JP2010501622A - Fc−融合タンパク質の精製法 - Google Patents
Fc−融合タンパク質の精製法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010501622A JP2010501622A JP2009526067A JP2009526067A JP2010501622A JP 2010501622 A JP2010501622 A JP 2010501622A JP 2009526067 A JP2009526067 A JP 2009526067A JP 2009526067 A JP2009526067 A JP 2009526067A JP 2010501622 A JP2010501622 A JP 2010501622A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- fusion protein
- seq
- chromatography
- amino acids
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
Abstract
Description
本発明は、タンパク質精製の分野に関する。より具体的には、プロテインA又はプロテインGアフィニティークロアトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるFc-融合タンパク質の精製に関する。
タンパク質は、一般的に「生物製剤」と称される薬物として商業的に重要となっている。最も大きな挑戦は、商業的スケールでのタンパク質の精製のための費用有効的及び効率的な方法の開発である。大-スケールでのタンパク質の製造のために今日多くの方法が利用できるが、細胞培養上清のような粗生成物は、所望の生成物のみならず、所望の生成物から分離が困難な不純物をも含む。細胞発現組換えタンパク質産物の細胞培養上清は、細胞が血清無しの培地で増殖する場合には、不純物がほとんどないことがあるが、宿主細胞タンパク質(HCP)は、精製過程で依然として除去されてしまう。更に、保険機関は、ヒト投与を意図したタンパク質の高い純度標準を要求している。
−IgGのアイソタイプによって変化する親和性を有するプロテインA又はプロテインGのアフィニティークロマトグラフィーを用いる、精製の可能性。IgG1、IgG2及びIgG4はプロテインAに強く結合し、IgG3を含むすべてのヒトIgGはプロテインGに強く結合する;
−Fc部位はリソソーム分解から保護する救助受容体FcRnに結合するので、循環系において半減期が増加する;
−Fc-融合タンパク質の医薬的使用によっては、Fcエフェクタ機能は望ましいことがある。このようなエフェクタ機能は、Fc受容体(FcγRs)との相互作用を介する抗体-依存的細胞毒性(ADCC)、及び補体成分1q(C1q)に結合することによる補体-依存的毒性(CDC)を含む。IgGアイソフォームは、様々なレベルのエフェクタ機能を発揮する。ヒトIgG1及びIgG3は強いADCC及びCDC効果を有するが、ヒトIgG2は弱いADCC及びCDC効果を発揮する。ヒトIgG4は弱いADCC及びCDC効果を示す。
本発明は、Fc-融合タンパク質の精製法の開発に基づく。
a. Fc-融合タンパク質を含む液体をプロテインA又はプロテインGアフィニティークロマトグラフィーに供し;
b. ステップ(a)の溶出液をカチオン交換クロマトグラフィーに供し;
c. ステップ(b)の溶出液をアニオン交換クロマトグラフィーに供し;並びに
d. ステップ(c)のフロースルーをヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供し、及び溶出液を集めて精製されたFc-融合タンパク質を得ること、
を含むFc-融合タンパク質の精製法に関する。
本発明は、ヒト投与に好適である高度に精製されたTACI-Fc調製物をもたらす、TACI-Fcと称される模範的な治療的Fc-融合タンパク質のための精製法の開発に基づく。
a. Fc-融合タンパク質を含む液体をプロテインA又はプロテインGアフィニティークロマトグラフィーに供し;
b. ステップ(a)の溶出液をカチオン交換クロマトグラフィーに供し;
c. ステップ(b)の溶出液をアニオン交換クロマトグラフィーに供し;
d. ステップ(c)のフロースルーをヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供し、及び溶出液を集めて、精製されたFc-融合タンパク質を得ること、
を含むFc-融合タンパク質の精製法に関する。
T250Q/M428L
M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F
E233P/L234V/L235A/ΔG236 + A327G/A330S/P331S
