JP3787355B2 - Ｆａｓ／ａｐｏ１受容体機能のモジュレーター - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体スーパーファミリーに属するレセプターおよびそれらの生物学的機能を制御する分野に一般的に関する。ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体スーパーファミリーは、ｐ５５腫瘍壊死因子受容体およびｐ７５腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒｓ）、ＦＡＳリガンド受容体（ＦＡＳ／ＡＰＯ１またはＦＡＳ−Ｒともいわれ、以下ＦＡＳ−Ｒという）ならびにそのほかのものなどの受容体を含む。さらに詳しくは、本発明は新規なタンパク質、ここではＭＯＲＴ−１と表わし（ＨＦ−１ともいう）、Ｆａｓ−Ｒの細胞内ドメイン（ＩＣ）（この細胞内ドメインをＦａｓ−ＩＣと表わす）に結合し、Ｆａｓ−Ｒの機能をモジュレートすることのできるタンパク質に関する。さらに、ＭＯＲＴ−１は自己会合もでき、それ自身の細胞傷害性を引き起こすことが可能である。本発明はＭＯＲＴ−１の製造および使用にも関する。
ＨＦ−１（オリジナルの表記）およびＭＯＲＴ−１（本発明で用いる表記）は両方とも本願明細書に用いられるが、同一のタンパク質を示す。
背景技術
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）およびリンホトキシン（ＴＮＦ−β）（以下、ＴＮＦはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βの両者を意味する）は、単核食細胞によっておもに形成される多機能な前炎症性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカイン類であり、細胞に多大な影響を及ぼす（Ｗａｌｌａｃｈ，Ｄ．（１９８６）ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ７（Ｉｏｎ Ｇｒｅｓｓｅｒ，ｅｄ．），ｐｐ．８３−１２２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；ａｎｄ Ｂｅｕｔｌｅｒ ａｎｄ Ｃｅｒａｍｉ（１９８７））。ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの両者は、特定の細胞表面受容体に結合することによってそれらの効果を開始する。その効果のうちのいくつかは生物にとって利益になるようである。たとえば、それらは腫瘍細胞またはウイルス感染した細胞を破壊するかもしれず、顆粒球の抗菌活性を増大させるかもしれない。このように、腫瘍や感染源に対する生物の防御にＴＮＦは寄与し、かつ損傷からの回復に寄与する。ＴＮＦは抗腫瘍剤として用いることができ、その適用の際にはＴＮＦが腫瘍細胞の表面のその受容体に結合し、それによって腫瘍細胞を死へと導く出来事が始まる。ＴＮＦは抗感染薬としても用いることができる。
しかしながら、ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの両者は有害な効果も有する。過剰に産生されたＴＮＦ−αは数種の疾患において主たる病原の役割をすることがありうる、という証拠がある。さらに、ＴＮＦ−αの効果、主として血管系に対する効果は敗血症性ショック症状の主たる原因である、と現在のところ知られている（Ｔｒａｃｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。いくつかの疾患では、ＴＮＦは脂肪細胞の活性を抑制することおよび食欲不振を引き起こすことにより体重の過剰損欠（悪液質）を引き起こすかもしれず、そのためにＴＮＦ−αはカケクチンと呼ばれていた。ＴＮＦはリウマチ様疾患においては組織に対する損傷のメディエーターとして（Ｂｅｕｔｌｅｒ ａｎｄ Ｃｅｒａｍｉ，１９８７）、移殖片対宿主反応においては観察される損傷の主たるメディエー夕ーとして（Ｐｉｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７）も記載されていた。さらに、ＴＮＦは炎症の過程およびほかの多くの疾患と関係することが知られている。
２種の明らかに独立して発現される受容体、ｐ５５およびｐ７５ＴＮＦ−Ｒｓは、ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの両者に特異的に結合し、前述のＴＮＦの生物学的効果を開始および／または媒介する。これらの２種の受容体は構造的に似ていない細胞内ドメインを有するが、それはそれらが異なるシグナリングをすることを示唆している（Ｈｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｂｒｏｃｋｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｌｅｏｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｓｃｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｎｏｐｈａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９０；ａｎｄ Ｈｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０参照）。しかしながら、細胞のメカニズム、たとえばｐ５５およびｐ７５ＴＮＦ−Ｒｓの細胞内シグナリングに関係する様々なタンパク質やおそらくはほかの因子類は、まだ今のところ解明されていない（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５８５４に、以下にも記載されるように、ｐ７５ＩＣおよびｐ５５ＩＣに結合しうる新規なタンパク質が初めて記載されている）。リガンド、すなわちＴＮＦ（αまたはβ）が受容体に結合したのちに通常生じることがこの細胞内シグナリングである。それは反応のカスケードの開始に関与し、その結果ＴＮＦに対して観察される細胞の応答が生ずる。
前述のＴＮＦの細胞致死性効果に関しては、これまでに研究されたたいていの細胞ではこの効果はｐ５５ＴＮＦ−Ｒによっておもに引き起こされる。Ｐ５５ＴＮＦ−Ｒの細胞外ドメイン（リガンド結合ドメイン）に対する抗体は、それら自身が細胞致死性効果を引き起こすことができ（ＥＰ ４１２４８６参照）、その効果はこれらの抗体による受容体の架橋の有効性と関係するが、細胞内シグナリングプロセスの発生の第１段階であると信じられている。さらに、突然変異の研究（Ｂｒａｋｅｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９３）によれば、Ｐ５５ＴＮＦ−Ｒの生物学的機能はその細胞内ドメインの完全さに依存することが示されており、したがって、ＴＮＦの細胞致死性効果を導く細胞内シグナリングの開始は、ｐ５５ＴＮＦ−Ｒの２またはそれより多くの細胞内ドメインの会合の結果として生ずる、ということが示唆されている。さらには、ＴＮＦ（αおよびβ）はホモトリマーとして存在し、受容体分子に対するその結合能および架橋能、すなわち受容体の凝集を生じさせる能力によって、ｐ５５ＴＮＦ−Ｒを介する細胞内シグナリングを誘導すると示唆される。ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５８５４には（以下にも記載する）、ｐ５５ＩＣとｐ５５ＤＤがいかにして自己会合し、リガンドに依存した様式でＴＮＦに関連した効果を細胞内に誘導することができるかについて記載されている。
ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体スーパーファミリーのほかのメンバーは、Ｆａｓ抗原とも言われ、様々な組織に発現される細胞表面タンパク質であり、そしてＴＮＦ−ＲおよびＮＧＦ−Ｒを含む多数の細胞表面受容体と相同性を共有するＦＡＳ受容体（ＦＡＳ−Ｒ）である。ＦＡＳ−Ｒはアポトーシスの形態で細胞死を媒介し（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、自己反応性Ｔ細胞のネガティブセレクターとして働く、すなわちＴ細胞の成熟の間にＦＡＳ−Ｒは自己抗原を認識するＴ細胞のアポトーシスによる死（ａｐｏｐｔｏｐｉｃ ｄｅａｔｈ）を媒介するようである。また、ＦＡＳ−Ｒ遺伝子（１ｐｒ）の突然変異により、ヒト自己免疫疾患全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に似ているマウスのリンパ球分裂疾患が生ずるということも見出されている（Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ＦＡＳ−Ｒのリガンドは数ある中でもキラーＴ細胞（または細胞傷害性Ｔリンパ球−ＣＴＬｓ）によって担持される細胞表面関連分子であると考えられており、したがって、前記ＣＴＬｓがＦＡＳ−Ｒを担持する細胞に接触すると、それらはＦＡＳ−Ｒを担持する細胞のアポトーシスによる細胞死を誘導することができる。さらに、ＦＡＳ−Ｒに特異的なモノクローナル抗体が作製されたが、このモノクローナル抗体は、ヒトＦＡＳ−ＲをコードするｃＤＮＡによって形質転換されたマウス細胞を含む、ＦＡＳ−Ｒ担持細胞のアポトーシスによる細胞死を誘導することが可能である（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａ１．，１９９１）。
Ｔリンパ球のほかに様々のほかの正常細胞がそれらの表面にＦＡＳ−Ｒを発現しており、この受容体をトリガーすることにより殺されることが可能であることも見出されている。このような傷害プロセスが制御されずに誘導されることは、ある疾患における組織損傷、たとえば急性肝炎における肝細胞の破壊、の原因となるのではないかと疑われている。したがって、ＦＡＳ−Ｒの細胞傷害性活性を抑制する方法を見出すことによって治療が可能になるかもしれない。
反対に、ある悪性細胞およびＨＩＶ感染細胞がそれらの表面にＦＡＳ−Ｒを担持することも見出されているので、ＦＡＳ−Ｒを介する細胞傷害性効果をこれらに引き起こすためにＦＡＳ−Ｒに対する抗体またはＦＡＳ−Ｒリガンドが用いられてもよく、それによってそのような悪性細胞やＨＩＶ感染細胞と戦う手段が提供されてもよい（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１参照）。したがって、ＦＡＳ−Ｒの細胞傷害性活性を増大するためのほかの方法を見出すことにより、さらに治療が可能になるかもしれない。
ＴＮＦ（αまたはβ）およびＦＡＳ−Ｒリガンドに対する細胞の応答、たとえば前述の病理学的な状態における細胞の応答をモジュレートする方法を提供することは長い間必要であると考えられている。ＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドが過剰に発現されているばあいは、ＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドによって誘導される細胞致死性効果を抑制することが望まれ、一方ほかの状態、たとえば創傷を治癒させたいばあいは、ＴＮＦ効果を増大することが望ましく、腫瘍細胞またはＨＩＶ感染細胞におけるＦＡＳ−Ｒのばあいは、ＦＡＳ−Ｒが媒介する効果を増大することが望ましい。
細胞表面に結合しているＴＮＦ−ＲｓへのＴＮＦの結合を競合させるために、抗ＴＮＦ抗体または可溶性ＴＮＦ受容体（本質的には受容体の可溶性細胞外ドメインである）を用いてＴＮＦのその受容体に対する結合を抑制し、ＴＮＦの有害な効果を調節するよう、多くのアプローチが本発明者らによって行なわれている（たとえば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｓ．ＥＰ １８６８３３、ＥＰ ３０８３７８、ＥＰ ３９８３２７およびＥＰ ４１２４８６参照）。さらに、ＴＮＦによって誘導される細胞の効果のためにはＴＮＦがその受容体に結合することが必要であるということにもとづいて、本発明者らによるアプローチ（たとえばＩＬ １０１７６９およびその対応ＥＰ ５６８９２５参照）は、ＴＮＦ−Ｒｓの活性をモジュレートすることによりＴＮＦ効果をモジュレートするよう行なわれている。要するに、ＥＰ ５６８９２５（ＩＬ １０１７６９）はＴＮＦ−Ｒｓにおけるシグナル伝達および／または切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）をモジュレートする方法に関し、その方法によればペプチドまたはほかの分子が受容体それ自身またはその受容体と相互に作用するエフェクタータンパク質のいずれかと相互に作用してＴＮＦ−Ｒｓの正常な機能をモジュレートする。ＥＰ ５６８９２５にはｐ５５ＴＮＦ−Ｒの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに変異を有する様々なｐ５５ＴＮＦ−Ｒｓの変異体の構築および特徴付けが記載されている。ここではｐ５５ＴＮＦ−Ｒの前記ドメンイン内の領域が受容体を機能させること、すなわちリガンド（ＴＮＦ）の結合およびそれに引き続くシグナル伝達ならびに細胞内シグナリング（これにより最終的に細胞にＴＮＦ効果が観察されることになる）、に不可欠であるとして同定された。さらに、ＴＮＦ−Ｒの前記ドメインの様々な領域に結合することのできるタンパク質、ペプチドまたはほかの因子（そのタンパク質、ペプチドおよびほかの因子はＴＮＦ−Ｒの活性を制御またはモジュレートに関係してもよい）を単離し、同定するための多くのアプローチも記載されている。そのようなタンパク質およびペプチドをコードするＤＮＡ配列を単離し、クローニングするための多くのアプローチ、これらのタンパク質およびペプチドの産生のための発現ベクターを構築するための多くのアプローチそしてＴＮＦ−ＲとまたはＴＮＦ−Ｒの様々の領域に結合する前記タンパク質およびペプチドと相互に作用する抗体またはそれらのフラグメントを作製するための多くのアプローチがＥＰ ５６８９２５にも記載されている。しかしながら、ＥＰ ５６８９２５はＴＮＦ−Ｒｓ（たとえばｐ５５ＴＮＦ−Ｒ）の細胞内ドメインに結合する実際のタンパク質およびペプチドを特定しておらず、ＴＮＦ−Ｒｓの細胞内ドメインに結合するそのようなタンパク質またはペプチドを単離し、同定するための酵母ツーハイブリッドアプローチも記載されていない。同様に、ＦＡＳ−Ｒ細胞内ドメインに結合することができるタンパク質またはペプチドについてはこれまでのところ開示されていない。
このように、ＴＮＦの効果またはＦＡＳ−Ｒリガンドの効果を阻害することが望まれているばあいは、細胞表面でのＴＮＦ−ＲｓかＦＡＳ−Ｒの量または活性を低下させることが望ましく、増大されたＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドの効果が求められるばあいは、ＴＮＦ−ＲｓまたはＦＡＳ−Ｒの量または活性を増大することが望ましい。これまでのところ、ｐ５５ＴＮＦ−Ｒおよびｐ７５ＴＮＦ−Ｒの両者のプロモーターが配列決定され、分析されて、様々な転写調節因子に特定のキー配列（ｋｅｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）モチーフが多数わかっている。そして、これらのＴＮＦ−Ｒｓの発現自体はそれらのプロモーターレベルで調節されることができる。すなわち受容体の数を減少させるためにはプロモーターからの転写を抑制し、受容体の数を増加させるためにはプロモーターからの転写を増大する（ＩＬ １０４３５５およびＩＬ １０９６３３参照）。これに対応する、ＦＡＳ−Ｒ遺伝子のプロモーターレベルでのＦＡＳ−Ｒの調節に関する研究は、これまでのところ報告されていない。
