PT2116259E - Proteínas de fusão de taci-imunoglobulina - Google Patents

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Description

1
DESCRIÇÃO "PROTEÍNAS DE FUSÃO DE TACI-IMUNOGLOBULINA"
CAMPO DA TÉCNICA A presente invenção refere-se, em geral, a proteínas de fusão melhoradas que compreendem uma fracção de receptor de factor de necrose tumoral e uma fracção de imunoglobulina. Em particular, a presente invenção refere-se a proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina melhoradas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As citocinas são proteínas pequenas solúveis que medeiam uma variedade de efeitos biológicos, incluindo a regulação do crescimento e da diferenciação de muitos tipos de células (veja-se, por exemplo, Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul e Seder, Cell 76:241 (1994)). As proteínas que constituem o grupo das citocinas incluem interleucinas, interferões, factores de estimulação de colónias, factores de necrose tumoral e outras moléculas reguladoras. Por exemplo, a interleucina-17 humana é uma citocina que estimula a expressão da interleucina-6, a molécula de adesão intracelular 1, a interleucina-8, o factor de estimulação de colónias de macrófagos de granulócitos e a expressão da prostaglandina E2, e desempenha um papel na maturação preferencial dos precursores hematopoiéticos CD34+ em neutrófilos (Yao et al., J. Immunol. 155:5483 (1995); Fossiez et al., J. Exp. Med. 183:2593 (1996)).
Os receptores que se ligam às citocinas são compostos comummente por uma ou mais proteínas integrais de membrana que se ligam à citocina com uma afinidade elevada e transduzem este evento de ligação à célula através de porções citoplasmáticas de certas subunidades dos receptores. Os receptores de citocinas têm sido agrupados 2 em várias classes com base nas similaridades entre os seus domínios de ligação a ligandos extracelulares. Por exemplo, as cadeias dos receptores responsáveis pela ligação e/ou a transdução do efeito dos interferões são membros da família de receptores de citocinas de tipo II, com base num domínio extracelular característico de 200 resíduos.
As interacções celulares que ocorrem durante uma resposta imune são reguladas por membros de várias famílias de receptores da superfície celular, incluindo a família de receptor de factor de necrose tumoral (TNFR). A família de TNFR consiste num número de receptores de glicoproteína integrais de membrana, muitos dos quais, em combinação com os seus respectivos ligandos, regulam as interacções entre as diferentes linhagens celulares hematopoiéticas (veja-se, por exemplo, Cosman, Stem Cells 12:440 (1994); Wajant et al., Cytokine Growth Factor Rev. 10 : 15 (1999); Yeh et al., Immunol. Rev. 169:283 (1999); Idriss e Naismith, Microsc. Res. Tech. 50:184 (2000)) .
Um de tais receptores é o TACI, interacção de CAML e activador transmembranar (von Bulow e Bram, Science 228:138 (1997); Bram e von Bulow, Patente US N° 5.969.102 (1999)). O TACI é um receptor ligado à membrana que tem um domínio extracelular que contém duas pseudo-repetições ricas em cisteína, um domínio transmembranar e um domínio citoplasmático que interage com o CAML (modulador de cálcio e ligando de ciclofilina), uma proteína integral de membrana localizada nas vesículas intracelulares que é co-indutora da activação de NF-AT quando é sobre-expressa em células Jurkat. O TACI associa-se a células B e um subconjunto de células T. As sequências de nucleótidos que codificam o TACI e a sua sequência de aminoácidos correspondente são apresentadas no presente documento como as SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente. O receptor de TACI liga-se a dois membros da família de ligandos dos factores de necrose tumoral (TNF). Um 3 ligando denomina-se de forma muito diversa como ZTNF4, "BAFF", "neutrocina-a", "BLyS", "TALL-1" e "THANK" (Yu et al, Publicação internacional N° W098/18921 (1998), Moore et al, Science 285:269 (1999); Mukhopadhyay et al, J Biol. Chem. 274:15978 (1999); Schneider et al, J. Exp. Med. 189:1747 (1999); Shu et al., J Leukoc. Biol. 65:680 (1999)). A sequência de aminoácidos de ZTNF4 é apresentada como SEQ ID NO: 3. O outro ligando foi denominado como "ZTNF2", "APRIL" e "ligando de apoptose de TNRF-1" (Hahne et al, J. Exp. Med. 188:1185 (1998); Kelly et al, Câncer Res. 60:1021 (2000)). A sequência de aminoácidos de ZTNF2 é apresentada como SEQ ID NO: 4. Ambos os ligandos também são ligados pelo receptor de maturação de células B (BCMA) (Gross et al. , Nature 404:995 (2000)). A sequência de nucleótidos e a de aminoácidos de BCMA são apresentadas como a SEQ ID NO: 26 e a SEQ ID NO: 27, respectivamente.
As actividades in vivo demostradas dos receptores de factor de necrose tumoral ilustram o potencial clínico das formas solúveis do receptor. As formas solúveis do receptor de TACI têm sido geradas como proteínas de fusão de imunoglobulina. As versões iniciais deram como resultado uma proteína heterogénea de baixa expressão. A heterogeneidade foi observada no terminal amino de TACI, no terminal carboxilo de Fc, e na região do talo de TACI. Existe, portanto, a necessidade de composições de receptor de TACI farmaceuticamente úteis. O documento WO 00/40716 descreve o receptor solúvel BR43x2 e métodos de utilização do mesmo para terapêutica. O documento WO 01/81417 descreve a utilização de TACI como um agente anti-tumoral. A presente invenção proporciona uma proteína de fusão de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI)-imunoglobulina, para utilização na inibição da proliferação de células tumorais, para utilização no tratamento de uma doença auto-imune, 4 para utilização no tratamento de asma, bronquite ou enfisema, para utilização no tratamento de doença renal, para utilização no tratamento de uma doença ou distúrbio associado a imunossupressão, rejeição de enxerto, doença do enxerto contra o hospedeiro, inflamação, dor articular, edema, anemia e choque séptico, ou para utilização no tratamento de um distúrbio seleccionada a partir de neoplasma, leucemia linfocitica crónica, mieloma múltiplo, linfoma não de Hodgkin, doença linfoproliferativa pós-transplante e gamapatia de cadeia leve, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina compreende: (a) uma fracção de receptor de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI), em que a fracção de receptor de TACI consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 de SEQ ID NO: 2; em que a fracção de receptor de TACI se liga a pelo menos um de ZTNF2 ou ZTNF4; e (b) uma fracção de imunoglobulina. A invenção também proporciona um método in vitro de inibição da proliferação de células tumorais, que compreende administrar às ditas células tumorais uma proteína de fusão de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI)-imunoglobulina, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina compreende:
(a) uma fracção de receptor de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI), em que a fracção de receptor de TACI 5 consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 de SEQ ID NO: 2; em que a fracção de receptor de TACI se liga a pelo menos um de ZTNF2 ou ZTNF4; e (b) uma fracção de imunoglobulina. A invenção proporciona ainda uma proteína de fusão de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI)-imunoglobulina, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina compreende: (a) uma fracção de receptor de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI), em que a fracção de receptor de TACI consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 de SEQ ID NO: 2; em que a fracção de receptor de TACI se liga a pelo menos um de ZTNF2 ou ZTNF4; e (b) uma fracção de imunoglobulina; e em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina consiste em ou compreende uma forma secretada de qualquer uma das SEQ ID NO: 50, 52, 54 ou 56.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura 1 mostra a sequência de aminoácidos de TACI humano. As localizações das pseudo-repetições ricas em cisteína indicam-se em sombreado, o domínio transmembranar está enquadrado e a região do talo indica-se com uma linha descontínua. 6 A Figura 2 é um diagrama esquemático de uma imunoglobulina da subclasse de IgGl. CL: região constante das cadeias leves; Cm, CH2, CH3: regiões constantes das cadeias pesadas; VL: região variável das cadeias leves; VH: região variável das cadeias pesadas; CHO: hidrato de carbono; N: terminal amino; C: terminal carboxilo.
As figuras 3A, 3B, 3C e 3D mostram uma comparação da sequência de aminoácidos do Fc da região constante γΐ humana de tipo selvagem com as variantes Fc-488, Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 e Fc8. 0 dominio CHi da região constante γΐ humana não forma parte do Fc e, portanto, não é mostrado. Indica-se a localização da região de dobradiça, e dos domínios CH2 e CH3 · Indicam-se os resíduos de Cys que normalmente estão implicados na ligação por meio de ligações dissulfeto à região constante de cadeia leve (LC) e a região constante de cadeia pesada (HC) . Um símbolo “indica a identidade com o tipo selvagem nessa posição, enquanto que "***" indica a localização do terminal carboxilo e ilustra a diferença no terminal carboxilo de Fc6 em relação às outras versões de Fc. As localizações dos aminoácidos indicam-se pelas posições dos índices EU. A figura 4 mostra a ligação específica de 125I-ZTNF4 com diversas construções de TACI-Fc. As proteínas de fusão de TACI-Fc tinham fracções de TACI que careciam dos primeiros 29 resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Uma das proteínas de fusão tinha uma fracção de TACI com uma região do talo intacta (TACI (dl-29)-Fc5) , enquanto que três das proteínas de fusão de TACI-Fc tinham fracções de TACI com diversas deleções na região do talo (TACI (dl-29, dl07-154)-Fc5; TACI (dl-29, dlll-154)-Fc5; TACI (dl-29, dl20- 154)-Fc5).
Descrevem-se os dados experimentais no Exemplo 4. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 1. Perspectiva geral 7
De acordo com o descrito a seguir, a presente invenção proporciona proteínas de fusão de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI)-imunoglobulina, e as utilizações das mesmas de acordo com o definido nas reivindicações. Por exemplo, a presente invenção trata da inibição da proliferação de células tumorais usando uma composição que compreende uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina de acordo com o definido nas reivindicações. Tal composição pode ser administrada a células cultivadas in vitro. A composição pode ser uma composição farmacêutica que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina, e a composição farmacêutica pode ser para a administração a um indivíduo que tenha um tumor. 0 indivíduo pode ser um indivíduo mamífero. A administração da composição farmacêutica pode inibir, por exemplo, a proliferação de linfócitos B num indivíduo mamífero. A presente memória descritiva trata da inibição da actividade de ZTNF4 num mamífero, usando uma composição que compreende uma TACI-imunoglobulina de acordo com o definido nas reivindicações. A actividade de ZTNP4 pode estar associada a diversas doenças e distúrbios. Por exemplo, pode ser usada uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina para tratar uma doença auto-imune, tal como lúpus eritematoso sistémico, miastenia gravis, esclerose múltipla, diabetes mellitus dependente da insulina, doença de Crohn, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil de evolução poliarticular e artrite psoriática. Alternativamente, pode ser usada uma composição farmacêutica que compreende uma TACI-imunoglobulina para tratar um distúrbio tal como asma, bronquite, enfisema e insuficiência renal em estágio final. Também é possível usar uma composição farmacêutica que compreende uma TACI-imunoglobulina para tratar a doença renal, tal como glomerulonefrite, vasculite, nefrite, amiloidose e pielonefrite, ou um distúrbio tal como neoplasma, leucemia linfocitica crónica, mieloma múltipla, linfoma de não Hodgkin, doença linfoproliferativa pós-transplante e gamapatia de cadeia leve. Em certos casos, a actividade de ZTNF4 pode estar associada às células T. Também pode ser usada uma composição farmacêutica que compreende uma TACI-imunoglobulina para tratar uma doença ou um distúrbio associado à imunossupressão, rejeição de enxerto, doença do enxerto contra o hospedeiro e inflamação. Por exemplo, pode ser usada uma composição farmacêutica que compreende uma TACI-imunoglobulina para diminuir a inflamação e tratar distúrbios tais como a dor de articulações, a edema, a anemia e o choque séptico. A presente memória descritiva descreve utilizações para reduzir os níveis de circulação em sangue de ZTNF4 num indivíduo mamífero que compreendem administrar ao indivíduo mamífero uma composição farmacêutica que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina, em que a administração da composição farmacêutica reduz o nível de circulação em sangue de ZTNF4 do indivíduo mamífero. Por meio de ilustração, a administração de tal composição farmacêutica pode reduzir os níveis de circulação em sangue de ZTNF4 em pelo menos 10 %, em pelo menos 20 %, em pelo menos de 10 a 60 %, em pelo menos de 20 a 50 %, ou em pelo menos de 30 a 40 %, em comparação com o nível em sangue de ZTNF24 antes da administração da composição farmacêutica. Os peritos na especialidade podem medir os níveis de circulação de ZTNP4. No exemplo 4 e no exemplo 5, descrevem-se métodos ilustrativos.
De acordo com o descrito a seguir, as proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina compreendem: (a) uma fracção de receptor de TACI que consiste na sequência de aminoácidos de resíduos de aminoácidos 30 9 a 154 de SEQ ID NO: 2, resíduos de aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID NO: 2, e (ii) resíduos de aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID NO: 2, e em que a fracção de receptor de TACI se liga a pelo menos um de ZTNF2 ou ZTNF4, e (b) uma fracção de imunoglobulina que compreende uma região constante de uma imunoglobulina.
As fracções de receptor de TACI incluem: polipéptidos que compreendem resíduos de aminoácidos 34 a 66 de SEQ ID NO: 2, e resíduos de aminoácidos 71 a 104 de SEQ ID NO: 2; polipéptidos que compreendem resíduos de aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID NO: 2; polipéptidos que compreendem a sequência de aminoácidos de resíduos de aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID NO: 2; e polipéptidos que têm uma sequência de aminoácidos que consiste em resíduos de aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID NO: 2. A fracção de imunoglobulina de uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina pode compreender uma região constante de cadeia pesada, tal como uma região constante de cadeia pesada humana. Uma região constante de cadeia pesada de IgGl é um exemplo de uma região constante de cadeia pesada adequada. Uma região constante de cadeia pesada de IgGl ilustrativa é um fragmento Fc de IgGl que compreende os domínios CH2 e CH3. O fragmento Fc de IgGl pode ser um fragmento Fc de IgGl de tipo selvagem ou um fragmento de Fc de IgGl mutado, tal como o fragmento Fc que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33. Uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina exemplar é uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54.
As proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina descritas no presente documento podem ser multímeros, tais como dímeros. A presente memória descritiva também proporciona moléculas de ácido nucleico (de acordo com o definido nas reivindicações) que codificam uma proteína de fusão de 10 TACI-imunoglobulina. A SEQ ID NO: 53 proporciona uma sequência de nucleótidos ilustrativa que codifica uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina. A presente memória descritiva de invenção descreve receptores solúveis de TACI que consistem num fragmento de um polipéptido que tem a sequência de aminoácidos dos resíduos de aminoácidos 30 a 154 da SEQ ID NO: 2, em que o receptor solúvel de TACI compreende pelo menos um de (i) resíduos de aminoácidos 34 a 66 da SEQ ID NO: 2 e (ii) resíduos de aminoácidos 71 a 104 da SEQ ID NO: 2; e em que o receptor solúvel de TACI se liga a pelo menos um de ZTNF2 ou ZTNF4. No presente documento, descrevem-se outros receptores solúveis de TACI como fracções de receptor de TACI adequados para as proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina. Além disso, os receptores solúveis de TACI podem ser usados em métodos descritos para as proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina.
Estes e outros aspectos da invenção serão evidentes após consultar a seguinte descrição detalhada e as seguintes figuras. Além disso, a seguir, identificam-se diversas referências. 2. Definições
Na descrição que se segue, é usada amplamente uma série de termos. As seguintes definições proporcionam-se com a finalidade de facilitar o entendimento da invenção.
Como é usado no presente documento, "ácido nucleico" ou "molécula de ácido nucleico" refere-se a polinucleótidos, tais como ácido desoxirribonucleico (ADN) ou ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos gerados por meio da reacção em cadeia da polimerase (PCR) e fragmentos gerados por meio de qualquer ligação, excisão, acção de endonucleases e acção de exonucleases. As moléculas de ácido nucleico podem estar compostas por monómeros que são nucleótidos de ocorrência natural (tais como ADN e ARN) ou análogos de nucleótidos de ocorrência 11 natural (por exemplo, formas α-enantioméricas de nucleótidos de ocorrência natural) ou uma combinação de ambos. Os nucleótidos modificados podem ter alterações nas fracções de açúcar e/ou nas fracções de bases de pirimidina ou purina. As modificações dos açúcares incluem, por exemplo, a substituição de um ou mais grupos hidroxilo com halogénios, grupos alquilo, aminas e grupos azido, ou os açúcares podem estar funcionalizados como éteres ou ésteres. Além disso, é possível que toda a fracção de açúcar esteja substituída com estruturas estericamente e electronicamente similares, tais como aza-açúcares e análogos de açúcar carbocíclicos. Os exemplos de modificações numa fracção de base incluem purinas e pirimidinas alquiladas, purinas ou pirimidinas aciladas, ou outros substitutos heterocíclicos conhecidos. Os monómeros de ácido nucleico podem estar ligados por ligações de fosfodiéster ou análogos de tais ligações. Os análogos de ligações de fosfodiéster incluem fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato e similares. 0 termo "molécula de ácido nucleico" também inclui os denominados "ácidos nucleicos peptídicos", que compreendem bases de ácido nucleico de ocorrência natural ou modificadas ligadas a uma estrutura de poliamida. Os ácidos nucleicos podem ser de cadeia simples ou de cadeia dupla. 0 termo "complemento de uma molécula de ácido nucleico" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que tem uma sequência de nucleótidos complementar e uma orientação reversa em comparação com uma sequência de nucleótidos de referência. Por exemplo, a sequência 5' ATGCACGGG 3' (SEQ ID NO: 57) é complementar a 5' CCCGTGCAT 3' (SEQ ID NO: 58) . 0 termo "contig" denota uma molécula de ácido nucleico que tem uma extensão contígua de sequência idêntica ou 12 complementar a outra molécula de ácido nucleico. Diz-se que as sequências contíguas se "sobrepõem" com uma dada extensão de uma molécula de ácido nucleico na sua totalidade ou ao longo de uma extensão parcial da molécula de ácido nucleico. 0 termo "sequência de nucleótidos degenerada" denota uma sequência de nucleótidos que inclui um ou mais codões degenerados em comparação com uma molécula de ácido nucleico de referência que codifica um polipéptido. Os codões degenerados contêm diferentes tripletos de nucleótidos, mas codificam o mesmo resíduo de aminoácido (isto é, os tripletos GAU e GAC codificam Asp). 0 termo "gene estrutural" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que é transcrita no ARN mensageiro (ARNm), que em seguida é traduzido numa sequência de aminoácidos característica de um polipéptido específico.
Uma "molécula de ácido nucleico isolada" é uma molécula de ácido nucleico que não está integrada no ADN genómico de um organismo. Por exemplo, uma molécula de ADN que codifica um factor de crescimento que foi separada do ADN genómico de uma célula é uma molécula de ADN isolada. Outro exemplo de uma molécula de ácido nucleico isolada é uma molécula de ácido nucleico sintetizada quimicamente que não está integrada no genoma de um organismo. Uma molécula de ácido nucleico que foi isolada de uma determinada espécie é menor que a molécula de ADN completa de um cromossoma dessa espécie.
Uma "construção de uma molécula de ácido nucleico" é uma molécula de ácido nucleico, de cadeia simples ou de cadeia dupla, que foi modificada por meio da intervenção humana para que contenha segmentos de ácido nucleico combinados e justapostos numa disposição que não existe na natureza. "ADN linear" denota moléculas de ADN não circulares que têm as extremidades 5' e 3' livres. ADN linear pode ser 13 preparado a partir de moléculas de ADN circulares fechadas, tais como plasmideos, por meio de digestão enzimática ou alteração fisica. "ADN complementar (ADNc) " é uma molécula de ADN de cadeia simples que se forma a partir de um molde de ARNm pela enzima transcriptase reversa. Tipicamente, utiliza-se um iniciador complementar a porções do ARNm para iniciar a transcrição reversa. Os peritos na especialidade também usam o termo "ADNc" para referirem-se a uma molécula de ADN de cadeia dupla que consiste em tal molécula de ADN de cadeia simples e a sua cadeia de ADN complementar. 0 termo "ADNc" também se refere a um clone de uma molécula de ADNc sintetizada a partir de um molde de ARN.
Um "promotor" é uma sequência de nucleótidos que dirige a transcrição de um gene estrutural. Tipicamente, o promotor está localizado na região 5' não codificante de um gene, em posição proximal ao local de iniciação da transcrição de um gene estrutural. Os elementos de sequência dentro dos promotores que funcionam no inicio da transcrição caracterizam-se com frequência por sequências de nucleótidos consenso. Estes elementos dos promotores incluem locais de ligação à ARN polimerase, sequências TATA, sequências CAAT, elementos específicos da diferenciação (DSEs; McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)), elementos de resposta ao AMP cíclico (CREs), elementos de resposta ao soro (SREs; Treisman, Seminars in Câncer Biol. 1:47 (1990)), elementos de resposta a glicocorticóides (GREs) e locais de ligação para outros factores de transcrição, tais como CRF/ATF (0'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)), AP2 (Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)), SP1, proteína de ligação para os elementos de resposta a AMPc (CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)) e factores octaméricos (veja-se, em geral, Watson et al., eds., "Molecular Biology of the Gene", IV ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, 14
Inc. 1987) e Lemaigre e Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)). Se um promotor é um promotor induzível, então a taxa de transcrição aumenta como resposta a um agente indutor. Em contraste, a taxa de transcrição não está regulada por um agente indutor se o promotor for um promotor constitutivo. Também são conhecidos os promotores repressiveis.
Um "promotor central" contém seguências de nucleótidos essenciais para a função do promotor, incluindo a caixa TATA e o inicio da transcrição. Por meio desta definição, um promotor central pode ou não pode ter uma actividade detectável na ausência de sequências especificas que podem aumentar a actividade ou conferir uma actividade especifica de um tecido.
Um "elemento regulador" é uma sequência de nucleótidos que modula a actividade de um promotor central. Por exemplo, um elemento regulador pode conter uma sequência de nucleótidos que se liga a factores celulares que permitem a transcrição exclusiva ou de forma preferente em determinadas células, tecidos ou organitos. Estes tipos de elementos reguladores estão normalmente associados a genes que se expressam de um modo "específico para célula", "específico para tecido" ou "específico para organito".
Um "potenciador" ou "enhancer" é um tipo de elemento regulador que pode aumentar a eficácia da transcrição, independentemente da distância ou da orientação do potenciador com respeito ao local de início da transcrição.
"ADN heterólogo" refere-se a uma molécula de ADN ou uma população de moléculas de ADN que não existe de maneira natural numa dada célula hospedeira. As moléculas de ADN heterólogas a uma determinada célula hospedeira podem conter ADN derivado da espécie da célula hospedeira (isto é, ADN endógeno) contanto que o ADN hospedeiro esteja combinado com ADN não hospedeiro (isto é, ADN exógeno). Por exemplo, uma molécula de ADN que contém um segmento de ADN 15 não hospedeiro que codifica um polipéptido ligado operativamente a um segmento de ADN hospedeiro que compreende um promotor da transcrição se considera uma molécula de ADN heteróloga. Em contraste, uma molécula de ADN heteróloga pode compreender um gene endógeno ligado operativamente com um promotor exógeno. Como outro exemplo, uma molécula de ADN que compreende um gene derivado de uma célula de tipo selvagem se considera ADN heterólogo se essa molécula de ADN estiver introduzida numa célula mutante que carece do gene de tipo selvagem.
Um "polipéptido" é um polímero de resíduos de aminoácidos ligados por meio de ligações peptídicas, produzido de maneira natural ou sinteticamente. Os polipéptidos de menos de aproximadamente 10 resíduos de aminoácidos denominam-se comummente "péptidos".
Uma "proteína" é uma macromolécula que compreende uma ou mais cadeias polipeptídicas. Uma proteína também pode compreender componentes não peptídicos, tais como grupos de hidrato de carbono. Os hidratos de carbono e outros substituintes não peptídicos podem ser adicionados a uma proteína através da célula na qual a proteína é produzida, e variarão com o tipo de célula. As proteínas são definidas no presente documento em termos das suas estruturas de aminoácidos; os substituintes tais como os grupos de hidrato de carbono geralmente não se especificam, embora possam estar presentes.
Um péptido ou um polipéptido codificado por uma molécula de ADN não hospedeiro é um péptido ou um polipéptido "heterólogo".
Um "elemento genético integrado" é um segmento de ADN que foi incorporado a um cromossoma de uma célula hospedeira após introduzir esse elemento na célula por meio de manipulação humana. Dentro da presente invenção, os elementos genéticos integrados são derivados mais comummente de plasmídeos linearizados que são introduzidos 16 nas células por meio de electroporação ou outras técnicas. Os elementos genéticos integrados são transmitidos da célula hospedeira original à sua progénie.
Um "vector de clonagem" é uma molécula de ácido nucleico, tal como um plasmídeo, um cosmideo ou um bacteriófago, que tem a capacidade de replicar-se de maneira autónoma numa célula hospedeira. Os vectores de clonagem contêm comummente um ou um número pequeno de locais de reconhecimento de endonucleases de restrição que permite a inserção de uma molécula de ácido nucleico de uma maneira determinável sem a perda de uma função biológica essencial do vector, assim como as sequências de nucleótidos que codificam um gene marcador que é adequado para utilização na identificação e na selecção de células transformadas com o vector de clonagem. Os genes marcadores incluem comummente genes que proporcionam resistência à tetraciclina ou resistência à ampicilina.
Um "vector de expressão" é uma molécula de ácido nucleico que codifica um gene que é expresso numa célula hospedeira. Tipicamente, um vector de expressão compreende um promotor da transcrição, um gene e um terminador da transcrição. A expressão génica habitualmente é colocada sob o controlo de um promotor e diz-se que tal gene está "ligado operativamente" ao promotor. De maneira similar, um elemento regulador e um promotor central estão ligados operativamente se o elemento regulador modular a actividade do promotor central.
Um "hospedeiro recombinante" é uma célula que contém uma molécula de ácido nucleico heteróloga, tal como um vector de clonagem ou um vector de expressão. No presente contexto, um exemplo de um hospedeiro recombinante é uma célula que produz uma proteína de fusão de TACI-Fc a partir de um vector de expressão. 17
Os "transformantes integradores" são células hospedeiras recombinantes nas quais o ADN heterólogo foi integrado no ADN genómico das células.
Uma "proteína de fusão" é uma proteína híbrida expressa por uma molécula de ácido nucleico que compreende sequências de nucleótidos de pelo menos dois genes. Por exemplo, uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina compreende uma fracção de receptor de TACI e uma fracção de imunoglobulina. Como é usado no presente documento, um "fracção de receptor de TACI" é uma parte do domínio extracelular do receptor de TACI que se liga a pelo menos um entre ZTNF2 ou ZTNF4. 0 termo "fracção de imunoglobulina" refere-se a um polipéptido que compreende uma região constante de uma imunoglobulina. Por exemplo, a fracção de imunoglobulina pode compreender uma região constante de cadeia pesada. 0 termo proteína de fusão de "TACI-Fc" refere-se a uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina na qual a fracção de imunoglobulina compreende regiões constantes das cadeias pesadas da imunoglobulina, CH2 e CH3. 0 termo "receptor" denota uma proteína associada a uma célula que se liga a uma molécula bioactiva denominada "ligando". Esta interacção medeia o efeito do ligando sobre a célula. No contexto da ligação do receptor de TACI, o termo "que se liga especificamente" ou "ligação específica" refere-se à capacidade do ligando para ligar-se competitivamente com o receptor. Por exemplo, ZTNF4 liga-se especif icamente com o receptor de TACI, e isto pode ser mostrado por meio da observação da competição pelo receptor de TACI entre ZTNF4 marcado de maneira detectável e ZTNF4 sem marcar.
Os receptores podem estar ligados à membrana, ser citossólicos ou nucleares; monoméricos (por exemplo, o receptor da hormona estimulante da tiróide, receptor beta-adrenérgico) ou multiméricos ((por exemplo, receptor do 18 PDGF, receptor de hormonas do crescimento, receptor da IL-3; receptor do GM-CSF, receptor do G-CSF, receptor da eritropoietina e receptor da IL-β). Os receptores ligados à membrana caracterizam-se por uma estrutura de múltiplas domínios que compreende um domínio extracelular de ligação a ligando e um domínio efector intracelular que está comummente implicado na transdução de sinais. Em certos receptores ligados à membrana, o domínio extracelular de ligação a ligandos e o domínio efector intracelular estão localizados em polipéptidos separados que compreendem o receptor funcional completo.
Em geral, a ligação do ligando ao receptor tem como resultado uma mudança configuracional no receptor que provoca uma interacção entre o domínio efector e outra ou outras moléculas na célula, o que por sua vez conduz a uma alteração do metabolismo da célula. Os eventos metabólicos que estão ligados frequentemente às interacções entre receptor e ligando incluem a transcrição génica, a fosforilação, a desfosforilação, os aumentos da produção de AMP cíclico, a mobilização do cálcio celular, a mobilização de lípidos de membrana, a adesão celular, a hidrólise de lípidos de inositol e a hidrólise de fosfolípidos. 0 termo "sequência sinal de secreção" denota uma sequência de ADN que codifica um péptido (um "péptido de secreção") que, como componente de um polipéptido de maior tamanho, dirige o polipéptido maior através de uma via de secreção de uma célula na qual é sintetizado. 0 polipéptido maior é comummente clivado para eliminar o péptido de secreção durante o trânsito pela via de secreção.
Um "polipéptido isolado" é um polipéptido que está essencialmente livre de componentes celulares contaminantes, tais como impurezas de hidratos de carbono, lípidos ou outras proteínas associadas ao polipéptido na natureza. Tipicamente, uma preparação de um polipéptido isolado contém o polipéptido numa forma muito purificada, 19 isto é, pelo menos aproximadamente 80 % puro, pelo menos aproximadamente 90 % puro, pelo menos aproximadamente 95 % puro, mais de 95 % puro ou mais de 99 % puro. Um modo de demostrar que uma determinada preparação de proteínas contém um polipéptido isolado é por meio da aparição de uma única banda após uma electroforese em gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio (SDS) da preparação proteica e uma coloração com azul brilhante de Coomassie do gel. No entanto, o termo "isolado" não exclui a presença do mesmo polipéptido em formas físicas alternativas, tais como dímeros ou, alternativamente, formas glicosiladas ou derivadas.
Os termos "amino-terminal" e "carboxi-terminal" são usados no presente documento para indicar as posições dentro dos polipéptidos. Quando o contexto o permite, estes termos são usados com referência a uma determinada sequência ou porção de um polipéptido para indicar proximidade ou uma posição relativa. Por exemplo, uma determinada sequência colocada carboxi-terminalmente a uma sequência de referência num polipéptido está localizada em posição proximal ao terminal carboxilo da sequência de referência, mas não está necessariamente no terminal carboxilo do polipéptido completo. O termo "expressão" refere-se à biossíntese de um produto génico. Por exemplo, no caso de um gene estrutural, a expressão implica a transcrição do gene estrutural em ARNm e a tradução do ARNm num ou mais polipéptidos. O termo "variante de splice" é usado no presente documento para indicar formas alternativas de ARN transcrito desde um gene. A variação por splice é produzida de maneira natural por meio da utilização de locais de splicing alternativo de uma molécula de ARN transcrito, ou menos comummente, entre moléculas de ARN transcritas em separado, e pode ter como resultado vários ARNm transcritos do mesmo gene. As variantes de splice podem codificar 20 polipéptidos que têm a sequência de aminoácidos alterada. O termo variante de splice também é usado no presente documento para indicar um polipéptido codificado por uma variante de splice de um ARNm transcrito de um gene.
Como é usado no presente documento, o termo "imunomodulador" inclui citocinas, factores de crescimento de células estaminais, linfotoxinas, moléculas co-estimuladoras, factores hematopoiéticos e análogos sintéticos destas moléculas. O termo "par de complemento/anti-complemento" indica fracções não idênticas que formam um par estável associado não covalentemente em condições apropriadas. Por exemplo, a biotina e a avidina (ou a estreptavidina) são membros prototípicos de um par de complemento/anti-complemento. Outros exemplos de pares de complemento/anti-complemento incluem pares de receptor/ligando, pares de anticorpo/antigénio (ou hapteno ou epitopo), pares de poli-nucleótidos senso/antisenso, e similares. Quando se deseja a posterior dissociação do par de complemento/anti-complemento, o par de complemento/anti-complemento tem preferivelmente uma afinidade de ligação inferior a ΙΟ9 ΝΓ1.
Um "fragmento de anticorpo" é uma parte de um anticorpo tal como F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab e similares. Independentemente da estrutura, um fragmento de anticorpo liga-se ao mesmo antigénio que é reconhecido pelo anticorpo intacto. O termo "fragmento de anticorpo" também inclui um polipéptido sintético ou desenhado geneticamente que se liga a um antigénio especifico, tal como polipéptidos que consistem na região variável da cadeia leve, fragmentos "Fv" que consistem nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve, moléculas de polipéptido de cadeia simples recombinantes nas quais as regiões variáveis das cadeias leve e pesada estão ligadas por um ligante peptídico ("proteínas scFv") e unidades mínimas de reconhecimento que 21 consistem nos resíduos de aminoácidos que imitam a região hipervariável.
Um "anticorpo quimérico" é uma proteína recombinante que contém os domínios variáveis e as regiões determinantes da complementaridade derivados de um anticorpo de roedor, enquanto que o restante da molécula de anticorpo é derivada de um anticorpo humano.
Os "anticorpos humanizados" são proteínas recombinantes nas quais as regiões determinantes da complementaridade murinas de um anticorpo monoclonal foram transferidas das cadeias variáveis pesadas e leves da imunoglobulina murina a um domínio variável humano.
Como é usado no presente documento, um "agente terapêutico" é uma molécula ou um átomo que se conjuga com uma fracção de anticorpo para produzir um conjugado que é útil para a terapêutica. Os exemplos de agentes terapêuticos incluem fármacos, toxinas, imunomoduladores, quelantes, compostos de boro, agentes ou corantes fotoactivos e radioisótopos.
Um "marcador detectável" é uma molécula ou um átomo que pode ser conjugado com uma fracção de anticorpo para produzir uma molécula útil para o diagnóstico. Os exemplos de marcadores detectáveis incluem quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iões paramagnéticos ou outras fracções marcadoras. 0 termo "etiqueta de afinidade" é usado no presente documento para indicar um segmento de polipéptido que pode ser ligado a um segundo polipéptido para proporcionar a purificação ou a detecção do segundo polipéptido, ou para proporcionar locais para a ligação do segundo polipéptido a um substrato. Em princípio, pode ser usado qualquer péptido ou proteína para a qual esteja disponível um anticorpo ou outro agente de ligação específica como etiqueta de afinidade. As etiquetas de afinidade incluem um tracto de polihistidina, a proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 22 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198 :3 (1991)), glutationa-S-transferase (Smith e Johnson, Gene 67:31 (1988)), etiqueta de afinidade Glu-Glu (Grussenmeyer et al. , Proc. Natl. Acad Sei. USA 82:7952 (1985)), sustância P, péptido FLAG (Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988)), péptido de ligação à estreptavidina, ou outro epítopo antigénico ou domínio de ligação. Veja-se, em geral, Ford et al, "Protein Expression and Purification" 2:95 (1991). As moléculas de ADN que codificam etiquetas de afinidade podem ser obtidas de fornecedores comerciais (por exemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Um "anticorpo nu" é um anticorpo inteiro, a diferença de um fragmento de anticorpo, que não está conjugado com um agente terapêutico. Os anticorpos nus incluem anticorpos tanto policlonais como monoclonais, assim como certos anticorpos recombinantes, tais como anticorpos quiméricos e humanizados.
Como é usado no presente documento, o termo "componente de anticorpo" inclui tanto um anticorpo inteiro como um fragmento de anticorpo.
Um "imunoconjugado" é um conjugado de um componente de anticorpo com um agente terapêutico ou um marcador detectável.
Um "polipéptido alvo" ou um "péptido alvo" é uma sequência de aminoácidos que compreende, pelo menos, um epítopo e que está expressa numa célula alvo, tal como uma célula tumoral, ou uma célula que possui um antigénio de um agente infeccioso. As células T reconhecem os epítopos peptídicos apresentados por uma molécula do complexo maior de histocompat ibilidade a um polipéptido alvo ou a um péptido alvo e, comummente, lisam a célula alvo ou recrutam outros imunócitos para que se dirijam ao local da célula alvo, destruindo desse modo à célula alvo.
Um "péptido antigénico" é um péptido que se unirá a uma molécula do complexo maior de histocompatibilidade para 23 formar um complexo de MHC-péptido, que é reconhecido por uma célula T, induzindo desse modo uma resposta de linfócitos citotóxicos após a apresentação à célula T. Assim, os péptidos antigénicos são capazes de ligarem-se a uma molécula do complexo maior de histocompatibilidade apropriada e induzir uma resposta das células T citotóxicas, tais como a lise celular ou uma liberação de citocinas especificas contra a célula alvo que se liga ao antigénio ou o expressa. 0 péptido antigénico pode ser ligado no contexto de uma molécula do complexo maior de histocompatibilidade de classe I ou classe II, numa célula apresentadora de antigénio ou numa célula alvo.
Em eucariotas, a ARN polimerase II catalisa a transcrição de um gene estrutural para produzir ARNm. É possível desenhar uma molécula de ácido nucleico para que contenha um molde de ARN polimerase II em que o transcrito de ARN tenha uma sequência que seja complementar à de um ARNm específico. 0 transcrito de ARN denomina-se um "ARN antisenso" e uma molécula de ácido nucleico que codifica o ARN antisenso denomina-se um "gene antisenso". As moléculas de ARN antisenso são capazes de ligarem-se às moléculas de ARNm, o que tem como resultado uma inibição da tradução do ARNm.
Devido à falta de exactidão dos métodos analíticos padrão, entende-se que os pesos moleculares e os comprimentos dos polímeros são valores aproximados. Quando tal valor é expresso como "cerca de" ou "aproximadamente" X, será entendido que o valor de X indicado terá uma exactidão de ± 10 %. 3. Produção de Moléculas de Ácido Nucleico que Codificam Proteínas de TACI-Imunoglobulina A figura 1 proporciona a sequência de aminoácidos predita de TACI humano (von Bulow e Bram, Science 278:138 (1997)). O polipéptido TACI contém os seguintes elementos preditos: (a) duas estruturas de pseudo- repetição ricas em cisteína características dos domínios de ligação dos ligandos dos factores de necrose tumoral; (b) uma "região do talo" de 62 aminoácidos que reside entre os domínios de ligação dos ligandos e o domínio transmembranar; (c) um domínio transmembranar de 20 aminoácidos; e (d) um domínio intracelular de 127 aminoácidos. A sequência de aminoácidos não contém uma sequência sinal amino-terminal hidrofóbica predita.
Com a finalidade de criar uma forma solúvel de TACI humano para utilização como inibidor da interacção entre o ligando nativo e o receptor nativo, gerou-se uma proteína de fusão de domínio extracelular de TACI-Fc de imunoglobulina humana. Utilizou-se a sequência de TACI humano disponível como ponto inicial para desenhar a molécula da proteína de fusão (von Biilow e Bram, Science 278:138 (1997)). Esta construção inicial, designada "TACI-Fc4", incluía os resíduos de aminoácidos 1 a 154 do polipéptido TACI e uma região Fc humana modificada, descritos a seguir. Seleccionou-se o ponto de fusão do resíduo 154 para que incluíra o máximo possível da região do talo de TACI, sem incluir nenhuma possível porção do domínio transmembranar predito.
Como o polipéptido TACI nativo não contém uma sequência sinal amino-terminal, adicionou-se uma sequência sinal amino-terminal ao TACI para gerar uma forma secretada da proteína de fusão de TACI-Fc. A sequência sinal era uma sequência pré-pro modificada do activador tissular do plasminogénio humano. As modificações foram incluídas para aumentar a excisão por meio de uma peptidase sinal e o processamento específico da protease furina, e por esse motivo esta sequência foi denominada "tPA líder optimizado (otPA)". A seguir, ilustra-se a sequência otPA (SEQ ID NO: 25); os resíduos de aminoácidos modificados estão sombreados. Inseriu-se a sequência codificante da proteína 25 de fusão de TACI-Fc recombinante num vector de expressão que foi transferido a células de ovário de hamster chinês. 26 ~3S -30
Msfe M.a Mafe Lys Arg úly Lsru Cys Cys Vai fciã» Leu x»eu Cya local de clivagem da peptidase sinal -20 „ ( -ia @ty &X*· Vai fii* V*I Ser IS 61a xim Uim ,&2« pia &Ist local de clivagem da furina jyr§
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As células de ovário de hamster chinês transfectadas produziram a proteína de TACI-Fc4 a um nível baixo de aproximadamente 0,3 pg/célula/dia. A análise de Western blot da proteína de TACI-Fc com antissoros de cabra contra Fc de IgG humana revelou duas bandas, uma banda era menor que o tamanho esperado de aproximadamente 48 kDa. A análise da sequência de aminoácidos de proteínas purificadas revelou que a banda menor reflectia a excisão das proteínas de fusão de TACI em diversos locais da região do talo de TACI. Com referência à SEQ ID NO: 2, os terminais principais foram descobertos nos resíduos de aminoácidos 118 e 123, embora as proteínas tivessem também sido clivadas nas posições dos aminoácidos 110, 139 e 141.
Além da heterogeneidade provocada pela excisão na região do talo, também foi observada heterogeneidade nos terminais amino e carboxilo. Com referência à SEQ ID NO: 2, os terminais principais foram descobertos nos resíduos de aminoácidos 1, 10 e 13. As diferenças no terminal carboxilo reflectem a heterogeneidade natural das imunoglobulinas recombinantes e as proteínas de fusão de imunoglobulina, que inclui a deleção incompleta do resíduo de lisina codificado carboxiterminalmente. Encontrou-se outra fonte da heterogeneidade na natureza variável da estrutura de hidrato de carbono ligada ao domínio CH2 de imunoglobulina codificado por Fc. 27
Geraram-se novas versões de TACI-Fc para tratar a heterogeneidade observada. Desenharam-se construções que incluíam pelo menos uma das seguintes variações na fracção de TACI: (1) deletaram-se porções da região do talo de TACI; (2) substituiu-se uma porção da região do talo de TACI por uma porção da região do talo do BCMA; (3) mutou-se o resíduo de arginina da posição 119 para eliminar um possível local de excisão de furina; (4) mutou-se o resíduo de glutamina da posição 121 para eliminar um possível local de excisão de furina; (5) mutou-se o resíduo de arginina da posição 122 para eliminar um possível local de excisão por meio de furina; (6) mutaram-se o resíduo de aminoácido das posições 123 e 142 a resíduos de aminoácidos encontrados nas posições correspondentes de TACI murino; (7) substituiu-se a sequência sinal do otPA humano com uma sequência sinal da região variável da cadeia pesada humana; (8) mutou-se o resíduo de valina da posição 29 em metionina, e uniu-se a sequência sinal do otPA numa posição amino-terminal com este resíduo; e (9) uniu-se a sequência sinal otPA numa localização amino-terminal com o resíduo de alanina da posição 30.
Também se introduziram modificações na fracção de imunoglobulina. Nos vertebrados superiores, foram identificadas cinco classes de imunoglobulina, IgG, igA, IgM, IgD e IgE. As proteínas IgG, IgD e IgE são caracteristicamente heterotetrâmeros ligados por meio de ligações dissulfeto que consistem em duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. Tipicamente, a IgM é encontrada como um pentâmero de um tetrâmero, enquanto que a IgA ocorre como um dímero de um tetrâmero. A IgG compreende a classe principal, pois existe normalmente como a segunda proteína mais abundante encontrada no plasma. Em seres humanos, a IgG consiste em quatro subclasses denominadas IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Como é mostrado na figura 2, cada cadeia pesada de 28 imunoglobulina possui uma região constante que consiste em domínios proteicos de região constante (Cm, dobradiça, CH2 e CH3> que são invariáveis para uma dada subclasse. As regiões constantes das cadeias pesadas da classe IgG identificam-se com o símbolo grego γ. Por exemplo, as imunoglobulinas da subclasse IgGl contêm uma região constante ayl nas cadeias pesadas. 0 fragmento Fc, ou domínio Fc, consiste nas regiões de dobradiça e os domínios CH2 e CH3 das cadeias pesadas ligados por meio de ligações dissulfeto. Nas proteínas de fusão de imunoglobulina, os domínios Fc da subclasse IgGl são usados habitualmente como a fracção de imunoglobulina, porque a IgGl tem a semivida em soro mais longa de todas as proteínas séricas. Uma semivida em soro prolongada pode ser uma característica proteica desejável para os estudos animais e uma possível utilização terapêutica em seres humanos. Além disso, a subclasse IgGl possui a maior capacidade de levar a cabo funções efectoras mediadas por anticorpos. A função efectora principal que pode ser a mais útil numa proteína de fusão de imunoglobulina é a capacidade de um anticorpo IgGl para mediar a citotoxicidade celular dependente de um anticorpo. Por outro lado, isto poderia ser uma função não desejável para uma proteína de fusão que funcione fundamentalmente como antagonista. Foram identificados vários dos resíduos de aminoácidos específicos que são importantes para uma actividade mediada pela região constante de um anticorpo na subclasse IgGl. A inclusão ou a exclusão destes aminoácidos específicos permite portanto a inclusão ou a exclusão de uma actividade mediada pela região constante de uma imunoglobulina específica.
Geraram-se seis versões de um Fc de IgGl humana modificado para criar proteínas de fusão de Fc. Desenhou-se Fc-488 para a clonagem conveniente de uma proteína de fusão que continha a região Fc γΐ humana, e foi construída usando 29 a região constante γΐ de imunoglobulina humana de tipo selvagem como molde. Preocupações sobre potenciais efeitos deletérios devido a um residuo de cisteina não emparelhado levaram a tomar a decisão de substituir a cisteina (residuo de aminoácido 24 de SEQ ID NO: 6), que normalmente se liga por meio de ligações dissulfeto à região constante das cadeias leves da imunoglobulina, por um residuo de serina. Introduziu-se outra mudança mais no codão que codifica a posição do índice EU 218 (resíduo de aminoácido 22 da SEQ ID NO: 6) para introduzir um local de reconhecimento da enzima de restrição Bg/II com a finalidade de facilitar futuras manipulações do ADN. Estas mudanças foram introduzidas no produto da PCR codificado em iniciadores para PCR. Devido à localização do local de Bg/III e para completar a região de dobradiça de Fc, incorporaram-se os codões para as posições do índice EU 216 e 217 (resíduos de aminoácidos 20 e 21 da SEQ ID NO: 6) nas sequências parceiras da proteína de fusão.
Fc4, Fc5 e Fc6 contêm mutações para reduzir as funções efectoras mediadas pelo Fc por meio da redução da ligação a FcyRI e a ligação ao complemento Clq. Fc4 contém as mesmas substituições de aminoácidos que foram introduzidas em Fc-488. Introduziram-se mais substituições de aminoácido para reduzir potenciais funções efectoras mediadas por Fc. Especificamente, introduziram-se três substituições de aminoácidos para reduzir a ligação a FcyRI. Estas são as substituições nas posições do índice EU 234, 235 e 237 (resíduos de aminoácidos 38, 39 e 41 de SEQ ID NO: 6) . Observou-se que as substituições realizadas nestas posições reduziram a ligação a FcyRI (Duncan et al., Nature 332:563 (1988)). Estas substituições de aminoácido também podem reduzir a ligação a FcyRIIa, assim como a ligação a FcyRIII (Sondermann et ai., Nature 406:267 (2000); Wines et al., J. Immunol. 164:5313 (2000)). 30 Vários grupos descreveram a relevância das posições do índice EU 330 e 331 (resíduos de aminoácidos 134 e 135 da SEQ ID NO: 6) na ligação ao complemento Clq e a posterior fixação do complemento (Canfield e Morrison, J. Exp. Med 173:1483 (1991); Tao et al. , J. Exp. Med. 178:661 (1993)). As substituições dos aminoácidos realizadas nestas posições foram introduzidas em Fc4 para reduzir a fixação do complemento. O domínio CH3 de Fc4 é idêntico ao encontrado no correspondente polipéptido de tipo selvagem, a excepção do codão de terminação, que foi mudado de TGA a TAA para eliminar um possível local de metilação dam quando o ADN clonado é crescido em estirpes de E. coli mais dam.
Em Fc5, voltou-se a mutar o resíduo de arginina situado na posição do índice EU 218 a uma lisina, porque o esquema de clonagem de Bg/II não foi utilizado em proteínas de fusão que continham este determinado Fc. O resíduo da sequência de Fc5 coincide com a descrição anterior de Fc4.
Fc6 é idêntico a Fc5, excepto que o codão de lisina carboxi-terminal foi eliminado. A lisina C- terminal de imunoglobulinas maduras é eliminada habitualmente das imunoglobulinas maduras após a tradução antes da secreção desde células B ou é eliminada durante a circulação em soro. Por conseguinte, o resíduo de lisina C-terminal não é encontrada comummente em anticorpos circulantes. Como nos Fc4 e Fc5 anteriores, o codão de terminação da sequência de Fc6 foi mudado a TAA.
Fc7 é idêntico ao Fc de γι de tipo selvagem, a excepção de uma substituição do aminoácido situado na posição do índice EU 297 localizada no domínio CH2 · A posição do índice EU Asn-297 (resíduo de aminoácido 101 de SEQ ID NO: 6) é um local de ligação de hidratos de carbono ligado a N. O hidrato de carbono ligado a N introduz uma potencial fonte de variabilidade numa proteína expressa recombinantemente, devido às potenciais variações de lote a lote da estrutura do hidrato de carbono. Numa tentativa 31 para eliminar esta potencial variabilidade, mutou-se Asn-297 a um resíduo de glutamina para evitar a ligação do hidrato de carbono ligado a N nessa posição de resíduo. 0 hidrato de carbono do resíduo 297 também está implicado na ligação de Fc a FcyRIII (Sondermann et al., Nature 406:267 (2000)). Portanto, a deleção do hidrato de carbono deveria diminuir a ligação do Fc7 recombinante que contém as proteínas de fusão com os FcyR em geral. Como no caso anterior, o codão de terminação da sequência de Fc7 foi mutado a TAA.
Fc8 é idêntico à região γΐ da imunoglobulina de tipo selvagem mostrada na SEQ ID NO: 6, excepto que o resíduo de cisteína da posição do índice EU 220 (resíduo de aminoácido 24 da SEQ ID NO: 6) foi substituído por um resíduo de serina. Esta mutação eliminou o resíduo de cisteína que normalmente se liga por meio de ligações dissulfeto à região constante das cadeias leves da imunoglobulina.
No quadro 1, descrevem-se construções de TACI-Fc ilustrativas. QUADRO 1
Construções de proteínas de fusão de TACI-Fc ilustrativos Sequência de TACIa Versão de Fc TACIb Fc4 TACIb Fc5 TACIb Fcyl TACI (dlO 7-154) Fc5 TACI (R119Q) Fc4 TACI (1-104)-BCMA (42-54)° Fc5 TACI (dl43-150) Fc5 TACI (R142G, dl43-150) Fc5 32 (continuação)
Construções de proteínas de fusão de TACI-Fc ilustrativos Sequência de TACIa Versão de Fc TACI (R119G, Q121P, R122Q, S123A) Fc5 TACI (R119G, R122Q) Fc5 TACI (dl-28, V29M) Fc6 TACI (dl-29) Fc6 TACI (dl-29) Fc5 TACI (dl-29, dl07-154) Fc5 TACI (dl-29, dl11-15 4) Fc5 TACI (dl-29, dl20-154) Fc5 3A informação sobre localizações, mutações e deleções de sequências de aminoácidos proporciona-se entre parênteses com referência à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. bInclui os resíduos de aminoácidos 1 a 154 de SEQ ID NO: 2. cEsta construção inclui os resíduos de aminoácidos 1 a 104 de SEQ ID NO: 2 (TACI) e os aminoácidos 42 a 54 de SEQ ID NO: 27 (BCMA).
Produziram-se as proteínas de TACI-Fc por meio de células de ovário de hamster chinês recombinantes, isolaram-se e analisaram-se usando uma análise de Western blot e uma análise das sequências de aminoácidos. De maneira surpreendente, a deleção dos 29 primeiros aminoácidos do terminal N do polipéptido TACI teve como resultado um aumento de dez vezes a produção das proteínas de fusão de TACI-Fc por meio de células de ovário de hamster chinês. Esta deleção também reduziu a excisão da região do talo de comprimento completa. Além disso, suprimiu-se a excisão na região do talo de TACI por meio do truncamento da região do talo de TACI ou por meio da substituição da região do talo de TACI em outra sequência 33 de aminoácidos (por exemplo, a sequência de aminoácidos da região do talo do BCMA).
De acordo com o descrito no exemplo 4, as análises funcionais das construções de TACI-Fc indicam que as proteínas de fusão TACI (dl-29)-Fc5, TACI (dl-29, dl07-154)-Fc5, TACI (dl-29, dlll-154)-Fc5 e TACI (dl-29, dl20-154)- Fc5 têm afinidades de ligação similares por ZTNF24. No entanto, as construções TACI (dl-29)-Fc5, TACI (dl-29, dlll-154)-Fc5 e TACI (dl-29, dl20-154)-Fc5 parecem ligar-se mais a ZTNF4 por mol de TACI-Fc que a construção TACI (dl-29, dl07-154)-Fc5. Em função da utilização desejada (isto é, terapêutico, de diagnóstico ou de investigação), podem utilizadas proteínas de fusão de TACI-Fc de alta capacidade ou de baixa capacidade. Além disso, a combinação de proteínas de fusão de TACI-Fc de alta e baixa capacidade permite a titulação de ZTNF2 ou de ZTNF24. A presente invenção contempla proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina de acordo com o definido nas reivindicações que compreendem uma fracção de receptor de TACI que consiste nos resíduos de aminoácidos 34 a 104 da SEQ ID NO: 2, 30 a 110 da SEQ ID NO: 2 ou 30 a 154 da SEQ ID NO: 2. A presente memória descritiva descreve proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina que compreendem uma fracção de receptor de TACI que consiste nos resíduos de aminoácidos 31 a 106 da SEQ ID NO: 2, 31 a 110 da SEQ ID NO: 2, 31 a 119 da SEQ ID NO: 2 ou 31 a 154 da SEQ ID NO: 2.
De maneira mais geral, a presente memória descritiva descreve proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina nas quais a fracção de receptor de TACI consiste num fragmento dos resíduos de aminoácidos 30 a 154 de SEQ ID NO: 2 e nas quais a fracção de receptor de TACI se liga a pelo menos um entre ZTNF2 ou ZTNF4. Tais fragmentos compreendem uma região de pseudo-repetição rica em cisteína e, opcionalmente, podem incluir pelo menos um entre um 34 segmento N-terminal, que reside numa posição amino-terminal da região de pseudo-repetição rica em cisteina, e um segmento do talo, que reside numa posição carboxi-terminal com respeito à região de pseudo-repetição rica em cisteina. As regiões de pseudo-repetição ricas em cisteina incluem polipéptidos que: (a) compreendem, pelo menos, um entre os resíduos de aminoácidos 34 a 66 da SEQ ID NO: 2 e os resíduos de aminoácidos 71a 104 da SEQ ID NO: 2; (b) compreendem tanto os resíduos de aminoácidos 34 a 66 da SEQ ID NO: 2 como os resíduos de aminoácidos 71a 104 da SEQ ID NO: 2; ou (c) compreendem os resíduos de aminoácidos 34 a 104 da SEQ ID NO: 2.
Os segmentos N-terminais incluem os seguintes com referência à SEQ ID NO: 2: o resíduo de aminoácido 33; os resíduos de aminoácidos 32 a 33; os resíduos de aminoácidos 31 a 33; e os resíduos de aminoácidos 30 a 33. Os segmentos do talo adequados incluem um ou mais aminoácidos dos resíduos de aminoácidos 105 a 154 da SEQ ID NO: 2. Por exemplo, o segmento do talo pode consistir nos seguintes com referência à os resíduos de aminoácidos 105 108, os resíduos aminoácidos 105 111, os resíduos aminoácidos 105 114, os resíduos aminoácidos 105 117, os resíduos aminoácidos 105 120, os resíduos aminoácidos 105 123, os resíduos aminoácidos 105 126, os resíduos SEQ ID NO: 2: o res: aminoácidos 105 a a 107, os resíduos de aminoácidos 105 a 110, os resíduos de aminoácidos 105 a 113, os resíduos de aminoácidos 105 a 116, os resíduos de aminoácidos 105 a 119, os resíduos de aminoácidos 105 a 122, os resíduos de aminoácidos 105 a 125, os resíduos de aminoácidos 105 duo de aminoácido 105, 106, os resíduos de de aminoácidos 105 a a 109, os resíduos de de aminoácidos 105 a a 112, os resíduos de de aminoácidos 105 a a 115, os resíduos de de aminoácidos 105 a a 118, os resíduos de de aminoácidos 105 a a 121, os resíduos de de aminoácidos 105 a a 124, os resíduos de de aminoácidos 105 a a 127, os resíduos de 35 aminoácidos 105 a 128, os resíduos de aminoácidos 105 a 129, os resíduos de aminoácidos 105 a 130, os resíduos de aminoácidos 105 a 131, os resíduos de aminoácidos 105 a 132, os resíduos de aminoácidos 105 a 133, os resíduos de aminoácidos 105 a 134, os resíduos de aminoácidos 105 a 135, os resíduos de aminoácidos 105 a 136, os resíduos de aminoácidos 105 a 137, os resíduos de aminoácidos 105 a 138, os resíduos de aminoácidos 105 a 139, os resíduos de aminoácidos 105 a 140, os resíduos de aminoácidos 105 a 141, os resíduos de aminoácidos 105 a 142, os resíduos de aminoácidos 105 a 143, os resíduos de aminoácidos 105 a 144, os resíduos de aminoácidos 105 a 145, os resíduos de aminoácidos 105 a 146, os resíduos de aminoácidos 105 a 147, os resíduos de aminoácidos 105 a 148, os resíduos de aminoácidos 105 a 149, os resíduos de aminoácidos 105 a 150, os resíduos de aminoácidos 105 a 151, os resíduos de aminoácidos 105 a 152, os resíduos de aminoácidos 105 a 153 e os resíduos de aminoácidos 105 a 154.
Outros segmentos do talo adequados incluem um ou mais aminoácidos da região do talo do BCMA (isto é, os resíduos de aminoácidos 42 a 54 de SEQ ID NO: 27) . Por exemplo, o segmento do talo pode consistir nos seguintes com referência à SEQ ID NO: 27: o resíduo de aminoácido 42, os resíduos de aminoácidos 42 a 43, os resíduos de aminoácidos 42 a 44, os resíduos de aminoácidos 42 a 45, os resíduos de aminoácidos 42 a 46, os resíduos de aminoácidos 42 a 47, os resíduos de aminoácidos 42 a 48, os resíduos de aminoácidos 42 a 49, os resíduos de aminoácidos 42 a 50, os resíduos de aminoácidos 42 a 51, os resíduos de aminoácidos 42 a 52, os resíduos de aminoácidos 42 a 53 e os resíduos de aminoácidos 42 a 54.
De maneira mais geral, o segmento do talo pode consistir em dois a 50 resíduos de aminoácido. A fracção de imunoglobulina de uma proteína de fusão descrita no presente documento compreende, pelo menos, uma 36 região constante de uma imunoglobulina. Preferivelmente, a fracção de imunoglobulina representa um segmento de uma imunoglobulina humana. A sequência da imunoglobulina humana pode ser uma sequência de aminoácidos de tipo selvagem ou uma sequência de aminoácidos de tipo selvagem modificada que tenha, pelo menos, uma das mutações de aminoácidos tratadas anteriormente. A sequência de aminoácidos da imunoglobulina humana também pode variar do tipo selvagem tendo uma ou mais mutações caracteristicas de um determinante alotípico conhecido. 0 quadro 2 mostra os determinantes alotípicos da região constante da IgGyl humana (Putman, "The Plasma Proteins", Vol. V, páginas 49 a 140 (Academic Press, Inc. 1987) ) . As posições do índice EU 214, 356, 358 e 431 definem os alotipos de IgGyl conhecidos. A posição 214 está no domínio CHi da região constante da IgGyl e, portanto, não reside na sequência de Fc. A sequência de Fc de tipo selvagem da SEQ ID NO: 6 inclui os alotipos Glm(l) e Glm(2-) . No entanto, pode ser modificada a fracção de Fc de uma proteína de TACI-Fc para que reflicta qualquer combinação destes alotipos. QUADRO 2
Determinantes alotípicos da região constante da imunoglobulina γΐ humana Alotipo Resíduo de aminoácido Posição dos aminoácidos índice EU SEQ ID NO: 6 Glm(l) Asp, Leu 356, 358 160, 162 Glm(l-) Glu, Met 356, 358 150, 162 Glm(2) Gly 431 235 Glm(2-) Ala 431 235 Glm(3) Arg 214 — Glm(3-) Lys 214 — 37
Os exemplos de proteínas de TACI-Fc revelados no presente documento compreendem regiões constantes da IgGl humana. No entanto, as fracções de imunoglobulina adequadas também incluem polipéptidos que compreendem, pelo menos, uma região constante, tal como uma região constante de uma cadeia pesada de qualquer das seguintes imunoglobulinas: IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE e IgM. Vantajosamente, as fracções de imunoglobulina derivadas da IgG2 de tipo selvagem ou da IgG4 de tipo selvagem oferecem uma função efectora reduzida em comparação com a IgGl de tipo selvagem ou a IgG3 de tipo selvagem. A presente memória descritiva descreve as proteínas de fusão que compreendem uma fracção de receptor de TACI, de acordo com o descrito anteriormente, e albumina ou β2 -macroglobulina.
Outro tipo de proteína de fusão de receptor que se liga a ZTNF2 ou ZTNF24 é uma proteína de fusão de BCMA-imunoglobulina. Foram realizados estudos com uma proteína de fusão de BCMA-Fc4 na qual a fracção de BCMA consiste nos resíduos de aminoácidos 1 a 48 da SEQ ID NO: 27. De maneira surpreendente, os estudos farmacocinéticos realizados em ratinhos revelaram que a proteína de fusão de BCMA-Fc4 tinha uma semivida de aproximadamente 101 horas, enquanto que uma proteína de TACI-Fc tinha uma semivida de 25 horas. Assim, pode ser preferível a administração de uma proteína de fusão de BCMA-imunoglobulina em certos ambientes clínicos. Além disso, a combinação das proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina e de BCMA-imunoglobulina pode ser vantajosa para tratar certas afecções. Esta terapêutica de combinação pode ser realizada por meio da administração das proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina e de BCMA-imunoglobulina, ou por meio da administração de heterodímeros das proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina e BCMA-imunoglobulina.
Outro tipo de proteína de fusão de receptor que se liga a ZTNF4 é uma proteína de fusão de imunoglobulina que 38 compreende um domínio extracelular de um receptor denominado "Ztnfrl2". As sequências de nucleótidos e de aminoácidos de Ztnfrl2 proporcionam-se como a SEQ ID NO: 59 e a SEQ ID NO: 60, respectivamente. Os fracções de receptor Ztnfrl2 incluem os polipéptidos que compreendem os resíduos de aminoácidos 1 a 69 da SEQ ID NO: 60 ou os resíduos de aminoácidos 19 a 35 da SEQ ID NO: 60.
As proteínas de fusão da presente invenção podem ter a forma de polipéptidos de cadeia simples, dímeros, trímeros ou múltiplos de dímeros ou de trímeros. Os dímeros podem ser homodímeros ou heterodímeros, e os trímeros podem ser homotrímeros ou heterotrímeros. Os exemplos de heterodímeros incluem um polipéptido de TACI-imunoglobulina com um polipéptido de BCMA-imunoglobulina, um polipéptido de TACI-imunoglobulina com um polipéptido de Ztnfrl2-imunoglobulina e um polipéptido de BCMA-imunoglobulina com um polipéptido de Ztnfrl2-imunoglobulina. Os exemplos de heterodímeros incluem um polipéptido de TACI-imunoglobulina com dois polipéptidos de BCMA-imunoglobulina, um polipéptido de TACI-imunoglobulina com dois polipéptidos de Ztnfrl2-imunoglobulina, um polipéptido de BCMA-imunoglobulina com dois polipéptidos de Ztnfrl2-imunoglobulina, dois polipéptidos TACI- imunoglobulina com um polipéptido de BCMA-imunoglobulina, dois polipéptidos de TACI-imunoglobulina com um polipéptido de Ztnfrl2-imunoglobulina, dois polipéptidos de BCMA-imunoglobulina com um polipéptido de Ztnfrl2- imunoglobulina e um trímero de um polipéptido de TACI-imunoglobulina, um polipéptido de BCMA-imunoglobulina e um polipéptido de Ztnfrl2-imunoglobulina.
Em tais proteínas de fusão, a fracção de receptor de TACI pode consistir na seguinte sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2: os resíduos de aminoácidos 30 a 154. A fracção de receptor BCMA pode compreender, pelo menos, uma entre as seguintes sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 27: os resíduos de aminoácidos 1 a 48, os resíduos de aminoácidos 8 a 41 e os resíduos de aminoácidos 21 a 37. A fracção de receptor Ztnfrl2 pode compreender, pelo menos, uma entre as seguintes sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 60: os resíduos de aminoácidos 1 a 69 e os resíduos de aminoácidos 19 a 35.
Podem ser produzidas proteínas de fusão usando os métodos de PCR usados para construir as moléculas de TACI-Fc ilustrativas que se descrevem nos exemplos. No entanto, os peritos na especialidade podem usar outras abordagens padrão. Por exemplo, podem ser obtidas moléculas de ácido nucleico que codificam os polipéptidos TACI, BCMA, Ztnfrl2 ou imunoglobulina por meio do rastreio de bibliotecas de ADNc humano ou genómicas usando sondas de polinucleótido baseadas nas sequências reveladas no presente documento. Estas técnicas são padrão e estão bem estabelecidas (veja-se, por exemplo, Ausubel et al. (eds.), "Short Protocols in Molecular Biology", III Edição, páginas 4-1 a 4-6 (John Wiley & Sons 1995) ("Ausubel (1995)"); Wu et al, "Methods in Gene Biotechnology", páginas 33-41 (CRC Press, Inc. 1997) ("Wu (1997)"); Ausubel (1995) nas páginas 5-1 a 5-6; Wu (1997) nas páginas 307-327)).
Alternativamente, podem ser obtidas moléculas para construir proteínas de fusão de imunoglobulina por meio da síntese de moléculas de ácido nucleico por meio da utilização de oligonucleótidos longos que se iniciam mutuamente e as sequências de nucleótidos descritas no presente documento (veja-se, por exemplo, Ausubel (1995) nas páginas 8-8 a 8-9). As técnicas estabelecidas que usam a reacção em cadeia da polimerase proporcionam a capacidade de sintetizar moléculas de ADN de um comprimento de, pelo menos, duas quilobases (Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993), Bambot et al., "PCR Methods and Applications" 2:266 (1993), Dillon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of 40
Synthetic Genes" em "Methods in Molecular Biology", Vol. 15: "PCR Protocols: Current Methods and Applications", White (ed.), páginas 263-268, (Humana Press, Inc. 1993) e Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299 (1995)).
As moléculas de ácido nucleico da presente invenção também podem ser sintetizadas com "máquinas de genes" usando protocolos tais como o método da fosforamidita. Se for requerido ADN de cadeia dupla sintetizado quimicamente para uma aplicação tal como a síntese de um gene ou de um fragmento de gene, então se forma cada cadeia complementar em separado. A produção de genes curtos (60 a 80 pares de bases) é simples tecnicamente e pode ser realizada por meio da síntese das cadeias complementares e em seguida emparelhando-as. Para a produção dos genes mais longos (>300 pares de bases), no entanto, podem ser necessárias estratégias especiais, porque a eficácia do acoplamento de cada ciclo durante a síntese de ADN químico é quase de 100 %. Para solucionar este problema, os genes sintéticos (de cadeia dupla) são montados de forma modular a partir de fragmentos de cadeia simples que são de 20 a 100 nucleótidos de comprimento. Para mais informação sobre a síntese de polinucleótidos, veja-se, por exemplo, Glick e Pasternak, "Molecular Biotechnology, Principies and Applications of Recombinant DNA" (ASM Press 1994), Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984) e Climie et al., Proc. Nat'lAcad. Sei. USA 87:633 (1990). 4. Produção de polipéptidos de TACI-imunoglobullna
Os polipéptidos da presente invenção podem ser produzidos em células hospedeiras recombinantes seguindo técnicas convencionais. Para expressar uma sequência que codifica TACI-imunoglobulina, deve-se ligar operativamente uma molécula de ácido nucleico que codifique o polipéptido com sequências reguladoras que controlem a expressão da transcrição num vector de expressão e, em seguida, introduzi-la numa célula hospedeira. Além das sequências 41 reguladoras da transcrição, tais como promotores e potenciadores, os vectores de expressão podem incluir sequências reguladoras da tradução e um gene marcador que seja adequado para a selecção de células que possuem o vector de expressão.
Os vectores de expressão que são adequados para a produção de uma proteína estranha em células eucariotas contêm comummente (1) elementos de ADN procariota que codificam uma origem de replicação bacteriana e um marcador da resistência a um antibiótico para proporcionar o crescimento e a selecção do vector de expressão num hospedeiro bacteriano; (2) elementos de ADN eucariota que controlam o início da transcrição, tais como um promotor; e (3) elementos de ADN que controlam o processamento dos transcritos, tais como uma sequência de terminação da transcrição/poliadenilação.
Os vectores de expressão também podem incluir sequências de nucleótidos que codificam uma sequência secretora que dirija ao polipéptido heterólogo na via secretora de uma célula hospedeira. Por exemplo, um vector de expressão pode compreender uma sequência de nucleótidos que codifica TACI-imunoglobulina e uma sequência secretora derivada de qualquer gene secretado. De acordo com o discutido anteriormente, uma sequência sinal adequada é uma sequência sinal tPA. A SEQ ID NO: 25 proporciona um exemplo de sequência sinal tPA. Outra sequência sinal adequada é uma sequência sinal da VH de 26-10 murino. O anticorpo 26-10 murino é descrito, por exemplo, por Near et ai., Mol. Immunol. 27:901 (1990). As sequências de aminoácidos e de nucleótidos ilustrativas da sequência sinal da VH de 26-10 murino são proporcionadas pela SEQ ID NO: 61 e a SEQ ID NO: 65, respectivamente. A SEQ ID NO: 62 revela a sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão de TACI-Fc5 que compreende uma sequência sinal da VH de 26-10 murino. 42
As proteínas de TACI-imunoglobulina da presente invenção podem estar expressas em células de mamífero. Os exemplos de células hospedeiras de mamífero adequadas incluem células de rim de mono verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), células de rim embrionário humano (293-HEK; ATCC CRL 1573), células de rim de hámster neonato (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), células de rim canino (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovário de hamster chinês (CHO-K1; ATCC CCL 61; CHO DG44 (Chasin et al, Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), células pituitárias de rato (GH1; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL 2,2), células de hepatoma de rato (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), células de rim de mono transformadas com o SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650) e células embrionárias murinas (NIH-3T3; ATCC CRL 1658).
Para um hospedeiro mamífero, os sinais reguladores da transcrição e da tradução podem ter uma origem virai, tal como de adenovírus, vírus do papiloma bovino, vírus de símio ou similares, em que os sinais reguladores estão associados a um determinado gene que tem um nível de expressão elevado. As sequências reguladoras da transcrição e da tradução também podem ser obtidas de genes de mamífero, tais como genes de actina, de colagénio, de miosina e de metalotioneína.
As sequências reguladoras da transcrição incluem uma região promotora suficiente para dirigir o início da síntese de ARN. Os promotores eucariotas adequados incluem o promotor do gene da metaloteoneína I de ratinho (Harner et al., J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982)), o promotor TK do vírus Herpes (McKnight, Cell 31:355 (1982)), o promotor precoce do SV40 (Benoist et al., Nature 290:304 (1981)), o promotor do vírus do sarcoma de Rous (Gorman et al., Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 79:6777 (1982)), o promotor do citomegalovírus (Foecking et al., Gene 45:101 (1980)) e o promotor do vírus do tumor de mama de ratinho (veja-se, em geral, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in 43
Mammalian Cell Culture", em "Protein Engineering: Principies and Practice", Cleland et al. (eds.), páginas 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)). 0 promotor do virus do sarcoma mieloproliferativo e o potenciador do citomegalovirus humano proporcionam uma combinação útil de um promotor e um potenciador.
Alternativamente, pode ser usado um promotor procariota, tal como o promotor da ARN polimerase do bacteriófago T3, para controlar a produção de proteínas de TACI-imunoglobulina em células de mamífero se o promotor procariota estiver regulado por um promotor eucariota (Zhou et ai., Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990) e Kaufman et al., Nucl. Acids. Res. 19:4485 (1991)).
Pode ser introduzido um vector de expressão em células hospedeiras usando uma variedade de técnicas padrão que incluem a transfecção por meio de fosfato de cálcio, a transfecção mediada por lipossomas, a administração mediada por microprojécteis, a electroporação e similares. As células transfectadas podem ser seleccionadas e propagadas para proporcionar células hospedeiras recombinantes que compreendam o vector de expressão integrado estavelmente no genoma das células hospedeiras. As técnicas para introduzir vectores em células eucariotas e as técnicas para seleccionar tais transformantes estáveis usando um marcador seleccionável dominante estão descritas, por exemplo, por Ausubel (1995) e por Murray (ed.), "Gene Transfer and Expression Protocols" (Humana Press 1991).
Por exemplo, um marcador seleccionável adequado é um gene que proporciona resistência ao antibiótico neomicina. Neste caso, a selecção é levada a cabo na presença de um fármaco do tipo da neomicina, tal como G-418 ou um similar. Também podem ser usados sistemas de selecção para aumentar o nível de expressão do gene de interesse, método que se denomina "amplificação". A amplificação é levada a cabo por meio da cultura de transfectantes na presença de um nível 44 baixo do agente selectivo e, em seguida, por meio do aumento da guantidade do agente selectivo para seleccionar células gue produzam niveis elevados dos produtos dos genes introduzidos. Um marcador seleccionável amplificável adeguado é a dihidrofolato-redutase, gue confere resistência ao metotrexato. Também podem ser usados outros genes de resistência a outros fármacos (por exemplo, de resistência à higromicina, de resistência a múltiplas fármacos, da puromicina-acetiltransferase). Alternativamente, podem ser usados marcadores gue introduzam um fenótipo modificado, tal como proteína verde fluorescente, ou proteínas da superfície celular, tais como CD4, CD8, MHC de classe I, fosfatase alcalina de placenta, para diferençar as células transfectadas das células não transfectadas por meio de métodos como a classificação FACS ou a tecnologia de separação por meio de pérolas magnéticas.
Também podem ser produzidas polipéptidos de TACI-imunoglobulina por meio de células de mamífero cultivadas usando um sistema de administração virai. Os exemplos de vírus úteis a tal efeito incluem adenovírus, vírus do herpes, vírus Vaccinia e vírus adenoassociados (AAV). 0 adenovírus, um vírus de ADN de cadeia dupla, é actualmente o vector de transferência génica melhor estudado para a administração de ácido nucleico heterólogo (para mais informação, veja-se Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994) e Douglas e Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)). As vantagens do sistema de adenovírus incluem a acomodação de insertos de ADN relativamente longos, a capacidade para crescer até títulos elevados, a capacidade para infectar uma grande selecção de tipos de células de mamífero e a flexibilidade gue permite a utilização com um grande número de vectores disponíveis gue contêm diferentes promotores.
Por meio da deleção de porções do genoma do adenovírus, podem ser acomodados insertos mais longos (de 45 até 7 kb) do ADN heterólogo. Estes insertos podem ser incorporados no ADN virai por meio da ligação directa ou por meio da recombinação homóloga com um plasmideo co-transfectado. Uma opção é a de eliminar o gene EI essencial do vector virai, o gue tem como resultado a incapacidade para replicar-se a não ser que o gene EI seja proporcionado pela célula hospedeira. Podem ser cultivadas, por exemplo, células 293 humanas infectas com um vector de adenovirus (N° ATCC CRL- 1573, 45504, 45505) como células aderentes ou em cultura em suspensão a uma densidade de células relativamente elevada para produzir quantidades significativas de proteína (veja-se Garnier et al., Cytotechnol. 15:145 (1994)).
Os peritos na especialidade podem criar vectores de expressão adequados para produzir as proteínas de fusão descritas no presente documento com células de mamífero. O exemplo 4 descreve características de um vector de expressão. Como outro exemplo, um vector de expressão pode compreender uma cassete de expressão bicistrónica que inclui uma porção do potenciador do citomegalovírus humano, o promotor do vírus do sarcoma mieloproliferativo, uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteina de fusão, os locais de entrada ribossómicos internos do poliovírus, uma sequência de nucleótidos que codifica a dihidrofolato-redutase murina, seguida pela sequência de adição de poli(A) do SV40. A sequência de nucleótidos de SEQ ID NO: 69 mostra um construção de potenciador de citomegalovírus/promotor da LTR do vírus do sarcoma mieloproliferativo, em que o potenciador do citomegalovírus estende-se do nucleótido 1 a 407. O promotor da LTR do vírus do sarcoma mieloproliferativo, com a região de controlo negativo ausente, estende-se do nucleótido 408 ao nucleótido 884 da SEQ ID NO: 69. A SEQ ID NOs: 70 proporciona uma sequência de nucleótidos para o promotor da 46 LTR do vírus do sarcoma mieloproliferativo sem a região de controlo negativo. 0 exemplo 1 descreve um vector de expressão gue compreende um promotor do citomegalovírus para dirigir a expressão do transgene de proteína recombinante, um intrão de uma imunoglobulina e uma sequência sinal do activador tissular do plasminogénio. Um intrão de imunoglobulina adequado é um intrão da VH de 26-10 murino. A SEQ ID NO: 66 proporciona uma sequência de nucleótidos ilustrativa de um intrão da VH de 26-10 murino. Um vector de expressão também pode incluir uma região não traduzida 5' (UTR) localizada a montante da sequência de nucleótidos que codifica uma proteína de TACI-imunoglobulina. Uma 5'-UTR adequada pode derivar do gene da VH de 26-10 murino. A SEQ ID NO: 63 revela a sequência de nucleótidos de uma 5' -UTR da VH de 26-10 murino nativa útil, enquanto que a SEQ ID NO: 64 mostra a sequência de nucleótidos de uma 5'-UTR da VH de 26-10 murino, que foi optimizada na extremidade 3'.
Por meio de ilustração, a SEQ ID NO: 67 proporciona uma sequência de nucleótidos que inclui os seguintes elementos: uma 5'-UTR da VH de 26-10 murino nativa (nucleótidos 1 a 51), uma sequência sinal da VH de 26-10 murino (nucleótidos 52 a 97 e 182 a 192), um intrão da VH de 26-10 murino (nucleótidos 98 a 181), uma sequência de nucleótidos que codifica uma fracção de TACI (nucleótidos 193 a 435) e uma sequência de nucleótidos que codifica uma fracção de Fc5 (nucleótidos 436 a 1.131) . A sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 68 difere da SEQ ID NO: 67 devido à substituição de uma 5'-UTR da VH de 26-10 murino optimizada (nucleótidos 1 a 51) pela sequência nativa.
As proteínas de TACI-imunoglobulina também podem ser expressas em outras células eucariotas superiores, tais como células de ave, de fungo, de insecto, de levedura ou vegetais. O sistema de baculovirus proporciona um meio eficaz para introduzir genes clonados em células de 47 insectos. Os vectores de expressão adequados baseiam-se no vírus da polihedrose nuclear múltipla de Autographa californica (AcMNPV) e contêm promotores conhecidos, tais como o promotor 70 da proteína do choque térmico (hsp) de Drosophila, o promotor do gene imediato-precoce do vírus da polihedrose nuclear de Autographa californica (ie-1) e o promotor precoce retardado de 39k, o promotor do baculovírus plO e o promotor da metalotioneína de Drosophila. Um segundo método para fabricar baculovírus recombinantes utiliza um sistema baseado em transposões descrito por Luckow (Luckow, et al., J. Virol. 67:4566 (1993) ). Este sistema, que utiliza vectores de transferência, é vendido no kit BAC-a-BAC (Life Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza um vector de transferência, PFASTBAC (Life Technologies), que contém um transposão Tn7 para mover o ADN que codifica o polipéptido de TACI-imunoglobulina ao genoma do baculovírus mantido em E. coli como um grande plasmídeo denominado "bacmídeo". Veja-se Hill-Perkins e Possee, J. Gene. Virol. 71:971 (1990), Bonning, et al., J. Gene. Virol. 75:1551 (1994) , e Chazenbalk e Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995) . Além disso, os vectores de transferência podem incluir uma fusão em quadro com ADN que codifica uma etiqueta epitópica no terminal C ou N do polipéptido de TACI-imunoglobulina, por exemplo, uma etiqueta epitópica Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Nat'1 Acad. Sei. 82:7952 (1985). Usando uma técnica conhecida na técnica, transforma-se um vector de transferência que contém uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteína de TACI-imunoglobulina em E. coli e rastrea-se em busca de baemídeos que contenham um gene lacZ interrompido indicador do baculovírus recombinante. O ADN de baemídeo que contém o genoma de baculovírus recombinante é então isolado usando técnicas comuns. 48 0 vector PFASTBAC ilustrativo pode ser modificado até um grau considerável. Por exemplo, pode ser retirado o promotor da polihedrina e substituído pelo promotor da proteína básica do baculovírus (também conhecido como promotor Pcor, p6.9 ou MP) que é expresso antes na infecção do baculovírus e observado que é vantajoso para expressar proteínas secretadas (veja-se, por exemplo, Hill-Perkins e Possee, J. Gene. Virol. 71:971 (1990), Bonning, et al, J. Gene. Virol. 75:1551 (1994) e Chazenbalk e Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995)). Em tais construções de vectores de transferência, pode ser usada uma versão curta ou longa do promotor da proteína básica. Além disso, podem ser construídos vectores de transferência com as sequências sinal secretoras derivadas de proteínas de insectos. Por exemplo, pode ser usada em tais construções uma sequência sinal secretora da Ecdisteróide Glucosiltransferase (EGT), a Melitina de mel de abelhas (Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA) ou o baculovírus gp67 (PharMingen: San Diego, CA) . O vírus recombinante ou bacmídeo é usado para transfectar células hospedeiras. As células hospedeiras de insectos adequadas incluem linhas celulares derivadas de IPLB-Sf-21, uma linha celular de ovário de pupas de Spodoptera frugiperda, tal como SJ9 (ATCC CRL 1711), Sf21AE e Sf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA), BEM COMO células Schneider- 2 de Drosophila e a linha celular HIGH FIVEO (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (Patente US N° 5.300.435) . Podem ser usados meios livres de soro comercialmente disponíveis para desenvolver e manter as células. Os meios adequados são II™ de Sf900 (Life Technologies) ou 921™ de ESF (Expression Systems) para as células Sf9; e Ex-cell0405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) ou Express FiveO™ (Life Technologies) para as células de T. ni. Quando é usado vírus recombinante, as células desenvolvem-se comummente a partir de uma densidade de 49 inoculação de aproximadamente 2-5 x 105 células até uma densidade de 1-2 x 106 células, momento no qual se adiciona uma reserva virai recombinante a uma multiplicidade de infecção (Mdl) de 0,1 a 10, mais comummente a quase 3.
As técnicas estabelecidas para produzir proteínas recombinantes em sistemas de baculovírus são proporcionadas por Bailey et al., "Manipulation of Baculovírus Vectors" em Methods in Molecular Biology, Volume 7: "Gene Transfer and Expression Protocols", Murray (ed.), páginas 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991), por Patel et al., "The baculovírus expression system" em dNa Cloning 2: Expression Systems, II edição, Glover et al. (eds.), páginas 205244 (Oxford University Press 1995), por Ausubel (1995) nas páginas 16-37 a 16-57, por Richardson (ed.), "Baculovírus Expression Protocols" (The Humana Press, Inc. 1995) e por Lucknow, "Insect Cell Expression Technology" em Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996).
Também podem ser usadas células de fungos, incluindo células de leveduras, para expressar os genes descritos no presente documento. As espécies de leveduras de particular interesse a este respeito incluem Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris e Pichia methanolica. Os promotores adequados para a expressão em leveduras incluem promotores de GALl (galactose), PGK (fosfoglicerato cinase), ADH (álcool deshidrogenase), AOX1 (álcool oxidase), HIS4 (histidinol deshidrogenase) e similares. Foram desenhados muitos vectores de clonagem de levedura e podem ser obtidos facilmente. É possível desenhar um vector para gerar construções que utilizem os elementos necessários para levar a cabo uma recombinação homóloga em levedura (veja-se, por exemplo, Raymond et al., BioTechniques 26:134 (1999)). Por exemplo, tal vector de expressão pode incluir sequências de URA3 e CEN-ARS (sequência de replicação autónoma) necessárias para a selecção e a replicação em S. 50 cerevisiae. Outros vectores adequados incluem vectores baseados em YIp, tais como YIp5, vectores baseados em YRp, tais como YRpl7, vectores baseados em YEp, tais como YEpl3 e vectores baseados em YCp, tais como YCpl9. Os métodos para transformar células de S. cerevisiae com ADN exógeno e produzir polipéptidos recombinantes a partir destas células são revelados por, por exemplo, Kawasaki, Patente US N° 4.599.311, Kawasaki et al., Patente US N° 4.931.373, Brake, Patente US N° 4.870.008, Welch et al., Patente US N° 5.037.743 e Murray et al., Patente US N° 4.845.075. As células transformadas são seleccionadas pelo fenótipo determinado pelo marcador seleccionável, comummente, a resistência a um fármaco ou a capacidade para desenvolver-se na ausência de um determinado nutriente (por exemplo, leucina) . Um sistema vectorial adequado para utilização em Saccharomyces cerevisiae é o sistema vectorial POT1 revelado por Kawasaki et al. (Patente US N° 4.931.373), que permite a selecção de células transformadas por meio do seu crescimento em meios que contêm glicose. Outros promotores e terminadores adequados para utilização em levedura incluem aqueles de genes de enzimas glicolíticas (veja-se, por exemplo, Kawasaki, Patente US N° 4.599.311, Kingsman et al., Patente US N° 4.615.974 e Bitter, Patente US N° 4.977.092 e genes da álcool deshidrogenase. Vejam-se também as patentes US N° 4.990.446, 5.063.154, 5.139.936 e 4.661.454.
Na técnica são conhecidos sistemas de transformação para outras leveduras, que incluem Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii e Candida maltosa. Veja-se, por exemplo, Gleeson et al., J. Gene. Microbiol. 132:3459 (1986) e Cregg, Patente US N° 4.882.279. Podem ser utilizadas células de Aspergillus de acordo com os métodos de McKnight et al., Patente US N° 4.935.349. Os métodos 51 para transformar Acremonium chrysogenum são revelados por Sumino et al, Patente US N° 5.162.228. Lambowitz, Patente US N° 4.486.533, revela métodos para transformar Neurospora.
Por exemplo, a utilização de Pichia methanolica como hospedeiro para a produção de proteínas recombinantes é revelado por Raymond, patente US 5.716.808, Raymond, Patente US N° 5.736.383, Raymond et al., Yeast 14:11-23 (1998) e nas publicações internacionais N° WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 e WO 98/02565. As moléculas de ADN para utilização na transformação de P. methanolica serão preparadas comummente como plasmídeos circulares de cadeia dupla, que serão preferivelmente linearizados antes da sua transformação. Para a produção de polipéptidos em P. methanolica, o promotor e o terminador do plasmídeo podem ser os do gene de P. methanolica, tais como o gene de utilização do álcool de P. methanolica (AUG1 ou AUG2). Outros promotores úteis incluem aqueles dos genes da dihidroxiacetona sintase (DHAS), da formiato deshidrogenase (FMD) e da catalase (CAT) . Para facilitar a integração do ADN no cromossoma do hospedeiro, é preferível ter o segmento de expressão inteiro do plasmídeo flanqueado por ambas extremidades pelas sequências de ADN do hospedeiro. Um marcador seleccionável adequado para utilização em Pichia methanolica é um gene ADE2 de P. methanolica, que codifica a fosforibosil-5-aminoimidazol carboxilase (AIRC; EC 4.1.1.21) e que permite o crescimento das células hospedeiras de ade2 na ausência de adenina. Para os métodos industriais a grande escala em que é desejável minimizar a utilização do metanol, podem ser usadas células hospedeiras nas quais tenham sido deletados ambos genes de utilização do metanol (AUG1 e AUG2). Para a produção de proteínas secretadas, as células hospedeiras podem ser deficientes em genes de protease vacuolar (PEP4 e PRB1). A electroporação é usada para facilitar a introdução de um plasmídeo que 52 contém ADN que codifica um polipéptido de interesse em células de P. methanolica. As células de P. methanolica podem ser transformadas por meio de electroporação usando um campo eléctrico pulsado decrescente exponencialmente que tenha uma força de 2,5 a 4,5 kV/cm, preferivelmente de aproximadamente 3,75 kV/cm e uma constante de tempo (t) de 1 a 40 milissegundos, o mais preferível, de aproximadamente 20 milissegundos.
Também podem ser introduzidos vectores de expressão em protoplastos vegetais, tecidos vegetais intactos ou células vegetais isoladas. Os métodos para introduzir vectores de expressão em tecido vegetal incluem a infecção directa ou a co-cultura do tecido vegetal com Agrobacterium tumefaciens, a administração mediada com microprojécteis, a injecção de ADN, a electroporação e similares. Veja-se, por exemplo, Horsch et al., Science 227:1229 (1985), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992) e Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1993).
Alternativamente, as proteínas de TACI-imunoglobulina podem ser produzidas em células hospedeiras procariotas. Os promotores adequados que podem ser usados para produzir polipéptidos de TACI-imunoglobulina num hospedeiro procariota são conhecidos pelos peritos na especialidade e incluem promotores capazes de reconhecer as polimerases de T 4, T3, Sp6 e T7, os promotores PR e PL do bacteriófago Lambda, os promotores trp, recA, de choque térmico, lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA e lacZ de E. coli, os promotores de B. subtilis, os promotores dos bacteriófagos de Bacillus, os promotores de Streptomyces, o promotor int do bacteriófago Lambda, o promotor bla de pBR322 e o promotor CAT do gene da cloranfenicol acetil transferase. Os promotores procariotas têm sido revisados por Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson et al., "Molecular 53
Biology of the Gene", IV Ed. (Benjamin Cummins 1987) e por Ausubel etal. (1995).
Os hospedeiros procariotas adequados incluem E. coli e Bacillus subtilus. As estirpes de E. coli adequadas incluem BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21 (DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 e ER1647 (veja-se, por exemplo, Brown (ed.), "Molecular Bioloqy Labfax" (Academic Press 1991)). As estirpes adequadas de Bacillus subtilus incluem BR151, YB886, MI119, MI120 e B170 (veja-se, por exemplo, Hardy, "Bacillus Cloninq Methods" em DNA Cloninq: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)).
Quando é expressa uma proteína de TACI-imunoglobulina em bactérias tais como E. coli, o polipéptido pode ser retido no citoplasma, comummente, como qrânulos insolúveis, ou pode ser diriqido ao espaço periplasmático por uma sequência de secreção bacteriana. No primeiro caso, as células são lisadas e os qrânulos são recobertos e desnaturalizados usando, por exemplo, isotiocianato de quanidina ou ureia. Então pode ser redobrado o polipéptido desnaturalizado e dimerizado por meio da diluição do desnaturalizante, tal como por meio de diálise contra uma solução de ureia e uma combinação de qlutationa reduzida e oxidada, seguida pela diálise contra uma solução salina tamponada. No último caso, é possível recuperar o polipéptido do espaço periplasmático em forma solúvel e funcional exercendo um efeito sobre as células (por meio de, por exemplo, um tratamento de ultra-som ou um choque osmótico) para libertar os conteúdos do espaço periplasmático e recuperar a proteína, evitando assim a necessidade da desnaturalização e a redobragem.
Os métodos para expressar proteínas em hospedeiros procariotas são conhecidos pelos peritos na especialidade (veja-se, por exemplo, Williams et al., "Expression of 54 foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies" em DNA Cloning 2: Expression Systems, II edição, Glover et al. (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995), Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" em Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995) e Georgiou, "Expression of Proteins in Bactéria" em Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.)/· página 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)) .
Ausubel (1995) proporciona métodos padrão para introduzir vectores de expressão em células bacterianas, de levedura, de insecto e vegetais.
Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture" em Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996) proporcionam métodos gerais para expressar e recuperar proteína estranha produzida por um sistema celular de mamífero. Por exemplo, Grisshammer et al., "Purification of over-produced proteins from E. coli cells" em DNA Cloning 2: Expression Systems, II edição, Glover et al. (eds.), páginas 59-92 (Oxford University Press 1995) proporcionam técnicas padrão para recuperar a proteína produzida por um sistema bacteriano. Richardson (ed.), "Baculovírus Expression Protocols" (The Humana Press, Inc. 1995) descreve métodos estabelecidos para isolar proteínas recombinantes de um sistema de baculovírus.
Como alternativa, os polipéptidos da presente invenção podem ser sintetizados por meio da síntese exclusiva em fase sólida, os métodos parciais em fase sólida, a condensação de fragmentos ou a síntese clássica de soluções. Estes métodos de síntese são conhecidos pelos peritos na especialidade (veja-se, por exemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (II edição), (Pierce Chemical Co. 55 1984), Bayer e Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986), Atherton et al., "Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach" (IRL Press 1989), Fields e Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis" Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997) e Lloyd-Williams et al, "Chemical Approaches to the Synthese of Peptides and Proteins" (CRC Press, Inc. 1997)). As variações nas estratégias de síntese química total, tais como "a ligação química nativa" e a "ligação de proteínas expressas" também são padrão (veja-se, por exemplo, Dawson et al., Science 266:776 (1994), Hackeng et al, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 94:7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir et al, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 95:6705 (1998) e Severinov e Muir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998)). 5. Análise para proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina É possível examinar a função das proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina usando uma variedade de abordagens para medir a capacidade das proteínas de fusão para ligar-se com ZTNF4 ou com ZTNF2. Por meio de ilustração, o exemplo 4 proporciona métodos para medir a afinidade e a capacidade de ligação com ZTNF4.
Alternativamente, as proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina podem ser caracterizadas pela capacidade para inibir a estimulação de células B humanas por ZTNF4 solúvel, de acordo com o descrito por Gross et al., publicação internacional N° W000/40716. De maneira breve, isolam-se células B humanas de células mononucleares de sangue periférica usando pérolas magnéticas de CD19 e o sistema de separação magnética VarioMacs (Miltenyi Biotec Auburn, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Misturam-se as células B purificadas com ZTNF4 solúvel (25 ng/ml) e IL-4 humana recombinante (10 ng/ml, Pharmingen) e colocam-se as células em placas de 96 poços de fundo redondo a 1 x 105 células por poço. 56
As proteínas de TACI-imunoglobulina solúveis podem ser diluídas de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 6 ng/ml, e incubadas com as células B durante cinco dias, emitindo pulsações durante a noite no dia quatro com 1 pCi de 3H-timidina por poço. Como controlo, também pode ser incubada a proteína de TACI-imunoglobulina com células B e IL-4 sem ZTNF4. As placas são colhidas usando um colheitador de placas de Packard e contadas usando um leitor de Packard.
Utilizou-se esta abordagem geral para examinar três proteínas de fusão de TACI-Fc. Embora todas as proteínas de fusão inibissem a proliferação de células B, as construções TACI (dl-29, dlll-154)-Fc5 e TACI (dl-29, dl20- 154)-Fc5 foram mais potentes que TACI (dl-29, dl07-154)-Fc5.
Existem modelos animais bem estabelecidos disponíveis para analisar a eficácia in vivo das proteínas de TACI-imunoglobulina em certos estados patológicos. Por exemplo, podem ser analisadas as proteínas de TACI-imunoglobulina num número de modelos animais de doença auto-imune, tais como estirpes congénitas de ratinhos MRL-lpr/lpr ou NZB x NZW Fl, que servem como modelo do LES (lúpus eritematoso sistémico). Tais modelos animais são conhecidos na técnica (veja-se, por exemplo, Cohen e Miller (Eds.), "Autoimmune Disease Models: A Guidebook" (Academic Press, Inc. 1994). A descendência de um cruzamento entre ratinhos negros de Nova Zelândia (NZB) e ratinhos brancos de Nova Zelândia (NZW) desenvolve uma forma espontânea de LES que se assemelha muito ao LES em seres humanos. A descendência dos ratinhos, conhecida como NZBW, começa a desenvolver auto-anticorpos IgM contra as células T a um mês de idade, e dos cinco aos sete meses de idade, os auto-anticorpos contra o ADN são a imunoglobulina dominante. A hiperactividade das células B policlonais conduz à sobre-produção dos auto-anticorpos. A sedimentação destes auto-anticorpos, particularmente, de aqueles dirigidos contra o ADN de 57 cadeia simples, está associada ao desenvolvimento da glomerulonefrite, que se manifesta clinicamente como proteinúria, azotemia e morte a partir de uma insuficiência renal. A insuficiência de rim é a causa principal de mortalidade nos ratinhos afectados de LES espontâneo e na estirpe NZBW, este método é crónico e obliterante. A doença é mais rápida e grave em fêmeas que em machos, com uma sobrevivência média de somente 245 dias em comparação com os 406 dias para os machos. Enquanto que muitos dos ratinhos fêmea serão sintomáticos (proteinúria) dos sete aos nove meses de idade, alguns podem ser muito mais jovens ou mais velhos quando desenvolvem os sintomas. A nefrite imune mortal observada nos ratinhos NZBW é muito similar à glomerulonefrite observada no LES humano, o que torna este modelo murino espontâneo muito atractivo para analisar os potenciais agentes terapêuticos para o LES (Putterman e Naparstek, "Murine Models of Spontaneous Systemic Lupus Erythematosus" em Autoimmune Disease Models: A Guidebook, páginas 217234 (Academic Press, Inc., 1994); Mohan et al.r J. Immunol. 154:1470 (1995); e Daikh et al., J. Immunol. 159:3104 (1997)) .
De acordo com o descrito por Gross et al, publicação internacional N° W000/40716, podem ser administradas as proteínas de TACI-imunoglobulina a ratinhos NZBW para controlar o seu efeito supressor sobre as células B durante um periodo de cinco semanas quando, como média, se acredita que a produção de auto-anticorpos contra as células B está a níveis elevados nos ratinhos NZBW. De maneira breve, podem ser divididos 100 ratinhos (NZB x NZW)F! fêmea de 8 semanas de idade em seis grupos de 15 ratinhos. Antes do tratamento, analisa-se a proteína em urina dos ratinhos uma vez ao mês e extrai-se sangue para CBC e o banco de soro. O soro pode ser rastreado quanto à presença de auto-anticorpos. Devido a que a proteinúria é o sinal distintivo 58 da glomerulonefrite, são controlados os níveis de proteína em urina com uma haste medidora a intervalos regulares no transcurso do estudo. 0 tratamento pode começar quando os ratinhos são de uma idade de aproximadamente cinco meses. Os ratinhos recebem injecções intraperitoneais de somente de veículo (solução salina tamponada com fosfato) ou de TACI-imunoglobulina humana (proteína de controlo) ou de proteína de TACI-imunoglobulina (por exemplo, de 20 a 100 pg de proteína de teste por dose) três vezes à semana durante cinco semanas. O sangue é colhido duas vezes durante o tratamento e será colhido pelo menos duas vezes depois do tratamento. Determinam-se os valores da haste medidora de urina para a proteinúria e os pesos corporais a cada duas semanas após começar o tratamento. São colhidos sangue, o valor da haste medidora de urina e o peso corporal no momento da eutanásia. Dividem-se o baço e o timo para uma análise de classificação celular activada por fluorescência e histologia. Também são colhidos glândulas salivais submandibulares, cadeia de nódulos linfáticos mesentéricos, lóbulo de fígado com vesícula biliar, intestino ceco e grosso, estômago, intestino delgado, pâncreas, rim direito, glândula suprarrenal, língua com traqueia e esófago, coração e pulmões para a histologia.
Os modelos murinos para a encefalomielite alérgica experimental foram usados como ferramenta para investigar tanto os mecanismos das doenças mediadas pelo sistema imunológico como os métodos de uma possível intervenção terapêutica. O modelo é similar à esclerose múltipla humana e produz uma desmielinização como resultado da activação de células T a neuroproteínas tais como a proteína básica mielina ou a proteína proteolipídica. A inoculação com antigénio conduz à indução de CD4+, células T restringidas ao MHC de classe II (Thl). As mudanças no protocolo para a encefalomielite alérgica experimental podem produzir 59 variantes agudas, recidivas crónicas ou de transferência passiva do modelo (Weinberg et al., J. Iiranunol. 162:1818 (1999); Mijaba et al., Cell. Immunol. 186 : 94 (1999); e Glabinski, Meth. Enzym. 288:182 (1997)).
Gross et ai., publicação internacional N° W000/40716, descrevem uma abordagem para avaliar a eficácia das proteínas de TACI-imunoglobulina na melhoria dos sintomas associados à encefalomielite alérgica experimental. De maneira breve, administra-se uma injecção subcutânea a 25 ratinhos PLxSJL F1 fêmea (12 semanas de idade) de 125 pg/ratinho de antigénio (proteína proteolipídica de mielina, PLP, resíduos 139-151), formulada em adjuvante completo de Freund. Dividem-se os ratinhos em cinco grupos de cinco ratinhos. Administram-se injecções intraperitoneais de toxina pertusse (400 ng) o dia 0 e 2. Administra-se aos grupos uma dose x 1, x 10 e x 100 de proteína de TACI-imunoglobulina, um grupo somente receberá veículo e um grupo não receberá tratamento. A terapêutica de prevenção começa no dia 0, a terapêutica de intervenção começa no dia 7 ou ao aparecer os sinais clínicos. Os sinais da doença, a perda de peso e a paralisia, manifestam-se aproximadamente aos 10 a 14 dias e duram aproximadamente uma semana. Analisam-se diariamente os animais por meio da colheira dos pesos corporais e por meio da atribuição de uma pontuação clínica correspondente ao grau dos seus sintomas. Os sinais clínicos da encefalomielite alérgica experimental aparecem aos 10 a 14 dias da inoculação e duram aproximadamente uma semana. Ao finalizar o estudo, sacrificam-se todos os animais por meio de overdose de gás e faz-se uma necropsia. São colhidos o cérebro e a coluna vertebral para a histologia ou congelados para a análise de ARNm. Representam-se o peso corporal e os dados de pontuação clínica por indivíduo e por grupo. 60
No modelo de artrite induzida por colagénio, os ratinhos desenvolvem artrite inflamatória crónica, que se assemelha muito à artrite reumatóide humana. Como a artrite induzida por colagénio partilha caracteristicas imunológicas e patológicas similares com a artrite reumatóide, isto converte-se num modelo ideal para rastrear os potenciais compostos anti-inflamatórios humanos. Outra vantagem da utilização do modelo de artrite induzida por colagénio é que os mecanismos de patogénese são conhecidos. Foram identificados os epítopos de células T e B no colagénio de tipo II, e foram determinados diversos parâmetros imunológicos (hipersensibilidade de tipo retardado e anticorpo contra o colagénio) e inflamatórios (citocinas, quimiocinas e enzimas degradantes da matriz), e podem ser usados para medir a eficácia dos compostos de teste nos modelos (Wooley, Curr. Open. Rheum. 3:407 (1999); Williams et al., Immunol. 89:9784 (1992); Myers et al, Life Sei. 61:1861 (1997); e Wang et al., Immunol. 92:8955 (1995)).
Gross et al., publicação internacional N° W000/40716, descrevem um método para avaliar a eficácia das proteínas de TACI-imunoglobulina na melhoria dos sintomas associados à artrite induzida por colagénio. De maneira breve, dividem-se ratinhos DBA/1J macho de oito semanas de idade (Jackson Labs) em grupos de cinco ratinhos/grupo e administram-se a esses duas injecções subcutâneas de 50 a 100 μΐ de 1 mg/ml de colagénio (de pintainho ou de origem bovino) a intervalos de três semanas. Um controlo não recebe injecções de colagénio. A primeira injecção está formulada em adjuvante completo de Freund e a segunda injecção está formulada em adjuvante incompleto de Freund. Administra-se a proteína de TACI-imunoglobulina profilacticamente em ou antes da segunda injecção, ou depois que o animal desenvolva uma pontuação clínica de dois ou mais que dure pelo menos 24 horas. Os animais 61 começam a mostrar sintomas de artrite após a segunda injecção de colagénio, habitualmente, às dois a três semanas. Por exemplo, podem ser administradas TACI-Fc, uma proteína de controlo, IgFc humana ou solução salina tamponada com fosfato (veículo) profilacticamente começando sete dias antes da segunda injecção (dia -7). As proteínas podem ser administradas a 100 pg, três vezes à semana como uma injecção intraperitoneal de 200 μΐ, e continuando durante quatro semanas.
No modelo de artrite induzida por colagénio, avalia-se o grau da doença em cada pata usando um calibrador para medir a grossura da pata e por meio da atribuição de uma pontuação clínica a cada pata. Por exemplo, uma pontuação clínica de "0" indica um ratinho normal, uma pontuação de "1" indica que há um ou mais dedos inflamados, uma pontuação de “2" indica uma inflamação suave da pata, uma pontuação de "3" indica uma inflamação moderada da pata e uma pontuação de "4" indica uma inflamação grave da pata. Sacrificam-se os animais uma vez que a doença tenha se estabelecido durante um período estabelecido de tempo, habitualmente, de sete dias. Extraem-se as patas para histologia ou análise do ARNm, e extrai-se soro para os análise de imunoglobulina e citocina. A miastenia gravis é outra doença auto-imune para a qual há modelos murinos disponíveis. A miastenia gravis é um distúrbio de transmissão neuromuscular que implica a produção de auto-anticorpos dirigidos contra o receptor da acetilcolina nicotínica. Esta doença é adquirida ou herdada com características clínicas que incluem uma fraqueza anormal e uma fatiga ao realizar exercícios.
Foi estabelecido um modelo murino de miastenia gravis. (Christadoss et ai., "Establishment of a Mouse Model of Myasthenia gravis Which Mimics Human Myasthenia gravid Pathogenese for Immune Intervention" em Immunobiology of Proteins and Peptides VIII, Atassi e Bixler (Eds.), páginas 62 195-199 (1995)). A miastenia gravis auto-imune experimental é uma doença mediada por anticorpos caracterizada pela presença de anticorpos contra o receptor da acetilcolina. Estes anticorpos destroem o receptor conduzindo a impulsos eléctricos neuromusculares defeituosos, tendo como resultado uma fraqueza muscular. No modelo da miastenia gravis auto-imune experimental, imunizam-se os ratinhos com o receptor da acetilcolina nicotinica. Os sinais clínicos da miastenia gravis tornam-se evidentes semanas depois da segunda imunização. A miastenia gravis auto-imune experimental avalia-se por meio de vários métodos que incluem a medição dos níveis em soro dos anticorpos contra o receptor da acetilcolina por meio de radioimunoensaio (Christadoss e Dauphinee, J. Immunol. 136:2437 (1986); Lindstrom et al., Methods Enzymol. 74:432 (1981)), a medição do receptor da acetilcolina muscular ou a electromiografia (Coligan et al. (Eds.), Protocols in Immunology. Vol. 3, página 15.8.1 (John Wiley & Sons, 1997)).
Pode ser determinado o efeito de TACI-imunoglobulina sobre a miastenia gravis auto-imune experimental por meio da administração de proteínas de fusão quando a miastenia gravis clínica está em curso em ratinhos B6. Por exemplo, imunizam-se 100 ratinhos B6 com 20 pg de receptor da acetilcolina em adjuvante completo de Freund os dias 0 e 30. Aproximadamente de 40 a 60 % dos ratinhos desenvolverá uma miastenia gravis clínica moderada (grau 2) a severa (grau 3) após voltar a imunizar com receptor de acetilcolina. Dividem-se os ratinhos com doença clínica de grau 2 e 3 em três grupos (com graus iguais de fraqueza) e pesam-se (os ratinhos com fraqueza também perdem peso, pois têm dificuldades em consumir alimento e água) e extrai-se o soro dos mesmos (para o nível de isotipos e anticorpos contra o receptor da acetilcolina prévios ao tratamento). Ao grupo A injecta-se I.P. solução salina tamponada com 63 fosfato, ao grupo B injecta-se intraperitonealmente IgG-Fc humana como proteína de controlo (100 pg) e ao grupo C injectam-se 100 pg de TACI-Fc três vezes à semana durante quatro semanas. Rastreiam-se os ratinhos quanto à fraqueza muscular clínica duas vezes à semana, e pesam-se e extrai-se soro aos 15 e 30 dias do começo do tratamento. É colhido sangue total no dia 15 para determinar a proporção entre células T/B por meio de uma análise de classificação celular activada por meio de fluorescência usando os marcadores B220 e CD5. Sacrificam-se os ratinhos sobreviventes aos 30 a 45 dias do início do tratamento e congelam-se os corpos dos animais mortos para uma extracção posterior do receptor da acetilcolina muscular para determinar a perda de receptor de acetilcolina muscular, a patologia principal da miastenia gravis (veja-se, por exemplo, Coligan et al. (Eds.), Protocols in Immunology. Vol. 3, página 15.8.1 (John Wiley & Sons, 1997)).
Os anticorpos em soro contra o receptor da acetilcolina muscular dos ratinhos podem ser determinados por meio de um radioimunoensaio estabelecido, e os isotipos dos anticorpos contra o receptor da acetilcolina (IgM, IgGl, IgG2b e IgG2c) são medidos por meio de ELISA. Tais métodos são conhecidos. Determinam-se os efeitos de TACI-imunoglobulina sobre a miastenia gravis clínica em curso, o nível de anticorpos e isotipos contra o receptor da acetilcolina e a perda de receptor da acetilcolina muscular.
Podem ser imunizados aproximadamente 100 ratinhos com 20 pg de receptor da acetilcolina em adjuvante completo de Freund os dias 0 e 30. Dividem-se os ratinhos com miastenia gravis clínica em quatro grupos. Ao grupo A injectam-se intraperitonealmente 100 pg de Fc de controlo, ao grupo B injectam-se 20 pg de Fc de controlo, ao grupo C injectam-se 100 pg de TACI-Fc e ao grupo D injectam-se 20 pg de TACI-Fc três vezes à semana durante quatro semanas. Pesam-se os 64 ratinhos e extrai-se soro antes e aos 15 e 30 dias do inicio do tratamento. Analisa-se o soro quanto ao anticorpo e os isotipos contra o receptor da acetilcolina de acordo com o descrito anteriormente. Também pode ser medida a perda de receptor da acetilcolina muscular.
Os peritos na especialidade podem determinar outras análises adequadas das proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina. 6. Produção de conjugados de TACI-imunoglobulina A presente memória descritiva descreve composições de TACI-imunoglobulina modificadas quimicamente nas quais um polipéptido de TACI-imunoglobulina está ligado com um polímero. Tipicamente, o polímero é hidrossolúvel, tal que o conjugado de TACI-imunoglobulina não precipite num meio aquoso, tal como um meio fisiológico. Um exemplo de um polímero adequado é um que tenha sido modificado para ter um único grupo reactivo, tal como um éster activo para a acilação ou um aldeído para a alquilação. Deste modo, pode ser controlado o grau de polimerização. Um exemplo de aldeído reactivo é o próprionaldeído de polietileno glicol ou monoalcoxi-(Ci-Cio) ou derivados de ariloxilo do mesmo (veja-se, por exemplo, Harries, et al., Patente US N° 5.252.714). O polímero pode estar ramificado ou não ramificado. Além disso, pode ser usada uma mistura de polímeros para produzir conjugados de TACI- imunoglobulina.
Os conjugados de TACI-imunoglobulina usados para a terapêutica podem compreender resíduos poliméricos hidrossolúveis farmaceuticamente aceitáveis. Os polímeros hidrossolúveis adequados incluem polietileno glicol (PEG), monometoxi-PEG, mono-alcoxi(Ci-Ci0)-PEG, ariloxi-PEG, poli(N-vinilpirrolidona)PEG, tresil-monometoxi-PEG, pro-pionaldeído de PEG, bis-succinimidil-carbonato-PEG, homopolímeros de propileno glicol, um copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, dextrano, 65 celulose ou outros polímeros baseados em hidratos de carbono. Os PEG adequados podem ter um peso molecular de aproximadamente 600 a aproximadamente 60.000, incluindo, por exemplo, 5.000, 12.000, 20.000 e 25.000. Um conjugado de TACI- imunoglobulina também pode compreender uma mistura de tais polímeros hidrossolúveis.
Um exemplo de um conjugado de TACI-imunoglobulina compreende uma fracção de TACI-imunoglobulina e uma fracção de óxido de polialquilo ligadas ao terminal N de TACI-imunoglobulina. O PEG é um óxido de polialquilo adequado. Por meio de ilustração, a TACI-imunoglobulina pode ser modificada com PEG, método conhecido como "PEGilação". A PEGilação de TACI-imunoglobulina pode ser levada a cabo por meio de quaisquer das reacções de PEGilação conhecidas na técnica (veja-se, por exemplo, o documento EP 0 154 316,
Delgado et ai., "Criticai Reviews in Therapeutic Drug
Carrier Systems" 9:249 (1992), Duncan e Spreafico, Clin.
Pharmacokinet. 27:290 (1994) e Francis et al., Int J
Hematol 68:1 (1998)). Por exemplo, pode ser realizada a PEGilação por meio de uma reacção de acilação ou por meio de uma reacção de alquilação com uma molécula de polietileno glicol reactiva. Numa abordagem alternativa, formam-se conjugados de TACI-imunoglobulina por meio da condensação de PEG activado, em que foi substituído um grupo amino ou hidroxilo terminal do PEG por um ligante activado (veja-se, por exemplo, Karasiewicz et al., Patente US N° 5.382.657). A PEGilação por meio de acilação requer tipicamente fazer reagir um derivado de éster activo de PEG com um polipéptido de TACI-imunoglobulina. Um exemplo de um éster de PEG activado é o PEG esterificado em N- hidroxisuccinimida. Como é usado no presente documento, o termo "acilação" inclui os seguintes tipos de ligações entre TACI-imunoglobulina e um polímero hidrossolúvel: amida, carbamato, uretano e similares. Os métodos para 66 preparar TACI-imunoglobulina PEGilada por meio de acilação compreenderão tipicamente as etapas de (a) fazer reagir um polipéptido de TACI-imunoglobulina com PEG (tal como um éster reactivo de um derivado de aldeído de PEG) em condições por meio das guais um ou mais grupos de PEG se unam com TACI-imunoglobulina e (b) obter o ou os produtos de reacção. Geralmente, as condições de reacção óptimas para as reacções de acilação serão determinadas com base em parâmetros conhecidos e de acordo com os resultados que se desejem obter. Por exemplo, quanto maior seja a proporção entre PEG:TACI-imunoglobulina, maior será a percentagem de produto de TACI- imunoglobulina poliPEGilado. 0 produto da PEGilação por meio de acilação é, comummente, um produto de TACI-imunoglobulina poliPEGilado, em que os grupos ε-amino da lisina estão PEGilados por meio de um grupo de ligação acilo. Um exemplo de ligação conectora é uma amida. Tipicamente, a TACI-imunoglobulina resultante será pelo menos 95 % mono-, di-, ou tri-pegilada, embora possam ser formadas algumas espécies com graus mais elevados de PEGilação em função das condições de reacção. É possível separar a espécie PEGilada dos polipéptidos de TACI-imunoglobulina sem conjugar usando métodos de purificação padrão, tais como diálise, ultrafiltração, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de afinidade e similares. A PEGilação por meio de alquilação implica geralmente fazer reagir um derivado de aldeído terminal do PEG com TACI-imunoglobulina na presença de um agente redutor. Os grupos de PEG podem ser unidos ao polipéptido por meio de um grupo -CH2-NH. A derivação por meio de alquilação redutora para gerar um produto monoPEGilado aproveita a reactividade diferencial dos diferentes tipos de grupos amino primários disponíveis para a derivação. Tipicamente, a reacção é levada a cabo a um pH que permite aproveitar as diferenças 67 de pKa entre os grupos ε-amino dos resíduos de lisina e o grupo α-amino do resíduo N-terminal da proteína. Por meio de tal derivação selectiva, controla-se a ligação de um polímero hidrossolúvel que contém um grupo reactivo, tal como um aldeído, a uma proteína. A conjugação com o polímero ocorre predominantemente no terminal N da proteína sem uma modificação significativa de outros grupos reactivos tais como os grupos amino das cadeias laterais dos resíduos de lisina. A presente invenção proporciona uma preparação substancialmente homogénea de conjugados monopoliméricos de TACI-imunoglobulina. A alquilação redutora para produzir uma população substancialmente homogénea de moléculas de conjugado de TACI-imunoglobulina monopolimérico pode compreender as etapas de: (a) fazer reagir um polipéptido TACI-imunoglobulina com um PEG reactivo em condições de alquilação redutora a um pH adequado para permitir a modificação selectiva do grupo a-amino do terminal amino de TACI-imunoglobulina e (b) obter o ou os produtos de reacção. 0 agente redutor usado para a alquilação redutora deveria ser estável em solução aquosa e capaz de reduzir somente a base de Schiff formada no método inicial da alquilação redutora. Os agentes redutores ilustrativos incluem borohidreto de sódio, cianoborohidreto de sódio, dimetilaminaborano, trimetilaminaborano e piridinaborano.
Para uma população substancialmente homogénea de conjugados de TACI-imunoglobulina monopoliméricos, as condições da reacção de alquilação redutora são aquelas que permitem a ligação selectiva do resíduo polimérico hidrossolúvel com o terminal N de TACI-imunoglobulina. Tais condições de reacção proporcionam geralmente diferenças de pKa entre os grupos amino dos resíduos de lisina e o grupo α-amino do terminal N. 0 pH também afecta à proporção entre o polímero e a proteína a ser usada. Em geral, se o pH for inferior, será desejado um maior excesso de polímero 68 contra proteína, porque quanto menos reactivo seja o grupo CC N-terminal, mais polímero é necessário para alcançar as condições óptimas. Se o pH for maior, o polímero-TACI-imunoglobulina não necessita ser tão grande, porque há disponíveis mais grupos reactivos. Tipicamente, o pH estará no intervalo de 3 a 9 ou de 3 a 6.
Outro factor a considerar é o peso molecular do polímero hidrossolúvel. Geralmente, quanto mais alto seja o peso molecular do polímero, menor será o número de moléculas poliméricas que poderão ser ligadas à proteína. Para as reacções de PEGilação, o peso molecular mais comum é de aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa, ou de aproximadamente 12 kDa a aproximadamente a aproximadamente 25 kDa. A proporção molar entre o polímero hidrossolúvel e TACI-imunoglobulina estará, geralmente, no intervalo de 1:1 a 100:1. Tipicamente, a proporção molar entre o polímero hidrossolúvel e TACI-imunoglobulina será de 1:1 a20:l para a poliPEGilação e de 1:1 a 5:1 para a monoPEGilação.
Os métodos gerais para produzir conjugados que compreendem um polipéptido e resíduos poliméricos hidrossolúveis são conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Karasiewicz et ai., Patente US N° 5.382.657, Greenwald et al., Patente US N° 5.738.846, Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997)). A presente invenção contempla composições farmacêuticas que compreendem uma proteína de fusão, de acordo com o definido nas reivindicações, e um veículo farmaceuticamente aceitável. O veículo pode ser um veículo orgânico ou inorgânico convencional. Os exemplos de veículos incluem água, solução tampão, álcool, propileno glicol, macrogol, óleo de sésamo, óleo de milho e similares. 7. Isolamento de polipéptidos de TACI-imunoglobulina 69
Os polipéptidos da presente invenção podem ser purificados até pelo menos aproximadamente 80 % de pureza, até pelo menos aproximadamente 90 % de pureza, até pelo menos aproximadamente 95 % de pureza ou mais de 95 % de pureza com respeito a macromoléculas contaminantes, particularmente, outras proteínas e ácidos nucleicos, e livres de agentes infecções e pirogénicos. Os polipéptidos da presente invenção também podem ser purificados até um estado farmaceuticamente puro que tenha uma pureza de mais de 99,9 %. Em certas preparações, o polipéptido purificado está substancialmente livre de outros polipéptidos, particularmente, de outros polipéptidos de origem animal.
Podem ser usados métodos de fraccionamento e/ou purificação convencional para obter preparações de polipéptidos de TACI-imunoglobulina sintéticos e polipéptidos de TACI-imunoglobulina recombinantes purificados a partir de células hospedeiras recombinantes. Em geral, pode ser usada a precipitação em sulfato de amónio e a extracção por meio de agentes ácidos ou caotrópicos para o fraccionamento das amostras. As etapas de purificação exemplares podem incluir a exclusão por tamanho com hidroxiapatita, FPLC e cromatografia em fase líquida de alta resolução de fase reversa. Os meios cromatográficos adequados incluem dextranos derivados, agarose, celulose, poliacrilamida, sílicas especializadas e similares. São adequados os derivados de PEI, DEAE, QAE e Q. Os exemplos de meios cromatográficos incluem aqueles meios derivados de grupos fenilo, butilo ou octilo, tais como fenil-sefarose FF (Pharmacia) , Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octil-Sefarose (Pharmacia) e similares; ou resinas poliacrílicas, tais como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) e similares. Os suportes sólidos adequados incluem pérolas de vidro, resinas baseadas em sílica, resinas celulósicas, pérolas de agarose, pérolas de agarose entrecruzada, pérolas de 70 poliestireno, resinas de poliacrilamida entrecruzada e similares que sejam insolúveis nas condições a serem usadas. Estes suportes podem ser modificados com grupos reactivos que permitem a ligação das proteinas pelos grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfidrilo, grupos hidroxilo e/ou resíduos de hidrato de carbono.
Os exemplos de químicas de acoplamento incluem a activação com brometo de cianogénio, a activação com N-hidroxisuccinimida, a activação com epóxido, a activação com sulfidrilo, a activação com hidrazina, e os derivados carboxilo e amino para as químicas de acoplamento com carbodiimida. Estes e outros meios sólidos são conhecidos e são usados amplamente na técnica, e podem ser obtidos de fornecedores comerciais. A selecção de um determinado método para o isolamento e a purificação dos polipéptidos é uma questão de desenho de rotina e está determinada, em parte, pelas propriedades do suporte seleccionado. Veja-se, por exemplo, "Affinity Chromatography: Principies & Methods" (Pharmacia LKB Biotechnology 1988) e Doonan, "Protein Purification Protocols" (The Human Press 1996) .
Os peritos na especialidade podem criar outras variações no isolamento e a purificação de TACI-imunoglobulina. Por exemplo, podem ser usados anticorpos contra TACI ou contra Fc para isolar grandes quantidades de proteína por meio de purificação por imunoafinidade.
Os polipéptidos da presente invenção também podem ser isolados por meio da explotação de determinadas propriedades. Por exemplo, pode ser usada uma cromatografia de adsorção de iões metálicos imobilizados (IMAC) para purificar as proteínas ricas em histidina, incluindo aquelas que compreendem etiquetas de polihistidina. De maneira breve, primeiro carrega-se um gel com iões metálicos divalentes para formar um quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)). Serão adsorvidas as proteínas ricas em histidina a esta matriz com afinidades 71 diferentes, em função do ião metálico usado, e serão eluidas por meio de eluição competitiva, descendendo o pH ou a utilização de agentes quelantes potentes. Outros métodos de purificação incluem a purificação de proteínas glicosiladas por meio da cromatografia de afinidade à lectina, cromatografia da proteína A e cromatografia de permuta iónica (M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:529 (1990)).
Também podem ser preparados polipéptidos de TACI-imunoglobulina ou fragmentos dos mesmos por meio de síntese química, de acordo com o descrito anteriormente. Os polipéptidos de TACI-imunoglobulina podem ser monómeros ou multímeros; glicosilados ou não glicosilados; PEGilados ou não PEGilados; e podem ou não incluir um resíduo de aminoácido de metionina inicial. Uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina pode estar não glicosilada, glicosilada ou glicosilada somente na fracção de TACI ou na fracção de imunoglobulina. A fracção de imunoglobulina pode ser obter de um anticorpo humano, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado. 8. Utilizações terapêuticas dos polipéptidos de TACI-imunoglobulina
As proteínas de TACI-imunoglobulina podem ser usadas para modular o sistema imune por meio da ligação com ZTNF4 ou ZTNF2, evitando assim a ligação destes ligandos com receptores TACI ou BCMA endógenos. Por conseguinte, a presente memória descritiva descreve especificamente a utilização de proteínas de TACI-imunoglobulina num indivíduo que careça de uma quantidade adequada de receptores TACI ou BCMA, ou que produza um excesso de ZTNF4 ou ZTNF2. Estas moléculas podem ser administradas a qualquer indivíduo em necessidade de tratamento. A presente invenção contempla utilizações terapêuticas tanto veterinários como humanos, de acordo com o definido nas reivindicações, incluindo os indivíduos ilustrativos 72 indivíduos mamíferos, tais como animais do campo, animais domésticos e pacientes humanos.
Os polipéptidos de TACI-imunoglobulina podem ser usados para o tratamento de doenças auto-imunes, cancros de células B, imunomodulação, IBD e patologias mediadas por anticorpos contra IBD ou qualquer anticorpo (por exemplo, ITCP, miastenia gravis e similares) , doenças renais, resposta imune indirecta de células T, rejeição de enxerto e a doença do enxerto contra o hospedeiro. Os polipéptidos da presente invenção podem ser dirigidos a regular especificamente as respostas das células B durante uma resposta imune. Além disso, os polipéptidos da presente invenção podem ser usados para modular o desenvolvimento das células B, o desenvolvimento de outras células, a produção de anticorpos e a produção de citocina. Os polipéptidos da presente invenção também podem modular a comunicação das células T e B por meio da neutralização dos efeitos proliferativos de ZTNF4.
Os polipéptidos de TACI-imunoglobulina da presente invenção podem ser úteis para neutralizar os efeitos de ZTNF24 para tratar leucemias de células pré-B ou B, tais como leucemia de células plasmáticas, leucemia linfocítica crónica ou aguda, mielomas tais como o mieloma múltipla, mieloma de células plasmáticas, mieloma endotelial e mieloma de células gigantes, e linfomas tais como linfoma de não Hodgkin, para os quais está associado um aumento dos polipéptidos ZTNF4. ZTNF4 é expresso em células CD8+, monócitos, células dendríticas, monócitos activados, o que indica que, em certos distúrbios auto-imunes, as células T citotóxicas poderiam estimular a produção de células B através de um excesso na produção de ZTNF4. As proteínas imunosupressoras que bloqueiam selectivamente a acção dos linfócitos B seriam de utilidade no tratamento da doença. A produção de auto-anticorpos é comum em várias doenças auto-imunes e 73 contribui à destruição de tecidos e ao agravamento da doença. Os auto-anticorpos também podem conduzir à aparição de complicações na sedimentação de complexos imunes e conduzir a muitos sintomas do lúpus eritematoso sistémico, incluindo a insuficiência renal, sintomas neurálgicos e a morte. A modulação da produção de anticorpos independente da resposta celular também seria benéfica em muitos estados patológicos. Também foi observado que as células B desempenham um papel na secreção das imunoglobulinas artritogénicas na artrite reumatóide. Como tal, a inibição da produção de anticorpos contra ZTNF4 seria benéfica no tratamento de doenças auto-imunes, tais como a miastenia gravis, a artrite reumatóide, a artrite reumatóide juvenil de evolução poliarticular e a artrite psoriática. Os agentes terapêuticos imunosupressores tais como as proteínas de TACI-imunoglobulina que bloqueiam ou neutralizam selectivamente a acção dos linfócitos B seriam úteis a tais efeitos. A invenção proporciona utilizações que utilizam proteínas de TACI-imunoglobulina para bloquear ou neutralizar selectivamente as acções das células B em associação com doenças renais num estágio final, que podem estar ou não associadas a doenças auto-imunes. Tais métodos também seriam úteis para tratar doenças renais imunológicas. Tais métodos seriam úteis para tratar glomerulonefrite associada a doenças tais como nefropatia membranosa, nefropatia por IgA ou doença de Berger, nefropatia por IgM, doença de Goodpasture, glomerulonefrite pós-infecciosa, doença mesangioproliferativa, leucemia linfóide crónica, síndrome nefrótico de cambio mínimo. Tais métodos também serviriam como aplicações terapêuticas para tratar glomerulonefrite secundaria ou vasculite associada a doenças tais como o lúpus, poliarterite, Henoch-Schonlein, esclerodermia, doenças relacionadas com o VIH, amiloidose e síndrome urémico hemolítico. As utilizações da presente 74 invenção também seriam úteis como parte de uma aplicação terapêutica para tratar nefrite intersticial ou pielonefrite associada a pielonefrite crónica, abuso de analgésicos, nefrocalcinose, nefropatia provocada por outros agentes, nefrolitiase ou nefrite intersticial crónica ou aguda. A presente memória descritiva descreve a utilização de proteínas de TACI-imunoglobulina no tratamento de doenças hipertensivas ou de vasos grandes, incluindo a estenose ou oclusão das artérias renais e as embolias de colesterol ou embolias renais. A presente invenção também proporciona utilizações para o tratamento de neoplasmas renais ou urológicos, mielomas múltiplas, linfomas, neuropatia ou amiloidose de cadeia leve. A invenção também proporciona utilizações para bloquear ou inibir células B activadas usando proteínas de TACI-imunoglobulina para o tratamento do asma e de outras doenças das vias respiratórias crónicas, tais como a bronquite e o enfisema. As proteínas de TACI-imunoglobulina descritas no presente documento também podem ser usados para tratar a Síndrome de Sjogren.
Também se proporcionam utilizações para inibir ou neutralizar um resposta de células T efectoras usando proteínas de TACI-imunoglobulina para utilização em imunossupressão, em particular, para uma utilização terapêutica tal como a doença do enxerto contra o hospedeiro e rejeição de enxerto. Além disso, as proteínas de TACI-imunoglobulina seriam úteis em protocolos terapêuticos para o tratamento de doenças auto-imunes tais como a diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM) e a doença de Crohn. As utilizações da presente invenção teriam um valor terapêutico adicional para o tratamento de doenças inflamatórias crónicas, em particular, para diminuir a dor 75 articular, a edema, a anemia e outros sintomas associados, assim como para tratar o choque séptico. Há modelos animais bem estabelecidos disponíveis para analisar a eficácia in vivo das proteínas de TACI-imunoglobulina da presente invenção em certos estados patológicos. Em particular, podem ser analisadas as proteínas de TACI-imunoglobulina in vivo num número de modelos animais de doença auto-imune, tais como estirpes congénitas de ratinhos MRL-lpr/lpr ou NZB x NZW Fl, que servem como modelo do LES (lúpus eritematoso sistémico). Tais modelos animais são conhecidos na técnica. A descendência de um cruzamento entre ratinhos negros de Nova Zelândia (NZB) e ratinhos brancos de Nova Zelândia (NZW) desenvolve uma forma espontânea de LES que se assemelha muito ao LES em seres humanos. A descendência dos ratinhos, conhecida como NZBW, começa a desenvolver auto-anticorpos IgM contra as células Tal mês de idade, e aos 5-7 meses de idade, os auto-anticorpos contra o ADN de Ig são a imunoglobulina dominante. A hiperactividade das células B policlonais conduz à sobre-produção dos auto-anticorpos. A sedimentação destes auto-anticorpos, particularmente, dos dirigidos contra o ADN de cadeia simples, está associada ao desenvolvimento da glomerulonefrite, que se manifesta clinicamente como proteinúria, azotemia e morte a partir da insuficiência renal. A insuficiência de rim é a causa principal de mortalidade nos ratinhos afectados de LES espontâneo e na estirpe NZBW, este método é crónico e obliterante. A doença é mais rápida e grave em fêmeas que em machos, com uma sobrevivência média de somente 245 dias em comparação com os 406 dias para os machos. Enquanto que muitos dos ratinhos fêmea serão sintomáticos (proteinúria) aos 7-9 meses de idade, alguns podem ser muito mais jovens ou mais velhos quando desenvolvem os sintomas. A nefrite imune mortal observada nos ratinhos NZBW é muito similar à 76 glomerulonefrite observada no LES humano, o que converte a este modelo murino espontâneo em útil para analisar os potenciais agentes terapêuticos para o LES.
Os modelos de ratinho para a encefalomielite alérgica experimental (EAE) foram usados como ferramenta para investigar tanto os mecanismos das doenças mediadas pelo sistema imunológico como os métodos de uma possível intervenção terapêutica. 0 modelo assemelha-se à esclerose múltipla humana e produz uma desmielinização como resultado da activação de células T a neuroproteínas tais como a proteína básica mielina (MBP) ou a proteína proteolipídica (PLP). A inoculação com antigénio conduz à indução de CD4+, células T restringidas ao MHC de classe II (Thl) . As mudanças no protocolo para a EAE podem produzir variantes agudas, recidivas crónicas ou de transferência passiva do modelo.
No modelo de artrite induzida por colagénio (AIC), os ratinhos desenvolvem artrite inflamatória crónica, que se assemelha muito à artrite reumatóide humana (AR) . Como a AIC partilha características imunológicas e patológicas similares com a AR, esta converte-se num modelo ideal para rastrear os potenciais compostos anti-inflamatórios humanos. Outra vantagem da utilização do modelo de AIC é que os mecanismos de patogénese são conhecidos. Foram identificados os epítopos de células T e B no colagénio de tipo II, e foram determinados diversos parâmetros imunológicos (hipersensibilidade de tipo retardado e anticorpo contra o colagénio) e inflamatórios (citocinas, quimiocinas e enzimas degradantes da matriz) relativos à artrite mediada pelo sistema imune, e podem ser usados para medir a eficácia dos compostos de teste nos modelos. A miastenia gravis (MG) é outra doença auto-imune para a qual há modelos murinos disponíveis. A MG é um distúrbio de transmissão neuromuscular que implica a produção de auto-anticorpos dirigidos contra o receptor da acetilcolina 77 nicotínica (AChR) A MG é adquirida ou herdada com características clinicas que incluem uma fraqueza anormal e uma fatiga ao realizar exercícios. Foi estabelecido um modelo de ratinhos da MG. A miastenia gravis auto-imune experimental (MGAE) é uma doença mediada por anticorpos caracterizada pela presença de anticorpos contra o AChR. Estes anticorpos destroem o receptor conduzindo a impulsos eléctricos neuromusculares defeituosos, que têm como resultado uma fraqueza muscular. No modelo da MGAE, imunizam-se os ratinhos com o receptor da acetilcolina nicotinica. Os sinais clínicos da MG tornam-se evidentes semanas depois da segunda imunização. A MGAE avalia-se por meio de vários métodos que incluem a medição dos níveis em soro dos anticorpos contra o AChR por meio de radioimunoensaio, a medição do AChR muscular ou a electromiografia.
Geralmente, a dose da proteína de TACI-imunoglobulina administrada variará em função de factores tais como a idade, o peso, a altura, o sexo, o estado de saúde geral e a história médica prévia do indivíduo. Tipicamente, é desejável proporcionar ao receptor uma dose de proteína de TACI-imunoglobulina que esteja no intervalo de aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg (quantidade de agente/peso corporal do indivíduo), embora também possa ser administrada uma dose mais baixa ou mais alta de acordo com as circunstâncias. A administração de uma proteína de TACI-imunoglobulina a um indivíduo pode ser intravenosa, intra-arterial, intra-peritoneal, intramuscular, subcutânea, intrapleural, intratecal, por perfusão por meio de um cateter regional ou por meio de injecção intralesional directa. Quando se administram as proteínas terapêuticas por injecção, a administração pode ser por meio de infusão contínua, ou por meio de um único ou múltiplos bolus. 78
Outras vias de administração incluem a via oral, pela membrana mucosa, pulmonar e transcutânea. A administração oral é adequada para microesferas de poliéster, microesferas de zeina, microesferas proteinóides, microesferas de policianoacrilato e sistemas baseados em lipidos (veja-se, por exemplo, DiBase e Morrei, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins" em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 255-288 (Plenum Press 1997)) . A viabilidade de uma administração intranasal está exemplificada por meio de um modo tal como a administração de insulina (veja-se, por exemplo, Hinchcliffe e Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)). As partículas em pó ou líquidas que compreendem TACI-imunoglobulina podem ser preparadas e inaladas com a ajuda de dispensadores de pó seco, geradores de aerossol líquido ou nebulizadores (por exemplo, Pettit e Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton et ai., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)). Esta abordagem ilustra-se por meio do sistema de tratamento da diabetes AERX, que é um inalador electrónico de mão que administra insulina em aerossol aos pulmões. Os estudos têm mostrado que foram administradas proteínas tão grandes quanto de 48.000 kDa através da pele a concentrações terapêuticas com a ajuda de ultra-som de baixa frequência, o que ilustra a viabilidade da administração transcutânea (Mitragoutri et al., Science 269:850 (1995)). A administração transdérmica por meio da utilização de electroporação proporciona outro meio para administrar uma proteína de TACI-imunoglobulina (Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)).
Pode ser formulada uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de TACI-imunoglobulina de acordo com os métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, por meio dos quais as proteínas terapêuticas se combinam numa mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. Diz-se que uma composição é um 79 "veículo farmaceuticamente aceitável" se a sua administração puder ser tolerada por um paciente receptor. A solução salina estéril tamponada com fosfato é um exemplo de um veículo farmaceuticamente aceitável. Os peritos na especialidade conhecem outros veículos adequados. Veja-se, por exemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, XIX Edição (Mack Publishing Company 1995). A efeitos terapêuticos, as proteínas de TACI-imunoglobulina administram-se a um paciente numa quantidade terapeuticamente eficaz. Diz-se que uma proteína de TACI-imunoglobulina e um veículo farmaceuticamente aceitável administram-se numa "quantidade terapeuticamente eficaz" se a quantidade administrada for fisiologicamente relevante. Um agente é fisiologicamente relevante se a sua presença tiver como resultado uma mudança detectável na fisiologia de um paciente receptor. Por exemplo, um agente usado para tratar uma inflamação é fisiologicamente relevante se a sua presença alivia a resposta inflamatória. Como outro exemplo, um agente usado para inibir o crescimento de células tumorais é fisiologicamente relevante se a administração do agente tiver como resultado uma diminuição do número de células tumorais, uma diminuição da metástase, uma diminuição do tamanho de um tumor sólido ou um aumento da necrose de um tumor. Além disso, um agente usado para tratar o lúpus eritematoso sistémico é fisiologicamente relevante se a administração do agente tiver como resultado uma diminuição dos anticorpos circulantes contra o ADN de cadeia dupla ou uma diminuição em pelo menos um dos seguintes sintomas: febre, dor articular, lesões cutâneas eritematosas ou outras características do lúpus eritematoso sistémico. Um exemplo da indicação geral de administração de uma proteína de TACI-imunoglobulina numa quantidade terapeuticamente eficaz é que, após a sua administração a um indivíduo, há uma diminuição dos níveis de circulação de ZTNF4 (BLyS). 80
Pode ser preparada uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de TACI-imunoglobulina em forma líquida, num aerossol ou em forma sólida. As formas líquidas ilustram-se por meio de soluções injectáveis e suspensões orais. Os exemplos de formas sólidas incluem cápsulas, comprimidos e formas de liberação controlada. A última forma ilustra-se por meio de bombas miniosmóticas e implantes (Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery" em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps" em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant" em Protein Delivery: Physical System, Sanders e Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)).
Os lipossomas proporcionam um meio para administrar polipéptidos terapêuticos a um indivíduo intravenosamente, intraperitonealmente, intratecalmente, intramuscularmente, subcutaneamente ou por meio de administração oral, por inalação ou administração intranasal. Os lipossomas são vesículas microscópicas que consistem num ou mais compartimentos aquosos rodeados de bicamadas lipídicas (veja-se, em geral, Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Supl. 1):S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993) e Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Lipo- somes as Carriers" em Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), páginas 3-24 (CRC Press 1995)). Os lipossomas têm uma composição similar às membranas celulares e, como resultado disso, os lipossomas podem ser administrados de maneira segura, sendo biodegradáveis. Em função do método de preparação, os lipossomas podem ser unilaminares ou multilaminares, e os lipossomas podem variar no tamanho com diâmetros que variam de 0,02 pm a 81 mais de 10 pm. Pode ser encapsulada uma variedade de agentes nos lipossomas: A divisão dos agentes hidrofóbicos nas bicamadas e a divisão dos agentes hidrófilos no espaço ou os espaços aquosos internos (veja-se, por exemplo, Machy et al., "Lipossomes In Cell Biology And Pharmacology" (John Libbey 1987) e Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)). Além disso, é possível controlar a disponibilidade terapêutica do agente encapsulado variando o tamanho dos lipossomas, o número das bicamadas, a composição lipídica, assim como as características de carga e superfície dos lipossomas.
Os lipossomas podem ser adsorvidos a quase qualquer tipo de célula e em seguida libertam lentamente o agente encapsulado. Alternativamente, um lipossoma absorvido pode ser submetido a endocitose por células que sejam fagocíticas. A endocitose é seguida pela degradação intralisossomal dos lípidos lipossomais e a liberação dos agentes encapsulados (Scherphof et al., Ann. N.E. Acad. Sei. 446:368 (1985)). Após a administração intravenosa, os pequenos lipossomas (0,1 a 1,0 um) são comummente absorvidos pelas células do sistema retículo endotelial, localizado principalmente no fígado e no baço, enquanto que os lipossomas maiores de 3,0 pm são depositados no pulmão. Esta absorção preferencial dos lipossomas menores pelas células do sistema retículo endotelial foi usada para administrar agentes quimioterapêuticos a macrófagos e a tumores do fígado. O sistema retículo endotelial pode ser iludido por vários métodos que incluem a saturação com grandes doses de partículas lipossomais ou a desactivação selectiva de macrófagos por meio de métodos farmacológicos (Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802 : 428 (1984)). Além disso, observou-se que a incorporação de fosfolípidos derivados de glicolípidos ou de polietileno glicol nas membranas lipossomais tem como resultado uma redução significativa da 82 absorção por parte do sistema retículo endotelial (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen et al, Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
Também podem ser preparados os lipossomas para dirigi-los a determinadas células ou órgãos variando a composição f osf olipídica ou por meio da inserção de receptores ou ligandos nos lipossomas. Por exemplo, foram usados lipossomas preparados com um alto conteúdo de um tensioactivo não iónico para dirigi-los ao fígado (Hayakawa et al., patente japonesa 04-244.018; Kato et al., Biol. Phann. Buli. 16:960 (1993)). Estas formulações foram preparadas misturando f ospat idilcolina de soja, (X-tocoferol e óleo de rícino hidrogenado etoxilado (HCO-60) em metanol, concentrando a mistura a vácuo e em seguida reconstituindo a mistura com água. Também se observou que uma formulação lipossomal de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) com uma mistura de esterilglucósido derivado de soja (SG) e colesterol (Ch) se dirige ao fígado (Shimizu et al, Biol. Pharm. Buli. 20:881 (1997)).
Alternativamente, podem ser unidos diversos ligandos dirigidos com a superfície do lipossoma, tais como anticorpos, fragmentos de anticorpos, hidratos de carbono, vitaminas e proteínas transportadoras. Por exemplo, podem ser modificados lipossomas com derivados galactosilipídicos de tipo ramificado para dirigi-los a receptores de asialoglicoproteínas (galactose), que se expressam exclusivamente sobre a superfície de células de fígado (Kato e Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi et al, Biol. Pharm. Buli. 20:259 (1997) ). De maneira similar, Wu et al., Hepatology 27: 772 (1998) , observou-se que a marcação de lipossomas com asialofetuína levou a uma redução da semivida em plasma dos lipossomas, aumentando enormemente a absorção do lipossoma marcado com asialofetuína pelos hepatócitos. Por outro lado, a acumulação hepática de lipossomas que compreendem 83 derivados de galactosilípidos de tipo ramificado pode ser inibida por meio de uma pré-injecção de asialofetuina (Murahashi et al. , Biol. Pharm. Buli. 20:259 (1997)). Os lipossomas de albumina de soro humano poliaconitilados proporcionam outra abordagem para dirigir lipossomas às células de figado (Kamps et al.r Proc. Nat'lAcad. Sei. USA 94:11681 (1997)). Além disso, Geho, et al., Patente US N° 4.603.044, descrevem um sistema de administração de vesículas de lipossoma dirigidas aos hepatócitos que tem especificidade por receptores hepatobiliares associados a as células metabólicas especializadas do figado.
Numa abordagem mais geral sobre o direccionamento a tecidos, as células alvo são marcadas previamente com anticorpos biotinilados específicos de um ligando expresso pela célula alvo (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)). Após a deleção do anticorpo livre do plasma, administram-se lipossomas conjugados com estreptavidina. Em outra abordagem, os anticorpos dirigidos são ligados directamente com os lipossomas (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)).
As proteínas de TACI-imunoglobulina podem ser encapsuladas nos lipossomas usando técnicas padrão de microencapsulação de proteínas (veja-se, por exemplo, Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson et al., Câncer Res. 50:1853 (1990) e Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving et al. "Preparaiion and Use of Lipossomes in Immunological Studies" em Liposonae Technology, II Edição, Vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef et al., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)). De acordo com o indicado anteriormente, os lipossomas terapeuticamente úteis podem conter uma variedade de componentes. Por exemplo, os lipossomas podem compreender derivados lipídicos de poli(etileno glicol) (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)) . 84
Desenharam-se microesferas de polímeros degradáveis para manter níveis sistémicos elevados de proteínas terapêuticas. As microesferas são preparadas a partir de polímeros degradáveis, tais como poli(lactida-co-glicólido) (PLG), polianidridos, poli(orto-ésteres) , polímeros de acetato de etilvinilo não biodegradáveis, em que as proteínas estão imobilizadas no polímero (Gombotz e Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery" em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos e Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery" em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281:1161 (1998); Put-ney e Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). As nanoesferas revestidas de polietileno glicol (PEG) também podem proporcionar veículos para uma administração intravenosa de proteínas terapêuticas (veja-se, por exemplo, Gref et ai., Pharm. Biotechnol. 10: 167 (1997)). A presente memória descritiva descreve proteínas de TACI-imunoglobulina modificadas quimicamente nas quais o polipéptido está ligado com um polímero, de acordo com o tratado anteriormente.
Os peritos na especialidade podem criar outras formas farmacêuticas, como é mostrado, por exemplo, Ansel e Popovich, "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", V Edição (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), "Remington's Pharmaceutical Sciences", XIX Edição (Mack Publishing Company 1995) e por Ranade e Hollinger, "Drug Delivery Systems" (CRC Press 1996).
Por meio de ilustração, as composições farmacêuticas podem ser fornecidas como um kit que compreende um recipiente que compreende uma proteína de TACI-imunoglobulina. Os polipéptidos terapêuticos podem ser 85 proporcionados em forma de uma solução injectável para uma única ou múltiplas doses, ou em forma de um pó estéril que será reconstituído antes da injecção. Alternativamente, tal kit pode incluir um dispensador de pós secos, um gerador de aerossol líquido ou um nebulizador para a administração de um polipéptido terapêutico. Tal kit pode compreender além disso informação por escrito sobre as indicações e a utilização da composição farmacêutica. Além disso, tal informação pode incluir a afirmação de que a composição de proteína de TACI-imunoglobulina está contra-indicada em pacientes com hipersensibilidade conhecida bem na fracção de receptor de TACI ou na fracção de imunoglobulina. 9. Utilizações terapêuticas das sequências de nucleótidos de TACI-imunoglobulina A presente memória descritiva descreve a utilização de moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas de fusão de TACI e imunoglobulina para proporcionar estas proteínas de fusão a um indivíduo em necessidade de tal tratamento. Para uma utilização terapêutica veterinária ou uma utilização terapêutica humana, podem ser administradas tais moléculas de ácido nucleico a um indivíduo que tenha um distúrbio ou uma doença, de acordo com o tratado anteriormente. Como num exemplo tratado anteriormente, as moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina podem ser usadas para um tratamento a longo prazo do lúpus eritematoso sistémico.
Existem numerosas abordagens para introduzir um gene de TACI-imunoglobulina num indivíduo, incluindo a utilização de células hospedeiras recombinantes que expressam TACI-imunoglobulina, a administração de ácido nucleico nu que codifica TACI-imunoglobulina, a utilização de um veículo lipídico catiónico com uma molécula de ácido nucleico que codifica TACI-imunoglobulina e a utilização de vírus que expressam TACI-imunoglobulina, tais como retrovírus recombinantes, vírus adeno-associados 86 recombinantes, adenovírus recombinantes e vírus do Herpes simples recombinantes (veja-se, por exemplo, Mulligan, Science 260:926 (1993), Rosenberg et al., Science 242:1575 (1988), LaSalle et al., Science 259:988 (1993), Wolff et al, Science 247:1465 (1990), Breakfield e Deluca, The New Biologist 3:203 (1991)). Numa abordagem ex vivo, por exemplo, as células são isoladas de um indivíduo, transfectadas com um vector que expressa um gene de TACI-imunoglobulina e em seguida transplantadas no indivíduo.
Para efectuar a expressão de um gene de TACI-imunoglobulina, construi-se um vector de expressão em que uma sequência de nucleótidos que codifica um gene de TACI-imunoglobulina está ligada operativamente a um promotor central e, opcionalmente, a um elemento regulador para controlar a transcrição do gene. Os requisitos gerais de um vector de expressão foram descritos anteriormente.
Alternativamente, pode ser administrado um gene de TACI-imunoglobulina usando vectores virais recombinantes (por exemplo, Kass-Eisler et al, Proc. Nat'lAcad. Sei. USA 90:11498 (1993), Kolls et al, Proc. NaflAcad. Sei. USA 91:215 (1994), Li et al, Hum. Gene Ther. 4:403 (1993), Vincent et al, Nat. Genet. 5:130 (1993) e Zabner et al., Cell 75:207 (1993)), vectores virais associados a adenovirus (Flotte et al., Proc. Nat'lAcad. Sei. USA 90:10613 (1993)), vírus alfa tais como o vírus do Bosque de Semliki e o vírus Sindbis (Hertz e Huang, J. Vir. 66:857 (1992) , Raju e Huang, J. Vir. 65:2501 (1991) e Xiong et al., Science 243:1188 (1989)), vectores do vírus do Herpes (por exemplo, patentes US N° 4.769.331, 4.859.587, 5.288.641 e 5.328.688), vectores de parvovírus (Koering et al., Hum. Gene Yherap. 5:457 (1994)), vectores do vírus da varíola (Ozaki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193:653 (1993) , Panicali e Paoletti, Proc. Nat'lAcad. Sei. USA 79:4927 (1982)), vírus da varíola, tais como o vírus da varíola de canário ou o vírus Vaccinia (Fisher-Hoch et al., 87
Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 86:317 (1989) e Flexner et al., Ann. N.E. Acad. Sei. 569:86 (1989)) e retrovirus (por exemplo, Baba et al., J. Neurosurg 79:729 (1993), Ram et al., Câncer Res. 53:83 (1993), Takamiya et al., J. Neurosci. Res 33:493 (1992), Vile e Hart, Câncer Res. 53:962 (1993), Vile e Hart, Câncer Res. 53:3860 (1993) e Anderson et al., Patente US N° 5.399.346) . Em diversas formas de realização, pode ser utilizados o próprio vector virai, ou uma partícula virai que contenha o vector virai, nos métodos e as composições descritas a seguir.
Como ilustração de um sistema, o adenovírus, um vírus de ADN de cadeia dupla, é um vector de transferência génica bem caracterizado para a administração de uma molécula de ácido nucleico heteróloga (para mais informação, veja-se Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994); Douglas e Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)) . O sistema de adenovírus oferece várias vantagens que incluem: (i) a capacidade de acomodar insertos de ADN relativamente grandes; (ii) a capacidade de ser desenvolvido até títulos elevados; (iii) a capacidade para infectar uma ampla selecção de tipos de células de mamífero; e (iv) a capacidade para ser usado com promotores muito diferentes, incluindo promotores ubíquos, específicos de um tecido e reguláveis. Além disso, podem ser administrados adenovírus por meio de injecção intravenosa, porque os vírus são estáveis na corrente sanguínea.
Usando vectores de adenovírus em que se deletaram porções do genoma do adenovírus, são incorporados insertos no ADN virai por meio da ligação directa ou por meio da recombinação homóloga com um plasmídeo co-transfectado. Num exemplo de sistema, deleta-se o gene EI essencial do vector virai, e o vírus não será replicado a não ser que o gene EI seja proporcionado pela célula hospedeira. Quando se administra intravenosamente a animais intactos, o adenovírus dirige-se fundamentalmente ao fígado. Embora um sistema de administração adenoviral com a deleção de um gene EI não pode replicar-se nas células hospedeiras, o tecido do hospedeiro expressará e processará uma proteína heteróloga codificada. As células hospedeiras também secretarão a proteína heteróloga se o gene correspondente incluir uma sequência sinal secretora. As proteínas secretadas entrarão em circulação desde o tecido que expressa o gene heterólogo (por exemplo, o fígado muito vascularizado).
Além disso, os vectores adenovirais que contêm diversas deleções de genes virais podem ser usados para reduzir ou eliminar respostas imunes ao vector. Tais adenovírus têm deletados EI e, além disso, contêm deleções de E2A ou E4 (Lusky et al., J. Virol. 72:2022 (1998); Raper et al., Human Gene Therapy 9:671 (1998)). Também foi publicado que a deleção de E2b reduz respostas imunes (Amalfitano et al., J. Virol. 72:926 (1998)). Por meio da deleção de todo o genoma do adenovírus, podem ser acomodados insertos muito longos do ADN heterólogo. A geração dos denominados adenovírus "gutless", em que foram eliminados todos os genes virais, é particularmente vantajosa para a inserção de insertos grandes de ADN heterólogo Yeh. e Perricaudet, FASEBJ. 11:615(1997)).
As reservas de títulos elevados de vírus recombinantes capazes de expressar um gene terapêutico podem ser obtidas a partir de células de mamífero infectadas usando métodos padrão. Por exemplo, pode ser preparado o vírus do Herpes simples em células Vero, de acordo com o descrito por Brandt et al., J. Gene. Virol. 72:2043 (1991), Herold et al. , J. Gene. Virol. 75:1211 (1994), Visalli e Brandt,
Virology 185:419 (1991), Grau et al., Invest. Ophthalmol.
Vis. Sei. 30:2474 (1989), Brandt et al. , J. Virol. Meth. 36:209 (1992) e por Brown e MacLean (eds.), "HSV Vírus
Protocols" (Humana Press 1997). 89
Alternativamente, pode ser introduzido um vector de expressão que compreenda um gene de TACI-imunoglobulina nas células de um indivíduo por meio da lipofecção in vivo usando lipossomas. Podem ser usados lípidos catiónicos sintéticos para preparar lipossomas para a transfecção in vivo de um gene que codifique um marcador (Felgner et al., Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 84:7413 (1987); Mackey et al., Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 85:8027 (1988)). A utilização da lipofecção para introduzir genes exógenos em órgãos específicos in vivo tem certas vantagens práticas. Podem ser usados lipossomas para dirigir a transfecção a determinados tipos de células, o que é particularmente vantajoso num tecido com heterogeneidade celular, tal como o pâncreas, o fígado, o rim e o cérebro. Os lípidos podem ser acoplados quimicamente com outras moléculas a efeitos da direccionamento. Os péptidos dirigidos (por exemplo, as hormonas ou os neuroutransmissores), as proteínas tais como os anticorpos ou as moléculas não peptídicas podem ser acopladas aos lipossomas quimicamente. A electroporação é outro modo alternativo de administração. Por exemplo, Aihara e Miyazaki, Nature Biotechnology 16:867 (1998) demonstraram a utilização de electroporação in vivo para a transferência de genes no músculo.
Geralmente, a dose de uma composição que compreende um vector terapêutico que tem uma sequência de nucleótidos de TACI-imunoglobulina, tal como um vírus recombinante, variará em função de factores tais como a idade, o peso, a altura, o sexo, o estado de saúde geral e a história médica prévia do indivíduo. As vias adequadas de administração de vectores terapêuticos incluem injecção intravenosa, injecção intra-arterial, injecção intraperitoneal, injecção intramuscular, injecção intratumoral e injecção na cavidade que contém um tumor. Por meio de ilustração, Horton et al., Proc. Nat'1 Acad Sei. USA 96:1553 (1999), demonstraram que 90 a injecção intramuscular de ADN plasmídico que codifica interferão (X produz potentes efeitos anti-tumorais sobre os tumores primários e metastáticos num modelo murino.
Pode ser formulada uma composição que compreenda vectores virais, vectores não virais ou uma combinação de vectores virais e não virais de acordo com os métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, por meio dos quais os vectores ou os virus se combinam numa mistura com um veiculo farmaceuticamente aceitável. De acordo com o indicado anteriormente, diz-se que uma composição, tal como uma solução salina tamponada com fosfato, é um "veiculo farmaceuticamente aceitável" se a sua administração puder ser tolerada por um indivíduo receptor. Há outros veículos adequados que são conhecidos pelos peritos na especialidade (veja-se, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", XIX Ed. (Mack Publishing Co. 1995) e "Gilman's the Pharmacological Base of Therapeutics", VII Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)). A efeitos terapêuticos, o vector terapêutico de expressão génica, ou um vírus recombinante que compreende tal vector, e um veículo farmaceuticamente aceitável administram-se a um indivíduo numa quantidade terapeuticamente eficaz. Diz-se que uma combinação de um vector de expressão (ou um vírus) e um veículo farmaceuticamente aceitável administra-se numa "quantidade terapeuticamente eficaz" se a quantidade administrada for fisiologicamente relevante. Um agente é fisiologicamente relevante se a sua presença tiver como resultado uma mudança detectável na fisiologia de um indivíduo receptor. Por exemplo, um agente usado para tratar uma inflamação é fisiologicamente relevante se a sua presença aliviar a resposta inflamatória. Como outro exemplo, um agente usado para inibir o crescimento de células tumorais é fisiologicamente relevante se a administração do agente tiver como resultado uma diminuição do número de células 91 tumorais, uma diminuição da metástase, uma diminuição do tamanho de um tumor sólido ou um aumento da necrose de um tumor.
Quando o indivíduo tratado com um vector terapêutico de expressão génica ou um vírus recombinante é um ser humano, então a terapêutica é, preferivelmente, uma terapêutica de genes em células somáticas. Isto é, o tratamento preferido para um ser humano com um vector terapêutico de expressão génica ou um vírus recombinante não implica introduzir em células uma molécula de ácido nucleico que possa formar parte de uma linha germinal humana e ser transmitida de geração em geração (isto é, terapêutica génica em linha germinal humana). 10. Produção de ratinhos transgénicos É possível desenhar geneticamente ratinhos transgénicos para que sobre-expressem sequências de ácidos nucleicos que codificam as proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina em todos os tecidos, ou sob o controlo de um elemento regulador específico de um tecido ou preferido por um tecido. Estes sobre-produtores das proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina podem ser usados para caracterizar o fenótipo que resulta da sobre-expressão, e os animais transgénicos podem servir como modelos para a doença humana provocada por um excesso da proteína receptora TACI. Os ratinhos transgénicos que sobre-expressam as proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina também proporcionam biorreactores modelo para a produção de proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina em leite ou sangue de animais de maior tamanho. Os métodos para produzir ratinhos transgénicos são conhecidos por aqueles peritos na especialidade (veja-se, por exemplo, Jacob, "Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice" em Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), páginas 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994), Monastersky e Robl (eds.), "Strategies in Transgenic 92
Animal Science" (ASM Press 1995) e Abbud e Nilson, "Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice" em Gene Expression Systems: Using Naturefor the Art of Expression, Fernandez e Hoeffler (eds.), páginas 367-397 (Academic Press, Inc. 1999)).
Por exemplo, pode ser começado um método para gerar um ratinho transgénico que expresse uma sequência de ácido nucleico que codifique uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina com machos férteis adultos (sementais) (B6C3fl, de 2 a 8 meses de idade (Taconic Farms, Germantown, NY)), machos vasectomizados (castrados) (B6D2fl, de 2 a 8 meses, (Taconic Farms)), fêmeas férteis pré-pubescentes (dadores) (B6C3fl, de 4 a 5 semanas, (Taconic Farms)) e fêmeas férteis adultas (receptoras) (B6D2fl, de 2 a 4 meses, (Taconic Farms)). Aclimatam-se os dadores durante uma semana e em seguida se injectam nos mesmos aproximadamente 8 Ul/ratinho de gonadotropina sérica de égua grávida (Sigma Chemical Company; St. Louis, MO) I.P., e 46-47 horas depois, 8 Ul/ratinho de gonadotropina coriónica humana (hCG (Sigma)) I.P. para induzir uma superovulação. Cruzam-se os dadores com os sementais após as injecções de hormonas. A ovulação geralmente ocorre às 13 horas da injecção de hCG. A copulação é confirmada pela presença de um tampão vaginal na manhã seguinte ao cruzamento. São colhidos os óvulos fertilizados sob um microscópio cirúrgico. São colhidos os oviductos e os óvulos são depositados em lâminas porta-objectos para análise de urina que contêm hialuronidase (Sigma). Lavam-se os óvulos uma vez em hialuronidase e duas vezes em meio de Whitten W640 (descrito, por exemplo, por Menino e 0'Claray, Biol. Reprod. 77:159 (1986) e Dienhart e Downs, Zygote 4:129 (1996)) que foi incubado com CO2 a 5 %, O2 a 5 % e N2 a 90 % a 37°C. Então se armazenam os óvulos numa incubadora com CO2 a 5 %/37°C até a microinjecção. 93
Linearizam-se de dez a vinte microgramas de ADN plasmidico que contém uma sequência que codifica a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina, purificam-se em gel e ressuspendem-se em Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), EDTA 0,25 mM (pH 8,0) a uma concentração final de 5-10 nanogramas por microlitro para a microinjecção. Por exemplo, as sequências que codificam a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina podem codificar um polipéptido TACI com a deleção dos resíduos de aminoácidos 1 a 29 e 111 a 154 da SEQ ID NO: 2, e uma fracção de imunoglobulina Fc5.
Microinjecta-se o ADN plasmidico nos óvulos colhidos contidos numa gota de meio W640 coberta por óleo mineral equilibrado com CO2 morno. Extrai-se o ADN com uma agulha para injecção (retirada de um tubo capilar de vidro de borosilicato de 0,75 mm de D.I., 1 mm de D.E.) e injecta-se nos óvulos individuais. Cada óvulo é penetrado com a agulha para injecção até um ou ambos pró-núcleos haplóides.
Injectam-se picolitros de ADN nos pró-núcleos e retira-se a agulha para injecção sem entrar em contacto com os nucléolos. Repete-se o método até que todos os óvulos tenham sido injectados. Transferem-se os óvulos correctamente microinjectados a uma placa de cultura de tecido orgânico com meio W640 pré-gaseifiçado para um armazenamento durante a noite numa incubadora a 37°C/com C02 a 5 %.
Ao dia seguinte, transferem-se os embriões de duas células às receptoras pseudo-grávidas. As receptoras são identificadas pela presença de tampões de copulação após a copulação com os castrados vasectomizados. As receptoras são anestesiadas e rasuradas no lado dorsal esquerdo, e transferidas a um microscópio cirúrgico. Realiza-se uma pequena incisão na pele, atravessando a parede muscular, no centro do área abdominal delimitada pela caixa torácica, a sela e a pata traseira, a meio caminho entre o joelho e o baço. Exteriorizam-se os órgãos reprodutores sobre um 94 pequeno pano cirúrgico. Estende-se a almofada adiposa sobre o pano cirúrgico e une-se uma pinça para vasos pequena (Roboz, Rockville, MD) à almofada adiposa, que deixa-se pendurada sobre a parte traseira do ratinho, evitando que os órgãos voltem a deslizar ao interior.
Com uma pipeta fina de transferência que contém óleo mineral seguido de bolhas alternantes de W640 e ar, transferem-se 12-17 embriões de duas células saudáveis da injecção do dia anterior na receptora. Localiza-se a ampola inchada e une-se o oviducto entre a ampola e a bolsa, faz-se um pequeno corte no oviducto com uma agulha de 28 g cerca da bolsa, sendo assegurado que não rasgue a ampola nem a bolsa.
Transfere-se a pipeta ao corte do oviducto, e colocam-se os embriões soprando, deixando escapar a primeira bolha de ar da pipeta. Pressiona-se suavemente a almofada adiposa no peritoneu e permite-se o deslizamento ao interior dos órgãos reprodutores. Fecha-se a parede peritoneal com uma sutura e fecha-se a pele com uma pinça para feridas. Os ratinhos recuperam-se num aquecedor para lâminas porta-objectos a 37°C durante um mínimo de quatro horas.
Devolvem-se as receptoras às jaulas em pares e permite-se que transcorra os 19-21 dias de gestação. Após o nascimento, deixa-se que passe um período de pós-parto de 19-21 dias antes do desmame. Determina-se o sexo dos animais desmamados, colocam-se em jaulas separadas por sexos e extrai-se uma amostra para biopsia de 0,5 cm da cauda (usada para a genotipificação) com tesouras limpas.
Prepara-se o ADN genómico dos pedaços de cauda usando, por exemplo, um kit DNEASY de QIAGEN seguindo as instruções do fabricante. Analisa-se o ADN genómico por PCR usando iniciadores desenhados para amplificar uma sequência de ácido nucleico que codifique uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina ou um gene marcador seleccionável que foi introduzido no mesmo plasmídeo. Uma vez confirmado que os 95 animais são transgénicos, realiza-se um retrocruzamento com uma estirpe endogámica colocando uma fêmea transgénica com um macho de tipo selvagem ou um macho transgénico com uma ou duas fêmeas de tipo selvagem. À medida que estão a nascer as crias e são desmamadas, separam-se por sexos e corta-se a cauda para a genotipificação.
Para comprovar a expressão de um transgene num animal vivo, realiza-se uma hepatectomia parcial. Prepara-se cirurgicamente o abdómen superior, justo debaixo da apófise xifóide. Usando uma técnica estéril, realiza-se uma pequena incisão de 1,5-2 cm debaixo do esterno e exterioriza-se o lóbulo lateral esquerdo do fígado. Faz-se uma ligadura com seda 4-0 ao redor do lóbulo inferior fixando-o por fora da cavidade corporal. É usada uma pinça atraumática para fixar a ligadura enquanto que coloca-se uma segunda volta de Dexon absorvível (American Cyanamid; Wayne, N.J.) em posição proximal à primeira ligadura. Faz-se um corte distai da ligadura de Dexon e colocam-se aproximadamente 100 mg do tecido de fígado extirpado numa placa Petri estéril. Transfere-se a secção de fígado extraída a um tubo de fundo redondo de polipropileno de 14 ml e congela-se rapidamente em azoto líquido e em seguida se armazena sobre gelo seco. Fecha-se a zona da cirurgia com uma sutura e pinças para fechar feridas, e coloca-se a jaula dos animais sobre uma placa de aquecimento a 37°C durante as 24 horas posteriores à operação. Controla-se o animal diariamente depois da operação e retiram-se as pinças aos 7-10 dias depois da cirurgia. Examina-se o nível de expressão do ARNm da proteína de fusão de TACI-imunoglobulina para cada ratinho transgénico usando uma análise de hibridação de solução de ARN ou por meio da reacção em cadeia da polimerase.
Com a abordagem geral anteriormente descrita, foram produzidos ratinhos transgénicos que expressam níveis relevantes da proteína de fusão de TACI-imunoglobulina no 96 leite. Neste caso em particular, a sequência que codifica a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina codificava um polipéptido TACI com a deleção dos resíduos de aminoácidos 1 a 29 e 111 a 154 da SEQ ID NO: 2, e uma fracção de imunoglobulina Fc5. A presente invenção, descrita assim de maneira geral, será entendida mais facilmente em referência aos seguintes exemplos, que são proporcionados por meio de ilustração e não pretendem ser restritivos da presente invenção. EXEMPLO 1
Construção de moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas de TACI-Fc
As moléculas de ácido nucleico que codificam o TACI humano foram obtidas durante a clonagem e a expressão dos receptores de ZTNF4 de acordo com o descrito por Gross et al. , Nature 404:995 (2000). As sequências codificantes contidas nas construções de expressão de TACI-Fc foram geradas por meio de PCR de sobreposição, usando técnicas padrão (veja-se, por exemplo, Horton et al., Gene 77:61 (1989)). Foram usados ADNc de TACI e ADNc de Fc humanos como moldes iniciais para as amplificações por PCR. Os iniciadores para a PCR foram desenhados para que produzissem as extremidades 5' e 3' desejadas das sequências codificantes e para introduzir os locais de reconhecimento de enzimas de restrição com a finalidade de facilitar a inserção destas sequências codificantes nos vectores de expressão. As sequências codificantes de TACI-Fc foram inseridas nos vectores de expressão que incluíam um gene da dihidrofolato redutase murino funcional. Um vector de expressão também continha um promotor do citomegalovírus para dirigir a expressão do transgene de proteína recombinante, um intrão de imunoglobulina, uma sequência sinal do activador tissular do plasminogénio, uma sequência interna de entrada ao ribossoma, um cistrão de CD8 deletado para a selecção superficial das células 97 transfectadas e elementos de expressão de leveduras para o crescimento do plasmídeo em células de levedura. 0 método usado para construir TACI-Fc4 ilustra uma abordagem que foi usada para produzir as proteínas de fusão de TACI-Fc. Produziram-se outras proteínas de fusão de TACI-Fc por meio da inserção de sequências de nucleótidos que codificavam uma proteína de fusão de TACI-Fc num vector de expressão de mamífero e a introdução desse vector de expressão nas células de mamífero. A. Construção do fragmento Fc4 de Igyl
Para preparar a proteína de fusão de TACI-Fc4, modificou-se a região Fc da IgGl humana (a região de dobradiça e os domínios CH2 e CH3) para eliminar o receptor Fcyl (FcyRI) e as funções de ligação a complementos (Clq). Esta versão modificada da Fc da IgGl humana foi denominada /yFc4".
Isolou-se a região Fc a partir de uma PCR de uma biblioteca de fígados fetais humanos (Clontech), usando os iniciadores de oligo 5' ATCAGCGGAA TTCAGATCTT CAGACAAAAC TCACACATGC CCAC 3' (SEQ ID NO: 7) e 5' GGCAGTCTCT AGATCATTTA CCCGGAGACA GGGAG 3' (SEQ ID NO: 8). As mutações da região Fc foram introduzidas por PCR reduzir a ligação a FcyRI. 0 local de ligação a FcyRI (Leu-Leu-Gly-Gly; resíduos de aminoácidos 38 a 41 de SEQ ID NO: 6, que correspondem às posições do índice EU 234 a 237) foi mutado a Ala-Glu-Gly- Ala para reduzir a ligação a FcyRI (veja-se, por exemplo, Duncan et al., Nature 332:563 (1988); Baum et al., EMBO J. 13:3992 (1994)). Foram usados os iniciadores
de oligonucleótido 5' CCGTGCCCAG CACCTGAAGC C GAGGGGGCA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC C 3' (SEQ ID NO: 9) e 5' GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A 3' (SEQ ID NO: 10) para introduzir a mutação. Adicionaram-se a um volume final de 50 μΐ 570 ng de molde de IgFc, 5 μΐ de 10 x tampão de reacção de Pfu (Stratagene), 8 μΐ de dNTP 1,25 mM, 31 μΐ de água destilada, 2 μΐ de iniciadores de oligonucleótido 20 mM. 98
Adicionou-se um volume igual de óleo mineral e aqueceu-se a reacção até 94°C durante 1 minuto. Adicionou-se a polimerase de Pfu (2,5 unidades, Stratagene) seguida de 25 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 72°C durante 1 minuto seguido de uma prolongação a 72°C durante 7 minutos. Fraccionaram-se os produtos de reacção por meio de electroforese e detectou-se a banda correspondente ao tamanho predito de aproximadamente 676 pares de bases. Extirpou-se esta banda do gel e recuperou-se usando um kit de extracção de gel QIAGEN QIAquickTM (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.
Também se utilizou a PCR para introduzir uma mutação de Ala a Ser (resíduo de aminoácido 134 de SEQ ID NO: 6, que corresponde à posição do índice EU 330) e de Pro a Ser (resíduo de aminoácido 135 de SEQ ID NO: 6, que corresponde à posição do índice EU 331) para reduzir a ligação ao complemento Clq ou a fixação de complementos (Duncan e Winter, Nature 332:788 (1988)). Realizaram-se duas reacções da primeira série usando a sequência de IgFc com o local de ligação com FcyRI mutado como molde. Adicionaram-se a um volume final de 50 μΐ, 1 μΐ de molde de IgFc com o local de ligação com FcyRI mutado, 5 μΐ de 10 x tampão de reacção de Pfu (Stratagene), 8 μΐ de dNTP 1,25 mM, 31 μΐ de água destilada, 2 μΐ de 5' GGTGGCGGCT CCCAGATGGG TCCTGTCCGA GCCCAGATCT TCAGACAAAA CTCAC 3' (SEQ ID NO: 11) 2 0 mM, um iniciador 5' que começa no nucleótido 36 da SEQ ID NO: 5 e 2 μΐ de 5' TGGGAGGGCT TTGTTGGA 3' (SEQ ID NO: 12) 20 mM, um iniciador 3' que começa no complemento do nucleótido 405 de SEQ ID NO: 5. A segunda reacção continha 2 μΐ de cada uma das reservas 20 mM dos iniciadores de oligonucleótido 5' TCCAACAAAG CCCTCCCATC CTCCATCGAG AAAACCATCT CC 3' (SEQ ID NO: 13), um iniciador 5' que começa no nucleótido 388 de SEQ ID NO: 5, e 5' GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG 3' (SEQ ID NO: 14), um iniciador 3', para introduzir a mutação de Ala a Ser , o 99 local de restrição de Xbal e o codão de terminação. Adicionou-se um volume igual de óleo mineral e aqueceram-se as reacções até 94°C durante 1 minuto. Adicionou-se polimerase de Pfu (2,5 unidades, Stratagene) seguida de 25 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 72°C durante 2 minutos seguidos de uma prolongação a 72°C durante 7 minutos. Fraccionaram-se os produtos de reacção por meio de electroforese e detectaram-se bandas correspondentes aos tamanhos preditos de aproximadamente 370 e aproximadamente 395 pares de bases, respectivamente. Extirparam-se as bandas do gel e extrairam-se usando um kit de extracção de gel QIAGEN QIAquickTM (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.
Realizou-se uma reacção da segunda série para unir os fragmentos anteriores e adicionar o local de restrição BamHI de 5' e uma sequência sinal da região variável de cadeia pesada JBL 2' CL da imunoglobulina humana (Cogne et al., Eur. J. Immunol. 18:1485 (1988)). A um volume final de 50 μΐ, adicionaram-se 30 μΐ de água destilada, 8 μΐ de dNTP 1,25 mM, 5 μΐ de 10 x tampão de reacção da polimerase de Pfu (Stratagene) e 1 μΐ de cada um dos dois primeiros produtos da PCR. Adicionou-se um volume igual de óleo mineral e aqueceu-se a reacção até 94°C durante 1 minuto. Adicionou-se polimerase de Pfu (2,5 unidades) seguida de 5 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos e 72°C durante 2 minutos. A temperatura foi levada de novo até 94°C e adicionaram-se 2 μΐ de cada reserva 20 mM de 5' uma GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG 3' (SEQ ID NO: 14), um iniciador 5' que começa no nucleótido 1 de SEQ ID NO: 5, e 5' GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A 3' (SEQ ID NO: 10), seguidos de 25 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos e 72°C durante 2 minutos, e uma prolongação final de 7 minutos a 72°C. Visualizou-se uma porção da reacção usando 100 electroforese em gel. Detectou-se uma banda de 789 pares de bases correspondente ao tamanho predito. B. Construção de vector de expressão de TACI-Fc4
Construíram-se plasmídeos de expressão que compreendiam uma região codificante da proteína de fusão de TACI- Fc4 por meio da recombinação homóloga em levedura. Isolou-se um fragmento de ADNc de TACI usando uma PCR que incluía a sequência polipeptídica desde o nucleótido 14 ao nucleótido 475 de SEQ ID NO: 1. Os dois iniciadores usados na produção do fragmento de TACI foram: (1) um iniciador que continha 40 pares de bases da sequência flanqueadora do vector em 5' e 17 pares de bases correspondentes ao terminal amino do fragmento de TACI (5' CTCAGCCAGG AAATCCATGC CGAGTTGAGA CGCTTCCGTA GAATGAGTGG CCTGGGCCG 3 ' ; SEQ ID NO: 15); (2) 40 pares de bases da extremidade 3' correspondente à sequência Fc4 flanqueadora e 17 pares de bases correspondentes ao terminal carboxilo do fragmento de TACI (5' GCATGTGTGA GTTTTGTCTG AAGATCTGGG CTCCTTCAGC CCCGGGAG 3'; SEQ ID NO: 16) . A um volume final de 100 μΐ adicionaram-se 10 ng do molde de TACI, 10 μΐ de 10 x tampão de reacção da polimerase de Taq (Perkin Elmer) , 8 μΐ de dNTP 2,5 nM, 78 μΐ de água destilada, 2 μΐ de cada uma das reservas 20 mM dos iniciadores de oligonucleótido e polimerase de Taq (2,5 unidades, Life Technology).
Adicionou-se um volume igual de óleo mineral e aqueceu-se a reacção até 94°C durante 2 minutos, seguidos de 25 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos, 72°C durante 1 minuto seguido de uma prolongação a 72°C durante 5 minutos. O fragmento que continha o ADNc codificante do fragmento Fc4 foi construído de uma maneira similar. Os dois iniciadores usados na produção do fragmento Fc4 foram (a montante e a jusante) um iniciador de oligonucleótido que continha 40 pares de bases da sequência flanqueadora 5' de TACI e 17 pares de bases correspondentes ao terminal 101 amino do fragmento Fc4 (5' GCACAGAGGC TCAGAAGCAA GTCCAGCTCT CCCGGGGCTG AAGGAGCCCA GATCTTCAGA 3'; SEQ ID NO: 17); e um iniciador de oligonucleótido que continha 40 pares de bases da extremidade 3' correspondente à sequência flanqueadora do vector e 17 pares de bases correspondentes ao terminal carboxilo do fragmento Fc4 (5' GGGGTGGGTA CAACCCCAGA GCTGTTTTAA TCTAGATTAT TTACCCGGAG ACAGGG 3'; SEQ ID NO: 18). A um volume final de 100 μΐ adicionaram-se 10 ng do molde de Fc4, anteriormente descrito, 10 μΐ de 10 x tampão de reacção da polimerase de Taq (Perkin Elmer) , 8 μΐ de dNTP 2,5 nM, 78 μΐ de água destilada, 2 μΐ de cada uma das reservas 20 mM dos oligonucleótidos e polimerase de Taq (2,5 unidades, Life Technology). Adicionou-se um volume igual de óleo mineral e aqueceu-se a reacção até 94°C durante 2 minutos, seguidos de 25 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos, 72°C durante 1 minuto, seguido de uma prolongação a 72°C durante 5 minutos.
Processaram-se dez microlitros de cada uma das reacções PCR de 100 μΐ descritas anteriormente sobre gel de agarose LMP a 0,8 % (Seaplaque GTG) com 1 x tampão de TBE para análise. Precipitaram-se os 90 μΐ restantes de cada reacção PCR com a adição de 5 μΐ de cloreto de sódio 1M e 250 μΐ de etanol absoluto. Clivou-se o plasmídeo pZMP6 com Smal para lineariza-lo no poliligante. O plasmídeo ρΖΜΡβ foi derivado do plasmídeo pCZR199 (Colecção Americana de Culturas Tipo, Manassas, VA, ATCC N° 98668) e é um vector de expressão de mamífero que contém uma cassete de expressão que tem o promotor precoce imediato do citomegalovírus, um intrão consenso da região variável do locus de cadeia pesada da imunoglobulina de ratinho, múltiplos locais de restrição para a inserção de sequências codificantes, um codão de terminação e um terminador de hormona do crescimento humano. O plasmídeo também tem uma origem de replicação de E. coli, uma unidade de expressão de marcadores seleccionáveis de mamífero que tem um 102 promotor de SV40, um potenciador e uma origem de replicação, um gene da dihidrofolato redutase e o terminador de SV40. 0 vector ρΖΜΡβ foi construído a partir de pCZR199 por meio da substituição do promotor da metalotioneína com o promotor precoce imediato do citomegalovírus e as sequências de Kozac da extremidade 5' do grelha de leitura aberta.
Combinaram-se cem microlitros de células de levedura competentes (S. cerevisiae) com 10 μΐ que continham aproximadamente 1 pg do domínio extracelular de TACI e os fragmentos PCR de Fc4, e 100 ng do vector ρΖΜΡβ digerido por Smal e transferido a uma tina de electroporação de 0,2 cm. Submeteram-se a electroporação as misturas de levedura/ADN a 0,75 kV (5 kV/cm) , °° ohms, 25 pF. Adicionaram-se a cada tina 600 pl de sorbitol 1,2M e colocou-se em placas a levedura em duas alíquotas de 300 pl sobre placas URA-D que se incubaram a 30°C.
Após aproximadamente 48 horas, ressuspenderam-se os transformantes de levedura Ura+ de uma única placa em 1 ml de água e centrifugaram-se brevemente até fazer sedimentar as células de levedura. Ressuspenderam-se os sedimentos celulares em 1 ml de tampão de lise (Triton X-100 a 2 %; SDS a 1 %; NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) . Adicionaram-se quinhentos microlitros da mistura de lise a um tubo Eppendorf que continha 300 pl de pérolas de vidro lavadas em ácido e 200 pl de fenol-clorofórmio, submeteu-se a movimentos vorticiais durante intervalos de 1 minuto duas ou três vezes, seguidos de uma centrifugação de 5 minutos num centrifugador Eppendorf à taxa máxima. Transferiram-se trezentos microlitros da fase aquosa a um tubo limpo, e fez-se precipitar o ADN com 600 pl de etanol, seguindo com uma centrifugação durante 10 minutos a 4°C. Ressuspenderam-se os sedimentos de ADN em 100 pl de água. A transformação das células de E. coli electrocompetentes (DH10B, GibcoBRL) realizou-se com 0,5-2 103 ml de preparaçao de ADN de levedura e 40 μΐ de células DH10B. Electropulsaram-se as células a 2,0 kV, 25 mF e 400 ohms. Após a electroporação, colocaram-se em placas 1 ml de SOC (Bacto-Triptona a 2 % (Difco, Detroit, MI)), extracto de levedura a 2,5 % (Difco), NaCl 10 mM, KC1 2,5 mM; MgCl2 10 mM; MgS04 10 mM, glicose 20 mM) em aliquotas de 250 μΐ sobre quatro placas LB/AMP (Caldo de L.B. (Lennox), Bacto-Agar a 1,8 % (Difco), 100 mg/1 de ampicilina).
Identificaram-se clones individuais que albergavam a construção de expressão correcto para TACI-Fc4 por meio de digestão por restrição para verificar a presença do inserto e para confirmar que diversas sequências de ADN tinham sido ligadas correctamente entre si. Submeteu-se a uma análise sequencial o inserto de clones positivos. Isola-se o ADN plasmidico a grande escala com o kit Qiagen Maxi (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. C. Construção de Fc5, Fc6 e Fc7
Em Fc5, voltou-se a mudar o resíduo de Arg da posição de índice EU 218 por um resíduo de Lys. A Igyl humana de tipo selvagem contém uma lisina nesta posição. De maneira breve, produziram-se moléculas de ácido nucleico que codificavam Fc5 usando os iniciadores de oligonucleótido 5' GAGCCCAAAT C T T CAGACAAAAC T CACA CATGCCCA 3' ( SEQ ID NO: 19) e 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' (SEQ ID NO: 20). As condições para a amplificação por PCR foram as seguintes. A um volume final de 50 μΐ adicionaram-se 236 ng do molde de Fc4, 5 μΐ de 10 x tampão de reacção de Pfu (Stratagene) , 4 μΐ de dNTP 2,5 mM, 1 μΐ de cada um dos oligonucleótidos 20 uM e 1 μΐ de polimerase de Pfu (2,5 unidades, Stratagene). O perfil térmico da amplificação consistiu em 94°C durante 2 minutos, 5 ciclos a 94°C durante 15 segundos, 42°C durante 20 segundos, 72°C durante 45 segundos, 20 ciclos a 94°C durante 15 segundos, 72°C durante 1 minuto e 20 segundos, seguidos de uma prolongação a 72°C durante 7 minutos. Fraccionou-se o produto de 104 reacção por meio de electrof orese em gel de agarose e detectou-se a banda correspondente ao tamanho predito de aproximadamente 718 pares de bases. Extirpou-se a banda do gel e recuperou-se usando um kit de extracção de gel QIAGEN QIAguick (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.
Fc6 é idêntico a Fc5, excepto que o codão de lisina carboxi-terminal foi eliminado. Como nos Fc4 e Fc5 anteriores, o codão de terminação da sequência de Fc6 foi mudado a TAA. Fc6 gerou-se a partir do molde de ADN que codificava Fc5 usando os iniciadores de oligonucleótido 5' GAGCCCAAAT CTTCAGACAA AACTCACACA TGCCCA 3' (SEQ ID NO: 19) e 5' GGCGCGCCTC TAGATTAACC CGGAGACAGG GAGAGGC 3' (SEQ ID NO: 21).
Fc7 é idêntico ao Fc de jl de tipo selvagem, a excepção de uma substituição de um aminoácido situado na posição do índice EU Asn 297 localizada no domínio CH2. Mutou-se Asn-297 a um resíduo de Gin para evitar a ligação do hidrato de carbono ligado a N nessa posição de resíduo. Como antes, o codão de terminação da sequência de Fc7 foi mudado a TAA. Fc7 gerou-se por meio de uma PCR de sobreposição usando ADNc de Fc de IgCyl humana de tipo selvagem como molde e os iniciadores de oligonucleótido 5' GAGCCCAAAT C T T GCGACAAAAC T CACA 3' (SEQ ID NO: 22) e 5' GTACGTGCTTTGGTACTGCTCCTCCCGCGGCTT 3' (SEQ ID NO: 23) para gerar a metade de 5' de Fc7, e os iniciadores de oligonucleótido 5' CAGTACCAAAGCACGTACCGTGTGGTCA 3' (SEQ ID NO: 24) e 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' (SEQ ID NO: 20) para gerar a metade de 3' de Fc7. Os dois produtos da PCR foram combinados e amplificados usando os iniciadores de oligonucleótido 5' GAGCCCAAATCTTGCGACAAAACTCACA 3' (SEQ ID NO: 22) e 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATT TACCCGGAGACA 3' (SEQ ID NO: 20). 105
Todos os produtos resultantes da PCR foram purificados sobre gel, clonados e verificados por meio da análise das sequências de ADN. D. Construção de proteínas de fusão de TACI-Fc amino-truncadas
Geraram-se quatro versões truncadas no terminal amino de TACI-Fc. As quatro tinham uma sequência sinal modificada do activador tissular do plasminogénio humano (SEQ ID NO: 25) fusionada com o resíduo de aminoácido número 30 de SEQ ID NO: 2. No entanto, as quatro proteínas diferiam na localização do ponto em que Fc5 estava fusionado com a sequência de aminoácidos de TACI de SEQ ID NO: 2. O quadro 3 resume as estruturas das quatro proteínas de fusão. QUADRO 3
Proteínas de fusão de TACI Designação de TACI-Fc Resíduos de aminoácidos de TACI TACI(dl-29)-Fc5 30 a 154 de SEQ ID NO: 2 TACI(dl-2 9, dl07-154)-Fc5 30 a 106 de SEQ ID NO: 2 TACI(dl-29, dlll -154)-Fc5 30 a 110 de SEQ ID NO: 2 TACI(dl-29, dl20-154-Fc5 30 a 119 de SEQ ID NO: 2
As cassetes de expressão codificantes das proteínas geraram-se por meio de PCR de sobreposição usando técnicas padrão (veja-se, por exemplo, Horton et al. , Gene 77:61 (1989)). Foram usadas uma molécula de ácido nucleico codificante de TACI e uma molécula de ácido nucleico codificante de Fc5 como moldes para a PCR. Nos quadros 4 e 5, identificam-se os iniciadores de oligonucleótido. 106 QUADRO 4
Iniciadores de oligonucleótido usados para produzir as proteínas de fusão de TACI Designação de TACI-Fc Designações dos oligonucleótidos TACI 5' TACI 3' Fc5 5' Fc5 3' TACI(dl-29)-Fc5 ZC24.903 ZC24.955 ZC2 4.952 ZC24.946 TACI(dl-29, dlO 7-154)-Fc5 ZC24.903 ZC24.951 ZC2 4.949 ZC24.946 TACI(dl-29, dlll-154)-Fc5 ZC24.903 ZC28.978 ZC28.979 ZC2 4.946 TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5 ZC24.903 ZC2 8.981 ZC2 8.980 ZC24.946 QUADRO 5
Sequências dos oligonucleótidos Iniciador Sequência de nucleótidos SEQ ID NO. ZC24.903 5' TATTAGGCCGGCCACCATGGATGCAATGA3' 40 ZC24.955 5' TGAAGATTTGGGCTCCTTGAGACCTGGGA 3' 41 ZC2 4.952 5' TCCCAGGTCTCAAGGAGCCCAAATCTTCA 3' 42 ZC24.946 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' 20 ZC24.951 5' TGAAGATTTGGGCTCGTTCTCACAGAAGTA 3' 43 ZC24.949 5' ATACTTCTGTGAGAACGAGCCCAAATCTTCA 3' 44 ZC28.978 5' TTTGGGCTCGCTCCTGAGCTTGTTCTCACA 3' 45 ZC28.979 5' CTCAGGAGCGAGCCCAAATCTTCAGACA 3' 46 ZC28.981 5' TTTGGGCTCCCTGAGCTCTGGTGGAA 3' 47 ZC28.980 5' GAGCTCAGGGAGCCCAAATCTTCAGACA 3' 48 A primeira série das amplificações por PCR consistiu em duas reacções para cada uma das quatro versões truncadas no terminal amino. As duas reacções foram levadas a cabo em separado usando os oligonucleótidos de TACI 5' e 3' numa reacção, e os oligonucleótidos de Fc5 5' e 3' em outra 107 reacção para cada versão. As condições para a primeira série da amplificação por PCR foram como segue. A um volume final de 25 μΐ adicionaram-se aproximadamente 200 ng do molde de ADN, 2,5 μΐ de 10 x tampão de reacção de Pfu (Stratagene), 2 μΐ de dNTP 2,5 mM, 0,5 μΐ de cada oligonucleótido 5' e oligonucleótido 3' 20 μΜ e 0,5 μΐ de polimerase de Pfu (2,5 unidades, Stratagene). O perfil térmico da amplificação consistiu em 94°C durante 3 minutos, 35 ciclos a 94°C durante 15 segundos, 50°C durante 15 segundos, 72°C durante 2 minutos, seguidos de uma prolongação a 72°C durante 2 minutos. Fraccionaram-se os produtos de reacção por meio de electroforese em gel de agarose e extirparam-se do gel as bandas correspondentes aos tamanhos preditos e recuperaram-se usando um kit de extracção de gel QIAGEN QIAquick (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. A segunda série de amplificação por PCR, ou reacção de amplificação por PCR de sobreposição, realizou-se usando os fragmentos purificados sobre gel da primeira série de PCR como molde de ADN. As condições para a segunda série da amplificação por PCR foram como segue. A um volume final de 25 μΐ adicionaram-se aproximadamente 10 ng do molde de ADN do fragmento de ADN e do fragmento de Fc5, 2,5 pL de 10 x tampão de reacção de Pfu (Stratagene), 2 μΐ de dNTP 2,5 mM, 0,5 μΐ de cada ZC24.903 (SEQ ID NO: 40) e ZC24.946 (SEQ ID NO: 20) 20 μΜ e 0,5 μΐ de polimerase de Pfu (2,5 unidades, Stratagene). O perfil térmico da amplificação consistiu em 94°C durante 1 minutos, 35 ciclos a 94°C durante 15 segundos, 55°C durante 15 segundos, 72°C durante 2 minutos, seguidos de uma prolongação a 72 °C durante 2 minutos. Fraccionaram-se os produtos de reacção por meio de electroforese em gel de agarose, e extirparam-se do gel as bandas correspondentes aos tamanhos preditos e recuperaram-se usando um kit de extracção de gel QIAGEN QIAQUICK (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. 108
Clonou-se em separado cada uma das quatro versões dos produtos da PCR de TACI-Fc com o terminal amino truncado usando o kit de clonagem de PCR ZEROBLUNT TOPO de Invitrogen seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. O quadro 6 identifica as sequências de nucleótidos e aminoácidos destes construções de TACI-Fc. QUADRO 6
Sequências das variantes de TACI-Fc Designação de TACI-Fc SEQ ID NOS. Nucleótido Aminoácido TACI(dl-29)-Fc5 49 50 TACI(dl-2 9, dl 0 7-154)-Fc5 51 52 TACI(dl-29, dlll-154)-Fc5 53 54 TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5 55 56
Uma vez verificadas as sequências de nucleótidos, digeriram-se os plasmideos que compreendiam cada uma das quatro versões das fusões de TACI-Fc com o terminal amino truncado com Frei e Asei para libertar os segmentos codificantes dos aminoácidos. Uniram-se os fragmentos de Frel/AscI num vector de expressão de mamífero que continha o promotor do CMV e um segmento poli (A) de SV40. Os vectores de expressão introduziram-se em células de ovário de hamster chinês de acordo com o descrito a seguir. EXEMPLO 2
Produção de proteínas de TACI-Fc por células de ovário de hamster chinês
Foram usadas as construções de expressão de TACI-Fc para transfectar, por meio de electroporação, células DG44 de ovário de hamster chinês (CHO) adaptadas a uma suspensão desenvolvidas em meio livre de proteínas animais (Urlaub et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555 (1986)). As células DG44 CHO carecem de um gene da dihidrof olato redutase 109 funcional devido às deleções em ambas localizações cromossómicas da dihidrofolato redutase. O crescimento das células na presença de concentrações crescentes de metotrexato tem como resultado a amplificação do gene da dihidrofolato redutase e do gene codificado pela proteína recombinante ligada na construção de expressão.
Passaram-se as células DG44 CHO a meio PFCHO (JRH Biosciences, Lenexa, KS), L-glutamina 4 mM (JRH Biosciences) e 1 x suplemento de hipoxantina-timidina (Life Technologis), e incubaram-se as células a 37°C e CO2 a 5 % em balões de agitação Corning a 120 rpm sobre uma plataforma agitadora por rotação. As células foram transfectadas em separado com plasmídeos de expressão linearizados. Para garantir a esterilidade, realizou-se uma única etapa de precipitação em etanol sobre gelo durante 25 minutos por meio da combinação de 200 pg de ADN plasmídico num tubo Eppendorf com 20 μΐ de ADN veículo de esperma de salmão triturado (5' —>3' Inc. Boulder, CO, 10 mg/ml) , 22 μΐ de NaOAc 3M (pH 5,2) e 484 μΐ de etanol a 100 % (Gold Shield Chemical Co., Hayward, CA). Após a incubação, centrifugou-se o tubo a 14.000 rpm num microcentrifugador colocado numa sala fria a 4°C, retirou-se o sobrenadante e lavaram-se os sedimentos duas vezes com 0,5 ml de etanol a 70 % e deixaram-se secar ao ar.
As células DG44 CHO foram preparadas enquanto se secavam os sedimentos de ADN por meio da centrifugação de 106 células totais (16,5 ml) num tubo de centrifugação cónica de 25 ml a 900 rpm durante 5 minutos. Ressuspenderam-se as células DG44 CHO num volume total de 300 μΐ de meio de crescimento PFCHO e colocaram-se numa tina para Gene-Pulser com um espaço de eléctrodo de 0,4 cm (Bio-Rad). Ressuspendeu-se o ADN, após um tempo de secagem de aproximadamente 50 minutos, em 500 μΐ de meio de crescimento PFCHO e adicionaram-se as células à tina tal que o volume total não superasse os 800 μΐ, e deixou-se 110 repousar a temperatura ambiente durante 5 minutos para diminuir a formação de bolhas. Colocou-se a tina numa unidade II do electroporador Gene Pulser de BioRad configurado a 0,296 kV (quilovoltios) e 0,950 de AC (Alta Capacidade) e realizou-se imediatamente a electroporação.
Incubaram-se as células durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de colocar as mesmas num volume total de 20 ml de meios PFCHO num balão T-75 de CoStar. Colocou-se o balão a 37°C e C02 a 5 % durante 48 horas, em seguida contaram-se as células com um hemocitómetro utilizando a exclusão com azul de tripano e colocaram-se em meios de selecção PFCHO sem suplemento de hipoxantina-timidina e que continham metotrexato 200 mM (Cal Biochem).
Após a recuperação do método de selecção em metotrexato, examinaram-se os meios condicionados que continham proteínas de TACI-Fc secretadas por meio de análise de Western blot. EXEMPLO 3
Análise estrutural das proteínas de TACI-Fc
Em certos casos, purificaram-se parcialmente as proteínas de fusão de TACI-Fc antes da análise. Filtrou-se de forma estéril o meio condicionado das culturas de ovário de hamster chinês através de um filtro de 0,22 um e capturou-se a proteína de TACI-Fc sobre uma coluna de proteína A. Eluiu-se o material ligado à proteína A e passou-se a uma coluna de exclusão por tamanho S-200 para a purificação final.
Realizou-se uma análise de Western blot tanto no meio celular condicionado como na proteína purificada para avaliar a estabilidade estrutural das proteínas de TACI-Fc. De maneira breve, transferiram-se amostras de proteína ou de sobrenadante a membranas de nitrocelulose e detectaram-se as proteínas de TACI-Fc usando IgG2a de cabra anti-ratinho conjugada com peroxidase (Boehringer Mannheim) ou 111 antissoros específicos da Fc da IgG de cabra anti-humana conjugada com peroxidase (Pierce).
Realizaram-se análise das sequências de aminoácidos amino-terminais sobre os sistemas sequenciadores de proteínas modelo 476A e 494 da Divisão de Applied Biosystems de Perkin Elmer (Foster City, CA). A análise de dados foi realizada com o sistema de análise de dados modelo 610A de Applied Biosystems para a sequenciação de proteínas, versão 2.1a (Applied Biosystems, Inc.). A maioria dos fornecimentos e os reagentes usados eram de Applied Biosystems, Inc. EXEMPLO 4
Análise funcional das proteínas de TACI-Fc
Foram usadas duas abordagens para examinar as características de ligação para quatro proteínas de TACI-Fc com ZTNF4. Uma abordagem mediu a capacidade das construções de TACI-Fc para competir com as placas revestidas de TACI na ligação de ZTNF4 marcado com 125I. Na segunda abordagem, incubaram-se concentrações crescentes de ZTNF4 marcado com 1 oc I com cada construção de TACI-Fc, e determinou-se a radioactividade associada aos complexos de ZTNF4-TACI-Fc precipitados. As proteínas de fusão de TACI-Fc tinham fracções de TACI que careciam dos primeiros 29 resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Uma das proteínas de fusão tinha uma fracção de TACI com uma região do talo intacta (TACI (dl-29)-Fc5), enquanto que três das proteínas de fusão de TACI-Fc tinham fracções de TACI com diversas deleções na região do talo (TACI (dl-29, dl07-154)-Fc5; TACI (dl-29, dlll- 154)-Fc5; TACI (dl-29, dl20-154)-Fc5). A. Ensaio de ligação competitiva
Radioiodou-se ZTNF4 com pérolas de iodo (Pierce) de acordo com os métodos padrão. De maneira breve, iodaram-se 50 pg do ZTNF4 com 4 mCi de 125I usando uma única pérola de iodo. Deteve-se a reacção com uma solução a 0,25 % de 112 albumina de soro bovino e retirou-se 125I livre por meio de filtração sobre gel usando uma coluna PD-10 (Pierce). Determinou-se a radioactividade específica das preparações de 125I-ZTNF4 por meio de precipitação em ácido tricloroacético antes e depois da etapa de dessalinização.
Adicionou-se um fragmento N-terminal do receptor de TACI, denominado "TACI-N" a placas de 96 poços (100 μΐ a 0,1 pg/ml) e incubaram-se durante a noite a 4°C. Lavaram-se as placas, bloquearam-se com Superblock (Pierce) e lavaram-se de novo. Misturaram-se as construções de TACI-Fc, a diversas concentrações que variavam de 0 a 11,5 ng/ml, com uma concentração fixa de 125I-ZTNF4 (20 ng/ml) e incubaram-se durante 2 horas a 37°C sobre a placa revestida com TACI-N. Os controlos continham TACI-N em solução ou careciam de TACI-Fc. Após a incubação, lavaram-se as placas e realizou-se a contagem. Cada determinação realizou-se por triplicado.
Os resultados mostraram que todos as construções de TACI-Fc inibiram a ligação de 125I-ZTNF4 completamente a concentrações de aproximadamente 100 ng/ml ou superiores. As proteínas de TACI-Fc, TACI (dl-29)-Fc5, TACI (dl- 29, dlll-154)-Fc5 e TACI (dl-29, dl20-154)-Fc5 foram inibidores mais eficazes que a construção de TACI-Fc, TACI (dl-29, dl07-154-Fc5. Um fragmento Fc em separado não inibiu a ligação. Calcularam-se os valores de CI50 para cada construção em três experimentos. Os valores meios para as construções foram: TACI (dl-29)-Fc5: 2,07 nM; TACI (dl-29, dl07-154) -Fc5: 4,95 nM; TACI (dl-29, dlll-154) Fc5: 2,31 nM; e TACI (dl-29, dl20-154)-Fc5: 2,21 nM. B. Ensaio de ligação em solução
Incubou-se uma concentração de 0,05 nM de cada construção de TACI-Fc com 0,4 pM a 1,5 nM de 125I-ZTNF4 durante 30 minutos a temperatura ambiente num volume total de 0,25 ml/tubo. Adicionou-se uma suspensão de Pansorbina (Staph A) a cada tubo e, após 15 minutos, centrifugaram-se 113 as amostras, lavaram-se duas vezes e realizou-se a contagem dos sedimentos. Determinou-se a ligação não especifica por meio da adição de ZTNF4 sem marcar 130 nM à mistura de 125I-ZTNF4/TACI-Fc. Calculou-se a ligação especifica por meio da subtracção de cpm ligada na presença de ZTNF4 sem marcar da cpm ligada total a cada concentração de 125I-ZINF4. Cada determinação realizou-se por triplicado. Calcularam-se as constantes de ligação usando o software GraphPad Prism (Macintosh v. 3.0). A figura 4 ilustra a ligação especifica de 125I-ZTNF4 com os diversas construções de TACI-Fc. A ligação pareceu aproximar à saturação com cada construção, e foi significativamente superior para as construções TACI (dl-29)- Fc5, TACI (dl-29, dlll-154-Fc5, TACI (dl-29, dl20-154-Fc5, em comparação com a ligação de TACI (dl-29, dl07- 154-Fc5. Calcularam-se os valores de Bmax e Kd, e no guadro 7 sumarizam-se os resultados. QUADRO 7
Ligação de 125I-ZTNF4 com as construções de TACI-Fc Construção de TACI-Fc Kd (nM) Bmax (M) TACI (dl-29)-Fc5 0, 134 0, 023 TACI (dl-29, dl07-154)-Fc5 0, 121 0,010 TACI (dl-29, dl11-15 4)-Fc5 0, 115 0, 018 TACI (dl-29, dl20-154)-Fc5 0, 092 0, 021 EXEMPLO 5
Medição do ZTNF2 circulante
Determinaram-se os níveis de ZTNF4 nos indivíduos com uma afecção patológica (tal como o LES, a artrite reumatóide, por exemplo) em comparação com indivíduos normais usando uma análise de electroquimioluminescência. Preparou-se uma curva padrão a partir de ZTNF4 humano solúvel a 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml e 0 ng/ml em tampão ORIGIN (Igen, Gaithersburg, MD) . Diluíram- 114 se as amostras de soro em tampão ORIGIN. Incubaram-se os padrões e as amostras a temperatura ambiente durante duas horas com anticorpo anti-ZTNF4-NF BV humano de coelho biotinilado diluído até 1 ug/ml em tampão para análise Origin (IGEN) e anticorpo policlonal anti-ZTNF4- NF BV humano de coelho rutenilado diluído até 1 ug/ml em tampão para análise Origin (IGEN). Após a incubação, submeteram-se as amostras a movimentos vorticiais e adicionaram-se 0,4 mg/ml de pérolas Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega) de estreptavidina a cada padrão e cada mostra a 50 μΐ/tubo, e incubaram-se durante 30 minutos a temperatura ambiente. Então foram submetidas as amostras a movimentos vorticiais e lidas sobre um analisador Origin (Igen) de acordo com as instruções do fabricante. A análise Origin baseia-se na electroquimioluminescência e produz uma leitura em ECL. Num estudo, detectou-se um nível elevado de ZTNF4 nas amostras de soro de ratinhos tanto NZBWF1/J como MRL/Mpj-Faslpr, o que progrediu até estágios avançados de glomerulonefrite e doença auto-imune. A análise ORIGIN também se utilizou para medir os níveis de ZTNF4 no sangue de pacientes de LES, em comparação com os níveis de circulação em indivíduos normais. Preparou-se uma curva padrão a partir de ZTNF4 humano solúvel a 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml e 0 ng/ml em tampão ORIGIN (Igen). Todas as amostras dos pacientes foram processadas por triplicado com um volume final de 25 μΐ. Incubaram-se os padrões e as amostras a temperatura ambiente durante duas horas com anticorpo de captura, anticorpo policlonal antÍ-ZTNF4-NF BV humano de coelho biotinilado diluído até 1 pg/ml em tampão para análise Origin (IGEN) e um anticorpo de detecção, anticorpo policlonal antÍ-ZTNF4-NF BV humano de coelho rutenilado diluído até 1 ug/ml em tampão para análise Origin (IGEN). Após a incubação, submeteram-se as amostras a movimentos vorticiais e adicionaram-se 0,4 mg/ml de pérolas Dynabeads 115 (Dynal) de estreptavidina a cada padrão e cada mostra a 50 μΐ/tubo, e incubaram-se durante 30 minutos a temperatura ambiente. Então foram submetidas as amostras a movimentos vorticiais e analisadas sobre um analisador 1,5 Origin (Igen) de acordo com as instruções do fabricante.
Esta análise incluía 28 amostras de controlo normais e amostras de 20 pacientes diagnosticados com LES. Observaram-se níveis elevados de ZTNF4 no soro dos pacientes diagnosticados com LES, em comparação com os dadores de soro de controlo normal. Os níveis de ZTNF4 calcularam-se como um aumento dos níveis de ZTNF4 no paciente ou as amostras de controlo em comparação com uma amostra de soro humano de referência arbitrária. A média das 28 amostras de controlo foi de 1,36 vezes contra a amostra de referência humana e a média das 20 amostras dos pacientes de LES foi de 4,92. Sete dos 20 pacientes de LES tinham níveis de ZTNF4 que eram duas vezes a média das amostras de controlo, enquanto que somente houve um indivíduo de controlo que apresentou um nível de mais que o dobro da média de controlo. A memória descritiva descreve a forma de realização EI a forma de realização E44, a seguir: EI. A utilização de uma proteína de fusão de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI)-imunoglobulina para o fabrico de um medicamento para inibir a proliferação de células tumorais, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina compreende: (a) uma fracção de receptor de TACI que consiste num fragmento de um polipéptido que tem a sequência de aminoácidos de resíduos de aminoácidos 30 a 154 de SEQ ID NO: 2, em que a fracção de receptor de TACI compreende pelo menos um de (i) resíduos de aminoácidos 34 a 66 de SEQ ID NO: 2, e (ii) resíduos de aminoácidos 71 a 104 de 116 SEQ ID NO: 2, e em que a fracção de receptor de TACI se liga a pelo menos um de ZTNF2 ou ZTNF4, e (b) uma fracção de imunoglobulina que compreende uma região constante de uma imunoglobulina. E2. A utilização de E 1, em que a fracção de receptor de TACI compreende resíduos de aminoácidos 34 a 66 de SEQ ID NO: 2, e resíduos de aminoácidos 71 a 104 de SEQ ID NO: 2. E3. A utilização de E 1, em que a fracção de receptor de TACI compreende resíduos de aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID NO: 2. E4. A utilização de E 1, em que a fracção de receptor de TACI tem a sequência de aminoácidos de resíduos de aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID NO: 2 E5. A utilização de E 1, em que a fracção de imunoglobulina compreende uma região constante de cadeia pesada. E6. A utilização de E 5, em que a fracção de imunoglobulina compreende uma região constante de cadeia pesada humana. E7. A utilização de E 6, em que a região constante de cadeia pesada é uma região constante de cadeia pesada de IgGl. E8. A utilização de E 7, em que a fracção de imunoglobulina é um fragmento Fc de IgGl que compreende os domínios CH2, e
Ch3 · E9. A utilização de E 8, em que a fracção de imunoglobulina é um fragmento Fc de IgGl que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:33. E10. A utilização de E 9, em que proteína de fusão de TACI-imunoglobulina tem uma sequência de aminoácidos que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:54.
Eli. A utilização de E 1, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina é um dímero. E12. A utilização de E 1, em que a composição é administrada a células cultivadas in vitro. E13. A utilização de E 1, em que a composição é uma composição farmacêutica que compreende a proteína de fusão 117 de TACI-imunoglobulina e um veículo farmaceuticamente aceitável, e em que a composição farmacêutica é administrada a um indivíduo mamífero, que tem um tumor. EI4. A utilização de E 13, em que a administração da composição farmacêutica inibe a proliferação de linfócitos B no indivíduo mamífero. E15. A utilização de uma proteína de fusão de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI)-imunoglobulina para o fabrico de um medicamento para inibir a proliferação de células tumorais num indivíduo mamífero, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina tem uma sequência de aminoácidos que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:54. E16. A utilização de E 15, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina é um dímero. EI7. Uma proteína de fusão que compreende: (a) uma fracção de receptor de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI), em que a fracção de receptor de TACI consiste num fragmento de um polipéptido que tem a sequência de aminoácidos de resíduos de aminoácidos 30 a 154 de SEQ ID NO: 2, em que a fracção de receptor de TACI compreende pelo menos um de (i) resíduos de aminoácidos 34 a 66 de SEQ ID NO: 2, e (ii) resíduos de aminoácidos 71 a 104 de SEQ ID NO: 2, e em que a fracção de receptor de TACI se liga a pelo menos um de ZTNF2 ou ZTNF4, e (b) uma fracção de imunoglobulina que compreende uma região constante de uma imunoglobulina. E18. A proteína de fusão de E 17, em que a fracção de receptor de TACI compreende resíduos de aminoácidos 34 a 66 de SEQ ID NO: 2, e resíduos de aminoácidos 71 a 104 de SEQ ID NO: 2. E19. A proteína de fusão de E 17, em que a fracção de receptor de TACI compreende resíduos de aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID NO: 2. 118 E20. A proteína de fusão de E 17, em que a fracção de receptor de TACI tem a sequência de aminoácidos de resíduos de aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID NO: 2 E21. A proteína de fusão de E 17, em que a fracçao de imunoglobulina compreende uma região constante de cadeia pesada. E22. A proteína de fusão de E 21, em que a fracçao de imunoglobulina compreende uma região constante de cadeia pesada humana. E23. A proteína de fusão de E 22, em que a região constante de cadeia pesada é uma região constante de cadeia pesada de IgGl. E24. A proteína de fusão de E 23, em que a fracção de imunoglobulina é um fragmento Fc de IgGl que compreende CH21 e CH3 domínios. E25. A proteína de fusão de E 24, em que a fracçao de imunoglobulina é um fragmento Fc de IgGl que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33. E26. A proteína de fusão de E 25, em que proteína de fusão de TACI-imunoglobulina tem uma sequência de aminoácidos que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54. E27. A proteína de fusão de E 17, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina é um dímero. E28. Uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão de E 17. E29. A molécula de ácido nucleico de E 28, em que a molécula de ácido nucleico tem uma sequência de nucleótidos que compreende a sequência de nucleótidos de SEQ ID NO: 53. E30. Uma composição farmacêutica, que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma proteína de fusão de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI)-imunoglobulina, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina tem uma sequência de aminoácidos que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54. 119 Ε31. A composição farmacêutica de E 30, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina é um dímero. E32. A utilização de uma proteína de fusão de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI)-imunoglobulina para o fabrico de um medicamento para reduzir níveis de sangue circulante de ZTNF4 num indivíduo mamífero, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina compreende: (a) uma fracção de receptor de TACI que consiste num fragmento de um polipéptido que tem a sequência de aminoácidos de resíduos de aminoácidos 30 a 154 de SEQ ID NO: 2, em que a fracção de receptor de TACI compreende pelo menos um de (i) resíduos de aminoácidos 34 a 66 de SEQ ID NO: 2, e (ii) resíduos de aminoácidos 71 a 104 de SEQ ID NO: 2, e em que a fracção de receptor de TACI se liga a ZTNF4, e (b) uma fracção de imunoglobulina que compreende uma região constante de uma imunoglobulina. E33. A utilização de E 32, em que a fracção de receptor de TACI compreende resíduos de aminoácidos 34 a 66 de SEQ ID NO: 2, e resíduos de aminoácidos 71 a 104 de SEQ ID NO: 2. E34. A utilização de E 32, em que a fracção de receptor de TACI compreende resíduos de aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID NO: 2 . E35. A utilização de E 32, em que a fracção de receptor de TACI tem a sequência de aminoácidos de resíduos de aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID NO: 2 E36. A utilização de E 32, em que a fracção de imunoglobulina compreende uma região constante de cadeia pesada. E37. A utilização de E 36, em que a fracção de imunoglobulina compreende uma região constante de cadeia pesada humana. 120 Ε38. A utilização de E 37, em que a região constante de cadeia pesada é uma região constante de cadeia pesada de IgGl. E39. A utilização de E 38, em que a fracção de imunoglobulina é um fragmento Fc de IgGl que compreende CH2r e CH3 domínios. E40. A utilização de E 39, em que a fracção de imunoglobulina é um fragmento Fc de IgGl que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:33. E41. A utilização de E 40, em que TACT-imunoglobulina proteína de fusão tem uma sequência de aminoácidos que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:54. E42. A utilização de E 32, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina é um dímero. E43. A utilização de uma proteína de fusão de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI)-imunoglobulina para o fabrico de um medicamento, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina tem uma sequência de aminoácidos que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:54. E44. A utilização de E 43, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina é um dímero. 121 LISTA DE SEQUÊNCIAS [0272] <110> ZymoGenetics, Inc.
<120> PROTEÍNAS DE FUSÃO DE TACI-IMUNOGLOBULINA
<13 0> 01-20PC <150> 60/293,343 <151> 2001-05-24 <160> 70
<170> FastSEQ para Windows Versão 3.0 <210> 1 <211> 1377 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (14)...(892) <400> 1 agcatcctga gta atg agt ggc ctg ggc cgg age agg cga ggt ggc cgg 49
Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg 1 S-χο age cgt gtg gac cag gag gag ege ttt cca cag ggc ctg tgg acg ggg 97
Ser Arg Vai Asp Gin Glu Glu Arg Phe Pro Gin Gly Leu Trp Thr Gly 15 20 25 gtg gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag tac tgg gat cct ctg ctg 145
Val Ala Net Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro Leu Leu 30 35 40 ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc aac cat cag age cag ege 193
Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gin Ser Gin Arg 122 acc tgt TL „ p.._ gea gee ttc tgc agg tea etc age tgc ege aag gag caa ggc 241 Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gin Gly 65 70 75 aag ttc tat gac cat etc ctg agg gac tgc ate age tgt gee tcc ate 289 Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys 11e Ser Cys Ala Ser Ile 80 85 90 tgt gga cag cac cct aag caa tgt gea tac ttc tgt gag aac aag etc 337 Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu 95 100 105 agg age cca gtg aac ctt cca cca gag etc agg aga cag cgg agt gga 385 Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gin Arg Ser Gly 110 115 120 gaa gtt gaa aac aat tea gac aac teg gga agg tac caa gga ttg gag 433 Glu Vai Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gin Gly Leu Glu 125 130 135 140 cac aga ggc tea gaa gea agt cca gct etc ccg ggg ctg aag ctg agt 481 His Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser 145 150 155 gea gat cag gtg gee ctg gtc tac age acg ctg ggg etc tgc ctg tgt 529 Ala Asp Gin Val Ala Leu Val Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys 160 165 170 gee gtc etc tgc tgc ttc ctg gtg gcg gtg gee tgc ttc etc aag aag 577 Ala Vai Leu Cys Cys Phe Leu Val Ala Val Ala Cys Phe Leu Lys Lys 175 180 185 agg ggg gat ccc tgc tcc tgc cag ccc ege tea agg ccc cgt caa agt 625 Arg Gly Asp Pro Cys Ser Cys Gin Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gin Ser 190 195 200 ccg gee aag tet tcc cag gat cac gcg atg gaa gee ggc age cct gtg 673 Pro Ala Lys Ser Ser Gin Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Val 205 210 215 220 age aca tcc ccc gag cca gtg gag acc tgc age ttc tgc ttc cct gag 721 Ser Thr Ser Pro Glu Pro val Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu • 225 230 235 123 tgc agg gcg ccc acg cag gag age gea Cys Arg Ala Pro Thr Gin Glu Ser Ala 240 • 245 ccc act tgt gct gga agg tgg ggg tgc Pro Thr Cys Ala Giy Arg Trp Gly Cys 255 260 cag cct tgc cca cac ate cca gac agt Gin Pro Cys Pro His Ile Pro Asp Ser 270 275 cct gcc cag gag ggg ggc cca ggt gea Pro Ala Gin Glu Giy Gly Pro Gly Ala 285 290 gtc acg cct ggg acc ccc gac 769 Vai Thr Pro Gly Thr Pro Asp 250 cac acc agg acc aca gtc ctg 817 His Thr Arg Thr Thr Vai Leu 265 ggc ctt ggc att gtg tgt gtg 865 Gly Leu Gly Ile Vai Cys Vai 280 taaatggggg tcagggaggg 912 aaaggaggag ggagagagat ggagaggagg ggagagagaa agagaggtgg ggagagggga 972 gagagatatg aggagagaga gacagaggag gcagaaaggg agagaaacag aggagacaga 1032 gagggagaga gagacagagg gagagagaga cagaggggaa gagaggcaga gagggaaaga 1092 ggcagagaag gaaagagaca ggcagagaag gagagaggca gagagggaga gaggcagaga 1152 gggagagagg cagagagaca gagagggaga gagggacaga gagagataga gcaggaggtc 1212 ggggcactct gagtcccagt tcccagtgca gctgtaggtc gtcatcacct aaccacacgt 1272 gcaataaagt cctcgtgcct gctgctcaca gcccccgaga gcccctcctc ctggagaata 1332 aaacctttgg cagctgccct tcctcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1377
<210> 2 <211> 293 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 124
Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Vai Asp 1 5 10 15 Gin Glu Glu Arg Phe Pro Gin Gly Leu Trp Thr Gly Vai Ala Met Arg 20 25 30 Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met 35 40 45 Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gin Ser Gin Arg Thr Cys Ala Ala 50 55 60 Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe Tyr Asp 65 70 75 80
His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gin His 85 90 95 Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro Vai 100 105 110 Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gin Arg Ser Gly Glu Vai Glu Asn 115 120 125 Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gin Gly Leu Glu His Arg Gly Ser 130 135 140 Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp Gin Va-1 145 150 155 160 Ala Leu Vai Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys Ala Vai Leu Cys 165 170 175 Cys Phe Leu Vai Ala Vai Ala Cys Phe Leu Lys Lys Arg Gly Asp Pro 180 185 190 Cys Ser Cys Gin Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gin Ser Pro Ala Lys Ser 195 200 205 Ser Gin Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Vai Ser Thr Ser Pro 210 215 220 Glu Pro Vai Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Cys Arg Ala Pro 225 230 235 240 Thr Gin Glu Ser Ala Vai Thr Pro Gly Thr Pro Asp Pro Thr Cys Ala 245 250 255 Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Vai Leu Gin Pro Cys Pro 260 265 270 His Ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly Ile Vai Cys Vai Pro Ala Gin Glu 275 280 285
Gly Gly Pro Gly Ala 290 <210> 3 125
<211> 285 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 3
Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gin Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu 15 10 15
Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Vai Ser IIe Leu Pro 20 25 30
Arg Lys Glu Ser Pro Ser Vai Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu 35 40 45 126
Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Vai Vai 50 55 60 Ser Phe Tyr Gin Vai Ala Ala Leu Gin Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg 65 70 75 80 Ala Glu Leu Gin Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly 85 90 95 Ala Pro t Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Vai Thr Ala Gly Leu 100 105 110 Lys íle Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gin Asn 115 120 125 Ser Arg Asn Lys Arg Ala Vai Gin Gly Pro Glu Glu Thr Vai Thr Gin 130 135 140 Asp Cys Leu Gin Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gin Lys 145 150 155 160 Gly Ser Tyr Thr Phe Vai Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser 165 170 175 Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Vai Lys Glu Thr Gly Tyr 180 185 190 Phe Phe 11 e Tyr Gly Gin Vai Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met 195 200 205 Gly His Leu Ile Gin Arg Lys Lys Vai His Vai Phe Gly Asp Glu Leu 210 215 220 Ser Leu Vai Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gin Asn Met Pro Glu Thr Leu 225 230 235 240 Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly 245 250 255 Asp Glu Leu Gin Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gin Ile Ser Leu 260 265 270 Asp Gly Asp Vai Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu 275 280 285
<210> 4 <211> 250 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 127
Met Pro Ala Ser Ser Pro Phe Leu Leu Ala Pro Lys Gly Pro Pro Gly 15 10 15
Asn Met Gly Gly Pro Vai Arg Glu Pro Ala Leu Ser Vai Ala Leu Trp 20 25 30
Leu Ser Trp Gly Ala Ala Leu Gly Ala Vai Ala Cys Ala Met Ala Leu 35 40 45 Leu Thr Gin Gin Thr Glu Leu Gin Ser Leu Arg Arg Glu Vai Ser Arg 50 55 60 Leu Gin Gly Thr Gly Gly Pro Ser Gin Asn Gly Glu Gly Tyr Pro Trp 65 70 75 80 Gin Ser Leu Pro Glu Gin Ser Ser Asp Ala Leu Glu Ala Trp Glu Asn 85 90 95 Gly Glu Arg Ser Arg Lys Arg Arg Ala Vai Leu Thr Gin Lys Gin Lys 100 105 110 Lys Gin His Ser Vai Leu His Leu Vai Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys 115 120 125 Asp Asp Ser Asp Vai Thr Glu Vai Met Trp Gin Pro Ala Leu Arg Arg 130 135 140 Gly Arg Gly Leu Gin Ala Gin Gly Tyr Gly Vai Arg Ile Gin Asp Ala 145 150 155 160 Gly Vai Tyr Leu Leu Tyr Ser Gin Vai Leu Phe Gin Asp Vai Thr Phe 165 170 175 Thr Met Gly Gin Vai Vai Ser Arg Glu Gly Gin Gly Arg Gin Glu Thr 180 185 190 Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr 195 200 205 Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Vai Phe His Leu His Gin Gly Asp Ile 210 215 220 Leu Ser Vai 11 e Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro 225 230 235 ' 240 His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Vai Lys Leu 245 250
<210> 5 <211> 762 <212> ADN <213> Homo Sapiens <220> 128 <221> CDS <222> (7)...(759) <4Ο0> 5 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro 1 5 10 129 aga tgg gtc ctg tcc gag ccc aaa tet tgt gac aaa act cac aca tgc 96 Arg Trp Val Leu Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 15 20 25 30 cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tea gtc ttc ctc 144 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 35 40 45 ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg ate tcc cgg acc cct gag 192 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 50 55 * 60 gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag 240 Vai Thr cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 65 70 75 ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 288 Phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala L^s Thr Lys ÔO 85 90 ccg cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc 336 Pro Arg 61 u Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 95 1Õ0 105 110 acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 384 Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 115 120 125 gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate tcc aaa 432 Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 130 135 140 gcc aaa 999 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 480 Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 145 150 155 cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa 528 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 160 165 170 ggc ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag 576 130
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 175 180 185 190 ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 624 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 195 200 205 tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag 672 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 210 215 220 cag ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 720 Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 225 230 235 cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa tga 762 His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro· Gly Lys 240 245 250
<210> 6 <211> 251 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 6 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 20 25 30 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 35 40 45 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 50 55 60 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 65 70 75 80 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 85 90 95 Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 100 105 110 Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 115 120 125 131
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 11 e Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 130 135 140 Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 145 150 155 160 Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe 165 170 175 Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 180 185 190 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 195 200 205 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 210 215 220 Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 225 230 235 240 Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245 250
<210> 7 <211> 44 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 7
atcagcggaa ttcagatctt cagacaaaac tcacacatgc ccac 44 <210> 8 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 8
ggcagtctct agatcattta cccggagaca gggag 35 <210> 9 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 132 <223> Iniciador de PCR. <400> 9
ccgtgcccag cacctgaagc cgagggggca ccgtcagtct tcctcttccc c 51 <210> 10 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 10
ggattctaga ttatttaccc ggagacaggg a 31 <210> 11 <211> 55 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 11
ggtggcggct cccagatggg tcctgtccga gcccagatct tcagacaaaa ctcac 55 <210> 12 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 12
tgggagggct ttgttgga 18 <210> 13 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 13 133 tccaacaaag ccctcccatc ctccatcgag aaaaccatct cc 42 <210> 14
<211> 57 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 14
ggatggatcc atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcggctc ccagatg 57 <210> 15 <211> 59 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 15
ctcagccagg aaatccatgc cgagttgaga cgcttccgta gaatgagtgg cctgggccg 59 <210> 16 <211> 48 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 16
gcatgtgtga gttttgtctg aagatctggg ctccttcagc cccgggag 48 <210> 17 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 17 134 134 aaggagccca
gcacagaggc tcagaagcaa gtccagctct cccggggctg gatcttcaga 60 <210> 18 <211> 56 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 18 ttacccggag
ggggtgggta caaccccaga gctgttttaa tctagattat acaggg 56 <210> 19 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 19
gagcccaaat cttcagacaa aactcacaca tgccca 36 <210> 20 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 20
taattggcgc gcctctagat tatttacccg gagaca 36 <210> 21 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 21 ggcgcgcctc tagattaacc cggagacagg gagaggc 37 135
<210> 22 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 22
gagcccaaat cttgcgacaa aactcaca 28 <210> 23 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 23
gtacgtgctt tggtactgct cctcccgcgg ctt 33 <210> 24 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 24
cagtaccaaa gcacgtaccg tgtggtca 28 <210> 25 <211> 35 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência lider tPA optimizada. <400> 25 136
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Vai Leu Leu Leu Cys Gly 15 10 15
Ala Vai Phe Vai Ser Leu Ser Gin Glu IIe His Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30
Phe Arg Arg 35 <210> 26 <211> 995 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (219) ... (770 <400> 26 aagactcaaa cttagaaact tgaattagat gtggtattca aatccttacg tgccgcgaag 60 acacagacag cccccgtaag aacccacgaa gcaggcgaag ttcattgttc tcaacattct 120 agctgctctt gctgcatttg ctctggaatt cttgtagaga tattacttgt ccttccaggc 180 tgttctttct gtagctccct tgttttcttt ttgtgatc atg ttg cag atg gct ggg 236
Met Leu Gin Met Ala Gly 1 5 cag tgc tcc caa aat gaa tat ttt gac agt ttg ttg cat gct tgc ata 284
Gin Cys Ser G'n Asn Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu His Ala Cys IIe 10 15 20 cct tgt caa ctt cga tgt tct tct aat act cct cct cta aca tgt cag
Pro Cys Gin Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr Pro Pro Leu Thr Cys Gin 25 30 35 332 137 cgt tat tgt aat gea agt gtg acc aat tea gtg aaa gga acg aat gcg 380 Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Vai Thr Asn Ser Vai Lys Gly Thr Asn Ala 40 45 50 att ctc tgg ade tgt ttg gga ctg age tta ata att tet ttg gea gtt 428 Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu Ile Ile Ser Leu Ala Val 55 60 65 70 ttc gtg cta atg ttt ttg cta agg aag ata age tet gaa cca tta aag 476 Phe Vai Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile Ser Ser Glu Pro Leu Lys 75 80 85 gac gag ttt aaa aac aca gga tea ggt ctc ctg ggc atg gct aac att 524 Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu Leu Gly Met Ala Asn Ile 90 95 100 gac ctg gaa aag age agg act ggt gat gaa att att ctt ccg aga ggc 572 Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu Ile Ile Leu Pro Arg Gly 105 110 115 ctc gag tac acg gtg gaa gaa tgc acc tgt gaa gac tgc ate aag age 620 Leu Glu Tyr Thr Vai Glu Glu Cys Thr Cys Glu Asp Cys Ile Lys Ser 120 125 130 aaa ccg aag gtc gac tet gac cat tgc ttt cca ctc cca gct atg gag 668 Lys Pro Lys Vai Asp Ser Asp His Cys Phe Pro Leu Pro Ala Met Glu 135 140 145 150 gaa ggc gea acc att ctt gtc acc acg aaa acg aat gac tat tgc aag 716 Glu Gly Ala Thr Ile Leu Vai Thr Thr Lys Thr Asn Asp Tyr Cys Lys 155 160 165 age ctg cca gct gct ttg agt gct acg gag ata gag aaa tea att tet 764 Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu Ile Glu Lys Ser Ile Ser 170 175 180 gct agg taattaacca tttcgactcg agcagtgcca ctttaaaaat cttttgtcag 820 Ala Arg aatagatgat gtgtcagatc tctttaggat gactgtattt ttcagttgcc gatacagctt 880 tttgtcctct aactgtggaa actctttatg ttagatatat ttctctaggt tactgttggg 940 agcttaatgg tagaaacttc cttggtttca tgattaaagt cttttttttt cctga 995 138 138 55 135 Cys Ser Gin Asn Glu Tyr Phe Asp Ser 10 15 Cys Gin Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr 25 30 Tyr Cys Asn Ala Ser Vai Thr Asn Ser 40 45 Leu- Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu 60 Vai Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile 75 80 Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu 90 95 Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu 105 110 Glu Tyr Thr Vai Glu Glu Cys Thr Cys 120 125 Pro Lys Vai Asp Ser Asp His Cys Phe 140 Gly Ala Thr Ile Leu Vai Thr Thr Lys 155 160 Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu 170 175 <210> 27 <211> 184 <212> PRT <213> Homo <400> 27
Met Leu Gin 1
Leu Leu His
Pro Pro Leu 35
Vai Lys Gly 50
Ile lie Ser 65
Ser Ser Glu Leu Gly Met
Ile IIe Leu 115
Glu Asp Cys 130
Pro Leu Pro 145
Thr Asn Asp Ile Glu Lys sapiens
Met Ala Gly 5
Ala Cys Ile 20
Thr Cys Gin
Thr Asn Ala
Leu Ala Vai 70
Pro Leu Lys 85
Ala Asn Ile 100
Pro Arg Gly
Ile Lys Ser
Ala Met Glu 150
Tyr Cys Lys 165
Ser Ile Ser 180
Ala Arg
<210> 28 <211> 762 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Fracção de imunoglobulina modificada.
<221> CDS <222> (7)...(759) <400> 28 139 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro 1 5 10 aga tgg gtc ctg tcc gag ccc aga tet tea gac aaa act cac aca tgc 96 Arg Trp Val Leu Ser Glu Pro Arg Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 15 V 20 25 30 cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tea gtc ttc ctc 144 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 35 40 45 ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg ate tcc cgg acc cct gag 192 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 50 55 60 gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag 240 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 65 70 75 ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 288 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys ΛΠ OU 85 90 ccg cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc 336 Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 95 100 105 110 acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 384 Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 115 120 125 gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate tcc aaa 432 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 130 135 140 gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 480 Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 145 150 155 cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa 528 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 160 . 165 170 140 99C ttc tat ccc age gac ate gee gtg gag tgg gag age aat ggg cag 576 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 175 180 185 190 ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 624 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 195 200 205 tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag 672 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 210 215 220 cag ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 720 Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 225 230 235 cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa tga 762 His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 240 245 250
<210> 29 <211> 251 <212> PRT <213> Sequência Artificial <400> 29 141
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Vai Leu Ser Glu Pro Arg Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 20 25 30 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro 35 40 45 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 11 e Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr 50 55 60 Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn 65 70 75 80 Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 85 90 95 Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai 100 105 110 Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser 115 120 125
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 130 135 140 Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 145 150 155 160 Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe 165 170 175 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 180 185 190 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 195 200 205 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 210 215 220 Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 225 230 235 240 Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245 250 <210> 30 <211> 76 2 <212> ADN <213> Sequência Artificia 1 <220> <223> Fracçao de imunoglobul ina mod ifi cada. 142 <221> CDS <222> (7)...(759) <4Ο0> 30 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro 1 5 10 aga tgg gtc ctg tcc gag ccc aga tct tca gac aaa act cac aca tgc Arg Trp Vai Leu Ser Glu Pro Arg Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 15 20 25 30 cca ccg tgc cca gca cct gaa gcc gag ggg gca ccg tca gtc ttc ctc Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Vai Phe Leu 35 40 45 ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg ate tcc cgg acc cct gag 143
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 50 * 55 60 gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag 240 Vai Thr Çys Vai Vai Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 65 70 75 ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 288 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 80 85 90 ccg cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc '336 Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 95 100 105 110 acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 384 Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 115 120 125 gtc tcc aac aaa gcc ctc cca tcc tcc ate gag aaa acc ate tcc aaa 432 Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr Ile Ser Lys 130 135 140 gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 480 Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 145 150 ♦ 155 cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa 528 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 160 165 170 ggc ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat 999 cag 576 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 175 180 185 190 ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 624 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 195 200 205 tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag 672 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 210 215 220 144 cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 720 Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 225 230 235 cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa tga 762 His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 240 245 250
<210> 31 <211> 251 <212> PRT <213> Sequência Artificial <400> 31 145
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Vai Leu Ser Glu Pro Arg Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 20 25 30 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro 35 40 45 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr 50 55 60 Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn 65 70 75 80 Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 85 90 95 61 u Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai 100 105 no Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser 115 120 125 Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 130 135 140 Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 145 150 155 160 Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe 16b 170 175 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 180 185 190 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 195 200 205 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 210 215 220 Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 225 230 235 240 Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245 250
<210> 32 <211> 762 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Fracção de imunoglobulina modificada. 146 <221> CDS <222> (7)...(759) <400> 32 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro * 1 5 10 aga tgg gtc ctg tcc gag ccc aaa tet tea gac aaa act cac aca tgc 96 Arg Trp Vai Leu Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 15 20 25 30 cca ccg tgc cca gca cct gaa gcc gag ggg gca ccg tea gtc ttc ctc 144 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu 35 40 45 ttc ccc cca asa ccc aag gac acc ctc atg ate tcc cgg acc cct gag 192 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 50 55 60 gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag 240 Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 65 70 75 ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 288 Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 80 85 90 ccg cgg 9ag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc 336 147
Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 95 100 105 110 âCC gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 384 Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 115 120 125 gtc tcc aac aaa gcc ctc cca tcc tcc ate 9ag aaa acc ate tcc aaa 432 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 130 135 140 9cc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 480 Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 145 150 155 cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa 528 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 160 165 170 ggc ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag 576 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 11 e Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 175 180 185 190 ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 624 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 195 200 205 tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc acc 9tg gac aag age agg tgg cag 672 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 210 215 220 cag ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 720 Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 22 5 230 235 cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa tga 762 His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 240 245 250
<2l0> 33 <211> 251 <212> PRT 148 <213> Sequência Artificial <400> 33
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Vai Leu Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 20 25 30 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro 35 40 45 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr 50 55 60 Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn 65 70 75 80 Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 85 90 95 Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai 100 105 110 Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser 115 120 125 Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 130 135 140 Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 145 150 155 160 Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe 165 170 175 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 180 185 190 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 195 200 205 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 210 215 220 Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 225 230 235 240 Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245 250
<210> 34 <211> 759 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Fracção de imunoglobulina modificada. 149 <221> CDS <222> (7)...(756) <4Ο0> 34 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc etc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro 1 5 10 aga tgg gtc ctg tcc gag ccc aaa tet tea gac aaa act cac aca tgc 96 Arg Trp Vai Leu Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 15 20 25 30 cca ccg tgc cca gea cct gaa gee gag ggg gea ccg tea gtc ttc etc 144 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu 35 40 45 ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tcc cgg acc cct gag 192 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 50 55 60 gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag 240 Vai Thr Cys Vai Vai Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 65 * 70 75 ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gee aag aca aag 288 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 80 85 90 ccg cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc etc 336 Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 95 100 105 110 acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 384 Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 115 120 125 gtc tcc aac aaa gee etc cca tcc tcc ate gag aaa acc ate tcc aaa 432 Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 11 e Ser Lys 130 135 140 gee aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 480 150
Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 145 150 155 cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa 528 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 160 165 170 99C ttc tat ccc age gac ate gee gtg gag tgg gag age aat ggg cag 576 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 11 e Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 175 180 185 190 ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 624 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 195 200 205 tcc ttc ttc etc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag 672 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 210 215 220 cag ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 720 Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 225 230 235 cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt tga 759 His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 240 245 250
<210> 35 <211> 250 < 212 > PRT <213> Sequência Artificial <400> 35 151
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val AI a Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 val Leu Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 20 25 30 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 35 40 45 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 50 55 60
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 65 70 75 80 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 85 90 95 Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 100 105 110 Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 115 120 125 Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 130 135 140 Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 145 150 155 160 Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 165 170 175 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 180 185 190 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 195 200 205 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 210 215 220 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 225 230 235 240 Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 245 250
<210> 36 <211> 762 <212> ADN <213> Sequência Artificial 152 <220> <223> Fracção de imunoglobulina modificada. <221> CDS <222> (7)...(759) <400> 36 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro 1 5 10 aga tgg gtc ctg tcc gag ccc aaa tct tgc gac aaa act cac aca tgc 96 153
Arg Trp Vai Leu Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 15 20 25 30 cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tea gtc ttc ctc 144 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 35 40 * 45 ttc ccc cca aaa cçc aag gac acc ctc atg ate tcc cgg acc cct gag 192 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 50 55 60 gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag 240 Vai Thr Cys Vai Vai Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 65 70 75 ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 288 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys 80 85 90 ccg cgg gag gag cag tac caa age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc 336 Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Gin Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 95 inn lu v 105 110 acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 384 Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 115 120 125 gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate tcc aaa 432 vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 130 135 140 gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 480 Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 145 150 155 cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa 528 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 160 165 170 ggc ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag 576 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 175 180 185 190 154 ccg gag aac aac tac aag acc acg cet ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 624 Ργο Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly 195 200 205 tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag 672 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin 210 215 220 cag ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 720 Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn 225 230 235 cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa tga 762 His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 240 245 250
<210> 37 <211> 251 <212> PRT <213> Sequência Artificial <4Ο0> 37 155
Met 1 Lys His Leu Trp 5 Phe Phe Leu Vai Leu Ser Glu 20 Pro Lys Ser Cys Cys Pro Ala 35 Pro Glu Leu Leu Gly 40 Pro Lys 50 Pro Lys Asp Thr Leu 55 Met Cys 65 Vai Vai Vai Asp Vai Ser 70 His Trp Tyr Vai Asp Gly 85 Vai Glu Vai Glu Glu Gin Tyr 100 Gin Ser Thr Tyr Leu His Gin 115 Asp Trp Leu Asn Gly 120 Asn Lys 130 Ala Leu Pro Ala Pro 135 Ile Gly 145 Gin Pro Arg Glu Pro Gin 150 Vai
Leu Leu Vai Ala Ala Pro Arg Trp 10 15 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 25 30 Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro 45 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr 60 Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn 75 80 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 90 95 Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai 105 110 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser 125 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 140 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 155 160
Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser 165 Tyr Pro Ser Asp 11 e Ala Vai Glu 180 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 195 200 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 210 215 Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met 225 230 Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 245 <210> 38 <211> 762
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220>
Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe 170 175
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 185 190
Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 205
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 220
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 235 240
Pro Gly Lvs 250 156 <223> Fracçao de imunoglobulina modificada. <221> CDS <222> (7)...(759) <400> 38 48 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc etc ctg ctg gtg gcg gct ccc Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro 1 5 10 aga tgg gtc ctg tcc gag ccc aaa tet tea gac aaa act cac aca tgc Arg Trp Vai Leu Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 15 20 25 30 cca ccg tgc cca gea cct gaa ctc ctg 999 gga ccg tea gtc ttc ctc Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu 35 40 45 ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg ate tcc cgg acc cct gag Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 50 55 60 gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct 9ag gtc aag 96 144 192 240 157
Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 65 70 75 ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 288 Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 80 85 90 ccg cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc 336 Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 95 100 105 110 UVb gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 384 Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 115 120 125 gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate tcc aaa 432 Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 130 135 140 gcc aaa 999 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 480 Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 145 150 155 cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa 528 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 150 165 170 ggc ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag 576 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 175 180 185 190 ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 624 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 195 200 205 tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag 672 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 210 215 220 cag ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 720 Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 225 230 235 158 cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa tga His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 240 245 250 <210> 39 <211> 25! L <212> PRT <213> Sequência Artificial <400> 39 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Vai Leu Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 20 25 30 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro 35 40 45 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr 50 55 60 Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn 65 70 75 80 Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 85 90 95 61 u Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai 100 105 110 Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser 115 120 125 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 130 135 140 Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Va.l Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 145 150 155 160 Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe 165 170 175 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 18G 185 190 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 195 200 205 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 210 215 220 Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 225 230 235 240 Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Prò Gly Lys 245 250 159
<210> 40 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 40
tattaggccg gccaccatgg atgcaatga 29 <210> 41 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 41
tgaagatttg ggctccttga gacctggga 29 <210> 42 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR.
<400> 42 tcccaggtct caaggagccc aaatcttca 29 <210> 43 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR.
<400> 43 tgaagatttg ggctcgttct cacagaagta 30 <210> 44 <211> 31 <212> ADN 160 <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 44
atacttctgt gagaacgagc ccaaatcttc a 31 <210> 45 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 45
tttgggctcg ctcctgagct tgttctcaca 30 <210> 46 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 46
ctcaggagcg agcccaaatc ttcagaca 28 <210> 47 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. <400> 47
tttgggctcc ctgagctctg gtggaa 26 <210> 48 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR. 161 <400> 48
gagctcaggg agcccaaatc ttcagaca 28 <210> 49 <211> 1214 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Proteína de fusão.
<221> CDS <222> (17) ... (1192) <400> 49 tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Vai Leu 1 5 10 teg ctc age cag gaa ate cat gee Ser Leu Ser Gin Glu Ile His Ala 25 atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gla 40 tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys 55 60 gca gee ttc o agg tea ctc age 100 148 196 ctg ctg tgt ggc gee gtc ttc gtt Leu Leu Cys Gly Ala Vai Phe Vai 15 20 gag ttg aga cgc ttc cgt aga gct Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala 30 35 tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr 45 50 aac cat cag age cag cgc acc tgt 244 162
Asn His Gin Ser Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser 65 70 75 tgc ege aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat etc ctg agg gac tgc 292 Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys 80 85 90 ate age tgt gee tec ate tgt gga cag cac cct aag caa tgt gea tac 340 Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr 95 100 105 ttc tgt gag aac aag etc agg age cca gtg aac ctt cca cca gag etc 388 Phe .Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu 110 115 120 agg aga cag cgg agt gga gaa gtt gaa aac aat tea gac aac teg gga 436 Arg Arg Gin Arg Ser Gly Glu Val Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly 125 130 135 140 agg tac caa gga ttg gag cac aga ggc tea gaa gea agt cca gct etc 484 Arg Tyr Gin Gly Leu Glu His Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu 145 i r· λ ίου 155 cca ggt etc aag gag ccc aaa tet tea gac aaa act cac aca tgc cca 532 Pro Gly Leu Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 160 165 170 ccg tgc cca gea cet gaa gee gag ggg gea ccg tea gtc ttc etc ttc 580 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe 175 180 185 ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tcc cgg acc cct gag gtc 628 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 190 195 200 aca tgc gtg 9tg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc 676 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val tys Phe 205 210 215 220 aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gee aag aca aag ccg 724 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 225 230 235 163 cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc acc 772 Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 240 245 250 gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc 820 Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 255 260 265 tcc aac aaa gcc ctc cca tcc tcc ate gag aaa acc ate tcc aaa gcc 868 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 270 275 280 aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg 916 Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 285 290 295 300 gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc 964 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 305 310 315 ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg 1012 Pine Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 320 325 330 gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc 1060 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 335 340 345 ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag 1108 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 350 355 360 ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac 1156 Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 365 370 375 380 tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa taatctagag 1202 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390 gcgcgccaat ta 1214 164
<210> 50 <211> 392 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Proteína de fusão. <400> 50 165
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Vai Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Vai Phe Vai Ser Leu Ser Gin Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30 Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro 35 40 45 Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gin Ser 50 55 60 Gin Arg Thr Cys Ala Ala· Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu 65 70 75 80 Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala 85 90 95 Ser Ile Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn 100 105 110 Lys Leu Arg Ser Pro Vai Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gin Arg 115 120 125 Ser Gly Glu Vai Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gin Gly 130 135 140 Leu Glu His Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys 145 150 155 160 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 165 170 175 Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 180 185 190 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai 195 200 205 Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai 210 215 220 Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 225 230 235 240 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin 245 250 255 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala 260 265 270 16 6
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 275 280 285 Arg 61 u Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 290 295 300 Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 305 310 315 320 Asp 11 e Ala Vai 61 u Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 325 330 335 Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 340 345 350 Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe 355 350 365 Ser Cys Ser Vai Het His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 370 375 380 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390
<210> 51 <211> 1070 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>
<223> Proteína de fusão. <221> CDS <222> (17) . . . (1048) <400> 51 167 tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52 Met Asp Ala Het Lys Arg Gly Leu Cys Cys Vai Leu 1 5 10 ctg ctg tgt ggc gcc gtc ttc gtt tcg ctc age cag gaa ate cat gcc Leu Leu Cys Gly Ala Vai Phe Vai Ser Leu Ser Gin Glu 11 e H1s Ala 15 20 25 gag ttg aga cgc ttc cgt aga gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin 30 35 40 tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc 168
Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys 45 50 55 60 aac cat cag age cag ege acc tgt gea gee ttc tgc agg tea etc age 244 Asn His Gin Ser Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser 65 70 75 tgc ege aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat etc ctg agg gac tgc 292 Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys 80 85 90 ate age tgt gee tcc ate tgt gga cag cac cct aag caa tgt gea tac 340 He Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr ,· 95 100 105 i ttc tgt gag aac gag ccc aaa tet tea gac aaa act cac aca tgc cca 388 Phe Cys Glu Asn Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 110 115 120 ccg tgc cca gea cct gaa gee gag ggg gea ccg tea gtc ttc etc ttc 436 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe 125 130 135 140 ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tcc cgg acc cct gag gtc 484 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 145 150 155 aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc 532 Th r Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 160 165 170 aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gee aag aca aag ccg 680 Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 175 180 185 cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc etc acc 628 Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 190 195 200 gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat 99c aag gag tac aag tgc aag gtc 676 Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 205 210 215 220 169 <210> 52 <211> 34 4 <212> PRT <213> Sequênci; a Artif icial <220> <223> Prote ína de fus ão. <400> 52 tcc aac aaa gcc ctc cca tcc tcc Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser 225 aaa ggg cag ccc cg a gaa cca cag Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 240 gat gag ctg acc aag aac cag gtc Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val 255 260 ttc tat ccc age gac ate gcc gtg Phe Tyr Pro Ser Asp 11 e Ala Val 270 275 gag aac aac tac aag acc acg cct Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 285 290 ttc ttc ctc tac age aag ctc acc Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 305 ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 320 tac a cg cag aag age ctc tcc ctg Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 335 340 gcgcgccaat ta ate gag aaa acc ate tcc aaa gcc 724 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 230 235 gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg 772 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 245 250 age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc 820 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 265 gag tgg gag age aat 999 cag ccg 868 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 280 ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc 916 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 295 300 gtg gac aag age agg tgg cag cag 964 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 310 315 atg cat gag gct ctg cac aac cac 1012 Met His Glu Ala Leu His Asn His 325 330 tet ccg ggt aaa taatctagag 1058 Ser Pro Gly Lys 1070 170
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Vai Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Vai Phe Vai Ser Leu Ser Gin Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30 Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro 35 40 45 Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gin Ser 50 55 60 Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu 65 Glv 70 75 80 61 n Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala 85 90 95 Ser lie Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn 100 105 110 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 115 120 125 Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 130 135 140 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Val Val 145 150 155 160 Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Val 165 170 175 Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr lys Pro Arg Glu Glu Gin 180 185 190 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin 195 200 205 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala 210 215 220 leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 225 230 235 240 Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 245 250 255 Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 260 265 270 Asp 11 e Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 275 280 285 Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 290 295 300 Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 305 310 315 320 Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 325 330 335 171
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340
<210> 53 <211> 1082 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Proteína de fusão.
<221> CDS <222> (17) . . . (1060) <400> 53 172 tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Vai Leu 1 5 10 ctg ctg tgt ggc gee gtc ttc gtt teg ctc age cag gaa ate cat gee 100 Leu Leu Cys Gly Ala Vai Phe Vai Ser Leu Ser Gin Glu Ile His Ala 15 20 25 gag ttg aga ege ttc cgt aga gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag 148 Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin 30 35 40 tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc 196 Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys 45 50 55 60 aac cat cag age cag ege acc tgt gca gee ttc tgc agg tea ctc age 244 Asn His Gin Ser Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser 65 70 75 tgc ege aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat ctc ctg agg gac tgc 292 Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys SO 85 90 ate age tgt gee tcc ate tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac 340 Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr 95 100 105 173 ttc tgt gag aac aag etc agg age gag ccc aaa tet tea gac aaa act 388 Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr 110 115 120 cac aca tgc cca ccg tgc cca gea cct gaa gee gag ggg gea ccg tea 436 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser 125 130 135 140 gtc ttc etc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tcc cgg 484 Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 145 150 155 acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct 532 Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 150 165 170 gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag 9tg cat aat gee 580 Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 175 180 185 aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc 628 Lys Thr Lys Pro Arg Glu .Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 190 195 200 age gtc etc acc gtc ctg cac cag gac tgg Ctg aat ggc aag gag tac 676 Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 205 210 215 220 aag tgc aag gtc tcc aac aaa gee etc cca tcc tcc ate gag aaa acc 724 Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 225 230 235 ate tec aaa gee aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg 772 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 240 245 250 ccc cea tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc 820 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 255 260 265 ctg gtc õaa 99c ttc tat ccc age gac ate gee gtg gag tgg gag age 868 Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 270 275 280 916 174 916 174 aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg oar Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu gQV As D 285 290 295 300 tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag aac Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser 305 310 315 agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat 9ag QCt Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala 320 325 330 ctg cac aac cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 335 340 345 964 1012 1060 1082 taatctagag gcgcgccaat ta
<210> 54 <211> 348 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Proteina de fusão. <400> 54
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Vai Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Vai Phe Vai Ser Leu Ser Gin Glu ile His Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30 Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro 35 40 * 45 Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gin Ser 50 55 60 Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu 65 70 75 80 Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala 85 90 95 Ser Ile Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn 100 105 110 175
Lys Leu Arg Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 115 120 125 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe 130 135 140 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 145 150 155 160 Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro· Glu Val Lys Phe 165 170 175 Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 180 185 190 Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 195 200 205 Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 210 215 220 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 225 230 235 240 Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 245 250 255 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 260 265 270 Phe Tyr Pro Ser Asp 11 e Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 275 280 285 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 290 295 300 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 305 310 315 320 Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 325 330 335 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 345 <210> 55 <211> 1109 <212> ADN <213> <220> Sequência Artificial <223> Proteína de fusão. <221> CDS <222> (17) ... (1090) <400> 55 176 tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Vai Leu 1 5 10 ctg ctg tgt ggc gee gtc ttc gtt teg ctc age cag gaa ate cat gee 100 Leu Leu Cys Gly Ala Vai Phe Vai Ser Leu Ser Gin Glu Ile His Ala 15 20 25 gag ttg aga ege ttc cgt aga gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag 148 Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin 30 35 40 tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc 196 Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys 45 50 55 60 aac cat cag age cag ege acc tgt gca gee ttc tgc agg tea ctc age 244 Asn His Gin Ser Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser 65 70 75 tgc ege aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat ctc ctg' agg gac tgc 292 Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys 80 85 90 ate age tgt gee tcc ate tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac 340 Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr 95 100 105 ttc tgt gag aac aag ctc agg age cca gtg aac ctt cca cca gag ctc 388 Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu 110 115 120 agg gag ccc aaa tet tea gac aaa act cac aca tgc cca ceg tgc cca 436 Arg 125 Glu Pro Lys Ser Ser 130 Asp Lys Thr His Thr 135 Cys Pro Pro Cys Pro 140 gca cct gaa gee gag ggg gca ceg tea gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa 484 Ala Pro Glu Ala Glu 145 Gly Ala Pro Ser Val 150 Phe Leu Phe Pro Pro 155 Lys ccc aag gac acc etc atg ate tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg 532 177
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val' 160 165 170 gtg gtg gac 9tg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac 580 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 175 180 185 gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ceg cgg gag gag 628 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 190 195 200 cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc etc acc gtc ctg cac 676 Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 205 210 215 220 cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa 724 Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 225 230 235 gcc etc cca tcc tcc ate •gag aaa acc ate tcc aaa gcc aaa 999 cag 772 Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin 240 % 245 * 250 ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg 820 Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 255 260 265 acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc 868 Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 270 275 280 age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac aac 916 Ser Asp Ile Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 285 290 295 300 tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac 99c tcc ttc ttc ctc 964 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 305 310 315 tac age aag etc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag 999 aac gtc 1012 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val 320 325 330 178 ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag 1060 Phe Ser Cys Ser Vai Met His 61 u Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin 335 340 345 aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa taa tctagaggcg cgccaatta H09 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys * 350 355
<210> 56 <211> 357 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Proteína de fusão. <400> 56 179
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Vai Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Vai Phe Vai Ser Leu Ser Gin Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30 Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro 35 40 45 Leu Leú Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gin Ser 50 55 60 Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu 65 70 75 80 Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala 85 90 95 Ser Ile Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn 100 105 110 Lys Leu Arg Ser Pro Vai Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Glu Pro Lys 115 120 125 Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 130 135 140 Glu Gly Ala Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro lys Pro Lys Asp Thr 145 150 155 160 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai 165 170 175 Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai 180 185 190 180
Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 195 200 205 Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu 210 215 220 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser 225 230 235 240 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys. -Gly Gin Pro Arg Glu Pro 245 250 255 Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin 260 265 270 Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 275 280 285 Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 290 295 300 Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 305 310 315 320 Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser 325 330 335 Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 340 348 350
Leu Ser Pro Gly Lys 355
<210> 57 <211> 9 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos ilustrativa. <400> 57 atgcacggg 9
<210> 58 <211> 9 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos ilustrativa. <400> 58 cccgtgcat 9 181 181 <210> 59 <211> 586 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <22l> CDS <222> (27) ... (578) <400> 59 gcagcttgtg cggcggcgtc ggcacc atg agg cga ggg ccc cgg age ctg cgg 53
Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg 1 5 ccc tgc gtc ccg gee gag tgc ttc Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe 20 25 gee tgc ggg etc ctg ege acg ccg Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro 35 40 age cct gcg ccc agg acg gcg ctg Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu 50 55 ggg gee ggc gag gcg gcg ctg ccc Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro 70 ccc gcg ctg ctg ggc ctg gea ctg Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu 85 ctg gtg age tgg agg cgg cga cag Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gin 100 105 gea gag gee ccc gac gga gac aag 101 149 197 245- 293 341 ggc agg gac gcg cca gee ccc acg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 10 15 gac ctg ctg gtc ege cac tgc gtg Asp Leu Leu Vai Arg His Cys Val 30 cgg ceg aaa ccg gee ggg gee age Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 45 cag ccg cag gag teg gtg ggc gcg Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala 60 65 ctg ccc ggg ctg etc ttt ggc gee Leu Pro Gly Leu Leu Phe Gly Ala 75 80 gtc ctg gcg ctg gtc ctg gtg ggt Vai Leu Ala Leu Vai Leu Vai Gly 90 95 cgg cgg ctt ege ggc gcg tcc tcc 389 182
Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys 110 115 120 gac gcc cca gag ccc ctg gac aag gtc ate att ctg tct ccg gga ate 437 Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp Lys Val lie Ile Leu Ser Pro Gly Ile 125 130 135 tct gat gcc aca gct cct gcc tgg cct cct cct ggg gaa gac cca gga 485 Ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly 140 145 150 acc acc cca cct ggc cac agt gtc cct gtg cca gcc aca gag ctg ggc 533 Th r Thr Pro Pro Gly His Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly 155 160 165 tcc act gaa ctg gtg acc acc aag acg gcc ggc cct gag caa caa 578 Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gin Gin 170 175 180 tagcaggg 586
<210> 60 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60
Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys 20 25 30 Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala 35 40 45 Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly 50 55 60 Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu Val 85 90 95 Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gin Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ser 100 105 110 183
Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp 115 120 125
Lys Vai I1e IIe Leu Ser Pro Gly Ile Ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala 130 135 140
Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His Ser 145 ' 150 155 160
Vai Pro Vai Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Vai Thr Thr 165 170 175
Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gin Gin 180
<210> 61 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> sequência sinal de VH de 26-10. <400> 61
Met Gly Trp Ser Trp 11e Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 15 10 15
Vai Leu Ser
<210> 62 <211> 332 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Proteina de fusão. <400> 62
Met Gly Trp Ser Trp IIe Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly . 15 10 15
Vai Leu Ser Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro 20 25 30
Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr IIe Cys Asn His Gin Ser 35 40 45
Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu 50 55 60 184
Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala 65 70 75 80 Ser Ile Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn 85 90 95 Lys Leu Arg Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Vai Phe Leu Phe 115 120 125 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai 130 135 140 Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe 145 150 155 160 Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 165 170 175 Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr 180 185 190 Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai 195 200 205 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 210 215 220 Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 225 230 235 240 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly 245 250 255 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 260 265 270 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser 275 280 285 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 290 295 300 Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His 305 310 315 320 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
<210> 63 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> 26-10 VH 5' UTR. 185 <4Ο0> 63 aacatatgtc caatgtcctc tccacagaca ctgaacacac tgactccaac g 51
<210> 64 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> 26-10 VH 5' UTR modificada. <400> 64
aacatatgtc caatgtcctc tccacagaca ctgaacacac tgactgccac c 51 <210> 65 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> sequência sinal de VH de 26-10. <221> CDS <222> (1)...(57) <400> 65 atg gga tgg age tgg ate ttt etc ttt ctt ctg tea gga act gea ggt 48
Met Gly Trp Ser Trp lie Phe Leu Phe Leu Leú Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 gtc ctc tet 57
Vai Leu Ser
<210> 66 <211> 84 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> intrão de VH de 26-10. <400> 66 gtaaggggct ccccagttcc aaaatctgaa gaaaagaaat ggcttgggat gtcacagata 60 tccactctgt ctttctcttc acag 84 <210> 67 186 <211> 1135
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Proteína de fusão. <400> 67 aacatatgtc caatgtcctc tccacagaca ctgaacacac tgactccaac gatgggatgg 60 agctggatct ttctctttct tctgtcagga actgcaggta aggggctccc cagttccaaa 120 atctgaagaa aagaaatggc ttgggatgtc acagatatcc actctgtctt tctcttcaca 180 ggtgtcctct ctgctatgag atcctgcccc gaagagcagt actgggatcc tctgctgggt 240 acctgcatgt cctgcaaaac catttgcaac catcagagcc agcgcacctg tgcagccttc 300 tgcaggtcac tcagctgccg caaggagcaa ggcaagttct atgaccatct cctgagggac 360 tgcatcagct gtgcctccat ctgtggacag caccctaagc aatgtgcata cttctgtgag 420 aacaagctca ggagcgagcc caaatcttca gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 480 gcacctgaag ccgagggggc accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 540 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 600 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 660 ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 720 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccatcc 780 tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 840 ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 900 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 960 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1020 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1080 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa ataaa 1135 <210> 68 <211> 1135
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Proteína de fusão. <400> 68 aacatatgtc caatgtcctc tccacagaca ctgaacacac tgactgccac catgggatgg 60 agctggatct ttctctttct tctgtcagga actgcaggta aggggctccc cagttccaaa 120 187 atctgaagaa aagaaatggc ttgggatgtc acagatatcc actctgtctt tctcttcaca 180 ggtgtcctct ctgctatgag atcctgcccc gaagagcagt actgggatcc tctgctgggt 240 acctgcatgt cctgcaaaac catttgcaac catcagagcc agcgcacctg tgcagccttc 300 tgcaggtcac tcagctgccg caaggagcaa ggcaagttct atgaccatct cctgagggac 360 tgcatcagct gtgcctccat ctgtggacag caccctaagc aatgtgcata cttctgtgag 420 aacaagctca ggagcgagcc caaatcttca gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 480 gcacctgaag ccgagggggc accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 540 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 600 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 660 ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 720 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccatcc 780 tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 840 ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 900 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 960 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1020 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1080 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa ataaa 1135
<210> 69 <211> 884 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Potenciador (enhancer) de CMV/Construção de promotor de MPSV LTR. <400> 69 cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 60 ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 120 caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 180 ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 240 tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 300 accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 360 ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttgaat gaaagacccc 420 acctgtaggt ttggcaagct agcttaagta acgccatttg caaggcatgg aaaaatacat 480 aactgagaat agagaagttc agatcaaggt caggaacaga gaaacaggag aatatgggcc 540 aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg ccccgctcag ggccaagaac agttggaaca 600 ggagaatatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgc tcagggccaa 660 gaacagatgg tccccagatc ggtcccgccc tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt 720 tccagggtgc cccaaggacc tgaaatgacc ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt 780 cgcttctcgc ttctgttcgc gcgcttctgc tccccgagct caataaaaga gcccacaacc 840 cctcactcgg cgcgccagtc ctccgataga ctgcgtcgcc cggg 884
<210> 70 <211> 455 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Promotor de MPSV LTR sem a região de controlo negativo. <400> 70 aatgaaagac cccacctgta ggtttggcaa gctagaaggt taggaacaga gagacagcag 60 aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg ccccggctca gggccaagaa 120 cagatggtcc ccagatgcgg tcccgccctc agcagtttct agagaaccat cagatgtttc 180 cagggtgccc caaggacctg aaaatgaccc tgtgccttat ttgaactaac caatcagttc 240 gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct ccccgagctc aataaaagag cccacaaccc 300 ctcactcggc gcgccagtcc tccgatagac tgcgtcgccc gggtacccgt gttctcaata 360 aaccctcttg cagttgcatc cgactcgtgg tctcgctgtt ccttgggagg gtctcctctg 420 agtgattgac tacccgtcag cgggggtctt tcagt 455 189
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição
us 5969102 A wo 9818921 A wo 0040716 A wo 0181417 A us 5300435 A us 4599311 A us 4931373 A us 4870008 A us 5037743 A us 4845075 A us 4615974 A us 4977092 A us 4990446 A us 5063154 A us 5139936 A us 4661454 A us 4882279 A us 4935349 A us 5162228 A us 4486533 A us 5716808 A us 5736383 A wo 9717450 A
Bram and von Bulow, [0005] [0006] [0008] [0135] [0141] [0144] [0146] [0008] [0121]
Kawasak i [0123]
Kawasak i [0123]
Brake [0123] [0123]
Murray [0123]
Kingsman [0123]
Bitter [0123] [0123] [0123] [0123] [0123]
Cregg [0124]
McKnight [0124]
Sumino [0124]
Lambowitz [0124]
Raymond [0125]
Raymond [0125] [0125] 190 190 wo 9717451 A [0125] wo 9802536 A [0125] wo 9802565 A [0125] us 5252714 A, Harris [0154] EP 0154316 A [0156] US 5382657 A, Karasiewicz [0156] us 5738846 A, Greenwald [0164] JP 4244018 A [0195] us 4603044 A, Geho [0196] us 4769331 A [0206] us 4859587 A [0206] us 5288641 A [0206] us 5328688 A [0206] us 5399346 A, Anderson [0206] us 60293343 B [0272]
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Claims (34)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma proteína de fusão de interaccção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI)-imunoglobulina, para utilização na inibição da proliferação de células tumorais, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina compreende: (a) uma fracção de receptor de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI), em que a fracção de receptor de TACI consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 de SEQ ID NO: 2; em que a fracção de receptor de TACI se liga a pelo menos um de ZTNF2 ou ZTNF4; e (b) uma fracção de imunoglobulina.
2. A proteína de fusão de TACI-imunoglobulina para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a administração é a um indivíduo mamífero, que tem um tumor.
3. A proteína de fusão de TACI-imunoglobulina para utilização de acordo com a reivindicação 2, em que a dita inibição compreende a inibição da proliferação de linfócitos B no indivíduo mamífero.
4. Uma proteína de fusão de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI)-imunoglobulina, para utilização no tratamento de uma doença auto-imune, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina compreende: 2 (a) uma fracção de receptor de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI), em que a fracção de receptor de TACI consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 de SEQ ID NO: 2; em que a fracção de receptor de TACI se liga a pelo menos um de ZTNF2 ou ZTNF4; e (b) uma fracção de imunoglobulina.
5. A proteína de fusão de TACI-imunoglobulina para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que a dita doença auto-imune é seleccionada a partir do grupo que consiste em miastenia grave, diabetes mellitus dependente de insulina, doença de Crohn, artrite reumatóide juvenil de evolução poliarticular, e artrite psoriática.
6. A proteína de fusão de TACI-imunoglobulina para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que a dita doença auto-imune é lúpus eritematoso sistémico.
7. A proteína de fusão de TACI-imunoglobulina para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que a dita doença auto-imune é artrite reumatóide.
8. Uma proteína de fusão de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI)-imunoglobulina, para utilização no tratamento de asma, bronquite ou enfisema, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina compreende: (a) uma fracção de receptor de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de 3 ciclofilina (TACI), em que a fracção de receptor de TACI consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 de SEQ ID NO: 2; em que a fracção de receptor de TACI se liga a pelo menos um de ZTNF2 ou ZTNF4; e (b) uma fracção de imunoglobulina.
9. Uma proteína de fusão de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI)-imunoglobulina, para utilização no tratamento de doença renal, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina compreende: (a) uma fracção de receptor de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI), em que a fracção de receptor de TACI consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 de SEQ ID NO: 2; em que a fracção de receptor de TACI se liga a pelo menos um de ZTNF2 ou ZTNF4; e (b) uma fracção de imunoglobulina.
10. A proteína de fusão de TACI-imunoglobulina para utilização de acordo com a reivindicação 9, em que a dita doença renal é seleccionada a partir do grupo que consiste em insuficiência renal em estágio final, glomerulonefrite, vasculite, nefrite, amiloidose e pielonefrite. 4
11. Uma proteína de fusão de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI)-imunoglobulina, para utilização no tratamento de uma doença ou distúrbio associado a imunossupressão, rejeição de enxerto, doença do enxerto contra o hospedeiro, inflamação, dor nas articulações, edema, anemia e choque séptico, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina compreende: (a) uma fracção de receptor de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI), em que a fracção de receptor de TACI consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID NO-2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 de SEQ ID NO: 2; em que a fracção de receptor de TACI se liga a pelo menos um de ZTNF2 ou ZTNF4; e (b) uma fracção de imunoglobulina.
12. Uma proteína de fusão de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI)-imunoglobulina, para utilização no tratamento de um distúrbio seleccionada a partir de neoplasma, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiplo, linfoma não Hodgkin, doença linfoproliferativa pós-transplante e gamapatia de cadeia leve, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina compreende: (a) uma fracção de receptor de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI), em que a fracção de receptor de TACI consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: 5 (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 de SEQ ID NO: 2; em que a fracção de receptor de TACI se liga a pelo menos um de ZTNF2 ou ZTNF4; e (b) uma fracção de imunoglobulina.
13. A proteína de fusão de TACI-imunoglobulina para utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a dita proteína de fusão TACI-imunoglobulina consiste em ou compreende uma proteína de fusão de TACI-Fc; preferentemente em que a dita proteína de fusão de TACI-Fc é uma proteína de fusão de Fc de imunoglobulina humana.
14. A proteína de fusão de TACI-imunoglobulina para utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a dita fracção de imunoglobulina consiste na região charneira das cadeias pesadas de imunoglobulina ligada por pontes dissulfeto e os domínios CH2 e CH3 ·
15. A proteína de fusão de TACI-imunoglobulina para utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a fracção de imunoglobulina é uma fracção Fc de imunoglobulina IgGl.
16. A proteína de fusão de TACI-imunoglobulina para utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a dita fracção de imunoglobulina consiste em ou compreende uma fracção Fc de imunoglobulina seleccionada a partir do grupo que consiste em Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 ou Fc8; preferentemente em que a dita fracção de imunoglobulina consiste em ou compreende uma fracção Fc5 de imunoglobulina. 6
17. A proteína de fusão de TACI-imunoglobulina para utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina consiste em ou compreende uma forma secretada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 50, 52, 54 ou 56.
18. A proteína de fusão de TACI-imunoglobulina para utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina consiste em ou compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 50, 52, 54 ou 56, em que a sequência líder tPA optimizada (otPA) (SEQ ID NO: 25) foi removida.
19. A proteína de fusão de TACI-imunoglobulina para utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina é um dímero.
20. Um método in vitro de inibição da proliferação de células tumorais, que compreende administrar às ditas células tumorais uma proteína de fusão de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI)-imunoglobulina, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina compreende: (a) uma fracção de receptor de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI), em que a fracção de receptor de TACI consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 de SEQ ID NO: 2; 7 em que a fracção de receptor de TACI se liga a pelo menos um de ZTNF2 ou ZTNF4; e (b) uma fracção de imunoglobulina.
21. Uma proteína de fusão de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI)-imunoglobulina, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina compreende: (a) uma fracção de receptor de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI), em que a fracção de receptor de TACI consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 de SEQ ID NO: 2; em que a fracção de receptor de TACI se liga a pelo menos um de ZTNF2 ou ZTNF4; e (b) uma fracção de imunoglobulina; e em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina consiste em ou compreende uma forma secretada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 50, 52, 54 ou 56.
22. A proteína de fusão de TACI-imunoglobulina de acordo com a reivindicação 21, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina consiste em ou compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 50, 52, 54 ou 56, em que a sequência líder tPA optimizada (otPA) (SEQ ID NO: 25) foi removida.
23. Uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de acordo com a reivindicação 21 ou a reivindicação 22.
24. Um método para preparar uma proteína de fusão de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina TACI-imunoglobulina, em que o dito método compreende expressar uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica a dita proteína de fusão, em que a dita sequência de ácidos nucleicos é operativamente ligada a uma sequência reguladora que controla a expressão transcricional num vector de expressão; em que a dita proteína de fusão compreende: (a) uma fracção de receptor de interacção de activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (TACI), em que a fracção de receptor de TACI consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em: (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 de SEQ ID NO: 2; em que a fracção de receptor de TACI se liga a pelo menos um de ZTNF2 ou ZTNF4; e (b) uma fracção de imunoglobulina.
25. O método de acordo com a reivindicação 24, em que a dita proteína de fusão de TACI-imunoglobulina consiste em ou compreende uma proteína de fusão de TACI-Fc.
26. O método de acordo com a reivindicação 25, em que a dita proteína de fusão de TACI-Fc é uma proteína de fusão de Fc de imunoglobulina humana.
27. O método de acordo com qualquer das reivindicações 24-26, em que a dita fracção de imunoglobulina consiste na região charneira das cadeias pesadas da imunoglobulina ligada por pontes dissulfeto e os domínios CH2 e CH3. 9 28. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações 24- 27, em que a fracção de imunoqlobulina é uma fracção Fc de imunoglobulina IgGl. 29. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações 24- 28, em que a dita fracção de imunoglobulina consiste em ou compreende uma fracção Fc de imunoglobulina seleccionada a partir do grupo que consiste em Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 ou Fc8; preferentemente em que a dita fracção de imunoglobulina consistem em ou compreende uma fracção Fc5 de imunoglobulina.
30. O método de acordo com qualquer das reivindicações 24- 29, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina consiste em ou compreende uma forma secretada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 50, 52, 54, ou 56.
31. O método de acordo com qualquer das reivindicações 24- 30, em que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina consiste em ou compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 50, 52, 54 ou 56, e em que a sequência líder tPA optimizada (otPA) (SEQ ID NO: 25) foi removida.
32. O método de acordo com qualquer das reivindicações 24- 31, em que o dito método compreende expressar a sequência de nucleótidos que codifica a proteína de fusão numa célula hospedeira; preferentemente em que a dita célula hospedeira é uma célula de ovário de hamster chinês.
33. O método de acordo com a reivindicação 32, em que a célula de ovário de hamster chinês carece de um gene da dihidrofolato redutase funcional. 10
34. O método de acordo com a reivindicação 32 ou a reivindicação 33, em que a sequência de nucleótidos que codifica a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina é transfectada na célula hospedeira na forma de um vector de expressão.
35. O método de acordo com a reivindicação 34, em que o vector de expressão compreende um plasmídeo de expressão; preferentemente em que o plasmídeo de expressão compreende um promotor CMV e um segmento poli A SV40.
36. O método de acordo com qualquer das reivindicações 32-35, em que o crescimento das células hospedeiras na presença de concentrações aumentadas de metotrexato tem como resultado a amplificação do gene da dihidrofolato redutase e a sequência de nucleótidos ligada que codifica a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina.
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