EA007275B1 - Слитые белки taci-иммуноглобулина - Google Patents

Слитые белки taci-иммуноглобулина Download PDF

Info

Publication number
EA007275B1
EA007275B1 EA200301146A EA200301146A EA007275B1 EA 007275 B1 EA007275 B1 EA 007275B1 EA 200301146 A EA200301146 A EA 200301146A EA 200301146 A EA200301146 A EA 200301146A EA 007275 B1 EA007275 B1 EA 007275B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
amino acid
immunoglobulin
fragment
tac1
acid residues
Prior art date
Application number
EA200301146A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200301146A3 (ru
EA200301146A2 (ru
Inventor
Марк У. Риксон
Джейн А. Гросс
Original Assignee
Займодженетикс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Займодженетикс, Инк. filed Critical Займодженетикс, Инк.
Publication of EA200301146A2 publication Critical patent/EA200301146A2/ru
Publication of EA200301146A3 publication Critical patent/EA200301146A3/ru
Publication of EA007275B1 publication Critical patent/EA007275B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

В настоящем изобретении было доказано, что молекулы, которые мешают связыванию рецептора фактора некроза опухоли с его лигандом, например растворимого рецептора, являются полезными как в фундаментальных исследованиях, так и в терапии. Настоящее изобретение предоставляет улучшенные растворимые рецепторы трансмембранного активатора и кальциевого модулятора и взаимодействующие с циклофилиновым лигандом (TACI).