さらに、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体およびその構造的に関連する受容体ＦＡＳ−Ｒは、リンパ球が産生するリガンド類によって刺激されると、それら自身の活動停止を導く分解活性を細胞に引き起こすということは既知であるが、このトリガーのメカニズムは依然理解されていない、ということも記載しておくべきであろう。突然変異の研究によれば、ＦＡＳ−Ｒおよびｐ５５ＴＮＦ受容体（ｐ５５−Ｒ）において細胞傷害性のためのシグナリングは、それらの細胞内ドメイン内の別々の領域に関係するということが示されている（Ｂｒａｋｅｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｉｔｏｈ ａｎｄ Ｎａｇａｔａ，１９９３）。これらの領域（「デス・ドメイン」）には配列に類似性がある。ＦＡＳ−Ｒおよびｐ５５−Ｒの両者の「デス・ドメイン」は自己会合をする傾向がある。それらの自己会合は、シグナリングの開始に必要な受容体の凝集を明らかに促進し（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｗａｌｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｂｏｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５とともにＰＣＴ／ＵＳ９５／０５８５４参照）、受容体の発現レベルが高いとリガンド−非依存性シグナリングを引き起こすことにもなりうる（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５８５４およびＢｏｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
このように、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５８５４および本発明以前には、ＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドの細胞に対する効果のようなＴＮＦ／ＮＧＦスーパーファミリーに属するリガンドの効果を、細胞内シグナリングプロセス（そのシグナリングはＴＮＦ／ＮＧＦ受容体スーパーファミリーに属する受容体類の細胞内ドメイン類（ＩＣｓ）、たとえばＦＡＳ−ＩＣやＴＮＦ−Ｒｓの細胞内ドメイン類、すなわちｐ５５ＴＮＦ−Ｒ細胞内ドメインおよびｐ７５ＴＮＦ−Ｒ細胞内ドメイン（それぞれｐ５５ＩＣおよびＰ７５ＩＣ）などによっておそらくは大きく支配されている）を介して調節するであろうタンパク質は提供されていなかった。
したがって、ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに結合することができるタンパク質、ＭＯＲＴ−１、その類似体、フラグメントまたは誘導体、そのタンパク質は、ＦＡＳリガンドがその受容体に結合することにより開始される細胞内シグナリングプロセスに関与すると現在のところ信じられている、を提供することは本発明の目的の１つである。本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメントおよび誘導体は以前述べた出願に記載されているＦＡＳ−ＩＣ結合タンパク質とは明らかに異なるものである。
本発明のほかの目的は、これらのＦＡＳ−ＩＣ結合分子であるＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントおよび誘導体に対するアンタゴニスト（たとえば抗体）、前記ＦＡＳ−ＩＣ結合タンパク質が正のシグナルエフェクターである（すなわち、シグナリングを誘導する）ばあいは、所望によりそのアンタゴニストはシグナリングプロセスを阻害するために用いられてもよく、前記ＦＡＳ−ＩＣ結合タンパク質が負のシグナルエフェクターである（すなわち、シグナリングを阻害する）ばあいは、所望によりそのアンタゴニストはシグナリングプロセスを増大させるために用いられてもよい、を提供することである。
本発明のさらなるほかの目的は、前記ＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントおよび誘導体を用いてさらなるタンパク質または因子、たとえばシグナリングプロセスのさらに下流に関与するかもしれないタンパク質または因子を単離し、特徴付けすることおよび／またはシグナリングプロセスのさらに上流にあり、これらＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントおよび誘導体が結合するほかの受容体（たとえば、ほかのＦＡＳ−Ｒｓまたは関連する受容体）、つまりそれらの機能にも関与する受容体類を単離し、同定することである。
さらに、前記ＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントおよび誘導体をそれらに対するポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体の作製のために抗原として用いることを目的とする。その抗体は異なるソース、たとえば細胞抽出物または形質転換された細胞系から新規なＭＯＲＴ−１タンパク質を精製するために、さらに使用されてもよい。
そのうえ、これらの抗体は診断の目的で、たとえばＦＡＳ−Ｒ受容体を介する細胞の効果が異常に機能することに関係する疾患を同定するために使用されてもよい。
本発明のさらなる目的は、前記ＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントまたは誘導体からなる薬学的組成物ならびに前記抗体またはほかのアンタゴニストからなる薬学的組成物を提供することである。
発明の開示
本発明にしたがって、我々はＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに結合しうる新規なタンパク質を見出した。このＦＡＳ−ＩＣ結合タンパク質は、ＦＡＳ−Ｒリガンドが細胞表面で結合したのちに通常起こる細胞内シグナリングプロセスを介するかまたはモジュレートすることにより、細胞に対するＦＡＳ−Ｒリガンド効果のメディエーターまたはモジュレー夕ーとして作用するであろう。
この新規なタンパク質はＨＦ１またはＭＯＲＴ−１（「Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ（受容体毒性のメディエーター）」であるため）と表わされており、加えてそのＦＡＳ−ＩＣ結合特異性はほかの特性（実施例１参照）、たとえばそれはｐ５５−ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−Ｒの「デス・ドメイン（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ（ＤＤ），」（ｐ５５−ＤＤおよびＦＡＳ−ＤＤ）領域と相同な領域を有し、よって自己会合も可能である、という特性を有する。ＭＯＲＴ−１は単独で細胞傷害性、その自己会合能力におそらく関係する活性を活性化することも可能である。現在のところ、「デス・ドメイン」相同配列（ＭＯＲＴ−ＤＤ、ＭＯＲＴ−１のＣ末端部に存在する）を含むＭＯＲＴ−１の領域の同時発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が、ＦＡＳ−ＩＣの「デス・ドメイン」に結合するその能力から期待されるように、ＦＡＳで誘導される細胞死を強く妨害することもわかっている。さらに、同一の実験条件において、ＭＯＲＴ−ＤＤ領域を含まないＭＯＲＴ−１の一部分（ＭＯＲＴ−１のＮ末端部、アミノ酸１〜１７７、「ＭＯＲＴ−１ヘッド」）の同時発現は、ＦＡＳで誘導される細胞死の妨害をせず、するとしてもＦＡＳで誘導される細胞傷害性がいく分か増大されるということがわかった。
したがって、本発明は、ここでＭＯＲＴ−１と表わすタンパク質、その類似体またはフラグメント、これらすべてはＦＡＳ−リガンド受容体の細胞内ドメイン（ＦＡＳ−ＩＣ）と結合するかまたは相互作用することが可能である、をコードするＤＮＡ配列を提供する。
とくに、本発明は、
（ａ）未変性のＭＯＲＴ−１タンパク質のコード領域に由来するｃＤＮＡ配列、
（ｂ）中程度にストリンジェントな条件下で（ａ）のｃＤＮＡとハイブリダイゼーションすることができ、生物学的に活性なＦＡＳ−Ｒ細胞内ドメイン結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列および
（ｃ）（ａ）および（ｂ）で定義されたＤＮＡ配列に対する遺伝コードの結果として同義性であり、生物学的に活性なＦＡＳ−Ｒ細胞内ドメイン結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列
からなる群れより選ばれたＤＮＡ配列を提供する。
本発明の前記ＤＮＡ配列の特定の具体例は、図４に示された配列からなるタンパク質ＭＯＲＴ−１をコードするＤＮＡ配列である。
本発明は、本発明の前記配列のいずれかにコードされるＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導体、そのタンパク質、類似体、フラグメントおよび誘導体はＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインと結合するかまたは相互作用することが可能である、も提供する。
本発明の前記タンパク質の特定の具体例は、図４に示される推測されたアミノ酸配列を有するＭＯＲＴ−１タンパク質である。
また、本発明は、本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントまたは誘導体をコードし、本発明の前記ＤＮＡ配列を含み、適切な真核宿主細胞または原核宿主細胞で発現することができるベクター；前記ベクターを含む形質転換された真核宿主細胞または原核宿主細胞；およびＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントまたは誘導体の発現に適した条件下でＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体を産生し、前記タンパク質をえるために必要なこのタンパク質の翻訳後修飾を引き起こし、そして前述の形質転換した細胞の培地からまたは前述の形質転換した細胞の細胞抽出物から前述の発現したタンパク質、類似体、フラグメントまたは誘導体を抽出する方法も提供する。
ほかの観点において、本発明は、本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメントおよび誘導体に特異的な抗体またはその活性な誘導体もしくはフラグメントも提供する。
さらに本発明のほかの観点に関していえば、前述の本発明のＤＮＡ配列またはそれらがコードするタンパク質の様々な使用が提供される。中でもその使用はつぎのものを含む。
（ｉ）ＦＡＳ−Ｒを担持する細胞に対するＦＡＳ−Ｒリガンド効果のモジュレーション法であって、１またはそれより多くの本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントまたは誘導体、そのすべては前記ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに結合可能であり、ＦＡＳ−Ｒの活性をモジュレートすることができる、で前記細胞を処理することからなり、前記細胞の処理が１またはそれより多くの前記ＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントまたは誘導体を、細胞内投与に適した形態で、前記細胞に導入することまたは１またはそれより多くの前記タンパク質、類似体、フラグメントまたは誘導体をコードするＤＮＡ配列を、前記配列を担持する適切な発現ベクターの形態で（そのベクターは前記配列が前記細胞で発現されるように前記細胞への前記配列の挿入を行なうことができる）、前記細胞に導入することからなるモジュレーション法；
（ii）細胞に対するＦＡＳ−Ｒリガンド効果をモジュレートする方法であって、ＭＯＲＴ−１、その類似体、フラグメントまたは誘導体、そのすべてはＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに結合でき、かつＦＡＳ−Ｒの活性を修飾することができる、で前記細胞を処理することからなり、前記細胞の処理が前記ＭＯＲＴ−１、類似体、フラグメントまたは誘導体を、その細胞内導入に適した形態で、前記細胞に導入することまたは前記ＭＯＲＴ−１、類似体、フラグメントまたは誘導体をコードするＤＮＡ配列を、その配列を担持する適切なベクターの形態で（そのベクターは前記配列が前記細胞に発現されるように前記配列の前記細胞への挿入を行なうことが可能である）、を前記細胞に導入することからなるモジュレート法；
（iii）前記（ii）の方法において、前記細胞の処理が、
（ａ）ＦＡＳ−Ｒを担持する細胞の表面の特定の細胞表面受容体に結合することができるウイルスの表面タンパク質（リガンド）をコードする第１の配列、および前記細胞に発現するとＦＡＳ−Ｒの活性をモジュレートすることができる本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントおよび誘導体から選ばれたタンパク質、をコードする第２の配列を担持する組換え動物ウイルスベクターを構築するステップ；および
（ｂ）前記（ａ）のベクターを前記細胞に感染させることのステップ
からなる、組換え動物ウイルスベクターを用いて前記細胞をトランスフェクションすることである方法；
（iv）ＦＡＳ−Ｒを担持する細胞に対するＦＡＳ−Ｒリガンド効果をモジュレートする方法であって、本発明の抗体またはその活性誘導体もしくは活性フラグメントで前記細胞を処理することからなり、その処理とは前記抗体、活性フラグメントまたは活性誘導体を含有する適切な組成物を前記細胞に適用することであり、その適用において、前記細胞のＭＯＲＴ−１タンパク質またはその部分が細胞外表面に露出するばあいは、前記組成物は細胞外適用のために形成され、前記ＭＯＲＴ−１タンパク質が細胞内に存在するばあいは、前記組成物は細胞内適用のために形成されるモジュレート法；
（ｖ）ＦＡＳ−Ｒを担持する細胞に対するＦＡＳ−Ｒリガンド効果をモジュレートする方法であって、本発明のＭＯＲＴ−１配列の少なくとも一部分のアンチセンス配列をコードするオリゴヌクレオチド配列で前記細胞を処理することからなり、前記オリゴヌクレオチド配列がＭＯＲＴ−１タンパク質の発現をブロックすることができるモジュレート法；
（vi）前記（ｖ）の方法であって、前記細胞の処理が、
（ａ）ＦＡＳ−Ｒ担持細胞の表面の特定の細胞表面受容体に結合することができるウイルスの表面タンパク質（リガンド）をコードする第１の配列と本発明のＭＯＲＴ−１配列の少なくとも一部分のアンチセンス配列をコードするオリゴヌクレオチド配列であり、前記ウイルスにより前記細胞に導入されるとＭＯＲＴ−１タンパク質の発現をブロックすることができるオリゴヌクレオチド配列である第２の配列を担持する組換え動物ウイルスベクターを構築するステップ；および
（ｂ）前記（ａ）のベクターを前記細胞に感染させるステップ
からなる、組換え動物ウイルスベクターを用いて前記細胞をトランスフェクションする方法；
（vii）腫瘍細胞もしくはＨＩＶ感染細胞またはほかの疾患の細胞を処理する方法であって、
（ａ）腫瘍細胞表面受容体もしくはＨＩＶ感染細胞表面受容体またはほかの疾患の細胞に担持されている受容体と結合することができるウイルスの表面タンパク質をコードする配列および本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントおよび誘導体から選ばれたタンパク質であり、前記腫瘍細胞、ＨＩＶ感染細胞またはほかの疾患の細胞で発現するとその細胞を殺すことができるタンパク質をコードする配列を担持する組換え動物ウイルスベクターを構築すること；および
（ｂ）前記（ａ）のベクターを腫瘍細胞もしくはＨＩＶ感染細胞またはほかの疾患の細胞に感染させることからなる方法；
（viii）細胞に対するＦＡＳ−Ｒリガンド効果をモジュレートする方法であって、本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質をコードする細胞のｍＲＮＡ配列と相互作用することのできるリボザイム配列をコードするベクターを、そのリボザイム配列が前記細胞で発現できる形態で前記細胞に導入するリボザイム操作を適用することからなり、前記リボザイム配列が細胞で発現するとリボザイムは細胞のｍＲＮＡ配列と相互作用し、そのｍＲＮＡ配列を切断し、細胞でのＭＯＲＴ−１タンパク質の発現を阻害する方法；
（ix）前記方法のいずれかから選ばれた方法であって、前記ＭＯＲＴ−１タンパク質または配列をコードするＭＯＲＴ−１が、ＦＡＳ−ＩＣに特異的に結合するＭＯＲＴ−１タンパク質の少なくとも一部分またはＦＡＳ−ＩＣに特異的に結合するＭＯＲＴ−１タンパク質の一部分をコードする配列をコードするＭＯＲＴ−１の少なくとも一部分からなる方法；
（ｘ）ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに結合できるタンパク質を単離して固定する方法であって、ストリンジェントではないサザンハイブリダイゼーションののちＰＣＲクローニングの操作を適用することからなり、本発明の配列またはその一部分をプローブとして用いて、少なくとも部分的にそれらと相同性を有するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーからの配列と結合させ、そののちに結合した配列をＰＣＲ操作により増幅し、クローン化して本発明の前記配列と少なくとも部分的に相同性を有するタンパク質をコードするクローンをえる方法。
本発明はまた、細胞に対するＦＡＳリガンド効果をモジュレートするための薬学的組成物であって、活性成分としてつぎのうちのいずれかからなる薬学的組成物を提供する：
（ｉ）本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、その生物学的に活性なフラグメント、類似体、誘導体またはその混合物；（ii）細胞表面受容体と結合できるタンパク質をコードし、かつ本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントまたは類似体をコードする組換え動物ウイルスベクター；および（iii）本発明のＭＯＲＴ−１配列のアンチセンス配列をコードするオリゴヌクレオチド配列であって、前記（ii）の組換え動物ウイルスベクターの第２の配列であってもよいオリゴヌクレオチド配列。
ＭＯＲＴ−１はＦＡＳ−ＩＣと結合する明確な領域とＭＯＲＴ−１の自己会合に関係する別の明確な領域を有し、したがってこれらの明確な領域またはその部分を、ＭＯＲＴ−１またはＦＡＳ−Ｒに結合でき、ＭＯＲＴ−１に関連する細胞内シグナリングプロセスもしくはＦＡＳ−Ｒに関連する細胞内シグナリングプロセスに関係するかもしれないほかのタンパク質、受容体などを同定するために独立して用いてもよい、ということを記載しておくべきである。さらに、ＭＯＲＴ−１は前述のＭＯＲＴ−１の明確な領域もしくはほかの領域またはその組み合わせたもののいずれかに関連するほかの活性、たとえばＭＯＲＴ−１単独の細胞傷害性効果に関係するかもしれない酵素活性を有してもよい。このように、ＭＯＲＴ−１に関連する前記のようなさらなる活性に関係するかもしれないほかのタンパク質、ペプチドなどを特異的に同定するためにＭＯＲＴ−１を使用してもよい。
本発明のほかの観点および具体例も、つぎの本発明の詳細な説明に記載されているように提供される。
至る所で用いられているつぎの用語「細胞に対するＦＡＳ−リガンド効果のモジュレーション」および「細胞に対するＭＯＲＴ−１効果のモジュレーション」はｉｎ ｖｉｔｒｏ処理のみならずｉｎ ｖｉｖｏ処理も含む、ということを記載しておくべきである。
【図面の簡単な説明】
図１ＡおよびＢは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＦ１（ＭＯＲＴ１）およびＦＡＳ−ＩＣ間の相互作用を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０％アクリルアミド）のオートラジオグラムの複写物である。図１Ａは、ＦＬＡＧ−ＨＦ１（ＦＬＡＧ−ＭＯＲＴ１）融合タンパク質またはルシフェラーゼｃＤＮＡ（コントロール）でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の抽出物由来のタンパク質の免疫沈降物のコントロールオートラジオグラムを示す。免疫沈降は抗ＦＬＡＧ抗体を用いて行なった。；
図１Ｂは、融合タンパク質としてＦＬＡＧオリゴペプチド（ＦＬＡＧ−ＭＯＲＴ１）を用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞で産生された［³⁵Ｓ］−メチオニンを代謝的に標識したＨＦ１のＧＳＴ、ヒトおよびマウスＧＳＴ−ＦＡＳ−ＩＣ融合タンパク質（ＧＳＴ−ｈｕＦＡＳ−ＩＣ、ＧＳＴ−ｍＦＡＳ−ＩＣ）ならびにＧＳＴ−ＦＡＳ−ＩＣ融合タンパク質、ここでＦＡＳ−ＩＣはＩｌｅからＡｌａへの置換変異を２２５位に含んでいた（ＧＳＴ−ｍＦＡＳ−ＩＣ、Ｉ２２５Ａ）、に対する結合をオートラジオグラフィーにより評価する方法で、ＨＦ１とＦＡＳ−ＩＣとの間のｉｎ ｖｉｔｒｏでの相互作用を評価するために行なった代表的なゲルのオートラジオグラムを示す。初めに抽出されていた標識ＦＬＡＧ−ＭＯＲＴ１を含むＨｅＬａ細胞の［³⁵Ｓ］標識タンパク質は、様々なＧＳＴとＧＳＴ−ＦＡＳ−ＩＣタンパク質（グルタチオンビーズに結合している）との相互作用に付され、そののちＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。相互作用のすべての実験におけるコントロールとして、ルシフェラーゼでトランスフェクトされたＨｅＬａの細胞の抽出物を、ＧＳＴとＧＳＴ−ＦＡＳ−ＩＣ融合タンパク質との相互作用に付し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。図１ＡおよびＢについては実施例１にも記載する。
図２Ａ、ＢおよびＣは、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞由来の様々な免疫沈降物が分離され、ＨＦ１（ＭＯＲＴ１）とＦＡＳ−ＩＣとのｉｎ ｖｉｖｏでの相互作用を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０％アクリルアミド）のオートラジオグラムの複写物である。前記ＨｅＬａ細胞は、ＨＦ１−ＦＬＡＧ（ＦＬＡＧ−ＭＯＲＴ１）融合タンパク質のみ、ＨＦ１−ＦＬＡＧ融合タンパク質とヒトＦＡＳ−Ｒ（ＦＬＡＧ−ＭＯＲＴ１＋Ｆａｓ／ＡＰＯ１）またはヒトＦＡＳ−Ｒのみ（Ｆａｓ／ＡＰＯ１）のみをコードするＤＮＡ構築物（図２Ａ）；ＨＦ１−ＦＬＡＧ融合タンパク質とヒトｐ５５Ｒ（ＦＬＡＧ−ＭＯＲＴ１＋ｐ５５Ｒ）をコードするＤＮＡ構築物（図２Ｂ）；またはＨＦ１−ＦＬＡＧ融合タンパク質およびヒトＦＡＳ−Ｒとｐ５５−Ｒとの間のキメラ融合タンパク質（ＦＡＳ−Ｒの細胞外ドメインがｐ５５−Ｒの対応する領域と置換されたもの）（ＦＬＡＧ−ＭＯＲＴ１＋ｐ５５−ＦＡＳキメラ）、もしくはＦＡＳ−Ｒ−ｐ５５−Ｒキメラ融合タンパク質のみ（ｐ５５−Ｆａｓキメラ）をコードするＤＮＡ構築物（図２Ｃ）でトランスフェクトされた。すべてのばあいにおいて、トランスフェクトされた細胞は［³⁵Ｓ］システイン（２０μＣｉ／ｍｌ）および［³⁵Ｓ］メチオニン（４０μＣｉ／ｍｌ）で代謝的に標識され、タンパク質抽出に付された。そののち、異なるトランスフェクト細胞由来のタンパク質抽出物を、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ＦＡＳ抗体、抗ｐ７５−Ｒ抗体および抗ｐ５５−Ｒ抗体（図２Ａ〜ＣにおけるαＦＬＡＧ、αＦＡＳ、αｐ７５−Ｒおよびαｐ５５−Ｒ）である様々な抗体で免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。図２Ａの左側にはＦＡＳ−Ｒ（Ｆａｓ／ＡＰＯ１）およびＨＦ１−ＦＬＡＧ（ＦＬＡＧ−ＭＯＲＴ１）に対応するタンパク質バンドが示されており、図２ＡとＢの間にはスタンダード分子量マーカー（ｋＤａで）の相対位置が示され、図２Ｃの右側にはｐ５５Ｒとｐ５５−ＦＡＳキメラに対応するタンパク質バンドが示されている。図２Ａ〜Ｃについては実施例１にも記載されている。
図３は、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞由来のポリＡ⁺ＲＮＡが、実施例１で記載されているように、ＨＦｌ ｃＤＮＡでプローブされたノーザンブロットの複写物を示す。
図４は、実施例１で記載されているように、ＨＦ１の予備的なヌクレオチドと推測されたアミノ酸配列を図表的に示したものであり、そこでは翻訳開始候補位置、すなわち４９位の下線を引いたメチオニン残基（ボールドで下線が引かれているＭ）、が存在するが、「デス・ドメイン」に下線が付されている。星印は翻訳終止コドン（ヌクレオチド７６９〜７７１）を示す。各ラインの最初と中間にはヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の配列の始まり（５′末端）に対する相対位置を示す２種の数字が与えられている。１番目の数字はヌクレオチドを示し、２番目の数字はアミノ酸を示す。
図５は、ＭＯＲＴ−１のＣ末端を決定する実験の結果を示す。図５は、実施例１に記載されているように、ＨｅＬａ細胞で発現した様々なＭＯＲＴ−１−ＦＬＡＧ融合産物を分離し、³⁵Ｓ−システインと³⁵Ｓ−メチオニンで代謝的に標識したのちに、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ２）（レーン２、４および６）またはコントロールとしての抗ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ抗体（＃９）（レーン１、３および５）を用いて免疫沈降したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０％アクリルアミド）のオートラジオグラムの複写物である。
図６（ＡおよびＢ）は、ＭＯＲＴ−１でトランスフェクトされた細胞において細胞致死性効果がリガンドに依存せずに引き起こされることをグラフ的に示したものである。細胞の生存率は、中性レッドの取り込みアッセイをする（図６Ａ）かまたはトランスフェクトされたＤＮＡを発現する細胞の生存率を特別に決定するために培地中に分泌された胎盤アルカリホスファターゼの量を測定する（図６Ｂ）かにより決定された。ＨＦ１（ＭＯＲＴ１）、ヒトＦＡＳ−ＩＣ、ヒトｐ５５−ＩＣまたはルシフェラーゼ（コントロール）をコードする、テトラサイクリンで制御された発現ベクターとすべてのばあいにおいて分泌型アルカリホスファターゼをコードするｃＤＮＡとを用いてＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした。これにより細胞の生存率に対するこれらのタンパク質の一時的な発現の効果を評価することができる。図６Ａおよび６Ｂの両方において、白ぬきグラフはテトラサイクリン（１μｇ／ｍｌ、発現をブロックするため）の存在下でトランスフェクトされた細胞の増殖を表わし、黒ぬりグラフはテトラサイクリンが存在しないばあいのトランスフェクトされた細胞の増殖を示す。図６ＡおよびＢについては、実施例１にも記載されている。
図７は、実施例１に記載されているように、ＦＡＳ−Ｒを介する細胞傷害性効果に対するＭＯＲＴ−１タンパク質の異なる部分の効果をグラフ的に示すものである。
発明の詳細な説明
１つの観点において本発明は、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであるＦＡＳ−Ｒ受容体の細胞内ドメインに結合することができ、ＦＡＳ−Ｒのメディエー夕ーまたはモジュレー夕ーとして、たとえばＦＡＳリガンドがＦＡＳ−Ｒに結合することによって開始するシグナリングプロセスにおいてある役割を有するものとして考えられる新規なタンパク質ＭＯＲＴ−１（ＨＦ１）に関する。本発明のＭＯＲＴ−１のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列も新規な配列を表わす（それらはＤＮＡ配列またはアミノ酸配列のデータバンクである「ＧＥＮＥＢＡＮＫ」または「ＰＲＯＴＥＩＮ ＢＡＮＫ」にない）。
このように、本発明はＭＯＲＴ−１タンパク質をコードするＤＮＡ配列およびＤＮＡ配列によりコードされるＭＯＲＴ−１タンパク質に関する。
さらに、本発明はＭＯＲＴ−１タンパク質の生物学的に活性な類似体、フラグメントおよび誘導体をコードするＤＮＡ配列類ならびにそれらによってコードされる類似体類、フラグメント類および誘導体類にも関する。前記類似体、フラグメントおよび誘導体の製造は通常の方法によって行なわれる（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９参照）。その方法ではＭＯＲＴ−１タンパク質をコードするＤＮＡ配列において１またはそれより多くのコドンが欠失、付加またはほかのものによって置換されていてもよく、未変性のタンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸残基の変化を有する類似体がえられる。受け入れられる類似体類は、少なくともＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインヘの結合の可能性を保持しているものかまたはほかのいずれかの結合や酵素活性を介することのできるもの、たとえばＦＡＳ−ＩＣに結合するがシグナルを出さない、すなわちさらに下流の受容体、タンパク質またはほかの因子には結合しないかシグナルに依存する反応を触媒しない類似体である。いわゆるドミナントネガティブ効果を有する類似体、すなわちＦＡＳ−ＩＣに対する結合かまたはその結合ののちにひき続くシグナリングのいずれかが欠失している類似体は、前記のようにして産生することができる。前記類似体は、たとえば天然のＦＡＳ−ＩＣ結合タンパク質と競合させてＦＡＳ−リガンド効果を阻害するために使用することができる。同様に、ＦＡＳリガンド効果を増大させる働きをするであろういわゆるドミナントポジティブ類似体が産生されてもよい。これらは天然のＦＡＳ−ＩＣ結合タンパク質と同じかもしくはそれよりも良好なＦＡＳ−ＩＣ結合特性ならびにシグナリング特性を有するであろう。類似体のように、ＭＯＲＴ−１の生物学的に活性なフラグメント類は、ＭＯＲＴ−１の類似体について前述したように製造されればよい。ＭＯＲＴ−１の適切なフラグメント類は、ＦＡＳ−ＩＣ結合の可能性を保持するフラグメントかまたは前述のようにほかのいかなる結合または酵素活性を介することのできるフラグメントである。したがって、類似体について前述したように、ドミナントネガティブ効果またはドミナントポジティブ効果を有するＭＯＲＴ−１フラグメントを製造することも可能である。これらのフラグメントは本発明の類似体の特定のクラスを示す、すなわちそれらは全ＭＯＲＴ−１配列由来のＭＯＲＴ−１の一部分であり、その一部分またはフラグメントの各々は前述の望ましい活性のいずれかを有すると定義される、ということを記載しておくべきである。同様に、誘導体はＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体またはフラグメントの１またはそれより多くのアミノ酸残基の側鎖を標準的に修飾することにより、またはＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体またはフラグメントをほかの分子、たとえば当業者によく知られているような抗体、酵素、受容体などに複合させることにより製造してよい。
新規なＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメントおよび誘導体は多くのことに使用できる可能性を有する。たとえば、
（ｉ）ＦＡＳ−Ｒリガンドにより誘導される細胞傷害性が望まれる、抗腫瘍、抗炎症または抗ＨＩＶ感染などＦＡＳ−Ｒリガンド効果の増大が望まれる状況において、それらはＦＡＳ−Ｒリガンドの機能を模擬するかまたは増大させるために使用してよい。このばあいには、ＦＡＳ−Ｒリガンド効果、すなわち細胞傷害効果を増大させるＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導体は、それ自体が既知の標準的な操作によって細胞に導入されてよい。たとえば、ＭＯＲＴ−１タンパク質が細胞内に存在し、ＦＡＳ−Ｒリガンド効果が望まれる細胞にそれを導入すべきなので、細胞にこのタンパク質を特別に導入するためのシステムが必要である。これを行なう方法の１つはつぎのようである。組換え動物ウイルス、たとえばワクシニア（Ｖａｃｃｉｎｉａ）由来の１つを作製し、そのＤＮＡに対してつぎの２種の遺伝子を導入する：細胞に特異的に発現される細胞表面タンパク質に結合するリガンド、たとえばいくつかの細胞（ＣＤ４リンパ球、および関連する白血球）に特異的に結合するエイズ（ＨＩＶ）ウイルスｇｐ１２０タンパク質など、または組換えウイルスベクターがＦＡＳ−Ｒを担持する細胞に結合できるように、ＦＡＳ−Ｒを担持する細胞に特異的に結合するそのほかのリガンドをコードする遺伝子；およびＭＯＲＴ−１タンパク質をコードする遺伝子。こうしてウイルスの表面に細胞表面結合タンパク質が発現すると、ウイルスは腫瘍細胞またはほかのＦＡＳ−Ｒを担持する細胞を標的とし、続いて配列をコードするＭＯＲＴ−１タンパク質がウイルスを介して細胞内に導入されるであろう。細胞で一度発現するとＦＡＳ−Ｒリガンド効果が増大され、殺されることが望まれる腫瘍細胞またはほかのＦＡＳ−Ｒを担持する細胞の死が導かれるであろう。前記組換え動物ウイルスの構築は標準的な操作により行なわれる（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９参照）。ほかの可能性は、ＭＯＲＴ−１タンパク質の配列を、細胞に吸収され、そこで発現されることのできるオリゴヌクレオチドの形態で導入することである。さらなる可能性は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２７０，Ｎｏ．２４，ｐｐ．１４２５５−１４２５８，１９９５にＬｉｎらによって記載されている方法を修飾することによる。
