NO324725B1

NO324725B1 - MORT-1-protein, DNA-sekvens som koder for MORT-1 og antistoffer spesifikke for MORT-1, samt fremgangsmate for fremstilling, farmasoytiske sammensetninger og anvendelser.

Info

Publication number: NO324725B1
Application number: NO19972716A
Authority: NO
Inventors: David Wallach; Mark Boldin; Igor Mett; Eugene Varfolomeev
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1994-12-15
Filing date: 1997-06-12
Publication date: 2007-12-03
Also published as: DK0871645T3; HK1007248A1; CA2207815A1; NO972716L; ES2292172T3; WO1996018641A1; ATE377073T1; CN1105725C; EP0871645A4; AU4602296A; FI121273B; PT871645E; KR100536394B1; AU706401B2; EP0871645B1; UA58489C2; FI972457A; CA2207815C; CN1169729A; JPH10510712A

Description

MODULATORER AV FUNKSJONEN TIL FAS/APOl RESEPTORER

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse er generelt innenfor fagfeltet reseptorer som tilhører TNF/NGF-superfamilien av reseptorer og kontroll av deres biologiske funksjoner. TNF/NGF-superfamilien av reseptorer innbefatter reseptorer slik som p55 og p75 tumornekrosefaktorreseptorer (TNF-R) og FAS-ligandreseptorer (også kalt FAS/APOl eller FAS-R og vil heretter bli kalt FAS-R) og andre. Mer spesifikt angår oppfinnelsen et nytt protein, heretter kalt MORT-1 (også kalt HF-1), som bindes til intracellulær domene (IC) av Fas-R (denne intracellulære domenen betegnes Fas-IC), og det nye proteinet har evnen til å modulere funksjonen av Fas-R. Videre har MORT-1 også

evnen til selvassosiasjon og kan aktivere cellecytotoksisitet på egen hånd. Foreliggende oppfinnelse angår også en DNA-sekvens kodende for MORT-1, vektor og vertscelle inneholdende disse, samt fremstilling og anvendelser av MORT-1.

Det skal bemerkes at HF-1 (opprinnelig betegnelse) og MORT-1 (nåværende anvendte betegnelse) blir begge anvendt i beskrivelsen og betegner samme protein.

Oppfinnelsens bakgrunn

Tumornekrosefaktor (TNF-a) og lymfotoksin (TNF-8) (heretter TNF, refererer til både TNF-a og TNF-J3) er multifunksjonelle pro-inflammatoriske cytokiner dannet hovedsakelig ved mononukleær fagocytose, som har mange effekter på celler (Wallach, D. (1986) i: Interferon 7 (Ion Gresser, red.), s.83-122, Academic Press, London og Beutler og Cerami (1987)). Både TNF-a og TNF-6 initierer deres effekter ved å binde

til spesifikke celleoverflatereseptorer. Noen av effektene er sannsynligvis fordelaktige for organismen: de kan f.eks. ødelegge tumorceller eller virusinfiserte celler og forsterke antibakterielle aktiviteter i granulocytter. På denne måte bidrar TNF til forsvar av organismen mot tumorer og infeksiøse agens og bidrar til bedring av skade. TNF

kan således bli anvendt som et antitumormiddel, og ved denne anvendelsen bindes til reseptorer på overflaten av tumorceller for dermed å starte hendelser som fører til død av tumorcellene. TNF kan også bli anvendt som anti-infeksjonsmidler.

Både TNF-a og TNF-fl har også skadelige effekter. Det er vist at over-produksjon av TNF-a kan spille en viktig patogen rolle i flere sykdommer. Effektene av TNF-a, primært på vaskulaturen, er nå kjent å være en hovedårsak til symptomer av septisk sjokk (Tracey et al., 1986). I noen tilfeller kan TNF forårsake omfattende tap av vekt (cachexia) ved å undertrykke aktiviteter av adipocytter og ved å forårsake anoreksi, og TNF-a ble således kalt cachetin. Den ble også beskrevet som en mediator av skade på vev i reumatiske sykdommer (Beutler og Cerami, 1987) og en hovedmediator på skade observert i transplantat-versus-vertsreaksjoner (Piquet et al, 1987). I tillegg er TNF kjent å være involvert i inflammasjonsprosessen og i mange andre sykdommer.

To atskilte, uavhengig uttrykte reseptorer, p55 og p75 TNF-Rs, som binder både TNF-a og TNF-6 spesifikt, starter og/eller formidler de ovenfor angitte biologiske effektene av TNF. Disse to reseptorene har strukturelt ulike intracellulære domener, hvilket antyder at de signaliserer forskjellig (se Hohmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Brockhaus et al., 1990, Leotscher et al., 1990; Schall et al., 1990, Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990 og Heller et al., 1990). De cellulære mekanismene, f.eks. forskjellige proteiner og mulig andre faktorer som er involvert i intracellulær signalisering av p55 og p75 TNF-R er ennå ikke blitt utledet (i PCT/US95/05854 og slik også angitt under, beskrives for første gang nye proteiner som har evnen til å binde til p75IC og p55IC). Det er denne intracellulære signalisering som vanligvis forekommer etter binding av ligand, dvs. TNF (a eller 13) til reseptoren, som er ansvarlig for igangsetting av kaskaden av reaksjoner som til slutt resulterer i den observerte responsen til cellen på TNF.

Når det gjelder den ovenfor nevnte cytocidale effekten av TNF, blir i de fleste celler som er studert så langt, denne effekt utløst hovedsakelig av p55 TNF-R. Antistoffer mot ekstracellulær domene (ligand-bindende domene) av p55 TNF-R kan selv utløse den cytocidale effekten (se EP 412486) som korrelerer med effektivitet av reseptorkryssbinding av antistoffene, hva antas å være første trinn i generering av en intracellulær signaliseringsprosess. Mutasjonsstudier (Brakenbusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993) har videre vist at den biologiske funksjonen av p55 TNF-R avhenger av integritet av dens intracellulære domene, og således er det blitt foreslått at initiering av intracellulær signalisering fører til den cytocidale effekten av TNF som forekommer som en konsekvens av assosiasjon av to eller flere intracellulære domener av p55 TNF-R. Videre forekommer TNF (a og 6) som en homotrimer og har således blitt foreslått å indusere intracellulær signalisering via p55 TNF-R ved hjelp av dens evne til å binde til og til å kryssbinde reseptormolekylehe, det vil si forårsake reseptoraggregering. IPCT/US95/05854 og også i det etterfølgende blir det beskrevet hvordan p55IC og p55DD kan selvassosiere og indusere på en liganduavhengig måte, TNF-assosierte effekter i cellene.

Et annet medlem av TNF/NGF-superfamilien av reseptorer er FAS-reseptoren (FAS-R) som også er blitt kalt Fas-antigenet, et celleoverflateprotein uttrykt i forskjellige vev og som deler homologi med et antall celleoverflatereseptorer som inkluderer TNF-R og NGF-R. FAS-R formidler celledød i form av apoptose (Itoh et al., 1991) og synes å tjene som en negativ selektor av autoreaktive T-celler, det vil si under modning av T-celler, formidler FAS-R apoptisk død av T-celler som gjenkjenner selvantigener. Det har også blitt funnet at mutasjoner av FAS-genet (lpr) forårsaker en lymfoproliferasjonsforstyrrelse i mus som minner om den humane autoimmune sykdommen systemisk lupus erythematosus (SLE) (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). Liganden for FAS-R synes å være et celleoverflateassosiert molekyl båret av bl.a. dreper-T-celler (eller cytotoksiske T-lymfocytter - CTL) og således når slike CTL-kontaktceller bærer FAS-R, har de evne til å indusere apoptotisk celledød av FAS-R-bærende celler. Et monoklonalt antistoff har blitt fremstilt som er spesifikt for FAS-R, dette monoklonale antistoffet har evnen til å indusere apoptotisk celledød i celler som bærer FAS-R, inkludert museceller transformert med cDNA som koder for human FAS-R (Itoh et al., 1991).

Det har også blitt funnet at andre normale celler, ved siden av T-lymfocytter, uttrykker FAS-R på sin overflate og kan bli drept ved utløsning av denne reseptoren. Ukontrollert induksjon av en slik drepingsprosess er mistenkt å bidra til vevsskade i visse sykdommer, f.eks. destruksjon av leverceller i akutt hepatitt. Det å finne måter for å gjenopprette cytotoksisk aktivitet av FAS-R kan således ha terapeutisk potensial.

Siden det har blitt funnet at visse maligne celler og HIV-infiserte celler bærer FAS-R på sin overflate, kan antistoffer mot FAS-R eller FAS-R-ligand, bli anvendt til å utløse FAS-R-formidlet cytotoksiske effekter i disse, og dermed skaffe til veie en måte å bekjempe slike maligne celler eller HIV-infiserte celler (se Itoh et al., 1991). Funn av andre måter å forbedre den cytotiksiske aktiviteten av FAS-R kan derfor også ha terapeutisk potensial.

Det har lenge vært et behov for å skaffe til veie en måte for å modulere den cellulære responsen til TNF (a eller B) og FAS-R-ligand, f.eks. i patologiske situasjoner som nevnte over, der TNF eller FAS-R-liganden blir overuttfykt, er det ønskelig å hemme TNF- eller FAS-R-ligand-induserte cytocidiske effekter, mens andre situasjoner, f.eks. sårhelingsanvendelser, er det ønskelig å forbedre TNF-effekten eller i tilfelle med FAS-R, i tumorceller eller HIV-infiserte celler, er det ønskelig å forbedre FAS-R-formidlet effekt.

Et antall tilnærmelser har blitt gjort av foreliggende oppfinnere (se f.eks. europeiske søknader nr.EP 186833, EP 308378, EP 398327 og EP 412486) for å regulere de skadelige effektene av TNF ved hemming av binding av TNF til sine reseptorer ved å anvende anti-TNF-antistoffer eller ved anvendelse av løselige TNF-reseptorer (som hovedsakelig er den løselige ekstracellulære domenet av reseptorene) for å konkurrere med binding av TNF til celle-overflatebundet TNF-R. På basis av at TNF-binding til reseptorene er nødvendig for TNF-induserte cellulære effekter, har tilnærmelser blitt gjort av foreliggende oppfinnere (se f.eks. IL 101769 og dens tilsvarende EP 568925) på å modulere TNF-effekten ved modulering av aktiviteten til TNF-R. I korthet angår EP 568925 (IL 101769) en fremgangsmåte for modulering av signaltransduksjon og/eller kløyving i TNF-R, hvorved peptider eller andre molekyler enten kan reagere med reseptoren selv eller med effektorproteinene som reagerer med reseptoren, og således modulerer den normale funksjonen til TNF-R. I EP 568925 blir det beskrevet konstruksjon og karakterisering av forskjellige mutanter p55 TNF-R, som har mutasjoner i ekstracellulære, transmembranale og intracellulære domener av p55 TNF-R. På denne måten blir regioner i de ovenfor nevnte domenene av p55 TNF-R identifisert som essensielle for funksjoner til reseptoren, dvs. binding av liganden (TNF) for etterfølgende signaltransduksjon og intracellulær signalisering, som til slutt resulterer i den observerte TNF-effekten på cellene. Det blir også videre beskrevet et antall måter å isolere og identifisere proteiner, peptider eller andre faktorer som har evnen til å binde til forskjellige regioner av ovenfor nevnte domener av TNF-R, der proteinene, peptidene og andre faktorer kan være involvert i regulering eller modulering av TNF-R. Et antall måter for isolering og kloning av DNA-sekvenser som koder for slike proteiner og peptider; for konstruering av ekspresjonsvektorer for produksjon av disse proteinene og peptidene; og for fremstilling av antistoffer eller fragmenter av disse som reagerer med TNF-R eller med de ovenfor nevnte proteinene og peptidene som binder forskjellige regioner av TNF-R, blir også angitt i EP 568925. EP 568925 spesifiserer imidlertid ikke de virkelige proteinene og peptidene som binder til intracellulære domener av TNF-R (f.eks. p55 TNF-R), heller ikke beskrives gjær-to-hybridmåten for å isolere og identifisere slike proteiner eller peptider som bindes til intracellulære domener av TNF-R. Til nå har det på tilsvarende måte ikke vært noen beskrivelse av proteiner eller peptider som har evnen til å binde det intracellulære domene av FAS-R.

Når det således er ønskelig å hemme effekten av TNF, eller FAS-R-liganden, vil det være ønskelig å minske mengden eller aktiviteten av TNF-R eller FAS-R på celleoverflaten, mens en økning i mengden eller aktiviteten av TNF-R eller FAS-R vil være ønskelig når man søker en forbedret TNF eller FAS-R-ligandeffekt. Så langt har promotere av både p55 TNF-R og p75 TNF-R blitt sekvensert og analysert, og et antall nøkkelsekvensmotiv har blitt funnet som er spesifikke for forskjellige transkripsjons-regulerende faktorer, og slik kan ekspresjonen av disse TNF-R bli kontrollert på deres promoternivå, det vil si hemming av transkripsjon fra promoteren for en nedgang i antall reseptorer, og en økning av transkripsjon fra promotere for en økning i antall reseptorer (se IL 104355 og IL 109633). Tilsvarende studier som angår kontroll av FAS-R ved nivået av promoteren til FAS-R-genet har ennå ikke blitt rapportert.

