküls als auch am Methioninrest Nummer 49 innerhalb der HF1-Sequenz widerspiegeln (vgl. das fette unterstrichene M an Position 49 der Aminosäuresequenz in 4). Daher bestätigten (validierten) die vorstehenden Ergebnisse das C-terminale Ende von HF1 und lieferten Hinweise darauf, dass das N-terminale Ende von HF1 an Position 49 der Sequenz in 4 sein kann.
In der Tat wurde durch zusätzliche Expressionsexperimente von HF1 ohne das an sein 5'-Ende fusionierte FLAG-Octapeptid gezeigt, dass Met⁴⁹ als eine effektive Initiationstelle der Translation dient.
Es sollte erwähnt werden, dass eine in den Datenbanken „Gen Bank" und „Protein Bank" durchgeführte Suche ergab, dass es keine Sequenz gibt, die der von HF1, dargestellt in 4, entspricht. Daher repräsentiert HF1 ein neues FAS-IC-spezifisches Bindungsprotein.
Eine hohe Expression von p55-IC führt zu einer Auslösung einer cytoziden Wirkung (vgl. IL 109632 , 111125 und Boldin et al., 1995). Die Expression von Fas-IC in HeLa-Zellen hat auch eine solche Wirkung, jedoch in einem geringeren Ausmaß, welche nur unter Verwendung eines sensitiven Tests nachgewiesen werden konnte. In 6A und B wird ein Liganden-unabhängiges Auslösen von cytoziden Wirkungen in mit HF1 sowie menschlicher p55-IC und FAS-IC transfizierten Zellen graphisch dargestellt. Die Wirkung einer transienten Expression von HF1, menschlichem Fas-IC, menschlichem p55-IC oder Luciferase, die als Kontrolle diente, auf die Lebensfähigkeit von HeLa-Zellen wurde unter Verwendung eines Expressionsvektors unter Kontrolle von Tetracyclin untersucht. Die Zell-Lebensfähigkeit wurde 40 min, nach der Transfektion dieser cDNAs entweder in Gegenwart (offene Balken, 6A und B) oder in Abwesenheit (geschlossene Balken, 6A und B) von Tetracyclin (1 μg/ml, um die Expression zu blockieren) zusammen mit einer cDNA, codierend die sekretierte plazentare alkalische Phosphatase, beurteilt. Die Zell-Lebensfähigkeit wurde entweder durch den Neutralrot-Aufnahmetest (6A) bestimmt oder zur spezifischen Bestimmung der Lebensfähigkeit jener bestimmten Zellen, welche die transfizierte DNA exprimieren, durch Messung der Mengen der plazentaren alkalischen Phosphatase, die in das Wachstumsmedium sekretiert wurde (6B).
Daher ist es aus den 6A und B offensichtlich, dass die Expression von HF1 in HeLa-Zellen zu einem signifikanten Zelltod führte, der größer als der durch die FAS-IC-Expression verursachte ist. Diese cytotoxischen Wirkungen von p55-IC, FAS-IC und HF1 scheinen mit den „Todesdomänen"-Regionen, die in allen dieser Proteine vorhanden sind, in Beziehung zu stehen, wobei die „Todesdomänen" eine Neigung zur Selbstassoziation haben und dadurch möglicherweise die cytotoxischen Wirkungen veranlassen.
Die vorstehend erwähnten Charakteristika von HF1 (MORT-1), nämlich die spezifische Assoziation von HF1 mit der bestimmten Region im FAS-R, welche an der Induktion des Zelltodes beteiligt ist, und die Tatsache, dass sogar eine leichte Änderung der Struktur in jener Region, welche die Signalisierung verhindert (die Ipr^cg-Mutation), auch die Bindung von HF1 zunichte macht, weisen darauf hin, dass dieses Protein eine Rolle bei der Signalisierung oder der Auslösung von Zelltod spielt. Diese Auffassung wird weiter durch die beobachtete Fähigkeit von HF1, selbst eine cytozide Wirkung auszulösen, unterstützt. Daher kann HF1 (MORT-1) als (i) Modulator der Selbstassoziation von FAS-R durch seine eigene Fähigkeit, an FAS-R sowie an sich selbst zu binden, funktionierenden oder (ii) als Andockstelle für zusätzliche Proteine, die an der FAS-R-Signalisierung beteiligt sind, dienen, d. h. HF1 kann ein „Docking"-Protein sein und kann daher andere Rezeptoren neben FAS-R binden, oder (iii) einen Teil eines bestimmten Signalisierungssystems darstellen, das mit der FAS-R-Signalisierung interagiert.
Um die an der FAS-IC-Bindung und an der Modulation der durch FAS-R vermittelten zellulären Wirkungen (Cytotoxizität) beteiligten Regionen von MORT-1 (HF1) weiter zu analysieren, wurden die vorstehend erwähnten Experimente unter Verwendung von Vektoren, die Teile von MORT-1 codieren (den „MORT-1-Kopf", Aminosäuren 10117 und die „MORT-1-dd", Aminosäuren 130-245) (getrennt), mit einem Vektor, codierend den menschlichen FAS-R, zur Kotransfektion von HeLa-Zellen durchgeführt. In diesen Experimenten wurden die verschiedenen Proteine und Kombinationen von Proteinen transient in HeLa-Zellen, die einen durch Tetracyclin kontrollierten Transaktivator (HtTA-1) enthalten, durch Insertion der die Proteine codierenden Sequenzen in einen durch Tetracyclin kontrollierten Expressionsvektor pUHD10-3 exprimiert. Für Kontrolltransfektionen wurden Vektoren, die nur den FAS-R codieren, und Vektoren verwendet, codierend das FLAG-55.11-Fusionsprotein (das 55.11-Protein ist ein p55-IC-spezifisches Bindungsprotein, von dem ein Teil, enthaltend die Aminosäuren 309-900 (an seinem N-Terminus) an das FLAG-Octapaptid fusioniert wurde).
Nach den Transfektions- und Inkubationszeiträumen (vgl (iv), vorstehend) wurden die transfizierten Zellen mit verschiedenen Konzentrationen eines monoclonalen anti-FAS-R-Antikörpers (CH-11) behandelt, welcher spezifisch an die extrazelluläre Domäne von FAS-R, der von diesen Zellen exprimiert wird, bindet. Diese Bindung des anti-FAS-R-Antikörpers induziert die Aggregation von FAS-R an der Zelloberfläche (ähnlich wie der FAS-R-Ligand) und induziert den intrazellulären Signalweg, der durch FAS-IC vermittelt wird, was schließlich zum Zelltod führt (FAS-R-vermittelte zelluläre Cytotoxizität). Die Konzentrationen des verwendeten monoclonalen anti-FAS-R-Antikörpers (CH-11) waren im Bereich von 0,01-10 μg/ml, üblicherweise Konzentrationen wie 0,005, 0,05, 0,5 und 5 μg/ml. Die Zellen wurden mit dem anti-FAS-Antikörper in Gegenwart von 10 μg/ml Cycloheximid behandelt.
Die Ergebnisse der vorstehenden Analyse werden graphisch in 7 dargestellt, welche die %-Lebensfähigkeit der transfizierten Zellen als Funktion der Konzentration des zur Behandlung der Zellen verwendeten monoclonalen anti-FAS-R-Antikörpers (CH-11) für jede der vier verschiedenen Gruppen von transfizierten Zellen darstellt. Diese Gruppen von transfizierten Zellen werden wie folgt durch verschiedene Symbole gekennzeichnet: (i) die offenen Quadrate kennzeichnen die Zellen, die nur mit dem nicht relevanten (d. h. nicht FAS-IC-bindenden) Kontrollvektor, codierend das FLAG-55.11-Fusionsprotein („55.11", Negativkontrolle) transfiziert wurden, (ii) die geschlossenen Quadrate kennzeichnen die Zellen, die mit Vektoren, codierend den FAS-R, und Vektoren, codierend den C-terminalen Anteil von MORT-1, Aminosäuren 130-245, welcher die MORT-1-„Todesdomänen (dd)"- Homologieregion („fas+mort1dd") enthält, kotransfiziert wurden, (iii) die geschlossenen Dreiecke kennzeichnen die Zellen, die nur mit dem Vektor, codierend den FAS-R („fas", Positivkontrolle) transfiziert wurden, und (iv) die offenen Kreise kennzeichnen Zellen, die mit Vektoren, codierend den FAS-R, und Vektoren, codierend den N-terminalen Anteil von MORT-1, Aminosäuren 1-117, den „MORT-1-Kopf" („fas+mort1he"), kotransfiziert wurden.