E333A; K322A
が導入され得る。
(a) 配列番号2のアミノ酸34〜66;
(b) 配列番号2のアミノ酸71〜104;
(c) 配列番号2のアミノ酸34〜104;
(d) 配列番号2のアミノ酸30〜110;
(e) 配列番号3;
(f) 配列番号4;
(g) 高ストリンジェントな条件下で配列番号5、6又は7の補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;及び
(h) (c)、(d)、(e)又は(f)のポリペプチドと少なくとも80 %、85 %、90 %又は95 %の配列同一性を有する(c)、(d)、(e)又は(f)のいずれかの変異タンパク質、
から選ばれるポリペプチドから選択されるポリペプチドであって;
ここで、該ポリペプチドは少なくとも1つのBlys又はAPRILに結合する、ポリペプチドを含むことが非常に好ましい。
b.1. 6.0〜7.0の範囲のpH及び6〜10 mS/cmの範囲の導電率を有する緩衝液でカチオン交換樹脂を洗浄し;並びに
b.2. 7.0〜8.5の範囲のpH及び15〜22 mS/cmの範囲の導電率を有する緩衝液でカラムを溶出すること。
ステップ(b)が遊離のFcを効率的に除くことは驚くべきことに本発明の範囲内にある。そのため、本発明に従って、カチオン交換クロマトグラフィーは、好ましくは、5〜15倍の範囲の遊離Fcの除去又は減少のために使用できる。
従って、例えば、Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux J et al., 1984)で利用できるプログラム、例えばプログラムBESTFIT及びGAPは、2つのポリヌクレオチド間の%同一性、並びに2つのポリペプチド配列間の%同一性及び%ホモロジーを決定するために使用される。BESTFITは、Smith and Waterman (1981) の「部分的ホモロジー」アルゴリズムを使用し、2つの配列間の類似性の最良の単一部位を見つける。配列間の同一性及び/類似性を決定するための他のプログラム、例えば、プログラムのBLASTファミリー(Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, NCBI at www.ncbi.nlm.nih.govのホームページからアクセス可能)及びFASTA(Pearson W R, 1990)、も当該分野で知られている。
a.配列番号2のアミノ酸34〜66;
b. 配列番号2のアミノ酸71〜104;
c. 配列番号2のアミノ酸34〜104;
d. 配列番号2のアミノ酸30〜110;
e. 配列番号3;
f. 配列番号4;
g. 高ストリンジェントな条件下で配列番号5、6又は7の補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;及び
h. (c)、(d)、(e)又は(f)のポリペプチドと少なくとも80 %、85 %、90 %又は95 %の配列同一性を有する(c)、(d)、(e)又は(f)のいずれかの変異タンパク質、
から選ばれるポリペプチドを含み;
ここで、該ポリペプチドは少なくとも1つのBlys又はAPRILに結合する。
用語解説
CHO: チャイニーズハムスター卵巣
DSP: ダウンストリームプロセス
EDTA: エチレンジアミン四酢酸
ELISA: 酵素結合免疫吸着法
HAC: ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
HCP: 宿主細胞タンパク質
HPLC: 高速液体クロマトグラフィー
id: 内径
K: カリウム
kD: キロダルトン
MES: 2-モルホリノエタンスルホン酸
Na: ナトリウム
NaAc: 酢酸ナトリウム
n/d: 非決定
PA-SE-HPLC: プロテインAサイズ排除高速液体クロマトグラフィー
ppm: パーツ・パー・ミリオン
RO: 逆浸透
RT: 室温
SDS-PAGE: ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
SE-HPLC: サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
T℃: 温度
TMAC: テトラメチルアンモニウムクロリド
UV: 紫外線
WFI: 注入用水
WRO: 逆浸透水
出発物質は、血清無しの条件下で培養したTACI-Fc発現CHO細胞クローンの浄化ハーベストであり、使用するまで冷凍保存した。MabSelect Xtra(商標)カラム(GE Healthcare 17-5269-03)での捕獲ステップを、17 cmのベッド高を有するカラムで以下のプロトコールに従って実施した。15℃未満の温度を維持したロード溶液を除いて、すべての操作を室温で行った。280 nmでのUVシグナルを記録した。
250 cm/時間での逆流で、少なくとも3BVの0.1 M酢酸+20%エタノールでカラムを浄化した。フローを1時間停止した。
洗浄ステップ:
250 cm/時間での逆流で、少なくとも2BVのRO水で該カラムを洗浄した。
平衡化:
450 cm/時間での下降流で、少なくとも5BVの25 mMリン酸ナトリウム+15O mM NaCl、pH 7.0で(導電率及びpHパラメータが特定の範囲:pH 7.0±0.1、導電率 18±2 mS/cmとなるまで)該カラムを平衡化した。
ローディング:
350 cm/時間の流速で充填樹脂のml当たりのBiacoreアッセイによって決定した最大15 mgの総TACI-Fcの容量まで、15℃未満の温度で維持した浄化ハーベストでカラムをロードした。
洗浄ステップ:
350 cm/時間で少なくとも2BVの平衡緩衝液、次いで(UVシグナルがベースラインに戻るまで)450 cm/時間で少なくとも4BVの平衡緩衝液で該カラムを洗浄した。
溶出:
350 cm/時間の流速で表Iに記載の異なった溶出緩衝液で物質を溶出した。最初から6.0±0.5BVの溶出までのUVシグナル増加まで、溶出液フラクションを回収した。溶出液を室温で4.1未満のpH(必要ならば、クエン酸溶液の添加によって調整)で1時間インキュベートし、次いでpHを32% NaOH溶液の添加によって5.0±0.1に調整した。
再生:
450 cm/時間の逆流で、少なくとも3BVの5O mM NaOH+1 M NaClでカラムを再生し、15分間フローを停止し、次いで少なくとも3BVで450 cm/時間でのフローを再開した(UVシグナルがベースラインに戻るまで)。
このステップから、カラムを逆流モードで操作した。
洗浄ステップ:
450 cm/時間で少なくとも2BVのRO水でカラムを洗浄した。
浄化:
250 cm/時間で少なくとも3BVの浄化緩衝液でカラムを浄化し、フローを停止し、カラムを60分間インキュベートした。
最終洗浄ステップ:
250 cm/時間で少なくとも1BVのRO水でカラムを洗浄し、次いで250 cm/時間で少なくとも3BVの平衡緩衝液でカラムを洗浄し、最後に250 cm/時間で少なくとも2BVのRO水でカラムを洗浄した。
最後に、250 cm/時間で少なくとも3BVの20%エタノールでカラムをフラッシュした後に保存した。
350 cm/時間の流速で充填樹脂のL当たり15 gの総TACI-Fc5の動的容量でMabSelect Xtraカラムに、浄化されたハーベスト中のTACI-Fc5を直接捕獲した。生成物の回収を最大にし、同時に凝集レベルで顕著な減少を提供するために、溶出条件、特にpHを最適化した。浄化されたハーベスト中で約25〜40 %から開始して約5〜10%の凝集レベルを与え、濁りが観察されない、0.1 Mクエン酸ナトリウム(pH 3.9)の溶出緩衝液を選択した。HCPレベルは典型的に1500〜2000 ppmであった。HCPレベルは、ポリクローナル抗体を用いてELISAによって測定した。抗体混合物は、非-トランスフェクトCHO細胞の浄化かつ濃縮された細胞培養上清から得られる宿主細胞タンパク質に対して産生した。
好適なローディングバッファーに透析したプロテインAでの捕獲ステップからの溶出液は、カチオン交換クロマトグラフィーのための出発物質として使用した。
少なくとも1BVのWRO(逆浸透浄水)でカラムを洗浄した。
浄化:
次いで、カラムをアップ-フローモードで少なくとも3BVの0.5 M NaOH+1.5 M NaClで浄化した。
リンス:
カラムを少なくとも4BVのダウン-フローモードでリンスした。
平衡化:
少なくとも4BVの100 mMクエン酸ナトリウム(pH 5.0)で(あるいは、標的導電率 12±1 mS/cm及びpH 5.0±0.1となるまで)カラムを平衡化した。
充填樹脂のml当たりのSE-HPLCアッセイによって決定した、pH 5.0(pH 5.0±0.1及び導電率 12±1 mS/cm)及び最大50 mgのTACI-Fcの容量で捕獲した捕獲後の物質で、カラムをロードした。
洗浄ステップ:
少なくとも5BVの10O mM リン酸ナトリウム(pH 6.5)でカラムを洗浄した。
溶出:
異なった緩衝液、及び以下の表II〜IVの異なった条件下でカラムを溶出した。
再生及び浄化:
アップ-フローモードで4BVの0.5 M NaOH+1.5 M NaClでカラムを再生及び浄化した。次いで、フローを30分間停止した。
リンス:
カラムを少なくとも4BVのWROでリンスした。
保存:
カラムを少なくとも3BVの20 %エタノールで保存した。
カチオン交換ステップは、捕獲ステップの後に、第2精製ステップとして行った。捕獲溶出液は低pH (5.0) でかつ低導電性であり、カチオン交換体に直接的にロードすることができた。50 mg/mlのローディング容量を有するFractogel EMD SO3 -樹脂を選択した。非-生物活性分解物遊離Fcは、0.1 Mリン酸ナトリウムpH 6.5で洗浄ステップにおいて効率的に除いた。HCPの最大のクリアランス及び高いTACI-Fc回収(179 mMリン酸ナトリウムpH 8.0、導電率20.7 mS/cm)のために溶出条件を最適化した。
この精製ステップのために使用した出発物質は、好適なローディングバッファーに透析し又はそれで希釈した、Fractogel SO3 -でのカチオン交換ステップからの溶出液であった(実施例2)。
最初に、カラムを150 cm/時間の流速で少なくとも1BVのRO水でリンスした。
浄化:
次いで、カラムを少なくとも3BVの0.5 M NaOH+1.5 M NaClで浄化した。
洗浄ステップ:
カラムを200 cm/時間の流速で少なくとも3BV、少なくとも4〜10BVの0.5 M リン酸ナトリウム(pH 7.5)で洗浄した。
平衡化:
カラムを少なくとも5BVの10、15、20、25又は30 mM リン酸ナトリウム(pH 7.5)で平衡化した。場合により、カラムを3BVの0.5 M リン酸ナトリウム(pH 7.5)で予備平衡化できる。
ローディング、洗浄、及びフロースルーでのTACI-Fcの同時回収:
UV増加の開始から洗浄ステップの最後までの、4±0.5 BVの平衡緩衝液で実行されるフロースルーを回収して、充填樹脂のml当たりのSE-HPLCアッセイによって決定された50 mg TACI-Fc以下の容量で10〜30 mM、pH 7.5のリン酸塩濃度を得るために、希釈されたカチオン交換後の物質でカラムをロードした。
再生/浄化:
150 cm/時間の流速で逆流モードで(UVシグナルがベースラインに戻るまで)、カラムを少なくとも3BVの0.5M NaOH + 1.5M NaClで再生及び浄化した。再生の最後に、ポンプを30分間停止した。
洗浄ステップ:
200 cm/時間の流速で少なくとも3BVのRO水でカラムを洗浄した。
保存:
150 cm/時間の流速で少なくとも3BVの20 %エタノール (v/v) でカラムを保存する。
以下の表Vは、上記の精製法によって得られた結果を纏める。
フロースルーモードにおけるSource 3OQカラムでのアニオン交換ステップは、HCP及び凝集体のクリアランスを最大限にするたるために最適化した。2O mMリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.5で希釈又はダイアフィルターされたカチオン交換溶出液をローディングすることは、生成物回収(90%)と、HCP(約2000 ppm〜44 ppm)及び凝集体(約25 %〜5.6 %)のクリアランスとの妥協を与えた。150〜200 cm/時間での50 mg TACI-Fc/充填樹脂のmlの動的容量を用いた。
この精製ステップのために使用した出発物質は、アニオン-交換クロマトグラフィー・フロースローであった(実施例3参照)。
少なくとも1BVの20 mMリン酸ナトリウムpH 7.5緩衝液でカラムを洗浄し、次いで少なくとも3BVの0.5 Mリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.5でpHを下げた。
少なくとも5BVの20 mMリン酸ナトリウムpH 7.5緩衝液で(又は、標的導電性3.0±0.3 mS/cm及びpH 7.5±0.1に到達するまで)カラムを平衡化した。
ローディング:
充填樹脂のml当たりのSE-HPLCアッセイによって決定されたNMT 50 mg TACI-Fcの容量で、0.5 Mのストック溶液からの0.1 mM終濃度まで加えられた塩化カルシウム、及び85 %のオルトリン酸を添加することによって7.0に調整したpHをで、SOURCE 3OQフロースルーでカラムをロードした。ヒドロキシアパタイトカラム上でpH 7.0に調整された、塩化カルシウムを含まないSOURCE 3OQフロースルーも可能である。
洗浄ステップ:
少なくとも4BVの3、4又は5 mMのリン酸ナトリウム、1O mM MES、0.1 mM CaCl2 pH6.5でカラムを洗浄した。これらのステップでは、塩化カルシウムを含まない同一の緩衝液を使用することも可能である。
溶出:
異なったBVについてのUV増加の開始から(表VI及びVII参照)、カラムを5、4、3又は2 mMのリン酸ナトリウムで溶出し(表VI参照)、1O mM MES、0.1 mM CaCl2、及び0.6、0.7、0.8又は0.9 M KCl pH 6.5緩衝液で溶出した(表VII参照)。溶出のために塩化カルシウムを含まない同一緩衝液を使用することも可能である。
リンス:
カラムを少なくとも1BVの2O mMリン酸ナトリウムpH 7.5緩衝液;少なくとも3BVの0.5 Mリン酸ナトリウムpH 7.5緩衝液;及び少なくとも1BVの20 mMリン酸ナトリウムpH 7.5緩衝液でリンスした。
保存:
カラムを少なくとも3BVの0.5 M NaOHで保存した。
表VIは、凝集体クリアランス及び生成物回収に対する、溶出緩衝液のリン酸塩濃度(2〜5 mM)の効果を示す。溶出ピークフラクションを集め、TACI-Fc濃度及び凝集体レベルについてSE-HPLCによって分析した。
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、TACI-Fc凝集レベルを減少させる信頼性のある効率的な方法を提供する。約5〜8 %の凝集レベルを有するアニオン交換クロマトグラフィー精製物質から始めて(実施例3参照)、ヒドロキシアパタイトクトマトグラフィーは、このレベルを0.8 %未満に減少させることができ、85〜90 %のTACI-Fcの回収を伴う。
1 %未満(5つの実験で0.2〜0.8 %)までの凝集体の全体的な減少、約5〜10 ppmまでのHCPの全体的な減少及び0.5 %未満(5つの実験で0.2、0.1 %)までの遊離Fcレベルの全体的な減少をもたらす、高度に精製されたTACI-Fcを与えるTACI-Fcの4ステップ精製法を開発した。
1. Akerstrom and Bjork, J Biol Chem. 1989 Nov 25; 264(33): 19740-6
2. Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990
3. Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25: 389-3402, 1997
4. Armour KL. et al., 1999. Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur J Immunol. 29(8): 2613-24
5. Black et al., US 2002/01 15175
6. Bodmer et al., TIBS 27(1), 19-24
7. Boschetti, E., Jungbauer, Sep. Sci. & Tech. 2 No. 15, Acad. Press (2000) 53
8. Boschetti et al., Genetic Engineering Vol. 20, No. 13, July, 2000
9. Bossen et al., JBC 281 (2), 13964-13971
10. Bram and von Bulow, US 5,969,102 (1999)
11. Bram et al., WO 98/39361
12. Carter PJ., 2006. Potent antibody therapeutics by design. Nature Reviews Immunology. Advance online publication
13. Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984
14. Feng et al., Bioprocessing 2005, 1-7
15. Giovannini, Biotechnology and Bioengineering 73: 522-529 (2000) 16. Grantham et al., Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974)
17. Gross et al., Nature 404(27), 995-999
18. Gross et al., WO 00/40716
19. Hinton PR. et al., 2004. Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates. J Biol Chem. 279(8): 6213-6
20. Hymowitz et al., JBC 280(8), 7218-7227
21. ldusogie EE. et al., 2000. Mapping of the C1q binding site on rituxan, a chimeric antibody with a human IgGI Fc. J Immunol. 164(8): 4178-84
22. ldusogie EE. et al., 2001. Engineered antibodies with increased activity to recruit complement. J Immunol. 166(4): 2571-5
23. Ishihara, EP 1 614 693
24. Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., and Foeller, C. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD
25. Kochanek et al., EP 1 230 354
26. Locksley et al., Cell 104, 487-501, 2001
27. Melchers, Ann. Rheum. Dis 2003, 62, 25-27.
28. Moore et al., Science 285: 260-3
29. Moreau et al., Blood 103(8), 3148-3157
30. Naismith and Sprang, TIBS 23, 74-79, 1998
31. Novak et al., Blood 103(2), 689-694
32. Rixon et al., WO 02/094852
33. Pearson, Methods Enzymol. 1990; 183: 63-98
34. Porath, J. Carlsson, I. Olsson, and G. Belfrage, Nature (London) 258, 598-599 (1975)
35. Porath and B. Olin, Biochemistry 22, 1621-1630 (1983)
36. Puren et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Mar 2; 96(5): 2256-61
37. Shepard, J. of Chromatography 891: 93-98 (2000)
38. Shields RL. et al., 2001. High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem. 276(9): 6591-604.
39. Smith et al., WO 91/03553
40. Smith et al., WO 94/06476
41. Stanker, J. Immunological Methods 76: 157-169 (1985) (10 mM to 30 mM sodium phosphate elusion gradient)
42. Steurer W. et al., 1995. Ex vivo coating of islet cell allografts with murine CTLA4/Fc promotes graft tolerance. J Immunol. 155(3): 1165-74
43. Sun et al., WO 2005/044856
44. Takeda et al., EP 1 561 756
45. Tarditi, J. Chromatography 599: 13-20 (1992)
46. Vaccaro C. et al., 2005. Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levels. Nat Biotechnol. 23(10): 1283-8
47. Vigers et al., Nature. 1997 Mar 13; 386(6621): 190-4 48. Vedantham et al., WO 03/59935
49. VoIa et al., BioTechniques 14: 650-655 (1993)
50. von Bulow and Bram, Science 228: 138 (1997)
51. Xia et al., J. Exp. Med. 2000, 137-143
配列番号1は、TNFRスーパーファミリーのメンバーに共通のシステイン フィンガープリント配列(システイン豊富な偽反復)であり;
配列番号2は、ヒトTACI受容体の完全長配列であり(例えば、WO 98/39361に記載されている);
配列番号3は、本発明のヒトFc配列の例であり(例えば、WO 02/094852に記載されている);
配列番号4は、TACIの細胞外部分及びヒトIgG1 Fc部分から得られる配列を含む本発明の好ましいFc-融合タンパク質であり(例えば、WO 02/094852に記載されている);
配列番号5は、配列番号2のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり(例えば、WO 02/094852に記載されている);
配列番号6は、配列番号3のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり(例えば、WO 02/094852に記載されている);
配列番号7は、配列番号4のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである(例えば、WO 02/094852に記載されている)。
Claims (28)
- 6.9〜9.5の等電点(pl)を有するFc-融合タンパク質の精製方法であって、以下のステップ:
a. Fc-融合タンパク質を含む流体をプロテインA又はプロテインGアフィニティークロマトグラフィーに供し;
b. ステップ(a)の溶出液をカチオン交換クロマトグラフィーに供し;
c. ステップ(b)の溶出液をアニオン交換クロマトグラフィーに供し;
d. ステップ(c)のフロースルーをヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供し、及び溶出液を集めて、精製されたFc-融合タンパク質を得ること、
を含む、前記方法。 - ステップ(a)の溶出液が2.8〜4.5の範囲のpHで実行される、請求項1記載の方法。
- 前記ステップ(b)が、
1. 充填後のカチオン交換樹脂を6〜7の範囲のpH及び6〜10 mS/cmの範囲の導電率を有する緩衝液で洗浄し;及び
2. カラムを7.3〜8.2の範囲のpH及び15〜22 mS/cmの範囲の導電率を有する緩衝液で溶出すること、
を更に含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。 - 前記ステップ(c)において、平衡化及び充填が、3〜4.6 mS/cmの範囲の導電率及びFc-融合タンパク質のpl値未満の1単位のpHを有する緩衝液で行われる、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 前記ステップ(d)における溶出が、3〜10 mMの範囲の濃度のリン酸ナトリウムの存在下で行われる、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 前記ステップ(d)における溶出が、0.4〜1 Mの範囲の塩化カルシウムの存在下で行われる、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 前記ステップ(d)における溶出が、6〜7の範囲のpHで行われる、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
- 前記ステップ(a)が、組換えプロテインA又はプロテインGで修飾された架橋アガロースを含む樹脂上で行われる、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
- 前記ステップ(b)が強力なカチオン交換樹脂上で行われる、請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。
- 前記樹脂が、SO3 -基で修飾された架橋メタクリレートを含む、請求項9記載の方法。
- 前記ステップ(c)が、強力なアニオン交換樹脂上で行われる、請求項1〜11のいずれか1項記載の方法。
- 前記樹脂が、N+(CH3)3で修飾されたポリスチレン/ジビニルベンゼンを含む、請求項11記載の方法。
- 前記ステップ(d)がセラミック性ヒドロキシアパタイト樹脂上で行われる、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
- 前記セラミック性ヒドロキシアパタイト樹脂が、40 μmのサイズを有する粒子を含む、請求項13記載の方法。
- 限界濾過の少なくとも1つのステップを更に含む、請求項1〜14のいずれか1項記載の方法。
- 前記限界濾過ステップが、ステップ(b)と(c)との間、及び/又はステップ(d)の後で行われる、請求項15記載の方法。
- Fc-融合タンパク質の医薬組成物への調合を更に含む、請求項1〜16のいずれか1項記載の方法。
- 前記Fc-融合タンパク質が8〜9のplを有する、請求項1〜17のいずれか1項記載の方法。
- 前記Fc-融合タンパク質が8.3〜8.6のplを有する、請求項18記載の方法。
- 前記Fc-融合タンパク質が腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーのメンバーのリガンド結合タンパク質を含む、請求項1〜19のいずれか1項記載の方法。
- 前記リガンド結合タンパク質が、TNFR1、TNFR2、又はそのTNFの結合断片の細胞外ドメインから選ばれる、請求項20記載の方法。
- 前記リガンド結合部分が、BAFF-R、BCMA、TACIの細胞外ドメイン、又はBlys又はAPRILの少なくとも1つと結合するその断片から選ばれる、請求項20記載の方法。
- 前記Fc-融合タンパク質が、以下:
(a) 配列番号2のアミノ酸34〜66;
(b) 配列番号2のアミノ酸71〜104;
(c) 配列番号2のアミノ酸34〜104;
(d) 配列番号2のアミノ酸30〜110;
(e) 配列番号3;
(f) 配列番号4;
(g) 高ストリンジェントな条件下で配列番号5、6又は7の補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;及び
(h) (c)、(d)、(e)又は(f)のポリペプチドと少なくとも80 %、85 %、90 %又は95 %の配列同一性を有する(c)、(d)、(e)又は(f)のいずれかの変異タンパク質、
から選ばれるポリペプチドを含み;
ここで、該ポリペプチドは少なくとも1つのBlys又はAPRILに結合する、請求項22記載の方法。 - 前記Fc-融合タンパク質が免疫グロブリンの重鎖定常領域を含む、請求項1〜23のいずれか1項記載の方法。
- 前記定常領域がヒト定常領域である、請求項24記載の方法。
- 前記免疫グロブリンがIgG1である、請求項24又は25記載の方法。
- 前記定常領域が、ヒンジ、CH2及びCH3ドメインを含む、請求項23〜25のいずれか1項記載の方法。
- 前記Fc-融合タンパク質が、以下:
(a) 配列番号2のアミノ酸34〜66;
(b) 配列番号2のアミノ酸71〜104;
(c) 配列番号2のアミノ酸34〜104;
(d) 配列番号2のアミノ酸30〜110;
(e) 配列番号3;
(f) 配列番号4;
(g) 高ストリンジェントな条件下で配列番号5、6又は7の補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;及び
(h) (c)、(d)、(e)又は(f)のポリペプチドと少なくとも80 %、85 %、90 %又は95 %の配列同一性を有する(c)、(d)、(e)又は(f)のいずれかの変異タンパク質、
から選ばれるポリペプチドを含み;
ここで、該ポリペプチドは少なくとも1つのBlys又はAPRILに結合する、請求項1〜27のいずれか1項記載の方法によって得られた精製Fc-融合タンパク質組成物であって、
タンパク質凝集体の1 %未満又は0.5 %未満を含み、遊離のFcタンパク質の1 %未満、0.5 %未満又は0.1 %未満を含む、前記組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP06119610 | 2006-08-28 | ||
US84268206P | 2006-09-06 | 2006-09-06 | |
PCT/EP2007/058886 WO2008025747A1 (en) | 2006-08-28 | 2007-08-27 | Process for the purification of fc-fusion proteins |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010501622A true JP2010501622A (ja) | 2010-01-21 |
Family
ID=38625870
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009526067A Pending JP2010501622A (ja) | 2006-08-28 | 2007-08-27 | Fc−融合タンパク質の精製法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2010501622A (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013540787A (ja) * | 2010-11-01 | 2013-11-07 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー.ブイ. | 単一ユニットイオン交換クロマトグラフィー抗体精製 |
JP2014520814A (ja) * | 2011-07-08 | 2014-08-25 | メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション | Fc融合タンパク質の精製方法 |
JP2016019527A (ja) * | 2010-05-26 | 2016-02-04 | 石▲薬▼集▲団▼中奇制▲薬▼技▲術▼(石家庄)有限公司Cspc Zhongqi Pharmaceutical Technology(Shijiazhuang)Co.,Ltd. | B細胞活性化因子の拮抗物質、その調製方法及び利用法 |
JP2017521389A (ja) * | 2014-06-13 | 2017-08-03 | ルピン・リミテッド | TNFR:Fc融合タンパク質の精製方法 |
US11274140B2 (en) | 2020-05-08 | 2022-03-15 | Alpine Immune Sciences, Inc. | APRIL and BAFF inhibitory immunomodulatory proteins and methods of use thereof |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07504203A (ja) * | 1992-09-15 | 1995-05-11 | イミュネックス・コーポレーション | 腫瘍壊死因子アンタゴニストを用いるtnf−依存性炎症の治療方法 |
JP2004535182A (ja) * | 2001-05-24 | 2004-11-25 | ザイモジェネティクス,インコーポレイティド | Taci−免疫グロブリン融合タンパク質 |
WO2005100394A2 (en) * | 2004-04-14 | 2005-10-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | PURIFIED INTERLEUKIN-15/Fc FUSION PROTEIN AND PREPARATION THEREOF |
JP2005538686A (ja) * | 2001-12-21 | 2005-12-22 | イミュネックス・コーポレーション | タンパク質の精製方法 |
-
2007
- 2007-08-27 JP JP2009526067A patent/JP2010501622A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07504203A (ja) * | 1992-09-15 | 1995-05-11 | イミュネックス・コーポレーション | 腫瘍壊死因子アンタゴニストを用いるtnf−依存性炎症の治療方法 |
JP2004535182A (ja) * | 2001-05-24 | 2004-11-25 | ザイモジェネティクス,インコーポレイティド | Taci−免疫グロブリン融合タンパク質 |
JP2005538686A (ja) * | 2001-12-21 | 2005-12-22 | イミュネックス・コーポレーション | タンパク質の精製方法 |
WO2005100394A2 (en) * | 2004-04-14 | 2005-10-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | PURIFIED INTERLEUKIN-15/Fc FUSION PROTEIN AND PREPARATION THEREOF |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016019527A (ja) * | 2010-05-26 | 2016-02-04 | 石▲薬▼集▲団▼中奇制▲薬▼技▲術▼(石家庄)有限公司Cspc Zhongqi Pharmaceutical Technology(Shijiazhuang)Co.,Ltd. | B細胞活性化因子の拮抗物質、その調製方法及び利用法 |
KR101810551B1 (ko) | 2010-05-26 | 2017-12-19 | 씨에스피씨 종콰이 팔마씨우티컬 테크놀로지 (스자좡) 컴퍼니 리미티드 | B세포 활성인자길항제 및 그의 제조방법과 용도 |
JP2013540787A (ja) * | 2010-11-01 | 2013-11-07 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー.ブイ. | 単一ユニットイオン交換クロマトグラフィー抗体精製 |
JP2014520814A (ja) * | 2011-07-08 | 2014-08-25 | メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション | Fc融合タンパク質の精製方法 |
JP2017521389A (ja) * | 2014-06-13 | 2017-08-03 | ルピン・リミテッド | TNFR:Fc融合タンパク質の精製方法 |
US11274140B2 (en) | 2020-05-08 | 2022-03-15 | Alpine Immune Sciences, Inc. | APRIL and BAFF inhibitory immunomodulatory proteins and methods of use thereof |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8513393B2 (en) | Process for the purification of Fc-containing proteins | |
AU2007291282B2 (en) | Process for the purification of Fc-fusion proteins | |
US8168185B2 (en) | Process for the purification of anti CD-25 antibodies | |
US20100249381A1 (en) | Method for Purifying FC-Fusion Proteins | |
AU2002359816A1 (en) | Methods for purifying protein | |
US20100256337A1 (en) | Method for purifying an fc-containing protein | |
JP2010501622A (ja) | Fc−融合タンパク質の精製法 | |
NZ574626A (en) | Process for removing free Fc-moieties from fluids comprising Fc-containing proteins using ion exchange chromatography | |
EP2121931B1 (en) | Purification of fc-tact fusion proteins using the oilbody technology |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100826 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121106 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130205 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130213 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130507 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20130528 |