Det skal imidlertid nevnes her, mens det er kjent at tumornekrosefaktor (TNF)-reseptorer og den strukturelt-beslektede reseptoren FAS-R utløser i celler, ved stimulering av leukocyttproduserte ligander, destruktive aktiviteter som fører til deres egen bortgang, er mekanismene for denne utløsningen fremdeles lite forstått. Mutasjonsstudier indikerer at FAS-R og p55 TNF-reseptoren (p55-R) som signalerer for cytotoksisitet involverer atskilte regioner i deres intracellulære domener (Brakenbusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh og Nagata, 1993). Disse regionene ("døds-domener") har sekvenslikhet. "Dødsdomenene" til både FAS-R og p55-R har tendens til å selvassosiere. Deres selvassosiasjon fremmer tilsynelatende reseptoraggregering som er nødvendig for initiering av signalisering (se PCT/US95/05854, så vel som Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al., 1995) og som ved høyere nivåer av reseptorekspresjon, kan resultere i utløsning av en liganduavhengig signalisering (PCT/US95/05854 og Boldin et al., 1995).

Forut for PCT/US95/05854 og foreliggende oppfinnelse, har det ikke vært tilveiebrakt proteiner som kan regulere effektene av ligander som tilhører TNF/NGF-superfamilien, slik som TNF eller FAS-R-ligandeffekten på celler, ved formidling av den intracellulære signaliseringsprosessen, der signaliseringen sannsynligvis styres i stor grad av intracellulære domener (IC) av reseptorer som tilhører TNF-NGF-superfamilien av reseptorer, slik som de av TNF-R, det vil si p55 og p75 TNF-R-intracellulære domener (henholdsvis p55IC og p75IC), så vel som FAS-IC.

Det er således et mål ved oppfinnelsen å skaffe til veie MORT-1-proteiner som har evnen til binding til intracellulær domene av FAS-R, disse proteinene blir for tiden antatt å være involvert i intracellulær signaliseirngsprosess initiert ved binding av FAS-ligand til reseptoren. MOP.T-1-proteinet ifølge foreliggende oppfinnelse er distinkte fra FAS-IC-bindende proteiner som er beskrevet i de tidligere refererte søknadene.

Et annet mål ved oppfinnelsen er å skaffe til veie antagonister (f.eks. antistoffer) til disse FAS-IC-bindende molekyler, som er MORT-1-proteiner som kan bli anvendt til å hemme signaliseringsprosessen, når det er ønskelig, når slike FAS-IC-bindende proteiner er positive signaleffektorer (det vil si induserer signalisering), eller for å forbedre signalerinsprosessen når det er ønskelig, når slike FAS-IC-bindende proteiner er negative signaleffektorer (det vil si hemmer signalisering).

Et annet mål ved oppfinnelsen er å anvende slike MORT-1-proteiner til å isolere og karakterisere ytterligere proteiner eller faktorer, som f.eks. kan vær involvert videre nedstrøms i signaliseringsprosessen, og/eller å isolere og identifisere andre reseptorer videre oppstrøms i signaliseringsprosessen til hvilken disse MORT-1-proteiner bindes (f.eks. andre FAS-R eller beslektede reseptorer), og således i hvis funksjon de også er involvert.

Det er videre et mål med foreliggende oppfinnelse å anvende det ovenfor nevnte MORT-1-proteiner som antigener for fremstilling av polyklonale og/eller monoklonale antistoffer til disse. Antistoffene kan i sin tur f.eks. bli anvendt for rensing av det nye MORT-1-proteinet fra forskjellige kilder, slik som celleekstrakter eller transformerte cellelinjer. Videre kan disse antistoffene bli anvendt til diagnostiske formål, f.eks. for identifisering av forstyrrelser som er beslektet med unormal funksjonering av cellulære effekter formidlet av FAS-R-reseptoren. Et ytterligere mål ved oppfinnelsen er å skaffe til veie farmasøytiske sammensetninger som omfatter det ovennevnte MORT-1-proteinet så vel som farmasøytiske sammensetninger som omfatter de ovenfor angitte antistoffer eller andre antagonister.

Oppsummering av oppfinnelsen

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det funnet et nytt protein som har evnen til binding til intracellulær domene av FAS-R. Dette FAS-IC-bindende protein kan virke som en mediator eller modulator av FAS-ligandeffekten på celler ved hjelp av formidling eller modulering av intracellulær signaliseirngsprosess som vanligvis forekommer etter binding av FAS-R-ligand ved celleoverflaten.

Dette nye proteinet har blitt betegnet HF1, eller MORT-1 (for "mediator av reseptortoksisitet"), og i tillegg til dens FAS-IC-bindingsspesifitet har andre karakteristiske egenskaper (se eksempel 1), den har en region som er homolog til "dødsdomene" (DD)-regionene av p55-TNF-R og FAS-R (p55-DD og FAS-DD) og har også dermed evnen til selvassosiasjon. MORT-1 har også evnen til å aktivere cellecytotoksisitet alene, en aktivitet som er mulig beslekted med selvassosiasjonsevnen. Det er også blitt funnet at ko-ekspresjon av regionen i MORT-1 (HF1) som inneholder "dødsdomene"-homologisekvensen (MORT-DD, til stede i C-terminaldelen av MORT-1) interfererer sterkt med FAS-indusert celledød, slik det vil bli forventet fra dens evne til å binde seg til "dødsdomenen" av FAS-IC. Under samme eksperimentelle betingelser ble det funnet at ko-ekspresjon av den delen av MORT-1 som ikke inneholder MORT-DD-regionen (N-terminal del av MORT-1, aminosyrer 1-117, "MORT-1-hode") resulterte ikke i noen interferens av FAS-indusert celledød, og dersom i det hele tatt, en noe forbedret FAS-indusert cellecytotoksisitet.

Foreliggende oppfinnelse skaffer således til veie en DNA-sekvens kjennetegnet ved at den omfatter sekvensen SEQ ID NO: 1.

Foreliggende oppfinnelsen skaffer også til veie et MORT-1-protein kjennetegnet ved at det er kodet av DNA-sekvens ifølge oppfinnelsen, der proteinet har evnen til binding til eller reagering med det intracellulære domenet av FAS-ligandreseptoren (FAS-IC).

En spesiell utførelsesform av proteinet ifølge oppfinnelsen er MORT-1-protein som har den utledede aminosyresekvensen vist i SEQ ID NO:2.

Foreliggende oppfinnelse skaffer også til veie vektorer kjennetegnet ved at den omfatter en DNA-sekvens ifølge SEQ ID NO 1. Disse vektorene har evnen til å bli uttrykt i egnede eukaryote eller prokaryote vertsceller. Transformerte eukaryote eller prokaryote vertsceller som inneholder slike vektorer er også omfattet av oppfinnelsen. Oppfinnelsen skaffer også til veie en fremgangsmåte for fremstilling av et MORT-1-protein kjennetegnet ved at det omfatter dyrking av de transformerte vertscellene ifølge oppfinnelsen under betingelser som er egnet for ekspresjon av dette protein, gjennomføring av posttranslasjonelle modifiseringer av dette proteinet nødvendig for oppnåelse av dette protein, og isolering av det uttrykte protein. I et annet trekk vil foreliggende oppfinnelse skaffe til veie antistoffer eller aktive derivater eller fragmenter av disse som er spesifikke for MORT-1-proteinet ifølge oppfinnelsen.

Et annet trekk ved oppfinnelsen er å skaffe til veie en fremgangsmåte for in vitro behandling av tumorceller eller HIV-infiserte celler eller andre syke celler, kjennetegnet ved at den omfatter:

(a) konstruering av en rekombinant animalsk virusvektor som bærer en sekvens som koder for et viralt overflateprotein som har evnen til binding til en spesifikk tumorcelle-overflatereseptor eller HIV-infisert celleoverflatereseptor eller reseptor som blir båret av andre syke celler og en sekvens som koder for et protein valgt fra MORT-1-protein ifølge krav 2, som når de blir uttrykt i tumor, HIV-infiserte eller andre syke celler, har evnen til å drepe cellen; og (b) infisering av disse tumor eller HIV-infiserte celler eller andre syke celler med denne vektor (a).

Et annet trekk ved oppfinnelsen er å skaffe til veie en fremgangsmåte for isolering og identifisering av proteiner, faktorer og reseptorer som har evnen til binding til MORT-1-proteinet, kjennetegnet ved at den omfatter anvendelse av prosedyren for affinitetskromatografi, hvori MORT-1-proteinet blir festet til affinitetskromatografimatriks, hvori det festede proteinet blir brakt i kontakt med et celleekstrakt; og proteiner, faktorer eller reseptorer fra celleekstrakter som bindes til dette festede proteinet, deretter blir eluert, isolert og analysert.

Et annet trekk ved oppfinnelsen er å skaffe til veie en fremgangsmåte for isolering og identifisering av proteiner, faktorer og reseptorer som har evnen til binding til MORT-1-proteinet kjennetegnet ved at den omfatter anvendelse av gjær-to-hybirdprosedyren, hvori en sekvens som koder for MORT-1-proteinet blir båret av en hybridvektor og sekvensen fra et cDNA eller genomisk DNA-bibliotek blir båret av en andre hybridvektoren, vektorene blir deretter anvendt til å transformere gjærvertsceller og de positivt transformerte cellene blir isolert, etterfulgt av ekstraksjon av denne andre hybridvektoren for å oppnå en sekvens som koder for et protein som bindes til MORT-1-proteinet.

Et annet trekk ved oppfinnelsen er å skaffe til veie en fremgangsmåte for isolering og identifisering av et protein som har evnen til binding til intracellulær domene av FAS-R kjennetegnet ved at den omfatter anvendelse av prosedyren med ikke-stringent Southern hybridisering etterfulgt av PCR-kloning, hvori en sekvens ifølge krav 1, eller deler derav blir anvendt som en probe for å binde sekvenser fra et cDNA eller genomisk DNA-bibliotek som har minst delvis homologi til dette, de bundne sekvensene blir deretter amplifisert og klonet ved PCR-prosedyren i kloner som koder for proteiner som har minst delvis homologi til disse sekvensene ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse skaffer også til veie en farmasøytisk sammensetning for modulering av FAS-R-ligand-effekten på celler kjennetegnet ved at den omfatter en aktiv ingrediens valgt fra gruppen bestående av et MORT-1-protein ifølge oppfinnelsen.

Et annet trekk ved oppfinnelsen angår en farmasøytisk sammensetning for modulering av FAS-R-ligand-effekten på celler kjennetegnet ved at den omfatter en rekombinant animalsk virusvektor som bærer sekvenser som koder for et protein som har evnen til binding av en celleoverflatereseptor og som koder for et MORT-1-protein ifølge oppfinnelsen.

Et annet trekk ved oppfinnelsen er anvendelse av et protein kodet av en DNA-sekvens ifølge SEQ ID NO: 1 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av tumorceller, HIV infiserte celler eller andre syke celler.

Et annet trekk ved oppfinnelsen er anvendelse ifølge oppfinnelsen, der FAS-R-ligand-effekten på celler som bærer en FAS-R moduleres.

Det skal bemerkes at MORT-1 har en distinkt region som bindes til FAS-IC og en annen distinkt region som er involvert i selvassosiasjon av MORT-1, og således kan disse atskilte regionene eller deler av disse bli anvendt uavhengig av hverandre for å identifisere andre proteiner, reseptorer etc. som har evnen til binding til MORT-1 eller til FAS-R og som kan være involvert i MORT-1- eller FAS-R-beslektede intracellulære signaliseringsprosser. MORT-1 kan ha andre aktiviteter som er forbundet med noen av de ovenfor nevnte distinkte regioner eller andre regioner av MORT-1 eller kombinasjoner av disse, f.eks. enzymatisk aktivitet som kan være beslektet med cellecytotoksiske effekter av MORT-1 på egen hånd. MORT-1 kan også bli anvendt til å spesifikt identifisere andre proteiner, peptider, etc. som kan være involvert i slike ytterligere aktiviteter som er forbundet med MORT-1.

Andre trekk og utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse blir også tilveiebrakt slik de fremkommer fra følgende detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen.

Det skal bemerkes at når følgende begreper benyttes: "Modulering av FAS-ligandeffekten på celler" og "Modulering av MORT-1-effekt på celler", er det underforstått å omfatte in vitro- så vel som in vivo-behandling.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig 1 A og B er reproduksjoner av autoradiogrammer av SDS-PAGE geler (10 %

akrylamid) som viser interaksjon mellom HF1 (MORT-1) og FAS-IC in vitro. Fig. IA viser et kontrollautoradiogram av et immunopresipitat av proteinene (fra ekstrakter av HeLa-celler transfektert med FLAG-HF1 (FLAG-MORT-1)) eller med luciferase cDNA (kontroll), immunoutfellingen blir gjennomført med et anti-FLAG-antistoff; og Fig.IB viser et autoradiogram av en representativ gel gjennomført for å evaluere in vifro-interaksjon mellom HF1 og FAS-IC ved hjelp av vurdering, autoradio-grafisk, binding av [<35>S]-metionin-metabolsk merket HF1 produsert i transfekterte HeLa-celler som et fusjonsprotein med FLAG oktapeptidet (FLAG-MORT-1) til GST, human og mus GST-FAS-IC-fusjonsprotein (GST-huFAS-IC, GST-mFAS-IC) og GST-FAS-IC-fusjonsproteiner hvori FAS-IC inneholdt en Ile- til Ala-erstatningsmutasjon i posisjon 225 (GST-mFAS-IC I225A). [<35>S]-merkede proteiner av HeLa-celler som innbefatter merkede FLAG-MORT-l-fusjonspro teiner som først har blitt ekstrahert og utsatt for interaksjon med forskjellige GST og GST-FAS-IC-proteiner (bundet til glutationperler) og deretter til SDS-PAGE.

Som kontroller i alle interaksjonseksperimentene ble ekstrakter av HeLa-celler transfektert med luciferase gjenstand for interaksjoner med GST og GST-FAS-IC-fusjonsproteiner og SDS-PAGE. Fig.IA og B er også beskrevet i eksempel 1.

Fig.l A, B og C er reproduksjoner av autoradiogram av SDS-PAGE-geler (10 %

akrylamid) i hvilke det ble separert forskjellige immunopresipitater fra transfekterte HeLa-celler og som viser in v/vo-interaksjon av HF1 (MORT-1) med FAS-IC. HeLa-cellene ble transfektert med DNA-konstruksjoner som koder for: FH1-FLAG (FLAG-MORT-1) fusjonsprotein alene, HF 1-FLAG fusjonsprotein og human FAS-R (FLAG-MORT-1 + Fas/APOl) eller human FAS-R alene (Fas/AP01)(Fig. 2A); eller med HF 1-FLAG fusjonsprotein og human p55R (FLAG-MORT1 + p55R)(fig.2B); eller med HF 1-FLAG fusjonsprotein og et chimerisk fusjonsprotein mellom human FAS-R og p55-R, hvori den ekstracellulære domenen av FAS-R var erstattet med tilsvarende region av p55-R (FLAG-MORT1 + p55-FAS chimer) eller FAS-R-p55-R chimerisk fusjonsprotein alene (p55-Fas chimer)(Fig. 2C). I alle tilfeller ble transfekterte celler metabolsk merket med [<35>S]-cystein (20 uCi/ml) og [<35>S]-metionin (40 uCi/ml) og ble utsatt for proteinekstraksjon. Proteinekstrakter fra forskjellige transfekterte celler ble deretter immunoutfelt med forskjellige antistoffer som var anti-

FLAG, anti-FAS, anti-p75-R og anti-p55-R antistoffer (aFLAG, aFAS, ap75-R og ap55-R i figurene 2A-C) og utsatt for SDS-PAGE. På venstre side av fig. 2A er det vist proteinbånd som tilsvarer FAS-R (Fas/APOl) og HF 1-FLAG (FLAG-MORT1); mellom fig. 2A og B er vist relative posisjoner av standard molekyl-vektmarkører (i kDa); og på høyre side av fig. 2C er proteinbånd som tilsvarer p55R og p55-FAS-chimer vist. Fig. 2A-C er også beskrevet i eksempel 1. Fig.3 viser en reproduksjon av et Nortern blot hvori poly A+RNA (0,3 ug) fra HeLa-celler transfektert ble probet med HF1 cDNA som beskrevet i eksempel 1.

Fig.4 viser skjematisk den preliminære nukleotid og utbredte aminosyresekvensen

til HF1 som beskrevet i eksempel 1, hvori "dødsdomenen" er understreket og som er et mulig translasjonsstartsete, det vil si den understrekte metioninside i posisjon 49 (fete typer, understreket M). Stjernen viser translasjonsstoppkoden (nukleotider 769-771). På begynnelsen og i midten av hver linje er det vist to tall som viser de relative posisjonene av nukleotidene og aminosyrene i sekvensen med hensyn på start av sekvens (5' ende), hvori de første tallene betegner nukleotid og det andre tallet betegner aminosyren.

Fig. 5 viser resultater av forsøk på å bestemme C-terminal ende av MORT-1, der fig. 5

er en reproduksjon av et autoradiogram av en SDS-PAGE-gel (10 % akrylamid) der det ble separert forskjellige MORT-1-FLAG fusjonsprodukter uttrykt i HeLa celler og metabolsk merket med 35 S-cystein og <35>S-metionin fulgt av immunout-felling med enten anti-FLAG monoklonale antistoffer (M2)(brønner 2, 4 og 6)

eller som en kontroll, anti-p74 TNF-R-antistoffer (#9)(brønner 1, 3 og 5), som beskrevet i eksempel 1. Fig.6 (A og B) viser grafisk liganduavhengig utløsning av cytocidiske effekter i celler transfektert med MORT-1, der cellelevedyktighet ble bestemt enten ved nøytralt-rød opptakanalyse (fig. 6A), eller for spesifikk bestemmelse av levedyktigheten til cellene som uttrykte transfektert DNA, ved å måle mengde av placental alkalisk fosfatase sekretert i mediet (Fig. 6B). HeLa-celler ble transfektert med tetrasyklin-kontrollerte ekspresjonsvektorer som koder for HF1 (MORT1), human FAS-IC, human p55-IC eller luciferase (kontroll), og i alle tilfeller også med en cDNA-kodende sekretert alakalisk fosfatase, som tillot evaluering av forbigående ekspresjon av disse proteinene på levedyktigheten av cellene. I både fig. 6A og 6B representerer de åpne grafene transfekterte celler dyrket i nærvær av tetrasyklin (1 ug/ml, til blokkekspresjon) og de lukkede grafene representerer transfekterte celler dyrket i fravær av tetrasyklin. Fig. 6A og B erogså beskrevet i eksempel 1. Fig. 7 er en grafisk presentasjon av effektene av forskjellige deler av M0RT-1-proteinet på cellecytotoksiske effekter formidlet av FAS-R som beskrevet i eksempel 1.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Et trekk ved oppfinnelsen angår et nytt protein MORT-1 (HF1) som har evnen til binding til intracellulær domene av FAS-R-reseptoren, et medlem av TNF/NGF-superfamilien og betraktes således som en mediator eller modulator av FAS-R, og som f.eks. har en rolle i signaliseringsprosessen som blir initiert ved binding av FAS-R-liganden til FAS-R. Aminosyre- og DNA-sekvenser av MORT-1 ifølge oppfinnelsen representerer også nye sekvenser; de fremkommer ikke i "GENEBANK" eller "PROTEIN BANK", databanker av DNA- eller aminosyresekvenser.

Foreliggende oppfinnelse angår således også DNA-sekvensen som koder for MORT-1-proteinet og MORT-1-proteiner som er kodet av DNA-sekvensene.

Det nye MORT-1-proteinet har et antall mulige bruksområder, f.eks.:

(i) Det kan bli anvendt til å etterligne eller forbedre funksjonen av FAS-R-liganden, i situasjoner der en forbedret FAS-R-ligandeffekt er ønskelig, slik som ved anti-tumor, anti-inflammatorisk eller anti-HIV-anvendelser, der FAS-R-ligandindusert cytotoksisitet er ønsket. I dette tilfelle kan MORT-1-proteinet, det vil si den cytotoksiske effekten, bli innført til cellene ved standardprosedyrer som er kjent i seg selv. Ved at MORT-1-proteinet f.eks. er intracellulært og det skal innføres bare i cellene der FAS-R-ligandeffekten er ønskelig, er et system for spesifikk innføring av dette proteinet i cellene nødvendig. En måte å gjøre dette er ved å lage et rekombinant animalsk virus, f.eks. et avledet fra Vaccinia, til DNA av hvilken følgende to gener vil bli innført: genet som koder for en ligand som bindes til celleoverflateproteinet spesifikt uttrykt ved cellene f.eks. slike som AIDs (HlV)-virus gpl20-protein som binder spesifikt til noen celler (CD4-lymfocytter og beslektede leukemier) eller en hvilken som helst annen ligand som binder spesifikt til celler som bærer et FAS-R, slik at den rekombinante virusvektoren vil ha evnen til binding av slike FAS-R-bærende celler; og genet som koder for MORT-1-proteinet. Ekspresjon av celleoverflate-bindende protein på overflaten av virus vil målrette viruset spesifikt til tumorcellen eller andre FAS-R-bærende celler, og etter dette vil den MORT-1-protein kodende sekvensen bli innført i cellene via virus, og med en gang det er uttrykt i cellene vil det resultere i en forbedring av FAS-R-ligandeffekten, og dette fører til død av tumorcellene eller andre FAS-R-bærende celler som det er ønskelig å drepe. Konstruksjon av slike rekombinante animalske virus skjer ved standardprosedyrer (se f.eks. Sambrook et al., 1989). En annen mulighet er å innføre sekvensene til MORT-1-proteinet i form av oligonukleotider som kan bli absorbert av cellene og uttrykt deri. En ytterligere mulighet er å modifisere en fremgangsmåte som er beskrevet av Lin et al. i Journal of Biological Chemistry, vol.270, nr.24, s.14255-14258,1995. (ii) Det kan bli anvendt til å hemme FAS-R-ligandeffekten, f.eks. i tilfeller slik som vevsskade ved septisk sjokk, transplantatavstøtning eller akutt hepatitt hvor det er ønskelig å blokkere FAS-R-ligandindusert FAS-R intracellulær signalisering. I denne situasjon er det f.eks. mulig å innføre i cellene ved standardprosedyre, oligonukleotider som har antisenskodende sekvens for MORT-1-protein, som effektivt vil blokkere translasjon av mRNA som koder for MORT-1-protein og dermed blokkere dens ekspresjon og føre til hemming av FAS-R-ligandeffekt. Slike oligonukleotider kan bli innført i cellene ved å anvende ovenfornevnte rekombinante virustilnærming, der den andre sekvensen som bæres av viruset er oligonukleotidsekvensen.

En annen mulighet er å anvende antistoffer spesifikke mot MORT-1-

proteinet for å hemme dets intracellulære signaliseringsaktivitet.

En annen måte for hemming av FAS-R-ligandeffekten er ved den senere utviklede ribozym-tilnærmelsen. Ribozymer er katalytiske RNA-molekyler som spesifikt kløyver RNA. Ribozymer kan bli konstruert til å kløyve mål-RNA som man velger, f.eks. mRNA som koder for MORT-1-proteinet ifølge oppfinnelsen. Slike ribozymer vil ha en sekvens som er spesifikk for MORT-1-mRNA og vil ha evne til å reagere med denne (komplementær binding) fulgt av kløyving av mRNA, og dette resulterer i en nedgang (eller fullstendig tap) i ekspresjon av MORT-1-proteinet, nivået av den minskede ekspresjonen er avhengig av nivået av ribozymekspresjonen i målcellen. For å innføre ribozymer i de valgte cellene (f.eks. de som bærer FAS-R), kan hvilken som helst velegnet vektor bli anvendt, f.eks. plasmid, animalsk virus (retrovirus)-vektorer, som vanligvis blir anvendt for dette formål (se også (i) over, der viruset har, som en andre sekvens, en cDNA som koder for ribozymsekvensen som velges). (For oversikter, metoder etc. som angår ribozymer, se Chen et al., 1992; Zhao og Pick, 1993; Shore et al., 1993; Joseph og Burke, 1993; Shimayama et al., 1993; Cantor et al., 1993;

Barinaga, 1993; Crisell et al., 1993 og Koizumi et al., 1993).

(iii) Det kan bli anvendt til å isolere, identifisere og klone andre proteiner som har evne til å binde seg til dem, f.eks. andre proteiner involvert i intracellulær signaliseringsprosess som er nedstrøms for TNF-R eller FAS-R intracellulær domene. MORT-1-proteinet, nemlig DNA-selvensen som koder for dette, kan bli anvendt i gjær-to-hybridsystem (se eksempel 1 under) hvori sekvensen av MORT-1-proteinet vil bli anvendt som "agn" for å isolere, klone og identifisere fra cDNA eller genomiske DNA-biblioteker andre sekvenser ("bytter") som koder for proteiner som kan bindes til MORT-1-protein. På samme måte kan det bli bestemt om MORT-1-proteinet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bindes til andre cellulære proteiner, f.eks. andre reseptorer av TNF/NGF-superfamilien av reseptorer. (iv) MORT-1-proteinet kan også bli anvendt for å isolere, identifisere og klone andre proteiner av samme klasse, det vil si de som bindes til FAS-R intracellulær domene eller til funksjonelt beslektede reseptorer, og som er involvert i intracellulær signaliseringsprosess. I foreliggende søknad kan det ovenfor angitte gjær-to-hybirdsystemet bli anvendt, eller det kan bli anvendt et nylig utviklet system som benytter ikke-stringent Southern hybridisering fulgt av PCR-kloning (Wilks et al., 1989). I Wilks et al.-publikasjonen blir det beskrevet identifikasjon og kloning av to antatte protein-tyrosinkinaser ved anvendelse av ikke-stringent Southern hybridisering etterfulgt av kloning med PCR basert på den kjente sekvensen av kinasemotivet, en dannet kinasesekvens. Denne tilnærmelsen kan bli anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse ved å anvende sekvensen av MORT-proteinet for å identifisere og klone de av beslektet FAS-R intracellulær domene-bindende proteiner. (v) En annen tilnærmelse til å utnytte MORT-1-proteinet ifølge oppfinnelsen, er å anvende dem i metoder for affinitets kromatografi for å isolere og identifisere andre proteiner eller faktorer til hvilken de har evnen til binding, f.eks. andre reseptorer beslektet med FAS-R eller andre proteiner eller faktorer som er involvert i intracellulær signaliseringsprosess. Ifølge foreliggende søknad kan MORT-1-proteinet bli individuelt festet til affinitetskromatografimatrikser og deretter brakt i kontakt med celleekstrakter eller isolerte proteiner eller faktorer som er mistenkt for å være involvert i intracellulær signaliseringsprosess. Etter affinitetskromatografiprosedyren, kan andre proteiner eller faktorer som bindes til MORT-1-proteinet ifølge oppfinnelsen, bli eluert, isolert og karakterisert. (vi) Som angitt over kan MORT-1-proteinet ifølge oppfinnelsen også bli anvendt som immunogener (antigener) for å produsere spesifikke antistoffer mot disse. Disse antistoffene kan også bli anvendt med det formål å rense MORT-proteinet enten fra celleekstrakter eller fra transformerte cellelinjer ved å produsere MORT-1. Disse antistoffene kan videre bli anvendt for diagnostiske formål for identifisering av forstyrrelser som er beslektet med unormal funksjon av FAS-R-ligandsystemet, f.eks. overaktive eller underaktive FAS-R-ligandinduserte cellulære effekter. Skulle slike forstyrrelser være beslektet med et misfunksjonerende intracellulært signaliseirngssystem som involverer MORT-1-proteinet, vil slike antistoffer tjene som et viktig diagnostisk verktøy. (vii) MORT-1 kan også bli anvendt som en indirekte modulator av et antall andre proteiner i lys av dens evne til å binde til andre intracellulære proteiner (såkalte MORT-1-bindende proteiner, se under), der andre intracellulære proteiner binder direkte til andre intracellulære proteiner eller en intracellulær domene av et transmembrant protein. Et eksempel på et slikt protein eller en slik intracellulær domene er den velkjente p55 TNF-reseptoren, intracellulær signalisering av

denne blir modulert ved et antall proteiner som bindes direkte til den intracellulære domenen (se søknad under behandling IL 109632). Det er faktisk blitt isolert et slikt MORT-1-bindende protein (se under og eksempel 2) som bindes til intracellulærdomene av p55 TNF-reseptoren.

Med det formål å modulere disse andre intracellulære proteinene eller intracellulære domenene av transmembranale proteiner, kan MORT-1 bli innført i celler på et antall måter som nevnt over i punkt (ii).

Det skal også bemerkes at isolering, identifikasjon og karakterisering av MORT-1-proteinet ifølge oppfinnelsen kan bli gjennomført ved å anvende en hvilken som helst av velkjente standard screeningprosedyrer. En av disse screeningprosedyrene, f.eks. gjær-to-hybridprosedyren som er fremsatt her (eksempel 1) ble anvendt for å identifisere MORT-1-proteinet ifølge oppfinnelsen. På samme måte som angitt over og under, kan andre fremgangsmåter bli benyttet, slik som affinitetskromatografi, DNA-hybridiseringsprosedyre etc., slike som er velkjent innenfor fagområdet, for å isolere, identifisere og karakterisere MORT-1-proteinet i oppfinnelsen eller isolere, identifisere og karakterisere ytterligere proteiner, faktorer, reseptorer etc. som har evnen til binding til MORT-1-proteinet ifølge oppfinnelsen.

Det skal videre bemerkes at blant de karakteristiske egenskapene til MORT-1 er dens evne til å bindes til FAS-IC og dens evne til å selvassosiere. MORT-1 har også evnen til å aktivere cellecytotoksisitet på egen hånd, en aktivitet som er beslektet med selvassosiasjonsevnen. Det er vist (se eksempel 1) at den delen av MORT-1 som bindes til FAS-IC er forskjellig fra den delen av MORT-1 som er involvert i selvassosiasjon. MORT-1 kan også ha andre aktiviteter som kan være en funksjon av de ovenfor angitte distinkte delene av MORT-1-molekylet eller andre deler av molekyler i kombinasjoner med en hvilken som helst av disse delene. Disse andre aktivitetene kan være enzymatiske eller vedrøre binding av andre proteiner, f.eks. MORT-1-bindingsproteiner, eller andre reseptorer, faktorer etc. MORT-1 kan således bli anvendt i ovenfor nevnte metoder for å modulere FAS-R-ligandeffektene eller dens egne MORT-1-formidlede cellulære effekter, eller den kan bli anvendt for modulering av andre cellulære signaliseringsprosesser som er beslektet med andre reseptorer, faktorer etc.

I forbindelse med dette trekket ifølge oppfinnelsen kan mer spesifikt det MORT-1-kodende DNA-molekylet selv og mutasjoner derav (det vil si kodende analoger eller aktive fraksjoner av MORT-1) bli anvendt for genterapi (det vil si ved hjelp av de måter som er angitt i anvendelse (i) og (ii) over), for modulering av aktivitet til FAS-R (eller modulering eller mediering av FAS-ligandeffekten på cellene). Da MORT-1 også har en cytotoksisk effekt på cellene, kan disse MORT-1- eller mutant MORT-1-kodende DNA-molekylene også bli anvendt i genterapi for modulering av MORT-1-effekten i celler (også ved hjelp av anvendelse (i) og (ii) over). I disse genterapianvendelser kan MORT-1 bli anvendt på tre måter: (a) hele MORT-1-proteinet som både har FAS-IC og MORT-l-bindingsevne (det vil si inneholder de to regionene av MORT-1, der en av disse er involvert i binding til FAS-IC og den andre er involvert i selvassosiasjon av MORT-1) kan bli anvendt til å modulere FAS-R og MORT-1-assosierte effekter; (b) den delen av MORT-1 kan bli anvendt for indusering av en "dominant negativ"-effekt på FAS-IC, det vil si hemming av FAS-R-formidlede cellulære effekter, eller kan bli anvendt for indusering av en "oppnåelse av funksjon"-effekt på FAS-IC, det vil si en forbedring av FAS-R-formidlede cellulære effekter; og

(c) den delen av MORT-1 som spesifikt bindes til MORT-1, kan bli anvendt for induksjon av "dominant negativ"- eller "oppnådd funksjon"-effekter på MORT-1, det vil si enten hemming eller forbedring av MORT-1-assosierte cellulære effekter.

Slik det er angitt i anvendelse (vi) over, kan MORT-1-proteinet bli anvendt til å generere antistoffer spesifikke mot MORT-1. Disse antistoffene eller fragmentene av disse kan bli anvendt som angitt i detalj i det etterfølgende, og det er underforstått at i disse anvendelsene er det antistoffer eller fragmenter av disse som er spesifikke mot MORT-1. Når det gjelder antistoffer som er nevnt her og i det etterfølgende, menes begrepet "antistoff å innbefatte polyklonale antistoffer, monoklonale antistoffer (mAbs), kimære antistoffer, anti-iodotypiske antistoffer (anti-Id) og antistoffer som kan bli merket i oppløselig og bundet form, så vel som fragmenter av disse som er fremstilt ved en hvilken som helst kjent teknikk, slik som men ikke begrenset til, enzymatisk kløyving, peptidsyntese eller rekombinante teknikker. Polyklonale antistoffer er heterogene populasjoner av antistoffmolekyler avledet fra sera fra dyr immunisert med et antigen. Et monoklonalt antistoff inneholder en hovedsakelig homogen populasjon av antistoffer spesifikke mot antigenet, hvilke populasjoner inneholder hovedsakelig tilsvarende epitopbindingssteder. Mab kan bli oppnådd ved metoder som er kjent innenfor fagområdet, se f.eks. Kohler og Milstein, Nature. 256:495-497 (1975); US Patent nr.4.376.110; Ausubel et al., red., Harlow og Lane ANTIBODIES : A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); og Colligan et al., red., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. og Wiley Interscience, N.Y., (1992,1993), innholdet av disse referansene er innbefattet i sin helhet her ved referanse. Slike antistoffer kan være av en hvilken som helst immunoglobulinklasse som innbefatter IgG, IgM, IgE, IgA, GILD og en hvilken som helst underklasse av disse. Et hybridom som produserer mAb ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli dyrket in vitro, in situ eller in vivo. Produksjon av høyere titre av mAb in vivo eller in situ gjør at disse for tiden er de foretrukne produksjonsmetoder.

Kimære antistoffer er molekyler der forskjellige deler av disse er avledet fra forskjellige dyrearter, slik som de som har en variabel region avledet fra en mus-mAb og en human immunglobulinkonstant region. Kimære antistoffer blir primært anvendt for å redusere immunogenisitet i anvendelse og for å øke utbyttet i produksjon, f.eks. der mus-mAb har høyere utbytter fra hybridomer men høyere immunogenisitet hos mennesker, slik at human/mus-kimært mAb blir anvendt. Kimære antistoffer og fremgangsmåte for deres fremstilling er kjent innen fagområdet (Cabilly et al., Proe. Nati. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643.646 (1984); Cabilly et al., European Patent Application 171496 (utgitt 19. februar 1985); Morrison et al., European Patent Application 173494 (utgitt 5. mars 1986); Neuberger et al., PCT Application WO 8601533 (utgitt 13. mars 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson et al., International Patent Application nr. WO8702671 (utgitt 7. mai 1987); Liu et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Better et al., Science 240:1041-1043

(1988); og Harlow og Lane, ANTIBODIES : A LABORATORY MANUAL, supra. Disse referansene er i sin helhet innbefattet her ved referanse.

Et anti-iodotypisk (anti-Id) antistoff er et antistoff som gjenkjenner unike determinanter som generelt er assosiert med det antigen-bindende sete til et antistoff. Et Id-antistoff kan bli fremstilt ved immunisering av et dyr av samme art og genetisk type (f.eks. musestamme) som kilden for mAb med mAb til hvilken et anti-Id blir fremstilt. Det immuniserte dyret vil gjenkjenne og respondere på de iodotypiske determinantene av immuniseringsantistoffet ved fremstilling av et antistoff mot disse iodotypiske determinanter (anti-Id-antistoff). Se f.eks. US Patent 4.699.880, som med dette er innbefattet her med referanse.

Anti-Id-antistoffet kan også bli anvendt som et "immunogen" for å indusere en immunorespons i et annet dyr, ved produsering av et såkalt anti-anti-Id-antistoff. Anti-anti-Id kan være epitopisk identisk med det opprinnelig mAb som induserte anti-Id. Ved således å anvende antistoffer mot de iodotypiske determinantene av en mAb, er det mulig å identifisere andre kloner som uttrykker antistoffer av identisk spesifisitet.

Mab som således blir generert mot MORT-1-proteinet kan bli anvendt for å indusere anti-Id-antistoffer i egnede dyr, slik som BALB/c-mus. Miltceller fra slike immuniserte mus ble anvendt til å produsere anti-Id-hybridomer som utskiller anti-Id-mAb. Anti-Id-mAb kan videre bli koblet til en bærer slik som nøkkelhull-limpet hemocyanin (KLH) og ble anvendt til å immunisere ytterligere BALB/c-mus. Sera fra disse mus vil inneholde anti-Id-antistoffer som har bindingsegenskaper som er opprinnelig mAb-spesifikke for en epitope av ovenfor nevnte MORT-1-protein. Anti-Id-mAb har således deres egne idiotypiske epitoper eller "idiotyper" som er strukturelt lik epitopen som blir evaluert, slik som GRB protein-a.

Begrepet "antistoffet" menes også å innbefatte både intakte molekyler så vel som fragmenter av disse, slik som f.eks. Fab og F(ab')2, som har evnen til binding av antigen. Fab og F(ab')2-rfagmenter mangler Fc-fragmentet av intakt antistoff, fjernes raskere fra sirkulasjonen, og kan ha mindre ikke-spesifikk vevsbinding enn et intakt antistoff (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-25 (1983)).

Det skal bemerkes at Fab og F(ab')2 og andre fragmenter av antistoffene som er nyttige ifølge foreliggende oppfinnelse, kan bli anvendt for påvisning og kvantifisering av MORT-1-proteinet i henhold i metoden som her er beskrevet for intakte antistoffmolekyler. Slike fragment blir typisk produsert ved proteolytisk kløyving, ved å anvende enzymer slik som papain (for å produsere Fab-fragmenter) eller pepsin (for å produsere F(ab ')2-fragmenter).

Et antistoff sies å ha "evne til binding" av molekyl dersom det har evnen til spesifikt å reagere med molekylet for dermed å binde molekylet til antistoffet. Begrepet "epitope" menes å referere til den delen av et hvilket som helst molekyl som har evnen til å bli bundet av et antistoff som også kan bli gjenkjent av dette antistoffet. Epitoper eller "antigene determinanter" består vanligvis av kjemisk aktive overflategrupper av molekyler slik som aminosyrer eller sukkersidekjeder og har spesifikke tredimensjonal-strukturelle karaktertrekk så vel som spesifikke ladningskaraktertrekk.

Et "antigen" er et molekyl eller en del av et molekyl som har evnen til å bli bundet til et antistoff som i tillegg har evnen til å indusere et dyr til å fremstille antistoff som har evnen til binding til en epitope av dette antigenet. Et antigen kan ha en eller flere enn en epitope. Den spesifikke reaksjon som det er referert til over menes at antigenet vil reagere, på en meget selektiv måte, med tilsvarende antistoff og ikke med utallige andre antistoffer som kan bli fremkalt av andre antigener.

Antistoffene, inkludert fragmenter av antistoffer som er nyttige ifølge foreliggende

oppfinnelse, kan bli anvendt til kvantitativ eller kvalitativt å påvise MORT-1 i en prøve eller for å påvise tilstedeværelsen av celler som uttrykker MORT-1 ifølge foreliggende oppfinnelse. Dette kan bli gjennomført ved immunfluorescensteknikker som benytter et fluorescerende merket antistoff (se under) koblet med lys-mikroskopisk, flowcyto-metrisk eller fluorometrisk påvisning.

Antistoffene (eller fragmenter av disse) som er nyttige i foreliggende oppfinnelse kan benyttes histologisk, som i immunfluorescens eller immunelektronmikro-skopi, for in sz'tø-påvisning av MORT-1 ifølge foreliggende oppfinnelse. In srtM-påvisning kan bli gjennomført ved fjerning av en histologisk prøve fra en pasient, og tilveiebringe det merkede antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse til en slik prøve. Antistoffet (eller fragment) blir fortrinnsvis tilveiebrakt ved påføring eller pålegging av det merkede antistoff (eller fragment) på en biologisk prøve. Ved anvendelse av en slik prosedyre er det mulig å ikke bare bestemme tilstedeværelse av MORT-1, men også dens fordeling på det undersøkte vev. Ved å anvende foreliggende oppfinnelse, vil en person med kunnskap innenfor fagområdet anerkjenne at en hvilken som helst av tallrike variasjoner av histologiske metoder (slik som fargeprosedyre) kan bli modifisert for å oppnå en slik in sifw-påvisning.

Slike analyser for MORT-1 ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter typisk inkubering av en biologisk prøve, slik som et biologisk fluid, vevsekstrakt, nylig høstede celler slik som lymfocytter eller leukocytter, eller celler som har blitt inkubert i vevskultur, i nærvær av et detekterbart merket antistoff som har evnen til identifisering av MORT-1-proteinet, og påvisning av antistoff ved en hvilken som helst av et antall teknikker som er velkjente innenfor fagområdet.

Den biologiske prøven kan bli behandlet med et fastfasestøttemateriale eller -bærer slik som nitrocellulose, eller annen fastfasestøttemateriale eller -bærer som har evnen til immobilisering av celler, cellepartikler eller oppløselige proteiner. Støttematerialet eller bæreren kan deretter bli vasket med egnede buffere etterfulgt av behandling med et detekterbart merket antistoff i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse som angitt over. Fastfasestøttemateriale eller -bæreren kan deretter bli vasket med bufferen en andre gang for å fjerne ubundet antistoff. Mengden av bundet markør på denne fastfasebæreren kan deretter bli detektert på konvensjonelle måter.

Uttrykkene "fastfasestøttemateriale", "fastfasebærer", "faststoffstøttemateriale", "faststoffbærer", "støttemateriale" eller "bærer" har til hensikt å innbefatte en hvilken som helst støtte eller bærer som har evnen til binding av antigen eller antistoffer. Velkjente støtter eller bærere innbefatter glass, polystyren, polypropylen, polyetylen, dekstran, nylonamylaser, naturlige eller modifiserte celluloser, polyakrylamider, gabbro og magnetitt. Egen-skapene til bæreren kan enten være oppløselige i en viss grad eller uoppløselige i forbindelse med foreliggende oppfinnelse. Bærematerialet kan i virkeligheten ha en hvilken som helst mulig struktur eller konfigurasjon, så lenge det koblede molekylet har evnen til binding til et antigen eller antistoff. Støttematerialet eller bærekonfigurasjonen kan være sfærisk som i en perle, sylindrisk som på innsiden av et reagensrør, eller den ytre overflaten av en stav. Overflaten kan alternativt være flat slik som et ark, teststripe etc. Foretrukne støttematerialer eller bærere innbefatter polystyrenperler. Personer med kunnskap innenfor fagområdet vil være kjent med mange andre egnede bærere for binding av antistoffer og antigen, eller vil ha evnen til å fastslå det samme ved anvendelse av rutineeksperimentering.

Bindingsaktiviteten til en gitt produksjonsserie av antistoff, fra oppfinnelsen angitt over, kan bli bestemt i henhold til velkjente metoder. Personer med kunnskap innen fagområdet vil ha evnen til å bestemme operative og optimale analysebetingelser for hver bestemmelse ved å benytte rutineeksperimentering.

Andre slike trinn som vasking, omrøring, risting, filtrering o.l. kan bli tilført analysen, slik det er vanlig eller nødvendig for den spesielle situasjonen.

En av måtene hvori et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli detekterbart merket, er ved binding av samme til et enzym og anvende det i en enzymimmunanalyse (EIA). Dette enzymet i sin tur, når det senere eksponeres for et passende substrat, vil reagere med substratet på en måte slik at det produserer en kjemisk del som kan bli detektert, f.eks. ved spektrofotometri, fluorometri eller ved visuelle måter. Enzymer som kan bli anvendt som detekterbar markør av antistoffet inkluderer men er ikke begrenset til malatdehydrogenase, stafylokokkal nuklease, delta-5-steroidiso-merase, gjæralkoholdehydrogenase, alfa-glyserofosfatdehydrogenase, triosefosfatiso-merase, pepperrotperoksidase, alkalisk fosfatase, asparaginase, glukoseoksidase, beta-galaktosidase, ribonuklease, urease, katalase, glukose-6-fosfatdehydrogenase, glyko-amylase og acetylcholinesterase. Påvisning kan bli gjennomført ved kolorimetriske metoder som benytter et kromogent substrat for enzymet. Påvisning kan også bli gjennomført ved visuell sammenligning av grad av enzymreaksjon av et substrat sammenlignet med tilsvarende fremstilte standarder.

Påvisningen kan gjennomføres ved å anvende hvilken som helst av tallrike andre immunanalyser. F.eks. ved radioaktivitet av merking av antistoffer eller antistoff-fragmenter, er det mulig å detektere R-PTPase ved anvendelse av en radioimmun-analyse (RIA). En god beskrivelse av RIA kan man finne i Laboratory Techniques and Biochemistry i Molecular Biology av Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) med særlig referanse til kapitlet som har tittel "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" av Chard, T., som her er innbefattet ved referanse. Den radioaktive isotopen kan bli påvist på slike måter som ved anvendelse av en y-teller, en scintillasjonsteller eller ved autoradiografi.

Det er også mulig å merke et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse med en fluorescerende forbindelse. Når det fluorescerende merkede antistoffet blir eksponert for lys av riktig bølgelengde, kan dets tilstedeværelse bli detektert på grunn av fluorescens. Blant de mest vanlig anvendte fluorescerende merkingsforbindelsene, er fluorescens-isotiocyanat, rhodamin, phycoerytrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-ftaldehyd og fluorescamin.

Antistoffet kan også bli påvist merket ved å anvende fluorescensutsendende metaller, slik som <152>E, eller andre av lantanidserien. Disse metallene kan bli festet til antistoffet slik som metallchelaterende grupper som dietylentriaminpentaeddiksyre (ETPA).

Antistoffet kan også bli merket med en påvisbar markør ved kobling til en chemiluminiserende forbindelse. Tilstedeværelse av det chemiluminiserende merkede antistoffet blir deretter bestemt ved påvisning av tilstedeværelse av luminescens som fremkommer under forløpet av en kjemisk reaksjon. Eksempler på særlig nyttige chemiluminiserende merkingsforbindelser er luminol, isoluminol, teromatisk akridinester, imidazol, akridiniumsalt og oksalatester.

På samme måte kan en bioluminiserende forbindelse bli anvendt til å merke antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse. Bioluminiscens er en type av chemiluminescens funnet i biologiske systemer, hvori et katalytisk protein øker effekten av den chemiluminiserende reaksjonen. Tilstedeværelsen av en bioluminiserende protein blir bestemt ved påvisning av tilstedeværelse av luminescens. Viktige bioluminiserende forbindelser med det formål å merke, er luciferin, luciferase og aequorin.

Et antistoffmolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli tilpasset for utnyttelse i en immunometrisk analyse, også kjent som en "to-sete" eller "sandwish" analyse. I en typisk immunometrisk analyse blir en mengde av umerket antistoff (eller fragment av antistoff) bundet til en faststoffstøttemateriale eller -bærer og en mengde av detekterbart merket oppløselig antistoff blir tilsatt for å muliggjøre påvisning og/eller kvantifisering av det ternære komplekset dannet mellom fastfaseantistoff, antigen og merket antistoff. Typiske og foretrukne immunometriske analyser innbefatter "forover"-analyser, hvori antistoffet bundet til fastfasen blir brakt i kontakt med prøven som blir testet for å ekstrahere antigenet fra prøven ved dannelse av et binært fastfase-antistoff-antigenkompleks. Etter en egnet inkubasjonsperiode, blir faststoffstøttematerialet eller -bæreren vasket for å fjerne resten av fluidprøven, inkludert ureagert antigen, om noe, og brakt i kontakt i oppløsning som inneholder en ukjent mengde merket antistoff (som fungerer som et "reporter-molekyl". Etter en andre inkubasjonsperiode som tillater det merkede antistoffet å kompleksbinde med antigen bundet til fastfasestøttematerialet eller -bæreren gjennom umerket antistoff, blir det faste støttematerialet eller -bæreren vasket en andre gang for å fjerne ureagert merket antistoff. I en annen type av "sandwich"-analyse som også kan være nyttig med antigenet ifølge foreliggende oppfinnelse, blir de såkalte "samtidige" og "reverse" analyser anvendt. En samtidig analyse involverer et enkelt inkubasjonstrinn når antistoff bundet til fastfasestøttematerialet eller -bæreren og merket antistoff begge blir tilsatt prøven som blir undersøkt samtidig. Etter at inkubasjon er fullført, blir fastfasebæreren vasket for å fjerne resten av fluidprøven og ikke-kompleks merket antistoff. Tilstedeværelse av merket antistoff assosiert med det faste støttematerialet eller -bæreren blir deretter bestemt slik det vil være i en konvensjonell "forover" sandwich-analyse.

I "revers"-analysen blir trinnvis tilsetning først av en oppløsning av merket antistoff til fluidprøven etterfulgt av tilsetning av umerket antistoff bundet til fastfasetøtte-materialet eller -bærer etter en egnet inkubasjonsperiode er utnyttet. Etter en andre inkubasjon blir fastfasen vasket på konvensjonell måte for å fri den for resten av prøven som blir testet og oppløsningen av ureagert merket antistoff. Bestemmelse av merket antistoff forbundet med et fast støttemateriale eller bærer blir deretter bestemt som i "samtidig" og "forover" analyser.

MORT-1 ifølge oppfinnelsen kan deretter bli fremstilt ved en hvilken som helst standard rekombinant DNA-prosedyre (se f.eks. Sambrook et al., 1989), hvori egnete eukaryote eller prokaryote vertsceller blir transformert ved passende eukaryote eller prokaryote vektorer som inneholder sekvenser som koder for proteinet. Foreliggende oppfinnelse angår således også slike ekspresjonsvektorer og transformerte verter for produksjon av proteiner ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse angår også farmasøytiske sammensetninger som omfatter rekombinante dyrevirusvektorer som koder for MORT-1-protein, der vektoren også koder for et virusoverflateprotein som har evnen til binding av spesifikke målceller

(f.eks. cancerceller) overflateproteiner for å dirigere innsetting av MORT-1-sekvensen i cellene. Andre trekk ved oppfinnelsen vil bli tydelige fra etterfølgende eksempler.

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet mer detaljert i de følgende eksempler og etterfølgende tegninger: EKSEMPEL 1: Kloning og isolering av MORT-l-protein som bindes til intracellulær domene av FAS-R

( i ) To- hvbridscreen og to- hvbrid fi- galaktosidase- ekspresionstest.

For å isolere proteiner som reagerer med intracellulær domene av FAS-R, blir gjær-to-hybridsystemet anvendt (Fields og Song, 1989; se også tilsvarende IL 109632,112002 og 112692). I korthet er dette to-hybridsystemet en gjærbasert genetisk analyse for å detektere spesifikke protein-proteininteraksjoner in vivo ved gjenoppretting av en eukaryotisk transkripsjonsaktivator slik som GAL4, som har to separate domener, en DNA-bindende og en aktiverende domene, hvilke domener når de blir uttrykt og bundet sammen for å danne et gjenopprettet GAL4-protein, har evnen til binding til en oppstrøms aktiveringssekvens, som i sin tur aktiverer en promoter som regulerer ekspresjon av et reportergen, slik som lacZ eller HIS3, ekspresjonen som raskt ble observert i de dyrkede cellene. I dette systemet blir genene for de aktuelle reagerende proteinene klonet inn i separate ekspresjonsvektorer. I en ekspresjonsvektor blir sekvensen av et aktuelt protein klonet i fase med sekvensen til GAL4 DNA-bindende domene for å generere et hybridprotein med GAL4 DNA-bindende domene, og i den andre vektoren blir sekvensen av det andre aktuelle proteinet klonet i fase med sekvensen til GAL4-aktiveringsdomenet for å generere et hybridprotein med GAL4-aktiverende domene. De to hybridvektorene blir deretter ko-transformert inn i en gjærvertsstamme som har et lacZ eller HIS3-reportergen under regulering av oppstrøms GAL4 bindingsseter. Bare disse transformerte vertscellene (kotransformanter) hvori de to hybridproteinene blir uttrykt og har evnen til å reagere med hverandre, vil ha evnen til ekspresjon av reportergenet. I tilfellet med lacZ-reportergenet vil vertsceller som uttrykker antigenet få blå farge når X-gal blir tilsatt kulturen. Blå kolonier er således indikative på det faktum at de to klonede aktuelle proteinene har evnen til reaksjon med hverandre.

Ved å anvende dette to-hybridsystemet, ble intracellulær domene, FAS-IC, klonet separat i vektoren pGBT9 (som bærer GAL4 DNA-sekvensen, tilveiebrakt av

CLONTECH, USA, se under), for å skape fusjonsproteiner med GAL4 DNA-bindingsdomene. For kloning av FAS-R i pGBT9, ble et klon som koder for full-lengde cDNA-sekvens av FAS-R (se tilsvarende IL 111125) anvendt, fra hvilken den intracellulære domenen (IC) ble tatt ut ved standardprosedyre ved å anvende forskjellige restriksjonsenzymer og deretter isolert ved standardprosedyre og innsatt i pGBT9-vektoren åpnet, i sin multippel kloningsseteregion (MCS), med tilsvarende egnede restriksjonsenzymer. Det skal bemerkes at FAS-IC strekker seg fra residier 175-319 av intakt FAS-R, denne delen som inneholder residiene 175-319 blir FAS-IC innsatt i pGBT9-vektoren (se også IL 111125).

Hybridvektoren over (chimerisk) ble deretter kotransfektert sammen med et cDNA-bibliotek fra humane HeLa-celler klonet i pGAD GH-vektoren, som bærer GAL4-aktiverende domener, inn i HF7c gjærvertsstammen (alle de ovenfor angitte vektorer, pGBT9 og pGAD GH som bærer HeLa-celle cDNA-bibliotek, og gjærstammen ble innkjøpt fra Clontech Laboratories, Inc., USA som en del av MATCHMAKER Two-Hybrid System, #PT1265-1). Kotransfektert gjær ble selektert for deres evne til å vokse i medium som mangler histidin (His"-medium), der dyrkede kolonier er indikasjon på positive transformanter. De selekterte gjærklonene ble deretter testet for deres evne til å uttrykke lacZ-genet, d.v.s. for deres LAC Z-aktivitet, og dette ved tilsetning av X-gal til dyrkningsmediet, som blir katabolisert for å danne et blåfarget produkt med B-galaktosidase, enzymet som er kodet av lacZ-genet. Blå kolonier er således indikasjon på et aktivt lacZ-gen. For aktivitet av lacZ-genet, er det nødvendig at GAL4-transkripsjonsaktivatoren er til stede i aktiv form i transformerte kloner, nemlig at GAL4 DNA-bindende domener som er kodet av ovenfor nevnte hybridvektor blir kombinert riktig med en GAL4-aktiveringsdomene som er kodet av den andre hybridvektoren. En slik kombinasjon er mulig bare dersom to proteiner sammensmeltet med hverandre av GAL4-domenet har evnen til stabil reaksjon (binding) med hverandre. His<+> og blå kolonier (LAC Z<+>) som blir isolert er således kolonier som er blitt ko-transfektert med en vektor som koder for FAS-IC og en vektor som koder for et proteinprodukt av human HeLa-celleopprinnelse, som har evnen til binding stabilt til

FAS-IC.

Plasmid-DNA fra ovenfor nevnte His<+>, LAC Z<+> gjærkolonier ble isolert og elektroporert i E. coli stamme HB101 ved standardprosedyrer, etterfulgt av seleksjon av Leu<+> og Ampicillin-resistente transformanter, disse transformantene er de som bærer hybrid-pGAD GH-vektoren som har både Amp<R> og Leu<2->kodende sekvenser. Slike transformanter er derfor kloner som bærer sekvensen som koder for nylig identifiserte proteiner som har evnen til binding til FAS-IC. Plasmid-DNA ble deretter isolert fra disse transformerte E. coli og testet på nytt med: (a) retransformering av dem med opprinnelige FAS-R intracellulære domene-hybridplasmid (hybrid pGTB9 som bærer FAS-IC) i gjærstamme HF7 slik det er angitt over. Som kontroller blir vektorer som bærer irrelevante proteinkodende sekvenser, f.eks. pACT-lamin eller pGBT9 alene, anvendt for ko-transformasjon med FAS-IC-bindende protein (det vil si MORT-l)-enkodende plasmid. Kotransformert gjær ble deretter testet for vekst av His"-medium alene, eller med forskjellige nivåer av 3-aminotriazol; og (b) retransformering av plasmid-DNA og opprinnelig FAS-IC-hybridplasmid og kontrollplasmider beskrevet i (a) i gjærvertsceller av stamme SFY526 og bestemmelse av LAC Z<+->aktivitet (effektivitet av 6-galdannelse, det vil si blåfargedannelse).

Resultatene av testene over viste at mønsteret av vekst av koloniene i His"-medium var identisk med mønstre av LAC Z-aktivitet, slik det ble fastslått ved fargen på kolonien, det vil si His<+->kolonier var også LAC Z<+>. LAC Z-aktivitet i flytende kultur (foretrukne dyrkningsbetingelser) ble videre bestemt etter transfeksjon av GAL4 DNA-binding og aktiveringsdomenehybider i SFY526-gjærverter som har en bedre LAC Z-induserbarhet med GAL4 transkripsjonsaktivator enn den til HF7-gjærvertsceller.

Ved å anvende fremgangsmåten over, ble et protein kalt HF 1, og nå også kalt MORT-1 for "Mediator of Receptor-induced Toxicity", identifisert, isolert og karakterisert.

Det skal også nevnes at i et antall av de ovenfor nevnte to-hybrid fl-galaktosidase-ekspresjonstester ble ekspresjon av B-galaktosidase også bestemt ved en foretrukket filteranalyse. I screening ble 5 g av ca. 3x106 cDNA funnet å inneholde MORT-1-innskuddet. De såkalte klonede MORT-1 cDNA-innskuddene ble deretter sekvensert ved å anvende standard DNA-sekvenseirngsprosedyre. Aminosyresekvensen til MORT-1 ble utledet fra DNA-sekvensen. Resten av tallene i proteinene som er kodet av cDNA-innskuddene er som i Swiss-Prot databank. Delesjonsmutanter ble produsert av PCR og punktmutanter ved oligonukleotid-rettet mutagenese (Current Protocols in Molec.Biol., 1994).

( ii) Indusert ekspresjon, metabolsk merking og immunutfelling av proteiner.

MORT-1, N-bundet til FLAG oktopeptid (FLAG-HF1; Eastman Kodak, New Haven, Ct., USA), Fas-IC, FAS-R, p55-R, et chimer omfattet av ekstracellulær domene av p55-R (aminosyrer 1-168) koblet til transmembran og intracellulær domene av FAS-R (aminosyrer 153-319), og luciferase-cDNA som tjener som en kontroll, ble uttrykt i HeLa-celler. Ekspresjon ble gjennomført ved å anvende en tetrasyklinregulert ekspresjonsvektor, i en HeLa-celleklon (HtTA-1) som uttrykker en tetrasyklinregulert transaktivator (Gossen og Bujard, 1992; som beskrevet i PCT/US95/05854; se også Boldin et al., 1995). Metabolsk merking med [<35>S]metionin og [<35>S]cystein (DUPONT, Wilmington, De., USA og Amersham, Buckinghamshire, England) ble gjennomført 18 timer etter transfeksjon ved en ytterligere 4 timers inkubasjon ved 37 °C i Dulbeccos modifiserte Eagle's medium som manglet metionin og cystein, men supplert med 2 % dialysert fetalt kalveserum. Cellene ble deretter lysert i RIPA-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5,150 mM NaCl, 1 % deoksycholat, 0,1 % SDS og ImM EDTA), og lysatet ble forklarert ved inkubasjon med irrelevant kaninantiserum (3 ul/ml) og protein G sefarose-perler ul/ml). Immunutfelling ble gjennomført ved en times inkubasjon ved 4 °C av 0,3 kml prøver av lysat med mus-monoklonale antistoffer (5 ul/prøve) mot FLAG oktopeptid (M2; Eastman Kodak), p55-R (#18 og #20; (Engelmann et al., 1990)), eller FAS-R (ZB4; Kamiya Southand Oaks, Ca., USA) eller med isotype tilpasset mus-antistoffer som kontroll, fulgt av ytterligere en times inkubasjon med protein G sefarose-perler (30 ul/prøve).

( iii) In v# ro- binding.

Glutation S-transferase (GST)-fusjoner med villtype eller en mutert FAS-IC ble produsert og absorbert til glutation-agarose-perler (som beskrevet i IL 109632,111125, 112002,112692; se også Boldin et al., 1995; Current protocols in molecular biology, 1994; Frangioni ogNeel, 1993). Binding av metabolsk-merket FLAG-HF1-fusjonsprotein til GST-Fas-IC ble bestemt ved inkubering av perlene i to timer ved 4 °C med ekstrakter av HeLa-celler, metabolsk merket med [<35>S]metionin (60 uCi/ml), som uttrykker FLAG-HF1. Ekstraktene ble fremstilt i en buffer inneholdende 50 mN Tris-HCl, pH7,5,150 mM NaCl, 0,1 % NP-40, 1 mM ditiotreitol, 1 mM fenylmetylsulfo-nylfluorid, 20 ug/ml aprotonin, 20 ug/ml leupeptin, 10 mM natriumfluorid og 0,1 mM natriumvanadat (1 ml pr. 5 x IO<5> celler).

riv) Fastslåelse av cvtotoksisitet utløst med indusert ekspresjon av HF1.

HF1, FAS-IC, p55-IC og luciferase cDNA ble innsatt i en tetrasyklinregulert ekspresjonsvektor og transfektert til HtTa-1 celler (en HeLa-cellelinje)(Gossen og Bujard, 1992) sammen med en sekretert plasental alkalisk fosfatase cDNA, plassert under kontroll av SV40-promoter (pSBC-2-vektoren (Dirks et al., 1993)). Celledød ble bestemt 40 timer etter transfeksjon, enten ved nøytral-rød opptaksanalyse (Wallach, 1984) eller for bestemmelse av spesifikk død hos de cellene som uttrykker transfektert cDNA, ved bestemmelse av mengder av plasental alkalisk fosfatase (Berger et al., 1988) sekretert til vekstmediet ved minst 5 timers inkubasjon.

I et annet sett av eksperimenter for å analysere regionen av MORT-1 (HFl)-proteinet involvert i binding til FAS-IC, ble følgende proteiner uttrykt forbigående i HeLa-celler som inneholder en tetrasyklin-kontrollert transaktivator (HtTA-1) ved å anvende en tetrasyklin-kontrollert ekspresjonsvektor (pUHD10-3): human FAS-R alene, human FAS-R såvel som den N-terminale delen av MORT-1 (aminosyrer 1-117, "MORT-1-hodet"), human FAS-R såvel som C-terminaldelen av MORT-1, som inneholder dens "dødsdomene"-homologiregion (aminosyrer 130-245, "MORT-1 DD", se også IL 112742); FLAG-55.11 (aminosyrer 309-900 av protein 55.11 sammenkoblet ved N-terminalen til FLAG oktapeptidet, protein 55.11 er et p55-IC-spesifikt bindingsprotein, se også IL 109632). 12 timer etter transfeksjon ble cellene trypsinbehandlet og sådd på nytt ved en konsentrasjon på 30.000 celler/brønn. Etter 24 timers ytterligere inkubasjon ble cellene høstet i 6 timer med et monoklonalt antistoff mot ekstracellulær domene av FAS-R (monoklonalt antistoff CH-11, Oncor) ved forskjellige konsentrasjoner (0,001-10 ug/ml monoklonalt antistoff), i nærvær av 10 g/ml sykloheksimid. Cellelevedyktighet ble deretter bestemt ved nøytral-rød opptaksanalyse og resultatene ble presentert på bakgrunn av % levedyktige celler sammenlignet med celler som hadde blitt inkubert med sykloheksimid alene (i fråvær av anti-FAS-R-monoklonalt antistoff CdH-11).

( v) Northern og sekvensanalvser.

Poly A<+>RNA ble isolert fra total RNA fra HeLa-celler (oligotex-dT mRNA-sett. QIAGEN, Hilden, Tyskland). Northern analyse ved å anvende HF1 cDNA som en probe ble gjennomført ved konvensjonelle metoder (som beskrevet i PCT/US95/05854; se også Boldin et al, 1995). Nukleotidsekvensen av MORT-1 (HF1) ble bestemt i begge retninger ved dideoksy-kjedetermineringsmetoden.

Resultatene (vist i tabell 1 og figurene 1-7) oppnådd fra de ovenfor nevnte eksperimentelle prosedyrene er som følger: Sekvensanalyse av MORT-1 cDNA klonet med to-hybridprosedyren viste at den koder for et nytt protein (se under). Anvendelse av to-hybridtesten for videre å evaluere spesifisiteten til binding av dette protein (MORT-1) for "Mediator of Receptor-induced Toxicity") til FAS-IC, og å definere den celle-regionen i FAS-IC som den binder seg til, førte til følgende funn (tabell 1): (a) Proteinet bindes både til human og mus FAS-IC, men ikke til flere andre testede proteiner, inkludert tre reseptorer av TNF/NGF-reseptorfamilien (p55 og p75 TNF-reseptorer og CD40); (b) Erstatningsmutasjoner i posisjon 225 (Ile) i "dødsdomenen" av FS-R- vist å oppheve signalisering både in vitro og in vivo (lpr<C8->mutasjon (Watanabe-Fukunaga et al., 1992; Itoh og Nagata, 1993), forhindrer også binding av MORT-1 til FAS-IC; (c) MORT-1-bindingssetet i FAS-R forekommer i "dødsdomenen" og denne reseptoren, og (d) MORT-1 binder til seg selv. Denne cellebindingen og binding av HF1 til FAS-R involverer forskjellige regioner av proteinet: Et fragment av MORT-1 som tilsvarer residier 1-117 bindes til full-lengde MORT-1, men binder seg ikke til seg selv eller til FAS-IC. Et fragment som tilsvarer residier 130-245 binder seg til FAS-R, men binder seg ikke til MORT-1 (tabell 1). Det er åpenbart fra resultatene i tabell 1 at "døds-domene"-regionen av FAS-R er kritisk for FAS-IC selvassosiasjon, og det samme er "dødsdomenen" av p55-R for p55-IC selv-assosiasjon. Delesjonene på begge sider av disse "dødsdomener" påvirker ikke selvassosiasjonsevnen, mens en delesjon i disse "dødsdomener" påvirker selv-assosiasjonen. I tilfellet med MORT-1, er binding av MORT-1 til FAS-IC også avhengig av komplett (full) "dødsdomene" av FAS-R, mens den også er avhengig av regionen på utsiden av FAS-R "dødsdomene"-regionen for FAS-binding. I tabell I over blir det vist interaksjon av proteinene som er kodet av GAL4 DNA-bindende domene og aktiveringsdomenekonstruksjoner (pGBT9 og pGAD-GH) i transfektert SFY526 gjær slik det ble bestemt ved B-galaktosidase ekspresjonsfilter-analyse. DNA-bindene domenekonstruksjoner inkluderte fire konstruksjoner av human FAS-IC, fire konstruksjoner av mus FAS-IC som inkluderer to fulllengde konstruksjoner som har Ile til Leu eller Ile til Ala-erstatningsmutasjoner i posisjon 225 (henholdsvis I225N og I225A), og tre HF1 (MORT-l)-konstruksjoner, alle disse konstruksjoner er vist skjematisk på venstre side av tabellen. Aktiveringsdomenekontruksjonen inkluderte tre HF 1-konstruksjoner, HF 1-delen er i DNA-bindende domenekonstruksjoner; og en full-lengde human FAS-IC-konstruksjon, FAS-IC-delen er samme som i DNA-bindende domenekonstruksjon over. Intracellulære domener av human p55 TNF-reseptor (p55-IC, residier 206-426), human CD40 (CD40-IC, residier 216-277) og human p75 TNF-reseptor (p75-IC, residier 287-461) så vel som lamin, syklin D og "tom" GAL4 (pGBT9)-vektorer tjente som negative kontroller i form av DNA-bindende domenekonstruksjoner. SNF-1 og SNF4 tjente som positive kontroller i form av DNA-bindende domene (SNF1) og aktiveringsdomene (SNF4)-konstruksjoner. "Tomme" GAL4-vektorer (pGAD-GH) tjente også som negative kontroller i form av aktiveringsdomenekonstruksjoner (for flere detaljer angående p55-IC, p75-IC se også PCT/US95/05854). Symbolene "++" og "+" betegner utvikling av en sterk farge i løpet av henholdsvis 30 og 90 minutters analyse; og "-" betegner ingen utvikling av farge i løpet av 24 timer. Kombinasjoner der det ikke er gitt noen vurdering har ikke blitt testet.

Ekspresjon av HF1 (MORT-l)-molekyler sammenkoblet ved deres N-terminal med FLAG oktapeptid (FLAG-HF1) ga i HeLa-proteiner med fire distinkte størrelser - ca. 27, 28, 32 og 34 kD. I fig.l (A og B) er det vist resultater som demonstrerer interaksjon av HF1 med FAS-IC in vitro. Som angitt over i beskrivelsen av fig.l A og B, er fig.l A en reproduksjon av et kontroll autoradiogram av et immunopresipitat av proteiner fra ekstrakter fra HeLa-celler transfektert med FLAG-HF1 (FLAG-MORT-1) fusjonsprotein eller med luciferase cDNA som en kontroll, immunutfellingen ble anti-FLAG antistoff (aFLAG). Fig.l B er en reproduksjon av et autoradiogram som viser interaksjon in vitro mellom HF1 og FAS-IC, der HF1 er i form av [<35>S]metionin-metabolisert merket HFl-FLAG-fusjonsproteiner oppnådd fra ekstrakter av transfekterte HeLa-celler og FAS-IC er i form av human og mus GST-FAS-IC-fusjonsproteiner som inkluderer et som har en erstatningsmutasjon i posisjon 225 i FAS-IC, alle disse GST-FAS-IC-fusjonsproteiner ble produsert i E. coli. GST-fusjonsproteinene var festet til glutationperler før interaksjon med ekstrakter inneholdende HF1-FLAG fusjonsprotein etter denne interaksjonen ble STS-PAGE gjennomført. In vitro interaksjonen ble evaluert ved bestemmelse med autoradiografi etter SDS-PAGE, binding av [<35>S] metabolsk merket FH1, produsert i transfekterte HeLa-celler som en fusjon med FLAG oktapeptid (FLAG-HF1), til GST- GST-fusjon med human eller mus FAS-IC (GST-huFas-IC, GST-mFas-IC) eller til GST-fusjon med FAS-IC inneholdende en Ile til Ala erstatningsmutasjon i posisjon 225. Slik det fremkommer fra fig. IB, viste alle fire FLAG-HF1-proteiner evne til å binde til FAS-IC ved inkubasjon med GST-FAS-IC-fusjonsprotein. Som i gjær-to-hybridtesten (tabell 1), bandt HF1 seg ikke til GST-FAS-IC-fusjonsprotein med en erstatning i lpr<ce >mutasjonssetet (I225A).

Proteinene som er kodet med FLAG-HF1 cDNA viste også en evne til å binde seg til intracellulær domene av FAS-R, så vel som til intracellulære domener av FAS-R-chimer hvis ekstracellulære domene ble erstattet med den til p55-R (p55-FAS), når den ble ko-uttrykt med disse reseptorer i HeLA-celler. I fig.2 (A, B, C) viser resultatene interaksjon med HF1 med FAS-IC i transfekterte HeLa-celler, det vil si in vivo. Som nevnt over i beskrivelsen av fig. 2 A, B, C er disse figurene reproduksjoner av autoradiogram av immunpresipitater av forskjellige transfekterte HeLa-celler som viser in vivo interaksjon og spesifisitet ved interaksjon mellom HF1 og FAS-IC i celler kotransfektert med konstruksjoner som koder for disse proteiner. FLAG-HF1 fusjonsproteinet ble uttrykt og metabolsk merket med [<35>S]cystein (20 uCi/ml) og [<35>S]metionin (40 uCi/ml) i HeLa-celler, alene eller sammen med human FAS-R, FAS-R chimer, hvori den ekstracellulære domene av FAS-R var erstattet med tilsvarende region med human p55-R (p55-FAS) eller human p55-R som negativ kontroll. Kryssimmunutfelling av HF1 med ko-uttrykt reseptor ble gjennomført ved å anvende de angitte antistoffer (figurene 2 A-C). Slik det fremkommer i fig. 2A-C, har FLAG-HF1 evnen til binding til intracellulær domene av FAS-R såvel som intracellulær domene av FAS-R-p55-R chimer som har den ekstracellulære domene til p55-R og den intracellulære domenen til FAS-R, når den blir ko-uttrykt med disse reseptorene i HeLa-celler (se henholdsvis 3 mindre brønner i fig. 2A og 3 venstre-brønner i fig. 2C). Immunutfelling av FLAG-HF1 fra ekstrakter av transfekterte celler resulterte også i utfelling av ko-uttrykt FAS-R (fig. 2A) eller ko-uttrrykt p55-FAS chimer (fig. 2Cd). I motsatt tilfelle resulterte immunutfelling av disse reseptorene i ko-utfelling av FLAG-HF1 (fig. 2A og 2C).

Northern analyse ved å anvende HF1 cDNA som probe viste et enkelt hybridi-seringstranskript i HeLa-celler. Fig. 3 viser en reproduksjon av et Northern blot hvori poly A<+> RNA (0,3 ug) fra transfekterte celler ble hybridisert med HF1 cDNA. Størrelsen på dette transkriptet (ca. 1,8 kB) er nært til det av HF1 cDNA (ca. 1701 nukleotider).

I sekvensanalyse ble cDNA funnet å inneholde en åpen leseramme på ca. 250 aminosyrer. Fig. 4 viser den preliminære nukleotid og utledet aminosyresekvens av HF1 hvori "dødsdomene"-motivet er understreket, det samme er et mulig start Met-residie (posisjon 49; fete typer, understreket M) og translasjonsstoppkodon (stjernen under kodon i posisjon 769-771). "Dødsdomene"-motivet deler homologi med kjente p55-R og FAS-R "dødsdomenene"-motiver (p55DD og FAS-DD). For å bestemme den nøyaktige C-terminale enden av HF1 og oppnå evidens angående nøyaktig N-terminal (initielt Met-redisie)-ende av HF1, ble ytterligere eksperimenter gjennomført som følger: Ved å anvende metodene som er beskrevet over, ble et antall konstruksjoner som koder for HF 1-molekylene sammenkoblet ved deres N-terminal med FLAG-oktapeptidet (FLAG-HF1) og ble konstruert og uttrykt i HeLa-celler med metabolsk merking av de uttrykte proteiner ved å anvende 35 S-cystein og <35>S-metionin (se over med hensyn på fig. 5B). HFl-FLAG-molekylene var kodet av følgende cDNA inneholdende forskjellige porsjoner av HFl-kodende sekvens.

i) FLAG-oktapeptid-cDNA bundet til 5' ende av HF1 cDNA fra hvilken nukleotider 1-145 (se fig. 4) har blitt utelatt;

ii) FLAG-oktapeptid-cDNA bundet til 5' ende av HF1 full-lengde cDNA (se FLAG-HFl-konstruksjon over med hensyn til fig. IB);

iii) FLAG-oktapeptid-cDNA bundet til 5' ende av HFl-cDNA fra hvilke nukleotider 1-145 så vel som nukleotider 832-1701 (se fig. 4) hadde blitt utelatt og kodon GCC i posisjon 142-144 var mutert til TCC for å forhindre start av translasjon ved dette sted.

Etter ekspresjon av ovenfor nevnte HFl-FLAG-fusjonsprodukter, ble immunutfelling gjennomført som nevnt over ved å anvende enten anti-FLAG monoklonale antistoffer (M2) eller som en kontroll, anti-p75 TNF-R-antistoffer (#9), etterfulgt av SDS-PAGE (10 % akrylamid) og autoradiografi. Resultatene er vist i fig. 5, som er en reproduksjon av et autoradiogram der det ovenfor angitte HFl-FLAG-fusjonsproteinet ble separert, prøvene ble anbrakt på hver brønn og hver gel er som følger: Brønner 1 og 2: HFl-FLAG-fusjonsprotein kodet av FLAG oktapeptid cDNA bundet til 5' ende av HF1 cDNA fra hvilken nukleotider 1-145 har vært utelatt.

Brønner 3 og 4: HFl-FLAG-fusjonsprotein som er kodet av FLAG oktapeptid cDNA

bundet til 5' ende av full-lengde HF1 cDNA.

Brønner 5 og 6: HFl-FLAG-fusjonsprotein kodet av FLAG oktapeptid cDNA bundet til 5' ende av HF 1 cDNA fra hvilken nukleotider 1 -145 så vel som 832-1701 har blitt utelatt og GCC i posisjon 142-144 var mutert til TCC for å hindre start av translasjon ved dette sted. Lnmunutfellinger var med anti-FLAG monoklonale antistoffer for prøvene i brønnene 2,4 og 6 og anti-p75 TNF-R-antistoffer for prøvene i brønner 1, 3 og 5.

Fra autoradiogrammet i fig. 5 er det tydelig at identiteten til produktstørrelsene i brønnene 2 og 4 bekrefter at nukleotider 769-771 er sete for translasjonsterminering for HF1, det vil si dette kodonet representerer et stoppsignal og blir vist med en stjerne i fig. 4. Forekomst av et bredt bånd som representerer to translasjonsprodukter (slik man ser på gelen men som er sterkt merket og blir et enkelt stort bånd på autoradiogram) i brønn 6 viser at forekomst av to ytterligere produkter (høyere molekylvekts brede bånd) i brønner 2 og 4 reflekterer initiering av translasjon både ved N-terminal av FLAG-HFl-fusjonsmolekyl og metioninresidie nr.49 i HFl-sekvensen (se M understreket i posisjon 49 av aminosyresekvensen i fig. 4). Resultatene over har bekreftet (validert) C-terminalenden av HF1 og har skaffet til veie evidens at N-terminal ende av HF1 kan være i posisjon 49 av sekvensen i fig.4.

Det har i virkeligheten blitt vist ved ytterligere ekspresjonseksperimenter at HF1 uten FLAG oktapeptid sammenkoblet til 5' ende, at Met49 tjener som et effektivt sete for translasj onsinitiering.

Det skal nevnes at forskning gjennomført i "Gene Bank" og "Protein Bank" databaser viste at det er ingen sekvens som tilsvarer den til HF1 som er vist i fig. 4. HF1 representerer således et nytt FAS-IC-spesifikt bindende protein.

Høyekspresjon av p55-IC resulterer i utløsing av en cytocidal effekt (se IL 109632, 111125 og Boldin et al., 1995). Ekspresjon av FAS-IC i HeLa-celler har også en slik effekt, skjønt i en lavere grad, som kan bli påvist bare ved anvendelse av en sensitiv analyse. Fig. 6A og 6B viser grafisk liganduavhengig utløsning av cytocidale effekter i celler transfektert med HF1, så vel som human p55-IC og FAS-IC. Effekt av forbigående ekspresjon av HF1, human FAS-IC, human p55-IC, eller luciferase som tjente som en kontroll på levedyktighet av HeLa-celler, ble fastslått ved å anvende en tetrasyklinregulert ekspresjonsvektor. Cellelevedyktighet ble evaluert 40 minutter etter transfektering av disse cDNA, enten i nærvær av (åpne søyler, fig. 6A og B) eller fravær (fylte søyler, fig. 6A og B) av tetrasyklin (1 ug/ml, for å blokkere ekspresjon), sammen med en cDNA som koder for sekretert placental alkalisk fosfatase. Cellelevedyktighet ble bestemt enten ved nøytral-rød opptaksanalyse (fig. 6A), eller for bestemmelse av spesifikk levedyktighet av de spesielle cellene som uttrykker transfektert DNA, ved måling av mengden av placental alkalisk fosfatase sekretert til vekstmediet (fig. 6B).

Det er således åpenbart fra fig. 6A og B at ekspresjon av HF1 i HeLa-celler resulterte i signifikant celledød, større enn den som var forårsaket av FAS-IC-ekspre-sjon. Disse cytotoksiske effektene av alle av p55-IC, FAS-IC og HF1 synes å være beslektet til "dødsdomene"-regionen, til stede i alle disse proteinene, der "dødsdomenene" har en tilbøyelighet til å selvassosiere, og dermed mulig å gi støtet til de cytotoksiske effektene.

I lys av de ovenfor nevnte karaktertrekkene til HF1 (MORT-1), nemlig spesifikk assosiasjon av HF1 med den spesielle regionen i FAS-R som er involvert i celledød-induksjon, og det faktum at selv en svak endring av struktur i den regionen som forhindrer signalisering (//>r<cg->mutasjon) avskaffer også binding av HF 1, og dette viser at dette proteinet spiller en rolle i signalisering eller utløsning av celledød. Denne notasjonen blir videre støttet av den observerte evnen til HF1 å utløse selv en cytocidal effekt. HF1 (MORT-1) kan fungere som (i) en modulator av selvassosiasjon av FAS-R ved sin egen evne til å binde til FAS-R så vel som til seg selv, eller (ii) tjene som et dokumentsete for ytterligere proteiner som er involvert i FAS-R-signalisering, det vil si HF1 kan være et "dokumenterende" protein og kan derfor binde andre reseptorer ved siden av FAS-R, eller (iii) utgjøre deler av et distinkt signaliseringssystem som reagerer med FAS-R-signalisering.

For ytterligere å analysere regionene av MORT-1 (HF1) involvert i FAS-IC-binding og modulasjon av FAS-R-formidlede cellulære effekter (cytotoksisitet), ble ovenfor nevnte eksperimenter gjennomført ved å anvende vektorer som koder for deler av MORT-1

("MORT-1-hodet", aminosyrer 10117 og "MORT-1 dd", aminosyrer 130-245)(separat), med en vektor som koder for human FAS-R for ko-transfeksjon av HeLa-celler. I disse eksperimentene ble forskjellige proteiner og kombinasjoner av proteiner uttrykt forbigående i HeLa-celler som inneholder en tetrasyklin-regulert transaktivator (HtTA-1) ved innsetting av sekvensen som koder for proteiner inn i en tetrasyklin-regulert

ekspresjonsvektor pUHD10-3. Kontrolltransfeksjoner benytter vektorer som koder bare FAS-R og vektorer som koder FLAG-55.11-fusjonsprotein (55.11-proteinet er et p55-IC-spesifikt bindingsprotein av hvilken en porsjon som inneholder aminosyrer 309-900 ble sammensmeltet ved N-terminal til FLAG oktapeptidet).

Etter transfeksjon og inkubasjonsperiode (se (iv) over) ble transfekterte celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av et anti-FAS-R monoklonalt antistoff (CH-11) som binder spesifikt til ekstracellulær domene av FAS-R uttrykt ved celler. Denne binding av anti-FAS-R antistoff induserer aggregering av FAS-R ved celleover-flaten (mye lik FAS-R-liganden) og induserer den intracellulære signaliseirngsveien formidlet av FAS-IC, og resulterer til slutt i celledød (FAS-R-formidlet cellecytotok-sisitet). Konsentrasjonen av anti-FAS-R-monoklonalt antistoff (CH-11) som ble anvendt var i området fra 0,01-10 |ig/ml, vanligvis konsentrasjoner slik som 0,005; 0,05 og 5 ug/ml. Cellene ble behandlet med anti-FAS-antistoffet i nærvær av 10 \ ig/ m\ sykloheksimid.

Resultatene av ovenfor nevnte analyser er angitt grafisk i figur 7, som viser % levedyktighet av transfekterte celler som en funksjon av konsentrasjon av anti-FAS-R monoklonalt antistoff (CH-11) anvendt til behandling av cellene, for hver av de fire forskjellige gruppene av transfekterte celler. Disse gruppene av transfekterte celler er betegnet ved forskjellige symboler som følger: (i) åpent kvadrat betegner celletrans-fektert bare med ikke-relevant (det vil si ikke-FAS-IC-binding) kontrollvektor som koder for FLAG-55.11 fusjonsprotein ("55.11", negativ kontroll); (ii) de lukkede kvadratene betegner celler ko-transfekiert med vektorer som koder for FAS-R og vektorer som koder for C-terminal del av MORT-1, aminosyrer 130-245 som inneholder MORT-1 ("dødsdomene"(dd)-homologiregion ("fas<+>mortldd"); (iii) fylte trekanter betegner celler transfektert bare med vektor som koder for FAS-R ("fas", positiv kontroll); og (iv) åpne sirkler betegner celler ko-transfektert med vektorer som koder for FAS-R og vektorer som koder for N-terminal del av MORT-1, aminosyrer 1-117, og "MPRT-1 hodet" ("fas<+>mortlhe").

Fra resultatene som er presentert i fig. 7, er det åpenbart at ekspresjon av FAS-R i de transfekterte cellene gir en øket sensitivitet til cytocidale effekter av anti-FAS-R-antistoffer (sammenlign "fas" med "55.11"). Ko-ekspresjon av regionen in MORT-1 som inneholder "dødsdomene"-homologiregionen og FAS-R ("fas<+>mortldd") interfererer sterkt med FAS-indusert (det vil si FAS-R-formidlet) celledød, slik man kunne forvente fra evnen (se tabell 1 over) av MORT-1 "dødsdomene" (DD)-regionen for å binde til FAS-R "dødsdomene" (FAS-DD). Ko-ekspresjon av N-terminal del av MORT-1 og FAS-R ("fas<+>mortlhe") interfererer ikke med FAS-R-formidlet celledød, og, dersom i det hele tatt, økes cytotoksisiteten noe (svakt øket celledød).

Resultatene over viser klart av MORT-1-proteinet har to forskjellige regioner så lenge det angår binding til FAS-IC og formidling av celle-cytotoksisk aktivitet av FAS-IC.

Disse resultatene skaffer derfor også til veie en basis for anvendelse av forskjellige deler (det vil si aktive fragmenter eller analoger) av MORT-1-proteiner for forskjellige farmasøytiske anvendelser. Analogene eller fragmentene eller derivatene av MORT-1-proteinet som hovedsakelig inneholder bare C-terminale del av MORT-1, inkludert dens "dødsdomene"-region, kan således bli anvendt for hemming av FAS-R-

formidlet cytotoksiske effekter i FAS-R-inneholdende celler eller vev eller dermed beskytte disse cellene eller vevene mot skadelige effekter av FAS-R-ligand i slike tilfeller som i f.eks. akutt hepatitt. Analogene eller fragmentene eller derivatene av MORT-1-proteinet som inneholder hovedsakelig bare N-terminal del av MORT-1, kan alternativt bli anvendt for å øke FAS-R-formidlet cytotoksiske effekter i FAS-R-inneholdende celler og vev, og hører dermed til øket destruksjon av disse cellene eller vevene når det er ønskelig i slike tilfeller som f.eks. tumorceller og autoreaktive T- og

B-celler. Slik det er angitt over, kan anvendelse av forskjellige regioner av MORT-1 bli gjennomført ved å anvende forskjellig rekombinant virus (f.eks. Vaccinia) for å innsette MORT-l-regionkonsekvens i spesifikke celler eller vev som det er ønskelig å behandle.

Det er også mulig å fremstille og anvende forskjellige andre molekyler slik som antistoffer, peptider og organiske molekyler som har sekvenser og molekylære strukturer som tilsvarer de ovenfor angitte MORT-1-regioner for å oppnå de samme ønskede effektene som er formidlet av disse MORT-1-regionene.

REFERANSER

Barinaga, M. (1993) Science 26J21512-4.

Berger, J., Hauber, J., Hauber, R., Geiger, R. and Cullen, B.R. (1988) Gene 66. 1-10.

Beutler, B. and Cerami, C. (1987) NEJM, 316:379-385.

Boldin, M.P. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 337-341.

Brakebusch, C. et al. (1992) EMBO J., 11:943-950.

Brockhaus, M. et al. (1990) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:3127-3131.

Cantor, G.H. et al. (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 20:10932-6.

Chen, C.J. et al. (1992) Ann N.Y. Acad. Sei. 660:271-3.

Crisell, P. et al., (1993) Nucleic Acids Res. (England) 21 (22):5251-5.

Current protocols in molecular biology (Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore,

D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K., Albright, L.M., Coen, D.M. & Varki, A.,

eds.), (1994) pp. 8.1.1-8.1.6 and 16.7-16.7.8, Greene Publishing Associates, Inc. and

Wiley & Sons, Inc., New York.

Dirks, W., Wirth, M. and Hauser, H. (1993) Gene 128,247-249.

Engelmann, H. et al. (1990) J. Biol. Chem., 265:1531-1536.

Fields, S. and Song, O. (1989) Nature, 340:245-246.

Frangioni, J.V. and Neel, B.G. (1993) Anal. Biochem. 210, 179-187.

Gossen, M. and Boujard, H. (1992) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89:5547-5551.

Heller,- R.A. et al. (1990) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:6151-6155.

Hohmann, H.-P. et al. (1989) J. Biol. Chem., 264:14927-14934.

Itoh, N. et al. (1991) Cell £6:233.

Itoh, R andNagaia, S. (1993) J. Biol. Chem. 268, 10932-7.

Joseph, S. and Burke, J.M. (1993) J. Biol. Chem. 268:24515-8.

Koizumi, M. et aL (1993) Biol. Pharm. Bull (Japan) 16 (9):879-83.

Loetscher, H. et ai (1990) Cell, 61:351-359.

Nophar, Y. et al. (1990) EMBO J., 9.3269-3278.

Piquet; P.F. t al. (1987) J. Exp. Med., 166:1280-89.

Sambrook et al. (1989) Molecular Clonine. A Laboratorv Manual. Cold Spring

HarborLaboratory Press, Cold spring Harbor, NY.

Schall, T.J. et al. (1990) Cell, 6J.:361-370.

Shimayama, T. et al., (1993) Nucleic Acids Symp. Ser. 29:177-8

Shore, S.K. et al. (1993) Oncogene 8:3183-8.

Smith, CA. et al. (1990) Science, 248:1019-1023.

Song, H.Y. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269,22492-22495.

Tartaglia, L. A. et al. (1993) Cell, 74:845-853.

Tracey, J.T. et al. (1987) Nature, 330:662-664.

Wallach, D. (1984) J. Immunol. 132, 2464-9.

Wallach, D. (1986) in : Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), pp. 83-122, Academic Press, London Wallach, D. et al. (1994) Cytokine 6, 556.

Watanabe-Fukunaga, R. et al. (1992) Nature, 356, 314-317.

Wilks, A.F. et al. (1989) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86:1603-1607.

Zhao, J.J. and Pick, L. (1993) Nature (England) 365:448-51.

Claims

1. DNA-sekvens, karakterisert ved at den omfatter sekvensen SEQ ID NO: 1.

2. MORT-1-protein, karakterisert ved at det er kodet av DNA-sekvens ifølge krav 1, der proteinet har evnen til binding til eller reagering med det intracellulære domenet av FAS-ligandreseptoren (FAS-IC).

3. MORT-1-protein ifølge 2,karakterisert ved at det har den utledede aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 2.

4. Vektor, karakterisert ved at den omfatter en DNA-sekvens ifølge krav 1.

5. Transformerte vertsceller, karakterisert ved at de inneholder en vektor ifølge krav 4.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av et MORT-1-protein, karakterisert ved at det omfatter dyrking av de transformerte vertscellene ifølge krav 5 under betingelser som er egnet for ekspresjon av dette protein, gjennomføring av post-translasjonelle modifiseringer av dette proteinet nødvendig for oppnåelse av dette protein, og isolering av det uttrykte protein.

7. Antistoff eller aktive fragmenter eller derivater derav, karakterisert ved at de er spesifikke for MORT-1-protein ifølge krav 2.

8. Fremgangsmåte for in vitro behandling av tumorceller eller HIV-infiserte celler eller andre syke celler, karakterisert ved at den omfatter: (a) konstruering av en rekombinant animalsk virusvektor som bærer en sekvens som koder for et viralt overflateprotein som har evnen til binding til en spesifikk tumorcelle-overflatereseptor eller HIV-infisert celleoverflatereseptor eller reseptor som blir båret av andre syke celler og en sekvens som koder for et protein valgt fra MORT-1-protein ifølge krav 2, som når de blir uttrykt i tumor, HIV-infiserte eller andre syke celler, har evnen til å drepe cellen; og (b) infisering av disse tumor eller HIV-infiserte celler eller andre syke celler med denne vektor (a).

9. Fremgangsmåte for isolering og identifisering av proteiner, faktorer og reseptorer som har evnen til binding til MORT-1-proteinet ifølge krav 2, karakterisert ved at den omfatter anvendelse av prosedyren for affinitetskromatografi, hvori MORT-1-proteinet blir festet til affinitetskromatografimatriks, hvori det festede proteinet blir brakt i kontakt med et celleekstrakt; og proteiner, faktorer eller reseptorer fra celleekstrakter som bindes til dette festede proteinet, deretter blir eluert, isolert og analysert.

10. Fremgangsmåte for isolering og identifisering av proteiner, faktorer og reseptorer som har evnen til binding til MORT-1-proteinet ifølge krav 2, karakterisert ved at den omfatter anvendelse av gjær-to-hybridprosedyren, hvori en sekvens som koder for MORT-1-proteinet blir båret av en hybridvektor og sekvensen fra et cDNA eller genomisk DNA-bibliotek blir båret av en andre hybridvektoren, vektorene blir deretter anvendt til å transformere gjærvertsceller og de positivt transformerte cellene blir isolert, etterfulgt av ekstraksjon av denne andre hybridvektoren for å oppnå en sekvens som koder for et protein som bindes til MORT-1-proteinet.

11. Farmasøytisk sammensetning for modulering av FAS-R-ligand-effekten på celler, karakterisert ved at den omfatter en aktiv ingrediens valgt fra gruppen bestående av et MORT-1-protein ifølge krav 2.

12. Farmasøytisk sammensetning for modulering av FAS-R-ligand-effekten på celler, karakterisert ved at den omfatter en rekombinant animalsk virusvektor som bærer sekvenser som koder for et protein som har evnen til binding av en celleoverflatereseptor og som koder for et MORT-1-protein ifølge krav 2.

13. Fremgangsmåte for isolering og identifisering av et protein som har evnen til binding til intracellulær domene av FAS-R, karakterisert ved at den omfatter anvendelse av prosedyren med ikke-stringent Southern hybridisering etterfulgt av PCR-kloning, hvori en sekvens ifølge krav. 1, eller deler derav blir anvendt som en probe for å binde sekvenser fra et cDNA eller genomisk DNA-bibliotek som har minst delvis homologi til dette, de bundne sekvensene blir deretter amplifisert og klonet ved PCR-prosedyren i kloner som koder for proteiner som har minst delvis homologi til disse sekvensene ifølge krav 1.

14. Anvendelse av et protein kodet av en DNA-sekvens ifølge SEQ ID NO: 1 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av tumorceller, HIV infiserte celler eller andre syke celler.

15. Anvendelse ifølge krav 14, der FAS-R-ligand-effekten på celler som bærer en FAS-R moduleres.