CN1105725C - Fas/ap01受体功能的调节物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了可调节FAS/APO1功能的蛋白质。该蛋白质可在适当条件下通过培养一种宿主细胞来制备，该宿主细胞用含有编码这种蛋白质的DNA的载体转化，并分离该蛋白质。

Description

FAS/AP01受体功能的调节物

本发明主要涉及属于TNF/NGF受体超家族领域及其生物学功能的控制。受体的TNF/NGF超家族包括诸如p55和p75肿瘤坏死因子受体(TNF/R)以及FAS配体受体(也称作FAS/AP01或FAS-R，下文称作FAS-R)和其它的受体。更具体地说，本发明涉及一种新的蛋白质，本文称作MORT-1(也称作HF-1)，它与Fas-R的胞内区域(IC)结合(该胞内区域被称作Fas-IC)，并且该新型蛋白质可调节Fas-R的功能。再者，MORT-1也可进行自组合，并且可单独激活细胞毒性。本发明还涉及MORT-1的制备和使用。

这里需要说明的是，HF-1(原名)和MORT-1(本发明用名)在本说明书中同时使用，并表示同一种蛋白质。

肿瘤坏死因子(TNF-α)和淋巴细胞毒素(TNF-β)(下文中，TNF以TNFα和TNFβ表示)是多功能的促发炎细胞分裂素，主要由单核吞噬细胞形成，对细胞有多种效应(Wallach，D.(1996)Interferon 7(IonGresser，ed.)，pp.83-122，Academic Press，London；以及Beutler和Cerami(1987))。TNF-α和TNF-β通过结合到特定细胞表面受体上来起始它们的效应。有些效应可能对机体有益：它们可以破坏例如肿瘤细胞或病毒感染细胞并提高粒细胞的抗菌活性。这样，TNF有助于机体针对肿瘤和感染病原体的防御并有助于损伤的修复。因此TNF可用作抗肿瘤药剂，使用时它结合于肿瘤细胞表面的受体上，从而导致肿瘤细胞死亡情况的发生。TNF也可用作抗感染制剂。

然而，TNF-α和TNF-β也有副作用。已有证据表明过量TNF-α会在几种疾病中起主要的致病作用。因此现在已知TNF-α的效应，主要作用于维管结构，是引起败血性休克病症的主要原因(Tracey et al.，1986)。在一些疾病中，TNF通过抑制脂肪细胞的活动并通过厌食症的发生可导致体重过量减轻(恶病质)，因而TNF-α被称为恶病质素(Cachetin)。它也被描述为在风湿病中组织损伤的介导物(Beutler and Cerami，1987)以及在移植物对宿主的反应中观察到的损伤的主要介导物(Piquet et al.，1987)。另外，TNF与发炎过程和许多其它疾病有关也是众所周知的。

与TNF-α和TNF-β特异结合的两种不同的独立表达的受体，p55和p75和TNF-R起始和/或介导上述TNF的生物效应。这两种受体具有不同的胞内区域结构，提示它们的信导过程不同(参见Hohmann et al.，1989；Engelmann et al.，1990；Brochhaus et al.，1990；Leotscher et al.，1990；Schall et al.，1990；Nophar et al.，1990；Smith et al.，1990；和Heller et al.，1990)。然而，其细胞学机制，例如与p55和p75 TNF-R胞内信导有关的各种蛋白质和在可能存在的其它因子还有待阐明(在PCT/US95/05854及下文中第一次描述了新的蛋白质可与p75 IC和p55 IC结合)。正是这一通常发生在配体(即TNF(α或β)与受体结合后的胞内信导过程导致了阶梯反应的发生，最终导致了所观察到的细胞对TNF的反应。

至于上述TNF的杀细胞效应，在目前已研究过的绝大多数细胞中，这一效应主要是由p55 TNF-R引起的。针对p55 TNF-R胞外区域(配体结合区域)的抗体其自身可引起杀细胞效应(参见EP412486，这与受体与抗体的交叉连接效应一致，它被认为是胞内信导过程产生的第一步。再者，突变研究(Brakebusch et al.，1992；Tartaglia et al.，1993)表明，p55 TNF-R的生物功能依赖于其胞内区域的完整性，因而推测导致TNF杀细胞效果的胞内信导的起始是p55 TNF-R两个或多个胞内区域联合的结果。而且，TNF(α和β)是以同源三聚体的形式存在，因而推测，经由p55 TNF-R的胞内信导是通过其与受体分子结合和交联的能力，即使受体聚集来诱导的。在PCT/US95/05854及下文中描述了p55IC和p55DD可怎样自联合并以不依赖配体的方式在细胞中诱导与TNF相关的效应。

受体TNF/NGF超家族中的另一成员是FAS受体(FAS-R)，它也被称为Fas抗原，是一种在不同组织中表达的并与一些包括TNF-R和NGF-R的细胞表面受体具有同源性的细胞表面蛋白。FAS-R以自融解(apoptosis)的方式介导细胞死亡(Itoh et al.，1991)，并好象充作自反应性T细胞的负选择物，即在T细胞的成熟过程中，FAS-R介导识别自身抗原的T细胞的自融解死亡。现已发现，FAS-R基因(1pr)的突变在小鼠中导致淋巴细胞增殖紊乱，与人自身免疫疾病全身红斑狼疮(SLE)相似(Watanabe-Fukunaga et al.，1992)。FAS-R的配体好象是由杀伤T细胞(或者细胞毒性T淋巴细胞CTL)携带的细胞表面结合分子(还有其它分子)。因而当这种CTL与携带FAS-R的细胞接触时，它们可诱导携带FAS-R细胞的自融解细胞死亡。而且，已制备出对FAS-R特异性的单克隆抗体，该单克隆抗体可诱导携带FAS-R细胞的自融解细胞死亡，包括由编码人FAS-R cDNA转化的小鼠细胞(Itoh et al.，1991)。

现已发现，除了T淋巴细胞外各种其它正常细胞都能在其表面表达FAS-R并且可被该受体诱发死亡。这种杀伤过程诱导的失控被怀疑对某些疾病中的组织损伤起作用，例如，在急性肝炎中肝细胞的破坏。因而，寻找出的抑制FAS-R毒性产生的方法具有潜在的治疗用途。

反过来，由于已发现一些恶性细胞和HIV感染细胞在其表面携带FAS-R，针对FAS-R抗体或FAS-R配体的抗体在这些细胞中可用于诱发FAS-R介导的细胞毒效应，从而提供了一种抵抗这种恶性细胞或HIV感染细胞的方法(参见Itoh et al.，1991)。因而，寻找其它提高FAS-R细胞毒活性的方法也具有潜在的治疗价值。

长久以来，人们一直期待一种调节对TNF(α或β)和FAS-R配体细胞应答的方法，例如在上述的病理状态下，其中TNF或FAS-R配体被过量表达，人们期望抑制TNF-或FAS-R配体诱导的杀细胞效应，而在其它情况下，例如伤口愈合，人们期望提高TNF效应，或对于FAS-R来说在肿瘤细胞或HIV感染的细胞中，人们期望提高FAS-R介导的效应。

本发明已发现了几种方法(参见如，欧洲专利申请NO.EP186833，EP308378，EP398327和EP412486)来调节TNF的有害效应，它是通过使用抗-TNF抗体或使用可溶性TNF受体(基本上是该受体的可溶性胞外区域)与TNF结合到细胞表面结合TNF-R的竞争来抑制TNF与其受体的结合。而且，基于TNF与其受体的结合对TNF诱导的细胞效应来说是必需的这一点，本发明已开发出了通过调节TNF-R活性来调节TNF效应的方法(参见例如IL101769和其相应的EP568925)。简言之，EP568925(IL101769)涉及调节信号转导和/或TNF-R的断裂的方法，其中肽或其它分子可与受体本身或与受体相互作用的效应蛋白相互作用，从而调节TNF-R的正常功能。在EP568925中描述了各种突变型p55 TNF-R的构建和定性，该突变型p55 TNF-R在p55 TNF-R的胞外、跨膜和胞内区域具有突变。这样，p55 TNF-R上述区域内的区段被认为对受体的功能是必需的，即最终导致在细胞中观察到的TNF-效应的配体(TNF)结合和随后的信号转导和胞内信号。而且还描述了一些分离和鉴定可结合到上述TNF-R区域内不同区段的蛋白质、肽或其它因子的方法。这些蛋白质、肽和其它因子可涉及TNF-R活性的调节或调整。一些分离和克隆DNA顺序的方法，这种DNA顺序用于编码这些蛋白质和肽；构建产生这些蛋白质和肽的表达载体的方法；和制备与TNF-R相互作用或与结合到TNF-R不同区域上的蛋白质和肽相互作用的抗体或其片段的方法在EP568925中均有描述。然而，EP568925没有阐明结合到TNF-R(如p55 TNF-R)胞内区域的实际的蛋白质和肽，也没有描述分离和鉴定这种结合到TNF-R胞内区域的蛋白质或肽的酵母两杂种方法(yeast two-hybrid approach)。同样，截止目前还没有可结合到FAS-R胞内区域的蛋白质或肽的公开资料。

因而，当需要抑制TNF或FAS-R配体的效应时，需要降低细胞表面TNF-R或FAS-R的量或活性，而TNF-R或FAS-R量或活性的增加在寻求提高TNF或FAS-R配体效应时是必需的。为了这一目的，已对p55 TNF-R和p75 TNF-R的启动子进行了测序、分析，并且一些关键的序列主型(sequence motif)被发现与不同的转录调节因子具有特异性，因而这些TNF-R的表达可在其启动子水平进行控制，即为了降低受体的数量进行的从启动子的转录抑制和为了增加受体数量进行的从启动子的转录增强(参见IL104355和IL109633)。有关在FAS-R基因启动子水平的FAS-R控制的研究还有待公布。

再者，应当指出，即使已知肿瘤坏死因子(TNF)受体和其结构相关的受体FAS-R在白细胞产生的配体刺激后，在细胞中引起破坏活性，导致它们自身的死亡，但对这一引发的机理还知之甚少。突变研究表明，在FAS-R和p55 TNF受体(p55-R)信导细胞毒性与它们胞内区域的特定区段相关(Brakebush et al.，1992；Tartaglia et al.，1993；Itoh和Nagata，1993)。这些区段(“死亡区域”)具有序列相似性。FAS-R和p55-R的这一“死亡区域”倾向于自联合。它们的自联合明显地促进起始信导所必需的受体聚集(参见PCT/US95/05854，以及Song et al.，1994；Wallach et al.，1994；Boldin et al.，1995)并且受体的高水平表达可引起配体不依赖性信导的引发(PCT/US95/05854和Boldin et al.，1995)。

这样，在PCT/US95/05854和本发明之前，没有人能提供属于TNF/NGF超家族的通过介导胞内信导过程调节配体效应的蛋白质，如TNF或FAS-R对细胞的配体效应。这一信导在很大程度上是由属于受体的TNF/NGF超家族受体的胞内区域(IC)支配的，如TNF-R的胞内区域，即P55和P75 TNF-R胞内区域(分别为p55 IC和p75 IC)，以及FAS-IC。

因而，本发明的目的之一是提供可结合于FAS-R胞内区域的蛋白质，为MORT-1，其类似物、片段或衍生物。该蛋白质现在被认为参与由FAS配体与其受体的结合起始的胞内信导过程。本发明的MORT-1蛋白质，其类似物、片段或衍生物显著不同于前述申请中描述的FAS-IC结合蛋白。

本发明的另一目的是提供针对这些FAS-IC结合分子(为MORT-1蛋白质，其类似物、片段和衍生物)的对抗物(如抗体)。它在需要时在这种FAS-IC-结合蛋白是正信导效应物(即诱导信导)时可用于抑制信导过程，或在需要时，在这一FAS-IC-结合蛋白是负信导效应物(即抑制信导)时，用于增强信导过程。

本发明的另一目的是用这种MORT-1蛋白质，类似物、片段和衍生物来分离和鉴定另外的蛋白质或因子，这些蛋白质或因子例如可能参与了更下游的信导过程，和/或分离和鉴定信导过程中更下游的、与这些MORT-1蛋白质、类似物、片段和衍生物结合(如其它FAS-R或相关的受体)并因而参与其功能的受体。

本发明的另一个目的是使用上述MORT-1蛋白质、类似物、片段和衍生物作为抗原来制备其多克隆和/或单克隆抗体。这些抗体反过来可用作例如纯化从不同来源如细胞提取物或转化的细胞系得到的新的MORT-1蛋白质。

