PT871645E - Moduladores da função dos receptores fas/apo1 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MODULADORES DA FUNÇÃO DOS RECEPTORES FAS/APOl"

Campo da invenção A presente invenção é, de um modo geral, no campo dos receptores pertencentes à superfamília de receptores TNF/NGF e ao controlo das suas funções biológicas. A superfamília de receptores TNF/NGF inclui receptores como os receptores para os factores de necrose tumoral p55 e p75 (TNF-Rs) e o receptor do ligando FAS (também designado FAS/APOl ou FAS-R e que daqui em diante será designado por FAS-R) e outros. De um modo mais específico, a presente invenção diz respeito a uma nova proteína, aqui designada MORT-1 (também designada HF-1) que se liga ao domínio intracelular (IC) do Fas-R, (este domínio intracelular designado Fas-IC) e cuja nova proteína tem a capacidade de modular a função da Fas-R. Além disso, a MORT-1 tem também a capacidade de auto-associação e pode activar a citotoxixidade celular por si só. A presente invenção diz também respeito à preparação e utilizações da MORT-1.

Deve ser notado que a HF-1 (a designação original) e a MORT-1 (a designação utilizada actualmente) são ambas utilizadas durante a descrição e referem-se à mesma proteína.

Antecedentes da Invenção e Estado da Técnica 0 factor de necrose tumoral (TNF-α) e a linfotoxina (TNF-β) (daqui em diante, TNF, refere-se tanto a TNF-α como a TNF-β) são citocinas multifuncionais pro-inflamatórias formadas principalmente por fagócitos mononucleares, os 2 quais têm muitos efeitos nas células (Wallach, D. (1986) em: Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), pp. 83-122, Academic Press, London; e Beutler e Cerami (1987)). Ambos o TNF-α e TNF-β iniciam os seus efeitos ligando-se a receptores celulares de superfície específicos. Alguns dos efeitos são provavelmente benéficos para o organismo: podem destruir, por exemplo células tumorais ou células infectadas por vírus e aumentar a actividade antibacteriana dos granulócitos. Desta forma, o TNF contribui para a defesa do organismo contra tumores e agentes infecciosos e contribui para a recuperação de danos sofridos. Assim, o TNF pode ser usado como um agente anti-tumoral o qual, na sua aplicação se liga aos seus receptores na superfície das células tumorais e assim inicia os eventos que levam à morte da célula tumoral. 0 TNF pode também ser usado como um agente anti-infeccioso.

No entanto, ambos TNF-α e TNF-β também têm efeitos prejudiciais. Existem evidências de que a sobreprodução de TNF-α pode desempenhar um papel patogénico significativo em várias doenças. Assim, os efeitos do TNF-α, primariamente sobre a vasculatura, são agora conhecidos como sendo uma causa significativa dos sintomas do choque séptico (Tracey et al., 1986). Em algumas doenças, o TNF pode causar perda excessiva de peso (caquexia) através da supressão de actividades dos adipócitos e causando anorexia e, o TNF-a foi deste modo classificado como caquetina. Também foi descrito como um mediador dos danos nos tecidos em doenças reumáticas (Beutler e Cerami, 1987) e como um mediador significativo dos danos observados em reacções enxerto-versus-hospedeiro (Piquet et al., 1987). Além disso, o TNF é conhecido como estando envolvido no processo de inflamação e em muitas outras doenças. 3

Dois receptores distintos, expressos de um modo independente, os TNF-Rs p55 e p75, os quais se ligam a ambos TNF-α e TNF-β de um modo especifico, iniciam e/ou medeiam os efeitos biológicos do TNF salientados acima. Estes dois receptores têm domínios intracelulares estruturalmente heterogéneos, sugerindo que sinalizam de modo diferente (Ver Hohmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Brockhaus et al., 1990; Leotscher et al., 1990; Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990; e Heller et al., 1990). No entanto, os mecanismos celulares, por exemplo, as várias proteínas e possivelmente outros factores, os quais estão envolvidos na sinalização intracelular dos TNF-Rs p55 e p75 estão ainda por elucidar (No documento PCT/US95/05854 e como também aqui foi avançado, são descritas pela primeira vez, novas proteínas capazes de se ligarem ao p75IC e ao p55IC) . É esta sinalização intracelular, a qual ocorre normalmente após a ligação ao ligando, i.e., TNF (a ou β), para o receptor, que é responsável pelo início da cascata de reacções que resultam, em última análise, na resposta observada da célula ao TNF.

No que se refere ao efeito citocida do TNF, na maioria das células estudadas até agora, este efeito é desencadeado essencialmente pelo p55 TNF-R. Os anticorpos para o domínio extracelular (domínio de ligação ao ligando) do p55 TNF-R podem, eles próprios, desencadear o efeito citocida (ver o documento EP 412486) o qual está correlacionado com a eficácia das ligações cruzadas dos receptores pelos anticorpos, e que se acredita ser o primeiro passo na geração do processo de sinalização intracelular. Adicionalmente, estudos mutacionais (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993) demonstraram que a função 4 biológica do p55 TNF-R depende da integridade do seu dominio intracelular e, de um modo concordante, foi sugerido que a iniciação da sinalização intracelular que leva ao efeito citocida do TNF ocorre como uma consequência da associação de dois ou mais domínios intracelulares do p55 TNF-R. Além do que, o TNF (a e β) ocorre como um homotrímero e como tal, foi sugerido que induz a sinalização intracelular via TNF-R p55 através da sua capacidade para ligar e estabelecer ligações cruzadas com as moléculas de receptor, i.e., causar agregação de receptores. No documento PCT/US95/05854 e também aqui abaixo, está descrito como o p55lC e o p55DD se podem auto-associar e induzir, de um modo independente do ligando, os efeitos associados ao TNF nas células.

Outro membro da superfamília TNF/NGF de receptores é o receptor FAS (FAS-R), o qual também foi designado como antigénio Fas, uma proteína de superfície celular expressa em vários tecidos e partilhando homologia com vários receptores de superfície celular, incluindo o TNF-R e o NGF-R. 0 FAS-R medeia a morte celular na forma de apoptose (Itoh et al., 1991), e parece servir como seleccionador negativo de células T autoreactivas, i.e., durante a maturação das células T, o FAS-R medeia a morte apoptótica das células T, reconhecendo os próprios antigénios. Foi verificado que as mutações no gene FAS-R (lpr) causam um distúrbio da linfoproliferação em ratos que é semelhante à doença auto-imune humana lupus eritematoso sistémico (LES) (Watanabe-Fukunaga et al. 1992). 0 ligando para o FAS-R parece ser uma molécula associada à superfície celular transportada pelas células T assassinas (ou linfócitos T citotóxicos - CTLs), entre outras, sendo que quando tais CTLs contactam com células que transportam o FAS-R, são 5 capazes de induzir a morte celular por apoptose das células veiculo do FAS-R. Além disso, foi preparado um anticorpo monoclonal especifico para o FAS-R, sendo este anticorpo monoclonal capaz de induzir a morte celular por apoptose em células que transportam o FAS-R, incluindo células de rato transformadas por cDNA que codifica para o FAS-R humano (Itoh et al. 1991).

Foi também verificado que várias outras células normais, para além dos linfócitos T, expressam o FAS-R na sua superfície e podem ser mortas quando este receptor é desencadeado. A indução não controlada de tal processo de morte suspeita-se que contribua para o dano nos tecidos em determinadas doenças, por exemplo, a destruição de células do fígado na hepatite aguda. De um modo concordante, encontrar maneiras de restringir a actividade citotóxica do FAS-R pode ter potencial terapêutico.

Do mesmo modo, já que foi também verificado que certas células malignas e células infectadas pelo HIV transportam o FAS-R na sua superfície, anticorpos contra o FAS-R, ou o ligando para o FAS-R, podem ser utilizados para despoletar os efeitos citotóxicos mediados pelo FAS-R nos mesmos e assim proporcionar um modo de combater tais células malignas ou células infectadas pelo HIV (ver Itoh et al. 1991) . Encontrar outros modos de ampliar a actividade citotóxica do FAS-R pode assim também ter potencial terapêutico. Há muito que existe a necessidade de proporcionar um modo de modular a resposta celular ao TNF (a ou β) e ligando FAS-R, por exemplo, nas situações patológicas de acordo com o mencionado acima, onde o TNF ou o ligando FAS- 6 R estão sobre-expressos é desejável inibir os efeitos citocidas induzidos pelo TNF ou pelo ligando FAS-R, enquanto que em outras situações, p.ex., aplicações em tratamento de feridas, é desejável a ampliação do efeito do TNF, ou no caso do FAS-R, em células tumorais ou células infectadas por HIV é desejável a ampliação do efeito mediado pelo FAS-R.

Foram feitas várias abordagens pelos presentes inventores (ver por exemplo, os Pedidos de Patente Europeia Nos. EP 186833, EP 308378, EP 398327 e EP 412486) para regular os efeitos prejudiciais do TNF por inibição da ligação do TNF aos seus receptores usando anticorpos anti-TNF ou usando receptores solúveis do TNF (sendo essencialmente os domínios extracelulares solúveis dos receptores) para competir com a ligação do TNF aos TNF-Rs ligados à superfície celular. Além disso, tendo como base que a ligação do TNF aos seus receptores é necessária para os efeitos celulares induzidos pelo TNF, foram feitas abordagens pelos presentes inventores (ver por exemplo o documento IL 101769 e o seu correspondente documento EP 568925) para modular o efeito do TNF através da modulação da actividade dos TNF-Rs. De um modo breve, o documento EP 568925 (IL 101769) refere-se a um método de modular a transdução de sinal e/ou a clivagem nos TNF-Rs através do qual péptidos ou outras moléculas podem interagir ou com o receptor propriamente dito ou com proteínas efectoras que estão a interagir com o receptor, assim modulando o funcionamento normal dos TNF-Rs. No documento EP 568925 está descrita a construção e caracterização de vários TNF-Rs p55 mutantes, contendo mutações nos domínios extracelular, transmembranar e intracelular dos TNF-Rs p55. Desta forma regiões dentro dos domínios acima do p55 TNF-R 7 foram identificadas como sendo essenciais para o funcionamento do receptor, i.e. a ligação do ligando (TNF) e a subsequente transdução de sinal e sinalização intracelular, que resulta, em última análise, nos efeitos observados do TNF nas células. Além disso, há também descrito um número de abordagens para isolar e identificar proteínas, péptidos ou outros factores que são capazes de ligar às várias regiões nos domínios do TNF-R acima, cujos proteínas, péptidos e outros factores podem estar envolvidos na regulação ou modulação da actividade do TNF-R. São também avançadas no documento EP 568925 várias abordagens para isolar e clonar as sequências de DNA que codificam para tais proteínas e péptidos; para construir vectores de expressão para a produção destas proteínas e péptidos; e para a preparação de anticorpos ou fragmentos dos mesmos que interagem com o TNF-R ou com as proteínas acima e péptidos que ligam várias regiões do TNF-R. No entanto, o documento EP 568925 não especifica efectivamente as proteínas e péptidos que se ligam aos domínios intracelulares dos TNF-Rs (p.ex., p55 TNF-R), nem descreve a abordagem por dois híbridos de levedura para isolar e identificar tais proteínas e péptidos que se ligam ao domínio intracelular dos TNF-Rs. De um modo semelhante, até agora não houve divulgação de proteínas ou péptidos capazes de se ligar ao domínio intracelular do FAS-R.

Assim, quando é desejado inibir o efeito do TNF, ou o ligando FAS-R, seria desejável diminuir a quantidade ou a actividade dos TNF-Rs ou FAS-R na superfície celular, enquanto um aumento na quantidade ou actividade dos TNF-Rs ou FAS-R seria desejado quando se procura um efeito de ligando aumentado do TNF ou FAS-R. Para este fim os promotores de ambos TNF-R p55 e do TNF-R p75 foram sequenciados, analisados e alguns motivos de sequências chave foram encontrados, que são específicos para vários factores reguladores da transcrição, e como tal a expressão destes TNF-Rs pode ser controlada ao nível dos seus promotores, i.e. inibição da transcrição dos promotores para uma diminuição no número de receptores, e um aumento da transcrição dos promotores para um aumento do número de receptores (ver IL 104355 e IL 109633) . Estudos correspondentes dizendo respeito ao controlo do FAS-R ao nível do promotor do gene FAS-R têm ainda de ser publicados.

Além disso, deveria ser mencionado que, enquanto é do conhecimento geral que os receptores para o factor de necrose tumoral (TNF), e o receptor FAS-R estruturalmente relacionado, despoleta nas células, após estimulação por ligandos produzidos por leucócitos, actividades destrutivas que levam à sua própria morte, os mecanismos de tal desencadeamento são ainda pouco compreendidos. Estudos mutacionais indicam que nos receptores FAS-R e TNF p55 (p55-R) a sinalização para a citotoxicidade envolve duas regiões distintas no interior dos seus domínios intracelulares (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al.r 1993; Itoh e Nagata, 1993) . Estas regiões (os 'domínios da morte') têm semelhança sequencial.

Os 'domínios da morte' de ambos FAS-R e p55-R tendem a auto associar-se. A sua auto associação aparentemente promove a agregação de receptores que é necessária para a iniciação da sinalização (ver o documento PCT/US95/05854, bem como Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al., 1995) e a um nível mais elevado de expressão dos receptores pode resultar no despoletar de sinalização 9 independente dos ligandos (documento PCT/US95/05854 e Boldin et al. 1995).

Assim, antes do documento PCT/US95/05854 e da presente invenção, não foram proporcionadas proteínas que possam regular o efeito dos ligandos pertencentes à superfamília TNF/NGF, tais como os efeitos ligando TNF ou FAS-R nas células, por mediação do processo de sinalização intracelular, cuja sinalização é provavelmente regulada, em grande extensão, pelos domínios intracelulares (Ics) dos receptores pertencentes à superfamília de receptores TNF/NGF, tais como os dos TNF-Rs, i.e. os domínios intracelulares TNF-R p55 e p75 (p55IC e p75IC respectivamente), bem como o FAS-IC.

De um modo concordante, é um objectivo da invenção proporcionar proteínas, sendo a MORT-1, ou fragmentos da mesma, que sejam capazes de ligar ao domínio intracelular da FAS-R, cujas proteínas se acredita actualmente estarem envolvidas no processo de sinalização intracelular iniciado pela ligação do ligando FAS ao seu receptor. A proteína MORT-1 ou seus fragmentos da presente invenção são distintos das proteínas de ligação ao FAS-IC descritas nos pedidos mencionados anteriormente.

Outro objectivo da invenção é proporcionar antagonistas (p.ex., anticorpos) para estas proteínas de ligação ao FAS-IC, sendo a proteína MORT-1, ou fragmentos, os quais podem ser usados para inibir o processo de sinalização, quando desejado, quando tais proteínas de ligação ao FAS-IC são efectores de sinal positivo (i.e. induzem a sinalização), ou para aumentar o processo de sinalização, quando desejado, quando tais proteínas de 10 ligação ao FAZ-IC são efectores de sinal negativo (i.e., inibem a sinalização) .

Ainda outro objectivo da invenção é utilizar tais proteínas MORT-1 ou fragmentos para isolar e caracterizar proteínas ou factores adicionais, que podem, por exemplo, estar envolvidos a jusante no processo de sinalização, e/ou para isolar e identificar outros receptores a montante no processo de sinalização para os quais estas proteínas MORT-1, análogos, fragmentos e derivados se ligam (p.ex. outros FAS-Rs ou receptores relacionados), e portanto, em cuja função também estão envolvidos.

Adicionalmente, é um objectivo da presente invenção usar as acima mencionadas proteínas MORT-1 ou fragmentos como antigénios para a preparação de anticorpos policlonais e/ou monoclonais. Os anticorpos, por sua vez, podem ser usados, por exemplo, para a purificação da nova proteína MORT-1 a partir de diferentes fontes, tais como extractos celulares ou linhas de células transformadas.

Além disso, estes anticorpos podem ser usados para o propósito de diagnóstico, p.ex. para identificar distúrbios relacionados com o funcionamento anormal de efeitos celulares mediados pelo receptor FAS-R.

Um outro objectivo da invenção é o de proporcionar composições farmacêuticas compreendendo a proteína MORT-1 ou fragmentos acima, bem como composições farmacêuticas compreendendo os aqui acima descritos anticorpos ou outros antagonistas. 11

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, verificámos que uma nova proteína é capaz de se ligar ao domínio intracelular do FAS-R. Esta proteína ligante FAS-IC pode actuar como um mediador ou modulador do efeito ligando FAS-R em células mediando ou modulando o processo de sinalização intracelular que geralmente ocorre após a ligação do ligando FAS-R na superfície da célula.