Aus den in 7 präsentierten Ergebnissen wird offensichtlich, dass die Expression von FAS-R in den transfizierten Zellen eine erhöhte Sensitivität gegenüber den cytoziden Wirkungen der anti-FAS-R-Antikörper überträgt (vergleiche „fas" mit „55.11"). Weiterhin stört die Koexpression der Region in MORT-1, welche die „Todesdomänen"-Homologieregion enthält, und von FAS-R („fas+mort1dd") den durch FAS induzierten (d. h. durch FAS-R vermittelten) Zelltod stark, wie es von der Fähigkeit (vgl. vorstehende Tabelle 1) der MORT-1- „Todesdomänen" (DD)-Region an die FAS-R-„ Todesdomäne” (FAS-DD) zu binden, erwartet würde. Außerdem stört die Koexpression des N-terminalen Teils von MORT-1 und FAS-R („fas+mort1he") nicht den durch FAS-R vermittelten Zelltod und erhöht, wenn überhaupt, die Cytotoxizität ein wenig (d. h. der Zelltod ist leicht erhöht).
Daher zeigen die vorstehenden Ergebnisse eindeutig, dass das MORT-1-Protein zwei unterschiedliche Regionen aufweist, insofern es die Bindung an die FAS-IC und die Vermittlung der zellcytotoxischen Aktivität der FAS-IC betrifft.
Diese Ergebnisse stellen daher auch eine Basis für die Verwendung von verschiedenen Teilen (d. h. aktive Fragmente oder Analoge) des MORT-1-Proteins für verschiedene pharmazeutische Anwendungen bereit. Zum Beispiel können die Analoge oder Fragmente oder Derivate des MORT-1-Proteins, welche im Wesentlichen nur den C-terminalen Anteil von MORT-1 einschließlich seiner „Todesdomänen"-Region enthalten, zur Hemmung der durch FAS-R vermittelten cytotoxischen Wirkungen in FAS-R-enthaltenden Zellen oder Geweben verwendet werden und dadurch diese Zellen oder Gewebe vor den zerstörerischen Wirkungen des FAS-R-Liganden in Fällen wie zum Beispiel akuter Hepatitis schützen. Alternativ können die Analoge oder Fragmente oder Derivate des MORT-1-Proteins, welche im Wesentlichen nur den N-terminalen Anteil von MORT-1 enthalten, zur Verstärkung der durch FAS-R vermittelten cytotoxischen Wirkungen in FAS-R enthaltenden Zellen und Geweben verwendet werden, was dadurch zu einer verstärkten Zerstörung dieser Zellen oder Geweben führt, wenn gewünscht in Fällen wie zum Beispiel Tumorzellen und autoreaktiven T- und B-Zellen. Wie hier vorstehend genauer ausgeführt wurde, können die vorstehenden Verwendungen der verschiedenen Regionen von MORT-1 unter Verwendung verschiedener rekombinanter Viren (z. B. Vaccinia) ausgeführt werden, um die die MORT-1-Region codierende Sequenz in spezifische Zellen oder Gewebe, die behandelt werden sollen, einzuführen.
Weiterhin ist es auch möglich, verschiedene andere Moleküle wie Antikörper, Peptide und organische Moleküle, welche Sequenzen und molekulare Strukturen haben, die den vorstehend erwähnten MORT-1-Regionen entsprechen, zu präparieren und zu verwenden, um dieselben durch diese MORT-1-Regionen vermittelten gewünschten Wirkungen zu erzielen.
LITERATURVERZEICHNIS

Barinaga, M. (1993) Science 262 1512-4.
Berger, J., Hauber, J., Hauber, R., Geiger, R. und Cullen, B. R. (1988) Gene 66, 1-10.
Beutler, B. und Cerami, C. (1987) NEJM, 316: 379-385.
Boldin, M. P. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 337-341,
Brakebusch, C. et al. (1992) FMBO J., 11: 943-950.
Brockhaus, M. et al. (1990) Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 87. 3127-3131.
Cantor, G. H. et al. (1993) Proc. Natl, Acad. Sci. USA 90: 10932-6.
Chef, C. J. et al. (1992) Arm N. Y. Acad. Sci. 660: 271-3.
Crisell, P. et al., (1993) Nucleic Acids Res. (England) 21 (22): 5251-5.
Current protocols in molecular biology (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., Albright, L. M., Coen, D. M. & Varki, A., Hrsg ...), (1994)S. 8.1.1-8.1.6 and 16.7-16.7.8, Greene Publishing Associates, Inc. und Wiley & Sons, Inc., New York.
Dirks, W., Wirth, M. und Hauser, H. (1993) Gene 128, 247-249.
Engelmann, H. et al. (1990) J. Biol. Chem., 265: 1531-1536.
Fields, S. und Song, 0 (1989) Nature, 340: 245-246.
Frangioni, J. V. und Neel, B. G. (1993) Anal. Biochem. 210, 179-187.
Gossen, M. und Boujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551.
Heller; R. A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6151-6155.
Hohmann, H.-P. et al. (1989) J. Biol. Chem., 264: 14927-14934.
Itoh, N. et al. (1991) Cell 66: 233.
Itoh, N. und Nagata, S. (1993) J. 3101. Chem. 268. 10932-7.
Joseph, S. und Burke, J. M. (1993) J. Biol. Chem. 268: 24515-8.
Koizumi, M. et al. (1993) Biol. Pharm. Bull (Japan) 16 (9): 879-83.
Loetscher, H. et al. (1990) Cell, 61: 351-359.
Nophar, Y. et al. (1990) EMBO J., 9: 3269-3278,
Piquet, P. F. et al. (1987) J. Exp. Med., 166: 1280-89.
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarhorLaboratory Press, Cold spring Harbor, NY.
Schall, T. J. et al. (1990) Cell, 61: 361-370.
Shimayama, T. et al., (1993) Nucleic Acids Symp. Ser. 29: 177-8
Shore, S. K. et al. (1993) Oncogene 8: 3183-8.
Smith, C. A. et al. (1990) Science, 248: 1019-1023.
Song, H. Y. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 22492-22495,
Tartaglia, L. A. et al. (1993) Cell, 74: 845-853,
Tracey, J. T. et al. (1987) Nature, 330: 662-664.
Wallach, D. (1984) J. Immunol. 132, 2464-9.
Wallach, D. (1986) in: Interferon 7 (Ion Gresser, Hrsg.), S. 83-122, Academic Press, London
Wallach, D. et al. (1994) Cytokine 6 556.
Watanabe-Fukunaga, R. et al. (1992) Nature, 356, 314-317.
Wilks, A. F. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1603-1607.
Zhao, J. J. und Pick, L. (1993) Nature (England) 365: 448-51.

SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA-Sequenz, welche ein MORT-1-Protein codiert, welches die Aminosäuresequenz wie in 4 dargestellt umfasst, oder Fragmente davon, von denen alle in der Lage sind, die intrazelluläre Domäne von FAS-R zu binden.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer cDNA-Sequenz, abgeleitet vom codierenden Bereich eines nativen MORT-1-Proteins; (b) DNA-Sequenzen, welche in der Lage sind, an die Sequenz aus (a) unter mäßig stringenten Bedingungen zu hybridisieren, und welche ein biologisch aktives, die intrazelluläre Domäne von FAS-R bindendes Protein codieren; und (c) DNA-Sequenzen, welche dem genetischen Code folgend gegenüber den DNA-Sequenzen wie in (a) und (b) definiert degeneriert sind, und welche ein biologisch aktives, die intrazelluläre Domäne von FAS-R bindendes Protein codieren.
MORT-1-Protein oder Fragmente davon, welche von einer Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 codiert werden, wobei das Protein oder die Fragmente in der Lage sind, die intrazelluläre Domäne von FAS-R zu binden.
MORT-1-Protein nach Anspruch 3, welches die abgeleitete Aminosäuresequenz wie in 4 dargestellt hat.
Vektor, welcher eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 umfasst.
Transformierte Wirtszellen, welche einen Vektor nach Anspruch 5 enthalten.
Verfahren zur Herstellung eines MORT-1-Proteins oder von Fragmenten davon nach Anspruch 3 oder 4, umfassend das Züchten der transformierten Wirtszellen nach Anspruch 6 unter Bedingungen, welche für die Expression des Proteins oder der Fragmente geeignet sind, das Durchführen posttranslationaler Modifikationen des Proteins, wie für den Erhalt des Proteins oder der Fragmente erforderlich, und das Isolieren des exprimierten Proteins oder der exprimierten Fragmente.