而且，这些抗体可用于诊断目的，例如，鉴定与由FAS-R受体介导的细胞效应异常功能相关的疾病。

本发明的再一个目的是提供包含上述MORT-1蛋白质、类似物、片段或衍生物的药物组合物以及含有上述抗体或其它拮抗物的药物组合物。

根据本发明，我们发现了一种新的蛋白质，它可结合到FAS-R的胞内区域。该FAS-IC结合蛋白通过介导或调节通常发生在FAS-R结合到细胞表面之后发生的胞内信导过程充作FAS-R配体对细胞效应的介导物或调节物。

该新的蛋白质已被命名为HF1，或MORT-1(表示“受体毒性介导物”)，并且除了其FAS-IC-结合性外还有其它特性(见实施例1)，例如，它具有与p55-TNF-R和FAS-R(p55-DD和FAS-DD)的“死亡区域”(DD)区段具有同源性的区段，因而也可进行自联结。MORT-1也可单独激活细胞毒性，这一活性可能与其自联结能力相关。现已发现，含有“死亡区域”同源序列(MORT-DD，位于MORT-1的C末端部分)的MORT-1(HF1)中区段的共表达强烈干扰FAS-诱导的细胞死亡，正如从其结合到FAS-IC“死亡区域”的能力所预期的那样。另外，在相同的实验条件下，我们发现不含有MORT-DD区段(MORT-1的N-末端部分，氨基酸1-117，“MORT-1头部”)的部分的MORT-1共表达对FAS诱导的细胞死亡没有影响，并造成FAS-诱导的细胞毒性的某种程度的提高。

因而，本发明提供了一种编码本文称作MORT-1蛋白质、其类似物或片段的DNA序列，这些MORT-1蛋白质、其类似物或片段可结合到或作用于胞内区域FAS-配体受体(FAS-IC)。

具体地说，本发明提供了一种选自下组的DNA序列：

(a)来源于天然MORT-1蛋白质编码区的cDNA序列；

(b)在适度严谨条件下可与(a)的cDNA杂交并编码生物活性FAS-R胞内区域结合蛋白的DNA序列：和

(c)与(a)和(b)中限定的DNA序列遗传密码具有简并性的并且编码生物活性FAS-R胞内区域结合蛋白的DNA序列。

本发明上述DNA序列的一个特定实例是一种含有图4中描述的序列的编码蛋白质MORT-1的DNA序列。

本发明也提供了一种由上述序列中任一种编码的MORT-1蛋白质，其类似物、片段或衍生物，所说蛋白质、类似物、片段和衍生物可结合至FAS-R的胞内区域或与其相互作用。

本发明上述蛋白质的一个特定实例是具有图4描述的推测的氨基酸序列的MORT-1蛋白质。

本发明也提供了编码上述MORT-1蛋白质、类似物、片段或衍生物的载体，它含有本发明的上述DNA序列，这一载体可在适当的真核或原核宿主中表达；含有这种载体的转化的真核或原核宿主细胞；一种在适于所说蛋白质、类似物、片段或衍生物表达的条件下生产MORT-1蛋白质、类似物或衍生物的方法；获得所说蛋白质所需要的该蛋白质进行翻译后修饰的方法以及将表达的蛋白质、类似物、片段或衍生物从转化细胞的培养基或从转化细胞的细胞提取物中提取出来的方法。

另一方面，本发明也提供了对MORT-1蛋白质，其类似物、片段和衍生物具特异性的抗体或其活性衍生物或片段。

又一方面，本发明提供了根据上述DNA序列或它们编码的蛋白质的各种用途，这些用途包括：

(i)一种调节携带在FAS-R细胞上的FAS-R配体效应的方法，包括用一种或多种根据本发明的MORT-1蛋白质、类似物、片段或衍生物处理所说细胞，它们均可结合于所说FAS-R的胞内区域并调节其活性，其中，所说的细胞的处理包括将一种或多种MORT-1蛋白质、类似物、片段或衍生物以适合于胞内施用的形式导入细胞，或将编码一种或多种蛋白质、类似物、片段或衍生物的DNA序列以携带所说序列的适当表达载体的形式导入所说细胞，这种序列可在所说细胞中表达。

(ii)一种调节细胞上FAS-R配体效应的方法，包括用MORT-1，其类似物、片段或衍生物处理所说细胞，它们均可结合于FAS-R的胞内区域并改变其活性，其中所说的细胞处理包括将MORT-1、类似物、片段或衍生物以适于胞内导入的形式导入细胞，或者将编码MORT-1、类似物、片段或衍生物的DNA序列以携带所说序列的适当载体的形式导入细胞，所说载体可将其所携带序列以该序列可在所说细胞中表达的方式插入的细胞。

(iii)上述(ii)中的方法，其中所说细胞的处理是通过将该细胞用一种重组动物病毒载体转染而进行的，包括以下步骤：

(a)构建一种重组动物病毒载体，它携带一种序列，该序列编码一种病毒表面蛋白(配体)，这种表面蛋白能够结合于携带FAS-R的细胞表面的特定细胞表面受体上，而所携带第二个序列，可编码选自本发明的MORT-1蛋白质、类似物、片段和衍生物的蛋白质，当他们在所说胞中表达后，可调节FAS-R的活性。

(b)用(a)的所说的载体感染所说的细胞。

(iv)一种调节FAS-R配体对携带FAS-R的细胞效应的方法，包括用本发明的抗体或其活性衍生物或片段处理所说细胞，这种处理是用含所说抗体或其活性片段或衍生物的合适的组合物处理所说细胞，其中，当细胞的MORT-1蛋白质或它的一部分暴露于细胞表面时该组合物被配制成适于胞外使用的形式，当MORT-1蛋白质位于胞内时，该组合物被配制成适于细胞内使用的形式；

(v)一种调节FAS-R对携带FAS-R的细胞配体效应的方法，包括用编码对至少部分的MORT-1序列反义序列的寡核苷酸序列处理所说细胞，所选寡核苷酸序列可封闭MORT-1蛋白质的表达；

(vi)上述(v)中的方法，其中，所说细胞处理是用一种重组动物病毒载体转染细胞而进行的，包括以下步骤：

(a)构建一种重组动物病毒载体，它携带有一种序列，该序列编码一种可结合到FAS-R-携带细胞表面的特定细胞表面受体的病毒表面蛋白(配体)，和第二种序列，该序列是一种寡核苷酸序列，它编码至少部分MORT-1序列的反义序列，这种寡核苷酸序列当由病毒导入所说细胞后可封闭MORT-1蛋白质的表达；和

(b)用(a)中的所说载体感染所说细胞。

(vii)一种处理肿瘤细胞或HIV-感染细胞，或其它疾病细胞的方法，包括：

(a)构建一种重组动物病毒载体，它携带有一种编码可结合到肿瘤细胞表面受体HIV-感染细胞表面受体或由其它疾病细胞携带的受体的病毒表面蛋白质的序列，和一种编码选自MORT-1蛋白质、类似物、片段和衍生物的蛋白质的序列，当他们在所说肿瘤、HIV-感染细胞或其它疾病细胞中表达时可杀死所说细胞；和

(b)用(a)中的所说载体感染所说肿瘤或HIV-感染细胞或其它疾病细胞。

(viii)一种调节细胞上FAS-R配体效应的方法，包括使用核酶方法，其中，将一种编码可与一种细胞mRNA序列相互作用的核酶序列的载体以允许所说核酶序列在所说细胞中表达的形式导入所说细胞，上述细胞mRNA序列编码MORT-1蛋白质，并且当其中核酶序列在所说细胞中表达时，它与细胞mRNA序列相互作用并切割mRNA序列，导致MORT-1蛋白质在所说细胞中表达的抑制；

(ix)选自上述方法中任意一种的方法，其中，MORT-1蛋白质或MORT-1编码序列含有至少特异地与FAS-IC结合的那部分MORT-1蛋白质，或至少编码与FAS-IC特异性结合的那部分MORT-1蛋白质的那部分MORT-1编码序列。

(x)一种分离和鉴别可结合到FAS-R胞内区域的蛋白质的方法，包括使用非严谨Southern杂交条件和随后的PCR克隆，其中，将这种序列或其部分用作探针，从cDNA或基因组DNA文库中结合与其至少部分同源的序列，然后将被结合的序列扩增并用PCR方法克隆，以产生编码具有与本发明的所说序列至少部分同源性的蛋白质的克隆。

本发明也提供了一种用于调节细胞上FAS配体效应的药物组合物，含有作为活性组分的下列任一种物质：(i)根据本发明的MORT-1蛋白质，其生物学活性片段、类似物、衍生物或其混合物，(ii)一种重组动物病毒载体，它编码一种可与细胞表面受体结合的蛋白质，并编码MORT-1蛋白质或其生物学活性片段或类似物；和(iii)一种寡核苷酸序列，它编码一种MORT-1序列的反义序列，其中所说寡核苷酸序列可以是上述(ii)中的重组动物病毒载体的第二种序列。

应当指出，MORT-1具有一个特定的区域，它可结合至FAS-IC，和另一个特定的区域，它参与MORT-1的自联结，因而，这些特定的区段或它的一部分可独立地用于鉴别其它可结合至MORT-1或FAS-R并可能参与与MORT-1或FAS-R-相关的胞内信导过程的蛋白质、受体等。而且，MORT-1可能具有其它与上述特定的区域或MORT-1的其它区域或其结合有关的活性，例如，酶活性，它可能是单独与MORT-1的细胞毒效应相关。因而，MORT-1也可用于特异性地鉴别可能参与这种与MORT-1相关的另外活性的其它蛋白质、肽等。

以下将详细描述本发明的内容，其它方面和实施例。

请注意本文使用的下列术语：“调节细胞上的FAS-配体效应”；以及“调节细胞上的MORT-1效应”应被理解为既包括体外处理也包括体内处理。

附图说明：

图1A和B为SDS-PAGE胶(10％丙烯酰胺)放射自显影的复制图，表明HF1(MORT-1)和FAS-IC之间在体外的相互作用。图1A表明该蛋白质沉淀的对照放射自显影图(来源于用FLAG-HF1(FLAG-MORT-1)融合蛋白质或用荧光素酶cDNA(对照)转染的Hela细胞提取物]的免疫沉淀，免疫沉淀是用抗一FLAG抗体进行的；和图1B表明用于评估HF1和FAS-IC之间体外相互作用的具有代表性的胶的放射自显影图。HF1和FAS-IC之间作用的评估是通过用放射自显影评估在被转染Hela细胞中产生的以与FLAG八肽(FLAG-MORT-1)融合蛋白的形式存在的[³⁵S]-甲硫氨酸-代谢标记的HF1与GST、人和小鼠GST-FAS-IC融合蛋白(GST-huFAS-IC，GST-mFAS-IC)和GST-FAS-IC融合蛋白(其中FAS-IC 225位含有一个异亮氨酸到丙氨酸的替换突变(GST-mFAS-IC I225A))的结合而进行的。将包括首先提取出来的被标记的FLAG-MORT-1融合蛋白的HeLa细胞[³⁵S]标记蛋白质与各种GST和GST-IC蛋白质(结合于谷胱甘肽珠)进行相互作用，然后进行SDS-PAGE。将用荧光素酶转染的HeLa细胞提取物与GST和GST-FAS-IC融合蛋白进行相互作用，然后进行SDS-PAGE，并将其作为所有实验的对照。图1A和B也在实施例1中进行了描述。

图2A，B和C为SDS-PAGE胶(10％丙烯酰胺)放射自显影复制图，其上是被分离开的来源于被转染HeLa细胞的各种免疫沉淀物，并显示在体内的HF1(MORT-1)与FAS-IC的相互作用。该HeLa细胞是用编码单独的HF1-FLAG(FLAG-MORT-1)融合蛋白质、HF1-FLAG融合蛋白质和人FAS-R(FLAG-MORT1+Fas/AP01或单独的从FAS-R(Fas/AP01)(图2A)的DNA构建体转染的；或用HF1-FLAG融合蛋白质和人p55R(AFLAG-MORT1+p55R(图2B)转染的；或用HF1-FLAG融合蛋白和用人FAS-R和p55-R之间的嵌合融合蛋白转染的，其中FAS-R的胞外区域已被p55-R(FLAG-MORT1+p55-FAS嵌合体)或单独的FAS-R-p55-R嵌合融合蛋白(p55-Fas嵌合体)的相当区段替换(图2C)。在所有情况下，该转染细胞用[³⁵S]半胱氨酸(20μCi/ml)和[³⁵S]甲硫氨酸(40μCi/ml)进行了代谢标记，并进行了蛋白质提取。然后将从不同转染细胞得到的蛋白质提取物用各种抗体进行免疫沉淀。这些抗体是抗-FLAG，抗-FAS，抗-p75-R和抗-p55-R抗体(图2A-C中的αFLAG、αFAS、αp75-R和αp55-R)。并将这些免疫沉淀物进行SDS-PAGE。在图2A的左边，标明了相应于FAS-R(Fas/AP01)和HF1-FLAG(FLAG-MORT1)的蛋白质带；图2A和B之间标出了标准分子量标记物(单位为KDa)的相对位置；在图2C的左边，标出了相应于p55R和p55-FAS嵌合体的蛋白质带。实施例1中对图2A-C也有描述。