Esta nova proteína foi designada por HF1, ou MORT-1 (para "Mediator of Receptor Toxicity") , e além da sua especificidade para a ligação ao FAS-IC tem outras características (ver Exemplo 1), por exemplo, tem uma região homóloga às regiões "domínio de morte" (DD) do p55-TNF-R e FAS-R (p55-DD e FAS-DD), e assim é também capaz de auto associação. A MORT-1 é também capaz de activar a citotoxicidade celular por si só, uma actividade possivelmente relacionada com a sua capacidade de auto associação. Foi agora verificado que a co-expressâo da região na MORT-1 (HF1) que contém a sequência homóloga "domínio de morte" (MORT-DD, presente na porção C-terminal da MORT-1) interfere fortemente com a morte celular induzida por FAS, como seria de esperar da sua capacidade de se ligar ao "domínio de morte" da FAS-IC. Além disso, nas mesmas condições experimentais verificou-se que a co-expressão da porção da MORT-1 que não contém a região MORT-DD (porção N-terminal da MORT-1, aminoácidos 1-117, "porção superior da MORT-1) resulta na não interferência da morte celular induzida por FAS e, se existente, uma citotoxicidade celular induzida por FAS algo aumentada.

De um modo concordante, a presente invenção proporciona uma sequência de DNA que codifica a aqui 12 designada como proteína MORT-1 ou fragmentos da mesma, sendo que todos são capazes de se ligar ou interagir com o domínio intracelular do receptor do ligando FAS (FAS-IC).

Em particular, a presente invenção proporciona uma sequência de DNA seleccionada do grupo consistindo em: (a) uma sequência de cDNA derivada da região codificante de uma proteína MORT-1 nativa; (b) sequências de DNA capazes de hibridização a um CDNA de (a) sob condições moderadamente estringentes e que codificam para uma proteína biologicamente activa de ligação ao domínio intracelular do FAS-R; e (c) Sequências de DNA que são degeneradas como resultado do código genético para as sequências de DNA definidas em (a) e (b) e que codificam para uma proteína biologicamente activa de ligação ao domínio intracelular do FAS-R.

Uma forma de realização específica da sequência de DNA da invenção, acima, é uma sequência de DNA que codifica para a proteína MORT-1 compreendendo a sequência representada na Fig.4. A presente invenção proporciona também uma proteína MORT-1, ou fragmentos da mesma codificados por qualquer uma das sequências da invenção, acima, as referidas proteínas, ou fragmentos capazes de se ligar a ou interagir com o domínio intracelular do FAS-R.

Uma forma de realização específica das proteínas da invenção acima é a proteína MORT-1 tendo a sequência de aminoácidos deduzida, representada na Fig.4. 13

Também proporcionados pela presente invenção são os vectores que codificam para a proteína MORT-1, ou fragmentos da invenção, que contêm a sequência de DNA da invenção acima, estes vectores sendo capazes de ser expressos em células hospedeiras eucariotas ou procariotas adequadas; células hospedeiras eucariotas ou procariotas transformadas contendo tais vectores; e um método para produzir a proteína MORT-1 em condições adequadas para a expressão da referida proteína, ou fragmentos efectuando modificações pós traducionais da referida proteína de acordo com o necessário para obtenção da referida proteína e extracção da referida proteína, ou fragmentos do meio de cultura das referidas células transformadas ou de extractos celulares das referidas células transformadas.

Noutro aspecto, a presente invenção também proporciona anticorpos ou derivados ou fragmentos activos dos mesmos, específicos para a proteína MORT-1 da invenção, ou fragmentos da mesma.

Ainda noutro aspecto da invenção, são proporcionadas várias utilizações e métodos, das sequências de DNA acima ou das proteínas que elas codificam, de acordo com a invenção, cujos usos e métodos incluem, entre outros: (i) uma utilização da uma ou mais proteínas MORT-1, ou fragmentos de acordo com a invenção, todos os quais capazes de se ligar ao domínio intracelular e modular a actividade do referido FAS-R para a preparação de uma composição farmacêutica para a modulação do efeito de ligando do FAS-R em células contendo um FAS-R, em que a referida uma ou mais proteínas MORT-1, ou fragmentos são introduzidos em células 14 de uma forma adequada à administração intracelular ou em que uma sequência que codifica para a referida ou referidas proteínas, ou fragmentos é introduzida em células na forma de um vector de expressão adequado transportando a referida sequência, sendo tal vector capaz de efectuar a inserção da referida sequência nas referidas células de forma a que a referida sequência seja expressa nas referidas células; (ii) uma utilização da MORT-1 ou fragmentos da mesma, todos sendo capazes de se ligar ao domínio intracelular e modificar a actividade do FAS-R, para a preparação de uma composição farmacêutica para modular o efeito de ligando do FAS-R em células, em que a referida MORT-1 ou fragmentos são introduzidos em células de uma forma adequada à introdução intracelular dos mesmos, ou em que uma sequência de DNA que codifica para a referida MORT-1 ou fragmentos, é introduzida em células na forma de um vector adequado que transporta a referida sequência, sendo o vector referido capaz de efectuar a inserção da referida sequência nas referidas células de forma a que a referida sequência seja expressa nas referidas células. (iii) Uma utilização tal como em (ii) acima em que as referidas células são transfectadas com um vector virai animal recombinante compreendendo os passos de: (a)construção de um vector virai animal recombinante que transporta uma sequência que codifica para uma proteína virai de superfície (ligando) que é capaz de se ligar a um receptor celular de superfície específico na superfície de uma célula que contém o FAS-R e uma segunda sequência que codifica para uma proteína seleccionada das proteínas MORT-1 e fragmentos da invenção, que quando expressa nas 15 referidas células é capaz de modular a actividade do referido FAS-R; e (b)infecção das referidas células com o referido vector de (a) (iv) uma utilização de anticorpos ou derivados activos ou fragmentos dos mesmos de acordo com a invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para a modulação do efeito de ligando do FAS-R em células que transportam um FAS-R, em que a referida utilização induz a aplicação de uma composição contendo os referidos anticorpos, fragmentos activos ou derivados dos mesmos às referidas células, em que quando as proteínas MORT-1 ou porções da mesma das referidas células estão expostas na superfície celular, a referida composição é formulada para aplicação extracelular e, quando as referidas proteínas MORT-1 são intracelulares, a referida composição é formulada para aplicação intracelular; (v) uma utilização de uma sequência oligonucleotídica que codifica para uma sequência antisense de pelo menos parte da sequência MORT-1 da invenção, sendo a referida sequência oligonucleotídica capaz de bloquear a expressão da proteína MORT-1 para a preparação de uma composição farmacêutica; (vi) uma utilização como em (v) acima em que as referidas células são transfectadas com um vector virai animal recombinante compreendendo os passos de: (a) construção de um vector virai animal recombinante que transporta uma sequência que codifica para uma proteína 16 virai de superfície (ligando) que é capaz de se ligar a um receptor celular de superfície específico na superfície de uma célula que transporta FAS-R e uma segunda sequência que é uma sequência oligonucleotídica que codifica para uma sequência antisense de pelo menos parte da sequência MORT-1 de acordo com a invenção, sendo tal sequência oligonucleotídica capaz de bloquear a expressão da proteína MORT-1 quando introduzida nas referidas células pelo vírus referido; e (b)infectar as referidas células com o referido vector de (a) (vii) uma utilização de um vector virai animal recombinante que transporta uma sequência que codifica para uma proteína virai de superfície que é capaz de se ligar a um receptor de superfície de uma célula tumoral ou a um receptor de superfície de uma célula infectada por HIV ou a um receptor transportado por outras células doentes e uma sequência que codifica para uma proteína seleccionada da MORT-1 e fragmentos da invenção, que quando expressa no referido tumor, células infectadas por HIV, ou outras células doentes é capaz de matar a referida célula; para a preparação de uma composição farmacêutica para utilização num método de tratamento de células tumorais ou células infectadas por HIV ou outras células doentes que compreende: (a) construção de um vector virai animal recombinante que transporta uma sequência que codifica para uma proteína virai de superfície que é capaz de se ligar a um receptor de superfície de uma célula tumoral ou a um receptor de superfície de uma célula infectada por HIV ou a um receptor transportado por outras células doentes e uma sequência que 17 codifica para uma proteína seleccionada da MORT-1 e fragmentos da invenção, que quando expressa no referido tumor, células infectadas por HIV, ou outras células doentes é capaz de matar a referida célula; e (b) infecção do referido tumor ou células infectadas por HIV ou outras células doentes com o referido vector de (a). (viii) uma utilização de um vector que codifica para a sequência de um ribozima capaz de interagir com com uma sequência de mRNA celular que codifica para uma proteína MORT-1 da invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para modular o efeito de ligando do FAS-R em células, em que a referida composição farmacêutica é introduzida nas referidas células de uma forma que permita a expressão da referida sequência de ribozima nas referidas células e, em que quando a referida sequência de ribozima é expressa nas referidas células ela interactue com a referida sequência de mRNA celular e corte a referida sequência de mRNA resultando na inibição da expressão da referida proteína MORT-1 nas referidas células; (ix) uma utilização seleccionada de qualquer uma das utilizações acima, em que a referida proteína MORT-1 ou a referida sequência que codifica para a MORT-1 compreende pelo menos aquela parte da proteína MORT-1 que se liga específicamente ao FAS-IC, ou pelo menos aquela parte da sequência que codifica para a parte da proteína MORT-1 que se liga específicamente ao FAS-IC; (x) um método para isolar e identificar uma proteína capaz de se ligar ao domínio intracelular do FAS-R compreendendo a aplicação do procedimento de hibridação 18

Southern não estringente seguido de clonagem por PCR, em que a sequência ou partes da mesma de acordo com a invenção é utilizada como uma sonda para ligar sequências de uma biblioteca de CDNA ou DNA genómico, tendo pelo menos uma homologia parcial com as mesmas, sendo as referidas sequências ligadas seguidamente amplificadas e clonadas pelo procedimento de PCR para a obtenção de clones que codificam para proteínas que tenham pelo menos uma homologia parcial com as referidas sequências de acordo com a invenção. A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica para a modulação do efeito do ligando do FAS-R em células compreendendo, como ingrediente activo, qualquer um dos seguintes: (i) uma proteína MORT-1 de acordo com a invenção, os seus fragmentos biologicamente activos ou uma mistura dos mesmos; (ii) um vector virai animal recombinante que codifica para uma proteína capaz de ligar um receptor celular de superfície e codificar para uma proteína MORT-1 ou os seus fragmentos biologicamente activos ou análogos de acordo com a invenção; e (iii) uma sequência oligonucleotídica que codifica para uma sequência antisense da sequência para a MORT-1 da invenção, em que a referida sequência oligonucleotídica pode ser a segunda sequência do vector virai animal recombinante de (ii) acima.

Deve ser mencionado que a MORT-1 tem uma região distinta que liga ao FAS-IC e outra região distinta que está envolvida na auto-associação da MORT-1, e de um modo concordante, estas regiões distintas ou partes das mesmas pode ser utilizadas de forma independente para identificar 19 outras proteínas, receptores, etc. que são capazes de se ligar à MORT-1 ou ao FAS-R e que podem estar envolvidos nos processos de sinalização intracelular relacionados com a MORT-1 ou o FAS-R. Além disso, a MORT-1 pode ter outras actividades associadas com qualquer uma das regiões distintas acima ou outras regiões da MORT-1 ou combinações das mesmas, por exemplo, actividade enzimática, a qual pode estar relacionada com os efeitos citotóxicos celulares por si mesma. Assim, a MORT-1 pode também ser usada para identificar específicamente outras proteínas, péptidos, etc. que podem estar envolvidos em tais actividades adicionais asociadas com a MORT-1.

Outros aspectos e formas de realização da presente invenção são também proporcionados como resultantes da seguinte descrição detalhada da invenção.

Deve ser notado que, sempre que utilizados, os seguintes termos "Modulação do efeito do ligando do FAS-R em células"; e "Modulação do efeito MORT-1 em células" são entendidos como englobando o tratamento in vitro assim como o tratamento in vivo.

Breve Descrição das Figuras

Fig. 1 A e B são reproduções de autoradiogramas de géis SDS-PAGE (10% Acrilamida) que apresentam a interacção entre a HF1 (MORT-1) e o FAS-IC in vitro. A Fig. IA mostra um autoradiograma de controlo de um imunoprecipitado das proteínas (a partir de extractos de células HeLa transfectadas com a proteína de fusão FLAG-HF1 (FLAG-ORT1) ou com o cDNA luciferase (controlo), sendo a imunoprecipitação realizada com anticorpo anti-FLAG; e 20 A Fig. 1B apresenta um autoradiograma de um gel representativo realizado para avaliar a interaccão in vitro entre HF1 e FAS-IC por forma a avaliar, de forma autoradiográfica, a ligação da HFl metabolicamente marcada com [35S]-metionina produzida em células HeLa transfectadas como uma proteina de fusão com o octapéptido FLAG (FLAG-MORT1) à GST, à proteina de fusão GST-FAS-IC (GST-huFAS-IC, GST-mFAS-lC) de humanos e de ratos e às proteínas de fusão GTS-FAS-IC em que o FAS-IC continha uma mutação de substituição de Ile para Ala na posição 225 (GST-mFAS-IC I225A) . As proteínas de células HeLa marcadas com [35S]-metionina incluindo a proteína de fusão marcada FLAG-MORTl tendo sido primeiro extraídas foram sujeitas a interacção com as várias proteínas GST e GST-FAS-IC (ligadas às partículas de glutationo) e depois a SDS-PAGE. Como controlos em todas as experiências de interacção, extractos de células HeLa transfectadas com luciferase foram sujeitos a interacções com as proteínas de fusão GST e GST-FAS-IC e SDS-PAGE. As Figs. 1 A e B estão também descritas no Exemplo 1.

Fig. 2 A, B e C são reproduções de autoradiogramas de géis de SDS-PAGE (10% Acrilamida) nos quais foram separados vários imunoprecipitados de células HeLa transfectadas e que mostram a interacção in vivo da HFl (MORT1) com o FAS-IC. As células HeLa foram transfectadas com constructos de DNA que codificam: a proteína de fusão HF1-FLAG (FLAG-MORTl) por si só, a proteína de fusão HFl-FLAG e o FAS-R (FLAG-MORTl + Fas/APOl) humano ou o FAS-R humano por si só (Fas/APOl) (Fig.2A); ou com a proteína de fusão HF1-FLAG e o p55R (FLAG-MORT-1 + p55R) humano (Fig. 2B); ou com a proteína de fusão HF1-FLAG e a proteína de fusão quimérica entre o FAS-R humano e p55-R no qual o domínio extracelular 21 do FAS-R foi substituído pela região correspondente do p55-R (FLAG-M0RT1 + p55-FAS quimérico) ou a proteína de fusão quimérica FAS-R-p55-R por si só (p55-Fas quimérica) (Fig. 2C) . Em todos os casos as células transfectadas foram marcadas metabolicamente com [35S]cisteína (20 pCi/mL) e [35S]metionina (40 pCi/mL), e foram sujeitas a extracção proteica. Os extractos proteicos das diferentes células transfectadas foram então imunoprecipitados com vários anticorpos sendo os anticorpos anti-FLAG, anti-FAS, anti-p75-R e anti-p55-R (aFLAG, aFAS, ap75-R e ap55-R nas Figs. 2A-C) e sujeitos a SDS-PAGE. No lado esquerdo da Fig. 2A estão indicadas as bandas de proteína correspondentes ao FAS-R (Fas/APOl) e a HF1-FLAG (FLAG-MORT1); entre as Figs. 2A e B são apresentadas as posições relativas dos marcadores de peso molecular padrão (em kDa); e no lado direito da Fig. 2C estão indicadas as bandas de proteína correspondentes ao p55R e p55-FAS quimérico. As Fig. 2A-C estão também descritas no Exemplo 1.

Fig.3 apresenta a reprodução de um Northern blot no qual um RNA poly A+ (0,3 pg) de células HeLa transfectadas foi sondado com cDNA HF1, como descrito no Exemplo 1.

Fig. 4 representa esquematicamente a sequência preliminar de nucleótidos e a sequência de aminoácidos deduzida da HF1, como descrito no Exemplo 1, em que o "domínio da morte" está sublinhado por poder ser um possível local de início da tradução, i.e. o resíduo de metionina sublinhado na posição 49 (negrito, M sublinhado). O asterisco indica o codão stop da tradução (nucleótidos 769-771). No princípio e no meio de cada linha são proporcionados dois caracteres numéricos que representam as posições relativas dos nucleótidos e aminoácidos da 22 sequência que diz respeito ao inicio da sequência (terminação 5' ) , nos quais o primeiro carácter numérico representa o nucleótido e o segundo representa o aminoácido.

Fig. 5 apresenta os resultados dos ensaios para determinar a extremidade C-terminal da MORT-1, em que a Fig. 5 é uma reprodução de um autoradiograma de um gel SDS-PAGE (10% Acrilamida) onde foram separados vários produtos de fusão MORT-l-FLAG expressos em células HeLa e maetabolicamente marcados com 35S-cisteína e 35S-metionina seguida pela imunoprecipitação quer com anticorpos monoclonais anti-FLAG (M2) (faixas 2, 4 e 6) ou como controlo, com anticorpos anti p-75 TNF-R (#9)(faixas 1, 3 e 5), como descrito no Exemplo 1.

Fig. 6 (A e B) representa graficamente o despoletar independente do ligando de efeitos citocidas em células transfectadas com MORT-1, em que a viabilidade celular foi determinada ou pelo ensaio de absorção de vermelho neutro (Fig. 6A), ou por determinação especifica da viabilidade das células que expressaram o DNA transfectado, por medição das quantidades de fosfatase alcalina placentária secretadas para o meio (Fig. 6B). As células de HeLa foram transfectadas com vectores de expressão controlados por tetraciclina que codificam para HF1 (MORT1), FAS-IC humano, p55-IC humano, ou luciferase (controlo), e em todos os casos também com um cDNA que codifica para a fosfatase alcalina secretada, que permitiu a avaliação do efeito da expressão transiente destas proteínas na viabilidade das células. Em ambas as Figs. 6A e 6B os gráficos abertos representam células transfectadas crescidas na presença de tetraciclina (1 pg/mL, para bloquear a expressão) e os 23 gráficos fechados representam células transfectadas crescidas na ausência de tetraciclina. As Figs. 6A e 6B estão também descritas no Exemplo 1.

Fig. 7 é uma representação gráfica dos efeitos de diferentes porções de proteína MORT-1 nos efeitos citotóxicos celulares mediados pelo FAS-R, como descrito no Exemplo 1.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção refere-se, num aspecto, a uma nova proteína MORT-1 (HFl), a qual é capaz de se ligar ao domínio intracelular do receptor FAS-R, um membro da superfamília TNF/NGF e assim é considerada como um mediador ou modulador do FAS-R, tendo um papel, por exemplo, no processo de sinalização que é iniciado pela ligação do ligando FAS ao FAS-R. As sequências de DNA e de aminoácidos da MORT-1 de acordo com a invenção também representam novas sequências; não aparecem nas bases de dados "GENEBANK" ou "PROTEIN BANK" de sequências de DNA ou de aminoácidos.

Assim, a presente invenção diz respeito à sequência de DNA que codifica para a proteína MORT-1 e à proteína MORT-1 codificada pelas sequências de DNA.

Mais ainda, a presente invenção também diz respeito às sequências de DNA que codificam para fragmentos biologicamente activos da proteína MORT-1, e para os fragmentos assim codificados. A preparação de tais fragmentos é feita pr um procedimento padrão (ver por exemplo, Sambrook et al.r 1989) em que nas sequências de DNA que codificam para a proteína MORT-1, um ou mais codões podem ser eliminados, adicionados ou substituídos por 24 outros, para obter análogos contendo pelo menos uma alteração num residuo aminoácídico em relação à proteína nativa. Análogos aceitáveis que aqui são divulgados são aqueles que retêm pelo menos a capacidade de se ligar ao domínio intracelular do FAS-R, ou que podem mediar qualquer outra ligação ou actividade enzimática, p.ex. análogos que se ligam ao FAS-IC mas que não sinalizam, i.e. não se ligam a um receptor, proteína ou outro factor adicional a jusante, ou não catalizam uma reacção dependente de sinal. De tal forma podem ser produzidos análogos que têm um chamado efeito negativo dominante, nomeadamente, um análogo que é defeituoso na ligação ao FAS-IC, ou na sinalização subsequente que segue tal ligação. Tais análogos podem ser utilizados, por exemplo, para inibir o efeito ligando do FAS competindo com as proteínas naturais de ligação ao FAS-IC. Da mesma forma, podem ser produzidos os chamados análogos de efeito dominante positivo, que iriam servir para ampliar o efeito de ligando do FAS. Estes teriam as mesmas ou melhores propriedades de ligação ao FAS-IC e as mesmas ou melhores propriedadas de sinalização que as proteínas de ligação ao FAS-IC naturais. De uma forma análogo, fragmentos biologicamente activos da MORT-1 podem ser preparados como indicado acima no que diz respeito aos análogos da MORT-1. Os fragmentos adequados da MORT-1 são aqueles que retêm a capacidade de ligação ao FAS-IC ou que podem mediar qualquer outra ligação ou actividade enzimática como descrito acima. De um modo concordante, os fragmentos da MORT-1 que têm efeito dominante positivo ou dominante negatio podem ser preparados como descrito acima em respeito aos análogos. Deve ser notado que estes fragmentos representam uma classe especial dos análogos da invenção, nomeadamente, eles são uma porção definida da MORT-1 derivadas da sequência MORT-1 completa, tendo cada 25 tal porção ou fragmento qualquer uma das actividades desejadas acima mencionadas. De forma semelhante, os derivados que aqui são divulgados podem ser preparados por modificações padrão dos grupos laterais de um ou mais resíduos aminoacídicos da proteína MORT-1, dos seus análogos ou fragmentos, ou por conjugação da proteína MORT-1, seus análogos ou fragmentos, a outra molécula p.ex. um anticorpo, enzima, receptor, etc como são bem conhecidos na técnica. A nova proteína MORT-1 ou os seus fragmentos têm várias utilizações possíveis, por exemplo: (i) Podem ser usados para mimetizar ou ampliar a função do ligando FAS-R, em situações onde um efeito ligando ampliado do FAS-R é desejado como em aplicações anti-tumorais, anti inflamatórias ou anti-HIV onde a citotoxicidade induzida pelo ligando FAS-R é desejada. Neste caso a proteína MORT-1 ou os seus fragmentos que ampliam o efeito ligando do FAS-R, i.e. efeito citotóxico, podem ser introduzidos nas células por procedimentos padrão conhecidos per se. Por exemplo, como a proteína MORT-1 é intracelular e deverá ser introduzida em células onde o efeito ligando do FAS-R é desejado, é necessário um sistema para a introdução específica desta proteína nas células. Uma forma de fazer isto é criando um vírus animal recombinante p.ex. um derivado de Vacciria, para o DNA do qual os seguintes dois genes serão introduzidos: o gene que codifica para um ligando que se liga a proteínas de superfície celular específicamente expresso pelas células p.ex. tais como a proteína gpl20 do vírus da SIDA (HIV) que se liga especificamente a algumas células (linfócitos CD4 e leucemias relacionadas) ou qualquer outro ligando que se 26 ligue especificamente a células que transportem um FAS-R, de tal forma que o vector vírus recombinante será capaz de se ligar a tais células veículo do FAS-R; e o gene que codifica para a proteína MORT-1. Assim, a expressão de proteínas de ligação à superfície celular na superfície do vírus irá direccionar o vírus especificamente para a célula tumoral ou outra célula veículoa de FAS-R, sendo que em seguida a sequência que codifica para a proteína MORT-1 será introduzida nas células através do vírus, e uma vez expressa nas células irá resultar numa ampliação do efeito de ligando do FAS-R levando à morte das células tumorais ou outras células veículo de FAS-R que seja desejável destruir. A construção de tais vírus animais recombinantes é feita por procedimentos padrão (ver por exemplo, Sambrook et al., 1989). Outra possibilidade é introduzir as sequências da proteína MORT-1 na forma de oligonucleótidos que podem ser absorvidos pelas células e aí expressos. Uma outra possibilidade é modificando o método descrito por Lyn et. al., no Journal of Biological Chemistry, Vol. 270, No. 24, pp. 14255-14258, 1995. (ii) Eles podem ser usados para inibir o efeito de ligando do FAS-R, p.ex. em casos tais como dano tecidular no choque séptico, rejeição enxerto-vs.-hospedeiro, ou hepatite aguda, nos quais é desejado bloquear a sinalização intracelular do FAS-R induzida pelo ligando FAS-R. Nesta situação é possível, por exemplo, introduzir nas células, por procedimentos padrão, oligonucleótidos contendo a sequência antisense para a proteína MORT-1, que iria efectivamente bloquear a tradução de mRNA que codificam para a proteína MORT-1 e assim bloquear a sua expressão e levar à inibição do efeito ligando do FAS-R. Tais oligonucleótidos podem ser introduzidos nas células 27 utilizando a abordagem do virus recombinante acima, sendo a segunda sequência transportada pelo virus a sequência oligonucleotidica.

Outra possibilidade é utilizar anticorpos específicos para a proteína MORT-l para inibir a sua actividade de sinalização intracelular.

Ainda outra forma de inibir o efeito ligando do FAS-R é pela recentemente desenvolvida abordagem por ribozima. Os ribozimas são moléculas de RNA catalizadoras que clivam RNAs específicamente. Os ribozimas podem ser concebidos para clivar RNAs alvo escolhidos, p.ex. os mRNAs que codificam a proteína MORT-l da invenção. Tais ribozimas teriam uma sequência específica para o mRNA da MORT-l e seriam capazes de interagir com o mesmo (ligação complementar) seguido de clivagem do mRNA, resultando numa diminuição (ou perda completa) na expressão da proteína MORT-l, o nível de expressão diminuída sendo dependente do nível de expressão do ribozima na célula alvo. Para introduzir ribozimas nas células escolhidas (p.ex. aquelas que transportam o FAS-R) qualquer vector adequado pode ser utilizado, p.ex. plasmídeo, vectores virais animais (retrovirus), que são geralmente utilizados para este propósito (ver também (i) acima, onde o vírus tem, como segunda sequência, um cDNA que codifica para uma sequência de um ribozima escolhido). (Para revisões, métodos etc., dizendo respeito a ribozimas ver Chen et al., 1992; Zhao e

Pick, 1993; Shore et al. • F 1993; Joseph e Burke, 1993; Shimayama et al • F 1993; Cantor et al., 1993; Barinaga, 1993; Crisell et al, ., 1993 e Koizumi et al. , 1993) • (iii) Podem : ser usados para isolar , identificar e clonar outras proteínas que sejam capazes de se ligar aos mesmos, 28 p.ex. outras proteínas envolvidas no processo de sinalização intracelular que estão a jusante dos domínios intracelulares do TNF-R ou FAS-R. Por exemplo, a proteína MORT-1, nomeadamente a sequência de DNA que a codifica para poder ser usada no sistema de duplo-híbrido em levedura (ver Exemplo 1, abaixo) no qual a sequência da proteína MORT-1 irá ser usada como "isco" para isolar, clonar e identificar a partir de bibliotecas de cDNA ou DNA genómico outras sequências ("presas") que codificam proteínas que se podem ligar à proteína MORT-1. Da mesma forma, também pode ser determinado se a proteína MORT-1 da presente invenção se pode ligar a outras proteínas celulares, p.ex. outros receptores da superfamília de receptores TNF/NGF. (iv) A proteína MORT-1 ou os seus fragmentos podem também ser usados para isolar, identificar e clonar outras proteínas da mesma classe i.e. aquelas que se ligam ao domínio intracelular do FAS-R ou a receptores funcionalmente relacionados, e envolvidas no processo de sinalização intracelular. Nesta aplicação o sistema de duplo-híbrido em levedura acima referido pode ser usado, ou pode ser usado um sistema recentemente desenvolvido que emprega uma hibridação Southern não estringente, seguida de uma clonagem por PCR (Wilks et al., 1989) . Na publicação de Wilks et al., está descrita a identificação e clonagem de duas proteínas putativas tirosina-cinases por aplicação de uma hibridação Southern não estringente, seguida de uma clonagem por PCR baseada na sequência conhecida do motivo da cinase, uma sequência cinase concebida. Esta abordagem pode ser usada, em concordância com a presente invenção usando a sequência da proteína MORT-1 para identificar e clonar as sequências de proteínas relacionadas que se ligam ao domínio intracelular do FAS-R. 29 (v) Ainda outra abordagem para a utilização da proteina MORT-1 ou seus fragmentos da invenção é utilizá-los em métodos de cromatografia de afinidade para isolar e identificar outras proteínas ou factores aos quais são capazes de se ligar, p.ex. outros receptores relacionados com o FAS-R ou outras proteínas ou factores envolvidos no processo de sinalização intracelular. Nesta aplicação, a proteína MORT-1 ou os seus fragmentos da presente invenção, podem ser individualmente acopladas a matrizes de cromatografia de afinidade e depois colocadas em contacto com extractos celulares ou proteínas isoladas ou factores que se suspeitem estar envolvidos no processo de sinalização intracelular. Após o procedimento de cromatografia de afinidade, as outras proteínas ou factores que se ligam à proteína MORT-1 ou fragmentos da invenção, podem ser eluídos, isolados e caracterizados. (vi) Como referido acima, a proteína MORT-1 ou os seus fragmentos da invenção podem também ser usados como imunogénios (antigénios) para produzir anticorpos específicos para os mesmos. Estes anticorpos podem também ser usados para efeitos de purificação da proteína MORT-1 quer seja a partir de extractos celulares ou a partir de linhas celulares transformadas produzindo MORT-1, seus análogos ou fragmentos. Além disso, estes anticorpos podem ser usados para efeitos de diagnóstico na identificação de distúrbios relacionados com um funcionamento anormal do sistema ligando FAS-R, p.ex. efeitos celulares induzidos pelo ligando FAS-R hiperactivos ou hipoactivos. Assim, caso tais distúrbios estejam relacionados com um sistema de sinalização intracelular com mau funcionamento envolvendo a 30 proteína MORT-1, tais anticorpos iriam servir com uma importante ferramenta de diagnóstico. (vii) A MORT-1 pode também ser usada como um modulador indirecto de várias outras proteínas em virtude da sua capacidade de se ligar a outras proteínas intracelulares, (as chamadas proteínas de ligação MORT-1, ver abaixo), às quais outras proteínas intracelulares ligam directamente ainda outras proteínas intracelulares ou um domínio intracelular de uma proteína transmembranar. Um exemplo de tal proteína ou tal domínio intracelular é o bem conhecido receptor p55 do TNF, a sinalização intracelular do qual é modulada por várias proteínas que se ligam directamente ao seu domínio intracelular (ver o pedido pendente IL 109632). De facto, isolámos tal proteína ligando MORT-1 (ver abaixo e o Exemplo 2) que se liga ao domínio intracelular do receptor p55 do TNF.

Para efeitos de modulação destas outras proteínas intracelulares ou dos domínios intracelulares de proteínas transmembranares, a MORT-1 pode ser introduzida em células de várias formas como aqui mencionado acima (ii).

Deve também ser notado que o isolamento, identificação e caracterização da proteína MORT-1 da invenção pode ser efectuada usando qualquer um dos bem conhecidos procedimentos de monitorização. Por exemplo, um destes processos de monitorização, o procedimento de duplo-híbrido em levedura tal como aqui é apresentado (Exemplo 1), foi usado para identificar a proteína MORT-1 da invenção. Da mesma forma tal como notado acima e em baixo, outros procedimentos podem ser empregues tais como a cromatografia de afinidade, procedimentos de hibridação de DNA, etc. tal 31 como são bem conhecidos na técnica, para isolar, identificar e caracterizar a proteína MORT-1 da invenção ou para isolar, identificar e caracterizar proteínas adicionais, factores, receptores, etc. que são capazes de se ligar à proteína MORT-1 da invenção.