（ii）それらはＦＡＳ−Ｒリガンド効果を阻害するために使用してもよい。たとえば、敗血症性ショック、移植片対宿主拒絶または急性肝炎における組織の傷害のようなばあいでは、ＦＡＳ−Ｒリガンドで誘導されるＦＡＳ−Ｒ細胞内シグナリングをブロックすることが望まれている。このような状況では、たとえば、標準的な方法によってＭＯＲＴ−１タンパク質のための配列をコードするアンチセンスを有するオリゴヌクレオチドを細胞へ導入することが可能であり、それによりＭＯＲＴ−１タンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳が効果的にブロックされ、ＭＯＲＴ−１タンパク質の発現がブロックされてＦＡＳ−Ｒリガンド効果の阻害が導かれるであろう。前記オリゴヌクレオチドは、ウイルスによって担持される第２の配列をオリゴヌクレオ配列にした前記組換えウイルスアプローチを用いて細胞内に導入されてもよい。
ほかの可能性はＭＯＲＴ−１タンパク質に特異的な抗体を使用してその細胞内シグナリング活性を阻害することである。
さらに、ＦＡＳ−Ｒリガンド効果を阻害するほかの方法は、最近開発されたリボザイムアプローチによるものである。リボザイムはＲＮＡを特異的に切断する触媒ＲＮＡ分子である。リボザイムは一般的に好まれる標的ＲＮＡ、たとえば本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質をコードするｍＲＮＡを切断するために創作されてもよい。そのようなリボザイムはＭＯＲＴ−１ｍＲＮＡに特異的な配列を有し、それと相互作用する（相補的に結合する）ことができ、続いてｍＲＮＡを切断してＭＯＲＴ−１タンパク質の発現を減少させ（または完全に消失させ）るであろう。その減少した発現のレベルは標的細胞でのリボザイム発現のレベルに依存する。リボザイムを一般的に好まれる細胞（たとえば、ＦＡＳ−Ｒを担持する細胞）に導入するために、任意の適切なベクター、たとえば通常この目的のために用いられるプラスミド、動物のウイルス（レトロウイルス）ベクターを使用してもよい（ウイルスが第２の配列として一般的に好まれるリボザイム配列をコードするｃＤＮＡを有する、前記（ｉ）も参照）。（リボザイムに関する総説、方法などについては、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｚｈａｏ ａｎｄ Ｐｉｃｋ，１９９３；Ｓｈｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｊｏｓｅｐｈ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅ，１９９３；Ｓｈｉｍａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｃａｎｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｂａｒｉｎａｇａ，１９９３；Ｃｒｉｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３ ａｎｄ Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３参照）。
（iii）それらは、それらに結合できるほかのタンパク質、たとえば細胞内シグナリングプロセスに関係し、ＴＮＦ−ＲまたはＦＡＳ−Ｒ細胞内ドメインの下流に存在するほかのタンパク質を単離、同定およびクローン化するために使用されてもよい。たとえば、ＭＯＲＴ−１タンパク質、すなわちそれをコードするＤＮＡ配列は酵母ツーハイブリッドシステム（実施例１、下記参照）に使用されてもよい。前記システムではＭＯＲＴ−１タンパク質の配列がｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーからＭＯＲＴ−１タンパク質に結合できるタンパク質をコードするほかの配列（「プレイ（ｐｒｅｙ）」）を単離し、クローン化し、同定するために「ベイト（ｂａｉｔ）」として用いられるであろう。同様に、本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質がほかの細胞のタンパク質、たとえばＴＮＦ／ＮＧＦ受容体スーパーファミリーのほかの受容体に結合できるかどうかを決定されてもよい。
（iv）ＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導体は同じクラスのほかのタンパク質、すなわちＦＡＳ−Ｒ細胞内ドメインまたは機能的に関連する受容体に結合し、かつ細胞内シグナリングプロセスに関係するものを単離し、同定し、クローン化するために使用されてもよい。この適用では前述の酵母ツーハイブリッドシステムを用いてもよく、またストリンジェントではないサザンハイブリダイゼーションに続いてＰＣＲクローニングを行なう、最近開発されたシステム（Ｗｉｌｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）を用いてもよい。Ｗｉｌｋｓらの刊行物には、キナーゼモチーフの既知の配列、創作されたキナーゼ配列にもとづいてストリンジェントではないサザンハイブリダイゼーションを適用し、そののちにＰＣＲによってクローニングをすることによる、２種の推定のタンパク質−チロシンキナーゼの同定およびクローニングが記載されている。このアプローチは、本発明にしたがってＭＯＲＴ−１タンパク質の配列を用い、ＦＡＳ−Ｒ細胞内ドメイン結合タンパク質に関係するものを同定してクローン化するために用いてもよい。
（ｖ）さらに、本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導体を利用するほかのアプローチは、アフィニティクロマトグラフィーの方法にそれらを用いてそれらが結合することのできるほかのタンパク質または因子たとえば、ＦＡＳ−Ｒに関連するほかの受容体や細胞内シグナリングプロセスに関係するほかのタンパク質または因子を単離し、同定することである。この適用では本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導体を個別にアフィニティクロマトグラフィーマトリックスに付着させ、細胞抽出物と接触させるかまたは細胞内シグナリングプロセスに関係があると疑われるタンパク質または因子を単離してもよい。アフィニティクロマトグラフィー操作に続き、本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導体と結合するほかのタンパク質または因子を溶出し、単離して特徴付けることが可能である。
（vi）前述のように、本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導体は、免疫原（抗原）として使用してそれに特異的な抗体を産生してもよい。これらの抗体は細胞抽出物からかまたはＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体またはフラグメントを産生する形質転換された細胞系からのいずれかからＭＯＲＴ−１タンパク質を精製する目的で使用されてもよい。さらに、これらの抗体は、ＦＡＳ−Ｒリガンドシステムが異常に機能すること、たとえば過剰に活性化されるかまたは不充分な活性しかないＦＡＳ−Ｒリガンドで誘導される細胞の効果に関する疾患を同定する目的の診断に使用されてもよい。このように、そのような疾患がＭＯＲＴ−１タンパク質に関係する多機能な細胞内シグナリングシステムに関連するのなら、前記抗体は重要な診断具として役立つであろう。
（vii）ＭＯＲＴ−１は、ほかの細胞内タンパク質（いわゆるＭＯＲＴ−１結合タンパク質、以下参照）に結合するその能力を有する理由で多くのほかのタンパク質の間接的なモジュレー夕ーとして使用されてもよい。ほかの細胞内タンパク質はさらなる細胞内タンパク質または膜貫通タンパク質の細胞内ドメインに直接結合する。前記タンパク質または前記細胞内ドメインの具体例としては、よく知られているｐ５５ＴＮＦ受容体があげられ、その細胞内シグナリングはその細胞内ドメインに直接結合する多くのタンパク質によってモジュレートされている（ともに出願中のＩＬ １０９６３２参照）。事実、我々はｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメインに結合するＭＯＲＴ−１結合タンパク質を単離した（以下および実施例２参照）。
これらのほかの細胞内タンパク質または膜貫通タンパク質の細胞内ドメインをモジュレートする目的で、前記（ii）で述べたような多くの方法でＭＯＲＴ−１を細胞内に導入してもよい。
本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質の単離、同定および特徴付けは、よく知られている標準的なスクリーニング操作のいずれかを用いて行なわれてもよい、ということも述べておくべきである。たとえば、これらのスクリーニング操作のうちの１つとして、ここで（実施例１）述べられているように酵母ツーハイブリッド操作が本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質を同定するために用いられた。同様に、前述および以下にも述べるように、当該分野でよく知られているアフィニティクロマトグラフィー、ＤＮＡハイブリダイゼーション操作などのほかの操作を用いて本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質を単離、同定および特徴付けするかまたは本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質に結合することのできるさらなるタンパク質、因子、受容体などを単離、同定および特徴付けしてもよい。
さらには、ＭＯＲＴ−１の特徴のなかにはＦＡＳ−ＩＣに結合するその能力があり、自己会合のその能力もある、ということを述べておくべきである。ＭＯＲＴ−１は単独で細胞傷害性を活性化し、自己会合のその能力に関連する活性を活性化することも可能である、ということも記載しておくべきである。ＦＡＳ−ＩＣに結合するＭＯＲＴ−１の一部分は、その自己会合に関係するＭＯＲＴ−１の部分と異なると思われる（実施例１参照）。ＭＯＲＴ−１は、前述のＭＯＲＴ−１分子の明確な部分またはその分子のほかの部分またはこれらの部分のいずれかの組み合わさったものの機能であるかもしれないほかの活性を有してもよい。これらのほかの活性は酵素的であってもよく、またほかのタンパク質との結合に関連していてもよい（たとえば、ＭＯＲＴ−１結合タンパク質またはほかの受容体、因子など）。このように、ＭＯＲＴ−１はＦＡＳ−Ｒリガンド効果またはそれ自身のＭＯＲＴ−１を介する細胞の効果のモジュレーションのために、前記方法で使用されてもよく、ほかの受容体、因子などに関連するほかの細胞シグナリングプロセスのモジュレーションに使用されてもよい。
さらに詳しくは、本発明のこの観点によりＤＮＡ分子それ自体をコードするＭＯＲＴ−１およびその変異体（すなわち、ＭＯＲＴ−１の類似体または活性画分をコードする）がＦＡＳ−Ｒの活性をモジュレートする（または細胞に対するＦＡＳリガンド効果をモジュレートするかまたは媒介する）ための遺伝子治療（すなわち、前記（ｉ）および（ii）の使用で述べた方法により）に使用することができる。さらに、ＭＯＲＴ−１は細胞に対する細胞傷害性効果を有するので、これらのＭＯＲＴ−１またはＤＮＡ分子をコードするＭＯＲＴ−１変異体も、細胞におけるＭＯＲＴ−１効果をモジュレートするための遺伝子治療に用いられてもよい（これも前記（ｉ）および（ii）の使用の方法による）。これらの遺伝子治療の適用において、ＭＯＲＴ−１、類似体または誘導体は３通りの方法で用いられてもよい：
（ａ）ＦＡＳ−ＩＣおよびＭＯＲＴ−１結合能力を有する（すなわち、２つのＭＯＲＴ−１領域を含み、そのうちの１つはＦＡＳ−ＩＣへの結合に関し、もう１つはＭＯＲＴ−１の自己会合に関する）全ＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、誘導体または活性フラグメントはＦＡＳ−ＲおよびＭＯＲＴ−１に関連する効果をモジュレートするために用いられてよい；
（ｂ）ＦＡＳ−ＩＣに結合するＭＯＲＴ−１の一部分ならびにその部分の類似体、誘導体および活性フラグメントがＦＡＳ−ＩＣに「ドミナントネガティブ」効果を誘導する、すなわちＦＡＳ−Ｒを介する細胞の効果を阻害するために使用されてもよく、ＦＡＳ−ＩＣに対する「機能の獲得（ｇａｉｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」効果、すなわちＦＡＳ−Ｒを介する細胞の効果の増大を誘導するために使用されてもよい；および
（ｃ）ＭＯＲＴ−１に特異的に結合するＭＯＲＴ−１の一部分ならびにこの部分の類似体、誘導体および活性画分は、ＭＯＲＴ−１に対する「ドミナントネガティブ」効果または「機能の獲得」効果、すなわちＭＯＲＴ−１に関連する細胞の効果の阻害または増大を誘導するために使用されてもよい。
前記（iv）の使用で述べたように、ＭＯＲＴ−１タンパク質はＭＯＲＴ−１に対して特異的な抗体を作製するために使用されてもよい。これらの抗体またはそのフラグメントは以下に詳述するように使用されてもよく、これらの適用では抗体またはそのフラグメントはＭＯＲＴ−１に特異的なものであると理解される。
ここで記載される抗体に関しては、用語「抗体」はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、キメラ抗体、抗体に対する抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体を意味し、酵素的切断に限らず、ペプチド合成法または組換え法のような既知の技法のうちのいずれかにより提供されるそのフラグメントと同様に、可溶性の形態または結合した形態で標識されうる。
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫された動物の血清由来の不均一な抗体分子の群である。モノクローナル抗体は抗原に特異的な抗体の実質的に均一な群を含み、その群は実質的に同様のエピトープ結合部位を含む。モノクローナル抗体は当業者に知られている方法でえられればよい。たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，３７６，１１０；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）；およびＣｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）を参照のこと。これらの参考文献の内容は、「参考文献」によりここに完全に取り入れられている。前記抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤを含むイムノグロブリンクラスおよびそれらのサブクラスのうちのいずれかであってもよい。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養されてもよい。ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕにおける高力価のモノクローナル抗体の産生は近年好まれている産生方法である。