图3为Northern印迹的复制图，其中，从被转染的HeLa细胞得到的聚A⁺RNA(0.3μg)是用HF1 cDNA探测的，如实施例所述。

图4图解描述了HF1的初步的核苷酸序列和推测的氨基酸序列，如实施例1所述，其中“死亡区域”如一个可能的转译起始位点，即在49位划有底线的甲硫氨酸残基(黑体，划有底线的M)那样，在其底下划有底线。星号表示转译终止密码子(核苷酸769-771)。在每一行的开始和中间标有两个数字，表示相对于该序列的起点(5′端)序列中核苷酸和氨基酸的相对位置，其中，第一个数字表示核苷酸，第二个数字表示氨基酸。

图5显示了确定MORT-1C-末端的实验结果，它是一个SDS-PAGE胶(10％丙烯酰胺)的放射性自显影复制图，在其上是分离开的HeLa细胞中表达的各种MORT-1-FLAG融合产物，并是用³⁵S-半胱氨酸和³⁵S-甲硫氨酸进行代谢标记，然后用抗-FLAG单克隆抗体(M2)(泳道2、4和6)或作为对照的抗-p75 TNF-R抗体(#9)(泳道1、3和5)进行免疫沉淀，如实施例1所述。

图6(A和B)图解描述了用MORT-1转染的细胞中杀细胞效应的配体-不依赖性引发，其中细胞活性或者是用中性红摄取测试来确定的(图6A)，或者对于特异性测定表达被转染DNA细胞的活性来说，是用测定分泌至培养基中的胎盘碱性磷酸酶的量来确定的(图6B)。HeLa细胞是用四环素控制的表达载体转染的，该载体表达HF1(MORT1)、人FAS-IC、人p55-IC、或荧光素酶(对照)，以及在所有情况下的编码分泌的碱性磷酸酶的cDNA，这样可以评估这些蛋白质的瞬间表达对细胞活性的影响.在图6A和6B中，空心柱表示在四环素存在下(1μg/ml，阻断表达)生长的被转染细胞，实心柱表示不存在四环素时生长的被转染细胞。图6A和6B在实施例1中也有描述。

图7图解表示了不同含量的MORT-1蛋白质对由FAS-R介导的细胞毒效应的影响，如实施例1中所述。

以下将对本发明进行详细描述。本发明一方面涉及一种新型蛋白质MORT-1(HF1)，它可结合于FAS-R受体(TNF/NGF超家族的一个成员)的胞内区域，并因而被认为是FAS-R的介导物或调节物，在例如由FAS配体与FAS-R的结合起始的信导过程中有一定作用。本发明的MORT-1氨基酸序列和DNA序列为新的序列；在DNA或氨基酸序列的″GENEBAND″或″PROTEIN BANK″数据库中没有这些序列。

因而，本发明涉及编码MORT-1蛋白质的DNA序列和由该DNA序列编码的MORT-1蛋白质。

而且，本发明也涉及编码生物活性的MORT-1蛋白质的类似物、片段和衍生物的DNA序列和由此编码的类似物、片段和衍生物。这种类似物、片段和衍生物的制备是通过标准方法进行的(参见如Sambrook et al.，1989)，其中在编码MORT-1蛋白质的DNA序列中，一个或多个密码子可以被缺失、加入或由另外一个替换，以产生与天然蛋白质相比具有至少一个氨基酸残基的变化。可以采取的类似物是那些至少保留结合于FAS-R胞内区域的能力的，或能够介导任何其结合或酶活性的，如可与FAS-IC结合但不进行信导，即不结合于更下游的受体、蛋白质或其它因子，或不催化信号依赖性反应的类似物。这样，可产生具有所谓的主要为负效应的类似物，即在结合于FAS-IC，或这种结合后的随后的信导中为缺陷型的类似物。这样的类似物可用于例如通过与天然FAS-IC结合蛋白质竞争从而抑制FAS-配体-效应。同样，可以产生所谓的主要为正效应的类似物，它可用作增强FAS配体效应。它们可具有与天然FAS-IC结合蛋白质相同或更好的FAS-IC-结合性能以及相同或更好的信导性能。同样，MORT-1的生物活性片段可以与上述MORT-1类似物相同的方法制备。MORT-1合适的片段是那些保留FAS-IC结合能力或可介导上述其它结合或酶活性的片段。因而可以制备出如上述类似物的主要为负或主要为正效应的MORT-1片段。应当指出，这些片段代表了本发明类似物的一个特殊家族，即，它们被定义为来源于全长MORT-1序列的MORT-1的部分，每一部分或片段均具有任一种上述所需的活性。同样，可通过标准方法将MORT-1蛋白质、其类似物或片段的一个或多个氨基酸的侧链基团进行修饰而制备出衍生物，或通过将MORT-1蛋白质、其类似物或片段与其它分子如抗体、酶、受体等进行连接而制备衍生物。这些是公知的现有技术。

该新型蛋白质、其类似物、片段和衍生物具有一些可能的用途，例如：

(i)在需要增加FAS-R配体效应的情况下、如在抗-肿瘤、抗-炎症或抗-HIV应用时，这时FAS-R配体诱发的细胞毒性是必需的，它们可用于模仿或增强FAS-R配体的功能。这种情况下，增强FAS-R配体效应(即细胞毒效应)的MORT-1蛋白质、其类似物、片段或衍生物可通过现有技术的标准方法导入细胞。例如，由于MORT-1蛋白质是胞内的，并必须导入FAS-R配体效应是必需的细胞中，必须有一种将该蛋白质导入细胞中的系统。一种方式是通过创建一种重组动物病毒即来源于牛痘病毒的动物病毒，其DNA中引入了下面两个基团：编码与细胞表达的细胞表面蛋白质特异性结合的配体的基因，例如特异地与一些细胞(CD4淋巴细胞与白血病相关细胞)结合的AIDS(HIV)病毒gpl20蛋白质，或者特异地与携带FAS-R的细胞结合的任何其它一种配体，使得该重组动物病毒载体可与这种FAS-R-携带细胞相结合；以及编码MORT-1蛋白质的基因。因而，该细胞表面结合蛋白在病毒表面的表达将使该病毒特异性地靶击肿瘤细胞或其它FAS-R-携带细胞，随后，编码MORT-1蛋白质的序列将通过该病毒导入细胞，并且一旦在细胞中表达，将导致FAS-R配体效应的增强，导致需要杀死的肿瘤细胞或其它FAS-R携带细胞的死亡。这种重组动物病毒的构建是通过标准方法进行的(参见例如Sambrook et al.，1989)。另外一种可能性是将MORT-1蛋白质序列以寡核苷酸的形式导入，它可被细胞吸收并在其中表达。再一种可能性是用Lin et al.，描述于JournalofBiological Chemistry，Vol.270，No.24，pp.14255-14258，1995的方法的修改方法。

(ii)它们可用于抑制FAS-R配体效应，例如，在败血性休克的组织损伤、移植物对宿主的反应、或急性肝炎的情况下，其中需阻断FAS-R配体诱导的FAS-R胞内信导。在这种情况下，例如将具有MORT-1蛋白质反义编码序列的寡核苷酸通过标准方法导入细胞是可能的，这样可有效地阻断编码MORT-1蛋白质mRNA的转译，并因而阻断其表达并导致FAS-R配体效应的抑制。这种寡核苷酸可用上述重组动物病毒方法导入细胞，由病毒携带的第二个序列就是这种寡核苷酸序列。

另一种可能是使用对MORT-1蛋白质具特异性的抗体，来抑制其胞内信导活性。

抑制FAS-R配体效应的再一种方法是用最近开发的核酶方法进行的。核酶是特异地切割RNA的催化性RNA分子。核酶可被设计成切割所选择的靶RNA，例如，编码本发明的MORT-1蛋白质的mRNA。这种核酶具有特异于MORT-1 mRNA的序列，可与其相互作用(互补结合)，随后对该mRNA进行切割导致MORT-1蛋白质表达的降低(或完全丧失)。表达降低的水平依赖于靶细胞中核酶表达的水平。为了将核酶导入所选择细胞(如携带FAS-R的细胞)，可使用任一种合适的载体，如质粒、动物病毒(反转录病毒)载体。这些经常用于这一目的(参见上述(i)，其中该病毒具有作为第二个序列的编码所选择核酶序列的cDNA)。(有关核酶的叙述、方法等请参阅(Chen etal.，1992；Zhao and pick，1993；Shore et al.，1993；Joseph和Burke，1993；Shimayama et al.，1993；Cantor et al.，1993；Barinaga，1993；Crisell et al.，1993和Koizumi et al.，1993)。

(iii)它们可用于分离、鉴定和克隆可与它们相结合的其它蛋白质，例如，参与TNF-R或FAS-R胞内区域下游的胞内信导过程的其它蛋白质。例如，MORT-1蛋白质，即编码它的DNA序列可用于酵母两杂种系统(yeasttwo-hybrid system)  (见下文实施例1)，其中MORT-1蛋白质的序列可用作“诱饵”从cDNA或基因组DNA文库中分离、克隆和鉴定其它序列(“猎物”)，这些序列所编码的蛋白质可与MORT-1蛋白质结合。以同样方式也可测定本发明的MORT-1蛋白质是否可结合至其它细胞蛋白质上，例如受体的TNF/NGF超家族中的其它受体。

(iv)MORT-1蛋白质、其类似物、片段或衍生物也可用于分离、鉴定和克隆同一家族中的其它蛋白质，即可结合至FAS-R胞内区域或功能相关受体并参与胞内信导过程的那些蛋白质。在这一应用中，可使用上述酵母两杂种系统，或者使用最近开发出的使用非严谨Southern杂交和随后进行PCR克隆的系统(Wilkes et al.，1989)。Wilkes et al.的文章描述了使用非严谨Southern杂交和随后的PCR克隆，基于已知的激酸基序序列(一种想象的激酶序列)而进行的两种推测的蛋白质一酪氨酸激酶的鉴定和克隆。该方法可被用于根据本发明的使用MORT-1蛋白质序列鉴定和克隆FAS-R与胞内区域结合蛋白质相关的蛋白质。

(v)使用本发明MORT-1蛋白质、其类似物、片段或衍生物的另一种方法是将它们用于可与它们结合的其它蛋白质或因子的分离和鉴定的亲和层析方法中，例如与FAS-R相关的其它受体或参与胞内信导过程的其它蛋白质或因子。在这一应用中，将本发明MORT-1蛋白质、其类似物、片段或衍生物分别吸附于亲和层析基质上，然后将其与细胞提取物或分离的怀疑参与了胞内信导过程的蛋白质或因子相接触。在亲和层析程序之后，结合于MORT-1蛋白质、其类似物、片段或衍生物上的其它蛋白质或因子即可被洗脱、分离和鉴定出来。

(vi)如上所述，本发明的MORT-1蛋白质、其类似物、片段或衍生物也可用作免疫原(抗原)以产生它们的特异性抗体。这些抗体也可用于从产生MORT-1、其类似物或片段的细胞提取物或细胞系中纯化MORT-1蛋白质。而且，这些抗体可以用于诊断目的，鉴定与FAS-R配体系统功能异常相关的疾病，如FAS-R配体诱导的细胞效应的过高或过低。这样，如果一种疾病与MORT-1蛋白质参与的多功能信导系统功能异常相关，则这种抗体即可用作重要的诊断工具。

(vii)MORT-1可借助于其与其它胞内蛋白(所谓的MORT-1结合蛋白、见下文)相结合的能力被用作其它一些蛋白质的间接调节物，这些其它胞内蛋白质直接结合其它胞内蛋白质或跨膜蛋白质的胞内区域。这种蛋白质或这种胞内区域的一个例子是公知的p55 TNF受体，其胞内信导是由一些直接结合于其胞内区域的蛋白质调节的(参见共同在审专利IL 109632)。事实上我们已分离了这种MORT-1结合蛋白质(见下文和实施例2)，它结合于p55 TNF受体的胞内区域。

为了调节这些其他胞内蛋白质或跨膜蛋白质的胞内区域，可将MORT-1以上文(ii)中所述的几种方式导入细胞。

应当注意的是，本发明的MORT-1蛋白质的分离、鉴定和定性可用任一种公知的标准筛选方法进行。例如，这些筛选方法之一，酵母两杂种方法(yeast two-hybrid procedure)在本文中作了描述(实施例1)，并被用于鉴定本发明的MORT-1蛋白质。同样如上文和下文所述，也可使用现有技术公知的其它方法，如亲和层析、DNA杂交方法等来分离、鉴定和定性本发明的MORT-1蛋白质，或分离、鉴定和定性其它的可与本发明的MORT-1蛋白质相结合的蛋白质、因子、受体等。

再者，应注意，与FAS-IC结合的能力是MORT-1的特性之一，其自联结的能力也是其特性之一。MORT-1也可单独激活细胞毒性，这是一个与其自联结能力相关的活性。可以看出(见实施例1)MORT-1与FAS-IC结合的部分明显不同于参与其自联结的部分。MORT-1也可能具有其它一些活性，这些活性可能是上述MORT-1分子的特定部分或该分子的其它部分或任一种这些部分的组合的功能。这些其它活性可以是酶活性或与其它蛋白质的结合有关(如MORT-1结合蛋白质或其它受体、因子等)。因而，MORT-1可被用于上述调节FAS-R配体效应或其自身的MORT-1-介导的细胞效应的方法，或它可用于调节与其它受体、因子等相关的其它细胞信导过程。

尤其是，本发明这一方面的编码MORT-1的DNA分子本身和其突变体(即编码MORT-1的类似物或活性分子)可用于基因治疗(即通过上述(i)和(ii)用途所述方式)来调节FAS-R的活性(或调节或介导细胞上的FAS配体-效应)。而且，由于MORT-1对细胞具有细胞毒效应，这些编码MORT-1或突变型MORT-1的DNA分子也可用作调节细胞中MORT-1效应的基因治疗(也是通过上述(i)和(ii)用途中的方式)。在这些基因治疗用途中，MORT-1、类似物或衍生物可以三种方式使用：

(a)具有FAS-IC和MORT-1结合能力的完整MORT-1蛋白质、其类似物、衍生物或活性片段(即含有MORT-1的两个区段，其中之一参与FAS-IC的结合，另一个参与MORT-1的自联结)可被用于调节与FAS-R和MORT-1相关的效应；

(b)MORT-1同FAS-IC结合的部分和这一部分的类似物、衍生物和活性片段可用作诱导对FAS-IC的“主要为负”的效应，即抑制FAS-R介导的细胞效应，或可用于诱导对FAS-IC的“功能增强”效应，即增强FAS-R介导的细胞效应；和

(c)特异性结合MORT-1的MORT-1部分和这一部分的类似物、衍生物和活性片段可用于诱导对MORT-1的“主要为负”或“功能增强”效应，即抑制或增强与MORT-1相关的细胞效应。

如上述用途(vi)所述，MORT-1蛋白质可被用于产生特异于MORT-1的抗体。这些抗体或其片段可被用于下文详细所述的方法中。应理解在这些应用中，抗体或其片段是那些特异于MORT-1的那些抗体或片段。

对于本文所述的抗体来说，术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、抗-特异型(抗-Id)抗体和以溶解形式或结合形式标记的抗体，以及用现有技术例如但不限于酶切、肽合成或重组技术得到的它们的片段。

多克隆抗体是一群异源性抗体分子，来自于用一种抗原免疫的动物的血清。单克隆抗体含有一群特异于抗原的基本上同源的抗体，该抗体群含有基本上相似的抗原决定簇结合位点。单克隆抗体可由普通技术人员公知的方法获得。参见，例如Kohler和Milstein，Nature 256：495-497(1975)；U.S.Patent No.4376110；Ausubel et al.，eds.，Harlow and LaneANTIBODIES：ALABORATORY MANUAL，Cold Spring HarborLaboratory(1988)；and Colligan et al.，eds.，Current Protocols inImmunology，Greene publishin9 Assoc.and Wiley Interscience N.Y.，(1992，1993)，这些文献的内容全部引入作为参考。这种抗体可以是任何免疫球蛋白族，包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD和其任何亚族。产生本发明单克隆抗体的杂交瘤可以培养在体外、原位或体内。在体内或原位高滴度的单克隆抗体的产生方法是目前最优选的方法。

嵌合抗体是不同的部分来自不同种动物的分子。例如，具有鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白的恒定区的抗体。嵌合抗体主要用于降低使用中的免疫原性并提高产量。例如，当鼠单克隆抗体在杂交瘤中有较高的产率而在人类中有较高的免疫原性时，即可使用人/鼠嵌合单克隆抗体。嵌合抗体及其生产方法为现有技术已知的(Cabilly et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3273-3277(1984)；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984)；Boulianne et al.，Nature 312：643-646(1984)；Cabilly et al.，European Patent Application 125023(1984年11月14日公开)；Neuberger et al.，Nature 314：268-270(1985)；Taiguchi et al.，European Patent Application 171496(1985年2月19日公开)；Morrison et al.，European Patent Application 173494(1986年5月5日公开)；New-berger et al；PCT Application WO 8601533，(1986年3月13日公开)；Kudo et al.，European Patent Application184187(1986年6月11日公开)；Sahagan et al.，J.Immunol.137：1066-1074(1986)；Robinson et al.，International PatentApplication No.WO870267(1987年5月7日公开)；Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443(1987)；Sun et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218(1987)；Better et al.，Science 240：1041-1043(1988)；以及Harlow和Lane，ANTIBODIES：ALABORATORY MANUAL，上述文献。这些参考文献均引入本文作为参考。

抗特异型(抗-Id)抗体是一种识别通常与抗体的抗原结合位点相关的独特决定基的抗体。抗特异型抗体可通过用需要制备抗特异型抗体的单克隆抗体免疫与该单克隆抗体来源相同的物种和基因型(如小鼠的品系)的动物来制备。该被免疫的动物通过产生针对这些特异型决定基的抗体(抗-Id抗体)来识别和应答该免疫抗体的特异型决定基。参见例如，U.S.Patent No.4699880，其全文引入本文作为参考。

该抗-Id抗体也可用作免疫原在另一种动物中诱导免疫应答，产生所谓的抗-抗-Id抗体。该抗-抗-Id可与诱发抗-Id的原单克隆抗体具有相同的抗原决定簇。因而，通过使用针对单克隆的特异型决定基的抗体，使得可能鉴定其它表达相同特异性抗体的克隆。

因而，所产生的针对本发明MORT-1蛋白质，其类似物、片段或衍生物的单克隆抗体可被用于在合适动物中诱导抗-Id抗体，例如BALB/C小鼠。来自这种被免疫小鼠的脾细胞被用于产生分泌抗-Id单克隆抗体的抗-Id杂交瘤。而且，该抗-Id单克隆抗体可被偶联于一种载体上，如匙孔血兰蛋白(KLH)上，并被用于免疫另外的BALB/C小鼠。这些小鼠的血清中将含有抗-抗-Id抗体，它具有对上述MORT-1蛋白质、类似物、片段或衍生物的抗原决定基具特异性的原单克隆抗体的结合性能。

该抗-Id单克隆抗体因而具有其自身的特异型抗原决定簇，或“特异型抗原决定基(idiotopes)”，与被阐述的抗原决定基结构相似，如GRB蛋白质-α。

术语“抗体”既包括完整分子，也包括其片段，如Fab和F(ab’)₂，它可与抗原结合。Fab和F(ab’)₂片段缺乏完整抗体的Fc片段，可更快地从循环系统中清除，并具有比完整抗体分子较小的非特异性组织结合能力(Wahl et al.，J.Nucl.Med.24：316-325(1983))。

将会看到，本发明所用的Fab和F(ab’)₂和其它抗体片段可根据本文公开的完整抗体的方法用于检测和定量测定MORT-1蛋白质。这种片段典型地是用蛋白质裂解方法产生，所用酶例如番木瓜酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)₂片段)。

所说的抗体“可以结合”一种分子是指它可特异性地与该分子反应从而使该分子结合于抗体上。术语“抗原决定簇”是指可被抗体结合并也可被抗体识别的分子的任一部分。抗原决定簇或“抗原决定基”通常是由化学活性的分子表面基团组成，如氨基酸或糖侧链，并具有特定的三维结构特点以及特定的电荷特性。

“抗原”是一种可被抗体结合的分子或分子的一部分，它也可诱发动物产生可与这一抗原的抗原决定簇结合的抗体。一个抗原可具有一个或多个抗原决定簇。上文所述特异性反应是指抗原以高度选择性的方式与其相应抗体反应，而不与可能由其它抗原诱发的很多其它抗体反应。

本发明所用的抗体，包括抗体的片段可用于定量或定性检测样品中的MORT-1或检测表达本发明MORT-1的细胞的存在。这可用使用荧光标记的抗体荧光检测的免疫荧光技术(见下文)以及光显微镜术、流动细胞计数术来进行。

本发明所用的抗体(或者片段)可用于组织学研究，如使用免疫荧光或免疫电子显微镜检术进行原位检测。原位检测可通过从病人体内取出组织切面样品，在该样品上施用所标记的抗体来进行。抗体(或片段)最好以直接应用于生物样品上或以标记抗体的形式提供。通过使用这一方法，不仅可以确定MORT-1的存在，也可确定它在被检测组织上的分布。在使用本发明的方法时，本领域普通技术人员可很容易想到可将许多组织学方法(如染色方法)加以修改以进行这种原位检测。

本发明的对MORT-1的这种检测一般包括在可识别MORT-1蛋白质的可检测标记抗体的存在下温育生物样品，如生物液、组织提取物、新鲜收获的细胞如淋巴细胞或白细胞，或已在组织培养中温育过的细胞，并用现有技术已知的任一种方法检测该抗体。

该生物样品可用固相支持物或载体例如硝酸纤维素，或可固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白质的其它固相支持物或载体处理。该支持物或载体可随后用适当的缓冲液洗涤，然后用上述的可检测标记抗体处理。然后，该固相支持物或载体可用缓冲液再洗涤一次，以除去没有结合的抗体。然后，在所说固相支持物或载体上结合的标记的量可用常规方法进行检测。“固相支持物”、“固相载体”、“固体支持物”、“固体载体”、“支持物”或“载体”意指任何可结合抗原或抗体的支持物。公知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙淀粉酶、天然和改性纤维素，聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。为达到本发明目的，该载体的性质可以是在某种程度可溶的或不溶的。只要被偶联的分子可与抗原或抗体相结合，该支持物实际上可具有任一种构形。因而，该支持物或载体的构形可以是球形(如珠)，圆柱形(如试管内表面，或棒状物的外表面)。或者，该表面可以是平面如纸、试条等。优选的支持物或载体包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员知道许多其它合适的用于结合抗体或抗原的载体，或者可以通过常规实验确定这些载体。

给定批号的本发明上述的抗体的结合活性可根据公知的方法来测定。本领域技术人员通过常规实验能够确定该测定方法的最适操作条件。

诸如洗涤、搅拌、震荡、过滤等步骤在常规或特定情况下需要时可加入到测试方法中。

对本发明的抗体进行可检测性标记的方式之一是将其与一种酶相连，并将其用于酶联免疫检测(enzyme immunoassay(EIA))。反过来，当该酶暴露于适当底物时将与该底物发生反应，产生一种化学物质，它可通过例如分光光度计、荧光光度计或通过肉眼观察检测。可用于可检测性标记抗体的酶包括，但不限于，苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、delta-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、alpha-磷酸甘油脱氢酶、丙糖磷酸脱氢酸、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。

该检测可用比色法来进行，其中使用一种酶的产色底物。检测也可用底物的酶反应程度与以相似方式制备的标准反应的比较来进行。

检测可用一些其它免疫检测方法来进行。例如，通过放射性标记抗体或抗体片段，使得通过使用放射免疫测定(RIA)检测R-PTP酶成为可能。Work，T.S.et al.，的Laboratory Techniques and Biochemistry inMolecular Biology，North Holland Publishing Company，NY(1978)一书对RIA有详细描述，请特别参阅Chard，T.的“An Introduction toRadioimmune Assay and Related Techniques”一章，其内容引入本文作为参考。放射性同位素可用γ计数器或液闪计数器或通过放射自显影技术来检测。

也可用一种荧光化合物标记本发明的抗体。当该荧光标记的抗体暴露于适当波长的光线下时，可通过荧光检测其存在。最常用的荧光标记化合物有异硫氰酸荧光素，若丹明、藻红素、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、o-苯二醛和荧光胺。

该抗体也可用发荧光金属如¹⁵²E或镧系中的其它元素进行可检测标记。可使用例如二亚乙基三胺五乙酸(ETPA)的金属螯合基将这些金属与抗体相连。

抗体也可与一种化学发光化合物偶联而进行可检测性标记。然后，该化学发光标记的抗体的存在可通过化学反应过程中所产生的发光的检测而进行测定。特别有用的化学发光标记化合物的例子有鲁米诺、异鲁米诺。theromatic、吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。

同样，生物发光化合物也可用于标记本发明的抗体。生物发光物质是一类在生物系统中发现的化学发光物质，其中一种催化性蛋白质提高化学发光反应的效率。生物发光蛋白质的存在是通过测定发光物质的存在而测定的。用于标记的重要的生物发光化合物有荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。

可将本发明的抗体分子加以改造使其适用于免疫检测，也称为“双点(two site)”或者“夹心饼(sandwich)”检测。在一典型的免疫检测中，将一定量的非标记抗体(或抗体的片段)结合于固体支持物或载体上，并将一定量的可检测标记的可溶性抗体加入，使得可以检测和/或定量测定该固相抗体、抗原和标记抗体之间形成的三元复合物。

典型的和优选的免疫检测包括“向前(forward)”检测，其中，首先将结合于固相物的抗体与被测样品接触，通过形成二元的固相抗体-抗原复合物将抗原从样品中提取出来。适当温育后，将该固相支持物或载体清洗，以除去残余的液体样品，包括可能存在的没有反应的抗原，然后与含有未知量的标记抗体(作为“报道分子”)的溶液接触。第二次温育之后，使标记抗体通过非标记抗体与结合于固体支持物上的抗原进行复合，将该固体支持物或载体进行第二次洗涤，以除去没有反应的标记抗体。

在另一种“夹心饼”(sandwich)检测(也可使用本发明的抗原)中，使用了所谓的“同时”和“反相(reverse)”检测。“同时”检测包括一个单一的温育步骤，结合于固相支持物或载体上的抗体和标记抗体被同时加入被测样品中。温育完成后将固体支持物或载体清洗以除去残余的液体样品和没有复合的标记抗体。然后，对与固体支持物或载体相连的标记抗体的存在以与常规的“向前”夹心饼检测相同的方式进行检测。

在“反相(reverse)”检测中，首先向液体样品中逐步加入标记抗体的溶液，随后在适当温育之后加入结合于固体支持物或载体上的非标记抗体。第二次温育后，将该固相物以常规方式清洗，以除去残存的被测样品以及没有反应的标记抗体的溶液。然后，对与固体支持物或载体相连的标记抗体以“同时”和“反相”方法中的方式进行测定。

本发明的MORT-1可以任一种标准的重组DNA技术进行生产(参见例如，Sambrook，et al.，1989)，其中，将适当的真核或原核宿主细胞用含有编码该蛋白质序列的合适的真核或原核载体进行转化。因而，本发明也涉及生产本发明蛋白质的这种表达载体和转化的宿主细胞。如上所述，这些蛋白质也包括它们的生物活性类似物、片段和衍生物，因而编码它们的载体也包括编码这些蛋白质的类似物和片段的载体，并且被转化的宿主包括产生这种类似物和片段的那些宿主。这些蛋白质的衍生物是通过标准方法将被转化细胞产生的蛋白质或其类似物或片段进行修饰而产生的衍生物。

本发明也涉及含有编码MORT-1蛋白质的重组动物病毒载体的药物组合物，该载体也编码可结合至特定靶细胞(如癌细胞)表面蛋白质以引导MORT-1序列插入该细胞的病毒表面蛋白质。本发明的其它方面将在下述实施例中加以阐明。

本发明将在下述非限定性实施例及附图中加以详细描述。实施例1：结合至FAS-R胞内区域的MORT-1蛋白质的克隆和分离。(i)两杂种筛选和两杂种β-半乳糖苷酶表达试验

为分离与FAS-R胞内区域相互作用的蛋白质，使用了酵母两杂种系统(Fields和Song，1989；也参见共同在审专利IL 109632，112002和112692)。简言之，该两杂种系统是一种基于酵母的遗传检测方法，用于检测体内特异性蛋白质-蛋白质相互作用，它是通过复原真核转录激活子例如GAL4来进行的，该转录激活子具有两个分开的区域，一个DNA结合区域和一个激活区域，当这些区域被表达并结合在一起形成了复原的GAL4的蛋白质后，可结合至一个上游激活序列上，该上游激活序列反过来激活一种启动子，该启动子控制报道基因例如Lac Z或HIS3的表达，其表达很容易在培养的细胞中观察到。在这一系统中，候选相互作用蛋白质的基因被克隆至分开的表达载体上。在一个表达载体中，一个候选蛋白质的序列被与GAL4 DNA结合区域的序列同相克隆，以产生与GAL4 DNA结合区域杂合的杂种蛋白质，而在另一个载体中，第二个候选蛋白质的序列被与GAL4激活区域的序列同相克隆，以产生与GAL4激活区域杂合的杂种蛋白质。然后将该两种杂种载体共同转化至酵母宿主品系中，该品系具有在上游GAL4结合位点控制下的lac Z或HIS3报道基因。只有那些其中两种杂种蛋白质被表达并可相互作用的转化宿主细胞(共同转化子)可表达该报道基因。对于lac Z报道基因来说，表达该基因的宿主细胞当在培养基中加如X-gal时变成蓝色。因而，蓝色菌落表示两种克隆的候选蛋白质可相互作用。

使用该两杂种系统，将胞内区域FAS-IC分别克隆进载体pGBT9(携带GAL4 DNA结合序列，由CLONTECH，USA提供，见下文)，以产生与GAL4 DNA结合区域的融合蛋白质。对于将FAS-R克隆进pGBT9来说，使用了一个编码全长FAS-R cDNA序列的克隆(参阅共同在审专利IL 111125)，通过标准方法使用各种限制性酶从其中切除胞内区域(IC)，然后用标准方法分离并插入打开的pGBT9载体中。插入位点是在多克隆位点区段(MCS)，使用的是相应的限制性酶。应注意，在完整FAS-R中FAS-IC从残基175延伸至319，含有残基175-319的这一部分为插入pGBT9载体的FAS-IC(也见IL111125)。

然后，将上述杂种(嵌合)载体与来自人HeLa细胞的克隆pGAD GH载体的cDNA文库(带有GAL4激活区域)一起共转染进HF7c酵母宿主品系(所有上述载体、pGBT9和带有HeLa细胞cDNA文库的pGAD GH，以及酵母菌株均作为MATCHMAKER Two-Hybrid System，#PT1265-1的一部分得自Clontech Laboratories，Inc.，USA)。将该共转染的酵母在缺乏组氨酸培养基上进行生长能力的选择，可生长的菌落为阳性转化子。然后对选择出的酵母克隆进行lac Z基因表达能力的检测，即对于LACZ活性来说，在培养基中加入x-gal，它可被lacZ基因编码的酶β-半乳糖苷酶分解代谢形成蓝色产物。因而，蓝色菌落表明lacZ基因具有活性。对lacZ基因的活性来说，GAL4转录激活子必须以活性形式存在于转化克隆中，即由上述杂种质粒编码的GAL4 DNA结合区域以适当方式与由其它杂种载体编码的GAL4激活区域相组合。只有当与每一GAL4区域相融合的两种蛋白质可稳定地相互作用(结合)时，这样的组合才可能存在。因而，分离出的His⁺和蓝色(LAC Z⁺)菌落为用编码FAS-IC的载体和编码可稳定结合至FAS-IC的来源于人HeLa细胞蛋白质产物的载体共转变染的菌落。

将上述His⁺，LAC Z⁺酵母菌落中的质粒DNA用标准方法分离，并电打孔至大肠杆菌菌株HB101，随后筛选Leu⁺和氨苄青霉素抗性转化子，这些转化子带有杂种pGAD GH载体，该载体具有AmpR和leu²编码序列。因而这种转化子是带有编码最近鉴定的可与FAS-IC结合的蛋白质的序列的克隆。然后从这些转化的大肠杆菌中分离质粒DNA，并用下列方法重新检测：

(a)用原来的FAS-R胞内区域杂种质粒(杂种pGTB9，带有FAS-IC)将它们重新转化进如上文所述酵母菌株HF7。作为对照，将携带不相关蛋白质编码序列，如pACT-lamin或单独的pGBT9的载体用于与FAS-IC结合蛋白质(即MORT-1)编码质粒一起共转化。然后在单独的His^-培养基上或具有不同水平的3-氨基三唑的培养基上检测该共转化的酵母的生长；和

(b)将质粒DNA和(a)中所述的原来的FAS-IC杂种质粒和对照质粒重新转化进酵母宿主细胞，菌株SFY526，并确定LAC Z⁺的活性(β-gal形成，即蓝色形成的效率)。

上述试验的结果显示，在His^-培养基上菌落生长的类型与LAC Z活性的类型相同，这是通过对菌落的颜色的评估得出的结论，也就是说His⁺的菌落也为LAC Z⁺。而且，对液体培养(最优培养条件)中的LAC Z活性在GAL4 DNA结合和激活-区域杂种转染进SFY526酵母宿主细胞后进行评估，该酵母宿主与HF-7酵母宿主相比具有较好的被GAL4转录激活子诱导的LAC Z诱导性。

使用上述方法，一种被称为HF1的蛋白质，现也称为MORT-1，一种“受体诱导的毒性的介导物”现已被识别、分离和进行了鉴定。

而且，也应指出，在一些上述两杂种β-半乳糖苷酶表达试验中，β-半乳糖苷酶的表达也用优选的过滤试验评估。在筛选中，发现约3×10⁶个cDNA中有5个含有MORT-1插入。然后用标准的DNA测序方法对如此分离的克隆MORT-1 cDNA插入物进行测序。从DNA序列推导出MORT-1的氨基酸序列。由该cDNA插入物编码的该蛋白质的残基编号与Swiss-Prot数据库中的相同。用PCR产生缺失突变，用寡核苷酸定点诱变产生点突变(Current Protocols in Molec.Biol.，1994)。

(ii)蛋白质的诱导表达、代谢标记和免疫沉淀

将MORT-1、N-连接至FLAG的八肽(FLAG-HF1；Eastman Kodak，New Haven，Ct.，USA)、FAS-IC、FAS-R、p55-R、一种由融合于FAS-R跨膜和胞内区域(氨基酸153-319)的p55-R胞外区域(氨基酸1-168)组成的嵌合体、和作为对照的荧光素酶cDNA在Hela细胞中表达。表达是用一种四环素-控制的表达载体，在表达四环素控制的转激活子(transactivator)的HeLa细胞克隆(HtTA-1)中进行的(Gossen和Bujard，1992；描述于PCT/US95/05854的方法；也见Boldin et al.，1995)。用[³⁵S]甲硫氨酸和[³⁵S]半胱氨酸(DUPONT，Wilmington，De.，USA和Amersham，Buckinghamshire，England)的代谢标记是在转染后18小时进行的，再在37℃，在Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基中温育4小时。培养基中缺乏甲硫氨酸和半胱氨酸，但补充了2％透析的胎牛血清。然后将细胞在RIPA缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，150mM Nacl，1％NP-40，1％脱氧胆酸盐，0.1％SDS和1mM EDTA)中裂解，并将裂解液通过用不相关的兔抗血清(3μl/ml)和蛋白质G琼脂糖珠(Pharmacia，Uppsala，Sweden；60μl/ml)温育而进行预清洁。免疫沉淀是通过将0.3ml等份的裂解液与针对FLAG八肽(MZ；EastmanKodak)、p55-R(#8和#10；(Engelmann et al.，1990))，或FAS-R(ZB 4；Kamiya Southand Oaks，Ca.，USA)的鼠单克隆抗体(5μl/等份)，或与作为对照的同型匹配的(isotype matched)鼠抗体在4℃温育1小时而进行的，然后与蛋白质G琼脂糖珠(30μl/等份)再温育1小时。

(iii)体外结合

制备与野生型或突变型FAS-IC融合的谷胱苷肽S-转移酶(GST)融合体，并吸附于谷胱苷肽-琼脂糖珠上(如IL109632，111125，112002，112692所述；也见Boldin et al.，1995；Current Protocols in molecularbiology，1994；Frangioni和Neel，1993)。代谢标记的FLAG-HF1融合蛋白质与GST-FAS-IC的结合是通过将该珠与用[³⁵S]甲硫氨酸(60μCi/ml)代谢标记的表达FLAG-HF1的HeLa细胞提取物在4℃温育2小时来评估的。该提取物是在如下的缓冲液中制备的，这种缓冲液中含有50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，0.1％NP-40，1mM二硫苏糖醇，1mM EDTA，1mM苯甲基磺酰氯，20μg/ml Aprotonin，20μg/ml Leupeptin，10mM氯化钠和0.1mM钒酸钠(每5×10⁵细胞/ml)。