Antikörper oder aktive Fragmente davon, welche in der Lage sind, das MORT-1-Protein oder Fragmente davon nach Anspruch 3 oder 4 spezifisch zu binden.
Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von Proteinen, Faktoren oder Rezeptoren, welche in der Lage sind, das MORT-1-Protein nach Anspruch 3 oder 4 zu binden, umfassend: (a) das Anwenden des Affinitätschromatographieverfahrens, wobei das MORT-1-Protein an die Affinitätschromatographiematrix angeheftet ist, wobei das angeheftete Protein mit einem Zellextrakt in Kontakt gebracht wird; und wobei Proteine, Faktoren oder Rezeptoren aus dem Zellextrakt, welche an das angeheftete Protein gebunden haben, dann eluiert, isoliert und analysiert werden; oder (b) das Anwenden des Hefe-2-Hybrid-Verfahrens, bei dem eine Sequenz, welche das MORT-1-Protein codiert, von einem Hybridvektor getragen wird, und bei dem eine Sequenz von einer cDNA- oder genomischen DNA-Bibliothek von dem zweiten Hybridvektor getragen wird, wobei die Vektoren dann verwendet werden, um Hefewirtszellen zu transformieren, und die positiven transformierten Zellen isoliert werden, gefolgt von der Extraktion des zweiten Hybridvektors, um eine Sequenz zu erhalten, die ein Protein codiert, welches das MORT-1-Protein bindet.
Verfahren zur Isolierung und Identifizierung eines Proteins, welches in der Lage ist, die intrazelluläre Domäne von FAS-R zu binden, umfassend das Anwenden der nicht-stringenten Southern-Hybridisierung gefolgt von PCR-Clonierung, wobei eine Sequenz oder Teile davon nach Anspruch 1 oder 2 als Sonde verwendet werden, um Sequenzen aus einer cDNA- oder genomischen DNA-Bibliothek zu binden, welche mindestens eine partielle Homologie dazu haben, wobei die gebundenen Sequenzen dann durch das PCR-Verfahren amplifiziert und cloniert werden, um Clone zu erhalten, welche Proteine codieren, die mindestens eine partielle Homologie zu den Sequenzen nach Anspruch 1 oder 2 haben.
Arzneimittel umfassend einen Wirkstoff, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (1) einem MORT-1-Protein oder Fragmenten davon nach Anspruch 3 oder 4, und einem Gemisch davon; (2) einem rekombinanten tierischen Virusvektor, welcher DNA-Sequenzen trägt, die ein Protein codieren, welches in der Lage ist, einen Zelloberflächenrezeptor zu binden, und welche ein MORT-1-Protein oder Fragmente davon nach Anspruch 3 oder 4 codieren; (3) einem Oligonucleotid, welches eine Antisensesequenz der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 enthält; und (4) einem Antikörper oder aktiven Fragment davon nach Anspruch 8.
Verwendung einer Verbindung wie in Anspruch 11 definiert für die Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation des FAS-R-Liganden Effekts auf Zellen.
Verwendung einer Verbindung wie in Anspruch 11(2) definiert für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumorzellen, HIV-infizierten Zellen oder anderen erkrankten Zellen.
Verwendung von einem oder mehreren MORT-1-Proteinen oder Fragmenten nach Anspruch 3 oder 4, welche in der Lage sind, die intrazelluläre Domäne zu binden und die Aktivität von FAS-R zu modulieren, und Antikörpern oder aktiven Fragmenten davon nach Anspruch 8 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation des FAS-R-Liganden Effekts auf Zellen.
Verwendung eines Vektors, welcher eine Sequenz enthält, die ein Ribozym codiert, welches in der Lage ist, mit einer zellulären mRNA-Sequenz, welche ein MORT-1-Protein nach Anspruch 3 oder 4 codiert, zu interagieren, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation des FAS-R-Liganden Effekts auf Zellen.
Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, welche ein MORT-1-Protein oder Fragmente davon codiert, oder eines MORT-1-Proteins oder von Fragmenten davon nach Anspruch 3 oder 4 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation des MORT-1-induzierten Effekts auf Zellen.