キメラ抗体は、異なる動物種由来の異なる部分の分子であり、たとえばマウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒトイムノグロブリンの定常領域とを有する。キメラ抗体は適用の際の免疫原性を減少させるためにおもに用いられ、作製の際の収率を高めるために用いられる。たとえば、マウスモノクローナル抗体はハイブリドーマからの高収率を有するが、ヒトにおいては高い免疫原性を有するばあいに、ヒト／マウスキメラモノクローナル抗体が用いられる。キメラ抗体およびそれらの製造法は当該分野で既知である（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３２７３−３２７７（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３−６４６（１９８４）；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １２５０２３（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １４，１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８−２７０（１９８５）；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １７１４９６（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９，１９８５）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １７３４９４（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｍａｒｃｈ ５，１９８６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ８６０１５３３，（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｍａｒｃｈ １３，１９８６）；Ｋｕｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １８４１８７（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｊｕｎｅ １１，１９８６）；Ｓａｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０６６−１０７４（１９８６）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ８７０２６７１（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｍａｙ ７，１９８７）；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３（１９８７）；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：２１４−２１８（１９８７）；Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）；ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ｓｕｐｒａ．）。これらの参考文献は「参考文献」の欄によりここに完全に取り入れられている。
抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位に一般的に関連する特有の決定基を認識する抗体である。イディオタイプ抗体は、モノクローナル抗体、それに対して抗イディオタイプが作製される、を用いて、モノクローナル抗体のソースと同一の種および遺伝型を有する動物（たとえば、マウスの株）を免疫することにより作製することができる。免疫された動物は免疫する抗体のイディオタイプ決定基を認識し、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗−イディオタイプ抗体）を産生することにより免疫する抗体のイディオタイプ決定基に対する応答をするであろう。たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，６９９，８８０を参照のこと。これは「参考文献」の欄によりここに完全に取り入れられている。
抗イディオタイプ抗体は、さらなるほかの動物に免疫応答を誘導するための「免疫原」（いわゆる抗抗イディオタイプ抗体を産生する）として用いられてもよい。抗抗イディオタイプは抗イディオタイプを誘導するオリジナルのモノクローナル抗体とエピトープ的に同一であってもよい。このようにモノクローナル抗体のイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることにより、同一の特異性を有する抗体を発現するほかのクローンを同定することが可能である。
したがって、本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導体に対して産生されるモノクローナル抗体は、適切な動物、たとえばＢＡＬＢ／ｃマウス、において抗イディオタイプ抗体を誘導するために用いてもよい。前記免疫されたマウスからの脾細胞は、抗イディオタイプモノクローナル抗体を分泌する抗イディオタイプハイブリドーマを産生するために用いられる。さらに、抗イディオタイプモノクローナル抗体はキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなキャリアーと結合することができ、さらなるＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫するために用いられることができる。これらのマウスからの血清は、前記ＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントまたは誘導体のエピトープに特異的なオリジナルのモノクローナル抗体の結合特性を有する抗抗イディオタイプ抗体を含むであろう。
こうして、抗イディオタイプモノクローナル抗体は、それら自身のイディオタイプエピトープ、または評価されるエピトープに構造的に類似する「イディオトープ」、たとえばＧＲＢプロテイン−α、を有する。
用語「抗体」は、完全な分子とそれらのフラグメントたとえば、抗原に結合できるＦａｂとＦ（ａｂ′）₂の両者を含むものも意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ′）₂フラグメントは完全な抗体のＦｃフラグメントがなく、循環からより急速に取り除かれ、完全な抗体よりも組織結合特異性が少なくてもよい（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。
本発明に有用な抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）₂およびほかのフラグメントが、完全な抗体分子のためにここに記載されている方法にしたがって、ＭＯＲＴ−１タンパク質の検出および定量のために使用されてもよい。前記フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ′）₂フラグメントを産生するため）などの酵素を用いるタンパク質分解によって典型的に産生される。
抗体がある分子と特異的に反応してその分子と抗体とが結合できるばあいは、抗体は分子に「結合できる」といわれる。用語「エピトープ」は、抗体に結合されるいずれかの分子の一部分であって、その抗体に認識されうる部分を含むことを意味する。エピトープまたは「抗原決定基」は、アミノ酸や糖の側鎖などの化学的に活性な表面分子基から通常なり、特定の三次元構造特性のみならず特定の電荷特性も有する。
「抗原」は、抗体に結合されることのできる分子またはその分子の一部分であり、抗原のエピトープに結合できる抗体を動物にさらに産生させることができる。抗原は１またはそれより多くのあるエピトープを有していてもよい。前述の特異的な反応は、抗原が高度な選択性様式で対応する抗体と反応するが、ほかの抗原によって引きおこされてもよいほかの多数の抗体とは反応しないことを示すよう意図されている。
本発明で有用な抗体のフラグメントを含む抗体は、サンプル中のＭＯＲＴ−１の定量的または定性的検出または本発明のＭＯＲＴ−１を発現する細胞の存在を検出するために用いてよい。これは、光学顕微鏡的、フローサイトメトリック的または蛍光定量的検出と組み合わされた、蛍光的に標識された抗体を用いる免疫蛍光法（以下参照）によって確立されうる。
本発明で有用な抗体（またはそのフラグメント）は、本発明のＭＯＲＴ−１のｉｎ ｓｉｔｕでの検出のために、免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法のように、組織学的に使用されてもよい。Ｉｎ ｓｉｔｕ検出は患者から組織学的な試料を採取し、その試料に標識された本発明の抗体を提供することによって完成する。抗体（またはフラグメント）は好ましくは、標識抗体（またはフラグメント）を生物学的サンプルに適用するかまたは上にかぶせることにより提供される。このような操作を用いると、ＭＯＲＴ−１の存在のみならず、検査される組織でのその分布も測定されうる。本発明を用いると、広く様々な組織学的な方法（染色操作など）のいずれもが、そのｉｎ ｓｉｔｕ検出を達成するために修飾されうる、ということを当業者であれば容易に認めるであろう。
本発明のＭＯＲＴ−１のためのアッセイは典型的には、生物学的サンプル、たとえば生物学的液体、組織抽出物、リンパ球や白血球などの新鮮にえられた細胞または組織培地でインキュベートされた細胞など、をＭＯＲＴ−１タンパク質を同定することのできる検出可能な標識抗体の存在下でインキュベートし、当該分野でよく知られている多くの技法のうちのいずれかによりその抗体を検出することからなる。
生物学的サンプルはニトロセルロースのような固相支持体もしくは固相キャリヤー、または細胞、細胞の粒子もしくは可溶性タンパク質を固定化することのできるほかの固体支持体もしくは固体キャリヤーで処理されてもよい。支持体またはキャリヤーは適切な緩衝液で洗浄され、前記のように本発明で検出可能な標識抗体で処理してもよい。そののち、固相支持体またはキャリヤーを緩衝液で２度洗浄して結合していない抗体を除去してもよい。この固相支持体またはキャリヤーに結合した標識の量は従来の手段により検出すればよい。
「固相支持体」、「固相キャリヤー」「固体支持体」、「固体キャリヤー」、「支持体」または「キャリヤー」は、抗原や抗体を結合することのできるいかなる支持体またはキャリヤーをも意味するものである。よく知られている支持体またはキャリヤーとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、中性セルロースおよび修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、ハンレイガン（ｇａｂｂｒｏｓ）およびマグネタイトがあげられる。キャリヤーの特性は、本発明の目的のためにはある程度まで可溶性であるかまたは不溶性であることができる。支持体の材料は事実上、結合される分子が抗原か抗体に結合できる限り、いかなる構造のコンフィグレーションであってもよい。このように、支持体またはキャリヤーのコンフィグレーションは、ビーズのような球状、試験管の内側表面またはロッドの外側表面のような円筒状であってもよい。また、表面はシート、テストストリップなどのように平らであってもよい。好ましい支持体またはキャリヤーはポリスチレンビーズを含む。抗体または抗原を結合するためのほかの適するキャリヤーについては、当業者であればわかり、ルーチンの実験を用いることにより同一のものを確認できるであろう。
前述のようにして本発明でえられた多数の抗体の結合活性は、よく知られている方法により測定すればよい。当業者であればルーチンの実験を用いることにより各測定のための操作および最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。
洗浄、撹拌、振とう、ろ過などのほかのステップは、通常のようにまたは特定の条件に対しては必要に応じてアッセイ追加してもよい。
本発明の抗体を検出可能となるように標識することのできる方法のうちの１つは、抗体に酵素を結合させ、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を用いることである。この酵素は、のちに適切な基質にさらされると検出可能な、たとえば分光光度的、蛍光定量的または可視的手段により、化学的分子を産生するように基質と反応するであろう。抗体を検出可能にするために標識する際に用いることのできる酵素は、限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスのヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼがあげられる。検出は酵素用の色素基質を用いる色素法により行なうことができる。検出は、同様にして調製されたスタンダードと比較した基質に対する酵素反応の程度を視覚的に比較することにより行なってもよい。
検出は様々なほかの免疫測定法を用いて行なってもよい。たとえば、放射能で標識された抗体または抗体のフラグメントにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いてＲ−ＰＴＰアーゼを検出することができる。ＲＩＡについての好ましい記載は、Ｗｏｒｋ，Ｔ．Ｓ．らによるＬａｂｏｒａｔｏｔｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ（１９７８）に見られ、とくにＣｈａｒｄ，Ｔ．による“Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”というタイトルの章に言及されている。これは「参考文献」の欄によりここに取り入れられている。放射性アイソトープも、γカウンターまたはシンチレーションカウンターを用いてまたはオートラジオグラフィーを用いて検出することができる。
本発明の抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光的に標識された抗体が適切な波長の光にさらされると、その存在は蛍光により検出することができる。通常最もよく用いられている蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンである。
抗体は、¹⁵²Ｅまたはランタニド系のほかのものなどの蛍光発光金属を用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＥＴＰＡ）などの金属キレート基を用いて抗体に付着させることができる。
抗体は、化学発光化合物を結合させることにより検出可能に標識することもできる。化学発光が付された抗体の存在は、化学反応の過程のあいだに生ずる発光体の存在を検出することにより測定される。とくに有用な化学発行標識化合物の具体例は、ルミノール、イソルミノール、サーマティック アクリジニウムエステル（ｔｈｅ ｒｏｍａｔｉｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキシレートエステルである。
同様に、バイオ発光化合物が本発明の抗体の標識に用いられてもよい。バイオ発光体は、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的なシステムに見出されるタイプの化学発光体である。バイオ発光タンパク質の存在は、発光体の存在を検出することにより測定される。標識の目的のための重要なバイオ発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
本発明の抗体分子は「ツーサイト」アッセイまたは「サンドイッチ」アッセイとしても知られている、免疫的定量アッセイに利用するために適応させてもよい。典型的な免疫的定量アッセイでは、一定量の未標識抗体（または抗体のフラグメント）を固体支持体またはキャリヤーに結合させ、検出可能に標識した一定量の可溶性抗体を加えて、固相抗体、抗原および標識抗体間で形成された３成分の複合体を検出および／または定量する。
典型的で好まれる免疫定量アッセイは「フォーワード（ｆｏｒｗａｒｄ）」アッセイであり、そこでは固相に結合した固体がまず試験されるサンプルに接触し、２成分の固相抗体−抗原複合体の形成によりサンプルから抗原を抽出する。適切なインキュベーション期間ののち、固相支持体またはキャリヤーを洗浄して未反応の抗原を含む残った液体サンプルを除去し、未知の量の標識抗体（「レポーター分子」として働く）を含む溶液を接触させる。未標識抗体を介して抗体支持体またはキャリヤーに結合した抗原と標識抗体とを複合体とするために２回目のインキュベーションをしたのち、固体の支持体またはキャリヤーを２回洗浄し、未反応の標識抗体を除去する。
本発明の抗原を用いると有用なアッセイでもあるほかのタイプの「サンドイッチ」アッセイ、いわゆる「同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）」および「リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）」のアッセイ、が用いられる。同時のアッセイは、固体支持体またはキャリヤーに結合した抗体および標識抗体が試験されるサンプルに同時に加えられるので、１つのインキュベーションステップからなる。インキュベーションが完了すると、固体支持体またはキャリヤーを洗浄して残った液体サンプルおよび複合化されなかった標識抗体を除去する。固体支持体またはキャリヤーに結合した標識抗体の存在は、通常の「フォーワード」サンドイッチアッセイのようにして測定される。
「リバース」アッセイでは、標識抗体の溶液をまず液体サンプルに段階的に加え、つづいて固体支持体またはキャリヤーに結合する未標識の抗体を、適切なインキュベーションを行なったのちに加える。２回目のインキュベーションののちに、固相を通常の様式で洗浄し、試験されるサンプルおよび未反応の標識抗体の溶液の残りからそれを解放する。固体支持体またはキャリヤーに連結した標識抗体は、「同時に」および「フォーワード」アッセイで行なうようにして測定される。
本発明のＭＯＲＴ−１は標準的な組換えＤＮＡ操作（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９参照）により産生されてもよい。その操作では、タンパク質をコードする配列を含む適切な真核生物または原核生物のベクターにより、適切な真核生物または原核生物の宿主細胞が形質転換される。したがって、本発明は本発明のタンパク質を産生するためのそのような発現ベクターおよび形質転換された宿主にも関する。前述のように、これらのタンパク質はそれらの生物学的活性を有する類似体、フラグメントおよび誘導体を含み、したがってそれらをコードするベクターもこれらのタンパク質の類似体およびフラグメントをコードするベクターを含み、形質転換された宿主は前記類似体およびフラグメントを産生する宿主を含む。これらのタンパク質の誘導体は形質転換された宿主により産生されるタンパク質またはそれらの類似体またはフラグメントを標準的に修飾することにより産生される誘導体である。
本発明はＭＯＲＴ−１タンパク質をコードする組換え動物ウイルスベクター、このベクターは、細胞内にＭＯＲＴ−１配列を直接挿入するために、特定の標的細胞（たとえば癌細胞）の表面タンパク質と結合できるウイルス表面タンパク質をコードするベクターでもある、からなる薬学的組成物にも関する。本発明のほかの観点はつぎの実施例から明らかであろう。
以下に本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例および図面に限定されるものではない。
実施例１：ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに結合するＭＯＲＴ−１タンパク質のクローニングおよび単離
（ｉ）ツーハイブリッド スクリーンおよびツーハイブリッド β−ガラクトシダーゼ発現試験
ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインと相互作用するタンパク質を単離するために、酵素ツーハイブリッドシステムを用いた（Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ（１９８９）、共に係属中のＩＬ １０９６３２、１１２００２および１１２６９２も参照）。要約すると、このツーハイブリッドシステムは、２つの別のドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有するＧＡＬ４のような真核転写アクチベーターの回復を利用して、ｉｎ ｖｉｖｏでの特異的なタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための酵母を用いる遺伝子アッセイである。それらドメインが発現し、結合して回復したＧＡＬ４タンパク質を形成すると、ドメインは上流の活性化配列に結合することができ、ｌａｃＺまたはＨＩＳ３などのレポーター遺伝子の発現を制御するプロモーターを順に活性化する。レポーター遺伝子の発現は培養された細胞中に容易に観察される。このシステムでは、タンパク質と相互作用する候補の遺伝子は別々の発現ベクターへクローン化される。一方の発現ベクターでは、ＧＡＬ４ＤＮＡ−結合ドメインとハイブリッドタンパク質を生成するように、ある候補タンパク質の配列がＧＡＬ４ＤＮＡ−結合ドメインの配列と同位相で（ｉｎ ｐｈａｓｅ ｗｉｔｈ）クローン化され、他方のベクターでは、ＧＡＬ４−活性化ドメインとハイブリッドタンパク質を生成するように、第２候補タンパク質の配列がＧＡＬ４−活性化ドメインの配列と同位相でクローン化される。
つぎに２つのハイブリッドベクターは、上流のＧＡＬ４結合部位が制御されているｌａｃＺまたはＨＩＳ３レポーター遺伝子を有する酵母宿主株中へ同時に形質転換される。２つのハイブリッドタンパク質が発現しかつそれらのタンパク質が互いに相互作用しうる、形質転換されたそれらの宿主細胞（同時形質転換体）のみが、レポーター遺伝子を発現することができるであろう。ｌａｃＺレポーター遺伝子のばあい、Ｘ−ｇａｌが培地に加えられると、この遺伝子を発現している宿主細胞は色が青くなるであろう。したがって、青いコロニーは２つのクローン化された候補タンパク質が互いに相互作用することができるという事実を示す。
このツーハイブリッドシステムを用いて、細胞内ドメイン、ＦＡＳ−ＩＣ、を単独でベクターｐＧＢＴ９（ＧＡＬ４ＤＮＡ−結合配列を担持する、ＣＬＯＮＴＥＣＨ、米国より入手、以下参照）へ、ＧＡＬ４ＤＮＡ−結合ドメインとの融合タンパク質を作製するために、クローン化した。ｐＧＢＴ９へのＦＡＳ−Ｒのクローニングには、ＦＡＳ−Ｒの全長ｃＤＮＡ配列（係属中のＩＬ １１１１２５参照）をコードするクローンが用いられ、そこから種々の制限酵素を用いる標準的な操作により細胞内ドメイン（ＩＣ）を切断し、つぎに標準的操作により単離し、その多くのクローニング部位領域（ＭＣＳ）に、対応する適切な制限酵素を用いて、開裂したｐＧＢＴ９ベクターへ挿入した。ＦＡＳ−ＩＣは完全なＦＡＳ−Ｒの残基１７５〜３１９から延長（ｅｘｔｅｎｄ）しているが、残基１７５〜３１９を含むこの部分はｐＧＢＴ９ベクターへ挿入されたＦＡＳ−ＩＣである（ＩＬ１１１１２５も参照）ということを記載すべきである。
つぎに前記ハイブリッド（キメラの）ベクターを、ＧＡＬ４活性化ドメインを有する、ｐＧＡＤ ＧＨベクターへクローン化されたヒトＨｅＬａ細胞由来ｃＤＮＡライブラリーとともに、ＨＦ７ｃ酵母宿主株へ、同時トランスフェクトした（全ての前記ベクター、ｐＧＢＴ９およびＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーを担持するｐＧＡＤ ＧＨ、ならびに酵母株は、ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲツーハイブリッドシステム ♯ＰＴ１２６５−１の一部として、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，米国より購入した）。同時トランスフェクトされた酵母をヒスチジン欠損培地（Ｈｉｓ^-培地）中でのそれらの増殖能により選択した。増殖しているコロニーは陽性の形質転換体であることを示す。選択した酵母クローンは、つぎにそのｌａｃＺ遺伝子発現能、すなわちそのＬＡＣＺ活性について試験した。これは、ｌａｃＺ遺伝子によりコードされる酵素、β−ガラクトシダーゼにより異化され、青く着色した生産物を形成するＸ−ｇａｌを培地に加えることにより行なった。このように、青いコロニーは活性ｌａｃＺ遺伝子を示す。ｌａｃＺ遺伝子の活性には、ＧＡＬ４転写アクチベーターが形質転換されたクローンにおいて活性型で存在すること、すなわち前記ハイブリッドベクターによりコードされるＧＡＬ４ＤＮＡ−結合ドメインが他方のハイブリッドベクターによりコードされるＧＡＬ４活性化ドメインと正確に結合することが必要である。このような組み合わせは、ＧＡＬ４ドメインのそれぞれに融合した２つのタンパク質が互いに安定に相互作用（結合）するばあいに限り可能である。このように、単離されたＨｉｓ⁺および青い（ＬＡＣＺ⁺）コロニーは、ＦＡＳ−ＩＣをコードするベクターおよびＦＡＳ−ＩＣに安定に結合しうるヒトＨｅＬａ細胞起源のタンパク質産物をコードするベクターとともに同時トランスフェクトされたコロニーである。
前記Ｈｉｓ⁺、ＬＡＣＺ⁺酵母コロニー由来のプラスミドＤＮＡを単離し、標準的操作で大腸菌株ＨＢ１０１へ電気穿孔し、つづいてＬｅｕ⁺およびアンピシリン耐性形質転換体を選択をした。これらの形質転換体はＡｍｐ^RおよびＬｅｕ²の両コード配列を有するハイブリッドｐＧＡＤ ＧＨベクターを担持するものである。したがって、このような形質転換体は、ＦＡＳ−ＩＣに結合しうる新たに同定されたタンパク質をコードする配列を担持するクローン類である。つぎにプラスミドＤＮＡをこれらの形質転換した大腸菌から単離し、
（ａ）前述のように、それらをオリジナルのＦＡＳ−Ｒ細胞内ドメインハイブリッドプラスミド（ＦＡＳ−ＩＣを担持するハイブリッドｐＧＴＢ９）とともに酵母株ＨＦ７へ再形質転換すること。コントロール群として、たとえばｐＡＣＴ−ラミンまたはｐＧＢＴ９単独の配列をコードする無関係なタンパク質を担持するベクターを、ＦＡＳ−ＩＣ−結合タンパク質（すなわちＭＯＲＴ−１）をコードするプラスミドとともに同時形質転換のために用いた。つぎに同時形質転換した酵母はＨｉｓ^-培地単独、または３−アミノトリアゾールの異なる濃度を含む培地で増殖について試験した、および
（ｂ）プラスミドＤＮＡおよびオリジナルのＦＡＳ−ＩＣハイブリッドプラスミドおよび（ａ）に記載のコントロールプラスミドを酵母宿主細胞株ＳＦＹ５２６に再形質転換することおよびＬＡＣＺ⁺活性（β^-ｇａｌ形成の有効性、すなわち青色形成）を決定すること
により再試験した。
前記試験の結果は、コロニーの色で評価すると、Ｈｉｓ^-培地におけるコロニーの増殖のパターンはＬＡＣ Ｚ活性のパターンに一致した、すなわちＨｉｓ⁺コロニーはＬＡＣＸ⁺でもあったことを示した。さらに、ＧＡＬ４ＤＮＡ−結合ハイブリッドおよび活性化−ドメインハイブリッドを、ＨＦ−７酵母宿主細胞よりＧＡＬ４転写アクチベーターによる良好なＬＡＣＺ誘導能を有するＳＦＹ５２６酵母宿主へトランスフェクションしたのちに、液体培地（好ましい培地条件）におけるＬＡＣ Ｚ活性を評価した。
前記操作を用いて、ＨＦ１と称する、「受容体により誘導される毒性のメディエーター（Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ）」のため今やＭＯＲＴ−１とも称するタンパク質が同定され、単離されおよび特徴づけられた。
さらに、多数の前記ツーハイブリッド β−ガラクトシダーゼ発現試験において、β−ガラクトシダーゼの発現は好ましいフィルターアッセイによっても評価されたことも記載すべきである。スクリーニングでは、約３×１０⁶ｃＤＮＡのうちの５つがＭＯＲＴ−１挿入物を含むことがわかった。つぎにいわゆるクローン化したＭＯＲＴ−１ｃＤＮＡ挿入物を標準的なＤＮＡ配列決定操作を用いて配列決定した。ＭＯＲＴ−１のアミノ酸配列をＤＮＡ配列から推定した。ｃＤＮＡ挿入物によりコードされるタンパク質における残基の番号付けはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ｄａｔａ ｂａｎｋにならう。欠失突然変異株をＰＣＲにより、および点突然変異株をオリゴヌクレオチド−指示突然変異誘発（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，（１９９４））により生産した。
（ii）タンパク質の誘導された発現、代謝的標識および免疫沈降法
ＦＬＡＧオクトペプチドにＮ末端結合したＭＯＲＴ−１（ＦＬＡＧ−ＨＦ１、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，Ｃｔ．，米国）、Ｆａｓ−ＩＣ、ＦＡＳ−Ｒ、ｐ５５−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン（アミノ酸１５３〜３１９）に融合したｐ５５−Ｒの細胞ドメイン（アミノ酸１〜１６８）からなるキメラ、およびコントロールとして働くルシフェラーゼｃＤＮＡをＨｅＬａ細胞で発現させた。発現はテトラサイクリン−制御発現ベクターを用い、テトラサイクリン−制御トランスアクチベーターを発現するＨｅＬａ細胞のクローン（ＨｔＴＡ−１）（Ｇｏｓｓｅｎ）およびＢｕｊａｒｄ（１９９２）、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５８５４に記載、Ｂｏｌｄｉｎら（１９９５）も参照）において行なった。［³⁵Ｓ］メチオニンおよび［³⁵Ｓ］システイン（ＤＵＰＯＮＴ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅ．，米国およびＡｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）での代謝的標識はトランスフェクションの１８時間のち、さらにメチオニンおよびシステイン欠損であるが２％透析ウシ胎児血清を添加したダルベッコの改良イーグル培地で４時間インキュベーションを行なった。つぎに細胞をＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１％デオキシコーレート、０．１％ＳＤＳおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、溶解質を無関係なウサギ抗血清（３μｌ／ｍｌ）およびプロテインＧセファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国、６０μｌ／ｍｌ）とのインキュベーションにより前清浄した。免疫沈降法は、ＦＬＡＧオクトペプチド（Ｍ２、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）、ｐ５５−Ｒ（♯１８および♯２０、（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０））、またはＦＡＳ−Ｒ（ＺＢ４、Ｋａｍｉｙａ Ｓｏｕｔｈａｎｄ Ｏａｋｓ、Ｃａ．，米国）に対するマウスモノクローナル抗体（５μｌ／アリコート）と、もしくはコントロールとしてアイソタイプ適合マウス抗体とともに溶解質の０．３ｍｌアリコートを４℃で１時間インキュベーションし、さらにプロテインＧセファロースビーズ（３０μｌ／アリコート）と１時間インキュベートすることにより行なった。
（iii）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合
野生型ＦＡＳ−ＩＣまたは突然変異したＦＡＳ−ＩＣとのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合体を生産し、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させた（ＩＬ １０９６３２、１１１１２５、１１２００２、１１２６９２に記載、Ｂｏｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）、Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ ａｎｄ Ｎｅｅｌ（１９９３）も参照）。代謝的に標識したＦＬＡＧ−ＨＦ１融合タンパク質のＧＳＴ−Ｆａｓ−ＩＣへの結合は、代謝的に［³⁵Ｓ］メチオニン（６０μＣｉ／ｍｌ）で標識した、ＦＬＡＧ−ＨＦ１を発現するＨｅＬａ細胞の抽出物と４℃で２時間ビーズをインキュベーションすることにより評価した。抽出物は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＮＰ−４０、１ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド、２０μｇ／ｍｌアプロトニン、２０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０ｍＭフッ化ナトリウムおよび０．１ｍＭバナジン酸ナトリウム（１ｍｌ／５×１０⁵細胞）を含む緩衝液において調製した。
（iv）誘導されたＨＦ１の発現により誘発する細胞傷害性の評価
ＨＦ１、Ｆａｓ−ＩＣ、ｐ５５−ＩＣおよびルシフェラーゼｃＤＮＡをテトラサイクリン−制御発現ベクターへ挿入し、分泌型胎盤アルカリホスファターゼｃＤＮＡとともにＨｔＴＡ−１細胞（ＨｅＬａ細胞系）にトランスフェクトし（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ（１９９２））、ＳＶ４０プロモーター（ｐＳＢＣ−２−ベクター（Ｄｉｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９３））の制御下においた。細胞死を中性レッドの取り込みアッセイ（Ｗａｌｌａｃｈ（１９８４））または、トランスフェクトされたｃＤＮＡを発現するそれらの細胞における死を特異的に評価するために、インキュベーションの最後の５時間に増殖培地に分泌される胎盤アルカリホスファターゼの量を決定すること（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８８））により、トランスフェクションの４０時間のちに評価した。