(iv)由HF1的被诱导表达引发的细胞毒性的评估

将HF1，FAS-IC，p55-IC和荧光素酶cDNA插入四环素控制的表达载体中，并与置于SV40启动子控制之下的分泌胎盘碱性磷酸酶cDNA(pSBC-2载休(Dirks et al.，1993))一起转染HtTA-1细胞(一种HeLa细胞系)(Gossen和Bujard，1992)。转染40小时后评估细胞死亡，或者是通过中性红摄取测试(Wallach，1984)进行，或者对于特异性评估表达该转染的cDNA的细胞死亡来说，通过确定在温育的最后5小时分泌至生长培养基中的胎盘碱性磷酸酶(Berger et al.，1988)的量来进行。

在分析参与结合FAS-IC的MORT-1(HF1)蛋白质区域的另一组实验中，将下列蛋白质在含有四环素控制的转激活子(transactivatorHtTA-1)的HeLa细胞中进行瞬间表达，使用的是：四环素控制的表达载体(pUHD 10-3)：单独的人FAS-R；人FAS-R认及MORT-1的N-末端部分(氨基酸1-117，“MORT-1头”)；人FAS-R以及MORT-1的C末端部分，它含有其“死亡区域”同源区段(氨基酸130-245，即“MORT-1DD”，也见IL112742；；FLAG-55.11(在N-末端融合于FLAG八肽的蛋白质55.11的氨基酸309-900，蛋白质55.11为一种p55-IC特异性结合蛋白质，也见IL109632)。转染12小时后，将细胞用胰蛋白酶处理并以30000细胞/孔的浓度重新接种。进一步培养24小时后，用针对FAS-R胞外区域的单克隆抗体(单克隆抗体CH-11，Oncor)以各种浓度(0.001-10μg/ml单克隆抗体)，在10g/ml放线菌酮的存在下将细胞处理6小时。然后用中性红摄取试验确定细胞存活率，结果用存活细胞与单独的放线菌酮(不存在抗-FAS-R单克隆抗体CH-11)温育的细胞百分数来表示。

(v)Northern和序列分析

从HeLa细胞的总RNA中分离聚A⁺RNA(Oligotex-dT mRNA试剂盒。QIAGEN，Hilden，Germany)。用HF-1 cDNA作为探针通过常规方法进行Northern分析(如PCT/US95/05854的描述；也见Boldin et al.，1995)。通过双脱氧链终止方法双向测定MORT-1(HF1)的核苷酸序列。

上述实验所得结果(示于表1和图1-7)如下：通过两杂种方法克隆的MORT-1 cDNA的序列分析表明，它编码一种新的蛋白质(见下文)。应用两杂种试验进一步评估该蛋白质(MORT-1)(代表“受体诱导的毒性的介异物”)与FAS-IC的结合特异性，以及确定Fas-IC中与之结合的特定片段，得到如下结果(表1)：(a)该蛋白质可结合人和鼠Fas-IC，但不结合几种其它被测蛋白质，包括TNF/NGF受体家族的3种受体(p55和p75 TNF受体和CD40)；(b)在FAS-R的“死亡区域”的225位(Ile)的替换突变显示丢失了的体外和体内的信导能力(1pr^cg突变(Watanabe-Fukunaga et al.，1992；Itoh和Nagata，1993)，也阻止了MORT-1与FAS-IC的结合；(c)FAS-R中MORT-1结合位点位于该受体的“死亡区域”内；和(d)MORT-1结合于自身。该自身结合，以及HF1与FAS-R的结合涉及该蛋白质的不同区段：MORT-1相应于残基1-117片段与全长MORT-1结合，但不能与自身结合也不能与FAS-IC结合。相反，相应于残基130-245的片段与FAS-R结合，但不与MORT-1结合(表1)。而且，从表1中的结果可以看出，FAS-R的“死亡区域”对FAS-IC的自联合是很关键的，正如在p55-IC的自联合的p55-R的“死亡区域”一样。在这些“死亡区域”两边的缺失都不影响它们的自联合能力，但在这些“死亡区域”内的缺失会影响自联合能力。对于MORT-1来说，MORT-1与FAS-IC的结合也依赖于FAS-R完整的(全长)“死亡区域”，但FAS-IC结合也不依赖于FAS-R“死亡区域”以外的区段。表1 在转化的酵母中MORT-1与FAS-IC的相互作用和MORT-1的自联合：

通过两杂种β-半乳糖苷酶表达试验进行评估

特异性试验人p55-IC                                  -                   -      -       -人p75-IC                                  -                   -      -       -人CD40-IC                                 -                   -      -       -Cyclin D                                     -                   -      -       -Lamin                                        -                   -      -       -SNF1                                         -                   -      +       -pGBT9                                        -                   -      -       -

上文表1描述了由Ga14 DNA结合区域和激活区域构建体(pGBT9和pGAD-GH)编码的蛋白质在转染的SFY526酵母中的相互作用，这是用β-半乳糖苷酶表达过滤试验进行评估的。该DNA-结合-区域构建体包括4个人FAS-IC构建体，4个鼠FAS-IC构建体，它们包括在225位具有异亮氨酸到亮氨酸或异亮氨酸到丙氨酸突变(分别为I225N和I225A)的全长构建体，和三个HF1(MORT-1)构建体，所有这些构建体均图示于表的左边.激活-区域构建体包括3个HF1构建体，该HF1部分像在DNA-结合-区域构建体一样；和一个全长人FAS-IC构建体，该FAS-IC部分与在上述DNA-结合区域构建体中的相同。人p55 TNF受体的胞内区域(p55-IC残基206-426)，人CD40胞内区域(CD40-IC，残基216-277)和人p75 TNF受体和人p75 TNF受体的胞内区域(p75-IC，残基287-461)以及Lamin，Cyclin D和“空”Gal4(pGBT9)载体以DNA-结合区域构建体的形式被当作负对照。SNF-1和SNF4以DNA-结合-区域(SNF1)和激活-区域(SNF4)构建体的形式被当作正对照。“空”Gal4载体(pGAD-GH)也以激活区域构建体的形式被当作负对照(有关p55-IC，p75-IC的详细内容请参见PCT/US95/05854)。符号“++”和“+”分别表示在30和90分钟的测试时间内产生深的颜色。“-”表示在24小时内没有产生颜色。没有给出结果符号的组合没有进行试验。

在N-末端与FLAG八肽(FLAG-HF1)融合的HF1(MORT-1)分子的表达在HeLa细胞蛋白质中产生四种不同大小的蛋白质-约27、28、32和34KD。图1(A和B)显示了HF1与FAS-IC在体外相互作用的结果。如上文图1A和B的描述中所述，图1A是用FLAG-HF1(FLAG-MORT-1)融合蛋白质或用作为对照的荧光素酶cDNA转染的HeLa细胞提取物中蛋白质免疫沉淀的对照放射自显影复制图。免疫沉淀是用抗-FLAG抗体(αFLAG)进行的。图1B是显示HF1和FAS-IC之间体外相互作用放射自显影复制图，其中，HF1是以[³⁵S]甲硫氨酸代谢标记的HF1-FLAG融合蛋白质的形式存在的，它是从转染的HeLa细胞提取物中得到的。FAS-IC是以人和鼠GST-FAS-IC融合蛋白质的形式存在的，包括在FAS-IC中的225位具有替换突变的那种。所有这些GST-FAS-IC融合蛋白质均是在大肠杆菌中产生的。将GST融合蛋白质在与含有HF1-FLAG融合蛋白质的提取物相互作用之前结合于谷胱甘肽珠上，在该相互作用之后进行SDS-PAGE。通过SDS-PAGE后的放射自显影评估在体外的反应，这种方法是通过把[³⁵S]代谢标记的HF1与GST、GST与人或鼠FAS-IC的融合物(GST-hu FAS-IC，GST-m FAS-IC)或GST与在225位含有异亮氨酸到丙氨酸的替换突变的FAS-IC的融合物的结合(HF1与FLAG八肽(FLAG-HF1)融合体的形式产生于转染HeLa细胞中)来评估该体外相互作用。从图1B看出，所有四种FLAG-HF1蛋白质在与GST-FAS-IC融合蛋白质温育之后显示出与FAS-IC相结合的能力。如酵母两杂种试验(表1)所示，HF1不与在lpr^cg突变位点(I225A)具有替换的GST-FAS-IC结合。

由FLAG-HF1 cDNA编码的蛋白质当与这些受体在HeLa细胞中共表达时，也显示出与FAS-R的胞内区域，以及FAS-R嵌合体的胞内区域相结合的能力，FAS-R嵌合体的胞外区域被p55-R(p55-FAS)的胞外区域所取代。图2(A、B、C)显示了HF1与FAS-IC在转染HeLa细胞(即体内)中与FAS-IC相互作用的结果。如上文对图2A、B、C的描述中所述，这些图是各种转染HeLa细胞的免疫沉淀的放射自显影复制图，显示了在细胞中HF1和FAS-IC之间的体内相互作用和该相互作用的特异性，该细胞是用编码这些蛋白质的构建体共转染的细胞。因而，FLAG-HF1融合蛋白质在HeLa细胞中被表达并用[³⁵S]半胱氨酸(20μCi/ml)和[³⁵S]甲硫氨酸(40μCi/ml)进行了代谢标记，这一表达是单独进行的，或与人FAS-R、FAS-R嵌合体(其中FAS-R的胞外区域被人p55-R的相应区段取代(p55-FAS))一起进行的，或与作为负对照的人p55-R一起进行的。用所示的抗体(图2A-C)进行HF1与共表达的受体交叉免疫沉淀。如图2A-C所示，当与这些受体在HeLa细胞中共表达时，FLAG-HF1可结合于FAS-R的胞内区域，以及可结合于具有p55-R的胞外区域和FAS-R胞内区域的FAS-R-p55-R嵌合体的胞内区域(请分别参见图2A的3个中间泳道和图2C的3个左边泳道)。而且，来自转染的细胞提取物FLAG-HF1的免疫沉淀也导致共表达的FAS-R(图2A)或共表达的p55-FAS嵌合体(图2C)的沉淀。反过来，这些受体的免疫沉淀导致FLAG-HF1的共沉淀(图2A和图2C)。

使用HF1 cDNA作为探针的Northern分析显示了在HeLa细胞中的一个单一的杂交转录物。图3为一个Northern印迹的复制图，其中，来自转染细胞的聚A⁺RNA(0.3μg)与HF1 cDNA杂交。该转录物的大小(约1.8kb)与HF1 cDNA(约1702核苷酸)相近。

序列分析发现，该cDNA含有一个约250个氨基酸的开放阅读框。图4描述了HF1的初步的核苷酸和推测的氨基酸序列，其中“死亡区域”基序下面划有底线，同样在一个可能的起始甲硫氨酸残基(49位；黑体，下面划线的M)和转移终止密码子(在769-771位密码子下面的星号)也作有标记。该“死亡区域”基序与已知的p55-R和FAS-R“死亡区域”基序(p55 DD和FAS-DD)具有同源性。为测定HF1准确的C-末端并获得有关HF1准确的N-末端(起始甲硫氨酸残基)的证据，进行了如下另外的实验：

使用上述方法，构建了一些编码在N-末端与FLAG八肽融合的HF1分子(FLAG-HF1)的构建体，在HeLa细胞中表达，并用[³⁵S]-半胱氨酸和[³⁵S]-甲硫氨酸对表达的蛋白质进行免疫标记(参见上述有关图5B的内容)。HF1-FLAG分子是由下述含有编码HF1序列不同部分的cDNA编码的：

i)连接于HF1 cDNA的5’端的FLAG八肽cDNA，其中HF1 cDNA核苷酸1-145(见图4)缺失；

ii)连接于HF1全长cDNA 5’端的FLAG八肽cDNA(见上文有关图1B的FLAG-HF1构建体的内容)；

iii)连接于HF1 cDNA 5’端的FLAG八肽cDNA，其中，核苷酸1-145以及核苷酸832-1701(见图4)缺失，并且142-144位点的密码子GCC突变成TCC以阻止在该位点起始转译。

在上述HF1-FLAG融合产物表达之后，用上述方法进行免疫沉淀，使用的是抗-FLAG单克隆抗体(M2)或作为对照的抗-p75 TNF-R抗体(#9)，然后进行SDS-PAGE(10％丙烯酰胺)及放射自显影。结果示于图5，它是一个放射自显影复制图，其上是分离开的上述HF1-FLAG融合蛋白质，在胶的每一泳道上所加的样品如下：

泳道1和2：由连接于HF1 cDNA 5′端的FLAG八肽cDNA编码的HF1-FLAG融合蛋白质，其中HF1-cDNA核苷酸1-145缺失。

泳道3和4：由连接于全长HF1 cDNA 5’端的FLAG八肽cDNA编码的HF1-FLAG融合蛋白质。

泳道5和6：由连接于HF1 cDNA 5’端的FLAG八肽cDNA编码的HF1-FLAG融合蛋白质，其中，HF1 cDNA核苷酸1-145以及832-1701缺失，并且在142-144位的GCC突变成TCC以阻止在该位点起始转译。免疫沉淀对于泳道2、4和6的样品来说用的是抗-FLAG单克隆抗体，泳道1、3和5的样品用的是抗-p75 TNF-R抗体。

