FI121273B - FAS/APO1-reseptorien toiminnan modulaattorit - Google Patents

Description

FAS/AP01-RESEPTORIEN TOIMINNAN MODULAATTORIT MODULATORER AV FAS/APOl RECEPTORERS FUNKTION

Keksintö koskee yleisesti reseptorien TNF/NGF- superperheeseen kuuluvia reseptoreja sekä niiden biologisten toimintojen säätelyä. Reseptorien TNF/NGF-superperheeseen kuuluvat sellaiset reseptorit kuin esimerkiksi p55 ja p75 tuumorinekroositekijän reseptorit (TNF-R:t) ja FAS-ligandin reseptori (kutsutaan myös FAS/APOl:ksi tai FAS-R:ksi, ja edempänä siitä käytetään nimeä FAS-R) sekä muita reseptoreja. Yksityiskohtaisemmin keksintö koskee uutta, tässä MORT-l:ksi (kutsutaan myös HF-l:ksi) nimettyä proteiinia, joka sitoutuu FAS-R:n intrasellulaariseen domeeniin (IC:hen) (tämä intrasellulaarinen domeeni on nimetty Fas-IC:ksi), ja joka uusi proteiini kykenee moduloimaan Fas-R:n toimintaa. Lisäksi MORT-1 kykenee myös itseassosioitumaan ja voi yksin aktivoida solun sytotoksisuuden. Keksintö koskee myös MORT-1:n valmistusta ja käyttötapoja. Todettakoon että HF1 (alkuperäinen nimitys) ja MORT-1 (nykyinen nimitys) käytetään rinnakkain selityksessä ja ne tarkoittavat samaa proteiinia.

β 9 S • Φ *'V Keksintö koskee erityisesti DNA-sekvenssiä, joka koodaa T*. MORT-1- (tai HF1-) proteiinia sekä MORT-l-proteiinia ja e a e * siitä valmistettavia farmaseuttisia koostumuksia ja näiden käyttöä. Tuumorinekroositeki j ä (TNF-cx) ja lymfotoksiini (TNF-β) (jäljempänä TNFtllä tarkoitetaan sekä TNF-A:aa että s··», TNF-B:aa) ovat monitoimintaisia proinf lammatorisia sytokiinejä, joita tuottavat pääasiassa mononukleaariset F , fagosyytit, ja niillä on monia vaikutuksia soluihin (Wallach, D. (1986) teoksessa Interferon 7 (Ion Gresser, toim.), s. 83-122, Academic Press, Lontoo; ja Beutler ja «· ’. Cerami (1987)) . Sekä TNF-A että TNF- aloittavat ’*».* vaikutuksensa sitoutumalla spesifisiin solun pinnan 2 reseptoreihin. Jotkin vaikutukset ovat todennäköisesti hyödyllisiä organismille: ne saattavat tuhota esimerkiksi kasvainsoluja tai viruksen infektoimia soluja ja lisätä granulosyyttien antibakteerisia vaikutuksia. Tällä tavalla TN F edistää organismin puolustusta kasvaimia ja infektiivisiä aineita vastaan sekä auttaa organismia toipumaan vaurioista. TNF:ää voidaankin siten käyttää kasvaimenvastaisena aineena, jossa käytössä sesitoutuu kasvainsolujen pinnalla oleviin reseptoreihinsa aloittaen näin kasvainsolujen kuolemaan johtavat tapahtumat. TNF:ää voidaan käyttää myös infektionvastaisena aineena.

Sekä TNF-A:lla että TNF-h:lla on kuitenkin myös haitallisia vaikutuksia. On todisteita siitä, että TNF-A:n liikatuotannolla voi olla tärkeä patogeeninen merkitys useissa sairauksissa. Näin ollen TNF-A:n, pääasiassa verisuonistoon kohdistuvien, vaikutusten tiedetään nykyisin olevan tärkeä septisen sokin oireiden aiheuttaja (Tracey et ai., 1986). Joissain sairauksissa TNF saattaa aiheuttaa liiallista painonmenetystä (kakeksiaa eli kuihtumista) .. estämällä rasvasolujen toimintoja sekä aiheuttamalla j ^ anoreksiaa, ja TNF-A:aa onkin kutsuttu kakektiiniksi. Se on ,1, myös kuvattu kudosvaurion välittäjänä reumasairauksissa m * t s .·„ j (Beutler ja Cerami, 1987) sekä siirteen ja isännän e 1 # vastareaktioissa havaitun vaurion tärkeänä välittäjänä s s» ,y% (Piquet et ai., 1987). Lisäksi TNF:n tiedetään osallistuvan tulehdusprosessiin sekä moniin muihin sairauksiin.

. -»« Edellä mainitut TNF:n biologiset vaikutukset panee alulle 7 ja/tai välittää kaksi erillistä, itsenäisesti ilmentyvää reseptoria, TNF-R:t p55 ja p75, jotka sitovat spesifisesti sekä TNF-A:aa että TNF-B:aa. Näillä kahdella reseptorilla on * y rakenteellisesti eroavat intrasellulaariset domeenit, mikä viittaa siihen, että niiden signaali on erilainen (katso 3

Hohmann et ai., 1989; Engelmann et ai., 1990; Brockhaus et ai., 1990; Leotscher et ai., 1990; Schall et ai., 1990; Nophar et ai., 1990; Smith et ai., 1990; ja Heller et ai., 1990). Vielä on kuitenkin selvitettävä solumekanismit, esimerkiksi eri proteiinit ja mahdolliset muut faktorit, jotka osallistuvat p55- ja p75-TNF-R:n solunsisäiseen signaalinsiirtoon (PCT/US95/05854:ssä ja samoin kuten tässä jäljempänä esitetään, nyt kuvataan ensimmäisen kerran uudet proteiinit, jotka kykenevät sitoutumaan p75IC:hen ja p55IC:hen). Juuri tämä solunsisäinen viestitys, joka tapahtuu tavallisesti sen jälkeen, kun ligandi, so. TNF (A tai B) , on sitoutunut reseptoriin, vastaa sen reaktiosarjan aloittamisesta, joka lopulta johtaa havaittavaan soluvasteeseen TNF:ää kohtaan.

Edellä mainittua TNF:n soluja tuhoavaa vaikutusta koskien useimmissa tähän mennessä tutkituissa soluissa tämän vaikutuksen laukaisee pääasiassa p55-TNF-R. Vasta-aineet p55-TNF-R:n ekstrasellulaarista domeenia (ligandinsitojadomeenia) vastaan voivat itse laukaista soluja tuhoavan vaikutuksen (katso EP 412486), joka korreloi #59 $ i „% vasta-aineiden reseptorien ristisitomistehokkuuden kanssa, SS# δ •h minkä uskotaan olevan ensimmäinen askel intrasellulaarisen ί * e s V.J eli solunsisäisen viestinsiirtoprosessin muodostumisessa.

ί s

Mutaatiotutkimukset (Brakebusch et ai., 1992; Tartaglia et Vj*; ai., 1993) ovat edelleen osoittaneet, että p55-TNF-R:n s biologinen toiminta riippuu sen intrasellulaarisen domeenin eheydestä, ja niinpä onkin esitetty, että TNF:n soluja 5V*: tuhoavaan vaikutukseen johtavan intrasellulaarisen Λ ; viestinsiirron aloitus on seurausta p55-TNF-R:n kahden tai useamman intrasellulaarisen domeenin assosioitumisesta. Lisäksi TNF (A ja β) esiintyy homotrimeerinä ja sellaisena Tl sen on ehdotettu indusoivan solunsisäistä viestinsiirtoa p55-TNF-R:n kautta, koska se kykenee sitoutumaan ja 4 silloittamaan reseptorimolekyylejä, so. aiheuttamaan reseptoriaggregaatiota. PCT/US95/05854:ssä ja tässä jäljempänä kuvataan, miten p55lC ja p55DD voivat itseassosioitua ja indusoida ligandista riippumattomalla tavalla TNF:ään liittyviä vaikutuksia soluissa.

Toinen reseptorien TNF/NGF-superperheen jäsen on FAS-reseptori (FAS-R), jota on kutsuttu myös Fas-antigeeniksi. Se on solun pintaproteiini, joka ilmentyy monissa eri kudoksissa ja jolla on homologiaa monien solun pinnan reseptorien kanssa, TNF-R ja NGF-R mukaan lukien. FAS-R välittää apoptoottista solukuolemaa (Itoh et ai., 1991), ja se näyttää toimivan autoreaktiivisten T-solujen negatiivisena valintatekijänä, so. T-solujen kypsymisen aikana FAS-R välittää self-antigeeneja tunnistavien T-solujen apoptooppista kuolemaa. On myös havaittu, että mutaatiot FAS-R-geenissä (lpr) aiheuttavat hiirillä lymfoproliferaatiohäiriön, joka muistuttaa ihmisen autoimmuunitautia systeeminen lupus erythematosus (SLE) (Watanabe-Fukunaga etal., 1992). FAS-R:n ligandi näyttää olevan solun pintaan liittynyt molekyyli, jota esiintyy muun » e ; , muassa tappaja-T-soluissa (eli sytotoksisissa T- “V lymfosyyteissä - CTL:issä), ja näin ollen kun sellaiset **.*'·, CTL:t joutuvat kosketuksiin FAS-R:ia kantavien solujen * kanssa, ne kykenevät indusoimaan FAS-R:ia kantavien solujen 'apoptooppisen solukuoleman. Lisäksi on valmistettu FAS-R:lie spesifinen monoklonaalinen vasta-aine. Tämä monoklonaalinen vasta-aine kykenee indusoimaan apoptooppisen solukuoleman ?. s FAS-R:ia kantavissa soluissa, mukaan lukien ihmisen FAS-R:ia • koodaavalla cDNA:lla transformoidut hiiren solut (Itoh et * * *;,? ai., 1991).

T-lymfosyyttien lisäksi myös erilaisten muiden normaalien solujen on havaittu ilmentävän pinnallaan FAS-R: ia, ja ne 5 voidaan tuhota laukaisemalla tämän reseptorin. Tällaisen tuhoamisprosessin säätelemättömän induktion epäillään osaltaan edistävän kudosvaurioita tietyissä sairauksissa, esimerkiksi maksasolujen tuhoutumista akuutissa maksatulehduksessa. Niinpä sillä, että löydetään keinot estää FAS-R:n sytotoksinen aktiivisuus, saattaa olla terapeuttista käyttöä.

Sitä vastoin koska on havaittu myös se, että tietyt pahanlaatuiset solut ja HIV-infektoidut solut kantavat pinnallaan FAS-R:ia, FAS-R:n vasta-aineita tai FAS-R:n ligandia voidaan käyttää laukaisemaan FAS-R-välitteisiä sytotoksisia vaikutuksia näissä soluissa, jolloin saadaan keino taistella sellaisia pahanlaatuisia soluja tai HIV-infektoituja soluja vastaan (katso Itoh et ai., 1991). Vielä muidenkin keinojen löytämisellä FAS-R:n sytotoksisen aktiivisuuden voimistamiseksi saattaa myös olla terapeuttisia käyttömahdollisuuksia.

Jo pitkään on kaivattu keinoa, jolla solun vastetta TNF:lle ·, (A:lie tai h:lie) ja FAS-R-ligandille voidaan moduloida.

,% Esimerkiksi edellä mainituissa patologisissa tilanteissa, ... joissa TNF:ää tai FAS-R-ligandia yli-ilmentyy, TNF:n tai \j FAS-R-ligandin indusoimia soluja tuhoavia vaikutuksia halutaan inhiboida, kun taas muissa tilanteissa, esim. *·*; haavan parantamissovelluksissa, TNF-vaikutusta halutaan voimistaa, tai FAS-R:n kohdalla, FAS-R:n välittämää vaikutusta kasvainsoluissa tai HIV-infektoiduissa soluissa halutaan voimistaa.

*% Tämän keksinnön keksijät ovat tehneet monia § *, lähestymisyrityksiä (katso esimerkiksi EP-hakemukset 186833, Π’ 308378, 398327 ja 412486) TNF:n haitallisten vaikutusten säätelemiseksi inhiboimalla TNF:n sitoutumista 6 reseptoreihinsa käyttämällä anti-TNF-vasta-aineita tai liukoisia TNF-reseptoreja (jotka ovat olennaisilta osiltaan reseptorien liukoisia ekstrasellulaarisia domeeneja) kilpailemaan TNF:n sitomisesta solun pintaan sitoutuneiden TNF-reseptorien kanssa. Vielä koska TNF:n indusoimien soluvaikutusten edellytyksenä on TNF:n sitoutuminen reseptoreihinsa, tämän keksinnön keksijät ovat tehneet lähestymisyrityksiä (katso esimerkiksi IL 101769 ja sitä vastaava EP 568925) TNF-vaikutuksen moduloimiseksi moduloimalla TNF-R:ien aktiivisuutta. Lyhyesti sanottuna EP 568925 (IL 101769) koskee menetelmää signaalinsiirron ja/tai pilkkomisen moduloimiseksi TNF-R:eissa, jolloin peptidit tai muut molekyylit voivat olla vuorovaikutuksessa joko itse reseptorin kanssa tai reseptorin kanssa vuorovaikutuksessa olevien efektoriproteiinien kanssa, siis TNF-R:ien normaalia toimintaa moduloidaan. EP 568925:ssä kuvataan erilaisten sellaisten mutantti-p55-TNF-R:ien konstruointi ja karakterisointi, joissa on mutaatioita p55-TNF-R:n ekstrasellulaarisissa, transmembraanisissa ja intra-sellulaarisissa domeeneissa. Tällä tavalla p55-TNF-R:n edellä mainituissa domeeneissa olevat alueet tunnistettiin ; , olennaisen tärkeiksi reseptorin toimimiselle, so. ligandin *V (TNF:n) sitoutumiselle ja sen jälkeiselle signaalinsiirrolle ja solunsisäiselle viestitykselle, joka lopulta johtaa s s # »‘ * havaittuun TNF-vaikutukseen soluissa. Lisäksi siinä kuvataan myös monia lähestymistapoja sellaisten proteiinien, peptidien tai muiden faktorien eristämiseksi ja = 5 tunnistamiseksi, jotka kykenevät sitoutumaan TNF-R:n edellä mainittujen domeenien eri alueisiin. Nämä proteiinit, y . peptidit ja muut faktorit voivat osallistua TNF-R:n *aj aktiivisuuden säätelyyn tai modulointiin. EP 568925:ssä **’ esitetään myös monia lähestymistapoja sellaisia proteiineja ja peptidejä koodaavien DNA-sekvenssien eristämiseksi ja »».’ kloonaamiseksi; ilmentämisvektorien rakentamiseksi näiden 7 proteiinien ja peptidien tuottamiseen; sekä sellaisten vasta-aineiden tai niiden fragmenttien valmistamiseksi, jotka ovat vuorovaikutuksessa TNF-R:n kanssa tai edellä mainittujen proteiinien ja peptidien kanssa, jotka sitoutuvat TNF-R:n eri alueille. EP 568925:ssä ei kuitenkaan kuvata varsinaisia proteiineja ja peptidejä, jotka sitoutuvat TNF-R:ien (esim. p55 TNF-R:n) intrasellulaarisiin domeeneihin, myöskään ei kuvata hiivan kaksi- hybridimenetelmää TNF-R:ien intrasellulaarisiin domeeneihin sitoutuvien proteiinien tai peptidien eristämiseksi ja tunnistamiseksi. Samoin tähän mennessä ei ole kuvattu proteiineja tai peptidejä, jotka kykenevät sitoutumaan FAS-R:n intrasellulaariseen domeeniin.

Niinpä silloin, kun halutaan inhiboida TNF:n tai FAS-R:n ligandin vaikutusta, olisi suotavaa vähentää TNF-R:ien tai FAS-R:n määrää tai aktiivisuutta solun pinnalla, kun taas TNF-R:ien tai FAS-R:n määrän tai aktiivisuuden lisäys olisi suotavaa silloin, kun TNF:n tai FAS-R-ligandin vaikutusta halutaan voimistaa. Tätä tarkoitusta varten on sekvensoitu ja analysoitu sekä p55-TNF-R:n että p75-TNF-R:n h» promoottoreita, ja lukuisia sellaisia avainsekvenssi- ·*» rakenteita on havaittu, jotka ovat spesifisiä erilaisille \* transkription säätelytekijöille, ja sinänsä näiden TNF-R:ien **,, ilmentymistä voidaan säädellä niiden promoottoritasolla, so.

T: promoottoreista lähtevää transkriptiota inhiboidaan reseptorien lukumäärän vähentämiseksi, ja promoottoreista lähtevää transkriptiota voimistetaan reseptorien lukumäärän lisäämiseksi (katso IL 104355 ja IL 109633) . FAS -R: n .*»J säätelyä FAS-R-geenin promoottoritasolla koskevat vastaavat tutkimukset ovat vielä selostettavana.

,*«·, Lisäksi tulee vielä mainita, että vaikka tuumorinekroosi- tekijän (TNF:n) reseptorien ja sen kanssa rakenteeltaan 8 läheisen FAS-R-reseptorin tiedetäänkin laukaisevan niiden omaan kuolemaan johtavan haitallisen vaikutuksensa soluissa leukosyyttien tuottamien ligandien stimuloinnin jälkeen, näistä laukaisumekanismeista tiedetään vasta vähän. Mutaatiotutkimukset osoittavat, että FAS-R:ssa ja p55-TNF-reseptorissa (p55-R:ssa) sytotoksisuuteen johtavaan viestitykseen osallistuu niiden intrasellulaarisissa domeeneissa olevia erillisiä alueita (Brakebusch et ai., 1992; Tartaglia et ai., 1993; Itoh ja Nagata, 1993). Näissä alueissa ('kuolemadomeeneissa') on sekvenssiyhtäläisyyttä. Sekä FAS-R:n että p55-R:n 'kuolemadomeenit’ pyrkivät itseassosioitumaan. Niiden itseassosiointi edistää ilmeisesti viestityksen aloitukseen välttämätöntä reseptori-aggregaatiota (katso PCT/US95/05854, samoin kuin julkaisut Song et ai., 1994; Wallach et ai., 1994; Boldin et ai., 1995) ja reseptorin runsaat ilmentymistasot voivat johtaa ligandista riippumattoman viestinsiirron laukaisuun (PCT/US95/05854 ja Boldin et ai., 1995).

Siten ennen PCT/US95/05854:ää ja tätä keksintöä ei ole ollut saatavilla proteiineja, jotka voivat säädellä TNF/NGF- e s ‘ " superperheeseen kuuluvien ligandien, kuten esimerkiksi TNF:n * tai FAS-R:n ligandin, vaikutusta soluihin intrasellulaarisen viestinsiirtoprosessin välityksellä, jota viestinsiirtoa '* * ohjaavat todennäköisesti suuressa määrin TNF/NGF- s ? s superperheeseen kuuluvien reseptorien, esimerkiksi TNF-* R:ien, so. p55 ja p75 TNF-R:ien, intrasellulaariset domeenit (IC:t) (p55IC ja vastaavasti p75IC) samoin kuin FAS-IC.

? « ί r f . Niinpä keksinnön eräänä tarkoituksena on tarjota käyttöön ** h proteiineja, joita ovat MORT-1, sen analogit, fragmentit tai ’**’ johdannaiset, jotka kykenevät sitoutumaan FAS-R:n , intrasellulaariseen domeeniin, joiden proteiinien uskotaan *. * nykyisin osallistuvan siihen solunsisäiseen viestinsiirtoon, 9 joka alkaa FAS-ligandin sitoutumisella reseptoriinsa. Keksinnön mukainen MORT-l-proteiini, sen analogit, fragmentit ja johdannaiset eroavat aikaisemmin mainituissa hakemuksissa kuvatuista FAS-IC:n sitojaproteiineissa.

Toisena keksinnön tarkoituksena on tarjota käyttöön antagonisteja (esim. vasta-aineita) näille FAS-IC:n sitoja-molekyyleille, joita ovat MORT-l-proteiini, sen analogit, fragmentit ja johdannaiset, joita antagonisteja voidaan käyttää inhiboimaan viestinsiirto haluttaessa silloin, kun nämä FAS-IC:n sitojaproteiinit ovat positiivisia signaaliefektoreita (so. indusoivat viestinsiirtoa) tai voimistamaan viestinsiirtoa haluttaessa silloin, kun nämä FAS-IC:n sitojaproteiinit ovat negatiivisia signaaliefektoreita (so. inhiboivat viestinsiirtoa).

Vielä eräänä keksinnön tarkoituksena on käyttää tällaista MORT-l-proteiinia, sen analogeja, fragmentteja ja johdannaisia, eristämään ja karakterisoimaan muita proteiineja tai faktoreita, jotka voivat esimerkiksi osallistua viestinsiirtoprosessiin pidemmällä alavirtaan, o » : ,·» ja/tai eristämään ja tunnistamaan muita reseptoreja pidemmällä ylävirtaan viestinsiirtoprosessia, joihin : proteiineihin tai faktoreihin nämä MORT-l-proteiini, sen * « !\t analogit, fragmentit ja johdannaiset sitoutuvat (esim. muita f”; FAS~R:eita tai sen kaltaisia reseptoreita), ja joiden toimintaan ne sen vuoksi myös osallistuvat.

*;··: Lisäksi tämän keksinnön tarkoituksena on käyttää edellä ; mainittuja MORT-l-proteiinia, analogeja, fragmentteja ja johdannaisia antigeeneinä polyklonaalisten ja/tai monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseen niitä kohtaan. Vasta-aineita voidaan puolestaan käyttää esimerkiksi uuden MORT-l-proteiinin puhdistamiseen eri 10 lähteistä, kuten solu-uutteista tai transformoiduista solulinj öistä.

Lisäksi näitä vasta-aineita voidaan käyttää diagnostisiin tarkoituksiin, esim. tunnistamaan sairauksia, jotka liittyvät FAS-R-reseptorin välittämien soluvaikutusten epänormaaliin toimintaan.

Vielä keksinnön tarkoituksena on antaa käyttöön farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät edellä mainittua MORT-l-proteiinia, sen analogeja, fragmentteja tai johdannaisia, samoin kuin farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät edellä mainittuja vasta-aineita tai muita antagonistej a.

Tämän keksinnön mukaan olemme löytäneet uuden proteiinin, joka kykenee sitoutumaan FAS-R:n intrasellulaariseen domeeniin. Tämä FAS-IC:n sitojaproteiini voi toimia FAS-R:n ligandin soluvaikutuksen välittäjänä tai modulaattorina välittämällä tai moduloimalla solunsisäistä viestinsiirtoa, joka tapahtuu tavallisesti sen jälkeen, kun FAS-R:n ligandi ° , on sitoutunut solun pinnalle.

6 s s il? *!**, Tämä uusi proteiini on nimetty HFl:ksi tai MORT-l:ksi * s- s ,1 ' ("Mediator of Receptor Toxicity"), ja sen FAS-IC:n sitomisspesif isyyden lisäksi sillä on muita ominaisuuksia (katso esimerkki 1). Sillä on esimerkiksi p55-TNF-R:n ja >«»( FAS-R:n "kuolemadomeeneille" (DD) (p55-DD:lle ja FAS-DD:lle) .,,,; homologinen alue, jonka avulla myös se kykenee ,· , itseassosioitumaan. MORT-1 kykenee myös itse aktivoimaan o 9 ;s,“ solun sytotoksisuuden. Tämä aktiivisuus liittyy I 9 T mahdollisesti sen itseassosioitumiskykyyn. Nyt on havaittu s s- a myös se, että sellaisen MORT-l:n (HFl:n) alueen >*‘ samanaikainen ilmentyminen (coexpression), joka sisältää 11 "kuolemadomeenille" homologisen sekvenssin (MORT-DD:n, sijaitsee MORT-l:n C-terminaalisessa osassa), häiritsee voimakkaasti FAS:n indusoimaa solukuolemaa, mikä onkin odotettavissa sen kyvyn perusteella sitoutua FAS-IC:n "kuolemadomeeniin". Lisäksi samoissa koeolosuhteissa havaittiin, että sen MORT-l:n osan, joka ei sisällä MORT-DD-aluetta (MORT-l:n N-terminaalinen osa, aminohapot 1-117, "MORT-l-pää") samanaikainen ilmentäminen (koekspressio) ei häirinnyt FAS:n indusoimaa solukuolemaa ja se jonkin verran kohotti, jos lainkaan, FAS:n indusoimaa solun sytotoksisuutta.

Niinpä tämä keksintö antaa käyttöön DNA-sekvenssin, joka koodaa tässä MORT-l:ksi nimettyä proteiinia, sen analogeja tai fragmentteja, jotka kaikki kykenevät sitoutumaan FAS- ligandin reseptorin intrasellulaariseen domeeniin (FAS-IC:hen) tai olemaan vuorovaikutuksessa sen kanssa.

Erityisesti keksintö antaa käyttöön DNA-sekvenssin, joka on joku seuraavista: li (a) cDNA-sekvenssi, joka saadaan natiivin MORT-l-proteiinin koodaavasta alueesta; *%, (b) DNA-sekvenssit, jotka kykenevät hybridisoitumaan (a)- ; ; kohdan cDNA:han kohtuullisen ankarissa olosuhteissa ja jotka koodaavat biologisesti aktiivista FAS-R:n intrasellulaarisen domeenin sitojaproteiinia; ja :*»J (c) DNA-sekvenssit, jotka ovat degeneroituneita kohdissa (a) ;***; ja (b) määriteltyjen DNA-sekvenssien geneettisen koodin degeneraation seurauksena ja jotka koodaavat biologisesti /··, aktiivista FAS-R:n intrasellulaarisen domeenin sitojaproteiinia.

12

Edellä mainitun keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin spesifinen suoritustapa koskee DNA-sekvenssiä, joka koodaa MORT-l-proteiinia, joka sisältää kuvassa 4 esitetyn sekvenssin.

Tämä keksintö koskee myös MORT-l-proteiinia, sen analogeja, fragmentteja tai johdannaisia, joita jokin keksinnön mukaisista edellä mainituista sekvensseistä koodaa. Mainitut proteiinit, analogit, fragmentit ja johdannaiset kykenevät sitoutumaan FAS-R:n intrasellulaariseen domeeniin tai olemaan vuorovaikutuksessa sen kanssa.

Edellä mainitun keksinnön mukaisen proteiinin spesifinen suoritustapa on MORT-l-proteiini, jolla on kuvassa 4 esitetty johdettu aminohapposekvenssi.

Vielä tämä keksintö antaa käyttöön vektoreita, jotka koodaavat edellä mainittua keksinnön mukaista MORT-l-proteiinia, sen analogeja, fragmentteja tai johdannaisia, jotka sisältävät edellä mainitun keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin, näitä vektoreita voidaan ilmentää sopivissa eukaryoottisissa tai prokaryoottisissa isäntäsoluissa; näitä ; t vektoreita sisältäviä transformoituja eukaryoottisia tai * prokaryoottisia isäntäsoluja; sekä menetelmän M0RT-1- proteiinin ja sen analogien tuottamiseksi olosuhteissa, jotka sopivat mainitun proteiinin, analogien, fragmenttien tai johdannaisten ilmentämiseen, toteuttamalla mainitun proteiinin aikaansaamiseksi välttämättömät mainitun proteiinin posttranslationaaliset modifikaatiot sekä uuttamalla mainittu ilmentynyt proteiini, analogit, • _ fragmentit tai johdannaiset mainittujen transformoitujen ’*<s* solujen kasvualustasta tai mainittujen transformoitujen *** solujen solu-uutteista.

Vielä eräässä näkökohdassa keksintö antaa käyttöön vasta- 13 aineita tai niiden aktiivisia johdannaisia tai fragmentteja, jotka ovat spesifisiä keksinnön mukaiselle M0RT-1-proteiinille, sen analogeille, fragmenteille ja j ohdannaisille.

Edelleen yhtenä keksinnön näkökohtana tarjotaan käyttöön edellä mainittujen DNA-sekvenssien tai niiden koodaamien keksinnön mukaisten proteiinien erilaisia käyttötapoja, joita ovat muun muassa: (i) menetelmä FAS-R:n ligandin vaikutuksen moduloimiseksi FAS-R:ia kantavissa soluissa, jossa menetelmässä mainittuja soluja käsitellään keksinnön mukaisella yhdellä tai useammalla MORT-l-proteiinilla tai fragmentilla, jotka kaikki kykenevät sitoutumaan intrasellulaariseen domeeniin ja moduloimaan mainitun FAS-R:n aktiivisuutta, jossa menetelmässä mainitussa solujen käsittelyssä mainittuihin soluihin viedään sisään yksi tai useampi mainittu M0RT-1-proteiini tai fragmentti solun sisään viemiseen sopivassa muodossa tai mainittuihin soluihin viedään DNA-sekvenssi, joka koodaa yhtä tai useampaa mainittua proteiinia tai fragmenttia, sopivana mainitun sekvenssin sisältävänä «** ilmentämisvektorina, joka kykenee aikaansaamaan mainitun sekvenssin insertoitumisen mainittuihin soluihin siten, että e n mainittu sekvenssi ilmentyy mainituissa soluissa; s s s . S- Φ e (ii) menetelmä FÄS-R:n ligandin vaikutuksen moduloimiseksi soluissa, jossa menetelmässä mainittuja soluja käsitellään MORT-l:llä tai fragmentilla, jotka kaikki kykenevät >*.J sitoutumaan intrasellulaariseen domeeniin ja modifioimaan .*"*» FAS-R:n aktiivisuutta, jossa menetelmässä mainitussa solujen h käsittelyssä mainittuihin soluihin viedään mainittu MORT-1 tai fragmentti solun sisään viemiseen sopivassa muodossa tai mainittuihin soluihin viedään DNA-sekvenssi, joka koodaa 14 mainittua MORT-l:tä tai sen fragmenttia sopivana mainitun sekvenssin sisältävänä vektorina, joka kykenee aikaansaamaan mainitun sekvenssin insertoitumisen mainittuihin soluihin siten, että mainittu sekvenssi ilmentyy mainituissa soluissa.

(iii) menetelmä kuten edellä kohdassa (ii), jossa menetelmässä mainittujen solujen mainitulla käsittelyllä tarkoitetaan mainittujen solujen transfektoimista yhdistelmäeläinvirusvektorilla, jossa menetelmässä: (a) rakennetaan yhdistelmäeläinvirusvektori, joka sisältää sekvenssin, joka koodaa sellaista viraalista pintaproteiinia (ligandia), joka kykenee sitoutumaan spesifiseen solun pinnan reseptoriin FAS-R:ia kantavan solun pinnalla, ja toisen sekvenssin, joka koodaa keksinnön mukaista M0RT-1-proteiinia, sen analogia, fragmenttia tai johdannaista, joka kykenee mainituissa soluissa ilmennyttyään moduloimaan mainitun FAS-R:n aktiivisuutta; ja (b) mainitut solut infektoidaan mainitulla kohdan (a) e 2 “ . vektorilla.

(iv) menetelmä FAS-R:n ligandin vaikutuksen moduloimiseksi * » * m es ,1 * FAS-R:ia kantavissa soluissa, jossa menetelmässä mainittuja

* P

soluja käsitellään keksinnön mukaisilla vasta-aineilla tai » # s r # s niiden aktiivisilla johdannaisilla tai fragmenteilla, jolla = mainitulla käsittelyllä tarkoitetaan sopivan vasta-aineita, niiden aktiivisia fragmentteja tai johdannaisia sisältävän • s koostumuksen applikaatiota mainittuihin soluihin, jossa menetelmässä silloin kun mainituissa soluissa olevat M0RT-1-y’ proteiinit tai niiden osat ovat paljaina solun ulkopinnalla, mainittu koostumus formuloidaan ekstrasellulaariseen ’..k applikaatioon, ja kun mainitut MORT-l-proteiinit ovat solun 15 sisällä, mainittu koostumus formuloidaan intrasellulaariseen applikaatioon; (v) menetelmä FAS-R:n ligandin vaikutuksen moduloimiseksi FAS-R:ia kantavissa soluissa, jossa menetelmässä mainittuja soluja käsitellään sellaisella oligonukleotidisekvenssillä, joka koodaa keksinnön mukaisen, ainakin osittaisen M0RT-1-sekvenssin antisense-sekvenssiä, mainittu oligonukleotidi-sekvenssi kykenee estämään MORT-l-proteiinin ilmentymisen; (vi) menetelmä kuten edellä kohdassa (v), jossa menetelmässä mainitulla solujen käsittelyllä tarkoitetaan mainittujen solujen transfektoimista yhdistelmäeläinvirusvektorilla, jossa menetelmässä: (a) rakennetaan yhdistelmäeläinvirusvektori, joka sisältää sekvenssin, joka koodaa sellaista viraalista pintaproteiinia (ligandia), joka kykenee sitoutumaan spesifiseen solun pinnan reseptoriin FAS-R:ia kantavan solun pinnalla, ja toisen sekvenssin, joka on oligonukleotidisekvenssi, joka koodaa keksinnön mukaisen, ainakin osittaisen M0RT-1-sekvenssin anti-sense-sekvenssiä, mainittu oligonukleot idi-<;· sekvenssi kykenee estämään MORT-l-proteiinin ilmentymisen mainittuihin soluihin mainitulla viruksella vietynä; ja T: (b) mainitut solut infektoidaan mainitulla kohdan (a) vektorilla· Γ": (vii) menetelmä kasvainsolujen tai HIV-infektoitujen solujen tai muiden sairaussolujen käsittelemiseksi, jossa **h menetelmässä: •h, (a) rakennetaan yhdistelmäeläinvirusvektori, joka sisältää sekvenssin, joka koodaa sellaista viraalista pinta- 16 proteiinia, joka kykenee sitoutumaan kasvainsolun pinnan reseptoriin tai HIV-infektoidun solun pinnan reseptoriin tai muulla sairaussolulla olevaan solun pinnan reseptoriin, ja sekvenssin, joka koodaa keksinnön mukaista MORT-l-proteiinia tai fragmenttia, joka kykenee ilmennyttyään mainitussa kasvainsolussa, HIV-infektoidussa solussa tai muussa sairaussolussa tuhoamaan mainitun solun; ja (b) mainitut kasvain- tai HIV-infektoidut tai muut sairaussolut infektoidaan mainitulla kohdan (a) vektorilla.

(viii) menetelmä FAS-R:n ligandin vaikutuksen moduloimiseksi soluissa, jossa menetelmässä käytetään ribotsyymimenetelmää, jossa sellaista ribotsyymisekvenssiä koodaava vektori, joka kykenee olemaan vuorovaikutuksessa keksinnön mukaista MORT-l-proteiinia koodaavan sellulaarisen mRNA-sekvenssin kanssa, viedään mainittuihin soluihin sellaisessa muodossa, että mainitun ribotsyymisekvenssin ilmentyminen mainituissa soluissa on mahdollista, ja jossa menetelmässä mainittu ribotsyymisekvenssi mainituissa soluissa ilmennyttyään on vuorovaikutuksessa mainitun sellulaarisen mRNA-sekvenssin * „ kanssa ja pilkkoo mainitun mRNA-sekvenssin, mikä johtaa "V mainitun MORT-l-proteiinin ilmentymisen inhiboitumiseen mainituissa soluissa; (ix) jokin edellä mainituista menetelmistä, jossa mainittu MORT-l-proteiini tai mainittua MORT-l-proteiinia koodaava # sekvenssi sisältää ainakin osan FAS-IC:hen spesifisesti * # sitoutuvasta MORT-l-proteiinista, tai ainakin sitä MORT-l:n osaa koodaavan sekvenssin, joka koodaa spesifisesti FAS-IC:hen sitoutuvaa MORT-l-proteiinin osaa; (x) menetelmä sellaisen proteiinin eristämiseksi ja a tunnistamiseksi, joka kykenee sitoutumaan FAS-R:n 17 intrasellulaariseen domeeniin, jossa menetelmässä käytetään sallivien olosuhteiden southern-hybridisaatiota ja sen jälkeen PCR-kloonausta, jossa keksinnön mukaista sekvenssiä tai sen osia käytetään koettimena sitomaan cDNA- tai genomisesta DNA-kirjastosta peräisin olevia sekvenssejä, joilla on siihen ainakin osittainen homologia, sitten mainitut sitoutuneet sekvenssit monistetaan ja kloonataan PCR-menetelmällä, jolloin saadaan klooneja, jotka koodaavat proteiineja, joilla on ainakin osittainen homologia mainittujen keksinnön mukaisten sekvenssien kanssa.

Keksintö antaa käyttöön myös farmaseuttisen koostumuksen FAS-ligandin vaikutuksen moduloimiseksi soluissa, joka koostumus sisältää aktiivisena aineosanaan jotakin seuraavista: (i) keksinnön mukaista MORT-l-proteiinia, sen biologisesti aktiivisia fragmentteja, tai niiden seoksia; (ii) yhdistelmäeläinvirusvektorin, joka koodaa sellaista proteiinia, joka kykenee sitoutumaan solun pinnan reseptoriin, ja joka koodaa keksinnön mukaista M0RT-1-J ; proteiinia tai sen biologisesti aktiivisia fragmentteja tai ,1Γ analogeja; ja (iii) keksinnön mukaisen MORT-l-sekvenssin * $ , *: anti-sense-sekvenssiä koodaavan oligonukleotidisekvenssin, s ** joka mainittu oligonukleotidisekvenssi voi olla edellä «* * kohdassa (ii) mainitun yhdistelmäeläinvirusvektorin toinen sekvenssi.