ＦＡＳ−ＩＣへの結合と関係するＭＯＲＴ−１（ＨＦ１）タンパク質の領域を分析するための実験のもう一方のセットでは、テトラサイクリン−制御発現ベクター（ｐＵＨＤ１０−３）を用いて、以下のタンパク質、ヒトＦＡＳ−Ｒ単独、ヒトＦＡＳ−ＲだけでなくＭＯＲＴ−１のＮ末端部分（アミノ酸１〜１１７、「ＭＯＲＴ−１ヘッド」）、ヒトＦＡＳ−ＲだけでなくＭＯＲＴ−１のＣ末端部分、これはその「デス・ドメイン」相同領域（アミノ酸１３０〜２４５、「ＭＯＲＴ−１ ＤＤ」、ＩＬ １１２７４２も参照）を含む、ＦＬＡＧ−５５．１１（Ｎ末端でＦＬＡＧオクタペプチドに融合したタンパク質５５．１１のアミノ酸３０９〜９００、タンパク質５５．１１はｐ５５−ＩＣ−特異的結合タンパク質である。ＩＬ １０９６３２も参照）がテトラサイクリン−制御トランスアクチベーターを含むＨｅＬａ細胞（ＨｔＴＡ−１）で一時的に発現された。トランスフェクションの１２時間後、細胞をトリプシン処理し、３０，０００細胞／ウェルの濃度で再びまいた。さらなるインキュベーションの２４時間のち、細胞を、１０ｇ／ｍｌシクロヘキシミドの存在下、種々の濃度（０．００１〜１０μｇ／ｍｌモノクローナル抗体）でＦＡＳ−Ｒの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体（モノクローナル抗体ＣＨ−１１、Ｏｎｃｏｒ）を用いて６時間処理した。つぎに細胞生存率を中性レッド取り込みアッセイにより決定し、結果はシクロヘキシミド単独（抗−ＦＡＳ−Ｒモノクローナル抗体ＣＨ−１１がない）とインキュベーションした細胞と比較して生存可能な細胞の％で表わした。
（ｖ）ノーザン分析および配列分析
ポリＡ⁺ＲＮＡをＨｅＬａ細胞の全ＲＮＡから単離した（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ ｍＲＮＡ ｋｉｔ．ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｄｅｎ、独国）。プローブとしてＨＦ１ ｃＤＮＡを用いるノーザン分析を通常の方法（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５８５４に記載、Ｂｏｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）も参照）により行なった。ＭＯＲＴ−１（ＨＦ１）のヌクレオチド配列をジデオキシチェーンターミネーション法により両方向で決定した。
前記実験過程により結果（表１および図１〜７に示す）は以下のようである。ツーハイブリッド操作によりクローン化されたＭＯＲＴ−１ ｃＤＮＡの配列分析はそれが新規タンパク質をコードすることを示した（下記参照）。このタンパク質（ＭＯＲＴ−１、「受容体−誘導毒性のメディエーター」のため）のＦａｓ−ＩＣへの結合の特異性をさらに評価するために、およびそれが結合するＦａｓ−ＩＣの特定の領域を定義するために、ツーハイブリッド試験を適用し、以下の発見に導いた（表１）。（ａ）タンパク質はヒトおよびマウスＦａｓ−ＩＣの両方に結合するが、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーの３種の受容体（ｐ５５およびｐ７５ＴＮＦ受容体ならびにＣＤ４０）を含む、数種のほかの試験したタンパク質類には結合しない。
（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方においてシグナリングを消滅させることが示される（ｌｐｒ^cg突然変異（Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）、Ｉｔｏｈ ａｎｄ Ｎａｇａｔａ（１９９３））、ＦＡＳ−Ｒの「デス・ドメイン」における２２５位（Ｉｌｅ）の置換突然変異もまたＦＡＳ−ＩＣへのＭＯＲＴ−１の結合を阻止する。
（ｃ）ＦＡＳ−ＲにおけるＭＯＲＴ−１結合部位はこの受容体の「デス・ドメイン」内に存在する、および（ｄ）ＭＯＲＴ−１はそれ自体に結合する。この自己結合、およびＦＡＳ−ＲへのＨＦ１の結合はタンパク質の異なる領域に関係する。残基１〜１１７に対応するＭＯＲＴ−１のフラグメントは全長ＭＯＲＴ−１に結合するが、それ自体にもＦＡＳ−ＩＣにも結合しない。逆に、残基１３０〜２４５に対応するフラグメントはＦＡＳ−Ｒに結合するが、ＭＯＲＴ−１には以前結合しない（表１）。さらに、表１の結果から、ＦＡＳ−Ｒの「デス・ドメイン」領域はＦＡＳ−ＩＣ自己会合に決定的であることが、ｐ５５−ＩＣの自己会合のためのｐ５５−Ｒの「デス・ドメイン」領域のように、明らかである。これらの「デス・ドメイン」の両端における欠失はその自己会合能に影響を及ぼさないが、一方でこれらの「デス・ドメイン」内での欠失は自己会合に影響を及ぼす。ＭＯＲＴ−１のばあいでは、ＭＯＲＴ−１のＦＡＳ−ＩＣに対する結合もまたＦＡＳ−Ｒの完全（全長）な「デス・ドメイン」に依存するが、一方でＦＡＳ−ＩＣ結合のためのＦＡＳ−Ｒ「デス・ドメイン」領域の領域外は依存しない。

β−ガラクトシダーゼ発現フィルターアッセイにより評価したようにトランスフェクトされたＳＦＹ５２６酵母内でのＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化−ドメイン構築物（ｐＧＢＴ９およびｐＧＡＤ−ＧＨ）によりコードされるタンパク質の相互作用を前記表１に表わす。ＤＮＡ−結合ドメイン構築物は、ヒトＦａｓ−ＩＣの４種の構築物、２２５位にＩｌｅからＬｅｕまたはＩｌｅからＡｌａへの置換突然変異を有する２種の全長構築物（各々、Ｉ２２５ＮおよびＩ２２５Ａ）を含むマウスＦａｓ−ＩＣの４種の構築物、および３種のＨＦ１（ＭＯＲＴ−１）構築物を含み、その全ての構築物類を図式的に表の左手側に示す。活性化−ドメイン構築物は、３種のＨＦ１構築物類、そのＨＦ１部分はＤＮＡ−結合−ドメイン構築物におけるのと同様である、および全長ヒトＦａｓ−ＩＣ構築物、Ｆａｓ−ＩＣ部分は前記ＤＮＡ−結合ドメイン構築物におけるのと同じである、を含んでいた。ヒトｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ残基２０６〜４２６）、ヒトＣＤ４０の細胞内ドメイン類（ＣＤ４０−ＩＣ、残基２１６〜２７７）およびヒトｐ７５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン（ｐ７５−ＩＣ、残基２８７〜４６１）だけでなく、ラミン、サイクリンＤおよび「空の（ｅｍｐｔｙ）」Ｇａｌ４（ｐＧＢＴ９）ベクター類をＤＮＡ−結合ドメイン構築物の形態で陰性コントロール群として供した。ＳＮＦ−１およびＳＮＦ４をＤＮＡ−結合ドメイン（ＳＮＦ）構築物および活性化−ドメイン（ＳＮＦ４）構築物の形態で陽性のコントロール群として供した。「空の」Ｇａｌ４ベクター（ｐＧＡＤ−ＧＨ）もまた活性ドメイン構築物の形態で陰性コントロール群として供した（ｐ５５−ＩＣ、ｐ７５−ＩＣに関するさらなる詳細については、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５８５４も参照）。記号「＋＋」および「＋」は、各々、アッセイの３０および９０分間内での強い発色を意味し、ならびに「−」は２４時間内に発色がないことを意味する。スコアがない組み合わせは試験しなかったことを与える。
ＦＬＡＧオクタペプチドとそのＮ末端で融合したＨＦ１（ＭＯＲＴ−１）分子（ＦＬＡＧ−ＨＦ１）の発現は４種の異なるサイズ、約２７、２８、３２および３４ｋＤのタンパク質類をＨｅＬａ細胞内で産生した。図１（ＡおよびＢ）にｉｎ ｖｉｔｒｏでのＦａｓ−ＩＣとのＨＦ１の相互作用を実証する結果を示す。図１ＡおよびＢの記載でわかるように、図１ＡはＦＬＡＧ−ＨＦ１（ＦＬＡＧ−ＭＯＲＴ１）融合タンパク質でまたはコントロールとしてのルシフェラーゼｃＤＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の抽出物由来のタンパク質の免疫沈降物のコントロールオートラジオグラムの複写物であり、免疫沈降は抗−ＦＬＡＧ抗体（αＦＬＡＧ）を用いて行なわれた。図１Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＨＦ１とＦＡＳ−ＩＣの間の相互作用を示すオートラジオグラムの複写物である。そこではＨＦ１は、トランスフェクトされたＨｅｌａの細胞の抽出よりえられた、［³⁵Ｓ］メチオニン−代謝的標識ＨＦ１−ＦＬＡＧ融合タンパク質の形態であり、またはＦＡＳ−ＩＣは、ＦＡＳ−ＩＣの２２５位に置換突然変異を有するものを含むヒトおよびマウスＧＳＴ−ＦＡＳ−ＩＣ融合タンパク質の形態であり、そのＧＳＴ−ＦＡＳ−ＩＣ融合タンパク質の全てが大腸菌において生産された。ＧＳＴ−融合タンパク質は、ＨＦ１−ＦＬＡＧ融合タンパク質を含む抽出物との相互作用させる前にグルタチオンビーズに付着され、この相互作用に続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥが行なわれた。このようにｉｎ ｖｉｔｒｏでの相互作用を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにつづくオートラジオグラフィーにより、ＧＳＴ、ヒトまたはマウスＦａｓ−ＩＣとのＧＳＴ融合（ＧＳＴ−ｈｕＦａｓ−ＩＣ、ＧＳＴ−ｍＦａｓ−ＩＣ）に対するまたは２２５位でのＩｌｅからＡｌａへの置換突然変異を含むＦａｓ−ＩＣとのＧＳＴ融合に対する、ＦＬＡＧオクタペプチドとの融合（ＦＬＡＧ−ＨＦ１）としてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞内で生産され、［³⁵Ｓ］で代謝的に標識されたＨＦ１の結合を評価することにより見きわめた。図１Ｂから明らかなように、全４種のＦＬＡＧ−ＨＦ１タンパク質はＧＳＴ−Ｆａｓ−ＩＣ融合タンパク質とのインキュベーションでＦａｓ−ＩＣへの結合能を示した。酵母ツーハイブリッド試験（表１）におけるように、ＨＦ１はｌｐｒ^cg突然変異部位での置換（Ｉ２２５Ａ）を有するＧＳＴ−Ｆａｓ−ＩＣ融合タンパク質には結合しない。
ＦＬＡＧ−ＨＦ１ ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質もまたＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに対してだけでなくその細胞外ドメインがｐ５５Ｒのそれと置換されたＦＡＳ−Ｒキメラ（ｐ５５−ＦＡＳ）の細胞内ドメインに対して、ＨｅＬａ細胞においてこれらの受容体で同時発現させると、結合能を示した。図２（Ａ、Ｂ、Ｃ）に、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞内での、すなわちｉｎ ｖｉｖｏでのＦＡＳ−ＩＣとのＨＦ１の相互作用を実証する結果を示す。図２Ａ、Ｂ、Ｃ、の記載において前記のように、これらの図はｉｎ ｖｉｖｏ相互作用およびこれらのタンパク質をコードする構築物で同時トランスフェクトされた細胞内でのＨＦ１とＦＡＳ−ＩＣのあいだの相互作用の特異性を実証する種々のトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞類の免疫沈降物のオートラジオグラムの複写物である。このように、ＦＬＡＧ−ＨＦ１融合タンパク質は単独で、またはヒトＦＡＳ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒの細胞外ドメインがヒトｐ５５−Ｒにおける対応する領域と置換されたＦＡＳ−Ｒキメラ（ｐ５５−ＦＡＳ）と一緒に、または陰性コントロールとして、ヒトｐ５５−Ｒと一緒に、ＨｅＬａ細胞内で発現し、［³⁵Ｓ］システイン（２０μＣｉ／ｍｌ）および［³⁵Ｓ］メチオニン（４０μＣｉ／ｍｌ）で代謝的に標識された。同時発現された受容体とのＨＦ１の交差免疫沈降は示した抗体類（図２Ａ〜Ｃ）を用いて行なった。図２Ａ〜Ｃにおいて明らかなように、ＦＬＡＧ−ＨＦ１はＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに対してだけでなくｐ５５−Ｒの細胞外ドメインおよびＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインを有するＦＡＳ−Ｒ−ｐ５５−Ｒキメラの細胞内ドメインに対しても、ＨｅＬａの細胞内でこれらの受容体類が同時発現されると、結合しうる（それぞれ、図２Ａの中央の３つのレーンおよび図２Ｃの左側の３つのレーンを参照）。さらに、トランスフェクトされた細胞の抽出物からのＦＬＡＧ−ＨＦ１の免疫沈降もまた同時発現されたＦＡＳ−Ｒ（図２Ａ）または同時発現されたｐ５５−ＦＡＳキメラ（図２Ｃ）の沈降という結果になった。逆に、これらの受容体類の免疫沈降はＦＬＡＧ−ＨＦ１の共沈降という結果になった（図２Ａおよび２Ｃ）。
プローブとしてＨＦ１ ｃＤＮＡを用いるノーザン分析はＨｅＬａ細胞において単一のハイブリダイゼーションした転写産物を表わした。図３は、トランスフェクトされた細胞由来のポリＡ⁺ＲＮＡ（０．３μｇ）がＨＦ１ ｃＤＮＡとハイブリダイズされたノーザンブロットの複写物を示す。この転写産物のサイズ（約１．８ｋＢ）はＨＦ１ ｃＤＮＡのそれ（約１７０２ヌクレオチド）に近い。
配列分析では、ｃＤＮＡは約２５０アミノ酸のオープンリーディングフレームを含むことが判った。図４は「デス・ドメイン」モチーフに下線を引き、可能性のある開始Ｍｅｔ残基（４９位、ボールド、下線を引いたＭ）および翻訳終結コドン（７６９〜７７１位のコドンの下の星印）も同様にし、ＨＦ１の予備の（ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ）ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を表わす。この「デス・ドメイン」モチーフは既知のｐ５５−ＲおよびＦＡＳ−Ｒ「デス・ドメイン」モチーフ類（ｐ５５ＤＤおよびＦＡＳ−ＤＤ）と相同性を共有する。ＨＦ１の正確なＣ末端を決定するためおよびＨＦ１の正確なＮ末端（開始Ｍｅｔ残基）に関する証拠をうるために、追加の実験を以下のように行なった。
前記方法を用いて、ＦＬＡＧオクタペプチドとそのＮ末端で融合したＨＦ１分子（ＦＬＡＧ−ＨＦ１）をコードする多数の構築物を構築し、³⁵Ｓ−システインおよび³⁵Ｓ−メチオニンを用いて発現されたタンパク質の代謝的標識とともにＨｅＬａ細胞で発現させた（図５Ｂに関しては前記参照）。ＨＦ１−ＦＬＡＧ分子はＨＦ１コード配列の異なる部分を含む以下のｃＤＮＡによりコードされた。
ｉ）ヌクレオチド１〜１４５（図４参照）を欠失させたＨＦ１ ｃＤＮＡの５′末端に結合したＦＬＡＧオクタペプチドｃＤＮＡ、
ii）ＨＦ１全長ｃＤＮＡの５′末端に結合したＦＬＡＧオクタペプチドｃＤＮＡ（図１Ｂに関しては前記ＦＬＡＧ−ＨＦ１構築物参照）、
iii）ヌクレオチド１〜１４５に加えてヌクレオチド８３２〜１７０１を欠失させ、１４２〜１４４位のコドンＧＣＣをこの部位での翻訳開始を阻止するためにＴＣＣに突然変異させたＨＦ１ ｃＤＮＡの５′末端に結合したＦＬＡＧオクタペプチドｃＤＮＡ。
前記ＨＦ１−ＦＬＡＧ融合生産物の発現につづき、抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ２）またはコントロールとして、抗−ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ抗体（♯９）を用い、前記のように免疫沈降を行ない、つづいてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）およびオートラジオグラフィーを行なった。結果を図５に示す。図５は、前記ＨＦ１−ＦＬＡＧ融合タンパク質が分離され、ゲルの各レーンにのせられたサンプルが以下のようであるオートラジオグラムの複写物である。
レーン１および２：ヌクレオチド１〜１４５を欠失させたＨＦ１ ｃＤＮＡの５′末端に結合したＦＬＡＧオクタペプチドｃＤＮＡによりコードされるＨＦ１−ＦＬＡＧ融合タンパク質。
レーン３および４：全長ＨＦ１ ｃＤＮＡの５′末端に結合したＦＬＡＧオクタペプチドｃＤＮＡによりコードされるＨＦ１−ＦＬＡＧ融合タンパク質。
レーン５および６：ヌクレオチド１〜１４５に加えて８３２〜１７０１を欠失させ、１４２〜１４４位でＧＣＣをこの部位での翻訳開始を阻止するためにＴＣＣに突然変異させたＨＦ１ ｃＤＮＡの５′末端に結合したＦＬＡＧオクタペプチドｃＤＮＡによりコードされるＨＦ１−ＦＬＡＧ融合タンパク質。
免疫沈降は、レーン２、４および６におけるサンプル用には抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体を用いて、レーン１、３および５におけるサンプル用には抗−ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ抗体で行なった。
図５のオートラジオグラムから、レーン２および４における生産物のサイズが同一であることにより、ヌクレオチド７６９〜７７１がＨＦ１の翻訳終止部であること、すなわちこのコドンは終止シグナルであり、図４に星印により示されることが確かめられた、ということは明らかである。さらに、レーン６においてちょうど２つの翻訳産物を表わす広いバンドが存在すること（ゲル上にみられるがオートラジオグラム上では強く標識されているので単一のバンドになっている）は、レーン２および４にさらに２つの産物（さらに大きい分子量の広いバンド）が存在するということがＦＬＡＧ−ＨＦ１融合分子のＮ末端およびＨＦ１配列内のメチオニン 残基数４９（図４におけるアミノ酸配列の４９位にボールドの下線をひいたＭを参照）の両方での翻訳の開始を反映している、ということを示す。このように、前記結果はＨＦ１の（認められていた）Ｃ末端を確認し、またＨＦ１のＮ末端は図４における配列の４９位であろうという証拠を提供した。
実に、その５′末端に融合したＦＬＡＧオクタペプチドがないＨＦ１の追加の発現実験により、Ｍｅｔ⁴⁹は翻訳開始の有効部位として働くことが示された。
「Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ」および「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂａｎｋ」データベースで処理された調査は図４に表わされるＨＦ１の配列に対応するものはないことを示したことを記載すべきである。このように、ＨＦ１は新規ＦＡＳ−ＩＣ−特異的結合タンパク質を表わす。
ｐ５５−ＩＣの高い発現は細胞傷害効果（ＩＬ １０９６３２、１１１１２５およびＢｏｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）参照）を引き起こす。ＨｅＬａ細胞でのＦａｓ−ＩＣの発現もまた、低い程度ではあるが、感度のよいアッセイを使用するばあいにのみ検出される、そのような効果を有する。図６ＡおよびＢは、ＨＦ１、加えてヒトｐ５５−ＩＣおよびＦＡＳ−ＩＣでトランスフェクトされた細胞における細胞傷害効果がリガンド非依存的に引き起こされることを図式的に表わす。ＨｅＬａ細胞の生存率に対する、ＨＦ１、ヒトＦａｓ−ＩＣ、ヒトｐ５５−ＩＣ、またはコントロールとして働くルシフェラーゼの一過性発現の効果をテトラサイクリン−制御発現ベクターを用いて評価した。細胞生存率は、分泌型胎盤アルカリホスファターゼをコードするｃＤＮＡとともに、テトラサイクリン（１μｇ／ｍｌ、発現を阻止するため）の存在下（白ぬきのバー、図６ＡおよびＢ）または不在下（黒ぬりのバー、図６ＡおよびＢ）でこれらのｃＤＮＡ類をトランスフェクションした４０分後に評価した。細胞の生存率は、トランスフェクトされたＤＮＡを発現するそれらの特定の細胞の生存率を特異的に決定するために、中性レッドの取り込みアッセイにより（図６Ａ）または、増殖培地に分泌される胎盤アルカリホスファターゼの量を測定することにより（図６Ｂ）決定した。
このように、ＨｅＬａ細胞におけるＨＦ１の発現により、ＦＡＳ−ＩＣ発現によってひきおこされるよりも重大な細胞死に至るということは図６およびＢから明らかである。ｐ５５−ＩＣ、ＦＡＳ−ＩＣおよびＨＦ１の全てのこれらの細胞傷害性効果は、「デス・ドメイン」領域に関し、これらのタンパク質類の全てに存在し、その「デス・ドメイン」が自己会合する傾向を有し、およびそれゆえに細胞傷害性効果を促進しうると思われる。
ＨＦＩ（ＭＯＲＴ−１）の前記特徴、すなわち、細胞死誘導に関係するＦＡＳ−Ｒの特定の領域とのＨＦ１の特異的会合、およびシグナリングを妨げるその領域における構造のわずかな変化でさえ、ＨＦ１の結合を消滅させる（ｌｐｒ^cg突然変異）という事実、の観点ではこのタンパク質が細胞死のシグナリングまたはトリガーの役割をになうことを示す。この考えは、それ自身が細胞傷害性効果を誘発するＨＦ１の能力が観察された、ということによりさらに支持される。このように、ＨＦ１（ＭＯＲＴ−１）は（ｉ）ＦＡＳ−Ｒのみならずそれ自身に対しても結合するそれ自身の能力によるＦＡＳ−Ｒの自己会合のモジュレーターとして機能し、または（ii）ＦＡＳ−Ｒシグナリングに関係する追加のタンパク質のためのドッキング部位として働く、すなわちＨＦ１は「ドッキング」タンパク質でありそれゆえＦＡＳ−Ｒに加えてほかの受容体に結合するであろう、または（iii）ＦＡＳ−Ｒシグナリングとの相互作用を有する異なるシグナリングシステムの部分を構築するのであろう。
ＦＡＳ−ＩＣ結合およびＦＡＳ−Ｒを介する細胞の効果（細胞傷害性）のモジュレーションに関係するＭＯＲＴ−１（ＨＦ１）の領域をさらに分析するために、ＭＯＲＴ−１の部分（「ＭＯＲＴ−１ヘッド」、アミノ酸１０１１７および「ＭＯＲＴ−１ｄｄ」、アミノ酸１３０〜２４５）（別々に）をコードするベクター類を用いて、ＨｅＬａ細胞の同時トランスフェクションのためのヒトＦＡＳ−Ｒをコードするベクターとともに、前記実験を行なった。これらの実験では種々のタンパク質およびタンパク質の組み合わせを、タンパク質をコードする配列をテトラサイクリン−制御発現ベクターｐＵＨＤ１０−３に挿入することによりテトラサイクリン−制御トランスアクチベーター（ＨｔＴＡ−１）を含むＨｅＬａ細胞で一時的に発現させた。コントロールトランスフェクション群はＦＡＳ−ＲのみをコードするベクターおよびＦＬＡＧ−５５．１１融合タンパク質（５５．１１タンパク質は、アミノ酸３０９〜９００を含む部分がＦＬＡＧオクタペプチドに（そのＮ末端で）融合したｐ５５−ＩＣ−特異的結合タンパク質である）をコードするベクターを用いた。
トランスフェクションおよびインキュベーション期間（前記（iv）参照）につづき、トランスフェクトされた細胞を、細胞により発現されたＦＡＳ−Ｒの細胞外ドメインに特異的に結合する種々の濃度の抗−ＦＡＳ−Ｒモノクローナル抗体（ＣＨ−１１）で処理した。抗ＦＡＳ−Ｒ抗体のこの結合は細胞表面でＦＡＳ−Ｒの凝集を誘導し（ＦＡＳ−Ｒリガンドのようである）、ＦＡＳ−ＩＣを介する細胞内シグナリング経路を誘導し、最後には、細胞死（ＦＡＳ−Ｒを介する細胞傷害性）という結果になる。用いられる抗−ＦＡＳ−Ｒモノクローナル抗体（ＣＨ−１１）の濃度は０．０１〜１０μｇ／ｍｌの範囲であり、通常０．００５、０．０５、０．５および５μｇ／ｍｌのような濃度であった。細胞は１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドの存在下抗−ＦＡＳ抗体で処理した。
前記分析の結果を、トランスフェクトされた細胞の４つの異なるグループのそれぞれについて、処理された細胞に用いられる抗−ＦＡＳ−Ｒモノクローナル抗体（ＣＨ１１）の濃度の関数として、トランスフェクトされた細胞の生存率％を表わす図７に図式的に説明する。トランスフェクトされた細胞のこれらのグループを以下のように異なる記号により記する。（ｉ）白ぬきの四角はＦＬＡＧ−５５．１１融合タンパク質をコードする非関連（すなわち、非ＦＡＳ−ＩＣ結合）コントロールベクター（「５５．１１」、陰性コントロール）によりトランスフェクトされた細胞を記し、（ii）黒ぬりの四角はＦＡＳ−Ｒをコードするベクターおよび、ＭＯＲＴ−１「デス・ドメイン（ｄｄ）」相同領域を含む、ＭＯＲＴ−１のＣ末端部分、アミノ酸１３０〜２４５をコードするベクターで同時トランスフェクトされた細胞（「ｆａｓ⁺ｍｏｒｔ１ｄｄ」を記し、（iii）黒ぬりの三角はＦＡＳ−Ｒをコードするベクターのみでトランスフェクトされた細胞（「ｆａｓ」、陽性コントロール）を記し、および（iv）白ぬきの丸はＦＡＳ−ＲをコードするベクターおよびＭＯＲＴ−１のＮ末端部分、アミノ酸１〜１１７、「ＭＰＲＴ−１ヘッド」をコードするベクターで同時トランスフェクトされた細胞（「ｆａｓ⁺ｍｏｒｔ１ｈｅ」）を記す。
図７に示した結果から、トランスフェクトされた細胞におけるＦＡＳ−Ｒの発現は抗−ＦＡＳ−Ｒ抗体の細胞傷害性効果に対して感受性（「ｆａｓ」と「５５．１１」とを比較）が増大されることが明らかである。さらに、「デス・ドメイン」相同領域を含むＭＯＲＴ−１における領域およびＦＡＳ−Ｒの同時発現（「ｆａｓ⁺ｍｏｒｔ１ｄｄ」）は、ＦＡＳ−Ｒ「デス・ドメイン」（ＦＡＳ−ＤＤ）に結合するＭＯＲＴ−１「デス・ドメイン」（ＤＤ）領域の能力（前記表１参照）から予期されるように、ＦＡＳで誘導される（すなわち、ＦＡＳ−Ｒを介する）細胞死を強く妨害する。さらに、ＭＯＲＴ−１のＮ末端部分およびＦＡＳ−Ｒの同時発現（「ｆａｓ⁺ｍｏｒｔ１ｈｅ」）はＦＡＳ−Ｒを介する細胞死を妨害せず、かりにするとしても、いくらか細胞傷害性を高める（すなわち、わずかに細胞死が増加する）程度である。
このように、前記結果は明らかに、ＭＯＲＴ−１タンパク質はＦＡＳ−ＩＣへの結合にかぎり２つの異なる領域を有することおよびＦＡＳ−ＩＣの細胞−細胞傷害性活性の介在が関与することを示す。
したがってこれらの結果は異なる薬学的適用のためにはＭＯＲＴ−１タンパク質の異なる部分（すなわち、活性フラグメント類またはアナログ類）を使用するということの根拠をも提供する。たとえば、その「デス・ドメイン」領域を含むＭＯＲＴ−１のＣ末端部分のみを本質的に含むＭＯＲＴ−１タンパク質のアナログまたはフラグメントまたはその誘導体は、ＦＡＳ−Ｒを含む細胞または組織におけるＦＡＳ−Ｒの介する細胞傷害性効果を阻害するために用いられてもよく、それゆえたとえば、急性肝炎のようなばあいに、ＦＡＳ−Ｒリガンドの有害な効果からこれらの細胞または組織を保護するであろう。また、腫瘍細胞および自己反応性ＴおよびＢ細胞のようなばあいに望まれれば、ＭＯＲＴ−１のＮ末端部分のみを本質的に含むＭＯＲＴ−１タンパク質のアナログまたはフラグメントまたはその誘導体を、ＦＡＳ−Ｒを含む細胞および組織におけるＦＡＳ−Ｒの介する細胞傷害性効果を高めるために用いてこれらの細胞または組織を破壊に導いてもよい。ここで詳述したように、ＭＯＲＴ−１の異なる領域の前記使用は、処理が望まれる特定の細胞または組織中へＭＯＲＴ−１領域コード配列を挿入するために種々の組み換えウイルス（たとえば、ワクシニア）を用いて行なわれてもよい。
さらに、これらのＭＯＲＴ−１領域を介する同様の所望の効果を達成するために、前記ＭＯＲＴ−１領域に対応する配列または分子構造を有する抗体、ペプチドおよび有機分子のような種々のほかの分子を製造し、用いることも可能である。

配列表
(1)一般情報：
(i)出願人：イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド
バインブールゼル、ヘンリー
ワラック、デイビッド
ボルディン、マーク
バルフォロメーフ、ユージーン
メット、アイゴア
(ii)発明の名称：ＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体機能のモジュレーター
(iii)配列の数：２
(iv)連絡先：
(A)名宛人：ブラウディ アンド ニーマーク
(B)街路：エヌ ダブリュ、セブンス ストリート 419、スイート 300
(C)都市：ワシントン
(D)州：ディストリクト オブ コロンビア
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：20004
(v)コンピュータ読取フォーム：
(A)媒体の形式：フロッピーディスク
(B)コンピュータ：ＩＢＭ製パーソナルコンピュータコンパチブル
(C)オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：PatentIn Release #1.0,バージョン #1.30
(vi)出願データ：
(A)出願番号：
(B)出願日：
(C)分類：
(vii)優先権データ：
(A)出願番号：イスラエル国 112022
(B)出願日：1994年12月15日
(vii)優先権データ：
(A)出願番号：イスラエル国 112692
(B)出願日：1995年２月19日
(vii)優先権データ：
(A)出願番号：イスラエル国 114615
(B)出願日：1995年７月16日
(viii)代理人情報：
(A)氏名：ブラウディ、ロジャー エル
(B)登録番号：25,618
(C)ファイル番号：WALLACH=16
(ix)連絡先情報：
(A)電話：(202)628-5197
(B)ファクシミリ：(202)737-3528
(C)テレックス：248633
(2)配列番号：１
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：1701
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：1..768
(xi)配列：配列番号：１

(2)配列番号：２
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：256
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：２

Claims (11)

1. ＦＡＳリガンド受容体の細胞内ドメイン（ＦＡＳ−ＩＣ）と結合することが可能である、ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子であって、
   （ａ）配列番号１記載のＭＯＲＴ−１タンパク質のヌクレオチド配列、
   （ｂ）ＭＯＲＴ−１タンパク質と１アミノ酸残基が異なり、ＦＡＳ−ＩＣに結合するＭＯＲＴ−１タンパク質の類似体をコードするヌクレオチド配列、
   （ｃ）ＭＯＲＴ−１タンパク質のアミノ酸残基１３０〜２４５を含有するフラグメントであって、ＦＡＳ−ＩＣと結合するフラグメントをコードするヌクレオチド配列、または
   （ａ）、（ｂ）または（ｃ）で定義されたヌクレオチド配列の縮重変異体からなる群から選択されるＤＡＮ分子。
2. 配列番号２のアミノ酸配列をコードする請求の範囲第１項記載のＤＮＡ分子。
3. 配列番号１に示されたＤＮＡ配列からなる請求の範囲第２項記載のＤＮＡ分子。
4. 請求の範囲第１項記載のＤＮＡ分子によってコードされ、ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインと結合することができるポリペプチド。
5. 配列番号２に示される推測されたアミノ酸配列を含む請求の範囲第４項記載のポリペプチド。
6. 制御配列と機能的に連結された、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のＤＮＡ分子を含む、ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに結合するポリペプチドの真核細胞における発現のためのベクター。
7. ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに結合するポリペプチドの製造法であって、該ポリペプチドの発現を提供し、翻訳後修飾およびその単離に適した条件下で請求の範囲第６項記載のベクターで形質転換された宿主細胞を増殖することからなる製造法。
8. ＦＡＳ−Ｒを担持する細胞に対するインビトロにおけるＦＡＳ−Ｒリガンド効果のモジュレーション法であって、ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに結合可能であり、ＦＡＳ−Ｒの活性をモジュレートすることができる、請求の範囲第４項または第５項記載のポリペプチドによる該細胞の処理を含むモジュレーション法。
9. 請求の範囲第４項または第５項記載のポリペプチドをコードする細胞のｍＲＮＡ配列と結合することのできるリボザイム配列をコードするベクターを、そのリボザイム配列が該細胞で発現できる形態で該細胞に導入するリボザイム操作を適用することを含み、該リボザイム配列が細胞で発現するとリボザイムは細胞のｍＲＮＡ配列と結合し、そのｍＲＮＡ配列を切断し、該細胞でのＭＯＲＴ−１タンパク質の発現を阻害する、細胞に対するインビトロにおけるＦＡＳ−Ｒリガンド効果をモジュレートする方法。
10. 細胞へのＦＡＳ−Ｒリガンド効果をモジュレートするための薬学的組成物であって、活性成分として請求の範囲第４項または第５項記載のポリペプチドまたはそれらの混合物を含有する薬学的組成物。
11. 細胞へのＦＡＳ−Ｒリガンド効果をモジュレートするための薬学的組成物であって、細胞表面受容体と結合することができるタンパク質をコードする配列および請求の範囲第４項または第５項記載のポリペプチドをコードする配列を担持する組換え動物ウイルスベクターを活性成分として含有する薬学的組成物。

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