从图5的放射自显影可以看出，泳道2和4的产物大小证实了核苷酸769-771为HF1的转译终止位点，即该密码子为终止信号，在图4中用星号标示。而且，在泳道6中代表两种转译产物(如胶上看到的，但被强烈标记在放射自显影中变成了一个单一的宽带)的宽泳带的存在表明在泳道2和4中两种额外的产物(较高分子量的宽带)的存在反映了在FLAG-HF1融合分子的N-末端和在HF1序列内49位的甲硫氨酸残基(见图4中氨基酸序列第49位黑体下划线的M)的转译的起始。因而，上述结果证实了HF1的C-末端并提供了HF1的N-末端可能在图4序列中第49位的证据。

另外的没有在5’-端与FLAG八肽融合的HF1表达实验确实表明了Met49充当了转译起始的有效位点。

应当指出，对“Gene Bank”和“Protein Bank”的检索表明，其中没有图4所示的与HF1的序列相应的序列。因而，HF1代表了一种新的FAS-IC-特异性结合蛋白质。

p55-IC的高表达引发细胞毒效应(见IL109632，111125和Boldinetal.，1995)。FAS-IC在HeLa细胞中的表达也具有这一效应，虽然效果稍差，它只能用灵敏的测试方法进行检测才能检测到。图6A和B图示了用HF1以及人p55-IC和FAS-IC转染的细胞中配体独立引发的细胞毒效应。HF1、人FAS-IC、人p55-IC或作为对照的荧光素酶的瞬间表达对HeLa细胞存活性的影响是用四环素控制的表达载体进行评估的。细胞存活性是在这些cDNA在四环素(1μg/ml，阻止表达)的存在(图6A和B的空心柱)或不存在(图6A和B的实心柱)下，与编码分泌的胎盘碱性磷酸酶cDNA一起转染后40分钟进行评估的。细胞存活性是用中性红摄取试验(图6A)或者对于特异测定那些表达转染DNA的特定细胞的存活性来说，通过测定分泌至培养基中的胎盘碱性磷酸酶的量(图6 )来进行测定的。

因而，从图6A和B可以看出，HF1在HeLa细胞中的表达引起了显著的细胞死亡，比由FAS-IC表达引起的结果明显。所有p55-IC，FAS-IC和HF1的这些细胞毒效应好象与“死亡区域”相关，它存在于所有这些蛋白质中。该“死亡区域”倾向于自联合，并因而可能促进细胞毒效应。

鉴于HF1(MORT-1)的上述特性，即HF1与参与细胞死亡诱导的FAS-R中特定区段的特异性结合，以及该区段内即使轻微的变化即可阻止信号(lprcg突变)并丧失HF1的结合能力的事实，表明该蛋白质在信导或诱发细胞死亡中起作用。这一观点在观察到的HF1自身诱发杀细胞效应的能力上得到了进一步的支持。因而，HF1(MORT-1)的作用为(i)通过其与FAS-R结合以及自身结合的能力充当FAS-R自身联合的介导物，或(ii)充当参与FAS-R信导的另外的蛋白质的停泊位点，即HF1可以是“停泊”蛋白质并因而可与除FAS-R以外的其它受体结合，或(iii)组成与FAS-R信导相互作用的独特的信导系统的部分。

为了进一步分析参与FAS-IC结合和调节FAS-R介导的细胞效应(细胞毒性)的区段，使用编码部分MORT-1(“MORT-1头部”，氨基酸10117和“MORT-1dd”，氨基酸130-245)(分别)以及用于共转染HeLa细胞的编码人FAS-R的载体进行上述实验。在这些实验中，各种蛋白质和蛋白质组合在HeLa细胞中瞬间表达，该HeLa细胞中含有一个四环素控制的转激活子(transativator)(HtTA-1)，它是通过将编码这些蛋白质的序列插入到一个四环素-控制的表达载体pUHD 10-3而构建的。使用仅编码FAS-R的载体和编码FLAG-55.11融合蛋白质(55.11蛋白质为一种p55-IC-特异性结合蛋白质，其中含有氨其酸309-900的部分与FLAG八肽融合(在其N-末端))的载体作为对照转染。

在转染和温育后(见上文(iv))，将转染细胞用各种浓度的抗-FAS-R单克隆抗体(CH-11)处理，这种单克隆抗体特异地与细胞表达的FAS-R胞外区域结合。这种抗-FAS-R抗体的结合在细胞表面诱导了FAS-R的聚集(类似于FAS-R配体)并诱导了由FAS-IC介导的胞内信导途径，最终导致了细胞死亡(FAS-R介导的细胞毒性)。所用的抗-FAS-R单克隆抗体(CH-11)的浓度是在0.01-10μg/ml的范围内，常用的浓度为0.005；0.05；0.5和5μg/ml。用抗-FAS抗体在10μg/ml放线菌酮的存在下处理细胞。

上述分析的结果如图7所示。对于被转染细胞的四个不同的组的每一个来说，图7描述了作为用于处理细胞的抗-FAS-R单克隆抗体(CH11)浓度的函数的转染细胞的存活百分率。转染细胞的这些不同的组是用下列符号表示的：(i)空心方块表示仅用不相关(即非FAS-IC结合)的编码FLAG-55.11融合蛋白质(“55.11”，负对照)的对照载体转染的细胞；(ii)实心方块表示用编码FAS-R的载体和编码MORT-1C-末端部分(氨基酸130-245，这段氨基酸区域含有MORT-1 “死亡区域(dd)同源区段(fas+mortldd)”)的载体共转染的细胞；(iii)实心三角表示仅用编码FAS-R(“FAS”，正对照)载体转染的细胞；和(iv)空心圆圈表示用编码FAS-R的载体和编码MORT-1N-末端部分(氨基酸1-117，“MORT-1头部”(“fas+mortl he”)的载体共转染的细胞。

从图7所示结果可以看出，转染细胞中FAS-R的表达提高了其对抗-FAS-R抗体的杀细胞效应的敏感性。而且，MORT-1中含有“死亡区域”同源区段的区段和FAS-R(“fas+mortl dd”)的共表达强烈干扰了FAS-诱导(即FAS-R介导)的细胞死亡，这与从MORT-1“死亡区域(DD)”与FAS-R“死亡区域”(FAS-DD)相结合的能力(见上文表1)所预期的结果相一致。再者，MORT-1的N-末端部分和FAS-R(“fas+mortl he”)的共表达不干扰FAS-R-介导的细胞死亡，并在某种程度上提高细胞毒性(即稍微增加细胞死亡)。

因而，上述结果清楚表明，就与FAS-IC结合和介导FAS-IC的细胞毒活性而言，MORT-1蛋白质具有两个明显不同的区段。

这些结果也提供了将MORT-1蛋白质的不同部分(即活性片段或类似物)用于不同的药物用途的基础。例如，基本上仅含有MORT-1的C-末端部分包括其“死亡区域”区段的MORT-1蛋白质的类似物或片段或衍生物在含有FAS-R的细胞或组织中可用于抑制FAS-R-介导的细胞毒效应，从而保护这些细胞或组织在例如急性肝炎的情况免受FAS-R配体的损伤。或者，基本上仅含有MORT-1 N-末端部分的MORT-1蛋白质的类似物或片段或衍生物可用于增强含有FAS-R的细胞和组织中的FAS-R-介导的细胞毒效应，从而在例如肿瘤细胞和自身反应性T和B细胞的情况下需要破坏时提高这些细胞的被破坏效应。如上文详细所述，MORT-1不同区段的上述应用可使用各种重组病毒(如牛痘病毒)将MORT-1区段-编码序列插入需要治疗的细胞或组织中来进行。

再者，为了达到相同的所需的由这些MORT-1区段介导的效应，也可制备和使用具有上述MORT-1区段相应的序列或分子结构的各种其它分子，例如抗体、肽和有机分子。

                                                  序列表(1)一般资料：

      (i)发明人：耶达研究与发展有限公司

                 WEINWURZEL.Henry

                 WALLACH.David

                 BOLDIN.Mark

                 VARFOLOMEEV.Eugene

                 METT.Igor

      (ii)发明名称：FAS/AP01受体功能的调节物

      (iii)序列数：2

      (iv)通信地址：

          (A)收信人：BROWDY AND NEIMARK

          (B)街道：419 Seventh Street N.W..Ste.300

          (C)城市：Washington

          (D)洲：D.C.

          (E)国家：United States of America

          (F)邮编：20004

      (v)计算机可读形式

          (A)介质类型：软盘

          (B)计算机：IBM PC兼容

          (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

          (D)软件：PatentIn Release#1.0.Version#1.30

      (vi)当前申请资料：

          (A)申请号：

          (B)申请日：

          (C)分类：

      (vii)在先申请资料：

          (A)申请号：IL 112002

          (B)申请日：15-DEC-1994

      (vii)在先申请资料：

          (A)申请号：IL 112692

          (B)申请日：19-FEB-1995

      (vii)在先申请资料：

          (A)申请号：IL 114615

          (B)申请日：16-JUL-1995

      (viii)代理人资料

          (A)姓名：Browdy.Roger L.

          (B)登记号：25.618

          (C)案号：Wallach＝16

      (ix)电讯资料：

          (A)电话：(202)628-5197

          (B)传真：(202)737-3528

          (C)电传：248633(2)SQE ID NO：1的资料

      (i)序列特征：

         (A)长度：1701碱基对

         (B)类型：核酸

         (C)链型：单链

         (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特点：

        (A)名称/关键词CDS

        (B)位置：1..768

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GTG AAT CAG GCA CCG GAG TGC AGG TTC GGG GGT GGA ATC CTT GGG CCG       48Val Asn Gln Ala Pro Glu Cys Arg Phe Gly Gly Gly Ile Leu Gly Pro1               5                  10                  15CTG GGC AAG CGG CGA GAC CTG GCC AGG GCC AGC GAG CCG AGG ACA GAG       96Leu Gly Lys Arg Arg Asp Leu Ala Arg Ala Ser Glu Pro Arg Thr Glu

         20                  25              30GGC GCG CGG AGG GCC GGG CCG CAG CCC CGG CCG CTT GCA GAC CCC GCC       144Gly Ala Arg Arg Ala Gly Pro Gln Pro Arg Pro Leu Ala Asp Pro Ala

     35              40                      45ATG GAC CCG TTC CTG GTG CTG CTG CAC TCG GTG TCG TCC AGC CTG TCG       192Met Asp Pro Phe Leu Val Leu Leu His Ser Val Ser Ser Ser Leu Ser

 50                  55                  60AGC AGC GAG CTG ACC GAG CTC AAG TTC CTA TGC CTC GGG CGC GTG GTC       240Ser Ser Glu Leu Thr Glu Leu Lys Phe Leu Cys Leu Gly Arg Val Val65                  70                  75                  80AAG CGC AAG CTG GAG CGC GTG CAG AGC GGC CTA GAC CTC TTC TCC ATG       288Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly Leu Asp Leu Phe Ser Met

             85                  90                  95CTG CTG GAG CAG AAC GAC CTG GAG CCC GGG CAC ACC GAG CTC CTG CGC       336Leu Leu Glu Gln Asn Asp Leu Glu Pro Gly His Thr Glu Leu Leu Arg

        100                 105             110GAG CTG CTC GCC TCC CTG CGG CGC CAC GAC CTG CTG CGG CGC GTC GAC       384Glu Leu Leu Ala Ser Leu Arg Arg His Asp Leu Leu Arg Arg Val Asp

    115                 120                 125GAC TTC GAG GCG GGG GCG GCG GCC GGG GCC GCG CCT GGG GAA GAA GAC       432Asp Phe Glu Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Glu Glu Asp

130                 135                 140CTG TGT GCA GCA TTT AAC GTC ATA TGT GAT AAT GTG GGG AAA GAT TGG       480Leu Cys Ala Ala Phe Asn Val Ile Cys Asp Asn Val Gly Lys Asp Trp145                 150                 155                 160AGA AGG CTG GCT CGT CAG CTC AAA GTC TCA GAC ACC AAG ATC GAC AGC       528Arg Arg Leu Ala Arg Gln Leu Lys Val Ser Asp Thr Lys Ile Asp Ser

            165                 170                 175ATC GAG GAC AGA TAC CCC CGC AAC CTG ACA GAG CGT GTG CGG GAG TCA       576Ile Glu Asp Arg Tyr Pro Arg Asn Leu Thr Glu Arg Val Arg Glu Ser

        180                 185                 190CTG AGA ATC TGG AAG AAC ACA GAG AAG GAG AAC GCA ACA GTG GCC CAC       624Leu Arg Ile Trp Lys Asn Thr Glu Lys Glu Asn Ala Thr Val Ala His

    195                 200                 205CTG GTG GGG GCT CTC AGG TCC TGC CAG ATG AAC CTG GTG GCT GAC CTG       672Leu Val Gly Ala Leu Arg Ser Cys Gln Met Asn Leu Val Ala Asp Leu

210                 215                 220GTA CAA GAG GTT CAG CAG GCC CGT GAC CTC CAG AAC AGG AGT GGG GCC       720Val Gln Glu Val Gln Gln Ala Arg Asp Leu Gln Asn Arg Ser Gly Ala225                 230                 235                 240ATG TCC CCG ATG TCA TGG AAC TCA GAC GCA TCT ACC TCC GAA GCG TCC       768Met Ser Pro Met Ser Trp Asn Ser Asp Ala Ser Thr Ser Glu Ala Ser

            245                 250                 255TGATGGGCCG CTGCTTTGCG CTGGTGGACC ACAGGCATCT ACACAGCCTG GACTTTGGTT     828CTCTCCAGGA AGGTAGCCCA GCACTGTGAA GACCCAGCAG GAAGCCAGGC TGAGTGAGCC     888ACAGACCACC TGCTTCTGAA CTCAAGCTGC GTTTATTAAT GCCTCTCCCG CACCAGGCCG     948GGCTTGGGCC CTGCACAGAT ATTTCCATTT CTTCCTCACT ATGACACTGA GCAAGATCTT     1008GTCTCCACTA AATGAGCTCC TGCGGGAGTA GTTGGAAAGT TGGAACCGTG TCCAGCACAG     1068AAGGAATCTG TGCAGATGAG CAGTCACACT GTTACTCCAC AGCGGAGGAG ACCAGCTCAG     1128AGGCCCAGGA ATCGGAGCGA AGCAGAGAGG TGGAGAACTG GGATTTGAAC CCCCGCCATC     1188CTTCACCAGA GCCCATGCTC AACCACTGTG GCGTTCTGCT GCCCCTGCAG TTGGCAGCAAA    1248GGATGTTTTT GTCCCATTTC CTTGGAGGCC ACCGGGACAG ACCTGGACAC TAGGGTCAGG     1308CGGGGTGCTG TGGTGGGGAG AGGCATGGCT GGGGTGGGGG TGGGGAGACC TGGTTGGCCG     1368TGGTCCAGCT CTTGGCCCCT GTGTGAGTTG AGTCTCCTCT CTGAGACTGC TAAGTAGGGG     1428CAGTGATGGT TGCCAGGACG AATTGAGATA ATATCTGTGA GGTGCTGATG AGTGATTGAC     1488ACACAGCACT CTCTAAAACT TCCTTGTGAG GATTATGGGT CCTGCAATTC TACAGTTTCT     1548TACTGTTTTG TATCAAAATC ACTATCTTTC TGATAACAGA ATTGCCAAGG CAGCGGGATC     1608TCGTATCTTT AAAAAGCAGT CCTCTTATTC CTAAGGTAAT CCTATTAAAA CACAGCTTTA     1668CAACTTCCAT ATTACAAAAA AAAAAAAAAA AAA                                  1701

(2)SEQ ID NO：2的资料

          (i)序列特征：

             (A)长度：256个氨基酸

             (B)类型：氨基酸

             (C)拓扑结构：线性

          (ii)分子类型：蛋白质

          (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Val Asn Gln Ala Pro Glu Cys Arg Phe Gly Gly Gly Ile Leu Gly Pro1               5                  10                  15Leu Gly Lys Arg Arg Asp Leu Ala Arg Ala Ser Glu Pro Arg Thr Glu

         20                  25                  30Gly Ala Arg Arg Ala Gly Pro Gln Pro Arg Pro Leu Ala Asp Pro Ala

     35                  40                  45Met Asp Pro Phe Leu Val Leu Leu His Ser Val Ser Ser Ser Leu Ser

 50                  55                  60Ser Ser Glu Leu Thr Glu Leu Lys Phe Leu Cys Leu Gly Arg Val Val65                  70                  75                  80Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly Leu Asp Leu Phe Ser Met

             85                  90                  95Leu Leu Glu Gln Asn Asp Leu Glu Pro Gly His Thr Glu Leu Leu Arg

        100                 105                 110Glu Leu Leu Ala Ser Leu Arg Arg His Asp Leu Leu Arg Arg Val Asp

    115                 120                 125Asp Phe Glu Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Glu Glu Asp

130                 135                 140Leu Cys Ala Ala Phe Asn Val Ile Cys Asp Asn Val Gly Lys Asp Trp145             150                     155                 160Arg Arg Leu Ala Arg Gln Leu Lys Val Ser Asp Thr Lys Ile Asp Ser

            165                 170                 175Ile Glu Asp Arg Tyr Pro Arg Asn Leu Thr Glu Arg Val Arg Glu Ser

        180                 185                 190Leu Arg Ile Trp Lys Asn Thr Glu Lys Glu Asn Ala Thr Val Ala His

    195                 200                 205Leu Val Gly Ala Leu Arg Ser Cys Gln Met Asn Leu Val Ala Asp Leu

210                 215                 220Val Gln Glu Val Gln Gln Ala Arg Asp Leu Gln Asn Arg Ser Gly Ala225                 230                 235                 240Met Ser Pro Met Ser Trp Asn Ser Asp Ala Ser Thr Ser Glu Ala Ser

            245                 250                 255参考文献Barinaga，M.(1993)Science  2621512-4.Berger，J.，Hauber，J.，Hauber，R.，Geiger，R.and Cullen，B.R.(1988)Gene 66，1-10.Beutler，B.and Cerami，C.(1987)NEJM， 316：379-385.Boldin，M.P.et al.(1995)J.Biol.Chem. 270，337-341.Brakebusch，C.et al.(1992)EMBO J.， 11：943-950.Brockhaus，M.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 87：3127-3131.Cantor，G.H.et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA  90：10932-6.Chen，C.J.et al.(1992)Ann N.Y.Acad.Sci. 660：271-3.Crisell，P.et al.，(1993)Nucleic Acids Res.(England) 21(22)：5251-5.Current protocols in molecular biology(Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，

D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，Struhl，K.，Albright，L.M.，Coen，D.M.& Varki，A.，

eds.)，(1994)pp.8.1.1-8.1.6 and 16.7-16.7.8，Greene Publishing Associates，Inc.and

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HarborLaboratory Press，Cold spring Harbor，NY.Schall，T.J.et al.(1990) Cell， 61：361-370.Shimayama，T.et al.，(1993)Nucleic Acids Symp.Ser. 29：177-8Shore，S.K.et al.(1993)Oncogene  8：3183-8.Smith，C.A.et al.(1990)Science， 248：1019-1023.Song，H.Y.et al.(1994)J.Biol.Chem. 269，22492-22495.Tartaglia，L.A.et al.(1993)Cell， 74：845-853.Tracey，J.T.et al.(1987)Nature， 330：662-664.Wallach，D.(1984)J.Immunol. 132，2464-9.Wallach，D.(1986)in：Interferon 7(Ion Gresser，ed.)，pp.83-122，Academic Press，LondonWallach，D.et al.(1994)Cytokine  6，556.Watanabe-Fukunaga，R.et al.(1992)Nature， 356，314-317.Wilks，A.F.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 86：1603-1607.Zhao，J.J.and Pick，L.(1993)Nature(England) 365：448-51.

Claims (31)

1.一种DNA分子，包括：

(1)一种编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的MORT-1蛋白质的DNA序列；

(2)一种编码所说的MORT-1蛋白质的类似物的DNA序列，这种MORT-1蛋白质类似物与FAS配体受体(FAS-IC)的胞内区域结合，该DNA序列可在中度严谨条件下与编码SEQ ID NO：2的cDNA杂交；或者

(3)一种由编码所说的与FAS-IC结合的MORT-1蛋白质的片段的DNA序列组成的DNA编码序列。

2.按照权利要求1所述的DNA分子，包括一种编码所说的MORT-1蛋白质的类似物的DNA序列，该MORT-1蛋白质类似物与FAS-IC结合，该DNA序列可在中度严谨条件下与编码SEQ ID NO：2的cDNA杂交。

3.按照权利要求2所述的DNA分子，包括一种编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的MORT-1蛋白质或MORT-1蛋白质的类似物，该类似物与MORT-1蛋白质之间具有单个氨基酸残基的差异，并与FAS配体受体的胞内区域(FAS-IC)结合。

4.按照权利要求1所述的DNA分子，包括一种编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的DNA序列。

5.按照权利要求4所述的DNA分子，包括SEQ ID NO：1的DNA序列。

6.按照权利要求1所述的DNA分子，包括一种由编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的片段的DNA序列组成的DNA编码序列，所述的片段与FAS-IC结合。

7.一种含有权利要求1所述的DNA序列的载体。

8.按照权利要求7所述的载体，它可以在一种真核宿主细胞中表达。

9.按照权利要求7所述的载体，它可以在一种原核宿主细胞中表达。

10.一种含有权利要求3所述的DNA序列的载体。

11.按照权利要求10所述的载体，它可以在一种真核宿主细胞中表达。

12.按照权利要求10所述的载体，它可以在一种原核宿主细胞中表达。

13.含有权利要求7所述载体的转化的真核或原核宿主细胞。

14.含有权利要求10所述载体的转化的真核或原核宿主细胞。

15.一种制备与FAS-R的细胞内区域结合的多肽的方法，包括在适于表达产物从所说的细胞中表达的条件下培养权利要求13的转化的宿主细胞，如果需要对所说的表达产物进行翻译后加工，得到所说的多肽，并分离所说的表达的多肽。

16.一种制备与FAS-R的细胞内区域结合的多肽的方法，包括在适于表达产物从所说的细胞中表达的条件下培养权利要求14的转化的宿主细胞，如果需要对所说的表达产物进行翻译后加工，得到所说的多肽，并分离所说的表达的多肽。

17.一种多肽，包括：

(1)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的MORT-1蛋白质；

(2)一种与FAS配体受体的胞内区域(FAS-IC)结合的所说的MORT-1蛋白质的类似物，这种类似物是由一种在中度严谨条件下可与编码SEQ IDNO：2的cDNA杂交的DNA序列编码的；

(3)一种与FAS-IC结合的所说的MORT-1蛋白质的片段。

18.按照权利要求17的多肽，包括一种与FAS-IC结合的所说的MORT-1蛋白质的类似物，该类似物是由一种在中度严谨条件下可与编码SEQ ID NO：2的cDNA杂交的DNA序列编码的。

19.一种多肽，包括具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的MORT-1蛋白质或者所说的MORT-1蛋白质的类似物，这种类似物与MORT-1蛋白质之间具有单个氨基酸残基的差异并与FAS配体受体的胞内区域(FAS-IC)结合。

20.按照权利要求17的多肽，包括具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的MORT-1蛋白质。

21.按照权利要求17的多肽，包括所说的MORT-1蛋白质的片段，该片段与FAS-IC结合。

22.一种用于调节细胞上FAS-R配体效应的药物组合物，包括作为活性成份的按照权利要求17的多肽。

23.一种用于调节细胞上FAS-R配体效应的药物组合物，包括作为活性成份的重组动物病毒载体，该载体编码一种可与细胞表面受体结合的蛋白质并编码一种权利要求17所述的多肽。

24.一种用于调节细胞上FAS-R配体效应的药物组合物，包括作为活性成份的按照权利要求19的多肽。

25.一种用于调节细胞上FAS-R配体效应的药物组合物，包括作为活性成份的重组动物病毒载体，该载体编码一种可与细胞表面受体结合的蛋白质并编码一种权利要求19所述的多肽。

26.权利要求17所述的多肽在制备用于调节细胞上FAS-R配体效应的药物中的应用。

27.权利要求7所述的载体在制备用于调节细胞上FAS-R配体效应的药物中的应用。

28.权利要求19所述的多肽在制备用于调节细胞上FAS-R配体效应的药物中的应用。

29.权利要求10所述的载体在制备用于调节细胞上FAS-R配体效应的药物中的应用。

30.一种寡核苷酸序列，它编码SEQ ID NO：1的DNA序列或其片段的反义序列，它所具有的长度在被导入可表达所说的MOET-1蛋白质的细胞后足以使其能够阻止SEQ ID NO：2的MORT-1蛋白质的表达。

31.一种用于调节细胞上FAS-R配体效应的药物组合物，包括作为活性成份的权利要求30所述的编码反义序列的寡核苷酸。

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