Description

Данное изобретение, в целом, относится к усовершенствованным слитым белкам, содержащим фрагмент рецептора фактора некроза опухоли и фрагмент иммуноглобулина. В частности, данное изобретение относится к усовершенствованным ТАС1-иммуноглобулиновым слитым белкам.
Предпосылки изобретения
Цитокины являются растворимыми небольшими белками, которые опосредуют ряд биологических эффектов, включая регуляцию роста и дифференциации многих типов клеток (см., например, Ага1 е! а1, Аппи. Веу. Вюсйет. 59:783 (1990); Моктапп, Сшт. Θρίη. 1ттипо1. 3:311 (1991); Раи1 апб 8ебег, Се11 76:241 (1994)). Белки, которые составляют группу цитокинов, включают интерлейкины, интерфероны, колониестимулирующие факторы, факторы некроза опухоли и другие регуляторные молекулы. Например, интерлейкин-17 человека является цитокином, который стимулирует экспрессию интерлейкина-6, внутриклеточной адгезионной молекулы 1, интерлейкина-8, колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов и экспрессию простагландина Е2 и играет роль в избирательном созревании гемопоэтических предшественников СЭ34+ в нейтрофилы (Уао.е! а1., 1ттипо1. 755:5483 (1995); Еокк1ех е!.а1, 1. Εχρ. Меб. 183:2593 (1996)).
Рецепторы, которые связывают цитокины, являются типично состоящими из одного или нескольких интегральных мембранных белков, которые связывают цитокины с высокой аффинностью и передают этот результат связывания в клетку через цитоплазматические участки определенных субъединиц рецептора. Рецепторы цитокинов сгруппированы в несколько классов на основе сходств в их внеклеточных лиганд-связывающих доменах. Например, рецепторные цепи, ответственные за связывание и/или трансдукцию действия интерферонов, являются членами рецепторного семейства цитокинов II типа, основанного на характеристике внеклеточного домена из 200 остатков.
Клеточные взаимодействия, которые происходят во время иммунного ответа, регулируются членами нескольких семейств поверхностных клеточных рецепторов, включая рецепторное семейство фактора некроза опухоли (ΤΝΡΚ.). Семейство ΤΝΡΡ состоит из ряда интегральных мембранных гликопротеиновых рецепторов, многие из которых, связываясь с их соответствующими лигандами, регулируют взаимодействия между различными гемопоэтическими клеточными линиями (см., например, Соктап, 8!ет Се11к 12:440 (1994); \Уа)ап1 е! а1., Су!окше Сгоет!й Еас1ог Веу. 70:15 (1999); Уей е! а1., 1ттипо1. Веу. 769:283 (1999); 1бпкк апб Nа^кт^ίй, М1сгокс. Век. Тесй. 50:184 (2000)).
Одним таким рецептором является ТАС1, трансмембранный активатор, и взаимодействующий с САМЬ (уоп Ви1оет апб Вгат, 8с1епсе 228:138 (1997); Вгат апб уоп Ви1оет, патент США N 5969102 (1999)). ТАС1 является мембранно-связанным рецептором, который имеет внеклеточный домен, имеющий в своем составе две обогащенные цистеином псевдоповторности, трансмембранный домен и цитоплазматический домен, который взаимодействует с САМБ (кальциевым модулятором и циклофилиновым лигандом), интегральный мембранный белок, локализованный во внутриклеточных везикулах, который является коиндуктором активации ΝΡ-АТ при сверхэкспрессии в клетках Журката. ТАС1 ассоциированы с В-клетками и субпопуляцией Т-клеток. Нуклеотидные последовательности, которые кодируют ТАС1, и соответствующую ему аминокислотную последовательность, даны здесь как 8ЕС Ш, номера 1 и 2 соответственно.
Рецептор ТАС1 связывает два члена семейства лигандов фактора некроза опухоли (ΊΝΕ). Один лиганд, по-разному определяемый, как ΖΊΝΕΤ, ВАЕЕ, нейтрокин-α, В1у8, ТАЕЬ-1 и ТНАМ< (Уи е! а1., международная публикация № \У098/18921 (1998), Мооге е! а1., 8с1епсе 285:269 (1999); Микйорабйуау е! а1., 1. Вю1. Сйет. 274:15978 (1999); 8сйпе1бег е! а1., 1. Εχρ. Меб. 189:1747 (1999); 8йи е! а1., 1. Ьеикос. Вю1. 65:680 (1999)). Аминокислотную последовательность ΖΊΝΤΓ представляют как 8ЕС Ш N0:3. Другой лиганд назвали как ’^'Т№2, АРВ1Ь и лиганд гибели-1 ΤNВΕ (Найпе е! а1., 1. Εχρ. Меб. 788:1185 (1998); Ке11у е! а1., Сапсег Век. 60:1021 (2000)). Аминокислотную последовательность ΖΊΝΕΤ представляют как 8 ЕС Ш N0:4. Оба лиганда также связываются рецептором созревания В-клеток (ВСМА) (Сгокк е! а1., №11иге 404:995 (2000)). Нуклеотидную и аминокислотную последовательность ВСМА представляют как 8ЕС Ш N0:26 и 8ЕС Ш N0:27 соответственно.
Показанная ш у1уо активность рецепторов фактора некроза опухоли иллюстрирует клинические возможности растворимых форм рецептора. Растворимые формы рецептора ТАС1 были синтезированы в виде иммуноглобулиновых слитых белков. Первоначальные варианты давали в результате слабо экспрессируемый гетерогенный белок. Гетерогенность наблюдали в амино-конце ТАС1, в карбоксильном конце Ес и в стволовой области ТАС1. Следовательно, существует необходимость в фармацевтически пригодных композициях рецептора ТАС1.
Сущность изобретения
Данное изобретение предусматривает усовершенствованные слитые ТАС1-иммуноглобулиновые белки, пригодные в качестве терапевтических композиций.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 демонстрирует аминокислотную последовательность ТАС1 человека. Положения богатых цистеином псевдо-повторностей заштрихованы, трансмембранный домен помещен в рамку и стволовой участок показан мелкими черточками.
- 1 007275
Фиг. 2 представляет собой схематический чертеж иммуноглобулина подкласса 1дС1. Οχ константная область легкой цепи; СН1, СН2, СН3: константные области тяжелой цепи; Уъ: вариабельная область легкой цепи; УН: вариабельная область тяжелой цепи; СНО: углевод; Ν: амино-конец; С: карбоксильный конец.
Фиг. 3А, 3В, 3С и 3Ό показывают сравнение аминокислотной последовательности константной области Ес γ1 дикого типа человека с вариантами Ес-488, Ес4, Ес5, Есб, Ес7 и Ес8. СН1-домен константной области γ1 человека не является частью Ес и поэтому не показан. Показана локализация шарнирного участка, СН2- и СН3-доменов. Отмечены остатки Сук, которые обычно вовлечены в дисульфидные связи константной области легкой цепи (ЬС) и константной области тяжелой цепи (НС). Обозначение «.» показывает идентичность с диким типом в этом положении, тогда как «***» обозначает локализацию карбоксильного конца и иллюстрирует различия в карбоксильном конце Есб относительно других вариантов Ес. Положения аминокислот обозначены по индексной позиции Европейского сообщества.
Фиг. 4 показывает специфическое связывание 1251-2Т№4 с различными конструкциями ТАС1-Ес. Слитые белки ТАС1-Ес содержат фрагменты ТАС1, у которых отсутствуют первые 29 аминокислотных остатков аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0:2. Один из слитых белков содержит фрагмент ТАС1 с интактной стволовой областью (ТАС1(61-29)-Ес5), тогда как три из слитых белков ТАС1-Ес содержат фрагменты ТАС1 с различными делециями в стволовой области ТАС1(61-29,6107-154)-Ес5; ТАС1(61-29,6111-154)-Ес5; ТАС1(6 1-29,6120- 154)-Ес5. Экспериментальные подробности описывают в примере 4.
Подробное описание изобретения
1. Обзор
Как описано ниже, данное изобретение предусматривает слитые белки трансмембранного активатора и кальциевого модулятора, взаимодействующие с циклофилиновым лигандом (ТАС1) с иммуноглобулинами, и способы применения ТАС1-иммуноглобулиновых слитых белков. Например, настоящее изобретение предоставляет способы ингибирования пролиферации опухолевых клеток, предусматривающие введение в опухолевые клетки композиции, которая содержит слитый белок ТАС1-иммуноглубулина. Такая композиция может быть введена в клетки, культивируемые ίη νίίτο. Альтернативно, композиция может быть фармацевтической композицией, которая состоит из фармацевтически приемлемого носителя и слитого белка ТАС1-иммуноглобулина, и фармацевтическая композиция может быть введена субъекту, который имеет опухоль. Субъект может быть млекопитающим субъектом. Введение фармацевтической композиции может ингибировать, например, пролиферацию В-лимфоцитов у млекопитающего субъекта.
Данное изобретение также предоставляет способы ингибирования активности 2Т№4 у млекопитающего, предусматривающие введение млекопитающему композиции, которая содержит ТАС1иммуноглобулин. Активность 2Т№4 может быть ассоциирована с различными болезнями и нарушениями. Например, фармацевтическая композиция, которая содержит слитый белок ТАС1-иммуноглобулина, может быть использована для лечения аутоиммунных болезней, таких как системная красная волчанка, астенический бульбарный паралич, рассеянный склероз, инсулинзависимый сахарный диабет, болезнь Крона, ревматоидный артрит, ювенильный ревматоиднный полиартрит и псориатический артрит. Альтернативно, фармацевтическая композиция, которая содержит ТАС1-иммуноглобулин, может быть использована для лечения расстройства, такого как астма, бронхит, эмфизема и последняя стадия почечной недостаточности. Фармацевтическая композиция, предусматривающая ТАС1-иммуноглобулин, может быть также использована для лечения почечного заболевания, такого как гломерулонефрит, васкулит, нефрит, амилоидоз и пиелонефрит, или расстройства, такого как неоплазма, хроническая лимфоцитарная лейкемия, множественная миелома, неходчкинкская лимфома, пост-трансплантационное лимфопролиферативное нарушение и легкая цепь гаммопатии. В определенных случаях активность 2Т№4 может быть ассоциирована с Т-клетками. Фармацевтическая композиция, которая содержит ТАС1иммуноглобулин, может быть также использована для лечения заболевания или нарушения, связанного с иммуносупрессией, отторжением трансплантата, реакцией «трансплантат против хозяина» и воспаления. Например, фармацевтическая композиция, которая содержит ТАС1-иммуноглобулин, может быть использована для уменьшения воспаления и для лечения нарушений, таких как суставная боль, опухоль, анемия и септический шок.
Данное изобретение также предоставляет способы снижения циркулирующих уровней 2Т№4 в крови у млекопитающих субъектов, предусматривающие введение млекопитающему субъекту фармацевтической композиции, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель и слитый белок ТАС1-иммуноглобулина, причем введение фармацевтической композиции снижает циркулирующий уровень 2Т№4 в крови млекопитающего субъекта. В качестве иллюстрации, введение такой фармацевтической композиции может снизить циркулирующий уровень 2Т№4 в крови, по меньшей мере, на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на от 10 до б0%, по меньшей мере на от 20 до 50% или по меньшей мере на от 30 до 40%, по сравнению с уровнем 2Т№4 в крови перед введением фармацевтиче
- 2 007275 ской композиции. Специалисты в данной области могут измерить циркулирующие уровни ΖΤΝΡ4. Иллюстративные способы описывают в примере 4 и в примере 5.
Как описано ниже, иллюстративные слитые белки ТАС1-иммуноглобулина содержат:
(a) фрагмент рецептора ТАС1, который состоит из фрагмента полипептида, который имеет аминокислотную последовательность аминокислотных остатков с 30 по 154 последовательности 8ЕО ΙΌ N0:2, причем фрагмент рецептора ТАС1 содержит, по меньшей мере, один из (ί) аминокислотных остатков с 34 по 66 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2, и (ίί) аминокислотные остатки с 71 по 104 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2, и причем компонент рецептора ТАС1 связывает, по меньшей мере, один из ΖΤΝΕ2 или ΖΤΝΕ4, и (b) фрагмент иммуноглобулина, содержащий константную область иммуноглобулина.
Подходящие фрагменты рецептора ТАС1 включают полипептиды, которые содержат аминокислотные остатки с 34 по 66 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 и аминокислотные остатки с 71 до 104 8Е0 ΙΌ N0:2; полипептиды, которые содержат аминокислотные остатки с 34 по 104 8Е0 ΙΌ N0:2; полипептиды, которые содержат аминокислотную последовательность аминокислотных остатков с 30 по 110 8Е0 ΙΌ N0:2, и полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков с 30 по 110 8Е0 ΙΌ N0:2.
Иммуноглобулиновый фрагмент слитого белка ТАС1-иммуноглобулина может содержать константную область тяжелой цепи, например, константную область тяжелой цепи человека. Константная область тяжелой цепи !дС 1 представляет один пример пригодной константной области тяжелой цепи. Иллюстративной константной областью тяжелой цепи 1дС1 является Ее-фрагмент 1дС1, который содержит домены СН2 и Снз. Ее-фрагмент 1дС1 может быть Ес-фрагментом дикого типа 1дС1 или видоизмененным Ес-фрагментом 1дС 1, таким как фрагмент Ес, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:33. Одним типичным слитым белком ТАС1-иммуноглобулина является белок, который содержит аминокислотную последовательность, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:54.
Слитые белки ТАС1-иммуноглобулина, описанные здесь, могут быть мультимерами, например, димерами.
Данное изобретение также предоставляет молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют слитый белок ТАС1-иммуноглобулина. Иллюстративная нуклеотидная последовательность, которая кодирует слитый белок ТАС1-иммуноглобулина, представлена последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:53.
Данное изобретение также включает в себя растворимые рецепторы ТАС1, которые состоят из фрагмента полипептида, который имеет аминокислотную последовательность аминокислотных остатков с 30 по 154 8Е0 ΙΌ N0:2, причем растворимый рецептор ТАС1 содержит по меньшей мере один из (ί) аминокислотных остатков с 34 по 66 8Е0 ΙΌ N0:2 и (ίί) аминокислотные остатки с 71 по 104 8Е0 ΙΌ N0:2, и причем растворимый рецептор ТАО связывает по меньшей мере один из ΖΊ^Ζ или ΖΤNЕ4. Дополнительные растворимые рецепторы ТАО описывают здесь в виде подходящих фрагментов рецептора ТАС! для слитых белков ТАСЕиммуноглобулинов. Кроме того, растворимые рецепторы ТАС! могут быть использованы в способах, описанных для слитых белков ТАСЕиммуноглобулинов.
Эти и другие аспекты изобретения станут очевидными из ссылки к следующему детальному описанию и рисункам. Кроме того, различные ссылки представляют ниже.
2. Определения
В последующем описании широко используют ряд терминов. Нижеследующие определения представлены для облегчения понимания изобретения.
Как используется здесь, «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» относится к полинуклеотидам, таким как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК), олигонуклеотидам, фрагментам, синтезированным полимеразной цепной реакцией (ПЦР), и фрагментам, произведенным любым из эндонуклеазных действий и экзонуклеазных действий - лигирования, разрезания. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть составлены из мономеров, которые являются природными нуклеотидами (таких как ДНК и РНК), или аналогов природных нуклеотидов (например, α-энантиомерных форм природных нуклеотидов), или сочетания обоих. Модифицированные нуклеотиды могут иметь перестройки в сахарных остатках и/или в остатках пиримидиновых или пуриновых оснований. Модифицирование сахаров включает, например, замещение одной или нескольких гидроксильных групп галогенами, щелочными группами, аминами и азидными группами, или сахара могут быть функционализированы в виде простых или сложных эфиров. Кроме того, целый сахарный остаток может быть замещен пространственно и электронно сходными структурами, такими как азасахара и карбоциклические аналоги сахаров. Примеры модификаций в основе остатка включают алкилированные пурины и пиримидины, ацилированные пурины или пиримидины, или другие хорошо известные гетероциклические замещения. Мономеры нуклеиновых кислот могут быть связаны фосфодиэфирными связями или аналогами таких связей. Аналоги фосфодиэфирных связей включают фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфоранилитад, фосфороамидат и т.п. Термин молекула нуклеиновой кислоты» также включает так называемые «пептидные нуклеиновые кислоты», которые состоят из природных или модифицированных оснований нуклеиновых кислот, при
- 3 007275 соединенных к полиамидной основе. Нуклеиновые кислоты могут быть или одноцепочечными, или двухцепочечными.
Термин «комплементарная молекула нуклеиновой кислоты» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей комплементарную нуклеотидную последовательность и противоположное направление по сравнению с эталонной нуклеотидной последовательностью. Например, последовательность 5'АТОСАСООО 3'(8ЕО ГО N0:57) является комплиментарной последовательности 5'СССбТОСЛТ 3' (8ЕЕ) ГО N0:58).
Термин «контиг» означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая имеет прилегающий отрезок идентичной или комплементарной последовательности другой молекуле нуклеиновой кислоты. Прилегающие последовательности, говорят, «перекрывают» данный отрезок молекулы нуклеиновой кислотой или полностью, или на частичном протяжении молекулы нуклеиновой кислоты.
Термин «вырожденная нуклеотидная последовательность» означает последовательность нуклеотидов, которая включает один или несколько вырожденных кодонов по сравнению с эталонной молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид. Вырожденные кодоны содержат различные триплеты нуклеотидов, но кодируют тот же аминокислотный остаток (например, триплеты ОЛИ и ОЛС каждый кодирует Акр).
Термин «структурный ген» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется в матричную РНК (мРНК), которая затем транслируется в аминокислотную последовательность, характерную для конкретного полипептида.
«Изолированная молекула нуклеиновой кислоты» представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая не является интегрированной (пер., встроенной) в геномную ДНК организма. Например, молекула ДНК, которая кодирует фактор роста, которая была отделена от геномной ДНК клетки, является изолированной молекулой ДНК. Другим примером изолированной молекулы ДНК является молекула химически синтезированной нуклеиновой кислоты, которая не интегрирована в геном организма. Молекула нуклеиновой кислоты, которая выделена из отдельных видов, является меньшей, чем целая молекула ДНК хромосомы тех же видов.
«Молекулярная конструкция нуклеиновой кислоты» означает молекулу нуклеиновой кислоты, или одно- или двухцепочечной, которая была модифицирована посредством человеческого вмешательства таким образом, что она содержит в себе участки нуклеиновой кислоты, скомбинированные и соединенные в расположении, не существующем в природе.
«Линейная ДНК» означает некольцевые молекулы ДНК, имеющие свободные 5' и 3' концы. Линейная ДНК может быть получена из замкнутых кольцевых молекул ДНК, таких как плазмидные, путем энзиматического переваривания или физического разрыва.
«Комплементарная ДНК (кДНК)» означает одноцепочечную молекулу ДНК, которая образована из матричной мРНК ферментом обратной транскриптазой. Типично, затравка, комплементарная участку мРНК, используется для инициации обратной транскрипции. Специалисты в данной области также используют термин кДНК, который относится к двухцепочечной молекуле ДНК, состоящей из такой одноцепочечной молекулы ДНК и ей комплементарной нити ДНК. Термин «кДНК» также относится к клону молекулы кДНК, синтезированному из РНК-матрицы.
«Промотор» означает нуклеотидную последовательность, которая направляет транскрипцию структурного гена. Типично, промотор локализован на 5' некодирующем участке гена, ближайшем к сайту начала транскрипции структурного гена. Последовательность элементов внутри промоторов, функция которых в инициации транскрипции, часто отличается консенсусными нуклеотидными последовательностями. Такие промоторные элементы включают РНК-полимеразные связывающие сайты, ТАТАпоследовательности, СААТ-последовательности, специфические для дифференциации элементы (ΌδΕκ; МсОеНее е! а1, МоЕЕпйосгшоЕ 7:551 (1993)), элементы ответа на циклический АМФ (СКЕк), сывороточные элементы ответа (8КЕк; Тгс1ктап. 8ет1пагк ίη Сапсег Βίο1. 1:47 (1990)), элементы ответа на глюкокорикоид (ОКЕк), и связывающие сайты других факторов транскрипции, таких как СКЕ/АТЕ (0'КеШу е! а1., 1. Вю1. СНет. 267:19938 (1992)), АР2 (Уе е! а1, 1. Вю1. СНет. 269:25728 (1994)), 8Р1, белок, связывающий цАМФ-элемент ответа (СКЕВ; Ьоекеп, Оепе Ехрг. 3:253 (1993)) и октамерные факторы (см. вообще, \Уа1коп е! а1., ейк., Мо1еси1аг Вю1оду о£ (Не Оепе, 4!Н ей. (ТНе Вефатт/Ситттдк РиЬНкЫпд Сотрапу, 1пс. 1987) и Ьетащге апй Коиккеаи, ВюсНет. 1. 303:1 (1994)). Если промотор является индуцибельным промотором, тогда скорость траскрипции возрастает в ответ на индуцирующий агент. Наоборот, скорость траскрипции не регулируется индуцирующим агентом, если промотор является конститутивным промотором. Репрессируемые промоторы также известны.
«Коровый промотор» содержит нуклеотидные последовательности существенные для функции промотора, включая ТАТА-бокс и последовательность начала транскрипции. Согласно этому определению, коровый промотор может или не может иметь обнаруживаемую активность в отсутствие специфических последовательностей, которые могут усиливать активность или придавать тканеспецифическую активность.
«Регуляторный элемент» означает нуклеотидную последовательность, которая изменяет активность корового промотора. Например, регуляторный элемент может содержать нуклеотидную последователь
- 4 007275 ность, которая связывается с клеточными факторами, разрешающими исключительно транскрипцию, или предпочтительно в отдельных клетках, тканях или органеллах. Такие типы регуляторных элементов обычно ассоциированы с генами, которые экспрессируются в «клеточно-специфичной», «тканеспецифичной» или «органельно-специфичной» манере.
«Энхансер» означает тип регуляторного элемента, который может усиливать эффективность транскрипции, независимо от расстояния или ориентации энхансера относительно сайта начала транскрипции.
«Гетерологичная ДНК» относится к молекуле ДНК или популяции молекул ДНК, которые не существуют естественным образом внутри данной хозяйской клетки. Молекулы ДНК, гетерологичные по отношению к конкретной клетке-хозяину, могут содержать ДНК, полученную из разновидностей клеткихозяина (например, эндогенная ДНК), при условии, что хозяйская ДНК скомбинирована с нехозяйской ДНК (например, экзогенной ДНК). Например, молекула ДНК, содержащая отрезок нехозяйской ДНК, кодирующей полипептид, пришита в результате манипуляций к отрезку хозяйской ДНК, содержащему транскрипционный промотор, и считается, должна быть гетерологичной молекулой ДНК. Наоборот, гетерологичная молекула ДНК может содержать эндогенный ген, связанный в результате манипуляций с экзогенным промотором. В качестве другой иллюстрации молекула ДНК, содержащая ген, полученный из клетки дикого типа, считается, должна быть гетерологичной ДНК, если такую молекулу ДНК внедряют в мутантную клетку, в которой отсутствует ген дикого типа.
«Полипептид» означает полимер аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, созданный или природным путем, или икусственно. Полипептиды меньше, чем около 10 аминокислотных остатков обычно относят к «пептидам».
«Белок» означает макромолекулу, содержащую один или несколько полипептидных цепей. Белок может также содержать непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные заместители могут быть добавлены к белку клеткой, в которой белок синтезируется, и будут изменяться вместе с типом клетки. В этом патенте белки определяют на основе их аминокислотной структуры основной цепи; заместители, такие как углеводные группы, вообще не указывают, но тем не менее, заместители могут присутствовать.
Пептид или полипептид, кодируемый нехозяйской молекулой ДНК, является «гетерологичным» пептидом или полипептидом.
«Интегрированный генетический элемент» означает отрезок ДНК, который внедрили в хромосому хозяйской клетки, после чего этот элемент вводили в клетку посредством манипуляций человека. В рамках настоящего изобретения, интегрированные генетические элементы чаще всего получают из линеаризованных плазмид, которые вводят внутрь клетки электропорацией, или другими способами. Интегрированные генетические элементы передаются из исходной клетки-хозяина ее потомству.
«Клонирующий вектор» означает молекулу нуклеиновой кислоты, например, плазмидной, космидной или бактериофага, которая обладает способностью реплицироваться автономно в хозяйской клетке. Клонирующие векторы типично содержат в себе один сайт, или небольшое число сайтов узнавания рестрикционными эндонуклеазами (пер., рестриктазами), которые делают возможной инсерцию (пер., вставку) молекулы нуклеиновой кислоты в устанавливаемой манере без потери существенной биологической функции вектора, также как и нуклеотидной последовательности, кодирующей маркерный ген, который является подходящим для использования в идентификации и селекции клеток, трансформированных клонирующим вектором. Маркерные гены типично включают в себя гены, которые придают устойчивость к тетрациклину и устойчивость к ампициллину.
«Экспрессионный вектор» означает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей ген, который экспрессируется в хозяйской клетке. Типично, экспрессионный вектор содержит транскрипционный промотор, ген и терминатор транскрипции. Экспрессию гена обычно ставят под контроль промотора и такой ген, указывают, должен быть «операбельно связан с» промотором. Аналогично, регуляторный элемент и коровый промотор являются операбельно связанными, если регуляторный элемент регулирует активность корового промотора.
«Рекомбинантный хозяин» означает клетку, которая содержит в себе гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты, например клонирующий вектор или экспрессионный вектор. В настоящем контексте, примером рекомбинантного хозяина является клетка, которая синтезирует слитый белок ТАС1-Бс из экспрессионного вектора.
«Интегративные трансформанты» означает рекомбинантные хозяйские клетки, в которых гетерологичная ДНК становится интегрированной в геномную ДНК клеток.
«Слитый белок (прим. пер., составной, гибридный, химерный белок)» означает гибридный белок, экспрессированный молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидные последовательности по меньшей мере, двух генов. Например, слитый белок ТАС1-иммуноглобулина содержит фрагмент рецептора ТАС1 и фрагмент иммуноглобулина. Как используют здесь, «фрагмент (прим. пер., компонент) рецептора ТАС1» является участком внеклеточного домена рецептора ТАС1, который связывает, по меньшей мере, один из 2ТИТ 2 или ΖΊΝΕΤ. Фраза «иммуноглобулиновый фрагмент» имеет отношение к полипептиду, который содержит константную область иммуноглобулина. Например, иммуноглобулиновый фрагмент может содержать константную область тяжелой цепи. Термин слитый белок «ТАС1-Бс» отно
- 5 007275 сится к слитому белку ТАС1-иммуноглобулина, в котором иммуноглобулиновый фрагмент содержит константные области иммуноглобулиновой тяжелой цепи, СН2 и СН3.
Термин «рецептор» означает ассоциированный с клеткой белок, который связывается с биологически активной молекулой, называемой «лиганд». Это взаимодействие опосредует эффект лиганда на клетку. В контексте связывание рецептора ТАС1, фраза «специфично связывает» или «специфичное связывание» относится к способности лиганда к конкурентному связыванию с рецептором. Например, ΖΊΝΡ4 специфически связывается с рецептором ТАС1 и это может быть показано путем наблюдения за конкуренцией за рецептор ТАС1 между меченым, для обнаружения, ΖΤΝΕ4 и немеченым ΖΤΝΕ4.
Рецепторы могут быть мембранно-связанными, цитоплазматическими или ядерными; мономерными (например, рецептор тиреотропина, бета-адренергический рецептор), или мультимерными (например, ΡΌΟΡ-рецептор (рецептор фактора роста тромбоцитов), рецептор гормона роста, рецептор 1Ь-3 (рецептор интерлейкина-3), рецептор СМ-С8Р, рецептор С-С8Р, рецептор эритропоэтина и рецептор 1Ь-6). Мембранно-связанные рецепторы характеризуются мультидоменной структурой, содержащей внеклеточный лиганд-связывающий домен и внутриклеточный эффекторный домен, который типично вовлечен в передачу сигнала. У некоторых мембранно-связанных рецепторов внеклеточный лиганд-связывающий домен и внутриклеточный эффекторный домен расположены в изолированных полипептидах, которые составляют полный функциональный рецептор.
Вообще, связывание лиганда с рецептором приводит в результате к конформационному изменению в рецепторе, которое вызывает взаимодействие между эффекторным доменом и другими молекулами (другой молекулой) в клетке, которое, в свою очередь, ведет к изменению клеточного метаболизма. Метаболические события, которые часто связаны с лиганд-рецепторными взаимодействиями, включают: транскрипцию гена, фосфорилирование, дефосфорилирование, увеличение синтеза циклического АМФ, мобилизацию клеточного кальция, мобилизацию мембранных липидов, клеточную адгезию, гидролиз инозитольных липидов и гидролиз фосфолипидов.
Термин «секреторная сигнальная последовательность» означает последовательность ДНК, которая кодирует пептид («секреторный пептид»), который в качестве компонента большего полипептида, направляет больший полипептид по секреторному пути клетки, в которой он синтезируется. Больший полипептид, как правило, расщепляется для удаления секреторного пептида во время прохождения по секреторному пути.
«Изолированный полипептид» означает полипептид, который является существенно свободным от примесных клеточных компонентов, таких как углеводы, липиды или другие белковые примеси, ассоциированные с полипептидом в природе. Типично получение изолированного полипептида включает в себя полипептид в высокоочищенном виде, т.е. по меньшей мере около 80%-ной чистоты, по меньшей мере около 90% чистоты, по меньшей мере около 95% чистоты, больше чем 95% чистоты или больше чем 99% чистоты. Одним из способов показать, что конкретное получение белка содержит изолированный полипептид, является появление одиночной полосы после электрофореза белкового препарата в полиакриламидном геле в додецилсульфате натрия (8Ό8) и окрашивания геля Кумасси бриллиантовым синим (Соошакые ВгППап! В1ие). Однако, термин «изолированный» не исключает присутствия такого же полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры, или альтернативно гликозилированные или производные формы.
Термин «аминоконцевой», «карбоксиконцевой» используют здесь для обозначения положений внутри полипептидов. Где позволяет контекст, эти термины используют со ссылкой на конкретную последовательность или часть полипептида для обозначения пространственной близости или относительного положения. Например, определенная последовательность, расположенная на карбоксильном конце по отношению к исходной последовательности, внутри полипептида является близлежащей к карбоксильному концу эталонной последовательности, но не обязательно находится в карбоксильном конце полного полипептида.
Термин «экспрессия» относится к биосинтезу продукта гена. Например, в случае структурного гена, экспрессия включает в себя транскрипцию структурного гена в мРНК и трансляцию мРНК в один или несколько полипептидов.
Термин «вариант сплайсинга» используют здесь для обозначения альтернативных форм РНК, транскрибированных с гена. Варьирование сплайсинга происходит естественно вследствие использования альтернативных сайтов сплайсинга в транскрибированной молекуле РНК, или реже, между отдельно транскрибированными РНК молекулами и могут давать в результате несколько матричных РНК, транскрибированных из того же гена. Варианты сплайсинга могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин вариант сплайсинга также используют здесь для обозначения полипептида, кодируемого вариантом сплайсинга мРНК, транскрибированной с гена.
Как используют здесь, термин «иммуномодулятор» включает в себя цитокины, факторы роста стволовых клеток, лимфотоксины, костимуляторные молекулы, гематопоэтические факторы и синтетические аналоги этих молекул.
Термин «пара комплемент/антикомплемент» означает неидентичные фрагменты, которые образуют нековалентносвязанную, стабильную пару при соответствующих условиях. Например, авидин и биотин
- 6 007275 (или стрептавидин) являются прототипичными представителями пары комплемент/антикомплемент. Другой пример пары комплемент/антикомплемент включает пары рецептор/лиганд, пары антитело/антиген (или гаптен, или эпитоп), смысловые/антисмысловые полинуклеотидные пары и тому подобное. В тех случаях, когда желательна последующая диссоциация пары комплемент/антикомплемент, пара комплемент/антикомплемент предпочтительно имеет аффинность связывания, меньшую чем 109 М-1.
«Фрагмент антитела» представляет собой фрагмент антитела, например Р(аЬ')2, Р(аЬ)2, РаЬ', РаЬ и тому подобное. Независимо от структуры, фрагмент антитела связывается с тем же самым антигеном, который узнается интактным антителом.
Термин «фрагмент антитела» также включает искусственный или генноинженерный полипептид, который связывается со специфическим антигеном, например полипептидами, состоящими из легкой цепи вариабельного участка, Ρν''-фрагментами, состоящими из вариабельных участков тяжелой и легкой цепей, рекомбинантными одноцепочечными полипептидными молекулами, в которых легкие и тяжелые вариабельные участки связаны пептидным линкером (κοΡν-белками) и минимальными единицами узнавания, состоящими из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельный участок.
«Химерное антитело» означает рекомбинантный белок, который содержит в себе вариабельные домены и участки, определяющие комплементарность, полученные от антитела грызуна, тогда как остаток молекулы антитела получен от антитела человека.
«Гуманизированные антитела» представляют собой рекомбинантные белки, в которых мышиные участки, определяющие комплементарность моноклонального антитела, перенесли из тяжелой и легкой вариабельных цепей мышиного иммуноглобулина в вариабельный домен человека.
Как используют здесь, «терапевтический агент» означает собой молекулу или атом, который конъюгирован с фрагментом антитела для получения конъюгата, который является полезным для терапии. Примеры терапевтических агентов включают лекарственные препараты, токсины, иммуномодуляторы, хелатирующие агенты, соединения бора, фотоактивные агенты или красители и радиоизотопы.
«Детектируемая метка» представляет собой молекулу или атом, которые могут быть конъюгированы с участком антитела для получения молекулы, пригодной для обнаружения. Примеры детектируемых меток включают комплексоны, фотоактивные агенты, радиоизотопы, флуоресцентные агенты, парамагнитные ионы, или другие маркерные агенты.
Термин «аффинная метка» используют здесь для обозначения отрезка полипептида, который может быть прикреплен ко второму полипептиду для обеспечения очистки или обнаружения второго полипептида или предоставления сайтов прикрепления второго полипептида к субстрату. В принципе, любой пептид или белок, для которого антитело, или другой специфический связывающий агент является доступным, может быть использован в качестве аффинной метки. Аффинные метки включают полигистидиновый участок, протеинА (Νίΐκκοη е! а1., ЕМВО I. 4:1075 (1985); Νίΐκκοη е! а1., МеФобк Еихуто1. 198:2 (1991)), глутатион-8-трансферазу (8шйй аиб Ьойикои, Сеие 67:31 (1988)), С1и-С1и-аффинную метку (бтиккешеует е! а1., Ргос. N11. Асаб. δοί. И8А 82:7952 (1985)), Р-вещество, РЬАС-пептид (Норр е! а1., Βίο1ес11по1оду 6:1204 (1998)), стрептавидин-связывающий пептид или другие антигенные эпитопы, или связывающие домены. Вообще, см. Ротб е! а1., Рто1еш Ехртеккюи аиб РитШсайои 2:95 (1991). Молекулы ДНК, кодирующие аффинные метки, являются доступными от коммерческих поставщиков (например, Рйатшас1а Вю1ес11. Р1кса1а^ау, N1).
«Оголенное антитело» означает целое антитело, в противоположность фрагменту антитела, которое не конъюгировано с терапевтическим агентом. Оголенные антитела включают как поликлональные, так и моноклональные антитела, а также определенные рекомбинантные антитела, например, химерные и гуманизированные антитела.
Как используют здесь «антительный компонент» включает в себя как целое антитело, так и антительный фрагмент.
«Иммуноконъюгат» означает конъюгат антительного компонента с терапевтическим агентом или детектируемой меткой.
«Полипептид-мишень» или «пептид-мишень» означает аминокислотную последовательность, которая содержит, по меньшей мере, один эпитоп, и которая экспрессируется в клетке-мишени, такой как опухолевая клетка, или клетка, которая переносит антиген инфекционного агента. Т-клетки узнают пептидные эпитопы, представленные молекулой главного комплекса гистосовместимости на полипептидемишени или пептиде-мишени и типично лизируют клетку-мишень или призывают другие иммунные клетки к местонахождению клетки-мишени, таким образом, убивая клетку-мишень.
«Антигенный пептид» означает пептид, который свяжет молекулу главного комплекса гистосовместимости с образованием МНС-пептидного комплекса, который узнается Т-клеткой, таким образом, индуцируя цитотоксический ответ лимфоцитов при представлении Т-клетке. Таким образом, антигенные пептиды способны связываться с соответствующей молекулой главного комплекса гистосовместимости и индуцировать цитотоксический ответ Т-клеток, например клеточный лизис, или выброс специфического цитокина, против клетки-мишени, которая связывает или экспрессирует антиген. Антигенный пептид может быть связан в контексте с молекулой главного комплекса гистосовместимости I класса или II класса на клетке, представляющей антиген, или на клетке-мишени.
- 7 007275
У эукариот, РНК-полимераза II катализирует транскрипцию структурного гена для получения мРНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть сконструирована таким образом, чтобы содержать матрицу РНК-полимеразы II, в которой РНК-транскрипт имеет последовательность, которая комплементарна последовательности специфической мРНК. РНК-транскрипт называют «антисмысловой РНК» и молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует антисмысловую РНК, называют «антисмысловой ген». Молекулы антисмысловой РНК способны связываться с мРНК, приводя в результате к ингибированию трансляции мРНК.
Вследствие погрешностей стандартных аналитических методов, понятно, что молекулярные массы и длины полимеров являются приблизительными. Если такие значения выражают как «около» X, или «приблизительно» X, то указанная величина X, будет понятным, является с точностью до ±10%.
3. Получение молекул нуклеиновых кислот, кодирующих белки ТАСЕиммуноглобулин
Фиг. 1 предоставляет прогнозируемую аминокислотную последовательность ТАСЛ человека (νοη Ви1о^ апб Вгат, 8с1епсе 278:138 (1997)). Полипептид ТАСЛ содержит в себе следующие прогнозируемые элементы: (а) две богатых цистеином псевдо-повторяющихся структуры, характерные для лиганд связывающих доменов фактора некроза опухоли, (Ь) 62-аминокислотную «стволовую область», которая находится между лиганд-связывающими доменами и трансмембранным доменом, (с) 20тиаминокислотный трансмембранный домен и (б) 127-аминокислотный внутриклеточный домен. Аминокислотная последовательность не содержит прогнозированную гидрофобную аминоконцевую сигнальную последовательность.
Для того, чтобы создать растворимую форму ТАСЛ человека для использования в качестве ингибитора взаимодействия лиганд:нативный рецептор, создали слитый белок: внеклеточный домен ТАСЕЕс иммуноглобулин человека. Доступную последовательность ТАСЛ человека использовали в качестве начальной точки конструирования молекулы слитого белка (νοη Ви1о^ апб Вгат, 8с1епсе 278:138 (1997)). Эта исходная конструкция, обозначенная как «ТАСЕЕсЛ», включающая аминокислотные остатки с 1 по 154 полипептида ТАСЛ, и модифицированный участок Ес человека описана ниже. Точку слияния 154-го остатка выбрали для присоединения как можно большего стволового участка ТАСЛ, при этом, не включая любую возможную часть прогнозированного трансмембранного домена.
Поскольку нативный полипептид ТАСЛ не содержит аминоконцевую сигнальную последовательность, то аминоконцевую сигнальную последовательность присоединяли к ТАСЛ для создания секретируемой формы слитого белка ТАСЕЕс. Сигнальной последовательностью была модифицированная препоследовательность-пропоследовательность активатора плазминогена ткани человека. Модификации были включены для усиления расщепления сигнальной пептидазой и процессинга протеазоспецифичного фурина и, по этой причине, эта последовательность была названа как «оптимизированная лидирующая последовательность 1РА (о!РА)». Последовательность о!РА (8ЕР ГО N0:25) представлена ниже; модифицированные аминокислотные остатки заштрихованы.
Последовательность, кодирующая рекомбинантный слитый белок ТАСЕиммуноглобулина, встроили в экспрессионный вектор, который искусственно вводили в клетки яичника китайского хомячка.
-35 -30
Ме! Азр А1а Ме( Ьуз Агд <31у Ьеи Суз Суз \/а1 Ьеи Ьеи Ьеи Суз сайт разрезания сигнальной пептидазы
-20 | -Ю
С 1у А1а \/а1 Рпе \/а1 8ег Ьеи Зег С1п С1и Не Ηί5 А1а О!и Ьеи фуриновый сайт разрезания
I
Агд Агд Рпе Агд Агд
Трансфецированные клетки яичника китайского хомячка производили белок ТАСЕЕсЛ на низком уровне от около 0,3 пкг/клетку/день. Вестерн-блот анализ белка ТАСЕЕс с козьей антисывороткой против Ес человека выявил две полосы, одна полоса была меньше, чем ожидаемый размер, приблизительно 48 кДа. Анализ аминокислотной последовательности очищенных белков выявил, что меньшая полоса отображала расщепление слитых белков по разным сайтам внутри корового участка ТАСЕ Обращаясь к последовательности 8ЕР ГО N0:2, мажорный конец обнаружили на аминокислотных остатках 118 и 123, хотя белки также расщеплялись по аминокислотным остаткам в положениях 110, 139 и 141.
В дополнение к гетерогенности, вызванной расщеплением в стволовой области, наблюдали также гетерогенность в аминоконце (Ν-конце) и карбоксильном конце (С-конце). Со ссылкой на 8ЕР ГО N0:2, мажорный аминоконец обнаружили в положениях аминокислотных остатков 1, 10 и 13. Различия в карбоксильных концах отражают естественную гетерогенность рекомбинантных иммуноглобулинов и слитых иммуноглобулиновых белков, которые включают неполное удаление лизинового остатка, кодированного с карбоксиконца. Другую причину гетерогенности обнаружили в вариабельной природе углеводной структуры, прикрепленной к кодированному иммуноглобулиновому СН2-домену фрагмента Ес.
- 8 007275
Новые варианты ТЛС1-Ее были синтезированы в ответ на наблюдаемую гетерогенность. Были созданы конструкции, которые включали по меньшей мере одно из следующих изменений во фрагменте ТАС1: (1) части стволовой области ТАС1 удалили, (2) часть стволовой области ТАС1 заменили частью стволовой области ВСМА, (3) остаток аргинина в положении 119 изменили для элиминирования потенциального фуринового сайта расщепления, (4) остаток глутамина в положении 121 изменили для элиминирования (удаления) потенциального фуринового сайта расщепления, (5) остаток аргинина в положении 122 изменили для элиминирования потенциального фуринового сайта расщепления, (6) аминокислотный остаток в положениях 123 и 142 изменили на аминокислотные остатки, обнаруженные в соответствующих положениях ТАС1 мышей, (7) сигнальную последовательность о!РА человека заменили сигнальной последовательностью вариабельного участка тяжелой цепи человека, (8) остаток валина в положении 29 был изменен на метионин, и сигнальная последовательность о!РА была присоединена в аминоконцевом положении к этому остатку и (9) сигнальная последовательность о!РА была присоединена в аминоконцевом положении к остатку аланина в положении 30.
Модификации были также внесены в иммуноглобулиновую часть. Пять классов иммуноглобулинов идентифицировано у высших позвоночных: ЦС. ЦА. 1дМ, Ι§Ό и 1дЕ. Белки 1дС, ЦЭ и 1дЕ являются характерно дисульфидно-связанными гетеротетрамерами, состоящими из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей. Типично 1дМ находится в виде пентамера тетрамера, несмотря на то, что 1дА существует в виде димера тетрамера.
ЦС составляют большой класс, который существует в норме как второй наиболее обильный белок, обнаруженный в плазме. У человека ЦС состоит из четырех подклассов, обозначенных ЦС1. 1дС2, ЦС3 и 1дС4. Как показано на фиг. 2, каждая тяжелая цепь иммуноглобулина имеет константную область, которая состоит из константных участков белковых доменов (Сн1 шарнирного участка, СН2 и СН3), которые являются неизменными для данного подкласса. Константные области тяжелой цепи класса ЦС отождествляют греческой буквой γ. Например, иммуноглобулины подкласса ЦС1 содержат константный участок тяжелой цепи γ1.
Фрагмент Ес, или Ее-домен, состоит из петлевых (глобулярных) участков, СН2 и СН3-доменов тяжелой цепи, связанных дисульфидными мостиками. В иммуноглобулиновых слитых белках, Ес-домены подкласса ЦС1 часто используют в качестве иммуноглобулиновой части, поскольку ЦС 1 имеет самый продолжительный период полураспада сыворотки, чем любой из сывороточных белков. Протяженный период полужизни сыворотки может быть желательной характеристикой белка при изучении животных и при потенциальном терапевтическом использовании для человека. Кроме того, подкласс ЦС1 обладает очень сильной способностью выполнять эффекторные функции, опосредованные антителом. Первичная эффекторная функция, которая может быть наиболее полезной у иммуноглобулинового слитого белка, является способность 1дС1-антител опосредовать связанную с антителом клеточную цитотоксичность. С другой стороны, это может быть нежелательной функцией слитого белка, который функционирует первично как антагонист. Идентифицировали несколько из специфичных аминокислотных остатков, которые являются важными для постоянной активности антител подкласса 1дС1. Включение или исключение таких специфических аминокислот, следовательно, предусматривает включение или выключение специфической пространственно-опосредованной иммуноглобулиновой активности.
Было получено шесть вариантов модифицированных Ес ЦС1 человека для создания слитых белков Ес. Ес-488 сконструировали для удобного клонирования слитого белка, содержащего Ес-участок γ1 человека, и он был сконструирован с использованием, в качестве затравки, константной области иммуноглобулина дикого типа γ1 человека. Беспокойство о потенциально вредных эффектах вследствие непарного цистеинового остатка привело к решению замены цистеина (аминокислотный остаток 24 последовательности 8ЕО ΙΌ N0:6), который обычно связан дисульфидными связями с константной областью легкой цепи иммуноглобулина, на сериновый остаток. Дополнительное изменение было внедрено в кодирующий кодон, в 218 индексной ЕИ-позиции (аминокислотный остаток 22 последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:6) для внедрения сайта узнавания фермента рестрикции Вд/ΙΙ для облегчения последующих манипуляций с ДНК. Эти изменения были внесены в продукт полимеразной цепной реакции (ПЦР), кодированный ПЦР-праймерами. Благодаря локализации сайта Вд/ΙΙ и для того, чтобы достроить шарнирный участок Ес, кодоны 216 и 217 по индексной ЕИ-позиции (аминокислотные остатки 20 и 21 последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:6) внедряли в партнерные последовательности слитого белка.
Ес4, Ес5 и Ес6 содержат в себе мутации для снижения эффекторных функций, опосредованных Ес, снижением связывания ЕсγΚI и связывания комплемента С1 с.|. Ес4 содержит те же самые аминокислотные замещения, что были введены в Ес-488. Дополнительные аминокислотные замещения вводили для снижения потенциальных эффекторных функций, опосредованных Ес. В частности, замещения трех аминокислот вводили для снижения связывания Ес'/РЕ Эти замещения 234, 235 и 237 по индексной ЕИпозиции (аминокислотные остатки 38, 39 и 41 последовательности 8ЕЦ Ш N0:6). Показали, что замещения в этих положениях снижает связывание с ЕсγΚI (Эипсап а! а1., ИаШгс 332:563 (1988)). Такие аминокислотные замещения могут также снижать связывание ЕсγΚIIа, также как и связывание Ес'/ВШ (8опбегтапп е! а1, ИаШгс 406:267 (2000); \Ушс5 е! а1., I. ^типоЕ 764:5313 (2000)).
- 9 007275
Несколько групп описали важность положений 330 и 331 по индексной позиции Европейского сообщества (аминокислотные остатки 134 и 135 в 8Ер ΙΌ N0:6) в связывании комплемента С1ц и последующей фиксации комплемента (Саийе1б аиб Могпзои, ЕЕхр.Меб. 773:1483 (1991); Тао е! а1., ЕЕхр.Меб. 778:661 (1993)). Аминокислотные замещения в этих положениях вводили в Ее4 для снижения связывания комплемента. СН3-домен Ее4 является идентичным таковому, который нашли в соответствующем полипептиде дикого типа, за исключением стоп-кодона, который изменили с ТОЛ на ТАА для элиминирования потенциального сайта метилирования баш, если клонированную ДНК наращивают в бат-плюс штамме Е.ео1т
В Ее5 аргининовый остаток 218 по индексной позиции Европейского сообщества изменяли обратно на лизин, поскольку схему клонирования Вд/ΙΙ не использовали при слиянии белков, содержащих этот конкретный Ее. Остаток последовательности Ее5 соответствует выше описанному для Ее4.
Ее6 является идентичным Ес5 за исключением того, что С-концевой лизиновый кодон элиминировали. С-концевой лизин зрелых иммуноглобулинов часто удаляют из зрелых иммуноглобулинов на посттрансляционной стадии перед секрецией из В-клеток, или удаляют во время циркуляции сыворотки. Следовательно, С-концевой лизиновый остаток типично не обнаруживают в циркулирующих антителах. Как в выше упомянутых Ес4 и Ес5, стоп-кодон в последовательности Ес6 заменили на ТАА.
Ес7 является идентичным Ес γ1 дикого типа за исключением аминокислотного замещения в положении 297 по индексной позиции Европейского сообщества, локализованного в СН2-домене. По индексной позиции Европейского сообщества Ази-297 (аминокислотный остаток 101, 8Ер ΙΌ N0:6) является сайтом присоединения углевода, связанного с Ν-концом. Связанный с Ν-концом углевод вносит потенциальный источник вариабельности в рекомбинантно экспрессированный белок благодаря потенциальному ваьированию между группами в углеводной структуре. В попытке элиминирования этой потенциальной вириабельности изменяли Ази-297 на остаток глутамина для предотвращения присоединения Νконцевого углевода по этому положению остатка. Углевод при 297 остатке также вовлечен в связывание Ес с ЕсγΚIII (8опбегтапи е! а1., №1иге 406:267 (2000)). Однако удаление углевода должно вообще снизить связывание рекомбинантного Ес7, содержащего слитые белки, с ЕсγΚ8. Так же, как и выше, стоп-кодон в последовательности Ес7 изменили на ТАА.
Ес8 является идентичным участку γ1 иммуноглобулина дикого типа, показанного в 8Ер ΙΌ N0:6, за исключением того, что цистеиновый остаток в положении 220 по индексной позиции Европейского сообщества (аминокислотный остаток 24 последовательности 8Ер ΙΌ N0:6) заменили сериновым остатком. Это изменение элиминировало цистеиновый остаток, который обычно связан дисульфидными связями с константным участком легкой цепи иммуноглобулина.
Иллюстративные конструкции ТЛСЕЕс описывают в табл. 1.
Таблица 1. Иллюстративные конструкции слитого белка ТЛСЕЕс
а Информацию о локализации, мутациях и делециях аминокислотных последовательностей представляют в круглых скобках относительно аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2.
ь Включает аминокислотные остатки с 1 по 154 8Е0 ΙΌ N0:2.
с Эта конструкция включает аминокислотные остатки с 1 по 104 8Е0 ΙΌ N0:2 (ТАСЧ) и аминокислотные остатки с 42 по 54 8Е0 ΙΌ N0:27 (ВСМА).
- 10 007275
Белки ТАС1-Рс синтезировали рекомбинантными клетками яичника китайского хомячка, изолировали и анализировали с использованием Вестерн-блот анализа и анализа аминокислотной последовательности. Удивительно, что делеция первых 29-и аминокислот с Ν-конца полипептида ТАС1 дала в результате десятикратное усиление синтеза слитых белков ТАС1-Рс клетками яичника китайского хомячка. Эта делеция также уменьшает расщепление полноразмерной стволовой области. Кроме того, расщепление внутри стволовой области подавлено или укорачиванием стволовой области ТАС1, или замещением стволовой области ТАС1 частью другой аминокислотной последовательностью (например, аминокислотной последовательностью стволовой области ВСМА).
Как описано в примере 4, функциональный анализ конструкций ТАС1-Рс показывает, что слитые белки ТАС1(б1-29)-Рс5, ТАС1(б1-29,б107-154)-Рс5, ТАС1(б1-29,б111-154)-Рс5 и ТАС1(б1-29,6120-154)Рс5 имеют сходные аффиности связывания ΖТNΕ4. Однако конструкции ТАС1(61-29)-Рс5, ТАСД6129,6111-154)-Рс5 и ТАС1(61-29,6120-154)-Рс5, по-видимому, связывают больше ΖТNΕ4 на моль ТАС1-Рс, чем конструкция ТАС1(61-29,6107-154)-Рс5. В зависимости от использования по назначению (т.е. терапевтическое, диагностическое или научное), могут быть использованы слитые белки ТАС1-Рс или с высокой, или с низкой емкостью. Кроме того, комбинация слитых белков ТАС1-Рс с высокой емкостью и с низкой емкостью делает возможным титрование ΖТNΕ2 или ΖТNΕ4.
Настоящее изобретение рассматривает слитые белки ТАС1-иммуноглобулина, которые включают в себя фрагмент рецептора ТАС1, состоящий из аминокислотных остатков с 30 по 106 БЕР ΙΌ N0:2, с 30 по 110 БЕР ΙΌ N0:2, с 30 по 119 БЕР ΙΌ N0:2 или с 30 по 154 БЕР ΙΌ N0:2. Настоящее изобретение также включает в себя слитые белки ТАС1-иммуноглобулина, которые включают в себя фрагмент рецептора ТАС1, состоящий из аминокислотных остатков с 31 по 106 БЕО ΙΌ N0:2, с 31 по 110 БЕО ΙΌ N0:2, с 31 по 119 БЕР ΙΌ N0:2 или с 31 по 154 БЕр ΙΌ N0:2.
В более общем смысле, настоящее изобретение включает слитые белки ТАСРиммуноглобулина, причем фрагмент рецептора ТЛС.Ч состоит из фрагмента аминокислотных остатков с 30 по 154 БЕр ΙΌ N0:2 и причем фрагмент рецептора ТАО связывает, по меньшей мере, один из ΖТNΕ2 или ΖТNΕ4. Такие фрагменты содержат богатую цистеином псевдоповторяющуюся область и произвольно могут включать, по меньшей мере, один из ^концевых отрезков, которому свойственно положение аминоконца в богатой цистеином псевдоповторяющейся области, и стволовой отрезок, которому свойственно положение Сконца в богатой цистеином псевдоповторяющейся области. Подходящие богатые цистеином псевдоповторяющиеся области включают полипептиды, которые: (а) содержат по меньшей мере один из аминокислотных остатков с 34 по 66 БЕр ΙΌ N0:2 и аминокислотные остатки с 71 по 104 БЕр ΙΌ N0:2, (Ь) содержат как аминокислотные остатки с 34 по 66 БЕр ΙΌ N0:2, так и аминокислотные остатки с 71 по
104 БЕр ΙΌ N0:2 или (с) содержат аминокислотные остатки с 34 по 104 БЕр ΙΌ N0:2.
Подходящие ^концевые отрезки включают следующие с обращением к БЕр ΙΌ N0:2: аминокислотный остаток 33, аминокислотные остатки с 32 по 33, аминокислотные остатки с 31 по 33 и аминокислотные остатки с 30 по 33. Подходящие стволовые отрезки включают одну или несколько аминокислот аминокислотных остатков со 105 по 154 БЕр ΙΌ N0:2. Например, стволовой отрезок может состоять из следующих с обращением к БЕр ΙΌ N0:2: аминокислотного остатка 105, аминокислотных остатков со
105 по аминокислотных остатков со 106, аминокислотных остатков со 105 по 107, аминокислотных остатков со 105 по 108, аминокислотных остатков со 105 по 109, аминокислотных остатки со 105 по 110, аминокислотные остатки со 105 по 111, аминокислотных остатков со 105 по 112, аминокислотных остатков со 105 по 113, аминокислотных остатков со 105 по 114, аминокислотных остатков со 105 по 115, аминокислотных остатков со 105 по 116, аминокислотных остатков со 105 по 117, аминокислотных остатков со 105 по 118, аминокислотных остатков со 105 по 119, аминокислотных остатков со 105 по 120, аминокислотных остатков со 105 по 121, аминокислотных остатков со 105 по 122, аминокислотных остатков со 105 по 123, 105 по 124, аминокислотных остатков со 105 по 125, аминокислотных остатков со 105 по 126, аминокислотных остатков со 105 по 127, аминокислотных остатков со 105 по 128, аминокислотных остатков со 105 по 129, аминокислотных остатков со 105 по 130, аминокислотных остатков со 105 по 131, аминокислотных остатков со 105 по 132, аминокислотных остатков со 105 по 133, аминокислотных остатков со 105 по 134, аминокислотных остатков со 105 по 135, аминокислотных остатков со 105 по 136, аминокислотных остатков со 105 по 137, аминокислотных остатков со 105 по 138, аминокислотных остатков со 105 по 139, аминокислотных остатков со 105 по 140, аминокислотных остатков со 105 по 141, аминокислотных остатков со 105 по 142, аминокислотных остатков со 105 по 143, аминокислотных остатков со 105 по 144, аминокислотных остатков со 105 по 145, аминокислотных остатков со 105 по 146, аминокислотных остатков со 105 по 147, аминокислотных остатков со 105 по 148, аминокислотных остатков со 105 по 149, аминокислотных остатков со 105 по 150, аминокислотных остатков со 105 по 151, аминокислотных остатков со 105 по 152, аминокислотных остатков со 105 по 153, аминокислотных остатков со 105 по 154.
