CZ314699A3 - Sekvence DNA, vektor a protein - Google Patents

Abstract

Proteiny schopné modulovat nebo zprostředkovat funkci MORT-1 a sekvence DNA kódující tyto proteiny, způsob výroby těchto proteinů rekombinantnímpostupemajejich použití.

Description

Předkládaný vynález se obecně týká oblasti receptorů náležejících do nadrodiny receptorů pro TNF/NGF a regulace jejich biologické funkce. Nadrodina TNF/NGF receptorů zahrnuje i receptory pro nádorový nekrotický faktor (TNF, tumor necrosis faktor) p55 a p75 (TNF-R, rovněž označované CD120a, respektive CD120b, ale v dalším textu označované jako p55-R a p75-R) a receptor FAS ligandů (nazývaný rovněž FAS/APO1 nebo FAS-R nebo CD95, ale v dalším textu označovaný jako FAS-R) a další receptory. Konkrétněji, předkládaný vynález se dále týká nových proteinů, které se vážou k jiným proteinům, které se samy vážou k proteinu MORT-1 (nebo FADD), ty se nazývají MORT-1-vazebné proteiny, nebo které se mohou vázat na MORT-1 přímo, a konkrétně se týká jednoho takového proteinu, zde označovaného G1 (který také bývá označován „CASH“ podle „CASPASE HOMOLOG“, který ale bude zde v dalším nazýván G1). Tento G1 protein se váže k MORT-1-vazebnému proteinu Mch4 (též označovanému/nazývanému CASP-10) a snad i k dalšímu MORT1-vazebnému proteinu zvanému MACH (též označovanému/nazývanému CASP-8), a snad i přímo k samotnému proteinu MORT-1.

Předkládaný vynález se tedy obecně týká nových proteinů, které jsou schopné přímo nebo nepřímo modulovat nebo zprostředkovávat funkci proteinu MORT-1 nebo jiných proteinů, které se přímo nebo nepřímo vážou k MORT-1. Vynález se zejména týká proteinu G1, jeho přípravy a použití, jakož i různých nových isoforem G1 a jejich přípravy a použití.

- 2^;·

Dosavadní stav techniky

Nádorový nekrotický faktor (TNF-α) a lymfotoxin (TNF-β) (dále v textu se TNF vztahuje na TNF-α i TNF-β) jsou multifunkční t* prozánětlivé cytokiny, produkované hlavně mononukleárními fagocyty, a, 5 které mají četné účinky na buňky (Wallach, D. (1986) v: Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), str. 83-122, Academie Press, London; Beutler aCerami , 1987, NEJM 316:379-385). TNF-α a TNF-β iniciují své účinky vazbou na specifické receptory na buněčném povrchu. Některé z účinků jsou pravděpodobně prospěšné organismu: například mohou io ničit nádorové buňky nebo buňky infikované viry a mohou zvyšovat antibakteriální aktivitu granulocytů. TNF tímto způsobem přispívá k obraně organismu proti nádorům a infekčním agens a přispívá k zotavení po zranění. TNF tedy může být použit jako protinádorový prostředek, přičemž při této aplikaci se TNF váže ke svým receptorům na povrchu nádorových buněk a tím iniciuje kroky vedoucí ke smrti nádorových buněk. TNF může být též použit jako prostředek proti infekcím.

Avšak TNF-α a TNF-β mají též škodlivé účinky. Existují důkazy, že nadprodukce TNF-α může hrát významnou patogenní úlohu u několika chorob. Například účinky TNF-α, hlavně na vaskulaturu, jsou hlavní příčinou symptomů septického šoku (Tracey et al., 1987, Nátuře 330:662-664). Při některých chorobách může TNF potlačením aktivity adipocytů a vyvoláním anorexie vést k nadměrné ztrátě hmotnosti (kachexii); proto dostal TNF-α i název kachetin. Byla též i 25 popsána role TNF-α jako mediátoru poškození tkání při revmatických fe chorobách (Beutler aCerami, 1987, NEJM 316:379-385) a jako hlavního mediátoru poškození pozorovaného při reakcích štěpu proti hostiteli (Piquet et al., 1987, J. Exp. Med. 166:1280-1289). Kromě toho je známo, že TNF je zapojen v procesu zánětu a v mnoha dalších chorobách.

- 3·-· ··

Shora uvedené biologické účinky TNF jsou iniciovány a/nebo zprostředkovány dvěma různými, nezávisle exprimovanými receptory p55 a p75 TNF-R, které specificky vážou TNF-α i TNF-β. Tyto dva receptory mají strukturně odlišné intracelulární domény, což svědčí o rozdílném způsobu signalizace (viz Hohmann et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:14927-14934; Engelmann et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:1531-1536; Brockhaus et al., 1990, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:3127-3131; Leotscher et al., 1990; Schall et al., 1990, Cell 61:361370; Nophar et al., 1990, EMBO J. 9:3269-3278; Smith et al., 1990, io Science 248:1019-1023; a Heller et al., 1990, Proč. Nati. Acad. Sci.

USA 87:6151-6155). Buněčné mechanismy, například různé proteiny a případné další faktory, které jsou zapojeny v přenosu signálu od receptorů p55 TNF-R a p75 TNF-R, však zbývá ještě objasnit. Je to právě tento intracelulární přenos signálu, ke kterému obvykle dochází po vazbě ligandu, tj. TNF (a nebo β), k receptorů, který je zodpovědný za zahájení kaskády reakcí, jež nakonec vedou k pozorované odpovědi buňky na TNF.

Co se týká shora zmíněného cytocidního účinku TNF, u většiny dosud studovaných buněk je tento účinek spouštěn hlavně receptorem p55 TNF-R. Protilátky namířené proti extracelulární (ligand vážící) doméně receptorů p55 TNF-R mohou samy vyvolat cytocidní účinek (viz EP 412486), což koreluje s účinnou agregací receptorů protilátkami, o níž se věří, že je prvním krokem v procesu přenosu signálu do buňky. Dále, mutační studie (Brakebusch et al., 1992,

EMBO J. 11:943-950; Tartaglia et al., 1993, Cell 74:845-853) ukázaly, \ že biologická funkce receptorů p55 TNF-R závisí na integritě jeho intracelulární domény, a proto bylo navrženo, že k iniciaci přenosu signálu vedoucího k cytocidnímu účinku TNF dochází v důsledku asociace dvou nebo více intracelulárních domén p55 TNF-R. Kromě toho, TNF (a a β) se vyskytuje jako homotrimer a jako takový by mohl indukovat intracelulární přenos signálu prostřednictvím p55 TNF-R díky své schopnosti vázat a tím agregovat molekuly receptorů.

c

F

- 4··• ·

Jiným členem TNF/NGF nadrodiny receptoru je FAS receptor (FAS-R), známý též pod jménem FAS antigen, což je protein exprimovaný na povrchu buněk různých tkání, který sdílí homologii s řadou receptorů na buněčném povrchu, včetně TNF-R a NGF-R.

FAS-R zprostředkovává buněčnou smrt při apoptose (Itoh et al., 1991, Cell 66:233) a zdá se, že slouží jako negativní selektor autoreaktivních buněk T, tj. při zrání buněk T, FAS-R zprostředkuje apoptickou smrt buněk T rozpoznávajících vlastní antigeny. Rovněž bylo zjištěno, že mutace v genu pro FAS-R (Ipr) způsobují poruchu lymfoproliferace io u myší, jež připomíná lidskou autoimunitní chorobu systémový lupus erythematosus (SLE) (Watanabe-Fukunaga et al., 1992, Nátuře 356:314-317). Zdá se, že ligandem receptoru FAS-R je molekula spojená s povrchem buněk, mezi jinými zabíječských buněk T (nebo cytotoxických lymfocytů T - CTL buněk); dostanou-li se tudíž takovéto

CTL buňky do kontaktu s buňkami nesoucími FAS-R, mohou v nich indukovat apoptickou smrt. Dále: byla připravena monoklonální protilátka specifická pro FAS-R a tato monoklonální protilátka byla schopná indukovat apoptickou smrt buněk nesoucích FAS-R, včetně myších buněk transformovaných cDNA, jež kódovala lidský FAS-R (Itoh et al., 1991, Cell 66:233).

Zatímco některé cytotoxické účinky lymfocytů jsou zprostředkovány interakcí mezi ligandem produkovaným lymfocytem a hojně se vyskytujícím povrchovým receptorem FAS-R (CD95), čímž se spouští buněčná smrt, bylo též zjištěno, že různé jiné normální buňky, vedle lymfocytů T, exprimují na svém povrchu FAS-R a mohou být zabity aktivací tohoto receptoru. Předpokládá se, že neregulovaná indukce takovéhoto zabíjecího procesu přispívá k poškození tkáně při některých chorobách, například k destrukci jaterních buněk při akutní hepatitidě. Nalezení způsobů jak potlačit cytotoxickou aktivitu FAS-R tak může mít terapeutický potenciál.

Naopak, jelikož bylo rovněž zjištěno, že některé maligní buňky a buňky infikované virem HIV nesou na svém povrchu FAS-R, nabízí • · • · · ·· · ···· _ ^_· · · ·· · · · · · · · se možnost použít protilátky namířené proti FAS-R nebo ligand receptoru FAS-R ke spuštění cytotoxických procesů v těchto buňkách a tímto způsobem bojovat proti takovýmto maligním nebo virem HlV-infikovaným buňkám (viz Itoh et al., 1991, Cell 66:233).

Nalezení nových způsobů, tentokrát jak zvýšit- cytotoxickou aktivitu FAS-R, proto může mít rovněž terapeutický potenciál.

Již dlouho je pociťována potřeba nalézt způsob jak modulovat buněčnou odpověď na TNF (a nebo β) a FAS-R ligand. Například v patologických situacích zmíněných shora, při kterých dochází io k nadprodukci TNF nebo FAS-R ligandu, je žádoucí inhibovat cytocidní účinky indukované TNF nebo FAS-R ligandem, zatímco v jiných situacích, např. při hojení ran, je žádoucí účinek TNF posílit, anebo v případě FAS-R u nádorových nebo HlV-infikovaných buněk, -je žádoucí zesílit účinek zprostředkovaný FAS-R.

Předkladatelé použili řadu přístupů (viz například Evropské patentové přihlášky EP 186833, EP 308378, EP 398327 a EP 421486) k regulaci škodlivých účinků TNF, spočívajících v inhibici vazby TNF kjeho receptorům anti-TNF protilátkami nebo pomocí solubilních receptorů TNF (což jsou v podstatě volné extracelulární domény receptorů), které soutěží o vazbu TNF s receptory TNF-R zakotvenými na povrchu buněk. Dále: na základě toho, že vazba TNF k příslušným receptorům je podmínkou pro buněčné účinky indukované TNF, předkladatelé použili přístupy (viz například EPO 568925) k modulaci TNF účinku, jež spočívají v modulaci aktivity TNF-R receptorových ^r 25 molekul.

_ř Ve stručnosti, EPO 568925 se týká způsobu modulace přenosu signálu a/nebo štěpení v TNF-R molekulách, při němž peptidy nebo jiné molekuly interagují buď se samotným receptorem nebo s efektorovými proteiny interagujícími s receptorem, a takto mohou modulovat normální funkci TNF-R. V EPO 568925 je popsána konstrukce a charakterizace různých mutantních forem p55 TNF-R, ·· ·· • · · · ·· · ·

- ρ·ϊ· · které mají mutace v extracelulární, transmembránové a intracelulární doméně. Tímto způsobem byly ve shora uvedených doménách molekuly p55 TNF-R identifikovány oblasti nezbytné pro funkci * receptoru, tj. pro vazbu ligandu (TNF) a následný přenos signálu dovnitř buňky, které nakonec vedou k pozorovanému účinku TNF naV buňky. Dále je popsána řada přístupů k izolaci a identifikaci proteinů, peptidů nebo jiných faktorů, které jsou schopné se vázat k různým oblastem ve shora zmíněných doménách TNF-R, kteréžto proteiny, peptidy a jiné faktory se mohou účastnit regulace nebo modifikace aktivity TNF-R. V EPO 568925 je dále také uvedena řada postupů na izolaci a klonování DNA sekvencí kódujících takovéto proteiny a peptidy; na konstrukci expresních vektorů pro produkci těchto proteinů a peptidů; a na přípravu protilátek nebo jejich fragmentů, které interagují s TNF-R nebo se shora uvedenými proteiny a peptidy, jež se vážou k různým oblastem TNF-R. EPO 568925 však nespecifikuje konkrétní proteiny a peptidy, které se vážou k intracelulárním doménám TNF-R molekul (např. p55 TNF-R), ani neuvádí použití kvasinkového dvojhybridového systému na izolaci a identifikaci takovýchto proteinů nebo peptidů, které se vážou k intracelulárním doménám molekul TNF-R. Podobně nejsou v EPO 568925 zveřejněny proteiny nebo peptidy schopné vazby k intracelulární doméně FAS-R.

Je-li tedy zájem inhibovat účinek TNF nebo FAS-R ligandu, bude zapotřebí snížit množství nebo aktivitu receptorů TNF-R nebo FAS-R na buněčném povrchu, zatímco v případech, kdy cílem je zesílený účinek TNF nebo FAS-R ligandu, bude zapotřebí zvýšit množství nebo aktivitu receptorů TNF-R nebo FAS-R. Z toho důvodu byly získány sekvence promotorů p55 TNF-R i p75 TNF-R a následnou analýzou bylo nalezeno několik klíčových sekvenčních motivů, jež jsou specifické pro různé transkripční faktory; na úrovni promotorů tak může být regulována exprese těchto TNF-R, tj. inhibici transkripce z příslušných promotorů lze docílit snížení, počtu receptorů a zvýšením fť- ' ’ ΐ;

sf f’· fc ' ř

I-

transkripce z promotorů lze docílit zvýšení počtu receptorů (EP 606869 a WO 9531206). Odpovídající studie týkající se regulace FASR na úrovni promotoru genu FAS-R ještě nebyly popsány.

I když je známo, že receptory pro nádorový nekrotický faktor (TNF) a strukturně podobný receptor FAS-R spouští v buňkách stimulovaných ligandy, jež jsou produkovány leukocyty, destrukční aktivity vedoucí k jejich vlastnímu zániku, mechanismy tohoto spouštění jsou dosud málo prozkoumané. Mutační studie naznačují, že v receptorech FAS-R a p55 TNF-R (p55-R) se na přenosu signálu io podílejí zřetelně vymezené části jejich intracelulárních domén (Brakebusch et al., 1992, EMBO J. 11:943-950; Tartaglia et al., 1993, Cell 74:845-853; Itoh a Nagata, 1993, J. Biol. Chem. 268:10932-7). Tyto oblasti ('domény smrti', neboli 'domény efektoru smrti' označované 'DED') vykazují sekvenční podobnost. 'Domény smrti' obou receptorů FAS-R i p55-R mají tendenci autoasociovat. Tato autoasociace patrně podporuje zmiňovanou agregaci receptorů, jež je nutná pro iniciaci přenosu signálu (viz Song et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:22492-22495; Wallach et al., 1984, J. Immunol. 132:24649; Boldin et al., 1995, J. Biol, Chem. 270:7795-7798), a při vysoké hladině exprese receptoru může vést ke spuštění přenosu signálu nezávisle na ligandu (Boldin et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:77957798).

Některé cytotoxické účinky lymfocytů jsou zprostředkovány interakcí mezi ligandem produkovaným lymfocytem a FAS-R (CD-95), hojně se vyskytujícím receptorem na povrchu buněk, který má schopnost spustit buněčnou smrt (viz též Nagata a Golstein, 1995, Science 267:1449-1456); v zabíjení buněk mononukleárními fagocyty hraje roli ligand-receptorový pár, TNF a jeho receptor p55-R (CD120), které jsou strukturně podobné FAS-R a jeho ligandu (viz též

3o Vandenabeele et al., 1995, Trends Cell Biol. 5:392-400). Podobně jako i v jiných případech účinků indukovaných receptory, indukce buněčné smrti prostřednictvím receptorů TNF-R a FAS-R probíhá

- 8·•· ·· · · · ·· • · · « · · ·· · prostřednictvím řady interakcí typu protein-protein, jež vedou od vazby ligandu na receptor až ke konečné aktivaci enzymatických efektorových funkcí. V jednotlivých případech byly popsány * neenzymatické protein-protein interakce, které iniciují přenos signálu pro buněčnou smrt: vazba trimerních molekul TNF nebo FAS-R ligandu k receptorům, z toho plynoucí interakce intracelulárních domén receptorů (Brakebusch et al., 1992, EMBO J. 11:943-950; Tartaglia et al., 1993, Cell 74:845-853; Itoh a Nagata, 1993, J. Biol. Chem. 268:10932-7) podpořená tendencí domén smrti (neboli domén io efektoru smrti, DED) autoasociovat (Boldin et al., 1995, J. Biol. Chem.

270:337-341), a indukovaná vazba dvou cytoplasmatických proteinů (které se také mohou vázat navzájem) k intracelulárním doménám receptorů - MORT-1 (nebo FADD) k FAS-R (Boidin et ai., 1995, J. Biol. Chem. 270:7795-7798; Chinnaiyan et al., 1995, Cell 81:505-512;

Kischkel et al., 1995, EMBO J. 14:5579-5588), a TRADD k p55-R (Hsu et al., 1995, Cell 81:495-504; Hsu et al., 1996, Cell 84:299-308). Pomocí kvasinkového dvojhybridového systému byly identifikovány tři proteiny, které se vážou k intracelulární doméně FAS-R a p55-R v oblasti 'domény smrti', která se účastní indukce buněčné smrti receptory prostřednictvím hetero-asociace homologních oblastí, a které jsou i samostatně schopné vyvolat buněčnou smrt. Jeden z těchto proteinů je MORT-1 (Boldin et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:7795-7798), též známý jako FADD (Chinnaiyan et al., 1995, Cell 81:505-512), který se specificky váže k FAS-R. Druhý protein, TRADD (viz též Hsu et al., 1995, Cell 81:495-504; Hsu et al., 1996, Cell 84:299-308) se váže k p55-R, a třetí, RIP (viz též Stanger et al., 1995, w Cell 81:513-523), se váže k FAS-R i k p55-R. Tyto proteiny se kromě vazby k FAS-R a p55-R mohou vázat i mezi sebou navzájem, což dává možnost funkční “křížové komunikace“ mezi FAS-R a p55-R. K těmto

3o vazbám dochází prostřednictvím konzervovaného motivu, 'modulu domény smrti' (též nazývaného 'DED', tj. 'domény efektoru smrti'), který je společný pro receptory i jejich asociované proteiny. V k ·

K .

- 9·kvasinkovém dvojhybridovém testu se sice MORT-1 spontánně váže k FAS-R, v savčích buňkách však tato vazba nastává pouze po stimulaci receptoru, což naznačuje, že MORT-1 se účastní počátečních fází signalizace receptorem FAS-R. MORT-1 neobsahuje žádný sekvenční motiv charakteristický pro enzymatickou aktivitu, a proto jeho schopnost spouštět buněčnou smrt zřejmě nezahrnuje nějakou vnitřní aktivitu samotného proteinu MORT-1, ale spíše aktivaci nějakého jiného proteinu (proteinů), které se vážou k MORT-1 a působí níže v signalizační kaskádě. Jsou-li v buňkách exprimovány mutované formy MORT-1, jimž schází N-koncová část molekuly, indukce cytotoxicity prostřednictvím FAS/APO1 (FAS-R) nebo p55-R je blokována (Hsu et al., 1996, Cell 84:299-308; Chinnaiyan et al., 1996, J. Bioi. Chem. 271:4961-4965), což naznačuje, že tato N-koncová oblast přenáší prostřednictvím protein-protein interakcí signál pro cytocidní účinek obou receptorů.

Nedávné studie prokázaly, že počátku různých fyziologických procesů buněčné smrti se účastní skupina cytoplasmatických thiolových proteas, které jsou strukturně příbuzné protease CED3 z Caenorhabditis elegans a savčímu interleukin-ΐβ konvertujícímu enzymu (ICE) (přehledné články Kumar, 1995, Trends Biochem. Sci. 20:198-202 a Henkart, 1996, Immunity 4:195-201). Objevily se též náznaky, že proteasa (proteasy) z této rodiny mohou hrát i roli v buněčné cytotoxicitě indukované prostřednictvím FAS-R a TNF-R receptorů. Bylo zjištěno, že specifické peptidové inhibitory proteas a dva virově kódované proteiny, protein crmA z kravských neštovic a bakulovirový protein p35, poskytují buňkám ochranu před touto buněčnou cytotoxicitou (Enari et al., 1995, Nátuře 375:78-81; Los et al., 1995, Nátuře 375:81-83; Tewari et al·., 1995a, J. Biol. Chem. 270:18738-18741; Xue et al., 1995, Nátuře 377:248-251; Beidler et al.,

1995, J. Biol. Chem. 270:16526-16528). Krátce po stimulaci receptorů

FAS-R nebo TNF-R bylo v buňkách možné prokázat rychlé štěpení

I

- 10·určitých specifických buněčných proteinů, zřejmě zprostředkované proteasou (proteasami) CED3/ICE rodiny.

Je třeba podotknout, že tyto CDE3/ICE proteásy, označované též caspasy, jsou produkovány ve formě neaktivních prekursorů, které se aktivují proteolytickým štěpením po indukci programu buněčné smrti. Tyto caspasy jsou konzervované cysteinové proteásy, jež štěpí specifické buněčné proteiny za aspartátovými zbytky, a hrají tím zásadní roli ve všech známých procesech programované buněčné smrti. Prekursorové proteiny obsahují vedle homologních C-koncových oblastí, z nichž jsou odvozeny maturní proteásy, unikátní N-koncové oblasti. Interakce těchto 'prodomén' se specifickými regulačními molekulami umožňuje diferencovanou aktivaci různých caspas různými indukujícími signály (Boldin et al., 1996, Cell 85:803-815; Muzio et al.,

1996, Cell 8:817-827; Duan a Dixit, 1997, Nátuře 385:86-89; Van

Criekinge et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:27245-8; Ahmad et al.,

1997, Cancer Research 57:615-620).

Jedna taková proteasa plus její různé isoformy (včetně inhibujících), označená jako MACH (nazývaná také CASP-8), jež se váže k proteinu MORT-1 a moduluje jeho aktivitu a tudíž i aktivitu

FAS-R a p55-R, a která může působit též nezávisle na MORT-1, byla nedávno izolována, klonována, charakterizována a taktéž byla popsána její možná použití, jak je podrobně uvedeno, a zde v úplnosti zahrnuto odkazem, ve spoluvlastněných, společně podaných Israelských Patentových Přihláškách No. IL 114615, 114986, 115319,

116588 a 117932, jakož i v jim odpovídajícím PCT (Patent

Cooperation Treaty) protějšku No. PCT/US96/10521, a v nedávné publikaci nynějších předkladatelů (Boldin et al., 1996, Cell 85:803815). Jiná taková proteasa a její různé isoformy (včetně inhibujících), označená Mch4 (zvaná také CASP-10) byla rovněž nedávno izolována a charakterizována nynějšími předkladateli’ (nepublikováno) a jinými autory (Fernandes-Alnemri et al., 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93:7464-7469; Srinivasula et al., 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA

93:14486-14491). Tento Mch4 protein je rovněž M0RT-1- vazebný protein, jenž moduluje aktivitu MORT-1 a tudíž pravděpodobně též aktivitu FAS-R a p55-R, a který rovněž může působit nezávisle na MORT-1. Podrobnosti týkající se všech aspektů, znaků, vlastností a použití Mch4 jsou předloženy ve shora uvedených publikacích, které všechny jsou zde zahrnuty v úplnosti odkazem.

Je třeba též poznamenat, že caspasy MACH (CASP-8) a Mch4 (CASP-10), které mají podobné prodomény (viz Boldin et al., 1996, Cell 85:803-815; Muzio et al., 1996, Cell 8:817-827; Fernandesio Alnemri et al., 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93:7464-7469; Vincent a Dixit, 1997, J. Biol, Chem. 272:6578-6583) interagují prostřednictvím svých prodomén s MORT-1, přičemž k interakci slouží 'motiv domény smrti' neboli 'doména efektoru smrti', DED, přítomný v N-koncové části MORT-1 a přítomný ve dvou kopiích v MACH (CASP-8) a Mch4 (CASP-10) (viz Boldin et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:7795-7798;

Chinnaiayn et al., 1995).

Je třeba též zmínit, vzhledem k shora uvedenému, že různé proteiny/enzymy/receptory zúčastněné v intracelulárním přenosu signálu vedoucím k buněčné smrti, dostaly nejrůznější názvy. Aby se předešlo nejasnostem, je níže uveden seznam různých názvů pro všechny tyto proteiny nebo jejich části, včetně nových jmen stanovených novou konvencí, spolu se jmény používanými pro usnadnění v tomto textu:

- 12·-·

Obvyklý nebo první název	Jiné názvy	Název podle nové konvence	Název užívaný v tomto textu
p55 TNF receptor	p55-R	CD12Oa.	p55-R
p75 TNF receptor	p75-R	CD120b	p75-R
FAS receptor	FAS-R, FAS/APO1	CD95	FAS-R
MORT-1	FADD	-	MORT-1
MACH	FLICE1,Mch5	CASP-8	MACH
Mch4	FLICE2	CASP-10	Mch4
G1	-	CASH	G1
'doména smrti'	motiv domény smrti, MORT motiv, doména efektoru smrti (DED), MORT moduly		doména smrti/motiv domény smrti/MORT moduly
CED3/ICE proteasy	caspasy	CASP	CED3/ICE proteasy

Podstata vynálezu

Cílem vynálezu je poskytnout nové proteiny, včetně všech jejich isoforem, analogů, fragmentů nebo derivátů, které jsou schopné vázat se k MORT-1-vazebným proteinům jako například shora zmíněným proteinům Mch4 a MACH a jejich isoformám, nebo které jsou schopné vazby k samotnému MORT-1. Vzhledem k tomu, že MORT-1 se sám váže k intracelulární doméně FAS-R, jsou nové proteiny podle vynálezu, díky své vazbě k MORT-1-vazebným proteinům a tedy nepřímo k MORT-1, nebo přímo k proteinu MORT-1, schopné ovlivňovat přenos signálu v buňce, zahájený vazbou FAS ligandu ke

- 13^,s

• A A	A A	A	A A		A A
• A Á	• ·	• A	A	A'	A	A
• A A	• A	A	A	A	A	A
						A
• · ·	A A	Á	A	A	A	A
.. ..	• A	♦ A A	A A		A A

svému receptorů, a jako takové jsou tyto nové proteiny podle vynálezu modulátory účinku na buňky zprostředkovaného FAS-R. Protein MORT-1 je také zapojen do modulace účinku TNF na buňky prostřednictvím své účasti v modulaci p55-R, a tudíž nové proteiny podle vynálezu lze rovněž chápat jako modulátory účinku TNF na buňky, zprostředkovaného skrze p55-R. Proteiny podle vynálezu mohou taktéž být, analogicky se shora uvedenou modulací účinků na buňky skrze FAS-R a p55-R, i mediátory nebo modulátory jiných cytotoxických mediátorů nebo induktorů, jež působí ve sdílených nebo příbuzných intracelulárních signalizačních dráhách, ve kterých jsou proteiny podle vynálezu (např. G1 a jeho isoformy) zapojeny. Tyto nové proteiny podle vynálezu jsou označeny “G1“ proteiny a jak je uvedeno shora, zahrnují G1 protein (uvedený příkiadem níže), všechny jeho isoformy, analogy, fragmenty nebo deriváty.

Jiným cílem vynálezu je poskytnout antagonisty (např. protilátky, peptidy, organické sloučeniny nebo dokonce některé isoformy) k shora uvedeným novým G1 proteinům a jejich isoformám, analogům, fragmentům a derivátům', které mohou být použity, je-li to žádoucí, k inhibici přenosu signálu nebo, konkrétněji, k inhibici buněčné

2o cytotoxicity.

Dalším cílem vynálezu je použití výše uvedených nových G1 proteinů a jejich isoforem, analogů, fragmentů a derivátů k izolaci a charakterizaci dalších proteinů nebo faktorů, které mohou být zapojeny v regulaci receptorové aktivity, např. dalších proteas, jež štěpí nové proteiny a tím je činí biologicky aktivními, a/nebo k izolaci a identifikaci jiných receptorů, působících výše v signalizační kaskádě, ke kterým se tyto nové proteiny, analogy, fragmenty a deriváty vážou (např. jiné FAS-R nebo příbuzné receptory), a v jejichž funkci jsou tedy také zapojeny.

3o Ještě dalším cílem vynálezu je poskytnout inhibitory, které mohou být vneseny do buněk, aby se vázaly nebo interagovaly s G1 • · · « · «© 4 4

4 4 4 e i

k

r 'f 'fe proteinem a případnými G1 isoformami, jež mají proteasovou aktivitu (G1 protein má oblast, jež je homologní s proteolytickými oblastmi Mch4 a MACH) a inhibovaly jejich intracelulární aktivitu, která může být, alespoň u některých G1 isoforem, proteolytickou aktivitou.

Kromě toho je cílem předkládaného vynálezu použít shora zmíněné nové G1 proteiny a jejich isoformy a analogy, fragmenty a deriváty jako antigeny pro získání příslušných polyklonálních a/nebo monoklonálních protilátek. Protilátky potom mohou být použity, například, při purifikaci nových proteinů z různých zdrojů, jako jsou ío buněčné extrakty nebo transformované buněčné linie.

Dále ještě, tyto protilátky mohou být použity pro diagnostické účely, např. pro identifikaci poruch souvisejících s abnormální funkcí buněčných procesů zprostředkovaných FAS-R nebo příbuznými réceptory.

Dalším cílem vynálezu je poskytnout farmaceutické prostředky obsahující shora uvedené nové G1 proteiny, jejich isoformy, analogy, fragmenty nebo deriváty, jakož i farmaceutické prostředky obsahující shora zmíněné protilátky nebo jiné antagonisty.

Podle vynálezu byl izolován nový protein G1, schopný vazby

2o nebo interakce s Mch4, který sám se váže k MORT-1, a ten se váže k intracelulární doméně FAS-R. Protein G1 může též interagovat s jiným MORT-1-vazebným proteinem, nazývaným MACH, a může být rovněž schopen přímo se vázat nebo přímo interagovat s MORT-1. G1 pravděpodobně funguje jako modulující součást signalizační dráhy buněčné smrti, iniciované vazbou FAS ligandů k receptoru FAS-R na buněčném povrchu, a to na základě skutečnosti, že obsahuje proteasovou oblast podobnou proteasovým oblastem v Mch4 a MACH, a tudíž G1 může být rovněž aktivní intracelulární proteasa. Dále, v závislosti na průběhu transkripce a translace při expresi G1, zejména její proteasové oblasti, mohou vznikat některé isoformy G1 bez aktivní proteasové oblasti, a jako takové mohou sloužit coby antagonisté

proteolytické aktivity zprostředkované, například, proteiny Mch4 a MACH. V apoptických procesech spouštěných FAS-R byla prokázána účast proteas CED3/ICE rodiny. MORT-1 (nebo FADD) se váže k intracelulámí doméně FAS-R po aktivaci tohoto receptoru, a nový protein G1 podle vynálezu se váže k MORT-1-vazebným proteinům, jako k Mch4 a možná též k MACH, nebo případně přímo k MORT-1. Protein G1, klonovaný a charakterizovaný podle vynálezu, může existovat v četných isoformách, z nichž některé obsahují oblast homologní s CED3/ICE oblastí, která má proteolytickou aktivitu (proteolytickou doménu), podobnou jako mají Mch4 a některé isoformy MACH, a které mohou způsobit buněčnou smrt, jsou-li v buňkách exprimovány. Aktivace tohoto nového CED3/ICE homologů (tj. různých isoforem G1 majících proteolytickou doménu) receptorem FAS-R (prostřednictvím přímé nebo nepřímé interakce s MORT-1) tak zřejmě tvoří efektorovou složku dráhy buněčné smrti zprostředkované receptorem FAS-R.

Kromě toho, G1 zřejmě také působí jako efektorová složka programu buněčné smrti iniciovaného vazbou TNF k p55-R na povrchu buňky; v této dráze se MORT-1 váže k TRADD, což je protein, jenž se váže k intracelulámí doméně p55-R (Hsu et al., 1995, Cell 81:495-504), a současně nebo následně s tím, se G1 váže k MORT-1vazebným proteinům, jako např. k Mch4 nebo k MACH, nebo přímo k MORT-1, přičemž dochází k aktivaci G1 na aktivní proteasu, zapojenou do procesu buněčné smrti.

Je též třeba podotknout, že i když protein G1 vykazuje alespoň některé ze sekvenčních charakteristik nezbytných pro funkci CED/ICE3 proteas, má některé své vlastní odlišné sekvenční znaky, které mohou umožňovat jeho unikátní a možná tkáňově/buněčně specifický mechanismus účinku.

Podle vynálezu je tedy poskytován nový protein, označený G1. Tento G1 protein byl izolován a nakloňován pomocí dvojhybridového ·· » « ··

16··»

·<Μ.

systému, a charakterizován jako molekula, jež váže Mch4. Mch4 je, jak bylo řečeno výše, MORT-1-vazebný protein, který je schopen způsobit buněčnou smrt, i když by však mělo být také řečeno, že některé isoformy Mch4 mají opačný účinek, tzn. brání zabití buněk. Dále, sekvenovánt G1 zatím ukázalo, že v N-koncové oblasti G1 se nacházejí dva tzv. 'MORT MODULY' (MM), které byly rovněž nalezeny v MORT-1-vazebných proteinech MACH a Mch4. Zdá se, že tyto MORT MODULY v G1 zodpovídají za jeho schopnost vázat se k Mch4 a mohou též být základem případné přímé vazby k MORT-1 a vazby k MACH nebo specifickým isoformám proteinu MACH (vzniklých variantním sestřihem). V další části sekvence G1 směrem 3' od Nkoncové oblasti, jež obsahuje MORT MODULY, se nachází dlouhá oblast vykazující podobnost proteolytické oblasti proteinů MACH a Mch4. Kromě toho, předběžná analýza chromosomálni lokalizace G1 sekvence naznačuje, že G1 se nachází na lidském chromosomu 2, velmi blízko místa, kde je i Mch4 a MACH, což rovněž napovídá vzájemný vztah mezi G1, MACH a Mch4.

Konkrétněji, ve shodě s předkládaným vynálezem byly nalezeny nejméně tři možné isoformy G1 (viz Přiklad 1 níže). Dvě z nich byly

2o izolovány a nakloňovány a zdá se, že představují dvě sestřihové varianty nového proteinu, označeného G1 (nebo CASH). Větší isoforma byla pojmenována G1a (nebo CASHa) a menší byla pojmenována Θ1β (nebo CASHp) (zdá se však, že existuje více než jedna krátká isoforma, proto se G1p označuje též ϋ1β1 a druhá krátká isoforma se označuje Gip2 - viz Příklad 1 níže). Obě tyto G1a a β isoformy obsahují dvě N-koncové domény smrti/MORT MODULY a prostřednictvím těchto motivů se mohou vázat k sobě navzájem a také se mohou vázat kMORTI, MACH a Mch4. Delší isoforma G1a má unikátní C-koncovou část (ve srovnání s kratší Θ1β isoformou),

3o přičemž tento C-koncový úsek je sekvenčně homologní s oblastí proteasové aktivity caspasy. Pokud jde o biologickou aktivitu, kratší

íi

9«

- 17·-·

Θ1β isoforma inhibuje buněčnou smrt/cytotoxicitu zprostředkovanou receptory p55-R a FAS-R, zatímco naopak, delší G1a isoforma má cytotoxické účinky alespoň u některých typů buněk (např. buněk 293), přičemž v této cytotoxicitě hraje roli její oblast homologie t 5 s proteasovou doménou. Avšak je též třeba podotknout, že delší G1a isoforma je v jiných buněčných typech (např. HeLa buňky) schopná cytotoxicitu zprostředkovanou FAS-R a p55-R inhibovat. Tyto výsledky naznačují, že protein G1 (jmenovitě jeho různé isoformy) může v programech buněčné smrti působit při přenosu signálu od receptorů io p55-R a FAS-R jako atenuátor/inhibitor anebo iniciátor/zesilovač.

Je třeba také poznamenat, že v tomto textu se různé isoformy G1, např. G1a a G1fl, pro přehlednost často označují jednoduše jako ir.

'G1'; výraz 'G1' v těchto případech však zahrnuje všechny isoformy G1, což tedy může znamenat, že jde jak o induktory/zesilovače, tak o inhibitory/atenuátory cytotoxicity. Půjde-li o konkrétní G1 isoformu, bude použito specifické označení (např. G1a nebo G10, podle případu). Při použití 'G1' jako kolektivního označení různých isoforem bude též často užito termínu 'modulátor', což znamená; že pro danou biologickou aktivitu může mít účinek inhibiční nebo zesilující.

Vzhledem ke shora uvedenému a jak zde bude níže vyloženo, G1 je zřejmě modulátorem aktivity MORT-1 a tudíž modulátorem účinků na buňky zprostředkovaných FAS-R a také p55-R, jakož i případnými dalšími receptory patřícími do rodiny TNF/NGF receptorů a rovněž dalších receptorů, jež mohou sdílet společné složky a mechanismy intracelulárního přenosu signálu.

Jelikož G1 zřejmě má protease-podobnou oblast (alespoň dlouhá isoforma), může být přímo zodpovědný za buněčnou cytotoxicitu a zánětlivý proces způsobený nebo indukovaný různými podněty, včetně stimulů přenášených prostřednictvím receptorů TNF/NGF rodiny, jakož i případných dalších.

i ' .

I ··

• ·· • · 4 • 94	44 · 4 4 44 4 4 4	44 4 4 4 4 4 4
• 4 44	44 444	44

G1 může též působit jako inhibitor buněčné cytotoxicity a zánětu a to na základě toho, že jako součást komplexu dalších proteinů může ovlivňovat cytotoxické nebo zánětlivé účinky těchto dalších proteinů (např. MACH a Mch4 nebo dokonce MORT-1), což v důsledku může vést k inhibici jejich cytotoxické aktivity nebo jejich aktivty v zánětu.

G1 může ale též působit jako zesilovač buněčné cytotoxicity a zánětu, a to zesilováním aktivity jiných proteinů (např. Mch4 a MACH nebo dokonce MORT-1) tím, že vazbou k nim je přivádí k vazbě s MORT-1 nebo k účinku na MORT-1 nezávislém, v každém případě s důsledkem spočívajícím v zesílení cytotoxické aktivity různých proteinů nebo v zesílení jejich zánětlivých účinků.

Analogickým způsobem může G1 též působit jako inhibitor nebo zesilovač jiných intracelulárních mediátorů nebo modulátorů, jež využívají signalizačních drah, v nichž je G1 aktivně zapojen.

MORT-1 (zkratka odvozena z 'Mediator of Receptor Toxicity',

Boldin et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:7795-7798) je schopen vázat se k intracelulární doméně FAS-R. Zdá se, že tento protein působí jako mediátor nebo modulátor buněčného účinku ligandů receptoru FAS-R tím, že zprostředkuje nebo moduluje intracelulární přenos signálu,

2o který obvykle nastává po vazbě FAS-R ligandů na povrchu buňky. Vedle FAS-vazebné specifity byly u MORT-1 nalezeny další vlastnosti (viz Odkazový Příklad 1), například má oblast homologní s 'doménou smrti' (DD) v p55-TNF-R a FAS-R (p55-DD a FAS-DD), a je proto rovněž schopen autoasociace. MORT-1 je též sám schopen aktivovat buněčnou cytotoxicitu, což možná souvisí s jeho schopností autoasociace. Rovněž bylo zjištěno, že koexprese oblasti MORT-1 obsahující sekvenci homologní s 'doménou smrti' (MORT-DD, přítomnou v C-koncové části MORT-1) silně brání buněčné smrtí indukované FAS ligandem, což lze očekávat vzhledem ke schopnosti

3o MORT-DD vázat se k 'doméně smrti' FAS-IC. Dále bylo za stejných experimentálních podmínek zjištěno, že koexprese části MORT-1, jež

t·

• 4 4	··	•	44		4 4
4 4 4	• ·		4 4	4	4
• e«	4 ·	•	4 4	4	4
					•
• · ·	• ·	4	4 4	4	4
• · ··	• ·	444	44		44

neobsahuje oblast MORT-DD (N-koncová část MORT-1, aminokyseliny 1-117, “MORT-1 hlava“) nebránila buněčné smrti indukované FAS ligandem, a pokud vůbec, poněkud zesilovala FAS-indukovanou buněčnou cytotoxicitu.

Je proto pravděpodobné, že MORT-1 se váže také k jiným proteinům účastnícím se na intracelulárním přenosu signálu. Tyto MORT-1-vazebné proteiny mohou proto též působit jako nepřímé mediátory a modulátory účinku FAS-R ligandu na buňky tím, že zprostředkují nebo modulují aktivitu MORT-1; nebo mohou tyto MORTio 1-vazebné proteiny působit přímo jako mediátory nebo modulátory intracelulárního přenosu signálu spojeného s MORT-1 tím, že zprostředkují nebo modulují aktivitu MORT-1, který má, jak bylo shora uvedeno, zřejmě nezávislou schopnost aktivovat buněčnou cytotoxicitu. Tyto MORT-1-vazebné proteiny mohou být též použity v jakémkoli standardním vyhledávacím postupu směřujícím k izolaci, identifikaci a charakterizaci dalších proteinů, peptidů, faktorů, protilátek atd., které mohou být zapojené do procesu přenosu signálu souvisejícího s MORT-1 nebo FAS-R, nebo mohou být součástí jiných intracelulárních signalizačních drah. Takovéto MORT-1-vazebné proteiny byly izolovány a popsány jak bylo shora uvedeno ve spoluvlastněných, společně podaných Israelských patentových přihláškách No. IL 114,615, 114,986, 115,319, 116,588, 117,932 a jim odpovídající PCT přihlášce PCT/US96/10521 (pokud jde o MACH a jeho isoformy), a ostatními, jako Fernandes-Alnemri et al. 1996,

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93:7464-7469 a Srinivasula et al. 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93:14486-14491 (pokud jde o Mch4 a další takové 'Meh' proteiny). Jeden z těchto MORT-1-vazebných proteinů, shora uvedený MACH, byl nakloňován, sekvenován a částečně charakterizován, přičemž byly zpočátku zjištěny následující vlastnosti:

MACH cDNA kóduje otevřený čtecí rámec ORF-B; MACH se velmi silně a specificky váže k MORT-1; vazebné místo pro MACH se na molekule MORT-1 nachází před (směrem k N-konci) “doménou smrti“;

ORF-B oblast molekuly MACH představuje část interagující s MORT1; MACH je schopen autoasociovat a je schopen samostatně indukovat buněčnou cytotoxicitu. Dále: pozdější analýza, vyložená ve * shora uvedených spoluvlastněných, společně podaných patentových ' přihláškách, jakož i v Boldin et al. (1996), ukázala, že MACH se

4' vlastně vyskytuje v mnoha isoformách. Kromě toho, již zmíněný MACH ORF-B je ve skutečnosti jedna z isoforem proteinu MACH, označená jako ΜΑΟΗβΙ. Ve shora uvedených publikacích týkajících se Mch4 bylo též popsáno, že tento protein se rovněž váže k MORT-1 (nebo w FADD) a přímo se účastní na buněčné cytotoxicitě s MORT-1, nebo nezávisle na MORT-1, a to na základě své proteolytické aktivity.

Předkládaný vynález tedy poskytuje DNA sekvenci kódující protein G1, jeho analogy nebo fragmenty, schopné vázat se nebo přímo či nepřímo interagovat s MORT-1 a/nebo s kterýmikoli z MORT15 1-vazebných proteinů, jako například s Mch4 nebo s MACH, přičemž řečený G1 protein, jeho analogy nebo fragmenty, jsou schopné zprostředkovat intracelulární účinek zprostředkovaný receptorem FAS-R nebo p55-TNF-R, přičemž řečený G1 protein, jeho analogy nebo fragmenty, jsou rovněž schopné modulovat nebo zprostředkovat intracelulární účinek dalších intraceíulárních proteinů, k nimž jsou schopné se přímo nebo nepřímo vázat.

Zejména vynález poskytuje DNA sekvenci vybranou ze skupiny :

(a) cDNA sekvence odvozená z kódující oblasti nativního G1 proteinu;

(b) DNA sekvence schopné hybridizovat za mírně stringentních * podmínek k sekvenci dle (a), a které kódují biologicky aktivní G1 protein; a (c) DNA sekvence, které jsou s ohledem na genetický kód degenerované vůči DNA sekvencím uvedeným v (a) a (b), a které kódují biologicky aktivní G1 protein.

£ l·' fc i:

- 2t

	c · • * e β	• ♦ β «	« ·	*· • · o e	•	• 6
						•
	• ·	• ·		• ·	•	•
•s	··	··	• · ·	««	··

Další specifické provedení shora uvedené DNA sekvence podle vynálezu je DNA sekvence zahrnující alespoň část sekvence kódující alespoň jednu isoformu G1 proteinu. Jiným provedením shora uvedené DNA sekvence je sekvence kódující G1 protein, znázorněná na Obr.1 (G1a isoforma). Jiné takovéto provedení je druhá G1 isoforma znázorněná na Obr.2 (Gip isoforma).

Předkládaný vynález poskytuje G1 proteiny a jejich analogy, fragmenty nebo deriváty, kódované kteroukoli ze shora uvedených sekvencí podle vynálezu, přičemž řečené proteiny, analogy, fragmenty a deriváty jsou schopné vázat se nebo interagovat přímo či nepřímo s MORT-1 a/nebo s kterýmkoli z MORT-1-vazebných proteinů, jako například Mch4 nebo MACH, a zprostředkovat intracelulární účinek zprostředkovaný FAS-R nebo p55 TNF-R receptorem, nebo jakýmkoli jiným cytotoxickým mediátorem nebo induktorem, ke kterému jsou řečené G1 proteiny, analogy, fragmenty nebo deriváty schopné se přímo nebo nepřímo vázat.

Konkrétním provedením vynálezu je G1 protein, jeho analogy, fragmenty a deriváty. Dalším provedením je jakákoli isoforma G1 proteinu, její analogy, fragmenty a deriváty.

2o Předkládaný vynález rovněž poskytuje vektory kódující výše uvedený G1 protein a analogy, fragmenty nebo deriváty podle vynálezu, které obsahují DNA sekvence podle vynálezu, přičemž tyto vektory jsou schopné exprese ve vhodných eukaryotických nebo prokaryotických hostitelských buňkách; transformované eukaryotické nebó prokaryotické hostitelské buňky obsahující takovéto vektory; a způsob produkce G1 proteinu nebo analogů, fragmentů nebo derivátů podle vynálezu, pěstováním takovýchto transformovaných hostitelských buněk za podmínek vhodných pro expresi řečeného proteinu, analogů, fragmentů nebo derivátů, uskutečněním post30 translačních modifikací řečeného proteinu nezbytných pro získání proteinu a izolováním exprimovaného proteinu, analogů, fragmentů

© © « • · • 9

22·-· ·· • 99 ·

β e • · • · · nebo derivátů z kultivačního média transformovaných buněk nebo z buněčných extraktů transformovaných buněk. Shora uvedeným definicím má být rozuměno tak, že zahrnují všechny isoformy G1 proteinu.

Z jiného hlediska předkládaný vynález poskytuje též protilátky nebo jejich aktivní deriváty nebo fragmenty, které jsou specifické pro G1 protein a jeho analogy, fragmenty a deriváty podle vynálezu.

Z ještě jiného hlediska poskytuje vynález různá použití shora uvedených DNA sekvencí nebo proteinů jimi kódovaných, přičemž tato použití obecně zahrnují mezi jiným:

(A) Způsob modulace buněčné smrti nebo zánětlivých procesů, zahrnující působení na řečené buňky jedním nebo více G1 proteiny, analogy, fragmenty nebo deriváty podle vynálezu jak uvedeno shora, kde působení na buňky zahrnuje zavedení jednoho nebo více proteinů, analogů, fragmentů nebo derivátů do buněk ve formě vhodné pro jejich intracelulární zavedení, nebo zavedení nukleotidové sekvence kódující řečený jeden nebo více proteinů, analogů, fragmentů nebo derivátů do buněk ve formě vhodného vektoru nesoucího řečenou sekvenci, přičemž vektor je schopný vnést sekvenci do buněk způsobem, že sekvence je v buňkách exprimována; a (B) Způsob modulace buněčné smrti nebo zánětlivých procesů, zahrnující působení na řečené buňky jedním nebo více inhibitory jednoho nebo více proteinů/enzymů zprostředkujících buněčnou smrt nebo zánětlivé procesy, přičemž řečené inhibitory jsou vybrány ze skupiny sestávající z: (i) jednoho nebo více G1 proteinů, analogů, fragmentů nebo derivátů podle vynálezu, jež jsou schopné inhibovat buněčnou smrt nebo zánětlivé procesy; a (ii) inhibitorů jednoho nebo více G1 proteinů podle vynálezu, kdy řečený jeden nebo více G1 proteinů zesiluje nebo zprostředkuje buněčnou smrt nebo zánětlivé procesy.

·· • φ φφ • · * • « · • · · • · · · ·« φφ &

·· • · ·· β β β • · ·· • « • · • β • · »· ·· β

···

Shora uvedené způsoby podle vynálezu zahrnují obzvláště následující specifická provedení:

(i) Způsob modulace účinku FAS-R ligandu nebo TNF na buňky nesoucí FAS-R nebo p55-R, zahrnující působení na řečené buňky jedním nebo více G1 proteiny, analogy, fragmenty nebo deriváty podle vynálezu, jež mají schopnost vázat se přímo či nepřímo k MORT-1, ř- nebo k MORT-1-vazebným proteinům jako Mch4 nebo MACH, přičemž

MORT-1 se zase přímo váže k intracelulární doméně FAS-R, nebo 10 mají schopnost vázat se přímo či nepřímo k MORT-1 nebo k MORT-1vazebným proteinům jak uvedeno shora, přičemž MORT-1 se zase | váže k proteinu TR.ADD, který se váže k intracelulární doméně p55-R, , a tím jsou schopné modulovat/zprostředkovávat aktivitu FAS-R nebo p55 TNF-R, přičemž toto působení na řečené buňky zahrnuje zavedení jednoho nebo více proteinů, analogů, fragmentů nebo derivátů do buněk ve formě vhodné pro jejich intracelulární zavedení, nebo zavedení DNA sekvence kódující jeden nebo více proteinů, analogů, fragmentů nebo derivátů do buněk ve formě vhodného vektoru nesoucího řečenou sekvenci, přičemž vektor je schopný vnést sekvenci do buněk způsobem, že sekvence je v buňkách exprimována.

(ii) Způsob modulace účinku FAS-R ligandu nebo TNF na buňky podle (i) shora, kde řečené působení na buňky zahrnuje zavedení G1 proteinu nebo jeho analogů, fragmentů nebo derivátů do řečených buněk ve formě vhodné pro intracelulární zavedení, nebo zavedení DNA sekvence kódující G1 protein nebo analogy, fragmenty nebo deriváty do buněk ve formě vhodného vektoru nesoucího řečenou sekvenci, přičemž vektor je schopný vnést sekvenci do buněk způsobem, že sekvence je v buňkách exprimována.

v _ ‘ 'φ

-•24*-** (iii) Způsob jako (ii) shora, kde řečené působení na řečené buňky se provede transfekcí buněk rekombinantním živočišným virovým vektorem, což zahrnuje kroky:

(a) konstrukce rekombinantního vektoru odvozeného ze živočišného viru, který obsahuje sekvenci kódující virový povrchový protein (ligand) schopný vázat se k specifickému povrchovému receptorů buňky, která nese na povrchu FAS-R nebo p55-R, a který obsahuje druhou sekvenci kódující protein vybraný z G1 proteinu a jeho analogů, fragmentů a derivátů, který je při expresi v řečených buňkách schopný modulovat/zprostředkovat aktivitu FAS-R nebo p55-R receptorů; a (b) infikování řečených buněk vektorem podle (a).

(iv) Způsob modulace účinku FAS-R ligandu nebo TNF na buňky nesoucí FAS-R nebo p55-R, zahrnující působení na řečené buňky protilátkami nebo jejich aktivními fragmenty či deriváty podle vynálezu, přičemž řečené působení spočívá v aplikaci vhodného prostředku, obsahujícího protilátky nebo jejich aktivní fragmenty nebo deriváty na řečené buňky, přičemž je-li alespoň část G1 proteinu přístupná na buněčném povrchu, tento prostředek je upraven pro extracelulární aplikaci, a v případě, že řečené G1 proteiny jsou zcela intracelulární, prostředek je upraven pro intracelulární aplikaci.

(v) Způsob modulace účinku FAS-R ligandu nebo TNF na buňky nesoucí FAS-R nebo p55-R, zahrnující působení na řečené buňky oligonukleotidem kódujícím antisense sekvenci alespoň k části sekvence G1 proteinu podle vynálezu, přičemž řečená oligonukleotidová sekvence je schopná blokovat expresi G1 proteinu.

(vi) Způsob jako (ii) shora pro působení na nádorové buňky nebo HlV-infikované buňky nebo jiné nemocné buňky, zahrnující:

(a) konstrukci rekombinantního živočišného virového 30 vektoru, který obsahuje sekvenci kódující virový povrchový protein

- 2fr schopný vázat se na specifický receptor na povrchu nádorové buňky nebo na povrchový receptor HlV-infikované buňky nebo na receptor nesený jinými nemocnými buňkami, a sekvenci kódující protein vybraný z G1 proteinu, analogů, fragmentů a derivátů podle vynálezu, který při expresi v řečeném tumoru, HlV-infikované buňce nebo jiné nemocné buňce je schopen zabít řečenou buňku; a (b) infikování tumoru nebo HlV-infikované buňky nebo jiných nemocných buněk vektorem podle (a).

(vii) Způsob modulace účinku FAS-R ligandu nebo TNF na buňky, zahrnující použití ribozymu, při kterém je vektor kódující ribozymovou sekvenci, jež je schopná interagovat s buněčnou mRNA sekvencí kódující G1 protein podle vynálezu, zaveden do řečených buněk ve formě, jež umožňuje expresi ribozymové sekvence v buňkách, přičemž při expresi této ribozymové sekvence v buňkách dochází k interakci této sekvence s buněčnou mRNA sekvencí a k štěpení této mRNA sekvence, což vede k inhibici exprese G1 proteinu v buňkách.

(viii) Způsob vybraný ze způsobu podle vynálezu, kde kódující sekvence řečeného G1 proteinu obsahuje alespoň jednu z G1 isoforem a jejich analogů, fragmentů a derivátů podle vynálezu, jež jsou schopné přímo či nepřímo se vázat k MORT-1 nebo k MORT-1vazebným proteinům, jako například Mch4 a MACH, přičemž MORT-1 se zase váže specificky k FAS-IC (intracelulární doméně), anebo jež jsou schopné přímo či nepřímo se vázat k MORT-1 nebo shora uvedeným MORT-1-vazebným proteinům, přičemž MORT-1 se zase váže k TRADD a ten se zase váže k p55-IC.

(ix) Způsob izolace a identifikace proteinů podle vynálezu, jež jsou schopné vázat se přímo či nepřímo k MORT-1 proteinu nebo

3o k MORT-1-vazebným proteinům, zahrnující použití kvasinkového dvojhybridového postupu, při kterém jeden hybridní vektor nese μ

sekvenci kódující řečený MORT-1 protein nebo některý M0RT-1vazebný protein a druhý hybridní vektor nese sekvenci z cDNA nebo genomové DNA knihovny, přičemž těmito vektory se transformují kvasinkové hostitelské buňky, izolují se pozitivní transformované buňky, a následně se extrahuje řečený druhý hybridní vektor, aby se získala sekvence kódující protein, který se váže k řečenému MORT-1 proteinu nebo MORT-1-vazebným proteinům.

(x) Způsob podle kteréhokoli ze shora uvedených (i)-(ix), kde řečený G1 protein je kterákoli z isoforem G1, jejich analogů, fragmentů a derivátů.

(xi) Způsob podle kteréhokoli ze shora uvedených (i)-(x), kde G1 protein nebo kterákoli žjeho isoforem, analogů, fragmentů nebo derivátů se účastní modulace buněčného účinku zprostředkovaného nebo modulovaného kterýmkoli jiným cytotoxickým mediátorem nebo induktorem, ke kterému je řečený G1 protein, isoforma, analog, fragment nebo derivát schopen se přímo či nepřímo vázat.

(xii) Způsob systematického vyhledávání dalších látek jako jsou například peptidy,, organické sloučeniny, protilátky atd., za účelem získání specifických léčiv, jež jsou schopná inhibovat aktivitu G1, např.

inhibovat G1a proteasovou aktivitu a tím inhibovat buněčnou cytotoxicitu, nebo inhibovat G1(3 aktivitu a tím zesilovat buněčnou cytotoxicitu.

Provedení shora uvedeného způsobu vyhledávání podle (xii) zahrnují:

(1) Způsob vyhledávání ligandu schopného vazby k G1 proteinu podle vynálezu, jak shora uvedeno, zahrnující uvedení buněčného extraktu do kontaktu s afinitním chromatografickým nosičem, ke kterému je řečený protein připojen, čímž se ligand naváže k nosiči, a eluci, izolaci a analýzu ligandu.

Ň.· í;

í

- 2?·-·

i: (2) Způsob vyhledávání DNA sekvence kódující ligand schopný vázat se k G1 proteinu podle vynálezu, zahrnující použití kvasinkového dvojhybridového postupu, při kterém jeden hybridní vektor nese sekvenci kódující řečený protein a druhý hybridní vektor '5 nese sekvence z cDNA nebo genomové DNA knihovny, transformaci kvasinkových hostitelských buněk těmito vektory, izolaci pozitivně transformovaných buněk, a extrakci řečeného druhého hybridního vektoru, aby se získala sekvence kódující řečený ligand.

, io (3) Způsob identifikace a produkce ligandů schopného | modulovat buněčnou aktivitu, jež je modulována/zrostředkována proteinem MORT-1 nebo MORT-1 -vazebnými proteiny, zahrnující:

a) vyhledávání ligandů schopného vazby k polypeptidu obsahujícímu alespoň část MORT-1 nebo MORT-115 vazebných proteinů vybraných z MACH proteinů, Mch4 proteinů a dalších MORT-1-vazebných proteinů;

b) identifikaci a charakterizaci ligandů, jiného než MORT-1 nebo MORT-1-vazebné proteiny nebo části receptoru z rodiny TNF/NGF receptorů, o kterém bylo řečeným vyhledávacím postupem zjištěno, že je schopen vazby; a

c) produkci ligandů v podstatě izolované a purifikované formě.

« (4) Způsob identifikace a produkce ligandů schopného \ 25 modulovat buněčnou aktivitu, jež je modulována nebo zprostředkována

G1 proteinem podle vynálezu, zahrnující:

a) vyhledávání ligandů schopného vazby k polypeptidu obsahujícímu alespoň část G1a sekvence zobrazené j, v Obr.1, nebo alespoň část Gip sekvence zobrazené v Obr.2;

Ύ,

,«r

b) identifikaci a charakterizaci ligandu, jiného než MORT-1 nebo MORT-1-vazebné proteiny nebo části receptoru z rodiny TNF/NGF receptorů, o kterém bylo řečeným vyhledávacím postupem zjištěno, že je schopen řečené vazby; a

c) produkci ligandu v podstatě izolované a purifikované formě.

/' (5) Způsob identifikace a produkce ligandu schopného modulovat buněčnou aktivitu, jež je modulována/zprostředkována G1 proteinem, zahrnující:

a) vyhledávání ligandu schopného vazby k alespoň části Gla sekvence zobrazené vObr.1, nebo G1p sekvence zobrazené v Obr.2;

b) identifikaci a charakterizaci ligandu, jiného než 15 MORT-1 nebo MORT-T-vázebné proteiny nebo části receptoru z rodiny

TNF/NGF receptorů, o kterém bylo řečeným vyhledávacím postupem zjištěno, že je schopen řečené vazby; a

c) produkci řečeného ligandu v podstatě izolované a purifikované formě.

(6) Způsob identifikace a produkce molekuly schopné přímo či nepřímo modulovat buněčnou aktivitu, jež je modulována/zprostředkována G1, zahrnující:

a) vyhledávání molekuly schopné modulovat aktivity, 25 jež jsou modulovány/zprostředkovány G1;

b) identifikaci a charakterizaci této molekuly; a

c) produkci této molekuly v podstatě izolované a purifikované formě.

- 2&

(7) Způsob identifikace a produkce molekuly schopné přímo či nepřímo modulovat buněčnou aktivitu, jež je modulována/zprostředkována G1 proteinem podle vynálezu, zahrnující:

a) vyhledávání molekuly schopné modulovat aktivity', jež jsou modulovány/zprostředkovány G1 proteinem;

b) identifikaci a charakterizaci této molekuly; a

c) produkci této molekuly v podstatě izolované 10 a purifikované formě.

Předkládaný vynález též poskytuje farmaceutický prostředek na modulaci účinku FAS-R ligandu nebo TNF na buňky, nebo účinku jakéhokoli jiného cytotoxického mediátoru nebo induktoru na buňky, jak shora uvedeno, zahrnující jako aktivní složku kteroukoli z následujících:

(i) G1 protein podle vynálezu a jeho biologicky aktivní fragmenty, analogy, deriváty nebo jejich směsi;

(ii) rekombinantní živočišný virový vektor, kódující protein 20 schopný vázat se k receptoru na buněčném povrchu a kódující G1 protein nebo biologicky aktivní fragmenty nebo analogy podle vynálezu;

(iii) oligonukleotidová sekvence kódující antisense sekvenci G1 proteinu podle vynálezu, kde řečený oligonukleotid může být druhá sekvence rekombinantního vektoru shora uvedeného v (ii);

Předkládaný vynález rovněž poskytuje:

I. způsob modulace účinku na buňky indukovaného MORT-1 proteinem nebo MORT-1-vazebným proteinem nebo jakýmkoli jiným cytotoxickým mediátorem nebo induktorem, zahrnující působení G1 • · • tt

proteinů, jejich analogů, fragmentů nebo derivátů, nebo sekvencí kódujících G1 proteiny, jejich analogy nebo fragmenty na řečené buňky podle kteréhokoli ze způsobů (i)-(x) uvedených shora, přičemž řečené působení vede k zesílení nebo k inhibici účinku zprostředkovaného proteinem MORT-1, a tím také účinku zprostředkovaného FAS-R nebo p55-R, nebo jiným cytotoxickým mediátorem nebo induktorem.

II. způsob jak uvedeno shora, kde G1 protein, jeho analog, fragment nebo derivát, je tou částí G1 proteinu, jež se specificky účastní vazby k MORT-1 nebo k MORT-1-vazebným proteinům nebo k jinému cytotoxickému mediátoru nebo induktoru, nebo sekvence G1 proteinu kóduje tu část ,G1 proteinu, jež se specificky účastní vazby k MORT-1 nebo k MORT-1-vazebným proteinům nebo k jinému cytotoxickému mediátoru nebo induktoru.

III. způsob jako shora, kde G1 protein je kteroukoli z G1 isoforem, přičemž tyto isoformy jsou schopné zesilovat účinek na buňky spojený s MORT-1, nebo účinek na buňky spojený s· jiným cytotoxickým mediátorem nebo induktorem, a tím též zesilovat účinek na buňky spojený s FAS-R nebo p55-R, nebo účinek jiného

2o cytotoxického mediátoru či induktoru na buňky.

IV. způsob jako shora, kde G1 protein je kteroukoli z G1 isoforem, přičemž tyto isoformy jsou schopné inhibovat účinek na buňky spojený s MORT-1, nebo účinek na buňky spojený s jiným cytotoxickým mediátorem nebo induktorem, a tím též inhibovat účinek na buňky spojený s FAS-R nebo p55-R, nebo účinek jiného cytotoxického mediátoru či induktoru na buňky.

Jak plyne ze všeho shora uvedeného, jakož . i z podrobného popisu v dalším textu, na buňky a tkáně lze působit G1 proteinem též nezávisle na MORT-1. Izolace G1 proteinů, jejich identifikace a charakterizace mohou být provedeny jakoukoli standardní vyhledávací technikou, jež se používají k izolaci a identifikaci proteinů,

například kvasinkovým dvojhybridovým systémem, metodami afinitní chromatografie a kterýmkoli z dalších dobře známých standardních postupů používaných k těmto účelům.

Dále, některé G1 isoformy mohou mít pouze protease podobnou oblast (homologní se shora uvedenými proteasovými oblastmi jiných známých proteas), která však nemá faktickou proteasovou aktivitu, což má za následek, že takovéto isoformy mohou mít primárně inhibiční roli, jak je uvedeno shora.

Dále ještě, vzhledem ktomu, že G1 nebo kterékoli z jeho isoforem se mohou účastnit modulace MORT-1-nezávislých intracelulárních drah, G1 nebo kterékoli z jeho isoforem se mohou účastnit modulace přenosu signálu v kterékoli jiné intracelulární dráze nebo mechanizmu.

Předkládaný vynález rovněž poskytuje další hlediska a provedení, jak vyplývá z následujícího podrobného popisu vynálezu.

Je třeba podotknout, že v textu užívané termíny “Modulace účinku FAS-ligandu nebo TNF na buňky“ a “Modulace účinku MORT-1 nebo MORT-1-vazebného proteinu na buňky“ zahrnují in vitro stejně jako in vivo působení, a dále, že rovněž zahrnují inhibici nebo zesílení/zvýšení.

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález se z jednoho hlediska týká nových G1 proteinů, jež jsou schopné přímé nebo nepřímé vazby nebo interakce s MORT-1 nebo s MORT-1-vazebnými proteiny jako například Mch4 a MACH, a tudíž i vazby k intracelulární doméně FAS-R receptoru, k níž se MORT-1 váže, anebo vazby k intracelulární doméně p55 TNF-R, k níž se váže protein TRADD a k tomuto proteinu TRADD se váže protein MORT-1. G1 proteiny podle vynálezu tedy lze považovat za mediátory nebo modulátory FAS-R, jež hrají roli například v přenosu signálu iniciovaném vazbou FAS ligandu k receptoru FASf

- &2 -·· ** ··· ·’ ··

R a podobně v přenosu signálu iniciovaném vazbou TNF k receptoru p55-R. G1 proteiny podle vynálezu zahrnují nově objevený G1 a jeho isoformy.

Zejména je, v souladu s vynálezem, zveřejněn nový protein G1 (též nazývaný CASH), jenž je zřejmě homologem proteasy CED3 z hlísta. Tento nový G1 protein, i když blízce příbuzný, vykazuje určité odlišnosti ve struktuře a substrátové specifitě, a tak může mít v savčích buňkách poněkud odlišné funkce. Skutečně, jsou známy dvě různé aktivity těchto proteas. Hlavní úlohou ICE (zvané též CASP-1) se zdá být proteolytická úprava IL-Ιβ prekursoru, zatímco o CED3 bylo jasně prokázáno, že slouží jako efektor programované buněčné smrti. Zdá se, že tuto posledně jmenovanou funkci mají též alespoň některé ze savčích homologů, například některé MACH (zvané též CASP-8) isoformy podle shora uvedených spoluvlastněných společně podaných patentových přihlášek, jakož i shora zmíněný příbuzný Mch4 (zvaný též CASP-10), k němuž se G1 podle předkládaného vynálezu váže. Aminokyselinová sekvence MACHal vykazuje nejbližší podobnost k CPP32 (zvaným též CASP-3), což je nejbližší známý savčí homolog proteasy CED3. Substrátová specifita MACH je též podobná specifitě

CPP32 až nato, že MACHal se zdá mít substrátovou specifitu omezenější než CPP32. CPP32 přednostně štěpí peptidový substrát odpovídající štěpícímu místu v poly(ADP- ribosa)polymerase (PARP), má však též určitou proteolytickou aktivitu vůči peptidu odpovídajícímu ICE štěpícímu místu v prekursoru IL-Ιβ. Zdá se však, že MACHal je schopen štěpit výhradně sekvence odvozené z PARP. Tyto vztahy MACHal s CPP32 a CED3 a jeho odlišnosti od iCE jsou v souladu s představou, že MACHal, podobně jako CED3, slouží jako regulátor buněčné smrti. MACHal přesto vykazuje některé sekvenční rysy, které jej odlišují od CED3 a CPP32, jakož i od všech ostatních členů

CED3/ICE rodiny. C-koncová část MACHal, “nad“ (upstream) oblastí CED3/ICE homologie, nevykazuje vůbec žádnou podobnost

s takovouto upstream oblastí ostatních homologů. Oblast CED3/ICE homologie vykazuje též některé unikátní sekvenční rysy. Tyto odlišnosti naznačují, že MACHal patří k zvláštní evoluční větvi této rodiny, a že jeho účast v buněčné smrti se bude poněkud lišit od role dříve popsaných CED3/ICE homologů. Podobně, G1 protein podle vynálezu a jeho případné isoformy rovněž vykazují ve svých sekvencích některé zřetelné odlišnosti v oblasti CED3/ICE homologie a tyto rozdíly jako takové mohou představovat unikátní vlastnosti, odrážející specifitu G1 aktivity v savčích buňkách.

Jeden důležitý rozdíl se může týkat způsobu regulace funkce proteasy. Vzhledem k tomu, že se účastní buněčné smrti jak při vývoji, tak při receptorem-indukované imunitní cytolyse, musí být štěpení proteinů CED3/ICE proteasami regulovatelné signály pocházejícími jak z nitra buňky, tak z receptorů na buněčném povrchu. Při buněčné smrti v průběhu vývoje se zdá, že aktivace takovýchto proteas zahrnuje mechanismy ovlivňující genovou expresi, což vede k zvýšené syntéze proteas a též k poklesu syntézy proteinů jako je BCL-2, které působí proti apopticky. V případě cytotoxicity spuštěné FAS-R nebo TNF receptory je však situace rozhodně jiná. Buňky mohou být

2o zabíjeny účinkem TNF nebo FAS-R ligandů dokonce i v situaci, kdy jejich proteosyntéza je plně blokována (ve skutečnosti jsou v takovém případě zabíjeny ještě účinněji) a za těchto podmínek zůstávají závislé na stimulu. Aktivace proteas CED3/ICE rodiny prostřednictvím TNF receptorů a FAS-R tak může nastávat mechanismem, který je nezávislý na proteosyntéze. Unikátní vlastnosti sekvence MACHal mohou MACHal umožňovat účast v takovémto mechanismu. Podobně, unikátní vlastnosti sekvence G1 proteinu podle vynálezu mohou rovněž udělovat proteinu G1 schopnost účasti v takovémto mechanismu.

Nový G1 protein tak může být dalším členem nedávno objevené skupiny proteas, zahrnujících shora zmíněný MACH (a jeho isoformy) tř _ -·· ·· »·· ** ·· a Mch4, o nichž bylo zjištěno, že asociují buď přímo nebo prostřednictvím adaptorového proteinu, s intracelulární doménou receptoru na buněčném povrchu. Na základě analogie s mechanismem působení proteinů, majících jiné enzymatické aktivity a asociujících do komplexu s receptory, se zdá přijatelná představa, že vazba G1 k Mch4 nebo G1 k MACH (nebo isoformě MACHal) a dále vazba Mch4 nebo MACH k MORT-1, nebo přímá vazba G1 k MORT-1 umožňuje stimulaci proteasové aktivity G1 a/nebo Mch4 a/nebo MACH jako důsledku stimulace FAS-R vazbou FAS ligandů. Aktivace w proteasy může být též umožněna prostřednictvím p55-R, vazbou

MORT-1 k TRADD, který se váže k p55-R.

U jiných členů CED3/ICE rodiny se zjistilo, že plnou aktivitu vykazují pouze po proteolytické úpravě, ke které dochází buď autoštěpením nebo účinkem jiných proteas této rodiny (přehledy v

Kumar, 1995, Trends Biochem. Sci. 20:198-202; Henkart, 1996, Immunity 4:195-201). Jak je například podrobněji rozebráno ve shora uvedených spoluvlastněných a společně podaných patentových přihláškách týkajících se proteinu MACH, je cytotoxický účinek způsobený současnou expresí (koexpresí) dvou hlavních potenciálních produktů autoštěpení MACHal, na rozdíl od nepřítomnosti cytotoxicity v buňkách exprimujících oblast CED3/ICE homologie v plné délce, ve shodě s možností, že taktéž MACHal získává plnou aktivitu až po své proteolytické úpravě. Enzymatická aktivita pozorovaná v lyzátech bakterií exprimujících plnou délku této oblasti je zřejmě projevem autoštěpení proteinu syntetizovaného za těchto podmínek, nebo proteolytického opracování nějakými bakteriálními proteasami. Jakým způsobem takováto úprava probíhá uvnitř savčí buňky a jak je vyvolávána aktivací receptorů FAS-R a p55-R není známo, ani není jasné jaký je relativní příspěvek proteasové aktivity MACHal k cytotoxicitě indukované prostřednictvím FAS-R a TNF. Zhodnocení tohoto příspěvku je komplikováno skutečností, že také exprese MACHpi, u nějž chybí oblast homologie CED3/ICE, vede k výrazné

5, ^r fe

«>

cytotoxicitě. Tato cytotoxicita je podle všeho projevem schopnosti ΜΑΟΗβΙ vázat se k MACHal. Transfekované molekuly MACH mohou díky této schopnosti vyvolat, po agregaci, konformační změnu v endogenních molekulách MACHal. Takovýto mechanismus by mohl dobře vysvětlit i cytotoxicitu pozorovanou při buněčné nadprodukci molekul, které stojí v signalizační kaskádě výše nad proteinem MACH (MORT-1, TRADD nebo domény smrti p55-R nebo FAS-R). V současnosti však nelze vyloučit, že cytotoxicita pozorovaná po indukované expresi MACH nebo molekul působících před MACH, je vedle proteolytické aktivity oblasti CED3/ICE homologie v MACH též projevem aktivace některého z jiných mechanismů, o nichž se předpokládá účast v cytotoxickém účinku FAS-R a p55-R (například aktivace neutrální nebo kyselé sfingomyelinasy). Nelze rovněž vyloučit, že proteolytické aktivita oblasti CED3/ICE homologie má i jiné funkce kromě indukování cytotoxicity. Jasnější představu o funkci MACHaí by mohla poskytnout identifikace endogenních proteinových substrátů, jež jsou štěpeny po aktivaci MACHal. Nalezení způsobů jak libovolně umlčet aktivitu MACHal, například expresí inhibujících molekul, přispěje k pochopení funkce tohoto proteinu a umožní regulovat jeho aktivitu podle potřeby.

G1 protein podle vynálezu a jeho možné isoformy se mohou chovat analogickým způsobem, zmíněným pro shora uvedené proteiny MACH, ať s přímou interakcí s jinými proteiny nebo bez ní; jmenovitě, G1 může působit přímo prostřednictvím vazby k MORT-1 nebo může působit nepřímo prostřednictvím vazby k Mch4 a/nebo MACH a pak vazbou Mch4 a/nebo MACH k MORT-1, nebo nějakým jiným, dosud neobjasněným mechanismem specifickým pro G1. Podobně, regulace G1 aktivity může být analogická jako u předpokládané regulace MACH proteinu, jak bylo diskutováno výše.

V buňkách exprimujícíeh G1 se mohou docela dobře vyskytovat přirozené inhibitory proteásy obsažené v tomto proteinu. U některých • · jiných členů CED3/ICE rodiny bylo prokázáno, že existence isoforem, produktů alternativního sestřihu, vytváří možnost fyziologického omezování funkce těchto proteas. Bylo popsáno, že některé ‘ z isoforem těchto jiných proteas působí jako přirozené inhibitory isoforem s plnou délkou, zřejmě tak, že s nimi vytváří neaktivní heterodimery. Tak tomu může dost dobře být i v případě G1 a některých z jeho možných isoforem, například isoforem, kterým chybí N-koncové štěpící místo. Exprese takovýchto inhibujících isoforem může představovat mechanismus, kterým buňka chrání sama sebe před cytotoxicitou zprostředkovanou FAS-R a TNF.

G1 může mít ještě další funkce, například G1 nebo kterákoli z jeho isoforem může mít zesilující nebo zvyšující účinek na další proteiny s enzymatickou aktivitou, např. na proteolytickou aktivitu různých isoforem Mch4 a MACH,.přičemž tato zesilující nebo zvyšující aktivita G1 je výsledkem mechanismu, kdy G1 přivádí další proteiny do vazby k MORT-1 (např. proteiny Mch4 a MACH). Dále, G1 nebo kterákoli z jeho isoforem mohou též plnit funkce, jež nesouvisejí s cytotoxicitou, ale při kterých se spíše uplatňují jako vazebná platforma pro molekuly zapojené do jiných, nikoli cytotoxických účinků

FAS-R a TNF.

Některé specifické G1 isoformy podle vynálezu jsou uvedeny níže, v Příkladu 1. Jedna z nich, označená jako G1a (CASHa) byla izolovaná z člověka (hG1a/hCASHa) a myši (mG1a/mCASHa) a jde zřejmě o sestřihovou variantu, která obsahuje oblast proteasové ^b 25 homologie, a která má, alespoň v některých buňkách (např. 293 buňky), cytotoxickou aktivitu. Další z nich, označená jako Gip (CASHp) byla izolována z člověka a jde zřejmě o krátkou sestřihovou variantu bez oblasti proteasové homologie, která fakticky inhibuje signalizační dráhy pro buněčnou smrt.

3o V důsledku jedinečné schopnosti FAS-R a TNF receptorů způsobovat buněčnou smrt, jakož i schopnosti TNF receptorů spouštět

44 44 4 49 44

4 · 4 9 444 9 4 9 4

44 4 4 4 444 4

různé jiné aktivity poškozující tkáně, může být porušení funkce těchto receptorů pro organismus obzvláště škodlivé. Skutečně, jak nadměrná tak nedostatečná funkce těchto receptorů prokazatelně přispívá k patologickým projevům různých chorob. Odhalení molekul účastnících se na signalizační aktivitě těchto receptorů amalezení způsobů jak modulovat funkci takových molekul představuje potenciální návod pro nové terapeutické přístupy k těmto chorobám. Vzhledem k předpokládané důležité roli G1 ve FAS-R a TNF toxicitě by obzvláště důležité mohly být návrhy léčiv, jež by blokovaly io proteolytickou funkci této molekuly, jak již bylo popsáno u některých jiných členů CE4D3/ICE rodiny. Unikátní charakter sekvence CED3/ICE homologu obsaženého v molekulách G1 může umožnit vývoj léčiv, která zajistí ochranu buněk před nadměrnou eytotoxicitou, zprostředkovanou imunitním systémem, bez ovlivnění fyziologických procesů buněčné smrti, ve kterých jsou zapojeny jiní členové CED3/ICE rodiny.

Jak uvedeno shora, G1 nebo kterákoli z jeho isoforem se může rovněž účastnit modulace jiných intracelulárních signalizačních drah, jako například modulace jiných cytotoxických mediátorů nebo induktorů, nebo jiných proteinů nezávislých na MORT-1 nebo MORT-1vazebných proteinech. G1 nebo alespoň jeho isoformy, které mají protease-podobnou oblast bez vlastní proteásové aktivity, mohou mít primárně inhibiční funkci; jmenovitě, mohou inhibovat ty dráhy, např. signalizační dráhy obecně, nebo cytotoxické dráhy speciálně, ve kterých se G1 nebo jeho isoformy účastní buď přímou vazbou ke komponentám těchto drah, nebo nepřímo, vazbou k jiným proteinům, které se potom vážou ke komponentám těchto drah.

Vynález se rovněž týká DNA sekvence kódující G1 protein a G1 proteinů kódovaných DNA sekvencemi.

Kromě toho, vynález se dále týká DNA sekvencí kódujících biologicky aktivní analogy, fragmenty a deriváty G1 proteinu, φ φ • · φ φ φ φ • φφ · φ φφ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φ φφ φφ a analogů, fragmentů a derivátů takto kódovaných. Takovéto analogy, fragmenty a deriváty se připravují standardními postupy (viz například Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY); při nichž lze v DNA kódující G1 protein vynechat, přidat nebo nahradit jeden nebo více kodonů za vzniku analogů, které mají alespoň jednu aminokyselinovou změnu oproti nativnímu proteinu.

Polypeptid nebo protein “v podstatě odpovídající“ G1 proteinu zahrnuje nejenom G1 protein, ale též polypeptidy nebo proteiny, které jsou analogy G1.

Analogy, jež v podstatě odpovídají G1 proteinu, jsou takové polypeptidy, ve kterých byla jedna nebo více aminokyselin v aminokyselinové sekvenci G1 proteinu nahražena jinou aminokyselinou, vynechána a/nebo vsunuta, za předpokladu, že výsledný protein vykazuje ve srovnání s G1 proteinem, kterému odpovídá, v podstatě stejnou nebo vyšší biologickou aktivitu.

K tomu, aby v podstatě odpovídaly G1 proteinu, musí být změny v sekvenci G1 proteinů, jako jsou isoformy, obecně relativně malé.

I když počet změn může být vyšší než deset, je s výhodou, není-li více

2o než deset změn, výhodněji ne více než pět a nejvýhodněji ne více než tři takovéto změny. K získání potenciálně biologicky aktivních proteinů, které by v podstatě odpovídaly G1 proteinům, lze použít jakékoli techniky; jednou takovou technikou je konvenční mutageneze DNA, která kóduje protein, vedoucí k nemnoha modifikacím. Proteiny exprimované z takto mutagenizovaných klonů pak mohou být systematicky testovány co do schopnosti vazby k různým MORT-1 vazebným proteinům, jako například k Mch4 a MACH, nebo dokonce přímo k MORT-1, a/nebo schopnosti zprostředkovat FAS-R a p55-R aktivitu, a/nebo zprostředkovat aktivitu kterékoli jiné intracelulární dráhy způsobem uvedeným shora.

« “Konzervativní“ změny jsou takové změny, u kterých se neočekává změna aktivity proteinu a které jsou obvykle první identifikovány, neboť nelze očekávat, že by podstatně změnily velikost, náboj nebo konformaci proteinu a tedy jeho biologické vlastnosti.

Konzervativní substituce G1 proteinů zahrnují analog, kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek v polypeptidu je konzervativně nahražen jinou aminokyselinou. Takovéto substituce se výhodně provádějí podle následujícího seznamu, uvedeného v Tabulce IA, přičemž substituce mohou být určeny rutinním experimentováním tak, io aby se u syntetizované’polypeptidové molekuly získaly modifikované strukturní a funkční vlastnosti při zachování biologické aktivity charakteristické pro G1 protein.

	Tabulka IA
15	Původní zbvtek	Příklad substituce
	Ala	Gly;Ser
	Arg	Lys
	Asn	Gin; His
	Asp	Glu
20	Cys	Ser
	Gin	Asn
	Glu	Asp
	Gly	Aia;Pro
	His	Asn;Gln
25	lle	Leu;Val
	Leu	lle; Val
	Lys	Arg;Gln;Glu

• toto	toto to	«·
• to ·	to · ··	to · to
• toto	• · ·	• · ··
_··	·· ···	to·

Met	Leu;Tyr;lle
Phe	Met;Leu;Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp;Phe
Val	lle;Leu

Jinou skupinou substitucí v G1 proteinu jsou takové, kdy alespoň jeden aminokyselinový zbytek v polypeptidu je odstraněn a na jeho místo přijde jiný zbytek podle Tabulky IB. Typy substitucí, jež mohou být v polypeptidu provedeny, mohou vycházet z analýzy frekvencí aminokyselinových záměn mezi homologními proteiny z různých druhů, jak uvádí Tabulka 1-2 v Schulz et al., G.E. Principlés of Protein Structure, Springer-Verlag, NY, 1978, a Obr. 3-9 v Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman and Co., San Francisco, CA 1983. Alternativní konzervativní substituce jsou zde na základě takovéto analýzy definovány jako záměny v rámci jedné z pěti následujících skupin:

TABULKA IB

1. Malé alifatické, nepolární nebo mírně poiární zbytky: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);

2. Polární, záporně nabité zbytky a jejich amidy: Asp, Asn, Glu, Gin;

3. Polární, kladně nabité zbytky: His, Arg, Lys;

4. Velké alifatické nepolární zbytky: Met, Leu, lle, Val (Cys);

}·

- «Μ

£·

5. Velké aromatické zbytky; Phe, Tyr, Trp.

» · · 4 ·· ··

Tři aminokyselinové zbytky uvedené výše v závorkách hrají v proteinové architektuře zvláštní úlohu. Gly je jediný zbytek, který nemá žádný postranní řetězec a tak dodává polypeptidovému řetězci flexibilitu. Podporuje tím však tvorbu jiné sekundární struktury než α-helixu. Pro, vzhledem ke své neobvyklé geometrii, silně omezuje strukturu řetězce a má obecně tendenci podporovat tvorbu struktur podobných β-ohybu. V některých případech může Cys být schopen io účasti v tvorbě disulfidických vazeb, což je důležité pro svinutí proteinového řetězce. Podle Schulze et al., supra by Skupiny 1 a 2 ve shora uvedené tabulce splynuly do jedné. Je třeba si i uvědomit, že Tyr, vzhledem ke svému potenciálu tvořit vodíkové vazby, má mnoho společného se Ser a Thr, atd.

Konzervativní aminokyselinové substituce podle vynálezu, např.

jak jsou uvedené shora, jsou známé v oboru a lze očekávat, že po takové aminokyselinové záměně budou zachovány biologické a strukturní vlastnosti polypeptidu. Většina delecí a substitucí podle vynálezu jsou ty, které nevedou k zásadním změnám ve vlastnostech proteinové nebo polypeptidové molekuly. “Vlastnost“ je tu definována tak, aby zahrnula změny sekundární struktury, např. α-helix nebo βlist, i změny v biologické aktivitě, např. ve vazbě MORT-1-vazebných proteinů nebo MORT-1 nebo ve zprostředkování účinku FAS-R ligandu nebo TNF na buňky.

Příklady provádění aminokyselinových substitucí v proteinech, jež mohou být použity pro získání analogů G1 proteinů podle vynálezu, zahrnují všechny známé metodické kroky, jak jsou uvedeny v U.S. patentech RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585 a 4,737,462 autorů Mark et al.; 5,116,943 autorů Koths et al.; 4,965,195 autorů Namen et al.;

4,879,111 autorů Chong et al.; a 5,017,691 autorů Lee et al.; a U.S.

00

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

00 e 0

patent No. 4,904,584 (Shaw et al.) týkající se proteinů substituovaných lysinem.

Kromě shora diskutovaných konzervativních substitucí, které by významně nezměnily aktivitu G1 proteinu, jsou v rozsahu vynálezu konzervativní substituce nebo méně konzervativní a náhodnější změny, které mají za následek vyšší biologickou aktivitu analogů G1 proteinů.

Osoba znalá oboru si bude vědoma, že pro potvrzení přesného účinku substituce nebo delece bude účinek substituce (substitucí), io delece (delecí), atd. vyhodnocován rutinními testy na vazbu a buněčnou smrt. Testování pomocí takovéhoto stadardního testu nepředstavuje nepřiměřené experimentování.

Přijatelné analogy jsou takové analogy, u kterých je zachována alespoň schopnost vazby k MORT-1-vazebným proteinům jak uvedeno shora, nebo vazby k MORT-1 nebo jiným proteinům, a tím, jak uvedeno shora, zprostředkování aktivity FAS-R a p55-R nebo jiných proteinů jak uvedeno shora. Takto mohou být připraveny analogy, které mají tak zvaný dominantně negativní účinek, jmenovitě, analog, který je defektní buď ve vazbě k MORT-1-vazebným proteinům (např.

Mch4 nebo MACH) nebo ve vazbě k MORT-1 nebo jiným proteinům, nebo v následné signalizační nebo proteasové aktivitě po takovéto vazbě. Takovéto analogy mohou být použity například k inhibici účinku FAS-ligandu nebo účinku jiných proteinů tím, že kompetují s přirozenými MORT-1-vazebnými proteiny nebo s jinými proteiny. Zdá se například pravděpodobné, že isoformy proteinu MACH, MACHa2 a MACHa3, jsou „přirozené“ analogy sloužící k inhibici MACH aktivity prostřednictvím kompetice s vazbou (proteasové) aktivních isoforem proteinu MACH k MORT-1, což se zdá být nezbytné pro aktivaci těchto MACH isoforem. Jakmile se aktivní isoformy MACH nemohou vázat k

MORT-1, budou též inhibovány intracelulární signalizační dráhy zprostředkované receptory FAS-R a p55-R. Podobně mohou i G1 nebo ·· i ······ ·· i ··· ·········

I ··········

I ·····©©·«©«·

I ·· ·· · ····

I - ¢3 -·· ·· ··· »· ··

I kterékoli z jeho isoforem působit jako inhibitory účinku FAS-ligandu prostřednictvím kompetice s různými MORT-1-vazebnými proteiny o vazbu k MORT-1, nebo tak, že s těmito proteiny interagují * způsobem, jenž brání jejich vazbě k MORT-1. Podobně mohou být připraveny tzv. dominantně pozitivní G1 analogy, které by působily

I ’ zesílení účinku FAS ligandu nebo TNF. Takovéto analogy by měly stejnou nebo lepši schopnost vázat se k MORT-1-vazebným proteinům nebo dokonce stejné nebo lepší MORT-1-vazebné vlastnosti a stejné nebo lepší signalizační vlastnosti než přirozené G1 proteiny.

Na genetické úrovni se tyto analogy obecně připravují místně

L cílenou mutagenezou nukleotidů v DNA, jež kóduje G1 protein, za vzniku DNA kódující analog a dále expresí v buněčné kultuře se získá rekombinantní polypeptid. Analogy zpravidla vykazují stejnou nebo zvýšenou kvalitativní biologickou aktivitu jako přirozeně se vyskytující protein, Ausubel et al., 1987-1995, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, lne. and Wiley & Sons, lne., New York, NY; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Příprava G1 proteinu jak je zde uvedený nebo alternativní nukleotidové sekvence, jež kóduje stejný polypeptid, ale liší se od přirozené sekvence využitím degenerace genetického kódu, může být dosaženo místně specifickou mutagenezou DNA kódující již dříve připravený analog nebo nativní G1 protein. Při místně specifické ‘‘ 25 mutageneze se použijí oligonukleotidy o specifické sekvenci, jež kódují

DNA sekvenci požadované mutace a zároveň obsahují dostatečný počet sousedících nukleotidů tak, aby poskytly sekvenci primerů o postačující velikosti a sekvenční komplexitě pro vytvoření stabilních duplexů na obou stranách zamýšlené delece. Zpravidla se s výhodou ; 30 používá primer o délce 20 až 25 nukleotidů, s 5 až 10 komplementárními nukleotidy na obou stranách kolem sekvence, jež í má být změněna. Technika místně specifické mutageneze je obecně i*

4« · ·· ·· fe fe?

dobře známá v oboru, jak ilustrují publikace jako Adelman et al., 1983, DNA 2:183), jejíž zveřejnění je zde zahrnuto odkazem.

Jak je známo, technika místně specifické mutageneze zpravidla využívá fágového vektoru, který může existovat v jednořetězcové i dvouřetězcové formě. Týpické vektory užitečné pro místně cílenou mutagenezu zahrnují vektory jako je například fág M13, jak uvádí Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor A.Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), jehož zveřejnění je zde zahrnuto odkazem. Tyto fágy jsou komerčně io běžně dostupné a jejich použití je obecně dobře známé osobám zběhlým v oboru. Jinou možností, jak získat jednořetězcovou DNA, jsou plasmidové vektory obsahující místo pro počátek replikace jednořetězcového fága (Veira et al., Meth. Enzymoí. 153:3, 1987).

Při místně cílené mutageneze se obecně nejprve získá jednořetězcový vektor, který obsahuje DNA sekvenci kódující relevantní polypeptid. Oligonukleotidový primer nesoucí požadovanou mutovanou sekvenci se připraví synteticky na automatizovaném DNA/oligonukleotidovém syntetizéru. Tento primer je pak přihybridizován k jednořetězcovému vektoru a působením DNA polymerujících enzymů jako je Klenowův fragment DNA polymerasy I z E.coli se dokončí syntéza řetězce, jenž nese mutaci. Mutovaná sekvence a druhý řetězec tedy nesou požadovanou mutaci. Vektor ve formě heteroduplexu se pak použije k transformaci vhodných buněk, jako jsou buňky E.coli JM101 a selektují se klony, které obsahují rekombinantní vektory nesoucí mutovanou sekvenci.

Po selekci takovéhoto klonu může být sekvence mutovaného G1 proteinu vyjmuta a vložena do vhodného vektoru, obecně vektoru pro expresi nebo transfer, použitelného pro transfekci vhodného hostitele.

Gen nebo nukleová kyselina kódující G1 protein mohou také být 30 detegovány, získány a/nebo modifikovány, in vitro, in šitu a/nebo in vivo, pomocí známých technik pro amplifikaci DNA nebo RNA, jako je

- Φ5 ·· » « ·· ΐ*

PCR a chemická syntéza oligonukleotidů. PCR umožňuje amplifikací (zvýšení počtu) specifické sekvence DNA opakovanými DNA polymerizačními reakcemi. PCR reakce může být použito místo klonování; je nutné pouze znát sekvenci nukleové kyseliny.

K provedení PCR reakce se navrhují příměry, které' jsou komplementární k dané sekvenci, jež má být amplifikována. Primery jsou pak získány automatizovanou syntézou DNA. Primery mohou být navrženy tak, aby hybridizovaly k libovolné části genu a lze použít podmínky, za kterých může být tolerováno chybné párování.

Amplifikace úseku s chybným párováním může vést k syntéze mutovaného produktu, což v důsledku povede k vytvoření peptidů s novými vlastnostmi (tj. k místně cílené mutageneze). Viz rovněž např. Ausubei, supra, Kap. 16. PCR lze též spřáhnout se syntézou komplemetární DNA (cDNA), jež se získá z RNA pomocí reversní transkripce. RNA tak např. byla použita jako výchozí materiál pro syntézu extracelulární domény prolaktinového receptoru, aniž bylo třeba klonování.

PCR primery mohou být dále navrženy tak, aby zahrnovaly nová restrikční místa nebo jiné prvky, jako terminační kodony, na koncích genových segmentů, jež se mají amplifikovat. Takovéto umístění restrikčních míst na 5' a 3' koncích amplifikované genové sekvence dovoluje, aby genové segmenty kódující G1 protein nebo jeho fragment byly konstruovány na míru pro ligaci k jiným sekvencím a/nebo do klonovacích míst ve vektorech.

PCR a další metody amplifikace RNA a/nebo DNA jsou dobře známé v oboru a mohou být použity podle vynálezu bez nepřiměřeného experimentování, na základě poznatků a instrukcí zde prezentovaných. Známé metody amplifikace DNA nebo RNA zahrnují, ale bez omezení, polymerasovou řetězovou reakci (PCR) a příbuzné amplifikační postupy (viz např. U.S. patenty No. 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188 autorů Mullis et al.; 4,795,699 a 4,921,794 autorů Tábor et al.; 5,142,033, autorem Innis; 5,122,464 autorů Wilson • ·· *9 9 ·· 99

9999 9# 99 9*99 ·*· ··· 9···

9» 999 0 0 00 09 0 • · · · 9 · · · · · . ¢0 ... .· .......

et al.; 5,091,310, autorem Innis; 5,066,584 autorů Gyllensten et al.; 4,889,818 autorů Gelfand et al.; 4,994,370 autorů Silver et al.; 4,766,067, autorem Biswas; 4,656,134, autorem Ringold; a Innis et al., eds. PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) a amplifikaci zprostředkovanou RNA, pří níž se používá antisense-RNA k cílové sekvenci jako templátu pro syntézu dvojřetězcové DNA (U.S. patent No. 5,130,238 autorů Málek et al., s obchodním názvem NASBA); imuno-PCR, která kombinuje amplifikaci DNA se značením protilátkou (Ruzicka et al., Science 260:487 (1993); Sáno et al., Science 258:120 io (1992); Sáno et al., Biotechniques 9:1378 (1991)), přičemž celý obsah těchto patentů a citovaných prací jsou zde v úplnosti zahrnuty odkazem.

Biologicky aktivní fragmenty G1 proteinů (např. fragmenty kteréhokoli z G1 proteinů nebo jeho isoforem) mohou být připraveny analogickým způsobem jak je shora uvedeno pro analogy G1 proteinů. Vhodné fragmenty G1 proteinů jsou takové, které si zachovávají schopnosti G1 a které mohou zprostředkovávat biologickou aktivitu FAS-R a p55-R nebo jiných proteinů jak je uvedeno shora. Mohou tedy být připraveny fragmenty proteinu G1, které mají dominantně negativní nebo dominantně pozitivní účinek jak je shora uvedeno v případě analogů. Je třeba poznamenat, že tyto fragmenty představují zvláštní třídu analogů podle vynálezu, jmenovitě jde o definované části G1 proteinů odvozených z úplné sekvence G1 proteinu (např. z kterékoli sekvence G1 nebo jeho isoforem), přičemž každá taková část nebo fragment má kteroukoli ze shora uvedených požadovaných aktivit. Takovýto fragment může být např. peptid.

Podobně, jak je dobře známo v oboru, mohou být deriváty připraveny standardními modifikacemi postranních skupin jednoho nebo více aminokyselinových zbytků G1 proteinu, jeho analogů nebo

3o fragmentů, nebo konjugací G1 proteinu, jeho analogů nebo fragmentů s jinou molekulou, např. protilátkou, enzymem, receptorem atd. Termín “deriváty“ jak se zde užívá tedy zahrnuje deriváty, které mohou být

v	··	««		•	··
•	• ·	•	•	··	•	•	•
•	··	•	9	•	•	•	•
%	• ·	•	•	•	•	•	•
v	.··	··		···	··

připraveny s využitím funkčních skupin vyskytujících se na postranních řetězcích aminokyselinových zbytků nebo na N- nebo Ckoncových skupinách při uplatnění postupů známých v oboru; deriváty jsou součástí vynálezu. Deriváty mohou mít chemické složky, jako jsou cukerné nebo fosfátové zbytky, za předpokladu že takováto frakce má stejnou nebo vyšší biologickou aktivitu než G1 proteiny.

Deriváty mohou například zahrnovat , alifatické estery karboxylových skupin, amidy karboxylových skupin vzniklé reakcí s amoniakem nebo s primárními nebo sekundárními aminy, N-acyl deriváty volných aminoskupin aminokyselinových zbytků vytvořené s acylovými zbytky (např. alkanoylovými nebo karbocyklickými aroylovými skupinami) nebo O-acyl deriváty volné hydroxylové skupiny (např. serinových nebo threoninových zbytků) vytvořené s acylovými zbytky.

Termín “deriváty“ je míněn tak, že zahrnuje pouze takové deriváty, které nemění jednu aminokyselinu za jinou z dvaceti běžně se vyskytujících přirozených aminokyselin.

G1 protein je protein nebo polypeptid, je však také sekvencí aminokyselinových zbytků. Polypeptid sestávající z delší sekvence,

2o která v sobě zahrnuje úplnou sekvenci G1 proteinu v souladu s definicemi zde uvedenými, bude zahrnut do rozsahu takovéhoto polypetidu, pokud přidané sekvence neovlivní základní a nové vlastnosti vynálezu, tj., buď zachovávají nebo zvyšují biologickou aktivitu G1 proteinu nebo mohou být štěpeny za vzniku proteinu nebo polypeptidu, jenž má biologickou aktivitu G1 proteinu. Vynález tak například zahrnuje fúzované proteiny sestávající z G1 proteinu fúzovaného s jinými aminokyselinami nebo peptidy.

Nový G1 protein, jeho analogy, fragmenty a deriváty mají řadu možných použití, například:

(i) G1 protein, jeho analogy, fragmenty a deriváty mohou být použity k napodobení nebo zesílení funkce MORT-1-vazebných « ·

ř.

ř proteinů jako jsou například Mch4 a MACH (včetně jejich různých isoforem) , nebo dokonce samotného MORT-1, a tím i FAS-R ligandů nebo TNF, nebo jiných proteinů, v situacích kdy je žádoucí zvýšený účinek FAS-R ligandů nebo TNF nebo jiných proteinů, jako je tomu při protinádorových, protizánětlivých, anti-HIV aplikacích-atd, při kterých je žádoucí cytotoxicita indukovaná FAS-R ligandem nebo TNF nebo jiným proteinem. G1 protein, jeho analogy, fragmenty nebo deriváty, které zesilují účinek FAS-R ligandů nebo TNF nebo jiného proteinu, tj., cytotoxický účinek, mohou být v takových případech vneseny do buněk standardními postupy, známými per se. Pokud má například být G1 protein, o kterém se předpokládá, že je lokalizován zcela intracelulárně, vnesen do buněk, ve kterých je požadován účinek FAS-R ligandů nebo TNF nebo jiného proteinu, je zapotřebí systém pro specifické vnesení tohoto proteinu do buněk. Jeden způsob je vytvoření rekombinantního živočišného viru, např. viru odvozeného z vaccinie , do jejíž DNA se vnesou dva geny: gen kódující ligand, jenž se váže k proteinům specificky exprimovaným na povrchu buněk, např. HIV protein gp120, který se specificky váže k některým buňkám (CD4 lymfocytům a příbuzným leukémiím), nebo kterýkoli jiný ligand, který se specificky váže k buňkám nesoucím na povrchu FAS-R nebo p55-R tak, aby rekombinantní virus byl schopen vázat se na takovéto FAS-R nebo p55-R nesoucí buňky; druhý gen pak kóduje G1 protein. Exprese proteinu schopného vázat se k buněčnému povrchu tak nasměruje virus specificky k nádorové buňce nebo jiné buňce nesoucí

FAS-R nebo p55-R, a sekvence kódující G1 protein (např. G1a sekvence) tak bude vnesena virem do buňky a její exprese v buňce povede k zesílení účinku FAS-R ligandů nebo TNF a následné smrti nádorové buňky nebo jiných buněk nesoucích FAS-R nebo p55-R, jejichž zabití je žádoucí. Ke konstrukci takových rekombinantních živičišných virů lze použít standardní postupy (viz například Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Jinou možností je ř

f %

i &

'n

,*· zavést sekvence G1 proteinu (např. kteroukoli z G1 nebo jeho isoforem) ve formě oligonukleotidů, jež mohou být absorbovány buňkami a posléze v nich exprimovány.

Další způsob jak zesílit takovouto buněčnou cytotoxicitu spočívá v inhibici aktivity G1 isoforem (např. Gip), které samy působí inhibičně na buněčnou cytotoxicitu. Způsobů jak inhibovat takovéto G1 isoformy je řada a zahrnují způsoby uvedené níže v (ii), kde se pojednává o inhibici takovýchto inhibujících G1 isoforem, jako například Gip.

(ii) Mohou být použity k inhibici účinku FAS-R ligandu nebo TNF nebo jiného proteinu, např. v případech jako je poškození tkáně při septickém šoku, reakce štěpu proti hostiteli, nebo akutní hepatitida, kdy je žádoucí blokovat intracelulární signalizaci indukovanou FAS-R ligandem nebo TNF prostřednictvím receptorů FAS-R nebo p55-R, nebo signalizaci zprostředkovanou jiným proteinem. V této situaci je například možné do buněk vnést pomocí standardních postupů antisense oligonukleotidy proti kódující sekvenci G1 proteinu, jež by účinně blokovaly translaci mRNA kódující G1 protein a tím blokovaly jeho expresi a tak inhibovaly účinky FAS-R ligandů nebo TNF nebó jiného proteinu. Takovéto oligonukleotidy mohou být vneseny do buněk pomocí shora uvedeného postupu s použitím rekombinantního viru, kde oligonukleotid je druhou sekvencí nesenou virem.

Dále, jak řečeno shora a doloženo příkladem níže, byla izolována alespoň jedna G1 isoforma, která je 'přirozeným inhibitorem' buněčné cytotoxicity, jmenovitě Gip. Do buněk může být takováto G1 isoforma dodána přímo nebo do buněk může být zaveden vhodný vektor nesoucí nukleotidovou sekvenci kódující tuto isoformu tak, aby při expresi v buňkách tato G1 isoforma inhibovala buněčnou cytotoxicitu.

Jinou možností je použití protilátek specifických pro G1 protein na inhibici jeho intracelulární signalizační aktivity.

f, Ještě jiným způsobem jak inhibovat účinek FAS-R ligandu nebo

TNF je v poslední době vyvinutá metoda, využívající ribozymů. Ribozymy jsou RNA s katalytickou aktivitou, které specificky štěpí RNA molekuly. Ribozymy mohou být konstruovány tak, aby štěpily zvolené cílové RNA molekuly, např. mRNA kódující G1 protein podle vynálezu. Takovéto ribozymy by měly sekvenci specifickou pro mRNA G1 proteinu a byly by schopné s ní interagovat (komplementárním párováním) a následně tuto mRNA štěpit, což by vedlo k poklesu (nebo úplné ztrátě) exprese G1 proteinu, přičemž míra této snížené exprese by závisela na hladině exprese ribozymů v cílové buňce. K zavedení ribozymů do zvolené buňky (např. buňky nesoucí FAS-R nebo p55-R) lze použít jakýkoli vhodný vektor, např. plasmidy, vektory odvozené z živočišných virů (retrovirů), jež jsou obvykle používány pro tento účel (viz také (i) shora, kde virus má jako druhou sekvenci cDNA, kódující sekvenci ribozymů). (Pro přehledy, metody atd. týkající se ribozymů viz. Chen et al., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:271-273; Zhao a Piek, 1993, Nátuře 365:448-51; Shore et al., 1993, Oncogene 8:3183-8; Joseph a Burke, 1993, J. Biol. Chem. 268:24515-8; Shimayama et al., 1993, Nucleic Acids Symp. Ser. 29:177-8; Cantor et al., 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:10932-10936; Barinaga, 1993, Science 262:1512-1514; Crisell et al., 1993, Nucleic Acids Res. (England) 21:5251-5255; Koizumi et al., 1993, Biol. Pharm. Bull (Japan) 16:879-883).

(iii) G1 protein, jeho analogy, fragmenty nebo deriváty mohou též být použity k izolaci, identifikaci a klonování dalších proteinů stejné třídy, tj. proteinů vázajících se k intracelulární doméně FAS-R nebo funkčně příbuzných receptorů, nebo proteinů vázajících se k shora uvedeným MORT-1-vazebným proteinům, nebo proteinů vázajících se k MORT-1 a tím i k funkčně příbuzným

3o receptorům jako FAS-R a p55-R, a tedy proteinů účastnících se , intracelulárního přenosu signálu. V této přihlášce může být použit ί shora uvedený kvasinkový dvojhybridový systém, nebo může být f

I &

I

I

* použit v poslední době vyvinutý systém, který spočívá na nestringentní

Southernově hybridizaci a následném PCR klonování (Wilks et al., 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:1603-1607). V této publikaci ’ Wilks et al. popisují identifikaci a klonování dvou předpokládaných protein-tyrosinových kinas s uplatněním nestringentní Southernovy hybridizace s následným klonováním pomocí PCR, které vycházejí ze známé sekvence kinasového motivu. Tento přístup lze použít, v souladu s vynálezem, s použitím sekvence G1 proteinu k identifikaci a klonování příbuzných MORT-1-vazebných proteinů.

io (iv) Ještě další přístup k využití G1 proteinu nebo jeho analogů, fragmentů nebo derivátů podle vynálezu, je jejich použití v afinitní chromatografií pro izolaci a identifikaci dalších proteinů nebo faktorů, ke kterým jsou schopné se vázat, např. MORT-1, MORT-1vazebných proteinů, nebo jiných proteinů nebo faktorů účastnících se intracelulárního přenosu signálu. V této přihlášce mohou být G1 protein, jeho analogy, fragmenty nebo deriváty podle vynálezu, jednotlivě připojeny k afinitnímu chromatografickému nosiči a poté přivedeny do kontaktu s buněčnými extrakty nebo izolovanými proteiny či faktory, o nichž se předpokládá, že se účastní intracelulárního přenosu signálu. Po afinitní chromatografií lze proteiny nebo faktory, které se vážou k G1 proteinu, nebo jeho analogům, fragmentům nebo derivátům podle vynálezu eluovat, izolovat a charakterizovat.

(v) Jak uvedeno shora, G1 protein, nebo jeho analogy, fragmenty nebo deriváty podle vynálezu, mohou být též použity jako > 25 imunogeny (antigeny) za účelem získání specifických protilátek. Tyto protilátky mohou být rovněž použity při purifikaci G1 proteinu (např. G1 nebo kterékoli z jeho isoforem) buď z buněčných extraktů nebo z transformovaných buněčných linií produkujících G1 protein nebo jeho analogy nebo fragmenty. Dále mohou být tyto protilátky použity > 30 pro diagnostické účely při identifikaci poruch souvisejících

Γ, [ s nenormální funkcí systému FAS-R ligandů nebo TNF, např. při nadměrných nebo nedostatečných buněčných účincích indukovaných

FAS-R ligandem nebo TNF. Pokud by takovéto poruchy souvisely se špatnou funkcí MORT-1 proteinu nebo různých jiných shora uvedených MORT-1-vazebných proteinů nebo samotného G1 proteinu v systému intracelulárního přenosu signálu, sloužily by takovéto protilátky jako důležitý diagnostický nástroj.

Je třeba též podotknout, že izolaci, identifikaci a charakterizaci G1 proteinu podle vynálezu lze provést s použitím kteréhokoli z dobře známých standardních vyhledávacích postupů. Například jeden z těchto postupů, kvasinkový dvojhybridový systém, jak je zde vyloženo níže, byl použit k identifikaci MORT-1 proteinu a posléze různých MORT-1-vazebných proteinů a G1 proteinu podle vynálezu. Podobně, jak je uvedeno shora a níže, mohou být k izolaci, identifikaci a charakterizaci G1 proteinu podle vynálezu, nebo k izolaci, identifikaci a charakterizaci dalších proteinů, faktorů, receptorů atd, jež jsou schopné vázat se k G1 proteinům podle vynálezu, uplatněny další postupy dobře známé v oboru, jako afinitní chromatografie, DNA hybridizace atd.

Jak je zde shora vyloženo, G1 protein může být použit k vytvoření protilátek specifických pro G1 proteiny, např. G1 a jeho isoformy. Detailní použití těchto protilátek nebo jejich fragmentů je zde vyloženo níže, přičemž se rozumí, že protilátky nebo fragmenty protilátek v těchto aplikacích jsou specifické pro G1 proteiny.

Na základě zjištění, v souladu s vynálezem, že alespoň některé z G1 nebo jeho možných isoforem jsou proteasy příbuzné 25 s proteasami CED3/ICE rodiny, lze pro tyto G1 proteiny a isoformy uvažovat následující specifické aplikace v medicině: u jiných CED3/ICE proteas již bylo zjištěno, že pro ně existují specifické inhibitory, z nichž některé pronikají do buněk, kde mohou účinně blokovat programovanou buněčnou smrt. Je tedy možné, v souladu 30 s vynálezem, navrhnout inhibitory, které budou bránit buněčné smrti _ř indukované FAS-R ligandem nebo TNF tam, kde jsou v signalizačních β © ©

-•5S drahách zapojeny isoformy G1 proteas. Dále se zdá možné, s ohledem na přítomnost unikátních sekvencí v těchto nových G1 proteasách, navrhnout inhibitory, jež budou vysoce specifické vůči účinkům indukovaným TNF nebo FAS-R ligandem. Zjištění vynálezu rovněž poskytují možnost studovat mechanismus, kterým nastává aktivace “smrtící proteásy“ v odpovědi na FAS-R ligand a TNF, což by umožnilo následný vývoj léčiv, jež mohou regulovat rozsah této aktivace. Takováto léčiva by byla velmi užitečná pro řadu onemocnění. Mimo jiné přichází do úvahy akutní hepatitida, při které je akutní poškození jater zřejmě projevem smrti jaterních buněk zprostředkované FAS-R ligandem; autoimunitně indukovaná buněčná smrt, jako smrt β Langerhansových buněk pankreatu, jež vede k cukrovce; smrt buněk při odmítnutí štěpu (např. ledviny, srdce a jater); smrt oligodendrocytů v mozku při roztroušené sklerose; inhibice sebevraždy buněk T (při

15—AIDS), což umožňuje proliferaci AIDSviru a tudíž choroby AIDS. ~~~

Jak je zde shora uvedeno, je možné, že G1 nebo jedna nebo více z jeho možných isoforem (např. G1$, isoforma) mohou sloužit jako “přirozené“ inhibitory G1 proteásy nebo G1 proteasových isoforem, a že mohou tedy být použity jako shora uvedené specifické inhibitory těchto G1 proteas. Podobně mohou být systematicky testovány další látky jako peptidy, organické sloučeniny, protilátky atd., aby se získala specifická léčiva, schopná inhibovat G1 proteásy.

Neomezující příklad návrhu a systematického vyhledávání peptidových inhibitorů G1 proteas vychází z předcházejících studií o peptidových inhibitorech ICE nebo ICE-podobných proteas, substrátové specifitě ICE a strategii epitopové analýzy s využitím peptidové syntézy. Pro účinné štěpení peptidů proteasou ICE byly jako minimální požadavky zjištěny: přítomnost čtyř aminokyselin nalevo od štěpené vazby se silnou preferencí pro kyselinu

3o asparagovou v Pí místě, přičémž napravo od Pí místa postačuje přítomnost methylaminu (Sleath et al., 1990, J. Biol. Chem.

• ·

265:14526-14528; Howard et al., 1991, J. Immunol. 147:2964-2969; Thornberry et al., 1992, Nátuře 356:768-774). Dále, fluorogenní substrát (tetrapeptid) acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-methyl-kumaryl-7amid), zkráceně Ac-DEVD-AMC, odpovídající sekvenci v poly(ADP5 ribosajpolymerase (PARP), o které bylo zjištěno, že je v buňkách štěpena krátce po stimulaci receptoru FAS-R, jakož i při jiných apoptických procesech (Kaufmann, 1989, Cancer Res. 49:5870-5878; Kaufmann et al., 1993, Cancer Res. 53:3976-3985; Lazebník et al., 1994, Nátuře 371:346-347) je účinně štěpen CPP32 (člen CED3/ICE to rodiny proteas) a MACH proteasami (a podobně také možná G1 proteasami).

Jelikož se zdá, že přítomnost Asp v Pí pozici substrátu je důležitá, mohou být tetrapeptidy mající jako čtvrtý aminokyselinový zbytek Asp a v prvních třech pozicích různé kombinace aminokyselin, “15“ rychTe“testovany na vazbu Kákťivnímu místu Gl^proteas s použitím, například, metody vyvinuté Geysenem (Geysen, 1985, Immunol.

• Today 6:364-369; Geysen et al., 1987, J. Immunol. Meth. 102:259274), pomocí které se velký počet peptidů na pevném nosiči testoval na specifické interakce s protilátkami. Vazba MACH proteas kě specifickým peptidům může být detegována pomocí různých detekčních metod, jako je radioaktivní značení G1 proteas atd., které jsou dobře známé osobám zběhlým v oboru. Metodou podle Geysena bylo možné otestovat nejméně 4000 peptidů za pracovní den.

Vzhledem k tomu, že by byly výhodné peptidové inhibitory, jež by selektivně inhibovaly G1 proteasy, aniž by zasahovaly do fyziologických procesů buněčné smrti, ve kterých vystupují jiní členové CED3/ICE rodiny proteas, lze soubor peptidů, vázajících se k G1 proteasam ve vazebném testu jak bylo shora popsáno, syntetizovat ve formě fluorogenního peptidového substrátu pro

3o vyzkoušení, zda podléhají selektivnímu štěpení G1 proteasami, aniž by přitom docházelo k jejich štěpení jinými CED3/ICE proteasami. Peptidy, u kterých se prokáže, že jsou selektivně štěpeny G1

ί:..,

F

F k’

F*:

proteasami pak mohou být modifikovány, aby se zvýšila prostupnost do buňky a byla inhibována, reversibilně nebo ireversibilně, apoptická aktivita G1. Thornberry et al. 1994, Biochemistry 33:3934-3940, popsali, že tetrapeptid (acyloxy)methylketon Ac-Tyr-Val-Ala-Asp5 CH2OC(O)-[2,6-(CF₃)₂]Ph je účinným inaktivátorem ICE. Podobně,

Milligan et al. 1995, Neuron 15:385-393, popsali tetrapeptidové inhibitory ICE, přičemž pokud tetrapeptidy obsahovaly skupinu chlormethylketonovou, šlo o inhibici ireversibiliní, kdežto se skupinou aldehydovou docházelo k inhibici reversibilní. Benzyloxykarboxyl-Aspio CH₂OC(O)-2,6-dichlorbenzen (DCB) rovněž inhiboval ICE (Mashima et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 209:907-915). Tetrapeptidy selektivně se vážící k G1 proteasam mohou tedy být modifikovány např. aldehydovou skupinou, chiormeíhyiketonem, (acyloxy)methylketonem nebo CH₂OC(O)-DCB skupinou za vzniku _15_, p_e_p_tido_v_ěho_inhibi.tQr_uJ3J_p.r_o.teaso-vé-_aktiv-ity-____—-__:_

Zatímco některé specifické inhibitory jiných CED3/ICE proteas procházejí snadno do buněk, může být nutné zvýšit buněčnou prostupnost peptidových inhibitorů. Chemickou modifikací nebo derivatizací peptidů může být například zvýšena jejich prostupnost .. . .

přes buněčnou membránu a usnadněn transport takovýchto peptidů přes membránu do cytoplasmy. Muranishi et al. 1991, Pharm.

Research 8:649, popsali derivatizací thyrotropin uvolňujícího hormonu kyselinou laurylovou, čímž vznikl lipofilní lauroyl derivát s dobrou schopností pronikat přes buněčné membrány. Zacharia et al., 1991,

Eur. J. Pharmacol. 203:353-357, použili oxidaci methioninu na sulfoxid a výměnu peptidové vazby za její ketomethylenový isoster (COCH₂), aby dosáhli usnadnění transportu peptidů přes buněčnou membránu. Toto jsou jen některé ze známých modifikací a derivátů, jež jsou běžné v oboru.

Kromě toho, léčiva nebo peptidové inhibitory schopné inhibovat aktivitu G1 nebo jeho možných isoforem při buněčné smrti, mohou být #

¹

L ί,

*·

konjugovány nebo vytvářet komplex s molekulami, jež usnadňují vstup do buňky.

U.S. Patent 5,149,782 zveřejňuje postup, kdy molekula, jež má být transportována přes buněčnou membránu je konjugována s činidlem mísícím ses membránou, jako jsou fusogenní polypeptidy, polypeptidy tvořící iontové kanály, jiné membránové polypeptidy, a dlouhé mastné kyseliny, např. kyselina myristová, kyselina palmitová. Tato činidla mísící se s membránou zavádějí molekulové konjugáty do lipidové dvojvrstvy buněčné membrány a usnadňují io jejich vstup do cytoplasmy.

Low et al. v U.S. Patentu 5,108,921 podává přehled dostupných metod sloužících k transmembránovému přenosu molekul jako jsou, ale bez omezení, proteiny a nukleové kyseliny, s využitím mechanismu endocytotícké aktivity zprostředkované receptorem. Tyto receptorové systémy zahrnují receptory rozpoznávající galaktosu, mannosu, mannosu-6-fosfát, transferrin, asialoglykoprotein, transkobalamin (vitamin Bi₂), a-2 makroglobuliny, insulin a další peptidové růstové faktory jako epidermální růstový faktor (EGF). Low et al. uvádějí, že receptory pro živiny, jako receptory pro biotin a folát mohou být s výhodou použity k zvýšení transportu přes membránu, díky lokalizaci a četnosti biotinových a folátových receptorů na membránovém povrchu většiny buněk a souvisejícími transmembránovými transportními procesy zprostředkovanými receptory. Komplex vytvořený mezi sloučeninou, jež má být vnesena do cytoplasmy a ligandem, jako biotinem nebo folátem, je přiveden do kontaktu s buněčnou membránou nesoucí biotinové nebo foiátové receptory, tím se iniciuje trans-membránový transportní mechanismus zprostředkovaný receptorem a sloučenině je tak umožněn vstup do buňky.

O ICE je známo, že toleruje do značné míry substituce v P₂ pozici a tato tolerance byla využita při vývoji velmi účinné a selektivní

ř'fe u

*s afinitní značky, jež nese navázaný biotin (Thornberry et al., 1994, Biochemistry 33:3934-3940). P2 pozice a možná též N-konec tetrapeptidového inhibitoru mohou tedy být modifikovány nebo derivatizovány, např. přidáním molekuly biotinu, aby se zvýšila průchodnost těchto peptidu přes buněčnou membránu.

Navíc, v oboru je známo, že připojení záváděcí/signální sekvence k danému peptidu za vzniku “chimérního peptidu“ umožní takovémuto “chimérnímu peptidu“ transport do cytoplasmy přes buněčnou membránu.

Osoby znalé peptidového oboru si budou vědomi, že peptidové inhibitory G1 proteolytické aktivity podle vynálezu zahrnují peptidomimetická léčiva nebo inhibitory, které mohou rovněž být rychle vyšetřeny na vazbu k G1 protease a mohou být základem pro návrhy možná stabilnějších inhibitorů.

Bude rovněž zřejmé, že stejné prostředky usnadňující nebo zvyšující transport peptidových inhibitorů přes buněčné membrány, jak bylo diskutováno shora, jsou aplikovatelné pro samotný G1 nebo jeho isoformy, jakož i další peptidy a proteiny, které své účinky vykonávají uvnitř buňky.

Co se týká protilátek zmiňovaných zde v celém textu, termín “protilátka“ zahrnuje polyklonální protilátky, monoklonální protilátky (mAb), chimérní protilátky, anti-idiotypové (anti-ld) protilátky namířené proti protilátkám, které mohou být značené, v solubilní nebo vázané formě, jakož i jejich fragmenty získané kteroukoli známou technikou, jako je, ale bez omezení, enzymatické štěpení, peptidová syntéza nebo rekombinantní technologie.

Polyklonální protilátky jsou heterogenní populace molekul protilátek získaných ze séra zvířat imunizovaných antigenem. Monoklonální protilátka obsahuje v podstatě homogenní populaci protilátek specifických pro antigen, přičemž populace obsahuje v podstatě podobná vazebná místa pro epitop. Monoklonální protilátky ΐ'

i'

S^!

mohou být získány metodami dobře známými v oboru. Viz například Kohler a Milstein, Nátuře 256:495-497 (1975); U.S. Patent No. 4,376,110; Ausubel et al., 1987-1995, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, lne. and Wiley & Sons, lne.,

New York, NY; Harlow a Lané, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); a Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y., (1992-1996), v nichž obsažené odkazy jsou zde v úplnosti zahrnuty odkazem. Takovéto protilátky mohou příslušet io do kterékoli třídy imunoglobulinů, včetně IgG, IgM, IgE, IgA, IgD a jejich podtříd. Hybridom produkující mAb podle vynálezu může být kultivován in vitro, in šitu nebo in vivo. Vzhledem k produkci vysokých íitrů monoklonálních protilátek in vivo nebo in šitu je tomuto způsobu produkce v současnosti dávána přednost.

Ί5——-Chimérní protilátky jsou molekuly,—jéjichž—různé—části—jsou—* odvozené z různých živočišných druhů, jako např. u chimérních protilátek, které mají variabilní oblast odvozenou z myší monoklonální protilátky a konstatntní část z lidského imunoglobulinu. Chimérní protilátky se zejména používají pro snížení imunogenity při klinické

2o aplikaci a pro vyšší výtěžky. Například v situaci, kdy myší mAb poskytují vyšší výtěžky z hybridomů, ale u lidí vyvolávají imunitní odpověď, používají se takovéto lidské/myší chimérní monoklonální protilátky. Chimérní protilátky a způsoby jejich produkce jsou dobře známé v oboru (Cabilly et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:327325 3277 (1984); Morrison et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nátuře 312:643-646 (1984); Cabilly et al., Evropská patentová přihláška 125023 (publikovaná 14.listopadu 1984); Neuberger et al., Nátuře 314:268-270 (1985); Taniguchi et al., Evropská patentová přihláška 171496 (publikovaná 19.února 1985);

Morisson et al., Evropská patentová přihláška 173494 (publikovaná 5.března 1986); Neuberger et al., PCT přihláška WO 8601533 (publikovaná 13.března 1986); Kudo et al., Evropská patentová • 0 f přihláška 184187 (publikovaná 11.června 1986); Sahagan et al., J.

Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson et al., Mezinárodní patentová přihláška No. WO8702671 (publikovaná 7.května 1987); Liu » et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:3439-3443 (1987); Sun et al.,

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Better et al., Science

240:1041-1043 (1988); a Harlow a Lané, ANTIBODIES:

A LABORATORY MANUAL, supra. Tyto odkazy jsou zde v úplnosti zahrnuty odkazem.

Anti-idiotypová (anti-ld) protilátka je protilátka, která rozpoznává io unikátní determinanty zpravidla spojené s vazebným místem pro antigen. Anti-ld protilátka může být připravena imunizací zvířete stejného druhu a genetického typu (např. kmene myši) ze kterého pochází mAb, vůči které se anti-ld připravuje. Imunizované zvíře rozpozná a bude reagovat na idiotypové determinanty imunizující —---15—protilátky-tím—že^- začne~vytvářet^_protilátku^—proti^_těmto^— idiotypovým^- determinantám (anti-ld protilátku). Viz např. U.S. Patent No. 4,699,880, který je zde v úplnosti zahrnut odkazem.

Anti-ld protilátka může být rovněž použita jako “imunogen“ na vyvolání imunitní odpovědi v ještě dalším zvířeti, za vzniku tzv. anti20 anti-ld protilátky. Anti-anti-ld může být epitopově identická s původní mAb, která vyvolala anti-ld. Takto je možné s použitím protilátek namířených proti idiotypovým determinantám mAb identifikovat další klony exprimující protilátky s identickou specifitou.

Monoklonální protilátky vytvořené proti G1 proteinům nebo jejich analogům, fragmentům nebo derivátům podle vynálezu, mohou tedy být použity k navození anti-ld protilátek ve vhodných zvířatech, jako jsou myši kmene BALB/c. Buňky sleziny z takto imunizovaných myší se použijí ke konstrukci anti-ld hybridomů, jež budou produkovat antild monoklonální protilátky. Dále, anti-ld monoklonální protilátky mohou být navázány na nosič jako je hemocyanin měkýše šášně lodní (KLH) ; a použity k imunizaci dalších myší kmeneBALB/c. Sérum těchto myší

Í

I

bude obsahovat anti-anti-ld protilátky s vazebnými vlastnostmi původní mAb specifické pro epitop shora uvedeného G1 proteinu nebo jeho analogů, fragmentů nebo derivátů.

Anti-ld monoklonální protilátky tedy mají své vlastní idiotypové 5 · epitopy, neboli “idiotopy“, strukturně podobné hodnocenému epitopu, jako například GRB protein-a.

Termínem “protilátka“ se rovněž míní, že zahrnuje jak celé molekuly tak jejich fragmenty, jako například Fab a F(ab')2, které jsou schopné vázat antigen. Fab a F(ab')2 fragmenty nemají Fc fragment protilátky, rychleji vymizí z cirkulace a mohou mít nižší nespecifickou tkáňovou vazbu než celá protilátka (Wahl et al., J. Nud. Med. 24:316325 (1983)).

Je zřejmé, že Fab a F(ab')2 a další fragmenty protilátek využitelných podle vynálezu mohou být použity k detekci a kvantifikaci

G1 proteinu s použitím metod zde zveřejněných pro celé molekuly protilátek. Takovéto fragmenty jsou zpravidla získány proteolytickým štěpením, přičemž se užívají enzymy jako papain (na získání Fab fragmentů) nebo pepsin (na získání F(ab')2 fragmentů).

O protilátce lze říci, že je “schopná vázat“ molekulu, pokud je schopná specificky interagovat s molekulou a tím molekulu vázat k protilátce. Termínem “epitop“ se míní ta část jakékoli molekuly, která může být vázána protilátkou a která může být také rozpoznána touto protilátkou. Epitopy nebo “antigenní determinanty“ zpravidla sestávají z chemicky aktivních povrchových seskupení molekul, jako jsou aminokyseliny nebo cukerné postranní řetězce, se specifickou trojrozměrnou strukturou a specifickými nábojovými vlastnostmi.

“Antigen“ je molekula nebo část molekuly, která může být vázána protilátkou, a která dále může vyvolat u zvířete tvorbu protilátky schopné vázat se k epitopu tohoto antigenu. Antigen může mít jeden nebo více epitopů. Specifickou reakcí, o níž byla řeč shora, se rozumí, že antigen reaguje vysoce selektivně se svojí odpovídající • · ř I protilátkou a nikoli s velkým množstvím jiných protilátek, které mohly být vyvolány jinými antigeny.

Protilátky, včetně fragmentů protilátek, využitelné podle ^r vynálezu, mohou být použity ke kvantitativní nebo kvalitativní detekci

G1 proteinu ve vzorcích nebo k detekci buněk, které exprimují G1 protein podle vynálezu. Toho může být dosaženo imunofluorescenčními technikami, jež využívají fluorescenčně značené protilátky (viz níže) v kombinaci s detekcí mikroskopií, průtokovou cytometrií nebo fluorometrií.

Protilátky (nebo jejich fragmenty) využitelné podle vynálezu se mohou použít v histologii k in šitu detekci G1 proteinu podle vynálezu s použitím imunofluorescenční nebo imunoelektronové mikroskopie. In šitu detekce může být provedena po odebrání histologického vzorku od pacienta přidáním značené protilátky podle vynálezu k takovémuto vzorku. Protilátka (nebo fragment) je s výhodou použita tak, že značená protilátka (nebo fragment) je aplikována nebo přiložena k biologickému vzorku. Použitím takového postupu je možné stanovit nejen přítomnost G1 proteinu, ale také jeho distribuci ve vyšetřované tkáni. Osoby běžně zběhlé v oboru si při použití vynálezů ihned

2o uvědomí, že kterákoli z celé řady histologických metod (jako například barvící postupy) může být modifikována, aby bylo dosaženo takovéto in šitu detekce.

Takovéto testy na G1 protein podle vynálezu typicky spočívají v inkubaci biologického vzorku, jako například biologické tekutiny, extraktu tkáně, čerstvě odebraných buněk jako lymfocytů nebo leukocytů, nebo buněk, které byly inkubovány v tkáňové kultuře, »1, v přítomnosti značené protilátky schopné identifikovat G1 protein a v detekci protilátky pomocí kterékoli z celé řady technik dobře známých v oboru.

Biologický vzorek může být zachycen na pevnou fázi nebo nosič jako nitrocelulosu, nebo na jinou pevnou fázi nebo nosič, který s, · . υ ·« o «

-•02·Ť· umožňuje imobilizaci buněk, buněčných částí nebo rozpustných proteinů. Pevná fáze nebo nosič mohou pak být promyty vhodnými pufry a následně inkubovány s detegovatelně značenou protilátkou v souladu s vynálezem, jak bylo uvedeno shora. Pevná fáze nebo nosič mohou pak být promyty pufrem podruhé, aby se odstranila nenavázaná protilátka. Množství vázané značky na pevné fázi nebo nosiči může potom být detegováno běžnými prostředky.

Termíny “pevná fáze“, “nosič pevné fáze“, “pevný nosič“, nebo “nosič“ se rozumí jakákoli pevná fáze nebo nosič schopná vázat antigen nebo protilátky. Dobře známé pevné fáze nebo nosiče zahrnují sklo, polystyren, polypropylen, polyetylén, dextran, nylon, amylasy, přirozené a modifikované celulosy, polyakrylamidy, gabro a magnetit. Pro účely vynálezu může být nosič buď do určité míry rozpustný nebo nerozpustný. Pevná fáze může mít prakticky libovolnou konfiguraci, ~15_nutné^-ye^—pouzeT^aby ňavazana molekuláT”byla schopná se vázaT k antigenu nebo protilátce. Pevná fáze nebo nosič tedy mohou být sférické jako u kuliček, válcovité jako u vnitřního povrchu zkumavky nebo vnějšího povrchu tyčinky. Povrch může také být plochý jako u listu nebo proužku, atd. Výhodné pevné fáze nebo nosiče zahrnují

2o polystyrénové kuličky. Osoby znalé oboru budou znát mnoho dalších vhodných nosičů pro vazbu protilátek nebo antigenů, anebo budou schopny tyto zjistit pomocí rutinního experimentování.

Vazebná aktivita dané šarže protilátky podle vynálezu jak shora uvedeno, může být stanovena pomocí dobře známých metod. Osoby znalé oboru budou schopné určit běžným experimentováním funkční a optimální podmínky pro každé stanovení.

Další kroky jako promývání, míchání, třepání, filtrování a podobně, mohou být zařazeny do procedury jak je obvyklé nebo nutné v konkrétní situaci.

Jeden ze způsobů jak může být protilátka podle vynálezu detegovatelně označená je navázat protilátku k enzymu a použít ji

ř.

?·

• · φ« · ·· ··

·.· · · · · '· ·· « ·· · ·' · ·'· ·=· · • · · * · e 9 φ <>· · v enzymoimunoanalýze (EIA). Tento enzym pak následně bude v přítomnosti vhodného substrátu reagovat se substrátem za vzniku chemického produktu, detegovatelného například spektrofotometricky, fluorometricky nebo visuálně. Enzymy, jež mohou být použity

5- k značení protilátek zahrnují, ale·bez omezení, malátdehydrogenasu; stafylokokovou nukleasu, delta-5-steroid isomerasu, kvasinkovou alkoholdehydrogenasu, alfa-glycerofosfátdehydrogenasu, triosofosfátisomerasu, křenovou peroxidasu, alkalickou fosfatasu, asparaginasu, glukosaoxidasu, beta-galaktosidasu, ribonukleasu, ureasu, katalasu, glukosa-6-fosfátdehydrogenasu,' glúkoamylasu a acetylcholinesterasu. Detekce může být provedena kolorimetrickými metodami, jež využívají chromogenních substrátů enzymů. Detekce může být provedena též visuáíním porovnáním rozsahu enzymatické reakce substrátu se standardy připravenými za podobných podmínek.

Ί5 “Detekce můzé^byTTlošáženo s použitířřrkterékoli z řady dalších imunostanovení. Po radioaktivním označení protilátek nebo jejich fragmentů je možné detegovat například R-PTPasu pomocí radioimunoanalýzy (RIA). Dobrý popis RIA metody lže najít v La b o rato ry Te ch n i q ue s a n d B ioc h e m i st ry i n Mol ecu I a r B i o I og y, au to r ů

Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) se zvláštním poukazem na kapitolu, kterou napsal Chard, T., “Úvod do radioimunoanalýzy a příbuzných technik“, která je zde zahrnuta odkazem. Radioaktivní izotop je detegován pomocí gama-počítače nebo kapalinového scintilačního počítače nebo autoradiografií.

Dále je možné protilátku podle vynálezu označit fluorescenční sloučeninou. Po vystavení fluorescenčně značené protilátky světlu o vhodné vlnové délce, může být přítomnost protilátky detegována díky fluorescenci. Mezi nejběžněji užívané sloučeniny k fluorescenčnímu značení patří fluorescein isothiokyanát, rhodamin, phycoerythrin, pycocyanin, allophycocyanin, o-ftalaldehyd, a fluoreskamin.

·· • · ··

- U4 -·*

Protilátka může být též značena kovy vydávajícími fluorescenci jako např. ¹⁵²E nebo další lanthanidy. Tyto kovy mohou být navázány k protilátce prostřednictvím skupin chelatujících kovy, jako např. kyselina diethylentriaminpentaoctová (ETPA).

Protilátka může být též značena navázáním chemíluminiscenční sloučeniny. Přítomnost chemiluminiscenčně označené protilátky je pak stanovena podle luminiscence vycházející v průběhu chemické reakce. Příkladem obzvláště užitečných sloučenin pro chemiluminiscenční značení jsou luminol, isoluminol, theromatický akridiniový ester, imidazol, akridiniová sůl a ester oxalátu.

Podobně mohou být k značení protilátky podle vynálezu použity bioluminiscenční sloučeniny. Bioluminiscence je typ chemiluminiscence, vyskytující se v biologických systémech, ve kterých je účinnost chemiluminiscenční reakce zvyšována katalytickým proteinem. Přítomnost bioluminiscenčního proteinu se stanovuje detekcí luminiscence. Důležité bioluminiscenční sloučeniny pro účely značení jsou luciferin, luciferasa a aequorin.

Molekula protilátky podle vynálezu může být použita v imunostanovení, známém též jako “dvojstranná“ nebo “sendvičová“

2o analýza. V typickém imunometrickém stanovení se určité množství neznačené protilátky (nebo fragmentu protilátky) naváže k pevné fázi nebo nosiči a přidává se určité množství solubilní značené protilátky, které umožňuje detekci a/nebo kvantifikaci ternárního komplexu mezi protilátkou na pevné fázi, antigenem a značenou protilátkou.

Typická a výhodná imunostanovení zahrnují “forward“ analýzy, při kterých je protilátka navázaná na pevné fázi nejprve inkubována s testovaným vzorkem, aby se antigen ze vzorku navázal do binárního komplexu protilátka na pevné fázi - antigen. Po vhodné době inkubace se pevná fáze nebo nosič promyje, aby se odstranily zbytky kapalného

3o vzorku, včetně nenavázaného antigenů, je-li takový, a potom se přidá roztok obsahující neznámé množství značené protilátky (která slouží • ·· ·« · ·· ·· 9 9 · · 9 9 · l· >

ty jako “reportérové molekula“). V průběhu druhé inkubace se značená protilátka komplexuje s antigenem, který je navázaný k pevné fázi nebo nosiči prostřednictvím neznačené protilátky, a poté se pevná fáze nebo nosič podruhé promyje, aby se odstranila nenavázaná značená protilátka.

V jiném typu “sendvičového“ stanovení, které může být použitelné pro antigeny podle vynálezu, se provádějí tzv. “simultánní“ a “reverzní“ analýzy. Simultánní stanovení spočívá v jediném inkubačním kroku, ve kterém se protilátka vázaná k pevné fázi nebo nosiči a značená protilátka současně přidávají k testovanému vzorku. Po ukončení inkubace se pevná fáze nebo nosič promyje, aby se odstranily zbytky kapalného vzorku a nenavázaná značená protilátka. Přítomnost značené protilátky spojené s pevnou fází nebo nosičem se pak stanoví stejně jako v případě konvenčního “forward“ sendvičového

15—stanovení.-— -----——

Při “reverzním“ stanovení se nejprve přidá roztok značené protilátky ke kapalnému vzorku a po vhodné inkubační době následuje přídavek neznačené protilátky vázané na pevné fázi nebo nosiči. Po druhé inkubaci je pevná fáze konvenčním způsobem promyta, aby se odstranily zbytky testovaného vzorku a nenavázané značené protilátky. Stanovení značené protilátky spojené s pevnou fází nebo nosičem se provede stejně jako v “simultánní“ a “forward“ analýze.

G1 proteiny podle vynálezu mohou být připraveny kterýmkoli standardním postupem využívajícím rekombinantní DNA (viz např.

Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY a Ausubei et al., 1987-1995, supra), při kterém se vhodné eukaryotické nebo prokaryotické hostitelské buňky, dobře známé v oboru, transformují vhodnými eukaryotickými nebo prokaryotickými vektory obsahujícími

3o sekvence kódující proteiny. Vynález se tedy rovněž týká takovýchto expresních vektorů a transformovaných hostitelů sloužících k produkci

&

β · 4 4 4 4444

-Β6-*...... ··' ·* proteinů podle vynálezu. Jak uvedeno shora, tyto proteiny též zahrnují jejich biologicky aktivní analogy, fragmenty a deriváty, takže vektory, jež je kódují, zahrnují rovněž vektory kódující analogy a fragmenty těchto proteinů, a transformovaní hostitelé zahrnují též hostitele produkující takovéto analogy a fragmenty. Deriváty těchto proteinů, produkovaných transformovanými hostiteli, jsou deriváty získané standardní modifikací proteinů nebo jejich analogů nebo fragmentů.

Vynález se rovněž týká farmaceutických prostředků obsahujících rekombinantní živočišné virové vektory, kódujících G1 proteiny, io přičemž vektor také kóduje virový povrchový protein schopný vazby k specifickým povrchovým proteinům na cílové buňce (např. na nádorových buňkách), což umožní vnesení G1 proteinů do buněk. Další farmaceutické prostředky podle vynálezu obsahují jako aktivní součást (a) oligonukleotidovou sekvenci kódující antisense sekvenci

15—vůči-sekvenci-GI-proteinuT-nebO-Cbj-léčivaTjež-blokujnproteolytickou aktivitu G1 nebo jeho isoforem.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu zahrnují dostatečné množství aktivní složky, aby dosáhly zamýšleného účelu. Navíc mohou f armace utické prostřed ky o bsah ovát vh od n é f a rm aceuticky p říj ate In é nosiče, zahrnující vehikula a plnidla, které usnadňují zpracování aktivních sloučenin do preparátů použitelných farmaceuticky, a které mohou stabilizovat takovéto preparáty pro podávání potřebným subjektům, jak je osobám zběhlým v oboru dobře známo.

Předpokládá se, že G1 protein a jeho isoformy nebo isotypyjsou exprimovány v různých tkáních ve značně odlišných hladinách a zřejmě rovněž s různými profily exprese isotypů, analogicky jako je tomu s expresí MACH proteinu a jeho různých isotypů, jak je naznačeno ve shora uvedených spoluvlastněných, společně podaných patentových přihláškách. Tyto rozdíly mohou možná přispívat k tkáňově specifickým charakteristikám odpovědí na Fas/APO1-ligand a TNF. Autoři vynálezu již dříve ukázali (ve shora zmíněných ·· ♦ · · ·♦ ·· • · ·· · · · * • · · » · · · ·· ·*··· * • · · · · · ·

patentových přihláškách), že podobně jako u jiných CED3/ICE homologů (Wang et al., 1994, Cell 78:739-750; Alnemri et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:4312-4317), MACH isoformy obsahující neúplné CED3/ICE oblasti (např. MACHa3) mají inhibiční účinek na aktivitu současně exprimovaných molekul MACHal nebo MACHa2; bylo o nich také zjištěno, že blokují indukci buněčné smrti zprostředkovanou Fas/APO1 a p55-R. Exprese takovýchto inhibujících isoforem v buňkách, může představovat mechanismus buněčné sebeobrany před cytotoxicitou způsobenou Fas/APO1 a TNF. Lze tedy očekávat io analogický inhibiční účinek alespoň některých G1 isoforem. Značná heterogenita MACH isoforem a podobně předpokládaná, analogická heterogenita G1 isoforem, jež výrazně přesahuje míru heterogenity pozorovanou u ostatních proteas CED3/ICE rodiny, by měla umožňovat obzvláště jemnou regulaci funkce aktivních MACH isoforem

15—a analogicky též aktivních G1 isoforem podle vynálezu.-------Je rovněž představitelné, že některé z možných G1 isoforem plní další funkce. Například, dříve zjištěná (autory vynálezu, jak uvedeno shora) schopnost MACH01 vázat se k MORT-1 i k MACHal naznačuje, že tato isoforma by vlastně mohla zesilovat aktivitu enzymaticky aktivních isoforem. Mírná cytotoxicita pozorovaná v kulturách 293-EBNA a MCF7 transfekovaných touto isoformou a poměrně značný cytotoxický účinek vyvolaný v HeLa buňkách jsou pravděpodobně projevem aktivace endogenně exprimovaných MACHa molekul způsobené vazbou transfekovaných MACHpi molekul. Je představitelné, že některé MACH isoformy by mohly též fungovat jako vazebné platformy pro molekuly, které jsou zapojeny do jiných, nikoli cytotoxických účinků Fas/APO1 a TNF receptorů. Analogicky, G1 a/nebo jeho isoformy tedy mohou vykazovat též takovéto zesilující aktivity nebo působit jako vazebná místa pro jiné takovéto molekuly.

Vzhledem k unikátní schopnosti Fas/Apo1 a TNF receptorů vyvolávat buněčnou smrt, jakož i schopnosti TNF receptorů spouštět • J · ·· · ···· a *Q g ·,· · · · · · . · · · ·

L i* další aktivity poškozující tkáně, by mohly být poruchy funkce těchto receptorů obzvláště škodlivé pro organismus. Skutečně, bylo prokázáno, že nadměrná i nedostatečná funkce těchto receptorů $ přispívá k patologickým projevům různých chorob (Vassalli, 1992, Ann.

Rev. Immunol. 10:411-452; Nagata a Golstein, 1995, Science

267:1449-1456). Identifikace molekul účastnících se na signalizační aktivitě receptorů a nalezení způsobů jak modulovat aktivitu těchto molekul by mohly vést k novým terapeutickým přístupům. S ohledem na předpokládanou ústřední roli G1 v toxicitě zprostředkované io Fas/APO1 a TNF, se jeví jako obzvláště důležité navrhnout léčiva, jež mohou blokovat možnou proteolytickou aktivitu G1, jak již bylo učiněno | v případě některých .jiných proteinů CED3/ICE rodiny (Thornberry et al., 1994, Biochemistry 33:3934-3940; Miiier et ai., 1995, J. immunol. 154:1331-1338; Mashima et al., 1995, Biochem. Biophys. Res.

í___15 Commun___209:907-915; Milligan et al., 1995, Neuron 15:385-393;-Enari et al., 1995, Nátuře 375:78-81; Los et al., 1995, Nátuře 375:8183). Unikátní rysy v sekvenci CED3/ICE homologu, které zřejmě existují v G1 molekulách by mohly umožnit konstrukci léčiv, jež by specificky ovlivňovaly pouze jeho aktivitu. Takováto léčiva by mohla

2o poskytovat ochranu přeď nadměrnou cytotoxicitou zprostředkovanou , imunitním systémem, v níž je zapojen G1, aniž by zasahovala do fyziologických procesů buněčné smrti, ve kterých se účastní jiní členové CED3/ICE rodiny.

Další aspekty vynálezu budou zřejmé z následujících příkladů.

* 25 Vynález bude nyní podrobněji popsán v následujících nijak omezujících příkladech a doprovázejících vyobrazeních.

Mělo by se též podotknout, že postupy:

(i) dvojhybridová analýza a dvojhybridovový test exprese β-galaktosidasy; (ii) indukovaná exprese, metabolické značení

3o a imunoprecipitace proteinů; (iii) in vitro vazba; (iv) stanovení ' cytotoxicity; a (v) northernová a sekvenční analýza, jak jsou uvedeny í

I

í»,

Xi’

I· níže v Odkazových Příkladech 1 (viz též Boldin et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:7795-7798), 2 a 3 (viz též Boldin et al., 1996, Cell 85:803815) s ohledem na MORT-1 a MORT-1 vazebný protein (např. MACH) jsou stejně použitelné (s některými modifikacemi) pro odpovídající izolaci, klonování a charakterizaci G1 a jeho možných isoforem podle vynálezu. Tyto postupy se tedy mají chápat jako úplné zveřejnění stejných postupů, použitých pro izolaci, klonování a charakterizaci G1 podle vynálezu, jak je níže podrobně uvedeno v Příkladu 1. (Níže uvedené Odkazové Příklady 1-3 se rovněž objevují v totožné nebo io rovnocenné formě ve spoluvlastněných, společně podaných Izraelských Přihláškách No. 114,615, 114,986, 115,319, 116,588 a 117,932, jakož i v odpovídající PCT Přihlášce No. PCT/US96/10521). Kromě toho, ve shora uvedené části s názvem 'Stručný popis obrázků' jsou rovněž zahrnuty některé detaily experimentálních postupů

15_provedených podle vynálezu a tyto detaily experimentálních postupů tvoří část Příkladu 1 níže, pokud jde o úplné zveřejnění vynálezu, a tudíž by měly být vzaty v úvahu společně se zveřejněním v Příkladu 1.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1A schematicky znázorňuje předběžnou nukleotidovou . . sekvenci jedné isoformy G1 proteinu, jak je podrobně popsáno v Příkladu 1.

Obrázek 1B schematicky znázorňuje odvozenou 25 aminokyselinovou sekvenci isoformy zobrazené v Obr.lA.

Obrázek 2 schematicky znázorňuje předběžnou nukleotidovou a odvozenou aminokyselinovou sekvenci druhé isoformy G1 proteinu, jak je podrobně popsáno v Příkladu 1.

Obrázek 3 schematicky znázorňuje srovnání aminokyselinových 3o sekvencí lidských (hCASHa, hCASHp) G1 (neboli CASH) a myších

tí’

(mCASHa) sestřihových variant, a konzervované motivy nalezené v těchto proteinech. Obrázek 3 ukazuje kolineární seřazení aminokyselinových sekvencí myšího G1a (mCASHa), lidského G1a (hCASHa) a Gip (hCASHp), CASP-8 (MACH/FLICE/Mch5), CASP5 10 (Mch4/FLICE2), CASP-3 (CPP32/Apopain/Yama) a CASP-1 (ICE).

CASP-1 a CASP-3 jsou zobrazeny bez svých prodoménových oblastí. Aminokyselinové zbytky jsou očíslovány napravo od sekvencí. Tečkované čáry vyznačují mezery v sekvenci pro dosažení optimálního seřazení sekvencí. Moduly „domény smrti“ (DED) jsou vystínovány. io Aminokyseliny, jež jsou identické ve více než třech proteinech jsou zarámovány. V oblasti homologie s proteasou jsou aminokyseliny, které byly seřazené podle zbytků v CASP-1, jež mají podle proteinové krystalografie úlohu v katalytické aktivitě, označeny následujícím způsobem: Zbytky, u nichž se předpokládá účast v katalýze a jež “15—odpovídají—His2-3-7—a~Cys285—v-CASP-1—jsou tmavě vystínovány a označeny plnými kroužky pod seřazenými.sekvencemi. Zbytky tvořící vazebnou kapsu pro postranní karboxylový zbytek P1 Asp, jež odpovídají Arg179, Gln238, Arg341 a Ser347 v CASP-1, jsou světleji stínované a označené prázdnými kroužky. Známá a navržená štěpící místa Asp-X a potenciální štěpící místo nalezené v podobné pozici G1 (CASH) jsou vystínována. Horizontální šipky vyznačují N- a C-konce malé a velké podjednotky CASP-1. C-konce proteinů jsou vyznačeny hvězdičkami.

Na Obrázku 4 (A,B) jsou ukázány reprodukce autoradiogramů northernové analýzy, znázorňující G1 transkripty v různých lidských tkáních (srdce, mozek, placenta, plíce, játra, kosterní sval, ledvina, pankreas, slezina, thymus, prostata, varle, vaječník, tenké střevo, tlusté střevo a lymfocyty periférní krve - PBL). Northernová analýza byla provedena následujícím způsobem: radioaktivně značená mRNA

3o sonda, odpovídající oblasti “domény smrti“ (DED) proteinu G1 (nukleotidové pozice 482-1070 vGip (viz Obr.2), což je oblast společná oběma klonovaným sestřihovým variantám G1 (CASH)) byla

• ·· · · · ·· ·· ··· · · · · · · · · · • · · · · · · · • · ββ· φ β e β e β β ·«.·· ·· · ···· ·· ··« ·· ·· připravena pomocí T7 RNA polymerasy (Promega) a touto sondou byly analyzovány membrány (Clontech) obsahující poly(A)+ RNA (2 pg na dráhu) z různých lidských tkání.

Obrázek 5 schematicky znázorňuje výsledky sledování interakce G1a (CASHa) aGip (CÁSHp) s dalšími proteiny, obsahujícími “doménu smrti“ (DED), po transfekci do kvasinek (např. s MORT1/FADD, MACHal (CASP-8a1), MACHpl (CASP-8p1), MACHp4 (CASP-8p4), Mch4 (CASP-10), G1a (CASHa), G1p (CASHp), p55-R (p55ic), RIP, TRADD a s laminem (negativní kontrola)). Vazebné vlastnosti Gip (CASHp) a rovněž i G1a (CASHa) byly stanoveny v kvasinkovém reportérovém kmeni SFY526 (Clontech), s použitím vektorů pGBT9-obsahujícím GAL4 DNA-vazebnou doménu, pGAD1318 a pGADGH-obsahujícím GAL4 aktivační doménu. Kvantitativní vyhodnocení vazby v kvasinkách bylo provedeno na základě exprese β-galaktosidasy jak je uvedeno v Odkazových Příkladech 1-3. Výsledky jsou vyjádřeny jako čas potřebný k vyvinutí silného zabarvení. Umístění testovaných insertů do rekombinantních plasmidů obsahujících DNA-vazebnou doménu nebo aktivační doménu vedlo při obou kombinacích ke stejnému výsledku ve všech testovaných případech. Žádný ze zkoušených insertů neposkytl pozitivní reakci s kontrolními proteiny, včetně intracelulárních domén lidského p55-R (CD120a), p75-R (CD120b), CD40, laminu a prázdného Gal4 vektoru......

Obrázek 6 (A-D) znázorňuje účinky G1a (CASHa), Gip (CASHp) a mutantních G1a (CASHa) na buněčnou viabilitu a na indukci buněčné smrti. Kvantitativní vyhodnocení buněčné smrti indukované v buňkách HeLa-Fas (výsledky jsou schematicky znázorněny jako sloupcové grafy v Obr. 6A) a 293-T (výsledky schematicky znázorněny jako sloupcové grafy v Obr. 6B a 6C) po transfekci těchto buněk příslušnými rekombinantními plasmidy bylo provedeno jak se uvádí v Příkladu 1. Buňky (5x10⁵ pro 293T buňky nebo 3x10⁵ pro HeLa

• ·

buňky, na 6-cm miskách) byly transientně transfekovány cDNA, kódujícími příslušné proteiny, společně s plasmidem pCMV-p-gal. K transfekci bylo použito metody využívající kalcium fosfátový koprecipitát. Každá miska byla transfekována 5 pg příslušného pcDNA3 plasmidu nebo, při transfekci dvěma různými plasmidy, 2,5 pg každého, a dále 1,5 pg vektoru exprimujícího β-galaktosidasu. Buňky byly 6 až 10 hodin po transfekci opláchnuty a inkubovány dalších 14 hodin. K buňkám pak byly přidány anti-CD95 (anti-Fas-R) monoklonální protilátky (CH11 (Oncor (Gaithersburg, MD)), 0,5 pg/ml) a lidský rekombinantní TNFa (100 ng/ml), spolu s cycloheximidem (CHX, 10 pgml), a buňky byly inkubovány další 4 hodiny. Pak byly buňky obarveny 5-brom-4-chlor-3-indoxyl-p-D-galaktopyranosidem (XGal) a prohlíženy mikroskopem s fázovým kontrastem. Ve všech experimentech byla buněčná smrt hodnocena 24 hodin po transfekci v případě HeLa-Fas buněk a 20 hodin po transfekci u 293T buněk. Uvedená data (průměr ± SD; n rovno alespoň 3 experimentům) představují procento modrých buněk, jejichž membrány vykazovaly tvorbu blebů.

Reprodukce mikrofotografií na Obrázku 6D znázorňují 2o morfologii 293T buněk transientně exprimujících vyznačené rekombinantní plasmidy. Fotografie byly pořízeny 20 hodin po transfekci.

“75”

Příklady provedení vynálezu

ODKAZOVÝ PŘÍKLAD 1: Klonování a Izolace MORT-1 proteinu, který se váže k intracelulární doméně FAS-R

A

I

I

L

Á i

ř

Ϊ.

(i) Dvoihybridová analýza a dvoihybridový test exprese_ β5 galaktosidasy

Na izolaci proteinů interagujících s intracelulární doménou FASR byl použit kvasinkový dvojhybridový systém’(Fields a Song, 1989, Nátuře 340:245-246). Ve stručnosti, tento kvasinkový dvojhybridový systém je genetický test sloužící k detekci specifických protein-protein io interakcí in vivo na základě obnovení eukaryotického transkripčního aktivátoru, jako například GAL4, který má dvě samostatné domény, DNA vazebnou doménu a aktivační doménu. Jsou-li tyto domény

---exprimovány a navázány k sobě, vytvoří obnovený GAL4 protein, který je schopen vázat se k aktivační sekvenci lokalizované před genem (ve směru 5', upstream), což vede k aktivaci promotoru, který řídí expresi reportérového genu, jako například lacZ nebo HIS3, a tato exprese je v buňkách snadno pozorovatelná. Geny pro předpokládané interagujíčí proteiny se v tomto systému klonují do samostatných expresních vektorů. Do jednoho expresního vektoru se klonuje sekvence kódující jednoho proteinového kandidáta interakce ve shodné čtecí fázi se sekvencí pro GAL4 DNA-vazebnou doménu tak, aby vznikl hybridní protein s GAL4 DNA-vážebnou doménou; v druhém vektoru je klonována sekvence kódující druhý kandidátní protein ve fázi se sekvencí pro GAL4 aktivační doménu, dávající vznik hybridnímu proteinu s GAL4 aktivační doménou. Tyto dva hybridní vektory jsou pak současně transformovány do kvasinkového hostitelského kmene, který obsahuje lacZ nebo HIS3 reporterový gen pod kontrolou GAL4 regulačních elementů. Pouze ty transformované hostitelské buňky (kotransformanty), ve kterých jsou exprimovány dva hybridní proteiny schopné vzájemné interakce, budou moci exprimovat • · ® β *^:74 reportérový gen. V případě lacZ reporterového genu budou hostitelké buňky exprimující tento gen v přítomnosti X-gal substrátu modré. Modré kolonie budou tedy indikovat skutečnost, že dva klonované kandidátní proteiny jsou schopné navzájem interagovat.

' S použitím tohoto dvojhybridového systému byla do vektoru pGBT9 (od firmy CLONTECH, USA, nesoucí GAL4 DNA-vazebnou sekvenci) zaklonována intracelulární doména FAS receptoru, FAS-IC (viz níže) tak, aby fúzovaný protein obsahoval GAL4 DNA-vazebnou doménu. Pro klonováni FAS-R do pGBT9 se vyšlo z plasmidu kódujícího plnou délku cDNA sekvence pro FAS-R (WO 9531544); z něj byla vyštěpena intracelulární doména (IC) standardním postupem s využitím různých restrikčních enzymů, fragment DNA byl izolován standardním postupem a poté vnesen do pGBT9 vektoru otevřeného v mnohočetném klonovacím úseku (MCS) odpovídajícími restrikčními enzymyrKJe třeba požňáměKatTžě^FAS-IC leží mezi amiňokyselinovými zbytky 175-319 v rámci úplné molekuly FAS-R, přičemž tato část obsahující zbytky 175-319 představuje FAS-IC, jež byla zaklonována do pGBT9 vektoru.

Shora uvedený hybridní (chimérní) vektor pak byl transfekován do kvasinkového kmene HF7c společně s cDNA knihovnou z lidských HeLa buněk klonovanou v pGAD GH vektoru, nesoucím GAL4 aktivační doménu (všechny shora uvedené vektory, pGBT9 a pGAD GH nesoucí HeLa cDNA knihovnu, a kvasinkový kmen byly zakoupeny od fy Clontech Laboratories, lne., USA, jako součásti soupravy

MATCHMAKER Two-Hybrid System, #PT1265-1). Transfekované kvasinky byly selektovány na schopnost růstu v médiu bez histidinu (His' médiu), přičemž rostoucí kolonie indikovaly pozitivní transformanty. Vybrané kvasinkové klony pak byly analyzovány na schopnost exprimovat lacZ gen, tj. byla sledována jejich LACZ aktivita tak, že k médiu byl přidán X-gal, který je katabolizován na modře zbarvený produkt v důsledku aktivity β-galaktosidasy, enzymu kódovaného genem lacZ. Modré kolonie tedy indikují aktivní lacZ gen.

75·Aktivní exprese lacZ genu vyžaduje, aby v transformovaných klonech byl přítomen GAL4 transkripční aktivátor v aktivní formě, jmenovitě aby se GAL4 DNA-vazebná doména kódovaná shora uvedeným hybridním vektorem správně kombinovala s GAL4 aktivační doménou kódovanou druhým hybridním vektorem. Takováto kombinace je možná jen tehdy, jestliže dva proteiny fúzované k oběma GAL4 doménám jsou schopné vzájemné stabilní interakce (vazby). Takže His⁺ a modré (LACZ⁺) kolonie, které byly izolovány, jsou kolonie, které byly transfekovány vektorem kódujícím FAS-IC a vektorem kódujícím proteinový produkt pocházející z lidských HeLa buněk, který je schopen pevně se vázat k FAS-IC.

Plasmidová DNA ze shora uvedených His⁺, LACZ⁺ kvasinkových kolonií byla izolována a elektroporována standardními postupy do E. coli kmene HB101 a následovala selekce Leu* a Ampicilin res iste nt n i ch^-1 ra n sf o rm a n tu, přičemž tyto transfo rmanty obsah ují hybridní pGAD GH vektor, který nese Amp^R i Leu2 kódující sekvence. Takovéto transformanty jsou proto klony nesoucí sekvence kódující nově identifikované proteiny schopné vázat se k FAS-IC. Z těchto transformovaných E. coli byla pak izolována plasmidová DNA a ta byla dále analyzována následujícím způsobem:

(a) opětovnou transformací společně s původním hybridním plasmidem nesoucím FAS-R intracelulární doménu (hybridním pGTB9 nesoucím FAS-IC) do kvasinkového kmene HF7 jak zde bylo vyloženo shora. Jako kontroly byly v kotransformaci s plasmidem kódujícím FAS-IC-vazebný protein (tj. MORT-1) použity vektory nesoucí sekvenci kódující irelevantní protein, např. pACTlamin, nebo samotný pGBT9. Kotransformované kvasinky pak byly analyzovány z hlediska růstu na samotném His' médiu nebo s různými hladinami 3-aminotriazolu; a (b) opětovnou transformací plasmidové DNA a původního

FAS-IC hybridního plasmidu a kontrolních plasmidů popsaných v (a)

• ·

I fc

£-

i I· f

i έ

i»· do kvasinkového hostitelského kmene SFY526 a stanovením LACZ⁺ aktivity (účinnosti tvorby β-gal, tj. tvorby modrého zabarvení).

Výsledky shora uvedených testů ukázaly, že růst kolonií na His' médiu koreluje s LACZ aktivitou hodnocenou podle barvy kolonie, tj.

His⁺ kolonie byly také LACZ*. Dále, LACZ aktivita v tekuté kultuře (preferované podmínky kultivace) byla hodnocena po transfekci hybridních plasmidů s GAL4 DNA-vazebnou doménou a s aktivační doménou do kvasinek kmene SFY526, ve kterých se lépe indukuje lacZ exprese GAL4 transkripčním aktivátorem, než je tomu v HF7 kvasinkových buňkách.

S použitím shora uvedeného postupu byl identifikován, izolován a charakterizován protein dříve označený HF1 a nyní označovaný jako MORT-1 (“Mediator of Receptor-induced Toxicity“).

_Dále ještě by mělo byt zmíněno, že v řadě shora uvedených dvojhybridových testů exprese β-galaktosidasy byla exprese βgalaktosidasy též s výhodou stanovována testem na filtru. Při této analýze bylo zjištěno, že pět z asi 3x10⁶ cDNA molekul obsahovalo MORT-1 insert. Takto izolované klonované MORT-1 cDNA inserty byly sekvenovány standardními postupy. Z DNA sekvence byla odvozena aminokyselinová sekvence MORT-1 (pro MORT-1 DNA a aminokyselinovou sekvenci, viz spoluvlastněné, společně podané Izraelské Přihlášky No. 112,022, 112,692 a 114,615 a jejich odpovídající PCT Přihlášku No. WO96/18641). Číslování aminokyselinových zbytků v proteinech kódovaných cDNA inserty je jako v databázi Swiss-Prot. Deleční mutanty byly připraveny pomocí PCR a bodové mutanty pomocí oligonukleotidově cílené mutagenezy (Current Protocols in Molec. Biol., 1994).

(ii) Indukovaná exprese, metabolické značení a imunoprecipitace proteinů

1«

ř

I;

I

Ul

V HeLa buňkách byly exprimovány MORT-1, nesoucí na N-konci FLAG oktapeptid (FLAG-MORT-1; Eastman Kodak, New Haven, CT, USA), Fas-IC, FAS-R, p55-R, chiméra sestávající z extracelulární domény p55-R (aminokyseliny 1-168) fúzované k transmembránové a intracelulární doméně FAS-R (aminokyseliny 153-319), a cDNA kódující luciferasu, jež slouží jako kontrola. Exprese byla provedena s použitím expresního vektoru regulovaného tetracyklinem v klonu buněk HeLa (HtTA-1), který exprimuje tetracyklinem regulovaný transaktivátor (Gossen a Bujard, 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA io 89:5547-5551; viz též Boldin et al., 1995). Metabolické značení [³⁵S]methioninem a [³⁵S]cysteinem (DUPONT, Wilmington, DE, USA aAmersham, Buckinghamshire, Anglie) se provádělo 18 hod po transfekci inkubací po dobu 4 hod při 37°C v Dulbeccově modifikaci Eagleova média bez methioninu a cysteinu, doplněném 2%

15—dialyzovaným fetálním telecím sérem. Buňky pak byly lyžovány v RIPA pufru (10 mM Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% deoxycholát, 0,1% SDS a 1 mM EDTA) a lyzát byl předčištěn inkubací s irelevantním králičím antisérem (3 μΙ/ml) a kuličkami Protein GSepharosy (Pharmacia, Uppsala, Švédsko; 60 μΙ/ml). Imunoprecipitace

0.3 ml alikvotů lyzátu se prováděla inkubací po dobu 1 hodiny při 4°C s myšími monoklonálními protilátkami (5 μΙ/alikvot). namířenými proti FLAG oktapeptidu (M2; Eastman Kodak), p55-R (#18 a #20; Engelmann et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:1531-1536), FAS-R (ZB4; Kamiya Southand Oaks, CA, USA) nebo s myšími imunoglubuliny stejného isotypu jako kontrolou, a poté následovala další inkubace 1 hod s kuličkami Protein G-Sepharosy (30 μΙ/alikvot).

(iii) In vitro vazba

FAS-IC, divokého typu nebo mutovaný, byl fúzován ke glutathion S-transferase a fúzované proteiny byly adsorbovány na kuličky glutathion-agarosy; viz Boldin et al., 1995, J. Biol. Chem.

270:7795-7798; Current Protocols in Molecular Biology, 1994; Frangioni a Neel, 1993, Anal. Biochem. 210:179-187). Vazba metabolicky značeného FLAG-MORT-1 proteinu k GST-Fas-IC byla stanovena po inkubaci kuliček (s navázaným GST-Fas-IC) po dobu

2hod při 4°C s extrakty HeLa buněk exprimujících FLAG-MORT-1, metabolicky značených [³⁵S]methioninem (60 pCi/ml). Extrakty byly připraveny v pufru obsahujícím 50 mM Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCI, 0,1% NP-40, 1 mM dithiotreitol, 1mM EDTA, 1mM fenymethylsulfonylfluorid, 20 pg/ml Aprotinin, 20 pg/ml Leupeptin, 10 io mM fluorid sodný a 0,1 mM vanadát sodný (1 ml na 5x10⁵ buněk).

“---------(iv) Hodnocení cvtotoxicity vyvotané indukovanou expresí MORT-1 cDNA molekuly kódující MORT-1, Fas-IC, p55-IC a luciferasu byly vloženy do expresního vektoru, umožňujícího regulaci exprese tetracyklinem, a transfekovány do HtTA-1 buněk (linie HeLa buněk) (Gossen a Bujard, 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:5547-5551) společně s vektorem nesoucím pod SV40 promotorem cDNA pro secernovanou placentální alkalickou fosfatasu (pSBC-2 vektor, Dirks et al., 1993, Gene 128:247-249). Buněčná smrt byla hodonocena 40 hod po transfekci na základě testu vitálního barvení s neutrální červení (Wallach, 1984, J. Immunol. 132:2464-9) nebo, při hodnocení smrti * specificky u buněk exprimujících transfekované cDNA, bylo stanoveno množství placentální alkalické fosfatasy (Berger et al., 1988, Gene ^? 66:1-10) secernované do růstového média v posledních 5 hodinách inkubace.

V jiném souboru pokusů zaměřených na analýzu oblasti proteinu v

MORT-1 účastnící se vazby k FAS-IC, byly v HeLa buňkách, jež obsahují tetracyklinem regulovaný transaktivátor (HtTA-1), transientně í

I'Λ í

A•-•¥9··-

·' jT7

í>

i r

í f

», c

exprimovány s použitím expresního vektoru regulovaného tetracyklinem (pUHD10-3) následující proteiny: samotný lidský FASR; lidský FAS-R a N-koncová část MORT-1 (aminokyseliny 1-117, “MORT-1 hlava“); lidský FAS-R a C-koncová část MORT-1, jež obsahuje oblast homologie s 'doménou smrti' (aminokyseliny 130-245, “MORT-1 DD“); FLAG-55.11 (aminokyseliny 309-900 proteinu 55.11 fúzované na N-konci k FLAG oktapeptidu; protein 55.11 je specifický p55-IC-vazebný protein). Dvanáct hodin po transfekci byly buňky trypsinizovány a znova nasazeny v koncentraci 30 000 buněk/jamku. io Po 24 hod inkubace bylo na buňky působeno po dobu 6 hod monoklonální protilátkou namířenou proti extracelulární doméně FASR (monoklonální protilátka CH-11, Oncor, Gaithersburg, MD, USA) v různých koncentracích (0,001-10 pg/mi), v přítomnosti 10 pg/ml cycloheximidu. Buněčná viabilita byla pak stanovena testem vitálního .15—-barvení-s—neutrální červení a výsledky-byly-vyjádřeny-jako-%T-živýGh buněk oproti buňkám, jež byly inkubovány pouze s cycloheximidem (tj. v nepřítomnosti anti-FAS-R monoklonální protilátky CH-11).

(v) Northernová a sekvenční analýza

Póly A⁺ RNA byla izolována z celkové RNA HeLa buněk (Oligotex-dT mRNA souprava, QIAGEN, Hilden, Německo).

Northernová analýza s použitím MORT-1 cDNA jako sondy byla provedena obvyklým postupem (viz Boldin et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:7795-7798). Nukleotidová sekvence MORT-1 byla určena v obou směrech s použitím dideoxy terminační metody.

Analýza sekvence MORT-1 cDNA nakloňované dvojhybridovou . technikou ukázala, že jde o nový protein. Použití dvojhybridového testu k dalšímu studiu specifity vazby tohoto proteinu (MORT-1, tj. “Mediator of Receptor-induced Toxicity“) k Fas-IC, a k stanovení konkrétní oblasti Fas-IC, s níž se váže, vedlo k následujícím zjištěním: (a) MORT-1 .se váže k lidskému i myšímu proteinu FAS-IC, nikoli však

Ε

Ϋ'

k několika dalším testovaným proteinům, včetně tří receptorů rodiny TNF/NGF receptorů (p55 a p75 TNF receptory a CD40); (b) substituční mutace v pozici 225 (lle) v 'doméně smrti' FAS-R, o kterých bylo prokázáno, že brání přenosu signálu in vitro i in vivo (mutace IpF⁹ (Watanabe-Fukunaga et al., 1992, Nátuře 356:314-317;

Itoh a Nagata, 1993, J. Biol. Chem. 268:10932-7), rovněž brání vazbě MORT-1 k FAS-IC; (c) vazebné místo pro MORT-1 na FAS-R se nachází uvnitř 'domény smrti' tohoto receptoru; a (d) MORT-1 se může vázat sám k sobě. Tato autoasociace a vazba MORT-1 k FASio R nastává prostřednictvím odlišných oblastí proteinu. Fragment MORT-1 odpovídající zbytkům 1-117 se váže k MORT-1 o plné délce, ale neváže se sám k sobě ani k FAS-IC. Naopak, fragment odpovídající zbytkům 130-245 se váže k FAS-R, neváže se však k MORT-1. Dále se ještě zjistilo, že oblast 'domény smrti' ve FAS-R

15_je kriticky důležitá pro autoasociaci FAS-IC, stejně jako je 'doména_____ smrti' v p55-R nutná k autoasociaci p55-IC. Delece na obou stranách těchto 'domén smrti' neovlivňují jejich schopnost autoasociace, avšak delece uvnitř těchto 'domén smrti' vliv mají. V případě MORT-1 je vazba MORT-1 k FAS-IC rovněž závislá na úplnosti 'domény smrti'

FAS-R, zatímco vazba .k FAS-IC rovněž nezávisí na oblastech vně 'domény smrti' FAS-R.

Interakce proteinů kódovaných rekombinantními plasmidy s GAL4 DNA-vazebnou doménou a s aktivační doménou (pGBT9 a pGAD-GH) v transfekovaných kvasinkách SFY526 byla hodnocena pomocí testu exprese β-galaktosidasý na filtru. Plasmidy s DNAvazebnou doménou zahrnovaly čtyři konstrukce s lidským Fas-IC, čtyři konstrukce myšího Fas-IC včetně dvou o plné délce, které měly lle v pozici 225 mutovaný na Leu nebo Ala (I225L a I225A), a tři konstrukce s MORT-1. Plasmidy s aktivační doménou zahrnovaly tři konstrukce s MORT-1, kde MORT-1 část byla stejná jako v plasmidech s DNA-vazebnou doménou; a konstrukci s lidským Fas-IC o plné délce, kde Fas-IC část byla stejná jako v shora uvedeném plasmidu

-*8ΐ·s DNA-vazebnou doménou. Jako negativní kontroly sloužily plasmidy obsahující GAL4 DNA-vazebnou doménu ve fúzi s intracelulárními doménami lidského p55 TNF receptoru (p55-IC zbytky 206-426), lidského CD40 (CD40-IC, zbytky 216-277) a lidského p75 TNF receptoru (p7.5-IC, zbytky 287-461), a dále s laminem, cyclinem D, a “prázdný“ Gal4 (pGBT9). Jako pozitivní kontrola sloužily SNF1 a SNF4 ve formě plasmidu s DNA-vazebnou doménou (SNF1) a plasmidu s aktivační doménou (SNF4). Jako negativní kontrola ve formě plasmidů s aktivační doménou sloužily rovněž “prázdné“ Gal4 vektory io (pGAD-GH). Symboly “++“ a “+“ použité při prezentaci výsledků získaných shora uvedenou analýzou znamenají vznik tmavé barvy během 30 respektive 90 minut; značí, že během 24 hod nedošlo k vyvinutí barvy.

Exprese MORT-1 molekul fúzovaných na N-konci k FLAG ^{* 20 * * * * 25 * * * * 30 * *}

Ί5—oktapeptidu (FLAG-MORT-1) poskytla v HeLa buňkách—proteiny o čtyřech rozdílných velikostech - přibližně 27, 28, 32 a 34 kDa. Interakce MORT-1 s Fas-IC in vitro byla sledována pomocí imunoprecipitace proteinů z extraktů HeLa buněk transfekovaných plasmidem kódujícím fúzovaný protein FLAG-MORT-1 nebo kontrolní cDNA pro luciferasu,„ přičemž imunoprecipitace se prováděla antiFLAG protilátkou (aFLAG). Interakce in vitro byla též prokázaná mezi

MORT-1 a FAS-IC, kde MORT-1 je ve formě FLAG-MORT-1 fúzovaných proteinů, metabolicky značených [³⁵S]methioninem a získaných z extraktů transfekovaných HeLa buněk, a FAS-IC je ve formě lidských a myších GST-FAS-IC fúzovaných proteinů, včetně mutantního, který má substituci v pozici 225 FAS-IC, přičemž všechny tyto GST-FAS-IC fúzované proteiny byly získány heterologní expresí v E.coli. GST-fúzované proteiny byly nejprve navázány ke kuličkám glutathion-agarosy, pak inkubovány s extrakty obsahujícími MORT-130 FLAG fúzovaný protein a nakonec byla provedena SDS-PAGE s autoradiografickým vyhodnocením. In vitro interakce byla hodnocena podle toho, jak se [³⁵S] metabolicky značený MORT-1,

	··	99	0	99
	• 9	• 9	9 9	9 0	9
	99	9 9	9	0 9	9
	e © ©	© β	9	* 9 0	0
		9 9	00 9	9 9

B produkovaný v transfekovaných HeLa buňkách jako protein fúzovaný k, s FLAG oktapeptidem (FLAG-MORT-1) vázal k GST, GST fúzované í¹ s lidským nebo myším Fas-IC (GST-huFas-IC, GST-mFas-IC), nebo r k GST fúzované s Fas-IC obsahujícím mutaci Ile na Ala v pozici 225.

Bylo prokázáno, že všechny čtyři FLAG-MORT-1 proteiny byly schopné se po inkubaci s GST-Fas-IC fúzovaným proteinem vázat k Fas-IC. Stejně jako v kvasinkovém dvojhybridovém testu se MORT-1 nevázal k GST-Fas-IC fúzovanému proteinu, v němž došlo k substituci v místě Ipf⁵ mutace (I225A).

io Proteiny kódované FLAG-MORT-1 cDNA prokázaly též schopnost vázat se k intracelulární doméně FAS-R, jakož i k intracelulární doméně FAS-R chimerního proteinu, u kterého byla extracelulární doména nahražena extracelulární doménou pocházející z p55-R (p55-FAS chiméra), pokud byly exprimovány společně —--— i? “S^_těmiťo~rečeptory v HeLá^bUňkách. V tomto^-případě, interakce MORT1 s FAS-IC v transfekovaných HeLa buňkách, tzn. in vivo, pozorovaná s imunoprecipitáty z různě transfekovaných HeLa buněk dokládá in vivo interakci a specifitu interakce mezi MORT-1 a FAS-IC v buňkách, jež byly současně transfekovány rekombinantními plasmidy kódujícími tyto proteiny. Takže, v HeLa buňkách byl exprimován a metabolicky značen [³⁵S] cysteinem (20 pCi/ml) a [³⁵S] methioninem (40 pGi/ml) FLAG-MORT-1 fúzovaný protein buď sám nebo společně s lidským FAS-R, FAS-R chimérou, v níž byla extracelulární doména FAS-R nahražena odpovídající doménou i 25 z lidského p55-R (p55-FAS), nebo s lidským p55-R jako negativní

Γ kontrolou. S použitím různých specifických protilátek byla provedena ^ř křížová imunoprecipitace MORT-1 s koexprimovaným receptorem.

Al·,,

Výsledky ukázaly, že FLAG-MORT-1 je schopen vázat se k intracelulární doméně FAS-R, jakož i k intracelulární doméně FAS-Rv „ 30 p55-R chiméry, která má extracelulární doménu z p55-R

I t a intracelulární doménu z FAS-R, pokud je koexprimován s těmito

R í receptory v HeLa buňkách. Dále, imunoprecipitace FLAG-MORT-1 z b

&·

99 9 9· 99

9 9 9 99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 e »99 9 9 · 9 99 9

k řrr·

extraktů transfekovaných buněk vedla i k precipitaci koexprimovaného FAS-R nebo koexprimované p55-FAS chiméry. Naopak, imunoprecipitace těchto receptorů vedla ke koprecipitaci FLAG-MORT-1 proteinu.

' Northernovou analýzou s MORT-1 cDNA jako sondou se v HeLa buňkách prokázal jediný hybridizující transkript. Velikost RNA transkriptu (asi 1,8 kb) pozorovaného při northernové analýze póly A⁺ RNA (0,3 pg) z transfekovaných buněk, s použitím sondy MORT-1 cDNA, je blízká velikosti MORT-1 cDNA (asi 1702 nukleotidů).

io Při analýze sekvence bylo zjištěno, že cDNA obsahuje otevřený čtecí rámec pro asi 250 aminokyselin. Ve shora uvedených spoluvlastněných, společně podaných přihláškách jsou ukázány DNA a aminokyselinové sekvence MORT-1 (viz WO96/18641). V těchto sekvencích je motiv 'domény smrti' podtržený, právě tak jako možný startovací Met zbytek (pozice 49; tučně, podtržené M) a translační stop kodon (hvězdička pod kodonem v pozici 769-771). Tento motiv 'domény smrti' sdílí homologii se známými motivy 'domény smrti' v p55-R a FAS-R (p55DD a FAS-DD). K určení přesného C-konce MORT-1 a k získání důkazůi ohledně přesného N-konce (iniciační Met zbytek) MORT-1 proteinu byly provedeny následující další experimenty:

Pomocí metod shora popsaných byla zkonstruována řada plasmidů, které kódují MORT-1 molekuly fúzované na svých N-koncích k FLAG oktapeptidu (FLAG-MORT-1) a tyto byly exprimovány v HeLa buňkách s metabolickým značením exprimovaných proteinů při použití ³⁵S-cysteinu a ³⁵S-methioninu. FLAG-MORT-1 molekuly byly kódovány následujícími cDNA molekulami, jež obsahovaly různé části MORT-1 kódující sekvence:

i) cDNA pro FLAG oktapeptid připojená k 5' konci MORT30 1 cDNA, z níž byly vypuštěny nukleotidy 1-145;

*«

I « ·· »ί·θ4·_ • · · • ‘· · • · · ·

ř'

ii) cDNA pro FLAG oktapeptid připojená k 5' konci MORT1 cDNA plné délky;

iii) cDNA pro FLAG oktapeptid připojená k 5' konci MORT1 cDNA, z níž byly vypuštěny nukleotidy 1-145 a 832-1701 a v níž kodon GCC v pozici 142-144 byl mutován na TCC, aby se zamezilo startu translace z této pozice.

Po expresi shora uvedených FLAG-MORT-1 fúzovaných produktů byla provedena imunoprecipitace jak uvedeno shora, přičemž byly použity anti-FLAG monoklonální protilátky, nebo jako kontrola io anti-p75 TNF-R protilátky, a poté následovala SDS-PAGE (10% akrylamid) a autoradiografie. Výsledky analýzy se shora uvedenými FLAG-MORT-1 fúzovanými produkty potvrdily C-konec proteinu MORT-1 a poskytly důkaz, že N-konec MORT-1 by mohl být v pozici 49 sekvence. ______

Skutečně, dodatečnými pokusy s expresí MORT-1 bez FLAG oktapeptidu na 5' konci bylo prokázáno, že Met49 slouží jako účinné místo iniciace translace.

Prohledání databází 'Gene Bank' a 'Protein Bank' ukázalo, že v té době v databázích nebyla uložena žádná sekvence odpovídající

2o shora izolované sekvenci MORT-1. MORT-1 tedy představuje nový FAS-IC specifický vazebný protein.

Vysoká exprese p55-IC vede ke spuštění cytocidního účinku (Boldin et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:7795-7798). Exprese Fas-IC v HeLa buňkách měla rovněž takovýto účinek, byť v menší míře, která mohla být detegována pouze citlivým testem. Cytocidní účinky spouštěné nezávisle na ligandu byly tedy analyzovány v buňkách transfekovaných MORT-1, jakož i lidským p55-IC a FAS-IC. Byl hodnocen účinek transientní exprese MORT-1, lidského Fas-IC, lidského p55-IC, nebo luciferasy (jež sloužila jako kontrola) na viabilitu

HeLa buněk, přičemž byl použit expresní vektor, který bylo možné regulovat tetracyklinem. Viabilita buněk byla hodnocena 40 minut po

·· • · f transfekci těchto cDNA molekul společně s cDNA kódující • secernovanou placentální alkalickou fosfatasu, buď v přítomnosti nebo

I nepřítomnosti tetracyklinu (1 gg/ml, k zamezení exprese). Viabilita < buněk byla určena buď testem vitálního barvení s neutrální červení,

- 5 · nebo pro určení viability specificky těch buněk, které exprimují transfekovanou DNA, měřením množství placentální alkalické fosfatasy, jež byla secernovaná do média.

Shora uvedená analýza prokázala, že exprese MORT-1 v HeLa buňkách měla za následek významnou buněčnou smrt, větší než způsobila exprese FAS-IC. Tyto cytotoxické účinky všech, p55-IC, FAS-IC a MORT-1, zřejmě souvisí s oblastí 'domény smrti', která je přítomná vé všech těchto proteinech, přičemž tyto 'domény smrti' mají tendenci autoasociovat a tím možná vyvolávat cytotoxické účinky.

Vzhledem k shora zmíněným vlastnostem MORT-1, jmenovitě schopnosti specifické asociace MORT-1 s onou konkrétní oblastí ve FAS-R, která se účastní indukce buněčné smrti, a skutečnost, že i nepatrná změna struktury této oblasti, která brání přenosu signálu (Ipf⁹ mutace) zároveň brání vazbě MORT-1, naznačuje, že tento protein hraje roli při přenosu signálu vedoučímu k buněčné smrti. Tuto

2o představu dále podporuje i pozorovaná schopnost MORT-1 samotného spouštět cytocidní účinek. MORT-1 tedy může (i) působit jako modulátor autoasociace FAS-R molekul tím, že má sám schopnost vázat se k FAS-R, jakož i sám k sobě, nebo (ii) může sloužit jako vazebná platforma pro další proteiny účastnící se na přenosu signálu ' 25 od FAS-R, tj. MORT-1 může fungovat jako vazebný protein a může : proto vázat jiné receptory kromě FAS-R, nebo (iii) může být součástí jiné signalizační dráhy, která interaguje se signalizační dráhou FAS-R.

i,

Ve snaze dále analyzovat oblasti MORT-1, které se účastní λ» · .

> vazby k FAS-IC a modulace buněčných účinků zprostředkovaných ý 30 FAS-R (modulace cytotoxicity), byly provedeny shora zmíněné ? experimenty, ve kterých byly pro kotransfekce HeLa buněk použity ^L toto » l • to • to ·· • · ’ • to 1 • · » ·· 4 ·· ·· li.

vektory, které kódují samostatně části MORT-1 ('MORT-1 hlava', aminokyseliny 1-117, a 'MORT-1 dd', aminokyseliny 130-245) a vektor, který kóduje lidský FAS-R. V těchto pokusech byly v HeLa buňkách, jež obsahují tetracyklinem regulovaný transaktivátor (HtTA5 1), transientně exprimovány různé proteiny a kombinace proteinů, přičemž sekvence kódující tyto proteiny byly vloženy do expresního vektoru pUHD10-3, který je regulován tetracyklinem. V kontrolních transfekcích byly použity vektory kódující pouze FAS-R a vektory kódující FLAG-55.11 fúzovaný protein (55.11 protein je p55-ICio specifický vazebný protein, jehož část obsahující aminokyseliny 309900 byla fúzována, na svém N-konci, k FLAG oktapeptidu).

Po transfekci a inkubaci bylo na transfekované buňky působeno různými koncentracemi anti-FAS-R monoklonální protilátky (CH-11), která se specificky váže k extracelulární doméně FAS-R ts receptorumexprimOvárTélŤo-bUnkařTriTTáto vazba anti-FAS-R protilátky indukuje agregaci FAS-R na buněčném povrchu (velmi podobně jako FAS-R ligand) a indukuje tak intracelulární signalizační dráhu zprostředkovanou FAS-IC, což v důsledku vede k buněčné smrti (FAS-R zprostředkovaná buněčná cytotoxicita). Koncentrace anti-FAS20 R monoklonální protilátky (CH-11) se pohybovaly v rozmezí 0,001-10 Hg/ml, obvykle 0,005; 0,05; 0,5 a 5 pg/ml. Buňky byly inkubovány s anti-FAS protilátkou v přítomnosti 10 μg/ml cycloheximidu.

Výsledky shora uvedené analýzy ukazují, že exprese FAS-R v transfekovaných buňkách dodává buňkám zvýšenou citlivost vůči cytocidním účinkům anti-FAS-R protilátek. Dále, kóexprese FASR a oblasti MORT-1, jež obsahuje oblast homologie s 'doménou smrti', výrazně brání buněčné smrti indukované FAS ligandem (t.j. zprostředkované FAS-R), jak lze očekávat ze schopnosti 'domény smrti' (DD) MORT-1 proteinu vázat sek 'doméně smrti' FAS-R (FASi

3o DD). Dále, kóexprese N-koncové části MORT-1 a FAS-R nebrání • ·· · ·· ·· ·· · · · · ·· · · · · • ·· ··· ···· ·· · · · · · ·· ·· · • _«· · ·· · ···* •*•87·- ·· ··· ·· ·« buněčné smrti zprostředkované FAS-R a spíše poněkud cytotoxicitu (tj.pozoruje se mírně zvýšená buněčná smrt).

Tyto výsledky tedy jasně naznačují , že MORT-1 má dvě odlišné oblasti. Dokud ide o vazbu k řr

s.

ř

zvyšuje protein FAS-IC a zprostředkování buněčné cytotoxické aktivity FAS-ÍC.

Tyto výsledky proto též poskytují základ pro využití různých částí (tj. aktivních fragmentů nebo analogů) MORT-1 proteinu v různých farmaceutických aplikacích. Analogy nebo fragmenty MORT-1 proteinu nebo jejich deriváty, které v podstatě obsahují pouze C10 koncovou část MORT-1 včetně jeho 'domény smrti', mohou být například použity k inhibicí cytotoxických účinků zprostředkovaných FAS-R v buňkách nebo tkáních obsahujících FAS-R a tím chránit tyto buňky nebo tkáně před škodlivými účinky FAS-R ligandu, například v případech akutní hepatitidy. Naopak, analogy nebo fragmenty

MORT-1 proteinu nebo jejich deriváty, které v podstatě obsahují pouze N-koncovou část MORT-1 mohou být použity k zvýšení cytotoxických účinků zprostředkovaných FAS-R v buňkách nebo tkáních obsahujících FAS-R a tím vést ke zvýšené destrukci těchto buněk nebo tkání je-li to žádoucí, například v případě nádorových

2o buněk nebo autoreaktivních buněk T a B. Jak je zde shora podrobně rozvedeno, tato použití rozdílných částí MORT-1 mohou být realizována s použitím různých rekombinantních virů (např. Vaccinia), pomocí kterých lze vnést sekvenci kódující danou oblast MORT-1 do konkrétních buněk nebo tkání, jejichž léčba je žádoucí.

Dále je též možné připravit a použít různé jiné molekuly, jako například protilátky, peptidy a organické molekuly, které mají sekvence nebo molekulární struktury odpovídající shora uvedeným oblastem MORT-1, s cílem dosáhnout stejných účinků jaké zprostředkovávají tyto MORT-1 oblasti.

Kromě toho může být MORT-1 využit k specifické identifikaci, izolaci a charakterizaci dalších proteinů, které jsou schopné vázat se

k MORT-1 (tj. MORT-1- vazebné proteiny); viz Odkazové Příklady 2 a 3.

ODKAZOVÝ PŘÍKLAD 2: Izolace MORT-1 vazebného proteinu (i) Dvoihybridová analýza a dvoihybridovv test exprese_[T gaiaktosidasy

Analogicky s postupem popsaným v Odkazovém Příkladu 1, byla dvojhybridovým testem, s použitím intracelulární domény p55 TNF-R (p55 IC) a MORT-1 jako “návnad“, analyzována lidská cDNA knihovna připravená z buněk B . Byly získány dva cDNA klony, které kódují proteinový produkt, jenž je schopný vázat se k MORT-1 i k p55IC. U obou klonů byla zjištěna identická nukleotidové sekvence na 5'konci (viz spoluvlastněné, společně podané WO96/18641 a PCT/US96/10521).

(ii) Vazebné vlastnosti nově klonované cDNA; dvoihybridová analýza

Ke zjištění vazebné specifity nového MORT-1-vazebného proteinu byl ve shora zmíněném kvasinkovém dvojhybridovém testu použit jako “kořist“ plasmid obsahující cDNA pro tento nový MORT-1vazebný protein, a v samostatných pokusech k němu byla přidávána řada “návnad“. Tyto “návnady“ zahrnovaly plasmidové konstrukce kódující MORT-1, části MORT-1 (MORT 'hlavu', aa 1-117, MORT 'ocas', aa 130-245), p55 IC (206-426 p55) nebo jeho části ('doména smrti', 326-426 p55; a další úseky z oblasti předcházející 'doménu smrti', tj. 206-326). Výsledky jsou uvedeny níže v Tabulce 2.

TABULKA 2

Návnada

Exprese β-galaktosidasy

MORT-1	+++
130-245 MORT-1	+
1-117 MORT-1	-
206-426 p55	+++
326-426 p55	+++
206-326 p55	-
206-308 p55	-
206-345 p55	-
p55 L35INI	-
Fas IC	-
233-319 Fas	-
p75 IC	-
CD40 IC	-
pGBT10	-
SNF1	-
cyklin D	-
lamin	-

Shora uvedené výsledky stanovení vazby klonu k velkému | panelu návnad v dvojhybridovém testu exprese β-galaktosidasy potvrdily, že protein kódovaný tímto klonem se specificky váže k doménám smrti jak v p55 TNF-R tak v MORT-1.

F Obecně, MORT-1-vazebný protein může být využit přímo k modulaci nebo zprostředkování účinků na buňky spojených s * MORT-1 nebo nepřímo, k modulaci nebo zprostředkování účinku FASc [ R ligandu na buňky, je-li tento účinek modulován nebo zprostředkován £

í r

tí' proteinem MORT-1. Totéž platí i pokud jde o další intracelulární proteiny nebo intracelulární domény transmembránových proteinů, jak bylo zde konkrétně prokázáno pro p55 TNF-R.

MORT-1-vazebné proteiny zahrnují proteiny, které se specificky 5 vážou k celému MORT-1 proteinu, nebo proteiny,' které se vážou k rozdílným oblastem MORT-1 proteinu, např. k zde shora uvedeným N- a C-koncovým oblastem MORT-1. MORT-1-vazebné proteiny, které se vážou specificky k takovýmto oblastem mohou být použity k modulaci aktivity těchto oblastí a tudíž specifických aktivit MORT-1 určovaných těmito oblastmi.

ODKAZOVÝ PŘIKLAD 3: Izolace a charakterizace MACH Proteinu.

dalšího MORT-1 vazebného proteinu (i) Dvoihybridová analýza, dvoihvbridovy test exprese_[U galaktosidasy, sekvenování a analýza sekvence

Podle postupu vyloženého ve shora uvedených Odkazových Příkladech 1 a 2 byl v kvasinkovém dvojhybridovém systému, s použitím plasmidové konstrukce kódující plnou délku lidského proteinu MORT-1 jako “návnady“, izolován cDNA klon kódující další nový MORT-1-vazebný protein. Tento nový protein byl původně označen jako MORT-2 a nyní byl, na základě svých vlastností, níže zdě podrobněji rozvedených, přejmenován na MACH (MORT-1 associated CED3 homolog).

Sekvence tohoto cDNA klonu byla určena standardními postupy, uvedenými shora v Odkazových Příkladech 1 a 2. Rozbor sekvence standardními postupy a počítačovými programy (viz Odkazové Příklady 1 a 2) ukázal, že tato cDNA představuje novou sekvenci a že kóduje nový protein (ani DNA, ani aminokyselinová sekvence nebyly nalezeny v databázích GENBANK nebo PROTEIN BANK). Dále,

3o v cDNA kódující MACH byl nalezen otevřený čtecí rámec ORF-B, který

má vysokou homologii s oblastí předcházející (směrem 5') motiv 'domény smrti' v proteinu MORT-1 (viz Odkazový Příklad 1). Ve spoluvlastněných, společně podaných Israelských Přihláškách No. 114615, 114986, 115319, 116588 a 117932 jakož i v jim odpovídající

POT přihlášce No. PCT/US96/10521 je uvedena struktura části MACH cDNA klonu, jež obsahuje ORF-B (235 aminokyselinových zbytků); odvozená aminokyselinová sekvence MACH ORF-B; a nukleotidová sekvence MACH cDNA. Oblast ORF-B sdílí vysokou homologii s oblastí MORT-1 předcházející v MORT-1 motiv 'domény smrti'.

io Kvasinkový dvojhybridový test byl dále použit k prozkoumání specifity vazby MACH k MORT-1, zejména k vymezení oblasti v MORT-1, ke které se MACH váže, ak určení, který z otevřených čtecích rámců (ORF) MACH interaguje s MORT-1; použité postupy byly jak shora uvedeno v Odkazových Příkladech 1 a 2. Ve stručnosti,

As byly připraveny různě plasmidové^-”konstrukce s MORT-1, MACH, GAL4 DNA-vazebnou doménou a aktivační doménou a testovány na interakci proteinů v transfekovaných SFY526 kvasinkových buňkách; interakce byla hodnocena pomocí exprese β-galaktosidasy v testu na filtru. Plasmidové konstrukce sDNA-vazebnou doménou byly připraveny ve vektorech pGBT9 a plasmidy s aktivační doménou ve vektorech pGAD-GM. Do konstrukcí s aktivační doménou byla zaklonována cDNA pro MACH o plné délce (MACH), jakož i pouze pro ORF-B oblast (MACH B). Kontrolní plasmidové konstrukce s aktivační doménou obsahovaly kódující sekvenci pro MORT-1 plné délky (MORT-1, pozitivní kontrola), anebo neměly žádný insert, tj. byly to “prázdné“ vektory (pGAD-GM). Do plasmidových konstrukcí s DNAvazebnou doménou byly zařazeny cDNA pro MORT-1 plné délky (MORT-1), nebo cDNA kódující pouze přední část MORT-1 (MORT-1 DD, aa 130-245). Kontrolní plasmidové konstrukce s DNA30 vazebnou doménou, jež byly připraveny k určení specifity MACH vazby, zahrnovaly konstrukce kódující lamin (Lamin), aminokyselinové zbytky 287-461 intracelulární domény lidského p75 TNF-R (lidský p75 •· · · · ·· ·· • · · · · · · * * «

IC), cyklin D (cycD), SNF1, aminokyselinové zbytky 206-426 intracelulární domény lidského p55 TNF-R (lidský p55 IC), oblast 'domény smrti' v intracelulární doméně lidského FAS-R (lidský Fas DD), aminokyselinové zbytky 216-277 intracelulární domény lidského s CD40 (lidský CD40 IC), vektory bez insertu tj. “prázdné“ pGBT9 ^ř vektory (pGBT9, negativní kontrola), a ORF-B oblast proteinu MACH (MACH Β). V testu se hodnotil vznik zabarvení: čím větší zabarvení, tím větší interakce mezi proteiny kódovanými z plasmidových konstrukcí s DNA-vazebnou doménou a s aktivační doménou. Vývin io barvy byl znázorněn symboly, přičemž “+++“ a “+“ značí vznik tmavé barvy během 30 respektive 90 min testu, a značí, že během 24 hod

I testu nedošlo ke vzniku zabarvení. U kombinací, kde se interakce ί netestovala, není žádný symbol. Výsledky různých interakcí £ nalezených pro shora uvedený případ jsou uvedeny níže v Tabulce 3.

L--—-15—Výsledky různých interakcí isoforem MACH jsou uvedeny ve shora zmíněné spoluvlastněné, společně podané PCT/US96/10521 ajejich

IL protějšcích.

TABULKA 3 <* /

Hybrid aktivační domény

Hybrid DNA-vazebné domény	MACH	MACH B	MORT-1	pGAD-GH
MORT-1	+++	+++	+++	—
Vazebná oblast v MORT-1
MORT1 (-117)
MORT1 DD (130-245)	—	—
Testv soecifitv

Τ' $:

ί>

• ·

Lamin	___	—
lidský p75 IC	—
cyc D
SNF1
lidský p55 IC
lidský FAS DD	___
lidský CD40 IC	—
pGBT9	—
MACH B		+	+

__Z výsledků ukázaných v Tabulce 3 shora je tedy zřejmé, že____ (a) MACH se váže k MORT-1 velmi silně a specificky;

(b) Vazebné místo pro MACH v molekule MORT-1 se 5 nachází před motivem 'domény smrti' v MORT-1, tj. je v oblasti

MORT-1 ohraničené aminokyselinovými zbytky 1-117;

(c) ORF-B oblast MACH je ta oblast proteinu MACH, která interaguje s MORT-1; a (d) Oblast ORF-B proteinu MACH je schopná to autoasociovat.

(ii) Cytotoxické účinky zprostředkované schopností proteinu

MACH autoasociovat

Zjištění, že MACH se může vázat sám se sebou (autoasociovat), 15 zvláště pak, že oblast ORF-B proteinu MACH je schopná autoasociovat a dřívěji nalezená korelace mezi autoasociací a buněčnou cytotoxicitou, jež byla pozorována pro intracelulární domény p55 TNF-R a FAS-R, a jak bylo pozorováno pro MORT-1 (viz ί

φ * φ · φφφφ · « · · φ ·· φφφ φφφφ

Φ O ΦΦΦ φ φ φφ β β Φ • · · Φ-Λ Φ φφφφ φφ· φ· - 94 -*·· ·· ··

Odkazový Příklad 1), naznačují, že autoasociace proteinu MACH může rovněž hrát roli v buněčné cytotoxicitě.

K otestování této možnosti byly připraveny plasmidové konstrukce kódující MACH v expresním vektoru regulovaném tetracyklinem (podrobnosti viz Odkazový Příklad 1). Tyto plasmidy byly po transfekci HeLa buněk transientně exprimovány. Vedle plasmidů nesoucích MACH byly použity i další kontrolní plasmidy a byly porovnány účinky jejich transientní exprese na viabilitu HeLa buněk. Tyto další konstrukce zahrnovaly MORT-1, lidský FAS-IC io a luciferasu (Luc). Dále byly sledovány i účinky kotransfekce HeLa buněk plasmidy exprimujícími MORT-1 a MACH, aby se zjistilo, jaké důsledky bude mít interakce těchto dvou proteinů. Po transfekci byly buňky inkubovány a 48 hodin po transfekci byla hodnocena viabilita buněk inkubovaných v přítomnosti nebo nepřítomnosti tetracyklinu iš (1pg/ml), jehož přítomnost blokuje expresi. Viabilita buněkbýlá stanovena pomocí testu vitálního barvení s neutrální červení.

Z výsledků shora uvedené analýzy bylo zřejmé, že MACH indukuje v HeLa buňkách dramatický cytotoxický účinek, tj., že indukovaná nadprodukce MACH v HeLa buňkách vede k dramatickému cytotoxickému účinku. Tento cytotoxický účinek pravděpodobně souvisí se schopností MACH proteinu autoasociovat.

(iii) Northernová analýza

S použitím dobře známých postupů (viz Odkazový Příklad 1) 25 byla provedena v několika buněčných iiniích northernová analýza, s MACH cDNA jako sondou. Výsledky této analýzy ukázaly, že ve velkém počtu buněčných linií, zvláště CEM, Ráji, Daudi, Hela, Alexander, Jurkat, a A673, se vyskytují dva hybridizující transkripty o přibližné velikosti 3,2 kb.

• 9

Vzhledem k shora uvedenému, může být MACH protein využit přímo k modulaci nebo zprostředkování účinků na buňky spojených s MORT-1, nebo nepřímo k modulaci nebo zprostředkování účinku FAS-R ligandů na buňky, pokud je tento účinek modulován nebo zprostředkován proteinem MORT-1. Skutečnost, že MACH se specificky váže k přední části MORT-1 a že sdílí homologii s MORT-1, dává možnost specifického použití MACH nebo MACH ORF-B na modulaci této specifické oblasti MORT-1 a tudíž specifické aktivity MORT-1 touto oblastí podmíněné. Dále, MACH nebo MACH ORF-B může být použit jako modulátor nebo mediátor intracelulárních účinků analogickým způsobem jako MORT-1 sám (viz výše), na základě schopnosti MACH proteinu autoasociovat a indukovat buněčnou cytotoxicitu samostatně.

Další analýzy MACH proteinu a DNA sekvencí, jež jej kódují,

Tě bylý^prove^děhyjakjezděiiíže^_uve'denO^Dále^_byjo^_zjištěno7-že-MACH ORF-B představuje jednu z mnoha isoforem MACH. MACH protein a DNA sekvence, jež jej kódují, byly tudíž přejmenovány, jak vyplyne z následujícího.

(a) Dvoihybridová analýza vyhledávající proteiny vážící se k MORT-1 odhalila novy protein, který sdílí sekvenční motiv s MORT-1:

Jak bylo zmíněno shora; k identifikaci proteinů podílejících se na indukci buněčné smrti proteinem MORT-1 byla použita dvojhybridová technika, pomocí které se v cDNA knihovnách vyhledávají proteiny, jež se vážou k MORT-1. Dvojhybridová analýza lidské cDNA knihovny z B buněk (Durfee et al., 1993, Genes Dev. 7:555-569), při které byla použita MORT-1 cDNA jako návnada, vedla k izolaci cDNA klonů samotného MORT-1, což odráží schopnost tohoto proteinu autoasociovat, a dále klony TRADD, k nimž se MORT-1 účinně váže (viz Odkazový Příklad 2). Analýza rovněž poskytla cDNA klony s novou • ·

-·9δ 1/

r.

sekvencí, jejichž produkt se specificky vázal k MORT-1. Protein, který byl původně nazván MACH, a později, když bylo zjištěno, že se vyskytuje v četných isoformách (viz níže), byl přejmenován na MACHpi, prokázal v dvojhybridovém testu rovněž schopnost vázat se sám k sobě, nebyl však schopen vazby k FAS-R (viz shora uvedenou spoluvlastněnou, společně podanou PCT/US96/10521, která též zahrnuje všechny následující analýzy a výsledky z nich získané).

Do kvasinek SFY526 byly transfekovány a v nich exprimovány plasmidové konstrukce s GAL4 DNA-vazebnou doménou a s aktivační doménou (pGBT9 a pGAD-GH), nesoucí MORT-1 a MACHpi a jejich deleční varianty, dále též MACHal, mutovaný MACHal, ve kterém byl katalytický cystein Cys360 nahražen serinem (MACHal (C360S)) a intracelulární doménu lidského FAS-R (Fas-IC). Interakce proteinů byly hodnoceny v testu exprese β-galaktosidasy na filtru jak je popsáno v Boldin et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:7795-7798. Výsledky jsou vyjádřeny jako čas potřebný ke vzniku silného zabarvení. Žádný ze zkoušených insertů nevykázal interakci se žádnou z celé řady použitých negativních kontrol, které zahrnovaly intracelulární domény lidského p55 TNF receptorů, p75 TNF receptorů a CD40, dále lamin, cyklin D a “prázdné“ Gal4 vektory. MACHpl byl identifikován při dvojhybridové analýze lidské cDNA knihovny z B buněk (Durfee et al., 1993, Genes Dev. 7:555-569) hledající proteiny, jež se vážou k MORT-1, s použitím HF7c kvasinkového reportérového kmene. Všechny experimentální postupy, kromě těch, kde je vyznačeno jinak, byly jak je uvedeno shora (viz též Boldin et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:7795-7798). Deleční analýza ukázala, že MACHpise váže k N-koncové části MORT-1, která je zapojena do indukce buněčné smrti (Chinnaiyan et al., 1995, Cell 81:505-512). ΜΑΟΗβΙ se v transfekovaných kvasinkách též vázal sám k sobě. Nevázal se však k několika kontrolním proteinům a na rozdíl od MORT-1 se nebyl schopen vázat k FAS-R. Exprese ΜΑΟΗβΙ molekul

I • ·

If,

v savčích buňkách poskytla 34kDa protein, který se vázal ke koexprimovaným molekulám MORT-1. ΜΑΟΗβΙ byl rovněž schopen vázat se in vitro k fúzovanému GST-MORT-1 proteinu.

Porovnání aminokyselinových sekvencí ΜΑΟΗβΙ a MORT-1 5 odhalilo v těchto dvou proteinech sdílený sekvenční motiv (označený “Mort modul“), který je odlišný od motivu domény smrti, jehož prostřednictvím se MORT-1 váže k FAS-R. Tento motiv se vyskytuje jednou v MORT-1 a dvakrát v ΜΑΟΗβΙ. Stejný motiv byl nalezen ivPEA-15, což je astrocytový fosfoprotein neznámé funkce.

Předběžná data nasvědčují, že MORT motiv se účastní vazby ΜΑΟΗβΙ (a dalších MACH isoforem) k MORT-1.

Odvozená aminokyselinová sekvence ΜΑΟΗβΙ je prezentována ve shora uvedené PCT/US96/10521 a odpovídajících IL protějšcích, _zejména II—117932.—Ukázány jsou dva MORT moduly a označeny jsou C-konce dvou použitých delečních mutantů ΜΑΟΗβΙ. Sekvenční homologie modulů v ΜΑΟΗβΙ, MORT-1 a genu PEA-15 (přírůstkové číslo X86809) byla rovněž prezentována ve shora uvedených spoluvlastněných, společně podaných přihláškách, kde jsou identické a podobné zbytky označeny zarámováním respektive stínováním.

Ve shora uvedených spoluvlastněných přihláškách je též prezentována formou diagramu doména smrti, MORT moduly, a oblast CED3/ICE homologie v FAS/APO1, ΜΑΟΗβΙ a MACHal.

Oblast v MORT-1, obsahující tento 'MORT modul', se podílí na indukci buněčné smrti tímto proteinem (viz Odkazový Příklad 1 shora). Bylo prokázáno, že též přispívá, i když sama nepostačuje, k autoasociaci MORT-1 (viz Odkazový Příklad 1). Analýza vazebných vlastností delečních mutantů ΜΑΟΗβΙ v transfekovaných kvasinkách ukázala podobnou účast MORT modulů v autoasociaci ΜΑΟΗβΙ, jakož i v jeho vazbě k MORT-1: ΜΑΟΗβΙ molekuly, kterým chyběla oblast za

MORT modulem (směrem 3'), se nebyly schopné vázat k sobě φ φ ί· ζ*;^;

1'

navzájem, zachovaly si však schopnost vázat se k MORT-1 o plné délce a k ΜΑΟΗβΙ o plné délce. Další zkracování, při kterém byla deletována i část MORT modulu, vedlo ke ztrátě vazebné schopnosti proteinu. Účast MORT modulů v těchto interakcích byla dále studována tak, že deleční mutanty ΜΑΟΗβΙ, fúzované s FLAG oktapeptidem (FLAG- ΜΑΟΗβΙ), byly exprimovány v HeLa buňkách a zkoušeny na vazbu in vitro s bakteriálně připraveným fúzovaným proteinem glutathion-S-transferasa-MORT-1 (GST-MORT-1). Podobně jako u kvasinkového dvojhybridového testu, tato in vitro vazba závisela na interakci oblasti uvnitř ΜΑΟΗβΙ modulů. V transfekovaných HeLa buňkách byly připraveny [³⁵S]- metabolicky značené ΜΑΟΗβΙ, ΜΑΟΗβΙ fúzovaný na N-konci k FLAG oktapeptidu (FLAG-ΜΑΟΗβΙ), FLAG-ΜΑΟΗβΙ mutanty zkrácené na C-konci, a luciferasa jako kontrola. Pro expresi byl použit expresní vektor regulovaný tetracyklinem a klon HeLa buněk (HtTA-1), který exprimuje tetracyklinem regulovaný transaktivátor.

Hodnocení exprese proteinů a jejich molekulové hmotnosti vycházelo z imunoprecipitace buněčných lysátů s použitím anti-FLAG protilátky. Použity byly následující protilátky: králičí anti-ΜΑΟΗβΙ aanti-MORT1 antiséra byla připravena proti GST-ΜΑΟΗβΙ a GSTMORT1 fúzovaným proteinům. Myší monoklonální protilátky proti FLAG oktapeptidu (M2) a proti FAS/APO1 (CH11, Yonehara et al., 1989, J. Exp. Med. 169:1747-1756) byly koupeny od Eastman Kodak respektive Oncor (Gaithersburg, MD). Myší monoklonální protilátka proti HA epitopu (12CA5, Field et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8:21592165) a anti-TNF protilátka byly připraveny v naší laboratoři obvyklým postupem, dobře známým v oboru. Ve shora uvedených, spoluvlastněných, společně podaných přihláškách, zejména v PCT/US96/10521a IL 117932, jsou prezentovány výsledky ukazující afinitní vazbu proteinů k GST-MORT-1 adsorbovanému ke kuličkám glutathion-agarosy (nebo v kontrolách, vazbu k GST nebo k GST

fúzovaným s intracelulární doménou Fas-APO1) a dále výsledky imunoprecipitací různých MORT-1 a MACH fúzovaných produktů s použitím různých specifických protilátek.

(b) MACH se vyskytuje v četných isoformách:

Northernová analýza s ΜΑΟΗβΙ cDNA jako sondou prokázala

L v několika různých buněčných liniích málo zastoupený transkript(y)

I, 10 o přibližné velikosti 3 kb. Ve stručnosti, byla provedena northernová r;

K analýza celkové RNA (14 μρΛίΓέίΐθ) nebo póly A⁺ RNA (2H.g/dráha)

h. izolovaných z několika buněčných linií a s použitím ΜΑΟΗβΙ cDNA jako sondy. Použité buněčné^ linie T47D, OEM, Ráji, Daudj, .HeLa,

Aleksander, Jurkat a A673, jsou všechny lidského původu a byly odvozeny z karcinomu vývodu mléčné žlázy, respektive akutní lymfoblastické T-buněčné leukemie, respektive Burkittova lymfomu, ’ respektive Burkittova lymfomu, respektive epiteloidního carcinomu, ' respektive lidského hepatomu, respektive akutní T-buněčné leukemie,

V respektive rabdomyosarkomu. Poměrně difúzní tvar hybridizujícího 20 pruhu na northernových přenosech naznačuje, že se jedná o transkripty heterogenní velikosti v rozmezí 2,85 až 3,5 kb. Množství i velikosti transkriptů se mezi jednotlivými lidskými tkáněmi lišily a nekorelovaly s expresí MORT-1 nebo FAS/APO1 (Watanabe et al., * 1992, J. Immunol. 148:1274-1279). Například ve varleti a kosterním ’* * 25 svalu jsou MACH transkripty stěží detégovatelné, přestože tyto tkáně * exprimují významná množství MORT-1. Naopak, klidové mononukleární leukocyty periferní krve, ve kterých je exprese MORT-1 velmi nízká, měly vysokou hladinu exprese MACH. Aktivace leukocytů ; lektinem vedla, souběžně s indukcí MORT-1, k výrazné změně profilu p 30 velikostí MACH transkriptů.

• e

- Ί·θί) >·«

Pro pochopení povahy této velikostní heterogenity, byly v cDNA knihovnách hledány transkripty hybridizující s ΜΑΟΗβΙ cDNA sondou. Takto byly nakloňovány MACHal a MACHa2 z Charon BS cDNA knihovny připravené z mRNA lidského thymu. Knihovna byla hybridizována za stringentních podmínek s ΜΑΟΗβΙ cDNA sondou, značenou pomocí soupravy s náhodnými primery (Boehringer

I Mannheim). Další MACH isoformy byly nakloňovány pomocí RT-PCR na celkové RNA z lidských lymfoblastoidních buněk Ráji (MACHal, a2, a3, β3 a β4) a Daudi (MACHa2, β2, β3, β4 a β5). Reversní transkripce byla provedena s oligo-dT adapterovým primerem (5'GACTCGAGTCTAGAGTCGAC(T)₁₇-3') a SuperScript II reversní transkriptasou (GIBCO-BRL) podle pokynů výrobce. První kolo PCR bylo provedeno s použitím soupravy Expand Long Template PCR System (Boehringer Mannheim) a s následujícími sense a antisense rs primery: 5'-AAGTGAGCAGATCAGÁÁTTGAG-3', odpovídajícím nukleotidům 530-551 v ΜΑ^β1 cDNA, respektive 5'GACTCGAGTCTAGAGTCGAC-3'. Druhé kolo bylo provedeno s Vent polymerasou (NEB) a s následujícími sense a antisense vnitřními (nested) primery: 5'-GAGGATCCCCAAATGCAAACTGGATGATGAC20 3', respektive 5'-GCCACCAGCTAAAAACATTCTCAA-3', odvozenými z

ΜΑΰΗβΙ cDNA sekvence. Aby se potvrdilo, že ΜΑΰΗβ3 a ΜΑΟΗβ4 mají iniciační kodony, bylo z RNA Ráji buněk nakloňováno pro tyto isoformy více sekvence směrem k 5' konci. Po RT-PCR reakci s oligodT adapterovým primerem provedené jak bylo výše popsáno, * 25 následovala dvě kola PCR (s Vent polymerasou (NEB)) s použitím následujících sense a antisense primerů: 5'TTGGATCCAGATGGACTTCAGCAGAAATCTT-3' a 5'ATTCTCAAACCCTGCATCCAAGTG-3', odvozených ze sekvence ΜΑϋΗβΙ. Posledně uvedený oligonukleotid je specifický pro β_ř 30 isoformy. Z klonů takto získaných byly úplně ošekvenovány ty, u kterých byly nalezeny nukleotidy kódující aminokyseliny tzv. 'bloku í .

ř

- >01

Λ

5,

S' ř

b

L >

iI

2' (jehož přítomností se odlišují ΜΑ0Ηβ3 a ΜΑ0Ηβ4 od ΜΑΟΗβΙ a ΜΑ0Ηβ2). Nukleotidové sekvence všech klonovaných isoforem byly stanoveny v obou směrech dideoxy terminační metodou. Pro MACHa3 a ΜΑΟΗβ2 byly získány pouze parciální cDNA klony. Celá tato analýza

5' prokázala existenci četných isoforem MACH proteinu. Podrobněji byly studovány aminokyselinové sekvence sedmi těchto isoforem. Výsledky jsou doloženy příklady a formou diagramu ve shora uvedených spoluvlastněných, společně podaných přihláškách, zejména PCT/US96/10521 a IL 117932, kde jsou aminokyselinové sekvence tří io isoforem porovnány se známými homology.

Nepřítomnost 65 nukleotidů, kódujících v MACHal 'blok 2', způsobuje v ΜΑΟΗβΙ á ΜΑΟΗβ2 změnu čtecího rámce pro nukleotidy kódující 'blok 3'. Tyto nukleotidy proto v těchto isoformách kódují jiné aminokyseliny, které tak tvoří unikátní C-koncovou oblast. V ΜΑΟΗβ3_ a ΜΑΟΗβ4 je sice zachován čtecí rámec bloku 3, ale nepřítomnost nukleotidů, kódujících CED3/ICE oblast, a části 3'-nekódující oblasti, má za následek změnu čtecího rámce následujících nukleotidů dále níže. Díky této změně čtecího rámce je v 3'-nekódující oblasti, nejvíce směrem k jejímu 5' konci, kódováno 10 aminokyselin, které tak

2o vytvářejí C-koncovou oblast unikátní pro tyto dvě isoformy.

Isoformy byly nakloňovány z lidské cDNA knihovny připravené z B buněk (ΜΑΟΗβΙ), z lidské thymové cDNA knihovny (MACHal a a2) azmRNA lidských lymfoblastoidních buněk Řaji (MACH2a1, a2, α3, β3, β4 a β5) a Daudi (MACHa2, β2, β3, β4 a β5). Klonování . z mRNA buněk Ráji a Daudi bylo provedeno pomocí RT-PCR, s použitím oligonukleotidů odpovídajících 3'-nekódující oblasti a sekvenci uvnitř druhého MORT modulu v MACH β1. Iniciační kodon je tedy u klonů izolovaných tímto způsobem lokalizován uvnitř druhého MORT modulu.

3o Sekvence různých isoforem jsou vůči sobě navzájem v následujícím vztahu: (a) Všechny MACH isoformy sdílejí společnou, • 44 ♦ · 4 44 44

4 4 4 « 44 « 4 4' ·

44 44 4 4 4 44 t*

X

182 aminokyselin velkou N-koncovou oblast, která zahrnuje MORT moduly, liší se však směrem ke karboxy koncům (směrem 3' od těchto modulů), jakož i v nekódujících oblastech, (b) Podle C-koncových sekvencí lze isoformy rozdělit do dvou podskupin: čtyři isoformy definované jako podskupina β, mají odlišné C-konce v důsledku změn čtecího rámce. Dvě (MACH β1 a β2) mají stejný C-konec, který byl zjištěn v isoformě původně nalezené a klonované dvojhybridovou analýzou, a dvě isoformy (MACH β3 a β4) sdílejí odlišný C-konec; tři isoformy, definované jako podskupina a, mají mnohem delší io C-koncovou oblast, jež silně připomíná proteasy CED3/ICE rodiny (viz níže); (c) Úseky mezi oblastí MORT modulu a C-koncovou oblastí, která definuje podskupiny, se liší od isoformy k isoformě. Podrobnější vyšetření však ukázalo, že tyto intermediární oblasti sestávají z různých kombinací stejných tří aminokyselinových bloků (bloky 1,2 a

Ί5-—3-);—RozdílnOsti“vaminOkyselinových“s“ekvencích“m“ezÍ“njzřrými“‘kloňy“ odrážejí dva typy změn v nukleotidové sekvenci, - k nimž nejpravděpodobnějí dochází v důsledku alternativního sestřihu; (a) inserce nebo nepřítomnost jednoho ze dvou nukleotidových úseků, 45 respektive 65 nukleotidů dlouhých, nebo obou, v oblasti za nukleotidy kódujícími Lys184; (b) přítomnost dalšího insertu uvnitř oblasti, která v ΜΑΟΗβΙ vytváří 3'-nekódující úsek. Tyto změny ovlivňují čtecí rámec i délku proteinu.

Některé MACH isoformy obsahují úsek homologní s CED3/CE. Průzkum databází odhalil, že C-koncová oblast v MACHa isoformách, včetně bloku 3 a sekvencí následujících , po něm, velmi připomíná proteasy CED3/ICE rodiny. Sekvence této části MACH byla porovnána s různými známými lidskými členy této rodiny, jakož i s Caenorhabditis elegans ced3 proteinem (Ellis a Horvitz, 1986, Cell 44:817-829; Yuan et al., 1993, Cell 75:641-652) a známými lidskými proteasami

CED3/ICE rodiny: CPP32 (Fernandes-Alnemri et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:30761-30764), též zvaný apopain (Nicholson et al., 1995,

i)

· t©3 -··

Nátuře 376:37-43) a Yama (Tewari et al., 1995b, Cell 81:1-20), Mch2a (Fernandes-Alnemri et al., 1995, Cancer Res. 55:2737-2742), lch-1 (Wang et al., 1994, Cell 78:739-750; lidský homolog myšího Nedd2 proteinu, Kumar et al., 1994, Genes Dev. 8:1613-1626), ICE_reill (Munday et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:15870-15876) též zvaný TX a Ich2 (Faucheu et al., 1995, EMBO J. 14:1914-1922; Kamens et al, 1995, J. Biol. Chem. 270:15250-15256) a ICE (Thornberry et al., 1992, Nátuře 356:768-774; Cerreti et al., 1992, Science 256:97-100).

Shora uvedená C-koncová oblast MACH se nejvýrazněji podobá io CPP32 (41% identity a 62% homologie) a CED3 (34% identity a 56% homologie). Významně nižší podobnost vykazuje k ICE (28% identity a 50% homologie) ak jeho blízce příbuzným homologům ICE_reiH (též nazývaným TX a Ich2) a ICE_reilll. Podobnost byla pozorována téměř v celé délce oblasti, počínaje Tyr226 v bloku 3 až k C-konci MACHa isoforem. ' ~

Dva aspekty podobnosti jsou zvláště pozoruhodné:

(a) Všechny známé proteasy CED3/CE rodiny štěpí proteiny v místech, pro která je charakteristický výskyt Asp v P1 pozici a zbytku malé hydrofobní aminokyseliny v ΡΓ. Jejich specifita se však liší pokud jde o další strukturní prvky substrátu, včetně povahy zbytků v pozicích P2-P4. Aminokyselinové zbytky aktivního místa, které se účastní katalýzy (odpovídající His237, Gly238 a Cys285 v ICE), a zbytky vytvářející vazebnou kapsu pro karboxylový postranní řetězec P1 Asp (Arg179, Gln283, Arg341 a pravděpodobně také Ser347) jsou proto mezi těmito proteasami konzervovány. Tyto zbytky jsou rovněž konzervovány v MACHal, avšak s jednou výjimkou - konzervativní záměnou Ser na Thr v pozici odpovídající Ser347 v ICE. Další drobnou, přesto potenciálně důležitou sekvenční odlišnost mezi MACHa isoformami a zbývajícími členy proteasové rodiny představuje změna Arg na Gin u zbytku odpovídajícího Arg286 v ICE. Tento zbytek, který sousedí s předpokládaným katalytickým cysteinovým

I ι

fcI

í).

[ í:

ii.

fc-

»·'

• · · Φ · · · · · · »· · · · · ·· « · « » • ·· · · · φ · · · • · · · · · · · · · · »' • · · _Λ·- ♦ φ · · · ··· ·· . ρζ)4 ®*· ·* ·· zbytkem, je plně konzervován u všech ostatních členů CED3/ICE rodiny. Rovněž některé aminokyselinové zbytky lokalizované poblíž substrátových P2-P4 zbytků se v MACHa isoformách odlišují od ostatních členů CED3/ICE rodiny.

(b) Proteasy CED3/CE rodiny obsahují místa pro autoštěpení.

O několika proteasách je i skutečně známo, že podstupují toto autoproteolytické štěpení, které je podmínkou dosažení maximální katalytické aktivity. Jejich biologicky plně aktivní forma sestává ze dvou nekovalentně spojených štěpných produktů, lišících se velikostí (p20 a p17 u ICE; p17 a p12 u CPP32). Přítomnost potenciálních autoštěpících míst v dalších členech rodiny nasvědčuje, že podléhají podobnému proteolytickému opracování, na kterém podobně závisí i dosažení maximální aktivity. Takováto místa potenciálního proteolytického autoštěpení s v MACHalnácházejí téměř ve shodných

7š polohácfrjakoArCPP32.MístóddpovídájícíN-kohci^T7^odjédriotký CPP32 se nachází ve druhém konzervovaném bloku aminokyselin, jen několik aminokyselin “nad“ N-koncem oblasti CED3/ICE homologie (pod Asp216). Místo odpovídající štěpenému rozhraní mezi dvěma

.......podjednotkami CPP32 se nachází, stejně jako u všech dalších členů

CED3/ICE rodiny, o nichž je známo, že v nich dochází ke štěpení, několik aminokyselin za katalytickým cysteinem (pod Asp374). Tato konzervace nasvědčuje, že oblast CED3/ICE homologie v MACHal podléhá proteolytickému opracování. Velikosti dvou očekávaných produktů tohoto štěpení se velmi blíží velikostem dvou podjednotek maturního CPP32.

(c) Oblast CED3/ICE homologie v MACH má proteolytickou aktivitu

Ke zjištění, zda má oblast CED3/ICE homologie v MACHa proteolytickou aktivitu, byla část proteinu sahající od potenciálního štěpícího místa mezi Asp216 a Ser217, N-terminálně od oblasti

Γ »4

4' homologie, až k C-konci proteinu, exprimována v bakteriích jako GSTfúzovaný protein. Bakteriální lyzáty byly pak zkoušeny na schopnost štěpit fluorogenní peptidové substráty, o nichž již bylo dříve zjištěno, že jsou štěpeny ostatními CED3/ICE homology. Byly použity dva substrátové peptidy: Jeden z nich, acetyl-Asp-Gíu-Val-Asp-a-(4methyl-kumaryl-7-amid) (Ac-DEVD-AMC), odpovídá sekvenci v poly(ADP-ribosa)polymerase (PARP), což je nukleární protein, který je v buňkách štěpený krátce po stimulaci FAS-R (Tewari et al., 1995b, Cell 81:1-20), jakož i v dalších apoptických pochodech (Kaufmann, io 1989, Cancer Res. 49:5870-5878; Kaufmann et al., 1993, Cancer Res. 53:3976-3985; Lazebník et al., 1994, Nátuře 371:346-347). Tento fluorogenní substrát je účinně štěpen CPP32. Druhý fluorogenní . substrát, acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp-AMC (Ac-YVAD-AMC), odpovídá štěpícímu místu pro ICE v IL-1 β prekursoru. Tento fluorogenní substrát

Tě je^-štěpen^-IGErNbyzáty-Joakterií—exprimujících GED3/IGE—homologní oblast z MACHal účinně štěpily fluorogenní substrát odvozený podle sekvence v PARP. Nevykazovaly však měřitelnou proteolytickou aktivitu s fluorogenním substrátem Ac-YVAD-AMC, který odpovídá štěpícímu místu ICE v IL-Ιβ prekursoru (Thornberry et al., 1992,

2o Nátuře 356:768-774). Proteolytická aktivita byla blokována kyselinou jodoctovou (5 mM), což potvrzuje účast thiolové proteasy. Žádné štěpení nebylo pozorováno s lyzáty obsahujícími GST-fúzi s MACH CED3/ICE-homologní oblastí, ve které byl katalytický Cys360 nahražen serinovým zbytkem. Rovněž lyzáty exprimující plnou délku proteinu MACHa, ve fúzi s GST, neštěpily Ac-DEVD-AMC, což je pravděpodobně důsledkem neexistence bakteriálních enzymů, které by byly schopné proteolyticky opracovat molekulu MACHa plné délky. K štěpení nedošlo ani s lyzáty obsahujícími jen jeden ze dvou potenciálních štěpných produktů CED3/ICE-homologní oblasti.

3o Kinetika štěpení PARP-odvozeného substrátu, Ac-DEVD-AMC (50μΜ), extrakty E.coli exprimujících GST-fúzi CED3/ICE-homologní '••'•MŠÍ··

9» 9 9 ě 9 · · • 9 9 · © 9 9 • 9 9 9 ·· oblasti z MACHal (od Ser217 k C-konci proteinu) byla ukázána ve srovnání s nulovým štěpením extrakty bakterií exprimujících GST-fúze MACHal plné délky nebo jen jednoho ze dvou potenciálních ^Ý proteolytických produktů CED3/ICE-homologní oblasti (Ser217 až

Asp374 a Asp374 až k C-konci proteinu).

Dále byla ukázána závislost štěpení Ac-DEVD-AMC na koncentraci substrátu při 180 min inkubaci s extrakty bakterií exprimujících MACHal CED3/ICE-homologní oblast ve fúzi s GST. Žádné štěpení nebylo pozorováno v přítomnosti kyseliny jodoctové io (5 mM). Extrakty nebyly aktivní s Ac-YVAD-AMC, fluorogenním substrátem, jenž odpovídá substrátovému místu proteasy ICE v IL-β prekursoru.

Ve stručnosti, GST-fúzované proteiny byly exprimovány v ---------------—XL-Lblue—bakteriích—Ε,οο//·—3-ρ.ουζΐίίπ_βχρι_β5ηί^.ο_„_νΌΧ1ο_Γ_υ_ρ_ΟΕΧ3,_

Bakterie byly lyžovány ultrazvukem v pufru obsahujícím 25 mM HEPES pH 7,5, 0,1 % 3-[3-(cholamidpropyl)dimethylamin]-1-propansulfonát, 5 mM EDTA a 2 mM DTT, a následně centrifugovány 10 min při 16,000 x g. Přítomnost podobných množství různých fúzovaných proteinů v lyzátech byla potvrzena SDS-PAGE analýzou. 50 μΙ alikvoty z extraktů (4 mg/ml celkové bílkoviny) byly inkubovány při pokojové teplotě po vyznačenou dobu v celkovém objemu 500 μΙ s fluorogenními substráty ve vyznačených koncentracích. Uvolňování AMC bylo sledováno spéktrofluorometricky při excitační vlnové délce 380 nm a emisní vlnové délce 460 nm. Koncentrace byla stanovena na základě kalibrační křivky. Oba fluorogenní peptidové substráty byly získány z Peptide Institute lne. (Osaka, Japonsko). Jiné CED3/CE proteasy vykazují plnou aktivitu pouze po proteolytickém zpracování, které může nastat buď autoštěpením nebo štěpením jinými proteasami (přehled v Kumar, 1995, Trends Biochem. Sci. 20:198-202; Henkart, _Ě 30 1996, Immunity 4:195-201). Pozorování, že lyzáty bakterií exprimujících GST- MACHal molekuly nemají enzymatickou aktivitu, i

♦ · 4 >

• 4

4

- Í07 na rozdíl od aktivity pozorované u lyzátů bakterií exprimujících pouze CED3/ICE-homologní oblast, nasvědčuje, že proteolytické opracování je pro dosažení aktivity nutné i v případě MACHal. Jak toto zpracování MACHal probíhá v savčích buňkách a jakým způsobem je vyvoláno po stimulaci FAS-R nebo p55-R není známo. Bylo zjištěno, že v buňkách se k aktivovanému FAS-R váže MORT-1, spolu s několika dalšími proteiny (Kischkel et al., 1995, EMBO J. 14:55795588). Mezi těmito dalšími proteiny pravděpodobně bude MACHal a další MACH isoformy. Lze si představit, že vazba MORT-1 spolu s ío MACHa k FAS-R, přivede do kontaktu několik molekul proteinu MACH, nebo v nich vyvolá konformační změny, a tyto změny buď spustí autolytické štěpení MACHa, anebo učiní MACHal štěpitelný jinými proteasami. Stimulace p55-R by mohla spustit autoštěpení MACHal podobným, avšak méně přímým způsobem. Zde by nejprve . 15 shluk několika molekul TRADD, nebo konformační změna indukovaná v molekulách TRADD vyvolaly změnu tvorby nebo stavu agregace MORT-1 a s ním spojené molekuly MACH.

Substrátová specifita MACHa se spíš zdá být 'orientována na smrť. MACHa štěpí substrátový peptid odpovídající štěpenému místu v PARP (Ac-DEVD-AMC), tj. proteinu štěpenému při buněčné smrti, avšak nevykazuje žádnou proteolytickou aktivitu vůči peptidů, jenž odpovídá místu zpracování prekursoru IL-1 β proteasou ICE (Ac-YVADAMC). Identifikace buněčných proteinů, které slouží jako substráty pro MACHa, napomůže k objasnění kroků při indukci buněčné smrti, jež se _ nacházejí v kaskádě pod touto proteasou. Pravděpodobné substráty MACHa jsou další členové CED3/ICE rodiny, jako CPP32 a ICE. U některých z těchto proteas skutečně dochází k proteolytickému štěpení po stimulaci FAS-R nebo TNF receptoru (Miura et al., 1995, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92:8318-8322; Schlegel et al., 1996, J.

Biol. Chem. 271:1841-1844; Chinnaiyan et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:4961-4965). MACHa možná aktivuje, přímo nebo nepřímo *»

I «

- 1Ό8**·

9« «9 • ,· · * « 9 9 .'©9 ® • 9 9 9 ·9 prostřednictvím jiných CED3/ICE proteas i další proteasy, které nepatří do CED3/ICE rodiny. Účast řady proteas v procesu buněčné smrti je v souladu s nálezy, které popisují schopnost různých proteasových inhibitorů, včetně inhibitorů serinových proteas a inhibitoru štěpení ICE, jakož i antisense ICE cDNA, chránit buňky před toxicitou indukovanou FAS-R a TNF receptorem (Weitzen a Granger, 1980, J. Immunol. 125:719-724; Ruggiero et al., 1987, Cell Immunol. 107:317-325; Enari et al., 1995, Nátuře 375:78-81; Los et al., 1995, Nátuře 375:81-83) ίο V indukci buněčné smrti TNF receptory a FAS-R může participovat řada dalších enzymů, včetně fosfolipas, sfingomyelinas a protein kinas (viz Eischen et al., 1994, J. Immunol. 153:1947-1954; Vandenbeele et al., 1995, Trends Cell Biol. 5:392-400; Cifone et al., 1995, EMBO J. 14:5859-5868 a odkazy v nich uvedené). Některé z těchto enzymů mohou být aktivovárrÁÉrotěolyťičkým štěpěhínT. jěž je^ iniciováno MACHa. Je však též možné, že některé z těchto dalších aktivit souvisejících s buněčnou smrtí, jsou stimulovány prostřednictvím jiných signalizačních drah, nezávislých na stimulaci MACH a. Účast více než jedné signalizační kaskády v indukci buněčné smrti, některých společných pro receptory p55-R a FAS/APO1 a jiných indukovaných jen jedním z nich, je ve shodě s publikovanými nálezy o společných i rozdílných rysech procesů buněčné smrti indukované těmito dvěma receptory (Grell et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:25632566; Schulze-Osthoff et al., 1994, EMBO J. 13:4587-4596; Wong a Goeddel, 1994, J. Immunol. 152:1751-1755; Clement a Stamenkovic, 1994, J. Exp. Med. 180:557-567).

(d) MACHa se váže k MORT1 i k MACHQI:

Aby se zjistilo, zda se MACHal může vázat kMORTI stejně 30 jako ΜΑΟΗβΙ, byla nejprve zkoušena interakce obou proteinů v transfekovaných kvasinkách. Ukázalo se, že MACHal má významný ' ·· ·

e e

- ΊΌ9·-*· i

'?·

I b,

Ě cytotoxický účinek na kvasinky. Tento účinek se projevil výrazným poklesem počtu kolonií u kvasinek, které exprimovaly protein ve vektoru s aktivační doménou (AD), jehož hladina exprese je vyšší než v případě vektoru s DNA-vazebnou doménou (DBD). Na druhou stranu, MACHal, ve kterém byl katalytický cystein Cys360 nahražen serinem (MACHal (C360S)) nebyl cytotoxický ani pro savčí buňky (viz níže), ani pro kvasinky. Podobně jako ΜΑΟΗβΙ, MACHal (C360S) se v transfekovaných kvasinkách vázal k MORT-1 a také sám k sobě. Vázal se také k ΜΑΟΗβΙ. V kvasinkách exprimujících MACHal divokého typu spolu s MORT-1 nebo ΜΑΟΗβΙ rovněž docházelo k interakci transfekovaných proteinů. Intenzita zabarvení lacZ produktu se však mezi jednotlivými koloniemi kvasinek lišila: u kvasinek transfekovaných MACHal v AD i DBD vektoru nedošlo vůbec k tvorbě barevného produktu, pravděpodobně v důsledku cytotoxického účinku

MACHal divokého typu. Avšak navzdory těmto výkyvům, u kvasinek exprimujících MACHal v kombinaci s MORT1 nebo s ΜΑΟΗβΙ vyšla zřetelně pozitivní interakce transfekovaných proteinů. Na rozdíl od ΜΑΟΗβΙ, MACHal nevykázal v dvojhybridovém testu autoasociaci

Jak MACHal (C360S), tak ΜΑΟΗβΙ imunokoprecipitovaly

2o s MORT-1 z lyzátů buněk lidských embyonálních ledvin 293-EBNA; což nasvědčuje, že se k MORT-1 vážou i v savčích buňkách. V dalších pokusech, které si kladly otázku, zda se MACHal může vázat kMORTI také v savčích buňkách, byly MACHal nebo ΜΑΟΗβΙ fúzované s FLAG oktapeptidem exprimovány společně sMORTI molekulami fúzovanými s HA epitopem. V HeLa buňkách byly exprimovány [³⁵S]-metabolicky značené MACHal a ΜΑΟΗβΙ fúzované svými N-konci k FLAG oktapeptidu (FLAG-MACHa1 a β1), a MORT1 fúzovaný svým N-koncem k HA epitopu (Field et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8:2159-2165). Imunoprecipitace proteinů z buněčných

3o lyzátů byla provedena s použitím myších monoklonálních protilátek namířených proti FLAG oktapeptidu (M2; Eastman Kodak), HA epitopu ··

- Ί·10 ·* · (12CA5, Field et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8:2159-2165), nebo p75 TNF

F.' receptorů (#9, Bigda et al., 1994, J. Exp. Med. 180:445-460) jako kontrola. Proteiny byly analyzovány pomocí SDS-PAGE (12% > akrylamid) a následné autoradiografie. MACHal i ΜΑΟΗβΙ f 5 z buněčných lyzátů imunokoprecipitovaly s MORT1, což naznačuje, že i * se vážou k MORT1. Účinnost interakce MACHal s MORT1 byla nižší než v případě ΜΑΟΗβΙ a MORT1.

(e) MACH molekuly obsahující oblast CED3/ICE homologie mohou i io zprostředkovávat buněčnou smrt:

? Aby se zjistila role proteinů MACH v indukci buněčné smrti, byl ί studován účinek nadprodukce různých isoforem proteinu MACH na buněčnou viabilitu. Do buněk lidských embryonálních ledvin ^!ř,, » 293-EBNA a buněk MCF7 prsního karcinomu byly transfekovány vektory exprimující MACH společně s vektorem exprimujícím β-galaktosidasu, který sloužil jako markér účinnosti transfekce.

Ve stručnosti, buňky 293-EBNA, MCF7 a HeLa HtTA-1 byly

T kultivovány v Dulbebeccově modifikaci Eagleova minimálního esenciálního média doplněném 10% fetálním telecím sérem, ňeesenciálními aminokyselinami, 100 U/ml penicilinem a 100 pg/ml streptomycinem. Buňky (5x10⁵ 293-EBNA, 3x10⁵ MCF7, nebo 3x10⁵ HeLa buňky v 6-cm miskách) byly metodou kalcium fosfátového precipitátu transientně transfekovány expresními vektory nesoucími ; a cDNA uvedených proteinů, spolu s expresním vektorem pro , ‘ 25 β-galaktosidasu. V jedné sérii pokusů byla každá miska transfekována ^? 3,5 pg MACH vektoru a 1,5 pg pSV-p-gal; v další sérii pokusů byla každá miska transfekována 2,5 pg uvedeného MACH nebo MORT1 vektoru (nebo prázdného vektoru pro kontrolu) a 1,5 pg pSV-p-gal. Po 6 až 10 hodinách od transfekce byly buňky opláchnuty. Buňky 2933o EBNA a MCF7 byly bez dalšího působení inkubovány dalších 18 fi;,·

h.

• toto	toto to		to·
• toto	• * ··	•	• to	•
• to*	• · ·	•	‘to	to
• to · ·· toto	-*í*fl ·*·	•	• • ·	•

hodin. HeLa buňky byly po transfekci inkubovány 26 hod a potom 5 hod v přítomnosti buď anti-FAS.APO1 protilátky (CH11; 0,5 μς^Ι) nebo TNF (100 ng/ml), spolu s cycloheximidem (10 μg/ml). Rozsah buněčné smrti na konci inkubace byl hodnocen stanovením exprese β-galaktosidasy, jak popsal Kumar et al. 1994, Genes Dev. 8:16131626.

Kultury transfekované expresním vektorem pro MACHal nebo MACHcc2 vykazovaly ve značném rozsahu buněčnou smrt, jež se projevovala zakulacením, tvorbou blebů, smrštěním a nakonec io uvolněním buněk od povrchu misky. Do 20 hod po transfekci vykazovala většina transfekovaných buněk, identifikovaných pomocí βgalaktosidasového barvení (X-gal), kondenzovanou morfologii typickou pro apoptosu. Naproti tomu, buňky exprimující prázdný vektor zůstávaly viabilní.

Aby se objasnila role CED3/ICE-homologní oblasti v MACHa isoformách na jejich apoptotických účincích, byly buňky transfekovány expresním vektorem pro ΜΑΟΗβΙ isoformu, které chybí CED3/ICE.....homologní oblast, expresním vektorem pro MACHa3 isoformu, které chybí N-koncová část této oblasti, a expresními vektory pro

MACHal (C360S) a pro C-koncově zkrácený mutant MACHal (MACHal(1-415)), kterému chybí jeden ze zbytků považovaný za kritický pro proteasovou funkci CED3/CE (odpovídající zbytku Ser347 v ICE). V buňkách 293-EBNA nebo MCF7, transfekovaných expresními vektory pro MACHa3, MACHa1(1-415) nebo MACHal (C360S), nedošlo k žádnému projevu buněčné smrti (nad mírné pozadí pozorované u buněk transfekovaných prázdným vektorem). Taktéž buňky transfekované vedle těchto vektorů i vektorem pro MACHal vykázaly jen velmi málo buněčné smrti, což naznačuje, že molekuly MACH s neúplnou CED3/ICE oblastí mají negativně dominantní účinek na aktivitu molekul divokého typu. Buněčné kultury exprimující ΜΑΟΗβΙ, který vůbec neobsahuje CED3/ICE oblast, vykazovaly ··

44 44 4 44

44444444 44 4 4

44 ··« 4 · 4 ·

4 444 4 4 4 4 *4 4 • · · · · 4 4 4 t

..... -1*12»*· ·· ·· určitou nepatrnou buněčnou smrt. Tento účinek ΜΑΟΗβΙ, nejpravděpodobněji způsobený aktivací endogenních MACHal molekul, byl z jakéhosi důvodu výraznější u transfekovaných HeLa buněk. Mimoto, v HeLa buňkách byly také MACHa3, MACHa1(1-415) a MACHal (C360) poněkud cytotoxické.

Zdá se, že aktivita MACHa představuje enzymatický krok na vrcholu signalizační kaskády realizující cytocidní účinky FAS/APO1 a p55-R. Schopnost ΜΑΟΗβΙ vázat se k MORT-1 i k MACHal nasvědčuje, že tato isoforma zvyšuje aktivitu enzymaticky aktivních io isoforem. Je možné, že některé z isoforem MACH mají i další funkce.

Schopnost ΜΑΟΗβΙ vázat se k MOŘT-1 i k MACHal nasvědčuje, že tato isoforma zvyšuje aktivitu enzymaticky aktivních isoforem. Mírná cytotoxicita pozorovaná v kulturách buněk 293-EBNA a MCF7 __tr.ansfekovaných touto isoformou a poměrně významný cytotoxický účinek, který vyvolává v HeLa buňkách, patrně odráží aktivaci endogenně exprimovaných MACHa molekul po vazbě k transfekovaným ΜΑΟΗβΙ molekulám. Je možné, že některé isoformy MACH mohou též působit jako vazebné platformy pro molekuly, které se účastní dalších, necytotoxických účinků FAS/APO1 a TNF receptorů.

(f) Blokování MACHa funkce brání indukci buněčné smrti zprostředkované FAS/APO1 a p55-R | * K posouzení příspěvku MACHa k cytotoxicitě zprostředkované * 25 FAS/APO1 a p55-R, byly MACHa3 a nefunkční mutantní MACHal, £··

Γ MACHa1(1-415) a MACHa1(C360S) exprimovány v buňkách, které byly příslušně indukovány tak, aby se u nich projevila tato cytotoxicita. Cytotoxicita indukovaná p55-R byla v 293-EBNA buňkách spuštěna , nadprodukcí tohoto receptoru (Boldin et al., 1995, J. Biol. Chem.

t 30 270:337-341), a FAS/APO1 cytotoxicita nadprodukcí chimérních • ·· ·· · · • ·· ·· · • · ·· • · ·

Ί43·· ·· • · · ··· ·* • · · · · · · · ·· ··

I?

>

s.

I'fc>

U

T 'ΐ |t !L ř

molekul obsahujících extracelulární doménu p55-R a transmembránovou a intracelulární doménu FAS/APO1. Tato chiméra měla mnohem větší cytotoxický účinek než normální FAS/APO1. Cytotoxickou aktivitu bylo možné vyvolat v HeLa buňkách také působením TNF nebo protilátky namířené proti FAS/APO1 receptoru v přítomnosti inhibitoru proteosyntézy, cycloheximidu. HeLa buňky také reagovaly na transientní expresi FAS/APO1 receptoru. Ve všech studovaných systémech poskytoval MACHa3 a nefunkční mutanty MACHal účinnou ochranu před cytotoxicitou spuštěnou po stimulaci FAS/APO1 nebo p55-R. Takováto ochrana byla též pozorována, jak popsali již dříve Hsu et al. 1996, Cell 84:299-308 a Chinnaiyan et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:4961-4965, v buňkách transfekovaných N-koncově deletovaným mutantem MORT-1, kterému chybí MACH-vazebná oblast (MORT1 (92-208)). Tyto ochranné účinky naznačují; že~MACHa^—je nezbytnou složkou—obou—signalizačních-—__ kaskád pro buněčnou smrt, spouštěných z FAS/APO1 i z p55-R.

’ MACH je v různých tkáních exprimován ve výrazně odlišných hladinách a zřejmě též s různými profily isotypového zastoupení. Tyto rozdíly pravděpodobně přispívají k tkáňově-specifickým odlišnostem v odpovědi na FAS/APO1 ligand a TNF. Podobně jako v případě jiných CED3/ICE homologů (Wang et al., 1994, Cell 78:739-750; Alnemri et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:4312-4317) bylo u MACH isoforem obsahujících neúplné CED3/ICE oblasti (např. MACHa3) zjištěno, že inhibují aktivity současně exprimovaných molekul MACHal nebo

MACHa2; rovněž bylo zjištěno, že blokují buněčnou smrt indukovanou z FAS/APO1 nebo p55-R. Exprese takovýchto inhibujících isoforem v buňkách může představovat buněčný mechanismus sebeobrany před cytotoxicitou zprostředkovanou FAS/APO1 a TNF. Značná heterogenita MACH isoforem, rozsahem značně převyšující heterogenitu pozorovanou u ostatních proteas CED3/ICE rodiny, by

měla umožňovat zvláště jemnou regulaci funkce aktivních MACH isoforem.

Příklad 1: Klonování a izolace G1 proteinu, který se váže .5 k MORT-1-vazebnému proteinu Mch4 (i) Dvoihybridová analýza a dvoihybridovv test exprese β-galaktosidasy

S použitím postupů uvedených zde v Odkazových Příkladech 1-3 byl izolován nový protein, označený G1, který je zřejmě io homologní s ICE-podobnými proteasami a tudíž je možná dalším ' členem této rodiny proteas. G1 protein obsahuje dva moduly, které jsou homoiogní s MORT moduly, jmenovitě s MORT-1 N-koncovou částí, s MORT moduly v MACH proteinech (viz shora uvedené

-Odkazové—RříWady—1-3—a-Boldin—et—al—-1-996—Cell—85:803-8-15)—a15 s MORT moduly jiného příbuzného MORT-1-vazebného proteinu Mch4 (viz Fernandes-Alnemri et al., 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93:7464-7469; Srinivasula et al., 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93:14486-14491). Dále: G1 protein má enzymatickou (protease podobnou) oblast, jež je homologní s enzymatickými (proteasovými) oblastmi proteas CED3/ICE rodiny (například, proteasovými oblastmi MACH proteinů a Mch4 a dalších).

Ve stručnosti, klon proteinu G1 ('klon G1') byl získán dvojhybridovou analýzou cDNA knihovny lidských Jurkat buněk T, zaklonované do vektoru s Gal 4 aktivační doménou a s použitím proteinu Mch4 jako 'návnady'. Analýza byla provedena v kvasinkovém reportérovém kmeni HF7c (Clontech, Palo Alto, CA) v nepřítomnosti 3aminotriazolu, podle návodu Matchmaker™ Two-Hybrid System Protocol (Clontech). Sekvence Mch4 byla získána z EMBL databáze. Podle této sekvence byly navrženy PCR primery pomocí OLIGO4™

3o softwaru a z celkové RNA získané (standardním postupem) z primárních lidských endoteliálních buněk pupečníkové žíly byl • · t, metodou RT-PCR získán fragment DNA odpovídající kódující části Mch4. Tento fragment byl pak klonován do pGADGH vektoru a použit jako návnada, jak uvedeno shora, v dvojhybridové analýze. Touto analýzou bylo získáno 11 klonů a všechny kódovaly protein, který se jevil jako sestřihová varianta proteinu obsahujícího dva motivy homologní s MORT-1. Rozbor předběžné částečné sekvence G1 a sekvencí v 'dbesť databázi a v Human Genome Database úrovně 1 (level 1) poskytl řadu sekvencí exprimovaných úseků (expressed sequence tags, est), jež obsahovaly části sekvence klonu G1. io Sekvenční analýza těchto est fragmentů ukázala, že zřejmě existuje velký počet sestřihových variant proteinu G1, které obsahují úsek sekvence kódující proteinový motiv homologní s ICE-podobnými proteasami, a že tento úsek sekvence je iokaiizován směrem 3' od G1 sekvence získané dvojhybridovou analýzou.

Ύ5; Za^_účelem'získáníúplrréšěkvěnčě4šófórmyGT,kteráóbšáhuje protease-podobnou enzymatickou oblast, byla celková RNA z různých buněčných linií podrobena reversní transkripci s použitím oligonukleotidového primeru sestávajícího z 15 dT úseku a adptérové .· sekvence. Získané cDNA molekuly pak byly použity jako templáty pro první kolo PCR reakce s primery navrženými podle sekvence získané z 5' nekódující části G1 a na základě adaptérové sekvence. Následně byly v_sdruhém kole PCR reakce použity další oligonukleotidové primery mající sekvenci z 5' kódující části G1, včetně iniciačního ATG kodonu, a z adaptéru. Takto bylo možné získat úplnou sekvenci sestřihové varianty G1 proteinu, která obsahuje enzymatickou (protease-podobnou) oblast. Ta však představuje jen jednu z předpokládaných G1 isoforem.

Předběžná sekvence jedné takovéto G1 isoformy, sestřihové varianty G1, je znázorněna na Obr. 1, kde horní sekvence je nukleotidová sekvence a spodní sekvence představuje odvozenou aminokyselinovou sekvenci otevřeného čtecího rámce (ORF) začínajícího od ATG (nukleotidová pozice 482) a terminujícího u TAA

(nukleotid 1921), přičemž tyto iniciační a terminační kodony jsou v sekvenci označeny hvězdičkou (*). G1 sestřihová varianta podle Obr. 1 byla také předběžně označena 'G1a'.

V Obr. 2 je schematicky znázorněna sekvence jiné G1 isoformy, krátké G1 sestřihové varianty, jež má dva MORT moduly, a která byla předběžně označena jako ·Όίβ'; nahoře je uvedena nukleotidová sekvence a pod ní je odvozená aminokyselinová sekvence otevřeného čtecího rámce (ORF) začínajícího u nukleotidu v pozici 482 (ATG) a terminujícího u nukleotidu 1145 (TGA), přičemž tyto iniciační a io terminační kodony jsou v sekvenci označeny hvězdičkou (*).

Dále by mělo být řečeno, že původně izolovaný G1 klon získaný s použitím Mch4 sekvence jako 'návnady' byl alespoň zčásti krátkou sestřihovou variantou G1, nazvanou Θ1β (viz Obr.2). Tento původně izolovaný G1 klon byl parciálním klonem nové cDNA, který-po-dobně15 jako MACH (CASP-8) a Mch4 (CASP-10) obsahoval dva motivy 'domény smrtiVMort moduly (nebo 'domény efektoru smrti' - DED) následující hned za N-koncem (viz také Obr.3). S použitím tohoto původního klonu bylo pak možné izolovat a charakterizovat cDNA klony větší sestřihové varianty G1a a kratší sestřihové varianty Θ1β.

Větší sestřihová varianta má C-koncovou oblast s homologii k proteasové oblasti caspas a tudíž je pravděpodobně novým členem rodiny caspas. Jako taková, byla G1 také nazvána CASH podle 'caspase homolog'.Sekvence G1a(CASHa) a Θ1β (0Α5Ηβ) byly porovnány se sekvencemi ostatních caspas (pro další podrobnosti, zejména izolaci myší G1 sekvence, viz níže; pokud jde o Obr.3 viz shora 'Stručný popis obrázků'). Výsledky tohoto srovnání jsou schematicky znázorněny v Obr. 3, jehož podrobnosti a zejména klíč k vyznačeným sekvencím v obrázku jsou uvedeny shora, v kapitole 'Stručný popis obrázků'.

-· 1*t7 - ··

B ‘ «· ř^l.

i

Po shora uvedeném počátečním klonování a sekvenování G1, zvláště G1a aG1p isoforem, byly provedeny další analýzy těchto proteinů:

.1

(ii) Northernová analýza a další sekvenční analýzy:

Northernová analýza ukázala, že pro G1 protein existují transkripty o nejméně třech rozdílných velikostech 2, 2,2 a 4,4 kb, jejichž vzájemné zastoupení v různých tkáních se výrazně liší (Obr.4). K získání G1 (CASH) cDNA o plné délce, byla cDNA knihovna z lidských kožních fibroblastů (Clontech) hybridizována s cDNA io sondou odpovídající G1 sekvenci. Získány tak byly dva typy cDNA, zřejmě odpovídající dvěma sestřihovým variantám G1 (viz též shora). Proteiny kódované těmito dvěma cDNA měly společnou N-koncovou oblast, obsahující doménu efektoru smrti, lišily se však v C-koncích. Jeden (Gip=CASHp) měl krátký C-konec, odpovídající, původně klonované cDNA. Druhý (G1a=CASHa) měl dlouhý C-konec.

Aminokyselinová sekvence této delší C-koncové oblasti G1a vykazovala poměrně vysokou homologii s oblastmi proteasového prekursoru v MACH (CASP-8) a Mch4 (CASP-10) (viz též Obr. 3). V G1a však chybí několik zbytků, o kterých se ma zato, že jsou

2o rozhodující pro proteasovou aktivitu, což nasvědčuje tomu, že by protein nemusel mít aktivitu cysteinové proteásy. Je zajímavé, že G1a obsahuje substrátovou sekvenci pro caspasu v místě, které odpovídá místu proteolytického štěpení v proteasových oblastech molekul MACH (CASP-8) a Mch4 (CASP-10) (stínované v Obr.3). Předběžné výsledky naznačují, že G1ot může být v tomto místě skutečně štepena proteasou MACH (data nejsou ukázána).

Na základě .nukleotidové sekvence ÉST klonu, o němž bylo zjištěno, že odpovídá myšímu homologu části oblasti 'domény smrti' (DED) vG1, byly pomocí RT-PCR klonovány z mRNA myších jater cDNA obou sestřihových variant CASHa i CASHp. EST klon

(GenBank, přírůstkové číslo AA198928) byl identifikován jako myší homolog části DED oblasti vG1. Na základě této sekvence byly z mRNA myších jater klonovány pomocí RT-PCR myší G1a (CASHa) aGip (CASHp) sestřihové varianty. Reversní transkripce byla provedena s oligo-dT adaptérovým primerem (5'GACTCGAGTCTAGAGTCGAC(T)₁₇-3') a AMV reversní transkriptasou (Promega), podle pokynů výrobce. První kolo PCR bylo provedeno s použitím soupravy Expand Long Template PCR System (Boehringer Mannheim) s použitím následujících sense a antisense primerů: 5'10 GGCTTCTCGTGGTTCCCAGAGC-3', respektive 5’GACTCGAGTCTAGAGTCGAC-3' (adaptér). Druhé kolo bylo provedeno s použitím Vent polymerasy (NEB) a vnitřního sense primeru 5'-TGCTCTTCCTGTGTAGAGATG-3' a adptéru.

Srovnání sekvencí ukázalo vysokou konzervaci po celé délce Gla^-(CASHa) molekuly (71% identity v DED oblasti a 59% v obíastí proteasové homologie), což nasvědčuje, že oblast DED i oblast homologie s proteasou přispívají k funkci proteinu (viz Obr. 3).

(iii) Dvoihybridová analýza vazebné specifity G1 isoforem:

Dvojhybridový test vazebných vlastností G1a (CASHa) 20 aGip (CASHp) (Obr. 5) ukázal, že obě varianty interagují s MORT1/FADD a MACH (CASP-8), velmi pravděpodobně prostřednictvím svých sdílených DED oblastí. Pozoruhodné je, že ačkoli Θ1β (CASH(5) byl původně izolován při dvojhybridovém vyhledávání proteinů, jež by se vázaly k Mch4 (CASP-10), nyní v tomto testu vykazoval jen slabou vazbu k Mch4 (CASP-10), a zdá se, že G1a (CASHa) se váže jen slabě k Mch4 (CASP-10). Je však třeba poznamenat, že původní dvojhybridové vyhledávání za účelem nakloňování G1 proteinů se odlišovalo od nynějšího dvojhybridového testu na specifitu vazby, a proto se zdá, že G1a a G1p se oba vážou k MACH a Mch4, jak ukázaly výsledky původního klonování. Dvě G1 varianty také autoasociovaly a vázaly se i navzájem, nevázaly však • · * · · ·· · ··· · • β © e e » β · · · _v « • K · ♦ · · ·· · ··* t19 - ·· *......

RIP nebo TRADD (adaptérové proteiny, které podobně jako M0RT1/FADD obsahují domény smrti, ale nemají DED oblasti), ani se nevázaly k řadě irelevantních proteinů (např. k laminu), které byly použity jako negativní kontroly.

K dalšímu studiu funkce G1 byly jeho dvě varianty transientně exprimovány v HeLa a 293-T buňkách a sledovaly se účinky transfekovaných proteinů na signalizační kaskádu indukovanou p55-R (CD120a) receptorem po stimulaci TNF ligandem nebo v důsledku nadprodukce receptoru. Sledovány byly rovněž účinky na signalizační kaskádu indukovanou FAS-R (CD95) receptorem po stimulaci způsobené agregací FAS-R protilátkou nebo v důsledku nadprodukce chimérního receptoru sestávajícího z extracelulární domény p55-R (CD120a) a intracelulární domény FAS-R (CD95) (viz Obr. 6). V obou buněčných liniích neměla exprese samotného Gip (CASHp) žádný

T5^_ účinek na viafiilitLrbunék, zato silně inhibovala indukci buněčné smrti prostřednictvím p55-R (CD120a) i FAS-R (CD95). Exprese G1a (CASHa) varianty působila na tyto dvě buněčné linie velmi rozdílně. V HeLa buňkách inhibovala cytotoxicitu p55-R (CD120a) a FAS-R (GD95) podobně jako G1 β (CASHp). Avšak v 293-T buňkách působila výrazně cytotoxicky. Podobná cytotoxicita byla pozorována při expresi G1a proteinu v 293-EBNA buňkách (neukázáno). Tento cytotoxický účinek mohl být úplně blokován současnou expresí proteinu p35, což je inhibitor caspasy odvozený z bakuloviru (co se týká p35, viz též Clem et al., 1991, Science 254, 1388-1390; Xue a Horvitz, 1995,

Nátuře 377:248-251).

K posouzení role oblasti homologie s proteasou v Gla (CASHa) proteinu na jeho cytocidní účinek byly studovány funkce dvou jeho mutantů: G1/CASHa(1-385) a G1/CASHa(1-408) s C-koncovými delecemi v oblasti odpovídající té části proteasové domény, ze které je odvozena malá podjednotka maturní proteasy. Oba mutantní proteiny postrádaly jakýkoli cytotoxický účinek. Kromě toho chránily, podobně toů jako Gip (CASHp), 293 buňky před indukcí smrti zprostředkovanou p55-R (CD120a) a FAS-R (CD95) (Obr. 6C a D).

Pro shora uvedené pokusy byly použity následující metody a materiály:

(i) G1a (CASHa) deleční mutanty a chiméra p55-R/FAS-R (CD120a/CD95) byly připraveny pomocí PCR a/nebo konvenčními klonovacími technikami. Sestřihové varianty G1 (CASH), proteiny FASR (GD95) nebo p55-R (CD120a) signalizační kaskády (všechny lidského původu) a bakulovirový protein p35 byly exprimovány v savčích buňkách s použitím expresního vektoru pcDNA3 (Invitrogen). β-galaktosidasa byla exprimována z pCMV-p-gal vektoru (Promega).

(ii) Buňky iidských embryonálních ledvin, 293-T a 293-EBNA a lidské buňky cervikálního karcinomu HeLa (HeLa-Fas; HtTA-1 klon) ___________které trvale exprimují transfekovaný lidský FAS-R (CD95) (ustavené v autorově laboratoři) byly kultivovány v Dulbeccově modifikaci Eagleova minimálního esenciálního média doplněného 10% fetálním telecím sérem, neesenciálními aminokyselinami, 100 U/ml penicilinem a 100 pg/ml streptomycinem.

Shora uvedené nálezy naznačují, že G1 může vstupovat do interakce se složkami signalizačních komplexů p55-R a FAS-R a že působí indukci smrti způsobem, který se může lišit v závislosti na identitě sestřihové varianty G1 a typu buněk, ve kterých je exprimován.

Inhibice cytotoxicity způsobená ΰ1β, a v případě HeLa buněk též G1oc, je zřejmě zprostředkovaná oblastí 'domény smrti' (DED) tohoto proteinu. Pravděpodobně je projevem kompetice DED oblasti proteinu G1 s odpovídajícími oblastmi v MACH (CASP-8 a Mch4(CASP-10) o vazbu k MORT1/FADD.

Pokud jde o způsob jakým CASHa působí smrt buněk 293, schopnost proteinu p35 blokovat tento cytotoxický účinek naznačuje, • ·

* ř

i?

že cytotoxicita je zprostředkovaná aktivitou caspas. Avšak G1a, i když vykazuje značnou sekvenční homologii s caspasami, může ve skutečnosti postrádat proteasovou aktivitu, protože nemá několik konzervovaných aminokyselinových zbytků aktivního místa caspasy.

G1a proto možná působí tím, že aktivuje jiné molekuly, jež mají caspasovou aktivitu.

Jinou možností je, že G1a, i když sám neschopný působit jako proteasa, může být součástí aktivní proteasové molekuly. Krystalografické studie CASP-1a CASP-3 naznačují, že malá a velká podjednotka v obou maturních enzymech jsou odvozeny z odlišných proenzymových molekul (Walker et al., 1994, Cell 78:343-352; Wilson et al., 1994, Nátuře 370:270-5; Mittl et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:6539-6547; Rotonda et al., 1996, Nátuře Struct-Biol. 3:619-625). Vzhledem k pozorované závislosti G1a cytotoxické aktivity na neporušenosti oblasti odpovídající malé proteasové podjednotce (Obr. 6C), je možné, že tato oblast v G1a (CASHa) se může spojovat s oblastí velké podjednotky určité caspasy (caspas) způsobem, který vede k rekonstituci enzymaticky aktivní molekuly. Výsledný aktivní heterotetramer by pak mohl aktivovat další caspasy a tak spustit buněčnou smrt.

Dále: ukazuje se (výsledky nejsou ukázány), že G1 má určitou homologii s dalším proteinem, zvaným MYD88, který je zapojen v signalizační dráze zprostředkované interleukinem IL-1. G1 tak může být zapojen i v dalších drahách iniciovaných/zprostředkovaných jinými cytokiny.

Vzhledem k shora uvedenému, co se týká klonování a izolace G1 proteinu (alespoň jeho dvou isoforem), vyplývají následující charakteristiky a použití G1:

(i) G1 byl nakloňován po dvojhybridové analýze jako molekula, 3o která se váže na MORT-1-vazebný protein Mch4 a tudíž je možná jeho účast v modulaci aktivity Mch4 a MORT-1, a tudíž prostřednictvím i?

»9 99

9 ·

9 9 ··« Ί·22 -

mechanismů shora naznačených, je možná účast G1 v modulaci buněčných procesů iniciovaných FAS-R a p55-R. Jelikož Mch4 je schopen vázat se k MORT-1 a přímo se účastní pochodů buněčné cytotoxicity a v konečném důsledku buněčné smrti, a jelikož je také • 5 známo, že některé isoformy Mch4 inhibují buněčnou smrt, lze vyvodit, že G1 včetně jeho různých isoforem se mohou přímo nebo nepřímo účastnit jak buněčné cytotoxicity a buněčné smrti tak inhibice buněčné smrti.

(ii) G1 má zřejmě N-koncovou oblast, jež obsahuje dva MORT io moduly homologní s dvěma MORT moduly proteinu MACH (viz

Odkazové Příklady 1-3 shora) a proteinu Mch4. Přítomnost těchto MORT modulů v G1 proto zřejmě zodpovídá za schopnost G1 vázat se k Mch4, a možná také zodpovídá za vazbu G1 (nebo alespoň jeho některých isoforem) k MACH (nebo některým jeho isoformám), jakož i rs—přímo k MORT-1. G1 proto může být schopen modulovat aktivitu

MORT-1 (a následně aktivitu FAS-R a p55-R) přímo, přímou vazbou k MORT-1, nebo nepřímo, vazbou k Mch4 a/nebo MACH, o nichž je opět známo, že se vážou k MORT-1.

(iii) Analýza G1 sekvence ve shora uvedených databankách 20 rovněž ukázala, že G1 je zřejmě lokalizován na lidském chromosomu

2, velmi blízko lokusů Mch4 a MACH, což naznačuje těsný vztah mezi geny kódujícími všechny tyto proteiny také na chromosomální úrovni.

—(iv) Alespoň některé G1 isoformy (např. G1a isoforma na—Obr.

1) mají “pod“ oblastí MORT modulů oblast, která vykazuje podobnost 25 s enzymatickou, tj. proteasovou oblastí MACH a Mch4, a jako takový,

G1 může být členem CED3/ICE rodiny proteas.

(v) Přítomnost oblasti podobné protease v alespoň některých G1 isoformách (např. G1a ) naznačuje, že G1 nebo její takové isoformy se mohou přímo účastnit buněčné cytotoxicity a zánětu způsobených rozličnými stimuly, včetně receptorů TNF/NGF receptorové rodiny (např. FAS-R a p55-R) a rovněž dalších, které působí přímo nebo • ·

έf i

nepřímo prostřednictvím intracelulární proteasové aktivity a vyvolávají buněčnou cytotoxicitu a zánět.

(vi) G1 může zesilovat nebo zvyšovat aktivitu jiných proteinů, jako například MACH a Mch4 (včetně jejich různých isoforem), působících v intracelulárním mechanismech vedoucích k buněčné cytotoxicitě, zánětu a dalších souvisejících účinků, zprostředkovaných receptory TNF/NGF receptorové rodiny a dalšími, jež sdílejí společné intracelulární efektory. Zesilující účinek G1 (nebo alespoň některých jeho isoforem) může spočívat ve vazbě G1 k těmto dalším proteinům (jak bylo shora uvedeno, G1 se váže k Mch4 a možná také k MACH a MORT-1), čímž je přitahuje, aby se vázaly k MORT-1 (včetně MORT-1 autoasociace), nebo působily nezávisle na MORT-1.

(vii) G1 může také působit jako inhibitor aktivity jiných proteinů, a to jako součást komplexů jiných proteinů, ke kterým se váže (např.

Mch4 a možná také MACH a MORT-1), čímž ovlivňuje až inhibuje jejich cytotoxicitu. Dále: podobně jak bylo shora uvedeno o některých isoformách MACH a Mch4, mohou existovat také specifické isoformy G1, které mají inhibiční aktivitu. Jednou takovou G1 isoformou může být Ο1β, ukázaná na Obr. 2, která má dva MORT moduly, ale nemá žádnou zřetelnou oblast podobnosti s jinými známými proteasami.

Nyní, po úplném popisu vynálezu, si osoby znalé oboru budou vědomi, že totéž může být provedeno v širokém rámci rovnocenných parametrů, koncentrací a podmínek, bez toho, že by došlo k odklonu od ducha a rozsahu vynálezu a k nepřiměřenému experimentování.

Zatímco vynález byl popsán v souvislosti s jeho konkrétními provedeními, je jasné, že jej lze dále modifikovat. Tato přihláška má pokrývat jakékoli variace, použití, nebo adaptace vynálezu, vycházející obecně z principů vynálezu a zahrnující takové odchylky od předkládaného popisu, jaké mohou nastat v rámci známých nebo

3o obvyklých postupů a praxe v oboru, jehož se vynález týká a jaké by • · » « ·· • - ·· mohly být aplikované na základní rysy shora vyložené, jak následuje v rozsahu připojených nároků.

Všechny citované odkazy, včetně časopiseckých článků nebo * * abstraktů, publikovaných nebo odpovídajících US nebo zahraničních , : 5 patentových přihlášek, vydaných US nebo zahraničních patentů, nebo jakýchkoli dalších odkazů, jsou zde zahrnuty v úplnosti odkazem, včetně všech dat, tabulek, obrázků a textu prezentovaných v citovaných odkazech. Dále, veškerý obsah odkazů citovaných v rámci odkazů citovaných zde, je rovněž v úplnosti zahrnut odkazem.

Odkazy na známé metodické kroky, obvyklé metodické kroky, známé metody nebo obvyklé metody v žádném případě nepřipouštějí, že jakýkoli aspekt, popis nebo provedení vynálezu je zveřejněn, znám nebo naznačen v relevantním oboru.

Předcházející popis konkrétních provedení odkrývá obecnou povahu vynálezu v takové úplnosti, že ostatní mohou, při uplatnění znalostí běžně známých v oboru (včetně obsahu odkazů zde citovaných), tato konkrétní provedení snadno modifikovat a/nebo adaptovat pro různé aplikace, bez nepřiměřeného experimentování, bez odklonu od obecného principu vynálezu. Takovéto adaptace a modifikace proto budou spadat smyslem a rozsahem mezi obdoby popsaných provedení na základě poznatků a poučení zde uvedených. Rozumí se, že frazeologie a terminologie zde použitá je pro účely

.. —. popisu a nijak neomezuje, takže frazeologie a terminologie zde i, podaného popisu bude osobou zběhlou v oboru interpretována ve

I 25 světle poznatků a poučení zde uvedených spolu se znalostmi běžnými

L.

I v oboru.

I:

··

999

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL:

(A) JMÉNO: Yeda Research and Development Co. Ltd 5 (B) ULICE: Weizman Institute of Science (C) MĚSTO: P.O.B. 95 (D) STÁT: Rehovot (E) ZEMĚ: Israel (F) PSČ (ZIP): 76100 (G) TELEFON: 972-8-9344093 (H)FAX: 972-8-9470739 (A) JMÉNO: Wallach, David , _(B) ULICE: 24 Borochov St._____ (C) MĚSTO: Rehovot (E) ZEMĚ: Israel (F) PSČ (ZIP): 76406 (A) JMÉNO: Goltsev, Yura (B) ULICE: Weizmann Institute of Science, Beit Clore (C) MĚSTO: Rehovot ____________ (E) ZEMĚ: Israel - _______________ (F) PSČ (ZIP): 76100 (A) JMÉNO: Kovalenko, Andrei (B) ULICE: Weizmann Institute of Science, Beit Clore (C) MĚSTO: Rehovot (E) ZEMĚ: Israel

' Ť26 -

(F) PSČ (ZIP): 76100 (A) JMÉNO: Varfolomeev, Eugene (B) ULICE: Weizmann Institute of Science, Beit Clore (C) MĚSTO: Rehovot (E) ZEMĚ: Israel (F) PSČ (ZIP): 76100 (A) JMÉNO: Brodianski, Vadim ίο (B) ULICE: Rechov Hava Lutsky 10/12 (C) MĚSTO: Rehovot

-(E)-ZEMĚTTšřáěl(F) PSČ (ZIP): 76251 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Modulátory funkce FAS receptorů a dalších proteinů (iii) POČET SEKVENCÍ: 4 (iv) POČÍTAČOVÝ FORMÁT:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC compatible (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (v) ÚDAJE O PŘEDLOŽENÉ PŘIHLÁŠCE:

·· ·· · ·· ·· • ···· · · · · ♦ · · · · · Φ · ·

ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: IL PCT/IL98/00098 (vi) ÚDAJE O PŘEDCHÁZEJÍCÍCH PŘIHLÁŠKÁCH:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: IL 120367 (B) DATUM PODÁNÍ: 03-MAR-l997 (vi) ÚDAJE O PŘEDCHÁZEJÍCÍCH PŘIHLÁŠKÁCH:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: IL 120759 (B) DATUM PODÁNÍ: 01-MAY-1997 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2243 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

	GGACGTCGAG	GCATTACAAT	CGCGAAACCA	AGCCATAGCA	TGAAACAGCG	AGCTTGCAGC
25	CTCACCGACG	AGTCTCAACT	AAAAGGGACT	CCCGGAGCTA	GGGGTGGGGA	CTCGGCCTCA
	CACAGTGAGT	GCCGGCTATT	GGACTTTTGT	CCAGTGACAG	CTGAGACAAC	AAGGACCACG
	GGAGGAGGTG	TAGGAGAGAA	GCGCCGCGAA	CAGCGATCGC	CCAGCACCAA	GTCCGCTTCC

120

180

240

•	• ·· ·· · ··	• · • · • * • · ♦ » ·«
·· · · · • ·· · β © » e «	• · · · · • · · · • · · · · Φ · · · » ·· » ··
	AGGCTTTCGG	TTTCTTTGCC	TCCATCTTGG	GTGCGCCTTC	CCGGCGTCTA	GGGGAGCGAA	300
5	GGCTGAGGTG	GCAGCGGCAG	GAGAGTCCGG	CCGCGACAGG	ACGAACTCCC	CCACTGGAAA	360
GGATTCTGAA	AGAAATGAAG	TCAGCCCTCA	GAAATGAAGT	TGACTGCCTG	CTGGCTTTCC	420
	TGTTGACTGG	CCCGGAGCTG	TACTGCAAGA	CCCTTGTGAG	CTTCCCTAGT	CTAAGAGTAG	480
10	GATGTCTGCT	GAAGTCATCC	ATCAGGTTGA	AGAAGCACTT	GATACAGATG	AGAAGGAGAT	540
	GCTGCTCTTT	TTGTGCCGGG	ATGTTGCTAT	AGATGTGGTT	CCACCTAATG	TCAGGGACCT	600
	TCTGGATATT	TTACGGGAAA	GAGGTAAGCT	GTCTGTCGGG	GACTTGGCTG	AACTGCTCTA	660
15	CAGAGTGAGG	CGATTTGACC	TGCTCAAACG	TATCTTGAAG	ATGGACAGAA	AAGCTGTGGA	720
	GACCCACCTG	CTCAGGAACC	CTCACCTTGT	TTCGGACTAT	AGAGTGCTGA	TGGCAGAGAT	780
20	TGGTGAGGAT	TTGGATAAAT	CTGATGTGTC	CTCATTAATT	TTCCTCATGA	AGGATTACAT	840
	GGGCCGAGGC	AAGATAAGCA	AGGAGAAGAG	TTTCTTGGAC	CTTGTGGTTG	AGTTGGAGAA	9 0.0
	ACTAAATTTG	GTTGCCCCAG	ATCAACTGGA	TTTATTAGAA	AAATGCCTAA	AGAACATCCA	960
25	CAGAATAGAC	CTGAAGACAA	AAATCCAGAA	GTACAAGCAG	TCTGTTCAAG	GAGCAGGGAC	.1020
	AAGTTACAGG	AATGTTCTCC	AAGCAGCAAT	CCAAAAGAGT	CTCAAGGATC	CTTCÁAATAA	.1080
30	CTTCAGGCTC	CATAATGGGA	GAAGTAAAGA	ACAAAGACTT	AAGGAACAGC	TTGGCGCTCA	1140

1200

ACAAGAACCA GTGAAGAAAT	CCATTCAGGA AGAGCAAGCC		«· • « • « • · • · ·· AGAGCATACC TCGATTGCAT
·· · · · • ·« · β β · · · -*·' ATCAGAAGCT CCTAGGAATC	• ·· · · • · · · • · · · · • · · · ► *«· ·· TTTTTGCCTC TGCCTGATAA
TGAAGAGAGA	TACAAGATGA
TGGCAATGAG	ACAGAGCTTC	TTCGAGACAC'	CTTCACTTCC	CTGGGCTATG	AAGTCCAGAA
ATTCTTGCAT	CTCAGTATGC	ATGGTATATC	CCAGATTCTT	GGCCAATTTG	CCTGTATGCC
CGAGCACCGA	GACTACGACA	GCTTTGTGTG	TGTCCTGGTG	AGCCGAGGAG	GCTCCCAGAG
TGTGTATGGT	GTGGATCAGA	CTCACTCAGG	GCTCCCCCTG	CATCACATCA	GGAGGATGTT
CATGGGAGAT	TCATGCCCTT	ATCTAGCAGG	GAAGCCAAAG	atgtttttta	TTCAGAACTA

60

1320

1380

1440

1500

1560

15	TGTGGTGTCA	GAGGGCCAGC	TGGAGAACAG	CAGCCTCTTG	GAGGTGGATG	GGCCAGCGAT	1620
	GAAGAATGTG	GAATTCAAGG	CTCAGAAGCG	AGGGCTGTGC	ACAGTTCACC	GAGAAGCTGA.	1680
20	- CITCTTCTGG	AGCCTGTGTA	CTGCGGACAT'	GTČČCŤGCŤG	GÁGČAGTCTC	ACAGCTCACC	1740
	GTCCCTGTAC	CTGCAGTGCC	TCTCCCAGAA	ACTGAGACAA	GAAAGAAAAC	GCCCACTCCT	1800
—	GGATCTTCAC	ATTGAACTCA	ATGGCTACAT	gtatgattgg	AACAGCACAG	TT.TCTGCCAA---	18 60
25	GGAGAAATAT	TATGTCTGGC	TGCAGCACAC	TCTGAGAAAG	AAACTTATCC	TCTCCTACAC	1920
	ATAAGAAACC	AAAAGGCTGG	GCGTAGTGGC	TCACACCTGT	AATCCCAGCA	CTTTGGGAGG	1980
30	CCAAGGAGGG	CAGATCACTT	CAGGTCAGGA	GTTCGAGACC	AGCCTGGCCA	ACATGGTAAA	2040 '
	CGCTGTCCCT	AGTAAAAATG	CAAAAATTAG	CTGGGTGTGG	GTGTGGGTAC	CTGTGTTCCC	2100

• ·

- T30’-

t

I'.

AGTTACTTGG	GAGGCTGAGG	TGGGAGGATC	TTTTGAACCC	AGGAGTTCAG	GGTCATAGCA	2160
TGCTGTGATT	GTGCCTACGA	ATAGCCACTG	CATACCAACC	TGGGCAATAT	AGCAAGATCC	2220
CATCTCTTTA	AAAAAAAAAA	AAA				2243

(2) INFORMACE O SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 480 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová

T5 (D)^_TOP“OT7OGÍE~riněární ~ (ii) TYP MOLEKULY: protein

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:

2:

-

20

Met Ser Ala

Glu

Val

Ile

His

Gin

Val

Glu

Glu

Ala

Leu

Asp

Thr

Asp

1

5

10

15

Glu Lys Glu

Met

Leu

Leu

Phe

Leu

Cys

Arg

Asp

Val

Ala

Ile

Asp

Val

25

20

25

30

Val Pro Pro

Asn

Val

Arg

Asp

Leu

Leu

Asp

Ile

Leu

Arg

Glu

Arg

Gly

35

40

45 .

30

Lys Leu Ser

Val

Gly

Asp

Leu

Ala

Glu

Leu

Leu

Tyr

Arg

Val

Arg

Arg

50

55

60

:

»· to

1-38 -··

Μ

385

390

395

400

Phe Trp-Ser Leu Cys Thr Ala Asp Met Ser Leu Leu Glu Gin. Ser His

405

410

415

Ser Ser Pro Ser Leu Tyr Leu Gin Cys Leu Ser Gin Lys Leu Arg Gin

420

425

430

Glu Arg Lys Arg Pro Leu Leu Asp Leu His lle Glu Leu Asn Gly Tyr

435

440

445

Met Tyr. Asp Trp Asn Ser Arg Val Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Tyr Val

450

455

460

Trp Leu Gin His Thr Leu Arg Lys Lys Leu lle Leu Ser Tyr Thr Glx

465 . 470 475 ’ . 480

--------- (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 3: ---------20 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1373 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:

“

GGACGTCGAG GČATTACAAT CGCGAAACCA AGCCATAGCA TGAAACAGCG AGCTTGCAGC

·· · · · · ·· · ·· ·

44 ··· 4 4 4 4 c e · * β · · ·· ·· · „ · · · ·· · ····

- 1 \3 4 * · · · · · »4 44

CTCACCGACG AGTCTCAACT AAAAGGGACT CCCGGAGCTA GGGGTGGGGA CTCGGCCTCA 120

CACAGTGAGT GCCGGCTATT GGACTTTTGT CCAGTGACAG CTGAGACAAC AAGGACCACG 180

GGAGGAGGTG TAGGAGAGAA GCGCCGCGAA CAGCGATCGC CCAGCACCAA GTCCGCTTCC 240

AGGCTTTCGG TTTCTTTGCC TCCATCTTGG GTGCGCCTTC CCGGCGTCTA GGGGAGCGAA 300

GGCTGAGGTG GCAGCGGCAG GAGAGTCCGG CCGCGACAGG ACGAACTCCC CCACTGGAAA 360

GGATTCTGAA AGAAATGAAG TCAGCCCTCA GAAATGAAGT TGACTGCCTG CTGGCTTTCC 420

TGTTGACTGG CCCGGAGCTG TACTGCAAGA CCCTTGTGAG CTTCCCTAGT CTAAGAGTAG 480

GATGTCTGCT GAAGTCATCC ATCAGGTTGA AGAAGCACTT GATACAGATG AGAAGGAGAT 540

GCTGCTCTTT TTGTGCCGGG ATGTTGCTAT AGATGTGGTT CCACCTAATG TCAGGGACCT 600 ί* ť* ř

TCTGGATATT TTACGGGAAA GAGGTAAGCT GTCTGTCGGG GACTTGGCTG AACTGCTCTA 660

CAGAGTGAGG CGATTTGÁCC TGCTCAAACG TATCTTGAAG ATGGACAGAA AAGCTGTGGA 720

GACCCACCTG CTCAGGAACC CTCACCTTGT TTCGGACTAT AGAGTGCTGA TGGCAGAGAT 780

TGGTGAGGAT TTGGATAAAT CTGATGTGTC GTCATTAATT TTCCTCATGA AGGATTACAT 840

GGGCCGAGGC AAGATAAGCA AGGAGAAGAG TTTCTTGGAC CTTGTGGTTG AGTTGGAGAA 900

ACTAAATTTG GTTGCCCCAG AŤCAACTGGA TTTATTAGAA AAATGCCTAA AGAACATCCA 960 • · ís

δ

9 · · · · 9 · · ·

99 · 999 9

			- 195 -♦·*	• · · • · · · ·	• 9 9 9 9 9 9 ·
CAGAATAGAC	CTGAAGACAA	AAATCCAGAA	GTACAAGCAG	TCTGTTCAAG	GAGCAGGGAC	1020
AAGTTACAGG	AATGTTCTCC	AAGCAGCAAT	CCAAAAGAGT	CTCAAGGATC	CTTCAAATAA	1080
CTTCAGGATG	ATAACACCCT	ATGCCCATTG	TCCTGATCTG	AAAATTCTTG	GAAATTGTTC	1140
CATGTGATTA	ACATGGAACT	GCCTCTACTT	AATCATTCTG	AATGATTAAA	TCGTTTCATT	1200
TTCTAAATGT	GTTATAATGT	GTTTAGCCCT	TTCTTGTTGC	TGTATGTTTA	GATGCTTTCC	1260
AATCTTTTGT	TACTACTAAT	AATGCTATAA	AATAAATATC	CTTGTACTTC	TTAAAAAAAA	1320
AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAA	1373

v (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 222 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární ___ (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

Met Ser Ala Glu Val Ile His Gin Val Glu Glu Ala Leu Asp Thr Asp

10 15

Glu Lys Glu Met Leu Leu Phe Leu Cys Arg Asp Val Ala Ile Asp Val

0 ' '2 5, 3 0

• 9 ·« ·· > «· · i · · · k · · · k · · · • · · ·

99 99

I 9 9 9 9 9 9

99 9 9

9 9 9 9 9

9

9

Ser Leu Lys Asp Pro Ser Asn Asn Phe Arg Met lle Thr Pro Tyr Ala

195

200

205

His Cys Pro Asp Leu Lys lle Leu Gly Asn Cys Ser Met Glx

Claims (5)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. DNA sekvence kódující alespoň jednu isoformu G1 proteinu nebo její fragmenty a analogy, kde alespoň jedna G1 isoforma nebo

5 její fragmenty a analogy jsou schopné vázat se nebo interagovat přímo či nepřímo s MORT-1 a/nebo s kterýmkoli z MORT-1-vazebných proteinů, nebo jiných intracelulárních mediátorových/modulátorových proteinů, a jsou schopné zprostředkovat intracelulární účinek zprostředkovaný FAS-R nebo p55-TNF-R, nebo jinými cytotoxickými

10 mediátory nebo induktory.

2. DNA sekvence podle nároku 1 vybraná ze skupiny:

(a) cDNA sekvence odvozená z kódující oblasti nativní isoformy G1 proteinu;

15 (b) DNA sekvence schopné hybridizovat k sekvenci (a) za mírně stringentních podmínek, a které kódují biologicky aktivní isoformu G1 proteinu; a (c) DNA sekvence, které jsou v důsledku degenerace . genetického kódu degenerované sekvence (a) a (b), a které kódují

20 biologicky aktivní isoformu G1 proteinu.

3. DNA sekvence podle nároku 1 nebo nároku 2 obsahující alespoň část sekvence znázorněné vObr.1 a kódující alespoň jednu isoformu G1 proteinu, G1a isoformu.

4. DNA sekvence podle nároku 1 nebo nároku 2 obsahující alespoň část sekvence znázorněné v Obr.2 a kódující alespoň jednu isoformu G1 proteinu, Θ1β isoformu.

·· ·· • · « » · · I

13δ·-·

5. DNA sekvence podle nároku 3 kódující G1 isoformu s aminokyselinovou sekvencí znázorněnou v Obr.1, její fragmenty a analogy.

6. DNA sekvence podle nároku 4 kódující G1 isoformu s aminokyselinovou sekvencí znázorněnou v Obr.2, její fragmenty a analogy.

io

7. Vektor obsahující DNA sekvenci podle kteréhokoli z nároků 1-6.

8. Vektor podle nároku 7 schopný exprese v eukaryotické _hostitelské buňce_________

15 9. Vektor podle nároku 7 schopný exprese v prokaryotické hostitelské buňce.

10. Transformované eukaryotické nebo prokaryotické hostitelské buňky obsahující vektor podle kteréhokoli z nároků 7-9.

« 11. Isoforma G1 proteinu, její fragmenty nebo funkční analogy nebo |L ’’ deriváty, kódované DNA sekvencí podle kteréhokoli z nároků 1-6,

P přičemž uvedený protein, jeho fragmenty, analogy a deriváty jsou * schopné vázat se nebo interagovat přímo či nepřímo s MORT-1 a/nebo

25 s kterýmkoli z MORT-1-vazebných proteinů nebo jiných |. intracelulárních mediátorových/modulátorových proteinů a zprostředkovat intracelulární účinek zprostředkovaný FAS-R nebo p55P TNF-R, nebo jinými cytotoxickými mediátory nebo induktory.

• ·0 ♦· 9 09 ·· • •9 · · 999 0 99 9

9 99 090 9999

90 099 9 9 00 99 0 . - 09 00 9 9090 . Ί4ϋ*· ·· ·· *** ·· ·· ϊ

ř ί:

12. G1 isoforma, její fragmenty, analogy a deriváty podle nároku 11, kde uvedený protein, analogy, fragmenty a deriváty mají alespoň část aminokyselinové sekvence znázorněné v Obr. 1.

13. G1 isoforma, její fragmenty, analogy a deriváty podle nároku 11, kde uvedený protein, analogy, fragmenty a deriváty mají alespoň část aminokyselinové sekvence znázorněné v Obr. 2.

io 14. Způsob produkce alespoň jedné isoformy G1 proteinu, jejích fragmentů, analogů nebo derivátů podle kteréhokoli z nároků 11-13, vyznačující se tím, že zahrnuje pěstování transformovaných hostitelských buněk podle nároku 10, za podmínek vhodných pro expresi uvedeného proteinu, analogů nebo deriváťůT

15 uskutečnění posttranslačních modifikací dle potřeby k získání uvedeného proteinu, fragmentů, analogů nebo derivátů a izolaci uvedeného exprimovaného proteinu, fragmentů, analogů nebo derivátů.

20 15. Protilátky nebo jejich aktivní fragmenty nebo deriváty, specifické pro G1 protein, fragmenty, analogy nebo deriváty podle kteréhokoli z nároků 11-13. - ----------16. Způsob modulace buněčné smrti nebo zánětlivých procesů,

25 vyznačující se tím, že zahrnuje působení na uvedené buňky jedním nebo více G1 proteiny, analogy, fragmenty nebo deriváty podle kteréhokoli z nároků 11-13, kde působení na buňky zahrnuje zavedení jednoho nebo více proteinů, analogů, fragmentů nebo derivátů do buněk ve formě vhodné pro jejich

30 intracelulární zavedení, nebo zavedení nukleotidové sekvence kódující • ·· ·· ·· · · · · · • ·· 9 9 ·· ·· • 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9

99 99 uvedený jeden nebo více proteinů, analogů, fragmentů nebo derivátů do těchto buněk ve formě vhodného vektoru nesoucího uvedenou sekvenci, přičemž uvedený vektor je schopný vnést tuto sekvenci do buněk způsobem, že sekvence je v buňkách exprimována.

17. Způsob modulace účinku FAS-R ligandu nebo TNF na buňky nesoucí FAS-R nebo p55-R, vyznačující se tím, ž e zahrnuje působení na uvedené buňky jedním nebo více G1 proteiny, analogy, fragmenty nebo deriváty podle kteréhokoli z nároků io 11-13, schopných vázat se přímo či nepřímo k MORT-1 a/nebo ke kterémukoli z MORT-1-vazebných proteinů, kterýžto MORT-1 se váže k intracelulární doméně FAS-R, nebo schopných vázat se přímo či nepřímo k MORT-1, který se váže k TRADD, který se váže k intracelulární doméně p55-R, a tím jsou schopné

15 modulovat/zprostředkovat aktivitu uvedeného FAS-R nebo p55 TNF-R, kde působení na buňky zahrnuje zavedení jednoho nebo více proteinů, analogů, fragmentů nebo derivátů do buněk ve formě vhodné pro jejich intracelulární zavedení, nebo zavedení DNA sekvence kódující jeden nebo více proteinů, analogů, fragmentů nebo derivátů

20 do buněk ve formě vhodného vektoru nesoucího tuto sekvenci, přičemž uvedený vektor je schopný vnést sekvenci do buněk způsobem, že sekvence je v buňkách exprimována.

18. Způsob modulace účinku FAS-R ligandu nebo TNF na buňky

25 podle nároku 17, vyznačující se tím, že působení na buňky zahrnuje zavedení uvedeného G1 proteinu, analogů, fragmentů nebo derivátů do buněk, zavedení DNA sekvence kódující G1 protein, analogy fragmenty nebo deriváty do buněk ve formě vhodného vektoru nesoucího uvedenou sekvenci, přičemž vektor je schopný vnést

30 sekvenci do buněk způsobem, že sekvence je v buňkách exprimována.

f p

- 142 19. Způsob podle nároku 17 nebo 18, vyznačující se tím, že působení na buňky se provede transfekcí buněk rekombinantním živočišným virovým vektorem, zahrnující kroky:

5 (a) konstrukci rekombinantního vektoru, na bázi živočišného viru, nesoucího sekvenci kódující virový povrchový protein (ligand), který je schopný vázat se k specifickému receptorů na povrchu buňky, která nese FAS-R nebo p55-R, a druhou sekvenci kódující protein vybraný z G1 proteinu, analogů, fragmentů a derivátů io podle kteréhokoli z nároků 11-13, který při expresi v těchto buňkách je schopný modulovat/zprostředkovat aktivitu FAS-R nebo p55-R; a (b) infikování buněk vektorem die (a).

20. Způsob modulace buněčné smrti nebo zánětlivých procesů,

15 vyznačující se tím,' že zahrnuje působení na uvedené buňky jedním nebo více inhibitory jednoho nebo více proteinů/enzymů zprostředkujících buněčnou smrt nebo zánětlivé procesy, přičemž inhibitory jsou vybrány ze skupiny sestávající z : (i) jednoho nebo více G1 proteinů, analogů, fragmentů nebo derivátů

20 podle kteréhokoli z nároků 11-13, jež jsou schopné inhibovat buněčnou smrt nebo zánětlivé procesy; a (ii) inhibitorů jednoho nebo více G1 proteinů podle kteréhokoli z nároků 11-13, kdy jeden nebo více G1 proteinů zvyšuje/zesiluje nebo zprostředkuje buněčnou smrt nebo zánětlivé procesy.

21. Způsob modulace účinku FAS-R ligandu nebo TNF na buňky nesoucí FAS-R nebo p55-R, vyznačující se tím, ž e zahrnuje působení na buňky protilátkami nebo jejich aktivními fragmenty nebo deriváty podle nároku 15, přičemž působení se

30 provádí podáváním vhodného prostředku, obsahujícího uvedené

- 143 protilátky, jejich aktivní fragmenty nebo deriváty buňkám, přičemž je-li G1 protein nebo jeho části vystaven na extracelulárním povrchu buněk, prostředek je upraven pro extracelulární aplikaci, a jsou-li uvedené G1 proteiny intracelulární, tento prostředek je upraven pro

5 intracelulární aplikaci.

22. Způsob modulace účinku FAS-R ligandů nebo TNF na buňky nesoucí FAS-R nebo p55-R, vyznač u j ící se tím, ž e zahrnuje působení na buňky oligonukleotidovou sekvencí kódující io antisense sekvenci pro alespoň část DNA sekvence kódující G1 protein podle kteréhokoli z nároků 1-6, přičemž tato oligonukleotidová sekvence je schopná blokovat expresi G1 proteinu.

-23.—Způsob~podje~nároku^__227Y^_ý^_ž”Tra^_cTrj^_í^_č^_í se Π m ,

15 že uvedená oligonukleotidová sekvence se zavede do.buněk prostřednictvím viru podle nároku 19, kde tuto oligonukleotidovou sekvenci kóduje druhá sekvence viru.

24. Způsob léčby nádorových buněk nebo HlV-infikovaných buněk 20 nebo jiných nemocných buněk, vyznačující se tím, ž e zahrnuje:

---------konstrukci rekombinantního živočišného virového vektoru, který nese sekvenci kódující virový povrchový protein schopný vázat se na specifický receptor na povrchu nádorové buňky . 25 nebo na povrchový receptor HlV-infikované buňky nebo na receptor nesený jinými nemocnými buňkami, a sekvenci kódující protein vybraný z G1 proteinu, analogů, fragmentů a derivátů podle kteréhokoli z nároků 11-13, který při expresi v uvedeném tumoru, HIVinfikované buňce nebo jiné nemocné buňce je schopen zabít i 30 uvedenou buňku; a

- 144 (b) infikování uvedeného tumoru nebo HlV-infikovaných buněk nebo jiných nemocných buněk vektorem podle (a).

25. Způsob modulace účinku FAS-R ligandu nebo TNF na buňky, 5 vyznačující se tím, že zahrnuje použití ribozymu, při kterém se vektor kódující ribozymovou sekvenci, jež je schopná interagovat s buněčnou mRNA sekvencí kódující G1 protein podle kteréhokoli z nároků 11-13, zavede do uvedených buněk ve formě, jež umožňuje expresi ribozymové sekvence v buňkách, přičemž při io expresi ribozymové sekvence v buňkách dochází k interakci ribozymové sekvence s buněčnou mRNA sekvencí a k štěpení mRNA sekvence, což vede k inhibici exprese G1 proteinu v buňkách.

-26:—Způsob-podíe^-ΜβτέΉΌΚοί^ζΊΤόΤΌΚύ^Ιδ-^δΤΑΤγΤΤΓΙΠόΊΤρίΊΓΓ

15 se tím, že uvedený G1 protein, jeho analogy, fragmenty a deriváty jsou schopné se přímo či nepřímo vázat k MORT-1 a/nebo ke kterémukoli MORT-1-vazebnému proteinu, kterýžto MORT-1 se zase váže specificky k FAS-IC, nebo jsou schopné se přímo či nepřímo vázat k MORT-1 a/nebo ke kterémukoli z MORT-1-vazebných

20 proteinů, kterýžto MORT-1 se zase váže k TRADD a ten se zase váže k p55-IC.

27. Způsob izolace a identifikace proteinů podle kteréhokoli z nároků 11-13, jež jsou schopné vázat se přímo či nepřímo k MORT-1

25 proteinu a/nebo ke kterémukoli z MORT-1-vazebných proteinů, vyznačující se tím, že zahrnuje použití kvasinkového dvojhybridového postupu, při kterém jeden hybridní vektor nese sekvenci kódující uvedený MORT-1 protein a/nebo MORT-1-vazebný protein a druhý hybridní vektor nese sekvenci z cDNA nebo genomové

30 DNA knihovny, přičemž těmito vektory se transformují kvasinkové rh·

- 145 hostitelské buňky, izolují se pozitivní transformované buňky, a následně se extrahuje uvedený druhý hybridní vektor, aby se získala sekvence kódující protein, který se váže k uvedenému MORT-1 proteinu a/nebo MORT-1-vazebným proteinům.

28. Způsob podle kteréhokoli z nároků 16-27, vyznačující se tím, že uvedený protein je alespoň jednou z G1 isoforem, jejích analogů, fragmentů a derivátů.

io 29. Farmaceutický prostředek na modulaci účinku FAS-R ligandů nebo TNF nebo jiného proteinu na buňky, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku alespoň jednu isoformu G1 proteinu podle kteréhokoli z nároků 11-13, její biologicky aktivní

-fragmenty, analogyrderivátynebo7jejich“s7heši:

30. Farmaceutický prostředek na modulaci účinku FAS-R ligandů nebo TNF nebo jiného proteinu na buňky, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku rekombinantní živočišný virový vektor kódující protein schopný vázat se k receptoru na

20 buněčném povrchu a kódující alespoň jednu isoformu G1 proteinu nebo její biologicky aktivní fragmenty nebo analogy podle kteréhokoli z nároků 11-13. ____________ _________ .------------------------------31. Farmaceutický prostředek na modulaci účinku FAS-R ligandů

25 nebo TNF nebo jiného proteinu na buňky, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku oligonukleotidovou sekvenci kódující antisense sekvenci k mRNA G1 proteinu podle kteréhokoli z nároků 1-6.

• ·

- 146 - .............

32. Způsob modulace účinku na buňky indukovaného MORT-1 proteinem nebo MORT-1-vazebným proteinem nebo jiným proteinem, vyznačující se tím, že zahrnuje působení na uvedené buňky způsobem podle kteréhokoli z nároků 16-28, G1

5 proteiny, jejich analogy, fragmenty nebo deriváty, nebo sekvencemi kódujícími G1 proteiny, jejich analogy nebo fragmenty, přičemž toto působení vede k zesílení nebo k inhibici účinku zprostředkovaného MORT-1 proteinem, MORT-1-vazebným proteinem nebo jiným proteinem, a tím také účinku zprostředkovaného FAS-R nebo p55-R io nebo jiným cytotoxickým mediátorem nebo induktorem.

33. Způsob podle nároku 32, vyznačující s e tím, že G1 protein, jeho analog, fragment nebo derivát je ta část G1 proteinu, která se specificky účastní vazby k MORT-1 nebo k MORT-115 vazebnému proteinu nebo k jinému proteinu.

34. Způsob podle nároku 32 nebo 33, vyznačující se t í m , ž e uvedený G1 protein je kteroukoli z G1 isoforem, jež jsou schopné zesilovat účinek na buňky spojený s MORT-1 nebo s MORT20 1-vazebným proteinem nebo s jiným proteinem a tím také účinek na buňky spojený s FAS-R nebo s p55-R nebo s jiným cytotoxickým mediátorem nebo induktorem.

35. Způsob modulace apoptických procesů nebo procesů

25 programované buněčné smrti, vyznačující se tím, že zahrnuje působení na buňky jedním nebo více G1 proteiny, analogy, fragmenty nebo deriváty podle kteréhokoli z nároků 11-13, jež jsou schopné vázat se přímo či nepřímo k MORT-1 a/nebo ke kterémukoli z MORT-1-vazebných proteinů, kterýžto MORT-1 se váže

30 k intracelulární doméně FAS-R, nebo jsou schopné vázat se přímo či

- 147 - nepřímo k MORT-1 a/nebo ke kterémukoli z MORT-1-vazebných proteinů, kterýžto MORT-1 se váže k TRADD, který se váže k intracelulární doméně p55-R a tím jsou schopné modulovat/zprostředkovat aktivitu uvedeného FAS-R nebo p55 TNF-R,

5 přičemž působení na buňky zahrnuje zavedení jednoho nebo více proteinů, analogů, fragmentů nebo derivátů do buněk ve formě vhodné pro jejich intracelulární zavedení, nebo zavedení DNA sekvence kódující jeden nebo více proteinů, analogů, fragmentů nebo derivátů do buněk ve formě vhodného vektoru nesoucího uvedenou sekvenci,

10 přičemž tento vektor je schopný vnést sekvenci do buněk způsobem, že sekvence je v buňkách exprimována.

36. Fragment podle nároku 11, kde tímto fragmentem je peptid.

15 37. Způsob vyhledávání ligandu schopného vázat se k proteinu podle kteréhokoli z nároků 11-13, vyznačující se tím, ž e zahrnuje uvedení buněčného extraktu do kontaktu s afinitním _ chromatografickým nosičem, ke kterému je uvedený protein připojen, čímž se ligand naváže k nosiči, a eluci, izolaci a analýzu tohoto

20 ligandu.

_____________38. Způsob vyhledávání DNA sekvence kódující ligand schopný vázat se k proteinu podle kteréhokoli z nároků 11-13, vyznačující se tím, že zahrnuje použití kvasinkového

25 dvojhybridového postupu, při kterém jeden hybridní vektor nese sekvenci kódující uvedený protein a druhý hybridní vektor nese sekvence z cDNA nebo genomové DNA knihovny, transformaci kvasinkových hostitelských buněk uvedenými vektory, izolaci pozitivně transformovaných buněk, a extrakci druhého hybridního

3o vektoru, aby se získala sekvence kódující ligand.

• ·

- 148 39. Způsob identifikace a produkce ligandů schopného modulovat buněčnou aktivitu, jež je modulována/zprostředkována proteinem

MORT-1 nebo MORT-1-vazebnými proteiny, vyznačující se i

í , 5 t i m , ž e zahrnuje:

a) vyhledávání ligandů schopného vazby k polypeptidu obsahujícímu alespoň část MORT-1 nebo MORT-1vazebných proteinů vybraných z MACH proteinů, Mch4 proteinů a dalších MORT-1-vazebných proteinů;

ío b) identifikaci a charakterizaci ligandů, jiného než

MORT-1 nebo uvedené MORT-1-vazebné proteiny nebo části receptoru z rodiny TNF/NGF receptorů, o kterém bylo uvedeným vyhledávacím postupem zjištěno, že je schopen vazby; a

---——-- c) produkci—ligandů—v--podstatě—izolované rs a purifikované formě.

40. Způsob identifikace a produkce ligandů schopného modulovat buněčnou aktivitu, jež je modulována nebo zprostředkována proteinem podle kteréhokoli z nároků 11-13, v y z n a č u j i c i se

20 tím, že zahrnuje:

a) vyhledávání ligandů schopného vazby k poiypgptidu obsahujícímu alespoň část G1 a sekvence znázorněné ,, _r v Obr.1, nebo alespoň část G1p sekvence znázorněné v Obr.2;

b) identifikaci a charakterizaci ligandů, jiného než ý * 25 MORT-1 nebo MORT-1-vazebné proteiny nebo části receptoru z rodiny | TNF/NGF receptorů, o kterém bylo uvedeným vyhledávacím postupem , zjištěno, že je schopen vazby; a

I c) produkci ligandů v podstatě izolované a

L^: i purifikované formě.

ϊ - r * _: ’ s

- 149 -

41. Způsob identifikace a produkce ligandu schopného modulovat buněčnou aktivitu, jež je modulována/zprostředkována G1, vyznačující se tím, že zahrnuje:

5 a) vyhledávání ligandu schopného vazby k alespoň části G1a sekvence znázorněné vObr.1, nebo ΰ1β sekvence znázorněné v Obr.2;

b) identifikaci a charakterizaci ligandu, jiného než MORT-1 nebo MORT-1-vazebné proteiny nebo části receptoru z rodiny io TNF/NGF receptorů, o kterém bylo uvedeným vyhledávacím postupem zjištěno, že je schopen vazby; a

c) produkci ligandu v podstatě izolované a purifikované formě.

15 42. Způsob identifikace a produkce molekuly schopné přímo či nepřímo modulovat buněčnou aktivitu, jež je modulována/zprostředkována G1, vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) vyhledávání molekuly schopné modulovat aktivity,

20 jež jsou modulovány/zprostředkovány G1;

b) identifikaci a charakterizaci molekuly; a

c) produkci molekuly v podstatě izolované

I, a purifikované formě.

í

J *

U 25 43. Způsob identifikace a produkce molekuly schopné přímo či nepřímo modulovat buněčnou aktivitu, jež je modulována/zprostředkována proteinem podle kteréhokoli z nároků 11-13, vyznačující se tím, že zahrnuje:

• ·· ·· · ·· ·· • · · · · ··· · · · · • ·· ·· · ···· • · ··· · · ·· · · · • · « · « · » c c e

-150- ..............

a) vyhledávání molekuly schopné modulovat aktivity, jež jsou modulovány/zprostředkovány proteinem podle kteréhokoli z nároků 11-13;

b) identifikaci a charakterizaci molekuly; a

5 c) produkci molekuly v podstatě izolované a purifikované formě.

Zastupuje: