ES2292172T3

ES2292172T3 - Moduladores de la funcion de los receptores fas/apo1.

Info

Publication number: ES2292172T3
Application number: ES95944148T
Authority: ES
Inventors: David Wallach; Mark Boldin; E.-Dep. Membrane Res. and Biophysics VARFOLOMEEV; Igor Mett
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1994-12-15
Filing date: 1995-12-14
Publication date: 2008-03-01
Anticipated expiration: 2015-12-14
Also published as: DK0871645T3; HK1007248A1; CA2207815A1; NO972716L; WO1996018641A1; ATE377073T1; CN1105725C; EP0871645A4; AU4602296A; FI121273B; PT871645E; KR100536394B1; AU706401B2; EP0871645B1; UA58489C2; FI972457A; CA2207815C; CN1169729A; JPH10510712A; DE69535634T2

Abstract

SE PROPONEN PROTEINAS CAPACES DE MODULAR LA FUNCION DE FAS/APO1. LAS PROTEINAS PUEDEN SER PREPARADAS POR CULTURA DE UNA CELULA HUESPED TRANSFORMADA CON UN VECTOR QUE CONTIENE EL ADN QUE CODIFICA TAL PROTEINA EN CONDICIONES ADECUADAS, Y AISLAMIENTO DE LA PROTEINA.

Description

Moduladores de la función de los receptores FAS/APO1.

Campo de la invención

La presente invención generalmente está en el campo de los receptores pertenecientes a la superfamilia de receptores TNF/NGF y al control de sus funciones biológicas. La superfamilia de receptores TNF/NGF incluye receptores tales como los receptores del factor de necrosis tumoral (TNF-Rs, del Inglés "Tumor Necrosis Factor Receptors") p55 y p75 y el receptor de ligando FAS (también denominado FAS/APO1 o FAS-R y más adelante se denominará FAS-R) y otros. Más específicamente, la presente invención se refiere a una proteína novedosa, designada en la presente memoria MORT-1 (también denominada HF-1) la cual se une al dominio intracelular (IC) del Fas-R (este dominio intracelular designado Fas-IC) y dicha novedosa proteína es capaz de modular la función del Fas-R. Además, MORT-1 también es capaz de autoasociación y puede activar la citotoxicidad celular sobre sí misma. La presente invención también se refiere a la preparación y los usos de MORT-1.

Se debería señalar que HF-1 (la designación original) y MORT-1 (la designación actualmente usada) se usan ambas por toda la memoria y denotan la misma proteína.

Antecedentes de la invención y técnica anterior

El Factor de Necrosis Tumoral (TNF-\alpha) y la Linfotoxina (TNF-\beta) (más adelante, TNF, se refiere tanto a TNF-\alpha como a TNF-\beta) son citoquinas pro-inflamatorias multifuncionales formadas principalmente por fagocitos mononucleares, los cuales tienen muchos efectos sobre las células (Wallach, D. (1986) en: Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), pp. 83-122, Academic Press, Londres; y Beutler y Cerami (1987)). Tanto TNF-\alpha como TNF-\beta inician sus efectos uniéndose a receptores de superficie celular específicos. Algunos de los efectos parecen ser beneficiosos para el organismo: pueden destruir, por ejemplo, células tumorales o células infectadas por virus y aumentar las actividades antibacterianas de los granulocitos. De este modo, el TNF contribuye a la defensa del organismo contra tumores y agentes infecciosos y contribuye a la recuperación de la herida. Por tanto, el TNF se puede usar como un agente antitumoral en cuya aplicación se une a sus receptores sobre la superficie de las células tumorales y de ese modo inicia los sucesos que conducen a la muerte de las células tumorales. El TNF también se puede usar como agente anti-infeccioso.

Sin embargo, tanto TNF-\alpha como TNF-\beta también tienen efectos perjudiciales. Hay evidencia de que la sobre-producción de TNF-\alpha puede jugar un papel patogénico muy importante en varias enfermedades. Por tanto, los efectos de TNF-\alpha, principalmente sobre la vascularización, actualmente se sabe que son una causa muy importante de los síntomas del choque séptico (Tracey et. al., 1986). En algunas enfermedades, TNF puede causar pérdida excesiva de peso (cachexia) mediante la supresión de las actividades de adipocitos y causando anorexia y, por tanto, al TNF-\alpha se denominó cachetin. También se describió como mediador del daño a tejidos en enfermedades reumáticas (Beutler y Cerami, 1987) y como mediador muy importante del daño observado en las reacciones de hospedante contra injerto (Piquet et al., 1987). Además, se sabe que TNF está implicado en el proceso de inflamación y en muchas otras enfermedades.

Dos receptores distintos, expresados de manera independiente, los TNF-Rs p55 y p75, los cuales se unen específicamente tanto a TNF-\alpha como a TNF-\beta, inician y/o median los efectos biológicos anteriormente señalados de TNF. Estos dos receptores tienen dominios intracelulares estructuralmente desiguales que sugieren que señalan de manera diferente (Véase Hohmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Brockhaus et al., 1990; Leotscher et al., 1990; Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990; y Heller et al., 1990). Sin embargo, todavía se tienen que aclarar los mecanismos celulares, por ejemplo, las diversas proteínas y posiblemente otros factores, que están implicados en la señalización intracelular de los TNF-Rs p55 y p75 (En el documento PCT/US95/05854 y tal como también se explica a continuación en la presente memoria, se describen por primera vez, nuevas proteínas capaces de unirse al p75IC y p55IC). Es esta señalización intracelular, la cual se da normalmente después de la unión del ligando, es decir, TNF(\alpha o \beta), al receptor, que es responsable del comienzo de la cascada de reacciones que por último dan como resultado la respuesta observada de la célula a TNF.

En cuanto al efecto citocida anteriormente mencionado de TNF, en la mayoría de las células estudiadas hasta ahora, este efecto se desencadena principalmente por el TNF-R p55. Los anticuerpos contra el dominio extracelular (dominio de unión al ligando) del TNF-R p55 pueden desencadenar por sí mismos el efecto citocida (véase el documento EP 412486) el cual establece una correlación con la eficacia del entrecruzamiento del receptor por los anticuerpos, se cree que es la primera etapa en la generación del proceso de señalización intracelular. Además, los estudios mutacionales (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993) han mostrado que la función biológica del TNF-R p55 depende de la integridad de su dominio intracelular, y por consiguiente, se ha sugerido que la iniciación de la señalización intracelular que conduce al efecto citocida de TNF se da como consecuencia de la asociación de dos o más dominios intracelulares del TNF-R p55. Además, TNF (\alpha y \beta) se da como un homotrímero y así se ha sugerido que induce la señalización intracelular vía el TNF-R p55 por su capacidad para unirse a y entrecruzar las moléculas del receptor, es decir, causa agregación del receptor. En el documento PCT/US95/05854 y también a continuación en la presente memoria se ha descrito cómo el p55IC y p55DD pueden autoasociarse e inducir, de un modo independiente del ligando, los efectos asociados a TNF en células.

Otro miembro de la superfamilia de receptores TNF/NGF es el receptor de FAS (FAS-R) que también se ha denominado el antígeno de Fas, una proteína de superficie celular expresada en diversos tejidos y que comparte homología con un número de receptores de superficie celular incluyendo TNF-R y NGF-R. El FAS-R media la muerte celular en forma de apoptosis (Itoh et al., 1991), y parece servir como selector negativo de células T autorreactivas, es decir, durante la maduración de las células T, el FAS-R media la muerte apoptópica de las células T reconociendo los propios antígenos. También se ha encontrado que las mutaciones en el gen de FAS-R (lpr) causa un trastorno de linfoproliferación en ratones que se parece a la enfermedad autoinmune humana lupus eritematoso sistémico (LES) (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). El ligando para el FAS-R parece ser una molécula asociada a superficie celular portada por, entre otros, células T "agresoras" (o linfocitos T citotóxicos-CTLs, del Inglés "Cytotoxic T Lymphocytes"), y de ahí que cuando tales CTLs contactan con células que portan FAS-R, son capaces de inducir la muerte celular apoptópica de las células portadora de FAS-R. Además, se ha preparado un anticuerpo monoclonal que es específico para FAS-R, siendo este anticuerpo monoclonal capaz de inducir muerte celular apoptópica en células que portan FAS-R, incluyendo células de ratón transformadas por el ADNc que codifica el FAS-R humano (Itoh et al.,
1991).

También se ha encontrado que otras diversas células normales, a parte de los linfocitos T, expresan el FAS-R sobre su superficie y que pueden ser destruidas por el desencadenamiento de este receptor. Se sospecha que la inducción incontrolada de tal proceso mortal contribuye al daño tisular en ciertas enfermedades, por ejemplo, la destrucción de células de hígado en la hepatitis aguda. Por consiguiente, hallar modos para refrenar la actividad citotóxica de FAS-R puede tener potencial terapéutico.

A la inversa, puesto que también se ha encontrado que ciertas células malignas y células infectadas por VIH portan el FAS-R sobre su superficie, los anticuerpos contra FAS-R, o el ligando de FAS-R, se pueden usar para desencadenar los efectos citotóxicos mediados por FAS-R en estas y, de ese modo, proporcionar un medio para combatir tales células malignas o células infectadas por VIH (véase Itoh et al., 1991). Por lo tanto, encontrar incluso otros modos de aumentar la actividad citotóxica de FAS-R también puede tener potencial terapéutico.

Desde hace tiempo ha habido una sentida necesidad de proporcionar un modo para modular la respuesta celular a TNF (\alpha o \beta) y el ligando de FAS-R, por ejemplo, en situaciones patológicas tales como las anteriormente mencionadas, en las que se sobre-expresa TNF o el ligando de FAS-R es deseable inhibir los efectos citocidas inducidos por el ligando de FAS-R o TNF, mientras que en otras situaciones, por ejemplo, aplicaciones curativas de herida, es deseable aumentar el efecto de TNF, o en el caso de FAS-R, en células tumorales o células infectadas por VIH es deseable aumentar el efecto mediado por FAS-R.

Los presentes inventores han realizado un número de enfoques (véase, por ejemplo, Solicitud Europea Nº EP 186833, EP 308378, EP 398327 y EP 412486) para regular los efectos perjudiciales de TNF mediante la inhibición de la unión de TNF a sus receptores usando anticuerpos anti-TNF o usando receptores de TNF solubles (siendo esencialmente los dominios extracelulares solubles de los receptores) para competir con la unión de TNF a los TNF-Rs unidos a la superficie celular. Además, en base a que se requiere la unión de TNF a sus receptores para los efectos celulares inducidos por TNF, los enfoques por los presentes inventores (véase, por ejemplo, el documento IL 101769 y su correspondiente documento EP 568925) se han realizado para modular el efecto de TNF mediante la modulación de la actividad de los TNF-Rs. En resumen, el documento EP 568925 (IL 101769) se refiere a un método de modulación de la transducción de la señal y/o escisión en TNF-Rs por lo cual los péptidos u otras moléculas pueden interactuar o bien con el propio receptor o con las proteínas efectoras que interactúan con el receptor, modulando así el normal funcionamiento de los TNF-Rs. En el documento EP 568925 se ha descrito la construcción y caracterización de diversos TNF-Rs p55 mutantes, que tienen mutaciones en los dominios extracelulares, de transmembrana e intracelulares del TNF-R p55. De este modo se identificaron las regiones dentro de los dominios anteriores del TNF-R p55 como esenciales para el funcionamiento del receptor, es decir, la unión del ligando (TNF) y la posterior transducción de la señal y señalización intracelular que por último da como resultado el efecto de TNF observado sobre las células. Además, también se ha descrito un número de enfoques para aislar e identificar proteínas, péptidos u otros factores que sean capaces de unirse a las diversas regiones en los anteriores dominios del TNF-R, dichas proteínas, péptidos y otros factores pueden estar implicados en la regulación o modulación de la actividad del TNF-R. En el documento EP 568925 también se explican un número de enfoques para aislar y clonar las secuencias de ADN que codifican tales proteínas y péptidos; para construir vectores de expresión para la producción de estas proteínas y péptidos; y para la preparación de anticuerpos o fragmentos de los mismos que interactúen con el TNF-R o con las anteriores proteínas y péptidos que se unen a diversas regiones del TNF-R. Sin embargo, el documento EP 568925 ni especifica las actuales proteínas y péptidos que se unen a los dominios intracelulares de los TNF-Rs (por ejemplo, TNF-R p55), ni describe el enfoque del doble híbrido en levadura para aislar e identificar tales proteínas o péptidos que se unen a los dominios intracelulares de los TNF-Rs. Igualmente, hasta este momento no se han descrito proteínas o péptidos capaces de unirse al dominio intracelular de FAS-R.

Por tanto, si se desea inhibir el efecto de TNF, o el ligando de FAS-R, sería deseable disminuir la cantidad o la actividad de TNF-Rs o FAS-R en la superficie celular, mientras que sería deseable un incremento en la cantidad o la actividad de TNF-Rs o FAS-R si se ambiciona un efecto del ligando de FAS-R o TNF aumentado. Para este fin se han secuenciado y analizado los promotores de tanto el TNF-R p55 como el TNF-R p75 y se ha encontrado que un número de motivos de secuencia llaves son específicos a diversos factores de regulación de la transcripción, y así la expresión de estos TNF-Rs se puede controlar en su nivel de promotor, es decir, la inhibición de la transcripción a partir de los promotores para una disminución en el número de receptores, y un aumento de la transcripción a partir de los promotores para un incremento en el número de receptores (véase los documentos IL 104355 e IL 109633). Incluso se tiene que informar de los estudios correspondientes que se refieren al control de FAS-R en el nivel del promotor del gen de FAS-R.

Además, también se debería mencionar que, mientras que se sabe que los receptores del factor de necrosis tumoral (TNF), y el receptor FAS-R relacionado estructuralmente, desencadenan en células, sobre la estimulación mediante ligandos producidos por leucocitos, actividades destructivas que conducen a su propia destrucción, aún se entienden poco los mecanismos de este desencadenamiento. Estudios mutacionales indican que en FAS-R y el receptor de TNF p55 (p55-R) la señalización para citotoxicidad implica distintas regiones dentro de sus dominios intracelulares (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh y Nagata, 1993). Estas regiones (los "dominios de muerte") tienen similitud de secuencia. Los "dominios de muerte" de tanto FAS-R como p55-R tienden a autoasociarse. Su autoasociación aparentemente fomenta esa agregación del receptor que es necesaria para la iniciación de la señalización (véase el documento PCT/US95/05854, así como Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al., 1995) y a altos niveles de expresión del receptor puede dar como resultado el desencadenamiento de la señalización independiente de ligando (documento PCT/US95/05854 y Boldin et al., 1995).

Por tanto, antes del documento PCT/US95/05854 y la presente invención, no se habían proporcionado proteínas que pudieron regular el efecto de los ligandos pertenecientes a la superfamilia TNF/NGF, tal como el efecto del ligando de FAS-R o TNF sobre las células, mediante la mediación del proceso de señalización intracelular, dicha señalización probablemente está dirigida a una gran extensión por los dominios intracelulares (ICs) de los receptores pertenecientes a la superfamilia de receptores TNF/NGF, tales como los de los TNF-Rs, es decir, los dominios intracelulares de TNF-R p55 y p75 (p55IC y p75IC, respectivamente), así como el FAS-IC.

Por consiguiente, es una reivindicación de la invención proporcionar proteínas, siendo MORT-1 o fragmentos de las misma, que sean capaces de unirse al dominio intracelular del FAS-R, dichas proteínas actualmente se cree que están implicadas en el proceso de señalización intracelular iniciado por la unión del ligando FAS a su receptor. La proteína MORT-1 o fragmentos de la misma de la presente invención son distintos de las proteínas de unión a FAS-IC descritas en las solicitudes anteriormente mencionadas.

Otra reivindicación de la invención es proporcionar antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) a estas moléculas de unión a FAS-IC, siendo la proteína MORT-1 o fragmentos, que se puedan usar para inhibir el proceso de señalización, si se desea, cuando tales proteínas de unión a FAS-IC son efectores positivos de señal (es decir, inducen la señalización), o para aumentar el proceso de señalización, si se desea, cuando tales proteínas de unión a FAS-IC son efectores negativos de señal (es decir, inhiben la señalización).

Otra reivindicación de la invención es usar tal proteína MORT-1, o fragmentos, para aislar y caracterizar proteínas o factores adicionales, que pueden, por ejemplo, estar implicados más en dirección 3' ("downstream") en el proceso de señalización, y/o para aislar e identificar otros receptores más en dirección 5' ("upstream") en el proceso de señalización para lo cual esta proteína MORT-1, análogos, fragmentos y derivados se unen (por ejemplo, otros FAS-Rs o receptores relacionados), y de ahí que, también están implicados en su función.

Además, es una reivindicación de la presente invención usar la proteína MORT-1 anteriormente mencionada, o fragmentos, como antígenos para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales de ellos. Los anticuerpos, sucesivamente, se pueden usar, por ejemplo, para la purificación de la nueva proteína MORT-1 a partir de diferentes fuentes, tales como extractos celulares o líneas celulares transformadas.

Además, estos anticuerpos se pueden usar con propósitos diagnósticos, por ejemplo, para identificar trastornos relacionados con el funcionamiento anormal de los efectos celulares mediados por el receptor FAS-R.

Una reivindicación adicional de la invención es proporcionar composiciones farmacéuticas que comprendan la anterior proteína MORT-1, o fragmentos, así como composiciones farmacéuticas que comprendan los anticuerpos anteriormente señalados u otros antagonistas descritos en la presente memoria.

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Compendio de la invención

De acuerdo con la presente invención, hemos encontrado una novedosa proteína que es capaz de unirse al dominio intracelular del FAS-R. Esta proteína de unión a FAS-IC puede actuar como mediador o modulador del efecto del ligando de FAS-R sobre las células a modo de mediación o modulación del proceso de señalización intracelular que normalmente se da después de la unión del ligando de FAS-R a la superficie celular.

Esta novedosa proteína se ha designado HF1, o MORT-1 (del Inglés "Mediator of Receptor Toxicity"), y además su especificidad de unión a FAS-IC tiene otras características (véase el Ejemplo 1), por ejemplo, tiene una región homóloga a las regiones de "dominio de muerte" (DD, del Inglés "Death Domain") del TNF-R p55 y FAS-R (p55-DD y FAS-DD) y, de ese modo, también es capaz de la autoasociación. MORT-1 también es capaz de activar la citotoxicidad celular sobre sí misma, una actividad posiblemente relacionada con su capacidad de autoasociación. Actualmente también se ha encontrado que la expresión conjunta de la región en MORT-1 (HF1) que contiene la secuencia de homología de "dominio de muerte" (MORT-DD, presente en la parte C-terminal de MORT-1) interfiere fuertemente con la muerte celular inducida por FAS, como se esperaría de su capacidad de unirse al "dominio de muerte" del FAS-IC. Además, en las mismas condiciones experimentales se encontró que la expresión conjunta de la parte de MORT-1 que no contiene la región MORT-DD (la parte N-terminal de MORT-1, aminoácidos 1-117, "cabeza de MORT-1") dió como resultado la no interferencia de la muerte celular inducida por FAS y, si lo contiene, una citotoxicidad celular inducida por FAS algo aumentada.

Por consiguiente, la presente invención proporciona una secuencia de ADN que codifica una proteína designada MORT-1 en la presente memoria o fragmentos de la misma, todos los cuales son capaces de unirse a o interactuar con el dominio intracelular del receptor del ligando FAS (FAS-IC).

En concreto, la presente invención proporciona una secuencia de ADN seleccionada entre el grupo que consiste en:

(a): una secuencia de ADNc derivada de la región codificadora de una proteína MORT-1 natural;

(b): secuencias de ADN capaces de hibridación a un ADNc del punto (a) bajo condiciones moderadamente estrictas y las cuales codifican una proteína de unión al dominio intracelular de FAS-R biológicamente activa; y

(c): secuencias de ADN que están degeneradas como resultado del código genético para las secuencias de ADN definidas en los puntos (a) y (b) y las cuales codifican una proteína de unión al dominio intracelular de FAS-R biológicamente activa.

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Una realización específica de la anterior secuencia de ADN de la invención es una secuencia de ADN que codifica la proteína MORT-1 que comprende la secuencia representada en la Figura 4.

La presente invención también proporciona una proteína MORT-1 o fragmentos de la misma codificados mediante cualquiera de las anteriores secuencias de la invención, siendo dichas proteínas o fragmentos capaces de unirse a o interactuar con el dominio intracelular del FAS-R.

Una realización específica de la anterior proteína de la invención es la proteína MORT-1 que tiene la secuencia de aminoácidos deducida representada en la Figura 4.

Proporcionados también por la presente invención son los vectores que codifican la anterior proteína MORT-1 o fragmentos de la invención, que contiene la anterior secuencia de ADN de la invención, siendo estos vectores capaces de expresarse en células hospedantes eucariotas o procariotas adecuadas; células hospedantes eucariotas o procariotas transformadas que contienen tales vectores; y un método para producir la proteína MORT-1 bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína o fragmentos que efectúan modificaciones post-traducción de dicha proteína tal como sea necesario para la obtención de dicha proteína y la extracción de dicha proteína expresada o fragmentos a partir del medio de cultivo de dichas células transformadas o de extractos celulares de dichas células
transformadas.

En otro aspecto, la presente invención también proporciona anticuerpos o derivados activos o fragmentos de los mismos específicos a la proteína MORT-1, o fragmentos de la misma, de la invención.

Mediante otro aspecto de la invención, se han proporcionado diversos usos y métodos de las anteriores secuencias de ADN o las proteínas que codifican, de acuerdo con la invención, dichos usos y métodos incluyen entre otros:

(i): un uso de una o más proteínas MORT-1 o fragmentos de acuerdo con la invención, siendo todos capaces de unirse al dominio intracelular y modular la actividad de dicha FAS-R, para la preparación de una composición farmacéutica para la modulación del efecto del ligando de FAS-R sobre células que portan un FAS-R, en el que dicha o dichas proteínas MORT-1 o fragmentos son introducidos en las células de una forma adecuada para la administración intracelular, o en el que una secuencia de ADN que codifica dicha o dichas proteínas o fragmentos se introduce en las células en forma de un vector de expresión adecuado que porta dicha secuencia, siendo dicho vector capaz de efectuar la inserción de dicha secuencia en dichas células de modo que dicha secuencia se exprese en dichas células;

(ii): un uso de MORT-1 o fragmentos de la misma, siendo todos capaces de unirse al dominio intracelular y modificar la actividad de FAS-R, para la preparación de una composición farmacéutica para la modulación del efecto del ligando de FAS-R sobre células, en el que dicha MORT-1 o fragmentos se introducen en las células de una forma adecuada para la introducción intracelular, o en el que una secuencia de ADN que codifica dicha MORT-1 o fragmentos se introducen en las células en forma de un vector adecuado que porta dicha secuencia, siendo dicho vector capaz de efectuar la inserción de dicha secuencia en dichas células de modo que se exprese dicha secuencia en dichas células;

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(iii): un uso como en el anterior punto (ii) en el que dichas células se someten a transfección con un vector vírico animal recombinante, comprendiendo las etapas de:

(a): construir un vector vírico animal recombinante que porte una secuencia que codifica una proteína de superficie vírica (ligando) que es capaz de unirse a un receptor de superficie celular específico sobre la superficie de una célula portadora de FAS-R y una segunda secuencia que codifica una proteína seleccionada de la proteína MORT-1 y fragmentos de la invención que si se expresa en dichas células es capaz de modular la actividad de dicho FAS-R; y

(b): infectar dichas células con dicho vector del punto (a).

(iv): un uso de anticuerpos o derivados activos o fragmentos de los mismos de acuerdo con la invención para la preparación de una composición farmacéutica para la modulación del efecto del ligando de FAS-R sobre células que portan un FAS-R, en el que dicho uso incluye la aplicación de una composición adecuada que contiene dichos anticuerpos, fragmentos activos o derivados de los mismos a dichas células, en el que si se exponen las proteínas MORT-1 o porciones de las mismas de dichas células sobre la superficie extracelular, se formula dicha composición para la aplicación extracelular, y si dichas proteínas MORT-1 son intracelulares se formula dicha composición para la aplicación intracelular;

(v): un uso de una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia antisentido de al menos parte de la secuencia de MORT-1 de la invención, siendo dicha secuencia de oligonucleótidos capaz de bloquear la expresión de la proteína MORT-1, para la preparación de una composición farmacéutica para la modulación del efecto del ligando de FAS-R sobre células que portan un FAS-R;

(vi): un uso como en el anterior punto (v) en el que dichas células se someten a transfección con un vector vírico animal recombinante, comprendiendo las etapas de:

(a): construir un vector vírico animal recombinante que porte una secuencia que codifica una proteína de superficie vírica (ligando) que es capaz de unirse a un receptor de superficie celular específico sobre la superficie de una célula portadora de FAS-R y una segunda secuencia que es una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia antisentido de al menos parte de la secuencia de MORT-1 de acuerdo con la invención, siendo dicha secuencia de oligonucleótidos capaz de bloquear la expresión de la proteína MORT-1 si se introduce en dichas células mediante dicho virus; y

(b): infectar dichas células con dicho vector del punto (a).

(vii): un uso de un vector vírico animal recombinante que porta una secuencia que codifica una proteína de superficie vírica que es capaz de unirse a un receptor de superficie de célula tumoral o receptor de superficie de célula infectada por VIH o un receptor portado por otras células enfermas y una secuencia que codifica una proteína seleccionada entre la proteína MORT-1 y fragmentos de la invención, que si se expresa en dicho tumor, célula infectada por VIH, u otra célula enferma es capaz de destruir dicha célula, para la preparación de una composición farmacéutica para usar en un método para tratar células tumorales o células infectadas por VIH, u otras células enfermas, comprendiendo:

(a): construir un vector vírico animal recombinante que porta una secuencia que codifica una proteína de superficie vírica que es capaz de unirse a un receptor de superficie de célula tumoral o receptor de superficie de célula infectada por VIH o un receptor portado por otras células enfermas y una secuencia que codifica una proteína seleccionada entre la proteína MORT-1 y fragmentos de la invención, que si se expresa en dicho tumor, célula infectada por VIH, u otra célula enferma es capaz de destruir dicha célula; y

(b): infectar dicho tumor o células infectadas por VIH u otras células enfermas con dicho vector del punto (a).

(viii): un uso de un vector que codifica una secuencia de ribozima capaz de interactuar con una secuencia de ARNm celular que codifica una proteína MORT-1 de la invención para la preparación de una composición farmacéutica para modular el efecto del ligando de FAS-R sobre las células, en el que dicha composición farmacéutica se introduce en dichas células de una forma que permite la expresión de dicha secuencia de ribozima en dichas células, y en el que si se expresa dicha secuencia de ribozima en dichas células interactúa con dicha secuencia de ARNm celular y escinde dicha secuencia de ARNm dando como resultado la inhibición de la expresión de dicha proteína MORT-1 en dichas células;

(ix): un uso seleccionado entre cualquiera de los usos anteriores en el que dicha proteína MORT-1 o dicha secuencia codificadora de MORT-1 comprende al menos esa parte de la proteína MORT-1 que se une específicamente al FAS-IC, o al menos esa parte de la secuencia codificadora de MORT-1 que codifica esa parte de la proteína MORT-1 que se une específicamente al FAS-IC;

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(x): un método para aislar e identificar una proteína capaz de unirse al dominio intracelular de FAS-R que comprende aplicar el procedimiento de hibridación tipo "southern" no estricta seguido de clonación por PCR, en el cual se usa una secuencia o partes de las mismas de acuerdo con la invención como sonda para unir secuencias de una genoteca de ADN genómico o ADNc, que tienen al menos homología parcial a eso, a continuación, dichas secuencias unidas se amplifican y se clonan mediante el procedimiento de PCR para proporcionar clones codificadores de proteínas que tienen al menos homología parcial con dichas secuencias de acuerdo con la invención.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para la modulación del efecto del ligando FAS sobre células que comprende, como ingrediente activo, cualquiera de lo siguiente: (i) una proteína MORT-1 de acuerdo con la invención, sus fragmentos biológicamente activos o mezclas de los mismos; (ii) un vector vírico animal recombinante que codifica una proteína capaz de unirse a un receptor de superficie celular y que codifica una proteína MORT-1 o sus fragmentos biológicamente activos o análogos de acuerdo con la invención; e (iii) una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia antisentido de la secuencia de MORT-1 de la invención, en la que dicha secuencia de oligonucleótidos puede ser la segunda secuencia del vector vírico animal recombinante del anterior
punto (ii).

Se debería mencionar que MORT-1 tiene una región distinta que se une al FAS-IC y otra región distinta que está implicada en la autoasociación de MORT-1 y, por consiguiente, estas regiones distintas o partes de las mismas se pueden usar independientemente para identificar otras proteínas, receptores, etc, que sean capaces de unirse a MORT-1 o a FAS-R y que puedan estar implicadas en los procesos de señalización intracelular relacionados con MORT-1 o FAS-R. Además, MORT-1 puede tener otras actividades asociadas con o bien las anteriores regiones distintas u otras regiones de MORT-1 o combinaciones de las mismas, por ejemplo, actividad enzimática, lo cual puede estar relacionado con los efectos citotóxicos celulares de MORT-1 sobre sí mismos. Por tanto, MORT-1 también se puede usar para identificar específicamente otras proteínas, péptidos, etc., los cuales pueden estar implicados en tales actividades adicionales asociadas con MORT-1.

También se proporcionan otros aspectos y realizaciones de la presente invención ya que surgen de la siguiente descripción detallada de la invención.

Se debería señalar que, cuando se usa por toda la memoria, los siguientes términos: "Modulación del efecto del ligando FAS sobre las células"; y "Modulación del efecto de MORT-1 sobre las células" se entiende que abarcan el tratamiento in vitro así como in vivo.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 A y B son reproducciones de autorradiogramas de geles PAGE con SDS (acrilamida al 10%) que muestran la interacción entre HF1 (MORT-1) y FAS-IC in vitro. La Figura 1A muestra un autorradiograma control de un inmunoprecipitado de las proteínas (a partir de extractos de células HeLa sometidas a transfección con la proteína de la fusión FLAG-HF1 (FLAG-MORT-1) o con el ADNc de luciferasa (control)), realizándose la inmunoprecipitación con anticuerpo anti-FLAG; y

la Figura 1B muestra un autorradiograma de un gel representativo realizado para evaluar la interacción in vitro entre HF1 y FAS-IC a modo de valoración, de manera autorradiográfica, de la unión de HF1 marcada metabólicamente con [^{35}S]-metionina producida en células HeLa sometidas a transfección como una proteína de la fusión con el octapéptido FLAG (FLAG-MORT-1) a GST proteína de la fusión GST-FAS-IC de ratón y humana (GST-huFAS-IC, GST-mFAS-IC) y proteínas de la fusión GST-FAS-IC en las cuales el FAS-IC contenía una mutación de sustitución de Ile a Ala en la posición 225 (GST-mFAS-IC I225A). Las proteínas marcadas [^{35}S] de las células HeLa que incluyen la proteína de la fusión FLAG-MORT-1 marcada que se han extraído primero se sometieron a interacción con las diversas proteínas GST-FAS-IC y GST (unidas a gotas de glutatión) y, a continuación, a PAGE con SDS. Como controles en todos los experimentos de interacción, se sometieron los extractos de células HeLa sometidas a transfección con luciferasa a interacciones con las proteínas de la fusión GST-FAS-IC y GST y a PAGE con SDS. Las Figuras 1A y 1B también están descritas en el Ejemplo 1.

Fig. 2 A, B y C son reproducciones de autorradiogramas de geles PAGE con SDS (acrilamida al 10%) sobre los cuales se separaron diversos inmunoprecipitados de células HeLa sometidas a transfección y los cuales muestran la interacción in vivo de HF1 (MORT-1) con FAS-IC. Las células HeLa se sometieron a transfección con construcciones de ADN que codifican: sólo proteína de la fusión HF1-FLAG (FLAG-MORT-1), proteína de la fusión HF1-FLAG y el FAS-R humano (FLAG-MORT-1+Fas/APO1) o sólo el FAS-R humano (Fas/APO1) (Figura 2A); o con la proteína de la fusión HF1-FLAG y el p55R humano (FLAG-MORT-1+p55) (Figura 2B); o con la proteína de la fusión HF1-FLAG y una proteína de la fusión quimérica entre FAS-R humano y p55-R en la cual el dominio extracelular del FAS-R se sustituyó con la región correspondiente del p55-R (FLAG-MORT-1+quimera de p55-FAS) o sólo la proteína de la fusión quimérica FAS-R-p55-R (Figura. 2C). En todos los casos las células sometidas a transfección estaban marcadas metabólicamente con [^{35}S]cisteína (20 \muCi/ml) y [^{35}S]metionina (40 \muCi/ml), y se sometieron a extracción de proteína. A continuación, los extractos de proteína de las diferentes células sometidas a transfección se sometieron a inmunoprecipitación con diversos anticuerpos siendo los anticuerpos anti-FLAG, anti-FAS, anti-p75-R y anti-p55-R (\alphaFLAG, \alphaFAS, \alphap75-R y \alphap55-R en las Figuras 2A-C) y se sometieron a PAGE con SDS. En el lado izquierdo de la Figura 2A se indican las bandas proteicas correspondientes a FAS-R (Fas/APO1) y HF1-FLAG (FLAG-MORT-1); entre las Figuras 2A y B se muestran las posiciones relativas de los marcadores de peso molecular patrones (en kDa); y en el lado derecho de la Figura 2C se indican las bandas proteicas correspondientes a p55R y la quimera de p55-FAS. Las Figuras 2A-C también están descritas en el Ejemplo 1.

Fig. 3 muestra una reproducción de una transferencia tipo "Northern" en la cual se sondó el poli A^{+}ARN (0,3 \mug) de células HeLa sometidas a transfección con ADNc de HF1, tal como se describe en el Ejemplo 1.

Fig. 4 representa esquemáticamente el nucleótido preliminar y la secuencia de aminoácidos deducida de HF1, tal como se describe en el Ejemplo 1, en los cuales el "dominio de muerte" está subrayado ya que es un posible sitio de inicio de la traducción, es decir, el residuo de metionina subrayado en la posición 49 (M subrayada, en negrita). El asterisco indica el codón de parada de traducción (nucleótidos 769-771). Al comienzo y a la mitad de cada línea se proporcionan dos números que representan las posiciones relativas de los nucleótidos y los aminoácidos de la secuencia con respecto al comienzo de la secuencia (extremo 5'), en la cual el primer número denota el nucleótido y el segundo número denota el aminoácido.

Fig. 5 muestra los resultados de los experimentos para determinar el extremo C-terminal de MORT-1, en el que la Figura 5 es una reproducción de un autorradiograma de un gel PAGE con SDS (acrilamida al 10%) sobre el cual se separaron diversos productos de la fusión FLAG-MORT-1 expresados en células HeLa y marcados metabólicamente con ^{35}S-cisteína y ^{35}S-metionina seguido por inmunoprecipitación con o bien anticuerpos monoclonales anti-FLAG (M2)(líneas 2, 4 y 6) o como control, anticuerpos anti-TNF-R p75 (Nº 9) (líneas 1, 3 y 5), tal como se describe en el Ejemplo 1.

Fig. 6 (A y B) representa gráficamente el desencadenamiento independiente de ligando de los efectos citocidas en células sometidas a transfección con MORT-1, en el que se determinó la viabilidad celular o bien mediante el ensayo de consumo rojo neutro (Figura 6A), o para determinar específicamente la viabilidad de células que expresaron el ADN sometido a transfección, midiendo las cantidades de fosfatasa alcalina placentaria secretada en el medio (Figura 6B). Las células HeLa se sometieron a transfección con vectores de expresión controlados por tetraciclina que codifican HF1(MORT-1), FAS-IC humano, p55-IC humano, o luciferasa (control), y en todos los casos también con un ADNc que codifica la fosfatasa alcalina secretada, lo cual permitió la evaluación del efecto de la expresión transitoria de estas proteínas sobre la viabilidad de las células. En ambas Figuras 6A y 6B los gráficos abiertos representan las células sometidas a transfección crecidas en presencia de tetraciclina (1 \mug/ml, para bloquear la expresión) y los gráficos cerrados representan las células sometidas a transfección crecidas en ausencia de tetraciclina. Las Figuras 6A y B también están descritas en el Ejemplo 1.

Fig. 7 es una representación gráfica de los efectos de porciones diferentes de la proteína MORT-1 sobre los efectos citotóxicos celulares mediados por FAS-R, tal como se describe en el Ejemplo 1.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere, en un aspecto, a una novedosa proteína MORT-1(HF1) que es capaz de unirse al dominio intracelular del receptor FAS-R, un miembro de la superfamilia TNF/NGF y de ahí que se considere como un mediador o modulador de FAS-R, que tiene un papel en, por ejemplo, el proceso de señalización que se inicia mediante la unión del ligando FAS a FAS-R. Las secuencias de ADN y aminoácidos de MORT-1 de acuerdo con la invención también representan nuevas secuencias; no aparecen en los bancos de datos "GENEBANK" o "PROTEIN BANK" de secuencias de ADN o aminoácidos.

Por tanto, la presente invención se refiere a la secuencia de ADN que codifica la proteína MORT-1 y la proteína MORT-1 codificada por las secuencias de ADN.

Además, la presente invención también se refiere a las secuencias de ADN que codifican fragmentos biológicamente activos de la proteína MORT-1 y los fragmentos codificados de ese modo. La preparación de tales fragmentos es mediante procedimiento estándar (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989) en el cual en las secuencias de ADN que codifican la proteína MORT-1, uno o más codones se pueden someter a deleción, añadir o sustituir por otros, para producir análogos que tienen al menos un cambio de un residuo de aminoácidos con respecto a la proteína natural. Los análogos aceptables que se describen en la presente memoria son aquellos que retienen al menos la capacidad de unión al dominio intracelular del FAS-R, o que pueden mediar cualquier otra unión o actividad enzimática, por ejemplo, análogos que se unen al FAS-IC pero que no señalan, es decir, no se unen a un receptor más en dirección 3', proteína u otro factor, o no catalizan una reacción dependiente de señal. De tal modo se pueden producir análogos que tengan un llamado efecto negativo dominante, principalmente, un análogo que es defectuoso o bien en la unión al FAS-IC o en la posterior señalización que sigue a tal unión. Tales análogos se pueden usar, por ejemplo, para inhibir el efecto del ligando FAS compitiendo con las proteínas naturales de la unión a FAS-IC. Asimismo, se pueden producir análogos llamados positivos dominantes los cuales servirían para aumentar el efecto del ligando FAS. Estos tendrían las mismas o mejores propiedades de unión a FAS-IC y las mismas o mejores propiedades de señalización de las proteínas naturales de la unión a FAS-IC. De un modo análogo, los fragmentos biológicamente activos de MORT-1 se pueden preparar tal como se ha señalado anteriormente con respecto a los análogos de MORT-1. Los fragmentos adecuados de MORT-1 son aquellos que retienen la capacidad de unión a FAS-IC o que pueden mediar cualquier otra unión o actividad enzimática tal como se ha señalado anteriormente. Por consiguiente, se pueden preparar los fragmentos MORT-1 los que tienen un efecto negativo dominante o un efecto positivo dominante tal como se ha señalado anteriormente con respecto a los análogos. Se debería señalar que estos fragmentos representan una clase especial de los análogos de la invención, principalmente, son porciones definidas de MORT-1 derivadas de la secuencia entera de MORT-1, teniendo cada porción o fragmento cualquiera de las actividades deseadas anteriormente señaladas. Igualmente, los derivados que se describen en la presente memoria se pueden preparar mediante modificaciones estándar de los grupos laterales de uno o más residuos de aminoácidos de la proteína MORT-1, sus análogos o fragmentos, o mediante conjugación de la proteína MORT-1, sus análogos o fragmentos, a otra molécula, por ejemplo, un anticuerpo, enzima, receptor, etc. ya que son muy conocidos en la técnica.

La nueva proteína MORT-1 o sus fragmentos tienen un número de posibles usos, por ejemplo:

(i): Se pueden usar para imitar o aumentar la función del ligando de FAS-R, en situaciones en las que se desea un efecto del ligando de FAS-R aumentado tal como en aplicaciones antitumorales, anti-inflamatorias o anti-VIH en las que se desea la citotoxicidad inducida por ligando de FAS-R. En este caso se puede introducir la proteína MORT-1 o sus fragmentos que aumentan el efecto del ligando de FAS-R, es decir, el efecto citotóxico, a las células mediante procedimientos estándar conocidos per se. Por ejemplo, ya que la proteína MORT-1 es intracelular y se debería introducir solamente en las células en las que se desee el efecto del ligando de FAS-R, es necesario un sistema para la introducción específica de esta proteína en las células. Un modo de hacer esto es creando un virus animal recombinante, por ejemplo, uno derivado de Vaccinia, a cuyo ADN se introducirán los dos siguientes genes: el gen que codifica un ligando que se une a proteínas de superficie celular específicamente expresado por las células, por ejemplo, uno tal como la proteína gp120 del virus del SIDA (VIH) que se une específicamente a algunas células (linfocitos CD4 y leucemias relacionadas) o cualquier otro ligando que se une específicamente a células que portan de un FAS-R, de modo que el vector vírico recombinante será capaz de unirse a tales células portadoras de FAS-R; y el gen que codifica la proteína MORT-1. Por tanto, la expresión de la proteína de unión de superficie celular sobre la superficie de los virus dirigirá el virus específicamente a la célula tumoral u otra célula portadora de FAS-R, después de lo cual se introducirá la secuencia codificadora de la proteína MORT-1 en las células vía el virus, y una vez expresada en las células dará como resultado el aumento del efecto del ligando de FAS-R que conducirá a la muerte de las células tumorales u otras células portadoras de FAS-R que se desean destruir. La construcción de tal virus animal recombinante es mediante procedimientos estándar (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989). Otra posibilidad es introducir las secuencias de la proteína MORT-1 en forma de oligonucleótidos que se pueden absorber por las células y expresar allí. Una posibilidad adicional es modificado el método descrito por Lin et al., en Journal of Biological Chemistry, Vol. 270, Nº 24, pp. 14.255-14.258, 1995.

(ii): Se pueden usar para inhibir el efecto del ligando de FAS-R, por ejemplo, en casos tal como daño tisular en el choque séptico, rechazo hospedante contra injerto o hepatitis aguda, en los cuales se desea bloquear la señalización intracelular de FAS-R inducida por el ligando de FAS-R. En esta situación es posible, por ejemplo, introducir en las células, mediante procedimientos estándar, oligonucleótidos que tienen la secuencia codificadora antisentido para la proteína MORT-1, lo cual bloquearía eficazmente la traducción de los ARNm que codifican la proteína MORT-1 y de ese modo bloquear su expresión y conducir a la inhibición del efecto del ligando de FAS-R. Se pueden introducir tales oligonucleótidos en las células usando el anterior enfoque de virus recombinante, siendo la segunda secuencia portada por el virus la secuencia de oligonucleótidos.

: Otra posibilidad es usar anticuerpos específicos para la proteína MORT-1 para inhibir su actividad de señalización intracelular.

: Otro modo de inhibir el efecto del ligando de FAS-R es mediante el enfoque de ribozima recién desarrollado: las Ribozimas son moléculas de ARN catalíticas que escinden específicamente los ARNs. Las ribozimas se pueden crear in vitro para escindir ARNs diana de elección, por ejemplo, los ARNm que codifican la proteína MORT-1 de la invención. Tales ribozimas tendrían una secuencia específica para el ARNm de MORT-1 y serían capaces de interactuar con ella (unión complementaria) seguido de escisión del ARNm, dando como resultado una disminución (o pérdida completa) en la expresión de la proteína MORT-1, siendo el nivel de expresión disminuida dependiente del nivel de expresión de ribozima en la célula diana. Para introducir las ribozimas en las células de elección (por ejemplo, las que portan FAS-R) se puede usar cualquier vector adecuado, por ejemplo, plásmido, vectores víricos animales (retrovirus), que normalmente se usan con este propósito (véase también el punto (i) anterior, en el que el virus tiene, como segunda secuencia, un ADNc que codifica la secuencia de ribozima de elección) (Para revisiones, métodos, etc. concernientes a ribozimas véase Chen et al., 1992; Zhao y Pick, 1993; Shore et al., 1993; Joseph y Burke, 1993; Shimayama et al., 1993; Cantor et al., 1993; Barinaga, 1993; Crisell et al., 1993 y Koizumi et al., 1993).

(iii): Se pueden usar para aislar, identificar y clonar otras proteínas que sean capaces de unirse a ellos, por ejemplo, otras proteínas implicadas en el proceso de señalización intracelular que están en dirección 3' del dominio intracelular de TNF-R o FAS-R. Por ejemplo, la proteína MORT-1, principalmente, la secuencia de ADN que la codifica se puede usar en el sistema de doble híbrido en levadura (Véase Ejemplo 1, a continuación) en el cual la secuencia de la proteína MORT-1 se usará como "cebo" para aislar, clonar e identificar a partir de genotecas de ADN genómico o ADNc otras secuencias ("presas") que codifican proteínas que pueden unirse a la proteína MORT-1. Del mismo modo, también se puede determinar si la proteína MORT-1 de la presente invención puede unirse a otras proteínas celulares, por ejemplo, otros receptores de la superfamilia de receptores TNF/NGF.

(iv): La proteína MORT-1 o sus fragmentos se pueden usar para aislar, identificar y clonar otras proteínas de la misma clase, es decir, las que se unen al dominio intracelular de FAS-R o a los receptores funcionalmente relacionados, y se implican en el proceso de señalización intracelular. En esta aplicación se puede usar el sistema de doble híbrido en levadura anteriormente señalado, o se puede usar un sistema recién desarrollado que emplea la hibridación tipo "southern" no estricta seguida de clonación por PCR (Wilks et al., 1989). En la publicación de Wilks et al., se describe la identificación y clonación de dos tirosin quinasas de la proteína putativa mediante la aplicación de hibridación tipo "southern" no estricta seguida por clonación por PCR basada en la secuencia conocida del motivo de quinasa, una secuencia de quinasa concebida. Se puede usar este enfoque de acuerdo con la presente invención usando la secuencia de la proteína MORT-1 para identificar y clonar las de las proteínas de unión al dominio intracelular de FAS-R relacionadas.

(v): Otro enfoque para utilizar la proteína MORT-1 o sus fragmentos de la invención es usarlos en métodos de cromatografía de afinidad para aislar e identificar otras proteínas o factores a los cuales son capaces de unirse, por ejemplo, otros receptores relacionados con FAS-R u otras proteínas o factores implicados en el proceso de señalización intracelular. En esta aplicación, la proteína MORT-1 o sus fragmentos de la presente invención, se pueden unir individualmente a matrices de cromatografía de afinidad y, a continuación, entrar en contacto con extractos celulares o proteínas aisladas o factores sospechosos de estar implicados en el proceso de señalización intracelular. Después del procedimiento de cromatografía de afinidad, se pueden eluir, aislar y caracterizar las otras proteínas o factores que se unen a la proteína MORT-1 o fragmentos de la invención.

(vi): Tal como se ha señalado anteriormente, la proteína MORT-1 o sus fragmentos de la invención también se pueden usar como inmunogenes (antígenos) para producir anticuerpos específicos a ellos. Estos anticuerpos también se pueden usar con propósito de purificación de la proteína MORT-1 o bien a partir de extractos celulares o de líneas celulares transformadas que producen MORT-1, sus análogos o fragmentos. Además, estos anticuerpos se pueden usar con propósito de diagnóstico para identificar trastornos relacionados con el funcionamiento anormal del sistema del ligando de FAS-R, por ejemplo, efectos celulares inducidos por el ligando de FAS-R sobreactivo o poco activo. Por tanto, tales trastornos deberían estar relacionados con un sistema de señalización intracelular que funciona mal que implica a la proteína MORT-1, tales anticuerpos servirían como una importante herramienta de diagnóstico.

(vii): MORT-1 también se puede usar como un modulador indirecto de un número de otras proteínas por la ventaja de su capacidad de unión a otras proteínas intracelulares, (las proteínas de unión llamadas MORT-1, véase a continuación), dichas otras proteínas intracelulares se unen directamente incluso a otras proteínas intracelulares o a un dominio intracelular de una proteína de transmembrana. Un ejemplo de tal proteína o tal dominio intracelular es el muy conocido receptor de TNF p55, cuya señalización intracelular está modulada por un número de proteínas que se unen directamente a su dominio intracelular (véase el documento IL 109632 en tramitación con la presente invención). De hecho hemos aislado tal proteína de unión MORT-1 (véase a continuación y el Ejemplo 2) la cual se une al dominio intracelular del receptor de TNF p55.

: Con el propósito de modular estas otras proteínas intracelulares o los dominios intracelulares de proteínas de transmembrana, se puede introducir MORT-1 en las células de varios modos tal como los mencionados anteriormente en la presente invención en el punto (ii).

También se debería señalar que el aislamiento, identificación y caracterización de la proteína MORT-1 de la invención se puede realizar usando cualquiera de los procedimientos de selección ("screening") estándar muy conocidos. Por ejemplo, uno de estos procedimientos de selección, el procedimiento de doble híbrido en levadura tal como se explica en la presente memoria (Ejemplo 1), se usó para identificar la proteína MORT-1 de la invención. Asimismo, tal como se ha señalado anteriormente y a continuación, se pueden emplear otros procedimientos tales como la cromatografía de afinidad, los procedimientos de hibridación de ADN, etc. ya que son muy conocidos en la técnica, para aislar, identificar y caracterizar la proteína MORT-1 de la invención o para aislar, identificar y caracterizar proteínas, factores, receptores adicionales, etc. los cuales son capaces de unirse a la proteína MORT-1 de la invención.

Además, también se debería señalar que entre las características de MORT-1 esta su capacidad para unirse al FAS-IC y también su capacidad para autoasociarse. MORT-1 es también capaz de activar la citotoxicidad celular sobre sí misma, una actividad relacionada con su capacidad de autoasociación. Parece (véase el Ejemplo 1) que la parte de MORT-1 que se une al FAS-IC es distinta de la parte de MORT-1 que está implicada en su autoasociación. MORT-1 también puede tener otras actividades que pueden ser una función de las distintas partes anteriormente señaladas de la molécula de MORT-1 u otras partes de la molécula o combinaciones de cualquiera de estas partes. Estas otras actividades pueden ser enzimáticas o estar relacionadas con la unión a otras proteínas (por ejemplo, proteínas de unión a MORT-1 u otros receptores, factores, etc.). Por tanto, MORT-1 puede ser usada en los anteriores métodos para la modulación de los efectos del ligando de FAS-R o sus efectos celulares mediados por la propia MORT-1, o se puede usar en la modulación de otros procesos de señalización celular relacionados con otros receptores, factores, etc.

Más específicamente, mediante este aspecto de la invención la propia molécula de ADN codificadora de MORT-1 y mutaciones de la misma (es decir, análogos codificadores o fracciones activas de MORT-1) se pueden usar para terapia genética (es decir, mediante los modos explicados en los usos anteriores (i) e (ii)) para modular la actividad del FAS-R (o modular o mediar el efecto del ligando FAS sobre células). Además, ya que MORT-1 también tiene un efecto citotóxico sobre las células, estas moléculas de ADN codificadoras de MORT-1 mutante o MORT-1 también se pueden usar para terapia genética para modular el efecto de MORT-1 en células (también por los usos anteriores (i) e (ii)). En estas aplicaciones de terapia genética, se puede usar la MORT-1 de tres modos:

(a) se pueden usar toda la proteína MORT-1 o sus fragmentos activos que tienen capacidad de unión tanto a FAS-IC como a MORT-1 (es decir, contienen las dos regiones de MORT-1, una de las cuales está implicada en la unión a FAS-IC y la otra la cual está implicada en la autoasociación de MORT-1) para modular los efectos asociados a FAS-R y MORT-1;

(b) se pueden usar la parte de MORT-1 y los fragmentos activos de esta parte que se unen al FAS-IC para inducir un efecto "negativo dominante" sobre FAS-IC, es decir, la inhibición de los efectos celulares mediados por FAS-R, o se pueden usar para inducir un efecto de "ganancia de función" sobre FAS-IC, es decir, aumento de los efectos celulares mediados por FAS-R; y

(c) se pueden usar la parte de MORT-1 y las fracciones activas de esta parte que se unen específicamente a MORT-1 para la inducción de efectos "negativos dominantes" o de "ganancia de función" sobre MORT-1, es decir, o bien la inhibición o el aumento de los efectos celulares asociados a MORT-1.

Tal como se ha explicado en el anterior uso (vi), la proteína MORT-1 se puede usar para generar anticuerpos específicos a MORT-1. Estos anticuerpos o fragmentos de los mismos se pueden usar tal como se explica a continuación en la presente memoria en detalle, entendiéndose que en estas aplicaciones los anticuerpos o fragmentos de los mismos son los específicos para MORT-1.

En cuanto a los anticuerpos mencionados por toda la presente memoria, el término "anticuerpo" se supone que incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs, del Inglés "Monoclonal Antibodies"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) a anticuerpos que se pueden marcar de forma soluble o unida, así como fragmentos de los mismos proporcionados por cualquier técnica conocida, tal como, pero no se limita a, escisión enzimática, síntesis peptídica o técnicas recombinantes.

Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas de los sueros de animales inmunizados con un antígeno. Un anticuerpo monoclonal contiene una población sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos a antígenos, dichas poblaciones contienen sitios de unión a epítopo sustancialmente similares. Se pueden obtener mAbs mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); el documento de Patente U.S. Nº 4.376.110; Ausubel et al., eds., Harlow and Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); y Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene publishing Assoc. y Wiley Interscience N.Y., (1992, 1993), los contenidos de dichas referencias están incorporados enteramente en la presente memoria como referencia. Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier subclase de las mismas. Se puede cultivar in vitro, in situ o in vivo un hibridoma que produce un mAb de la presente invención. La producción de títulos altos de mAbs in vivo o in situ hace de éste el método de producción actualmente preferido.

Los anticuerpos quiméricos son porciones diferentes de moléculas de las cuales se derivan de especies diferentes de animales, tal como las que tienen la región variable derivada de un mAb de murina y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos principalmente se usan para reducir la inmunogenicidad en la aplicación y para incrementar los rendimientos en la producción, por ejemplo, cuando los mAbs de murina tienen mayores rendimientos a partir de hibridomas pero mayor inmunogenicidad en humanos, se usan tales mAbs quiméricos de humano/murina. Los anticuerpos quiméricos y los métodos para su producción son conocidos en la técnica (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3.273-3.277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6.851-6.855 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646 (1984); Cabilly et al., Solicitud de Patente Europea 125023 (publicada el 14 de Noviembre de 1984); Neuberger et al., Nature 314:268-270 (1985); Taniguchi et al., Solicitud de Patente Europea 171496 (publicada el 19 de Febrero de 1985); Morrison et al., Solicitud de Patente Europea 173494 (publicada el 5 de Marzo de 1986); Neuberger et al., Solicitud PCT WO 8601533, (publicada el 13 de Marzo de 1986); Kudo et al., Solicitud de Patente Europea 184187 (publicada el 11 de Junio de 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1.066-1.074 (1986); Robinson et al., Solicitud de Patente Internacional Nº WO 8702671 (publicada el 7 de Mayo de 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3.439-3.443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:214-218 (1987); Better et al., Science 240:1.041-1.043(1988); y Harlow y Lane, ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL, supra.

Un anticuerpo anti-idiotípico (anti-Id) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos generalmente asociados con el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo. Se puede preparar un anticuerpo Id inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo, raza de ratón) como la fuente del mAb con el mAb para el cual se está preparando un anti-Id. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo de inmunización produciendo un anticuerpo para estos determinantes idiotópicos (el anticuerpo anti-Id). Véase, por ejemplo, el documento de Patente U.S Nº 4.699.880.

El anticuerpo anti-Id también se puede usar como un "inmunogen" para inducir una respuesta inmune en incluso otro animal, produciendo un anticuerpo llamado anti-anti-Id. El anti-anti-Id puede ser idéntico de manera epitópica al mAb original el cual indujo el anti-Id. Por tanto, usando los anticuerpos para los determinantes idiotópicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresen anticuerpos de idéntica especificidad.

Por consiguiente, los mAbs generados contra la proteína MORT-1 o fragmentos de la misma de la presente invención se pueden usar para inducir anticuerpos anti-Id en los animales adecuados, tal como ratones BALB/c. Se usan células del bazo de tales ratones inmunizados para producir hibridomas de anti-Id que secreten mAbs anti-Id. Además, los mAbs anti-Id se pueden acoplar a un vehículo tal como la hemocianina de lapa Keyhole (KLH, del Inglés
"Keyhole Limpet Hemocyanin") y se usan para inmunizar más ratones BALB/c. Los sueros de estos ratones contendrán anticuerpos anti-anti-Id que tienen las propiedades de unión del mAb original específico para un epítopo de la anterior proteína MORT-1, análogos, fragmentos o derivados.

Por tanto, los mAbs anti-Id tienen sus propios epítopos idiotípicos, o "idiotopos", estructuralmente similares al epítopo que se evalúa, tal como la proteína \alpha GRB. El término "anticuerpo" también se supone que incluye tanto moléculas intactas así como fragmentos de las mismas, tal como, por ejemplo, Fab y F(ab')_{2}, los cuales son capaces de unirse al antígeno. Los fragmentos Fab y F(ab')_{2} carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan de la circulación más rápidamente, y puede tener menos unión a tejido no específico que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)).

Se apreciará que Fab y F(ab')_{2} y otros fragmentos de los anticuerpos útiles en la presente invención se pueden usar para la detección y cuantificación de la proteína MORT-1 de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria para moléculas de anticuerpo intacto. Tales fragmentos generalmente se producen mediante escisión proteolítica, usando enzimas tales como papaina (producir fragmentos Fab) o pepsina (producir fragmentos F(ab')_{2}).

Se dice que un anticuerpo es "capaz de unirse" a una molécula si es capaz de reaccionar específicamente con la molécula para de ese modo unir la molécula al anticuerpo. El término "epítopo" se supone que se refiere a esa porción de cualquier molécula capaz de unirse mediante un anticuerpo el cual también se puede reconocer mediante ese anticuerpo. Los epítopos o "determinantes antigénicos" normalmente consisten en agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas tales como cadenas laterales de azúcares o aminoácidos y tienen tres características estructurales dimensionales específicas así como características de carga específica.

Un "antígeno" es una molécula o una porción de una molécula capaz de unirse mediante un anticuerpo el cual es además capaz de inducir un animal para producir anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más de un epítopo. La reacción específica anteriormente mencionada se supone que indica que el antígeno reaccionará, de una manera altamente selectiva, con su correspondiente anticuerpo y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden ser provocados por otros antígenos.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de anticuerpos, útiles en la presente invención se pueden usar para detectar de cuantitativa o cualitativamente la MORT-1 en una muestra o para detectar la presencia de células que expresan la MORT-1 de la presente invención. Esto se puede efectuar mediante técnicas de inmunofluorescencia que emplean un anticuerpo marcado de manera fluorescente (véase a continuación) acoplado con detección microscópica de luz, citométrica de flujo o fluorométrica.

Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) útiles en la presente invención se pueden emplear de manera histológica, como en microscopía de inmunofluorescencia o inmunoelectrón, para la detección in situ de la MORT-1 de la presente invención. La detección in situ se puede efectuar extrayendo una muestra histológica de un paciente, y suministrando el anticuerpo marcado de la presente invención a dicha muestra. El anticuerpo (o fragmento) preferiblemente se suministra aplicando o cubriendo con el anticuerpo marcado (o fragmento) a una muestra biológica. A través del uso de tal procedimiento, es posible determinar no solamente la presencia de la MORT-1, sino también su distribución en el tejido examinado. Usando la presente invención, los expertos en la técnica fácilmente se darán cuenta que cualquiera de la amplia diversidad de métodos histológicos (tal como procedimientos de tinción) se pueden modificar para alcanzar tal detección in situ.

Tales ensayos para la MORT-1 de la presente invención generalmente comprenden la incubación una muestra biológica, tal como un fluido biológico, un extracto de tejido, células recién recogidas tal como linfocitos o leucocitos, o células que se han incubado en cultivo de tejido, en presencia de un anticuerpo marcado de manera detectable capaz de identificar la proteína MORT-1, y la detección del anticuerpo mediante cualquiera de varias técnicas muy conocidas en la técnica.

La muestra biológica se puede tratar con un soporte o vehículo en fase sólida tal como nitrocelulosa, u otro soporte o vehículo sólido el cual es capaz de inmovilizar células, partículas celulares o proteínas solubles. A continuación, se puede lavar el soporte o vehículo con tampones adecuados seguido de tratamiento con un anticuerpo marcado de manera detectable de acuerdo con la presente invención, tal como se ha indicado anteriormente. A continuación, se puede lavar el soporte o vehículo en fase sólida con el tampón una segunda vez para extraer el anticuerpo sin unir. A continuación, se puede detectar la cantidad de marcador unido sobre dicho soporte o vehículo sólido mediante medios convencionales.

Por "soporte en fase sólida", "vehículo en fase sólida", "soporte sólido", "vehículo sólido", "soporte" o "vehículo" se entiende cualquier soporte o vehículo capaz de unir antígeno o anticuerpos. Los soportes o vehículos bien conocidos incluyen cristal, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, amilasas nailon, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser o bien soluble hasta cierto punto o insoluble para los propósitos de la presente invención. El material de soporte puede tener virtualmente cualquier configuración estructural posible siempre que la molécula acoplada sea capaz de unirse a antígeno o anticuerpo. Por tanto, la configuración del soporte o vehículo puede ser esférica, como en una gota, cilíndrica, como en la superficie interna de un tubo de ensayo, o la superficie externa de una caña. Si no, la superficie puede ser plana tal como una lámina, una tira de ensayo, etc. Los soportes preferidos o vehículos incluyen gotas de poliestireno. Los expertos en la técnica conocerán otros vehículos adecuados para la unión a anticuerpo o antígeno, o serán capaces de establecer lo mismo mediante el uso de la experimentación de rutina.

La actividad de unión de muchos anticuerpos dados, de la invención tal como se ha señalado anteriormente, se puede determinar de acuerdo con métodos muy conocidos. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar las condiciones de ensayo opcionales y operativas para cada determinación mediante el empleo de experimentación de rutina.

Se pueden añadir otras etapas tal como lavar, remover, agitar, filtrar y similares a los ensayos ya que es habitual o necesario para la situación particular.

Uno de los modos en los que se puede marcar de manera detectable un anticuerpo de acuerdo con la presente invención es conectando el mismo con una enzima y usar en un inmunoensayo de enzima (EIA, del Inglés "Enzyme Immunoassay"). Esta enzima, sucesivamente, si se expone más tarde a un sustrato apropiado, reaccionará con el sustrato de tal manera para producir un resto químico que se puede detectar, por ejemplo, mediante espectrofotometría, fluorometría o mediante medios visuales. Las enzimas que se pueden usar para marcar de manera detectable al anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, malato deshidrogenasa, nucleasa estafilococal, delta-5-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa en levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolin-esterasa. La detección se puede efectuar mediante métodos colorímetros los cuales emplean un sustrato cromogénico para la enzima. La detección también se puede efectuar mediante comparación visual del alcance de la reacción enzimática de un sustrato en comparación con patrones preparados de manera similar.

La detección se puede efectuar usando cualquiera de una diversidad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, marcando radiactivamente de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, es posible detectar R-PTPasa a través del uso de un radioinmunoensayo (RIA, del Inglés "Radioimmunoassay"). Una buena descripción del RIA se puede encontrar en Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, por Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) con particular referencia al capítulo titulado "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" por Chard, T., incorporado como referencia en la presente memoria. Se puede detectar el isótopo radio-
activo mediante tales medios como el uso de un contador \gamma o un contador de centelleo o mediante autorradiografía.

También es posible marcar un anticuerpo de acuerdo con la presente invención con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado de manera fluorescente se expone a la luz de la longitud de onda apropiada, a continuación, se puede detectar su presencia debido a la fluorescencia. Entre los compuestos de marcaje fluorescente más comúnmente usados están: isotiocianato de fluoresceina, rodamina, ficoeritrina, picocianina, aloficocianina,
o-ftaldehido y fluorescamina.

El anticuerpo también se puede marcar de manera detectable usando metales que emiten fluorescencia tal como ^{152}E, u otros de la serie de lantanida. Estos metales se pueden unir al anticuerpo usando tales grupos quelantes de metal como el ácido dietilentriamina pentaacético (DTPA, del Inglés "Diethylenetriamine pentaacetic acid").

El anticuerpo también se puede marcar de manera detectable acoplándolo a un compuesto quimioluminiscente. A continuación, se determina la presencia del anticuerpo etiquetado quimioluminiscente detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el transcurso de una reacción química. Ejemplos de compuestos de marcaje quimioluminiscente particularmente útiles son luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.

Asimismo, se puede usar un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrada en sistemas biológicos en los cuales una proteína catalítica incrementa la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Compuestos bioluminiscentes importantes para los propósitos de marcaje son luciferina, luciferasa y aequorin.

Una molécula de anticuerpo de la presente invención se puede adaptar para la utilización en un ensayo inmunométrico, también conocido como un ensayo "dos sitios" o tipo "sándwich". En un ensayo inmunométrico típico, se une una cantidad de anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) sin marcar a un soporte o vehículo sólido y se añade una cantidad de anticuerpo soluble marcado de manera detectable para permitir la detección y/o cuantificación del complejo ternario formado entre anticuerpo en fase sólida, antígeno y anticuerpo marcado.

Los ensayos inmunométricos típicos, y preferidos, incluyen ensayos "directos" en los cuales el anticuerpo unido a la fase sólida se pone en contacto primero con la muestra a ser ensayada para extraer el antígeno de la muestra mediante la formación de un complejo binario antígeno -anticuerpo en fase sólida. Después de un periodo de incubación adecuado, se lava el soporte o vehículo sólido para separar el residuo de la muestra fluida, que incluye el antígeno sin reaccionar, si hay alguno, y se pone en contacto con la disolución que contiene una cantidad desconocida de anticuerpo marcado (el cual funciona como "molécula informativa"). Después de un segundo periodo de incubación para permitir al anticuerpo marcado formar un complejo con el antígeno unido al soporte o vehículo sólido a través del anticuerpo sin marcar, se lava el soporte o vehículo sólido una segunda vez para separar el anticuerpo marcado sin reaccionar.

En el otro tipo de ensayo tipo "sándwich", el cual también puede ser útil con los antígenos de la presente invención, se usan los ensayos llamados "simultáneo" e "inverso". Un ensayo simultáneo implica una sola etapa de incubación ya que el anticuerpo unido al soporte o vehículo sólido y el anticuerpo marcado se añaden ambos a la muestra a ser ensayada a la vez. Después de que se complete la incubación, se lava el soporte o vehículo sólido para separar el residuo de la muestra fluida y el anticuerpo marcado sin formar complejo. A continuación, se determina la presencia de anticuerpo marcado asociado con el soporte o vehículo sólido tal como sería en un ensayo tipo sándwich "directo" convencional.

En el ensayo "inverso", se utiliza la adición gradualmente primero de una disolución de anticuerpo marcado a la muestra fluida seguido de la adición de anticuerpo sin marcar unido a un soporte o vehículo sólido después de un periodo de incubación adecuado. Después de una segunda incubación, se lava la fase sólida de manera convencional para liberarlo del residuo de la muestra a ensayar y la disolución del anticuerpo marcado sin reaccionar. A continuación, la determinación del anticuerpo marcado asociado con un soporte o vehículo sólido se determina tal como en los ensayos "simultáneos" y "directos".

Entonces, la MORT-1 de la invención se puede producir mediante cualquier procedimiento de ADN recombinante estándar (véase, por ejemplo, Sambrook, et al., 1989) en el cual las células hospedantes eucariotas o procariotas adecuadas se transforman mediante vectores eucariotas o procariotas apropiados que contienen las secuencias codificadoras para las proteínas. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a tales vectores de expresión y hospedantes transformados para la producción de las proteínas de la invención. Tal como se ha mencionado anteriormente, estas proteínas también incluyen sus fragmentos biológicamente activos y, por tanto, los vectores que los codifican también incluyen vectores que codifican fragmentos de estas proteínas, y los hospedantes transformados incluyen aquellos que producen tales fragmentos. Los derivados descritos en la presente memoria son derivados producidos por modificación estándar de las proteínas o sus análogos o fragmentos, producidos por los hospedantes transformados.

La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden vectores víricos animales recombinantes que codifican la proteína MORT-1, dicho vector también codifica una proteína de superficie vírica capaz de unirse a proteínas de superficie de la célula diana específica (por ejemplo, células cancerosas) para dirigir la inserción de la secuencia de MORT-1 en las células. Otros aspectos de la invención se verán claramente a partir de los siguientes Ejemplos.

A continuación, se describirá la invención en más detalle en los siguientes Ejemplos no limitantes y los dibujos adjuntos:

Ejemplo 1 Clonación y aislamiento de la proteína MORT-1 la cual se une al dominio intracelular del FAS-R (i) Selección de doble híbrido y ensayo de la expresión de \beta-galactosidasa doble híbrido

Para aislar proteínas que interactúan con el dominio intracelular del FAS-R, se usó el sistema de doble híbrido en levadura (Fields y Song, 1989; véase también los documentos IL 109632, 112002 y 112692 en tramitación con la presente). En resumen, este sistema de doble híbrido es un ensayo genético basado en levadura para detectar interacciones proteína-proteína específicas in vivo mediante el restablecimiento de un activador transcripcional eucariota tal como GAL4 que tiene dos dominios separados, una unión a ADN y un dominio de activación, dichos dominios cuando se expresan y se unen juntos para formar una proteína GAL4 restablecida, es capaz de unirse a una secuencia de activación en dirección 5' que activa sucesivamente un promotor que controla la expresión de un gen informativo, tal como lacZ o HIS3, cuya expresión es fácilmente observada en las células cultivadas. En este sistema los genes para las proteínas de interacción candidatas se clonan en vectores de expresión separados. En un vector de expresión la secuencia de la proteína candidata uno se clona en fase con la secuencia del dominio de unión a ADN de GAL4 para generar una proteína híbrida con el dominio de unión a ADN de GAL4, y en el otro vector la secuencia de la segunda proteína candidata se clona en fase con la secuencia del dominio de activación de GAL4 para generar una proteína híbrida con el dominio de activación de GAL4. A continuación, los vectores doble híbridos se transforman conjuntamente en una cepa hospedante de levadura, aquellas células hospedantes transformadas (cotransformantes) en las cuales se expresan las proteínas doble híbridas y son capaces de interactuar unas con otras, serán capaces de la expresión del gen informativo. En el caso del gen informativo lacZ, las células hospedantes que expresan este gen se volverán azules de color cuando se añada X-gal a los cultivos. De ahí que las colonias azules sean indicativas del hecho de que las dos proteínas candidatas clonadas son capaces de interactuar una con otra.

Usando este sistema de doble híbrido, se clonó el dominio intracelular, FAS-IC, por separado, en el vector pGBT9 (que porta la secuencia de unión a ADN de GAL4, proporcionada por CLONTECH, USA, véase a continuación), para crear proteínas de fusión con el dominio de unión a ADN de GAL4. Para la clonación de FAS-R en pGBT9, se usó un clon que codifica la secuencia de ADNc completa de FAS-R (véase el documento IL 111125 en tramitación con la presente) a partir del cual se extrae el dominio intracelular (IC) mediante procedimientos estándar usando diversas enzimas de restricción y, a continuación, se aísla mediante procedimientos estándar y se inserta en el vector pGBT9 abierto, en su región de sitio de clonación múltiple (MCS, del Inglés "Multiple Cloning Site"), con las correspondientes enzimas de restricción adecuadas. Se debería señalar que el FAS-IC se extiende entre los residuos 175-319 del FAS-R intacto, siendo esta porción que contiene los residuos 175-319 el FAS-IC insertado en el vector pGBT9 (véase también el documento IL 111125).

A continuación, se sometió a transfección conjunta el anterior vector híbrido (quimérico) junto con una genoteca de ADNc de células HeLa humanas clonada en el vector pGAD GH, que porta el dominio de activación GAL4, en la cepa hospedante de levadura HF7c (todos los vectores anteriormente señalados, pGBT9 y pGAD GH que portan la genoteca de ADNc de la célula HeLa, y la cepa de levadura se adquirieron de Clontech Laboratories, Inc., USA, como una parte del Sistema de Doble Híbrido de MATCHMAKER, NºPT1265-1). Se seleccionaron las levaduras sometidas a transfección conjunta por su capacidad para crecer en medio carente de Histidina (medio His^{-}), siendo las colonias que crecen indicativas de transformantes positivos. A continuación, se ensayó en los clones de levadura seleccionados su capacidad para expresar el gen lacZ, es decir, su actividad LACZ, y esto añadiendo X-gal al medio de cultivo, el cual se cataboliza para formar un producto coloreado azul por \beta-galactosidasa, la enzima codificada por el gen lacZ. Por tanto, las colonias azules son indicativas de un gen lacZ activo. Para la actividad del gen lacZ, es necesario que el activador de la transcripción GAL4 esté presente de una forma activa en los clones transformados, principalmente que el dominio de unión a ADN de GAL4 codificado por el anterior vector híbrido se combine apropiadamente con el dominio de activación de GAL4 codificado por el otro vector híbrido. Tal combinación es solamente posible si las dos proteínas fusionadas a cada uno de los dominios de GAL4 son capaces de interactuar de manera estable (unión) una con otra. Por tanto, las colonias azules (LACZ^{+}) e His^{+} que se aislaron son colonias que han sido sometidas a transfección conjunta con un vector que codifica FAS-IC y un vector que codifica un productor proteico de origen celular de HeLa humana que es capaz de unirse de manera estable a FAS-IC.

Se aisló el ADN plásmido de las anteriores colonias de levadura LAC Z^{+} e His^{+} y se sometieron a electroporación en la cepa de E. coli HB101 mediante procedimientos estándar seguido de selección de transformantes resistentes a Ampicilina y Leu^{+}, siendo estos transformantes los que portan el vector pGAD GH híbrido el cual tiene tanto las secuencias codificadoras de Amp^{R} como Leu^{2}. Por lo tanto, tales transformantes son clones que portan las secuencias que codifican las proteínas recién identificadas capaces de unirse a FAS-IC. A continuación, se aisló el ADN plásmido de estas E. coli transformadas y se ensayó de nuevo:

(a) transformándolos de nuevo con el plásmido híbrido del dominio intracelular de FAS-R original (pGTB9 híbrido que porta el FAS-IC) en la cepa de levadura HF7 tal como se ha explicado anteriormente en la presente memoria. Como controles, se usaron vectores que portan secuencias codificadoras de proteína irrelevante, por ejemplo, pACT-lamin o sólo pGBT9 para la transformación conjunta con el plásmido codificador de proteína de unión a FAS-IC (es decir, MORT-1). A continuación, se ensayó el crecimiento sobre medio His^{-} sólo, o con diferentes niveles de 3-aminotriazola en las levaduras transformadas conjuntamente para; y

(b) transformando de nuevo el ADN plásmido y el plásmido híbrido de FAS-IC original y los plásmidos control descritos en el punto (a) en células hospedantes de levadura de la cepa SFY526 y determinando la actividad de LACZ^{+} (eficacia de la formación de \beta-gal, es decir, la formación de color azul).

Los resultados de los anteriores ensayos revelaron que el patrón de crecimiento de las colonias en medio His^{-} era idéntico al patrón de la actividad de LAC Z, valorado por el color de la colonia, es decir, las colonias His^{+} eran también LAC Z^{+}. Además, se valoró la actividad de LAC Z en cultivo líquido (condiciones de cultivo preferidas) después de la transfección de la unión a ADN de GAL4 y los híbridos del dominio de activación en los hospedantes de levadura SFY526 los cuales tienen una mejor capacidad de inducción de LAC Z con el activador de la transcripción GAL4 que el de las células hospedantes de levadura HF-7.

Usando el anterior procedimiento se identificó, aisló y caracterizó una proteína denominada HF1, y ahora también denominada MORT-1, del Inglés "Mediator of Receptor-induced Toxicity".

Además, también se debería mencionar que en varios de los anteriores ensayos de expresión de \beta-galactosidasa de doble híbrido, también se valoró la expresión de \beta-galactosidasa mediante un ensayo de filtro preferido. En la selección, se encontraron que 5 de aproximadamente 3x10^{6} ADNc contenían el inserto de MORT-1. A continuación, se secuenciaron los insertos de ADNc de MORT-1 clonado y así aislados usando procedimientos de secuenciación de ADN estándar. Se dedujo la secuencia de aminoácidos de MORT-1 a partir de la secuencia de ADN. La numeración del residuo en las proteínas codificadas por los insertos de ADNc son como en el banco de datos Swiss-Prot. Se produjeron mutantes por deleción mediante PCR, y mutantes puntuales mediante mutagénesis dirigida a oligonucleótidos (Current Protocols in Molec. Biol., 1994).

(ii) Expresión inducida, marcaje metabólico e inmunoprecipitación de proteínas

Se expresaron en células HeLa MORT-1, N-unida al octapéptido FLAG (FLAG-HF1; Eastman Kodak, New Heaven, Ct., USA), Fas-IC, FAS-R, p55-R, una quimera comprendida del dominio extracelular de p55-R (aminoácidos 1-168) fusionada al dominio intracelular y de transmembrana de FAS-R (aminoácidos 153-319), y la ADNc luciferasa la cual sirve como control. La expresión se llevó a cabo usando un vector de expresión controlado por tetraciclina, en un clon de célula HeLa (HtTA-1) que expresa un transactivador controlado por tetraciclina (Gossen y Bujard, 1992; tal como se describe en el documento PCT/US95/05854; véase también Boldin et al., 1995). Se realizó marcaje metabólico con [^{35}S]metionina y [^{35}S]cisteína (DUPONT, Wilmington, De., USA y Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra) 18 horas después de la transfección, mediante una incubación adicional de 4 horas a 37ºC en medio Eagle modificado de Dulbecco que carece de metionina y cisteína, pero complementado con suero de ternera fetal sometido a diálisis al 2%. A continuación, las células se sometieron a lisis en tampón RIPA (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, deoxicolato al 1%, SDS al 0,1% y EDTA 1 mM) y se aclaró previamente el lisado mediante incubación con antisuero de conejo irrelevante (3 \mul/ml) y gotas de Proteína G Sefarosa (Pharmacia, Uppsala, Suecia, 60 \mul/ml). La inmunoprecipitación se realizó mediante 1 hora de incubación a 4ºC de alícuotas de 0,3 ml del lisado con anticuerpos monoclonales de ratón (5 \mul/alícuota) frente al octapéptido FLAG (M2; Eastman Kodak), p55-R (Nº 18 y Nº 20; (Engelmann et al., 1990)), o FAS-R (ZB4; Kamiya Southand Oaks, Ca., USA), o con anticuerpos de ratón enfrentados a isotipo como control, seguido de una incubación adicional de 1 hora con gotas de Proteína G Sefarosa
(30 \mul/alícuota).

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(iii) Unión in vitro

Se produjeron las fusiones de Glutatión S-transferasa con el tipo natural o un Fas-IC mutado y se adsorbieron sobre las gotas de agarosa con glutatión (tal como se describe en los documentos IL 109632, 111125, 112002, 112692; véase también Boldin et al., 1995; Current protocols in molecular biology, 1994; Frangioni y Neel, 1993). Se evaluó la unión de la proteína de la fusión FLAG-HF1 metabólicamente marcada a GST-Fas-IC mediante la incubación de las gotas durante 2 horas a 4ºC con extractos de células HeLa, marcadas metabólicamente con [^{35}S]metionina (60 \muCi/ml), que expresan FLAG-HF1. Se prepararon los extractos en un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, NP-40 al 0,1%, ditiotreitol 1 mM, EDTA 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 20 \mug/ml de Aprotonina, 20 \mug/ml de Leupeptina, fluoruro de sodio 10 mM y vanadato de sodio 0,1 mM (1 ml por 5x10^{5} células).

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(iv) Valoración de la citotoxicidad desencadenada por la expresión inducida de HF1

Se insertaron HF1, Fas-IC, p55-IC y ADNc luciferasa en un vector de expresión controlado por tetraciclina y se sometieron a transfección a células HtTA-1 (una línea celular de HeLa) (Gossen y Bujard, 1992) junto con el ADNc de fosfatasa alcalina placentaria secretada, colocado bajo control del promotor SV40 (el vector pSBC-2 (Dirks et al., 1993)). Se valoró la muerte celular 40 horas después de la transfección, o bien mediante en ensayo de consumo de rojo neutral (Wallach, 1984) o, mediante la valoración específicamente de la muerte en aquellas células que expresan los ADNc sometidos a transfección, determinando las cantidades de fosfatasa alcalina placentaria (Berger et al., 1988) secretada al medio de crecimiento en las últimas 5 horas de incubación.

En otro conjunto de experimentos para analizar la región de la proteína MORT-1 (HF1) implicada en la unión al FAS-IC, se expresaron transitoriamente las siguientes proteínas en células HeLa que contiene un transactivador controlado por tetraciclina (HtTA-1), usando un vector de expresión controlado por tetraciclina (pUHD 10-3): sólo FAS-R humano; FAS-R humano así como la parte N-terminal de MORT-1 (aminoácidos 1-117, la "cabeza de MORT-1"); FAS-R humano así como la parte C-terminal de MORT-1, que contiene su región de homología de "dominio de muerte" (aminoácidos 130-245, la "MORT-1 DD", véase también el documento IL 112742); FLAG-55.11 (aminoácidos 309-900 de la proteína 55,11 fusionada en el terminal N al octapéptido FLAG, siendo la proteína 55.11 una proteína de unión específica a p55-IC, véase también el documento IL 109632). 12 horas después de la transfección, las células se sometieron a tripsina y se sembraron de nuevo a una concentración de 30.000 células/pocillo. Después de las 24 horas de incubación adicional, las células se trataron durante 6 horas con un anticuerpo monoclonal contra el dominio extracelular de FAS-R (anticuerpo monoclonal CH-11, Oncor) a diversas concentraciones (0,001-10 \mug/ml de anticuerpo monoclonal), en presencia de 10 g/ml de cicloheximida. A continuación, se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo de consumo de rojo neutral y se presentaron los resultados en términos de % de células viables en comparación con las células que se han incubado con sólo cicloheximida (en ausencia del anticuerpo monoclonal anti-FAS-R CH-11).

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(v) Análisis tipo "Northern" y de secuencia

Se aisló el poli A^{+} ARN del ARN total de las células HeLa (kit de ARNm Oligotex-dT, QIAGEN, Hilden, Alemania). Se realizó el análisis tipo "Northern" usando el ADNc de HF1 como sonda mediante métodos convencionales (tal como se describe en el documento PCT/US95/05854; véase también Boldin et al., 1995). Se determinó la secuencia de nucleótidos de MORT-1 (HF-1) en ambas direcciones mediante el método de terminación de la cadena
dideoxi.

Los resultados (tal como se muestran en la Tabla 1 y en las Figuras 1-7) obtenidos a partir de los anteriores procedimientos experimentales son los siguientes: el análisis de secuencia del ADNc de MORT-1 clonado mediante el procedimiento de doble híbrido indicó que codifica una novedosa proteína (véase a continuación). La aplicación del ensayo de doble híbrido más para evaluar la especificidad de la unión de esta proteína (MORT-1, del Inglés "Mediator of Receptor-Induced Toxicity") a Fas-IC, y definir la región particular en Fas-IC a la cual se une, condujo a los siguientes descubrimientos (Tabla 1): (a) la proteína se une tanto a Fas-IC humano como de ratón, pero no a otras diversas proteínas ensayadas, incluyendo tres receptores de la familia de receptor TNF/NGF (receptores de TNF p55 y p75 y CD40); (b) las mutaciones de sustitución en posición 225 (Ile) en el "dominio de muerte" de FAS-R, mostradas para suprimir la señalización tanto in vitro como in vivo (la mutación lpr^{cg} (Watanabe-Fukunaga et al., 1992; Itoh y Nagata, 1993)), también previenen la unión de MORT-1 al FAS-IC; (c) el sitio de unión a MORT-1 en FAS-R se da dentro del "dominio de muerte" de este receptor; y (d) MORT-1 se une a sí misma. Esta autounión, y la unión de HF1 a FAS-R implica regiones diferentes de la proteína: un fragmento de MORT-1 correspondiente a los residuos 1-117 se une a la MORT-1 completa, pero no se une ni a sí misma ni al FAS-IC. A la inversa, un fragmento que corresponde a los residuos 130-245 se une a FAS-R, incluso no se une a MORT-1 (Tabla 1). Además, se ve claramente a partir de los resultados en la Tabla 1 que la región de "dominio de muerte" de FAS-R es crítica para la autoasociación de FAS-IC, ya que es la región de "dominio de muerte" de p55-R para la autoasociación de p55-IC. Las deleciones sobre ambos lados de estos "dominios de muerte" no afectan a su capacidad de autoasociación mientras que, sin embargo, una deleción dentro de estos "dominios de muerte" afecta a la autoasociación. En el caso de MORT-1, la unión de MORT-1 a FAS-IC es también dependiente del "dominio de muerte" completo (entero) de FAS-R, mientras que, sin embargo, tampoco es dependiente de las regiones fuera de la región de "dominio de muerte" de FAS-R para la unión a FAS-IC.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Interacción de MORT-1 con FAS-IC y autoasociación de MORT-1 en levaduras transformadas: valoración mediante un ensayo de expresión de \beta-galactosidasa doble híbrido

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En la anterior Tabla 1 se representa la interacción de las proteínas codificadas por las construcciones del dominio de unión a ADN de Gal4 y del dominio de activación (pGBT9 y pGAD-GH) en levaduras SFY526 sometidas a transfección tal como se valoraron por el ensayo de filtro de expresión de \beta-galactosidasa. Las construcciones del dominio de unión a ADN incluían cuatro construcciones del Fas-IC humano, cuatro construcciones del Fas-IC de ratón que incluían dos construcciones completas que tenían mutaciones de sustitución Ile a Leu o Ile a Ala en la posición 225 (I225N e I225A, respectivamente), y tres construcciones de HF1 (MORT-1), todas estas construcciones se muestran esquemáticamente en el lado izquierdo de la tabla. Las construcciones del dominio de activación incluían tres construcciones de HF1, siendo la porción de HF1 como en las construcciones de dominio de unión a ADN; y una construcción de Fas-IC humana completa, siendo la porción de Fas-IC la misma que en la anterior construcción de dominio de unión a ADN. Los dominios intracelulares del receptor de TNF p55 humano (p55-IC, residuos 206-426), CD40 humana (CD40-IC, residuos 216-277) y receptor de TNF p75 humano (p75-IC, residuos 287-461) así como vectores de lamin, ciclina D y Gal4 "vacíos" (pGBT9) sirvieron como controles negativos en forma de construcciones de dominio de unión a ADN. SNF-1 y SNF4 sirvieron como controles positivos en forma de construcciones de dominio de unión a ADN (SNF1) y dominio de activación (SNF4). Los vectores Gal4 "vacíos" (pGAD-GH) también sirvieron como controles negativos en forma de construcciones de dominio de activación (para más detalles concernientes al p55-IC, p75-IC, véase también el documento PCT/US95/05854). Los símbolos "++" y "+" denotan el desarrollo del color oscuro en 30 y 90 minutos del ensayo, respectivamente; y "-" denota el no desarrollo del color en 24 horas. No se han ensayado las combinaciones para las cuales no se da resultado.

La expresión de las moléculas de HF1 (MORT-1) fusionadas en su terminal N con el octapéptido FLAG (FLAG-HF1) produjo en células HeLa proteínas de cuatro tamaños distintos, aproximadamente 27, 28, 32 y 34 kD. En la Figura 1 (A y B) se muestra los resultados que demuestran la interacción de HF1 con Fas-IC in vitro. Tal como se ha señalado anteriormente en la descripción de las Figuras 1A y B, la Figura 1A es una reproducción de un autorradiograma control de un inmunoprecipitado de proteínas a partir de extractos de células HeLa sometidas a transfección con la proteína de la fusión FLAG-HF1 (FLAG-MORT-1) o con ADNc luciferasa como control, realizándose la inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-FLAG (\alphaFLAG). La Figura 1B es una reproducción de un autorradiograma que muestra la interacción in vitro entre HF1 y FAS-IC en la que HF1 está en forma de proteínas de la fusión HF1-FLAG marcadas metabólicamente con [^{35}S]metionina obtenidas a partir de extractos de células HeLa sometidas a transfección y el FAS-IC está en forma de proteínas de la fusión GST-FAS-IC de ratón y humana que incluyen una que tiene una mutación de sustitución en la posición 225 en FAS-IC, todas las proteínas de la fusión GST-FAS-IC se produjeron en E. coli. Las proteínas de la fusión a GST se unieron a gotas de glutatión antes de la interacción con los extractos que contenían la proteína de la fusión HF1-FLAG después de esta interacción, se realizó PAGE con SDS. Por tanto, se evaluó la interacción in vitro valorando, mediante autorradiografía después de PAGE con SDS, la unión de HF1 marcada metabólicamente con [^{35}S]metionina, producida en células HeLa sometidas a transfección como una fusión con el octapéptido FLAG (FLAG-HF1), a GST, la fusión de GST con el Fas-IC humano o de ratón (GST-huFas-IC, GST-mFas-IC) o a la fusión de GST con Fas-IC que contiene una mutación de sustitución Ile a Ala en la posición 225. Tal como se ve claramente a partir de la Figura B, todas las cuatro proteínas de FLAG-HF1 mostraron capacidad para unirse a Fas-IC sobre la incubación con una proteína de la fusión GST-Fas-IC. Como en el ensayo de doble híbrido en levadura (Tabla 1), HF1 no se unió a una proteína de la fusión GST-Fas-IC con una sustitución en el sitio de mutación lpr^{cg} (I225A).

Las proteínas codificadas por el ADNc de FLAG-HF1 también mostraron una capacidad para unirse al dominio intracelular de FAS-R, así como al dominio intracelular de la quimera de FAS-R cuyo dominio extracelular estaba sustituido por el de p55-R(p55-FAS), si se expresaban conjuntamente con estos receptores en las células HeLa. En la Figura 2 (A, B, C) se muestran los resultados que demuestran la interacción de HF1 con FAS-IC en células HeLa sometidas a transfección, es decir, in vivo. Tal como se ha mencionado anteriormente en la descripción de las Figuras 2 A, B, C, estas figuras son reproducciones de autorradiogramas de inmunoprecipitados de diversas células HeLa sometidas a transfección que demuestran la interacción in vivo y la especificidad de la interacción entre HF1 y FAS-IC en células sometidas a transfección conjunta con construcciones que codifican estas proteínas. Por tanto, se expresó la proteína de la fusión FLAG-HF1 y se marcó metabólicamente con [^{35}S]cisteína (20 \muCi/ml) y [^{35}S]metionina (40 \muCi/ml) en células HeLa, sólo, o junto con FAS-R humano, la quimera de FAS-R en la cual el dominio extracelular de FAS-R estaba sustituido por la región correspondiente en el p55-R humano (p55-FAS), o el p55-R humano, como control negativo. Se realizó la inmunoprecipitación cruzada de HF1 con el receptor expresado conjuntamente usando los anticuerpos indicados (Figuras 2 A-C). Tal como se ve claramente en las Figuras 2 A-C, FLAG-HF1 es capaz de unirse al dominio intracelular de FAS-R, así como al dominio intracelular de una quimera FAS-R-p55-R que tiene el dominio extracelular de p55-R y el dominio intracelular de FAS-R, cuando se expresa conjuntamente con estos receptores en las células HeLa (véase las 3 líneas del medio de la Figura 2A y las 3 líneas de la izquierda de la Figura 2C, respectivamente). Además, la inmunoprecipitación de FLAG-HF1 a partir de los extractos de las células sometidas a transfección también dieron como resultado la precipitación del FAS-R expresado conjuntamente (Figura 2A) o de la quimera de p55-FAS expresada conjuntamente (Figura 2C). A la inversa, la inmunoprecipitación de estos receptores dieron como resultado la precipitación conjunta de la FLAG-HF1 (Figuras 2A y 2C).

El análisis tipo "Northern" usando el ADNc de HF1 como sonda reveló una transcripción de hibridación sencilla en las células HeLa. La Figura 3 muestra una reproducción de una transferencia tipo "Northern" en la que se hibridó poli A^{+} ARN (0,3 \mug) de células sometidas a transfección con el ADNc de HF1. El tamaño de esta transcripción (aproximadamente 1,8 kD) está cerca del de ADNc de HF1 (aproximadamente 1.702 nucleótidos).

\newpage

En el análisis de secuencia, se encontró que el ADNc contenía una pauta de lectura abierta de aproximadamente 250 aminoácidos. La Figura 4 representa la secuencia de nucleótidos preliminar y de aminoácidos deducida de HF1 en la cual el motivo de "dominio de muerte" está subrayado, ya que es un posible residuo de Met de inicio (posición 49; M subrayada y en negrita) y el codón de parada de traducción (el asterisco bajo el codón en la posición 769-771). Este motivo de "dominio de muerte" comparte homología con los motivos de "dominio de muerte" de FAS-R y p55-R conocidos (p55DD y FAS-DD). Para determinar el extremo C-terminal preciso de HF1 y para obtener la evidencia que se refiere al extremo N-terminal preciso (residuo Met inicial) de HF1, se llevaron a cabo los siguientes experimentos adicionales:

Usando los métodos anteriormente descritos, se construyeron varias construcciones que codificaban moléculas de HF1 fusionadas en su terminal N con el octapéptido FLAG (FLAG-HF1) y se expresaron en células HeLa con marcaje metabólico de las proteínas expresadas usando ^{35}S-cisteína y ^{35}S-metionina (véase lo anterior con respecto a la Figura 5B). Se codificaron las moléculas de FLAG-HF1 mediante los siguientes ADNc que contenían porciones diferentes de la secuencia codificadora de HF1:

i) El ADNc del octapéptido FLAG conectado al extremo 5' del ADNc de HF1 de cual se habían delecionado los nucleótidos 1-145 (véase la Figura 4);

ii) El ADNc del octapéptido FLAG conectado al extremo 5' del ADNc completo de HF1 (véase la construcción FLAG-HF1 anterior con respecto a la Figura 1B);

iii) El ADNc del octapéptido FLAG conectado al extremo 5' del ADNc de HF1 del cual se habían delecionado los nucleótidos 1-145 así como los nucleótidos 832-1.701 (véase la Figura 4) y el codón GCC en la posición 142-144 estaba mutado a TCC para prevenir el inicio de la traducción en este sitio.

Después de la expresión de los anteriores productos de la fusión HF1-FLAG, se llevó a cabo la inmunoprecipitación tal como se ha mencionado anteriormente, usando o bien anticuerpos monoclonales anti-FLAG (M2) o como control, anticuerpos anti-TNF-R p75 (Nº 9), seguida por PAGE con SDS (acrilamida al 10%) y autorradiografía. Los resultados se muestran en la Figura 5 que es una reproducción de un autorradiograma sobre el cual se separaron las proteínas de la fusión HF1-FLAG anteriormente señaladas, siendo las muestras cargadas en cada línea del gel las siguientes:

Líneas 1 y 2:: la proteína de la fusión HF1-FLAG codificada por el ADNc del octapéptido FLAG conectado al extremo 5' del ADNc de HF1 del cual se habían delecionado los nucleótidos 1-145.

Líneas 3 y 4:: la proteína de la fusión HF1-FLAG codificada por el ADNc del octapéptido FLAG conectado al extremo 5' del ADNc de HF1 completo.

Líneas 5 y 6:: la proteína de la fusión HF1-FLAG codificada por el ADNc del octapéptido FLAG conectado al extremo 5' del ADNc de HF1 del cual se habían delecionado los nucleótidos 1-145 así como 832-1.701 y el GCC en la posición 142-144 estaba mutado a TCC para prevenir el inicio de la traducción en este sitio.

Las inmunoprecipitaciones eran con anticuerpos monoclonales anti-FLAG para las muestras en las líneas 2, 4 y 6 y los anticuerpos anti-TNF-R p75 para las muestras en las líneas 1, 3 y 5.

A partir del autorradiograma de la Figura 5 se ve claramente que la identidad de los tamaños de producto en las líneas 2 y 4 confirma que los nucleótidos 769-771 están en el sitio de terminación de traducción para HF1, es decir, este codón representa una señal de parada y está indicado por un asterisco en la Figura 4. Además, la existencia de una banda ancha que representa justo dos productos de traducción (tal como se ve en el gel pero al estar fuertemente marcada llega a ser una única banda grande sobre el autorradiograma) en la línea 6 indica que la existencia de dos productos adicionales (las bandas anchas de mayor peso molecular) en las líneas 2 y 4 reflejan la iniciación de la traducción tanto en el terminal N de la molécula de la fusión FLAG-HF1 como en el residuo de metionina número 49 en la secuencia de HF1 (véase M subrayada y en negrita en la posición 49 de la secuencia de aminoácidos en la Figura 4). Por tanto, los resultados anteriores han confirmado (validado) el extremo C-terminal de HF1 y han proporcionado la evidencia de que el extremo N-terminal de HF1 puede estar en la posición 49 de la secuencia en la Figura 4.

Incluso, se ha mostrado mediante experimentos de expresión adicionales de HF1 sin el octapéptido FLAG fusionado a su extremo 5 que Met^{49} sirve como un sitio eficaz de iniciación de la traducción.

Se debería mencionar que una búsqueda guiada en las bases de datos "Gene Bank" y "Protein Bank" revelaron que no hay secuencia correspondiente a la de HF1 representada en la Figura 4. Por tanto, HF1 representa una nueva proteína de unión específica a FAS-IC.

La alta expresión de p55-IC da como resultado el desencadenamiento de un efecto citocida (véase los documentos IL 109632, 111125 y Boldin et al., 1995). La expresión de Fas-IC en células HeLa también tiene tal efecto, aunque a un menor grado, el cual se podría detectar solamente con el uso de un ensayo sensible. En la Figura 6 A y B se ha representado gráficamente el desencadenamiento independiente de ligando de los efectos citocidas en células sometidas a transfección con HF1, así como p55-IC humano y FAS-IC. Se valoró el efecto de expresión transitoria de HF1, Fas-IC humano, p55-IC humano o luciferasa, que servía como control, sobre la viabilidad de células HeLa usando un vector de expresión controlado por tetraciclina. Se evaluó la viabilidad celular 40 minutos después de someter a transfección estos ADNs o bien en presencia (barras abiertas, Figuras 6 A y B) o en ausencia (barras cerradas, Figuras 6 A y B) de tetraciclina (1 \mug/ml, para bloquear la expresión), junto con un ADNc que codifica la fosfatasa alcalina placentaria secretada. Se determinó la viabilidad celular o bien mediante el ensayo de consumo de rojo neutral (Figura 6A) o, para determinar específicamente la viabilidad de aquellas células particulares que expresan el ADN sometido a transfección, mediante la medición de las cantidades de fosfatasa alcalina placentaria secretada al medio de crecimiento (Figura 6B).

Por tanto, se ve claramente a partir de las Figuras 6 A y B que la expresión de HF1 en células HeLa dio como resultado muerte celular significativa, mayor que la causada por la expresión de FAS-IC. Estos efectos citotóxicos de todo p55-IC, FAS-IC y HF1 parecen estar relacionados con las regiones de "dominio de muerte", presentes en todas estas proteínas, dichos "dominios de muerte" tienen una propensión a autoasociarse y, de ese modo, posiblemente provocar los efectos citotóxicos.

En vista de las características anteriormente mencionadas de HF1 (MORT-1), principalmente, la asociación específica de HF1 con esa región particular en FAS-R que está implicada en la inducción de muerte celular, y el hecho de que incluso un ligero cambio de estructura en esa región, el cual previene la señalización (la mutación lpr^{cg}) suprima también la unión de HF1, indica que esta proteína juega un papel en la señalización o desencadenamiento de la muerte celular. Esta idea además se soporta por la capacidad observada de HF1 para desencadenar por sí misma un efecto citocida. Por tanto, HF1 (MORT-1) puede funcionar como: (i) un modulador de la autoasociación de FAS-R por su propia capacidad para unirse a FAS-R así como a sí misma, o (ii) sirve como un sitio de acoplamiento para proteínas adicionales que están implicadas en la señalización de FAS-R, es decir, HF1 puede ser una proteína de "acoplamiento" y, por lo tanto, puede unirse a otros receptores a parte de FAS-R, o (iii) constituye parte de un sistema de señalización distinto que interactúa con la señalización de FAS-R.

Para analizar más las regiones de MORT-1 (HF1) implicadas en la unión a FAS-IC y la modulación de los efectos celulares mediados por FAS-R (citotoxicidad), se llevaron a cabo los experimentos anteriormente mencionados, usando vectores que codifican porciones de MORT-1 (la "cabeza de MORT-1", aminoácidos 1-117 y la "MORT-1 DD", aminoácidos 130-245) (separadamente), con un vector que codifica el FAS-R humano para transfecciones conjuntas de células HeLa. En estos experimentos se expresaron transitoriamente las diversas proteínas y combinaciones de proteínas en células HeLa que contenían un transactivador controlado por tetraciclina (HtTA-1) mediante la inserción de las secuencias codificadoras de las proteínas en un vector de expresión controlado por tetraciclina pUHD10-3. Las transfecciones de control emplearon vectores que codificaban solamente el FAS-R y vectores que codificaban la proteína de la fusión FLAG-55.11 (siendo la proteína 55.11 una proteína de unión específica a p55-IC de la cual una porción que contenía los aminoácidos 309-900 se fusionó (en su N-terminal) al octapéptido FLAG).

Después de los periodos de transfección e incubación (véase el anterior punto (iv)) se trataron las células sometidas a transfección con diversas concentraciones de un anticuerpo monoclonal anti-FAS-R (CH-11) el cual se une específicamente al dominio extracelular de FAS-R expresado por las células. Esta unión del anticuerpo anti-FAS-R induce la agregación del FAS-R en la superficie celular (como el ligando de FAS-R) e induce la vía de señalización intracelular mediada por el FAS-IC, dando como resultado, por último, la muerte celular (citotoxicidad celular mediada por FAS-R). Las concentraciones del anticuerpo monoclonal anti-FAS-R (CH-11) usadas estaban en el intervalo de 0,01-10 \mug/ml, normalmente concentraciones tales como 0,005, 0,05, 0,5 y 5 \mug/ml. Se trataron las células con el anticuerpo anti-FAS en presencia de 10 \mug/ml de cicloheximida.

Los resultados del anterior análisis se explican gráficamente en la Figura 7 la cual representa el % de viabilidad de las células sometidas a transfección como una función de la concentración del anticuerpo monoclonal anti-FAS-R (CH11) usado para tratar las células, para cada uno de los cuatro grupos diferentes de células sometidas a transfección. Estos grupos de células sometidas a transfección se denotaron mediante símbolos diferentes tal como sigue: (i) el cuadrado abierto denota células sometidas a transfección solamente con el vector de control no relevante (es decir, sin unión a FAS-IC) que codifica la proteína de la fusión FLAG-55.11 ("55.11", control negativo); (ii) el cuadrado cerrado denota células sometidas a transfección conjunta con vectores que codifican el FAS-R y vectores que codifican la porción C-terminal de MORT-1, aminoácidos 130-245, la cual contiene la región de homología de "dominio de muerte" (dd) de MORT-1 ("fas+mort1dd"); (iii) los triángulos cerrados denotan células sometidas a transfección con solamente el vector que codifica el FAS-R ("fas", control positivo); y (iv) los círculos abiertos denotan células sometidas a transfección conjunta con vectores que codifican el FAS-R y vectores que codifican la porción N-terminal de MORT-1, aminoácidos 1-117, la "cabeza de MORT-1"("fas+mort1he").

A partir de los resultados presentados en la Figura 7, se ve claramente que la expresión de FAS-R en las células sometidas a transfección expresa una sensibilidad incrementada a los efectos citocidas de los anticuerpos anti-FAS-R (comparar "fas" con "55.11"). Además, la expresión conjunta de la región en MORT-1 que contiene la región de homología de "dominio de muerte" y FAS-R ("fas+mort1dd") interfiere fuertemente con la muerte celular inducida por FAS (es decir, mediada por FAS-R) como se esperaría de la capacidad (véase la anterior Tabla 1) de la región de "dominio de muerte" (DD) de MORT-1 para unirse al "dominio de muerte" de FAS-R (FAS-DD). Además, la expresión conjunta de la parte N-terminal de MORT-1 y FAS-R ("fas+mort1he") no interfiere con la muerte celular mediada por FAS-R y, si interfiere, aumenta algo la citotoxicidad (es decir, muerte celular ligeramente incrementada).

Por tanto, los resultados anteriores claramente indican que la proteína MORT-1 tiene dos regiones distintas en lo que se refiere a la unión al FAS-IC y la mediación de la actividad citotóxica celular del FAS-IC:

Por lo tanto, estos resultados también proporcionan una base para el uso de diferentes partes (es decir, fragmentos activos o análogos) de la proteína MORT-1 para diferentes aplicaciones farmacéuticas. Por ejemplo, se pueden usar los análogos o fragmentos o derivados de los mismos de la proteína MORT-1 que contienen esencialmente solamente la porción C-terminal de MORT-1 incluyendo su región de "dominio de muerte" para inhibir los efectos citotóxicos mediados por FAS-R en células o tejidos que contienen FAS-R y, de ese modo, proteger estas células o tejidos de los efectos perjudiciales del ligando de FAS-R en casos tales como, por ejemplo, hepatitis aguda. Si no, se pueden usar los análogos o fragmentos o derivados de los mismos de la proteína MORT-1 que contienen esencialmente solamente la porción N-terminal de MORT-1 para aumentar los efectos citotóxicos mediados por FAS-R en células y tejidos que contienen FAS-R, de ese modo, conduciendo a la destrucción aumentada de estas células o tejidos si se desea en casos tales como, por ejemplo, células tumorales y células T y B autorreactivas. Tal como se ha detallado anteriormente en la presente memoria, los usos anteriores de las diferentes regiones de MORT-1 se pueden llevar a cabo usando los diversos virus recombinantes (por ejemplo, Vaccinia) para insertar la secuencia codificadora de la región de MORT-1 en células o tejidos específicos que se desean tratar.

Además, también es posible preparar y usar otras diversas moléculas tales como anticuerpos, péptidos y moléculas orgánicas que tienen secuencias o estructuras moleculares que corresponden a las regiones de MORT-1 anteriormente señaladas para alcanzar los mismos efectos deseados mediados por estas regiones de MORT-1.

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Referencias

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD.

\hskip3.9cm

WEINWURZEL, Henry

\hskip3.9cm

WALLACH, David

\hskip3.9cm

BOLDIN, Mark

\hskip3.9cm

VARFOLOMEEV, Eugene

\hskip3.9cm

METT, Igor

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MODULARES DE LA FUNCIÓN DE LOS RECEPTORES FAS/APO1

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv): DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: BROWDY AND NEIMARK

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(B): CALLE: 419 Seventh Street N.W., Ste. 300

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(C): CIUDAD: Washington

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(D): ESTADO: D.C.

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(E): PAÍS: Estados Unidos de América

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(F): CÓDIGO POSTAL: 20004

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(v): FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SISTEMA LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN

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(C): CLASIFICACIÓN

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(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: IL 112022

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-DIC-1994

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(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: IL 112692

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 19-FEB-1995

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(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: IL 114615

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 16-JUL-1995

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(viii): INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE

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(A): NOMBRE: BROWDY, Roger L.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 25.618

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(C): REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: WALLACH=16

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(ix): INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

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(A): TELÉFONO: (202) 628-5197

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(B): TELEFAX: (202) 737-3528

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(C): TELEX: 248633

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(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1701 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..768

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

200

300

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(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 256 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

400

500

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD.

\hskip3.9cm

WEINWURZEL, Henry

\hskip3.9cm

WALLACH, David

\hskip3.9cm

BOLDIN, Mark

\hskip3.9cm

VARFOLOMEEV, Eugene

\hskip3.9cm

METT, Igor

\vskip0.800000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: BROWDY AND NEIMARK

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 419 Seventh Street N.W., Ste. 300

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Washington

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: D.C.

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Estados Unidos de América

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 20004

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SISTEMA LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: IL 112022

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-DIC-1994

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: IL 112692

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 19-FEB-1995

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: IL 114615

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 16-JUL-1995

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: BROWDY, Roger L.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 25.618

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: WALLACH=16

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (202) 628-5197

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (202) 737-3528

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TELEX: 248633

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1701 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..768

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 256 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

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8

Claims

1. Una secuencia de ADN que codifica una proteína MORT-1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 4, o fragmentos de la misma, todos los cuales son capaces de unirse al dominio intracelular de FAS-R.

2. La secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionada entre el grupo que consiste en:

(b): secuencias de ADN capaces de la hibridación para una secuencia del punto (a) bajo condiciones moderadamente estrictas y que codifican una proteína de unión al dominio intracelular de FAS-R biológicamente activa; y

(c): secuencias de ADN que son degeneradas como resultado del código genético para las secuencias de ADN definidas en los puntos (a) y (b) y que codifican una proteína de unión al dominio intracelular de FAS-R biológicamente activa.

3. Una proteína MORT-1 o fragmentos de la misma, codificada por una secuencia de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, siendo dicha proteína o fragmentos capaces de unirse al dominio intracelular del FAS-R.

4. La proteína MORT-1 de acuerdo con la reivindicación 3, teniendo la secuencia de aminoácidos deducida representada en la Figura 4.

5. Un vector que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

6. Células hospedantes transformadas que contienen un vector de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Un método para producir una proteína MORT-1 o fragmentos de la misma de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, que comprende el crecimiento de las células hospedantes transformadas de acuerdo con la reivindicación 6 bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína o fragmentos que efectúan modificaciones post-traducción de dicha proteína tal como sea necesario para obtener dicha proteína o fragmentos, e aislar dicha proteína o fragmentos expresados.

8. Anticuerpos, o fragmentos activos de los mismos, capaces de unión específica de la proteína MORT-1 o fragmentos de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4.

9. Un método para aislar e identificar proteínas, factores o receptores capaces de unirse a la proteína MORT-1 de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4; comprendiendo:

(a): la aplicación del procedimiento de cromatografía de afinidad en el cual dicha proteína MORT-1 se une a la matriz de la cromatografía de afinidad, dicha proteína unida se pone en contacto con un extracto celular; y, a continuación se eluyen, aíslan y analizan las proteínas, factores o receptores del extracto celular que están unidos a dicha proteína unida; o

(b): la aplicación del procedimiento del doble híbrido en levadura en el cual una secuencia que codifica dicha proteína MORT-1 es portada por el primer vector híbrido y la secuencia de una genoteca de ADNc o ADN genómico es portada por el segundo vector híbrido, usándose a continuación los vectores para transformar células hospedantes de levadura y aislándose las células transformadas positivas, seguido de la extracción de dicho segundo vector híbrido para obtener una secuencia que codifica una proteína que se une a dicha proteína MORT-1.

10. Un método para aislar e identificar una proteína capaz de unirse al dominio intracelular de FAS-R comprendiendo la aplicación del procedimiento de hibridación tipo "Southern" no estricta seguido de clonación por PCR, en el cual una secuencia o partes de la misma de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 se usa como sonda para unirse a secuencias de un ADNc o genoteca de ADN genómico, que tiene al menos homología parcial a esa, a continuación, dichas secuencias unidas se amplifican y clonan mediante el procedimiento de PCR para proporcionar clones que codifican proteínas que tienen al menos homología parcial a dichas secuencias de la reivindicación 1 ó 2.

11. Una composición farmacéutica que comprende un ingrediente activo seleccionado entre el grupo que consiste en:

(1): una proteína MORT-1, o fragmentos, de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, y mezcla de los mismos;

(2): un vector vírico animal recombinante que porta secuencias de ADN que codifican una proteína capaz de unirse a un receptor de superficie celular y que codifican una proteína MORT-1, o fragmentos, de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4;

(3): un oligonucleótido que contiene una secuencia antisentido de la secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2; y

(4): un anticuerpo o fragmento activo del mismo de acuerdo con la reivindicación 8.

12. El uso de un compuesto tal como el definido en la reivindicación 11 para la preparación de una composición farmacéutica para modular el efecto del ligando de FAS-R sobre las células.

13. El uso de un compuesto tal como el definido en la reivindicación 11(2) para la preparación de una composición farmacéutica para tratar células tumorales, células infectadas por VIH u otras células enfermas.

14. El uso de una o más proteínas MORT-1 o fragmentos de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4 capaces de unirse al dominio intracelular y modular la actividad de dicho FAS-R, y anticuerpos o fragmentos activos de los mismos de acuerdo con la reivindicación 8 para la preparación de una composición farmacéutica para modular el efecto del ligando de FAS-R sobre las células.

15. El uso de un vector que contiene una secuencia que codifica una ribozima capaz de interactuar con una secuencia de ARNm celular que codifica una proteína MORT-1 de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4 para la preparación de una composición farmacéutica para modular el efecto del ligando de FAS-R sobre las células.

16. El uso de una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que codifica una proteína MORT-1 o fragmentos de la misma o una proteína MORT-1 o fragmentos de la misma de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4 para la preparación de una composición farmacéutica para la modulación del efecto inducido por MORT-1 sobre las células.