Дополнительные подходящие стволовые отрезки включают один или несколько аминокислот стволового отрезка ВСМА (т.е., аминокислотные остатки с 42 по 54 БЕр ΙΌ N0:27). Например, стволовой отрезок может состоять из следующих аминокислотных остатков с обращением к БЕр ΙΌ N0:27: аминокислотного остатка 42, аминокислотных остатков с 42 по 43, аминокислотных остатков с 42 по 44, ами
- 11 007275 нокислотных остатков с 42 по 45, аминокислотных остатков с 42 по 46, аминокислотных остатков с 42 по 47, аминокислотных остатков с 42 по 48, аминокислотных остатков с 42 по 49, аминокислотных остатков с 42 по 50, аминокислотных остатков с 42 по 51, аминокислотных остатков с 42 по 52, аминокислотных остатков с 42 по 53, аминокислотных остатков с 42 по 54.
В более общем смысле, стволовая область может состоять из от двух до 50 аминокислотных остатков.
Иммуноглобулиновый фрагмент слитого белка, описанного здесь, содержит по меньшей мере одну константную область иммуноглобулина. Предпочтительно, иммуноглобулиновый фрагмент представляет отрезок иммуноглобулина человека. Последовательность иммуноглобулина человека может быть аминокислотной последовательностью дикого типа, или модифицированной аминокислотной последовательностью дикого типа, которая имеет по меньшей мере одну из аминокислотных мутаций, обсужденных выше.
Аминокислотная последовательность иммуноглобулина человека может также варьировать от дикого типа, имея одну или несколько мутаций, характерных для известной аллотипической детерминанты. Табл. 2 показывает аллотипические детерминанты константной области Ι§Θγ1 человека (Ри1тап, ТКе Р1азта Рго1етз, Уо1.У, стр. 49-140 (Асадетю Ргезз, 1пс. 1987)). Индексная позиция Европейского сообщества (Еи) 214, 356, 358 и 431 определяет известные аллотипы Ι§Θγ1. Положение 214 находится в домене СН1 константной области Ι§Θγ1 и, следовательно, не находится внутри последовательности Ес. Последовательность Ес дикого типа последовательности 8Е9 ΙΏ N0:6 включает в себя аллотипы О1т(1) и О1т(2-). Однако часть Ес белка ТАС1-Ес может быть модифицирована для отображения всякой комбинации таких аллотипов.
Таблица 2. Аллотипические детерминанты константной области иммуноглобулина γ1 человека
Аллотип
С1т(1)
О!т(2)
С!т(3)
Аминокислотный остаток
Азр, Ьеи
С1и,Ме1
С!у
А!а
Агд
Положение аминокислоты
ΕΙΙ индекс
8ЕО Ю N0:6
160,162
356,358
431
431
214
160,162
235
235 !_уз
214
Примеры белков ТАС1-Ес раскрытых здесь, содержат константные участки Ι§Θ1 человека. Тем не менее, подходящие иммуноглобулиновые фрагменты также включают полипептиды, содержащие по меньшей мере одну константную область, такую как константная область тяжелой цепи любого из следующих иммуноглобулинов: Ι§Θ2, Ι§Θ3, Ι§Θ4, ^ОАЦ ^ОА2, Ι§ϋ, Ι§Ε и Ι§Μ. Преимущественно, иммуноглобулиновые фрагменты, полученные из Ι§Ο2 дикого типа или Ι§Θ4 дикого типа, обеспечивают сниженную эффекторную функцию по сравнению с Ι§Θ1 дикого типа или Ι§Θ3 дикого типа. Настоящее изобретение также рассматривает слитые белки, которые содержат фрагмент рецептора ТАС!, как описано выше, и или альбумин, или в2-макроглобулин.
Другим типом рецепторного слитого белка, который связывает ΖΤNЕ2 или ΖΕΝΕ4, является слитый белок ВСМА-иммуноглобулин. Исследования выполнили со слитым белком ВСМА-Ес4, в котором фрагмент ВСМА состоит из аминокислотных остатков с 1 по 48 последовательности 8ЕО ΙΙ) N0:27. Удивительно, что фармакокинетические исследования на мышах показали, что слитый белок ВСМА-Ес4 имел период полужизни около 101 ч, тогда как белок ТАСЕЕс имел период полужизни 25 ч. Таким образом, введение слитого белка ВСМА-иммуноглобулин может быть предпочтительным в некоторых клинических состояниях. Кроме того, комбинирование слитых белков ТАСЕиммуноглобулина и ВСМАиммуноглобулин может быть полезным для лечения некоторых состояний. Такая комбинационная терапия может быть достигнута введением слитых белков ТАСЕиммуноглобулина и ВСМАиммуноглобулин, или введением гетеродимеров слитых белков ТАСЕиммуноглобулина и ВСМАиммуноглобулин.
Другим типом рецепторного слитого белка, который связывает ΖΤNЕ4, является слитый белок, содержащий внеклеточных домен рецептора, обозначенный как ΖΐηίΓ12. Аминокислотная и нуклеотидная последовательности ΖΐηΕιΤ2 представляют в виде 8ЕО ΙΏ N0:59 и 8ЕО ΙΏ N0:60 соответственно. Пригодные части рецептора ΖΐηΕιΤ2 включают полипептиды, содержащие аминокислотные остатки с 1 по 69 8Е9 ΙΏ N0:60, или аминокислотные остатки с 19 по 35 8ЕО ΙΏ N0:60.
Слитые белки настоящего изобретения могут иметь форму одноцепочечных полипептидов, димеров, тримеров или мультимеров, состоящих из димеров или тримеров. Димеры могут быть гомодимерами или гетеродимерами и тримеры могут быть гомотримерами или гетеротримерами. Примеры гетеродимеров включают полипептид ТАСЕиммуноглобулин с полипептидом ВСМА-иммуноглобулин, поли
- 12 007275 пептид ТАС1-иммуноглобулин с полипептидом Ζίηίτ 12-иммуноглобулин и полипептид ВСМАиммуноглобулин с полипептидом Ζίηίΐ'12-иммуноглобулин. Примеры гетеротримеров включают полипептид ТАС1-иммуноглобулин с двумя полипептидами ВСМА-иммуноглобулин, полипептид ТАС1иммуноглобулин с двумя полипептидами Ζίηί^12-иммуноглобулин, полипептид ВСМА-иммуноглобулин с двумя полипептидами Ζίηί^12-иммуноглобулин, два полипептида ТАС1-иммуноглобулин с полипептидом ВСМА-иммуноглобулин, два полипетида ТАС1-иммуноглобулин с полипептидом Ζίηίτ12иммуноглобулин, два полипептида ВСМА-иммуноглобулин с полипептидом Ζίη£τ12-иммуноглобулин и тример полипептида ТАС1-иммуноглобулин, ВСМА-иммуноглобулин и полипетид Ζίηίτ12иммуноглобулин.
В таких слитых белках фрагмент рецептора ТАС1 может содержать по меньшей мере одну из следующих аминокислотных последовательностей 8ЕО ΙΌ N0:2: аминокислотные остатки с 30 по 154, аминокислотные остатки с 34 по бб, аминокислотные остатки с 71 по 104, аминокислотные остатки с 47 по б2 и аминокислотные остатки с 8б по 100. Фрагмент рецептора ВСМА может содержать по меньшей мере одну из следующих аминокислотных последовательностей 8Е0 ΙΌ N0:27: аминокислотные остатки с 1 по 48, аминокислотные остатки с 8 по 41 и аминокислотные остатки с 21 по 37.
Фрагмент рецептора Ζίη£τ12 может содержать по меньшей мере одну из следующих аминокислотных последовательностей 8Е0 ΙΌ N0:60: аминокислотные остатки с 1 по 69 и аминокислотные остатки с 19 по 35.
Слитые белки могут быть синтезированы с использованием методов ПЦР, использованных для конструирования иллюстративных молекул ТАС1-Ес, которые описаны в примерах. Однако специалисты в данной области могут использовать другие стандартные подходы. Например, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды ТАС1, ВСМА, Ζίηίτ12 или иммуноглобулин, могут быть получены скринингом кДНК или геномной библиотек человека с использованием полинуклеотидных проб, основанных на последовательностях, раскрытых здесь. Эти способы являются стандартными и хорошо известными (см., например, АикиЬе1 с1 а1. (ебк.),8Ьой Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 3гб Εάίίίοη, стр. 4-1 по 4-6 (1оЬи ^11еу & 8опк 1995) (АикиЬе1 (1995)); \Уи еί а1., МеШобк ίη Сене В^есЬио1оду, стр. 33-41 (СКС Ргекк, 1пс. 1997)(№и(1997)); АикиЬе1 (1995) стр. 5-1 по 5-6; №и(1997) стр. 307-327)).
Альтернативно, молекулы для конструирования иммуноглобулиновых слитых белков могут быть получены путем синтезирования молекул нуклеиновых кислот с использованием взаимных длинных олигонуклеотидов в качестве затравки и нуклеотидных последовательностей, описанных здесь (см., например, АикиЬе1 (1995) стр. 8-8 по 8-9). Принятые способы с использованием полимеразной цепной реакции предоставляют возможность синтеза молекул ДНК длиной, по меньшей мере, две тысячи нуклеотидов (Абапд еί а1, Р1ап1 Мо1ес. Вю1. 27:1131 (1993), ВатЬοί еί а1., РСК Мебюбк аиб Аррбсабопк 2:266(1993), ЭШоп еί а1., Ике о£ Не Ро1утегаке Скат Βеасί^οη £ог Не Кар1б Сопкйисбоп о£ 8уиНс(1с Сенек, ίη МеШобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 15:РСК Рго1осо1к: СиггегИ МеШобк аиб АррНсабопк, ^Ьйе(еб.), стр. 263-268, (Нитаиа Ргекк, 1ис. 1993), и Но1охасНнк еί а1., РСК МеШобк Арр1. 4:299(1995)).
Молекулы нуклеиновой кислоты данного изобретения могут также быть синтезированы «генной машиной» с использованием протоколов, таких как фосфоамидит-метод. Если для применения необходима химически синтезированная двухцепочечная ДНК, например, для синтеза гена или фрагмента гена, то каждую комплементарную цепь делают отдельно. Получение коротких генов (от 60 до 80 пар оснований) является технически простым и может быть выполнено синтезом комплементарных цепей и затем их отжига. Однако для получения более длинных генов (>300 пар оснований) могут понадобиться специальные стратегии поскольку эффективность сопряжения каждого цикла во время синтеза ДНК редко сотавляет 100%. Для преодоления этой проблемы искусственные гены (двухцепочечные) собирают в модулярной форме из одноцепочечных фрагментов, которые являются длиной от 20 до 100 нуклеотидов. В качестве обзоров по синтезу полинуклеотидов см., например, СНск аиб Райетак, Мо1еси1аг Вю1ес1то1оду, Ргтар1ек аиб Арр11са11онк о£ КесотЬтагИ ^NА (А8М Ргекк 1994), Накнга еί а1.,Апии.К^.ВюсЬет.53:323(1984), и С11т1е еί а1., Ргос.№111 Асаб. 8ск И8А 87:633 (1990).
4. Получение ТАС1-иммуноглобулиновых полипептидов
Полипептиды данного изобретения могут быть получены в рекомбинантных клетках-хозяевах, следуя общепринятым способам. Для экспрессирования последовательности, кодирующей ТАС1иммуноглобулин, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, должна быть исправно связана с регуляторными последовательностями, которые контролируют транскрипционную экпрессию в экспрессионном векторе и затем введена внутрь клетки-хозяина. В добавление к транскрипционным регуляторным последовательностям, таким как промоторы, энхансеры, экспрессионные векторы могут включать трансляционные регуляторные последовательности и маркерные гены, которые являются пригодными для селекции клеток, которые несут экспрессионный вектор.
Экспрессионные векторы, которые являются подходящими для получения чужеродного белка в эукариотических клетках, типично содержат (1) элементы прокариотической ДНК, кодирующей бактериальную точку начала репликации и маркер устойчивости к антибиотику для обеспечения роста и отбора экспрессионного вектора в бактерии-хозяине; (2) элементы эукариотической ДНК, которые контролиру
- 13 007275 ют инициацию транскрипции, например, промотор; и (3) ДНК-элементы, которые контролируют процессинг транскриптов, таких как транскрипционная последовательность терминации/полиаденилирования.
Экспрессионные векторы могут также включать нуклеотидные последовательности, кодирующие секреторную последовательность, которая направляет гетерологичный полипептид по секреторному пути клетки-хозяина. Например, экспрессионный вектор может содержать нуклеотидную последовательность, которая кодирует ТАС1-иммуноглобулин и секреторную последовательность, полученную от любого секреторного гена. Как обсуждают выше, одной подходящей сигнальной последовательностью является сигнальная последовательность !РА. Пример сигнальной последовательности !РА представляют последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:25. Другой пригодной сигнальной последовательностью является Ун 26-10 сигнальная последовательность мыши. Мышиные антитела 26-10 описывает, например, №аг е! а1, Мо1.1ттипо1. 27:901 (1990). Иллюстративные аминокислотные и нуклеотидные последовательности мышиной 26-10 Ун сигнальной последовательности представляют последовательностями 8Е0 ΙΌ N0:61 и 8Е0 ΙΌ N0:65 соответственно. 8Е0 ΙΌ N0:62 раскрывает аминокислотную последовательность слитого белка ТАС1-Ес5, которая содержит мышиную 26-10 Ун сигнальную последовательность.
Белки ТАС1-иммуноглобулин данного изобретения могут быть экспрессированы в клетках млекопитающих. Примеры пригодных клеток-хозяев млекопитающих включают почечные клетки африканской зеленой обезьяны (Уега; АТСС СКЬ 1587), почечные клетки человеческого эмбриона (293-НЕК; АТСС СКЬ 1573), клетки почек детенышей хомячка (ВНК-21, ВНК-570; АТСС СКЬ 8544, АТСС СКЬ 10314), почечные клетки собаки (МОСК; АТСС ССЬ 34), клетки яичника китайского хомячка (СНО-К1; АТСС ССЬ61; СНО ЭС44(СНак1п е! а1., 8от.Се11.Мо1ес.Оепе!. 12:555, 1986)), клетки гипофиза крысы (ОН1; АТСС ССЬ82), 83-клетки НеЬа (АТСС ССЬ2.2), клетки гепатомы крысы (Н-4-11-Е; АТСС СКЬ 1548) почечные клетки обезьяны, трансформированные 8У40 (С08-1; АТСС СКЬ 1650) мышиные эмбриональные клетки (МН-3Т3; АТСС СКЬ 1658).
Для млекопитающего хозяина регуляторные сигналы транскрипции и трансляции могут быть получены из вирусных источников, таких как аденовирусы, вирусы папилломы быка, вируса обезьяны или подобных, в которых регуляторные сигналы ассоциированы с конкретным геном, который имеет высокий уровень экспрессии. Пригодные транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности также могут быть получены из генов млекопитающих, таких как гены актина, коллагена, миозина и металлотионеина.
Регуляторные последовательности транскрипции включают промоторный участок, достаточный для прямой инициации синтеза РНК. Подходящие эукариотические промоторы включают промотор гена металлотионеина I мыши (Натег е! а1., 1. Мо1ес. Арр1. Оепе!. 1:273 (1982)), ТК-промотор вируса герпеса (МсКшдН!, Се11 31:355 (1982)), ранний промотор 8У40 (ВепоШ е! а1., №1!иге 290:304 (1981)), промотор вируса саркомы Коик (Оогтап е! а1., Ргос. №И. Асай. 8с1. И8А 79:6777 (1982)), промотор цитомегаловируса (Еоесктд е! а1., Оепе 45:101 (1980)) и промотор вируса опухоли молочных желез мыши (см. вообще, Е1сНеуеггу, Ехргеккюп оГ Епдтеегей Рго!етк ш Маттайап Се11 сийиге, в Рго!ет Епдтеегтд: Ргтар1ек апй Ргасйсе, С1е1апй е! а1. (ейк), стр. 163-181 (йойп \Уйеу & 8опк, 1пс. 1996)). Одну полезную комбинацию промотора и энхансера обеспечили посредством миелопролиферативного промотора вируса саркомы и энхансера цитомегаловируса человека.
Альтернативно, прокариотический промотор, такой как РНК-полимеразный промотор бактериофага Т3, может быть использован для контроля синтеза белков ТАС1-иммуноглобулин в клетках млекопитающих, если прокариотический промотор регулируется эукариотическим промотором (2Нои е! а1., Мо11. Се11. Вю1. 70:4529 (1990), и КаиГтап е! а1., №с1. Ас1йк Кек. 79:4485 (1991)).
Экспрессионный вектор может быть введен внутрь клеток хозяина с использованием множества стандартных способов, включающих трансфекцию с фосфатом кальция, трансфекцию с помощью липосом, доставку с помощью микропроекции, электропорацию и т. п. Трансфецированные клетки могут быть отобраны и размножены для получения рекомбинантных клеток хозяина, которые содержат экспрессирующий вектор, устойчиво интегрированный в геном клетки-хозяина. Способы внедрения векторов в эукариотические клетки и методы отбора таких устойчивых трансформантов с использованием селективных маркеров описаны, например, АикиЬе1 (1995) апй Мштау (ей.), Оепе ТгапкГег апй Ехргеккюп Рго!осо1к (Нитапа Ргекк 1991).
Например, одним подходящим селективным маркером является ген, который предоставляет устойчивость к антибиотику неомицину. В этом случае, отбор проводят в присутствии лекарственного препарата неомицинового типа, например, О-418, или ему подобным. Системы отбора могут также быть использованы для усиления уровня экспрессии интересующего гена, процесс, называемый «амплификацией». Амплификацию осуществляют культивированием трансфектантов в присутствии низкого количества селективного агента, и затем увеличения количества селективного агента для отбора клеток, которые производят высокие уровни продуктов внедренных генов. Подходящим амплифицируемым селективным маркером является дигидрофолатредуктаза, которая придает устойчивость к метотрексату. Также могут быть использованы другие гены устойчивости к лекарственным препаратам (например, устойчивости к гигромицину, устойчивости ко многим лекарственным препаратам, к пуромицин-ацетилтрансферазе). Альтернативно маркеры, которые вводят в измененный фенотип, такие как зеленый флуоресцентный
- 14 007275 белок или поверхностные клеточные белки, такие как 0Ό4. 0Ό8. С1ахх Ι МНС, плацентарная щелочная фосфатаза, могут быть использованы для отделения трансфецированных клеток от нетрансфецированных клеток путем так называемой ЕАС8-сортировки, или технологии разделения на намагниченных шариках.
Полипептиды ТАСЧ-иммуноглобулин могут также быть произведены культивированными клетками млекопитающих с использованием вирусной системы доставки. Примеры вирусов для этой цели включают аденовирусы, вирусы герпеса, вакцинные вирусы и адено-ассоциированные вирусы (ААУ). Аденовирус, вирус с двухцепочечной ДНК, является наиболее изученным вектором переноса генов для доставки гетерологичной нуклеиновой кислоты (см. обзор Вескег е! а1., Ме111. Се11 Вю1. 43:161 (1994), и ЭонДах аиб Сшле1, 8с1еисе & Мебкше 4:44 (1997)). Преимущества аденовирусной системы включают размещение относительно крупных вставок ДНК, способность расти до высоких титров, способность инфецирования широкого ряда типов клеток млекопитающих и гибкость, которая позволяет использование с большим числом доступных векторов, содержащих различные промоторы.
Путем делеций частей аденовирусного генома могут быть помещены крупные вставки гетерологичной ДНК (вплоть до 7 т.п.). Такие вставки могут быть внедрены в вирусную ДНК прямым лигированием, или гомологичной рекомбинацией с котрансфецированными плазмидами. Альтернативой является удаление существенного гена Е1 из вирусного вектора, что в результате дает неспособность к репликации, если ген Е1 не предоставлен клеткой-хозяином. 293 клетки человека, инфицированные аденовирусным вектором, (АТСС, NN. СКЬ-1573, 45504, 45505), например, могут быть выращены в виде адгерентных клеток, или в суспензионной культуре при относительно высокой плотности клеток для получения существенного количества белка (см. Сагшег е! а1., Су1о1ес11по1. 75:145(1994)).
Специалисты в данной области могут изобрести пригодные экспрессионные векторы для получения слитых белков, описанных здесь, с клетками млекопитающих. Пример 4 описывает особенности одного из экспрессионных векторов. Другой пример экспрессионного вектора может содержать бицистронную экспрессионную кассету, которая включает часть энхансера цитомегаловируса человека, миелопролиферативный промотор вируса саркомы, нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, полиовирусные внутренние рибосомальные сайты входа, нуклеотидную последовательность, кодирующую дигидрофолатредуктазу мыши, за которой следует дополнительная поли-А поледовательность 8ν40. Нуклеотидная последовательность 8Еф ΙΌ N0:69 показывает конструкцию энхансер цитомегаловируса/миелопролиферативный ЬТК-промотор (содержащий длинные концевые повторы) вируса саркомы, в которой энхансер цитомегаловируса простирается от 1-го нуклеотида до 407. Миелопролиферативный ЬТК-промотор вируса саркомы в отсутствие участка негативного контроля простирается от 408 нуклеотида до 884 нуклеотида 8Еф ΙΌ N0:69. Нуклеотидную последовательность миелопролиферативного ЬТК-промотора вируса саркомы без участка негативного контроля представляют в 8Еф ΙΌ N0:70.
Пример 1 описывает экспрессионный вектор, который содержит промотор цитомегаловируса для прямой экспресси трансгена рекомбинантного белка, иммуноглобулиновый интрон и сигнальную последовательность тканевого активатора плазминогена. Одним подходящим иммуноглобулиновым интроном является интрон νΗ 26-10. 8Еф ΙΌ N0:66 представляет иллюстративную нуклеотидную последовательность интрона νΗ 26-10 мыши. Экспрессионный вектор может также включать 5'-нетранслируемую область (ИТК), локализованную выше нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок ТАСЧиммуноглобулин. Подходящая 5'-ИТК может быть произведена из гена νΗ 26-10 мыши. 8Еф ΙΌ N0:63 раскрывает нуклеотидную последовательность полезной нативной 5'-ИТК νΗ 26-10 мыши, в то время как 8Е0 ΙΌ N0:64 показывает нуклеотидную последовательность 5'-ИТК νΗ 26-10 мыши, которую оптимизировали на 3'-конце.
В качестве иллюстрации, последовательность 8Еф ΙΌ N0:67 предоставляет нуклеотидную последовательность, которая включает следующие элементы: нативную 5'-ИТК νΗ 26-10 мыши (нуклеотиды с 1 по 51), сигнальную последовательность νΗ 26-10 мыши (нуклеотиды с 52 по 97 и со 182 по 192), интрон νΗ 26-10 мыши (нуклеотиды с 98 по 181), нуклеотидную последовательность, которая кодирует часть ТАСЧ (нуклеотиды со 193 по 435) и нуклеотидную последовательность, которая кодирует часть Ес5 (нуклеотиды с 436 по 1131). Нуклеотидная последовательность 8Еф ΙΌ N0:68 отличается от 8Еф ΙΌ N0:67 вследствие замещения 5'-ИТК νΗ 26-10 (нуклеотиды с 1 по 51) нативной последовательности мыши оптимизированной последовательностью.
Белки ТАСЧ-иммуноглобулин могут также быть экспрессированы в других эукариотических клетках высших, таких как клетки птиц, грибов, насекомых, грибов или растений. Бакуловирусная система предоставляет эффективные способы внедрения клонированных генов внутрь клеток насекомых. Подходящие экспрессионные векторы основаны на вирусе ядерного полиэдроза АиЮдгарйа саИГогшса (АсМ№У) и содержат хорошо известные промоторы, такие как промотор белка теплового шока 70 (Нхр) ОгохорНИа, предранний генный промотор (1е-1) вируса ядерного полиэдроза АиЮдгарйа саНГогшса и задержанно ранний промотор 39К, бакуловирусный промотор р10 и металлотионеиновый промотор ЬгохорЫ1а. Второй способ создания рекомбинантных бакуловирусов использует систему, основанную на транспозонах, описанную Ьискоте (Ьискоте, е! а1., 1. Уйо1. 67:4566 (1993)). Эта система, которая использует вектор для переноса, продается в наборе ВАС-1о-ВАС (ЫГе Тесйио1од1е8, КоскуШе, МО). Эта систе
- 15 007275 ма использует сектор для переноса РЕА8ТВАС (Ъ1Ге ТесЕпо1од1ек), содержащий транспозон Тп7 для перемещения ДНК, кодирующей полипептид ТАСВиммуноглобулин, в бакуловирусный геном, поддерживающийся в Е.соб в виде большой плазмиды, называемой Ьаспиб. См. НШ-Регктк апб Роккее, 1. Сеп. У1го1. 71:971 (1990), Вопшпд., е! а1., 1. Сеп. У1го1. 75:1551 (1994), и СЕахепЬа1к апб Варорой, 1. Вю1. СЕет. 270:1543 (1995). Кроме того, векторы для переноса могут включать слияние внутри рамки с ДНК, кодирующей эпитопную метку на С-конце, или на №конце экспрессированного полипептида ТАСВ иммуноглобулин, например, эпитопная метка С1и-С1и (Сгпккептеуег е! а1., Ргос. N<11'1 Асаб. 8сг 82:7952 (1985)). Используя способ, известный в данной области, вектор для переноса, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок ТАСВиммуноглобулин, переносят внутрь Е.соб и отбирают бактериальные плазмиды, которые содержат прерывающийся IасΖ-ген, указывающий на рекомбинантные бакуловирусы. ДНК бактериальных плазмид, содержащую рекомбинантный бакуловирусный геном, затем выделяют, используя общепринятые способы.
Иллюстративный вектор РЕА8ТВАС может быть модифицирован до существенной степени. Например, полиэдриновый промотор может быть удален и замещен бакуловирусным основным белковым промотором (также известным как промотор Рсог, р6.9 или МР-промотор), который является раннеэкспрессируемым при бакуловирусной инфекции, и было показано, что он должен быть полезным для экспрессии секретируемых белков (см., например, НШ-Регкшк апб Роккее, 1. Сеп. Убо1. 77:971 (1990), Воппшд., е! а1., 1. Сеп. У1го1. 75:1551 (1994), и СЕахепЬа1к апб Варорой, 1. Вю1. СЕет. 270:1543 (1995)). В таких конструкциях векторов для переноса может быть использован короткий или длинный вариант основного белкового промотора. Кроме того, векторы для переноса могут быть сконструированы с секреторными сигнальными последовательностями, полученными из белков насекомых. Например, в таких конструкциях может быть использована секреторная сигнальная последовательность экдистероидных глюкозилтрансфераз (ЕСТ), или меллитина медоносных пчел йпубгодеп Согрогабоп, Саг1кЬаб, СА) или бакуловирусного др67 (РЕагМшдеп: 8ап П1едо, Са).
Рекомбинантные вирусы или бактериальные плазмиды используют для трансфекции клетокхозяина. Подходящие клетки-хозяина насекомых включают клеточные линии, полученные из ГРЬВ-8В 21, клеточной линии яичников куколки 8робор!ега Ггищрегба, таких как 8Г9 (АТСС СВЬ 1711), 8Г21АЕ и 8Г21 Ппубгодеп Согрогабоп; 8ап П1едо, Са), также как и клеток 8сЕпе1бег-2 ИгокорЕуба и клеточной линии НЮН ЕIVЕ0 (Ιπνί6Ό^π), полученной из ТйсЕор1ик1а ш (патент США N 5300435). Коммерчески доступная среда, не содержащая сыворотку, может быть использована для наращивания и для поддержания клеток. Подходящими средами являются 8Г900 ΙΙ™ (ЪгГе ТесЕпо1од1ек), или Е8Е 921™ (Ехргеккюп 8ук!етк) для клеток 8Г9; и Ех-се110405™ (ДВН Вюкаепсек, Ьепеха, К8) или Ехргекк Еше0™ (ЫГе ТесЕпо1ощек) для клеток Т.ш. При использовании рекомбинантного вируса клетки типично выращивают от плотности инокулята приблизительно 2-5 х 105 клеток до плотности 1-2 х 106 клеток, во время которой добавляют рекомбинантный вирусный маточный раствор при множественности заражения (Μ0Ι) от 0,1 до 10, более типично около 3.
Установленные способы производства рекомбинантных белков в бакуловирусных системах представлены Вайеу е! а1., Машри1абоп оГ Васи1о\згик Уес!огк, в Ме!Еобк ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1ите7: Сепе ТгапкГег апб Ехргеккюп Рго!осо1к, Миггау (еб), стр. 147-168 (ТЕе Нитапа Ргекк, Шс. 1991), Ра!е1 е! а1., ТЕе Ьаси1о\згик ехргеккюп кук!ет, в ^NА С1ошпд 2:Ехргеккюп 8ук1етк, 2пб Еб1боп, С1о\гег е! а1.(ебк.), стр.205-244 (0хГогб иптеегкбу Ргекк 1995), АикиЬе1 (1995) на стр. с 16-37 по 16-57, ВтеЕагбкоп (еб.), Васи^пик Ехргеккюп Рго!осо1к (ТЕе Нитапа Ргекк, Шс. 1995), и Ьискпоте, Шкес! Се11 Ехргеккюп ТесЕпо1оду, в Рго!еш Епдшеейпд: Рйпс1р1ек апб Ргасбсе, С1е1апб е! а1.(ебк.), стр. 183-218 (боЕп \Убеу & 8опк,1пс.1996).
Клетки грибов, в том числе дрожжевые клетки, также могут быть использованы для экспрессии генов, описанных здесь. Особенно интересные в этом отношении представители дрожжей включают 8ассаготусек се^еν^к^ае, Р1сЕ1а рак!ойк и Р1сЕ1а те!Еапобса. Подходящие промоторы для экспрессии в дрожжах включают промоторы от САВ1 (галактозы), РСК (фосфоглицеринкиназы), АЭН (алкогольдегидрогеназы), АОХ1 (алкогольоксидазы), Ш84 (гистидиндигидрогеназы) и прочие. Созданы многие дрожжевые клонирующие векторы и являются легко доступными. Вектор может быть сконструирован для создания конструкций, использующих необходимые элементы для осуществления гомологичной рекомбинации в дрожжах (см. например, Ваутопб е! а1., ВюТесЕпк|иек 26:134 (1999)). Например, такой экспрессионный вектор может включать последовательности ИВА3 и СЕ№АВ8 (автономно реплицирующуюся последовательность), требуемые для отбора и репликации в 8. сеге\зк1ае. Другие пригодные векторы включают векторы на основе Уф, такие как У!р5, векторы УВр, такие как УВр17, векторы УЕр, такие как УЕр13 и векторы УСр, такие как УСр19. Способы трансформирования клеток 8.сеге\зк1ае экзогенной ДНК и получения рекомбинантных полипептидов из этих клеток раскрыты, например, Катеакак1, патент США N 4599311, Катеакак е! а1., патент США N 4931373, Вгаке, патент США N 4870008, \Уе1с11 е! а1., патент США N 5037743 и Миггау е! а1., патент США N 4845075. Трансформированные клетки отбирают по фенотипу, определяемому селективным маркером, обычно устойчивостью к препарату, или способностью расти в отсутствие специфического питательного вещества (например, лейцина). Пригодной векторной системой для использования в 8ассаготусек сеге\зк1ае является векторная система РОТ1, раскры
- 16 007275 тая Каетакак1 е! а1.(патент США N 4931373), которая позволяет трансформированным клеткам быть отобранными путем роста в глюкозосодержащей среде. Дополнительные подходящие промоторы и терминаторы для использования в дрожжах включают таковые из генов гликолитических ферментов (см. например, Каетакак1, патент США N 4599311, КШдктапп е! а1., патент США N 4615974 и ВШет патент США N 4977092) и генов алкогольдегидрогеназы. См. также патенты США NN 4990446, 5063154, 5139936 и 4661454.
В данной области известны системы трансформации на основе других дрожжей, включая Напкепи1а ρо1уто^ρйа, 8с1ихокасс11аготусек ρотЬе, К1иууеготусек 1асйк, К1иууеготусек ГгадШк, ИкШадо тауб1к, РюЫа ρак!о^^к, РюЫа теШапойса, РюЫа дшйегтопбй и Сапб1ба та1!ока. См. например, С1еккоп е! а1., 1. Сеп. МюгоЬю1. 132:3459 (1986) и Сгедд, патент США N 4882279. Клетки А^е^Шик могут быть использованы в соостветствии со способом МсКЫдй! е! а1., патент США N 4935349. Способы трансформирования Асгетошит сйгукодепит раскрыты 8итто е! а1., патент США N 5162228. Способы трансформирования Nеи^окρо^а раскрыты ЬатЬоетй/, патент США N 4486533.
Например, применение РюЫа те!йапойса в качестве хозяина для получения рекомбинантных белков раскрыто Ваутопб в патенте США N 5716808, Ваутопб, патент США N 5736383, Ваутопб е! а1., Уеак! 74:11-23 (1998) и в международной публикации NN XV0 97/17450, XV0 97/17410, XV0 98/02536, и XV0 98/02565. Молекулы ДНК для использования в трансформированных Р. те!йапойса обычно будут подготовлены в виде двухцепочечных, кольцевых плазмид, которые предпочтительно линеаризируют перед трансформацией. Для наработки полипептидов в Р. те£йапойса промотором и терминатором в плазмиде может быть промотор гена Р. те!йапойса, например, ген утилизации спирта Р. те!йапойса (АиС1 или АиС2). Другие пригодные промоторы включают в себя промоторы генов дигидроксиацетонсинтазы (ИНА8), формиатдегидрогеназы (ЕМО) и каталазы (САТ). Для облегчения интегрирования ДНК внутрь хромосомы хозяина предпочтительно иметь цельный экспрессионный отрезок плазмиды, фланкированный с обоих концов последовательностями хозяйской ДНК. Пригодным селективным маркером для использования в РюЫа теШапойса является ген ΆΌΕ2 Р. теШапойса, который кодирует фосфорибозил-5-аминоимидазолкарбоксилазу (А1ВС; ЕС 4.1.1.21), и который позволяет клеткам хозяина абе2 расти в отсутствие аденина. Для крупномасштабных производственных процессов, где желательно минимизирование использования метанола, могут быть использованы клетки хозяина, в которых удалены оба гена, утилизирующих метанол (АИС1 и АИС2). Для наработки секретируемых белков в клетках хозяина могут отсутствовать гены вакуолярных протеаз (РЕР4 и РВВ1). Используют элктропорацию для способствования внедрения плазмиды, содержащей ДНК, кодирующей полипептид интереса, внутрь клеток Р. те!йапойса. Клетки Р. теШапойса могут быть трансформированы электропорацией с использованием экспоненциально затухающего, пульсирующего электрического поля, имеющего мощность от 2,5 до 4,5 кВ/см и фиксированное время (!) от 1 до 40 мс, более предпочтительно около 20 мс.
Экспрессионные векторы могут также быть внедрены внутрь протопластов растений, интактных растительных тканей или внутрь изолированных растительных клеток. Способы внедрения экспрессионных векторов внутрь растительной ткани включают прямое инфицирование или совместное культивирование растительной ткани с АдтоЬас!етшт ЫтеГааепк, микропроэкционную доставку, инъекцию ДНК, электропорацию и прочие. См., например, Ногксй е! а1., 8с1епсе 227:1229 (1985), К1ет е! а1., Вю!есйпо1оду 70:268 (1992) и М1к1 е! а1., Ргосебигек Гог 1пйобистд Еоге1дп ^NА т!о Р1ап!к в Ме!йобк т Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду апб Вю!есйпо1оду, Сйск е! а1., (ебк.), стр. 67-88 (СВС Ргекк, 1993).
Альтернативно, белки ТАС1-иммуноглобулин могут быть произведены в прокариотических клетках хозяина. Подходящими промоторами, которые могут быть использованы для получения полипептидов ТАС1-иммуноглобулин в прокариотическом хозяине, являются промоторы, хорошо известные в данной области и включают промоторы, допускающие узнавание полимеразами Т4, Т3 8ρ6 и Т7, промоторы бактериофага ламбда РВ и Ръ, промоторы Ε.^1ί !τρ, гесА, теплового шока, 1асИУ5, !ас, Iρρ-Iас8ρ^, ρйоА и IасΖ, промоторы В.кийййк, промоторы бактериофагов ВасШик, промоторы 8ΐ^еρ!отусек, промотор т! бактериофага ламбда, промотор Ыа ρВВ322 и промотор САТ гена хлорамфеникол-ацетилтрансферазы. Прокариотические промоторы рассмотрены Сйск, 1. 1пб. МютоЬю1. 1:277 (1987), ^а!коп е! а1., Мо1еси1аг Вю1оду оГ !йе Сепе, 4!й Ε6. (Вещают Ситттк 1987) и АикиЬе1 е! а1., (1995).
Пригодные прокариотические организмы-хозяева включают Ε.^1ί и ВасШик киЬШик. Пригодные штаммы Ε.^1ί включают В^21(^Ε3), В^21(^Ε3)ρ^ук8, В^21(^Ε3)ρ^укΕ, ИН1, 1)1141, ИН5, ПН51, ИН51Е, ИН51МСВ, ИН10В, №^^3, ПН118, С600, НВ101, 1М101, 1М105, 1М109, 1М110, К38, ВВ1, Υ1088, Υ1089, С8Н18, ΕΒ1451 и ΕΒ1647 (см. например, Втоетп (еб.) Мо1еси1аг Вю1оду БаЬГах (Асабетю Ргекк 1991)). Пригодные штаммы ВасШик киЬШик включают ВВ151, ΥВ886, М1119, М1120 и В170 (см., например, Нагбу, ВасШик С1ошпд Ме!йобк, Ш ^NА С1ошпд: А Ртасйса1 Аρρ^оасй, С1оует (еб.) (1ВЬ Ргекк 1985)).
При экспрессии белка ТАС1-иммуноглобулин в бактерии, например, в Ε.^1ί, полипептид может быть аккумулирован в цитоплазме, типично в виде нерастворимых гранул, или может быть направлен в периплазматическое пространство бактериальной секретирующей последовательностью. В ранее рассмотренном случае клетки лизируют, а гранулы выделяют и денатурируют с помощью, например, гуанидинизотиоцианата или мочевины. Денатурированный полипептид может затем быть повторно свернут и
- 17 007275 димеризован растворением в денатурирующем агенте, например, диализом против раствора мочевины и сочетанием восстанавленного и окисленного глутатиона, с последущим диализом против буферносолевого раствора. В последнем случае, полипептид может быть выделен из периплазматического пространства в растворимой и функциональной форме путем разрушения клеток (например, ультразвуком или осмотическим шоком) для высвобождения содержимого периплазматического пространства и выделения белка, таким образом, избегая необходимость денатурирования и повторного сворачивания.
Способы экспрессии белков в прокариотических «организмах» хозяина являются хорошо известными специалистам в данной области (см., например, ^1Шашк с1 а1., Ехртеккюп о£ Гогещп рго1ешк ίη Е.соб икшд р1акт1б уесЮгк апб рштГюабоп оГ кресТю ро1ус1опа1 апбЬоб1ек , в ΌΝΆ С1ошпд 2: Ехртеккюп 8ук1етк, 2пб Еб1боп, С1оует е1 а1., (ебк), стр. 15 (ОхЕотб Ищуегкйу Ргекк 1995), \Уагб е1 а1., Сепебс Машри1абоп апб Ехртеккюп оГ АпбЬоб1ек в Мопос1опа1 АпбЬоб1ек: Рппс1р1ек апб Аррбсабопк, стр. 137 (\Убеу-Ыкк, 1пс. 1995), апб Сеотдюи, Ехртеккюп оГ Рто1етк т Вас1епа в Рго1еш Епдтееппд: Рппс1р1ек апб Ргасбсе, С1е1апб е1 а1., (ебк.), стр. 101 (1обп \Убеу & 8опк, 1пс. 1996)).
Стандартные способы внедрения экспрессионных векторов в клетки бактерий, дрожжей, насекомых и растений представлены, например, АикиЬе1 (1995).
Общие способы экспрессии и получения чужеродного белка, произведенного клеточной системой млекопитающих, представлены, например, Е1сйеуепу, Ехртеккюп оГ Епдшеетеб Рто1етк т Матшабап Се11 СиНиге в Рто1ет Епщпеегбщ: Рппс1р1ек апб Ргасбсе, С1е1апб е1 а1., (ебк.), стр. 163 (\УПеу-Ыкк, 1пс. 1996). Стандартные способы выделения белка, произведенного бактериальной системой, предоставлены, например, Спккйаттет е1 а1., Рипбсабоп оГ оуег-ргобисеб рто1етк Ггот Е.соб се11к, т ΩΝΛ С1ошпд2: Ехртеккюп 8ук1етк, 2пб Еббюп, С1оуег е1 а1., (ебк.) стр. 59-92 (ОхГогб Ищуегкйу Ргекк 1995). Принятые способы выделения рекомбинантных белков из бакуловирусной системы описаны Ктсйатбкоп (еб.) Васи1оу1тик Ехртеккюп Рго1осо1к (Тбе Нитапа Ргекк, 1пс. 1995).
В качестве альтернативы, полипептиды настоящего изобретения могут быть синтезированы первоклассным твердофазным синтезом, частичными твердофазными методами, конденсацией фрагментов или традиционным жидкофазным синтезом. Эти методы синтеза хорошо известны в данной области (см. например, Мегпйе1б, 1. Ат. Сйет. 8ос. 85:2149 (1963), 81е\\ш1 е1 а1., 8обб Рйаке Рерббе 8уп1бек1к, (2пб Еб1боп), Р1егсе Сйет1са1 Со. 1984), Вауег апб Карр, Сйет. Рер1. Рго1. 3:3 (1986), А1бейоп е1 а1., 8обб Рйаке Рерббе 8уп1бек1к: А Ртасбса1 Арртоасй (1КИ Ргекк 1989), Е1е1бк апб Со1о\\'1ск, 8оКб-Р11аке Рерббе 8уп1бе8Ϊ8, Мебюбк ш Епхуто1оду Уо1ите 289 (Асабетк Ргекк 1997), и иоуб-ХУПКатк е1 а1., Сйетка1 Арргоасйек 1о 1бе 8уп1бек1к оГ Рерббек апб Рто1ешк (СКС Ргекк, 1пс. 1977)). Изменения в стратегиях общего химического синтеза, например, «нативное химическое лигирование» и «лигирование экспрессированных белков», также являются стандартными (см. например, Эа\\'коп е1 а1., 8аепсе 266:776 (1994), Наскепд е1 а1., Ргос. №1'1 Асаб. 8ск И8А 94:7845 (1997), Эахукоп, Мебюбк Епхушок 287:34 (1997), Мшг е1 а1., Ргос. N311 Асаб. δα. И8А 95:6705 (1998) и 8еуеппоу апб Мшг, 1. Вю1. Сйет. 273:16205 (1998)).
5. Анализ слитых белков ТАС1-иммуноглобулинов
Функция слитых белков ТАС1-иммуноглобулинов может быть оценена с использованием разнообразных подходов для оценки способности слитых белков связывать ΖΤΝΕ4 или ΖΤΝΕ2. В качестве иллюстрации пример 4 предоставляет способы измерения аффинности связывания и емкости связывания для ΖΤΝΕ4.
Альтернативно, слитые белки ТАС1-иммуноглобулина могут быть охарактеризованы по способности ингибировать стимуляцию В-клеток человека растворимым ΖΤNΕ4, как описано Сгокк е1 а1., 1п1егпабопа1 РиЬбсабоп №. \УО00/40716. Кратко, В-клетки человека выделяют из периферических мононуклеарных клеток крови с использованием намагниченных шариков СЭ19 и магнитной системы для разделения УапоМаск (М111епу1 Вю1ес АиЬигп, СА) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Очищенные В-клетки смешивают с растворимым ΖΤNΕ4 (25 нг/мл) и рекомбинантным 1Ь-4 человека (10 нг/мл, Рбатттдеп) и клетки вносят в лунки 96-луночныых круглодонных планшетов при 1х105 клеток на лунку.
Растворимые белки ТАС1-иммуноглобулин могут быть растворены от около 5 мкг/мл до около 6 нг/мл и инкубированы с В-клетками в течение пяти дней, с подачей импульсов 1 мкКи меченого Н3тимидина на лунку в течение ночи в четвертый день. В качестве контроля белок ТАС1-иммуноглобулин может также быть инкубирован с В-клетками и 1Ь-4 без ΖΤNΕ4. Для наращивания планшеты помещали в прибор для наращивания Раскагб и просчитывали с использованием счетчика Раскагб.
Для оценки трех слитых белков ТАС1-Ес использовали общий подход. Хотя все слитые белки ингибировали пролиферацию В-клеток, конструкции ТАС1(б1-29,б111-154)-Ес5 и ТАС1(б1-29,б120-154)-Ес5 были более эффективными, чем ТАС1(б1-29,б107-154)-Ес5.
Твердо установившиеся экспериментальные модели на животных возможны для тестирования эффективности белков ТАС1-иммуноглобулин ш у1уо при определенных болезненных состояниях. Например, белки ТАС1-иммуноглобулин могут быть проанализированы в ряде экспериментальных моделей аутоиммунных заболеваний на животных, такими как родственные линии мышей МКЕ-1рг/1рг или Е1 близкородственных линий мышей NΖВxNΖ\V, которые служат в качестве модели 8ЬЕ (системной крас
- 18 007275 ной волчанки). Такие экспериментальные модели на животных известны в данной области (см, например, Сойеп апб МШег (еб§.), Аи!о1ттипе Океане Мобек: А ОшбеЬоок (Асабетк Рге55. Шс. 1994).
Потомство от скрещивания между мышами новозелландской черной №\ν 2еа1апб В1аск (ΝΖΕ) и новозелландской белой №\ν Ζеа1аηб +ййе (ΝΖ+) обнаруживает спонтанную форму 8ЬЕ, которая имеет близкое сходство с 8ЬЕ человека. Потомство мышей, известное как ΝΖΕ+, в возрасте одного месяца начинает нарабатывать антитела !дМ против Т-клеток и в возрасте от пяти до семи месяцев аутоантитела против ДНК являются доминирующим иммуноглобулином. Вклад этих аутоантител, особенно тех, которые направлены против одноцепочечной ДНК, связан с развитием гломерулонефрита, который клинически проявляется как протеинурия, азотемия и смерть от почечной недостаточности.
Почечная недостаточность является главной причиной смертности у мышей, пораженных спонтанной 8ЬЕ, а у линии ΝΖΕ+ этот процесс является хроническим и уничтожительным. Заболевание является более быстрым и тяжелым у женских особей, чем у мужских, со средней жизнеспособностью в течение только 245 дней по сравнению с 406 днями для мужских особей. Несмотря на то, что многие из мышей женских особей в пяти-семи месячном возрасте будут с клинически выраженной протоуренией, некоторые особи могут быть гораздо моложе, или старше при проявлении у них симптомов. Смертельный иммунный нефрит, наблюдемый у мышей ΝΖΕ+, является очень похожим на наблюдаемый гломерулонефрит 8ЬЕ у человека, что делает эту спонтанную экспериментальную модель на мышах очень привлекательной для исследования лечений потенциальной 8ЬЕ (Рийегтап апб №рагйек, Миппе Мобек оГ 8роп!апеои§ 8уйетк Ьириз ЕгуШетаккик, ш Ли!о1ттипе Океане Мобек: А ОшбеЬоок, стр. 217-234 (Асабетк Рге§8, Шс., 1994); Мойап е! а1., 1. Iттиηο1. 154:1470 (1995); и Ошкй е! а1., 1. Тттипок 759:3104 (1997)).
Как описано Сго§8 е! а1., международная публикация № +000/40716, белки ТАСЬиммуноглобулин могут быть введены мышам NΖВ+ для выявления их подавляющего эффекта на В-клетки в течение пятинедельного периода в среднем, как полагают, что наработка антител к В-клеткам у мышей NΖВ+ достигает высокого уровня. Кратко, 100 женских особей мышей 8-недельного возраста Ρι (NΖВ х ΝΖ+) могут быть разделены на шесть групп по 15 особей в каждой. Перед введением, мышей поверяют один раз в месяц на белок в моче и отбирают кровь для СВС и заготовки сыворотки. Сыворотка может быть проанализирована на наличие аутоантител. Поскольку протеинурия является выраженным признаком гломерулонефрита, то уровень белка в моче измеряют показателем уровня с регулярными интервалами в течение периода исследования. Введение можно начинать, когда мыши будут приблизительно в пятимесячном возрасте. Мыши получают внутрибрюшинные инъекции только носителя (фосфатно-солевого буферного раствора), или ТАСЬиммуноглобулина человека (контрольный белок), или ТАС.Чиммуноглобулина (например, от 20 до 100 мкг испытуемого белка на дозу) три раза в неделю в течение пяти недель.
В течение лечения кровь собирают дважды и соберут, по меньшей мере, дважды после лечения. Значения показателей уровней в моче для протеинурии и значения масс тела определяют каждые две недели после начала лечения. Значения показаний для крови, мочи и массы тела собирали во время эвтаназии. Селезенку и тимус отделяли для анализа сортировки клеток, обработанных флуроесцентным агентом, и для гистологии. Субмандибулярные слюнные железы, цепь брыжеечных лимфатических узлов, печеночную долю с желчным пузырем, слепую кишку и толстую кишку, желудок, тонкий кишечник, поджелудочную железу, правую почку, надпочечник, язык с трахеей и пищеводом, сердце и легкие также собирали для гистологии.
Модели на мышах использовали для экспериментов по аллергическому энцефаломиелиту в качестве инструмента для исследования как механизмов заболеваний, связанных с иммунитетом, так и способов потенциального терапевтического вмешательства. Модель имеет сходство с рассеянным склерозом человека и приводит к демиелинизации как результату активации Т-клеток на нейробелки, такие как основной белок миелина или протеолипидный белок. Инокуляция антигеном приводит к индуцированию СИ4+, Т-клеток II класса (Тй1), заключенных в МНС. Изменения в процедуре экспериментального аллергического энцефаломиелита могут породить острые, хронически-рецидивные или пассивноперенесенные варианты модели (+етЬегд е! а1., 1. Iттиηο1. 762:1818(1999); МуаЬа е! а1., Се11. Тттипо1. 186:94 (1999); и 61аЬш8к1, Ме!й. Еп/лт. 288:182 (1997)).
Сго§8 е! а1., международная публикация №. +0 00/40716, описывает один подход к оценке эффективности белков ТАСкиммуноглобулин в улучшении симптомов, связанных с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом. Кратко, 25 женских особей мышей Е1 РЬх8]Ь (12-ти недельного возраста) подвергали подкожному инъецированию антигеном 125 мкг/мышь (антигеном является миелиновый протеолипидный белок, РЬР, остатки 139-151), приготовленным в полном адъюванте Фрейнда. Мышей делят на пять групп по пять мышей в каждой. Внутрибрюшинные инъекции токсина коклюша (400 нг) производили в 0 день и во второй. Группам давали 1, 10 или 100-кратную дозу белка ТАСТиммуноглобулин, одна группа получает только растворитель и одна группа не получает лечение. Профилактическая терапия начинается в 0 день, лечебное вмешательство начинается на 7 день или при появлении клинических признаков. Признаки заболевания, потеря веса и паралич, обнаруживаются приблизительно на 10-14 день и сохраняются в течение приблизительно одной недели. Животных оценивают еже
- 19 007275 дневно, посредством сбора массы тела и определения клинической оценки соответствия распространения их симптомов. Клинические признаки экспериментального аллергического энцефаломиелита появляются в течение 10-14 дней инокуляции и сохраняются приблизительно в течение одной недели. В конце исследования всех подвергают эвтаназии путем избыточной дозировки газа и вскрывают. Мозг и позвоночник собирают для гистологии или замораживают для анализа мРНК. Результаты массы тела и клинической оценки вносят на каждую особь или на группу.
В экспериментальной модели на животных по изучению индуцированного коллагеном артрита, у мышей развивался хронический воспалительный артрит, который имеет близкое сходство с ревматоидным артритом человека. Поскольку индуцированный коллагеном артрит обнаруживает сходные с ревматоидным артритом иммунологические и патологические признаки, то это делает его идеальной моделью для скрининга потенциальных противовоспалительных компонентов у человека. Другим преимуществом использования модели по изучению индуцированного коллагеном артрита является то, что механизмы его патогенеза известны. Идентифицированы Т- и В-клеточные эпитопы на коллаген II типа и определены различные иммунологические (замедленная гиперчувствительность и антитела против коллагена) и противовоспалительные (цитокины, хемокины, ферменты, разрушающие матрикс) параметры, относящиеся к иммуно-опосредованным артритам, и могут быть использованы для оценки эффективности тестируемых компонентов в моделях (^оо1еу, Сигг. Ορίη. ИНеит. 3:407 (1999); ^1Шатк е! а1., ^тииок 89:9784 (1992); Муегк е! а1., Б1ке 8οΐ. 67:1861 (1997); и №аи§ е! а1., Iттиηο1. 92:8955 (1995)).
Сгокк е! а1., международная публикация №. ^000/40716, описывает способ оценки эффективности белков ТАСБиммуноглобулин в улучшении симптомов, ассоциированных с артритом, индуцированным коллагеном. Кратко, восьминедельных мужских особей мышей ЭВА/Н (Ьасккои БаЬк) делят на группы по пять мышей в группе и производят две подкожные инъекции коллагена от 50 до 100 мкл в концентрации 1 мг/мл (коллаген цыпленка или бычий) с интервалами в три недели. Одна контрольная (группа) не получает инъекции коллагена. Первый инъекционный раствор приготовлен в полном адъюванте Фрейнда, а второй инъекционный раствор приготовлен в неполном адъюванте Фрейнда. Белок ТАСБ иммуноглобулин вводят с профилактической целью во время или перед вторым инъецированием, или после того, как животное обнаружит два или больше клинических показателей, которые сохраняются по меньшей мере 24 ч. Животные начинают демонстрировать симптомы артрита после второй инъекции коллагена, обычно в течение от двух до трех недель. Например, ТАСЬБс, контрольный белок, [дБс или фосфатно-буферный раствор (растворитель) могут быть введены с профилактической целью, начиная с семи дней до начала второго инъецирования (день -7). Белки могут быть введены в (количестве) 100 мкг, даваемые три раза в неделю в виде 200 микролитровой внутрибрюшинной инъекции и продолжающейся в течение четырех недель.
В экспериментальной модели на животных по изучению индуцированного коллагеном артрита степень заболевания оценивают в каждой лапке с использованием циркуля для определения толщины лапки и задания клинической оценки каждой лапке. Например, клиническая отметка «0» означает нормальная мышь, отметка «1» означает, что один или больше пальцев являются воспаленными, отметка «2» означает слабое воспаление лапок, оценка «3» означает среднее воспаление лапок и оценка «4» означает тяжелое воспаление лапок. Животных подвергают эвтаназии после того, как устанавливают заболевание в течение установленного периода времени, обычно семи дней. Лапки собирают для гистологического анализа, или для анализа мРНК, а сыворотку собирают для анализа иммуноглобулинов и цитокинов.
Миастения гравис является другим аутоиммунным заболеванием, для которого экспериментальные модели на мышах являются пригодными. Миастения гравис является нарушением нервно-мышечной проводимости, затрагивающем выработку аутоантител, направленных против никотинового ацетилхолинового рецептора. Это заболевание является приобретенным или наследственным с клиническими признаками, включающими огромную слабость и утомляемость при напряжении.
Установлена экспериментальная модель на мышах миастении гравис. (С11пк!абокк е! а1., Ек1аЬНкБтеи! ок а Мойке Мобе1 ок МуакШеша βπινίκ ^Ыск М1тюк Нитаи МуакШеша βπινί6 РаШодеиекЕ ког Пптиие Ще^е^ои, т [ттипоЬЫоду ок Рго!етк аиб РерБбек VIII, А!акк1 аиб В1х1ег (Ебк.), стр. 195-199 (1995)). Экспериментальная аутоиммунная миастениа гравис является заболеванием опосредованным антителами, охарактеризованным наличием антител к ацетилхолиновому рецептору. Эти антитела разрушают рецептор, приводя к повреждению нейромускульных электрических импульсов, выражающееся в мышечной слабости. В экспериметальной модели для миастении гравис мышей иммунизировали никотиновым ацетилхолиновым рецептором. Клинические признаки миастении гравис становятся очевидными через неделю после второй иммунизации. Экспериментальную миастениа гравис оценивают нескольким способами, включая измерение уровней сыворотки антител к рецептору ацетилхолина, радиоиммунологический анализ (С11пк!абокк аиб ПаирШиее, Б Iттиηο1. 136:2437 (1986); БтбкЛот е! а1., Ме!1юбк Еи/уток 74:432 (1981)), измерение мышечного рецептора ацетилхолина, или электромиографию (Со11даи е! а1., (Ебк.), Рго!осо1к ш Iттиηο1οду. №1.3, стр 15.8.1 №1т №Пеу & 8оик, 1997)).
Эффект ТАСБиммуноглобулин на экспериментальную миастениа гравис может быть установлен введением слитых белков во время проводящейся клинической миастениа гравис на мышах В6. Например, 100 особей мышей В6 иммунизируют 20-ю микрограммами (20 мкг) ацетилхолинового рецептора в
- 20 007275 полном адъюванте Фрейнда в дни 0 и 30-й. Приблизительно от 40 до 60% мышей проявят от умеренной (степень 2) до тяжелой (3-я степень) клинической миастении гравис после повышения уровня рецептора ацетилхолина. Мышей с клиническим заболеванием 2-й и 3-й степени делят на 3 группы (с одинаковыми степенями заболевания) и взвешивают (мыши вместе со слабостью также теряют в весе, так они испытывают затруднение в потреблении пищи и воды) и отбирают кровь для сыворотки (для предварительной очистки антител против рецептора ацетилхолина и уроня изотипов). Группу А инъецируют Ι.Ρ в фосфатно-солевом буферном растворе, группу В инъецируют внутрибрюшинно 1дС-Ес человека в качестве контрольного белка (100 мкг), и группу С инъецируют 100 мкг ТЛС1-Гс три раза в неделю в течение четырех недель. Мышей просматривают на клиническую мышечную слабость дважды в неделю и взвешивают и отбирают кровь для сыворотки через 15 и 30 дней после начала введения. Цельную кровь собирают на 15-й день для определения соотношения клеток Т/В с помощью анализа сортировки флуоресцентноактивированных клеток, с использованием маркеров В220 и СЭ5. Выживших мышей убивают после 3045 дней после начала лечения и их тела замораживают для последующего выделения рецептора ацетилхолина для определения потери мышечного рецептора ацетилхолина, первичной патологии в миастениа гравис (см. например, Сойдаи е! а1., (Ебк.), Рто!осо1к ίη 1ттипо1оду. Уо1. 3, стр. 15.8.1 (1ойи ХУбеу & 8опк, 1997)).
Сывороточные антитела к мышиному мышечному рецептору ацетилхолина могут быть определены установленным радиоиммунологическим анализом, а изотипы антител против рецептора ацетилхолина (1дМ, 1§С1, 1дО2Ь и 1дС2с) определяют методом ЕЫ8Л. Такие методы известны. Определяют эффекты ТАС1-иммуноглобулина на текущую клиническую миастениа гравис, антитела против рецептора ацетилхолина и уровень изотипов, и на потерю мышечного ацетилхолинового рецептора.
Приблизительно 100 мышей может быть иммунизировано 20-тью микрограммами рецептора ацетилхолина в полном адъюванте Фрейнда на 0-й и 30-й день. Мышей с клинической миастениа гравис делят на четыре группы. Группу А инъецируют внутрибрюшинно 100 микрограммами конрольного Ес, группу В инъецируют 20 микрограммами конрольного Ес, группу С инъецируют 100 микрограммами ТАС1-Ес и группу Э инъецируют 20 микрограммами ТАС1-Ес три раза в неделю в течение четырех недель. Мышей взвешивают, а кровь отбирают для сыворотки перед и после 15 и 30 дней после начала лечения. Сыворотку исследуют на антитела против рецептора ацетилхолина и изотипы как описано выше. Потеря мышечного рецептора ацетилхолина может также быть измеряна.
Другие анализы слитых белков ТАС1-иммуноглобулинов могут быть определены специалистами в данной области.
6. Получение конъюгатов ТАС1-иммуноглобулин
Настоящее изобретение включает в себя химически модифицированные ТАС1-иммуноглобулиновые композиции, в которых полипептид ТАС1-иммуноглобулин связан с полимером. Типично, полимер является водорастворимым, так что иммуноглобулиновый конъюгат не преципитируется в водной среде, такой как физиологическая среда. Примером пригодного полимера является полимер, который модифицировали, чтобы в его состав входила одна реакционноспособная группа, например, активный сложный эфир для ацилирования, или альдегид для алкилирования. Таким образом может быть проконтролирована степень полимеризации. Примером реакционноспособного альдегида является пропионовый альдегид полиэтиленгликоля, или моно-(С1-С10)алкокси, или арилокси- производные от них (см., например, Натк, е! а1., патент США N 5252714). Полимер может быть разветвленным или неразветвленным. Кроме того, для получения ТАС1-иммуноглобулиновых конъюгатов могут быть использованы смеси полимеров.
ТАС1-иммуноглобулиновых конъюгаты, используемые для терапии, могут содержать фармацевтически приемлемые водорастворимые полимерные компоненты. Подходящие водорастворимые полимеры включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), монометокси-ПЭГ, моно-(С1-С10)алкокси-ПЭГ, арилокси-ПЭГ, поли-Щ-винилпирролидон)ПЭГ, трезилмонометокси-ПЭГ, ПЭГ -пропиональдегид, Ь15-сукцинимидкарбонат-ПЭГ, гомополимеры пропиленгликоля, сополимер полипропиленоксид/этиленоксид, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт, декстран, целлюлозу или другие полимеры на основе углеводов. Подходящий ПЭГ может иметь молекулярную массу от около 600 до около 60000, включая, например, 5000, 12000, 20000 и 25000. Конъюгат ТАС1-иммуноглобулина может также содержать смесь таких водорастворимых полимеров.
Один пример конъюгата ТАС1-иммуноглобулин содержит часть ТАС1-иммуноглобулина и часть полиалкилоксида, присоединенную к Ν-концу ТАС1-иммуноглобулина. ПЭГ является одним подходящим полиалкилоксидом. В качестве иллюстрации, ТАС1-иммуноглобулин может быть модифицирован ПЭГом, процесс известен как «ПЭГилирование». ПЭГилирование ТАС1-иммуноглобулина может быть достигнуто любой их реакций ПЭГилирования, известных в данной области (см., например, ЕР 0 154 316, Эе1дабо е! а1., Спбса1 Ре\зе\\'8 ίη Тйетареийс Эгид Сатег 8ук!етк 9:249 (1992), Эппсам апб 8ргеаПсо. С11п. Рйагтасокше!. 27:290 (1994), и Егапак е! а1., ΙηΗ Нета!о1 68:1 (1998)). Например, ПЭГилирование может быть произведено реакцией ацилирования, или реакцией алкилирования с реакционноспособной молекулой полиэтиленгликоля. В альтернативном подходе, конъюгаты ТАС1-иммуноглобулина образу
- 21 007275 ют конденсированием активированного ПЭГа, при котором концевую гидроксильную или аминогруппу ПЭГа замещают активированным линкером (см., например, 1<ага51е\у|с/ е! а1., патент США N 5382657).
ПЭГилирование ацилированием типично требует взаимодействия активного производного сложного эфира ПЭГа с полипептидом ТАСЕиммуноглобулин. Примером активированного сложного эфира ПЭГа является ПЭГ, этерифицированный до №гидроксисукцинимида. Как используют здесь, термин «ацилирование» включает в себя следующие типы связей между ТАСЕиммуноглобулином и водорастворимым полимером: амидом, карбаматом, уретаном и т.п. Способы получения ПЭГилированного ТАСЕиммуноглобулина ацилированием будут типично содержать этапы (а) взаимодействия полипептида ТАСЕиммуноглобулин с ПЭГом (таким как реакционноспособный сложный эфир альдегидного производного ПЭГа) в условиях, при которых одна или несколько групп ПЭГа прикрепляются к ТАСЧиммуноглобулину, и (Ь) получения продукта (продуктов) реакции. Вообще, оптимальные условия взаимодействия реакций ацилирования будут определены на основе известных параметров и желаемых результатов. Например, чем больше соотношение ПЭГ :ТАСЕиммуноглобулин, тем выше процентное содержание поли-ПЭГилированного ТАСЕиммуноглобулинового продукта.
Продукт ПЭГилирования ацилированием является типично поли-ПЭГилированным продуктом ТАСЕиммуноглобулина, причем лизиновые ε-аминогруппы являются ПЭГилированными через ацильную связывающую группу. Примером соединительного звена является амид. Типично, образующийся в результате ТАСЕиммуноглобулин будет, по меньшей мере, на 95% моно-, ди- или три-пэгилированным, хотя могут быть образованы некоторые разновидности с более высокой степенью ПЭГилирования в зависимости от условий взаимодействия. ПЭГилированные разновидности могут быть отделены от неконъюгированных полипептидов ТАСЕиммуноглобулина с использованием стандартных способов очистки, например, диализа, ультрафильтрации, ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии и т.п.
ПЭГиляция алкилированием вообще включает в себя взаимодействие конечного производного альдегида ПЭГа с ТАСЕиммуноглобулином в присутствии редуцирующего агента. Группы ПЭГа могут быть присоединены к полипептиду через -СН2-Е1Н-группу.
Получение производных посредством редуктивного алкилирования для получения моноПЭГилированного продукта использует дифференциальную реакционную способность различных типов первичных аминогрупп, пригодных для получения производных. Типично, взаимодействие проводят при рН, которое позволяет взаимодействию использовать различия рКа между ε-аминогруппами остатков лизина и α-аминогруппой И-концевого остатка белка. Путем такого селективного получения производных контролируют присоединение водорастворимого полимера, который имеет в своем составе реакционную группу, например, альдегид, к белку. Конъюгирование с полимером происходит преимущественно на №конце белка без существенной модификации реакционных групп, таких как аминогруппы лизинов боковой цепи. Настоящее изобретение предоставляет существенно гомогенное получение конъюгатов монополимера ТАСЕиммуноглобулина.
Восстановительное алкилирование для производства существенно гомогенной популяции молекул конъюгата ТАСЕиммуноглобулина с монополимером может предусматривать этапы: (а) взаимодействия полипептида ТАСЕиммуноглобулин с реакционноспособным ПЭГом в условиях восстановительного алкилирования при рН подходящем для позволения избирательной модификации α-аминогруппы на аминоконце ТАСЕиммуноглобулина, и (Ь) получения продукта (продуктов) взаимодействия. Редуцирующий агент, используемый для восстановительного алкилирования, должен быть стабильным в водном растворе и способным к восстановлению Шиффового основания, образованного на начальных этапах восстановительного алкилирования. Иллюстративные восстановители включают боргидрид натрия, цианборгидрид натрия, диметиламинборан и пиридинборан.
Для существенно гомогенной популяции конъюгатов ТАСЕиммуноглобулина с монополимерами, условия взаимодействия восстановительного алкилирования являются такими, что позволяют избирательное присоединение водорастворимой части полимера к №концу ТАСЕиммуноглобулина. Такие условия взаимодействия вообще предусматривают различия рКа между аминогруппами лизина и αаминогруппой на №конце. рН также влияет на соотношение полимера к белку, что должно быть использовано. Вообще, если рН ниже, то будет желательно избыточное количество полимера по отношению к белку, поскольку меньшее количество реакционных ^концевых α-групп, больше полимера необходимо для достижения оптимальных условий. Если рН выше, то полимер:ТАС!-иммуноглобулин не должен быть большим, поскольку большее количество реакционных групп имеется в распоряжении. Типично рН будет находиться в диапазоне от 3 до 9, или от 3 до 6.
Другим фактором для рассмотрения является молекулярная масса водорастворимого полимера. Вообще, чем выше молекулярная масса полимера, тем меньше число полимерных молекул, которые могут быть присоединены к белку. Для взаимодействия с ПЭГом, типичная молекулярная масса составляет от около 2кДа до около 100 кДа, около 5 кДа до около 50 кДа, или около 12 кДа до около 25 кДа. Молярное соотношение водорастворимого полимера к ТАСЕиммуноглобулину будет вообще в области от 1:1 до 100:1. Типично, молярное соотношение водорастворимого полимера к ТАСЕиммуноглобулину будет от 1:1 до 20:1 для поли-ПЭГилирования и от 1:1 до 5:1 для моно-ПЭГилирования.
- 22 007275
Общие способы получения конъюгатов, содержащих части полипептида и водорастворимых полимеров, известны в данной области. См, например, 1<агак1е\у|сх е! а1., патент США N 5382657, Сгееп\уа16 е! а1., патент США N 5738846, №еГог111 е! а1., С11п. РЬагтасо1. ТНег.59:636 (1996), МопкагкН е! а1., Апа1. ВюсНет. 247:434(1997)).
Настоящее изобретение рассматривает композиции, содержащие пептид, или полипептид, описанные здесь. Такие композиции могут, кроме того, содержать носитель. Носителем может быть общепринятый органический или неорганический носитель. Примеры носителей включают воду, буферный раствор, спирт, пропиленгликоль, макрогол, кунжутное масло, кукурузное масло и т.п.
7. Выделение полипептидов ТАСВиммуноглобулин
Полипетиды настоящего изобретения могут быть очищены, по меньшей мере, до 80%-ной чистоты, по меньшей мере, до около 90%-ной чистоты, по меньшей мере, до около 95%-ной чистоты или выше, чем 95% чистоты относительно примесных макромолекул, особенно относительно других белков и нуклеиновых кислот, и не содержать инфекционные и пирогенные агенты. Полипептиды настоящего изобретения могут также быть очищены до фармацевтически чистого состояния, которое является выше, чем 99,9% чистоты. В определенных препаратах очищенный полипептид является существенно освобожденным от других полипептидов, особенно от других полипептидов животного происхождения.
Способы фракционирования и/или общепринятой очистки могут быть использованы для получения препаратов полипептидов, искусственных полипептидов ТАСВиммуноглобулин и рекомбинантных полипептидов ТАСВиммуноглобулин, очищенных от рекомбинантных клеток хозяина. Вообще, осаждение сульфатом аммония и кислотная экстракция, или хаотропная экстракция могут быть использованы для фракционирования образцов. Примеры этапов очистки могут включать жидкостную хроматографию на гидроксиапатите, эксклюзивную хроматографию, РРЬС (прим. пер., скоростная жидкостная хроматография белков) и обратно-фазовую жидкостную хроматографию с высоким разрешением. Пригодные хроматографические среды включают замещенные декстраны, агарозу, целлюлозу, полиакриламид, специальные селикагели и т.п. Производные ΡΞΙ, □ЕАН. РАЕ и р являются пригодными. Примеры хроматографических носителей включают такие носители, модифицированные фенильными, бутильными или октильными группами, например, РНепу1-БерНагоке РР (РНагтаща), Тоуореаг1 Ьи1у1 650 (Токо Наак, МопВ дотегууШе, РА) 0с1у1-БерНагоке (РНагташа) и т.п.; или полиакриловые смолы, такие как АтЬегсЬгот СО 71 (Токо Наак) и т.п. Пригодные твердые носители включают стеклянные шарики, смолы на основе силикагеля, целлюлозные смолы, агарозные шарики, сшитые шарики агарозы, полисиреновые шарики, сшитые полиакриламидные смолы и т.п., которые являются нерастворимыми в условиях, при которых они должны использоваться. Эти носители могут быть модифицированы реакционными группами, что делает возможным присоединение белков аминогруппами, карбоксильными группами, сульфгидрильными группами, гидроксильными группами и/или углеводными остатками.
Примеры процессов химического связывания включают активирование циан-бромидом, активирование №гидроксисукцинимидом, эпоксидное активирование, сульфгидрильное активирование, активирование гидразидом и карбокси- и апминопроизводными для процессов химической сшивки карбодиимидов. Эти и другие твердые носители являются хорошо известными и широко используются в данной области и являются доступными от коммерческих поставщиков. Выбор специфического способа выделения и очистки полипептида является рутинным делом и определяется, отчасти, свойствами выбранного носителя. Смотри, например, АГНиЦу СНготаЮщарНу: Ргшс1р1ек & Ме11ю6к (Рйагтааа ЬКВ Вю1есНпо1оду 1988) и Ооопап, Рго1ет РипПсаРоп Рго!осо1к (ТНе Нитапа Ргекк 1996).
Дополнительные варианты выделения и очистки ТАСВиммуноглобулинов могут быть придуманы специалистами в данной области. Например, могут быть использованы антитела анти-ТАО или анти-Рс для выделения больших количеств белка методом иммуноаффинной очистки.
Полипептиды настоящего изобретения также могут быть выделены с использованием индивидуальных свойств. Например, адсорбционная хроматография с иммобилизованными ионами металла (ГМАС) может быть использована для очистки белков, богатых гистидином, включая белки, содержащие полигистидиновые метки. Кратко, сначала гель наполняют ионами металла для образования хелатов (Би1ко^кк1, Тгепбк ίπ ВюсНет. 3:1 (1985)). Богатые гистидином белки будут адсорбироваться на этом матриксе с различной аффинностью, зависящей от использованного иона металла, будут сэлюированы конкурентной элюцией, понижением рН, или использованием сильных хелатирующих агентов. Другие способы очистки включают очистку гликозилированных белков аффинной хроматографией с иммобилизованным пектином, Рго1ет А - хроматография, и ионообменную хроматографию (МЛеийсНег, (еб.), МеЛ. Епгуток 782:529 (1990)).
Полипептиды ТАСВиммуноглобулин или их фрагменты могут также быть получены путем химического синтеза, как описано выше. Полипептиды ТАСВиммуноглобулин могут быть мономерами или мультимерами; гликозилированными или негликозилированными; ПЭГилированными или неПЭГилированными и могут включать или могут не включать начальный аминокислотный остаток метионина. Слитый белок ТАСВиммуноглобулина может быть негликозилированным, гликозилированным или гликозилированным только в части ТАШ или в части иммуноглобулина. Иммуноглобулиновая часть может быть получена из антител человека, химерных антител или антител человекообразных.
- 23 007275
8. Терапевтическое применение полипептидов ТАСГиммуноглобулин
Белки ТАСΙ-иммуноглобулин могут быть использованы для модуляции иммунной системы путем связывания ΖΤNЕ4 или ΖΤNΡ2, и таким образом, препятствуя связыванию этих лигандов с эндогенными рецепторами ТАС.Ч или ВСМА. Следовательно, настоящее изобретение включает использование белков ТАСЧ-иммуноглобулин субъекту, который испытывает недостаток в достаточном количестве рецепторов ТАСЧ или ВСМА, или который производит избыток ΖΤNΡ4 и ΖΤNΕ2. Эти молекулы могут быть введены любому субъекту, который нуждается в лечении, и настоящее изобретение рассматривает как применение в ветеринарии, так и в терапии человека. Иллюстративные субъекты включают субъекты млекопитающих, таких как сельскохозяйственные животные, домашние животные и больные люди.
Полипептиды ТАСЧ-иммуноглобулин могут быть использованы для лечения аутоиммунных заболеваний, карциномы В-клеток, иммуномодуляции, ΙΒΌ и любых патологий, опосредованных антителами (например, НСР. миастениа гравис и т.п.), почечная недостаточность, косвенный Т-клеточный иммунный ответ и отторжение трансплантата и заболевания трансплантат против хозяина. Полипептиды настоящего изобретения могут быть мишенями к специфичным ответам, регулируемым В-клетками во время иммунного ответа. Кроме того, полипептиды настоящего изобретения могут быть использованы для модулирования развития В-клеток, развития других клеток, наработки антител и наработки цитокинов. Полипептиды настоящего изобретения также могут модулировать взаимодействие Т-клеток и Вклеток путем нейтрализации пролиферативных эффектов ΖΤNΕ4.
Полипептиды ТАСЧ-иммуноглобулин настоящего изобретения могут быть полезными для нейтрализации эффектов ΖΤNΡ4 для лечения пре-В- или В-клеточных лейкозов, таких как плазмоклеточный лейкоз, хронический или острый лимфоцитарный лейкоз, миеломы, такие как множественная миелома, плазмоклеточная миелома, омобластома и гигантоклеточная миелогенная опухоль и лимфомы, такие как неходжкинская лифома, которая ассоциирована с ростом полипептидов ΖΤNΡ4.
ΖΤNΡ4 экспрессируется в СО8+-клетках, моноцитах, дендровидных клетках, активированных моноцитах, которые указывают, что, в определенных аутоиммунных заболеваниях, цитотоксические Т-клетки могут стимулировать наработку В-клеток посредством избыточной наработки ΖΤNΡ4. Иммунодепрессантные белки, которые избирательно блокируют действие В-лимфоцитов, могли бы использоваться при лечении заболевания. Наработка аутоантител является одинаковой для нескольких аутоиммунных заболеваний и вносит вклад в разрушение ткани и обострение заболевания. Аутоантитела могут также привести к появлению осложнений осаждения иммунного комплекса и привести ко многим симптомам системной красной волчанки, включая почечную недостаточность, невралгические симптомы и смерть. Модулирование наработки антител, не зависящее от клеточного ответа, также было бы выгодным во многих болезненных состояниях. Было показано также, что В-клетки играют роль в секреции артрогенных иммуноглобулинов при ревматоидных артритах. Как таковое, ингибирование наработки антител ΖΤNΡ4 было бы выгодным в лечении аутоиммунных заболеваний, таких как миастениа гравис, ревматоидный артирит, детский полиартрит и псориатический артрит. Иммунодепрессантная терапия, например, белками ТАО-иммуноглобулин, которые избирательно блокируют или нейтрализуют действие Влимфоцитов, была бы полезной для таких целей.
Изобретение предусматривает способы применения белков ТАСЧ-иммуноглобулин для селективного блокирования или нейтрализации действия В-клеток в связи с конечной стадией почечной недостаточности, которая может или не может быть ассоциирована с аутоиммунным заболеванием. Такие способы также были бы полезны для лечения иммунологических почечных заболеваний. Такие способы были бы полезными для лечения гломерулонефрита, связанного с заболеваниями, такими как мембранная нефропатия, ΙβΛ-нефропатия или болезнь Бергера, ΙβΜ нефропатия, болезнь Гудпасчура, постинфекционный гломерулонефрит, мезангиопролиферативное заболевание, хронический лимфоидный лейкоз, минимально измененный нефротический синдром. Такие способы также могли бы служить в качестве терапевтических применений для лечения вторичного гломерулонефрита или ангины, связанными с такими заболеваниями как волчанка, полиартрит, болезнь Шенлейна-Геноха, склеродерма, заболеваниями, связанными с ВИЧ, амилоидоз или гемолитико-уремический синдром. Способы настоящего изобретения также были бы полезными в качестве части (доли) терапевтического применения для лечения интерстициального нефрита или пиелонефрита, ассоциированного с хроническим пиелонефритом, злоупотребления болеутоляющими средствами, нефрокальциноза, нефропатии, вызванной другими агентами, почечнокаменной болезни или хронического или острого интерстициального нефрита.
Способы настоящего изобретения также включают применение белков ТАСГиммуноглобулин для лечения гипертонических заболеваний или заболеваний крупных сосудов, включая стеноз почечной артерии, или окклюзию, или холестериновую эмболию, или почечную эмболию.
Настоящее изобретение также предоставляет способы лечения почечных или урологических истинных опухолей, множественных миелом, лимфом, легкой цепи невропатии или амилоидоза.
Изобретение также предоставляет способы блокирования или ингибирования активированных Вклеток с использованием белков ТАСТ-иммуноглобулин для лечения астмы и других хронических забо
- 24 007275 леваний дыхательных путей, таких как бронхиты и эмфизема. Описанные здесь белки ТАС1иммуноглобулин также могут быть использованы для лечения синдрома Шегрена.
Также предоставляют способы ингибирования или нейтрализации эффекторного ответа Т-клеток с использованием белков ТАС1-иммуноглобулин для использования при иммунодепрессии, в частности для такого терапевтического использования, как при реакции «трансплантат против хозяина», так и при отторжении трансплантата. Кроме того, белки ТАС1-иммуноглобулин будут полезными в терапевтических протоколах для лечения таких аутоиммунных заболеваний как инсулинзависимый сахарный диабет (ГООМ) и болезнь Крона. Способы настоящего изобретения могут иметь дополнительную терапевтическую ценность для лечения хронических воспалительных заболеваний, в частности для уменьшения суставных болей, опухолей, анемии и других ассоциированных симптомов, также как и лечения септического шока.
Хорошо установленные модели на животных являются пригодными для анализа ш у|уо эффективности белков ТАС1-иммуноглобулин настоящего изобретения в точных болезненных состояниях. В частности, белки ТАС1-иммуноглобулин могут быть проанализированы ш у|уо в ряде экспериментальных моделей на животных на аутоиммунное заболевание, таких как МКЬ-1рг/1рг или Е1 ΗΖΕχΗΣ^ родственных линий мышей, которые служат в качестве модели 8ЬЕ (системной красной волчанки). Такие модели животных являются известными в данной области.
Потомство от скрещивания между мышами №\ν Ζеа1аηй В1аск (ЮВ) и №\ν Ζеа1аηй \У1ч!е (ΧΖν) проявляет спонтанные формы 8ЬЕ, которые имеют близкое сходство с 8ЬЕ человека. Потомство мышей, известное как ΚΖΕΧν, начинает обнаруживать 1дМ-аутоантитела против Т-клеток в возрасте 1 месяца и в 5-7-месячном возрасте, 1д-аутоантитела против ДНК являются доминантным иммуноглобулином. Поликлональная гиперактивность В-клеток приводит к чрезмерной наработке аутоантител. Накопление этих аутоантител, особенно аутоантител направленных против однонитевой ДНК, связано с развитием гломерулонефрита, который проявляется клинически как протеинурия, азотемия и смертью от почечной недостаточности. Почечная недостаточность является главной причиной смерти мышей, пораженных спонтанной 8ЬЕ, а у линии NΖΒV этот процесс является хроническим и уничтожающим. Заболевание является более быстрым и тяжелым у женских особей, чем у мужских со средним выживанием только 245 дней по сравнению с 406 днями для мужских особей. В то время как многие из женских особей мышей будут симптоматичными (протенуриа) в возрасте 7-9 месяцев, некоторые из них могут быть намного моложе или старше при проявлении симптомов. Смертельный иммунный нефрит, обнаруженный у мышей NΖΒV, является очень похожим на гломерулонефрит, обнаруженный у человека с 8ЬЕ, делая эту спонтанную модель на мышах полезной для тестирования потенциальной терапии 8ЬЕ.
Модели на мышах для экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЕАЕ) использовали в качестве инструмента для исследования как механизмов иммунно-опосредованного заболевания, так и способов потенциального терапевтического вмешательства. Модель имеет сходство с рассеянным склерозом человека и дает демиелинизацию в качестве результата активации Т-клеток к нейробелкам, таким как основной белок миелина (МВР) или протеолипидный белок (РЬР). Инокуляция антигеном приводит к индуцированию СЭ4+, Т-клеток II класса (ТН1), рестриктированных по главному комплексу гистосовместимости (МНС). Изменения в протоколе по ЕАЕ могут породить острые, хронически-рецидивные или пассивно-перенесенные варианты модели.
В экспериментальной модели на животных по изучению индуцированного коллагеном артрита (С1А), у мышей развивался хронический воспалительный артрит, который имеет близкое сходство с ревматоидным артритом (КА) человека. Поскольку С1А обнаруживает сходные с КА иммунологические и патологические признаки, то это делает его идеальной моделью для скрининга потенциальных противовоспалительных компонентов у человека. Другим преимуществом использования модели по изучению С1А является то, что механизмы его патогенеза известны. Идентифицированы Т- и В-клеточные эпитопы на коллаген ΙΙ типа и определены различные иммунологические параметры (замедленная гиперчувствительность и антитела против коллагена) и противовоспалительные (цитокины, хемокины, ферменты, разрушающие матрикс) параметры, относящиеся к иммунно-опосредованным артритам, и могут быть использованы для оценки эффективности тестируемых компонентов в моделях.
Миастения гравис (МО) является другим аутоиммунным заболеванием, для которого экспериментальные модели на мышах являются пригодными. МО является нарушением нервно-мышечной проводимости, затрагивающем выработку аутоантител, направленных против никотинового ацетилхолинового рецептора (АСНК). МО является приобретенным или наследственным с клиническими признаками, включающими огромную слабость и утомляемость при напряжении. Установлена экспериментальная модель на мышах МО. Экспериментальная аутоиммунная миастениа гравис (ЕАМО) является заболеванием, опосредованным антителами, характеризующимся наличием антител к АСНК. Эти антитела разрушают рецептор, приводя к повреждению нейромускульных электрических импульсов, выражающееся в мышечной слабости. В экспериметальной модели ЕАМО мышей иммунизировали никотиновым ацетилхолиновым рецептором. Клинические признаки МО становятся очевидными через неделю после второй иммунизации. ЕАМО оценивают несколькими способами, включая измерение уровней сыворотки
- 25 007275 антител к АСЬК радиоиммунологическим анализом, измерение мышечного АсйК, или электромиографией.
Вообще, доза введенного белка ТАС1-иммуноглобулин будет варьировать в зависимости от таких факторов как возраст субъекта, вес, пол общее медицинское состояние и предыдущая история болезни. Типично, является желательным обеспечение реципиента дозой белка ТАС1-иммуноглобулин, которая находится в диапазоне от около 1 пг/кг до 10 мг/кг (количество агента/массу тела субъекта), хотя более низкие, или более высокие дозы также могут быть введены как диктуют обстоятельства.
Введение белка ТАС1-иммуноглобулин субъекту может быть внутривенным, внутриартериальным, внутрибрюшинным, внутримышечным, подкожным, внутриплевральным, интратекальным, перфузионным через региональный катетер или прямой внутриповреждающей инъекций. При введении терапевтических белков инъекцией введение может быть в виде непрерывной инфузии или простыми, или сложными болюсами.
Дополнительные пути введения включают оральный, мембранно-слизистый, пульмональный и чрескожный. Оральный прием является пригодным для полиэфирных микросфер, зеиновых микросфер, белковых микросфер, полицианакрилатных микросфер и систем на основе липидов (см., например, ΌίВаке апб Могге1, Ога1 Эейтегу оГ М1сгоепсар8и1а1еб РгоЮиъ. ίη Рго1еш Эейтегу: Рйузюа1 8уз1етз, 8апбегз апб Непбгеп (ебк.), стр. 255-288 (Р1епит Ргезз 1997)). Удобоисполнимость интраназального введения иллюстрируют таким способом введения инсулина (см., например, Н1псНс11ГГе апб 111ит, Абν. Эгид ЭеКт. Кет. 35:199 (1999)). Сухие или жидкие частицы, содержащие ТАС1-иммуноглобулин, могут быть приготовлены и поглощены путем вдыхания с помощью диспергаторов для сухого порошка, аэрозольных генераторов для жидкостей, или распылителей (например, РеИй апб СотЬо)/, Т1ВТЕСН 16:343 (1998); Ра!1оп е! а1., Абт. Эгид Эейт. Кет. 35:235 (1999)). Этот подход иллюстрируют системой управления диабетом АЕКХ, которая представляет собой портативный электронный ингалятор, который доставляет аэрозольный инсулин в легкие. Исследования показывают, что белки до 48,000 кДа были доставлены через кожу в терапевтических концентрациях с помощью низкочастотного ультразвука, который иллюстрирует выполнимость чрескожного введения (Мйгадойт е! а1., 8аепсе 269:850 (1995)). Чрескожная доставка с использованием электропорации предоставляет другие способы введения белков ТАС1-иммуноглобулин (Ройк е! а1., Рйагт. Вю1есйпо1. 70:213 (1997)).
Фармацевтическая композиция, содержащая белок ТАС1-иммуноглобулин? может быть технологически произведена в соответствии с известными способами приготовления фармацевтически полезных композиций, в соответствии с чем терапевтические белки комбинируют в композицию с фармацевтически приемлемым носителем. Указывают, что композиция должна быть «фармацевтически пригодным носителем», если ее введение может быть толерантным для реципиентного пациента. Стерильный фосфатно-солевой буферный раствор является одним примером фармацевтически удовлетворяющего носителя. Другие подходящие носители являются хорошо известными в данной области. Смотри, например, Оеппаго (еб.), ВеттдФп'з Рйагтасеийса1 8с1епсез, 191й Ебйюп (Маск РиЬйзЫпд Сотрапу 1995).
В терапевтических целях белки ТАС1-иммуноглобулин вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве. Указывают, что белки ТАС1-иммуноглобулин и фармацевтически приемлемый носитель должны быть введены в «терапевтически эффективном количестве», если вводимое количество является физиологически существенным. Агент является физиологически существенным, если его наличие дает в результате обнаруживаемое изменение в физиологии реципиентного пациента. Например, агент, используемый для лечения воспаления, является физиологически существенным, если его присутствие облегчает воспалительную реакцию. В качестве другого примера агент, используемый для ингибирования роста опухолевых клеток, является существенным, если введение агента приводит в результате к уменьшению количества опухолевых клеток, уменьшенным метастазам, уменьшенной в размере твердой опухоли, или увеличенному некрозу опухоли. Кроме того, агент, используемый для лечения системной красной волчанки, является физиологически значимым, если введение агента дает в результате снижение циркулирующих антител против двухцепочечной ДНК или уменьшения по меньшей мере одного из следующих симптомов: лихорадки, боли суставов, эритемного поражения кожи или других признаков системной красной волчанки. Одним примером общего признака что белок ТАС1-иммуноглобулин вводят в терапевтически эффективном количестве является то, что при последующем введении субъекту наблюдается снижение в циркулирующих уровнях 2Т№4 (ВЬу8).
Фармацевтическая композиция, содержащая белок ТАС1-иммуноглобулин, может быть предоставлена в жидкой форме, в аэрозольной форме или в твердой форме. Жидкие формы иллюстрируют инъекционными растворами и оральными суспензиями. Экземпляры твердых форм включают капсулы, таблетки и формы с контролируемым высвобождением. Последнюю форму иллюстрируют миниосмотическими насосами и имплантатами (Вгетег е! а1., Рйагт. Вю1есйпо1. 10:239 (1997); Капабе, 1тр1ап18 т Эгид Эейтегу, в Эгид Эейтегу 8уз1етз, Капабе апб Но11шдег(еб8.), стр. 95-123(СКС Ргезз 1995); Вгетег е! а1., Рго1еш Эе1|тегу χνίίΐι 1пГи8юп Ритрз, т Рго1еш Эейтегу: Рйу81са1 8у81етз, 8апбегз апб Непбгеп (ебк.), стр. 239-254 (Р1епит Ргезз 1997); Уе\теу е! а1., Эейтегу оГ Рго1ешз Ггот а Соп1го11еб Ке1еа8е 1п,ес1аЬ1е 1тр1ап!, в Рго1ет Эейтегу: Рйузюа1 8у81етз, 8апбегз апб Непбгеп (ебк.), стр.93-117 (Р1епит Ргезз 1997)).
- 26 007275
Липосомы предоставляют один способ доставки терапевтических полипептидов субъекту: внутривенно, внутрибрюшинно, интратекально, внутримышечно, поверхностно или через оральное введение, ингаляцию или интраназальное введение. Липосомы являются микроскопическими везикулами, которые состоят из одного или нескольких липидных бислоев, окружающих водные компартменты (см., в целом, Ваккег-^оибеиЬегдг ег а1., Еиг. 1. С11и. М1сгоЫо1. йГес!. Όίδ. 12 (8ирр1.1):861 (1993), К1т, Эгидх 46:618 (1993), апб Каиабе, 81!е-8ресШс Эгид ОеПуегу Ихшд Ырохотех ах Саглегх, в Эгид Оейуегу 8ух!етх, Каиабе аиб ^Н^де!· (ебх.), стр.3-24 (СКС Ргехх 1995)).
Липосомы по составу сходны с клеточными мембранами и в результате, липосомы могут быть введены безопасно и являются биодеградируемыми. В зависимости от способа получения липосомы могут быть однослойными, или многослойными, и липосомы могут варьировать в размере с диапазоном диаметра от 0,02 мкм до больше чем 10 мкм. Множество агентов может быть инкапсулировано в липосомы: гидрофобные агенты, разделенные в бислоях, и гидрофильные агенты, распределенные во внутреннем (внутренних) водном пространстве (пространствах) (см., например, МасНу е! а1., Ырохотех Ιπ Се11 Вю1оду Аиб РНагтасо1оду ЛоНм ЫЬЬеу 1987), и 0х!го е! а1., Атепсаи 1. Иохр. РНагт. 46:1576 (1989)). Кроме того, существует возможность контроля терапевтической эффективности инкапсулированного агента посредством изменения размера липосомы, числа бислоев, липидного состава, так же как и заряда, и поверхностных свойств липосом.
Липосомы могут адсорбировать, практически, любые типы клеток и затем медленно высвобождать инкапсулированный агент. Альтернативно, абсорбированная липосома может быть подвергнута эндоцитозу клетками, которые являются фагоцитами. Эндоцитоз происходит с последующей деградацией липосомальных липидов внутри лизосом и высвобождением инкапсулированных агентов (8сНегрНоГ е! а1, Аии. КУ. Асаб. 8с1 446:368 (1985)). После внутривенного введения, небольшие липосомы (от 0,1 до 1,0 мкм) поглощаются клетками ретикулоэндотелиального аппарата, локализованного, главным образом, в печени и селезенке, в то время как липосомы больше чем 3,0 мкм, депонируются в легких. Это преимущественное поглощение более мелких липосом клетками ретикулоэндотелиального аппарата было использовано для доставки хемотерапевтических агентов к макрофагам и к опухолям печени.
Ретикулоэндотелиальный аппарат может быть обманут несколькими способами, включая насыщение большими дозами липосомных частиц, или избирательной инактивацией макрофагов фармакологическими средствами (С1ааххеи е! а1, ВюсНип. ВюрНух. Ас!а 802:428 (1984)). Кроме того, показано, что внедрение производных гликолипид-производных или полиэтиленгликоль-производных фосфолипидов внутрь липосомных мембран дает в результате существенно сниженное поглощение ретикулоэндотелиальный аппаратом (А11еи е! а1., ВюсНпп. ВюрНух. Ас!а 7068:133 (1991); А11еи е! а1., ВюсНпп. ВюрНух. Ас!а 7750:9(1993)).
Липосомы также могут быть подготовлены для специфических клеток-мишеней или органов варьированием фосфолипидной композиции или внедрением рецепторов, или лигандов внутрь липосом. Например, липосомы, очищенные с высоким содержанием неионного поверхностно-активного вещества, использовали для попадания в печень (Иауака^а е! а1., патент Японии N 04-244018; Ка!о е! а1., Вю1. РНагт. Ви11. 16:960 (1993)). Эти композиции были получены смешиванием соевого фосфатидилхолина, α-токоферола и этоксилированного гидрогенизированного касторового масла (НСО-60) в метаноле, концентрированием смеси в вакууме и затем разбавления смеси водой. Также было показано, что липосомная композиция дипальмитоилфосфатидилхолина (ЭРРС) со смесью полученного из сои стерилгликозида (8С) и холестерина (СН) попадает в печень (8Нптхи е! а1., Вю1. РНагт. Ви11. 20:881 (1997)).
Альтернативно, различные лиганды-мишени могут быть пришиты к поверхности липосомы, такие как антитела, фрагменты антител, углеводы, витамины и транспортные белки. Например, липосомы могут быть модифицированы разветвленными галактозиллипидными производными для обнаружения рецепторами асиалогликопротеина (галактозы), которые являются исключительно экспрессированными на поверхности клеток печени (Ка!о аиб 8ид1уата, СгН. Кеу. ТНег. Эгид Саглег 8ух!. 14:287 (1997); МигаНахН1 е! а1., Вю1. РНагт. Ви11. 20:259 (1997)). Подобным образом, \Уи е! а1., Иера1о1оду 27:772 (1998), показали, что мечение липосом асиалофетуином приводило к сокращению полужизни липосомной плазмы и вообще усиливало поглощение гепатоцитами липосом, меченых асиалофетуином. С другой стороны, печеночная аккумуляция липосом, содержащих разветвленные производные галактозиллипида, может быть ингибирована предварительной инъекцией асиалофетуина (МигаНахЫ е! а1., Вю1. РНагт. Ви11. 20:259 (1997)). Полиаконитилированные липосомы сывороточного альбумина человека предоставляют другой подход для попадания липосом в клетки печени (Катрх е! а1., Ргос. №11'1 Асаб. 8ск И8А 94:11681 (1997)). Кроме того, СеНо, е! а1., патент США N 4603044, описывают систему доставки в гепатоциты на основе липосомных пузырьков, которая является специфичной для гепатобилиарных рецепторов, ассоциированных со специализированными метаболическими клетками печени.
В более общем подходе по попаданию в ткани клетки-мишени предварительно метят биотинилированными антителами специфичными для лиганда, экспрессированного клеткой-мишенью (Иагахут е! а1., Абу. Эгид ЭеНу. Кеу. 32:99 (1998)). После удаления плазмой свободного антитела, вводят стрептавидинконъюгированные липосомы. В другом подходе, анитела, которые служат меткой, прикрепляют прямо к липосомам (Иагахут е! а1., Абу. Эгид ЭеНу. Кеу. 32:99(1998)).
- 27 007275
Белки ТАО-иммуноглобулин могут быть инкапсулированы внутрь липосом с использованием стандартных приемов микроинкапсулирования белков (см., например, Апбегкоп е! а1., Шес!. Iттиη. 31:1099 (1981), Апбегкоп е! а1.,Сапсег Кек. 50:1853 (1990), и СоИеп е! а1., ВюсЫт. ВюрИук. Ас!а 1063:95 (1991), АМпд е! а1.,Ргерага!юп апб Ике оГ Ырокотек т [ттипо1о§1са1 8!иб1ек, в Ырокоте ТесИпо1оду, 2пб ЕбЫоп, Уо1. III, СгедопабЫ (еб.), стр. 317 (СКС Ргекк 1993), +аккеГ е! а1., Ме!И. Епхуто1. 749:124 (1987)). Как подчеркивают выше, терапевтически пригодные липосомы могут иметь в своем составе различные компоненты. Например, липосомы могут содержать липидные производные полиэтиленгликоля (А11еп е! а1., ВюсЫт. ВюрИук. Ас!а 1150:9 (1993)).
Для поддержания высоких системных уровней терапевтических белков были созданы распадающиеся полимерные микросферы. Микросферы получают из биодеградируемых полимеров, таких как поли(лактид-когликолид)(РЬС), полиангидриды, полиортоэфиры, биологически неразложимые этилвинилацетатные полимеры, в которых белки инкапсулированы в полимер (СотЬо1/ апб Ре!Й, Вюсоп)ида!е СИет. 6:332 (1995); Капабе, Ко1е оГ Ро1утегк т Эгид ОеЮегу, в Эгид ЬеНтегу 8ук!етк, Капабе апб Но11шдег (ебк.), стр. 51-93 (СКС Ргекк 1995); Коккок апб Макк1еЮс7,ПедгабаЬ1е Соп!го11еб Ке1еаке 8ук!етк ИкеГц1 Гог Рго!ет Пе1тегу, в Рго!ет Пе1Ыегу:Рйукюа1 8ук!етк, 8апбегк апб Непбгеп (ебк.), стр.45-92 (Р1епит Ргекк 1997); ВагЫк е! а1., 8с1епсе 281:1161 (1998); РЫпеу апб Вигке, №11иге Вю!есИпо1оду 16:153 (1998); Ри!пеу, Сигг. 0рш СИет. Вю1. 2:548 (1998)). Наносферы, покрытые полиэтиленгликолем (ПЭГ), могут также предоставлять носители для внутривенного введения терапевтических белков (см., например, СгеГ е! а1., РИагт. Вю!есЬпо1. 10:167 (1997)).
Настоящее изобретение также рассматривает химически модифицированные белки ТЛСIиммуноглобулин, в которых полипептид связан с полимером, как обсуждают выше.
Другие лекарственные формы могут быть разработаны специалистами в данной области, как показано, например, Апке1 апб Рοрον^сИ, РИагтасеийса1 Ьокаде Еогтк апб Эгид ЬеЫ'егу 8ук!етк, 5'1' Ебйюп (Ьеа & ЕеЫдег 1990), Сеппаго (еб.), Кеттд!оп'к РИагтасеийса1 8с1епсек, 19'1' Ебйюп (Маск РиЬйкЫпд Сотрапу 1995), Капабе апб НоШпдег, Эгид ЭеЫ'егу 8ук!етк (СКС Ргекк 1996)).
В качестве иллюстрации, фармацевтические композиции могут быть поставлены в виде набора, содержащего контейнер, который содержит белок ТАСЬиммуноглобулин. Терапевтические полипептиды могут быть предоставлены в виде инъекционного раствора для одной или нескольких доз, или в виде стерильного порошка, который будет растворен перед инъецированием. Альтернативно, такой набор может включать в себя диспергатор для сухих порошков, жидкостно-аэрозольный генератор или распылитель для введения терапевтического полипептида. Такой набор, кроме того, может содержать написанную информацию по указанию и применению фармацевтической композиции. Кроме того, такая информация может включать утверждение, что белковая композиция ТАСЬиммуноглобулин противопоказана пациентам с известной гиперчувствительностью к любому из компонентов рецептора ТАСИ или имммуноглобулиновому компоненту.
9.Терапевтическое использование нуклеотидных последовательностей ТАСЬиммуноглобулина
Настоящее изобретение включает в себя применение молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют слитые белки ТАСЬиммуноглобулина для предоставления этих слитых белков субъекту, который нуждается в таком лечении. Для ветеринарного терапевтического применения или терапевтического применения для человека такие молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены субъекту, имеющему нарушение или заболевание, как обсуждено выше. В качестве одного примера, обсужденного ранее, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие слитый белок ТАСЬиммуноглобулина, могут быть использованы для продолжительного лечения системной красной волчанки.
Существует ряд подходов по внедрению гена ТАСЬиммуноглобулин субъекту, включающих использование рекомбинантных клеток хозяина, которые экспрессируют ТАСЬиммуноглобулин, доставку очищенной нуклеиновой кислоты, кодирующей ТАСЬиммуноглобулин, использование катионного липидного переносчика с молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует ТАСЬиммуноглобулин и использование вирусов, которые экспрессируют ТАСЬиммуноглобулин, таких как рекомбинантные ретровирусы, рекомбинантные адено-ассоциированные вирусы, рекомбинантные аденовирусы и рекомбинантные симплексные вирусы герпеса (см., например, МиШдап, 8с1епсе 260:926 (1993), КокепЬегд е! а1., 8с1епсе 242:1575 (1988), Ьа8а11е е! а1., 8с1епсе 259:988 (1993), +о1ГГ е! а1., 8аепсе 247:1465 (1990), ВгеакПе1б апб ОеЫса, ТИе №\ν Вю1од1к! 3:203 (1991)). В подходе ех νίνΌ, например, изолированные клетки субъекта заражают вектором, который экспрессирует ген ТАСЬиммуноглобулин, и затем пересаживают внутрь субъекта.
Для того чтобы произвести экспрессию гена ТАСЬиммуноглобулин, конструируют вектор, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая ген ТАСЬиммуноглобулин, пришита в результате манипуляций к коровому промотору и произвольно к регуляторному элементу для контроля транскрипции гена. Общие требования к экспрессионному вектору описывают выше.
Альтернативно, ген ТАСЬиммуноглобулин может быть доставлен с использованием рекомбинантных вирусных векторов, включающих, например, аденовирусные векторы (е.д.,Какк-Е1к1ег е! а1, Ргос.№11'1 Асаб. 8сЕ И8А 90:11498 (1993), Ко11к е! а1, Ргос. №!'1 Асаб. 8сЕ И8А 97:215 (1994), Ы е! а1, Нит.Сепе ТИег. 4:403 (1993), Утсеп! е! а1, №1. Сепе!. 5:130 (1993), апб ΖаЬпе^ е! а1, Се11 75:207 (1993)), аденовирус
- 28 007275 ассоциированные вирусные векторы (Б1ойе е! а1, Ргос. Νη!'1 Асаб. 8а. И8А 90:10613 (1993)), альфавирусы, такие как лесной вирус и 8шбЫк вирус (Нег!х аиб Ниаид, I. νίτ. 66:857 (1992), Ба)и аиб Ниаид, I. νίτ. 65:2501 (1991), аиб Х1оид е! а1, 8аеисе 243:1188 (1989)), вирусные векторы герпеса (е.д., патенты США №№: 4,769,331, 4,859,587, 5,288,641 и 5,328,688), векторы парвовирусов (Коепид е! а1, Нит. Сеие Тйетар. 5:457 (1994)), векторы вирусов оспы (Охак| е! а1, Вюсйет. Вюрйук. Век. Сотт. 193:653 (1993), Ратсай аиб Рао1е!й, Ргос. Νη!'1 Асаб. 8а. И8А 79:4927 (1982)), вирусы оспы, например, канареечный вирус оспы, или вирус коровьей оспы (Б1кйег-Носй е! а1, Ргос. Νη!1 Асаб. 8а. И8А 86:317 (1989), и Б1ехиег е! а1, Аии. КУ.Асаб. 8с1. 569:86 (1989)), и ретровирусы (е.д., ВаЬа е! а1, I. №игокшд 79:729 (1993), Ват е! а1, Саисег Век. 53:83 (1993), Такат1уа е! а1, I. №игока. Век 33:493 (1992), №1е аиб Най, Саисег Век. 53:962 (1993), νίΒ аиб Най, Саисег Век. 53:3860 (1993), и Аибегкои е! а1, патенты США NN 5399346). В рамках различных вариантов или сами вирусные векторы, или вирусные частицы, которые содержат вирусный вектор, могут быть использованы в способах и композициях, описанных ниже.
В качестве иллюстрации одной из систем аденовирус, вирус с двухцепочечной ДНК, является хорошо охарактеризованным ветором для генного переноса доставки гетерологичных молекул нуклеиновой кислоты (см. обзор, Вескег е! а1, Ме!1. Се11 Вю1. 43:161 (1994); Боид1ак аиб Силе1, 8аеисе & Мебюте 4:44 (1997)). Аденовирусная система дает несколько преимуществ, включающих: (1) способность к размещению относительно крупных вставок ДНК, (и) способность быть нарощенными до высокого титра, (ш) способность к инфицированию широкого ряда типов клеток млекопитающих и (ίν) способность быть использованными со многими различными промоторами, включая убиквитиновые, тканеспецифичные и регулируемые промоторы. Кроме того, аденовирусы могут быть введены путем внутривенной инъекции, поскольку вирусы являются устойчивыми в кровотоке.
Используя аденовирусные векторы, где части аденовирусного генома удалены, вставки внедряют в вирусную ДНК прямым лигированием или гомологичной рекомбинацией с плазмидой для котрансфекции. В иллюстративной системе важнейший ген Е1 удаляют из вирусного вектора, и вирус не будет реплицироваться пока ген Е1 не будет предоставлен клеткой-хозяином. При внутривенном введении интактным животным аденовирус сначала поражает печень. Хотя аденовирусная система доставки с делецией в гене Е1 не может реплицироваться в клетке-хозяине, ткани хозяина будут экспрессировать и подвергать процессингу кодируемый гетерологичный белок. Клетки хозяина будут также секретировать гетерологичный белок, если соответствующий ген включает в себя секреторную сигнальную последовательность. Секретированные белки будут поступать в кругооборот из ткани, которая экспрессирует гетерологичный ген (например, высоковаскулизированная печень).
Кроме того, аденовирусные векторы, содержащие различные делеции вирусных генов, могут быть использованы для снижения или элиминирования иммунного ответа на вектор. Такие аденовирусы содержат делецию в Е1 и, кроме того, содержат делеции Е2А или Е4 (Бикку е! а1., I. νίΐΌ1. 72:2022 (1998); Варег е! а1., Нитаи Сеие Тйегару 9:671 (1998)). Сообщалось также, что делеция Е2Ь понижает иммунный ответ (Ата1й!аио е! а1., I. νίΐΌ1. 72:926 (1998)). Делецией всего аденовирусного генома могут быть размещены очень крупные вставки гетерологичной ДНК. Получение так назывемых «бесхарактерных» аденовирусов, где все вирусные гены удалены, является особенно выгодным для инсерции крупных вставок гетерологичной ДНК (см., обзор УеН. аиб Ретлсаибе!, БА8ЕВ I. 11:615 (1997)).
Матричные растворы с высокими титрами рекомбинантных вирусов, обеспечивающих экспрессию терапевтического гена, могут быть получены из инфицированных клеток млекопитающих с использованием стандартных методов. Например, рекомбинантный вирус герпеса к1тр1ех может быть приготовлен в клетках Vе^а, как описано Вгаиб! е! а1., I. Сеи. №то1. 72:2043 (1991), Него1б е! а1., I. Сеи. №то1. 75:1211 (1994), νΐ^Ητ аиб Вгаиб!, V^^ο1οду 785:419 (1991), Стаи е! а1., ^ек!. Ор1!1а1то1. №к. 8а. 30:2474 (1989), Вгаиб! е! а1., I. νίΐΌ1. Ме!1. 36:209 (1992), и Вто^и аиб МасБеаи (ебк.), Н8Х; №ик Рго!осо1к (Нитаиа Ргекк 1997).
Альтернативно, экспрессионный вектор, содержащий ген ТАСБиммуноглобулин, может быть внедрен в клетки субъекта липофекцией 1и νί\Ό с использованием липосом. Искусственные катионные липиды могут быть использованы для получения липосом для трансфекции 1и νί\Ό геном, кодирующим маркер (Бе1диег е! а1., Ргос. №!'1 Асаб. 8а. И8А 84:7413 (1987); Маскеу е! а1., Ргос. Νη!'1 Асаб. 8а. И8А 85:8027 (1988)). Использование липофекции для внедрения экзогенных генов в специфические органы 1и νι\Ό имеет определенные практические преимущества. Липосомы могут быть использованы для прямой трансфекции отдельных типов клеток, которые являются особенно полезными в ткани с клеточной гетерогенностью, таких как ткани поджелудочной железы, печени, почек и мозга. Липиды могут быть химически связаны с другими молекулами с целью мечения. Пептиды-мишени (например, гормоны или нейротрансмиттеры), белки, такие как антитела, или непептидные молекулы могут быть присоединены к липосомам химическим путем.
Электропорация является другим альтернативным способом введения. Например, АШата аиб М1уахакк №1!иге Вю!ес1то1оду 76:867 (1998) демонстрировали использование электропорации 1и νί\Ό для переноса генов в мышцу.
Вообще, доза композиции, содержащей терапевтический вектор, имеющий нуклеотидную последовательность ТАСЬиммуноглобулина, например рекомбинантный вирус, будет варьировать в зависимо- 29 007275 сти от таких факторов, как возраст субъекта, вес, рост, пол, общее медицинское состояние и предыдущая история болезни. Пригодные пути введения терапевтических векторов включают внутривенную инъекцию, внутриартериальную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, внутриопухолевую инъекцию и инъекцию внутрь каверны, которая содержит опухоль. В качестве иллюстрации, Нойоп е! а1., Ргос. №11'1 Асаб. 8с1. И8А 96:1553 (1999), показал, что внутримышечная инъекция плазмидной ДНК, кодирующей интерферон-α, вызывает сильные противоопухолевые эффекты на первичные и метастазирующие опухоли в модельных экспериментах на мышах.
Композиция, содержащая вирусные векторы, не вирусные векторы или сочетание вирусных и не вирусных векторов настоящего изобретения могут быть приготовлены в соответствии с известными способами получения фармацевтически пригодных композиций, тем самым векторы или вирусы комбинируют в композицию с фармацевтически приемлемым носителем. Как отмечалось выше, композиция, такая как фосфатно-солевой буферный раствор, указывается, должна быть «фармацевтически приемлемым носителем», если ее введение может быть выдержано субъектом-реципиентом. Другие пригодные носители хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Яетшд!оп'к Рйагтасеибса1 8с1епсек, 19!й Еб. (Маск РиЬНкЫпд Со. 1995), и Сбтапк !йе Рйагтасо1од1са1 Вак1к оГ Тйегареибск, 7!й Еб. (МасМШап РиЬНкЫпд Со. 1985)).
В терапевтических целях экспрессионный вектор терапевтического гена или рекомбинантный вирус, содержащий такой вектор, и фармацевтически приемлемый носитель вводят субъекту в терапевтически эффективном количестве. Указывают, что комбинация экспрессионного вектора (или вируса) и фармацевтически приемлемого носителя должна быть введена в «терапевтически эффективном количестве», если вводимое количество является физиологически существенным. Агент является физиологически существенным, если его наличие дает в результате обнаруживаемое изменение в физиологии реципиентного субъекта. Например, агент, используемый для лечения воспаления, является физиологически существенным, если его наличие смягчает воспалительный ответ. В другом примере, агент, используемый для ингибирования роста клеток опухоли, является физиологически значимым, если введение агента приводит к уменьшению числа опухолевых клеток, уменьшению метастаз, уменьшению в размере твердой опухоли или усилению некроза опухоли.
Если субъектом, которого лечат экспрессионным вектором терапевтического гена или рекомбинантным вирусом, является человек, тогда терапией является предпочтительно генная терапия соматической клетки. Это означает, что предпочтительное лечение человека экспрессионным вектором терапевтического гена или рекомбинантным вирусом не влечет за собой внедрение внутрь клеток молекулы нуклеиновой кислоты, которая может образовывать часть зародышевой линии человека и быть передана следующим поколениям (т.е. исправление генетических дефектов методами генетической инженерии в зародышевой линии человека).
10. Получение трансгенных мышей
Трансгенные мыши могут быть созданы со сверхэкспрессируемыми последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими слитые белки ТАС1-иммуноглобулина во всех тканях, или под контролем тканеспецифичного или тканепредпочтительного регуляторного элемента. Это сверхпроизводство слитых белков ТАС1-иммуноглобулинов может быть использовано для отличия фенотипа, который получается в результате сверхэкспрессии, и трансгенные животные могут служить моделью для заболеваний человека, вызванных избытком рецепторного белка ТАС1. Трансгенные мыши, которые сверхэкспрессируют слитые белки ТАС1-иммуноглобулина, также предоставляют модель биореакторов по производству слитых белков ТАС1-иммуноглобулинов в молоке, или в крови высших животных. Способы получения трансгенных мышей являются хорошо известными специалистам в данной области (см., например, 1асоЬ, Ехргеккюп апб Кпоскои! оГ 1п!егГегопк ш Тгапкдешс Мюе, в Оуегехргеккюп апб Кпоскои! оГ Су!окшек т Тгапкдешс Мюе, 1асоЬ (еб.), стр. 111-124 (Асабетю Ргекк, Ь!б. 1994), Мопак!егкку апб ЯоЬ1 (ебк.), 8!га!ед1ек ш Тгапкдешс Ашта1 8аепсе (А8М Ргекк 1995) и АЬЬиб апб №1коп, ЯесотЬтап! Рго!ет Ехргеккюп ш Тгапкдешс Мюе, в Сепе Ехргеккюп 8ук!етк: Иктд №11иге Гог !йе Аг! оГ Ехргеккюп, Еегпапбех апб НоеГПег (ебк.), стр. 367-397 (Асабетю Ргекк, 1пс. 1999)).
Например, способ получения трансгенной мыши, которая экспрессирует нуклеотидную последовательность, которая кодирует слитый белок ТАС1-иммуноглобулина, может начинаться с взрослых, фертильных мужских особей (производителей) (В6С3Г1, в возрасте от 2 до 8 месяцев (Тасошс Еагтк Сегтап!о^п, ΝΥ)), самцов после вазектомии (поддельных) (В6Э2Г1, в возрасте от 2 до 8 месяцев (Тасошс Еагтк)), препубертатных фертильных самок (доноры) (В6С3Г1, от 4 до 5 недель (Тасошс Еагтк)) и взрослых фертильных самок (реципиентов) (В6Э2Г1, от 2 до 4 месяцев, (Тасошс Еагтк)). Доноров акклиматизируют в течение одной недели и затем инъецируют гонадотропином сыворотки жеребых кобыл в дозе приблизительно 8 МЕ/мышь (81дта Сйетюа1 Сотрапу; 8!. Ьошк, МО), внутрибрюшинно, и через 46-47 ч хорионическим гонадотропным гормоном человека в дозе 8 МЕ/мышь (йСС (Ддта)) внутрибрюшинно, для индуцирования суперовуляции. Доноров спаривали с производителями вслед за гормональными инъекциями. Овуляция вообще происходит в течение 13 ч инъекции йСС. Копуляцию подтверждают наличием вагинальной пробки утром после спаривания.
- 30 007275
Оплодотворенные яйцеклетки собирают под хирургическим микроскопом. Яйцеводы собирают и яйцеклетки выпускают на пластинки для анализа мочи, содержащие гиалуронидазу ЦЦта). Яйцеклетки промывают один раз в гиалуронидазе и дважды в среде Виттена (^Ыйеп'к ^640тебшт, описанной, например, Мешпо апб 0'С1агау, Вю1.Вергоб. 77:159 (1986), и О|еп11аг1 апб Οο\νπ5. 2удо!е 4:129 (1996)), яйцеклетки инкубировали с 5% С02, 5% 02 и 90% N при 37°С. Яйцеклетки затем хранят в инкубаторе при 37°С/5% С02 вплоть до микроинъекции.
От десяти до двадцати микрограмм плазмидной ДНК, содержащей кодирующую последовательность слитого белка ТАСЕиммуноглобулина, линеаризируют, очищают в геле и ресуспендируют в 10 мМ ТгЕ-НСЧ (рН 7,4), 0,25 мМ ЕОТА (рН 8,0) до конечной концентрации 5-10 нанограмм на микролитр для микроинъекции. Например, кодирующие последовательности слитого белка ТАСЕиммуноглобулина могут кодировать ТАСЕполипептид с делецией аминокислотных остатков с 1 до 29 и с 111 до 154 8ЕЦ ΙΌ N0:2 и фрагмент Ес5 иммуноглобулина.
Плазмидную ДНК микроинъецируют в собранные яйцеклетки, заключенные в каплю среды ^640, покрывают теплым, уравновешенным С02, минеральным маслом. ДНК втягивают внутрь инъекционной иглы (вытянутой из боросиликатного стеклянного капилляра с внутренним диаметром 0,75 мм, наружным диаметром 1 мм) и инъецируют внутрь отдельных яйцеклеток. Каждую яйцеклетку пронизывают инъекционной иглой внутрь одного или обоих гаплоидных пронуклеусов.
Пиколитры ДНК инъецируют внутрь пронуклеуса и инъекционную иглу удаляют без вступления в контакт с ядрышком. Процедуру повторяют до тех пор, пока все яйцеклетки будут инъецированы. Успешно микроинъецированные яйцеклетки переносят внутрь органной кюветы для клеточной культуры с предварительно газированной средой \У640 для хранения в течение ночи в инкубаторе при 37°С/5% С02.
На следующий день двухклеточные эмбрионы переносят внутрь псевдобеременных реципиентов. Реципиентов идентифицируют по наличию копуляционных пробок после копуляции с вазектомированными подделками. Реципиентов подвергают анестезированию и выбривают левую сторону спины, переносят под хирургический микроскоп. Делают небольшой надрез в коже и через мышечную стенку в середине брюшной области очерчивают реберную клетку, таз и заднюю ногу, шириной между коленом и селезенкой. Репродуктивные органы временно выводят на поверхность тела внутрь небольшой хирургической складки. Жировое тело протягивают над хирургической складкой и маломощным сосудистым зажимом (ЕоЬо/, ВоскуШе, ΜΌ) прикрепляют к жировому телу и оставляют, подвешивая над спинкой мыши, предохраняя органы от соскальзывания обратно внутрь.
Высококачественной пипеткой для переноса, содержащей минеральное масло, за которым следует чередование \У640 с воздушными пузырьками, 12-17 здоровых двухклеточных эмбрионов от инъецирования в предыдущий день, переносят внутрь реципиента. Разбухший пузырек помещают и прикрепляют яйцевод между пузырьком и сумкой, разрез в яйцеводе делают 28-граммовой иглой рядом с сумкой, будучи уверенными, что пузырек или сумка не повреждены.
Пипетку переносят в разрез в яйцеводе и выдувают эмбрионы внутрь, допуская первый воздушный пузырек до вытекания из пипетки. Жировое тело осторожно вдавливают внутрь брюшины и репродуктивным органам позволяют соскользнуть внутрь. Стенку брюшины закрывают одним швом и шкурку закрывают раневым зажимом. Мышей восстанавливают на плавном нагревателе при 37°С в течение минимум 4 ч.
Реципиентов возвращают в клетки парами и допускают 19-21-дневный период беременности. После рождения допускают 19-21-дневный послеродовой период перед отнятием от груди. У отнятых от груди детенышей определяют пол и помещают в отдельные клетки по половому признаку и производят биопсию, отрезают чистыми ножницами 0,5 см хвоста (для определения генотипа).
Геномную ДНК получают из хвостовых отрезков, с использованием, например, набора О^СЕН ОКЕАНУ, следуя инструкциям фирмы-производителя. Геномную ДНК анализируют методом ПЦР с использованием праймеров, сконструированных для амплификации последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих слитый белок ТАСЕиммуноглобулина или селективный маркерный ген, который был внедрен в ту же самую плазмиду. После подтверждения того, что животные должны быть трансгенными, их подвергают возвратному скрещиванию внутри инбредной линии, путем помещения трансгенных самок вместе с самцами дикого типа, или трансгенных самцов с одной или двумя (самкой) самками дикого типа. По мере того как детеныши рождаются и их отнимают от груди, их разделяют по полу и отрезают их хвостики для генотипического различия.
Для проверки экспрессии трансгена в живом животном производят частичную гепатэктомию. Хирургическое начало готовят в верхней части живота непосредственно под мечевидным отростком грудины. Используя стерильные приемы, делают небольшой 1,5-2 см надрез ниже грудины и временно выводят на поверхность левую латеральную долю печени. С использованием шелковой нити 4-0, обвязывают вокруг нижней доли, закрепляя ее с внешней стороны разреза тела. Атравматический зажим используют для фиксации банта, в то время как вторую петлю рассасывающегося дексона (Оехоп, Атепсап Суапат1б; ^аупе, N.1.) помещают на ближайшем расстоянии к первому узлу. Дистальный надрез делают от дексонового узла и приблизительно 100 мг отсеченной ткани печени помещают в стерильную чашку Петри. Отсеченный сегмент печени переносят в 14-и миллилитровую пропиленовую круглодонную про
- 31 007275 бирку и кусочек замораживают в жидком азоте и затем хранят в сухом льду. Хирургический участок закрывают наложением швов и раневых скрепок и клетки животных после операции помещают на подушку с подогревом на 37°С в течение 24 ч. В послеоперационный период животных проверяют ежедневно и раневые скрепки удаляют через 7-10 дней после операции. Уровень экспрессии мРНК слитого белка ТАС1-иммуноглобулина проверяют для каждой трансгенной мыши с использованием метода РНКгибридизации в растворе или полимеразной цепной реакции.
Используя общие подходы, описанные выше, получили трансгенных мышей, которые экспрессируют существенные уровни слитого белка ТАС1-иммуноглобулина в молоке. В этом конкретном случае, кодирующая последовательность слитого белка ТАС1-иммуноглобулина кодировала полипептид ТАС1 с делецией аминокислотных остатков с 1 по 29 и с 111 по 154 8ЕО ΙΌ N0:2 и иммуноглобулиновый Ес5фрагмент.
Таким образом, настоящее изобретение вообще описывает, как будет понятно более легко из ссылок на следующие примеры, которые предоставляют в качестве иллюстрации и которые не предназначены ограничивать настоящее изобретение.
Пример 1. Конструирование молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют белки ТАСЧ-Ес.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие ТАСЧ человека, получали во время экспрессионного клонирования рецепторов ΖТNΕ4, как описано Сгокк еί а1., №Щ.1ге 404:995 (2000). Кодирующие последовательности, содержащие в себе экспрессионные конструкции ТАСЧ-Ес, создавали методом ПЦР с перекрытием, с использованием стандартных методов (см., например, Нойоп еί а1., Сепе 77:61 (1989)). кДНК ТАСЧ человека и кДНК Ес использовали в качестве стартовых матриц для ПЦР-амплификации. ПЦРпраймеры сконструировали для получения желаемой кодирующей последовательности на 5' и 3'-концах и для внедрения сайтов узнавания ферментами рестрикции для облегчения встраивания этих кодирующих последовательностей в экспрессионные векторы. Кодирующие последовательности ТАСЧ-Ес встраивали внутрь экспрессионных векторов, которые содержали в себе функциональный ген дигидрофолатредуктазы мыши. Один экспрессионный вектор также содержал цитомегаловирусный промотор для направления экспрессии трансгенного рекомбинантного белка, иммуноглобулиновый интрон, сигнальную последовательность тканевого плазминогенного активатора, последовательность, определяющую место входа внутрь рибосом, удаленный цистрон СЭ8 для отбора зараженных клеток на поверхности и дрожжевые экспрессионные элементы для роста плазмид в дрожжевых клетках.
Один подход, который использовали для получения слитых белков ТАСЧ-Ес иммуноглобулин, иллюстрируют способом, используемым для конструирования ТАСГ-ГсГ Другие слитые белки ТАСЧ-Ес получали инсерцией нуклеотидных последовательностей, которые кодируют слитый белок ТАСЧ-Ес иммуноглобулин, в экспрессионный вектор млекопитающих и внедрении этого экспрессионного вектора в клетки млекопитающих.
А. Конструирование фрагмента Ес4 Ι§γ 1
Для приготовления слитого белка ТАСТ-Ес4 модифицировали Ес-фрагмент !цС1 человека (шарнирный участок доменов СН2 и СН3) для удаления связывающих функций Есγ1 с рецептором (Ес/КЧ) и с комплементом (СЧс.|). Этот модифицированный вариант Ес !цС1 человека обозначили «Ес4».
Ес-фрагмент изолировали из ПЦР-библиотеки печени человеческих эмбрионов (С1оиксЬ) с использованием олигопраймеров 5' АТСАССССАА ТТСАСАТСТТ САСАСААААС ТСАСАСАТСС ССАС 3' (8ЕС) ΙΌ N0:7) и 5' СССАСТСТСТ АСАТСАТТТА СССССАСАСА СССАС 3' (8ЕС) ΙΌ N0:8). Мутации внутрь Ес-фрагмента вводили методом ПЦР для уменьшения связывания ΡογΕ!. Связывающий сайт ЕсγК1 (Ьеи-Ееи-С1у-С1у; аминокислотные остатки с 38 по 41 8Е0 ΙΌ N0:6, что соответствует положениям с 234 по 237 по индексации Европейского сообщества) видоизменили на А1а-С1и-С1у-А1а для уменьшения связывания ЕсγК1 (см., например, Эинсан еί а1., №Щ.1ге 332:563 (1988); Вайт еί а1., ЕМВ0 Ч. 73:3992 (1994)). Олигонуклеотидные праймеры 5' СССТССССАС САССТСААСС ССАССССССА СССТСАСТСТ ТССТСТТССС С А'(НЕС) ΙΌ N0:9) и 5' ССАТТСТАСА ТТАТТТАССС ССАСАСАССС А 3' (8Е0 ΙΌ N0:10) использовали для внедрения изменений. К 50 мкл конечного объема добавляли 570 нг матрицы [цЕс, 5 мкл 10-кратного буфера для реакции Р£ц (8й^адепе), 8 мкл 1,25 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (бКТРк) 31 мкл дистиллированной воды, 2 мкл 20 мМ олигонуклеотидных праймеров. Добавляли равный объем минерального масла и реакционную смесь нагревали до 94°С в течение 1 мин. Добавляли Р£ц-полимеразу (2,5 единиц, 8й^адепе), после чего следуют 25 циклов при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с, 72°С в течение 1 мин, с последующим удлинением в течение 7 мин при 72°С. Продукты реакции фракционировали методом электрофореза, и обнаруживали полосу, соответствующую прогнозированному размеру около 676 пар нуклеотидов. Эту полосу вырезали из геля и ДНК выделяли с использованием набора ^IАСЕN 0ΙАцшскТМ Се1 Ехйасйоп Κίί (О|ацен) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.
ПЦР также использовали для введения замены А1а на 8ег (аминокислотный остаток 134 8Е0 ΙΌ N0:6, который соответствует положению 330 по индексации Европейского сообщества) и Рго на 8ег (аминокислотный остаток 135 8Е0 ΙΌ N0:6, который соответствует положению 331 по индексации Европейского сообщества) для уменьшения связывания комплемента СЧс.| или фиксирования комплемента
- 32 007275 (Эппсам апб ^ш!ег, №щ.1ге 332:788 (1988)). Два первых цикла реакции выполняли с использованием в качестве матрицы, измененной в результате побочной мутации последовательности 1дЕс, связывающую ЕсуВ1. К 50 мкл конечного объема добавляли 1 мкл измененной матрицы 1дЕс, связвающего сайта ЕсуВ1, 5 мкл 10-кратного буфера для реакции РГи (81га!адепе), 8 мкл 1,25 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (бКТРк), 31 мкл дистиллированной воды, 2 мкл 20 мМ 5’ ССТССССССТ СССАСАТССС ТССТСТСССА ССССАСАТСТ ТСАСАСАААА СТСАС 3' (8ΕΕ) ГО N0:11), 5'-начало праймера с нуклеотида 36 8ΕΕ) ГО N0:5, и 2 мкл 20 мМ 5 ТСССАССССТ ТТСТТССА 3' (8ΕΕ) ГО N0:12), 3'-начало праймера с комплементарного нуклеотида 405 8Ε0 ГО N0:5. Вторая реакционная смесь содержала по 2 мкл каждого из 20 мМ матричных олигонуклеотидных примеров 5’ ТССААСАААС СССТСССАТС СТССАТССАС ААААССАТС1 СС 3' (8Ε0 ГО N0:13), 5'-начало праймера с нуклеотида 388 8Ε0 ГО N0:5 и 5’ ССАТССАТСС АТСААССАСС ТСТССТТСТТ ССТССТССТС СТССССССТС ССАСАТС 3' (8Ε0 ГО N0:14), 3'-праймер для внедрения мутации А1а на 8ег, ХЬа1 сайт рестрикции и стоп-кодон. Добавляли равный объем минерального масла и реакционную смесь нагревали до 94°С в течение 1 мин. Добавляли РГи-полимеразу (2,5 единиц, 8!га!адепе), после чего следуют 25 циклов при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с, 72°С в течение 2 мин, с последующим удлинением в течение 7 мин при 72°С. Продукты реакции фракционировали методом электрофореза и обнаруживали полосы, соответствующие прогнозированным размерам около 370 и около 395 пар нуклеотидов соответственно. Полосы вырезали из геля и экстрагировали с использованием набора ^IАСΕN С1АдшскТМ Се1 Εx!^асΐ^оη К1! (01адеп) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.
Второй цикл реакции проводили для соединения вышеуказанных фрагментов и добавления сайта рестрикции 5' ВатН1 и сигнальной последовательности вариабельного домена тяжелой цепи 2'Сь иммуноглобулина человека !ВЬ (Содпе е! а1., Ειιγ. 1. 1ттипо1. 78:1485 (1988)). К 50 мкл конечного объема добавляли 30 мкл дистиллированной воды, 8 мкл 1,25 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (бКТРк), 5 мкл 10-кратного полимеразного реакционного буфера-РГи (8!га!адепе) и по 1 мкл каждого из двух первых двух продуктов ПЦР. Добавляли равный объем минерального масла и реакционную смесь нагревали до 94°С в течение 1 мин. Добавляли РГи-полимеразу (2,5 единиц, 8!га!адепе), после чего следуют 5 циклов при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 2 мин. Температуру опять поднимали до 94°С и добавляли по 2 мкл каждого из 20 мМ матричных растворов 5' ССАТССАТСС АТСААССАСС ТСТССТТСТТ ССТССТССТС СТССССССТС ССАСАТС 3’(8ΕΟ ΙΌ N0:14), 5'- начало праймера с нуклеотида 1 8ΕΕ) ГО N0: 5, и 5' ССАТТСТАСА ТТАТТТАССС ССАСАСАССС А 3' (8ΕΕ) ГО N0:10) с последующими 25 циклами при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с, 72°С в течение 2 мин и в конце с удлинением в течение 7 мин при 72°С. Продукты реакции обнаруживали с использованием гельэлектрофореза. Обнаружили полосу, соответствующую прогнозированному размеру в 789 пар нуклеотидов.
В. Конструирование экспрессионного вектора ТАС1-Ес4
Экспрессионные плазмиды, содержащие кодирующую область слитого белка ТАС1-Ес4, конструировали с помощью гомологичной рекомбинации в дрожжах. Фрагмент кДНК ТАС1, который включал полинуклеотидную последовательность с 14 нуклеотида по 475 нуклеотид 8Ε0 ГО N0:1, изолировали с использованием ПЦР. Обоими праймерами, используемыми в наработке фрагмента ТАС1, были: (1) праймер, содержащий в себе 40 пар оснований 5'-векторной фланкирующей последовательности, и 17 пар оснований, соответствующих амино-концу фрагмента ТАС1 (5’СТСАСССАСС АААТССАТСС ССАСТТСАСА СССТТСССТА СААТСАСТСС ССТСССССС 3’; 8ΕΕ) ГО N0:15; (2) 40 пар оснований 3'-конца, соответствующих фланкирующей последовательности Ес4, и 17 пар оснований, соответствующих карбоксильному концу фрагмента ТАС1 (5' ССАТСТСТСА СТТТТСТСТС ААСАТСТССС СТССТТСАСС ССССССАС 3'; 8Ε0 ГО N0:16). К 100 мкл конечного объема добавляли 10 нг матрицы ТАС1, 10 мкл 10-кратного буфера для Тад-полимеразы (10х Тад ρо1уте^аке Веас!юп ВиГГег, Регкш Ε1те^), 8мкл 2,5нМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (бNΤРк), 78 мкл дистиллированной воды, по 2 мкл каждого из 20 мМ матричных растворов олигонуклеотидных праймеров и Тад-полимеразу (2,5 единиц, ЫГе Тес1по1оду). Добавляли равный объем минерального масла и реакционную смесь нагревали до 94°С в течение 2 мин, с последующими 25 циклами при 94°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 72°С в течение 1 мин, с последующим удлинением в течение 5 мин при 72°С.
Фрагмент, содержащий кДНК, кодирующую фрагмент Ес4, конструировали сходным образом. Обоими праймерами, использованными для получения фрагмента Ес4 (против хода и по ходу транскрипции), были олигонуклеотидные праймеры, содержащие в себе 40 пар оснований 5'ТАС1-фланкирующей последовательности и 17 пар оснований, соответствующих амино-концу фрагмента Ес4 (5' ССАСАСАССС ТСАСААССАА СТССАССТСТ ССССССССТС ААССАССССА САТСТТСАСА 3’; 8ΕΕ) ГО N0:17; и олигонуклеотидный праймер, содержащий в себе 40 пар оснований на 3'-конце, соответствующие фланкирующей векторной последовательности, и 17 пар оснований, соответствующих карбоксильному концу фрагмента Ес4 (5' ССССТСССТА СААССССАСА ССТСТТТТАА ТСТАСАТТАТ ТТАСССССАС АСАССС 3'; 8Ε0 ГО N0:18). К 100 мкл конечного объема добавляли 10 нг матрицы Ес4, описанной выше, 10 мкл 10-кратного буфера для Тад-полимеразы (10х Тад ρо1уте^аке Веас!юп ВиГГег,Регкш Ε1те^), 8мкл 2,5нМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (бЭТРк), 78 мкл дистиллированной
- 33 007275 воды, по 2 мкл каждого из 20 мМ матричных растворов олигонуклеотидов и Тас.|-полимеразу (2,5 единиц, Ы£е Тесйпо1оду). Добавляли равный объем минерального масла и реакционную смесь нагревали до 94°С в течение 2 мин с последующими 25 циклами при 94°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 72°С в течение 1 мин, с последующим удлинением в течение 5 мин при 72°С.
По 10 мкл из каждой из 100 мкл реакционных смесей ПЦР, описанных выше, прогоняли в 0,8% ЬМР-агарозном геле (8еар1адие) с 1-кратным буфером ТВЕ для анализа. Оставшиеся 90 мкл реакционной смеси ПЦР осаждали добавлением 5 мкл 1М хлорида натрия и 250 мкл абсолютного этанола. Плазмиду рΖΜΡ6 расщепляли 8та! для линеаризации ее в полилинкере. Плазмиду рΖΜΡ6 получали из рСΖК199 (Атепсап Туре СиЙиге СоНесНоп, Мапаккак, УА, АТСС#98668) и она представляет собой экспрессионный вектор, содержащий экспрессионную кассету, имеющую предранний промотор цитомегаловируса, общий типичный интрон локуса вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, множественные сайты рестрикции для внедрения кодирующих последовательностей, стоп-кодон и терминатор гормона роста человека. Плазмида также имеет точку начала репликации Е.сой, экспрессионную единицу селективного маркера млекопитающих, имеющую промотор 8У40, энхансер и точку начала репликации, ген дигидрофолатредуктазы и терминатор 8У40. Вектор рΖΜΡ6 конструировали из рСΖК199 замещением металлотионеинового промотора на цитомегаловирусный предранний промотор и последовательность Кохас на 5'-конце открытой рамки считывания.
100 мкл компетентных дрожжевых клеток (8.сегеу1к1ае) смешивали с 10 мкл, содержащими приблизительно 1 мкг внеклеточного домена ТАС! и ПЦР-фрагменты Ес4, и со 100 нг вектора рΖΜΡ6, переваренного 8та1, и переносили в 0,2 сантиметровую кювету для электропорации. Смеси дрожжи/ДНК подвергали электропульсации при 0,75 кВ (5 кВ/см), да Ом, 25 мкФ. В каждую кювету добавляли 600 мкл 1,2 М сорбита и две аликвоты дрожжей по 300 мкл распределяли в двух чашках с ИКА-Э и инкубировали при 30°С.
После приблизительно 48 ч дрожжевые трансформанты Ига+ из одной чашки ресуспендировали в 1 мл воды и короткое время центрифугировали для получения осадка дрожжевых клеток. Клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл лизисного буфера (2% Тгйоп Х-100, 1% додецилсульфат натрия (8Ό8), 100 мМ №С1, 10 мМ Тпк, рН 8,0, 1мМ ЭДТА). 500 мкл смеси для лизиса добавляли в пробирки Эппендорф, содержащие 300 мкл отмытых кислотой стеклянных шариков, и 200 мкл смеси фенол-хлороформ, дрожжевые клетки разрушали в вортексе в течение 1 мин с интервалами, два или три раза с последующим центрифугировнием в течение 5 мин в центрифуге Эппендорф на максимальных оборотах. Триста микролитров водной фазы переносили в чистую пробирку и ДНК осаждали 600 мкл этанола с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 4°С. Осадок ДНК ресуспендировали в 100 мкл воды.
Трансформацию электрокомпетентных клеток Е.сой (ΌΗ10Β, ШЬсоВКЕ) осуществляли с использованием 0,5-2 мл начальной ДНК дрожжей и 40 мкл клеток ОН10В. Клетки подвергали электропульсации при 2,0 кВ 25 мФ и 400 Ом. Вслед за электропорацией, 1 мл 80С (2% Вас1о-Тгур1опе (Ойсо, Пе1гой, М1), 0,5% дрожжевой экстракт (Эйсо), 10 мМ №С1, 2,5 мМ КС1, 10мМ МдС12, 10 мМ Мд804, 20 мМ глюкоза) вносили в аликвотных объемах по 250 мкл в четыре чашки, содержащие ЬВ АМР (ЬВ Ьго1Н (Ьеппох), 1,8% Вас1о-Адаг (Ойсо), 100 мг/л ампициллина).
Индивидуальные клоны, скрывающие правильную экспрессионную конструкцию ТАС[-Ес4, идентифицировали рестрикционным перевариванием для подтверждения наличия инсерции и для подтверждения, что различные последовательности ДНК правильно соединились одни с другими. Вставки позитивных клонов подвергали анализу последовательностей. Крупные плазмидные ДНК выделяли с использованием набора Ц1адеп Мах1 кй (Ц1адеп) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.
С. Конструирование Ес5, Ес6 и Ес7
В Ес5 остаток Агд 218 по индексной позиции Европейского сообщества, заменили обратно на остаток Ьук. γ1 дикого типа человека содержит лизин в этом положении. Кратко, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие Ес5, получали с использованием олигонуклеотидных праймеров 5' САССССА ААТСТТСА6АСААААСТСАСАСАТ6СССА 3'(8ЕЦ И) N0:19) и 5' ТААТТ66С6С6ССТСТА6АТТАТТТАССС66А6АСА 3'(8ЕЦ ΙΩ N0:20). Условия ПЦР-амплификации были следующими. К 50 мкл конечного объема добавляли 236 нг матрицы Ес4, 5 мкл 10-кратного буфера для реакции Р£ц (81га1адепе), 4 мкл 2,5 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (йКТРк), по 1 мкл 20 мкМ каждого олигонуклеотида и 1 мкл Р£ц-полимеразы (2,5 единиц, 81га1адепе). Температурный профиль амплификации состоял из: 94°С в течение 2 мин, 5 циклов при 94°С в течение 15 с, 42°С в течение 20 с, 72°С в течение 45 с, 20 циклов при 94°С в течение 15 с, 72°С в течение 1 мин 20 с, с последующим удлинением в течение 7 мин при 72°С. Продукты реакции фракционировали методом электрофореза в агарозном геле, и обнаружили полосу, соответствующую прогнозированнному размеру около 718 пар нуклеотидов. Полосу вырезали из геля и восстанавливали с использованием набора ^IΛСЕN Ц^дикИМ Се1 Ехйасйоп Кй (Ц1адеп) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.
Ес6 является идентичным Ес5 за исключением того, что карбоксиконцевой лизиновый кодон удалили. Как у Ес4 и Ес5, как указано выше, стоп-кодон в последовательности Ес6 изменили на ТАА. Ес6 получали из ДНК-матрицы, которая кодирует Ес5 с использованием праймеров 5' 6А6СССАААТ
- 34 007275
СТТСАОАСАА ААСТСАСАСА ТОСССА 3'(8Ер ΙΌ N0:19) и 5' ООСОСОССТС ТАОАТТААСС СООАОАСАОО ОАОАООС 3' (8Ер ΙΌ N0:21).
Ес7 является идентичным Ес γ1 дикого типа за исключением замещения аминокислоты Акп в 297 положении по индексации Европейского сообщества, локализованной в СН2-домене. Акп 297 заменили на остаток О1п для предотвращения присоединения концевого углевода в этом положении остатка. Как сказано выше, стоп-кодон в последовательности Ес7 заменили на ТАА. Ес7 получили перекрыванием ПЦР, с использованием кДНК Ес 1дОг/1 дикого типа человека в качестве матрицы и олигонуклеотидных праймеров 5' ОАОСССАААТСТТОСОАСААААСТСАСА 3' (8Ер ΙΌ N0:22) и 5' ОТАСОТОСТ ТТООТАСТОСТССТСССОСООСТТ 3' (8ЕР ΙΌ N0:23) для 5'-участка Ес7 и олигонуклеотидных праймеров 5' САОТАССАААОСАСОТАССОТОТООТСА 3' (8Ер ΙΌ N0:24) и 5' ТААТТООСОСОССТСТАОАТТАТТТАСССООАОАСА 3' (8Ер ΙΌ N0:20) для создания 3'-участка Ес7. Два ПЦР-продукта объединяли и амплифицировали с использованием олигонуклеоидных праймеров 5' ОАОСССААА ТСТТОСОАСААААСТСАСА 3' (8Ер ΙΌ N0:22) и 5' ТААТТООСОСОССТСТАОАТТАТТТАСССООАОАСА 3' (8ЕР ΙΌ N0:20).
Все получающиеся в результате ПЦР продукты очищали в геле, клонировали и подтверждали анализом последовательности ДНК.
Ό. Конструирование амино-укороченных слитых белков ТАС1-Ес
Создали четыре аминоконцевых укороченных варианта ТАС1-Ес. Все четыре имели модифицированную сигнальную последовательность (8Ер ΙΌ N0:25) активатора плазминогена тканей человека слитую с аминокислотным остатком номер 30 8Ер ΙΌ N0:2. Однако, четыре белка, отличающиеся по положению точки, в которой Ес5 был слит с аминокислотной последовательностью ТАС1 8Ер ΙΌ N0:2. Табл. 3 обрисовывает структуры четырех слитых белков.
Таблица 3. Слитые белки ТАС1
Наименование ТАСЬЕс Аминокислотные остатки ТАС1
ТАС1(с11-29)-Ес5 с 30 по 154 δΕΟ Ю N0:2
ТАС1(01-29,с1107-154)-Ес5 с 30 по 106 ЗЕО Ю N0:2
ТАС1(с11-29,с1111-154)-Ес5 с 30 по 110 ЗЕО Ю N0:2
Т АС I (ό 1 -2 9, ό 120-154)- Ес5 с 30 по 119 5Е0 Ю N0:2
Экспрессионные кассеты, кодирующие белки, создали методом перекрывания ПЦР с использованием стандартных методов (см., например, Ног1оп е! а1., Оепе 77:61 (1989)). Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую ТАС1, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую Ес5, использовали в качестве матриц ПЦР. Олигонуклеотидные праймеры идентифицированы в табл. 4 и 5.
Таблица 4. Олигонуклеотидные праймеры, использованные для получения слитых белков ТАС1
Наименование ТАСЬЕс Наименование олигонуклеотидов
5’ТАС1 З’ТАС! 5’Ес5 3’Ес5
ТАС1(с11-29)-Ес5 Ζ024.903 ΖΟ24,955 ΖΟ24.952 ΖΟ24.946
ТАС1(с11-29,с1107-154)-Ес5 Ζ024,903 Ζ024,951 Ζ024,949 Ζ024.946
ТАС1(с11-29,0111-154)-Ес5 Ζ024,903 ΖΟ28,978 ΖΟ28,979 Ζ024,946
ТАС1(с11-29,с1120-154)-Ес5 Ζ024,903 ΖΟ28,981 Ζ028,980 ΖΟ24.946
Таблица 5. Олигонуклеотидные последовательности
- 35 007275
Праймер Нуклеотидная последовательность 8ЕО Ю ΝΟ
Ζϋ24,903 5 ТАТТАССССССССАССАТеСАТССААТСА 3' 40
ΖΟ24,955 5 ТСААСАТТТССССТССТТСАСАССТССЗСА 3' 41
ΖΟ24.952 5' ТСССАСОТСТСААССАССССАААТСТТСА 3 42
Ζϋ24,946 5ТААТТССССССССТСТАСАТТАТТТАСССССАСАСА 3 20
ΖΟ24,951 5’ ТСААСАТТТССССТССТТСТСАСАСААСТА 3 43
ΖΟ24,949 5’ АТАСТТСТСТСАСААССАССССАААТСТТСА 3 44
Ζϋ28:978 5’ ТТТСО6СТСССТССТСАССТТОТТСТСАСА 3' 45
ΖΟ28,979 5 СТСАССАСССАОСССАААТСТТСАСАСА 3 46
ΖΟ28,981 5 ТТТСЗССТСССТСАССТСТССТС36АА 3 47
Ζ028,980 5 (ЗАОСТСАСССАССССАААТСТТСАСАСА 3 48
Первый цикл амплификации с использованием ПЦР состоит из двух реакций для каждого из четырех аминоконцевых укороченных вариантов. Две реакции выполняли отдельно с использованием в одной реакции 5' и 3' олигонуклеотидов ТАСЯ и 5' и 3' олигонуклеотидов Ес5 в другой реакции для каждого варианта. Условия первого цикла ПЦР-амплификации были следующими. К 25 мкл конечного объема добавляли приблизительно 200 нг ДНК-матрицы, 2,5 мкл 10-кратного буфера для реакции РГи (8!га!адепе), 2мкл 2,5 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (бNΤРк), по 0,5 мкл 20 мкМ каждого 5' олигонуклеотида и 3' олигонуклеотида и 0,5мкл РГи-полимеразы (2,5 единиц, 8!га!адепе). Температурный профиль амплификации состоял из: 94°С в течение 3 мин, 35 циклов при 94°С в течение 15 с, 50°С в течение 15 с, 72°С в течение 2 мин, с последующим удлинением в течение 2 мин при 72°С. Продукты реакции фракционировали методом электрофореза в агарозном геле и полосы, соответствующие прогнозированным размерам, вырезали из геля и восстанавливали с использованием набора ^IАСЕN ^IА^υIСК Се1 Ех!гас!юп К1! (()1адеп) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.
Второй цикл ПЦР-амплификации, или ПЦР-амплификация реакций с перекрытием, выполняли с использованием фрагментов, очищенных в геле, после первого цикла ПЦР в качестве ДНК-матрицы. Условия второго цикла ПЦР-амплификации были следующими. К 25 мкл конечного объема добавляли приблизительно 10 нг ДНК-матрицы каждого из фрагментов ТАСЯ и фрагментов Ес5, 2,5 мкл 10-кратного буфера для реакции РГи (8!га!адепе), 2мкл 2,5 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (бОТРк), 0,5 мкл 20 мкМ каждого ΖΟ24,903 (8Е^ ΙΌ N0:40) и ΖΟ24,946 (8Е^ ΙΌ N0:20) и 0,5мкл РГи-полимеразы (2,5 единиц, 8!га!адепе). Температурный профиль амплификации состоял из: 94°С в течение 1 мин, 35 циклов при 94°С в течение 15 с, 55°С в течение 15 с, 72°С в течение 2 мин, с последующим удлинением в течение 2 мин при 72°С. Продукты реакции фракционировали методом электрофореза в агарозном геле, и полосы, соответствующие прогнозированным размерам, вырезали из геля и восстанавливали с использованием набора ^IАСЕN ^IА^υIСК Се1 Ех!гас!юп К1! (()1адеп) в соответствии с рекомендациями фирмыпроизводителя.
Каждый из четырех вариантов ПЦР-продуктов ТАСПЕс с укороченным аминоконцом отдельно клонировали с использованием набора ^йгодеп'к ΖЕВΟВ^υNΤ Т0Р0 РСВ С1ошпд Кй, следуя рекомендательному протоколу фирмы-изготовителя. Таблица 6 идентифицирует нуклеотидные и аминокислотные последовательности конструкций ТАСПЕс.
Таблица 6. Последовательности вариантов ТАСПЕс
Наименование ТАСВЕс Номера 8ЕО Ю
Нуклеотиды Аминокислоты
ТАС1(й1-29)-Ес5 49 50
ТАС1(с11-29,с1107-154)-Ес5 51 52
ТАС1(с11-29,с1111-154)-Ес5 53 54
ТАС1(с11-29,с1120-154)-Ес5 55 56
После проверки нуклеотидных последовательностей, плазмиды, содержащие каждый из четырех вариантов, слитые ТАСПЕс с укороченными аминоконцами, переваривали Еке1 и Акс1 для высвобождения амнокислотных кодирующих участков. Фрагменты Еке1-Акс1 лигировали внутрь экспрессионного вектора млекопитающих, содержащего промотор СМУ и поли-А участок 8У40. Экспрессионные векторы встраивали в клетки яичника китайского хомячка как описано ниже.
Пример 2. Производство белков ТАСПЕс клетками яичника китайского хомячка.
- 36 007275
Экспрессионные конструкции ТАСВРс использовали для трансфекции, посредством электропорации, суспензионно-адаптированных клеток яичников китайского хомячка (СНО) Ό044, выращенных в среде для клеток животных, не содержащих белки (Иг1аиЬ е! а1., Бот. Се11. Мо1ес. Сепе!. 72:555 (1986)). В клетках СНО ЭС44 отсутствует функциональный ген дигидрофолатредуктазы вследствие делеций в обоих местах дигидрофолатредуктазы в хромосомах. Рост клеток в присутствии возрастающих концентраций метотрексата дает в результате амплификацию гена дигидрофолатредуктазы и связанный ген, кодирующий рекомбинантный белок, работающий в экспрессионной конструкции.
Клетки СНО ЭС44 переносили на среду РРСН0 (ЖН Вюкшепсек, Ьепеха, КБ) с добавлением 4 мМ Ь-глутамина (ЖН Вюкаепсек) и 1х гипотанаксинтимидин (Ь1Ге Тес11по1ощек) и клетки инкубировали при 37°С и 5% С02 в качалочных колбах Согшпд при 120 об./мин на ротационно-встряхивающей платформе. Клетки раздельно подвергали трансфекции линеаризированными экспрессионными плазмидами. Для обеспечения стерильности однократное осаждение этанолом проводили на льду в течение 25 мин соединением 200 мкг плазмидной ДНК в пробирке Эппендорф с 20 мкл изолированной спермы лосося, несущей ДНК (5' 3' 1пс.Вои16ег, СО, 10 мг/мл), 22 мкл 3М №0Ас (рН 5,2) и 484 мкл 100% этанола (Со16 Б1не16 С1ет1са1 Со., Нау^агб, СА). После инкубации пробирку центрифугировали при 14 000 об/мин в микроцентрифуге, помещенной в холодную комнату при 4°С, супернатант удаляли, а осадок промывали дважды 0,5 мл 70% этанола и высушивали на воздухе.
В то время как осадок ДНК подсыхал, готовили клетки СНО ЭС44 центрифугированием 106 суммарных клеток (16,5 мл) в 25 мл конических центрифужных пробирках при 900 об./мин в течение 5 мин. Клетки СНО ЭС44 ресуспендировали в суммарном объеме 300 мкл ростовой среды РРСН0 и помещали в кювету Сепе-Ри1кег СитеИе с 0,4 см электродной щелью (ВюЖаб). После приблизительно 50 мин времени подсыхания ДНК ресуспендировали в 500 мкл ростовой среды РРСН0 и добавляли к клеткам в кювету так, что суммарный объем не превышал 800 мкл, и позволяли находиться при комнатной температуре в течение 5 мин для уменьшения образования пузырьков. Кювету помещали в аппарат ВюЯаб Сепе Ри1кег ΙΙ при 0,296 кВ (киловольт) и 0,950 высокой емкости и немедленно подвергали электропорации.
Клетки инкубировали 5 мин при комнатной температуре перед помещением в суммарный объем 20 мл среды РРСН0 в колбе СоБ1аг Т-75. Колбу помещали при 37°С и 5% С02 в течение 48 ч, затем клетки подсчитывали с использованием гемоцитометра, использующего высвобождение трипанового синего, и помещали в селекционную среду РРСН0 без добавки гипотанаксинтимидина и содержащую 200 мМ метотрексата (Са1Вюсйет).
После восстановления процесса селекции с метотрексатом приспособленную среду, содержащую секретированные белки ТАСВРс, проверяли анализом \Уек1егп В1о!
Пример 3. Структурный анализ белков ТАСВРс.
В определенных случаях слитые белки ТАСВРс частично очищали перед анализом. Кондиционированную среду из-под культуры клеток яичника китайского хомячка стерилизовали фильтрацией через 0,22мкм фильтр и белок ТАСВРс наносили на колонку с протеином А. Материал, связавшийся с протеином А, элюировали и пропускали через гель-фильтрационную колонку Б-200 для конечной очистки.
\Уек1егп В1оВанализ проводили как с кондиционированной клеточной средой, так и с очищенным белком для оценки структурной стабильности белков ТАСВРс. Кратко, образцы белка или супернатанта переносили на нитроцеллюлозные мембраны и детектировали белки ТАСВРс с использованием козьих антимышиных ΙβΟΣη, конъюгированных с пероксидазой (ВоеЬппдег МаплЬем), или с использованием козьих антител, связанных с пероксидазой, против специфической Ι§0 Рс антисыворотки человека (Р1егсе).
Анализы аминоконцевых аминокислотных последовательностей проводили с использванием системы для сиквенса белков Мо6е1к 476А и 494 Рго1ет Бесщепсег Бук!етк, Регкт Е1тег АррНеб Вюкук1етк ОМкюп (Рок1ег Сйу, СА). Результаты анализа обрабатывали с помощью Аррйеб Вюкук1етк Мо6е1 610А Эа1а Апа1ук1к Бук1ет Гог Рго1ет Бедиепсшд, уегкюп 2.1а (Аррйеб Вюкуйетк, Жс). Большая часть использованных приспособлений и реактивов была от АррНеб Вюкуйетк, Жс.
Пример 4. Функциональный анализ белков ТАСВРс.
Для оценки характеристик связывания четырех белков ТАСВРс с ΖТNΕ4 использовали два подхода. Первым подходом измеряли способность конструкций ТАСВРс к конкуренции на чашках, покрытых ТАО за связывание ΖТNΕ4, меченого 125Ι. Во втором подходе инкубировали возрастающие концентрации ΖТNΕ4, меченого 125Ι, с каждой из конструкций ТАСВРс и определяли радиоактивность, связанную с осажденными комплексами ΖТNΕ4-ТАСI-Рс. Слитые белки ТАСВРс имели фрагменты ТАСЕ которые не содержали 29 первых аминокислотных остатков аминокислотной последовательности БЕр ΙΌ N0:2. Один из слитых белков имел фрагмент ТАО с интактной стволовой областью (ТАСДЛ^)-?^), тогда как три из слитых белков ТАСВРс имели фрагменты с различными делециями в стволовой области (1^^-29,6107-154)^(^ ТАа(61-29,61 11-154)-Рс5; ТАа(61-29,6120-154)-Рс5).
А. Конкурентный анализ связывания
ΖТNΕ4 йодировали радиоактивным йодом с использованием 1о6оЬеа6к (Р1егсе), следуя стандартным способам. Кратко, 50 мкг ΖΊ^ΕΕΙ йодировали 4 мКи 125Ι с использованием одноразовых шариков 1о6оЬеа6. Реакционную смесь гасили 0,25% раствором бычьего сывороточного альбумина, а свободный 125Ι удаляли
- 37 007275 гель-фильтрацией с использованием колонки ΡΌ-10 (Р1егсе). Специфическую активность препаратов 125Ι/’Ш1;4 определяли осаждением трихлоруксусной кислотой до и после стадии обессоливания.
^концевой фрагмент рецептора ТАСД обозначенный как «ТΑСI-N», вносили в 96-луночные планшеты (по 100 мкл при 0,1 мкг/мл) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты отмывали, блокировали буфером 8ирегВ1оск (Р1егсе) и снова промывали. Конструкции ТАСЕЕс в различных концентрациях в диапазоне от 0 до 11,5 нг/мл, смешивали с фиксированной концентрацией 125I-ΖТNЕ4 (20 нг/мл) и инкубировали в течение 2 ч при 37°С на планшете, покрытом ТАО-Л. Контроли содержали или ТАС!-Л в растворе, или не содержали ТАСЕЕс. После инкубации планшеты отмывали и просчитывали. Каждое определение готовили в трехкратной повторности.
Результаты показали, что все конструкции ТАСЕЕс полностью ингибировали связывание 125ΙΖТNЕ4 в концентрациях около 100 нг/мл или выше. Белки ТАСЕЕс, ТАС!(б1-29)-Ес5, ТАС!(б1-29,б111154)-Ес5 и ТАС!(б1-29,б120-154)-Ес5 были более эффективными ингибиторами, чем конструкция ТАСЕ Ес ТАС!(б1-29,б107-154)-Ес5. Сам фрагмент Ес не ингибировал связывание. Значения Ю50 подсчитывали для каждой конструкции в трех экспериментах. Средние значения для конструкций составляли: ТАСЦб129)-Ес5 : 2,07 нМ; ТАС!(б1-29,б107-154)-Ес5:4,95НМ; ТАС!(б1-29,бШ-154)-Ес5: 2,31 нМ; и ТАСЦб129,б120-154)-Ес5:2,21 нМ.
В. Анализ связывания в растворе
Каждую конструкцию ТАСЕЕс концентрации 0,05 нМ инкубировали с от 0,4 пкМ до 1,5 нМ 125ΙΖТNЕ4 в течение 30 мин при комнатной температуре в суммарном объеме 0,25 мл/пробирку. В каждую пробирку добавляли суспензию РапзогЫп (81арЕ А) и после 15 мин образцы центрифугировали, дважды промывали и осадки просчитывали. Неспецифическое связывание определяли добавлением 130 нМ немеченого ΖТNЕ4 к смеси 125I-ΖТNЕ4/ТΑСI-Ес. Специфическое связывание определяли вычитанием связанных импульсов/минуту (срт) в присутствие немеченного ΖТNЕ4 из общего значения связанных имп/мин (срт) при каждой концентрации 125I-ΖТNЕ4. Каждое определение проводили в трехкратной повторности. Константы связывания рассчитывали с использованием программного обеспечения ОгарЕРаб Рг1зт зоПинге (Маст!озЬ ν.3.0).
Фиг. 4 иллюстрирует специфическое связывание 125I-ΖТNЕ4 с различными конструкциями ТАСЕЕс. Связывание обнаруживали при приближении насыщения каждой конструкцией и было существенно выше для конструкций ТАП(б1-29)-Ес5, ТАСЦб^бШ-Ш)^, ТАа(б1-29,б120-154)-Ес5 по сравнению со связыванием ТΑСI(б1-29,б107-154)-Ес5. Рассчитывали значения максимального связывание (Втах) и константу диссоциации (Кб), и результаты суммировали в табл. 7.
Таблица 7. Связывание 125I-ΖТNЕ4 с конструкциями ТАСЕЕс
Конструкция ТАСЕЕс Ка (нМ) Втах(нМ)
ТАС1(сИ-29)-Ес5 0,134 0,023
ТАС1(с11-29,с1107-154)-Ес5 0,121 0,010
ТАС1(с11-29,с1111-154)-Ес5 0,115 0,018
ТАС1(с11-29,0120-154)-Ес5 0,092 0,021
Пример 5. Определение циркулирующего ΖТNЕ4.
Уровни ΖТNЕ4 у индивидуумов с болезненными состояниями (такими как, например, системная красная волчанка, ревматоидный артрит) по отношению к нормальным индивидуумам определяли с использованием метода электрохемолюминесценции. Стандартную кривую, приготовленную из растворимого ΖТNЕ4 человека в концентрациях 10 нг/мл, 1 нг/мл, 0,1 нг/мл, 0,01 нг/мл и 0 нг/мл, готовили в буфере (ЖК.тШ (^еп, ОаНЕегзЬигд, МБ). Образцы сыворотки разводили в буфере 0КЮЕЛ. Стандарты и образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч с биотинилированными кроличьими антителами против ΖТNЕ4-NЕ ВУ человека, разведенными до 1 мкг/мл в буфере 0п§т Аззау ВиЕЕег (ЮЕ^, и рутенилированными поликлональными кроличьми антителами против ΖТNЕ4-NЕ ВУ человека, разведенными до 1 мкг/мл в буфере 0п§т Аззау ВиЕЕег (ЮЕ^. После инкубации образцы встряхивали и к каждому образцу и каждому стандарту добавляли 0,4 мг/мл покрытых стрептавидином шариков (з1гер!^1бт ПупаЬеабз, Бупа1, 0з1о, Ж^ау) при 50 мкл/пробирку и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Образцы встряхивали и образцы просчитывали на анализаторе 0п§т Апа1у/ег (^еп) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. 0п§т-анализ основан на электрохемолюминесценции и производит вывод результатов в ЕСЬ. В исследовании измеряли уровень возбуждения ΖТNЕ4 в образцах сыворотки мышей как №В№Е1/1, так и МВЕ/Мр]-Еаз1рг, который прогрессировал в развитых стадиях гломерулонефрита и аутиммунном заболевании.
0КЮШ А88АУ использовали также для определения уровней ΖТNЕ4 в крови пациентов с системной красной волчанкой относительно циркулирующих уровней у здоровых индивидуумов. Калибровочную кривую готовили из растворимого ΖТNЕ4 человека при 10 нг/мл, 1 нг/мл, 0,1 нг/мл, 0,01 нг/мл и 0
- 38 007275 нг/мл в буфере ОКТСШ (1деп). Все образцы пациентов вели в трехкратной повторности с конечным объемом 25 мкл. Стандарты и образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч с захватывающими антителами, биотинилированными кроличьими поликлональными антителами против ΖΤNΕ4№ ВУ человека, разведенными до 1 мкг/мл в буфере Опдш Аккау ВиГГег (1СЕЩ и антителами для детекции, рутенилированными кроличьими поликлональными антителами против ΖΤNΕ4-NΕ ВУ человека, разведенными до 1 мкг/мл в буфере ОпДп Аккау ВиГГег (1СЕЦ). Вслед за инкубацией образцы встряхивали и добавляли 0,4 мг/мл шариков, покрытых стрептавидином (к!гер!ау1бт ОупаЬеабк, Эупа1), в каждый стандарт и в каждый образец при 50 мкл/пробирку и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Образцы встряхивали и образцы анализировали с использованием анализатора Опдш 1,5 Апа1ухег (1деп) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.
Анализ включал 28 нормальных контрольных образцов и образцы от 20 пациентов с диагнозом системная красная волчанка (8ЬЕ). Повышенные уровни ΖΤNΕ4 наблюдали в сыворотке пациентов с диагнозом 8ЬЕ по сравнению с сывороткой здоровых контрольных доноров. Уровни ΖΤNΕ4 рассчитывали в виде кратного увеличения уровней ΖΤNΕ4 в образцах пациента или в контрольных образцах по сравнению с произвольным контрольным образцом сыворотки человека. Среднее значение 28 контрольных образцов в 1,36 раза превышало контрольный образец человека и среднее значение 20 образцов пациентов с 8ЬЕ составляло 4,92. Семеро из 20 пациентов с 8ЬЕ имели уровни ΖΊΝΓ, которые были в два раза выше среднего значения контрольных образцов, несмотря на то, что существовал только один контрольный индивидуум, который имел более, чем двукратное превышение над средним значением в контроле.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
- 39 007275 <Ы0> Κίχοη, Магк Μ
Сгозз, Дапе А <120> слитые белки ТАС1-иммуноглобулина <130> 01-20РС · .
<140> РСТ/и302/15910 <141> 2002-05-20 <150> 60/293,343 <151> 2001-05-24 <160> 70 <170> ЕазЬЗЕО £ог νίίηάον/з УегзЬоп 4.0.
<210> 1 <211> 1377 <212> ОМА <213> Ното зарЬепз <220>
<221> СОЗ <222> (14)...(892) <400> 1адсаксскда дка акд адк ддс скд ддс сдд аде адд еда ддк ддс едд49
Мек Зег СЬу Ьей СЬу Агд Зег Агд Агд СЬу СЬу Агд
510
аде Зег едк Агд дкд УаЬ 15 дас Азр сад С1п дад С1и дад С1и сде Агд 20 ььь Рке сса Рго сад С1п ддс СЬу скд Ьей 25 Ьдд Тгр асд ТЬг ддд СЬу 97
дкд дек акд ада Ьсс Ьдс ссс даа дад, сад Ьас кдд дак сск скд скд 145
УаЬ АЬа Мек Агд Зег Суз Рго СЬи СЬи СЬп Туг Тгр Азр Рго Ьей Ьей
30 35 40
ддк асе Ьдс акд Ъсс Ьдс ааа асе акк Ьдс аас сак сад аде сад сдс 193
ТЬг Суз Мек Зег Суз Ьуз ТЬг ЬЬе Суз Азп НЬз СЬп Зег СЬп Агд '
45 50 55 60
асе Ьдк дса дес ЬЬе кде адд Ьса скс аде Ьдс сдс аад дад саа ддс 241
Тпг Суз АЬа АЬа РЬе Суз Агд Зег Ьей Зег Суз Агд Ьуз СЬи СЬп СЬу
65 70 75
аад- ЬЬе Ьас дас сак скс сг д адд дас кде акс аде Ьдк дсс Ьсс акс 289
Ьуз Ώ Ч р Туг Азр НЬз Ьей Ьей Агд Азр Суз Не Зег Суз АЬа Зег ЬЬе
80 85 90
едк дда сад сас сск аад саа Ьдс дса Ьас ЬЬе кдк дад аас аад с кс 337
Суз С1у С1п 95 ΗΪ3 Рго Ьуз С1п Суз 100 А1а Туг Рйе Суз С1и 105 Азп Ьуз Ьеи
адд аде сса дйд аас сйй сса сса дад сес адд ада сад едд аде дда 385
Агд Бег Рго Уа1 Азп Ьеи Рго Рго С1и Ьеи Агд Агд С1п Агд Зег С1у
110 115 120
даа дйй даа аас аае Оса дас аас есд дда адд еас саа дда ййд дад 433
С1и Уа1 С1и Азп Азп Зег Азр Азп Зег С1у Агд Туг С1п <31у Ьеи С1и
125 130 135 140
сас ада ддс Оса даа дса аде сса дсе сес ссд ддд ейд аад ейд адй 481
ΗΪ3 Агд С1у Зег С1и А1а Зег Рго А1а Ьеи Рго С1у Ьеи Ьуз Ьеи Зег
145 150 155
дса дай сад дЪд дсс ейд дес еас аде асд ейд ддд СЙС еде ейд еде 529
А1а Азр С1п Уа1 А1а Ьеи Уа1 1уг Зег ТИг Ьеи С1у Ьеи Суз Ьеи Суз
160 165 170
дсс дЪе сйс еде Оде еес сед д^д дед дед дсс еде еес сес аад аад 577
А1а Уа1 Ьеи Суз Суз Рйе Ьеи Уа1 А1а Уа1 А1а Суз Рйе Ьеи Ьуз Ьуз
175 180 185
адд ддд дае ссс Оде есс Оде сад ссс сде йса адд ссс сде саа аде 625
Агд С1у Азр Рго Суз Зег Суз С1п Рго Агд Зег Агд Рго Агд С1п Зег
190 195 200
ссд дсс аад есе есс сад дае сас дед айд даа дсс ддс аде ссй дед 673
Рго А1а Ьуз Зег Зег С1п Азр Н13 А1а Мее С1и А1а С1у Зег Рго Уа1
205 210 215 220
аде аса Осс ссс дад сса дйд дад асе еде аде еес- еде ййс ссй дад 721
5ег Тйг 5ег Рго С1и Рго Уа1 С1и ТЙГ Суз Зег Рйе Суз Рйе Рго С1и
225 230 235
Оде адд дед ссс асд сад дад аде дса дОс асд ссй ддд асе ссс дас 769
Суз Агд А1а Рго Тйг С1п С1и Зег А1а Уа1 Тйг Рго С1у Тйг Рго Азр
240 245 250
ссс асе еде дсе дда адд едд ддд еде сас асе адд асе аса дйс ейд 817
Рго Тйг Суз А1а С1у Агд Тгр С1у Суз Низ Тйг Агд Тйг Тйг Уа1 Ьеи
255 260 265
сад ссй еде сса сас айс сса дас аде ддс сйй ддс айй дед еде дед 865
С1п Рго Суз Рго ΗΪ3 11е Рго Азр Зег С1у Ьеи С1у 11е Уа1 Суз Уа1
270 275 280
ссй дсс сад дад ддд ддс сса дде дса еаааеддддд йсадддаддд 912
Рго А1а С1п С1и С1у С1у Рго С1у А1а
235 290
аааддаддад ддадададай ддададдадд ддадададаа адададдйсд ддададддда972 дададайайд аддададада дасададдад дсадаааддд ададааасад аддадасада1032 дадддадада дадасададд дадададада сададдддаа дададдсада дадддааада1092 ддсададаад дааададаса ддсададаад дадададдса дададддада даддсадада1152 дддадададд садададаса дададддада дадддасада дададайада дсаддаддйс1212 ддддсасйсй дадйсссадй йсссадйдса дсйдОаддйс дйсайсассс аассасасдй1272
- 41 007275 дсааЕааадб ссЬсдЕдссЕ дсбдсСсаса дсссссдада дссссбссбс сЬддадааЬа ааассЬЬЬдд садсбдсссб ЬссЬсааааа аааааааааа ааааа
1332
1377 <210> 2 <211> 293 <212> РК.Т <213> Ното зарЬепз <400> 2
МеЪ Зег СЬу Ьеи СЬу Агд Зег Агд Агд СЬу СЬу Агд Зег Агд УаЬ Азр
1 5 . 10 15
СЬп СЬи СЬи Агд РЬе Рго СЬп СЬу Ьеи Тгр ТЬг СЬу УаЬ АЬа МеЬ Агд
20 25 30
Зег Суз Рго СЬи СЬи СЬп Туг Тгр Азр Рго Ьеи Ьеи СЬу ТЬг Суз МеЬ
35 40 45
Зег Суз Ьуз ТИг 11е Суз Азп НЬз СЬп Зег СЬп Агд ТЬг Суз АЬа АЬа
50 55 60
РЬе Суз Агд Зег Ьеи Зег Суз Агд Ьуз СЬи СЬп СЬу Ьуз РЬе Туг Азр
65 70 75 80
Н13 Ьеи Ьеи Агд Азр Суз Не Зег Суз А1а Зег ЬЬе Суз СЬу СЬп НЬз
85 90 95
Рго Ьуз СЬп Суз А1а Туг РЬе Суз СЬи Азп Ьуз Ьеи Агд Зег Рго УаЬ
100 105 110
Азп Ьеи Рго Рго СЬи Ьеи Агд Агд СЬп Агд Зег СЬу СЬи УаЬ СЬи Азп
115 120 125
Азп Зег Азр Азп Зег СЬу Агд Туг СЬп СЬу Ьеи СЬи НЬз Агд СЬу Зег
130 135 140
СЬи АЬа Зег Рго АЬа Ьеи Рго СЬу Ьеи Ьуз Ьеи Зег АЬа Азр СЬп УаЬ
145 150 155 160
АЬа Ьеи УаЬ Туг Зег ТЬг Ьеи СЬу Ьеи Суз Ьеи Суз АЬа УаЬ Ьеи Суз
165 170 175
Суз РЬе Ьеи УаЬ АЬа УаЬ АЬа Суз РЬе Ьеи Ьуз Ьуз· Агд СЬу Азр Рго
180 185 190
Суз Зег Суз СЬп Рго Агд Зег Агд Рго Агд СЬп Зег Рго АЬа Ьуз Зег
195 200 205
Зег СЬп Азр НЬз АЬа МеЕ СЬи АЬа СЬу Зег Рго УаЬ Зег ТИг Зег Рго
210 215 220
СЬи Рго УаЬ СЬи ТЬг Суз Зег РЬе Суз РЬе Рго СЬи Суз Агд АЬа Рго
225 230 235 240
ТЬг СЬп СЬи Зег АЬа УаЬ ТЬг Рго СЬу ТЬг Рго Азр Рго ТЬг Суз АЬа
245 250 255
СЬу Агд Тгр СЬу Суз НЬз ТЬг Агд ТЬг' ТЬг УаЬ Ьеи СЬп Рго Суз Рго
260 265 270
НЬз Не Рго Азр Зег СЬу Ьеи СЬу ЬЬе УаЬ Суз УаЬ Рго А1а СЬп СЬи
275 280 285
СЬу СЬу Рго СЬу АЬа
290
<210> 3 <211> 285 <212> РИТ <213> Ното зарЬепз <400> 3
Мек Азо Азр Зег ТЬг СЬи Агд СЬи СЬп Зег Агд Ьеи ТЬг Зег Суз Ьеи ’ 5 Ю . 15
- 42 007275
Ьуз Ьуз Агд С1и 20 С1и МеЬ Ьуз Ьеи Ьуз 25 С1и Суз Уа1 Зег Не 30 Ьеи Рго
Агд Ьуз С1и Зег Рго Зег Уа1 Агд Зег Зег Ьуз Азр С1у Ьуз Ьеи Ьеи
35 40 45
А1а А1а ТЬг Ьеи Ьеи Ьеи А1а Ьеи Ьеи Зег Суз Суз Ьеи ТЬг Уа1 Уа1
50 55 60
Зег РЬе Туг С1п Уа1 А1а А1а Ьеи С1п С1у Азр Ьеи А1а Зег Ьеи Агд
65 70 75 80
А1а С1и Ьеи С1п С1у ΗΪ3 ΗΪ3 А1а С1и Ьуз Ьеи Рго А1а С1у А1а С1у
85 90 95
А1а Рго Ьуз А1а С1у, Ьеи С1и С1и А1а Рго А1а Уа1 ТЬг А1а С1у Ьеи
100 105 но
Ьуз Не РЬе С1и Рго Рго А1а Рго С1у С1и С1у Азп Зег Зег С1п Азп
115 120 125
Зег Агд Азп Ьуз Агд А1а Уа1 (31п С1у Рго С1и С1и ТЬг Уа1 ТЬг С1п
130 135 140
Азр Суз Ьеи С1п Ьеи Не А1а Азр Зег С1и ТЬг Рго ТЬг Не С1п Ьуз
145 150 155 160
С1у Зег Туг ТЬг РЬе Уа1 Рго Тгр Ьеи Ьеи Зег РЬе Ьуз Агд С1у Зег
165 170 175
А1а Ьеи С1и С1и Ьуз С1и Азп Ьуз Не Ьеи Уа1 Ьуз С1и ТЬг С1у Туг
180 185 190
РЬе РЬе Не Туг О1у С1п Уа1 Ьеи Туг ТЬг Азр Ьуз ТЬг Туг А1а МеЬ
195 200 205
С1у НЬз Ьеи Не С1п Агд Ьуз Ьуз Уа1 Н13 Уа1 РЬе С1у Азр С1и Ьеи
210 215 220
Зег Ьеи Уа1 ТЬг Ьеи РЬе Агд Суз Не С1п Азп МеЬ Рго (31и ТЬг Ьеи
225 230 235 240
Рго Азп Азп Зег Суз Туг Зег А1а С1у Не А1а Ьуз Ьеи С1и С1и С1у
245 250 255
Азр С1и Ьеи С1п Ьеи А1а 11е Рго Агд С1и Азп А1а С1п Не Зег Ьеи
260 265 270
Азр С1у Азр Уа1 ТЬг РЬе РЬе С1у А1а Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи
275 280 285 <210> 4 <211> 250 <212> РКТ <213> Ното зарБепз <400> 4 '
МеЬ 1 Рго А1а Зег Зег 5 Рго РЬе Ьеи Ьеи А1а 10 Рго Ьуз С1у Рго Рго 15 С1у
Азп МеЬ С1у С1у Рго Уа1 Агд С1и Рго А1а Ьеи Зег Уа1 А1а Ьеи Тгр
20 25 30
Ьеи Зег Тгр С1у А1а А1а Ьеи С1у А1а Уа1 А1а Суз А1а МеЬ А1а Ьеи
35 40 45
Ьеи ТЬг С1п С1п ТЬг С1и Ьеи С1п Зег Ьеи Агд Агд С1и νβΐ Зег Агд
50 55 60
Ьеи С1п С1у ТЬг С1у С1у Рго Зег С1п Азп С1у С1и С1у Туг Рго Тгр
65 70 75 80
С1п Зег Ьеи Рго С1и С1г. Зег Зег Азр А1а Ьеи С1и АдЗ. Тгр С1и А.зп
85 90 95
С1у С1и Агд Зег Агд Ьуз Агд Агд А1а Уа1 Ьеи ТЬг С1п Ьуз С1п Ьуз
100 105 110
Ьуз С1п Н13 Зег Уа1 Ьеи ΗΪ3 Ьеи Уа1 Рго Не Азп А1а ТЬг Зег Ьуз
115 120 125
Азр Азр Зег Азр Уа1 ТЬг С1и Уа1 МеЬ Тгр С1п Рго А1а Ьеи Агд Агд
130 135 140
С1у Агд С1у Ьеи С1п А1а С1п· С1у Туг С1у Уа1 Агд Пе С1п Азр А1а
145 150 155 160
С1у Уа1 Туг Ьеи Ьеи Туг Зег С1п Уа1 Ьеи РЬе О1п Азр Уа1 ТЬг РЬе
165 170 175
ТЬг МеЬ С1у С1п Уа1 Уа1 Зег Агд С1и С1у С1п С1у Агд С1п С1и ТЬг
-1 А А
юи 103
Ьеи РЬе Агд Суз 11е Агд Зег МеЬ РГО Зег Н1з Рго Азр Агд А1а Туг
195 200 205
Азп Зег Суз Туг Зег А1а С1у Уа1 РЬе ΗΪ3 Ьеи ΗΪ3 С1п С1у Азр 11е
210 215 220
Ьеи Зег Уа1 Не 11е Рго Агд А1а Агд А1а Ьуз Ьеи Азп Ьеи Зег Рго
225 230 235 240
ΗΪ3 С1у ТЬг РЬе Ьеи С1у РЬе Уа1 Ьуз Ьеи
245 250
- 43 007275 <210> 5 <21·1> 7 52 <212> ϋΝΑ <213> Ното зариепз <220>
<221> С03
<222> (7) . . . .(759
<400> 5
ддаксс акд аад сас скд кдд ккс ккс скс скд скд дкд дед дек ссс 48
Мек Ьуз Низ Ьеи Тгр РЬе РЬе Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 А1а А1а Рго 1 5 10
ада Агд 15 Ьдд Тгр дке Уа1 скд Ьеи кос Зег дад С1и 20 ссс Рго ааа Ьуз кек Зег кдк Суз дас Азр 25 ааа Ьуз аск ТЬг сас Низ аса ТЬг кде Суз 30 96
сса ссд кде сса дса сск даа скс скд ддд дда ссд кса дке ккс скс 144
Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи
35 40 45
ккс ссс сса ааа ссс аад дас асе скс акд акс ксс едд асе ССк дад 192
РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мек Не Зег Агд ТЬг Рго С1и
50 55 60
дке аса кде дкд дкд дкд дас дкд аде сас даа дас сск дад дке аад 240
Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Низ С1и Азр Рго С-1и \7а1 Ьуз
65 70 75
ккс аас кдд кас дкд дас ддс дкд дад дкд сак аак дсс аад аса аад 288
РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Х7а1 Низ Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз
80 85 90
ссд едд дад дад сад кас аас аде асд кас едк дкд дке аде дке скс 336
Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи
95 100 105 110
асе ТЬг дке Уа1 скд Ьеи сас Низ сад С1п 115 дас Азр кдд Тгр скд Ьеи аак Азп ддс С1у 120 аад Ьуз дад С1и кас Туг аад Ьуз кде Суз 125 аад Ьуз 384
дке ксс аас ааа дсс скс сса дсс ссс акс дад ааа асе акс ксс ааа 432
Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз
130 135 140
дсс ааа ддд сад ссс еда даа сса сад дкд кас асе скд ссс сса ксс 480
А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег
145 - 150 155
едд да к дад скд асе аад аас сад дке аде скд асе кде скд дке ааа 528
Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п 57а1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз
160 165 170
ддс ккс как ссс аде дас акс дсс дкд 'дад кдд дад аде аак ддд сад 576
С1у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п
175 180 185 190
ссд· дад аас аас кас аад асе асд сск ссс дкд скд дас ксс дас ддс 624
Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у
195 200 205
ксс ккс ккс скс кас аде аад скс асе дкд дас аад аде адд кдд сад 672
Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п
210 215 220
сад ддд аас дке ккс кса кде ксс дкд акд сак дад дек скд сас аас 720
С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 Мек ΗΪ3 С1и А1а Ьеи Низ Азп
225 230 235
сас кас асд сад аад аде скс ксс скд кек ссд ддк ааа к да 762
Низ Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
240 245 250
- 44 007275 <210> б <211> 251 <212> РКТ <213> Ното зариепз <400> б
Мер Ьуз Низ Ьеи Тгр РЬе РЬе Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 А1а А1а . Рго Агд Тгр
1 5 10 15
Уа1 Ьеи 5ег С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Низ ТЬг ' Суз Рго Рго
20 25 30
Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе : Ьеи РЬе Рго
35 40 45
Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мер Не Зег Агд ТЬг Ргс ι С1и Уа1 ТЬг
50 55 60
Суз Уа1 Уа1 Уа1· Азр Уа1 Зег Низ С1и Азр Рго С1и Уа1 . Ьуз РЬе Азп
65 70 75 80
Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Низ Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд
85 90 95
С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1
100 105 НО
Ьеи Низ С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег
115 120 125
Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз
130 135- 140
С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр
145 150 155 160
С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп <31п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе
165 170 175
Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и
180 185 190
Азп Азп Туг Ьуз ТЬг. ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе
195 200 205
РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у
210 215 220
Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 Мер Низ С1и А1а Ьеи Низ Азп Нйз Туг
225 230 235 240
ТЬг σΐη Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
245 250
<210> 7 <211> 44 <212> ΌΝΑ <213> Ното зархепз <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 7 аЬсадсддаа ООсадаОсЫ: садасаааас Есасасайдс ссас44 <210> 8 · <211> 35 <212> ϋΝΑ' <213> Ното зараепз· <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 8 ддсадСсЕсЬ адаЕсаЫЬа сссддадаса дддад35 <210> 9 <211> 51 <212> ЬНА<213> Ното заргепз <220> <223> ПЦР-праймер <400> 9 ссдСдсссад сассРдаадс сдадддддса ссдРсадОсС РссОсиОссс с 51 <210> 10 <211> 31 <212> ΕΝΑ ' <213> Ното зарЬепз
- 45 007275 <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 10 ддаРРсОада ЬРаЬЫзассс ддадасаддд а31 <210> 11 <211> 55 <212> ϋΝΑ <213> Ното зариепз ., <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 11 ддрддсддсб сссадаЬддд РссРдбссда дсссадаРсб Рсадасаааа сЬсас55 <210> 12 <211> 18 <212> ΌΝΑ <213> Ното зариепз <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 12.
ОдддадддсО СРдОЬдда ·18 <210> 13 <211> 42·· <212> ϋΝΑ<213> Ното зархепз <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 13
Оссаасааад сссОсссаСс сОссаОсдад аааассаОсЪ со 42 <210> 14 <211> 57 ' <212> ϋΝΑ <213> Ното зархепз <220> · <223> ПЦР-праймер <400> 14 ддаРддабсс аОдаадсасс ЬдОддООсРЪ ссбссЬдсОд дОддсддсОс ссадабд 57 <210> 15 ’ <211> 59 <212> ША <213> Ното зариепз <220>
- 46 007275 <223> пЦР-праймер <400> 15
сСсадссадд аааЬссаОдс сдадОСдада сдсОЬссдЬа дааЬдадОдд ссрдддссд 59
<210> 16
<211> 48
<212> ΏΝΑ
<213> Ното зархепз
<220>
<223> ПЦР-праймер
<400> 16
дсаЬдСдСда дЬООЕдЪсЬд аадайсЬддд сйссЬСсадс сссдддад 48
<210> 17 •
<211> 60
<212> ΌΝΑ
<213> Ното зартепз
<220>
<223> ПЦР-праймер
<400> 17
дсасададдс Ьсадаадсаа дЬссадсЬсЬ сссддддсРд ааддадссса даЕсЕИсада 60
<210> 18
<211> 56
<212> ϋΝΑ
<213> Ното зардепз
<220>
<223> ПЦР-праймер
<400> 18
ддддбдддОа саассссада дсОд'ЬреОаа ес'ЬадаЬЬаЬ ЬОасссддад асаддд 56
<210> 19 <211> 36 <212> ϋΝΑ ' <213> Ното зартепз <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 19 дадсссааао сЬЬсадасаа аасЬсасаса Рдссса <210> 20 <211> 36 ’ <212> ΌΝΑ <213> Ното зарЬепз <220>
<223> ПЦР-праймер
- 47 007275 <400> 20
ПааППддсдс дссПсПада! !а!!!асссд дадаса36 <210> 21 <211> 37' <212> ΒΝΑ <213> Ното зархепз <220> .
<223> : ПЦР-праймер ..
<400> 21 ддсдсдссПс ПадаППаасс сддадасадд дададдс37 <210> 22 <211> 28 ' <212> ΌΝΑ <213> Ното зарЬепз <220>
<223> пцр-праймер <400> 22 дадсссааа! сППдсдасаа аасПсаса 28 <210> 23 <211> 33 <212> ΌΝΑ <213> Ното зарЬепз <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 23 д!асд!дс!! ПддПасПдс! ссПсссдсдд сП! 33 <210> 24 <211> 28 <212> ΠΝΑ <213> Ното зарЬепз <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 24· садПассааа дсасдПассд !д!дд!са28 <210> 25 <211> 35 <212> РКТ <213> Ното зарДепз <220>
<223> Оптимизированная лидерная последовательность (РА <400> 25
Ме! Азр А1а Ме! Ьуз Агд С1у Ьеи Суз Суз Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи Суз С1у
1 5 10 15
А1а Уа1 Рке Уа1 Зег Ьеи Зег (31п С1и Не ΗΪ5 А1а С1и Ьеи Агд Агд
20 25 30
Рйе Агд Агд
- 48 007275 <210> 26 <211> 995 ' <212> ϋΝΑ , .
<213> Ното заргепз <220>
<221> СОЗ <222> (219) . . . (770) <400> 26 аадасРсааа сРРадааасР рдааРРадаР дрддраррса ааРссРРасд Рдссдсдаад 60 асасадасад сссссдРаад аасссасдаа дсаддсдаад РРсаРРдРРс РсаасаРРсР 120 адсРдсРсРР дсРдсаРРРд сРсРддааРР сРРдРадада РаРРасРРдР ссРРссаддс 180 рдРРсРРРсР дРадсРсссР рдррррсррр РРдРдаРс ард РРд сад аРд дсР ддд 236
МеР Ьеи С1п Мер А1а С1у
- 5
сад (31п Рдс Суз Рсс Зег саа С1п 10 ааР Азп даа С1и РаР Туг РРР РЬе дас Азр 15 адр Зег ррд Ьеи РРд Ьеи саР ΗΪ3 дсР А1а 20 Рдс Суз аРа 11е 284
ссР РдР саа ерр еда Ьдр РсР РсР ааР асР ссР ссР сРа аса РдР сад 332
Рго Суз С1п Ьеи Агд Суз Зег Зег Азп ТЬг Рго Рго Ьеи ТЬг Суз 61п
25 30 35
сдр кар рдр аар дса адр дкд асе ааР Рса дкд ааа дда асд ааР дед 380
Агд Туг Суз Азп А1а Зег 17а 1 ТЬг Азп · Зег 17а 1 Ьуз С1у ТЬг Азп А1а
40 45 50
аРР сРс рдд асе Одр ррд дда сРд аде ЬЬа а!:а аРР осе ррд дса дее 428
11е Ьеи Тгр ТЬг Суз Ьеи С1у Ьеи Зег Ьеи Не 11е Зег Ьеи А1а Уа1
55 60 65 70
РРс дрд сРа ард ррр ррд сРа адд аад аРа аде РсР даа сса РРа аад 476
РЬе Уа1 Ьеи МеЬ РЬе Ьеи Ьеи Агд Ьуз 11е Зег Зег С1и Рго Ьеи Ьуз
75 80 85
да с дад РРР ааа аас аса дда Рса ддь СРС сРд ддс аРд дсР аас аРР · 524
Азр С1и РЬе Ьуз Азп ТЬг С1у Зег С1у Ьеи Ьеи С1у МеР А1а Азп 11е
90 95 100
дас ерд даа аад аде адд асР ддр дар даа аРР аРР СРР ссд ада ддс 572
Азр Ьеи С1и Ьуз Зег Агд ТЬг С1у Азр С1и 11е 11е Ьеи Рго Агд С1у
105 но 115
сРс дад Рас асд дЬд даа даа Рдс асе рдр даа дас Рдс аРс аад <Э.дС 620
Ьеи С1и Туг ТЬг Уа1 С1и С1и Суз ТЬг Суз С1и Азр Суз 11е Ьуз 5 5Е
120 125 130
ааа ссд аад дрс дас РсР дас саР Рдс РРР сса сРс сса дсР аРд дад 668
Ьуз Рго Ьуз Уа1 Азр Зег Азр ΗΪ3 Суз РЬе Рго Ьеи Рго А1а Мер С1и
135 140 145 150
даа ддс дса асе аРР СРР дрс асе асд ааа асд аар дас РаР Рдс аад 716
С1и С1у А1а ТЬг 11е Ьеи Уа1 ТЬг ТЬг Ьуз ТЬг Азп Азр Туг Суз Ьуз
155 160 165
аде сРд сса дсР дсР РРд адр дсР асд дад аРа дад ааа Рса аРР РсР 764
Зег Ьеи Рго А1а А1а Ьеи Зег А1а -ТЬг С1и 11е С1и Ьуз Зег 11е Зег
170 175 180
дсР адд РааРРаасса РРРсдасРсд адсадрдсса сРРРаааааР сРРРРдРсад 820 А1а Агд
- 49 007275 ааСадаЬдаЬ дОдксадакс БсЪЬЬаддаО дасБдЬаББР ЬОсадкОдсс дакасадсОО 880 ьеЬдЬссЬсС аасОдОддаа асЬсЬЬЬаЬд ООадаОаОаО ЬИсЬсЬаддЬ ОасОдООддд 940 адсОБааОдд ОадааасООс сЬЬддРЬЬса БдаООааадР сООООООООБ ссЬда 995 <210> 27 <211> 184 <212> РКТ <213> Ното зариепз <400> 27
МеО Ьеи (31п Мер А1а С1у <31п Суз Зег С1ги Азп С1и Туг. . РЬе Азр Зег
1 5 10 15
Ьеи Ьеи Низ А1а Суз 11е Рго Суз С1п Ьеи Агд Суз Зег Зег Азп ТЬг
20 25 . - - •30
Рго Рго Ьеи ТЬг Суз С1п Агд Туг Суз Азп А1а Зег Уа1 ТЬг Азп Зег
35 40 45
Уа1 Ьуз С1у ТЬг Азп А1а 11е Ьеи Тгр ТЬг Суз Ьеи С1у Ьеи Зег Ьеи
50 55 60
11е 11е Зег Ьеи А1а Уа1 РЬе Уа1 Ьеи Мер РЬе Ьеи Ьеи Агд Ьуз 11е
65 70 75 80
5ег Зег С1и Рго Ьеи Ьуз Азр С1и РЬе Ьуз Азп ТЬг С1у Зег С1у Ьеи
85 90 95
Ьеи. С1у МеЬ ' А1а Азп ' Не Азр Ьеи С1и Ьуз Зег Агд ТЬг С1у Азр С1и
100 • 105 но
11е 11е Ьеи Рго Агд С1у Ьеи С1и Туг ТЬг Уа1 О1и С1и Суз ТЬг Суз
115 120 125
С1и Азр Суз 11е Ьуз Зег Ьуз Рго Ьуз Уа1 Азр Зег Азр Низ Суз РЬе
130 135 140
Рго Ьеи Рго А1а МеО С1и С1и С1у А1а ТЬг Не Ьеи Уа1 ТЬг ТЬг Ьуз
145 150 155 160
ТЬг Азп Азр Туг Суз Ьуз Зег Ьеи Рго А1а А1а Ьеи Зег А1а ТЬг С1и
165 170 - 175
11е С1и Ьуз Зег Не Зег А1а Агд
180
<210> 28
<211> 762
<212> : ϋΝΑ
<213> : Ното зариепз
- 50 007275
<220> .
<221> <222> СЬЗ (7) . . .(759)
<400> 28 ддаесс аед аад сас сед Одд еес Обе сес сед сед дед дед дсе ссс
Мее Ьуз ΗΪ3 Ьеи Тгр РЬе РЬе Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 А1а А1а Рго
1 5 10
ада едд дес сед есс дад ссс ада есе еса дас ааа асе сас аса еде
Агд Тгр Уа1 Ьеи Зег. С1и Рго Агд Зег Зег Азр Ьуз ТЬг Низ ТЬг Суз
15 20 25 30
сса сед Еде сса дса ссе даа сес сед ддд дда ссд еса дес еес сес
Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи
35 40 45
еес ссс сса ааа ссс аад дас асе сес аед аес есс едд асе ссе дад
РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мее 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и
50 55 60
дес а.СЭ. Оде дед дед дед. дас дед аде сас даа дас ссе дад дес аад
Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег ΗΪ3 С1и Азр Рго 61и Уа1 Ьуз
65 70 75
еес аас едд Рас дед дас ддс дед дад дед сае аае дсс аад аса аад
РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр (31у Уа1 С1и Уа1 ΗΪ3 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз
80 85 90
сед едд дад дад сад еас аас аде асд еас еде дед дес аде дес сес
Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд' У а-1 Уа1· Зег_ Уа1 Ьеи
95 .100 105 110
асе дес сед сас сад дас едд сед аае ддс аад дад еас аад еде аад
ТЬг Уа1 Ьеи ΗΪ3 С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз
115 120 125
дес Осс аас ааа дсс сос сса дсс ссс аСс дад ааа асе аЬс Ьсс ааа
Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз
13 0 135 140
дес ааа ддд сад ссс еда даа сса сад дед еас асе сед ссс сса есс
А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег
145 150 155
едд даЬ дад сед асе аад аас сад дес аде сед асе еде сед дес ааа
Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз
160 165 170
ддс еес еае ссс аде дас аес дсс дед дад едд дад аде аае ддд сад
С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 <31и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п
175 180 18 5 190
сед дад аас аас еас аад асе асд ссе ссс дед сед дас есс дас ддс
Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у
195 200 205
144
192
240
288
336
384
432
480
528
576
624
кос Зег Ькс РЬе ккс РЬе скс Ьей 210 кас Туг аде Зег аад Ьуз скс Ьей асе ТЬг 215 дкд УаЬ дас Азр аад Ьуз аде Зег адд Агд 220 Ьдд Тгр сад СЬп 672
сад ддд аас дкс ккс кеа кде ксс дкд акд сак дад дек скд сас аас 720
СЬп СЬу Азп УаЬ РЬе Зег Суз Зег УаЬ Мек ΗΪ3 СЬи А1а Ьей НЬз Азп
225 230 235
сас Пас асд сад аад аде скс ксс скд кек ссд ддк ааа кда 762
НЬз Туг ТЬг СЬп Ьуз Зег Ьей Зег Ьей Зег Рго СЬу Ьуз
240 245 250
<210> 29 <211> 251 <212> РНТ <213> Ното зарЬепз <400> 29
Мек Ьуз НЬз Ьей Тгр РЬе РЬе Ьей Ьей Ьей УаЬ АЬа АЬа Рго Агд Тгр
1 5 10 15
УаЬ Ьей Зег СЬи Рго Агд Зег Зег Азр Ьуз ТЬг НЬз ТЬг Суз Рго Рго
20 25 30
Суз Рго АЬа Рго СЬи Ьей Ьей СЬу СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Ьей РЬе Рго
35 40 45
Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьей Мек 11е Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг
50 55 60
Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег НЬз СЬи Азр Рго СЬи УаЬ Ьуз РЬе Азп
65 70 75 80
Тгр Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд
85 90: 95
СЬи СЬи СЬп Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ Зег- УаЬ Ьей ТЬг УаЬ
100 105 110
Ьей НЬз СЬп Азр Тгр Ьей Азп СЬу Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег
115 120 125
Азп Ьуз АЬа Ьей Рго АЬа Рго 11е СЬи Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз АЬа Ьуз
130 135 140
СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго .СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьей Рго Рго Зег Агд Азр
145 150 155 160
СЬи Ьей ТЬг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьей ТЬг Суз Ьей УаЬ Ьуз СЬу РЬе
165 170 175
Туг Рго Зег Азр 11е АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег Азп СЬу СЬп Рго СЬи
180 185 190
Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго УаЬ Ьей Азр Зег Азр СЬу Зег РЬе
195 200 2 05
РЬе Ьей Туг Зег Ьуз Ьей ТЬг УаЬ Азр Ьуз Зег Агд Тгр СЬп СЬп СЬу
210 215 220
Азп УаЬ РЬе Зег Суз Зег УаЬ Мек НЬз СЬи АЬа Ьей НЬз Азп Н1з Туг
225 230 235 240
ТЬг СЬп Ьуз Зег Ьей Зег Ьей Зег Рго СЬу Ьуз
245 250 <210> 30 <211> 762 <212> ΟΝΑ <213> Ното зарЬепз
- 52 007275 <220> .
<221> СВЗ <222> (7) . . . (759)· <223> Модифицированный иммуноглобулиновый фрагмент <400> 30 ддаСсс аСд аад сас сСд Сдд ЬЬс ССс сСс сСд сСд дСд дед дсС ссс48
Мер Буз ΗΪ5 Ьей Тгр РЬе РЬе Беи Ьей Беи Уа1 А1а А1а Рго 1510
ада Агд 15 Ьдд Тгр дСс Уа1 сСд Беи Ссс Зег дад С1и 20 ссс Рго ада Агд СсС Зег Сса Зег дас Азр 25 ааа Буз асС ТЬг сас Н1з аса ТЬг Сдс Суз 30 96
сса сед Сдс сса дса ссС даа дсс дад ддд дса ссд Сса дСс ССс сСс 144
Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и А1а С1и С1у А1а Рго Зег Уа1 РЬе Беи
35 40 45
ссс ссс сса ааа ссс аад дас асе сСс аСд аСс Ссс сдд асе ссС дад 192
РЬе Рго Рго Буз Рго Буз Азр ТЬг Беи МеС 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и
50 55 60
дСс аса Сдс дед дед дьд дас дСд аде сас даа дас ссС дад дСс аад 240
Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег ΗΪ3 С1и Азр Рго С1и Уа1 Буз
65 70 75
ССс аас Сдд Сас дСд дас ддс дСд дад дСд саС ааС дсс аад аса аад 288
РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Низ Азп А1а Буз ТЬг Буз
80 85 9Ό
сед сдд дад дад сад Сас аас аде асд Сас сдС .дСд· дСс аде дСс сСс 336
Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Беи
95 100 105 110
асе дСс сСд сас сад дас ьдд сСд ааС ддс аад дад Сас аад Сдс аад 384
ТЬг Уа1 Беи ΗΪ3 С1п Азр Тгр Беи Азп <31у Буз С1и Туг Буз Суз Буз
115 120 125
дСс Ссс аас ааа дсс сСс сса Ссс Ссс аСс дад ааа асе аСс Ссс ааа 432
Уа1 Зег Азп Буз А1а Беи Рго Зег Зег 11е С1и Буз ТЬг 11е Зег Буз
130 135' 140
дсс ааа ддд сад ссс еда даа сса сад д£д Сас асе сСд ссс сса Ссс 480
А1а Буз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Беи Рго •Рго Зег
145 150 155
сдд даС дад сСд асе аад аас сад дСс аде сСд асе Сдс сСд дСс ааа 528
Агд Азр С-1и Беи ТЬг Буз Азп С1п Уа1 Зег Беи ТЬг Суз Беи Уа1 Буз
160 165 170
ддс ССс Рас ССС' аде дас аСс дсс дСд дад Сдд дад аде ааС ддд сад 576
С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 <31и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п
175 180 185 190
сед дад аас аас Сас аад асе асд ссС ссс дед сСд дас Ссс дас ддс 624
Рго С1и Азп Азп Туг Буз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Беи Азр Зег Азр С1у
195 200 205
Ссс СЬс ССс сЬс Сас аде аад сСс асе дьд дас аад аде адд ьдд сад 672
Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз· Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п
210 215 220
сад ддд аас дСс ЬСс Сса Сдс Ссс д^д аСд саС дад дсЬ сЬд сас аас 720
С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 Мер ΗΪ3 С1и А1а Ьеи ΗΪ3 Азп
225 230 235
сас Сас асд сад аад. аде сСс Ссс сСд Ось ссд ддЬ ааа С да 762
ΗΪ3 Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
240 245 250 <210> 31 <211> 251 . ’ <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 31
МеЬ Ьуз Η13 Ьеи Тгр РЬе РЬе Ьеи- Ьеи Ьеи Уа1 А1а А1а Рго Агд Тгр
1 5 10 15
Уа1 Ьеи Зег С1и Рго Агд Зег Зег Азр Ьуз ТЬг ΗΪ3 ТЬг Суз Рго Рго
20 25 30
Суз Рго А1а Рго С1и А1а С1и С1у А1а Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго
35 40 45
Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ Не Зег Агд ТЬг Рго (Ни Уа1 ТЬг
50 55 60
Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Н13 (Ни Азр Рго (Ии Уа1 Ьуз РЬе Азп
65 70 75 80
Тгр Туг' Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 ΗΪ3 Азп А1а Ьуз· ТЬг Ьуз Рго Агд
85 90 95
С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1
100 105 110
Ьеи ΗΪ3 С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз (Ни Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег
115 120 125
Азп Ьуз А1а Ьеи Рго Зег Зег Не (Ни Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз
130 135 140
С1у С1п Рго Агд С1и Рго <Ип Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго’ Зег Агд Азр
4 Л Г- •1 г о хэи 155 Л г г\ ха и
С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе
165 170 175
Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 Б1и Тгр С1и Зег Азп (Пу С1п Рго (Ии
180 185 190
Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр (Ну Зег РЬе
195 200 205
РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п (Ну
210 215 220
Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 Мер ΗΪ3 С1и А1а Ьеи Н1з Азп Н1з Туг
225 230 235 240
ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
245 250
<210> 32 <211> 762
- 54 007275 <212> ΌΝΑ .
<213> Ното зарЬепз <220> · <221> СЬЗ · <222> (7)...(759) <223> Модифицированный иммуноглобулиновый фрагмент <400> 32 ддабсс абд аад сас ебд бдд ббс ббс сбс ебд ебд дбд дед дсб ссс 48
Меб Ьуз НЬз Ьеи Тгр РЬе РЬе Ьеи Ьеи Ьеи УаЬ А1а АЬа Рго 15 10
ада Агд 15 бдд Тгр дбе УаЬ ебд Ьеи бсс Зег дад СЬи 20 ссс Рго ааа Ьуз бсб Зег бса Зег дас Азр 25 ааа Ьуз ас б ТЬг сас НЬз аса ТЬг бде Суз 30 96
сса сед бде сса дса ссб да а дсс дад ддд дса ссд бса дбе ббс сбс 144
Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и А1а СЬи СЬу АЬа Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи
35 40 45
Ебс ссс сса ааа ссс аад дас асе сбс абд абс бсс едд асе ссб дад 192
РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Меб 1Ье Зег Агд ТЬг Рго СЬи
50 55 60
дбе аса бде дбд дбд дбд дас дбд аде сас даа дас ссб дад дбе аад 240
УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег Н13 СЬи Азр Рго СЬи УаЬ Ьуз
65 70 75
бб.с аас бдд бас дбд дас ддс дбд дад дкд саб ааб дсс аад аса аад .'288
РЬе Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз -
80 85 90-
сед едд дад дад сад бас аас аде асд бас едб дбд дбе аде дбе сбс 336
Рго Агд СЬи СЬи СЬп Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ Зег УаЬ Ьеи
95 100 105 110
асе дбе ебд сас сад дас бдд ебд ааб ддс аад дад бас аад бде аад 384
ТЬг УаЬ Ьеи НЬз С1п Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз
115 120 125
дбе бсс аас ааа дсс сбс сса бсс бсс абс дад ааа асе абс бсс ааа 432
УаЬ Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго Зег Зег 11е СЬи Ьуз ТЬг 1Ье Зег Ьуз
130 135 140
дес ааа ддд сад ссс еда даа сса сад дбд бас асе ебд ссс сса бсс 480
АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд С1и Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег
145 150 155
едд даб дад ебд асе аад аас сад дбе аде ебд асе бде ебд дбе ааа 528
Агд Азр СЬи Ьеи ТЬг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи УаЬ Ьуз
160 165 170
ддс ббс баб ссс аде дас абс дсс дбд дад бдд дад аде ааб ддд сад 576
СЬу РЬе Туг Рго Зег Азр 11е АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег Азп СЬу СЬп
175 180 185 190
- 55 007275
ссд дад аас Рго <31и Азп аас Азп Пас Туг 195 аад асе асд Ткг
Ьуз Ткг
Псс Икс НПс сНс Нас аде аад сПс
Зег Рке РИе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи
210
сад ддд аас дПс Икс Пса Идс Псс
(31п С1у Азп Уа1 Рке Зег Суз Зег
225 - 230
сас Пас асд сад аад аде сНс Псс
ΗΪ3 Туг Ткг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег
240 245
<210> 33
<211> 251
<212> РКТ
<213> Ното зарЬепз
ссП Рго ссс Рго 200 дьд Уа1 сНд Ьеи дас Азр Псс Зег дас Азр 205 ддс С1у 624
асе дьд дас аад аде адд Ндд сад 672
Ткг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п
215 220
дкд анд сап дад дсН сНд сас аас 720
Уа1 МеП ΗΪ3 С1и А1а Ьеи НЬз Азп
235
сНд НсН ссд ддь ааа Ида 762
Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
250
<400> 33
Мек Ьуз НЬз Ьеи Тгр Рке Рке Ьеи Ьеи Ьеи УаЬ А1а А1а Рго Агд Тгр
1 5 10 15
Уа1 Ьеи Зег С1и Рго Ьуз Зег Зег Азр Ьуз Ткг НЬз Ткг Суз Рго Рго
20 25 30
Суз Рго А1а Рго С1и А1а С1и С1у А1а Рго Зег \7а1 Рке Ьеи Рке Рго
35 40 45
Рго Ьуз Рго Ьуз Азр Ткг Ьеи Мек 11е Зег Агд Ткг Рго СЬи Уа1 Ткг
50 55 60
Суз νβΐ Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег НЬз С1и Азр Рго С1и· Уа1 Ьуз Рке Азп
65 70 75 80
Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 НЬз Азп А1а Ьуз Ткг Ьуз Рго Агд
85 •90 95
С1и С1и С1п Туг Азп Зег Ткг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи Ткг Уа1
100 105 110
Ьеи НЬз С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег
115 120 125
Азп Ьуз А1а Ьеи РГО Зег Зег 11е С1и Ьуз Ткг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз
130 135 140
С1у С1п Рго Агд С1и РГО С1п Уа1 Туг' Ткг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр
145 150 155 160
С1и Ьеи Ткг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи Ткг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у Рке
165 170 175
Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго СЬи
180 185 190
Азп Азп Туг Ьуз Ткг Ткг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег Рке
195 200 205
Рке Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи Ткг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у
210 215 220
Азп Уа1 Рке Зег- Суз Зег \7а1 Мек НЬз С1и А1а Ьеи НЬз Азп НЬз Туг
225 230 235 240
Ткг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
245 250
- 56 007275 <210> 34 .
<211> 759 <212> ЬЫА <213> Ното зараепз · <220>
<221> СЬЗ <222> (7)...(756) <223> Модифицированный иммуноглобулиновый фрагмент <400> 34 ..
ууаиСС а с. у а. а. у СаС Сиу иуу ииС сиС СиС Сиу Сиу уиу уСу уСи ССС48
Мер Ьуз ΗΪ3 Ьеи Тгр РЬе РЬе Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 А1а А1а Рго 1510
ада Агд 15 Едд Тгр дрс Уа1 сРд Ьеи Рсс Зег дад С1и 20 ССС Рго ааа Ьуз РсР Зег Рса Зег дас Азр 25 ааа Ьуз а.сР ТЬг сас Н13 аса ТЬг Рдс Суз 30 96
сса ссд Рдс сса дса ССР даа дсс дад ддд дса ссд Рса дрс РРс сРс 144
Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и А1а С1и С1у А1а Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи
35 40 45
РРс ССС сса ааа ССС аад дас асе сРс аРд аРс Рсс едд асе ССР дад ' 192
РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мер 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и
50 55 60
дрс аса Рдс дбд дбд дбд дас д^д аде сас даа дас ССР дад дрс аад 240
Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег ΗΪ3 С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз
65 70 75
РРс аас Рдд Рас дрд дас ддс дбд дад дрд саР ааР- дсс аад аса аад 288
РЬе Аз η Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 ΗΪ3 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз
80 85 90
ссд едд дад дад сад Рас аас аде асд Рас сдр дрд др с аде дрс сРс 336
Рго Агд (31и С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи
95 100 105 110
асе дрс сРд сас сад дас ьдд сРд ааР ддс аад дад Рас аад Рдс аад 384
ТЬг Уа1 Ьеи ΗΪ5 С1п Азр тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз
115 120 125
дрс Рсс аас ааа дсс сРс сса Рсс Рсс аРс дад ааа асе аРс Рсс ааа 432
Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго Зег Зег 11е С1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз
130 135 140
дес ааа дд? сад ССС еда даа сса сад дрд Рас асе сРд ССС сса Рсс 480
А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег
145 150 155
едд даб дад сРд асе аад аас сад дрс аде сРд асе Рдс сРд дрс ааа 528
Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз
160 165 170
ддс РРс РаР ССС аде дас аРс дсс дрд дад рдд дад аде ааР ддд сад 576
С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п
- 57 007275
175 180 185 190
ссд дад аас аас Сас аад асе асд ссС ссс дСд сСд дас Ссс дас ддс 624
Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у
195 200 205
Ссс ссс ССс сСс Сас аде аад ССС асе дЕд дас аад аде адд Сдд сад 672
Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п
210 215 220
сад ддд аас дСс ссс. Сса Сдс Ссс д£д аСд саС дад дсС сСд сас аас 720
С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеС ΗΪ3 С1и А1а Ьеи Нхз Азп
225 230 235
сас Сас асд сад аад аде сСс Ссс сСд СсС ссд ддС С да 759
Нхз Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
240 245 250
<210> 35 <211> 250 <212> РЕТ <213> Ното зариепз <400> 35
МеС Ьуз Низ Ьеи Тгр РЬе РЬе Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 А1а А1а Рго Агд Тгр
1 5 10 15
Уа1 Ьеи Зег С1и Рго Ьуз Зег Зег Азр Ьуз ТЬг Низ ТЬг Суз Рго Рго
20 25 30
Суз Рго А1а Рго С1и А1а С1и С1у А1а Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго
35 40 45
Рго Ьуз Рго Ьуз .Азр .ТЬг Ьеи МеС 11е Зег Агд ТЬг· Рго С1и Уа1 ТЬг
50 55 60
Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Низ С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп
65 70 75 80
Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Низ Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд
85 90 95
С1и С1и (31п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1
100 105 110
Ьеи Низ С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег
115 120 125
Азп Ьуз А1а Ьеи Рго Зег Зег 11е С1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз
130 135 140
С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр
145 150 155 160
С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе
165 170 175
Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и
180 185 190
Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе
195 200 205
РЬе Ьеи Туг Зег· Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у
210 215 220
Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеС Низ С1и А1а Ьеи Низ Азп Низ Туг
225 230 235 240
ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 61у
245 250
- 58 007275 <210> 36 <211> 762 <212> ΏΝΑ <213> Ното зариепз <220>
<221> СОЗ <222> (7)...(759) <223> Модифицированный иммуноглобулиновый фрагмент <400> 36 ддаесс айд аад сас ейд едд еес еес ебс сед ейд дйд дед дсе ссс 48
Мей Ьуз Нхз Ьеи Тгр Рйе Рйе Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 А1а А1а Рго
5 ' 10 '
ада Агд 15 едд Тгр дйс Уа1 сед Ьеи есс Зег дад С1и 20 ссс Рго ааа Ьуз есе Зег еде Суз дас Азр .25 ааа Ьуз асе Тйг сас ΗΪ3 аса ТЬг Где Суз 30 96
сса ссд еде сса дса ссе даа сес сед ддд дда ссд йса дес еес сес 144
Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у СЯу Рго Зег Уа1 Рйе Ьеи
35 40 45
еес ссс сса ааа ссс аад дас асе сес айд аес есс едд асе ССЙ дад 192
Рке Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЙГ Ьеи Мей 11е Зег Агд Тйг Рго С1и
50 55: 60
дйс аса еде дед дйд дед дас дед аде. сас даа дас ССЙ дад дес аад 240
Уа1 ТЙГ Суз Уа1 ν31 νθΐ Азр Уа1 Зег ΗΪ3 С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз
65 70 75
еес аас Едд еас дед дас ддс дед дад дед сае аае дсс аад аса аад 288
Рйе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и- Уа1 ΗΪ3 Азп А1а Ьуз ΤΪ1Γ Ьуз
80 85 90
ссд едд дад дад сад еас саа аде асд еас сде дед дес аде дес сес 336
Рго Агд 61и С1и С1п Туг С1п Зег ТЙГ Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи
95 100 105 110
асе дйс сед сас сад дас едд сед аае ддс аад дад еас аад еде аад 384
ТЬг Уа1 Ьеи ΗΪ3 С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз
115 120 125
дес есс аас ааа дсс сес сса дсс ссс айс дад ааа асе аес есс ааа 432
Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз
130 135 140
дсс ааа ддд сад ссс еда даа сса сад дед еас асе сед ссс сса есс 480
А1а Ьуз СЯу С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЙГ Ьеи Рго Рго Зег
145 150 155
едд дае дад ейд асе аад аас сад дес аде сед асе еде сед дйс ааа 528
Агд Азр С1и Ьеи Тйг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЙГ Суз Ьеи Уа1 Ьуз
160 165 170
- 59 007275
ддс РРС РаР ссс аде дас аРс дсс дрд дад рдд дад аде ааР ддд сад 576
С1у РЬе туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п
175 180 185 190
ссд дад аас аас Рас аад асе асд ссС ссс дрд сРд дас Рсс е дас ддс 624
Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у
195 200 205
Рсс РРс РРс сРс Рас аде аад сРс асе дрд дас аад аде адд Рдд сад 672
Зег РЬе РЬе Ьеи туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п
210 • - 215 220
сад ддд аас дРс РРс Рса Рдс Рсс дрд аРд саР дад дсР сРд сас аас 720
С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 Мер Низ С1и А1а Ьеи Низ Азп
225 230 235
сас Рас асд сад а ад аде сЬс Ссс сРд РсР ссд ддр ааа Рда 762
Низ туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
240 245 250
<210> 37
<211> 251
<212> РКТ
<213> Ното
<400> 37
Мер Ьуз Низ Ьеи Тгр РЬе РЬе Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 А1а А1а Рго Агд Тгр
1 5 10 15
Уа1 Ьеи Зег С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз· ТЬг Низ ТЬг Суз Рго Рго
20 25 30
Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у. Рго Зег Уа1- РЬе Ьеи РЬе Рго
35 40 45
Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеР 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг
50 55 60
Суз 17а 1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Низ С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп
65 70 75 80
Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Низ Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд
85 90 95
С1и С1и С1п Туг С1п Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1
100 105. 110
Ьеи Низ С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег
115 120 125
Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз
13 0 135 140
С1у <31п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр
145 150 155 160
С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе
165 170 175
Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и
180 185 190
Азп Азп Туг Ьуз· ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе
195 200 205
РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у
210 215 220
Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеР Низ С1и А1а Ьеи Низ Азп Низ Туг
225 230 235 240
ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
245 250
- 60 007275 <210> 38 <211> 762 <212> ША <213> Ното зарЬепз <220>
<221> СЬЗ ..
<222> (7) . . . (759)’ <223> Модифицированный иммуноглобулиновый фрагмент <400> 38 ддаксс акд аад сас скд кдд ккс ккс скс скд скд дкд дед дек ссс48
Мек Ьуз НЬз Ьей Тгр РЬе РЬе Ьей Ьей Ьей УаЬ А1а А1а Рго 1510
ада Агд 15 кдд Тгр дке УаЬ скд Ьей Ссс Зег дад СЬи 20 ссс Рго ааа Ьуз кек Зег кеа Зег дас Азр 25 ааа Ьуз ас к ТЬг сас НЬз аса ТЬг кде Суз 30 96
сса ссд кде сса дса сск даа скс скд ддд дда ссд кеа дке ккс скс 144
Рго Рго Суз Рго АЬа Рго СЬи Ьей Ьей СЬу СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Ьей
35 40 4-5
ккс ссс сса ааа ссс аад дас асе скс акд акс ксс едд асе сск дад 192
РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьей Мек 1Ье Зег Агд ТЬг Рго СЬи
50 55- 60
дке аса кде дкд дкд дкд дас дкд аде сас даа дас· сск дад дке аад 240
УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег НЬз СЬи Азр Рго СЬи УаЬ Ьуз
65 70 75
ккс аас ндд кас дкд дас ддс дкд дад дкд сак аак дсс аад аса аад 288
РЬе Азп. Тгр Туг Уа1 Азр С1у УаЬ С1и УаЬ НЬз Азп А1а ьуз ТЬг Ьуз
80 85 90
ссд едд дад дад сад кас аас аде асд кас едк дкд дке аде дке скс 336
Рго Агд СЬи СЬи СЬп Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ Зег УаЬ Ьей
95 100 105 110
асе дке скд сас сад дас кдд скд аак ддс аад дад кас аад кде аад 384
ТЬг УаЬ Ьей НЬз СЬп Азр Тгр Ьей Азп СЬу Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз
115 120 125
дке ксс аас ааа дсс скс сса дсс ссс акс дад ааа асе акс ксс ааа 432
УаЬ Зег Азп Ьуз АЬа Ьей Рго АЬа Рго 11е СЬи Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз
130 135 140
дсс ааа ддд сад- ссс еда даа сса сад дкд кас асе скд ссс сса ксс 480
АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьей Рго Рго Зег
145 150 155
едд дак дад скд асе аад аас сад дке аде скд асе кде скд дке ааа 528
Агд Азр СЬи Ьей ТЬг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьей ТЬг Суз Ьей УаЬ Ьуз
160 165 170
ддс СЬу 175 ббс РЬе баб Туг ссс Рго аде Зег дас Азр 180 абс 11е дсс АЬа дбд УаЬ дад СЬи ьдд Тгр 185 дад СЬи аде Зег ааб Азп ддд СЬу сад СЬп 190 576
ссд дад аас аас бас аад асе асд ссб ссс дбд ебд дас бсс дас ддс 624
Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго УаЬ Ьеи Азр Зег Азр СЬу
195 200 205
бсс ббс ббс сбс бас,. аде аад сбс асе дбд дас аад аде адд бдд сад 672
Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг УаЬ Азр Ьуз Зег Агд Тгр СЬп
210 215 220
сад .ддд аас дбе ббс бса бде бсс дбд абд саб дад дсб ебд сас аас 720
СЬп СЬу Азп УаЬ РЬе Зег Суз Зег УаЬ Меб НЬз СЬи АЬа Ьеи НЬз Азп
225 230 235
сас бас асд сад аад аде сбс бсс ебд бсб сед ддб ааа бда 762
НЬз Туг ТЬг СЬп Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго СЬу Ьуз
240 245 250 <210> 39 <211> 251 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 39 ' . '
Меб Ьуз НЬз Ьеи Тгр РЬе РЬе Ьеи Ьеи Ьеи УаЬ АЬа А1а Рго Агд Тгр
1 5 10 15
УаЬ Ьеи Зег СЬи Рго Ьуз Зег Зег Азр Ьуз ТЬг Нгз ТЬг Суз Рго Рго
20 25 30
Суз Рго АЬа Рго СЬи Ьеи Ьеи СЬу СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго
35 40 45
Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Меб Не Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг
50 55 60
Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег НЬз СЬи Азр Рго СЬи УаЬ Ьуз РЬе Азп
65 70 75 80
Тгр Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд
85 90 95
СЬи СЬи СЬп Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ Зег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ
100 105 ыо
Ьеи НЬз СЬп Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег
115 120 125
Азп Ьуз АЬа Ьеи Рго АЬа Рго Не СЬи Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз АЬа Ьуз
130 1.3 5 140
СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр
145 150 155 160
СЬи Ьеи ТЬг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РЬе
165 170 175
Туг Рго Зег Азр Не АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег Азп СЬу СЬп Рго СЬи
180 185 190
Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго УаЬ Ьеи Азр Зег Азр СЬу Зег РЬе
195 200 205
РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг УаЬ Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п СЬп СЬу
210 215 220
Азп УаЬ РЬе : Зег Суз Зег УаЬ Меб НЬз СЬи А1а Ьеи НЬз Азп НЬз Туг
225 230 235 240
ТЬг СЬп Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго СЬу Ьуз
245 250
- 62 007275 <210> 40 <211> 29 <212> ΌΝΑ <213> Ното зархепз <220> ’ <223> ПЦР-праймер' <400> 40 каккаддссд дссассакдд акдсаакда '29 <210> 41 <211> 29 <212> ША <213> Ното зариепз <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 41' кдаадакккд ддскссккда дасскддда29 <210> 42 <211> 29 '' <212> ϋΝΑ' <213> Ното зариепз · · '’ <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 42 ксссаддкск сааддадссс аааксккса29 <210> 43 <211> 30, <212> ϋΝΑ <213> Ното -зархепз <220>
<223> ПЦР-праймер' <400> 43’
Ьдаадакккд ддсксдкЬск сасадаадка30 <210> 44 <211> 31 ·’ <212> ША <213> Ното зариепз <220> ' <223> ПЦР-праймер
- 63 007275 <400> 44 аРасРСсОдк дадаасдадс ссаааСсРРс а 31 <210> 45 <211> 30 <212> ϋΝΑ <213> Ното зариепз <220>
<223> пцР-праймер · <400> 45
РББдддсесд сБссСдадсР РдООсБсаса <210> 46 <211> 28 <212> ΏΝΑ <213> Ното зариепз <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 46 сксаддадсд адсссаааБс Ыссадаса <210> 47 <211> 26 <212> ΗΝΑ <213> Ното зариепз <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 47
ОРОдддсОсс сОдадсОсРд дкддаа <210> 48 <211> 28 <212> ϋΝΑ <213> Ното зариепз <220>
<223> пЦР-праймер <400> 48 .
дадсЪсаддд адсссаааРс БОсадаса <210> 49 <211> 1214 <212> ϋΝΑ <213> Ното зариепз <220>
<221> 0ϋ3 <222> (17)...(1192) · <223> Кодирующая последовательность для слитого белка
- 64 007275 <400> 49
РаРРаддссд дссасс аРд даР дса аРд аад ада ддд сРс Рдс РдР дРд сРд 52 МеР Азр А1а Мер Ьуз Агд (21у Ьеи Суз Суз Уа1 Ьеи 15 10
сРд Ьеи сРд Ьеи РдР Суз 15 ддс С1у дсс А1а дрс Уа1 РРс РЬе дрр Уа1 20 Рсд Зег сРс Ьеи аде Зег сад С1п даа С1и 25 аРс Не саР Н13 дсс А1а 100
дад РРд ада сдс РРС. сдр ада дсР аРд ада Рсс Рдс ссс даа дад сад 148
С1и Ьеи Агд Агд РЬе Агд Агд А1а МеР Агд Зег Суз Рго С1и (31и (31п
30 35 40
Рас рдд даР ссР сРд сРд ддр асе Рдс аРд Рсс Рдс ааа асе аРР Рдс 196
Туг Тгр Азр Рго Ьеи Ьеи С1у ТЬг Суз Мер Зег Суз Ьуз ТЬг 11е Суз
45 50 55 60
аас саР сад аде сад сдс асе рдр дса дсс РРс Рдс адд Рса сРс аде 244
Азп Н13 (31п Зег С1п Агд ТЬг Суз А1а А1а РЬе Суз Агд Зег Ьеи Зег
65 70 75
Рдс сдс аад дад саа ддс аад РРс РаР дас саР сРс сРд адд дас Рдс 292
Суз Агд Ьуз С1и С1п (31у Ьуз РЬе Туг Азр ΗΪ3 Ьеи Ьеи Агд Азр Суз
80 85 90
аРс аде РдР дсс Рсс аРс РдР дда сад сас ссР аад саа рдр дса Рас 340
11е Зег Суз А1а Зег 11е Суз С1у С1п Η13 Рго Ьуз С1п Суз А1а Туг
95 100 105
РРс рдр дад аас аад сРс адд аде сса дрд аас сРР сса сса дад сРс 388
РЬе Суз С1и Азп Ьуз Ьеи Агд Зег Рго Уа1 Азп Ьеи Рго Рго С1и Ьеи
но 115 120
а гтгг а гтя г'я гт Г'ГГГГ = гг<- ггггп гт-Ь 1-ГЯЯ • я^я г* ее-^ £Са ГТ Я г* З.З.С к Г'ГГ ГТ ГТЯ 43 6
'-ьзьз аь1-4 5 ее а У’-*'-* Э Ν*'— '-’-’Э 5Э Я
Агд Агд С1п Агд Зег С1у С1и Уа1 (31и Азп Азп Зег Азр Азп Зег С1у
125 130 135 140
адд Рас саа дда ррд дад сас ада ддс Рса даа дса адр сса дсР сРс 484
Агд Туг С1п С1у Ьеи С1и ΗΪ3 Агд С1у Зег С1и А1а Зег Рго А1а Ьеи
145 .< 150 155
сса ддр сРс аад дад ссс ааа РсР Рса дас ааа асР сас аса Рдс сса 532
Рго С1у Ьеи Ьуз (31 и Рго Ьуз Зег Зег Азр Ьуз ТЬг ΗΪ3 ТЬг Суз Рго
160 165 170
ссд Рдс сса дса ссР даа дсс дад ддд дса ссд Рса дрс РРс сРс РРс 580
Рго Суз Рго А1а Рго С1и А1а С1и С1у А1а Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе
175 180 185
ссс сса ааа ссс аад дас асе сРс аРд аРс Рсс едд асе ссР дад дрс 628
Рго Рго Ьуз Рго- Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеР Не Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1
190 195 200
аса Рдс дрд дкд дрд дас дрд аде сас даа дас ссР дад дРс аад РРс 676
ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Н1з С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе
205 210 215 220
- 65 007275
аас Азп едд Тгр еас Туг дед Уа1 дас Азр 225 ддс С1у дед Уа1 дад С1и дед Уа1 сае Низ 230 аае Азп дсс А1а аад Ьуз аса ТЬг аад Ьуз 235 ссд Рго 724
едд дад дад сад еас аас аде асд еас еде дед дес аде дес сес асе 772
Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг
240 245 250
дес сед сас сад дас едд сед аае ддс аад дад еас аад еде аад дес 820
Уа1 Ьеи Низ С1п Азр. Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1
255 260 265
есс аас ааа дсс сес сса есс есс аес дад ааа асе аес есс ааа дсс 868
Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго Зег Зег 11е С1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а
270 275 280
ааа ддд сад ссс еда даа сса сад дед еас асе сед ссс сса есс едд 916
Ьуз 61у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд
285 290 295 300
дае дад сед асе аад аас сад дес аде сед асе еде сед дес ааа ддс 964
Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у
305 310 315
еес еае ссс аде дас аес дсс дед дад едд дад аде аае ддд сад ссд 1012
РЬе Туг .Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп (31у С1п Рго
320 325 330
дад аас аас еас аад асе асд ссе ссс дед сед дас есс дас ддс есс 1060
С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 .Ьеи Азр/ Зег Азр С1у Зег
335 340 345
еес еес сес еас аде аад сес асе дед дас аад аде адд едд сад сад 1108
РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п
350 355 360
ддд аас дес еес еса еде есс дед аед сае дад дсе сед сас аас сас 1156
С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 Мее Н13 С1и А1а Ьеи ΗΪ3 Азп ΗΪ3
365 370 375 380
еас асд сад аад аде сес есс сед есе' ссд дде ааа еааесеадад 1202
Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
385 390
дсдсдссаае 1 за 1214
<210> 50 <211> 392 <212> РКТ <213> Ното зариепз <400> 50
Мее Азр А1а Мее Ьуз Агд С1у Ьеи Суз Суз Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи Суз С1у
1 5 10 15
А1а Ча1 РЬе Уа1 Зег Ьеи Зег С1п С1и 11е Низ А1а С1и Ьеи Агд Агд
20 25 30
- 66 007275
РЬе Агд Агд А1а Мек Агд Зег Суз 40 Рго О1и С1и С1п Туг 45 Тгр Азр Рго
35
Ьеи Ьеи С1у ТЬг Суз Мек Зег Суз Ьуз ТЬг 11е Суз Азп Низ С1п Зег
50 55 · 60
С1п Агд ТЬг Суз А1а А1а РЬе Суз Агд Зег Ьеи Зег Суз Агд Ьуз С1и
65 70 75 80
С1п С1у Ьуз РЬе Туг Азр Низ Ьеи Ьеи Агд Азр Суз 11е Зег Суз А1а
85 90 95
Зег 11е Суз С1у С1п Низ Рго Ьуз С1п Суз А1а Туг РЬе Суз С1и Азп
100 105 110
Ьуз Ьеи Агд Зег Рго. Уа1 Азп Ьеи Рго Рго С1и Ьеи Агд Агд С1п Агд
Т 1 С •Т 'П п ЮС
хи х^и и
Зег С1у С1и Уа1 С1и Азп Азп Зег Азр Азп Зег С1у Агд Туг С1п С1у
13 0 135 140·
Ьеи С1и Низ Агд С1у Зег С1и А1а Зег Рго А1а Ьеи Рго С1у Ьеи Ьуз
145 150 155 160
С1и Рго Ьуз Зег Зег Азр Ьуз ТЬг Низ ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а
165 170 175
Рго С1и А1а С1и С1у А1а Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго
180 185 190 -·
Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мек 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1
195 200 205
Уа1 Азр Уа1 Зег Низ С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1
210 215 220
Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Низ Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п
225 230 235 240
дуг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Низ С1п
245 250 255
Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а
. 260 265 270
Щей Рго Зег Зег 11е <31и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз О1у С1п Рго
275 280 285
Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТЬг
290 295 300
/-« Ί__ т г _ 1 «-ТЧ1 ▼ ▼_ т Ί - _ Т-Щ — гги г»
ьуз АйП. <^ХХ1 Ус1Х £>ег ьеи Х’ПГ ьеи ' ν<11 ьу а ^χγ гне иуи гх и оех
305 310 315 320
Азр Не А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп. Е1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг
325 330 335
Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг
340 345 350
Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЬе
355 360 355
Зег Суз Зег Уа1 Мек Низ С1и А1а Ьеи Низ Азп Низ Туг ТЬг С1п Ьуз
370 375 380
Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
385 390· <210> 51 <211> 1070' <212> ΌΝΑ, <213> Ното зархепз <220>
<221> СОЗ <222> (17) . . . (1048)· <223> Кодирующая последовательность для слитого белка
- 67 007275 <400> 51 каккаддссд дссасс акд дак дса акд аад ада ддд скс кде кдк дкд скд 52 Мек Азр А1а Мек Ьуз Агд СЬу Ьей Суз Суз УаЬ Ьей 15 10
скд Ьей скд Ьей кдк Суз 15 ддс СЬу дсс А1а дке УаЬ ккс РЬе дек УаЬ 20 кед Зег скс Ьей аде Зег сад СЬп даа СЬи 25 акс Не сак НЬз дсс А1а 100
дад ккд ада еде кке едк ада дек акд ада ксс кде ссс даа дад сад 148
СЬи Ьей Агд Агд РЬе Агд Агд АЬа Мек Агд Зег Суз Рго СЬи СЬи СЬп
30 35 40
кас кдд дак сск скд скд ддк асе кде акд ксс кде ааа асе акк кде 196
Туг Тгр Азр Рго Ьей Ьей СЬу ТЬг Суз Мек Зег Суз Ьуз ТЬг Не Суз
45 50 55 60
аас сак сад аде сад сдс асе кдк дса дсс ккс кде адд кеа скс аде 244
Азп НЬз СЬп Зег СЬп Агд ТЬг Суз АЬа АЬа РЬе Суз Агд Зег Ьей Зег
65 70 75
кде сдс аад дад саа ддс аад ккс как дас сак скс скд адд дас кде 292
Суз Агд Ьуз СЬи СЬп С1у Ьуз РЬе Туг Азр НЬз Ьей Ьей Агд Азр Суз
80 85 90
акс аде кдк дсс ксс акс кдк дда сад сас сск аад саа кдк дса кас 340
Не Зег Суз АЬа Зег Не Суз СЬу СЬп НЬз Рго Ьуз СЬп Суз АЬа Туг
95 100 105
ккс кдк дад аас дад ссс ааа кек кеа дас ааа аск сас аса кде сса 388
РЬе Суз СЬи Азп СЬи Рго Ьуз Зег Зег Азр Ьуз ТЬг НЬз ТЬг Суз Рго
110 115 120
ссд кде сса дса сск даа дсс дад ддд дса сед кеа дке ккс скс ккс 436
Рго Суз Рго АЬа Рго СЬи А1а СЬи СЬу АЬа Рго Зег УаЬ РЬе Ьей РЬе
125 130 135 140
ссс сса ааа ссс аад дас асе скс акд акс ксс едд асе сск дад дке 484
Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьей Мек 11е Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ
145 150 155
аса кде дкд дед дкд дас дкд аде сас даа дас сск дад дке аад ккс 532
ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег НЬз СЬи Азр Рго СЬи УаЬ Ьуз РЬе
160 165 170
аас йдд кас дед дас ддс дед дад дкд сак аак дсс аад аса аад ссд 580
Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго
175 180 185
едд дад дад сад кас аас аде асд кас едк дед дке аде дке скс асе 628
Агд СЬи СЬи СЬп Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ Зег УаЬ Ьей ТЬг
190 195 200
дке скд сас сад дас едд скд аак ддс аад дад кас аад кде аад дке 676
УаЬ Ьей НЬз СЬп Азр Тгр Ьей Азп СЬу Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ
205 210 215 220
- 68 007275
ОСС Зег аас Азп ааа Ьуз дес А1а сСс Ьеи 225 сса Рго Ссс Зег Ссс Зег аСс 11е дад С1и 230 ааа Ьуз асе ТЬг аСс 11е Ссс Зег ааа Ьуз 235 дес А1а 724
ааа ддд сад ссс еда даа сса сад дед Сас асе сСд ссс сса Ссс сдд 772
Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго <31п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго 'Зег Агд
240 245 250
даС дад сСд асе аад аас сад дес аде сСд асе Сде сСд дСс ааа ддс 820
Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз. Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у
255 260 265
ССс ЕаС ссс аде дас аСс дес дед дад Сдд дад аде аас ддд сад ссд 868
РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго
270 275 280
дад аас аас Сас аад асе асд ссС ссс дед сСд дас Ссс дас. ддс Ссс 916
С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег
285 290 295 300
ссс ССс сСс Сас аде аад сСс асе дед дас аад аде адд Сдд сад сад 964
РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр <31п С1п
305 310 315
ддд аас дСс ССс Сса Еде Ссс дСд аСд саС дад де С сСд сас аас сас 1012
С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеС ΗΪ3 (Ни А1а Ьеи Низ Азп Н13
320 325 330
Сас асд сад аад аде сСс Ссс сСд СсС ссд ддс ааа СааСсСадад 105 8
Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
335 340 дсдсдссааС Са
1070 <210> 52 <211> 344 <212> РЕТ <213> Ното заргепз <400> 52
МеС Азр А1а МеС Ьуз Агд С1у Ьеи Суз Суз Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи Суз С1у
1 5 10 15
А1а Уа1 РЬе Уа1 Зег Ьеи Зег Θΐη С1и 11е Η13 А1а С1и Ьеи Агд Агд
20 25 30
РЬе Агд Агд А1а МеС Агд Зег Суз Рго С1и С1и С1п Туг Тгр Азр Рго
35 40 45
Ьеи Ьеи С1у ТЬг Суз МеС Зег Суз Ьуз ТЬг 11е Суз Азп Нхз С1п Зег
50 55 60
С1п Агд ТЬг Суз А1а А1а РЬе Суз Агд Зег Ьеи Зег Суз Агд Ьуз С1и
65 70 75 80
С1п С1у Ьуз РЬе· Туг Азр Н1з Ьеи Ьеи Агд Азр Суз 11е Зег Суз А1а
85 90 95
Зег 11е Суз С1у С1п ΗΪ3 Рго Ьуз С1п Суз А1а Туг РЬе Суз С1и Азп
100 105 но
С1и Рго Ьуз Зег Зег Азр Ьуз ТЬг ΗΪ3 ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а
115 120 125
- 69 007275
Рго СЬи АЬа 130 СЬи СЬу АЬа Рго З.ег УаЬ 135 РЬе Ьеи РЬе 140 Рго Рго Ьуз Рго
Ьуз Азр ТЬг Ьеи Меб ЬЬе Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ
145 150 155 160
УаЬ Азр УаЬ Зег НЬз СЬи Азр Рго СЬи УаЬ Ьуз РЬе Азп Тгр Туг УаЬ
165 170 175
Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп
180 185 190
Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ Зег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи НЬз СЬп
195 200 205
Азр Тгр Ьеи Азп СЬу. Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз АЬа
210 215 220
Ьеи Рго Зег Зег 11е СЬи Ьуз ТЬг ЬЬе Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго
225 230 235 240
Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр СЬи Ьеи ТЬг
245 250 255
Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РЬе Туг Рго Зег
260 265 270
Азр 11е АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг
275 280 285
Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго УаЬ Ьеи Азр Зег Азр СЬу Зег РЬе РЬе Ьеи Туг
290 295 300
Зег Ьуз Ьеи ТЬг УаЬ Азр Ьуз Зег Агд Тгр СЬп СЬп СЬу Азп УаЬ РЬе
305 310 315 320
Зег Суз Зег УаЬ Меб НЬз СЬи АЬа Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТЬг СЬп Ьуз
325 330 335
Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго СЬу Ьуз
340
<210> 53 <211> 1082 <212> ϋΝΑ <213> Ното зарЬепз <220>
<221> СБЗ <222> (17)...(1060) <223> Кодирующая последовательность для слитого белка <400> 53 _ баббаддссд дссасс абд даб дса абд аад ада ддд сбс бде бдб дбд ебд 52 Меб Азр АЬа Меб Ьуз Агд СЬу Ьеи Суз Суз УаЬ Ьеи 15 10
ебд ебд бдб ддс Суз СЬу 15 дсс АЬа дбе УаЬ ббс дбб бед Зег сбс аде сад даа абс ЬЬе саб НЬз дсс · АЬа 100
Ьеи Ьеи РЬе УаЬ 20 Ьеи Зег СЬп СЬи 25
дад ббд ада еде ббс едб ада дсб абд ада бсс бде ссс даа дад сад 148
СЬи Ьеи Агд Агд РЬе Агд Агд АЬа Меб Агд Зег Суз Рго СЬи СЬи СЬп
30 35 40
бас ьдд даб ссб ебд ебд ддб асе бде абд бсс бде ааа асе абб бде 196
Туг Тгр Азр Рго Ьеи Ьеи СЬу ТЬг Суз Меб Зег Суз Ьуз ТЬг ЬЬе Суз
45 50 55 60
- 70 007275
аас Азп сае Н13 сад аде сад С1п 65 сдс асе Агд ТЬг еде Суз дса А1а дсс А1а 70 еес РЬе еде Суз адд Агд еса Зег сес Ьеи 75 аде Зег 244
С1п Зег
еде еде аад дад саа ддс аад еес еае дас сае сес сед адд дас еде 292
Суз Агд Ьуз 61и 80 С1п С1у Ьуз РЬе Туг 85 Азр Низ Ьеи Ьеи Агд 90 Азр Суз
аес аде еде дсс есс аес еде дда сад сас ссе аад саа еде дса еае 340
11е Зег Суз 95 А1а Зег 11е Суз С1у 100 С1п Низ Рго Ьуз С1п 105 Суз А1а Туг
еес еде дад аас аад сес адд аде дад ссс ааа есе еса дас ааа асе 388
РЬе Суз 110 С1и Азп Ьуз Ьеи Агд 115 Зег С1и Рго Ьуз Зег 120 Зег Азр Ьуз ТЬг
сас аса Сдс сса ссд еде сса дса ссе да а дсс дад ддд дса ссд еса 436
ΗΪ5 125 ТЬг Суз Рго Рго Суз 130 Рго А1а Рго С1и А1а 135 С1и С1у А1а Рго Зег 140
дес еес сес еес ссс сса ааа ссс аад дас асе сес аед аес есс едд 484
Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго 145 Рго Ьуз Рго Ьуз Азр 150 ТЬг Ьеи Мее 11е Зег 155 Агд
асе ссе дад дес аса еде дкд дед дед дас дед аде сас даа дас ссе 532
ТЬг Рго С1и Уа1 160 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 165 Азр Уа1 Зег Низ С1и 170 Азр Рго
дад дес аад еес аас кдд Сас д£д дас ддс дед дад дБд сае аае дсс 580
С1и Уа1 Ьуз 175 РЬе Азп Тгр Туг Уа1 180 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 185 Низ Азп А1а
аад аса аад ссд едд дад дад сад Сас аас аде асд еае еде дкд дес 628
Ьуз ТЬг 190 Ьуз Рго Агд С1и С1и 195 С1п Туг Азп. Зег ТЬг 200 Туг Агд Уа1 Уа1
аде дес сес асе дес сед сас сад дас едд сед аае ддс аад дад Сас 676
Зег 205 Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи 210 Низ С1п Азр Тгр Ьеи 215 Азп С1у Ьуз С1и Туг 220
аад еде аад дес есс аас ааа дсс сес сса есс есс аес дад ааа асе 724
Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег 225 Азп Ьуз А1а Ьеи Рго 230 Зег Зег 11е 61и Ьуз 235 ТЬг
аес есс ааа дсс ааа ддд сад ссс еда даа сса сад дед еае асе сед 772
11е Зег Ьуз А1а 240 Ьуз С1у С1п Рго Агд 245 С1и Рго С1п Уа1 Туг 250 ТЬг Ьеи ·
ссс сса есс едд дае дад сед асе аад аас сад дес аде сед асе еде 820
Рго Рго Зег 255 Агд Азр С1и Ьеи ТЬг 260 Ьуз Азп С1п Уа1 Зег 265 Ьеи ТЬг Суз
сед дес ааа ддс еес еае ссс аде дас аСс дсс дьд дад едд дад аде 868
Ьеи Уа1 270 Ьуз С1у РЬе Туг Рго 275 Зег Азр 11е А1а Уа1 280 С1и Тгр С1и Зег
аае ддд сад ссд дад аас аас Сас. аад асе асд ссе ссс дед сед дас 916
Азп 285 С1у С1п Рго С1и Азп 290 Азп Туг Буз ТЬг ТЬг 295 Рго Рго Уа1 Беи Азр 300
Ссс дас ддс Ссс ССс ССс сСс Сас аде аад сСс асе дСд дас аад аде • 964
Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Беи Туг Зег Буз Беи ТЬг Уа1 Азр Вуз Зег
305 310 315
адд Сдд сад сад ддд аас дСс ССс Сса Сдс Ссс дСд аСд сас дад дсс 1012
Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеС ΗΪ3 С1и А1а
320 325 330
сСд сас аас сас Сас асд сад аад аде сСс Ссс сСд СсС ссд ддС ааа 1060
Беи Низ Азп Низ Туг ТЬг С1п Буз Зег Беи Зег Беи Зег Рго С1у Буз
335 340 345
СааСсСадад дсдсдссааС Са
1082 <210> 54 <211> 348 <212> РНТ <213> Ното зариепз <220>
<223> Слитый белок <400> 54
МеС Азр А1а МеС Вуз Агд С1у Беи Суз Суз Уа1 Беи Беи Беи Суз С1у
1 5 10 15
А1а Уа1 .РЬе Уа1 Зег Беи Зег С1п С1и 11е Низ А1а С1и Беи Агд Агд
20 25 : 30
РЬе Агд Агд А1а МеС Агд Зег Суз Рго' С1и О1и С1п Туг Тгр Азр Рго
35 40 45
Беи Беи С1у ТЬг Суз МеС Зег Суз Вуз ТЬг 11е Суз Азп Низ С1п Зег
50 55 60
С1п Агд ТЬг Суз А1а А1а РЬе Суз Агд Зег Беи Зег Суз' Агд Вуз С1и
65 70 75 80
С1п С1у Буз РЬе Туг Азр Низ Беи Беи Агд Азр Суз 11е Зег Суз А1а
85 90 95
Зег 11е Суз С1у С1п Низ Рго Буз С1п Суз А1а Туг РЬе Суз С1и Азп
100 105 110
Буз Беи Агд Зег С1и Рго Вуз Зег Зег Азр Буз ТЬг Низ ТЬг Суз Рго
115 120 125
Рго Суз Рго А1а Рго С1и А1а С1и 61у А1а Рго Зег Уа1 РЬе Беи РЬе
130 135 140
Рго Рго Буз Рго Буз Азр ТЬг Беи МеС 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1
145 150 155 160
ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Низ С1и Азр Рго С1и Уа1 Буз РЬе
165 170 175
Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Низ Азп А1а Вуз ТЬг Буз Рго
180 185 190
Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Беи ТЬг
195 200 205
Уа1 Беи Низ С1п Азр Тгр Беи Азп С1у Вуз С1и Туг Буз Суз Буз Уа1
210 215 220
Зег Азп Буз А1а Беи Рго Зег Зег 11е С1и Вуз ТЬг 11е Зег Буз А1а
225 230 235 240
Буз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Беи Рго Рго Зег Агд
245 250 255
Азр С1и Беи ТЬг Буз Азп С1п Уа1 Зег Беи ТЬг Суз Беи Уа1 Буз С1у
260 265 270
РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а· Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго
275 280 285
С1и Азп Азп Туг Буз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Беи Азр Зег Азр С1у Зег
290 295 300
РЬе РЬе Беи Туг Зег Буз Беи ТЬг Уа1 Азр Буз Зег Агд Тгр С1п С1п
305 310 315 320
С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеС Низ С1и А1а Беи Низ Азп Низ
325. 330 335
Туг ТЬг С1п Вуз Зег Беи Зег Беи Зег Рго С1у Вуз
340 345
- 72 007275 <210> 55 ' <211> 1109 <212> ΏΝΑ <213> Ното зариепз <220>
<221> СБЗ <222> (17)...(1090) <223> Кодирующая последовательность для слитого белка <400> 55 еаййаддссд дссасс айд дай дса айд аад ада ддд сес еде еде дйд ейд 52 Мей Азр А1а Мей Ьуз Агд С1у Ьеи Суз Суз Уа1 Ьеи .-5 . · - 10
ейд ейд еде Суз 15 ддс С1у дсс А1а дес Уа1 еес Рйе дее Уа1 20 есд сес' :адс Зег сад даа аес 11е сае Низ дсс А1а 100
Ьеи Ьеи Зег Ьеи С1п С1и 25
дад ййд ада сдс еес сде ада дсе аед · ада есс еде ссс даа дад сад 148
С1и Ьеи Агд Агд Рйе Агд Агд А1а Мее Агд Зег Суз Рго С1и С1и С1п
30 35 40
бас едд дае ссе сед сед дде асе еде аед есс еде ааа асе аее еде 196
Туг Тгр Азр Рго Ьеи Ьеи С1у ТЙГ Суз Мее Зег Суз Ьуз ТЙГ 11е Суз
45 50 55 60
аас сае сад аде сад сдс асе еде дса дсс еес еде адд еса сес аде 244
Азп Н1з С1п Зег С1п Агд ТИг Суз А1а А1а Рйе Суз Агд Зег Ьеи Зег
65 70 75
ьае сае СЙС Г· Г ГТ Я ГТ ГТ ГТ Я г» гтг* 292
еде сдс аад дад ч-<и.сд. ддс аад дас —а '-•а'-
Суз Агд Ьуз С1и <31п <31у Ьуз Рйе Туг Азр Низ Ьеи Ьеи Агд Азр Суз
80 85 90
айс аде еде дсс есс аес еде дда сад сас ссе аад саа еде дса еас 340
11е Зег Суз А1а- Зег 11е Суз С1у <31п Низ Рго Ьуз С1п Суз А1а Туг
95 100 105
еес еде дад аас аад СЙС адд аде сса дед аас сее сса сса дад сес 388
Рйе Суз С1и Азп Ьуз Ьеи Агд Зег Рго Уа1 Азп Ьеи Рго Рго С1и Ьеи
110 115 120
адд дад ссс ааа НсН Нса дас ааа асе сас аса Ндс сса ссд Ндс сса 436
Агд С1и Рго Ьуз Зег Зег Азр Ьуз Ткг НЬз Ткг Суз Рго Рго Суз Рго
125 130 135 / 140
дса ссС даа дсс дад ддд дса ссд Нса дес нес сНс СНс ссс сса ааа 484
А1а Рго С1и А1а С1и С1у А1а Рго Зег Уа1 Рке Ьеи Рке Рго Рго Ьуз
145 150 155
ссс аад дас асе сНс аНд аНс Нее едд асе ССН дад дне аса Ндс дед 532
Рго Ьуз Азр Ткг Ьеи МеН 11е Зег Агд Ткг Рго С1и Уа1 Ткг Суз Уа1
160 165 170
дед дед дас дед аде сас даа дас ССН дад дес аад еес аас едд Сае 580
Уа1 Уа1 Азр Уа! Зег НЬз С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз Рке Азп Тгр Туг
175 180 185
дед дас ддс дед дад дед саН ааН дсс аад аса аад ссд едд дад дад 628
Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 ΗΪ3 Азп А1а Ьуз Ткг Ьуз Рго Агд С1и С1и
190 195 200
сад Нас аас аде асд Нас еде дед дке аде дес сНс асе де с сСд сас 676
С1п Туг Азп Зег Ткг Туг Агд Уа! Уа1 Зег Уа1 Ьеи Ткг Уа1 Ьеи ΗΪ3
205 210 215 220
сад дас едд сНд аак ддс аад дад Нас аад Ндс аад дНе Ссс аас ааа 724
С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз
225 230 235
дсс сНс сса Нее Нее аНс дад ааа асе акс Ссс ааа дсс ааа ддд сад 772
А1а Ьеи Рго Зег Зег 11е 61и Ьуз. Ткг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п
240 245 .250
ссс еда даа сса сад дед Нас асе сНд ссс сса Нее едд даН дад сНд 820
Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг Ткг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи
255 260 265
асе аад аас сад дНе аде сед асе Ндс сИд дНе ааа ддс еес СаН ссс 868
Ткг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи Ткг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у Рке Туг Рго
270 275 280
аде дас аНс дсс дед дад едд дад аде ааН ддд сад ссд дад аас аас 916
Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у (21п Рго С1и Азп Азп
285 290 295 300
Нас аад асе асд ССН ссс дед сед дас Нее дас ддс Ссс СНс еес сНс · 964
Туг Ьуз Ткг Ткг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег Рке Рке Ьеи
305 310 315
Нас аде аад сНс асе дед дас аад аде адд едд сад сад ддд аас дНе 1012
Туг Зег Ьуз Ьеи Ткг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1
320· 325 330
ННс Пса Иде Нее дед аНд саН дад дсН сед сас аас сас Сае асд сад 1060
Рке Зег Суз Зег Уа! МеН ΗΪ3 С1и А1а Ьеи НЬз Азп ΗΪ3 Туг Ткг С1п
335 340 345
аад аде сНс Нее сНд · Нее ссд ддН ааа Наа НсНададдсд сдссааССа · 1109
Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи ; Зег Рго С1у Ьуз ★
350 355
- 74 007275 <210> 56 <211> 357 <212> ΡΗΤ <213> Ното зархепз <400> 56
Мер Азр А1а Мер Ьуз Агд (Пу Ьеи Суз Суз Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи Суз С1у
1 5 10 15
А1а Уа1 РЬе Уа1 Зег Ьеи Зег 51п (Ли Не ΗΪ3 А1а (Ли Ьеи Агд Агд
20 25 30
РЬе Агд Агд А1а Мер Агд Зег Суз Рго (Пи С1и 51п Туг Тгр Азр Рго
35 40 45
Ьеи Ьеи С1у ТЬг Суз Мер Зег Суз Ьуз ТЬг 11е Суз Азп Н13 С1п Зег
50 55 60
(Пп Агд ТЬг Суз А1а А1а РЬе Суз Агд Зег Ьеи Зег Суз Агд Ьуз С1и
65 70 75 80
(Пп С1у Ьуз РЬе Туг Азр ΗΪ3 Ьеи Ьеи Агд А.зр Суз Не Зег Суз А1а
85 90 95
Зег Не Суз (Ну С1п Ηί3 Рго Ьуз <31п Суз А1а Туг РЬе Суз С1и Азп
100 105 110
Ьуз Ьеи Агд Зег Рго Уа1 Азп Ьеи Рго Рго (Пи Ьеи Агд (Ни Рго Ьуз
115 120 125
Зег Зег Азр Ьуз ТЬг ΗΪ5 ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и А1а
130 135 140
(Ли С1у А1а Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго.Ьуз Азр ТЬг
145 150 155 160
Ьеи Мер Не Зег Агд ТЬг Рго (Ли Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1
165 170 175
Зег ΗΪ3 С1и Азр Рго (Ли Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр (Ну Уа1
180 185 190
С1и Уа1 ΗΪ3 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и (Ли С1п Туг Азп Зег
195 200 205
ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Н1з С1п Азр Тгр Ьеи.
210 215 220
Азп (Пу Ьуз (Ни Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго Зег
225 230 235 240
Зег Не (Ни Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз (Пу С1п Рго Агд (Ни Рго
245 250 255
(Пп Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр (Ни Ьеи ТЬг Ьуз Азп <Ип
260 265 270
Ца1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а
275 280 285
Уа1 (Пи Тгр (Пи Зег Азп (Пу С1п Рго (Ни Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг
290 295 300
Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр (Ну Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи
305 310 315 320
ТЬг Уа1 Азр Ьуз.· Зег Агд Тгр С1п С1п (Пу Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег
325 330 335
Уа1 Мер ΗΪ3 (Ли А1а Ьеи ΗΪ3 Азп ΗΪ3 Туг ТЬг (Пп Ьуз Зег Ьеи Зег
340 345 350
Ьеи Зег Рго (Пу Ьуз
355
- 75 007275 <210> 57 <211> 9 ' „ <212> ϋΝΑ <213> Ното зартепз <220>
<223> Иллюстрированная нуклеотидная последовательность <400> 57 ..
аЬдсасддд .9 <210> 58 <211> 9.
<212> ϋΝΑ <213> Ното зархепз <220> .
<223> Иллюстрированная нуклеотидная последовательность <400> 58 сссдЬдсаЬ 9
<210> 59
<211> 586
<212> ΏΝΑ
<213> Ното заргепз
<220>
<221> СЬЗ
<222> (27) . . . . (578)
<400> 5 9
дсадсЬЬдЬд сддсддсдЬс ддсасс аЬд адд еда ддд ссс едд аде сЬд едд 53
МеЬ Агд Агд С1у Рго Агд Зег Ьеи Агд 1 5
.ддс С1у 10 адд Агд дас Азр дед А1а сса Рго дсс А1а 15 ссс Рго асд ТЬг ссс Рго Ьдс Суз дЬс Уа1 20 ссд Рго дсс А1а дад С1и Ьдс Суз ЬЬс РЬе 25 101
дас сЬд сЬд дЬс сдс сас Ьдс дйд дсс Ьдс ддд сЬс сЬд сдс асд ссд 149
Азр Ьеи Ьеи Уа1 Агд ΗΪ3 Суз Уа1 А1а Суз С1у Ьеи Ьеи Агд ТЬг Рго
30 35 40
едд сед ааа ссд дсс ддд дсс аде аде ссЬ дед ссс адд асд дед сЬд 197
Агд Рго Ьуз Рго А1а С1у А1а Зег Зег Рго А1а Рго Агд ТЬг А1а Ьеи
45 50 55
сад сед сад дад Ьсд дтд ддс дед ддд дсс ддс дад дед дед сЬд ссс 245
С1п Рго С1п С1и· Зег νβΐ С1у А1а С1у А1а С1у С1и А1а А1а Ьеи Рго
60 65 70
сЬд ссс ддд сЬд сЬс ььь ддс дсс ссс дед сЬд сЬд ддс сЬд дса сЬд 293
Ьеи Рго С1у Ьеи Ьеи РЬе 61у А1а Рго А1а Ьеи Ьеи С1у Ьеи А1а Ьеи
75 80 85
дСс Уа1 90 сСд Ьеи дед А1а скд дЬс сСд Ьеи 95 дед Уа1 ддс С1у сСд Ьеи дед Уа1 аде Зег 100 едд Тгр адд Агд сдд Агд еда Агд сад С1п 105
Ьеи Уа1
сдд сдд сьс сдс ддс дед Ссс Ссс дса дад дсс ССС дас дда дас аад
Агд Агд Ьеи Агд С1у А1а Зег Зег А1а С1и А1а Рго Азр С1у Азр Ьуз
но 115 120
дас дсс сса дад ссс ерд дас аад дСс аСс асе сСд СсС ссд дда аСс
Азр А1а Рго С1и Рго. Ьеи Азр Ьуз Уа1 Не 11е Ьеи Зег Рго С1у Не
125 130 135
ЬсС дак дсс аса дсС ссЬ дсс Сдд ссС ссС ссС ддд даа дас сса дда
Зег Азр А1а ТЬг А1а Рго А1а Тгр Рго Рго Рго С1у С1и Азр Рго (Ну
140 145 150
асе асе сса ссЬ ддс сас адС дСс ссС дед сса дсс аса дад сСд ддс
ТЬг ТЬг Рго Рго С1у Н13 Зег Уа1 Рго Уа1 Рго А1а ТЬг С1и Ьеи (Ну
155 160 165
Ссс асЬ даа скд дЬд асе асе аад асд дсс ддс ссС дад саа саа
Зег ТЬг (Ни Ьеи Уа1 ТЬг ТЬг Ьуз ТЬг А1а С1у Рго (Ни С1п С1п
170 175 180
Ьадсаддд
586 <210> 60 <211> 184 <212> РЕТ <213> Ното зарбепз <400> 60
МеС Агд Агд С1у Рго Агд Зег Ьеи Агд С1у Агд Азр А1а Рго А1а Рго
-1 С . 1 η 15
X и х и
ТЬг Рго Суз Уа1 Рго А1а С1и Суз РЬе Азр Ьеи Ьеи Уа1 Агд Нхз Суз
20 25 30
Уа1 А1а Суз (Ну Ьеи Ьеи Агд ТЬг Рго Агд Рго Ьуз Рго А1а (Ну А1а
35 40 45
Зег Зег Рго А1а Рго Агд ТЬг А1а Ьеи С1п Рго С1п (Ни Зег Уа1 (Ну
50 55 60
А1а С1у А1а (Ну С1и А1а А1а Ьеи Рго' Ьеи Рго С1у Ьеи Ьеи РЬе (Ну
65 70 75 80
А1а Рго А1а Ьеи Ьеи С1у Ьеи А1а Ьеи Уа1 Ьеи А1а Ьеи Уа1 Ьеи Уа1
85 90 95
С1у Ьеи Уа1 Зег Тгр Агд Агд Агд С1п Агд Агд Ьеи Агд С1у А1а Зег
100 105 110
Зег А1а С1и А1а Рго Азр С1у Азр Ьуз Азр А1а Рго (Ни Рго Ьеи Азр
115 120 125
Ьуз Уа1 11е Не Ьеи Зег Рго С1у Не Зег Азр А1а ТЬг А1а Рго А1а
130 135 140
Тгр Рго Рго Рго· (Пу С1и Азр Рго (Ну ТЬг ТЬг Рго Рго (Ну Нхз Зег
145 150 155 160
Уа1 Рго Уа1 Рго А1а ТЬг (Пи Ьеи С1у Зег ТЬг С1и Ьеи Уа1 ТЬг ТЬг
165 170 175
Ьуз ТЬг А1а (Ну Рго С1и С1п С1п
180 <210> 61 <211> 19 <212> РЕТ <213> Ното зархепз <220>
<223> 26-10 УН зхдпа! зедиепсе.
<400> 61 . .
МеЬ С1у Тгр Зег Тгр 11е РЬе Ьеи РЬе Ьеи Ьеи Зег С1у ТЬг А1а С1у
10 15
Уа1 Ьеи Зег
- 77 007275 <210> 62 <2Ы> 332 <212> ΡΗΤ <213> Ното зарЬепз <220>
<223> Слитый белок <400> 62
Мек СЬу Тгр Зег Тгр 11е РЬе Ьей РЬе Ьей Ьей Зег СЬу ТЬг А1а
1 5 10 15
УаЬ Ьей Зег АЬа Мек Агд Зег Суз Рго СЬи СЬи СЬп Туг Тгр Азр
20 25 30
Ьей Ьей СЬу ТЬг Суз Мек Зег Суз Ьуз ТЬг 11е Суз Азп НЬз СЬп
40 45
СЬп Агд ТЬг Суз АЬа АЬа РЬе Суз Агд Зег Ьей Зег Суз Агд Ьуз
55 60
СЬп СЬу Ьуз РЬе Туг Азр НЬз Ьей Ьей- Агд Азр Суз 11е Зег Суз
65 70 75
Зег 11е Суз СЬу С1п НЬз Рго ьуз С1п Суз АЬа Туг РЬе Суз С1и
85 90 95
Ьуз Ьей Агд Зег СЬи Рго Ьуз Зег Зег Азр Ьуз ТЬг НЬз ТЬг Суз
100 105 но
Рго Суз Рго АЬа Рго СЬи А1а СЬи СЬу АЬа Рго Зег УаЬ РЬе Ьей
115 120 125
Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьей Мек 11е Зег Агд ТЬг Рго СЬи
130 135 140
ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег НЬз СЬи Азр Рго СЬи УаЬ Ьуз
145 150 155
Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз
165 170 175
Агд СЬи СЬи СЬп Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ Зег УаЬ Ьей
180 185 190
УаЬ Ьей НЬз СЬп Азр Тгр Ьей Азп СЬу Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз
195 200 205
Зег Азп Ьуз АЬа Ьей Рго Зег Зег Не СЬи Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз
210 215 220
Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго С1п УаЬ Туг ТЬг Ьей • Рго Рго Зег
225 230 235
Азр СЬи Ьей ТЬг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьей ТЬг Суз Ьей УаЬ Ьуз
СЬу
Рго
Зег
СЬи
АЬа
Азп
Рго
РЬе
УаЬ
РЬе
160
Рго
ТЬг
УаЬ
АЬа
Агд
240
СЬу
245 250 255
РЬе Туг Рго Зег Азр ЬЬе АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег Азп СЬу СЬп Рго
260 265 270
СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго УаЬ Ьей Азр Зег Азр СЬу Зег
275 280 285
РЬе РЬе Ьей Туг Зег Ьуз Ьей ТЬг УаЬ Азр Ьуз Зег Агд тгр СЬп СЬп
290 295 300
СЬу Азп УаЬ РЬе Зег Суз Зег УаЬ Мек НЬз СЬи АЬа Ьей НЬз Азп НЬз
305 ЗЬО 315 320
Туг ТЬг СЬп Ьуз Зег Ьей Зег Ьей Зег Рго СЬу Ьуз
325. 330
- 78 007275 ϋΝΑ
Ното зарЬепз
Модифицированный 5' 26-10 УН ΙΠΈ
ΌΝΆ'
Ното зарЬепз
СЬЗ' (1) - - - (57)
Сигнальная последовательность 26-10 УН
65· <210> 63 <211> 51' <212> ϋΝΑ '’ <213> Ното зарЬепз.
<220> .
<223> -26-10 УН 5 ' ЦТК.
<400> 63•аасабабдбс саабдбссбс бесасадаса сбдаасасае бдасбссаас д51 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
аасабабдбс саабдбссбс бесасадаса ебдаасасас бдасбдссас с 51 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>
абд дда бдд аде бдд абс ббб сбс ббб ебб ебд бса дда асб дса ддб48
Меб СЬу Тгр Зег Тгр 11е РЬе Ьеи РЬе Ьеи Ьеи Зег СЬу ТЬг АЬа СЬу 15 1015 дбе обе бсб57
УаЬ Ьеи 5ег <210> 66 <211> 84 <212> ϋΝΑ <213> Ното зарЬепз <220> <223> Интрон 26-10 УН ' <400> 66 дбааддддсб ссссадббсс аааабебдаа даааадаааб ддеббдддаб дбсасадаба 60 бссасбсбдб сбббсбсббс асад .84 <210> 67 ..
<211> 1135’ <212> ϋΝΑ <213> Ното зарЬепз <220> ’ ’ <223> Слитый белок <400> 67 аасабабдбс саабдбссбс бссасадаса сбдаасасас бдасбссаас дабдддабдд60 ’ адебддабеб ббсбсбббсб бебдбеадда аебдеаддба аддддсбссс садббссааа120 абебдаадаа аадааабддс ббдддабдбе асадабабсс асбсбдбсбб бсбсббсаса180 ддбдбссбсб ебдебабдад абссбдсссс даададсадб асбдддабсс бебдебдддб240 ассбдсабдб ссбдсаааас сабббдсаас сабсададсс адсдсассбд бдсадссббс300 бдсаддбсас бсадсбдссд сааддадсаа ддсаадббсб абдассабсб ссбдадддас360 бдсабсадсб дбдссбссаб сбдбддасад сасссбаадс аабдбдеаба еббебдбдад420 аасаадсбса ддадсдадсс сааабсббса дасаааасбс асасабдссс ассдбдссса480 дсассбдаад ссдадддддс ассдбсадбс ббссбсббсс ссссаааасс сааддасасс540 сбсабдабсб сссддасссс бдаддбсаса бдедбддбдд бддаедбдад ссасдаадас600 ссбдаддбса адббсаасбд дбасдбддас ддедбддадд бдеабаабде саадасааад660 ссдсдддадд адсадбасаа садсасдбас едбдбддбеа дсдбссбсас сдбссбдсас720 саддасбддс бдаабддсаа ддадбасаад бдсааддбсб ссаасааадс ссбсссабсс780 бссабсдада ааассабсбс сааадссааа дддсадсссс дадаассаса ддбдбасасс840 сбдсссссаб сссдддабда дсбдассаад аассаддбса дссбдассбд ссбддбсааа900 ддсбб-сбабс ссадсдасаб сдссдбддад бдддададса абдддсадсс ддадаасаас96 0 басаадасса сдссбссСдб дсбддасбсс дасддсбссб бсббссбсба садсаадсбс1020 ассдеддаса ададсаддбд дсадсадддд ааедбеббеб сабдсбссдб дабдеабдад1080 дсбсбдсаса ассасбасас дсадаададс сбсбсссбдб сбссдддбаа абааа1135
- 79 007275 <210> 68 <211> 1135 <212> ΌΝΑ <213> Ното зариепз <220>
<223> Слитый белок <400> 68аасаРаРдРс сааРдбссРс Рссасадаса сРдаасасас РдасРдссас саРдддаРдд60 адсРддаРсб РРсРсРРРсР РсРдРсадда асРдсаддРа аддддсРссс садРРссааа120 аРсРдаадаа аадаааРддс РРдддаРдРс асадаРаРсс асРсРдРсРР РсРсРРсаса180 ддРдРссРсР сРдсРаРдад аРссРдсссс даададсадр асРдддаРсс РсРдсРдддР240 ассРдсаРдР ссРдсаааас саРРРдсаас саРсададсс адсдсассРд РдсадссРРс300
РдсаддРсас РсадсРдссд сааддадсаа ддсаадРРсР аРдассаРсР ссРдадддас360
РдсаРсадсР дРдссРссаР сРдРддасад сасссРаадс ааРдбдсаРа сРРсРдРдад420 аасаадсРса ддадсдадсс саааРсЕРса дасаааасРс асасаРдссс ассдрдссса480 дсассРдаад ссдадддддс ассдРсадРс РРссРсРРсс ссссаааасс сааддасасс540 сРсаРдаРсР' сссддасссс РдаддРсаса РдсдРддРдд РддасдРдад ссасдаадас600 ссРдаддРса адРРсаасРд драсдрддас ддсдрддадд РдсаРааРдс саадасааад650 ссдсдддадд адсадРасаа садсасдРас сдрдрддрса дсдРссРсас сдРссРдсас720 саддасрддс РдааРддсаа ддадРасаад РдсааддРсР ссаасааадс ссРсссаРсс780
РссаРсдада ааассаРсРс сааадссааа дддсадсссс дадаассаса ддРдРасасс840 сРдсссссаР сссдддарда дсРдассаад аассаддРса дссРдассРд ссРддРсааа900 ддсРРсРаРс ссадсдасар сдссдРддад Рдддададса аРдддсадсс ддадаасаас960
Расаадасса сдссРсссдР дсРддасРсс дасддсРссР РсРРссРсРа садсаадсРс1020 ассдрддаса ададсаддрд дсадсадддд аасдРсРРсР саРдсРссдР даРдсаРдад1080 дсРсРдсаса ассасРасас дсадаададс сРсРсссРдР сРссдддРаа аРааа1135 <210> 69 ’' <211> 884 <212> ΏΝΑ <213> Ното зархепз <220> . . ..
<223> Конструкция энхансер СМУ/ЬТК-промотор МРЗ\/ <400> 69· сдсдРРасаР аасРРасддР аааРддсссд ссРддсРдас сдсссаасда сссссдссса60
СРдасдРсаа РааРдасдРа РдРРсссаРа драасдссаа РадддасРРР ссаРРдасдР120 сааРдддРдд адРаРРРасд дРааасРдсс сасРРддсад РасаРсаадР дРаРсаРаРд180 ссаадРасдс ссссРаСРда сдРсааРдас ддРаааРддс ссдссРддса РРаРдсссад240
РасаРдассР РаРдддасРР РссРасРРдд садРасаРсР асдРаРРадР саРсдсРаРР300 ассарддрда РдсддРРРРд дсадРасаРс ааРдддсдРд даРадсддРР РдасРсасдд360 ддаРРРссаа дРсРссассс саРРдасдРс ааРдддадРР рдррррдаар дааадасссс420 ассРдРаддР РРддсаадсР адсРРаадРа асдссаРРРд сааддсаРдд аааааРасаР.480 аасРдадааР ададаадРРс адаРсааддР саддаасада дааасаддад ааРаРдддсс540 ааасаддаРа РсРдРддРаа дсадРРссРд ссссдсРсад ддссаадаас адРРддааса600 ддадааРаРд ддссааасад даРаРсРдРд дРаадсадРР ссРдссссдс Рсадддссаа660 даасадаРдд РссссадаРс ддрсссдссс Рсадсад.РРР сРададаасс аРсадаРдРР720
РссадддРдс сссааддасс РдаааРдасс сРдРдссРРа РРРдаасРаа ссааРсадРР780 сдсРРсРсдс РРсРдРРсдс дсдсРРсРдс РссссдадсР сааРаааада дсссасаасс840 ссРсасРсдд сдсдссадрс сРссдаРада сРдсдРсдсс сддд884 <210> 70<211> 455' <212> ϋΝΑ <213> Ното заргепз <220>
<223> |_ТР-промотор МР5\/ без участка негативного контроля <400> 70 аардааадас сссассРдРа ддРРРддсаа дсРадааддР Раддаасада дадасадсад60 ааРаРдддсс ааасаддаРа РсРдРддРаа дсадРРссРд ссссддсРса дддссаадаа120 садаРддРсс ссадаРдсдд РсссдсссРс адсадРРРсР ададаассар садаРдРРРс180 садддрдссс сааддассРд ааааРдассс РдРдссРРаР РРдаасРаас сааРсадРРс240 дсРРсРсдсР РсРдРРсдсд сдсРРсРдсР ссссдадсРс ааРаааадад сссасаассс300 сРсасРсддс дсдссадРсс РссдаРадас РдсдРсдссс дддрасссдй дРРсРсааРа360 аасссРсРРд садРРдсаРс сдасРсдРдд РсРсдсРдРР ссРРдддадд дРсРссРсРд420 адрдаррдас РасссдРсад сдддддРсРР РсадР '455

Claims (26)

1. Слитый белок, содержащий:
(а) фрагмент трансмембранного активатора и кальциевого модулятора и взаимодействующего с циклофилиновым лигандом рецептора (ТАСЧ), причем фрагмент рецептора ТАСЗ представляет собой полипептид, состоящий из последовательности длиной 32-80 аминокислот, причем фрагмент рецептора
- 80 007275
ТАС1 включает в себя по меньшей мере один из (ί) аминокислотных остатков с 34 по 66 БЕЦ ΙΌ NО:2 и (ίί) аминокислотных остатков с 71 по 104 БЕЦ ΙΌ NО:2, причем фрагмент рецептора ТАС1 связывает по меньшей мере один из ΖΤNΕ2 или ΖΊΝΓ, и (Ь) иммуноглобулиновый фрагмент, который содержит константную область иммуноглобулина.
2. Слитый белок по п.1, где фрагмент рецептора ТАС1 содержит аминокислотные остатки с 34 по 66 БЕЦ ΙΌ NО:2 и аминокислотные остатки с 71 по 104 БЕЦ ΙΌ NО:2.
3. Слитый белок по п.1, где фрагмент рецептора ТАС1 содержит аминокислотные остатки с 34 по 104 БЕС ΙΌ ^:2.
4. Слитый белок по п.1, где фрагмент рецептора ТАО имеет аминокислотную последовательность аминокислотных остатков с 30 по 110 БЕЦ ΙΌ NО:2.
5. Слитый белок по п.1, где иммуноглобулиновый фрагмент содержит константную область тяжелой цепи.
6. Слитый белок по п.5, где иммуноглобулиновый фрагмент содержит константную область тяжелой цепи человека.
7. Слитый белок по п.6, где константная область тяжелой цепи является константной областью тяжелой цепи ЦС1.
8. Слитый белок по п.7, где иммуноглобулиновый фрагмент является Ес-фрагментом !дС1, который содержит СН2 и СН3 -домены.
9. Слитый белок по п.8, где иммуноглобулиновый фрагмент является Ес-фрагментом (дС 1, содержащим аминокислотную последовательность БЕЦ ΙΌ NО:33.
10. Слитый белок по п.9, где слитый белок ТАСЕиммуноглобулина имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность БЕЦ ΙΌ NО:54.
11. Слитый белок по п.1, где слитый белок ТАСЕиммуноглобулина является димером.
12. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует слитый белок по п.1.
13. Молекула нуклеиновой кислоты по п.12, которая имеет нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность БЕЦ ΙΌ NО:53.
14. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и слитый белок трансмембранного активатора и кальциевого модулятора, взаимодействующего с циклофилиновым лигандом (ТАСЦ, с иммуноглобулином, причем слитый белок ТАСЕиммуноглобулина имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность БЕЦ ΙΌ NО:54.
15. Фармацевтическая композиция по п.14, где слитый белок ТАСЕиммуноглобулина является димером.
16. Применение слитого белка трансмембранного активатора и кальциевого модулятора, взаимодействующего с циклофилиновым лигандом (ТАСЦ с иммуноглобулином для производства лекарственного средства для снижения уровней ΖΤNΕ4 в циркулирующей крови у млекопитающего субъекта, причем слитый белок ТАСЕиммуноглобулина содержит:
(a) фрагмент рецептора ТАС.Ч, который представляет собой полипептид, состоящий из последовательности длиной 32-80 аминокислот, причем фрагмент рецептора ТАО содержит по меньшей мере один из (ί) аминокислотных остатков с 34 по 66 БЕЦ ΙΌ NО:2, и (и) аминокислотных остатков с 71 по 104 БЕЦ ΙΌ NО:2, причем фрагмент рецептора ТАО связывает ΖΊΝΓ, и (b) иммуноглобулиновый фрагмент, содержащий константную область иммуноглобулина.
17. Применение по п.16, где фрагмент рецептора ТАС! содержит аминокислотные остатки с 34 по 66 последовательности БЕЦ ΙΌ NО:2 и аминокислотные остатки с 71 по 104 последовательности БЕЦ ΙΌ №:2.
18. Применение по п.16, где фрагмент рецептора ТАСЕ содержит аминокислотные остатки с 34 по 104 последовательности БЕЦ ΙΌ NО:2.
19. Применение по п.16, где фрагмент рецептора ТАО имеет аминокислотную последовательность аминокислотных остатков с 30 по 110 последовательности БЕЦ ΙΌ NО:2.
20. Применение по п.16, где иммуноглобулиновый фрагмент содержит константную область тяжелой цепи.
21. Применение по п.20, где иммуноглобулиновый фрагмент содержит константную область тяжелой цепи человека.
22. Применение по п.21, где константная область тяжелой цепи является константной областью тяжелой цепи ЦС1.
23 Применение по п.22, где иммуноглобулиновый фрагмент является Ес-фрагментом (дС1, который содержит СН2 и СН3-домены.
24. Применение по п.23, где иммуноглобулиновый фрагмент является Ес-фрагментом (дС1, содержащим аминокислотную последовательность БЕЦ ΙΌ NО:33.
25. Применение по п.24, где слитый белок ТАСЕиммуноглобулина имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность БЕЦ ΙΌ NО:54.
26. Применение по п.16, где слитый белок ТАСЕиммуноглобулина является димером.
- 81 007275
10 20 30 _ 4050
МЗСЬСКЗРНС ΟΒ8Κνϋ<2ΕΕπ РРОСЬИТСУА МК5СРЕЕ(2УИ ррьъстсйзс
60 70 80 90100
ΚΤΙΟΝΗς^ΟΚ ’р’СААЁСКЗЬЗ СЙКЕООКРУр НЬЬНПС13СА '31ССОНРКСС
I 110 120 130 140150
ТКУЕСЕЫКЪКЗ ΡΥΝΕΡΡΕΕΚΚ 0Ρ3ϋΕνΕΝΝ3 ПЫЗСКУОСЬЕ НКЗЗЕАЗРАЬ
160 | | 170 180 190 200 РСЕКЬ5АП<2У Ά13νΥ3Ί йьсьс ЬСАУЬССЕЬУ АУАСР1] ККРС ПРСЗСОРКЗВ
210 220 230 240 250 РР<23РАКЗЗ(2 ϋΗΑΜΕΑΟ3Ρν ЗТЗРЕРУЕТС ЗГСЕРЕСКАР Τ0Ε3ΑνΤΡΟΤ 260 270 280 290 РПРТСАОККО СНТКТТУЬОР СРН1РРЗСЬС ТУСУРАОЕСС РСА Фиг. 1
С С
Фиг. 2
- 82 007275 ьс
218 | ДИКИЙ тип <31и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ес-488 . . Агд . Зег . Ес4 . . Агд . Зег . Рс5 . . . . Зег . Есб . . . . Зег . Ес 7 - . . . . . Ес8 . . . . Зег . 234 235 дикий ТИП |д1а Рго (31и Ьеи Ьеи С1у Ес-488 ...... Ес4 . . . А1а (31и . Ес5 . . . А1а С1и . Есб . . . А1а С1и . ЕС 7 ...... Ес 8 ...... СН2 -> домен
ДИКИЙ тип
ЕС-488
ЕС 4
Ес5
Есб
Ес7
Ес 8
Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ
НС I НС I 222 1 1 1 1 230 Ьуз Ткг ΗΪ3 ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго <- -> - шаонионыи 237 участок 245 <31 у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго А1а А1а А1а
11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1
260
ТЬг
ДИКИЙ ТИП ЕС-488 ЕС4
Ес5
Есб
Рс7
Ес8
275
Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Шз С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе
Фиг. ЗА
Фиг. ЗВ
- 83 007275
350
ДИКИЙ ТИП 11е Зег Ьуз А1а Ьуз|01 у С1п Рго Агд О1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ес-488 • · 1 1 . Ес4 Рс5 1 Реб • - ί 1 · Ес7 - · · 1 1 · Рс8 • · 1 <- СН21 домен 1 · 1снз -> домен 356 358 365 ДИКИЙ ТИП Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп О1п Уа1 Зег Ьеи Ес-488 Рс4 Гс5 Реб Ес 7 Гс8 380 ДИКИЙ ТИП ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз 61у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и Ес-488 Рс4 Ес5 Геб Ес7 Ге 8
395 дикий тип Тгр О1и Зег Азп <31у С1п Рго <31и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Гс-488 ...............
Ес4 ..... ..........
Ес5 ...............
Реб ...............
Гс7 ...............
Гс8 ...............
EA200301146A 2001-05-24 2002-05-20 Слитые белки taci-иммуноглобулина EA007275B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29334301P 2001-05-24 2001-05-24
PCT/US2002/015910 WO2002094852A2 (en) 2001-05-24 2002-05-20 Taci-immunoglobulin fusion proteins