Além disso, deve também ser notado que entre as características da MORT-1 está a sua capacidade de se ligar ao FAS-IC e também a sua capacidade de se auto associar. A MORT-1 é também capaz de activar a citotoxicidade celular por si só, uma actividade relacionada com a sua capacidade de auto associação. Aparentemente (Exemplo 1) a porção da MORT-1 que se liga ao FAS-IC é distinta da porção da MORT-1 que está envolvida na sua auto associação. A MORT-1 pode também ter outras actividades que podem ser função das acima referidas distintas porções da molécula MORT-1 ou outras porções da molécula ou combinações de quaisquer destas porções. Estas outras actividades podem ser enzimáticas ou relacionadas à ligação de outras proteínas (p.ex. proteínas de ligação à MORT-1 ou outros receptores, factores, etc.). Assim, a MORT-1 pode ser usada nos métodos acima para modulação dos efeitos de ligando do FAS-R ou os seus próprios efeitos celulares mediados pela MORT-1, ou pode ser usada na modulação dos processos de sinalização de outras células relacionados com outros receptores, factores, etc.

Mais especificamente, por este aspecto da invenção a molécula de DNA que codifica para a MORT-1 ela mesma e mutações da mesma (i.e. codificando para análogos ou fracções activas da MORT-1) pode ser usada para terapia genica (i.e. pelas formas adiantadas nas utilizações (i) e (ii) acima) para a modulação da actividade do FAS-R (ou 32 modulando ou mediando o efeito de ligando do FAS em células). Mais ainda, sendo que a MORT-l tem também um efeito citotóxico nas células, estas moléculas de DNA que codificam para a MORT-l ou para MORT-l mutantes podem também ser usadas em terapia génica para a modulação do efeito da MORT-l em células (também através das utilizações (i) e (ii) acima). Nestas aplicações em terapia génica, a MORT-l pode ser usada de 3 formas: (a) a proteína MORT-l na sua totalidade, ou fragmentos activos da mesma que possuam tanto a capacidade de se ligarem à MORT-l como ao FAS-IC (i.e. contêm as duas regiões da MORT-l, uma das quais está envolvida na ligação ao FAS-IC e a outra das quais está envolvida na auto associação da MORT-l) podem ser usados para modular efeitos associados ao FAS-R e MORT-l; (b) a porção da MORT-l e fragmentos activos desta porção que se igam ao FAS-IC podem ser usados para induzir um efeito "dominante negativo" no FAS-IC, i.e. inibição dos efeitos celulares mediados pelo FAS-R, ou pode ser usada para induzir um efeito de "ganho de função" no FAS-IC, i.e. ampliação dos efeitos celulares mediados pelo FAS-R; e (c) a porção da MORT-l e fracções activas desta porção, que se ligam específicamente à MORT-l podem ser usadas para indução de efeitos "dominante negativo" ou "ganho de função" na MORT-l, i.e. tanto inibição como ampliação dos efeitos celulares associados à MORT-l.

Tal como adiantado na utilização (vi) acima, a proteína MORT-l pode ser usada para gerar anticorpos específicos para a MORT-l. Estes anticorpos ou fragmentos dos mesmos 33 podem ser usados tal como adiantado aqui abaixo em detalhe, sendo compreendido que nestas aplicações os anticorpos ou fragmentos dos mesmos são aqueles específicos para a MORT-1.

No que diz respeito aos anticorpos daqui em diante aqui mencionados, o termo "anticorpo" pretende incluir anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (mAbs), anticorpos quiméricos, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) até anticorpos que podem ser marcados na forma solúvel ou ligada, bem como fragmentos dos mesmos desde que o sejam por qualquer técnica conhecida, tal como, mas não limitado a clivagem enzimática, síntese de péptidos ou técnicas recombinantes.

Os anticorpos policlonais são populações heterogéneas de moléculas de anticorpo derivadas do soro de animais imunizados com um antigénio. Um anticorpo monoclonal contém uma população substancialmente homogénea de anticorpos específicos para antigénios, cujas populações contêm locais de ligação aos epítopos substancialmente semelhantes. Os Mabs podem ser obtidos por métodos conhecidos para os especialistas na técnica. Ver, por exemplo Kohler e Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); Patente US N°. 4,376,110; Ausubel et ai. Eds., Harlow e Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor laboratory (1988); e Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene publishing Assoe, e Wiley Interscience N.Y. (1992, 1993), cujos conteúdos aqui contêm referências incorporadas na sua totalidade por referência. Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulinas incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD e qualquer subclasse das mesmas. Um hibridoma que produza um mAb da presente invenção pode ser 34 cultivado in vitro, in situ ou in vivo. A produção de concentrações elevadas de mAbs in vivo ou in situ fazem deste o método de produção preferido actualmente.

Os anticorpos quiméricos são moléculas cujas diferentes porções são derivadas de diferentes espécies animais, tais como aqueles que possuem a região variável de um mAb de murina e uma região constante de uma imunoglobulina humana. Os anticorpos quiméricos são principalmente usados para reduzir a imunogenicidade na aplicação e para aumentar o rendimento da produção, por exemplo, onde os mAbs de murina têm rendimentos mais elevados a partir de hibridomas mas uma mais elevada imunogenicidade em humanos, de tal modo que são utilizados mAbs quiméricos de humano/murina. Os anticorpos quiméricos e os métodos para a sua produção são conhecidos na técnica (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al.,

Nature 312:643-646 (1984); Cabilly et al., Pedido de Patente Europeia N° 125023 (publicada em 14 de Novembro, 1984); Neuberger et al., Nature 314:268-270 (1985);

Taniguchi et al., Pedido de Patente Europeia N° 171496 (publicada em 19 de Fevereiro, 1985); Morrison et al., Pedido de Patente Europeia N° 173494 (publicada em 5 de Março, 1986); Neuberger et al., Pedido PCT N° WO 8601533, (publicada em 13 de Março, 1986); Kudo et al., Pedido de Patente Europeia N° 184187 (publicada em 11 de Junho, 1986); Sahagan et al., j. Immunol. 137:1066-1074 (1986);

Robinson et al., Pedido de Patente Internacional N° WO8702671 (publicada em 7 de Maio, 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 84:3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sc USA 84:214-218 (1987); Better et al., 35

Science 240:1041-1043 (1988); e Harlow e Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supracitado.

Um anticorpo anti idiotípico (anti-Id) é um anticorpo que reconhece determinantes únicos geralmente associados com o local de ligação ao antigénio de um anticorpo. Um anticorpo Id pode ser preparado imunizando um animal da mesma espécie e tipo genético (p.ex. estirpe de rato) como a fonte do mAb com o mAb para o qual um anti-Id está a ser preparado. O animal imunizado irá reconhecer e responder aos determinantes idiotipicos do anticorpo imunizante produzindo um anticorpo para estes determinantes idiotipicos (o anticorpo anti-Id). Ver, por exemplo, a Patente US N°. 4,699,880. O anticorpo anti-Id pode também ser usado com um "imunogénio" para induzir uma resposta imune em ainda outro animal, produzindo o assim chamado anticorpo anti-anti-Id. O anticorpo anti-anti-Id pode ser idêntico a nivel de epitopos ao mAb original que induziu o ani-Id. Assim, usando anticorpos para os determinantes idiotipicos de um mAb, é possível identificar outros clones que expressam anticorpos de especificidade idêntica.

De um modo concordante, os mAbs gerados contra a proteina MORT-1 ou fragmentos da mesma, da presente invenção podem ser usados para induzir anticorpos anti-Id em animais adequados, tais como ratinhos BALB/c. As células de baço de tais ratinhos imunizados são utilizadas para produzir hibridomas anti-Id que segregam mAbs anti-Id. Além disso, os mAbs anti-Id podem ser acoplados a um veiculo tal como uma hemocianina modelo chave-fechadura (KLH) e usados para imunizar ratinhos BALB/c adicionais. O soro destes 36 ratinhos irá conter anticorpos anti-anti-Id que têm as propriedades de ligação do mAb original especifico para um epitopo da proteína MORT-1 acima, análogos fragmentos ou derivados.

Os mAbs anti-Id têm assim os seus próprios epítopos idiotípicos, ou "idiotopos" estruturalmente semelhantes ao epitopo que está a ser avaliado, tal como a proteína-α GRB. 0 termo "anticorpo" também pretende incluir ambas as moléculas intactas bem como os fragmentos das mesmas, tais como, por exemplo, Fab e F(ab')2, que são capazes de ligar o antigénio. Os fragmentos Fab e F(ab')2 não possuem o fragmento Fc do anticorpo intacto, são mais rapidamente eliminados da circulação, e podem ter menos ligação não específica a tecidos do que um anticorpo intacto (Wahl et ai., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)).

Será apreciado que Fab e F(ab')2 e outros fragmentos dos anticorpos úteis na presente invenção podem ser usados para a detecção e quantificação da proteína MORT-1 de acordo com os métodos aqui divulgados para moléculas de anticorpo intactas. Tais fragmentos são tipicamente produzidos por clivagem proteolítica, usando enzimas tais como a papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2).

Um anticorpo diz-se "capaz de ligar" a uma molécula se for capaz de reagir específicamente com a molécula para assim ligar a molécula ao anticorpo. 0 termo "epitopo" pretende-se que se refira à porção de qualquer molécula capaz de ser ligada por um anticorpo que possa também ser reconhecida por esse anticorpo. Epítopos ou "determinantes 37 antigénicos" usualmente consistem de agrupamentos de moléculas de superfície quimicamente activas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares e têm características tridimensionais estruturais especificas bem como características específicas de cargas.

Um "antigénio" é uma molécula ou porção de uma molécula capaz de ser ligada por um anticorpo que é adicionalmente capaz de induzir um animal a produzir anticorpo capaz de se ligar a um epítopo desse antigénio. Um antigénio pode ter um ou mais do que um epítopo. A reacção específica referida acima pretende indicar que o antigénio irá reagir, de uma forma altamente selectiva, com o seu anticorpo correspondente e não com a multiplicidade de outros anticorpos que podem ser solicitados por outros antigénios.

Os anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpos, úteis na presente invenção podem ser usados para detectar quantitativamente ou qualitativamente a MORT-1 numa amostra ou para detectar a presença de células que expressam a MORT-1 da presente invenção. Isto pode ser conseguido por técnicas de imunofluorescência empregando um anticorpo marcado fluorescentemente (ver abaixo) juntamente com microscopia óptico, citometria de fluxo, ou detecção fluorimétrica.

Os anticorpos (ou fragmentos dos mesmos) úteis na presente invenção podem ser empregues histológicamente, como na imunofluorescência ou microscopia imunoelectrónica, para detecção in situ da MORT-1 da presente invenção. A detecção in situ pode ser levada a cabo removendo um espécime histológico de um paciente, e proporcionando o 38 anticorpo marcado da presente invenção a um tal espécime. 0 anticorpo (ou fragmento) é proporcionado, de preferência, aplicando ou sobrepondo o anticorpo marcado (ou fragmento) a uma amostra biológica. Através da utilização de tal procedimento, é possível determinar não só a presença da MORT-1, mas também a sua distribuição no tecido examinado. Utilizando a presente invenção, os executores comuns da técnica irão prontamente perceber que qualquer um, de uma vasta variedade, de métodos histológicos (tais como procedimentos de coloração) podem ser modificados de forma a atingir tal detecção in situ.

Tais ensaios para a MORT-1 da presente invenção tipicamente compreendem incubar uma amostra biológica, tal como um fluido biológico, um extracto de tecido, células colhidas recentemente tais como linfócitos ou leucócitos, ou células que foram incubadas em cultura de tecidos, na presença de um anticorpo marcado detectável capaz de identificar a proteína MORT-1, e detectando o anticorpo por qualquer uma de um número de técnicas bem conhecidas na técnica.

A amostra biológica pode ser tratada com um suporte de fase sólida ou com um veículo como a nitrocelulose, ou outro suporte sólido ou veículo que seja capaz de imobilizar células, partículas celulares ou proteínas solúveis. 0 suporte ou veículo pode então ser lavado com soluções tampão adequadas seguido pelo tratamento com um anticorpo marcado, detectável de acordo com a presente invenção, como notado acima. 0 suporte de fase sólida ou veículo podem então ser lavados com a solução tampão uma segunda vez para remover o anticorpo não ligado. A 39 quantidade de marcador ligado na referida fase sólida ou veiculo pode então ser detectada por métodos convencionais.

Por "suporte de fase sólida", "veiculo de fase sólida", "suporte sólido", "veiculo sólido", "suporte" ou "veiculo" entende-se qualquer suporte ou veiculo capaz de ligar a um antigénio ou a anticorpos. Suportes ou veículos bem conhecidos, incluem vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, amilases de nylon, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, gabros e magnetite. A natureza do veículo pode ser ou solúvel até uma certa extensão ou insolúvel para os propósitos da presente invenção. 0 material de suporte pode ter virtualmente qualquer configuração estrutural desde que a molécula associada seja capaz de se ligar a um antigénio ou anticorpo. Assim, a configuração do suporte ou veículo pode ser esférica, tal como uma conta, cilíndrica, como a superfície interior de um tubo de ensaio, ou a face exterior de uma barra. Alternativamente, a superfície pode ser plana como uma folha, tira de teste, etc. Os suportes ou veículos preferidos incluem as esferas de poliestireno. Os especialistas na técnica conhecerão outros veículos adequados para ligar a anticorpos ou a antigénios, ou serão capazes de averiguar o mesmo utilizando ensaios de rotina. A actividade de ligação de um determinado lote de anticorpo, da invenção tal como referenciado acima, pode ser determinada de acordo com métodos bem conhecidos. Os especialistas na técnica serão capazes de determinar as condições operativas de ensaio óptimas para cada determinação empregando experiências de rotina. 40

Outros passos tais como lavagem, mistura, agitação, filtração e semelhantes podem ser adicionados aos ensaios tal como é costume ou necessário para a situação em particular.

Uma das formas pela qual um anticorpo de acordo com a presente invenção pode marcado de forma detectável é ligando o mesmo a um enzima e usar um imunoensaio enzimático (EIA) . Este enzima, por sua vez, quando mais tarde é exposto a um substrato apropriado, vai reagir com o substrato de tal forma a produzir uma porção química que pode ser detectada, por exemplo, por meios espectrofotométricos, fluorométricos ou visuais. Enzimas que podem ser usados para marcar detectavelmente o anticorpo incluem, mas não estão limitados a, malato desidrogenase, nuclease estafilocócica, delta-5-esteróide isomerase, álcool desidrogenase de leveduras, alfa-glicerofosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, asparaginase, glucose oxidase, beta-galactosidade, ribonuclease, urease, catalase, glucose-6-fosfato desidrogenase, glucoamilase e acetilcolina-esterase. A detecção pode ser conseguida por métodos colorimétricos que empregam um substrato cromogénico para o enzima. A detecção pode também ser conseguida por comparação visual da extensão da reacção enzimática de um substrato em comparação com padrões preparados de forma semelhante. A detecção pode ser conseguida utilizando qualquer um de vários outros imunoensaios. Por exemplo, marcando radioactivamente os antigénios ou fragmentos de anticorpo, é possível detectar o R-PTPase através da utilização de um radioimunoensaio (RIA) . Uma boa descrição de RIA pode ser 41 encontrada em Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, por Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) com referência particular para o capitulo entitulado "An Introduction to Radioimmune Assay and related Techniques" por Chard, T., aqui incorporado como referência. 0 isótopo radiaoactivo pode ser detectado por tais meios como a utilização de um contador γ ou um contador de cintilações ou por autoradiografia. É também possível marcar um anticorpo de acordo com a presente invenção com um composto fluorescente. Quando o anticorpo marcado fluorescentemente é exposto a luz do comprimento de onda apropriado, a sua presença pode ser detectada devido a fluorescência. Entre os compostos marcadores fluorescentes mais comumente usados estão o isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, picocianina, aloficocianina, o-ftaldeído e fluorescamine. 0 anticorpo também pode ser marcado de forma detectável usando metais emissores de fluorescência tais -ICO , como E, ou outros da serie dos lantanideos. Estes metais podem ser associados ao anticorpo usando grupos quelantes de metais tais como ácido dietilenotriaminopentacético (ETPA). 0 anticorpo também pode ser marcado de forma detectável por associação com um composto quimioluminescente. A presença de anticorpo marcado com quimioluminescência é então determinda por detecção da presença de luminescência que surge no decurso de uma reacção química. Exemplos de compostos marcadores quimioluminescentes particularmente úteis são o luminol, 42 isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazol, sal de acridínio e éster de oxalato.

Da mesma forma, um composto bioluminescente pode ser usado para marcar o anticorpo da presente invenção. A bioluminescência é um tipo de quimioluminescência encontrada em sistemas biológicos no qual uma proteína catalítica aumenta a eficiência da reacção quimioluminescente. A presença de uma proteína bioluminescente é determinada detectando a presença de luminescência. Compostos bioluminescentes importantes para efeitos de marcação são a luciferina, luciferase e aequorina.

Uma molécula de anticorpo da presente invenção pode ser adaptada para utilização num ensaio imunométrico, também conhecido como ensaio "bi-localizado" ou "sandwich". Num ensaio imunométrico típico, uma quantidade de anticorpo (ou fragmento de anticorpo) não marcado é ligado a um suporte sólido ou veículo e uma quantidade de anticorpo solúvel detectável é adicionado para permitir a detecção e/ou quatificação do complexo ternário formado entre anticorpo em fase sólida, antigénio, e anticorpo marcado.

Tipicamente, e preferencialmente, os ensaios imunométricos incluem ensaios "forward" nos quais o anticorpo ligado à fase sólida é primeiro colocado em contacto com a amostra que está a ser testada para extrair o antigénio da amostra por formação de um complexo binário anticorpo em fase sólida-antigénio. Depois de um período adequado de incubação, o suporte sólido ou veículo é lavado para remover o resíduo do fluido de amostra, incluindo o antigénio que não reagiu, se algum, e o que esteve em 43 contacto com a solução contendo uma quantidade desconhecida de anticorpo marcado (que funciona como "molécula repórter"). Depois de um segundo período de incubação para permitir que o anticorpo marcado forme um complexo com o antigénio ligado ao suporte sólido ou veículo através do anticorpo não marcado, o suporte sólido ou veículo é lavado uma segunda vez para remover o anticorpo marcado que não reagiu.

Noutro tipo de ensaio "sandwich", que pode também ser útil com os antigénios da presente invenção, os chamados ensaios "simultâneos" e "inversos" são usados. Um ensaio simultâneo envolve um único passo de incubação sendo que o anticorpo ligado ao suporte sólido ou veículo e o anticorpo marcado são ambos adicionados à amostra que está a ser testada ao mesmo tempo. Depois da incubação estar completa, o suporte sólido ou veículo é lavado para remover o resíduo de fluido de amostra e o anticorpo marcado que não complexou. A presença de anticorpo marcado associado com o suporte sólido ou veículo é então determinada tal como seria feito num ensaio sandwich "forward" convencional.

No ensaio "inverso", a adição faseada, primeiro deuma solução do anticorpo marcado à amostra fluida, seguido pela adição de anticorpo não marcado ligado a um suporte sólido ou veículo depois de um período de incubação adequado ser utilizado. Depois de uma segunda incubação, a fase sólida é lavada de forma convencional para a libertar do residuo da amostra que está a ser testada e da solução de anticorpo marcado que não reagiu. A deteminação do anticorpo marcado associado com um suporte sólido ou veículo é então determinada tal como nos ensaios "simultâneos" e "forward". 44 A MORT-1 da invenção pode então ser produzida por qualquer procedimento de DNA recombinante padrão (ver por exemplo, Sambrook, et al., 1989) no qual células hospedeiras eucariotas ou procariotas adequadas são transformadas por vectores eucariotas ou procariotas adequados contendo as sequências que codificam para as proteínas. De um modo concordante, a presente invenção também diz respeito a tais vectores de expressão e hospedeiros transformados para a produção de proteínas da invenção. Tal como mencionado acima, estas proteínas também incluem os seus fragmentos biologicamente activos e assim os vectores que as codificam também incluem vectores que codificam fragmentos destas proteínas, e os hospedeiros transformados incluem aqueles que produzem tais fragmentos. Os derivados aqui apresentados são derivados produzidos por modificações padrão das proteínas ou seus análogos ou fragmentos, produzidos por hospedeiros transformados. A presente invenção também diz respeito a composições farmacêuticas compreendendo vectores virais animais recombinantes que codificam para a proteína MORT-1, cujo vector também codifica para uma proteína virai de superfície capaz de se ligar a proteínas de superfície de células alvo específicas (p.ex. células de cancro) para direccionar a inserção da sequência MORT-1 nas células. Outros aspectos da invenção tornar-se-ão evidentes através dos exemplos seguintes. A invenção será agora descrita em mais detalhe nos exemplos não limitantes que se seguem e nas figuras que os acompanham: 45 EXEMPLO 1: Clonagem e isolamento da proteína MORT-1 que se liga ao domínio intracelular do FAS-R (i) Teste de Expressão com Monitorização de duplo-híbrido e duplo-hibrido β-galactosidase

Para isolar proteínas que interagem com o domínio intracelular do FAS-R, o sistema de duplo-híbrido em levedura foi utilizado (Fields e Song, 1989; ver também os pedidos pendentes IL 109632, 112002 e 112692). De forma breve, este sistema de duplo-híbrido é um ensaio genético baseado em levedura para detectar interacções proteína-proteína específicas in vivo por restauração de um activador transcricional eucariota tal como GAL4 que tem dois domínios separados, um de ligação ao DNA e um domínio de activação, cujos domínios quando expressos e ligados um ao outro para formar uma proteína GAL4 restaurada, é capaz de se ligar a uma sequência de activação a montante que por seu lado activa um promotor que controla a expressão de um gene repórter, tal como lacZ ou HIS3, a expressão do qual é prontamente observada nas células em cultura. Neste sistema os genes para a proteína interactuante candidata são clonados em vectores de expressão separados. Num vector de expressão a sequência da primeira proteína candidata é clonada em fase com a sequência do domínio de ligação ao DNA da GAL4 para gerar uma proteína híbrida com o domínio de ligação ao DNA da GAL4, e no outro vector a sequência da segunda proteína candidata é clonada em fase com a sequência do domínio de activação da GAL4 para gerar uma proteína híbrida com o domínio de activação da GAL4. Os dois vectores híbridos são então co-transformados para uma cadeia de levedura hospedeira naquelas células hospedeiras transformadas (co-transformantes) nas quais as duas proteínas híbridas são expressas e são capazes de interagir 46 uma com a outra, serão capazes de expressão do gene repórter. No caso do gene repórter lacZ, as células hospedeiras que expressam este gene ficarão com a cor azul quando X-gal é adicionado às culturas. Assim, as colónias azuis são indicativas do facto de que as duas proteínas candidatas clonadas são capazes de interagir uma com a outra.

Usando este sistema de duplo-híbrido, o domínio intracelular, FAS-IC, foi clonado, separadamente, no vector pGBT9 (que transporta a sequência de ligação ao DNA da GAL4, proporcionada por CLONTECH, USA, ver abaixo), para criar proteínas de fusão com o domínio de ligação ao DNA da GAL4. Para a clonagem do FAS-R no pGBT9, foi usado um clone que codifica para a sequência completa de cDNA do FAS-R (ver pedido pendente IL 111125) ao qual o domínio intracelular (IC) foi excisado por procedimentos padrão usando vários enzimas de restrição e então isolado por procedimentos padrão e inserido no vector pGBT9 aberto, na sua região localizada de clonagem múltipla (MCS), com os correspondentes adequados enzimas de restrição. Deve ser notado que o FAS-IC se estende dos resíduos 175-319 do FAS-R intacto, esta porção contendo os resíduos 175-319 sendo o FAS-IC que é inserido no vector pGBT9 (ver também IL 111125) . 0 vector híbrido acima (quimérico) foi então co-transfectado juntamente com uma biblioteca de cDNA de células HeLa humanas clonadas no vector pGAD GH, contendo o domínio de activação da GAL4, na cadeia de levedura hospedeira HF7c (todos os vectores notados acima, pGBT9 e pGAD GH que transportam a biblioteca de cDNA da célula HeLa, e a cadeia de levedura foram adquiridas a Clontech 47

Laboratories, Inc., USA, como parte de MATCHMAKER Two-Hybrid system, #PT1265-1) . As leveduras co-transfectadas foram seleccionadas pela sua capacidade de crescer num meio sem Histidina (meio His"), sendo colónias em crescimento indicadoras de transformados positivos. Os clones de levedura seleccionados foram então testados pela sua capacidade de expressar o gene lacZ, i.e. pela sua actividade lacZ, e isto por adição de X-gal ao meio de cultura, que é catabolizado para formar um produto de cor azul pelo β-galactosidase, o enzima codificado pelo gene lacZ. Assim, colónias azuis são indicativas de um gene lacZ activo. Para a actividade do gene lacZ, é necessário que o activador de transcrição da GAL4 esteja presente nos clones transformados numa forma activa, nomeadamente que o domínio de ligação ao DNA da GAL4 codificado pelos vectores híbridos acima seja combinado de forma adequada com o domínio de activação da GAL4 codificado pelo outro vector híbrido. Tal combinação só é possível se as duas proteínas fundidas a cada um dos domínios da GAL4 forem capazes de interagir (de se ligar) de forma estável. Assim, as colónias His+ e as colónias azuis (LAC Z+) que foram isoladas são colónias que foram co-transfectadas com o vector que codifica o FAS-IC e um vector que codifica uma proteína como produto de origem em células HeLa humanas, que é capaz de se ligar de forma estável ao FAS-IC. 0 DNA plasmídeo das colónias de levedura His+ e LAC Z+ foi isolado e sujeito a electroporação em cadeias HB101 de E. coli ou procedimentos padrão seguido de selecção de transformantes resistentes a Leu+ e Ampicilina, sendo estes transformantes aqueles que transportam o vector híbrido pGAD GH que possui ambas as sequências que codificam AmpR e Leu2. Tais transformantes são assim clones que transportam 48 as sequências que codificam proteínas recentemente identificadas capazes de se ligar ao FAS-IC. 0 DNA plasmideo foi então isolado a partir destes E. coli transformados e re-testado por: (a) retransformando-os com o plasmideo híbrido do domínio intracelular original FAS-R (pGTB9 híbrido que transporta o FAS-R) na estirpe de levedura HF7 tal como aqui acima indicado. Como controlos, foram usados vectores transportando sequências irrelevantes que codificam proteínas, p.ex. pACT-lamina ou pGBT9 por si só foram usados para a co-transformação com o plasmideo que codifica para a proteína de ligação ao FAS-IC (i.e. MORT-1). As leveduras co-transformadas foram então testadas para crescimento em meio His~ somente, ou com diferentes níveis de 3-aminotriazole; e (b) retransformando o DNA plasmideo e o plasmideo híbrido original FAS-IC os plasmídeos de controlo descritos em (a) em células hospedeiras da estirpe SFY526 de levedura e determinando a actividade LAC z+ (efectividade de formação de β-gal, i.e. formação de cor azul).

Os resultados dos testes acima revelaram que o padrão de crescimento das colónias em His” era idêntico ao padrão de actividade LAC Z, tal como avaliado pela cor da colónia, i.e. colónias His+ eram também LAC Z+. Além disso, a actividade LAC Z em cultura líquida (condições de cultura preferenciais) foi avaliada após a transfecção dos híbridos dos domínios de ligação ao DNA e de activação da GAL4 em leveduras hospedeiras SFY526 que têm uma melhor inducibilidade com o activador de transcrição GAL4 do que as das leveduras hospedeiras HF-7. 49

Usando o procedimento acima uma proteína chamada HF1, e agora também chamada MORT-1 para "Mediator of Receptor-induced Toxicity", foi identificada, isolada e caracterizada.

Além disso, deve ser mencionado que em alguns dos testes duplo-híbrido de expressão de β-glactosidase acima, a expressão de β-glactosidase foi também avaliada por um ensaio de filtro preferencial. Na monitorização, 5 de cerca de 3xl06 cDNAs verificou-se conterem o insert MORT-1. Os assim isolados inserts clonados de cDNA da MORT-1 foram então sequenciados usando métodos padrão de sequenciação de DNA. A sequência de aminoácidos da MORT-1 foi deduzida da sequência de DNA. A numeração dos resíduos nas proteínas codificadas pelos inserts de cDNA é feita como no banco de dados Swiss-prot. Mutantes de delecção foram produzidos por PCR, e mutantes pontuais por mutagénese dirigida a oligonucleótidos (Current Protocols in Molec. Biol., 1994). (ii) Expressão induzida, marcação metabólica e imunoprecipitação de proteínas A MORT-1, N-ligada ao octapéptido FLAG (FLAG-HF1; Eastman Kodak, New Haven, Ct., USA), FAS-IC, FAS-R, p55-R, uma quimera composta pelo domínio extracelular do p55-R (aminoácidos 1-168) fundida aos domínios transmembranar e intracelular do FAS-R (aminoácidos 153-319), e o cDNA da luciferase que serve de controlo, foram expressos em células HeLa. A expressão foi realizada usando um vector de expressão controlado por tetraciclina, num clone de uma célula HeLa (HtTA-1) que expressa um transactivador controlado por tetraciclina (Gossen e Bujard, 1992; como descrito no documento PCT/US95/05854; ver também Boldin et ai., 1995). A marcação metabólica com [35S]metionina e 50 [35S] cisteína (DUPONT, Wilmington, De., USA e Amersham, Buckinghamshire, England) foi realizada 18 horas depois da transfecção, por uma posterior incubação de 4h a 37°C no meio Eagle modificado de Dulbecco sem metionina nem cisteina, mas suplementado com soro fetal de vitelo a 2% dializado. As células foram então sujeitas a lise em solução padrão RIPA (lOmM Tris-HCL, pH 7,5, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1% desoxicolato, 0,1% SDS e 1 mM EDTA) e o lisado foi pré-clarifiçado por incubação com antisoro irrelevante de coelho (3 pL/rnL) e esferas de Proteina G Sefarose (Pharmacia, Uppsala, Sweden, 60 μΙ/mL). A imunoprecipitação foi realizada por incubação durante lh a 4°C de alíquotas de 0,3 rnL de lisado com anticorpos monoclonais de rato (5pL/al íquota) contra 0 octapéptido FLAG (M2; Eastman Kodak), p55-R (#18 e #20; (Engelmann et al.r 1990)) , ou FAS-R (ZB4; Kamiya Southand Oaks, Ca., USA), ou com anticorpos de ratinho com isotipo compatível como controlo, seguido de uma posterior incubação de lh com esferas de Proteína G Sefarose (30 pL/alíquota). (iii) Ligação In vitro

As fusões de Glutationo-S-Transferase (GST) com o Fas-IC do tipo nativo ou mutado foram produzidas e adsorvidas a esferas de glutationo-agarose (como descrito nos documentos IL 109632, 111125, 112002, 112692, ver também Boldin et al., 1995; Current protocols in molecular biology, 1994; Frangioni e Neel, 1993). A ligação da proteína de fusão FLAG-HF1 metabolicamente marcada ao GST-Fas-IC foi avaliada incubando as esferas durante 2h a 4°C com extractos de células HeLa, metabolicamente marcadas com [35S]metionina (60 pCi/mL), que expressam FLAG-HFl. Os extractos foram preparados numa solução tampão contendo 50 mM Tris-HCl, pH7,5, NaCl 150mM, NP-40 0,1%, ditiotreitol 1 mM, EDTA lmM, 51 fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, aprotinina 20 pg/mL, leupeptina 20 pg/rnL, fluoreto de sódio 10 mM e vanadato de sódio 0,1 mM (lmL por 5xl01 2 3 4 5 células). (iv) Avaliação da citotoxicidade despoletada pela expressão induzida de HF1 1 A HF1, Fas-IC, p55-IC e cDNAs de luciferase foram 2 inseridos num vector de expressão controlado por tetraciclina e transfectados em células HtTA (uma linha 3 celular de HeLa) (Gossen e Bujard, 1992) juntamente com o cDNA da fosfatase alcalina placentária segregada, colocados 4 sob o controlo do promotor SV40 (o vector pSBC-2 (Dirks et al., 1993)). A morte celular foi avaliada 40 horas após a transfecção, quer pelo ensaio de recolha do vermelho neutro (Wallach, 1984) ou, avaliando especificamente a morte nas células que expressam os cDNAs transfectados, determinando as quantidades de fosfatase alcalina placentária (Berger et al., 1988) segregada para o meio de crescimento nas últimas 5 horas de incubação.

Noutro conjunto de experiências para analizar a região da proteína MORT-1 (HF1) envolvida na ligação ao FAS-IC, as seguintes proteínas foram expressas de forma transitória em células HeLa que contêm um transactivador controlado por tetraciclina (HtTA-1), usando um vector de expressão controlado por tetraciclina (pUHD10-3): FAS-R humano por si só; FAS-R humano bem como a porção N-terminal da MORT-1 (aminoácidos 1-117, a "porção superior da MORT-1"); o FAS-R humano bem como a porção C-terminal da MORT-1, que contém a sua região de homologia "domínio da morte" (aminoácidos 130-245, a "MORT-1 DD", ver também o documento IL 112742); FLAG-55.11 (aminoácidos 309-900 da proteína 55.11 fundidos na porção N-terminal ao octapéptido FLAG, sendo a proteína 52 55.11 uma proteína específica de ligação p55-IC, ver também o documento IL 109632) . 12 horas após a transfecção, as células foram tripsinizadas e re-semeadas a uma concentração de 30.000 células/poço. Após 24 horas de incubação adicional, as células foram tratadas durante 6 horas com um anticorpo monoclonal contra o domínio extracelular do FAS-R (anticorpo monoclonal CH-11, Oncor) a várias concentrações (anticorpo monoclonal 0,001-10 pg/mL), na presença de cicloheximida 10 g/mL. A viabilidade celular foi então determinada pelo ensaio de recolha do vermelho neutro e os resultados foram apresentados em termos de % de células viáveis em comparação com as células gue haviam sido incubadas com apenas cicloheximida (na ausência de anticorpo monoclonal CH-11 anti FAS-R). (v) Monitorização Northern e Sequencial O RNA Poly A+ foi isolado do RNA total de células HeLa (oligotex-dT mRNA kit. QIAGEN, Hilden, Germany). A análise Northern usando o cDNA HF-1 como sonda foi realizada por métodos convencionais (como descrito no documento PCT/US95/05854; ver também Boldin et ai., 1995). A sequência de nucleótidos da MORT-1 (HF1) foi determinada em ambas as direcções pelo método de terminação da cadeia didesoxi.

Os resultados (apresentados na Tabela 1 e nas Figs. 1-7) obtidos dos procedimentos experimentais acima são como se segue: A análise da sequência do cDNA MORT-1 clonado pelo procedimento de duplo-híbrido indicou que este codifica para uma nova proteína (ver abaixo). Aplicando o teste de duplo-híbrido adicionalmente, para avaliar a especificidade da ligação desta proteína (MORT-1) para "Mediator of Receptor-induced Toxicity") ao Fas-IC, e para 53 definir a região particular no FAS-IC ao qual se liga, levou às seguintes verificações (Tabela 1) : (a) A proteína liga a ambos Fas-IC de humano e rato, mas não a várias outras proteínas testadas, incluindo três receptores da família dos receptores TNF/NGF (receptores p55 e TNF p75 e CD40); (b) As mutações de substituição na posição 225 (Ile) no "domínio da morte" do FAS-R, que já mostraram abolir a sinalização tanto in vitro como in vivo (a mutação lprcg (Watanabe-Fukunaga et ai., 1992; Itoh e Nagata, 1993), também previnem a ligação da MORT-1 ao FAS-IC; (c) O local de ligação do FAS-R à MORT-1 ocorre dentro do "dominio da morte" deste receptor; e (d) A MORT-1 liga-se a si própria. Esta auto ligação, e a ligação de HF1 a FAS-R envolvem diferentes regiões da proteína. Um fragmento da MORT-1 correspondente aos resíduos 1-117 liga-se à MORT-1 em toda a sua extensão, mas não se liga a si próprio nem ao FAS-IC. Contudo, um fragmento correspondente aos resíduos 130-245 liga-se ao FAS-R, no entanto não se liga à MORT-1 (Tabela 1). Além disso, é evidente dos resultados na Tabela 1 que a região "domínio da morte" do FAS-R é crítica para a auto-associação do FAS-IC, bem como é a região "domínio da morte" de p55-R para a auto-associação do p55-IC. As delecções em ambos os lados destes "domínios da morte" não afectam a sua capacidade de auto associação enquanto, no entanto, uma delecção dentro destes "domínios da morte" afecta a auto-associação. No caso da MORT-1, a ligação da MORT-1 ao FAS-IC é também dependente do "domínio da morte" completo (cheio) do FAS-R, enquanto no entanto, também não é dependente das regiões fora do "domínio da morte" do FAS-R para ligação ao FAS-IC. 54

Tabela 1 - Interacção da MORT-1 com o FAS-IC e auto-associação da MORT-1 dentro das leveduras transformadas: avaliação por um teste de expressão com duplo-hibrido de β-galactosidase. 54 4- •£f

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Na tabela 1 acima está representada a interacção das proteínas codificadas pelo domínio de ligação ao DNA da 55 GAL4 e os constructos do domínio de activação (pGBT9 e pGAD-GH) em leveduras SFY526 transfectadas como avaliado pelo ensaio de filtragem da expressão de β-galactosidase. Os constructos do domínio de ligação ao DNA incluíram quatro constructos do Fas-IC humano, quatro constructos do Fas-IC de rato incluindo dois conctructos com o seu comprimento total tendo mutações de substituição de Ile a Leu ou Ile a Ala na posição 225 (I225N e I225A, respectivamente), e três constructos de HF1 (MORT-1), sendo todos os constructos mostrados esquematicamente no lado esquerdo da tabela. Os constructos do domínio de activação incluíam três constructos de HFl, estando a porção HF-1 tal como nos constructos do domínio de ligação ao DNA; e um constructo no seu comprimento total de Fas-IC humano, sendo a porção Fas-IC a mesma nos constructos do domínio de ligação ao DNA acima. Os domínios intracelulares do receptor TNF p55 humano (p55-IC resíduos 206-246) , CD40 humano (CD40-IC, resíduos 216-277) e receptor TNF p75 humano (p75-IC, resíduos 287-461) bem como os vectores lamina, ciclina D e Gal4 "vazia" (pGBT9) serviram como controlos negativos na forma de constructos do domínio de ligação ao DNA. SNF-1 e SNF-4 serviram como controlos positivos na forma de constructos do domínio de ligação ao DNA (SNF1) e do domínio de activação (SNF4) . Vectores "vazios" Gal4 (pGAD-GH) também serviram como controlos negativos na forma de constructos do domínio de activação (para mais detalhes relativamente a p55-IC, p75-IC, ver também o documento PCT/US95/05854) . Os símbolos "++" e "+" denotam o desenvolvimento de côr forte nos primeiros 30 a 90 minutos do ensaio, respectivamente; e denota a ausência de desenvolvimento de côr em 24h. As combinações para as quais não foi dada classificação, não foram testadas. 56 A expressão de moléculas de HF1 (MORT-1) fundidas na sua terminação N com o octapéptido FLAG (FLAG-HF1) originou em células HeLa, proteínas de quatro tamanhos distintos -cerca de 27, 28, 32, e 34 KD. Na Fig. 1 (A e B) são apresentados os resultados que demonstram a interacção de HF1 com Fas-IC in vitro. Como notado acima na descrição das Figs. IA e B, a Fig. IA é uma reprodução de um autoradiograma de controlo de um imunoprecipitado de proteínas de extractos de células HeLa transfectadas com a proteína de fusão FLAG-HF1 (FLAG-M0RT1) ou com cDNA de luciferase como controlo, sendo a imunoprecipitação realizada com anticorpo anti-FLAG (aFLAG). Fig. 1B é uma reprodução de uma autoradiografia que mostra a interacção in vivo entre HF1 e FAS-IC onde o HF1 está na forma de proteínas de fusão metabolicamente marcadas com [35S]metionina HF1-FLAG obtidas de extractos de células HeLa transfectadas e o FAS-IC está na forma de proteínas de fusão de humano e de rato GTS-FAS-IC incluindo uma que tem uma mutação de substituição na posição 225 no FAS-IC, sendo que todas as proteínas de fusão GST-FAS-IC foram produzidas em E. coli. As proteínas de fusão GST foram ligadas a contas de glutationo antes da interacção com os extractos contendo a proteína de fusão HFl-FLAG seguindo esta interacção, foi realizado SDS-PAGE. Assim a interacção in vitro foi avaliada por estimativa, por autoradiografia em seguimento do SDS-PAGE, a ligação de HF1 metabolicamente marcado com [35S], produzido em células HeLa transfectadas como uma fusão com o octapéptido FLAG (FLAG-HF1), a GST, à fusão de GST com o FAS-IC de humano ou rato (GST-huFas-IC, GST-mFas-IC) ou à fusão de GST com o FAS-IC contendo uma mutação por substituição de Ile a Ala na posição 225. Como é evidente da Fig. 1B, todos as quatro proteínas FLAG-HF1 mostraram capacidade de se ligar ao Fas-IC aquando da 57 incubação com uma proteína de fusão GST-Fas-IC. Tal como no teste de duplo-híbrido em leveduras (Tabela 1), HF1 não se ligou à proteína de fusão GST-Fas-IC com uma substituição no site de mutação lprcg (I225A) .

As proteínas codificadas pelo cDNA FLAG-HF1 mostraram também uma capacidade para se ligar ao domínio intracelular do FAS-R, bem como ao domínio intracelular do FAS-R quimérico cujo domínio extracelular foi substituído por aquele do p55-R (p55-FAS), quando co-expresso com estes receptores em células HeLa. Na Fig. 2 (A, B, C) são apresentados os resultados que demonstram a interacção de HF1 com FAS-IC em células HeLa transfectadas, i.e. in vivo. Como mencionado acima na descrição das Figs. 2A, B, C, estas figuras são reproduções de autoradiogramas de imunoprecipitados de várias células HeLa transfectadas que demonstram in vivo a interacção e especificidade da interacção entre HF1 e FAS-IC em células co-transfectadas com constructos que codificam estas proteínas. Assim, a proteína de fusão FLAG-HF1 foi expressa e metabolicamente marcada com [35S] cisteína (20 μ Ci/mL) e [35S]metionina (40 pCi/mL) em células HeLa, por si só, ou juntamente com FAS-R humano, FAS-R quimérico no qual o domínio extracelular do FAS-R foi substituído pela correspondente região no humano p55-R (p55-FAS), ou o p55-R humano, como controlo negativo. A imunoprecipitação cruzada do HF1 com o receptor co-expresso foi realizada usando os anticorpos indicados (Figs. 2 A-C). Como é evidente das Figs. 2 A-C, FLAG-HF1 é capaz de se ligar ao domínio intracelular do FAS-R, bem como ao domínio intracelular de uma quimera FAS-R-p55 tendo o domínio extracelular do p55-R e o domínio intracelular do FAS-R, quando co-expresso com estes receptores em células HeLa (ver as 3 faixas do meio Fig 2A e as 3 faixas do lado 58 esquerdo Fig. 2C, respectivamente). Além disso, a imunoprecipitação de FLAG-HF1 a partir de extractos das células transfectadas também resultou na precipitação do FAS-R co-expresso (Fig. 2A) ou da quimera co-expressa p55-FAS (Fig. 2C) . Contudo, a imunoprecipitação destes receptores resultou na co-precipitação de FLAG-HF1 (Figs. 2A e 2C). A análise por Northern usando o cDNA da HF1 como sonda revelou um único transcrito a hibridar em células HeLa. A Fig. 3 apresenta a reprodução de um Northern Blot no qual o RNA poly A+ (0,3 pg) de células transfectadas foi hibridado com o cDNA da HF1. O tamanho deste transcrito (cerca de 1,8 kB) é próximo daquele do cDNA de HF1 (cerca de 1.702 nucleótidos).

Na análise sequencial, verificou-se que o cDNA contém uma grelha de leitura aberta (ORF) com cerca de 250 aminoácidos. A Fig. 4 representa a sequência de nucleótidos preliminar e a sequência de aminoácidos deduzida da HF1 na qual o motivo "domínio da morte" está sublinhado, tal como está um possível resíduo de iniciação de Met (posição 49; negrito, M sublinhado) e o codão stop para a transcrição (o asterisco debaixo do codão na posição 769-771) . Este motivo "domínio da morte" partilha homologia com os conhecidos motivos "domínio da morte" p55-R e FAS-R (p55DD e FASDD). De forma a determinar a extremidade C-terminal de HF1 e para obter evidências em no que diz respeito à extremidade N-terminal (resíduo Met inicial) de HF1, experiências adicionais foram levadas a cabo como se segue:

Usando os métodos descritos acima, alguns constructos que codificam para moléculas de HF1 fundidas na sua 59 extremidade N-terminal com o octapéptido FLAG (FLAG-HF1) foram construídos e expressos em células HeLa com marcação metabólica das proteínas expressas usando 35S-cisteína e 35S-metionina (ver acima a respeito da Fig. 5B). As moléculas de HF1-FLAG foram codificadas pelos seguintes cDNAs contendo diferentes porções da sequência que codifica para o HF1: i) 0 cDNA do octapéptido FLAG ligado à extremidade 5' do cDNA de HF1 do qual os nucleótidos 1-145 (ver Fig. 4) foram eliminados; ii) 0 cDNA do octapéptido FLAG ligado à extremidade 5' do comprimento total do cDNA do HF1 (ver constructo FLAG-HF1 acima a respeito da Fig. 1B); iii) 0 cDNA do octapéptido FLAG ligado à extremidade 5' do cDNA de HF1 do qual os nucleótidos 1-145 bem como os nucleótidos 832-1701 (ver Fig. 4) foram eliminados e o codão GCC na posição 142-144 foi mutado para TCC para prevenir o inicio da tradução neste local.

Após a expressão dos produtos de fusão HF1-FLAG acima, foi levada a cabo a imunoprecipitação como mencionado acima, usando ou anticorpos monoclonais anti-FLAG (M2) ou como controlo, anticorpos anti-p75 TNF-R (#9), seguida de SDS-PAGE (10% acrilamida) e autoradiografia. Os resultados são apresentados na Fig. 5, a qual é uma reprodução de um autoradiograma no qual foram separadas as acima notadas proteínas de fusão HF1-FLAG, as amostras carregadas em cada faixa do gel sendo como se segue:

Faixas 1 e 2: Proteína de fusão HFl-FLAG codificada pelo cDNA do octapéptido FLAG ligado à extremidade 5' do cDNA de HF1 do qual os nucleótidos 1-145 foram eliminados. 60

Faixas 3 e 4: Proteína de fusão HF1-FLAG codificada pelo cDNA do octapéptido FLAG ligado à extremidade 5' do comprimento total do cDNA da HF1.

Faixas 5 e 6: Proteína de fusão HF1-FLAG codificada pelo O cDNA do octapéptido FLAG ligado à extremidade 5' do cDNA de HF1 do qual os nucleótidos 1-145 bem como os nucleótidos 832-1701 foram eliminados e o codão GCC na posição 142-144 foi mutado para TCC para prevenir o início da tradução neste local.

As imunoprecipitações foram feitas com anticorpos monoclonais anti-FLAG para as amostras nas faixas 2, 4 e 6 e anticorpos anti-p75 TNF-R para as amostras nas faixas 1,3 e 5.

Do autoradiograma da Fig. 5 é evidente que a identidade dos tamanhos dos produtos nas faixas 2 e 4 confirma que os nucleótidos 769-771 são o local de terminação da tradução para a HF1, i.e. este codão representa um sinal stop e está indicado por um asterisco na Fig. 4. Além disso, a ocorrência de uma banda larga que representa apenas dois produtos da tradução (como observado no gel mas sendo fortemente marcado indica uma única banda larga no autoradiograma) na faixa 6 indica que a ocorrência de dois produtos adicionais (as bandas largas de peso molecular mais elevado) nas faixas 2 e 4 reflectem a iniciação da tradução tanto na porção N-terminal da molécula de fusão FLAG-HF1 como no resíduo de metionina número 4 9 na sequência de HF1 (ver M negrito e sublinhado na posição 49 da sequência de aminoácidos na Fig.4). Assim, os resultados acima confirmaram (validaram) a extremidade C-terminal de HF1 e proporcionaram evidências que a 61 extremidade N-terminal de HF1 pode estar na posição 49 da sequência da Fig. 4.

De facto, foi demonstrado por ensaios adicionais da expressão de HF1 sem o octapéptido FLAG fundido à sua terminação 5, que Met49 serve como um local efectivo de iniciação da tradução.

Deve ser mencionado que uma busca conduzida nas bases de dados "Gene Bank" e "Protein Bank" revelou que não há nenhuma sequência correspondente àquela de HF1 representada na Fig. 4. Assim, a HFl representa uma nova proteína específica de ligação ao FAS-IC. A elevada expressão do p55-IC resulta num despoletar de um efeito citocida (ver os documentos IL 109632, 11125 e Boldin et al., 1995). A expressão de FAS-IC em células HeLa também tem tal efeito, apesar de em menor extensão, o que pôde ser detectado apenas com a utilização de um ensaio sensível. Nas Fig. 6 A e B está representado graficamente o despoletar independente do ligando de efeitos citocidas em células transfectadas com HFl, bem como p55-IC e FAS-IC humanos. O efeito da expressão transiente de HFl, FAS-IC humano, p55-IC humano, ou luciferase que serviram como controlo, na viabilidade de células HeLa foi avaliado usando um vector de expressão controlado por tetraciclina. A viabilidade celular foi avaliada 40 min depois das células serem transfectadas com estes cDNAs quer em presença (barras abertas, Fig. 6A e B) ou ausência (barras fechadas, Fig. 6A e B) de tetraciclina (1 pg/mL, para bloquear a expressão), em conjunto com um cDNA que codifica para a fosfatase alcalina placentária segregada. A viabilidade celular foi determinada quer pelo ensaio de 62 recolha do vermelho neutro ou, para determinar específicamente a viabilidade daquelas células em particular que expressam o cDNa transfectado, medindo a quantidade de fosfatase alcalina placentária segregada para o meio de crescimento (Fig. 6B) .

Assim, é evidente das Figs. 6 A e B que a expressão de HFl em células HeLa resultou numa morte celular significativa, superior àquela causada pela expressão de FAS-IC. Estes efeitos citotóxicos de todos p55-IC, FAS-IC e HFl parecem estar relacionados com as regiões "domínio da morte", presentes em todas estas proteínas, cujos "domínios da morte" têm uma propensão para se auto associar, e assim possivelmente propiciar os efeitos citotóxicos. À luz das características da HFl (MORT-1) acima mencionadas, nomeadamente, a associação específica da HFl com aquela região particular do FAS-R que está envolvida na indução da morte celular, e o facto de que mesmo uma pequena alteração de estrutura nessa região, que previne a sinalização (a mutação lprcg) elimina também a ligação da HFl, indica que esta proteína desempenha um papel na sinalização e despoletar da morte celular. Esta noção é ainda suportada pela capacidade observada da HFl para despoletar por si só um efeito citocida. Assim, a HFl (MORT-1) pode funcionar como (i) um modelador da auto-associação do FAS-R pela sua própria capacidade de se ligar ao FAS-R bem como a si própria, ou (ii) servir como um local de ancoragem para proteínas adicionais que estão envolvidas na sinalização do FAS-R, i.e. a HFl pode ser uma proteína de "ancoragem" e pode assim ligar outros receptores para além do FAS-R, ou (iii) constitui parte de 63 um sistema de sinalização distinto que interage com o sistema de sinalização do FAS-R.

De forma a analisar adicionalmente as regiões da MORT-1 (HF1) envolvidas na ligação ao FAS-IC e na modulação dos efeitos celulares mediados pelo FAS-R (citotoxicidade), as experiências mencionadas acima foram executadas, usando vectores que codificam para porções da MORT-1 (a "porção superior" da MORT-1, aminoácidos 10117 e a "MORT-1 dd", aminoácidos 130-245) (separadamente), com um vector que codifica para o FAS-R humano para co-transfecções de células HeLa. Nestas experiências as várias proteínas e combinações de proteínas foram expressas de forma transitória em células HeLa que contêm um transactivador controlado por tetraciclina (HtTA-1) inserindo as sequências que codificam para as proteínas num vector de expressão controlado por tetraciclina pUHD10-3. As transfecções de controlo empregaram vectores que codificam apenas o FAS-R e vectores que codificam a proteína de fusão FLAG-55.11 (sendo a proteína 55.11 uma proteína específica de ligação ao p55-IC da qual uma porção contendo os aminoácidos 309-900 foi fundida (na sua terminação N) ao octapéptido FLAG).

Posteriormente aos períodos de transfecção e de incubação (ver (iv) acima) as células transfectadas foram tratadas com várias concentrações de um anticorpo monoclonal anti-FAS-R (CH-11) que se liga específicamente ao domínio extracelular do FAS-R expresso por células. Esta ligação do anticorpo anti-FAS-R induz a agregação de FAS-R na superfície celular (muito como o ligando FAS-R) e induz a via de sinalização intracelular mediada pelo FAS-IC, resultando, em última análise, na morte celular 64 (citotoxicidade celular mediada por FAS-R). As concentrações do anticorpo monoclonal anti-FAS-R (CH-11) usado foram no intervalo de 0,01-10 pg/mL, geralmente concentrações tais como 0, 005; 0,05; 0,5 e 5 pg/mL. As células foram tratadas com o anticorpo anti-FAS na presença de cicloheximida 10 pg/mL.

Os resultados da análise acima estão apresentados gráficamente na Fig. 7 que representa a % de viabilidade das células transfectadas em função da concentração de anticorpo monoclonal anti-FAS-R (CH11) usado para tratar as células, para cada um dos quatro diferentes grupos de células transfectadas. Estes grupos de células transfectadas são representados por diferentes símbolos como se segue: (i) o quadrado aberto representa células transfectadas apenas com o vector de controlo não relevante (não ligante a FAS-IC) que codifica para a proteína de fusão FLAG-55.11 ("55.11", controlo negativo); (ii) o quadrado fechado representa células co-transfectadas com vectores que codificam para o FAS-R e vectores que codificam para a porção C-terminal da MORT-1, aminoácidos 130-245, que contêm a região de homologia "domínio da morte (dd) da MORT-1 ("fas+mortldd"); (iii) os triângulos fechados representam células transfectadas com apenas o vector que codifica para o FAS-R ("fas", controlo positivo); e (iv) os círculos abertos representam células co-transfectadas com vectores que codificam o FAS-R e vectores que codificam a porção N-terminal da MORT-1, aminoácidos 1-117, a "porção superior de MPRT-1" ("faz + mortlhe").

Dos resultados apresentados na Fig. 7, é evidente que a expressão do FAS-R nas células transfectadas confere uma 65 sensibilidade aumentada aos efeitos citocidas dos anticorpos anti-FAS-R (comparar "fas" a "55.11"). Além disso, a co-expressão da região da MORT-1 que contém a região de homologia "dominio da morte" e FAS-R ("faz + mortldd") interfere fortemente com a morte celular induzida por FAS (i.e. mediada pelo FAS-R) tal como seria esperado da capacidade (ver Tabela 1 acima) da região "dominio da morte" (DD) da MORT-1 se ligar ao "dominio da morte" do FAS-R (FAS-DD) . Mais ainda, a co-expressão da porção N-terminal da MORT-1 e FAS-R ("fas+mortlhe") não interfere com a morte celular mediada por FAS-R e, se de todo, de alguma forma amplia a citotoxicidade (i.e. morte celular ligeiramente aumentada).

Assim, os resultados acima indicam claramente que a proteina MORT-1 tem duas regiões distintas no que diz respeito à ligação ao FAS-IC e à mediação da actividade citotóxica celular do FAS-IC.

Estes resultados também proporcionam uma base para a utilização de diferentes porções (i.e. fragmentos activos ou análogos) da proteina MORT-1 para diferentes aplicações farmacêuticas. Por exemplo, os análogos ou fragmentos ou derivados dos mesmos da proteina MORT-1 que contenham essencialmente apenas a porção C-terminal da MORT-1 inclusive do sua região "domínio da morte" podem ser usados para inibir efeitos citotóxicos mediados pelo FAS-R em células ou tecidos que contenham FAS-R e assim proteger estas células ou tecidos dos efeitos prejudiciais do ligando FAS-r em casos tais como, por exemplo, hepatite aguda. Em alternativa, os análogos ou fragmentos ou derivados dos mesmos da proteína MORT-1 que contêm essencialmente apenas a porção N-terminal da MORT-1 podem 66 ser usados para ampliar os efeitos citotóxicos mediados pelo FAS-R em células ou tecidos que contenham FAS-R, assim levando à destruição aumentada destas células ou tecidos quando desejado em casos tais como, por exemplo, células tumorais e cálulas T e B autoreactivas. Como aqui detalhado acima, as utilizações acima de diferentes regiões da MORT-1 podem ser levadas a cabo usando os vários virus recombinantes (p.ex. Vaccinia) para inserir a sequência que codifica para a região da MORT-1 em células ou tecidos específicos que se desejam tratar.

Além disso, também é possível preparar e usar várias outras moléculas tais como, anticorpos, péptidos e moléculas orgânicas que têm sequências ou estruturas moleculares correspondentes às das regiões da MORT-1, acima descritas, por forma a atingir os mesmos efeitos mediados por estas regiões da MORT-1. 67

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Lisboa, 6 de Setembro de 2007

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL

(i) REQUERENTE: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD WEINWURZEL, Henry WALLACH, David BOLDIN, Mark VARFOLOMEEV, Eugene METT, Igor

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: MODULADORES DA FUNÇÃO DOS RECEPTORES FAS/APOl (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) ENDEREÇO DE CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO: BROWDY E NEIMARK (B) RUA: 419 Seventh Street N.M., Ste 300 (C) CIDADE: Washington (D) ESTADO: D.C. (E) PAÍS: Estados Unidos da América (F) CÓDIGO POSTAL: 20004 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE SUPORTE: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DE PEDIDO: (B) DATA DO DEPÓSITO: (B) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: IL 112022 (B) DATA DO DEPÓSITO: 15-DEZ-1994 70 (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: IL 112692 (B) DATA DO DEPÓSITO: 19-FEV-1995 (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (C) NÚMERO DO PEDIDO: IL 114615 (D) DATA DO DEPÓSITO: 16-JUL-1995 (viii) INFORMAÇÃO DO ADVOGADO/AGENTE: (A) NOME: BROWDY, Roger L. (B) NÚMERO DE REGISTO: 25,618 (C) NÚMERO REFERÊNCIA/ORDEM: WALLACH=16 (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (202) 628-5197 (B) TELEFAX: (202) 737-3528 (C) TELEX: 248633 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 1701 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..768 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1: 71 tm AAT »0 GCA CCS GAG TOC AGÇ TTC GGG SW SGA ATC CTT ©3© CCS . 4« vai Asu Sla Alá Fr© Gltt Cys Arg Fh« Gly Gly Gly lie Leu Gly Fro 1 5 10 15 CTG CSC AAG 03G CG& GAC CTG GCC AGG GCC AGC GAG CCG A3G ÂCA GAG 9Ê

Leu Gly Lya Arg Arg Asp Leu Ala Arg Ale Ser Glu Prc Arg Thr Glu 23 25 30 SGC GCG CGS AGG GCC SOO CCG Cftõ CCC CGS CCG CTT GCA GAG CCG GCC 144

Gly Ala Arg Arg Ala Gly Fro Gin Fro Arg Pr o Leu Ala Asp Pro Ala 35 40 45· ATG GAC CCS TTC CTG CTG CTG CTG CÃC TCG GTG TCG TCC AGC C?G TCG 132

Met Aap Fro Pha Leu vai Leu. Leu His Ser vai Ser ser Ser Leu Ser se S5 «o AGC AGC GAG CTG ACC GAG CTC AAG TTC CTA TGC CTC G33 CGC GTG GTC 240 Sêr Ser Glu Leu Thr Glu Leu Lys Phé Leu Cys Leu Gly Arg Vai Vai 65 70 7$ 60 MG CSC MS CTG GAG CSC GTS CAS AGC GGS CTA GAC CTC TTC TCC ATG 288

Lys Arg 'Lya Leu. Glu Arg Vai Gin Ser Gly Leu Aep Léu Fhe Ser Kst 05 30 35 CTG CTG GAG CAS MC GAC CTG GAG CCC GGG CÂC ACC GAG CTC CTG CGC 336

Leu Leu Glu Gin Asa Asp Leu Glu Fro Gly Hia Thr Glu Leu Leu Arg 100 105 U0 GAG CTG CTC GCC TCC CTG CGS CGC CAC GAC CTG CTG CGG CGC GCC GAC .304

Glu Leu Leu Ala Ser Leu Arg Arg Hís Asp Leu Leu Arg Arg Vai Asp 115 120 ias GAC TTC GAG GCC GSG GCS 005 GCC GGG GCC GCG CCT GGG SM SAA GAC 432

Asp Fbe Glu Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Glu Glu Aap 130 135 140 CTG TGT GCA GCA.TTT MC CTC: ATA TGT GAT MT GTG GCG AM GÃT TGG 460

Leu Cys Ala Ala Phe Asa vai He Cys Asp Asn vai Gly Lys Asp Trp 145 ISO 155 160 AGA AGS CTG GÇT CGT CAS CTC AM CTC TCA GAC ACC AAG ATC GAC AGC 523

Arg Arg Léu Ala Arg Gin leu Lya Vai Ser Asp Thr Lys lie Asp Ser 16S 170 175 ATC SAG GAC ASA TAC CCC CGC MC CTG AÇA GAG CGT GTG CGG GAG TCA S76 lie Glu Asp Arg Tyr Pro Arg Asa Leu Thr Glu Arg vai Arg Glu Ser 180 165 130 CTG ASA ATC TGG AAG MC ACA GAG MG GAG AAC GCA ACA GTG GCC CAC 624

Leu Arg lie Trp Lys Asm Thr Glu Lys Glu As« Ala Thr Vai Ala Mie 135 200 . 305 CTG GTG GSG GCT CTC AGG TCC TGC CAC ATG AAC CTG GTG GCT GAC CTG 672

Leu Vai Sly Ala Leu Arg Ser Cys Gin Set Asn Leu Vai Ala Asp Leu 210 215 .220 GTA CM GAG GTT CAG CAG GCC CGT GAC CTC CAG AAC AGG ACT GCG GCC 720

Vai Gin Glu Vai Gin Gin Ala Arg Asp Leu Gin Asa Arg Ser Gly Ala 225 230 33$ 240 72 ATO· TCC CTO ATO TCA TCC AAC TCA GAC CCA TC? ACG TCC GM GCG TCC 768

Met Ser Fr© H*t Ser ?«p abí Ser Aep Ala Ser Tbr Ser Glu Ma Ser 245 250 255 TGATGGGCCG CTGCTFTGCG CTGGTGGACC ACÃGGCRTÇT ACAÇAGCCTG GACTTTGGTT 338 CTCTCCAGGA AGGTAGCCCA SCACTQTGAA GACCC&3CAG GAAGCCAGGC TGAGTGAGCC $88 ACACACCACC TGCTTCTGAA CTCAAGCTGC δΤΤΤΆΤΤΑΑΤ GCCTCTCCCG CACCAGGCCG 948 GGCTTGGCíCC crGCACASAT ATrrCCATrr CTTCCTCRCT ATGACACTGA GCAAGATCTT 1008 GTCTCCRCTA AATCAGCTCC TOCGGGÂGTA CTTOGAAAGT TGGAACCGTO TCCAGCACAG 1068 AAGGAATCTG TGCASATGAG CAGTCACACT STTACTCCAC ASCGGAGGA3 ACCAGCTC&G 1128 AGGCCCAGGA ATCSGAGCSA A8O0R8AGG TGGAGMCTO GGATTTGMC CCCCSCC&TC U88 CTTCACCAOA GCCCATGCTC AACCACTST® ÕÇQTTCTGCT GCCCCTGCM TTOGCAGAAA 1248 GQATGTTTTT GTCCCATTTC CTTGGftGGCC ACCGGGACAG ACCTOGACAC TASGGTCAGG 1306

CaaWIOCTO TOGTO&XAG AQGÇATGQC? GGGGTGGGGG TOC&SMACC TQGTTGGCCG 1368 TOSTCCASCP CTTOGCCCOf CTGTOAGTTG AGTCTCCTCT CTGAGACTOC TASGTAGGGG 1428 C&StSATQGT TSCCAÊGAC3 MTTGAfíATA ATATCTGTGA GGTGCTGRTO RGTGATTGAC 1488 ACACAGCACT CTCTARMCT TtCTTGTCAG GATTATGOGT CCTOCMTTO TaCAGTTFCT 1548 TACTGTTTTG TATCRAAATC ACTATCTTTC TOATAACMÃ ATTGCCAASS CAGCGGGATC 1608 TCGTATOTT AAAMGCAffT CCTCTTATTC CTAAGGTMT CCTÃTTAAAA CAÍAGCTJTA 1668 CAACTrCCAT ΑΤΤΑΕΑΑΑΑΑ AMAAARAAA AAA 1701 (2)INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2:

(i)CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (C) COMPRIMENTO: 256 aminoácidos (D) TIPO: aminoácidos (E) TOPOLOGIA: linear (ii)TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi)DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: 73 vai AER Gin Ala pro Giu Cya Arg pfce Gly Gly Gly Ile Leu Gly Pr» '1; ρ* 5 10 IS teu Gly Lya Mg .Arg ÃSp Leu Ala Mg Ala Ser Glu. PrO Mg Thr GlU 28 25 • 30 m Alá Mg Arg Ala Gly Pr» Gin Pr» Arg Pro Leu Ala ÀSp Prs Ala m 40 45 Asp 90 Prss Phe Leu Vai Leu 55 Leu HiS Ser vai Ser &Q Ser Ser Leu Ser ser Ser Glu Leu Tftr Glu Leu Lys ?he Leu Cys Leu Gly Arg Vai vai 65 78 75 @0 Lys Arg Lys Leu GlU Arg Vai Gin Ser Gly Leu Asp Leu Pbe Ser Met 8¾ 95 Leu Leu GlU Glíí Mn ASp Leu Glu Pr o Gly His Thr Glu Leu Leu Arg ISO 105 no Giu Leu Leu Ala Ser Leu Arg Arg Hís Aep Leu Leu Arg Arg Vai Ãsp U5 120 125 ASp Phe GiU Ala Gly Mi Ala Ala Gly Ala Ala Fto Gly Glu Glu Asp 1.30 135 140 Leu m Ala. Ala Phe Mn Vai Ile Cys Asp Asn Vai Gly Lys Asp ?rp 1*5 ISO 155 160 Arg Arg Lêu Ala Arg Gin Leu Lys Vai Ser Aap Thr LyS II® Aep Ser 1£5 I?Ô 175 ile Glu Aip Arg Tyv pro Arg Ag» Leu Thr Glu Arg val Arg Glu Ser 180 115 190 Leu Arg Ile T tp Lys Asn Thr Glu Lys Glu Asn Ala Thr Vai Ala His 195 200 205 Leu Vftl Gly Ala Leu Arg Ser eys Gin Met Asn LéU Vai Ala Asp Leu 210 2IS 220 Vai Gin, Glu Vai Gin Gin Ala Arg Asp Leu Gin Asn Arg Ser Gly Ala 225 230 235 240: mt Ser Pro Met Ser Trp Asn Ser Asp Ala Ser Thr Ser GlU Ala Ser 245 250 255 74

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL

(i) REQUERENTE: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD WEINWURZEL, Henry WALLACH, David BOLDIN, Mark VARFOLOMEEV, Eugene METT, Igor

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: MODULADORES DA FUNÇÃO DOS RECEPTORES FAS/APOl (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) ENDEREÇO DE CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO: BROWDY E NEIMARK (B) RUA: 419 Seventh Street N.M., Ste 300 (C) CIDADE: Washington (D) ESTADO: D.C. (E) PAÍS: Estados Unidos da América (F) CÓDIGO POSTAL: 20004 (v)SUPORTE ELECTRONICO PARA COMPUTADOR: (A) TIPO DE SUPORTE: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DE PEDIDO: (B) DATA DO DEPÓSITO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (C) NÚMERO DO PEDIDO: IL 112022 (D) DATA DO DEPÓSITO: 15-DEZ-1994 75 (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (E) NÚMERO DO PEDIDO: IL 112692 (F) DATA DO DEPÓSITO: 19-FEV-1995 (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (G) NÚMERO DO PEDIDO: IL 114615 (H) DATA DO DEPÓSITO: 16-JUL-1995 (viii) INFORMAÇÃO DO ADVOGADO/AGENTE: (D) NOME: BROWDY, Roger L. (E) NÚMERO DE REGISTO: 25,618 (F) NÚMERO REFERÊNCIA/ORDEM: WALLACH=16 (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES: (D) TELEFONE: (202) 628-5197 (E) TELEFAX: (202) 737-3528 (F) TELEX: 248633 (2)INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (F) COMPRIMENTO: 1701 pares de bases (G) TIPO: ácido nucleico (H) TIPO DE CADEIA: simples (I) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (ix) CARACTERÍSTICAS:

(J) NOME/CHAVE: CDS (K) LOCALIZAÇÃO: 1..768 (xii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1: 76 0TG MT CA8 QCA CCS GAQ ICC A93 TTC GGG GCT GGA ATC CTT GGG CCS 40 vai hmi Gla Alà Ρϊΰ Glu Cys Arg Phe Gly Gly Gly Xle Leu Gly Pri> I 5 10 1.5 cm GGC AAG oss CGA GAC cm GCC am GCC AOC GAG CCS AGG AÇA om 9fi teu Cly Lys Arg Arg Mp teu Ala Arg Ala ter Glu ?ro Axg Thr Glu 20 25 30 GGC GCG CGG ÂGG GCC SOO 033 CM cee CGG cco CTT GCA GAC occ GCC 144 GLy ÂU Axg 35 Ar g Ala ely Pare Õlft 40 PrO Axg Pro Leu Ala 45 Asp Prs? Ala ATG GAC ceo TTC CTS CTG CTG CTG CAC Φ3Ϊ GTG TCG TCC AGC CTG TCG 192 Hat Asp ?ro Phe teu Vai Leu tea «is Sar Vai Ser Sêr Ser teu Ser 3« 55 «0 AGC &GC GAG CTG ACC OAO CTÇ AAG TTC CÍA. TGC crc e-GG CGÇ GTO GTC 340 Ser Ser Olw teu fte Glu Leu Lye Pha teu Cys teu sly Arg Vai vai £S 70 75 00 MS CSC MS cre GM jfWf* Vvv GTB CAG AGC GGC CTA CAC CTC TTC TCC ATS 2SS Lys Arg Lys Leu GlU Arg val ^ Glu Ser Gly Léu Asp teu Phe Ser mt 85 90 95 CTG CTG OAG CAS MC GAC CTG GAG ccc QGG CAC ACC GM CTC CTG CSC 335 teu teU Glu QIti Asn Asp teu Glu Pro Gly His Thr Glu teu Leu. Arg ISO 105 110 SAG CTG CTÇ mc TCC CTO COO esc CAC GAC CK CTG CGG CSC GTC GAC 384 Gks teu teu Ala Ser Leu Arg ftrg Mis Asp teu teu Mf Arg Vai Asp 115 120 135 GAC TTC GA» GCG GGQ gcg ©CG GCC GGG GCC GCG CCT G® GAA GAft GAC 432 Asp Phs Gla Ala Gly Ala Ãía Ala Gly Ala Ala Prõ Gly GrU Glu Asp 130 Í35 140 CTG TST GCA OCA TTT MC GTC ATA TST GAT AÁT GTG GGG AM m TGS 480 Leu Cys Ala Ala PM asa Vai 11« Cys Asp Asíi Vai Gly Lys A@P Trp 14¾ ISO 155 ISO AGA AGG CT-3 GCT CGT CAG CTO MA CTC TCA GAC ACC AM ATC GAC AGC S38 m ftrg Leu Ais Arg Glu teu Lys Vai Sex Asp Thr Lys Ue Asp Sèr 77

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Leu Arg Ile Trp Lys Asn Thr Sl« Lys ÕI» Àsb Ais Thr Vai Ala His iss 250 a&s CTG OTG SGG OCT ÇTC A88 TOC TOS CAS ATO MC CTB «tS OCX SAC CTÕ «72

Leu Vàl Gly Ala teu Arg S«r Cya Gl» Set Asa Leu Vai Ala Asp Lèu 210 215 220 GTA CM GA(J ATT CAG CAS GCC CGT GAC CTC CAC MC AQG A0T OG0 dCC 720

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ArC TCC CCC ATO TCA TOO MC TCft GAC OCA TC" AC" ICC GM OCO TCC 7S8

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AdSCCCAOSA ATCdSASCGA AOCAOAOAOS TGGASAACTO βΟΑΤΤΤΒΑΑΟ CCCCGCCATC 11BB CTTCACCASA 8CCCATQCTC AACCACTOT0 OCOTTCTGCT dCCOCT0CA0 CTQQCASAAA 1248 QGATSrTTTT GTCCCATTTC CTTSSAtSSCC ACCSGSACAÉ ACCT05ACAC TAGGGTCAGG 1308 CGOGGTGCfd ΤδάΤβΟβΟΑΟ A05CATS0CT GSGGTGOGOG TEGE3GAGACÇ TOSTTSOCÇG 1358 TOOTCCAOCT CTTGOCCCCT GTGTGAGTKS AOTCTCCTCT CTSAGACTOC TMJ3TAGOQG 1428

CAOTOKTSGT TOCCÃQSACO MTTGMATA MATCTOfiA GgTGCtOÁTG AStOAÍTOAC 14 8 S ACACAGCACT CTCTMATCT TCCTT5T0A8 dATTATGOOT GCTÓCMTTC WO/TmCS 1548 TAcrerme tatcamatc Acmtcmc tsatmcaoa attsccmgq caoccooatc i«ra TCOTftTCTTT AAAAAGCAST CCTCTTATTC CTMGOTMT CCFATTAAAA CACftGeTTTA 15S8 CAACTTCCAT ATIACAAAAft ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑ 1701 (2)INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2:

(i)CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (L) COMPRIMENTO: 256 aminoácidos (M) TIPO: aminoácidos (N) TOPOLOGIA: linear 78 (ii)TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi)DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: vai 3 As» Gin Alá pro £ Slu Cys Arg Pfee Sly 10 Ôly Gly We Leu Sly 15 Pro teu Gly Lya Arg Arg Asp teu Ate. Arg Ala ser Slu Pro Arg Thr Glu 20 25 30 Sly Ate Arg Arg Ala Sly Pre- Gin Pro Arg P-EO teu Ala A.sp Pro Ala 35 46 43 Met Asp Pko Fte teu Vai teu. teu Hís Ser Vai Ser Ser Ser teu Ser 50 35 fiO Sar Ser Glu teu Ur Gte Leu Lye Pfae teu Cys teu Sly Arg Vai Vai 55 70 75 eo Lys 1 4rg 3 jys teu Slu. Arg Vai Gin Ser Sly teu Asp Leu Phe Ser Met 85 SÓ $s teu teu Glu Gin 160 As π &Sp teu 61« Pr <5 10S ciy Sis Thr Slu Í46U 110: Leu Arg Glu teu teu Ala Ser teu Arg Arg Mia Asp teu teu Arg Arg Vai A&p 115 120 125

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Vai 61» 61« Vai otn Glh Ala Arg Asp teu alft Asa Arg Ser ôly Ala 225 230 235 240

Met Ser Pr* Jftet Ser Trp Asn s«r A$p Ala Ser Thr ser <sl« Ala Ser 245 250 255

Lisboa, 31 de Outubro de 2007

Claims (16)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Sequência de DNA que codifica para uma proteína MORT- 1. compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 4, ou seus fragmentos, todos os quais são capazes de se ligar ao domínio intracelular do FAS-R.

2. Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, seleccionada do grupo que consiste em: a) uma sequência de cDNA derivada da região codificante de uma proteína MORT-1 nativa; b) sequências de DNA capazes de hibridar com uma sequência de (a) sob condições moderadamente estringentes, as quais codificam para uma proteína de ligação ao domínio intracelular do FAS-R biologicamente activa; e c) sequências de DNA que são degeneradas como resultado do código genético para as sequências de DNA definidas em (a) e (b) e que codificam para uma proteína de ligação ao domínio intracelular do FAS-R biologicamente activa.

3. Proteína MORT-1 ou seus fragmentos, codificados por uma sequência de acordo com a reivindicação 1 ou 2, a referida proteína ou fragmentos sendo capazes de se ligar ao domínio intracelular do FAS-R.

4. Proteína MORT-1 de acordo com a reivindicação 3, contendo a sequência de aminoácidos deduzida, apresentada na Fig. 4.

5. Vector compreendendo uma sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1 ou 2. 2

6. Células hospedeiras transformadas, contendo um vector de acordo com a reivindicação 5.

7. Método para produzir uma proteína ou seus fragmentos de acordo com a reivindicação 3 ou 4, compreendendo o crescimento das células hospedeiras transformadas de acordo com a reivindicação 6 sob condições adequadas para a expressão da referida proteína ou fragmentos, efectuando modificações pós-traducionais da referida proteína de acordo com o necessário para a obtenção da referida proteína ou fragmentos e o isolamento da referida proteína ou fragmentos expressos.

8. Anticorpos ou seus fragmentos activos, capazes de se ligar especificamente à proteína MORT-1 ou fragmentos de acordo com a reivindicação 3 ou 4.

9. Método para o isolamento e identificação de proteínas, factores ou receptores capazes de se ligar à proteína MORT-1 de acordo com a reivindicação 3 ou 4, compreendendo: (a) aplicação do procedimento de cromatografia de afinidade no qual a referida proteína MORT-1 está ligada à matriz de cromatografia de afinidade, a referida proteína ligada é colocada em contacto com um extracto celular; e proteínas, factores ou receptores do extracto celular que se ligam à referida proteína ligada e são depois eluídos, isolados e analisados; ou (b) aplicação do procedimento com dois híbridos de levedura, no qual uma sequência que codifica para a referida proteína MORT-1 é transportada por um vector híbrido e a sequência de uma biblioteca de cDNA ou de DNA 3 genómico é transportada pelo segundo vector híbrido, os vectores sendo depois utilizados para transformar células hospedeiras de levedura e as células transformadas positivamente sendo isoladas, seguidas de extracção do referido segundo vector híbrido para obter uma sequência que codifica para uma proteína que se liga à referida proteína MORT-1.

10. Método de isolamento e identificação de uma proteína capaz de se ligar ao domínio intracelular do FAZ-R, compreendendo a aplicação do procedimento da hibridação Southern não estringente, seguida de clonagem por PCR, no qual uma sequência ou suas partes de acordo com a reivindicação 1 ou 2, são utilizadas como sondas para se ligarem a sequências de uma biblioteca de cDNA ou DNA genómico, contendo pelo menos homologia parcial com as mesmas, as referidas sequências ligadas depois amplificadas e clonadas pelo procedimento de PCR para originar clones que codificam para proteínas contendo, pelo menos, homologia parcial com as referidas sequênias da reivindicação 1 ou 2.

11. Composição farmacêutica compreendendo um ingrediente activo seleccionado do grupo que consiste em: (1) uma proteína MORT-1 ou fragmentos de acordo com a reivindicação 3 ou 4 e sua mistura; (2) um vector virai recombinante animal, o qual transporta sequências de DNA que codificam para uma proteína capaz de se ligar ao receptor de superfície celular e codificar para uma proteína MORT-1 ou fragmentos, de acordo com a reivindicação 3 ou 4; 4 (3) um oligonucleótido contendo uma sequência antisense da sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1 ou 2; e (4) um anticorpo ou seu fragmento activo de acordo com a reivindicação 8.

12. Utilização de um composto de acordo com o definido na reivindicação 11 para a preparação de uma composição farmacêutica para a modulação do efeito do ligando FAZ-R nas células.

13. Utilização de um composto de acordo com o definido na reivindicação 11(2) para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento das células tumorais, células infectadas com HIV ou outras células doentes.

14. Utilização de uma ou mais proteínas MORT-1 ou fragmentos de acordo com a reivindicação 3 ou 4, capazes de se ligar ao domínio intracelular e modular a actividade do referido FAS-R e os anticorpos ou seus fragmentos activos, de acordo com a reivindicação 8, para a preparação de uma composição farmacêutica para modular o efeito de ligando FAS-R nas células.

15. Utilização de um vector contendo uma sequência que codifica para um ribozima capaz de interactuar com uma sequência de mRNA celular que codifica para uma proteína MORT-1 de acordo com a reivindicação 3 ou 4, para a preparação de uma composição farmacêutica para a modulação do efeito do ligando FAS-R nas células. 5

16. Utilização de uma sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que codifica para uma proteína MORT-1 ou seus fragmentos ou uma proteína MORT-1 ou seus fragmentos de acordo com a reivindicação 3 ou 4, para a preparação de uma composição farmacêutica para a modulação do efeito induzido da MORT-1 nas células. Lisboa, 31 de Outubro de 2007 1/7 FIG

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4G 3 0 .......► Uve;·

FIG. 5 6/7 FOSFATASE ALCALINA VIABILIDADE CELULAR PLACENTÁRIA SECRETADA (OD A 540 nm)

LUCIFERASE P55-IC FAS-IC M0RT1 HUMANO HUMANO FIG. 6A £ G LD o<; Q o

LUCIFERASE

P55-IC FAS-IC M0RT1 HUMANO HUMANO FIG. 6B DE VIABILIDADE 7/7

ANTICORPO ANTI-FAS (CH11), MICROGRAMA / mL FAS -o- FAS+MORT1 dd FAS+MORT1 he FIG. 7