Tulee mainita, että MORT-l:ssä on erillinen alue, joka ,*«» sitoutuu FAS-IC:hen, ja toinen erillinen alue, joka ,,,* osallistuu MORT-l:n itseassosiaatioon, ja niinpä näitä **· erillisiä alueita tai niiden osia voidaan käyttää toisistaan riippumatta identifioimaan muita proteiineja, reseptoreja, ym., jotka kykenevät sitoutumaan MORT-l:een tai FAS-R:iin ja 18 jotka voivat osallistua MORT-l:een tai FAS-R:iin liittyviin solunsisäisiin viestitysprosesseihin. Lisäksi MORT-l:llä voi olla muita aktiivisuuksia, jotka liittyvät jompaan kumpaan edellä mainittuun erilliseen alueeseen tai muihin MORT-l:n alueisiin tai niidenkombinaatioihin, esimerkiksi sellainen entsymaattinen aktiivisuus, joka voi liittyä MORT-l:n itse aikaansaamiin solusytotoksisiin vaikutuksiin. Siten MORT-1 voidaan myös käyttää sellaisten proteiinien, peptidien, jne. spesifiseen tunnistamiseen, jotka voivat osallistua MORT-l:stä johtuviin muihin aktiivisuuksiin.

Keksintö antaa käyttöön myös muita näkökantoja ja suoritustapoja, jotka ilmenevät seuraavasta keksinnön yksityiskohtaisesta kuvauksesta.

Tulee huomata, että läpi koko tekstin käytettynä ilmaisujen "FAS-ligandin vaikutuksen moduloiminen soluissa" ja "MORT-l:n vaikutuksen moduloiminen soluissa" tarkoitetaan käsittävän sekä in vitro että in vivo -käsittelyn.

Kuvissa 1 A ja B esitetään kopiot SDS-PAGE-geelien (10%:inen * , akryyliamidi) autoradiogrammeista, jotka osoittavat HFl:n s s * “V (MORTl:n) ja FAS-IC:n välisen vuorovaikutuksen in vitro.

Kuvassa IA esitetään kontrolliautoradiogrammi, joka on saatu ,! ' proteiinien (peräisin sellaisten HeLa-solujen uutteista, jotka on transfektoitu FLAG-HFl- (FLAG-M0RT1) fuusioproteiinin tai lusiferaasin cDNA:lla (kontrolli)) immunosakoilla. Immunosaostus tehtiin anti-FLAG-vasta- s aineella; ja e e

Kuvassa IB esitetään vastaavan sellaisen geelin d’ autoradiogrammi, joka ajettiin HFl:n ja FAS-IC:n välisen in ».d vitro -vuorovaikutuksen arvioimiseksi määrittämällä d.d autoradiografisesti sellaisen [35S]-metioniinileimatun HFl:n 19 sitoutuminen, joka oli tuotettu transfektoiduissa HeLa-soluissa fuusioproteiinina FLAG-oktapeptidin kanssa (FLAG-M0RT1), GST:hen, ihmisen ja hiiren GST-FAS-IC-fuusioproteiiniin (GST-huFAS-IC, GST-mFAS-IC) ja sellaiseen GST-FAS-IC-fuusioproteiiniin, jossa FAS-IC:ssä oli mutaatio, jossa Ile korvautui Ala:lla asemassa 225 (GST-mFAS-IC I225A). HeLa-solujen [35S]-leimatut proteiinit, joihin sisältyi leimattu FLAG-MORTl-fuusioproteiini, saatettiin niiden uuttamisen jälkeen vuorovaikutukseen erilaisten GSTiiden ja GST-FAS-IC-proteiinien (sidottu glutationi-helmiin) kanssa, minkä jälkeen tehtiin SDS-PAGE. Kaikissa vuorovaikutuskokeissa käytettiin kontrolleina lusiferaasilla transfektoiduista HeLa-soluista saatuja uutteita, jotka saatettiin vuorovaikutukseen GST:n ja GST-FAS-IC-fuusioproteiinien kanssa, minkä jälkeen niille tehtiin SDS-PAGE. Kuvat 1 A ja B selostetaan myös esimerkissä 1.

Kuvissa 2 A, B ja C esitetään kopiot sellaisten SDS-PAGE-geelien (10%:inen akryyliamidi) autoradiogrammeista, joilla eroteltiin erilaisia transfektoiduista HeLa-soluista peräisin olevia immunosakkoja, ja jotka osoittavat HFl:n ,·; (MORTlrn) ja FAS-IC:n välisen vuorovaikutuksen in vivo.

.1:* HeLa-solut transfektoitiin DNA-konstrukteilla, jotka . *: koodasivat: pelkästään HF1-FLAG- (FLAG-M0RT1) fuusioproteiinia, HFl-FLAG-fuusioproteiinia ja ihmisen FAS-»* * R:ia (FLAG-M0RT1 + Fas/APOl) tai pelkästään ihmisen FAS-R:ia (kuva 2A) ; tai HFl-FLAG-fuusioproteiinia ja ihmisen p55R:ia **·' (FLAG-M0RT1 + p55R) (kuva 2B) ; tai HFl-FLAG-fuusioproteiinia ja FAS-R:n ja p55R:n muodostamaa kimeeristä , fuusioproteiinia, jossa FAS-R:n ekstrasellulaarinen domeeni on korvattu p55-R:n vastaavalla alueella (FLAG-MORT1 + p55- s »· FAS -kimeera) tai pelkästään FAS-R-p55-R kimeeristä fuusioproteiinia (p55-Fas-kimeeraa) (kuva 2C) . Kaikissa tapauksissa transfektoidut solut leimattiin metabolisesti 20 [35S]-kysteiinillä (20 pCi/ml) ja [35S] -metioniinilla (40 yCi/ml) ja niille tehtiin proteiiniuutto. Sitten eri transfektoiduista soluista saadut proteiiniuutteet immunosaostettiin erilaisilla vasta-aineilla, joita vasta-aineita olivat anti-FLAG, anti-FAS, anti-p75-R ja anti-p55-R (AFLAG, AFAS, Ap75-R ja Ap55-R kuvissa 2A-C), ja niille tehtiin SDS-PAGE. Kuvan 2A vasemmalla puolella esitetään FAS-R:ia (Fas/APOl) ja HFl-FLAG:ia (FLAG-MORT1) vastaavat proteiinivyöhykkeet; kuvien 2A ja B välissä osoitetaan standardimolekyylipainomerkkien (kDarna) suhteelliset sijainnit; ja kuvan 2C oikealla puolella esitetään p55R:ia ja p55-FAS-kimeeraa vastaavat proteiinivyöhykkeet. Myös kuvat 2A-C selostetaan esimerkissä 1.

Kuvassa 3 esitetään kopio Northern blot-analyysistä, jossa transfektoiduista HeLa-soluista peräisin olevaa polyA+RNA:ta (0,3 pg) hybridisoitiin HFlrn cDNA:n kanssa, kuten esimerkissä 1 kuvataan.

Kuvassa 4 esitetään kaavamaisesti HFlrn alustava nukleotidi-ja johdettu aminohapposekvenssi, kuten esimerkissä 1 ; ^ kuvataan, jossa kuvassa "kuolemadomeeni" on alleviivattu *'*/ samoin kuin mahdollinen translaation aloituskohta, so.

'***. alleviivattu metioniinitähde asemassa 49 (lihavoitu, alle- ’ viivattu M) . Tähdellä osoitetaan translaation lopetuskodoni (nukleotidit 769-771). Kunkin rivin alussa ja keskellä on kaksi lukua, jotka kuvaavat sekvenssin nukleotidien ja aminohappojen suhteellisia sijainteja sekvenssin alusta (5'-^ % pää) lähtien. Ensimmäinen luku tarkoittaa nukleotidia ja toinen luku tarkoittaa aminohappoa.

'p Kuvassa 5 esitetään MORT-l:n C-terminaalisen pään määrittämiseksi suoritettujen kokeiden tulokset. Kuva 5 on kopio sellaisen SDS-PAGE-geelin (10%:inen akryyliamidi) 21 autoradiogrammista, jolla eroteltiin erilaisia M0RT1-FLAG-fuusiotuotteita, jotka olivat ilmentyneet HeLa-soluissa ja leimattu 35S-kysteiinillä ja 35S-metioniinilla, minkä jälkeen tehtiin immunosaostus joko anti-FLAG monoklonaalisilla vasta-aineilla (M2) (raidat 2, 4 ja 6) tai kontrollina käytetyillä anti-p75 TNF-R-vasta-aineilla (#9) (raidat 1, 3 ja 5), kuten esimerkissä 1 kuvataan.

Kuvassa 6 (A ja B) esitetään graafisesti ligandista riippumattomien soluja tuhoavien vaikutusten laukaisu MORT-l:llä transfektoiduissa soluissa, solujen elävyys määritettiin joko neutraalipunaisen ottomäärityksellä (kuva 6A) tai transfektoitua DNA:ta ilmentävien solujen elävyys määritettiin spesifisesti mittaamalla kasvualustaan erittyneen istukkaperäisen alkalisen fosfataasin määrä (kuva 6B) . HeLa-solut transfektoitiin tetrasykliinin säätelemillä ilmentämisvektoreilla, jotka koodasivat HF1:tä (MORTlrtä), ihmisen FAS-IC:tä, ihmisen p55-IC:tä tai lusiferaasia (kontrolli), ja kaikissa tapauksissa myös eritettävää alkalista fosfataasia koodaavalla cDNA:lla, jonka avulla voitiin arvioida näiden proteiinien lyhytaikaisen .: I ilmentymisen aiheuttama vaikutus solujen elinkykyyn.

,»I Molemmissa kuvissa 6A ja 6B avoimet pylväät edustavat » ” tetrasykliinin läsnäollessa (1 yg/ml, estää ilmentymisen) *' kasvatettuja transfektoituja soluja ja täytetyt pylväät ·* edustavat transfektoituja soluja, jotka on kasvatettu tetrasykliinin puuttuessa. Myös kuvat 6A ja 6B selostetaan **** esimerkissä 1.

ase*

Kuvassa 7 esitetään graafisesti MORT-l-proteiinin eri osien vaikutukset FAS-R:n välittämiin solusytotoksisiin ”· vaikutuksiin, kuten esimerkissä 1 kuvataan.

Keksinnön yksi näkökohta koskee uutta proteiinia MORT-1 22 (HF1), joka kykenee sitoutumaan TNF/NGF-superperheeseen kuuluvan FAS-R-reseptorin intrasellulaariseen domeeniin, minkä vuoksi sitä pidetään FAS-R:n välittäjänä tai modulaattorina, jolla on merkitystä esimerkiksi viestinsiirtoprosessissa, joka saa alkunsa FAS-ligandin sitoutuessa FAS-R:iin. Myös keksinnön mukaisen MORT-l:n aminohappo- ja DNA-sekvenssit ovat uusia sekvenssejä; niitä ei ole DNA- tai aminohapposekvenssitietopankeissa 'GENEBANK' tai 'PROTEIN BANK’.

Näin ollen tämä keksintö koskee DNA-sekvenssiä, joka koodaa MORT-l-proteiinia, ja näiden DNA-sekvenssien koodaamaa MORT-1-proteiinia.

Lisäksi tämä keksintö koskee myös DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat MORT-l-proteiinin biologisesti aktiivisia fragmentteja, sekä näiden sekvenssien koodaamia fragmentteja. Tällaiset fragmentit valmistetaan tavanomaisella menetelmällä (katso esim. Sambrook et ai., 1989), jossa MORT-l-proteiinia koodaavissa DNA-sekvensseissä oleva yksi tai useampi kodoni voidaan poistaa, lisätä tai * , substituoida toisella, jolloin saadaan analogeja, joissa on natiiviin proteiiniin nähden vähintään yhden aminohappo-*'**, tähteen muutos. Hyväksyttäviä ovat sellaiset analogit, * joissa säilyy ainakin kyky sitoutua FAS-R:n intra- sellulaariseen domeeniin tai jotka voivat välittää jotakin muuta sitoutumis- tai entsymaattista aktiivisuutta, esim.

, analogit, jotka sitovat FAS-IC:tä mutta eivät välitä φ 19 "*· signaalia, so. eivät sitoudu edempänä alavirrassa olevaan • t reseptoriin, proteiiniin tai muuhun faktoriin, tai eivät / katalysoi signaalista riippuvaa reaktiota. Siten voidaan tuottaa analogeja, joilla on niin kutsuttu dominantti-negatiivinen vaikutus, nimittäin analogi, joka on puutteellinen joko sitoutumisessa FAS-IC:hen tai tällaisen 23 sitoutumisen jälkeisessä viestinsiirrossa. Sellaisia analogeja voidaan käyttää esimerkiksi inhiboimaan FAS-ligandin vaikutus kilpailemalla luontaisten FAS-IC:n sitojaproteiinien kanssa. Samoin voidaan tuottaa niin kutsuttuja dominanttipositiivisia analogeja, jotka toimisivat FAS-ligandivaikutuksen voimistajina. Näillä olisi samanlaiset tai paremmat FAS-IC:n sitomisominaisuudet ja samanlaiset tai paremmat viestinsiirto-ominaisuudet kuin luontaisilla FAS-IC:n sitojaproteiineilla. Analogisella tavalla edellä mainittujen MORT-l:n analogien kanssa voidaan valmistaa MORT-l:n biologisesti aktiivisia fragmentteja. Sopivia MORT-l:n fragmentteja ovat ne, jotka säilyttävät FAS-IC:n sitomiskyvyn tai jotka voivat välittää jotakin muuta edellä mainittua sitoutumis- tai entsymaattista aktiivisuutta. Niinpä voidaan valmistaa MORT-l-fragmentteja, joilla on edellä analogien yhteydessä mainittu dominanttinegatiivinen tai dominanttipositiivinen vaikutus. Tulee huomata, että nämä fragmentit tarkoittavat tiettyä keksinnön mukaisten analogien luokkaa, ne ovat nimittäin kokonaisesta MORT-l-sekvenssistä peräisin olevia määrättyjä MORT-l:n osia, joilla jokaisella osalla tai fragmentilla on .f: jokin edellä mainituista halutuista aktiivisuuksista.

s

Samalla tavoin voidaan valmistaa johdannaisia modifioimalla # s , *ί tavanomaisin keinoin MORT-l-proteiinin, sen analogien tai fragmenttien yhden tai useamman aminohappotähteen sivuryhmiä *’ “ tai konjugoimalla MORT-l-proteiini, sen analogeja tai johdannaisia toiseen molekyyliin, esim. vasta-aineeseen, ··* entsyymiin, reseptoriin, ym., kuten alalla hyvin tunnetaan.

a e *· * ,*·· Uudella MORT-l-proteiinilla, sen fragmenteilla on monia , ,1 käyttömahdollisuuksia, esimerkiksi: 1

Niitä voidaan käyttää jäljittelemään tai voimistamaan FAS-ligandin toimintaa tilanteissa, joissa FAS-R-ligandin 24 voimistunut vaikutus on toivottavaa, kuten kasvaimenvastaisissa, tulehduksenvastaisissa tai HIV:n vastaisissa sovelluksissa, kun FAS-R:n ligandin indusoima sytotoksisuus on toivottavaa. Tässä tapauksessa M0RT-1-proteiini, sen analogit, fragmentit tai johdannaiset, jotka voimistavat FAS-R:n ligandin vaikutusta, so. sytotoksista vaikutusta, voidaan panna soluihin yleisillä, per se tunnetuilla menetelmillä. Esimerkiksi koska MORT-l-proteiini on intrasellulaarinen ja se tulisi viedä vain niihin soluihin, joissa FAS-R-ligandin vaikutus on suotavaa, järjestelmä tämän proteiinin spesifiseksi soluihin viemiseksi on välttämätön. Yksi keino tämän tekemiseksi on muodostaa yhdistelmäeläinvirus, esim. Vaccinia-peräinen, jonka DNA:han pannaan seuraavat kaksi geeniä: geeni, joka koodaa solujen spesifisesti ilmentämiin solun pinnan proteiineihin sitoutuvaa ligandia, sellaisia ovat esimerkiksi AIDS- (HIV)-viruksen gp!20-proteiini, joka sitoutuu spesifisesti eräisiin soluihin (CD4-lymfosyytit ja niihin liittyvät leukemiat), tai muuta spesifisesti FAS-R:ia kantaviin soluihin sitoutuvaa ligandia, niin että yhdistelmävirusvektori kykenee sitomaan näitä FAS-R:n ; . sisältäviä soluja; ja MORT-l-proteiinia koodaava geeni.

”V Niinpä solunpinnan sitojaproteiinin ilmentyminen viruksen T\ pinnalla kohdistaa viruksen spesifisesti kasvainsoluun tai ’ muuhun FAS-R:ia kantavaan soluun, minkä jälkeen MORT-1- ”... proteiinia koodaava sekvenssi viedään soluihin viruksen välityksellä ja kun se on kerran soluissa ilmentynyt, FAS-R-,· >· ligandin vaikutus voimistuu, mikä johtaa kasvainsolujen tai , 1 muiden sellaisten FAS-R:ia sisältävien solujen kuolemaan, * jotka halutaan tuhota. Tällaisia yhdistelmäeläinviruksia konstruoidaan tavanomaisilla menetelmillä (katso esimerkiksi T Sambrook et ai., 1989). Toinen mahdollisuus on M0RT-1- • , proteiinin sekvenssien sisäänvienti sellaisten oligo- nukleotidien muodossa, joita solut voivat absorboida ja 25 ilmentää. Vielä yksi mahdollisuus on modifioida menetelmää, joka on kuvattu artikkelissa Lin et ai., Journal of Biological Chemistry, voi. 270, no. 24, s. 14255-14258, 1995.

(ii) Niitä voidaan käyttää inhiboimaan FAS-R:n ligandin vaikutusta, esim. sellaisissa tapauksissa kuin kudosvaurio septisessä sokissa, siirrännäisen ja isännän välinen hylkimisreaktio tai akuutti maksatulehdus, jolloin FAS-R-ligandin indusoiman FAS-R:n solunsisäinen viestinsiirto halutaan estää. Tässä tapauksessa on mahdollista esimerkiksi viedä soluihin tavanomaisilla menetelmillä oligo-nukleotideja, joissa on MORT-l-proteiinin anti-sense-sekvenssiä koodaava sekvenssi, joka estäisi tehokkaasti MORT-l-proteiinia koodaavien mRNA:iden translaation, mikä estää sen ilmentymisen ja johtaa FAS-R-ligandin vaikutuksen inhibitioon. Sellaisia oligonukleotideja voidaan viedä soluihin käyttämällä edellä mainittua yhdistelmäviruskeinoa, jolloin toinen viruksen sisältämä sekvenssi on oligonukleotidisekvenssi.

9 J * Toinen mahdollisuus on käyttää MORT-l-proteiinille „'** spesifisiä vasta-aineita inhiboimaan sen solunsisäinen .*·§ viestinsiirtoaktiivisuus.

.· * Vielä yksi tapa inhiboida FAS-R:n ligandin vaikutusta on äskettäin kehitelty ribotsyymitapa. Ribotsyymit ovat »».* katalyyttisiä RNA-molekyylejä, jotka pilkkovat spesifisesti ' * RNA-molekyylejä. Ribotsyymejä voidaan muokata pilkkomaan *.» valittuja kohde-RNA: itä, esim. keksinnön mukaista MORT-1- ,ί proteiinia koodaavia mRNArita. Sellaisilla ribotsyymeillä h. olisi MORT-l:n mRNArlle spesifinen sekvenssi ja se kykenisi ” olemaan vuorovaikutuksessa sen kanssa (komplementaarinen sitoutuminen), jota seuraisi mRNA:n pilkkominen, mikä johtaa 26 MORT-l-proteiinin ilmentymisen vähenemiseen (tai täydelliseen häviämiseen), ilmentymistason väheneminen riippuu ribotsyymin ilmentymistasosta kohdesolussa. Ribotsyymien viemiseen valittuihin soluihin (esim. FAS-R:ia sisältäviin soluihin) voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa vektoria, esim. plasmidia, eläinvirus- (retrovirus-) vektoreita (katso myös edellä kohta (i)), jossa viruksella on toisena sekvenssinä cDNA, joka koodaa valittua ribotsyymisekvenssiä. (Ribotsyymejä koskevia katsauksia, menetelmiä ym. löytyy artikkeleista Chen et ai., 1992; Zhao ja Pick, 1993; Shore et ai., 1993; Joseph ja Burke, 1993; Shimayama et ai., 1993; Cantor et ai., 1993; Barinaga, 1993; Crisell et ai., 1993; ja Koizumi et ai., 1993).

(iii) Niitä voidaan käyttää eristämään, tunnistamaan ja kloonaamaan muita proteiineja, jotka kykenevät sitoutumaan niihin, esim. muita solunsisäiseen viestinsiirtoon osallistuvia proteiineja, jotka sijaitsevat alavirtaan TNF-R:n tai FAS-R:n intrasellulaarista domeenia. Esimerkiksi MORT-l-proteiinia, nimittäin sitä koodaavaa DNA-sekvenssiä voidaan käyttää hiivan kaksihybridijärjestelmässä (katso , jäljempänä esimerkki 1), jossa MORT-l-proteiinin sekvenssiä **," käytetään "syöttinä" eristämään, kloonaamaan ja tunnistamaan !”» cDNA- tai genomisista DNA-kirjastoista muita sekvenssejä ’ ' ("saaliita"), jotka koodaavat MORT-l-proteiiniin sitoutumaan kykeneviä proteiineja. Samalla tavoin voidaan myös määrittää, voiko keksinnön mukainen MORT-l-proteiini sitoutua muihin sellulaarisiin proteiineihin, esimerkiksi .muihin TNF/NGF-superperheen reseptoreihin.

(iv) MORT-l-proteiinia tai sen fragmentteja voidaan käyttää myös eristämään, tunnistamaan ja kloonaamaan muita samaan luokkaan kuuluvia proteiineja, so. niitä, jotka sitoutuvat 1=1 FAS-R:n intrasellulaariseen domeeniin tai niiden kanssa 27 toiminnallisesti samankaltaisiin reseptoreihin, ja jotka osallistuvat solunsisäiseen viestitysprosessiin. Tässä sovelluksessa voidaan käyttää edellä mainittua hiivan kaksihybridijärjestelmää tai sitten voidaan käyttää äskettäin kehitettyä (Wilks et ai., 1989) menetelmää, jossa käytetään sallivien olosuhteiden southern-hybridisaatiota, jonka jälkeen tehdään PCR-kloonaus. Wilksin ym. julkaisussa kuvataan kahden oletetun proteiini-tyrosiinikinaasin tunnistus ja kloonauskäyttämällä sallivaa southern-hybridisaatiota ja sen jälkeen PCR-kloonausta, joka perustui tunnettuun kinaasimotiivin sekvenssiin, "perustavaan" (conceived) kinaasisekvenssiin. Tätä keinoa voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisesti käyttämällä MORT-l-proteiinin sekvenssiä tunnistamaan ja kloonaamaan vastaavia FAS-R:n intrasellulaarisen domeenin sitojaproteiineja.

(v) Vielä yksi tapa käyttää keksinnön mukaista M0RT-1-proteiinia tai sen fragmentteja on niiden käyttäminen affiniteettikromatografiamenetelmissä eristämään ja tunnistamaan muita proteiineja tai faktoreita, joihin ne kykenevät sitoutumaan, esim. muita FAS-R:iden kaltaisia ; : reseptoreita tai muita solunsisäiseen viestinsiirtoon osallistuvia proteiineja tai faktoreita. Tässä sovelluksessa *! keksinnön mukainen MORT-l-proteiini, sen analogeja, ** fragmentteja tai johdannaisia voidaan kiinnittää erikseen affiniteettikromatografiamatrikseihin ja saattaa sen jälkeen yhteyteen solu-uutteiden tai sellaisten eristettyjen proteiinien tai faktorien kanssa, joiden arvellaan 1 ?, s osallistuvan solunsisäiseen viestinsiirtoprosessiin.

* Af finiteettikromatografiän jälkeen keksinnön mukaiseen MORT- , f 1-proteiiniin tai sen fragmentteihin sitoutuneet muut p proteiinit tai faktorit voidaan eluoida, eristää ja karakterisoida.

28 (vi) Kuten edellä on mainittu, keksinnön mukaista MORT-1- proteiinia tai sen fragmentteja voidaan käyttää myös immunogeeneinä (antigeeneinä) tuottamaan niitä vastaan spesifisiä vasta-aineita. Näitä vasta-aineita voidaan käyttää myös MORT-l-proteiinin puhdistamiseen joko solu-uutteista tai MORT-l-proteiinia, sen analogeja tai fragmentteja tuottavista transformoiduista solulinjöistä. Lisäksi näitä vasta-aineita voidaan käyttää diagnostisiin tarkoituksiin tunnistamaan sairauksia, jotka liittyvät FAS-R:n ligandijärjestelmän poikkeavaan toimintaan, esim. liian runsaisiin tai liian vähäisiin FAS-R-ligandin indusoimiin soluvaikutuksiin. Niinpä jos nämä sairaudet liittyvät sellaiseen virheelliseen solunsisäiseen viestitys-järjestelmään, johon MORT-l-proteiini osallistuu, nämä vasta-aineet toimisivat tärkeänä diagnostisena välineenä.

(vii) MORT-l:tä voidaan käyttää myös monien muiden proteiinien välillisenä modulaattorina, koska se kykenee sitoutumaan muihin intrasellulaarisiin proteiineihin (niin kutsuttuihin MORT-l:n sitojaproteiineihin, katso jäljempänä), jotka sitovat suoraan vielä muita ° 5 intrasellulaarisia proteiineja tai transmembraaniproteiinin “’V intrasellulaarisen domeenin. Esimerkkinä sellaisesta proteiinista tai sellaisesta intrasellulaarisesta domeenista s ' ’ on hyvin tunnettu p55-TNF-reseptori, jonka intra- *,,r sellulaarista viestinsiirtoa moduloivat monet sellaiset # e <>

S * S

proteiinit, jotka sitoutuvat suoraan sen intrasellulaariseen ... domeeniin (katso samaan aikaan haussa oleva IL 109632) . Itse e - '‘A asiassa olemme eristäneet sellaisen MORT-l:n S ί sitojaproteiinin (katso jäljempänä ja esimerkki 2), joka y'* sitoutuu p55-TNF-reseptorin intrasellulaariseen domeeniin.

If Näiden muiden intrasellulaaristen proteiinien tai transmembraaniproteiinien intrasellulaaristen domeenien 29 moduloimiseksi MORI-1 voidaan viedä soluihin monilla tavoilla, kuten edellä on kohdassa (ii) mainittu.

Tulee huomata myös se, että keksinnön mukaisen MORT-1-proteiinin eristys, tunnistus ja karakterisointi voidaan suorittaa käyttämällä mitä tahansa hyvin tunnetuista tavanomaisista seulontamenetelmistä. Esimerkiksi yhtä sellaista seulontamenetelmää, jäljempänä (esimerkki 1) esitettyä hiivan kaksihybridimenetelmää, käytettiin keksinnön mukaisen MORT-l-proteiinin tunnistamiseen. Samoin kuten edellä ja jäljempänä mainitaan, muita alalla hyvin tunnettuja menetelmiä, kuten affiniteettikromatografiaa, DNA-hybridisaatiomenetelmiä, ym. voidaan käyttää keksinnön mukaisen MORT-l-proteiinin eristämiseen, tunnistamiseen ja karakterisointiin tai sellaisten muiden proteiinien, faktorien, reseptorien, ym. eristämiseen, tunnistamiseen ja karakterisointiin, jotka kykenevät sitoutumaan keksinnön mukaiseen MORT-l-proteiiniin.

Lisäksi tulee huomata myös se, että MORT-l:n ominaisuuksiin kuuluu sen kyky sitoutua FAS-IC:hen sekä myös sen kyky e ; itseassosioitua. MORT-1 kykenee myös itse aktivoimaan solusytotoksisuuden, joka aktiivisuus liittyy sen a Λ; itseassosioitumiskykyyn. Näyttää siltä (esimerkki 1), että se MORT-1:n osa, joka sitoutuu FAS-IC:hen, eroaa siitä MORT- 5 s ,* 5 l:n osasta, joka osallistuu itseassosiomtiin. MORT-1 :llä voi olla myös muita aktiivisuuksia, jotka voivat olla edellä mainittujen MORT-l-molekyylin erillisten osien tai molekyylin muiden osien tai joidenkin näiden osien V; kombinaatioiden toimintoja. Nämä muut aktiivisuudet voivat 1 olla entsymaattisia tai liittyä muiden proteiinien (esim.

MORT-1:n sitojaproteiinien tai muiden reseptorien, faktorien, jne.) sitomiseen. Näin ollen MORT-1:tä voidaan käyttää edellä mainituissa menetelmissä moduloimaan FAS-R- 30 ligandin vaikutuksia tai sen omia MORT-l-välitteisiä soluvaikutuksia, tai sitä voidaan käyttää moduloimaan muita, muihin reseptoreihin, faktoreihin, jne. liittyviä solun viestitysprosessej a.

Yksityiskohtaisemmin tämän keksinnön näkökannan avulla itse MORT-l:tä koodaavaa DNA-molekyyliä ja sen mutaatioita (so. koodaavat MORT-l:n analogeja tai aktiivisia fragmentteja) voidaan käyttää geeniterapiaan (so., tavoilla, jotka on esitetty edellä kohtien (i) ja (ii) käyttötavoissa) moduloimaan FAS-R:n aktiivisuutta (tai moduloimaan tai välittämään FAS-ligandin vaikutusta soluihin). Lisäksi koska MORT-l:llä on myös sytotoksista vaikutusta soluihin, näitä MORT-l:tä tai mutantti-MORT-1:tä koodaavia DNA-molekyylejä voidaan käyttää myös geeniterapiaan moduloimaan MORT-l:n vaikutusta soluihin (samoin edellä kohtien (i) ja (ii) käyttötavoilla). Näissä geeniterapiasovelluksissa MORT-l:tä, analogeja tai johdannaisia voidaan käyttää kolmella tavalla: a) FAS-R:iin tai MORT-l:een liittyvien vaikutusten e » l ** modulointiin voidaan käyttää kokonaista MORT-l-proteiinia, I,: : tai sen aktiivisia fragmentteja, joilla on kyky sitoa sekä FAS-IC:tä että MORT-l:tä (so. sisältävät MORT-l:n kaksi ** '1 aluetta, joista toinen osallistuu sitoutumiseen FAS-IC:hen • " ja toinen osallistuu MORT-l:n itseassosiointiin); b) FAS-IC:hen sitoutuvaa MORT-l:n osaa ja tämän osan '··*’ aktiivisia fragmentteja voidaan käyttää indusoimaan "dominanttinegatiivinen" vaikutus FAS-IC:hen, so.

.*** inhiboimaan FAS-R-välitteisiä soluvaikutuksia, tai indusoimaan hyödyllinen (gain of function) vaikutus FAS-i’ IC:hen, so. voimistamaan FAS-R-välitteisiä soluvaikutuksia; 3a 31 c) spesifisesti MORT-l:een sitoutuvaa MORT-l:n osaa ja tämän osan aktiivisia fragmentteja voidaan käyttää indusoimaan "dominanttinegatiivinen" tai hyödyllinen (gain of function) vaikutus MORT-l:een, so. joko inhiboimaan tai voimistamaan MORT-1-välitteisiä soluvaikutuksia.

Kuten edellä kohdan (vi) mukaisessa käyttötavassa esitetään, MORT-l-proteiinia voidaan käyttää muodostamaan MORT-1:lie spesifisiä vasta-aineita. Näitä vasta-aineita tai niiden fragmentteja voidaan käyttää, kuten jäljempänä yksityiskohtaisesti esitetään, ymmärtäen, että vasta-aineet tai niiden fragmentit tarkoittavat niissä sovelluksissa MORT-1:lie spesifisiä vasta-aineita ja niiden fragmentteja.

Tässä läpi tekstin vasta-aineita käsiteltäessä termiin "vasta-aine" tarkoitetaan sisältyvän polyklonaaliset vasta-aineet, monoklonaaliset vasta-aineet (mAbs), kimeeriset vasta-aineet, anti-idiotyyppiset (anti-id) vasta-aineet vasta-aineille, jotka voidaan leimata liukoisessa tai sitoutuneessa muodossa, samoin kuin niiden fragmentit, jotka saadaan millä tahansa tunnetulla tekniikalla, kuten muun *;· muassa entsymaattisella pilkonnalla, peptidisynteesi- tai yhdistelmätekniikoilla.

: ί Polyklonaaliset vasta-aineet ovat sellaisten vasta- ainemolekyylien heterogeenisiä joukkoja, jotka ovat peräisin antigeenillä immunisoitujen eläinten seerumeista.

’* Monoklonaalinen vasta-aine sisältää pääosin homogeenisen v;* antigeeneille spesifisten vasta-aineiden joukon, jossa joukossa on pääosin samanlaiset epitoopinsitojakohdat. Monoklonaalisia vasta-aineita (MAbs) voidaan saada alan *\, asiantuntijoiden tuntemilla menetelmillä. Katso esim. Kohler ja Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); US-patentti 4,376,110; Ausubel et ai., toim., Harlow ja Lane ANTIBODIES: 32 A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); ja Colligan et al., toim., Current Protocols in Immunology, Greene publishing Assoc, ja Wiley Interscience N.Y., (1992, 1993), joiden viitteiden sisällöt sisällytetään tähän kokonaisuudessaan viitteenä. Nämä vasta-aineet voivat olla mitä tahansa immunoglobuliiniluokkaa, mukaan lukien IgG, IgM, IgE, IgA, GILD ja kaikki näiden alaluokat. Tämän keksinnön mukaista mAb:tä tuottavaa hybridoomaa voidaan viljellä in vitro, in situ tai in vivo. Korkeiden mAbs-titterien tuotanto in vivo tai in situ tekee siitä tällä hetkellä edullisen tuotantomenetelmän.

Kimeeriset vasta-aineet ovat molekyylejä, joiden eri osat ovat peräisin eri eläinlajeista, kuten esimerkiksi sellaisia, joissa on muriinin mAb:stä peräisin oleva muunteleva alue ja ihmisen immunoglobuliinin vakioalue. Kimeerisiä vasta-aineita käytetään pääasiassa alentamaan immunogeenisyyttä käytössä ja lisäämään saantoja valmistuksessa, esimerkiksi silloin, kun muriini-mAbs:eitä saadaan korkeampina saantoina hybridoomista mutta niiden ; ** immunogeenisuus on korkeampi ihmisissä, käytetään LA: esimerkiksi kimeerisiä ihmis/muriini-mAbs:eitä. Kimeeriset vasta-aineet ja niiden tuotantomenetelmät tunnetaan alalla ’« '» (Cabilly et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 3273-3277 : *’ (1984); Morrison et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: '·" ' 6851-6855 (1984); Boulianne et ai., Nature 312: 643-646 (1984); Cabilly et ai., EP-patenttihakemus 125023 (julkaistu '’** 14. marraskuuta, 1984); Neuberger et ai., Nature 314: 268-

S 0 f. - S

270 (1985); Taniguchi et ai., EP-patenttihakemus 171496 (julkaistu 19. helmikuuta, 1985); Morrison et ai., EP-l.l patenttihakemus 173494 (julkaistu 5. maaliskuuta, 1986);

Neuberger et ai., PCT-hakemus WO 8601533 (julkaistu 13.

: ; maaliskuuta, 1986); Kudo et ai., EP-patenttihakemus 184187 (julkaistu 11. kesäkuuta, 1986); Sahagan et ai., J. Immunol.

33 137: 1066-1074 (1986); Robinson et ai., kansainvälinen patenttihakemus WO8702671 (julkaistu 7. toukokuuta, 1987); Liu et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 3439-3443 (1987);

Sun et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 214-218 (1987);

Better et ai., Science 240: 1041-1043 (1988); ja Harlow ja

Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra. Nämä viitteet sisällytetään tähän kokonaisuudessaan viitteenä.

Anti-idiotyyppinen (anti-Id) vasta-aine on vasta-aine, joka tunnistaa ainutlaatuiset determinantit, joita liittyy tavallisesti vasta-aineen antigeeninsitojakohtaan. Id-vasta-aine voidaan valmistaa immunisoimalla saman lajin ja samaa geneettistä tyyppiä oleva eläin (esim. hiirikanta), joka on MAb:n lähteenä, mAb:lla, jota vastaan anti-Id:tä valmistetaan. Immunisoitu eläin tunnistaa ja vastaa immunisoivan vasta-aineen idiotyyppisiin determinantteihin tuottamalla vasta-ainetta näille idiotyyppisille determinanteille (anti-Id-vasta-ainetta). Katso esim. US-patentti 4,699,880, joka sisällytetään tähän %, kokonaisuudessaan viitteenä.

a » *·· Anti-Id-vasta-ainetta voidaan käyttää myös "immunogeeninä" *.* indusoimaan immuunivaste vielä toisessa eläimessä, jolloin ·.» muodostuu niin kutsuttua anti-anti-Id-vasta-ainetta. Anti- Γ; anti-Id-vasta-aine voi olla epitooppisesti identtinen alkuperäisen mAb:n kanssa, joka indusoi anti-Id:n. Näin ; ollen käyttämällä vasta-aineita mAb:n idiotyyppisille ‘d determinanteille, on mahdollista tunnistaa muita klooneja, , ; jotka ilmentävät vasta-aineita, joilla on identtinen % spesifisyys.

!I Niinpä mAbs:eita, jotka on muodostettu keksinnön mukaista MORT-l-proteiinia, sen analogeja, fragmentteja tai johdannaisia vastaan, voidaan käyttää indusoimaan anti-Id- 34 vasta-aineita sopivissa eläimissä, kuten BALB/c-hiirissä. Tällaisista immunisoiduista hiiristä otettuja pernasoluja käytetään tuottamaananti-Id-hybridoomia, jotka erittävät anti-Id-mAbs:eitä. Anti-Id-mAb:t voidaan edelleen kytkeä sellaiseen kantajaan kuin esimerkiksi avaimenreikäkotilon hemosyaniini (KLH) ja käyttää immunisoimaan lisää BALB/c-hiiriä. Näistä hiiristä otetut seerumit sisältävät anti-anti-Id-vasta-aineita, joilla on sellaisen alkuperäisen mAb:n sitoutumisominaisuudet, joka on spesifinen edellä mainitun MORT-l-proteiinin, sen analogien, fragmenttien tai johdannaisten epitoopille.

Anti-Id-mAb:eilla on siten omat idiotyyppiset epitooppinsa eli "idiotoopit", jotka muistuttavat rakenteeltaan arvioitavaa epitooppia, esimerkiksi GRB-proteiini-A:aa.

Termiin "vasta-aine" tarkoitetaan sisältyvän myös sekä kokonaiset molekyylit että niiden fragmentit, kuten esimerkiksi Fab ja F(ab')2, jotka kykenevät sitomaan antigeenin. Fab- ja F (ab')2~fragmenteista puuttuu : *·* kokonaisen vasta-aineen Fc-fragmentti, ne poistuvat ί,ΐ ; nopeammin verenkierrosta ja niillä saattaa olla vähemmän ,»·; epäspesifistä kudossitoutumista kuin kokonaisella vasta- *. h aineella (Wahl et ai., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).

5 On selvää, että Fab:tä ja F (ab')2: ta sekä muita tässä keksinnössä käyttökelpoisia vasta-aineiden fragmentteja *”p voidaan käyttää toteamaan ja kvantifioimaan MORT-l-proteiini tässä kuvattujen, kokonaisia vasta-ainemolekyylejä koskevien */·* menetelmien mukaisesti. Sellaisia fragmentteja tuotetaan i„* tyypillisesti proteolyyttisellä pilkonnalla käyttämällä *** sellaisia entsyymejä kuin esimerkiksi papaiini (Fab- :......: fragmenttien tuottamiseen) tai pepsiini (F(ab')2~ fragmenttien tuottamiseen).

35

Vasta-aineen sanotaan "kykenevän sitomaan" molekyylin, jos se kykenee spesifisesti reagoimaan molekyylin kanssa siten, että molekyyli sitoutuu vasta-aineeseen. Termillä "epitooppi" tarkoitetaan minkä tahansa molekyylin sitä osaa, jonka vasta-aine voi sitoa ja jonka tämä vasta-aine myös kykenee tunnistamaan. Epitoopit eli "antigeeniset determinantit" koostuvattavallisesti kemiallisesti aktiivisista molekyylien pintaryhmistä, kuten esimerkiksi aminohapoista tai sokerisivuketjuista, ja niillä on spesifiset kolmiulotteiset rakenneominaisuudet samoin kuin spesifiset varausominaisuudet.

"Antigeeni" on molekyyli tai molekyylin osa, jonka vasta-aine kykenee sitomaan ja joka lisäksi kykenee indusoimaan eläimen tuottamaan vasta-ainetta, joka kykenee sitoutumaan tämän antigeenin epitooppiin. Antigeenissä voi olla yksi tai useampi epitooppi. Spesifisellä reaktiolla, johon edellä viitattiin, tarkoitetaan, että antigeeni reagoi erittäin valikoivasti sitä vastaavan vasta-aineen kanssa eikä *\s moninaisten muiden vasta-aineiden kanssa, joita ehkä muut > *'. antigeenit herättävät.

' ft # 9 s # t « « β Tässä keksinnössä käyttökelpoisia vasta-aineita, mukaan ä m ; lukien vasta-aineiden fragmentit, voidaan käyttää toteamaan : Γ: kvantitatiivisesti tai kvalitatiivisesti MORT-1 näytteestä tai toteamaan sellaisten solujen läsnäolo, jotka ilmentävät • keksinnön mukaista MORT-1 :tä. Tämä voidaan toteuttaa immunof luoresenssitekniikoilla, joissa käytetään fluoresoivasti leimattua vasta-ainetta (katso jäljempänä), " * joka (tekniikka) on yhdistetty valomikroskooppi-, \ virtaussytometria- tai fluorometridetektioon.

Tässä keksinnössä käyttökelpoisia vasta-aineita (tai niiden fragmentteja) voidaan käyttää histologisesti, kuten 36 immunofluoresenssi- tai immunoelektronimikroskopiassa, keksinnön mukaisen MORT-l:n in situ -toteamiseen. In situ -toteaminen voidaan tehdä ottamalla potilaasta kudosnäyte ja saattamalla keksinnön mukainen leimattu vasta-aine sellaiseen näytteeseen. Vasta-ainetta (tai fragmenttia) käytetään edullisesti siten, että leimattu vasta-aine (tai fragmentti) pannaan biologiseen näytteeseen tai näyte päällystetään sillä. Tällaisella menetelmällä on mahdollista määrittää MORT-l:n läsnäolon lisäksi myös sen jakautuminen tarkasteltavassa kudoksessa. Tätä keksintöä käyttämällä alaa tunteva ymmärtää helposti, että tällaisen in situ toteamisen aikaansaamiseksi voidaan modifioida monia erilaisia histologisia menetelmiä (kuten esimerkiksi värjäysmenetelmiä).

Sellaisissa keksinnön mukaisten MORT-l:n määrityksissä inkuboidaan tavallisesti biologista näytettä, kuten esimerkiksi biologista nestettä, kudosuutetta, juuri talteen otettuja soluja, kuten lymfosyyttejä tai leukosyyttejä, tai soluja, joita on inkuboitu kudosviljelmässä, sellaisen : 1 toteamiskelpoisesti leimatun vasta-aineen kanssa, joka S' 3 l.l * kykenee tunnistamaan MORT-l-proteiinin, ja vasta-aine ...Ϊ todetaan jollain lukuisista alalla hyvin tunnetuista * » « ** ” tekniikoista.

' Biologista näytettä voidaan käsitellä kiinteäfaasisella tuella tai kantajalla, kuten esimerkiksi nitroselluloosalla, tai muulla kiinteällä tuella tai kantajalla, joka kykenee . immobilisoimaan solut, solupartikkelit tai liukoiset proteiinit. Tuki tai kantaja voidaan sitten pestä sopivilla . » puskureilla, minkä jälkeen seuraa käsittely toteamis- !’ kelpoisesti leimatulla edellä mainitulla keksinnön i Ί mukaisella vasta-aineella. Tämän jälkeen kiinteäfaasinen tuki tai kantaja voidaan pestä toisen kerran puskurilla 37 sitoutumattoman vasta-aineen poistamiseksi. Sitten mainitulle kiinteälle tuelle tai kantajalle sitoutuneen leiman määrä voidaan todeta tavanomaisin keinoin.

"Kiinteäfaasisella tuella", "kiinteäfaasisella kantajalla", "kiinteällä tuella", "kiinteällä kantajalla", "tuella" tai "kantajalla" tarkoitetaan mitä tahansa tukea tai kantajaa, joka kykenee sitomaan antigeeniä tai vasta-aineita. Hyvin tunnettuja tukia tai kantajia ovat lasi, polystyreeni, polypropyleeni, polyeteeni, dekstraani, nailonamylaasit, luontaiset ja modifioidut selluloosat, polyakryyliamidit, gabrot ja magnetiitti. Kantaja voi tämän keksinnön tarkoituksiin olla joko jossain määrin liukoinen tai liukenematon. Tukimateriaalilla voi olla käytännöllisesti katsoen mikä tahansa mahdollinen rakenteellinen konfiguraatio kunhan kytketty molekyyli kykenee sitoutumaan antigeeniin tai vasta-aineeseen. Tuen tai kantajan konfiguraatio voi siten olla pallomainen, kuten helmissä, sylinterimäinen, kuten testiputken sisäpinnassa tai sauvan

Xulkopinnassa. Vaihtoehtoisesti pinta voi olla sileä, kuten «> • arkissa (sheet), testisuikaleessa, jne. Polystyreenihelmet *;· ovat edullisia tukia tai kantajia. Alan asiantuntijat tietävät tai saavat rutiinikokein selville monia muita : vasta-aineen tai antigeenin sitomiseen sopivia kantajia.

Keksinnön mukaisen vasta-aineen, kuten edellä on mainittu, tietyn erän sitoutumisaktiivisuus voidaan määrittää hyvin *”*» tunnettujen menetelmien mukaisesti. Alan asiantuntijat kykenevät määrittämään kullekin määritykselle operatiiviset ja optimaaliset määritysolosuhteet rutiinikokeita ja käyttämällä.

Muut vaiheet, kuten pesu, sekoitus, ravistelu, suodatus ja vastaavat, voidaan lisätä määrityksiin sen mukaan, mikä 38 tietyssä tilanteessa on tavanomaista tai välttämätöntä.

Yksi keino, jolla keksinnön mukainen vasta-aine voidaan toteamiskelpoisesti leimata, on kytkeä tämä vasta-aine entsyymiin ja käyttää entsyymi-immunologista määritystä (EIA:ta). Tämä entsyymi puolestaan reagoi sitten, kun se myöhemmin altistetaan sopivalle substraatille, substraatin kanssa niin, että muodostuu kemiallinen osa, joka voidaan todeta esimerkiksi spektrofotometrisesti, fluorimetrisesti tai visuaalisesti. Sellaisia entsyymejä, joita voidaan käyttää vasta-aineen toteamiskelpoiseen leimaamiseen, ovat muun muassa malaattidehydrogenaasi, stafylokokkaalinen nukleaasi, delta-5-steroidi-isomeraasi (isomeras), hiivan alkoholidehydrogenaasi, alfa-glyserofosfaattidehydrogenaasi, trioosifosfaatti-isomeraasi, piparjuuriperoksidaasi, alkalinen fosfataasi, asparaginaasi, glukoosioksidaasi, beta-galaktosidaasi, ribonukleaasi, ureaasi, katalaasi, glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi, glukoamylaasi ja asetyylikoliiniesteraasi. Toteaminen voidaan suorittaa kolorimetrisin menetelmin, joissa entsyymille käytetään : '** kromogeenistä substraattia. Toteaminen voidaan suorittaa i myös vertaamalla visuaalisesti substraatin entsyymireaktion .«.h suuruutta samalla tavalla valmistettuihin standardeihin.

* s * « o ‘ ** Toteaminen voidaan tehdä käyttämällä monenlaisia muita *** 4 immuunimääritysmenetelmiä. Esimerkiksi vasta-aineiden tai vasta-ainefragmenttien radioaktiivisella leimauksella on mahdollista todeta R-PTPaasi käyttämällä radioimmuuni- -¾ s S 9 määritystä (RIA:ta) . RIArsta löytyy hyvä kuvaus teoksesta Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work, T. S. et al., North Holland Publishing Company, NY ’V (1978), erityisesti T. Chardin kappaleessa "An Introduction 1 to Radioimmune Assay and Related Techniques", joka sisällytetään tähän viitteenä. Radioaktiivinen isotooppi 39 voidaan todeta sellaisin keinoin kuin esimerkiksi käyttämällä -laskinta tai tuikelaskinta tai autoradiograafisesti.

Keksinnön mukainen vasta-aine on mahdollista leimata myös fluoresoivalla yhdisteellä. Kun fluoresoivasti leimattu vasta-aine altistetaan oikean aallonpituiselle valolle, sen läsnäolo voidaan todeta fluoresenssista. Kaikkein yleisimmin käytettyjä fluoresoivia leimayhdisteitä ovat fluoreskeiini-isotiosyanaatti, rodamiini, fykoerytriini, fykosyaniini, allofykosyaniini, o-ftaalialdehydi ja fluoreskamiini.

Vasta-aine voidaan leimata toteamiskelpoisesti myös käyttämällä fluoresenssia emittoivia metalleja, kuten esimerkiksi 152E:tä tai muita lantanidisarjan metalleja. Nämä metallit voidaan kiinnittää vasta-aineeseen käyttämällä sellaisia metallin kelaattiryhmiä kuin dietyleenitriamiinipentaetikkahappo (ETPA).

• Vasta-aine voidaan leimata toteamiskelpoisesti myös fj kytkemällä se kemiluminoivaan yhdisteeseen. Sen jälkeen *· kemiluminoivasti merkityn vasta-aineen läsnäolo määritetään \t toteamalla kemiallisen reaktion aikana muodostuneen luminesenssin läsnäolo. Erityisen käyttökelpoisia kemiluminoivia leimayhdisteitä ovat esimerkiksi luminoli, isoluminoli, teromaattinen (theromatic) akridiniumesteri, ί imidatsoli, akridiniumsuola ja oksalaattiesteri.

: Samalla tavalla keksinnön mukaisen vasta-aineen leimaamiseen *» voidaan käyttää bioluminoivaa yhdistettä. Bioluminesenssi on , kemiluminesenssin muoto, jota tavataan biologisissa v järjestelmissä, jossa katalyyttinen proteiini lisää kemiluminesenssireaktion tehokkuutta. Bioluminesoivan proteiinin läsnäolo määritetään toteamalla luminesenssin 40 läsnäolo. Leimaamiseen tärkeitä bioluminesoivia yhdisteitä ovat lusiferiini, lusiferaasi ja aequorin.

Keksinnön mukainen vasta-ainemolekyyli voidaan sovittaa käytettäväksi immunometrisessä määrityksessä, joka tunnetaan myös nimillä "kaksipaikkainen" (two-site) tai "voileipä" (sandwich) -määritys. Tyypillisessä immunometrisessä määrityksessä erä leimaamatonta vasta-ainetta (tai vasta-aineen fragmenttia) sidotaan kiinteälle tuelle tai kantajalle ja erä toteamiskelpoisesti leimattua liukoista vasta-ainetta lisätään, jotta kiinteäfaasisen vasta-aineen, antigeenin ja leimatun vasta-aineen välille muodostunut ternaarinen kompleksi voidaan todeta ja/tai kvantifioida.

Tyypillisiä ja edullisia immunometrisiä määrityksiä ovat "forward"-määritykset, joissa kiinteään faasiin sidottu vasta-aine saatetaan ensin yhteyteen tutkittavan näytteen kanssa uuttamaan näytteestä antigeeni muodostamalla binaarinen kiinteän faasin vasta-aineen ja antigeenin välinen kompleksi. Sopivan inkubointiajan jälkeen kiinteä : ** tuki tai kantaja pestään nestemäisen näytteen mahdollisen ·'· · jäännöksen, mukaan lukien reagoimaton antigeeni, ·“’· poistamiseksi ja saatetaan sitten yhteyteen sellaisen * liuoksen kanssa, joka sisältää tuntemattoman määrän leimattua vasta-ainetta (joka toimii "reportteri-* molekyylinä"). Toisen inkubointijakson jälkeen, jonka aikana . . leimatun vasta-aineen annetaan muodostaa kompleksi sellaisen , antigeenin kanssa, joka on sidottu leimaamattoman vasta- » φ aineen välityksellä kiinteään tukeen tai kantajaan, kiinteä k '* tuki tai kantaja pestään toisen kerran reagoimattoman '*··* leimatun vasta-aineen poistamiseksi.

,,,* Toisentyyppisessä "sandwich"-määrityksessä, joka myös voi olla käyttökelpoinen keksinnön mukaisten antigeenien kanssa, 41 käytetään niin kutsuttuja "simultaani-" ("simultaneous") ja "reverse"-määrityksiä. Simultaanimääritys sisältää yhden inkubointijakson, koska sekä kiinteään tukeen tai kantajaan sidottu vasta-aine että leimattu vasta-aine lisätään tutkittavaan näytteeseen samalla kertaa. Kun inkubointi on suoritettu loppuun, kiinteä tuki tai kantaja pestään nestemäisen näytteen jäännöksen ja kompleksoimattoman leimatun vasta-aineen poistamiseksi. Kiinteään tukeen tai kantajaan sitoutuneen leimatun vasta-aineen määrä määritetään sitten aivan kuin tavanomaisessa "forward"-sandwich-määrityksessä.

"Reverse"-määrityksessä käytetään asteittaista lisäystä, jossa nestemäiseen näytteeseen lisätään ensin leimatun vasta-aineen liuosta, minkä jälkeen lisätään leimaamatonta vasta-ainetta, joka on sidottu kiinteään tukeen tai kantajaan, sopivan inkubointiajan kuluttua. Toisen inkuboinnin jälkeen kiinteä faasi pestään tavanomaisella tavalla, jotta siitä poistuisi tutkittavan näytteen jäännös ja reagoimatonta leimattua vasta-ainetta sisältävä liuos. Kiinteään tukeen tai kantajaan sitoutuneen leimatun vasta-**» aineen määrä määritetään sitten aivan kuin "simultaani"- ja *·.· "f orward"-määrityksissä.

:: Keksinnön mukaista MORT-l:tä voidaan tuottaa millä tahansa tavanomaisella yhdistelmä-DNA-tekniikalla (katso esimerkiksi , Sambrook et ai., 1989), jossa sopivat eukaryoottiset tai prokaryoottiset isäntäsolut transformoidaan sopivilla %J eukaryoottisilla tai prokaryoottisilla vektoreilla, jotka sisältävät proteiineja koodaavia sekvenssejä. Niinpä tämä *. keksintö koskee myös sellaisia ilmentämisvektoreita ja • transformoituja isäntiä keksinnön mukaisten proteiinien tuottamiseen. Kuten edellä on mainittu, näihin proteiineihin sisältyvät myös niiden biologisesti aktiiviset analogit, 42 fragmentit ja johdannaiset, ja siten myös niitä koodaaviin vektoreihin sisältyvät vektorit, jotka koodaavat näiden proteiinien analogeja ja fragmentteja, ja transformoituihin isäntiin kuuluvat ne, jotka tuottavat näitä analogeja ja fragmentteja. Näiden proteiinien johdannaiset ovat johdannaisia, jotka on tuotettu transformoitujen isäntien tuottamien proteiinien tai niiden analogien tai fragmenttien tavanomaisella modifikaatiolla.

Tämä keksintö koskee myös farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät MORT-l-proteiinia koodaavia yhdistelmäeläinvirus-vektoreita, joka vektori koodaa myös viruksen sellaista pintaproteiinia, joka kykenee sitomaan spesifisen kohdesolun (esim. syöpäsolujen) pintaproteiineja, niin että MORT-1-sekvenssi ohjautuu insertoitumaan soluihin. Muita keksinnön näkökantoja ilmenee seuraavista esimerkeistä.

Keksintöä kuvataan nyt yksityiskohtaisemmin seuraavilla keksintöä rajoittamattomilla esimerkeillä ja liitteenä olevilla piirroksilla:

Ui ESIMERKKI 1 FAS-R:n intrasellulaariseen domeeniin sitoutuvan MORT-1-’· *: proteiinin kloonaus ja eristys *’ * (i) Kaksihybridiseulonta ja kaksihybridin β-galaktosidaasin ilmentämistesti ä FAS-R:n intrasellulaarisen domeenin kanssa ‘Ui vuorovaikutuksessa olevien proteiinien eristämiseen käytettiin hiivan kaksihybridijärjestelmää (Fields ja Song, *r 1989, katso myös samaan aikaan haussa olevat IL 109632, = 112002 ja 112692). Lyhyesti sanottuna tämä kaksihybridijärjestelmä on hiivaan perustuva geneettinen 43 määritys spesifisten proteiini-proteiinivuorovaikutusten toteamiseen in vivo, jossa menetelmässä rekonstruoidaan (restoration) eukaryoottinen transkription aktivaattori, kuten esimerkiksi GAL4, jossa on kaksi erillistä domeenia, DNA:n sitojadomeeni ja aktivaatiodomeeni, kun domeenit ilmennetään ja sidotaan toisiinsa rekonstruoidun GAL4-proteiinin muodostamiseksi, aktivaattori kykenee sitoutumaan ylävirran aktivaatiosekvenssiin, joka puolestaan aktivoi promoottorin, joka säätelee sellaisen reportterigeenin ilmentymistä kuin esimerkiksi IacZ tai HIS3, jonka ilmentyminen havaitaan helposti viljellyistä soluista. Tässä järjestelmässä vuorovaikutuksessa olevien proteiini-ehdokkaiden geenit kloonataan erillisiin ilmentämis- vektoreihin. Toisessa ilmentämisvektorissa kloonataan yhden ehdokasproteiinin sekvenssi sovitettuna GAL4:n DNA:n sitojadomeenin sekvenssin kanssa siten, että muodostuu hybridiproteiini GAL4:n DNA:n sitojadomeenin kanssa, ja toisessa vektorissa kloonataan toisen ehdokasproteiinin sekvenssi sovitettuna GAL4:n aktivaatiodomeenin sekvenssin kanssa siten, että muodostuu hybridiproteiini GAL4:n « « ,*, aktivaatiodomeenin kanssa. Sitten kaksi hybridivektoria A. kotransformoidaan hiivaisäntäkantaan, jossa on IacZ- tai *»J HIS3-reportterigeeni ylävirran GAL4:n sitojakohtien säätelyn alaisena. Vain ne transformoidut isäntäsolut *;’j (kotransformantit) , joissa kaksi hybridiproteiinia ilmentyy ja jotka kykenevät olemaan vuorovaikutuksessa toistensa **"; kanssa, kykenevät ilmentämään reportterigeenin. LacZ- ;··; reportterigeenin kohdalla tämän geenin ilmentävät ·. \ isäntäsolut tulevat väriltään sinisiksi, kun viljelmiin lisätään X-gal:ia. Siniset pesäkkeet ilmaisevat siten sen, *, että kaksi kloonattua ehdokasproteiinia kykenevät olemaan l',l vuorovaikutuksessa toistensa kanssa.

Tätä kaksihybridijärjestelmää käyttäen kloonattiin erikseen 44 intrasellulaarinen domeeni, FAS-IC, vektoriin pGBT9 (jossa on GAL4:n DNA:n sitojasekvenssi, joka vektori saatiin CLONTECHiltä, USA, katso jäljempänä), jolloin muodostui fuusioproteiineja GAL4:n DNA:n sitojadomeenin kanssa. FAS-R:n kloonaamiseksi pGBT9:ään käytettiin FAS-R:n täysipituista cDNA-sekvenssiä (katso yhdessä haussa oleva IL 111125) koodaavaa kloonia, josta irrotettiin intrasellulaarinen domeeni (IC) yleisillä menetelmillä käyttäen erilaisia restriktioentsyymejä, minkä jälkeen se eristettiin yleisillä menetelmillä ja insertoitiin vastaavilla sopivilla restriktioentsyymeillä avattuun pGBT9-vektoriin sen monikloonauskohdan (MCS, multiple cloning site) alueella. Tulee huomata, että FAS-IC ulottuukokonaisen FAS-R:n tähteiden 175-319 alueelle, tämä tähteet 175-319 sisältävä osa on pGBT9-vektoriin insertoitu FAS-IC (katso myös IL 111125).

Sitten edellä mainittu hybridi- (kimeerinen) -vektori kotransfektoitiin HF7c-hiivakantaan yhdessä ihmisen HeLa-soluista peräisin olevan sellaisen cDNA-kirjaston kanssa, joka on kloonattu pGAD GH -vektoriin, joka sisältää GAL4:n ·. aktivaatiodomeenin (kaikki edellä mainitut vektorit, pGBT9 ja pGAD GH, joka sisältää HeLa-solun cDNA-kir j aston, sekä .1, hiivakanta hankittiin yhtiöltä Clontech Laboratories, Inc., USA, osana MATCHMAKER Two-Hybrid Systemiä, #PT1265-1). f- Kotransfektoidut hiivat valikoitiin niiden kyvyn perusteella

Uit kasvaa kasvualustalla, josta puuttuu histidiini (His~- kasvualusta), kasvavat pesäkkeet ilmaisevat positiiviset i *; transformantit. Sitten valikoiduista hiivaklooneista

•n-'* tutkittiin niiden kyky ilmentää IacZ-geeniä, so. niiden LAC

,·. Z -aktiivisuus, ja tämä tehtiin lisäämällä viljelyalastaan ,*** X-gal:ia, joka katabolisoituu IacZ-geenin koodaaman entsyymin β-galaktosidaasin muodostaessa sinistä tuotetta, h Siniset pesäkkeet ilmaisevat siten aktiivisen IacZ-geenin.

45

LacZ-geenin aktiivisuudelle on välttämätöntä, että GAL4:n transkription aktivaattori on transformoiduissa klooneissa aktiivisessa muodossa, nimittäin että toisen edellä mainituista hybridivektoreista koodaama GAL4:n DNA: n sitojadomeeni yhdistetään oikein toisen hybridivektorin koodaaman GAL4:n aktivaatiodomeenin kanssa. Sellainen kombinaatio on mahdollinen vain, jos nämä kaksi proteiinia, jotka on fuusioitu kuhunkin GAL4-domeeniin, kykenevät olemaan pysyvästi vuorovaikutuksessa (sitoutumaan) toistensa kanssa. Siten eristetyt His+- ja siniset (LAC Z+) -pesäkkeet ovat pesäkkeitä, jotka on kotransfektoitu FAS-IC:tä koodaavalla vektorilla ja vektorilla, joka koodaa ihmisen HeLa-soluperäistä proteiinituotetta, joka kykenee sitoutumaan pysyvästi FAS-IC:hen.

Edellä mainituista His+- ja LAC Z+ -hiivapesäkkeistä eristettiin plasmidi-DNA ja pantiin elektroporaatiolla E. coli -kantaan HB101 tavanomaisilla menetelmillä, minkä jälkeenLeuf- ja ampisilliiniresistentit transformantit valikoitiin. Nämä transformantit ovat niitä, jotka sisältävät sellaisen hybridi-pGAD GH -vektorin, jossa on sekä AmpR:ää että Leu2:ta koodaavat sekvenssit. Sellaiset : transformantit ovat siten klooneja, jotka sisältävät ‘ ^ sekvenssejä, jotka koodaavat äskettäin tunnistettuja ** proteiineja, jotka kykenevät sitoutumaan FAS-IC:hen. Sitten näistä transformoiduista E. coli -bakteereista eristettiin plasmidi-DNA ja testattiin uudelleen: (a) transformoimalla ne uudelleen alkuperäisellä FAS-R:n intrasellulaarisen domeenin hybridiplasmidilla (hybridi-’· pGTB9, joka sisältää FAS-IC:n) hiivakantaan HF7, kuten ·»’ edellä selostettiin. Kontrolleina käytettiin vektoreita, d* jotka sisälsivät tarkoituksetonta proteiinia koodaavia sekvenssejä, esim. pACT-lamiinia tai yksin pGBT9:ää 46 käytettiin kotransformaatioon yhdessä FAS-IC:n sitojaproteiinia (so. MORT-l:tä) koodaavan plasmidin kanssa. Sitten kotransformoiduista hiivoista tutkittiin kasvu His~-kasvualustalla yksin tai eri määrillä 3-aminotriatsolia; ja (b) transformoimalla uudelleen plasmidi-DNA ja alkuperäinen FAS-IC-hybridiplasmidi sekä kohdassa (a) kuvatut kontrolliplasmidit kannan SFY526 hiivaisäntäsoluihin ja määrittämällä LAC Z+ -aktiivisuus (h-gal:n muodostumisen tehokkuus, so. sinisen värin muodostuminen).

Edellä mainittujen testien tulokset paljastivat, että pesäkkeiden kasvumalli His”-kasvualustalla oli identtinen LAC Z -aktiivisuusmallin kanssa, mikä määritettiin pesäkkeen värin perusteella, so. His-positiiviset pesäkkeet olivat myös LAC Z -positiivisia. Lisäksi LAC Z -aktiivisuus nesteviljelmässä (edulliset viljelyolot) määritettiin sen jälkeen, kun GAL4:n DNA:n sitoja- ja aktivaatiodomeenihybridit oli transfektoitu SFY526-hiivaisäntiin, joilla on parempi LAC Z:n induktiokyky GAL4:n transkription aktivaattorilla kuin HF-7-hiivaisäntäsoluilla. Edellä mainittua menetelmää käyttäen identifioitiin, ; y, eristettiin ja karakterisoitiin proteiini, jota kutsutaan L» HFl:ksi, ja nyttemmin myös MORT-l:ksi ("Mediator of /,: Receptor-induced Toxicity").

j*j*j Lisäksi tulee mainita, että monissa edellä mainituissa kaksihybridin β-galaktosidaasin ilmentämiskokeissa β-galaktosidaasin ilmentäminen määritettiin myös edullisessa ·;·*· suodatusmäärityksessä. Seulonnassa havaittiin viiden noin 3 g, ; x 106 cDNA-molekyylistä sisältävän MORT-l-insertin. Näin .···, eristetyt kloonatut MORT-l-cDNA-insertit sekvensoi tiin \ sitten käyttäen yleisiä DNA:n sekvensointimenetelmiä. MORT- l:n aminohapposekvenssi johdettiin DNA-sekvenssistä. cDNA- 47 inserttien koodaamien proteiinien tähteiden numerointi on Swiss-Prot-tietopankin mukainen. Deleetiomutantit tuotettiin PCR:llä ja pistemutantit oligonukleotidiohjatulla mutageneesillä (Current Protocols in Molec. Biol., 1994).

(li) Indusoitu ilmentyminen, metabolinen leimaus ja proteiinien immunosaostus FLAG-oktapeptidiin N-sitoutunutta MORT-l:tä (FLAG-HF1; Eastman Kodak, New Haven, Ct., USA), Fas-IC:tä, FAS-R:ia, p55-R:ia, kimeeraa, joka sisälsi p55-R:n ekstrasellulaarisen domeenin (aminohapot 1-168) fuusioituneena FAS-R:n transmembraani- ja intrasellulaariseen domeeniin (aminohapot 153-319), sekä kontrollina toimivaa lusiferaasin cDNAita ilmennettiin HeLa-soluissa. Ilmentäminen suoritettiin käyttämällä tetrasykliinin säätelemää ilmentämisvektoria HeLa-solukloonissa (HtTA-1), joka ilmentää tetrasykliinin säätelemää transaktivaattoria (Gossen ja Bujard, 1992; kuvattu PCT/US95/05854:ssä; katso myös Boldin et ai., 1995). Metabolinen leimaus [35S]-metioniinilla ja [35S]-kysteiinillä (Dupont, Wilmington, De., USA ja Amersham, Buckinghamshire, Englanti) suoritettiin 18 tuntia transfektion jälkeen ’ ’ inkuboimalla vielä 4 tunnin ajan 37 °C:ssa Dulbeccon »y modifioidussa Eaglen elatusaineessa, jossa eiollut ’* metioniinia eikä kysteiiniä, mutta johon oli lisätty 2 % dialysoitua vasikan sikiön seerumia. Sitten solut lyysattiin RIPA-puskurissa (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 1 % deoksikolaattia, 0,1 % SDS:ää ja 1 mM EDTA) ja ”, lysaatti esikirkastettiin inkuboimalla irrelevantilla kanin antiseerumin (3 μΐ/ml) ja Protein G Sepharose-helmien '1 (Pharmacia, Upsala, Ruotsi; 60 μΐ/ml) kanssa. Immunosaostus **’ suoritettiin inkuboimalla 0,3 ml: n lysaattieriä 1 tunnin ‘J* ajan 4 °C:ssa sellaisten hiiren monoklonaalisten vasta- aineiden (5 μΐ/erä) kanssa, jotka oli suunnattu FLAG- 48 oktapeptidille (M2; Eastman Kodak), p55-R:lle (#18 ja #20; (Engelmann et al., 1990)) tai FAS-R:lle (ZB4; Kamiya Southand Oaks, Ca., USA) tai kontrollina olevien isotyypiltään sopivien (isotype matched) hiiren vasta-aineiden kanssa, jota seurasi vielä 1 tunnin inkubointi Protein G Sepharose-helmien (30 μΐ/erä) kanssa.

(iii) In vitro -sitoutuminen

Glutationi-S-transferaasi- (GST-) fuusiot villityypin tai mutatoidun Fas-IC:n kanssa muodostettiin ja adsorboitiin glutationi-agaroosihelmille (kuten on kuvattu IL 109632, 111125, 112002, 112692; katso myös Boldin et ai., 1995;

Current Protocols in molecular biology, 1994; Frangioni ja Neel, 1993). Metabolisesti leimatun FLAG-HF1-

fuusioproteiinin sitoutuminen GST-Fas-IC:hen määritettiin inkuboimalla helmiä 2 tunnin ajan 4 °C:ssa FLAG-HF1:tä ilmentävien [ 3oS]-metioniinilla (60 pCi/ml) metabolisesti leimattujen HeLa-solujen uutteiden kanssa. Uutteet valmistettiin puskurissa, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % NP-40, 1 mM ditiotreitolia, 1 mM

*, EDTArta, ImM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 20 pg/ml aprotiniinia, 20 yg/ml leupeptiiniä, 10 mM natriumfluoridia u, ja 0,1 mM natriumvanadaattia (1 ml 5 x 105 soluja kohti).

*„ (iv) Indusoidun HFl-ilmentymisen laukaiseman sytotoksisuuden : analysointi ; HFl:n, Fas-IC:n, p55-IC:n ja lusiferaasin cDNAtt :··; insertoitiintetrasykliinin säätelemään ilmentämisvektoriin ; ja transfektoitiin HtTA-l-soluihin (HeLa-solulinja) (Gossen ja Bujard, 1992) yhdessä eritettävän istukan alkalisen fosfataasin cDNA:n kanssa sijoitettuna SV40-promoottorin säätelyn alaiseksi (pSBC-2-vektori (Dirks et ai., 1993)).

49

Solukuolema määritettiin 40 tunnin kuluttua transfektiosta joko neutraalipunaisen ottomäärityksellä (Wallach, 1984) tai määrittämällä kuolema spesifisesti transfektoituja cDNArita ilmentävissä soluissa analysoimalla kasvualustaan 5 viimeisen inkubointitunnin aikana erittyneen istukan alkalisen fosfataasin määrät (Berger et ai., 1988).

Toisessa koejärjestelyssä sen MORT-1- (HF1-) -proteiinin alueen määrittämiseksi, joka osallistuu sitoutumiseen FAS-IC:hen, ilmennettiin lyhytaikaisesti seuraavia proteiineja tetrasykliinin säätelemän transaktivaattorin (HtTA-l:n) sisältävissä HeLa-soluissa käyttäen tetrasykliinin säätelemää ilmentämisvektoria (pUHDlO-3): Pelkästään ihmisen FAS-R; ihmisen FAS-R samoin kuin MORT-1:n N-terminaalinen osa (aminohapot 1-117, "MORT-l-pää"; ihmisen FAS-R samoin kuin MORT-1:n C-terminaalinen osa, joka sisältää sen "kuolemadomeenin" homologia-alueen (aminohapot 130-245, "MORT-1 DD", katso myös IL 112742); FLAG-55.11 (55.11- proteiinin aminohapot 309-900 fuusioituneena FLAG-oktapeptidin N-terminaaliin, 55.11-proteiini on spesifinen p55-IC:n sitojaproteiini, katso myös IL 109632). Kun transfektiosta oli kulunut 12 tuntia, solut trypsinoitiin ja siirrostettiin uudelleen konsentraationa 30 000 solua/kolo. ’* Sen jälkeen, kun oli edelleen inkuboitu 24 tuntia, soluja * käsiteltiin 6 tunnin ajan FAS-R:n ekstrasellulaarista domeenia vastaan kohdistuvalla monoklonaalisella vasta- s s aineella (monoklonaalinen vasta-aine CH-11, Oncor) „ erilaisina konsentraatioina (0,001-10 pg/ml monoklonaalista vasta-ainetta) 10 g/ml sykloheksimidin läsnäollessa. Solujen . elävyys määritettiin neutraalipunaisen ottomäärityksellä ja 7 tulokset esitetään %:eina eläviä soluja verrattuna soluihin,

•f joita oli inkuboitu pelkästään sykloheksimidillä (anti-FAS-R

monoklonaalinen vasta-aine CH-11 puuttuu).

50 (v) Northern- ja sekvenssianalyysi

PolyA+RNA eristettiin HeLa-solujen kokonais-RNA:sta (Oligotex-dT mRNA kit, QIAGEN, Hilden, Saksa). Northern-analyysi, jossa koettimena käytettiin HFl:n cDNArta, suoritettiin tavanomaisin menetelmin (kuten on kuvattu PCT/US95/05854:ssä; katso myös Boldin et ai, 1995). MORT~l:n (HFl:n) nukleotidisekvenssi määritettiin molemmissa suunnissa dideoksiketjunterminaatiomenetelmällä.

Edellä mainituista kokeista saatiin seuraavat tulokset (esitetään taulukossa 1 ja kuvissa 1-7): kaksihybridimenetelmällä kloonatun MORT-l:n cDNA:n sekvenssianalyysi osoitti sen koodaavan uutta proteiinia (katso jäljempänä). Kun kaksihybridimenetelmää käytettiin edelleen arvioimaan tämän proteiinin (MORT-l:n) ("Mediator of Receptor-induced Toxicity") Fas-IC:lle sitoutumisen spesifisyys ja määrittämään se tietty alue Fas-IC:ssä, johon MORT-1 sitoutuu, havaittiin seuraavaa (taulukko 1): (a)

Proteiini sitoutuu sekä ihmisen että hiiren Fas-IC:hen, mutta ei useisiin muihin tutkittuihin proteiineihin, mukaan , lukien kolme TNF/NGF-reseptoriperheen reseptoria (p55- ja p75-TNF-reseptorit ja CD40); (b) FAS-R:n ' kuolemadomeenissa' asemassa 225 (Ile) tapahtuvat korvausmutaatiot, joiden on $ ·« : osoitettu lopettavan viestinsiirron sekä in vitro että in % vivo (iprcg-mutaatio (Watanabe-Fukunaga et ai., 1992; Itoh ja Nagata, 1993), estävät myös MORT-1:n sitoutumisen FAS-IC:lle; (c) MORT-1:n sitomiskohta sijaitsee FAS-R:ssä tämän j“; reseptorin 'kuolemadomeenissa'; ja (d) MORT-1 sitoutuu j‘*i itseensä. Tähän itseensä sitoutumiseen ja HFl:n ,*, ; sitoutumiseen FAS-R:lle osallistuvat proteiinin eri alueet: tähteitä 1-117 vastaava MORT-1:n fragmentti sitoutuu ! täysipituiseen MORT-1:een, mutta ei sitoudu itseensä eikä FAS-IC:hen. Sitä vastoin tähteitä 130-245 vastaava 51 fragmentti sitoutuu FAS-R:iin, mutta ei sitoudu MORT-l:een (taulukko 1) . Lisäksi taulukon 1 tulosten perusteella on ilmeistä, että FAS-R:n 'kuolemadomeenin' alue on ratkaiseva FAS-IC:n itseassosioitumiselle, samoin kuin p55-R:n 'kuolemadomeenin' alue p55-IC:n itseassosioitumiselle. Näiden 'kuolemadomeenien' molemmille puolille tehdyt deleetiot eivät vaikuta itseassosioitumiskykyyn, kun taas deleetio näissä 'kuolemadomeeneissa' vaikuttaa itseassosioitumiseen. MORT-l:n tapauksessa MORT-l:n sitoutuminen FAS-IC:hen riippuu myös kokonaisesta (täydellisestä) FAS-R:n 'kuolemadomeenista', vaikka sen sitoutuminen FAS-IC:hen ei kuitenkaan riipu FAS-R:n 'kuolemadomeenin' ulkopuolella olevista alueista.

52 TAULUKKO 1 MORT-l:n ja FAS-IC:n välinen vuorovaikutus ja MORT-l:n itseassosioituminen transformoiduissa hiivoissa: määritys on tehty kaksihybridin β-galaktosidaasin ilmentämiskokeella

AKTIVAATIODOMEENIHYBRIDI

DNA:n SITOJA- DOMEENIHYBRIDI ____, v.

M0RT1 e v ΖΓ .8 o o

Ihmisen Fas-IC ^ g β AT g f £4# £4 8 S “ fUffr- -"·ΆΓ Kok. ++ . + ++ - ' Kuolemadomeeni' Π · Nl 200-319 ++ ++ I · kl 233-319 - - - - kW) · I 175-304 ++ - -f ++

Hiiren Fas-IC

C\f ' - N Kok. ++ - ++ ++ I ·' - ~ I\ I 197-305 ++ · + ++ “ “ k VV — ~~i\1 I22SN - ++

Nai l\V-' ·~Ί\1 I225A - ++

A=J

MORT1 C_fr. f f f i lI Kok. ++ ++ "* ++ "* " .* · ' Kuolemadomeenimotiivi' •γ I l 1-117 + - « S #

S

*·*, I' ~1 130-245 - - ++ s m 3

; - SPESIFISYYSTESTIT

» Ihmisen p55-!C — - -

Ihmisen p75-IC - - ·** Ihmisen CD40-IC - - -

Sykliini D - - - - *, * J Lamiini - - - U . . ’ SNF1 - - -r - pGST9 - - - - 53

Edellä taulukossa 1 kuvataan Gal4:n DNA:n sitojadomeeni- ja aktivaatiodomeenikonstruktien (pGBT9:n ja pGAD-GH:n) koodaamien proteiinien vuorovaikutus transfektoiduissa SFY52β-hiivoissa, mikä määritettiin β-galaktosidaasin ilmentymisen suodatusmäärityksellä. DNA:n sitoja- domeenikonstrukteihin kuului neljä konstruktia ihmisen Fas-ICrstä, neljä konstruktia hiiren Fas-IC:stä, mukaan lukien kaksi täysipitkää konstruktia, joissa on Ile Leu tai Ile Ala -korvausmutaatiot asemassa 225 (I225N ja vastaavasti I225A), sekä kolme HF1- (MORT-1-) -konstruktia, jotka kaikki konstruktit esitetään kaavamaisesti taulukon vasemmalla puolella. Aktivaatiodomeenikonstrukteihin kuului kolme HF1-konstruktia, joissa HFl-osa oli kuten DNA:n sitojadomeenikonstrukteissa; ja täysipitkä ihmisen Fas-IC-konstrukti, jossa Fas-IC-osa oli sama kuin edellä DNA:n sitojadomeenikonstruktissa. Intrasellulaariset domeenit ihmisen p55-TNF-reseptorista (p55-IC, tähteet 206-426), ihmisen CD40:stä (CD40-IC, tähteet 216-277) ja ihmisen p75-TNF-reseptorista (p75-IC, tähteet 287-461) samoin kuin lamiini, sykliini D ja 'tyhjät' Gal4- (pGBT9-) -vektorit toimivat negatiivisina kontrolleina DNA:n sitoja-domeenikonstruktien muodossa. SNFlrtä ja SNF4:ää käytettiin positiivisina kontrolleina DNArn sitojadomeeni- (SNF1) ja vastaavasti aktivaatiodomeeni- (SNF4) -konstruktien * muodossa. Myös "tyhjät" Gal4 (pGAD-GH) vektorit toimivat negatiivisina kontrolleina aktivaatiodomeenikonstruktien muodossa (lisää p55-IC:tä ja p75-IC:tä koskevia yksityiskohtia katso myös PCT/US95/05854). Symbolit "++" ja "+" tarkoittavat voimakasta värinmuodostusta vastaavasti 30 ja 90 minuutin kuluessa kokeen aloituksesta; ja ’* tarkoittaa, että väriä ei kehittynyt 24 tunnin sisällä y** kokeen aloituksesta. Sellaisia yhdistelmiä, joille ei ole merkitty arvostelua, ei ole testattu.

54 FLAG-oktapeptidiin N-terminaalillaan fuusioitujen HF1-(M0RT-1-) -molekyylien (FLAG-HFl:n) ilmentyminen tuotti HeLa-soluissa neljää eri kokoa olevia proteiineja - noin 27, 28, 32 ja 34 kD. Kuvassa 1 (A ja B) esitetään tulokset, jotka osoittavat HFl:n ja Fas-IC:n välisen vuorovaikutuksen invitro. Kuten edellä kuvien IA ja B kuvauksessa mainittiin, kuva IA on kopio sellaisten HeLa-solujen, jotka oli transfektoitu FLAG-HF1- (FLAG-M0RT1) -fuusioproteiinin tai kontrollina olevan lusiferaasin cDNArlla, uutteista peräisin olevien proteiinien immunosakkojen kontrolli- autoradiogrammista. Immunosaostus tehtiin anti-FLAG-vasta-aineella (AFLAGtlla). Kuva IB on kopio autogrammista, joka osoittaa HFl:n ja FAS-IC:n välisen vuorovaikutuksen in vitro, HF1 on siinä [35S]metioniinilla leimattuina HF1-FLAG-fuusioproteiineina, jotka on saatu transfektoitujen HeLa-solujen uutteista, ja FAS-IC on ihmisen ja hiiren GST-FAS-IC-fuusioproteiineina, mukaan lukien yksi, jossa on korvausmutaatio FAS-IC:n asemassa 225, kaikki GST-FAS-IC-fuusioproteiinit tuotettiin E. colissa. GST-fuusioproteiinit kiinnitettiin glutationihelmiin, ennen kuin ne saatettiin vuorovaikutukseen HFl-FLAG-fuusioproteiinia sisältävien ·. uutteiden kanssa. SDS-PAGE suoritettiin tämän vuorovaikutuksen jälkeen. Siten in vitro -vuorovaikutus arvioitiin SDS-PAGEn jälkeen määrittämällä auto-·, : radiografisesti [35S]:llä metabolisesti leimatun HFl:n, joka oli tuotettu HeLa-soluissa fuusiona FLAG-oktapeptidin kanssa >*!’. (FLAG-HF1), sitoutuminen GST:hen, GST-fuusioon ihmisen tai hiiren Fas-IC:n kanssa (GST-huFas-IC, GST-mFas-IC) tai GST-* fuusioon sellaisen Fas-IC:n kanssa, jossa on Ile Ala korvausmutaatio asemassa 225. Kuten kuvasta IB ilmenee, » kaikilla neljällä FLAG-HFl-proteiinilla oli kyky sitoutua s**% Fas-IC:hen GST-Fas-IC-fuusioproteiinin kanssa inkuboitaessa.

F Kuten hiivan kaksihybridikokeessa (taulukko 1), HF1 ei sitoutunut sellaiseen GST-Fas-IC-fuusioproteiiniin, jossa 55 oli korvaus iprcg-mutaatiokohdassa (I225A).

Myös FLAG-HFl:n cDNA:n koodaamilla proteiineilla oli kyky sitoutua FAS-R:n intrasellulaariseen domeeniin samoin kuin sellaisen FAS-R-kimeeran intrasellulaariseen domeeniin, jonka ekstrasellulaarinen domeeni oli korvattu p55-R:n ekstrasellulaarisella domeenilla (p55-FAS), kun ne ilmentyivät yhdessä (koekspressoituivat) näiden reseptorien kanssa HeLa-soluissa. Kuvassa 2 (A, B, C) esitetään tulokset, jotka osoittavat HFl:nja FAS-IC:n välisen vuorovaikutuksen transfektoiduissa HeLa-soluissa, so. in vivo. Kuten edellä kuvien 2 A, B ja C selityksessä on mainittu, nämä kuvat esittävät kopiot erilaisten transfektoitujen HeLa-solujen immunosakkojen auto- radiogrammeista, jotka osoittavat HFl:n ja FAS-IC:n välisen in vivo -vuorovaikutuksen ja vuorovaikutuksen spesifisyyden soluissa, jotka oli kotransfektoitu näitä proteiineja koodaavilla konstrukteilla. Siten FLAG-HFl-fuusioproteiinia g r ilmennettiin ja leimattiin metabolisesti [ S]-kystennillä (20 pCi/ml) ja [35S]-metioniinilla (40 pCi/ml) HeLa-soluissa joko yksin tai yhdessä ihmisen FAS-R:n, FAS-R-kimeeran, jossa FAS-R:n ekstrasellulaarinen domeeni oli korvattu : ; ihmisen p55-R:n vastaavalla alueella (p55-FAS), tai h negatiivisena kontrollina olevan ihmisen p55-R:n kanssa, h HFl:n risti-immunosaostus yhdessä ilmennetyn reseptorin kanssa suoritettiin käyttäen osoitettuja vasta-aineita (kuvat 2 A-C). Kuten kuvista 2 A-C ilmenee, FLAG-HFl kykenee sitoutumaan FAS-R:n intrasellulaariseen domeeniin samoin * s s ** kuin sellaisen FAS-R-p55-R-kimeeran intrasellulaariseen domeeniin, jossa on p55-R:n ekstrasellulaarinen domeeni ja *** FAS-R:n intrasellulaarinen domeeni, kun näitä ilmennettiin ,,»* yhdessä näiden reseptorien kanssa HeLa-soluissa (katso kolme keskikaistaa kuvassa 2A ja vastaavasti kolme vasenta kaistaa kuvassa 2C). Lisäksi transfektoitujen solujen uutteista 56 peräisin olevan FLAG-HFl:n immunosaostus johti myös yhdessä ilmentyneen FAS-R:n (kuva 2A) tai yhdessä ilmentyneen p55-FAS-kimeeran (kuva 2C) saostumiseen. Käänteisesti näiden reseptorien immunosaostus johti samalla FLAG-HFl:n saostumiseen (kuvat 2A ja 2C).

Northern-analyysi, jossa koettimena käytettiin HFl:n cDNArta, paljasti yhden hybridisoituneen transkriptin HeLa-soluissa. Kuvassa 3 esitetään kopio Northern blot analyysistä, jossa transfektoiduista soluista peräisin olevaa polyA+RNA:ta (0,3 yg) hybridisoitiin HFl:n cDNA:n kanssa. Tämän transkriptin koko (noin 1,8 kb) on lähellä HFl:n cDNArta (noin 1702 nukleotidia).

Sekvenssianalyysissä cDNArn havaittiin sisältävän noin 250 aminohapon avoimen lukukehyksen. Kuva 4 esittää HFlrn alustavan nukleotidi- ja johdetun aminohapposekvenssin, jossa 'kuolemadomeenin' motiivi on alleviivattu samoin kuin mahdollinen Met-aloitustähde (asema 49; lihavoitu, alleviivattu M) ja translaation lopetuskodoni (tähti kodonin alla asemassa 769-771). Tällä rkuolemadomeenin' motiivilla J F. on homologiaa tunnettujen p55-R:n ja FAS-R:n · 'kuolemadomeenien' (p55DD ja FAS-DD) motiivien kanssa. HFlrn täsmällisen C-terminaalisen pään määrittämiseksi ja »/'* täsmällisen N-terminaalin pään (aloittava Met-tähde) • ” osoittamiseksi suoritettiin vielä seuraavat kokeet v : seuraavalla tavalla; ' Edellä kuvattuja menetelmiä käyttäen konstruoitiin lukuisia sellaisia HFl-molekyylejä koodaavia konstrukteja, jotka oli ! *.» fuusioitu N-terminaalissaan FLAG-oktapeptidin kanssa (FLAG- ’wt’· HF1), ja niitä ilmennettiin HeLa-soluissa siten, että h. ilmentyneet proteiinit leimattiin metabolisesti käyttäen J5S- 7"; kysteiiniä ja 35S-metioniinia (katso edellä kuva 5B) . HF1- 57 FLAG-molekyylejä koodasivat seuraavat cDNArt, jotka sisälsivät eri osia HFl:tä koodaavasta sekvenssistä: i) FLAG-oktapeptidin cDNA kytkettynä sellaisen HFl:n cDNA:n 5’-päähän, josta on poistettu nukleotidit 1-145 (katso kuva 4) ; ii) FLAG-oktapeptidin cDNA kytkettynä HFl:n täysipituisen cDNA:n 5'-päähän (katso edellä FLAG-HFl-konstrukti kuvassa IB) ; iii) FLAG-oktapeptidin cDNA kytkettynä sellaisen HFl:n cDNA:n 5’-päähän, josta on poistettu sekä nukleotidit 1-145 että nukleotidit 832-1701 (katso kuva 4), ja kodoni GCC asemassa 142-144 on mutatoitu TCC:ksi estämään translaation aloitus tästä kohdasta.

Edellä mainittujen HFl-FLAG-fuusiotuotteiden ilmentämisen jälkeen tehtiin immunosaostus kuten edellä on mainittu käyttäen joko anti-FLAG-monoklonaalisia vasta-aineita (M2) . tai kontrollina olevia anti-p75-TNF-R-vasta-aineita (#9), $ s , minkä jälkeen tehtiin SDS-PAGE (10%:inen akryyliamidi) ja 3 # V autoradiografia. Tulokset esitetään kuvassa 5, joka on kopio » autoradiogrammista, jolla eroteltiin edellä mainitut HF1- • s • m FLAG-fuusioproteiinit. Geelin raidoille pannut näytteet ·;·. olivat seuraavat: ···, Raidat 1 ja 2: HFl-FLAG-fuusioproteiini, jota koodaa FLAG- oktapeptidin cDNA kytkettynä sellaisen HFl:n cDNA:n 5'- t 0 , päähän, josta on poistettu nukleotidit 1-145.

**’ Raidat 3 ja 4: HFl-FLAG-fuusioproteiini, jota koodaa FLAG- oktapeptidin cDNA kytkettynä HFl:n täysipituisen cDNA:n 5'-*· päähän.

58

Raidat 5 ja 6: HFl-FLAG-fuusioproteiini, jota koodaa FLAG-oktapeptidin cDNA kytkettynä sellaisen HFl:n cDNA:n 5'-päähän, josta on poistettu sekä nukleotidit 1-145 että nukleotidit 832-1701 ja kodoni GCC asemassa 142-144 on mutatoitu TCCrksi estämään translaation aloitus tästä kohdasta.

Immunosakat oli muodostettu anti-FLAG monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa raidoissa 2, 4 ja 6 oleville näytteille ja anti-p75-TNF-R-vasta-aineiden kanssa näytteille raidoissa 1, 3 ja 5.

Kuvan 5 autoradiogrammista ilmenee se, että tuotteiden kokojen identtisyys raidoissa 2 ja 4 varmistaa sen, että nukleotidit 769-771 ovat HFl:n translaation terminaatiokohta, so. tämä kodoni on lopetussignaali ja se osoitetaan kuvassa 4 tähdellä. Lisäksi sellaisen leveän vyöhykkeen esiintyminen, joka edustaa täsmälleen kahta translaatiotuotetta (mikä nähdään geelistä, mutta voimakkaan leimautumisen vuoksi siitä tulee yksi laaja vyöhyke • ”«· autoradiogrammissa) , raidassa 6 viittaa siihen, että kahden ·,· * ylimääräisen tuotteen (korkeampimolekyylipainoiset leveät ..'.V vyöhykkeet) esiintyminen raidoissa 2 ja 4 tarkoittaa, että ·, *I translaatio alkaa sekä FLAG-HFl-fuusiomolekyylin N- : " terminaalissa että metioniinitähteessä numero 49 HF1-

V ’ sekvenssissä (katso lihavoitu alleviivattu M

aminohapposekvenssin asemassa 49 kuvassa 4). Näin ollen **”* edellä mainitut tulokset varmistavat (vahvistavat) HFl:n C- terminaalisen pään ja antavat viitteen siitä, että HF1:n N-terminaalinen pää voi olla sekvenssin asemassa 49 kuvassa 4.

> Muilla HFl:n ilmentämiskokeilla ilman FLAG-oktapeptidin fuusioimista sen 5-päähän on todellakin osoitettu, että 59

Met49 toimii tehokkaana translaation aloituskohtana.

Tulee mainita, että 'Gene Bankin' ja 'Protein Bankin' tietokannoissa tehty seulonta paljasti, että kuvassa 4 esitettyä HFl:tä vastaavaa sekvenssiä ei ole niissä olemassa. Siten HF1 on uusi FAS-IC:n spesifinen sitojaproteiini.

P55-IC:n runsas ilmentyminen johtaa soluja tuhoavan vaikutuksen laukaisuun (katso IL 109632, 111125 ja Boldin et ai., 1995). Myös Fas-IC:n ilmentymisellä HeLa-soluissa on sellainen vaikutus, vaikkakin vähemmässä määrin. Tämä vaikutus voitaisiin todeta vain käyttämällä herkkää määritystä. Kuvissa 6 A ja B kuvataan graafisesti ligandista riippumattomia soluja tuhoavia vaikutuksia soluissa, jotka on transfektoitu HFl:llä, samoin kuin ihmisen p55-IC:llä ja FAS-IC:llä. HFl:n, ihmisen Fas-IC:n, ihmisen p55-IC:n tai kontrollina toimivan lusiferaasin lyhytaikaisen ilmentymisen vaikutus HeLa-solujen elinkykyyn määritettiin käyttäen tetrasykliinin säätelemää ilmentämisvektoria. Solujen > elävyys arvioitiin 40 minuutin kuluttua siitä, kun nämä cDNA:t oli transfektoitu joko tetrasykliinin (1 yg/ml, estää V ilmentymisen) läsnäollessa (avoimet pylväät, kuvat 6 A ja B) tai puuttuessa (täytetyt pylväät, kuvat 6 A ja B) yhdessä eritettävää istukan alkalista fosfataasia koodaavan cDNA:n •;y kanssa. Solujen elävyys määritettiin joko neutraalipunaisen ottomäärityksellä (kuva 6A) tai määrittämällä spesifisesti ·”, niiden tiettyjen solujen elävyys, jotka ilmentävät transfektoitua DNA: ta, mittaamalla kasvualustaan erittyneen ,* , istukan alkalisen fosfataasin määrät (kuva 6B).

T Siten kuvista 6 A ja B ilmenee, että HFl:n ilmentyminen •2 HeLa-soluissa johti merkittävään solukuolemaan, joka oli voimakkaampaa kuin FAS-IC:n ilmentämisellä aiheutettu. Nämä 60 kaikkien p55-IC:n, FAS-IC:n ja HFl:n sytotoksiset vaikutukset näyttävät liittyvän kaikissa näissä proteiineissa oleviin 'kuolemadomeeni'-alueisiin, joilla on taipumus itseassosioitua, joka mahdollisesti sysää liikkeelle sytotoksisia vaikutuksia.

Edellä mainitut HFl:n (MORT-l:n) ominaisuudet huomioon ottaen, nimittäin HFl:n spesifinen assosioituminen sen tietyn FAS-R:n alueen kanssa, joka osallistuu solukuoleman induktioon, ja se seikka, että jo pienikin muutos tämän alueen rakenteessa, joka estää viestityksen (lprcq- mutaatio), lopettaa myös HFl:n sitoutumisen, viittaa siihen, että tällä proteiinilla on merkitystä viestinsiirrossa tai solukuoleman laukaisemisessa. Tätä käsitystä tukee edelleen HFl:n havaittu kyky laukaista itse soluja tuhoava vaikutus. Siten HF1 (MORT-1) voi toimia (i) FAS-R:n itseassosioitumisen modulaattorina sen oman kyvyn perusteella sitoutua FAS-R:iin samoin kuin itseensä, tai (ii) toimia ankkurointipaikkana muille proteiineille, jotka osallistuvat FAS-R:n viestitykseen, so. HF1 voi olla 'ankkurointi'proteiini ja siitä syystä sitoa FAS-R:n lisäksi s s ä i l "" muita reseptoreja, tai (iii) se muodostaa osan erillisestä ft i viestitysjärjestelmästä, joka on vuorovaikutuksessa FAS-R:n viestityksen kanssa.

61 soluissa, jotka sisälsivät tetrasykliinin säätelemän transaktivaattorin (HtTA-l:n), insertoimalla proteiineja koodaavat sekvenssit tetrasykliinin säätelemään ilmentämisvektoriin pUHD10-3. Kontrollitransfektioissa käytettiin vain FAS-R:ia koodaavia vektoreita sekä FLAG-55.11-fuusioproteiinia (55.11-proteiini, joka on p55-IC:n spesifinen sitojaproteiini, jonka aminohapot 309-900 sisältävä osa fuusioitiin (N-terminaalissa) FLAG-oktapeptidiin) koodaavia vektoreita.

Transfektion ja inkubointijaksojen (katso (iv) edellä) jälkeen transfektoituja soluja käsiteltiin erilaisilla konsentraatioilla anti-FAS-R monoklonaalisia vasta-aineita (CH-11), jotka sitoutuvat spesifisesti solujen ilmentämän FAS-R:n ekstrasellulaariseen domeeniin. Tämä anti-FAS-R-vasta-aineen sitominen indusoi FAS-R:n aggregoitumisen solun pinnalle (paljon kuten FAS-R:n ligandi) ja indusoi FAS-IC-välitteisen solunsisäisen viestitysreitin, joka lopulta johtaa solun kuolemaan (FAS-R-välitteinen solusytotoksisuus). Käytetyt anti-FAS-R monoklonaalisen . vasta-aineen (CH-11:n) konsentraatiot olivat alueella 0,01- , 10 pg/ml, tavallisesti konsentraatiot olivat sellaisia kuin * V 0,005, 0,05, 0, 5 ja 5 yg/ml. Soluja käsiteltiin anti-FAS- vasta-aineella 10 yg/ml:n sykloheksimidiä läsnäollessa.

·;·, Edellä mainitun analyysin tulokset esitetään graafisesti kuvassa 7, jossa kuvataan jokaiselle transfektoitujen ···, solujen neljälle ryhmälle se, kuinka monta % transf ektoiduista soluista on eläviä solujen käsittelyyn , käytetyn anti-FAS-R monoklonaalisen vasta-aineen (CH-ll:n) I»,* konsentraation funktiona. Transfektoitujen solujen ryhmiä *** merkitään eri symbolein seuraavalla tavalla: (i) avoin neliö tarkoittaa soluja, jotka on transfektoitu pelkästään ei-relevantilla (so. ei FAS-IC:n sitoja) kontrollivektorilla, 62 joka koodaa FLAG-55.11-fuusioproteiinia ("55.11", negatiivinen kontrolli); (ii) täytetty neliö tarkoittaa soluja, jotka on kotransfektoitu FAS-R:ia koodaavilla vektoreilla ja vektoreilla, jotka koodaavat MORT-l:n C-terminaalista osaa, aminohappoja 130-245, joka alue sisältääMORT-1:n 1kuolemadomeenin' (dd) homologia-alueen ("fas+mortldd"); (iii) täytetyt kolmiot tarkoittavat soluja, jotka on transfektoitu vain vektorilla, joka koodaa FAS-R:ia ("fas", positiivinen kontrolli); ja (iv) avoimet ympyrät tarkoittavat soluja, jotka on kotransfektoitu vektoreilla, jotka koodaavat FAS-R:ia, ja vektoreilla, jotka koodaavat MORT-l:n N-terminaalista osaa, aminohappoja 1-117, 'MORT-l:n pää' "fas+mortlhe").

Kuvan 7 tulosten perusteella selviää, että FAS-R:n ilmentyminen transfektoiduissa soluissa tuo mukanaan lisääntyneen herkkyyden anti-FAS-R-vasta-aineiden soluja tuhoaville vaikutuksille (vertaa "fas-soluja" "55.11-soluihin"). Lisäksi 'kuolemadomeenin' homologia-alueen sisältävän MORT-l-alueen ja FAS-R:n ilmentäminen yhdessä ("fas+mortldd") häiritsee voimakkaasti FAS:n indusoimaa (so.

a *.» FAS-R-välitteistä) solukuolemaa, kuten odotettavissa oli, J l koska MORT-l:n ' kuolemadomeeni-' (DD-) -alue kykenee ,’·* sitoutumaan FAS-R:n ' kuolemadomeeniin' (FAS-DD:hen) (katso ’„*** edellä taulukko 1). Lisäksi M0RT-l:n N-terminaalisen osan ; **· ilmentäminen yhdessä FAS-R:n kanssa ("fas+mortlhe) ei V * häiritse FAS-R-välitteistä solukuolemaa ja jonkin verran, jos lainkaan, kohottaa sytotoksisuutta (so. hieman lisää *»»»* solukuolemia) .

; \| Näin ollen edellä mainitut tulokset osoittavat selvästi, ! !· että MORT-l-proteiinissa on kaksi erillistä aluetta mitä FAS-IC:hen sitoutumiseen ja FAS-IC:n solulle sytotoksisen aktiivisuuden välittämiseen tulee.

63 Nämä tulokset antavat siten perustan MORT-l-proteiinin eri osien (so. aktiivisten fragmenttien tai analogien) käytölle eri farmaseuttisiin sovellutuksiin. Esimerkiksi niitä MORT-l-proteiinin analogeja tai fragmentteja tai johdannaisia, jotka sisältävät pääasiassa vain MORT-l:n C-terminaalisen osan sen kuolemadomeeni mukaan lukien, voidaan käyttää inhiboimaan FAS-R-välitteisiä sytotoksisia vaikutuksia FAS-R:ja sisältävissä soluissa tai kudoksissa, ja siten suojata näitä soluja taikudoksia FAS-R-ligandin haitallisilta vaikutuksilta esimerkiksi sellaisissa tapauksissa kuin akuutti hepatiitti. Vaihtoehtoisesti niitä MORT-l-proteiinin analogeja tai fragmentteja tai johdannaisia, jotka sisältävät pääasiassa vain MORT-l:n N-terminaalisen osan, voidaan käyttää voimistamaan FAS-R-välitteisiä sytotoksisia vaikutuksia FAS-R:ja sisältävissä soluissa tai kudoksissa, mikä johtaa näiden solujen tai kudosten voimistuneeseen tuhoutumiseen haluttaessa, esimerkiksi kasvainsolujen tai autoreaktiivisten T- ja B-solujen tapauksessa. Kuten edellä on yksityiskohtaisesti kuvattu, edellä mainitut MORT-l:n eri . alueiden käyttötavat voidaan suorittaa käyttäen erilaisia .·, yhdistelmäviruksia (esim. Vacciniaa) insertoimaan MORT-l:n « s aluetta koodaava sekvenssi niihin spesifisiin soluihin tai , : kudoksiin, joita halutaan käsitellä.

Lisäksi on mahdollista valmistaa ja käyttää monenlaisia muita molekyylejä, kuten esimerkiksi vasta-aineita, "j peptidejä ja orgaanisia molekyylejä, joissa on edellä * * ’ mainittuja MORT-l:n alueita vastaavia sekvenssejä tai ’ ; molekyylirakenteita, jotta aikaansaadaan näiden MORT-l:n alueiden välittämiä samoja haluttuja vaikutuksia.

64

KIRJALLISUUSVIITTEET

Barinaga, M. (1993) Science 262: 1512-4.

Berger, J., Hauber, J., Hauber, R., Geiger, R. ja Cullen, B.R. (1988) Gene 66: 1-10.

Beutler, B. ja Cerami, C. (1987) NEJM, 3^6: 379-385.

Boldin, M.P. et al. (1995) J. Biol. Chem. 2_7_0 : 337-341.

Brakebusch, C. et ai. (1992) EMBO J., _11: 943-950.

Brockhaus, M. et ai. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87: 3127-3131.

Cantor, G.H. et ai. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 10932-6.

Chen, C.J. et ai. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sei. 660: 271-3. Crisell, P. et ai. (1993) Nucleic Acids Res. (Englanti) 21 (22): 5251-5.

Current protocols in molecular biology (Ausubel, F.M.,

Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G.,

Smith, J.A., Struhl, K., Albright, L.M., Coen, D.M. & Varki, A., toim.) (1994) s. 8.1.1-8.1.6 ja 16.7-16.7.8, Greene

Publishing Associates, Inc. ja Wiley & Sons, Inc., New York.

,, Dirks, W., Wirth, M. ja Hauser, H. (1993) Gene 128: 247-249.

» * I , Engelmann, H. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 1531-1536.

Fields, S. ja Song, 0. (1989) Nature 340: 245-246.

Frangioni, J.V. ja Neel, B.G. (1993) Anal. Biochem. 210: *.*. : 179-187.

Gossen, M. ja Boujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551.

,*··, Heller, R.A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: , ; 6151-6155.

y ; Hohmann, H.-P. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 14927- 14934.

Itoh, N. et al. (1991) Cell _66: 233.

Itoh, N. ja Nagata, S. (1993) J. Biol. Chem. 268: 10932-7. Joseph, S. ja Burke, J.M. (1993) J. Biol. Chem. 268: 24515- 8.

65

Koizumi, M. et ai. (1993) Biol. Pharm. Bull (Japani) 1_6 (9): 879-83.

Loetscher, H. et ai. (1990) Cell _61: 351-359.

Nophar, Y. et ai. (1990) EMBO J., 9: 3269-3278. Piquet, P.F.

et ai. (1987) J. Exp. Med., 166: 1280-89.

Sambrook et ai. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Schall, T.J. et al. (1990) Cell 61: 361-370.

Shimayama, T., et al. (1993) Nucleic Acids Symp. Ser. 2 9: 177-8 .

Shore, S.K. et al. (1993) Oncogene 8_: 3183-8.

Smith, C.A. et al. (1990) Science 248: 1019-1023.

Song, H.Y. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 22492-22495.

Tartaglia, L.A. et al. (1993) Cell 7j4· 845-853.

Tracey, J.T. et al. (1987) Nature 330: 662-664.

Wallach, D. (1984) J. Immunol. 132: 2464-9.

Wallach, D. (1986) teoksessa Interferon 7 (Ion Gresser, toim.) s. 83-122, Academic Press, Lontoo Wallach, D. et al. (1994) Cytokine _6: 556.

Watanabe-Fukunaga, R. et al. (1992) Nature 356: 314-317. Wilks, A.F. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 6: 1603-1607.

s Zhao, J.J. ja Pick, L. (1993) Nature (Englanti) 3 65: 448-51.

Claims (16)

1. DNA-sekvenssi, joka koodaa MORT-1 (tai HF1) proteiinia, joka käsittää kuviossa 4 esitetyn aminohapposekvenssin, tai sen fragmentteja, jotka kaikki kykenevät sitoutumaan FAS-R:n intrasellulaariseen domeeniin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat: (a) cDNA-sekvenssi, joka saadaan natiivin MORT-l-proteiinin koodaavasta alueesta; (b) DNA-sekvenssit, jotka kykenevät hybridisoitumaan kohdan (a) sekvenssiin kohtuullisen ankarissa olosuhteissa ja jotka koodaavat biologisesti aktiivista FAS-R:n intrasellulaarisen domeenin sitojaproteiinia; ja (c) DNA-sekvenssit, jotka ovat degeneroituneita kohdissa (a) ja (b) määriteltyjen DNA-sekvenssien geneettisen koodin seurauksena ja jotka koodaavat biologisesti aktiivista FAS- o '* R:n intrasellulaarisen domeenin sitojaproteiinia. ! a> a

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen sekvenssin ' koodaama MORT-l-proteiini tai sen fragmentit, jolloin h,, mainittu proteiini tai sen fragmentit kykenevät sitoutumaan FAS-R:n intrasellulaariseen domeeniin. *‘h

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen MORT-l-proteiini, jolla * on kuviossa 4 esitetty johdettu aminohapposekvenssi. f*

5. Vektori, joka käsittää patenttivaatimuksen 1 tai 2 f ’ mukaisen DNA-sekvenssin.

6. Transformoidut isäntäsolut, jotka käsittävät patenttivaatimuksen 5 mukaisen vektorin.

7. Menetelmä patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukaisen M0RT-1-proteiinin tai sen fragmenttien valmistamiseksi, menetelmän käsittäessä sen, että patenttivaatimuksen 6 mukaisia transformoituja isäntäsoluja kasvatetaan olosuhteissa, jotka sopivat mainitun proteiinin tai fragmenttien ilmentämiseen, toteutetaan mainitun proteiinin tai fragmenttien aikaansaamiseen välttämättömät mainitun proteiinin posttranslationaaliset modifikaatiot ja mainittu ilmentynyt proteiini tai fragmentit eristetään.

8. Vasta-aineet tai niiden aktiiviset fragmentit tai johdannaiset, jotka ovat spesifisiä patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukaiselle MORT-l-proteiinille tai sen fragmenteille.

9. Menetelmä sellaisten proteiinien, faktorien tai reseptorien eristämiseksi ja tunnistamiseksi, jotka kykenevät sitoutumaan patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukaiseen MORT-l-proteiiniin, jolloin menetelmässä: Y' (a) käytetään affiniteettikromatografista menetelmää, jossa ”, mainittu MORT-l-proteiini kiinnitetään affiniteetti kromatograf ia-matriisiin, mainittu kiinnitetty proteiini saatetaan yhteyteen solu-uutteen kanssa; ja sen jälkeen mainittuun kiinnitettyyn proteiiniin sitoutuneet solu-··, uutteen proteiinit, faktorit tai reseptorit eluoidaan, eristetään ja analysoidaan; tai Y (b) käytetään hiivan kaksihybridimenetelmää, jossa Γ mainittua MORT-l-proteiinia koodaava sekvenssi on toisessa ; hybridivektorissa ja cDNA- tai genomisesta DNA-kirjastosta peräisin oleva sekvenssi on toisessa hybridivektorissa, joita vektoreita käytetään sitten transformoimaan hiivaisäntäsoluja ja positiivisesti transformoidut solut eristetään, jota seuraa mainitun toisen hybridivektorin uutto sellaista proteiinia koodaavan sekvenssin saamiseksi, joka sitoutuu mainittuun MORT-l-proteiiniin.

10. Menetelmä sellaisen proteiinin eristämiseksi ja tunnistamiseksi, joka kykenee sitoutumaan FAS-R:n intra-sellulaariseen domeeniin, käsittäen sen, että menetelmässä käytetään sallivien olosuhteiden Southern-hybridisaatiota, jota seuraa PCR-kloonaus, jossa patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista sekvenssiä tai sen osia käytetään koettimena sitomaan sellaisia cDNA- tai genomisen DNA-kirjaston sekvenssejä, joilla on siihen ainakin osittainen homologia, sitten mainitut sitoutuneet sekvenssit monistetaan ja kloonataan PCRtllä, jolloin saadaan klooneja, jotka koodaavat proteiineja, joilla on ainakin osittainen homologia mainittuihin patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisiin sekvensseihin.

11. Farmaseuttinen koostumus, joka käsittää vaikuttavaa * *·· ainetta, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat: (1) patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen MORT-l-proteiini, % *: sen biologisesti aktiiviset fragmentit ja näiden seokset; 5 (2) yhdistelmäeläinvirusvektori, joka sisältää sekvenssejä, jotka koodaavat proteiinia, joka kykenee sitoutumaan solun • pinnan reseptoriin ja joka koodaa patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukaista MORT-l-proteiinia tai sen biologisesti aktiivisia fragmentteja; (3) oligonukleotidisekvenssi, joka koodaa patenttivaatimusten 1 tai 2 mukaisen MORT-l-sekvenssin antisense-sekvenssiä; ja (4) sen patenttivaatimuksen 8 mukainen vasta-aine tai aktiivinen fragmentti tai johdannainen.

12. Patenttivaatimuksessa 11 määritellyn kaltaisen yhdisteen käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi FAS-R-ligandin vaikutuksen moduloimiseksi soluissa.

13. Patenttivaatimuksessa 11(2) määritellyn kaltaisen yhdisteen käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi kasvainsolujen, HIV-infektoituneiden solujen tai muiden sairaussolujen käsittelemiseksi.

14. Yhden tai useamman patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukaisen MORT-l-proteiinin tai -fragmentin, joka kykenee sitoutumaan mainitun FAS-R:n intrasellulaariseen domeeniin ja moduloimaan sen aktiivisuutta, ja sen patenttivaatimuksen 8 mukaisten vasta-aineiden ja aktiivisten fragmenttien tai johdannaisten käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi FAS-R-ligandin vaikutuksen moduloimiseksi soluissa.

15. Ribotsyymisekvenssiä koodaavan vektorin, joka kykenee olemaan vuorovaikutuksessa patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukaista MORT-l-proteiinia koodaavan sellulaarisen mRNA-sekvenssin kanssa, käyttö farmaseuttisen koostumuksen s valmistamiseksi FAS-R-ligandin vaikutuksen moduloimiseksi soluissa.

16. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen DNA-sekvenssin, », ’ joka koodaa MORT-l-proteiinia tai sen fragmentteja tai patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukaista MORT-l-proteiinia tai sen fragmentteja, käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi MORT-l:n indusoiman vaikutuksen moduloimiseksi soluissa.