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA200301146A2 EA200301146A2 (ru) 2004-06-24
EA200301146A3 EA200301146A3 (ru) 2005-02-24
EA007275B1 true EA007275B1 (ru) 2006-08-25

Family

ID=23128690

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200600894A EA010594B1 (ru) 2001-05-24 2002-05-20 Слитые белки taci-иммуноглобулина
EA200301146A EA007275B1 (ru) 2001-05-24 2002-05-20 Слитые белки taci-иммуноглобулина

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200600894A EA010594B1 (ru) 2001-05-24 2002-05-20 Слитые белки taci-иммуноглобулина

Country Status (28)

Country Link
US (9) US20030103986A1 (ru)
EP (2) EP1436003B3 (ru)
JP (2) JP2004535182A (ru)
KR (3) KR100976743B1 (ru)
CN (2) CN101628111B (ru)
AT (2) ATE542545T1 (ru)
AU (1) AU2002305646C1 (ru)
BR (1) BRPI0209933B8 (ru)
CA (1) CA2448123C (ru)
CY (2) CY1109751T1 (ru)
DE (1) DE60234202D1 (ru)
DK (2) DK2116259T3 (ru)
EA (2) EA010594B1 (ru)
ES (2) ES2379977T3 (ru)
HK (2) HK1076603A1 (ru)
HR (2) HRP20030948B1 (ru)
IL (2) IL158920A0 (ru)
ME (1) MEP21708A (ru)
MX (1) MXPA03010687A (ru)
NO (1) NO337295B1 (ru)
NZ (1) NZ529638A (ru)
PL (2) PL403488A1 (ru)
PT (2) PT1436003E (ru)
RS (2) RS20120253A1 (ru)
SI (2) SI1436003T1 (ru)
UA (1) UA82830C2 (ru)
WO (1) WO2002094852A2 (ru)
ZA (1) ZA200308984B (ru)

Families Citing this family (200)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8212004B2 (en) 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US7833529B1 (en) * 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
US6969519B2 (en) 2000-03-10 2005-11-29 Human Genome Sciences, Inc. Methods of using an agonistic antibody human tumor necrosis factor receptor (TR17)
US7879328B2 (en) 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
KR101155294B1 (ko) * 2000-06-16 2013-03-07 캠브리지 안티바디 테크놀로지 리미티드 면역특이적으로 ＢＬｙＳ에 결합하는 항체
ATE451390T1 (de) 2000-08-18 2009-12-15 Dyax Corp Polypeptide zur bindung an das b-lymphozyten- stimulatorische protein (blys)
US20030091565A1 (en) 2000-08-18 2003-05-15 Beltzer James P. Binding polypeptides and methods based thereon
ATE542545T1 (de) * 2001-05-24 2012-02-15 Zymogenetics Inc Taci-immunoglobulin-fusionsproteine
CA2446734A1 (en) 2001-05-24 2002-11-28 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against tumor necrosis factor delta (april)
HUP0500992A3 (en) * 2001-08-03 2007-11-28 Genentech Inc Tacis and br3 polypeptides and uses thereof
US7112410B1 (en) 2001-08-29 2006-09-26 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor TR21 and methods based thereon
US7256015B2 (en) * 2001-09-21 2007-08-14 Amgen Inc. TALL-1 receptor molecules and uses thereof
EP1495055B1 (en) * 2002-04-18 2013-08-14 Genencor International, Inc. Production of functional antibodies in filamentous fungi
US7262025B2 (en) * 2002-06-18 2007-08-28 Zymogenetics, Inc. Hybrid vector having a cytomegalovirus enhancer and myeloproliferative sarcoma virus promoter
JP2006502715A (ja) * 2002-10-11 2006-01-26 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド ホモ３量体融合タンパク質の製造
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
US7381794B2 (en) 2004-03-08 2008-06-03 Zymogenetics, Inc. Dimeric fusion proteins and materials and methods for producing them
BRPI0510883B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
ES2426005T3 (es) 2004-07-23 2013-10-18 Acceleron Pharma Inc. Polipéptidos del receptor ACTRII, procedimientos y composiciones
CA2580141C (en) 2004-09-23 2013-12-10 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
NZ565511A (en) 2005-07-22 2011-03-31 Five Prime Therapeutics Inc Compositions and methods of treating disease with FGFR fusion proteins
AR059025A1 (es) * 2005-08-09 2008-03-12 Zymogenetics Inc Metodos para el tratamiento y prevencion de proliferacion de celulas anormales utilizando moleculas de fusion taci
JP2009507777A (ja) * 2005-08-09 2009-02-26 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合分子を用いたＢ細胞性腫瘍の処置方法
WO2007019618A1 (en) * 2005-08-12 2007-02-22 Garvan Institute Of Medical Research Phrophylactic and/or therapeutic method for treatment of autoimmune disease
EA015860B1 (ru) 2005-10-13 2011-12-30 Хьюман Дженом Сайенсиз, Инк. Способы лечения аутоиммунных заболеваний при использовании антагониста нейтрокина-альфа
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
CN105001320A (zh) 2005-11-23 2015-10-28 阿塞勒隆制药公司 Activin-ActRIIa拮抗剂及其促进骨骼生长的应用
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
CA2629306A1 (en) 2005-11-23 2007-05-31 Genentech, Inc. Methods and compositions related to b cell assays
JP2009525765A (ja) * 2006-02-10 2009-07-16 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド 切断型のｉｌ−１７ｒａ可溶性受容体および炎症において使用する方法
WO2007123765A2 (en) 2006-03-31 2007-11-01 Human Genome Sciences Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
EA015342B1 (ru) * 2006-05-15 2011-06-30 Арес Трейдинг С.А. Способы лечения аутоиммунных заболеваний с использованием слитой молекулы taci-ig
EP2054441A1 (en) * 2006-08-25 2009-05-06 Zymogenetics, Inc. Soluble il-27 receptor
JP2010501622A (ja) * 2006-08-28 2010-01-21 アレス トレーディング ソシエテ アノニム Ｆｃ−融合タンパク質の精製法
PL2061803T5 (pl) * 2006-08-28 2023-03-27 Ares Trading S.A. Proces oczyszczania białek zawierających fc
CN101541825B (zh) * 2006-08-28 2013-08-14 阿雷斯贸易股份有限公司 Fc融合蛋白的纯化方法
BRPI0716382B8 (pt) * 2006-08-28 2021-05-25 Ares Trading Sa método para reduzir o teor de porções de fc livres em um fluido compreendendo uma proteína contendo fc, e uso de cromatografia de troca catiônica
AU2007357448B2 (en) * 2006-09-18 2012-09-06 Compugen Ltd Bioactive peptides and method of using same
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
EP2121931B1 (en) * 2007-01-26 2011-05-11 Merck Serono S.A. Purification of fc-tact fusion proteins using the oilbody technology
CN101835485B (zh) 2007-02-01 2016-10-26 阿塞勒隆制药公司 活化素-actriia拮抗剂及在治疗或预防乳腺癌中的用途
TW202021980A (zh) 2007-02-02 2020-06-16 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ActRIIB的變體與其用途
ME02333B (me) 2007-02-09 2013-04-30 Acceleron Pharma Inc FARMACEUTSKE SMEŠE KOJE SADRŽE AKTIVIN-ActRIIA ANTAGONISTE I NJIHOVA UPOTREBA U PREVENCIJI ILI LEČENJU MULTIPLOG MIJELOMA
ES2422479T3 (es) * 2007-03-27 2013-09-11 Zymogenetics Inc Combinación de inhibición de BLyS y micofenolato de mofetilo para tratamiento de enfermedades autoinmunitarias
JP2010537623A (ja) * 2007-03-27 2010-12-09 クリストファー ホーヴェンス 前立腺癌を治療する方法及び組成物
CN101323643B (zh) 2007-06-15 2010-12-01 烟台荣昌生物工程有限公司 优化的TACI-Fc融合蛋白
EP2190469B1 (en) 2007-09-04 2015-02-25 Compugen Ltd. Polypeptides and polynucleotides, and uses thereof as a drug target for producing drugs and biologics
CN101861161B (zh) 2007-09-18 2017-04-19 阿塞勒隆制药公司 活化素‑actriia拮抗剂和减少或抑制fsh分泌的用途
AU2008312406B2 (en) * 2007-10-16 2014-03-06 Ares Trading S.A. Combination of BLyS inhibition and anti-CD 20 agents for treatment of autoimmune disease
PT2219675E (pt) 2007-11-12 2013-11-18 Ares Trading Sa Formulações para proteínas de fusão de taci-imunoglobulina
WO2009062916A1 (en) * 2007-11-12 2009-05-22 Ares Trading S.A. Taci-immunoglobulin fusion proteins for treatment of optic neuritis
EP2219673A1 (en) * 2007-11-12 2010-08-25 Ares Trading S.A. Taci-immunoglobulin fusion proteins for treatment of relapsing multiple sclerosis
ES2572231T3 (es) 2007-12-07 2016-05-30 Zymogenetics Inc Anticuerpos monoclonales anti-IL-21 humana
WO2009093246A2 (en) * 2008-01-22 2009-07-30 Compugen Ltd. Novel clusterin derived peptide
CA2720682A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Zymogenetics, Inc. Levels of bcma protein expression on b cells and use in diagnostic methods
US8003335B2 (en) 2008-04-30 2011-08-23 Universite Paris-SUD11 Levels of APRIL in serum and use in diagnostic methods
PL2291657T3 (pl) 2008-05-01 2016-09-30 Stężenie heterotrimerów blys/april w surowicy oraz zastosowanie w sposobach diagnostycznych
EP2313105B1 (en) 2008-06-27 2013-07-24 ZymoGenetics, Inc. SOLUBLE HYBRID Fc gamma RECEPTORS AND RELATED METHODS
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
TWI748373B (zh) 2008-08-14 2021-12-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 使用gdf阱以增加紅血球水平
EP2343080B1 (en) 2008-09-30 2017-11-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING BONE DISEASES WHICH COMPRISES PROTEIN COMPRISING Frizzled1, Frizzled2 OR Frizzled7 EXTRACELLULAR CYSTEINE-RICH DOMAIN AND Fc PROTEIN
US20110311450A1 (en) 2008-12-08 2011-12-22 Zurit Levine Polypeptides and polynucleotides, and uses thereof as a drug target for producing drugs and biologics
WO2010096394A2 (en) * 2009-02-17 2010-08-26 Redwood Biosciences, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
US8338377B2 (en) * 2009-03-30 2012-12-25 Acceleron Pharma Inc. BMP-ALK3 antagonists and uses for promoting bone growth
MX2011013172A (es) 2009-06-08 2012-04-02 Acceleron Pharma Inc Metodos para aumentar adipocitos termogenicos.
EP3805259A1 (en) 2009-06-12 2021-04-14 Acceleron Pharma Inc. Truncated actriib-fc fusion proteins
IN2012DN03025A (ru) 2009-09-09 2015-07-31 Ct Se Llc
DK2498799T3 (en) 2009-11-13 2016-12-05 Five Prime Therapeutics Inc Use of the FGFR1 ECD proteins for the treatment of cancer diseases characterized by ligand dependent activating mutations in FGFR2
EP3332796A1 (en) 2009-11-17 2018-06-13 Acceleron Pharma Inc. Actriib proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
EP2507265B1 (en) 2009-12-01 2016-05-11 Compugen Ltd. Antibody specific for heparanase splice variant T5 and its use.
WO2011102845A1 (en) * 2010-02-18 2011-08-25 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion protein compositions and methods of use
WO2011109280A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Lerner Research Institute Methods and compositions to treat immune-mediated disorders
US20150231215A1 (en) 2012-06-22 2015-08-20 Randolph J. Noelle VISTA Antagonist and Methods of Use
US10745467B2 (en) 2010-03-26 2020-08-18 The Trustees Of Dartmouth College VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders
EP2552947A4 (en) 2010-03-26 2013-11-13 Dartmouth College VISTA REGULATORY T CELL MEDIATOR PROTEIN, VISTA BINDING ACTIVE SUBSTANCES AND USE THEREOF
PE20130342A1 (es) 2010-04-15 2013-04-20 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiacepinas y conjugados de las mismas
CN101851278B (zh) * 2010-05-26 2013-03-13 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 B细胞激活因子拮抗剂及其制备方法与用途
RU2626537C2 (ru) 2010-06-08 2017-07-28 Дженентек, Инк. Полученные с помощью генной инженерии антитела с цистеиновыми заменами и их конъюгаты
BR112012031329A2 (pt) 2010-06-09 2016-10-11 Zymogenetics Inc proteínas de fusão diméricas vstm3 e composições e métodos relacionados
US20130189268A1 (en) 2010-06-22 2013-07-25 Precision Biologics, Inc. Colon and pancreas cancer specific antigens and antibodies
WO2016030888A1 (en) 2014-08-26 2016-03-03 Compugen Ltd. Polypeptides and uses thereof as a drug for treatment of autoimmune disorders
WO2012001647A2 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Compugen Ltd. Polypeptides and uses thereof as a drug for treatment of multiple sclerosis, rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders
ES2719624T3 (es) 2010-09-23 2019-07-11 Prec Biologics Inc Peptidomiméticos de cáncer de colon y de páncreas
US20120258496A1 (en) * 2010-09-27 2012-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Production of low fucose antibodies in h4-ii-e rat cells
CN103298832A (zh) 2010-11-08 2013-09-11 阿塞勒隆制药公司 Actriia结合剂及其用途
US8481038B2 (en) 2010-11-15 2013-07-09 Five Prime Therapeutics, Inc. Treatment of cancer with elevated dosages of soluble FGFR1 fusion proteins
ES2544608T3 (es) 2010-11-17 2015-09-02 Genentech, Inc. Conjugados de anticuerpo y de alaninil-maitansinol
EP2643016A2 (en) 2010-11-23 2013-10-02 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Anti-il-6 antibodies for the treatment of anemia
US8951972B2 (en) 2010-12-09 2015-02-10 Five Prime Therapeutics, Inc. FGFR1 extracellular domain combination therapies for lung cancer
WO2012090150A2 (en) 2010-12-27 2012-07-05 Compugen Ltd New cell-penetrating peptides and uses thereof
JP6162606B2 (ja) 2011-01-14 2017-07-12 レッドウッド バイオサイエンス， インコーポレイテッド アルデヒド−タグ付き免疫グロブリンポリペプチド及びその使用方法
CN102085367B (zh) * 2011-01-19 2012-08-22 烟台荣昌生物工程有限公司 优化的TACI-Fc融合蛋白用于制备治疗类风湿性关节炎药物的应用
SG194099A1 (en) 2011-04-15 2013-11-29 Compugen Ltd Polypeptides and polynucleotides, and uses thereof for treatment of immune related disorders and cancer
WO2012155019A1 (en) 2011-05-12 2012-11-15 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature pepides
AU2012260601B2 (en) 2011-05-25 2018-02-01 Innate Pharma, S.A. Anti-KIR antibodies for the treatment of inflammatory disorders
WO2013001517A1 (en) 2011-06-30 2013-01-03 Compugen Ltd. Polypeptides and uses thereof for treatment of autoimmune disorders and infection
EP2750713B1 (en) 2011-10-14 2015-09-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US10016484B2 (en) 2011-11-14 2018-07-10 Five Prime Therapeutics, Inc. Methods of treating lung cancer
SG2014008304A (en) 2012-02-01 2014-06-27 Compugen Ltd C10rf32 antibodies, and uses thereof for treatment of cancer
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
WO2013192504A1 (en) 2012-06-22 2013-12-27 The Trustees Of Dartmouth College Novel vista-ig constructs and the use of vista-ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders
US9890215B2 (en) 2012-06-22 2018-02-13 King's College London Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
CA2884704C (en) 2012-09-07 2023-04-04 Randolph J. Noelle Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
CN105102068B (zh) 2012-10-12 2018-06-01 Adc疗法责任有限公司 吡咯并苯并二氮杂卓-抗体结合物
MX364329B (es) 2012-10-12 2019-04-23 Medimmune Ltd Conjugados del anticuerpo pirrolobenzodiazepina.
AU2013328628B2 (en) 2012-10-12 2016-12-15 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-anti-CD22 antibody conjugates
ES2660029T3 (es) 2012-10-12 2018-03-20 Medimmune Limited Conjugados de anticuerpo-pirrolobenzodiazepinas
PL2906253T3 (pl) 2012-10-12 2019-02-28 Adc Therapeutics Sa Koniugaty pirolobenzodiazepina-przeciwciało anty-psma
KR101819404B1 (ko) 2012-10-12 2018-02-28 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트
EP2906250B1 (en) 2012-10-12 2018-05-30 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-anti-psma antibody conjugates
CA2890217C (en) 2012-11-02 2021-07-20 Yifu FANG Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
CN103833856B (zh) * 2012-11-22 2017-05-03 上海康岱生物医药技术股份有限公司 抑制taci‑baff复合物形成的融合蛋白及其制法和用途
CN110452242A (zh) 2012-12-21 2019-11-15 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物
CA2894959C (en) 2012-12-21 2022-01-11 Spirogen Sarl Unsymmetrical pyrrolobenzodiazepines-dimers for use in the treatment of proliferative and autoimmune diseases
JP6444902B2 (ja) 2013-03-13 2018-12-26 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びその結合体
BR112015023070B1 (pt) 2013-03-13 2022-06-07 Genentech, Inc. Conjugados e compostos de pirrolobenzodiazepinas, composição farmacêutica que compreende os mesmo, bem como seus usos para o tratamento de uma doença proliferativa
KR102066318B1 (ko) 2013-03-13 2020-01-14 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨쥬게이트
BR112016002829A2 (pt) 2013-08-12 2017-09-19 Genentech Inc Composto e processo para preparar o composto de conjugado anticorpo-¿droga, composição farmacêutica, método de tratamento do câncer, kit para o tratamento do câncer, intermediário ligante¿-droga, porção e composto de porção droga de dímero cbi
US9950078B2 (en) 2013-10-11 2018-04-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2015052535A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US10010624B2 (en) 2013-10-11 2018-07-03 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
MX371092B (es) 2013-12-16 2020-01-16 Genentech Inc Compuestos peptidomimeticos y conjugados de anticuerpo-farmaco de los mismos.
KR20160092024A (ko) 2013-12-16 2016-08-03 제넨테크, 인크. 1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌 이량체 항체-약물 접합체 화합물, 및 사용 및 치료 방법
EA201691023A1 (ru) 2013-12-16 2016-10-31 Дженентек, Инк. Пептидомиметические соединения и их конъюгаты антитела с лекарственным средством
US11014987B2 (en) 2013-12-24 2021-05-25 Janssen Pharmaceutics Nv Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same
CN106661107B (zh) 2013-12-24 2021-12-24 杨森制药公司 抗vista抗体及片段
WO2015191881A2 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Green Kathy A Use of vista agonists and antagonists to suppress or enhance humoral immunity
EP3154566B1 (en) 2014-06-13 2022-08-03 Acceleron Pharma Inc. Actrii antagonist for the treatment or prevention of a cutaneous ulcer in a subject that has anemia
CN106687141A (zh) 2014-09-10 2017-05-17 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其缀合物
KR20170052600A (ko) 2014-09-12 2017-05-12 제넨테크, 인크. 시스테인 가공된 항체 및 콘주게이트
US10149913B2 (en) 2014-09-12 2018-12-11 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
AU2015317653A1 (en) 2014-09-17 2017-04-06 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and antibody disulfide conjugates thereof
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
JP6656243B2 (ja) 2014-10-28 2020-03-04 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ 細胞表面での非共有結合Ｆｃドメイン含有タンパク質ディスプレイの方法及びそのスクリーニング方法
EP3215531A1 (en) 2014-11-03 2017-09-13 Merck Patent GmbH Methods for generating bispecific shark variable antibody domains and use thereof
CN107148285B (zh) 2014-11-25 2022-01-04 Adc治疗股份有限公司 吡咯并苯并二氮杂䓬-抗体缀合物
EP4233889A3 (en) 2014-12-03 2023-10-11 Celgene Corporation Activin-actrii antagonists and uses for treating myelodysplastic syndrome
CN107206101B (zh) 2014-12-03 2021-06-25 基因泰克公司 季铵化合物及其抗体-药物缀合物
CN107405398A (zh) 2014-12-05 2017-11-28 伊穆奈克斯特股份有限公司 鉴定vsig8作为推定vista受体及其用以产生vista/vsig8激动剂和拮抗剂的用途
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
DK3313882T3 (da) 2015-06-24 2020-05-11 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-VISTA antistoffer og fragmenter
US11130818B2 (en) 2015-08-07 2021-09-28 Merck Patent Gmbh Transglutamine tag for efficient site-specific bioconjugation
DK3328881T3 (da) 2015-09-08 2019-10-07 Theripion Inc Apoa-1 fusionspolypeptider og relaterede sammensætninger og fremgangsmåder
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
CA3014013A1 (en) 2016-02-12 2017-08-17 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-vista (b7h5) antibodies
JP6943872B2 (ja) 2016-03-25 2021-10-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ
TWI770020B (zh) 2016-04-15 2022-07-11 丹麥商Ｈ朗德貝克公司 人類化抗pacap 抗體及其用途
CR20180537A (es) 2016-04-15 2019-03-04 Immunext Inc Anticuerpos vista antihumanos y su uso
WO2017189432A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 R.P. Scherer Technologies, Llc Antibody conjugates and methods of making and using the same
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
WO2017201449A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Genentech, Inc. Protac antibody conjugates and methods of use
CN109313200B (zh) 2016-05-27 2022-10-04 豪夫迈·罗氏有限公司 用于表征位点特异性抗体-药物缀合物的生物分析性方法
US10639378B2 (en) 2016-06-06 2020-05-05 Genentech, Inc. Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
WO2018027042A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 Bio-Techne Corporation Identification of vsig3/vista as a novel immune checkpoint and use thereof for immunotherapy
WO2018031662A1 (en) 2016-08-11 2018-02-15 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine prodrugs and antibody conjugates thereof
CN110139674B (zh) 2016-10-05 2023-05-16 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体药物缀合物的方法
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
WO2018136163A2 (en) 2016-12-09 2018-07-26 Theripion, Inc. Tandem apoa-1 fusion polypeptides
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
PL3544636T3 (pl) 2017-02-08 2021-12-06 Adc Therapeutics Sa Koniugaty pirolobenzodiazepina-przeciwciało
RS63502B1 (sr) 2017-04-18 2022-09-30 Medimmune Ltd Konjugati pirolobenzodiazepina
CA3057748A1 (en) 2017-04-20 2018-10-25 Adc Therapeutics Sa Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate
CN117683836A (zh) 2017-05-09 2024-03-12 辛利斯生物制药有限责任公司 用于修饰微囊藻毒素和节球藻毒素的方法
JP7265788B2 (ja) 2017-05-09 2023-04-27 シアノ バイオテック ゲーエムベーハー 修飾ミクロシスチンおよびノジュラリン
US11318211B2 (en) 2017-06-14 2022-05-03 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-CD19 ADC
NZ761175A (en) 2017-08-18 2024-07-26 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
TW201920192A (zh) 2017-09-20 2019-06-01 韓商Ｐｈ製藥公司 泰蘭他汀（ｔｈａｉｌａｎｓｔａｔｉｎ）類似物
CN111868082A (zh) 2018-02-02 2020-10-30 博奥泰克尼公司 调节vista和vsig3的相互作用的化合物及其制备和使用方法
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
WO2020086858A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 Genentech, Inc. Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
WO2020123275A1 (en) 2018-12-10 2020-06-18 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
CN114144436A (zh) 2019-07-24 2022-03-04 H.隆德贝克有限公司 抗mGluR5抗体及其用途
CA3131790A1 (en) * 2019-12-24 2021-07-01 Remegen Co., Ltd. Taci-fc fusion protein and use thereof
MX2022013998A (es) 2020-05-08 2023-02-16 Alpine Immune Sciences Inc Proteinas inmunomoduladoras inhibidoras de april y baff con y sin una proteina inhibidora de celulas t y metodos de uso de las mismas.
AU2021285813A1 (en) * 2020-06-02 2023-02-02 Ares Trading S.A. Methods related to the treatment of IGA nephropathy
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
WO2022178090A2 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Theripion, Inc. Dnase fusion polypeptides and related compositions and methods
US20240279310A1 (en) 2021-05-07 2024-08-22 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods of dosing and treatment with a taci-fc fusion immunomodulatory protein
JP2024518410A (ja) 2021-05-07 2024-05-01 ビエラ バイオ インコーポレイテッド 重症筋無力症を治療するための抗ｃｄ１９抗体の使用
EP4296287A1 (en) * 2021-09-30 2023-12-27 RemeGen Co., Ltd. Method for treating sjogren's syndrome using taci-fc fusion protein
WO2023051798A1 (zh) * 2021-09-30 2023-04-06 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗il23抗体融合蛋白及用途
EP4442702A1 (en) * 2022-06-08 2024-10-09 RemeGen Co., Ltd. Method for treating myasthenia gravis with taci-fc fusion protein
TW202421653A (zh) * 2022-09-30 2024-06-01 大陸商榮昌生物製藥（煙臺）股份有限公司 用TACI-Fc融合蛋白治療膜性腎病的方法
WO2024077018A2 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of taci-fc fusion immunomodulatory protein
WO2024114777A1 (zh) * 2022-12-02 2024-06-06 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 用TACI-Fc融合蛋白治疗微小病变型肾病的方法
WO2024123675A2 (en) * 2022-12-05 2024-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Taci-fc fusion proteins for multifunctional inhibition of baff, april, and neonatal fc receptor
WO2024138128A2 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Genentech, Inc. Cereblon degrader conjugates, and uses thereof

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US846A (en) 1838-07-17 Improvement in revolving fire-arms
US5738A (en) 1848-08-29 Francis kelsey
IE54046B1 (en) 1981-08-25 1989-05-24 Celltech Ltd Expression vectors
US4769331A (en) 1981-09-16 1988-09-06 University Patents, Inc. Recombinant methods and materials
US4486533A (en) 1982-09-02 1984-12-04 St. Louis University Filamentous fungi functional replicating extrachromosomal element
US4599311A (en) 1982-08-13 1986-07-08 Kawasaki Glenn H Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor
US4977092A (en) 1985-06-26 1990-12-11 Amgen Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells
US4603044A (en) 1983-01-06 1986-07-29 Technology Unlimited, Inc. Hepatocyte Directed Vesicle delivery system
US5139936A (en) 1983-02-28 1992-08-18 Collaborative Research, Inc. Use of the GAL1 yeast promoter
US4661454A (en) 1983-02-28 1987-04-28 Collaborative Research, Inc. GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4931373A (en) 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
US5288641A (en) 1984-06-04 1994-02-22 Arch Development Corporation Herpes Simplex virus as a vector
US4859587A (en) 1984-06-04 1989-08-22 Institut Merieux Recombinant herpes simplex viruses, vaccines and methods
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
DE3578435D1 (de) 1984-12-06 1990-08-02 Labofina Sa Promotoren fuer die expression von fremden genen in hefe, plasmide, die diese promotoren enthalten, sowie deren verwendung zur herstellung von polypeptiden.
US4751181A (en) 1984-12-31 1988-06-14 Duke University Methods and compositions useful in the diagnosis and treatment of autoimmune diseases
US4882279A (en) 1985-10-25 1989-11-21 Phillips Petroleum Company Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia
US4935349A (en) 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
US5063154A (en) 1987-06-24 1991-11-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Pheromone - inducible yeast promoter
US5037743A (en) 1988-08-05 1991-08-06 Zymogenetics, Inc. BAR1 secretion signal
US5162228A (en) 1988-12-28 1992-11-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Gylceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and promoter
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5328688A (en) 1990-09-10 1994-07-12 Arch Development Corporation Recombinant herpes simplex viruses vaccines and methods
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
JP3202999B2 (ja) 1991-01-31 2001-08-27 協和醗酵工業株式会社 肝移行性リポソーム製剤
US5298418A (en) 1991-09-16 1994-03-29 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Cell line isolated from larval midgut tissue of Trichoplusia ni
US5861151A (en) * 1991-12-20 1999-01-19 Bristol-Myers Squibb Co Soluble fusion molecules with binding specificity for cell adhesion molecules
ZA932523B (en) * 1992-04-10 1994-10-08 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against cd33 related surface antigens
ZA932522B (en) * 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
WO1994009137A1 (en) 1992-10-15 1994-04-28 Genentech, Inc. Antibodies against type 2 tumor necrosis factor receptor
US5650550A (en) 1993-10-01 1997-07-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Mutant mice having a deficit of functional estrogen receptors
US5523227A (en) 1994-06-17 1996-06-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior Univ. DNA encoding calcium-signal modulating cyclophilin ligand
ES2292172T3 (es) 1994-12-15 2008-03-01 Yeda Research And Development Co., Ltd. Moduladores de la funcion de los receptores fas/apo1.
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
DE19533447C1 (de) 1995-09-09 1996-12-05 Bbs Kraftfahrzeugtechnik Verfahren und Vorrichtung zum Befüllen eines Gießwerkzeugs mit einer Metallschmelze
EP0889966A1 (en) 1995-11-09 1999-01-13 ZymoGenetics, Inc. Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in pichia methanolica
US5716808A (en) 1995-11-09 1998-02-10 Zymogenetics, Inc. Genetic engineering of pichia methanolica
JP2001501453A (ja) 1996-03-14 2001-02-06 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド ヒト腫瘍壊死因子δおよびε
WO1998002565A1 (en) 1996-07-17 1998-01-22 Zymogenetics, Inc. TRANSFORMATION OF $i(PICHIA METHANOLICA)
IL128072A0 (en) 1996-07-17 1999-11-30 Zymogenetics Inc Preparation of pichia methanolica auxotrophic mutants
US5736383A (en) 1996-08-26 1998-04-07 Zymogenetics, Inc. Preparation of Pichia methanolica auxotrophic mutants
JP2001503263A (ja) 1996-10-25 2001-03-13 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド ニュートロカインα
WO1998027114A2 (en) 1996-12-17 1998-06-25 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US5969102A (en) 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
DE69838061T2 (de) * 1997-04-18 2008-03-13 Biogen Idec Ma Inc., Cambridge Typ ii tgf-beta receptor/immunoglobulin konstante domäne fusionsproteine
AU7608898A (en) 1997-06-06 1998-12-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
JP2002504818A (ja) 1997-06-06 2002-02-12 リジェネロン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド リガンドファミリーのｎｔｎ−２メンバー
WO1999004001A1 (en) * 1997-07-21 1999-01-28 Zymogenetics, Inc. Tumor necrosis factor receptor ztnfr-5
WO1999011791A2 (en) 1997-09-05 1999-03-11 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
TR200000669T2 (tr) 1997-09-12 2000-08-21 Apotech R & D Sa Büyüme etkinliğine sahip yeni bir protein-APRIL.
CZ303272B6 (cs) * 1999-01-07 2012-07-11 Zymogenetics, Inc. Farmaceutický prostredek obsahující fúzní protein, izolovaná molekula polynukleotidu, expresní vektor, kultivovaná bunka, zpusob prípravy polypeptidu a izolovaný polypeptid
US20060067933A1 (en) 1999-01-07 2006-03-30 Gross Jane A Soluble receptor BR43x2 and methods of using
EA006108B1 (ru) 1999-01-25 2005-08-25 Байоджен, Инк. Способы стимуляции и ингибирования роста в-клеток, продуцирования иммуноглобулинов и коррекции нарушений, связанных с baff-лигандом, у животного
WO2000062790A2 (en) 1999-04-19 2000-10-26 Immunex Corporation Soluble tumor necrosis factor receptor treatment of medical disorders
US20030022233A1 (en) 1999-04-30 2003-01-30 Raymond G. Goodwin Methods of use of the taci/taci-l interaction
SK782002A3 (en) * 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
BR0013391A (pt) 1999-08-17 2002-07-09 Biogen Inc Uso do receptor baff (bcma) como um agente imunoregulador
WO2001021631A2 (en) * 1999-09-20 2001-03-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Secreted proteins and uses thereof
UA74798C2 (ru) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Способ лечения рака у млекопитающих с помощью полипептида, который препятствует взаимодействию между april и его рецепторами
DE60028830T2 (de) 2000-02-16 2007-01-18 Genentech, Inc., South San Francisco Anti-april antikörper und hybridomazellen
EP1272647B1 (en) 2000-04-11 2014-11-12 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
ES2271004T3 (es) * 2000-04-27 2007-04-16 Biogen Idec Ma Inc. Uso de taci como agente antitumoral.
DE60128216T2 (de) * 2000-05-12 2008-01-10 Amgen Inc., Thousand Oaks Polypeptide zum Hemmen der April-vermittelten Proliferation von B- und T- Zellen
DE60142239D1 (de) 2000-08-11 2010-07-08 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd DEN PHOSPHORSÄURE-METABOLISMUS, DEN KALZIUM-METABOLISMUS, VERKALKUNG UND DEN VITAMIN D-METABOLISMUS KONTROLLIERENDE POLYPEPTIDE SOWIE FüR DIESE KODIERENDE DNA-MOLEKÜLE
CA2428242A1 (en) 2000-11-07 2002-05-16 Zymogenetics, Inc. Human tumor necrosis factor receptor
CA2438682A1 (en) * 2001-02-20 2002-08-29 Zymogenetics, Inc. Antibodies that bind both bcma and taci
ATE542545T1 (de) 2001-05-24 2012-02-15 Zymogenetics Inc Taci-immunoglobulin-fusionsproteine
PT2219675E (pt) 2007-11-12 2013-11-18 Ares Trading Sa Formulações para proteínas de fusão de taci-imunoglobulina

Also Published As

Publication number Publication date
EP1436003A2 (en) 2004-07-14
NO20035173L (no) 2004-01-23
JP2009232856A (ja) 2009-10-15
DK2116259T3 (da) 2012-05-21
AU2002305646C1 (en) 2009-08-06
HRP20030948A2 (en) 2004-06-30
EA200301146A3 (ru) 2005-02-24
US20100183609A1 (en) 2010-07-22
US9346878B2 (en) 2016-05-24
CN1612750A (zh) 2005-05-04
US20110229473A1 (en) 2011-09-22
IL158920A0 (en) 2004-05-12
UA82830C2 (en) 2008-05-26
WO2002094852A2 (en) 2002-11-28
MXPA03010687A (es) 2004-07-01
SI2116259T1 (sl) 2012-11-30
DK1436003T3 (da) 2010-03-15
US20090209006A1 (en) 2009-08-20
US20100129384A1 (en) 2010-05-27
NO337295B1 (no) 2016-03-07
US8815238B2 (en) 2014-08-26
KR20100061860A (ko) 2010-06-09
DE60234202D1 (de) 2009-12-10
NZ529638A (en) 2007-08-31
SI1436003T1 (sl) 2010-02-26
US7964711B2 (en) 2011-06-21
US7501497B2 (en) 2009-03-10
PL403488A1 (pl) 2013-07-08
US7862814B2 (en) 2011-01-04
KR20090080570A (ko) 2009-07-24
PL366760A1 (en) 2005-02-07
YU92503A (sh) 2006-05-25
US20100130728A1 (en) 2010-05-27
ZA200308984B (en) 2004-07-20
CN101628111B (zh) 2013-11-06
MEP21708A (en) 2010-06-10
CA2448123A1 (en) 2002-11-28
ES2379977T3 (es) 2012-05-07
US8524232B2 (en) 2013-09-03
EP2116259B1 (en) 2012-01-25
CA2448123C (en) 2012-09-11
BRPI0209933B8 (pt) 2021-05-25
WO2002094852A8 (en) 2004-04-22
ES2334772T3 (es) 2010-03-16
HK1137659A1 (en) 2010-08-06
EP1436003B3 (en) 2012-03-14
ATE446771T1 (de) 2009-11-15
US20030103986A1 (en) 2003-06-05
JP5149245B2 (ja) 2013-02-20
PT2116259E (pt) 2012-04-09
US7635767B2 (en) 2009-12-22
HRP20030948B1 (hr) 2013-06-30
PT1436003E (pt) 2010-03-12
ES2334772T7 (es) 2012-11-19
CN1612750B (zh) 2012-10-31
EA010594B1 (ru) 2008-10-30
CY1112840T1 (el) 2016-02-10
NO20035173D0 (no) 2003-11-21
KR100976743B1 (ko) 2010-08-19
PL219013B1 (pl) 2015-02-27
US20140328844A1 (en) 2014-11-06
HRP20130413A2 (hr) 2013-07-31
IL217265A (en) 2013-05-30
BR0209933A (pt) 2004-03-30
RS52228B (en) 2012-10-31
IL217265A0 (en) 2012-02-29
EP2116259A1 (en) 2009-11-11
EP1436003B1 (en) 2009-10-28
KR101021124B1 (ko) 2011-03-14
US20130309231A1 (en) 2013-11-21
US20060034852A1 (en) 2006-02-16
AU2002305646B2 (en) 2008-09-04
BRPI0209933B1 (pt) 2018-10-16
CN101628111A (zh) 2010-01-20
KR20040030628A (ko) 2004-04-09
US7951919B2 (en) 2011-05-31
RS20120253A1 (en) 2013-02-28
CY1109751T1 (el) 2014-09-10
HK1076603A1 (en) 2006-01-20
ATE542545T1 (de) 2012-02-15
EA200600894A1 (ru) 2007-08-31
EP1436003A4 (en) 2005-04-27
JP2004535182A (ja) 2004-11-25
EA200301146A2 (ru) 2004-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA007275B1 (ru) Слитые белки taci-иммуноглобулина
ES2316152T3 (es) Osteoprotegerina.
EA009026B1 (ru) Антитела против il-22ra, их партнеры по связыванию и способы их применения при воспалениях
EA015706B1 (ru) Моноклональное антитело или его фрагмент, связывающиеся с полипептидом il-22ra, гуманизированное антитело, полученное из указанного антитела, гибридомы, продуцирующие антитело, и применение указанного антитела
EA005005B1 (ru) ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД β1α-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА, ЕГО МУТАНТНЫЕ ФОРМЫ И ПРОИЗВОДНЫЕ И СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ
EA004635B1 (ru) Рецептор baff (bcma), иммунорегуляторный агент
AU2002305646A1 (en) TACI-immunoglobulin fusion proteins
EA015534B1 (ru) Антитела к миостатину и способы их применения
JP2023510870A (ja) Ｉｃｄ ｓｔａｔシグナル伝達が改変されたｃｄ１２２
CN1835769B (zh) Kim-1拮抗剂及其在免疫系统调节中的应用
KR20030064377A (ko) Ｔ 세포 매개 병증을 개선시키기 위한 방법 및 조성물
Streeter et al. Abnormal Development of Peripheral Lymphoid Organs in Mice Deficient in Lymphotoxin
MXPA00011932A (en) Membrane-bound proteins and nucleic acids encoding the same

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM