ES2329012T3

ES2329012T3 - Receptor del factor de necrosis tumoral humano.

Info

Publication number: ES2329012T3
Application number: ES01990899T
Authority: ES
Inventors: Jane A. Gross; Wenfeng Xu; Randal M. Henne; Francis J. Grant
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2000-11-07
Filing date: 2001-11-05
Publication date: 2009-11-20
Anticipated expiration: 2021-11-05
Also published as: DK1407017T3; ATE432986T1; WO2002038766A2; US20070066805A1; US7608686B2; WO2002038766A3; US20070060742A1; JP2009225798A; EP1407017B1; DE60138927D1; JP2004516826A; AU2002230659A1; EP1407017A2; US20070073041A1; US7799543B2; US20100197895A1; US20070178492A1; US20070264689A1; US20030092164A1; CA2428242A1

Abstract

Un polipéptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de: (a) los residuos de aminoácidos 1-69 de SEQ ID Nº: 2; (b) los residuos de aminoácidos 1-45 de SEQ ID Nº: 2; (c) los residuos de aminoácidos 1-17 de SEQ ID Nº: 2; y (d) los residuos de aminoácidos 39-64 de SEQ ID Nº:

Description

Receptor del factor de necrosis tumoral humano.

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a una proteína nueva expresada por las células humanas. En particular, la presente invención se refiere a un gen nuevo que codifica un receptor, denominado "Ztnfr12", y a las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos Ztnfr12.

Antecedentes de la invención

Las citocinas son proteínas solubles pequeñas que median una diversidad de efectos biológicos, que incluyen la regulación del crecimiento y la diferenciación de muchos tipos de células (véase, por ejemplo, Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul y Seder, Cell 76:241 (1994)). Las proteínas que constituyen el grupo de las citocinas incluyen las interleucinas, interferones, factores estimulantes de colonias, factores de necrosis tumoral, y otras moléculas reguladoras. Por ejemplo, la interleucina 17 humana es una citocina que estimula la expresión de la interleucina 6, la molécula de adhesión intracelular 1, interleucina 8, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, y la expresión de prostaglandina E2, y desempeña un papel en la maduración preferente de los precursores hematopoyéticos CD34+ hasta neutrófilos (Yao et al., J. Immunol. 155:5483 (1995); Fossiez et al., J. Exp. Med. 183:2593 (1996)).

Los receptores que se unen a citocinas están compuestos generalmente de una o más proteínas integrales de membrana que se unen a la citocina con una afinidad elevada, y transducen esta unión en la célula por medio de las porciones citoplasmáticas de ciertas subunidades del receptor. Los receptores de citocinas se han agrupado en varias clases basándose en las similitudes de sus dominios extracelulares de unión al ligando. Por ejemplo, las cadenas del receptor responsables de la unión y/o de la transducción del efecto de los interferones son miembros de la familia de receptores de citocinas de tipo II, basándose en un dominio extracelular característico de 200 residuos.

Las interacciones celulares, que se dan durante una respuesta inmunitaria, son reguladas por miembros de varias familias de receptores de la superficie celular, que incluyen la familia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFR). La familia TNFR consiste en varios receptores glicoproteicos integrales de membrana muchos de los cuales, junto con sus ligandos respectivos, regulan las interacciones entre las diferentes líneas de células hematopoyéticas (véase, por ejemplo, Cosman, Stem Cells 12:440 (1994); Wajant et al., Cytokine Growth Factor Rev. 10:15 (1999); Yeh et al., Immunol. Rev. 169:283 (1999); Idriss y Naismith, Microsc. Res. Tech. 50:184 (2000)).

Uno de tales receptores es TACI, activador transmembrana e interaccionador con CAML (von Bülow y Bram, Science 228:138 (1997); publicación PCT WO 98/39361). TACI es un receptor asociado a la membrana, que tiene un dominio extracelular que contiene dos pseudo-repeticiones ricas en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático que interacciona con CAML (ligando de ciclofilina modulador del calcio), una proteína integral de membrana localizada en las vesículas intracelulares que es un co-inductor de la activación de NF-AT cuando se sobreexpresa en células Jurkat. TACI está asociado a las células B y a un subgrupo de células T.

Las actividades in vivo demostradas de los receptores de factores de necrosis tumoral ilustran el potencial clínico, y la necesidad, de otros receptores semejantes, así como de los agonistas y antagonistas de los receptores de factores de necrosis tumoral.

El documento WO 02/24909 describe ácidos nucleicos que codifican polipéptidos BAFF-R, y los correspondientes polipéptidos, composiciones, métodos y usos.

La presente invención proporciona un polipéptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

(a): los residuos de aminoácidos 1-69 de SEQ ID Nº: 2;

(b): los residuos de aminoácidos 1-45 de SEQ ID Nº: 2;

(c): los residuos de aminoácidos 1-17 de SEQ ID Nº: 2; y

(d): los residuos de aminoácidos 39-64 de SEQ ID Nº: 2.

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La presente invención proporciona también una molécula de ácido nucleico aislada que consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada de:

(a): los nucleótidos 27-233 de SEQ ID Nº: 1;

(b): los nucleótidos 163-393 de SEQ ID Nº: 1;

(c): los nucleótidos 27-578 de SEQ ID Nº: 1;

(d): los nucleótidos 394-578 de SEQ ID Nº: 1; y

(e): los nucleótidos 27-162 de SEQ ID Nº: 1.

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La Figura 1 es un diagrama esquemático de una inmunoglobulina de la subclase IgG1. C_{L}: región constante de la cadena ligera; C_{H}1, C_{H}2, C_{H}3: regiones constantes de la cadena pesada; V_{L}: región variable de la cadena ligera; V_{H}: región variable de la cadena pesada; CHO: carbohidrato; N: extremo aminoterminal; C: extremo carboxiterminal.

ZTNF4 es un miembro de la familia de ligandos de factores de necrosis tumoral (TNF) (SEQ ID Nº:5). Esta molécula se ha denominado también "BAFF", "BLyS", "TALL-1", y "THANK" (Moore et al., Science 285:269 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem. 274:15978 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med. 189:1747 (1999); Shu et al., J. Leukoc. Biol. 65:680 (1999)). Se han identificado dos receptores que se unen a ZTNF4: el activador transmembrana e interaccionador con CAML (TACI) y el receptor de maduración de células B (BCMA) (Gross et al., Nature 404:995 (2000)). Se usó ZTNF4 biotinilado para identificar receptores nuevos potenciales para este ligando. En estos estudios, se midió la unión de ZTNF4 biotinilado a un panel de células tumorales mediante el uso de citometría de flujo. Sorprendentemente, se descubrió que ZTNF4 se une a una línea de células precursoras linfoides B humanas (células REH), aunque hubo poca unión de las células con anticuerpos monoclonales hacia TACI, o anticuerpos policlonales hacia BCMA. Se obtuvieron resultados similares con células BJAB, derivadas de un linfoma humano. Estas observaciones indicaron que ZTNF4 se unía a un receptor distinto de TACI o BCMA.

Para investigar adicionalmente esta posibilidad, se unió ZTNF4 marcado con ^{125}I a las células precursoras linfoides B, y se llevó a cabo un entrecruzamiento con moléculas de la superficie celular. El tratamiento con anticuerpos policlonales anti-ZTNF4 produjo un precipitado radiactivo, mientras el tratamiento con anticuerpos policlonales anti-TACI o anti-BCMA no produjo un precipitado radiactivo. Así, estos datos apoyaron la hipótesis de que un receptor nuevo justificase la unión de ZTNF4 a las células. El receptor, denominado "Ztnfr12", se aisló como se describe en el Ejemplo 1. Los estudios de unión indicaron que el receptor nuevo se une a ZTNF4, pero no a un ligando denominado "ZTNF2" (SEQ ID Nº:6). ZTNF2 se ha denominado también "APRIL" y "ligando de apoptosis 1 asociado a TNRF" (Hahne et al., J. Exp. Med. 188:1185 (1998); Kelly et al., Cancer Res. 60:1021 (2000)).

Las características de unión de Ztnfr12 se investigaron también mediante el uso de células hospedadoras recombinantes. Se transfectaron células de riñón de crías de hámster con un vector de expresión que comprendía las secuencias codificantes de Ztnfr12, y las células transfectadas se usaron en un estudio de unión con ZTNF4 marcado con I^{125}. Los estudios de unión y los análisis de Scatchard indicaron que la Kd de ZTNF4 para Ztnfr12 es 1,0 nM, que es comparable a la Kd de ZTNF4 para el receptor TACI (1,25 nM) expresado en células de riñón de crías de hámster transfectadas con un vector de expresión de TACI. Las células transfectadas expresaron aproximadamente 150 x 10^{6} receptores de la superficie celular Ztnfr12 por célula.

ZTNF4 parece unirse a prácticamente todas las células B periféricas CD19^{+} maduras, débilmente a las células B inmaduras en la médula ósea, y a la mayoría de las líneas de células B transformadas. Sin embargo, varios linfomas B, por ejemplo REH y BJAB, se unen a ZTNF4 pero no expresan niveles apreciables de TACI ni de BCMA. Además, se determinó la expresión superficial de TACI y BCMA y la unión de ZTNF4 en células aisladas de amígdala, sangre periférica y médula ósea humanas mediante el uso de citometría de flujo. Los resultados indican que TACI y BCMA se expresan a niveles máximos en la población de células B más inmaduras, IgM^{+}IgD^{lo}, en amígdala y sangre periférica humanas. Los niveles de expresión de ambos receptores disminuyen en la superficie de las células B IgM^{+}IgD^{+} más maduras, y se hallan a niveles muy bajos en las células B IgM^{-}IgD^{+}, una población que representa la etapa más madura de la maduración de las células B. Sin embargo, el ligando ZTNF4 se une a prácticamente todas las células B maduras a niveles elevados. En conjunto, estos datos implican la presencia de receptores adicionales para ZTNF4 en ciertos tumores de células B y en las células B humanas periféricas. Estos datos indican que Ztnfr12 se expresa a niveles máximos en la mayoría de las células B IgM^{-}IgD^{+} maduras, y pueden explicar los niveles elevados de unión de ZTNF4 a esta población.

Una secuencia de nucleótidos ilustrativa que codifica Ztnfr12 se proporciona en SEQ ID Nº:1. El polipéptido codificado tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: MRRGPRSLRG RDAPAPTPCV PAECFDLLVR HCVACGLLRT PRPKPAGASS PAPRTALQPQ ESVGAGAGEA ALPLPGLLFG APALLGLALV LALVLVGLVS WRRRQRRLRG ASSAEAPDGD KDAPEPLDKV IILSPGISDA TAPAWPPPGE DPGTTPPGHS VPVPATELGS TELVTTKTAG
PEQQ (SEQ ID Nº:2). Las características del polipéptido Ztnfr12 incluyen un dominio extracelular que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:2 o los residuos de aminoácidos 1 a 79 de SEQ ID Nº:2, un dominio transmembrana que comprende los residuos de aminoácidos 70 a 100 de SEQ ID Nº:2 o los residuos de aminoácidos 80 a 100 de SEQ ID Nº:2, y un dominio intracelular aproximadamente en los residuos de aminoácidos 101 a 184 de SEQ ID Nº:2.

Se proporciona una secuencia de nucleótidos que incluye el gen Ztnfr12 en SEQ ID Nº:9. El gen Ztnfr12 comprende tres exónes. Con referencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:2, el exón 1 codifica los residuos de aminoácidos 1 al primer nucleótido del codón del aminoácido 46, el exón 2 codifica el resto del aminoácido 46 al primer nucleótido del codón del aminoácido 123, y el exón 3 codifica el resto del aminoácido 123 al aminoácido 184. La región sin traducir de 3' incluye los nucleótidos 2405 a alrededor de 5720 de SEQ ID Nº:9. La Tabla 1 proporciona características adicionales de esta secuencia de nucleótidos.

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TABLA 1

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1

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El gen Ztnfr12 reside en el cromosoma 22q13.2, y Ztnfr12 se expresa en la mayoría de tejidos linfáticos (p.ej., tejido de nódulo linfático), tumores de células B, y células B de centros germinales. Los análisis de transferencia de Northern y de transferencia en mancha revelaron que la expresión del gen Ztnfr12 es detectable en el bazo, nódulo linfático, linfocitos de sangre periférica, riñón, corazón, hígado, músculo esquelético, páncreas, glándula suprarrenal, testículo, cerebro, útero, estómago, médula ósea, tráquea, timo, placenta, hígado fetal y células Raji. Las señales más intensas estuvieron asociadas a los tejidos de bazo y de nódulo linfático, mientras las señales débiles estuvieron asociadas a los tejidos de cerebro, útero y placenta. Por lo tanto, se pueden usar los anticuerpos hacia Ztnfr12 y las sondas de ácidos nucleicos para diferenciar estos tejidos.

La presente memoria descriptiva describe polipéptidos aislados que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70%, al menos un 80%, o al menos un 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) los residuos de aminoácidos 7 a 69 de SEQ ID Nº:2, (b) los residuos de aminoácidos 7 a 79 de SEQ ID Nº:2, (c) los residuos de aminoácidos 7 a 39 de SEQ ID Nº:2, (d) los residuos de aminoácidos 19 a 35 de SEQ ID Nº:2, (e) los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:2, (f) los residuos de aminoácidos 1 a 79 de SEQ ID Nº:2, (g) los residuos de aminoácidos 1 a 39 de SEQ ID Nº:2, (h) los residuos de aminoácidos 1 a 71 de SEQ ID Nº:2, (i) los residuos de aminoácidos 7 a 71 de SEQ ID Nº:2, (j) los residuos de aminoácidos 70 a 100 de SEQ ID Nº:2, (k) los residuos de aminoácidos 80 a 100 de SEQ ID Nº:2, (l) los residuos de aminoácidos 101 a 184 de SEQ ID Nº:2, y (m) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:2. Ciertos polipéptidos Ztnfr12 se unen específicamente a un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:2. Ciertos polipéptidos Ztnfr12 se unen específicamente a ZTNF4, mientras otros polipéptidos se unen específicamente a ZTNF4, pero no se unen específicamente a ZTNF2. Los polipéptidos Ztnfr12 ilustrativos incluyen los polipéptidos que comprenden, o que consisten en, los residuos de aminoácidos 7 a 69 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 79 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 39 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 19 a 35 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 79 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 71 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 71 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 39 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 80 a 100 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 70 a 100 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 101 a 184 de SEQ ID Nº:2, y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:2. La presente memoria descriptiva también describe polipéptidos aislados que comprenden al menos 15, o al menos 30, residuos de aminoácidos contiguos de los residuos de aminoácidos 7 a 69 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 79 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 39 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 19 a 35 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 79 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 71 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 71 de SEQ ID Nº:2, o los residuos de aminoácidos 1 a 39 de SEQ ID Nº:2.

La presente memoria descriptiva también describe polipéptidos codificados por al menos un exón de Ztnfr12. Por ejemplo, tales polipéptidos pueden consistir en las siguientes secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nº:2: los residuos de aminoácidos 1 a 45, los residuos de aminoácidos 47 a 122, y los residuos de aminoácidos 124 a 184.

La presente memoria descriptiva también describe polipéptidos Ztnfr12 variantes, en los que la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante comparte identidad con los residuos de aminoácidos 7 a 69 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 79 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 39 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 19 a 35 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 79 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 39 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 71 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 71 de SEQ ID Nº:2, o los residuos de aminoácidos 1 a 184 de SEQ ID Nº:2, seleccionados del grupo que consiste en al menos un 70% de identidad, al menos un 80% de identidad, al menos un 90% de identidad, al menos un 95% de identidad, o más del 95% de identidad, y en los que cualquier diferencia entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante y la secuencia de aminoácidos correspondiente de SEQ ID Nº:2 es debida a una o más sustituciones conservativas de aminoácidos.

La presente memoria descriptiva también describe anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente a tales polipéptidos. Los anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales murinos, anticuerpos humanizados derivados de anticuerpos monoclonales murinos, y anticuerpos monoclonales humanos. Los fragmentos de anticuerpos ilustrativos incluyen F(ab')_{2}, F(ab)_{2}, Fab', Fab, Fv, scFv, y las unidades mínimas de reconocimiento. La presente invención incluye además composiciones que comprenden un vehículo y un péptido, polipéptido, anticuerpo, o un anticuerpo anti-idiotipo descrito en el presente documento.

La presente memoria descriptiva también describe moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido Ztnfr12, en las que la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en: (a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº:3, (b) una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos de aminoácidos 7 a 69 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 79 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 39 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 19 a 35 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 79 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 39 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 71 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 71 de SEQ ID Nº:2, o los residuos de aminoácidos 1 a 184 de SEQ ID Nº:2, y (c) una molécula de ácido nucleico que permanece hibridada tras ser sometida a condiciones rigurosas de lavado a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 27 a 578 de SEQ ID Nº:1, la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 27 a 233 de SEQ ID Nº:1, la secuencia complementaria de la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 27 a 578 de SEQ ID Nº:1, o la secuencia complementaria de la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 27 a 233 de SEQ ID Nº:1. Las moléculas de ácido nucleico ilustrativas incluyen aquellas en las que cualquier diferencia entre la secuencia de aminoácidos codificada por la molécula de ácido nucleico (c) y la secuencia de aminoácidos correspondiente de SEQ ID Nº:2 es debida a una sustitución conservativa de
aminoácidos.

La presente memoria descriptiva también describe moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden los nucleótidos 27 a 578 de SEQ ID Nº:1 (que codifica los residuos de aminoácidos 1 a 184 de SEQ ID Nº:2), los nucleótidos 27 a 233 de SEQ ID Nº:1 (que codifica los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:2), los nucleótidos 27 a 263 de SEQ ID Nº:1 (que codifica los residuos de aminoácidos 1 a 79 de SEQ ID Nº:2), los nucleótidos 45 a 233 de SEQ ID Nº:1 (que codifica los residuos de aminoácidos 7 a 69 de SEQ ID Nº:2), los nucleótidos 45 a 263 de SEQ ID Nº:1 (que codifica los residuos de aminoácidos 7 a 79 de SEQ ID Nº:2), los nucleótidos 45 a 143 de SEQ ID Nº:1 (que codifica los residuos de aminoácidos 7 a 39 de SEQ ID Nº:2), los nucleótidos 81 a 131 de SEQ ID Nº:1 (que codifica los residuos de aminoácidos 19 a 35 de SEQ ID Nº:2), los nucleótidos 27 a 239 de SEQ ID Nº:1 (que codifica los residuos de aminoácidos 1 a 71 de SEQ ID Nº:2), los nucleótidos 45 a 239 de SEQ ID Nº:1 (que codifica los residuos de aminoácidos 7 a 71 de SEQ ID Nº:2), y los nucleótidos 327 a 578 de SEQ ID Nº:1 (que codifica los residuos de aminoácidos 101 a 184 de SEQ ID Nº:2).

La presente memoria descriptiva también describe moléculas de ácido nucleico que consisten en la secuencia de nucleótidos de un exón o intrón de Ztnfr12. Las secuencias de nucleótidos de estos exónes e intrones se identifican en la Tabla 1.

La presente memoria descriptiva también describe vectores y vectores de expresión que comprenden tales moléculas de ácido nucleico. Tales vectores de expresión pueden comprender un promotor de la transcripción y un terminador de la transcripción, en el que el promotor está unido de manera operable a la molécula de ácido nucleico, y en el que la molécula de ácido nucleico está unida de manera operable al terminador de la transcripción. La presente memoria descriptiva también describe células hospedadoras recombinantes y virus recombinantes que comprenden estos vectores y vectores de expresión. Las células hospedadoras ilustrativas incluyen células bacterianas, aviares, de levadura, fúngicas, de insecto, mamíferas y vegetales. Se pueden usar células hospedadoras recombinantes que comprenden tales vectores de expresión para producir polipéptidos Ztnfr12 cultivando tales células hospedadoras recombinantes que comprenden el vector de expresión y que producen la proteína Ztnfr12, y, opcionalmente, aislando la proteína Ztnfr12 a partir de las células hospedadoras recombinantes cultivadas. La presente memoria descriptiva también describe los productos de tales procesos.

La presente memoria descriptiva también describe polipéptidos que comprenden los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:13, polipéptidos que comprenden al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, o al menos 30 residuos de aminoácidos consecutivos de los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:13, polipéptidos que comprenden los residuos de aminoácidos 21 a 38 de SEQ ID Nº:13, proteínas de fusión que comprenden los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:13, moléculas de ácido nucleico que codifican tales secuencias de aminoácidos, vectores de expresión que comprenden tales moléculas de ácido nucleico, y células hospedadoras recombinantes que comprenden tales vectores de expresión. La presente memoria descriptiva también describe métodos para la producción de polipéptidos Ztnfr12 murinos mediante el uso de tales células hospedadoras recombi-
nantes.

Una alineación de las secuencias de aminoácidos de TACI, BCMA, Ztnfr12 humano, y Ztnfr12 murino reveló el siguiente motivo en los dominios extracelulares: C[NVPS][QPE][TAEN][EQ][CY][FW]D[PLS]L[VL][RGH][NHTA]C[VMI][SAP]C, en el que los aminoácidos aceptables para una posición dada se indican entre corchetes (SEQ ID Nº:46). La presente memoria descriptiva describe polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que consiste en este motivo, en los que los polipéptidos se unen a ZTNF4. La presente memoria descriptiva también describe anticuerpos que se unen a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en este
motivo.

Además, la presente memoria descriptiva describe composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y al menos uno de tales vectores de expresión o virus recombinantes que comprenden tales vectores de expresión. La presente memoria descriptiva también describe composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y un polipéptido descrito en el presente documento.

La presente memoria descriptiva también describe métodos para detectar la presencia de ARN de Ztnfr12 en una muestra biológica, que comprende las etapas de (a) poner en contacto una sonda de ácido nucleico de Ztnfr12 en condiciones de hibridación con (i) moléculas de ARN de ensayo aisladas a partir de la muestra biológica, o (ii) moléculas de ácido nucleico sintetizadas a partir de las moléculas de ARN aisladas, en la que la sonda tiene una secuencia de nucleótidos que comprende una porción de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº:1, o su complemento, y (b) detectar la formación de híbridos de la sonda de ácido nucleico y de las moléculas de ARN de ensayo o de las moléculas de ácido nucleico sintetizadas, en la que la presencia de los híbridos indica la presencia de ARN de Ztnfr12 en la muestra biológica. Por ejemplo, las sondas adecuadas consisten en las siguientes secuencias de nucleótidos: los nucleótidos 27 a 578 de SEQ ID Nº:1, y los nucleótidos 27 a 233 de SEQ ID Nº:1. Otras sondas adecuadas consisten en el complemento de estas secuencias de nucleótidos, o una porción de las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento, o sus complementos.

La presente memoria descriptiva también describe métodos para detectar la presencia del polipéptido Ztnfr12 en una muestra biológica, que comprenden las etapas de: (a) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo o con un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:2, en el que la puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones que permiten la unión del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo a la muestra biológica, y (b) detectar el anticuerpo unido o el fragmento de anticuerpo unido. Tal anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender además un marcador detectable seleccionado del grupo que consiste en un radioisótopo, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marcador enzimático, marcador bioluminiscente y oro coloidal.

La presente memoria descriptiva también describe equipos para llevar a cabo estos métodos de detección. Por ejemplo, un equipo para la detección de la expresión del gen Ztnfr12 puede comprender un recipiente que comprende una molécula de ácido nucleico, en el que la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en: (a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 27 a 233 de SEQ ID Nº:1, (b) una molécula de ácido nucleico que comprende el complemento de los nucleótidos 27 a 233 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº:1, y (c) una molécula de ácido nucleico que es un fragmento de (a) o (b) que consiste en al menos ocho nucleótidos. Tal equipo puede comprender también un segundo recipiente que comprende uno o más reactivos capaces de indicar la presencia de la molécula de ácido nucleico. Por otra parte, un equipo para la detección de la proteína Ztnfr12 puede comprender un recipiente que comprende un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, que se une específicamente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
Nº:2.

La presente memoria descriptiva también describe anticuerpos anti-idiotipo, o fragmentos de anticuerpos anti-idiotipo, que se unen específicamente a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:2. Un anticuerpo anti-idiotipo ejemplar se une a un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que consiste en los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 79 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 69 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 79 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 71 de SEQ ID Nº:2, o los residuos de aminoácidos 7 a 71 de SEQ ID Nº:2.

La presente memoria descriptiva también describe proteínas de fusión, que comprenden un polipéptido Ztnfr12 y un resto de inmunoglobulina. En tales proteínas de fusión, el resto de inmunoglobulina puede ser una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, tal como un fragmento F_{c} humano. La presente memoria descriptiva también describe moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican tales proteínas de fusión.

La presente memoria descriptiva también describe métodos para inhibir, en un mamífero, la actividad de un ligando que se une a Ztnfr12 (p.ej., ZTNF4), que comprende administrar al mamífero una composición que comprende al menos uno de: (a) un receptor Ztnfr12 soluble, (b) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular de Ztnfr12, y (c) una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular de Ztnfr12. Como ilustración, tal composición se puede usar para tratar trastornos o enfermedades asociadas a los linfocitos B, linfocitos B activados, o linfocitos B en reposo. Los ejemplos de linfomas de células B que se pueden tratar con las moléculas descritas en el presente documento incluyen el linfoma de Burkitt, linfoma no Burkitt, linfoma no hodgkiniano, mieloma múltiple, linfoma folicular, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfoma de células grandes, linfoma de zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma de células grandes (p.ej., linfoma inmunoblástico), linfoma linfocítico pequeño, y otros linfomas de células B. Tales composiciones se pueden usar también para tratar linfomas de células T, que incluyen el linfoma linfoblástico, linfoma anaplásico de células grandes, linfoma de células T cutáneo, linfomas de células T periféricas, linfoma angioinmunoblástico, linfoma angiocéntrico, linfoma intestinal de células T, linfoma de células T del adulto, leucemia de células T del adulto, y
similares.

Por ejemplo, la presente memoria descriptiva describe métodos para inhibir la proliferación de células tumorales (p.ej., células de linfoma de células B o células de linfoma de células T), que comprenden administrar a las células tumorales una composición que comprende al menos uno de: (a) receptor Ztnfr12 soluble, (b) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular de Ztnfr12, y (c) una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular de Ztnfr12. Tal composición se puede administrar a células cultivadas in vitro. De forma alternativa, la composición puede ser una composición farmacéutica, en la que la composición farmacéutica se administra a un sujeto que tiene un tumor.

Un ejemplo de una proteína de fusión es una proteína de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina que comprende el dominio extracelular de Ztnfr12, que es un polipéptido Ztnfr12 que comprende un fragmento de un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:2, y un resto de inmunoglobulina que comprende una región constante de una inmunoglobulina. Un resto de inmunoglobulina puede comprender una región constante de la cadena pesada. Una proteína de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina puede ser un monómero, un dímero, u otra configuración, como se discute más adelante.

Una composición que comprende un componente de anticuerpo anti-Ztnfr12 se puede administrar a células tumorales para inhibir la proliferación de las células. La composición se puede administrar a las células cultivadas in vitro, o la composición puede ser una composición farmacéutica que se administra a un sujeto que tiene un tumor. Tales composiciones pueden comprender un componente de anticuerpo anti-Ztnfr12 que es un anticuerpo anti-Ztnfr12 desnudo, o tales composiciones pueden comprender un componente de anticuerpo anti-Ztnfr12 que es un fragmento de anticuerpo anti-Ztnfr12 desnudo. Además, la composición puede comprender un inmunoconjugado que comprende un componente de anticuerpo anti-Ztnfr12 y un agente terapéutico. Los agentes terapéuticos pueden incluir un fármaco quimioterápico, citotoxina, inmunomodulador, agente quelante, compuesto de boro, agente fotoactivo, colorante fotoactivo, y radioisótopo. Tales composiciones pueden comprender una proteína de fusión de anticuerpo que comprende un componente de anticuerpo anti-Ztnfr12 y un inmunomodulador o un polipéptido citotóxico. Otra forma de composición es un anticuerpo multiespecífico, que comprende un componente de anticuerpo anti-Ztnfr12 desnudo, y al menos uno de un componente de anticuerpo anti-BCMA desnudo, y un componente de anticuerpo anti-TACI desnudo. Una composición de anticuerpo multiespecífico puede comprender anticuerpos biespecíficos que se unen a Ztnfr12, y al menos uno de BCMA y TACI. Las composiciones de anticuerpos multiespecíficos pueden comprender además un agente terapéutico. Además, una composición de anticuerpos multiespecíficos puede comprender: (a) una proteína de fusión de anticuerpo anti-Ztnfr12 que comprende un inmunomodulador o un polipéptido citotóxico, y (b) al menos uno de un componente de anticuerpo anti-BCMA o un componente de anticuerpo
anti-TACI.

Los polipéptidos que comprenden un dominio extracelular de Ztnfr12 o anticuerpos anti-Ztnfr12 se pueden usar para tratar una enfermedad autoinmunitaria. Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias incluyen lupus eritematoso sistémico, miastenia gravis, esclerosis múltiple, diabetes mellitus insulinodependiente, y artritis reumatoide. Los polipéptidos que comprenden un dominio extracelular de Ztnfr12 o anticuerpos anti-Ztnfr12 se pueden usar también para tratar el asma, bronquitis, enfisema, e insuficiencia renal o enfermedad renal terminal. Las enfermedades renales ilustrativas incluyen glomerulonefritis, vasculitis, leucemia linfoide crónica, nefritis, y pielonefritis. Los polipéptidos que comprenden un dominio extracelular de Ztnfr12 o anticuerpos anti-Ztnfr12 se pueden usar además para tratar neoplasias renales, mielomas múltiples, linfomas, neuropatía de cadenas ligeras o amiloidosis.

La presente memoria descriptiva también describe métodos para inhibir la actividad de ZTNF4, en los que la actividad de ZTNF4 está asociada a las células T efectoras. En un método relacionado, la actividad de ZTNF4 está asociada a la regulación de la respuesta inmunitaria. En otro método, la actividad de ZTNF4 está asociada a la inmunosupresión. En otro método, la inmunosupresión está asociada al rechazo de un injerto, una enfermedad de injerto contra huésped, o inflamación. En otro método, la inmunosupresión está asociada a una enfermedad autoinmunitaria. Como ilustración, la enfermedad autoinmunitaria puede ser diabetes mellitus insulinodependiente o enfermedad de Crohn. En otros métodos, la inmunosupresión está asociada a inflamación. Tal inflamación puede estar asociada, por ejemplo, a dolor articular, hinchazón, anemia o choque séptico.

La presente memoria descriptiva también describe métodos para detectar una anormalidad en el cromosoma 22q13.2 en un sujeto (a) amplificando, a partir del ADN genómico aislado a partir de una muestra biológica del sujeto, las moléculas de ácido nucleico que (i) comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica al menos uno de los exónes 1 a 3 de Ztnfr12, o que (ii) comprenden una secuencia de nucleótidos que es el complemento de (i), y (b) detectando una mutación en las moléculas de ácido nucleico amplificadas, en los que la presencia de una mutación indica una anormalidad en el cromosoma 22q13.2. En las variaciones de estos métodos, la etapa de detección se lleva a cabo comparando la secuencia de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico amplificadas respecto de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº:1 o SEQ ID Nº:9.

La presente memoria descriptiva también describe métodos para detectar una anormalidad en el cromosoma 22q13.2 en un sujeto que comprenden: (a) amplificar, a partir del ADN genómico aislado a partir de una muestra biológica del sujeto, un segmento del gen Ztnfr12 que comprende la secuencia de nucleótidos de al menos uno del intrón 1 y el intrón 2, o la secuencia de nucleótidos complementaria de al menos uno del intrón 1 y el intrón 2, y (b) detectar una mutación en las moléculas de ácido nucleico amplificadas, en los que la presencia de una mutación indica una anormalidad en el cromosoma 22q13.2. En las variaciones de estos métodos, la etapa de detección se lleva a cabo uniendo los segmentos del gen Ztnfr12 amplificados a una membrana, y poniendo en contacto la membrana con una sonda de ácido nucleico en condiciones de hibridación de rigurosidad elevada, en los que la ausencia de híbridos indica una anormalidad asociada a la expresión de Ztnfr12, o una mutación en el cromosoma 22q13.2. Como ilustración, una sonda de ácido nucleico adecuada puede comprender la secuencia de nucleótidos (o el complemento de la secuencia de nucleótidos) de cualquiera de los intrones 1 y 2.

Las mutaciones o las alteraciones del gen Ztnfr12 o de sus productos génicos pueden incluir mutaciones puntuales, deleciones, inserciones, y reordenamientos. Otro ejemplo de una mutación del gen Ztnfr12 es la aneuploidía. La presente memoria descriptiva describe métodos para detectar una anormalidad en el cromosoma 22q13.2 en un sujeto, que comprenden la identificación de una alteración en la región en posición 5' del primer exón del gen Ztnfr12 (p.ej., en los nucleótidos 1 a 1000 de SEQ ID Nº:9) mediante el uso de los métodos de detección descritos en el presente documento.

Los aspectos de la invención serán evidentes con referencia a la siguiente descripción detallada. Además, se identifican diversas referencias más adelante.

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2. Definiciones

En la siguiente descripción se usan con frecuencia varios términos. Se proporcionan las siguientes definiciones para facilitar la comprensión de la invención.

Como se usa en el presente documento, "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y fragmentos generados mediante ligadura, corte, acción de endonucleasas, y acción de exónucleasas. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas de monómeros que son nucleótidos naturales (tales como ADN y ARN), o análogos de nucleótidos naturales (p.ej., formas \alpha-enantioméricas de nucleótidos naturales), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en los restos de carbohidratos y/o en los restos de las bases de pirimidina o purina. Las modificaciones de los carbohidratos incluyen, por ejemplo, la sustitución de uno o más grupos hidroxilo con halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los carbohidratos pueden estar funcionalizados como éteres o ésteres. Además, el resto completo de carbohidrato puede estar sustituido con estructuras similares estéricamente y electrónicamente, tales como aza-carbohidratos y análogos de carbohidratos carbocíclicos. Los ejemplos de modificaciones en un resto de base incluyen las purinas y pirimidinas alquiladas, las purinas o pirimidinas aciladas, u otros sustituyentes heterocíclicos conocidos. Los monómeros de ácido nucleico pueden estar unidos mediante enlaces fosfodiéster o mediante análogos de tales enlaces. Los análogos de los enlaces fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato, y similares. La expresión "molécula de ácido nucleico" también incluye los denominados "ácidos nucleicos peptídicos", que comprenden bases de ácido nucleico naturales o modificadas unidas a un esqueleto de poliamida. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios.

La expresión "complemento de una molécula de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria y una orientación inversa en comparación con una secuencia de nucleótidos de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria a 5' CCCGTGCAT 3'.

La expresión "contig" indica una molécula de ácido nucleico que tiene un tramo contiguo de secuencia idéntica o complementaria a otra molécula de ácido nucleico. Se dice que las secuencias contiguas "se solapan" con un tramo dado de una molécula de ácido nucleico en su totalidad o a lo largo de un tramo parcial de la molécula de ácido nucleico.

La expresión "secuencia de nucleótidos degenerada" indica una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados en comparación con una molécula de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido. Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo residuo de aminoácido (es decir, los tripletes GAU y GAC codifican cada uno Asp).

La expresión "gen estructural" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se transcribe a ARN mensajero (ARNm), que después se traduce a una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico.

Una "molécula de ácido nucleico aislada" es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica un factor de crecimiento que se ha separado del ADN genómico de una célula es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico sintetizada químicamente que no está integrada en el genoma de un organismo. Una molécula de ácido nucleico que se ha aislado a partir de una especie particular es más pequeña que la molécula de ADN completa de un cromosoma de esa especie.

Una "construcción de una molécula de ácido nucleico" es una molécula de ácido nucleico, monocatenaria o bicatenaria, que se ha modificado por medio de la intervención humana para que contenga segmentos de ácido nucleico combinados y yuxtapuestos en una disposición que no existe en la naturaleza.

"ADN lineal" indica moléculas de ADN que no son circulares que tienen extremo 5' y 3' libres. El ADN lineal se puede preparar a partir de moléculas de ADN circulares cerradas, tales como plásmidos, mediante digestión enzimática o corte físico.

"ADN complementario (cADN)" es una molécula de ADN monocatenaria que se forma a partir de un molde de ARNm mediante la enzima transcriptasa inversa. En general, se emplea un cebador complementario respecto de las porciones del ARNm para la iniciación de la transcripción inversa. Los expertos en la técnica usan también el término "cADN" para referirse a una molécula de ADN bicatenaria que consiste en tal molécula de ADN monocatenaria y su cadena de ADN complementaria. El término "cADN" se refiere también a un clon de una molécula de cADN sintetizada a partir de un molde de ARN.

Un "promotor" es una secuencia de nucleótidos que dirige la transcripción de un gen estructural. En general, un promotor está localizado en la región no codificante de 5' de un gen, próximo al sitio de inicio transcripcional de un gen estructural. Los elementos de secuencia de los promotores que funcionan en la iniciación de la transcripción se caracterizan a menudo por secuencias de nucleótidos consenso. Estos elementos de los promotores incluyen los sitios de unión de la ARN polimerasa, las secuencias TATA, las secuencias CAAT, los elementos específicos de la diferenciación (DSEs; McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)), elementos de respuesta a AMP cíclico (CREs), elementos de respuesta séricos (SREs; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)), elementos de respuesta a glucocorticoides (GREs), y sitios de unión para otros factores de transcripción, tales como CRE/ATF (O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)), AP2 (Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)), SP1, proteína de unión al elemento de respuesta a cAMP (CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)) y factores octaméricos (véase, en general, Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4ª ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), y Lemaigre y Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)). Si un promotor es un promotor inducible, la velocidad de transcripción se incrementa en respuesta a un agente inductor. En contraste, la velocidad de la transcripción no está regulada por un agente inductor si el promotor es un promotor constitutivo. También se conocen los promotores
reprimibles.

Un "promotor mínimo" contiene las secuencias de nucleótidos esenciales para la función del promotor, que incluyen la caja TATA y el inicio de la transcripción. De acuerdo con esta definición, un promotor mínimo puede tener o no una actividad detectable en ausencia de secuencias específicas que pueden incrementar la actividad o conferir una actividad específica de tejido.

Un "elemento regulador" es una secuencia de nucleótidos que modula la actividad de un promotor mínimo. Por ejemplo, un elemento regulador puede contener una secuencia de nucleótidos que se une a factores celulares que permiten la transcripción exclusivamente o preferentemente en células, tejidos u orgánulos particulares. Estos tipos de elementos reguladores están asociados normalmente a genes que se expresan de una manera "específica de célula", "específica de tejido", o "específica de orgánulo".

Un "potenciador" es un tipo de elemento regulador que puede incrementar la eficacia de la transcripción, independientemente de la distancia o de la orientación del potenciador respecto del sitio de inicio de la transcrip-
ción.

"ADN heterólogo" se refiere a una molécula de ADN, o a una población de moléculas de ADN, que no existe de manera natural en una célula hospedadora dada. Las moléculas de ADN heterólogas para una célula hospedadora particular pueden contener ADN derivado de la especie de la célula hospedadora (es decir, ADN endógeno) con tal de que ese ADN del hospedador esté combinado con ADN que no es del hospedador (es decir, ADN exógeno). Por ejemplo, se considera que una molécula de ADN que contiene un segmento de ADN que no es del hospedador que codifica un polipéptido unido de manera operable a un segmento de ADN del hospedador que comprende un promotor de la transcripción es una molécula de ADN heteróloga. A la inversa, una molécula de ADN heteróloga puede comprender un gen endógeno unido de manera operable a un promotor exógeno. Como ilustración adicional, una molécula de ADN que comprende un gen derivado de una célula de tipo natural se considera que es ADN heterólogo si esa molécula de ADN se introduce en una célula mutante que carece del gen de tipo natural.

Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos, producido de forma natural o sintética. Los polipéptidos de menos de alrededor de 10 residuos de aminoácidos se denominan habitualmente "péptidos".

Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas. Una proteína puede comprender también componentes no peptídicos, tales como grupos de carbohidratos. Los carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos pueden ser añadidos a una proteína por la célula en la que se produce la proteína, y variarán con el tipo de célula. Las proteínas se definen en el presente documento en cuanto a sus estructuras del esqueleto de aminoácidos; los sustituyentes tales como los grupos de carbohidratos en general no se especifican, pero aún así pueden estar presentes.

Un péptido o polipéptido codificado por una molécula de ADN que no es del hospedador es un péptido o polipéptido "heterólogo".

Un "elemento genético integrado" es un segmento de ADN que se ha incorporado en un cromosoma de una célula hospedadora después de que el elemento se haya introducido en la célula por medio de la manipulación humana. En la presente invención, los elementos genéticos integrados proceden habitualmente de plásmidos linealizados que se introducen en las células mediante electroporación u otras técnicas. Los elementos genéticos integrados pasan desde la célula hospedadora original a su progenie.

Un "vector de clonación" es una molécula de ácido nucleico, tal como un plásmido, cósmido o bacteriófago, que tiene la capacidad de replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora. Los vectores de clonación contienen en general uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción que permiten la inserción de una molécula de ácido nucleico de una manera determinable sin la pérdida de la función biológica esencial del vector, así como secuencias de nucleótidos que codifican un gen marcador que es adecuado para el uso en la identificación y la selección de las células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores incluyen generalmente genes que proporcionan resistencia a tetraciclina o resistencia a ampicilina.

Un "vector de expresión" es una molécula de ácido nucleico que codifica un gen que se expresa en una célula hospedadora. En general, un vector de expresión comprende un promotor de la transcripción, un gen, y un terminador de la transcripción. La expresión génica se pone habitualmente bajo el control de un promotor, y se dice que tal gen está "unido de manera operable" al promotor. De forma similar, un elemento regulador y un promotor mínimo están unidos de manera operable si el elemento regulador modula la actividad del promotor mínimo.

Un "hospedador recombinante" es una célula que contiene una molécula de ácido nucleico heteróloga, tal como un vector de clonación o un vector de expresión. En el presente contexto, un ejemplo de un hospedador recombinante es una célula que produce Ztnfr12 a partir de un vector de expresión. En contraste, Ztnfr12 puede ser producido por una célula que es una "fuente natural" de Ztnfr12, y que carece de un vector de expresión.

"Transformantes integrativos" son células hospedadoras recombinantes en las que el ADN heterólogo se ha integrado en el ADN genómico de las células.

Una "proteína de fusión" es una proteína híbrida expresada mediante una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos de al menos dos genes. Por ejemplo, una proteína de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina comprende un resto de receptor Ztnfr12 y un resto de inmunoglobulina. Como se usa en el presente documento, un "resto de receptor Ztnfr12" es una porción del dominio extracelular del receptor Ztnfr12 que se une a al menos uno de ZTNF2 o ZTNF4. La frase "resto de inmunoglobulina" se refiere a un polipéptido que comprende una región constante de una inmunoglobulina. Por ejemplo, el resto de inmunoglobulina puede comprender una región constante de una cadena pesada. El término proteína de fusión "Ztnfr12-Fc" se refiere a una proteína de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina en la que el resto de inmunoglobulina comprende las regiones constantes de la cadena pesada de una inmunoglobulina, C_{H2} y C_{H3}.

El término "receptor" indica una proteína asociada a una célula que se une a una molécula bioactiva denominada "ligando". Esta interacción actúa como mediador en el efecto del ligando sobre la célula. En el contexto de la unión al receptor Ztnfr12, la frase "se une específicamente" o "unión específica" se refiere a la capacidad del ligando para unirse de forma competitiva al receptor. Por ejemplo, ZTNF4 se une específicamente al receptor Ztnfr12, y esto se puede demostrar observando la competición por el receptor Ztnfr12 entre ZTNF4 marcado de forma detectable y ZTNF4 sin marcar.

Los receptores pueden estar asociados a la membrana, o ser citosólicos o nucleares; monoméricos (p.ej., receptor de tirotropina, receptor \beta-adrenérgico) o multiméricos (p.ej., receptor de PDGF, receptor de la hormona del crecimiento, receptor de IL-3, receptor de GM-CSF, receptor de G-CSF, receptor de eritropoyetina y receptor de IL-6). Los receptores asociados a la membrana se caracterizan por una estructura de dominios múltiples, que comprenden un dominio extracelular de unión al ligando y un dominio efector intracelular de está implicado generalmente en la transducción de la señal. En ciertos receptores asociados a la membrana, el dominio extracelular de unión al ligando y el dominio efector intracelular están localizados en polipéptidos distintos que constituyen el receptor funcional completo.

En general, la unión del ligando al receptor da como resultado un cambio conformacional en el receptor que provoca una interacción entre el dominio efector y otra(s) molécula(s) de la célula, lo que a su vez conduce a una alteración del metabolismo de la célula. Los sucesos metabólicos que están asociados a menudo a las interacciones receptor-ligando incluyen la transcripción génica, la fosforilación, la desfosforilación, los incrementos en la producción de AMP cíclico, la movilización del calcio celular, la movilización de los lípidos de la membrana, la adhesión celular, la hidrólisis de lípidos de inositol y la hidrólisis de fosfolípidos.

La expresión "secuencia señal secretora" indica una secuencia de ADN que codifica un péptido (un "péptido secretor") que, como componente de un polipéptido mayor, dirige al polipéptido mayor a través de una ruta secretora de la célula en la que se sintetiza. El polipéptido mayor se escinde habitualmente para eliminar el péptido secretor durante el tránsito a través de la ruta secretora.

Un "polipéptido aislado" es un polipéptido que está esencialmente exento de componentes celulares contaminantes, tales como carbohidratos, lípidos, u otras impurezas proteicas asociadas al polipéptido en la naturaleza. En general, una preparación de polipéptido aislado contiene el polipéptido en una forma sumamente purificada, es decir, al menos alrededor del 80% de pureza, al menos alrededor del 90% de pureza, al menos alrededor del 95% de pureza, más del 95% de pureza, o más del 99% de pureza. Una manera de demostrar que una preparación de proteína particular contiene un polipéptido aislado es mediante la aparición de una única banda tras una electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico (SDS)-poliacrilamida de la preparación de proteína y una tinción del gel con azul de Coomassie brillante. Sin embargo, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o formas alternativamente glicosiladas o derivatizadas.

Los términos "aminoterminal" y "carboxiterminal" se usan en el presente documento para indicar las posiciones en los polipéptidos. Cuando el contexto lo permite, estos términos se usan con respecto a una secuencia o porción particular de un polipéptido para indicar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia colocada en posición carboxiterminal respecto de una secuencia de referencia en un polipéptido está localizada próxima al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el extremo carboxilo del polipéptido completo.

El término "expresión" se refiere a la biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen estructural, la expresión implica la transcripción del gen estructural a ARNm y la traducción del ARNm a uno o más polipéptidos.

La expresión "variante de corte y empalme" se usa en el presente documento para indicar las formas alternativas del ARN transcrito a partir de un gen. La variación del corte y empalme surge de forma natural por medio del uso de sitios de corte y empalme alternativos en una molécula de ARN transcrita, o de forma menos habitual entre moléculas de ARN transcritas por separado, y puede dar como resultado varios ARNms transcritos a partir del mismo gen. Las variantes de corte y empalme pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. La expresión variante de corte y empalme se usa también en el presente documento para indicar un polipéptido codificado por una variante de corte y empalme de un ARNm transcrito a partir de un gen.

Como se usa en el presente documento, el término "inmunomodulador" incluye las citocinas, los factores de crecimiento de células pluripotenciales, las linfotoxinas, las moléculas co-estimuladoras, los factores hematopoyéticos, y los análogos sintéticos de estas moléculas.

La expresión "pareja complemento/anti-complemento" indica restos no idénticos que forman una pareja estable asociada de forma no covalente en condiciones apropiadas. Por ejemplo, la biotina y la avidina (o estreptavidina) son miembros prototípicos de una pareja complemento/anti-complemento. Otras parejas complemento/anti-complemento ejemplares incluyen las parejas receptor/ligando, las parejas anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítopo), las parejas de polinucleótidos codificante/complementario, y similares. Cuando sea deseable la disociación posterior de la pareja complemento/anti-complemento, la pareja complemento/anti-complemento tiene preferiblemente una afinidad de unión menor de 10^{9} M^{-1}.

Un "anticuerpo anti-idiotipo" es un anticuerpo que se une al dominio de la región variable de una inmunoglobulina. En el presente contexto, un anticuerpo anti-idiotipo se une a la región variable de un anticuerpo anti-Ztnfr12, y así, un anticuerpo anti-idiotipo imita un epítopo de Ztnfr12.

Un "fragmento de anticuerpo" es una porción de un anticuerpo tal como F(ab')_{2}, F(ab)_{2}, Fab', Fab, y similares. Independientemente de la estructura, un fragmento de anticuerpo se une al mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal anti-Ztnfr12 se une a un epítopo de Ztnfr12.

La expresión "fragmento de anticuerpo" incluye también un polipéptido sintético o modificado genéticamente que se une a un antígeno específico, tal como los polipéptidos que consisten en la región variable de la cadena ligera, los fragmentos "Fv" que consisten en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, las moléculas polipeptídicas recombinantes de cadena simple en las que las regiones variables de las cadenas ligera y pesada están conectadas mediante un espaciador peptídico ("proteínas scFv"), y unidades mínimas de reconocimiento que consisten en los residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable.

Un "anticuerpo quimérico" es una proteína recombinante que contiene los dominios variables y las regiones determinantes de la complementariedad derivadas de un anticuerpo de roedor, mientras el resto de la molécula de anticuerpo deriva de un anticuerpo humano.

Los "anticuerpos humanizados" son proteínas recombinantes en las que las regiones determinantes de la complementariedad murinas de un anticuerpo monoclonal se han transferido desde las cadenas variables pesada y ligera de la inmunoglobulina murina a un dominio variable humano.

Como se usa en el presente documento, un "agente terapéutico" es una molécula o átomo que está conjugado a un resto de anticuerpo para producir un conjugado que es útil para la terapia. Los ejemplos de agentes terapéuticos incluyen fármacos, toxinas, inmunomoduladores, agentes quelantes, compuestos de boro, agentes o colorantes fotoactivos, y radioisótopos.

Un "marcador detectable" es una molécula o átomo que puede estar conjugado a un resto de anticuerpo para producir una molécula útil para el diagnóstico. Los ejemplos de marcadores detectables incluyen agentes quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iones paramagnéticos, u otros restos marcadores.

La expresión "marcador de afinidad" se usa en el presente documento para indicar un segmento de polipéptido que se puede unir a un segundo polipéptido para posibilitar la purificación o la detección del segundo polipéptido, o para proporcionar sitios para la unión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, se puede usar como marcador de afinidad cualquier péptido o proteína para el que haya disponible un anticuerpo u otro agente de unión específica. Los marcadores de afinidad incluyen un tramo de poli-histidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991)), glutatión S transferasa (Smith y Johnson, Gene 67:31 (1988)), marcador de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985)), sustancia P, péptido FLAG (Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988)), péptido de unión a estreptavidina, u otro epítopo antigénico o dominio de unión. Véase, en general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95 (1991). Hay disponibles moléculas de ADN que codifican marcadores de afinidad de proveedores comerciales (p.ej., Pharmacia Biotech, Piscataway,
NJ).

Un "anticuerpo desnudo" es un anticuerpo completo, a diferencia de un fragmento de anticuerpo, que no está conjugado con un agente terapéutico. Los anticuerpos desnudos incluyen tanto los anticuerpos policlonales como monoclonales, así como ciertos anticuerpos recombinantes, tales como los anticuerpos quiméricos y humaniza-
dos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "componente de anticuerpo" incluye tanto un anticuerpo completo como un fragmento de anticuerpo.

Un "anticuerpo biespecífico" tiene sitios de unión para dos antígenos diferentes en una única molécula de anticuerpo.

Una "composición de anticuerpos multiespecíficos" comprende componentes de anticuerpos que tienen sitios de unión para dos antígenos diferentes. Por ejemplo, una composición de anticuerpos multiespecíficos puede comprender componentes de anticuerpos biespecíficos, o una composición de anticuerpos multiespecíficos puede comprender al menos dos componentes de anticuerpos que se unen a diferentes antígenos.

Un "inmunoconjugado" es un conjugado de un componente de anticuerpo con un agente terapéutico o un marcador detectable.

Como se usa en el presente documento, la expresión "proteína de fusión de anticuerpo" se refiere a una molécula recombinante que comprende un componente de anticuerpo y un componente de polipéptido Ztnfr12. Los ejemplos de una proteína de fusión de anticuerpo incluyen una proteína que comprende un dominio extracelular de Ztnfr12, y un dominio Fc o una región de unión al antígeno.

Un "polipéptido objetivo" o un "péptido objetivo" es una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un epítopo, y que se expresa en una célula objetivo, tal como una célula tumoral, o una célula que porta un antígeno de un agente infeccioso. Las células T reconocen los epítopos peptídicos presentados por una molécula del complejo principal de histocompatibilidad para un polipéptido objetivo o péptido objetivo, y generalmente lisan la célula objetivo o atraen a otras células inmunitarias hacia la localización de la célula objetivo, por lo que destruyen la célula
objetivo.

Un "péptido antigénico" es un péptido que se unirá a una molécula del complejo principal de histocompatibilidad para formar un complejo MHC-péptido, que es reconocido por una célula T, por lo que se induce una respuesta de linfocitos citotóxicos tras la presentación a la célula T. Así, los péptidos antigénicos son capaces de unirse a una molécula apropiada del complejo principal de histocompatibilidad e inducir una respuesta de las células T citotóxicas, tal como la lisis celular o la liberación de citocinas específicas contra la célula objetivo que se une o que expresa el antígeno. El péptido antigénico se puede unir en el contexto de una molécula del complejo principal de histocompatibilidad de clase I o clase II, en una célula presentadora de antígenos o en una célula objetivo.

En los eucariotas, la ARN polimerasa II cataliza la transcripción de un gen estructural para producir ARNm. Se puede diseñar una molécula de ácido nucleico para que contenga un molde para la ARN polimerasa II en la que el transcrito de ARN tiene una secuencia que es complementaria a la de un ARNm específico. El transcrito de ARN se denomina "ARN complementario", y una molécula de ácido nucleico que codifica el ARN complementario se denomina "gen complementario". Las moléculas de ARN complementario son capaces de unirse a moléculas de ARNm, lo que da como resultado la inhibición de la traducción del ARNm.

Un "oligonucleótido complementario específico de Ztnfr12" o un "oligonucleótido complementario de Ztnfr12" es un oligonucleótido que tiene una secuencia (a) capaz de formar una molécula triple estable con una porción del gen Ztnfr12, o (b) capaz de formar una molécula doble estable con una porción de un transcrito de ARNm del gen
Ztnfr12.

Una "ribozima" es una molécula de ácido nucleico que contiene un centro catalítico. El término incluye las enzimas de ARN, los ARNs con autocorte y autoempalme, ARNs con autocorte, y moléculas de ácido nucleico que llevan a cabo estas funciones catalíticas. Una molécula de ácido nucleico que codifica una ribozima se denomina "gen de ribozima".

Una "secuencia guía externa" es una molécula de ácido nucleico que dirige la ribozima endógena, RNasa P, a una especie particular de ARNm intracelular, lo que da como resultado la escisión del ARNm por la RNasa P. Una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia guía externa se denomina un "gen de secuencia guía externa".

La expresión "gen Ztnfr12 variante" se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es una modificación de SEQ ID Nº:2. Tales variantes incluyen los polimorfismos naturales de los genes Ztnfr12, así como los genes sintéticos que contienen sustituciones conservativas de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:2. Las formas variantes adicionales de los genes Ztnfr12 son moléculas de ácido nucleico que contienen inserciones o deleciones de las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento. Un gen Ztnfr12 variante se puede identificar, por ejemplo, determinando si el gen hibrida con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº: 1, o su complemento, en condiciones
rigurosas.

De forma alternativa, los genes Ztnfr12 variantes se pueden identificar mediante comparación de secuencias. Dos secuencias de aminoácidos tienen "un 100% de identidad de secuencias de aminoácidos" si los residuos de aminoácidos de las dos secuencias de aminoácidos son iguales cuando se alinean para obtener una correspondencia máxima. De forma similar, dos secuencias de nucleótidos tienen "un 100% de identidad de secuencias de nucleótidos" si los residuos de nucleótidos de las dos secuencias de nucleótidos son iguales cuando se alinean para obtener una correspondencia máxima. Las comparaciones de secuencias se pueden llevar a cabo mediante el uso de programas informáticos habituales tales como los incluidos en la serie de programas bioinformáticos LASERGENE, producidos por DNASTAR (Madison, Wisconsin). Otros métodos para comparar dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos determinando la alineación óptima son muy conocidos para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Peruski y Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins", en Methods in Gene Biotechnology, páginas 123-151 (CRC Press, Inc. 1997), y Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2ª edición (Academic Press, Inc. 1998)). Los métodos particulares para determinar la identidad de secuencias se describen más adelante.

Un gen Ztnfr12 variante o polipéptido Ztnfr12 variante, un gen variante o polipéptido codificado por un gen variante se puede caracterizar funcionalmente mediante al menos uno de: la capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo anti-Ztnfr12, la capacidad de unirse específicamente a ZTNF4, y la capacidad de unirse específicamente a ZTNF4, pero no a ZTNF2.

La expresión "variante alélica" se usa en el presente documento para indicar cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de forma natural por medio de las mutaciones, y puede dar como resultado un polimorfismo fenotípico en las poblaciones. Las mutaciones genéticas pueden ser sinónimas (sin cambios en el polipéptido codificado), o pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. La expresión variante alélica se usa también en el presente documento para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen.

El término "ortólogo" indica un polipéptido o proteína obtenido de una especie que es el equivalente funcional de un polipéptido o proteína de una especie diferente. Las diferencias de secuencias entre los ortólogos son el resultado de la especiación.

Los "parálogos" son proteínas diferentes pero relacionadas estructuralmente producidas por un organismo. Se cree que los parálogos surgen por medio de la duplicación génica. Por ejemplo, \alpha-globina, \beta-globina y mioglobina son parálogos entre sí.

La presente invención incluye los fragmentos funcionales de los genes Ztnfr12 como se definen en las reivindicaciones. En el contexto de esta invención, un "fragmento funcional" de un gen Ztnfr12 se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una porción de un polipéptido Ztnfr12, que es un domino descrito en el presente documento, o que se puede caracterizar mediante al menos uno de: la capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo anti-Ztnfr12, la capacidad de unirse específicamente a ZTNF4, y la capacidad de unirse específicamente a ZTNF4, pero no a ZTNF2.

Debido a la imprecisión de los métodos analíticos habituales, se entiende que los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros son valores aproximados. Cuando tal valor se expresa como "alrededor de" X o "aproximadamente" X, se entenderá que el valor indicado de X será exacto en un \pm10%.

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3. Producción de Moléculas de Ácido Nucleico que Codifican Ztnfr12

Las moléculas de ácido nucleico que codifican un gen Ztnfr12 humano se pueden obtener cribando una biblioteca de cADN o genómica humana mediante el uso de sondas polinucleotídicas basadas en las SEQ ID Nºs:1 ó 9. Estas técnicas son habituales, y están bien establecidas.

Como ilustración, se puede aislar una molécula de ácido nucleico que codifica un gen Ztnfr12 humano a partir de una biblioteca de cADN. En este caso, la primera etapa sería preparar la biblioteca de cADN aislando ARN a partir de, por ejemplo, células B de centros germinales o tejido de nódulo linfático, mediante el uso de métodos bien conocidos para los expertos en la técnica. En general, las técnicas de aislamiento de ARN deben proporcionar un método para romper las células, un medio para inhibir la degradación mediada por RNasas del ARN, y un método para separar el ARN de los contaminantes de ADN, proteínas y polisacáridos. Por ejemplo, se puede aislar el ARN total congelando tejido en nitrógeno líquido, triturando el tejido congelado con un mortero para lisar las células, extrayendo el tejido triturado con una disolución de fenol/cloroformo para eliminar las proteínas, y separando el ARN de las impurezas restantes mediante precipitación selectiva con cloruro de litio (véase, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3^{rd} Edition, páginas 4-1 a 4-6 (John Wiley & Sons 1995) ["Ausubel (1995)"]; Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, páginas 33-41 (CRC Press, Inc. 1997) ["Wu (1997)"]).

De forma alternativa, se puede aislar el ARN total extrayendo el tejido triturado con isotiocianato de guanidinio, extrayendo con disolventes orgánicos, y separando el ARN de los contaminantes mediante el uso de centrifugación diferencial (véase, por ejemplo, Chirgwin et al., Biochemistry 18:52 (1979); Ausubel (1995) en las páginas 4-1 a 4-6; Wu (1997) en las páginas 33-41).

Para construir una biblioteca de cADN, se debe aislar ARN poli(A)^{+} a partir de una preparación de ARN total. Se puede aislar ARN poli(A)^{+} a partir de ARN total mediante el uso de la técnica habitual de cromatografía con oligo(dT)-celulosa (véase, por ejemplo, Aviv y Leder, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:1408 (1972); Ausubel (1995) en las páginas 4-11 a 4-12).

Las moléculas de cADN bicatenarias se sintetizan a partir de ARN poli(A)^{+} mediante el uso de métodos bien conocidos para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Wu (1997) en las páginas 41-46). Además, se pueden usar equipos disponibles comercialmente para sintetizar moléculas de cADN bicatenarias. Por ejemplo, tales equipos están disponibles de Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Promega Corporation (Madison, WI) y STRATAGENE (La Jolla, CA).

Son apropiados diversos vectores de clonación para la construcción de una biblioteca de cADN. Por ejemplo, se puede preparar una biblioteca de cADN en un vector derivado de un bacteriófago, tal como un vector \lambdagt10. Véase, por ejemplo, Huynh et al., "Constructing and Screening cDNA Libraries in \lambdagt10 and \lambdagt11", en DNA Cloning: A Practical Approach Vol. I, Glover (ed.), página 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) en las páginas 47-52.

De forma alternativa, se pueden insertar moléculas de cADN bicatenarias en un vector plasmídico, tal como un vector PBLUESCRIPT (STRATAGENE; La Jolla, CA), un vector LAMDAGEM-4 (Promega Corp.) u otros vectores disponibles comercialmente. También se pueden obtener vectores de clonación adecuados de la American Type Culture Collection (Manassas, VA).

Para amplificar las moléculas de cADN clonadas, la biblioteca de cADN se inserta en un hospedador procariótico mediante el uso de técnicas habituales. Por ejemplo, se puede introducir una biblioteca de cADN en células DH5 de E. coli competentes, que se pueden obtener, por ejemplo, de Life Technologies, Inc. (Gaithersburg,
MD).

Se puede preparar una biblioteca genómica humana por medios bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 5-1 a 5-6; Wu (1997) en las páginas 307-327). Se puede aislar el ADN genómico lisando el tejido con el detergente Sarcosil, digiriendo el lisado con proteinasa K, eliminando los restos insolubles del lisado mediante centrifugación, precipitando el ácido nucleico del lisado mediante el uso de isopropanol, y purificando el ADN resuspendido en un gradiente de densidad de cloruro de cesio.

Los fragmentos de ADN que son adecuados para la producción de una biblioteca genómica se pueden obtener mediante el corte aleatorio del ADN genómico o mediante la digestión parcial del ADN genómico con endonucleasas de restricción. Los fragmentos de ADN genómico se pueden insertar en un vector, tal como un vector de bacteriófago o cósmido, de acuerdo con las técnicas convencionales, tales como el uso de una digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, el uso de un tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable de las moléculas de ADN, y la ligadura con ligasas apropiadas. Los métodos para tal manipulación se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 5-1 a 5-6; Wu (1997) en las páginas
307-327).

De forma alternativa, se pueden obtener bibliotecas genómicas humanas de fuentes comerciales tales como ResGen (Huntsville, AL) y la American Type Culture Collection (Manassas, VA).

Se puede cribar una biblioteca que contiene cADN o clones genómicos con una o más sondas polinucleotídicas basadas en SEQ ID Nº:1, mediante el uso de métodos habituales (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 6-1 a 6-11).

Se pueden obtener también moléculas de ácido nucleico que codifican un gen Ztnfr12 humano mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores oligonucleotídicos que tienen secuencias de nucleótidos que se basan en las secuencias de nucleótidos del gen Ztnfr12, como se describe en el presente documento. Los métodos generales para cribar las bibliotecas con PCR se proporcionan, por ejemplo, en Yu et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries", en Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), páginas 211-215 (Humana Press, Inc. 1993). Además, las técnicas para usar la PCR para aislar genes relacionados se describen, por ejemplo, en Preston, "Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members", en Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), páginas 317-337 (Humana Press, Inc.
1993).

Los anticuerpos anti-Ztnfr12, producidos como se describe más adelante, se pueden usar también para aislar secuencias de ADN que codifican genes Ztnfr12 humanos a partir de bibliotecas de cADN. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden usar para cribar bibliotecas de expresión de \lambdagt11, o los anticuerpos se pueden usar para el inmunocribado tras la selección y la traducción de los híbridos (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 6-12 a 6-16; Margolis et al., "Screening \lambda expression libraries with antibody and protein probes", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2^{nd} Edition, Glover et al. (eds.), páginas 1-14 (Oxford University Press 1995)).

Como alternativa, se puede obtener un gen Ztnfr12 sintetizando moléculas de ácido nucleico mediante el uso de oligonucleótidos largos que actúan como cebadores mutuos y las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 8-8 a 8-9). Las técnicas establecidas que usan la reacción en cadena de la polimerasa proporcionan la capacidad de sintetizar moléculas de ADN de al menos dos kilobases de longitud (Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993), Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dillon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes", en Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), páginas 263-268, (Humana Press, Inc. 1993), y Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299 (1995)).

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden sintetizar también con "aparatos genéticos" mediante el uso de protocolos tales como el método de fosforamidita. Si es necesario un ADN bicatenario sintetizado químicamente para una aplicación tal como la síntesis de un gen o de un fragmento génico, se produce cada cadena complementaria por separado. La producción de genes cortos (60 a 80 pares de bases) es sencilla técnicamente, y se puede llevar a cabo sintetizando las cadenas complementarias y después renaturalizándolas. Para la producción de genes más largos (>300 pares de bases), sin embargo, pueden ser necesarias estrategias especiales, debido a que la eficacia de acoplamiento en cada ciclo durante la síntesis química de ADN casi nunca es del 100%. Para superar este problema, los genes sintéticos (bicatenarios) se ensamblan de una manera modular a partir de fragmentos monocatenarios que tienen una longitud de 20 a 100 nucleótidos. Para revisiones sobre la síntesis de polinucleótidos, véase, por ejemplo, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984), y Climie et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633
(1990).

La secuencia de un cADN de Ztnfr12 o de un fragmento genómico de Ztnfr12 se puede determinar mediante el uso de métodos habituales. Las secuencias polinucleotídicas de Ztnfr12 descritas en el presente documento se pueden usar también como sondas o cebadores para clonar regiones no codificantes de 5' de un gen Ztnfr12. Los elementos promotores de un gen Ztnfr12 se pueden usar para dirigir la expresión de genes heterólogos en tejido de nódulo linfático, por ejemplo, en animales transgénicos o en pacientes tratados con terapia génica. Tal elemento promotor se puede proporcionar mediante un fragmento que consiste en 50, 100, 200, 400 ó 600 nucleótidos de los nucleótidos 1 a 1000 de SEQ ID Nº:9. De forma alternativa, se puede proporcionar un promotor del gen Ztnfr12 mediante los nucleótidos 1 a 1000 de SEQ ID Nº:9. La identificación de los fragmentos genómicos que contienen un promotor o elemento regulador de Ztnfr12 se puede llevar a cabo mediante el uso de técnicas bien establecidas, tales como el análisis de deleciones (véase, en general, Ausubel (1995)).

La clonación de las secuencias flanqueantes de 5' también facilita la producción de las proteínas Ztnfr12 mediante la "activación génica", como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.641.670. Brevemente, la expresión de un gen Ztnfr12 endógeno en una célula se altera mediante la introducción en el locus de Ztnfr12 de una construcción de ADN que comprende al menos una secuencia de selección del objetivo, una secuencia reguladora, un exón, y un sitio donante de corte y empalme sin emparejar. La secuencia de selección del objetivo es una secuencia no codificante de 5' de Ztnfr12 que permite la recombinación homóloga de la construcción con el locus de Ztnfr12 endógeno, por lo que las secuencias de la construcción se unen de manera operable a la secuencia codificante de Ztnfr12 endógena. De esta manera, se puede sustituir o complementar un promotor de Ztnfr12 endógeno con otras secuencias reguladoras para proporcionar una expresión incrementada, específica de tejido, o regulada de otra
manera.

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4. Producción de Variantes de Ztnfr12

La presente invención proporciona una diversidad de moléculas de ácido nucleico, como se define en las reivindicaciones, que incluyen moléculas de ADN y de ARN, que codifican los polipéptidos Ztnfr12 descritos en el presente documento. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que, en vista de la degeneración del código genético, es posible una variación de secuencias considerable entre estas moléculas polinucleotídicas. SEQ ID Nº:3 es una secuencia de nucleótidos degenerada de abarca todas las moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido Ztnfr12 de SEQ ID Nº:2. Los expertos en la técnica reconocerán que la secuencia degenerada de SEQ ID Nº:3 también proporciona todas las secuencias de ARN que codifican SEQ ID Nº:2, sustituyendo U por T. Así, la presente invención contempla moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido Ztnfr12 que comprenden del nucleótido 27 al nucleótido 578 de SEQ ID Nº:1, y sus equivalentes de ARN.

La Tabla 2 enumera los códigos de una letra usados en SEQ ID Nº:3 para indicar las posiciones de los nucleótidos degenerados. Las "resoluciones" son los nucleótidos indicados mediante un código de una letra. El "complemento" indica el código para el/los nucleótido(s) complementario(s). Por ejemplo, el código Y indica C o T, y su complemento R indica A o G, siendo A complementario a T, y siendo G complementario a C.

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TABLA 2

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2

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Los codones degenerados usados en SEQ ID Nº:3, que abarcan todos los codones posibles para un aminoácido dado, se indican en la Tabla 3.

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TABLA 3

4

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Alguien de experiencia habitual en la técnica apreciará que se introduce cierta ambigüedad al determinar un codón degenerado, representativo de todos los codones posibles que codifican un aminoácido. Por ejemplo, el codón degenerado de serina (WSN) puede codificar, en ciertas circunstancias, arginina (AGR), y el codón degenerado de arginina (MGN) puede codificar, en ciertas circunstancias, serina (AGY). Existe una relación similar entre los codones que codifican fenilalanina y leucina. Así, ciertos polinucleótidos abarcados por la secuencia degenerada pueden codificar secuencias de aminoácidos variantes, pero alguien de experiencia habitual en la técnica puede identificar fácilmente tales secuencias variantes mediante referencia a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nº:2. Se puede analizar fácilmente la funcionalidad de las secuencias variantes como se describe en el presente documento.

Las diferentes especies pueden exhibir un "uso preferente de los codones". En general, véase, Grantham et al., Nucl. Acids Res. 8:1893 (1980), Haas et al. Curr. Biol. 6:315 (1996), Wain-Hobson et al., Gene 13:355 (1981), Grosjean y Fiers, Gene 18:199 (1982), Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075 (1986), Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573 (1982), Sharp y Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4:851 (1994), Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6:494 (1995), y Makrides, Microbiol. Rev. 60:512 (1996). Como se usa en el presente documento, la expresión "uso preferente de los codones " o "codones preferentes" es una expresión de la técnica que se refiere a los codones de traducción a proteína que son los usados más frecuentemente en las células de una cierta especie, por lo que se favorece así uno o varios representantes de los codones posibles que codifican cada aminoácido (véase la Tabla 3). Por ejemplo, el aminoácido treonina (Thr) puede estar codificado por ACA, ACC, ACG, o ACT, pero en las células mamíferas el codón usado más habitualmente es ACC; en otras especies, por ejemplo, células de insecto, levadura, virus o bacterias, pueden ser preferentes diferentes codones de Thr. Los codones preferentes para una especie particular se pueden introducir en los polinucleótidos de la presente invención mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica. La introducción de secuencias de codones preferentes en el ADN recombinante, por ejemplo, puede incrementar la producción de la proteína haciendo la traducción de la proteína más eficaz en un tipo de célula o especie particular. Por lo tanto, las secuencias de codones degenerados descritas en el presente documento sirven como patrón para optimizar la expresión de los polinucleótidos en diversos tipos de células y especies usados habitualmente en la técnica y descritos en el presente documento. Las secuencias que contienen codones preferentes se pueden analizar y optimizar para su expresión en diversas especies, y su funcionalidad se puede analizar tal como se describe en el presente
documento.

La presente memoria descriptiva describe polipéptidos variantes y moléculas de ácido nucleico que representan los equivalentes de otras especies (ortólogos). Estas especies incluyen, pero sin limitación, especies de mamíferos, aves, anfibios, reptiles, peces, insectos y otros vertebrados e invertebrados. Como ilustración, SEQ ID Nº:12, SEQ ID Nº:13, y SEQ ID Nº:14 proporcionan las secuencias de nucleótidos, aminoácidos y nucleótidos degenerados, respectivamente, de Ztnfr12 murino. Las características del polipéptido Ztnfr12 murino incluyen un dominio extracelular en los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:13, un dominio transmembrana en los residuos de aminoácidos 70 a 96 de SEQ ID Nº:13, un dominio intracelular en los residuos de aminoácidos 97 a 175 de SEQ ID Nº:13, y una región rica en cisteína en los residuos de aminoácidos 21 a 138 de SEQ ID Nº:13.

Son de interés particular los polipéptidos Ztnfr12 de otras especies de mamíferos, que incluyen los polipéptidos de ratón, porcinos, ovinos, bovinos, caninos, felinos, equinos y de otros primates. Los ortólogos de Ztnfr12 humano se pueden clonar mediante el uso de la información y las composiciones proporcionadas por la presente invención en combinación con las técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, se puede clonar un cADN de Ztnfr12 mediante el uso de ARNm obtenido de un tejido o tipo celular que expresa Ztnfr12 como se describe en el presente documento. Se pueden identificar las fuentes adecuadas de ARNm sondeando transferencias de Northern con sondas diseñadas a partir de las secuencias descritas en el presente documento. Después se prepara una biblioteca a partir de ARNm de un tejido o línea celular positivo.

Se puede aislar un cADN que codifica Ztnfr12 mediante una diversidad de métodos, tales como mediante la utilización de una sonda con un cADN humano completo o parcial, o con uno o más grupos de sondas degeneradas basadas en las secuencias descritas. También se puede clonar un cADN mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa con cebadores diseñados a partir de las secuencias representativas de Ztnfr12 humano descritas en el presente documento. Además, se puede usar una biblioteca de cADN para transformar o transfectar células hospedadoras, y se puede detectar la expresión del cADN de interés con un anticuerpo hacia el polipéptido Ztnfr12.

Los expertos en la técnica reconocerán que la secuencia descrita en SEQ ID Nº:1 representa un único alelo de Ztnfr12 humano, y que se espera que se dé la variación alélica y el corte y empalme alternativo. Las variantes alélicas de esta secuencia se pueden clonar mediante el uso de una sonda con el cADN o las bibliotecas genómicas de diferentes individuos según procedimientos habituales. Las variantes alélicas de las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento, que incluyen las que contienen mutaciones sinónimas y aquellas en las que las mutaciones dan como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos, se describen en el presente documento, ya que son proteínas que son variantes alélicas de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento. Las moléculas de cADN generadas a partir de ARNms con corte y empalme alternativo, que mantienen las propiedades del polipéptido Ztnfr12, se describen en el presente documento, ya que son polipéptidos codificados por tales cADNs y ARNms. Las variantes alélicas y las variantes de corte y empalme de estas secuencias se pueden clonar mediante el uso de sondas con el cADN o las bibliotecas genómicas de diferentes individuos o tejidos según los procedimientos habituales conocidos en la técnica.

En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden hibridar en condiciones rigurosas con moléculas de ácido nucleico que comprenden las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento. Por ejemplo, tales moléculas de ácido nucleico pueden hibridar en condiciones rigurosas con moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº:1, a moléculas de ácido nucleico que consisten en la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 27 a 578 de SEQ ID Nº:1, o a moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID Nº:1, o los nucleótidos 27 a 578 de SEQ ID Nº:1. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean alrededor de 5ºC más bajas que el punto de fusión térmico (T_{m}) para la secuencia especifica a una fuerza iónica y pH definidos. La T_{m} es la temperatura (a una fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia objetivo hibrida a una sonda perfectamente coincidente.

Un par de moléculas de ácido nucleico, tales como ADN-ADN, ARN-ARN y ADN-ARN, pueden hibridar si las secuencias de nucleótidos tienen cierto grado de complementariedad. Los híbridos pueden tolerar pares de bases apareados erróneamente en la doble hélice, pero la estabilidad del híbrido se ve influenciada por el grado de apareamientos erróneos. La T_{m} del híbrido apareado erróneamente disminuye 1ºC por cada 1-1,5% de apareamientos erróneos de pares de bases. La variación de la rigurosidad de las condiciones de hibridación permite controlar el grado de apareamientos erróneos que estarán presentes en el híbrido. El grado de rigurosidad se incrementa al incrementar la temperatura de hibridación, y al disminuir la fuerza iónica del tampón de hibridación. Las condiciones de hibridación rigurosas incluyen temperaturas de alrededor de 5-25ºC por debajo de la T_{m} del híbrido, y un tampón de hibridación que tenga hasta 1 M de Na^{+}. Se pueden alcanzar grados superiores de rigurosidad a temperaturas más bajas con la adición de formamida, que reduce la T_{m} del híbrido alrededor de 1ºC por cada 1% de formamida en la disolución tampón. En general, tales condiciones rigurosas incluyen temperaturas de 20-70ºC y un tampón de hibridación que contiene hasta 6x de SSC y 0-50% de formamida. Se puede alcanzar un grado superior de rigurosidad a temperaturas de 40-70ºC con un tampón de hibridación que tenga hasta 4x de SSC y 0-50% de formamida. Las condiciones muy rigurosas incluyen en general temperaturas de 42-70ºC con un tampón de hibridación que tiene hasta 1x de SSC y 0-50% de formamida. Se pueden usar diferentes grados de rigurosidad durante la hibridación y el lavado para alcanzar una unión específica máxima a la secuencia objetivo. En general, los lavados tras la hibridación se llevan a cabo a grados crecientes de rigurosidad para eliminar las sondas polinucleotídicas sin hibridar de los complejos hibridados.

Las condiciones anteriores pretenden servir como guía, y los conocimientos de un experto en la técnica le permiten adaptar estas condiciones para el uso con un híbrido polipeptídico particular. La T_{m} para una secuencia objetivo específica es la temperatura (en las condiciones definidas) a la que el 50% de la secuencia objetivo hibridará con una secuencia de una sonda perfectamente coincidente. Las condiciones que influyen en la T_{m} incluyen el tamaño y el contenido de pares de bases de la sonda polinucleotídica, la fuerza iónica de la disolución de hibridación, y la presencia de agentes desestabilizantes en la disolución de hibridación. Se conocen en la técnica numerosas ecuaciones para calcular la T_{m}, y son específicas para ADN, ARN e híbridos ADN-ARN y secuencias de sondas polinucleotídicas de longitud variable (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger y Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); y Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)). Los programas informáticos de análisis de secuencias tales como OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) y Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA), así como sitios de Internet, son herramientas disponibles para analizar una secuencia dada y calcular la T_{m} basándose en criterios definidos por el usuario. Tales programas pueden analizar también una secuencia dada en condiciones definidas e identificar secuencias de sondas adecuadas. En general, se lleva a cabo la hibridación de secuencias polinucleotídicas más largas, >50 pares de bases, a temperaturas de alrededor de 20-25ºC por debajo de la T_{m} calculada. Para las sondas más cortas, <50 pares de bases, la hibridación se lleva a cabo en general a la T_{m} o 5-10ºC menos. Esto permite una velocidad máxima de hibridación para ADN-ADN e híbridos ADN-ARN.

La longitud de la secuencia polinucleotídica influye en la velocidad y la estabilidad de la formación de híbridos. Las secuencias de sondas más cortas, <50 pares de bases, alcanzan el equilibrio con las secuencias complementarias rápidamente, pero pueden formar híbridos menos estables. Se pueden usar tiempos de incubación de minutos a horas para conseguir la formación de híbridos. Las secuencias de sondas más largas llegan al equilibrio más lentamente, pero forman complejos más estables incluso a temperaturas más bajas. Las incubaciones se dejan desarrollar durante la noche o más. En general, las incubaciones se llevan a cabo durante un período igual a tres veces el tiempo Cot calculado. El tiempo Cot, el tiempo que transcurre para que las secuencias polinucleotídicas se reasocien, se puede calcular para una secuencia particular mediante métodos conocidos en la técnica.

La composición de pares de bases de la secuencia polinucleotídica afectará a la estabilidad térmica del complejo híbrido, por lo que influirá en la elección de la temperatura de hibridación y de la fuerza iónica del tampón de hibridación. Los pares A-T son menos estables que los pares G-C en disoluciones acuosas que contienen cloruro sódico. Por lo tanto, cuanto mayor sea el contenido de G-C, más estable será el híbrido. La distribución uniforme de los residuos de G y C en la secuencia contribuye también de forma positiva a la estabilidad del híbrido. Además, la composición de pares de bases se puede manipular para alterar la T_{m} de una secuencia dada. Por ejemplo, 5-metildesoxicitidina se puede sustituir por desoxicitidina, y 5-bromodesoxiuridina se puede sustituir por timidina para incrementar la T_{m}, mientras 7-desazo-2'-desoxiguanosina se puede sustituir por guanosina para reducir la dependencia de la T_{m}.

La concentración iónica del tampón de hibridación afecta también a la estabilidad del híbrido. Los tampones de hibridación contienen en general agentes bloqueantes tales como disolución de Denhardt (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), ADN de esperma de salmón desnaturalizado, tARN, leche en polvo (BLOTTO), heparina o SDS, y una fuente de Na^{+}, tal como SSC (SSC 1x: cloruro sódico 0,15 M, citrato sódico 15 mM) o SSPE (SSPE 1x: NaCl 1,8 M, NaH_{2}PO_{4} 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,7). En general, los tampones de hibridación contienen Na^{+} 10 mM - 1 M. La adición de agentes desestabilizantes o desnaturalizantes tales como formamida, sales de tetraalquilamonio, cationes de guanidinio o cationes de tiocianato a la disolución de hibridación alterará la T_{m} de un híbrido. En general, se usa formamida a una concentración de hasta un 50% para permitir que las incubaciones se lleven a cabo a temperaturas menores y más convenientes. La formamida también actúa para reducir la señal de fondo inespecífica cuando se usan sondas de ARN.

Como ilustración, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido Ztnfr12 variante puede hibridar con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº:1 (o su complemento) a 42ºC durante la noche en una disolución que comprende un 50% de formamida, SSC 5x, fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), disolución de Denhardt 5x (disolución de Denhardt 100x: 2% (p/v) de Ficoll 400, 2% (p/v) de polivinilpirrolidona, y 2% (p/v) de albúmina de suero bovino), 10% de sulfato de dextrano, y 20 \mug/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado. Un experto en la técnica puede idear variaciones de estas condiciones de hibridación. Por ejemplo, la mezcla de hibridación se puede incubar a una temperatura superior, tal como alrededor de 65 ºC, en una disolución que no contenga formamida. Además, hay disponibles disoluciones de hibridación premezcladas (p.ej., disolución de hibridación EXPRESSHYB de CLONTECH Laboratories, Inc.), y la hibridación se puede llevar a cabo según las instrucciones del fabricante.

Tras la hibridación, las moléculas de ácido nucleico se pueden lavar para eliminar las moléculas de ácido nucleico sin hibridar en condiciones rigurosas, o en condiciones muy rigurosas. Las condiciones de lavado rigurosas típicas incluyen el lavado con una disolución de SSC 0,5x - 2x con un 0,1% de dodecilsulfato sódico (SDS) a 55 - 65ºC. Como ilustración, las moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido Ztnfr12 variante permanecen hibridadas con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 27 a 578 de SEQ ID Nº:1 (o su complemento) tras condiciones de lavado rigurosas, en las que la rigurosidad del lavado es equivalente a SSC 0,5x - 2x con un 0,1% de SDS a 55 - 65ºC, lo que incluye SSC 0,5x con un 0,1% de SDS a 55ºC, o SSC 2x con un 0,1% de SDS a 65ºC. Un experto en la técnica puede idear fácilmente condiciones equivalentes, por ejemplo, sustituyendo SSPE por SSC en la disolución de lavado.

Las condiciones de lavado muy rigurosas típicas incluyen el lavado con una disolución de SSC 0,1x - 0,2x con un 0,1% de dodecilsulfato sódico (SDS) a 50 - 65ºC. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido Ztnfr12 variante permanecen hibridadas con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 27 a 578 de SEQ ID Nº:1 (o su complemento) tras condiciones de lavado muy rigurosas, en las que la rigurosidad del lavado es equivalente a SSC 0,1x - 0,2x con un 0,1% de SDS a 50 - 65ºC, lo que incluye SSC 0,1x con un 0,1% de SDS a 50ºC, o SSC 0,2x con un 0,1% de SDS a 65ºC.

La presente memoria descriptiva describe polipéptidos Ztnfr12 aislados que tienen una identidad de secuencias sustancialmente similar al polipéptido de SEQ ID Nº:2, o sus ortólogos. La expresión "identidad de secuencias sustancialmente similar" se usa en el presente documento para indicar que los polipéptidos tienen una identidad de secuencias de al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% o más del 95% respecto de las secuencias mostradas en SEQ ID Nº:2, o los ortólogos.

La presente memoria descriptiva describe moléculas de ácido nucleico variantes de Ztnfr12 que se pueden identificar mediante el uso de dos criterios: una determinación de la similitud entre el polipéptido codificado y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:2, y un ensayo de hibridación, como se describió anteriormente. Tales variantes de Ztnfr12 incluyen las moléculas de ácido nucleico (1) que permanecen hibridadas con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 27 a 578 de SEQ ID Nº:1 (o su complemento) tras condiciones de lavado rigurosas, en las que la rigurosidad del lavado es equivalente a SSC 0,5x - 2x con un 0,1% de SDS a 55 - 65ºC, y (2) que codifican un polipéptido que tiene una identidad de secuencias de al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% o más del 95% respecto de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:2. De forma alternativa, las variantes de Ztnfr12 se pueden caracterizar como moléculas de ácido nucleico (1) que permanecen hibridadas con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 27 a 578 de SEQ ID Nº:1 (o su complemento) tras condiciones de lavado muy rigurosas, en las que la rigurosidad del lavado es equivalente a SSC 0,1x - 0,2x con un 0,1% de SDS a 50 - 65ºC, y (2) que codifican un polipéptido que tiene una identidad de secuencias de al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% o más del 95% respecto de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:2.

El porcentaje de identidad de secuencias se determina mediante métodos convencionales. Véase, por ejemplo, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986), y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992). Brevemente, se alinean dos secuencias de aminoácidos para optimizar las puntuaciones de alineación mediante el uso de una penalización por apertura de huecos de 10, una penalización por extensión de huecos de 1, y la matriz de puntuación "BLOSUM62" de Henikoff y Henikoff (ibídem), tal como se muestra en la Tabla 4 (los aminoácidos se indican mediante el código estándar de una letra). El porcentaje de identidad se calcula después como: ([Número total de coincidencias idénticas]/[longitud de la secuencia más larga más el número de huecos introducidos en la secuencia más larga para alinear las dos secuencias])(100).

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Los expertos en la técnica aprecian que hay disponibles muchos algoritmos establecidos para alinear dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitud "FASTA" de Pearson y Lipman es un método de alineación de proteínas adecuado para examinar el nivel de identidad compartido por una secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento y la secuencia de aminoácidos de una supuesta variante de Ztnfr12. El algoritmo FASTA se describe en Pearson y Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), y en Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990). Brevemente, FASTA caracteriza primero la similitud de secuencias identificando las regiones compartidas por la secuencia problema (p.ej., SEQ ID Nº:2) y una secuencia de análisis que tienen la mayor densidad de identidades (si la variable ktup es 1) o pares de identidades (si ktup=2), sin tomar en consideración las sustituciones conservativas de aminoácidos, las inserciones o las deleciones. Las diez regiones con la densidad más elevada de identidades se repuntúan comparando la similitud de todos los aminoácidos emparejados mediante el uso de una matriz de sustitución de aminoácidos, y los extremos de la regiones se "recortan" para incluir solamente aquellos residuos que contribuyen a la puntuación más alta. Si hay varias regiones con puntuaciones mayores del valor "de corte" (calculado mediante una fórmula predeterminada basada en la longitud de la secuencia y el valor ktup), entonces las regiones iniciales recortadas se examinan para determinar si las regiones se pueden unir para formar una alineación aproximada con huecos. Finalmente, las regiones con mayor puntuación de las dos secuencias de aminoácidos se alinean mediante el uso de una modificación del algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)), que permite inserciones y deleciones de aminoácidos. Los parámetros ilustrativos para el análisis FASTA son: ktup=1, penalización por apertura de huecos=10, penalización por extensión de huecos=1, y matriz de sustitución=BLOSUM62. Estos parámetros se pueden introducir en un programa FASTA modificando el archivo de la matriz de puntuación ("SMATRIX"), como se explica en el apéndice 2 de Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990).

También se puede usar FASTA para determinar la identidad de secuencias de moléculas de ácido nucleico mediante el uso de una proporción como se describió anteriormente. Para las comparaciones de secuencias de nucleótidos, el valor ktup puede oscilar entre uno a seis, preferiblemente tres a seis, lo más preferiblemente tres, con los otros parámetros ajustados como se describió anteriormente.

La presente memoria descriptiva describe moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene un cambio conservativo de aminoácidos, en comparación con una secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento. Por ejemplo, se pueden obtener variantes que contienen una o más sustituciones de aminoácidos de SEQ ID Nº:2, en las que un aminoácido de alquilo se sustituye por un aminoácido de alquilo en una secuencia de aminoácidos de Ztnfr12, un aminoácido aromático se sustituye por un aminoácido aromático en una secuencia de aminoácidos de Ztnfr12, un aminoácido que contiene azufre se sustituye por un aminoácido que contiene azufre en una secuencia de aminoácidos de Ztnfr12, un aminoácido que contiene hidroxilo se sustituye por un aminoácido que contiene hidroxilo en una secuencia de aminoácidos de Ztnfr12, un aminoácido ácido se sustituye por un aminoácido ácido en una secuencia de aminoácidos de Ztnfr12, un aminoácido básico se sustituye por un aminoácido básico en una secuencia de aminoácidos de Ztnfr12, o un aminoácido monocarboxílico dibásico se sustituye por un aminoácido monocarboxílico dibásico en una secuencia de aminoácidos de Ztnfr12. Entre los aminoácidos habituales, por ejemplo, una "sustitución conservativa de aminoácidos" se ilustra mediante una sustitución entre aminoácidos dentro de cada uno de los grupos siguientes: (1) glicocola, alanina, valina, leucina, e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina, y triptófano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina.

La tabla BLOSUM62 es una matriz de sustitución de aminoácidos derivada de alrededor de 2.000 alineaciones múltiples locales de segmentos de secuencias proteicas, que representan regiones muy conservadas de más de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff y Henikoff, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)). Por lo tanto, las frecuencias de sustitución de BLOSUM62 se pueden usar para definir sustituciones conservativas de aminoácidos que se pueden introducir en las secuencias de aminoácidos de la presente invención. Aunque es posible diseñar sustituciones de aminoácidos basadas únicamente en las propiedades químicas (como se discutió anteriormente), la frase "sustitución conservativa de aminoácidos" se refiere preferiblemente a una sustitución representada por un valor de BLOSUM62 mayor de -1. Por ejemplo, una sustitución de aminoácidos es conservativa si la sustitución se caracteriza por un valor de BLOSUM62 de 0, 1, 2 ó 3. Según este sistema, las sustituciones conservativas preferidas de aminoácidos se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de al menos 1 (p.ej., 1, 2 ó 3), mientras las sustituciones conservativas más preferidas de aminoácidos se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de al menos 2 (p.ej., 2 ó 3).

Ciertas sustituciones conservativas de aminoácidos se pueden identificar alineando las secuencias de aminoácidos de Ztnfr12 humano y murino. Por ejemplo, una alineación indica las siguientes sustituciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de Ztnfr12 humano de SEQ ID Nº:2: Ala^{15} a Val^{15}, Arg^{39} a His^{39}, y Ala^{71} a Leu^{71}. Tal alineación identifica otras sustituciones conservativas de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de Ztnfr12 humano, o sustituciones conservativas de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de Ztnfr12 murino.

Las variantes particulares de Ztnfr12 se caracterizan por tener una identidad de secuencias de al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% o más del 95% respecto de la secuencia de aminoácidos correspondiente (p.ej., SEQ ID Nº:2), en la que la variación en la secuencia de aminoácidos se debe a una o más sustituciones conservativas de aminoácidos.

Los cambios conservativos de aminoácidos en un gen Ztnfr12 se pueden introducir, por ejemplo, sustituyendo nucleótidos por los nucleótidos enumerados en SEQ ID Nº:1. Tales variantes de "aminoácidos conservativos" se pueden obtener mediante mutagénesis dirigida con oligonucleótidos, mutagénesis de barrido con espaciador, mutagénesis mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa, y similares (véase Ausubel (1995) en las páginas 8-10 a 8-22; y McPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991)). Se puede identificar un polipéptido Ztnfr12 variante mediante la capacidad de unirse específicamente a anticuerpos anti-Ztnfr12.

Las proteínas pueden comprender también residuos de aminoácidos que no se dan de forma natural. Los aminoácidos que no se dan de forma natural incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicocola, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido tiazolidin carboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, tert-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina, y 4-fluorofenilalanina. Se conocen en la técnica varios métodos para incorporar residuos de aminoácidos que no se dan de forma natural en las proteínas. Por ejemplo, se puede emplear un sistema in vitro en el que las mutaciones sin sentido se inhiben mediante el uso de tARNs inhibidores aminoacilados. Los métodos para sintetizar aminoácidos y tARN aminoacilado se conocen en la técnica. La transcripción y la traducción de plásmidos que contienen mutaciones sin sentido se lleva a cabo generalmente en un sistema exento de células que comprende un extracto de E. coli S30 y enzimas y otros reactivos disponibles comercialmente. Las proteínas se purifican mediante cromatografía. Véase, por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722 (1991), Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301 (1991), Chung et al., Science 259:806 (1993), y Chung et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:10145 (1993).

En un segundo método, la traducción se lleva a cabo en ovocitos de Xenopus mediante microinyección de ARNm mutado y tARNs inhibidores aminoacilados químicamente (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991 (1996)). En un tercer método, se cultivan células de E. coli en ausencia de un aminoácido natural que se va a sustituir (p.ej., fenilalanina), y en presencia de el/los aminoácido(s) deseado(s) que no se da(n) de forma natural (p.ej., 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina, o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido que no se da de forma natural se incorpora en la proteína en lugar de su equivalente natural. Véase, Koide et al., Biochem. 33:7470 (1994). Los residuos de aminoácidos naturales se pueden convertir en especies que no se dan de forma natural mediante modificación química in vitro. La modificación química se puede combinar con mutagénesis dirigida para ampliar adicionalmente la variedad de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci. 2:395 (1993)).

Se puede sustituir un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no están codificados por el código genético, aminoácidos que no se dan de forma natural, y aminoácidos artificiales por los residuos de aminoácidos de Ztnfr12.

Los aminoácidos esenciales de los polipéptidos de la presente invención se pueden identificar según los procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida o mutagénesis de barrido de alaninas (Cunningham y Wells, Science 244:1081 (1989), Bass et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:4498 (1991), Coombs y Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering", en Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), páginas 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). En esta última técnica, se introducen mutaciones de alaninas únicas en cada residuo de la molécula, y se analiza la actividad biológica de las moléculas mutantes resultantes para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996).

Aunque se puede usar el análisis de las secuencias para definir adicionalmente la región de unión a ligandos de Ztnfr12, los aminoácidos que desempeñan un papel en la actividad de unión de Ztnfr12 se pueden determinar también mediante análisis físico de la estructura, tal como se determina mediante técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o utilización de marcadores de fotoafinidad, junto con la mutación de los aminoácidos del supuesto sitio de contacto. Véase, por ejemplo, de Vos et al., Science 255:306 (1992), Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899 (1992), y Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59 (1992).

Se pueden hacer sustituciones de aminoácidos múltiples y analizarlas mediante el uso de métodos conocidos de mutagénesis y cribado, tales como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241:53 (1988)) o Bowie y Sauer (Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:2152 (1989)). Brevemente, estos autores describen métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionar el polipéptido funcional, y después secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. Otros métodos que se pueden usar incluyen la expresión en fagos (p.ej., Lowman et al., Biochem. 30:10832 (1991), Ladner et al., patente de EE.UU. nº 5.223.409, Huse, publicación internacional nº WO 92/06204, y mutagénesis dirigida regional (Derbyshire et al., Gene 46:145 (1986), y Ner et al., DNA 7:127, (1988)). Además, se puede usar Ztnfr12 marcado con biotina o FITC para la clonación de expresión de ligandos de Ztnfr12 nuevos.

También se pueden generar variantes de las secuencias de nucleótidos y polipéptidos de Ztnfr12 descritas por medio del reordenamiento aleatorio del ADN como describió Stemmer, Nature 370:389 (1994), Stemmer, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:10747 (1994), y la publicación internacional nº WO 97/20078. Brevemente, se generan moléculas de ADN variantes mediante recombinación homóloga in vitro mediante la fragmentación aleatoria de un ADN original, seguido de reconstrucción usando PCR, lo que da como resultado mutaciones puntuales introducidas aleatoriamente. Esta técnica se puede modificar mediante el uso de una familia de moléculas de ADN originales, tales como variantes alélicas o moléculas de ADN de diferentes especies, para introducir una variabilidad adicional en el proceso. La selección o el cribado en función de la actividad deseada, seguido por iteraciones adicionales de la mutagénesis y el ensayo, proporciona una "evolución" rápida de las secuencias, seleccionando las mutaciones deseables a la vez que se descartan simultáneamente los cambios perjudiciales.

Los métodos de mutagénesis descritos en el presente documento se pueden combinar con métodos de cribado automatizados de alto rendimiento para detectar la actividad de los polipéptidos clonados mutagenizados en las células hospedadoras. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican los polipéptidos biológicamente activos, o los polipéptidos que se unen a anticuerpos anti-Ztnfr12, se pueden recuperar a partir de las células hospedadoras y secuenciarlas rápidamente mediante el uso del equipamiento moderno. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y se pueden aplicar a polipéptidos de estructuras desconocidas.

La presente invención también incluye "fragmentos funcionales" de los polipéptidos Ztnfr12 y las moléculas de ácido nucleico que codifican tales fragmentos funcionales, como se define en las reivindicaciones. Se pueden llevar a cabo análisis de deleción rutinarios de las moléculas de ácido nucleico para obtener fragmentos funcionales de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido Ztnfr12. Como ilustración, las moléculas de ADN que comprenden la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 27 a 578 de SEQ ID Nº:1 se pueden digerir con nucleasa Bal31 para obtener una serie de deleciones anidadas. Los fragmentos se insertan después en vectores de expresión en el marco de lectura apropiado, y los polipéptidos expresados se aíslan y se analiza la capacidad de unión a anticuerpos anti-Ztnfr12. Una alternativa a la digestión con exónucleasas es usar la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos para introducir deleciones o codones de parada para especificar la producción de un fragmento deseado. De forma alternativa, los fragmentos particulares de un gen Ztnfr12 se pueden sintetizar mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa. Un ejemplo de fragmento funcional es el dominio extracelular de Ztnfr12 (es decir, alrededor de los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:2, o alrededor de los residuos de aminoácidos 1 a 79 de SEQ ID Nº:2).

Esta aproximación general se ejemplifica mediante los estudios sobre el truncamiento en uno o ambos extremos de los interferones, que han sido resumidos por Horisberger y Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995). Además, las técnicas habituales para el análisis funcional de las proteínas se describen, por ejemplo, en Trenter et al., Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993), Content et al., "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon", en Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), páginas 65-72 (Nijhoff 1987), Herschman, "The EGF Receptor", en Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton et al., (eds.) páginas 169-199 (Academic Press 1985), Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270:29270 (1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270:25291 (1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995), y Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30:1 (1996).

La presente memoria descriptiva describe fragmentos funcionales de un gen Ztnfr12 que tienen cambios de aminoácidos, en comparación con una secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento. Se puede identificar un gen Ztnfr12 variante basándose en la estructura mediante la determinación del nivel de identidad con las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos descritas, como se discutió anteriormente. Una aproximación alternativa para identificar un gen variante basándose en la estructura es determinar si una molécula de ácido nucleico que codifica un gen Ztnfr12 variante potencial puede hibridar con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como SEQ ID Nº:1.

La presente memoria descriptiva describe fragmentos polipeptídicos o péptidos que comprenden una porción que alberga un epítopo de un polipéptido Ztnfr12 descrito en el presente documento. Tales fragmentos o péptidos pueden comprender un "epítopo inmunógeno", que es una parte de una proteína que genera una respuesta de anticuerpos cuando se usa la proteína completa como inmunógeno. Los péptidos que albergan epítopos inmunógenos se pueden identificar mediante el uso de métodos habituales (véase, por ejemplo, Geysen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:3998 (1983)).

En contraste, los fragmentos polipeptídicos o péptidos pueden comprender un "epítopo antigénico", que es una región de una molécula proteica a la que se puede unir específicamente un anticuerpo. Ciertos epítopos consisten en un tramo lineal o contiguo de aminoácidos, y la antigenicidad de tales epítopos no se altera mediante agentes desnaturalizantes. Se conoce en la técnica que se pueden usar péptidos sintéticos relativamente cortos que pueden imitar los epítopos de una proteína para estimular la producción de anticuerpos contra la proteína (véase, por ejemplo, Sutcliffe et al., Science 219:660 (1983)). Por lo tanto, los péptidos y polipéptidos que albergan epítopos antigénicos son útiles para generar anticuerpos que se unen a los polipéptidos descritos en el presente documento.

Los péptidos y polipéptidos que albergan epítopos antigénicos pueden contener al menos cuatro a diez aminoácidos, al menos diez a quince aminoácidos, o alrededor de 15 a alrededor de 30 aminoácidos de una secuencia de aminoácidos. Tales péptidos y polipéptidos que albergan epítopos se pueden producir fragmentando un polipéptido Ztnfr12, o mediante síntesis peptídica química, como se describe en el presente documento. Además, se pueden seleccionar los epítopos mediante expresión en fagos de bibliotecas peptídicas aleatorias (véase, por ejemplo, Lane y Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993), y Cortese et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996)). Los métodos habituales para identificar epítopos y producir anticuerpos a partir de péptidos pequeños que comprenden un epítopo se describen, por ejemplo, en Mole, "Epitope Mapping", en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), páginas 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992), Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter y Ladyman (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995), y Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, páginas 9.3.1 - 9.3.5 y páginas 9.4.1 - 9.4.11 (John Wiley & Sons 1997).

Además de los usos descritos anteriormente, los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención son útiles como herramientas educativas en equipos de prácticas de laboratorio para cursos relacionados con la genética y la biología molecular, la química de proteínas, y la producción y el análisis de anticuerpos. Debido a sus secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas únicas, las moléculas de Ztnfr12 se pueden usar como patrones o como "incógnitas" para análisis. Por ejemplo, los polinucleótidos de Ztnfr12 se pueden usar como elemento auxiliar, tal como, por ejemplo, para enseñar a un estudiante cómo preparar construcciones de expresión para la expresión bacteriana, viral, o mamífera, que incluyen construcciones de fusión, en los que Ztnfr12 es el gen a expresar; para determinar los sitios de escisión para endonucleasas de restricción de los polinucleótidos; para determinar la localización del ARNm y del ADN de los polinucleótidos de Ztnfr12 en los tejidos (es decir, mediante transferencia de Northern y Southern, así como mediante reacción en cadena de la polimerasa); y para identificar los polinucleótidos y polipéptidos relacionados mediante hibridación de ácidos nucleicos. Como ilustración, los estudiantes descubrirán que la digestión con PstI de una molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 27 a 578 de SEQ ID Nº:1 proporciona dos fragmentos de alrededor de 174 pares de bases, y 378 pares de bases, y que la digestión con HinfI proporciona fragmentos de alrededor de 182 pares de bases, 226 pares de bases, y 144 pares de bases.

Los polipéptidos de Ztnfr12 se pueden usar como elemento auxiliar para enseñar la preparación de anticuerpos; para la identificación de proteínas mediante transferencia de Western; purificación de proteínas; determinación del peso de los polipéptidos Ztnfr12 expresados como proporción respecto de la proteína total expresada; identificación de los sitios de escisión del péptido; acoplamiento de marcadores amino- y carboxi-terminales; análisis de la secuencia de aminoácidos, así como, pero sin limitación, monitorización de las actividades biológicas de la proteína nativa y de la proteína marcada (es decir, inhibición mediante proteasas) in vitro e in vivo. Por ejemplo, los estudiantes descubrirán que la digestión de Ztnfr12 sin glicosilar con endopeptidasa Lys C produce cinco fragmentos que tienen pesos moleculares aproximados de 4870, 7691, 883, 4758, y 729, mientras la digestión de Ztnfr12 sin glicosilar con BNPS o NCS/urea produce fragmentos que tienen pesos moleculares aproximados de 10279, 4740, y 3877.

Los polipéptidos Ztnfr12 se pueden usar también para enseñar conocimientos analíticos tales como espectrometría de masas, dicroísmo circular para determinar la conformación, especialmente de las cuatro hélices \alpha, cristalografía de rayos X para determinar la estructura tridimensional a nivel atómico, espectroscopia de resonancia magnética nuclear para revelar la estructura de las proteínas en disolución. Por ejemplo, se puede dar un equipo que contiene Ztnfr12 a un estudiante para su análisis. Debido a que el instructor conocería la secuencia de aminoácidos, se puede dar la proteína al estudiante como examen para determinar los conocimientos o para desarrollar los conocimientos del estudiante, y el instructor sabría entonces si el estudiante ha analizado correctamente o no el polipéptido. Debido a que cada polipéptido es único, la utilidad educativa de Ztnfr12 sería única por sí misma.

Los anticuerpos que se unen específicamente a Ztnfr12 se pueden usar como elemento auxiliar de enseñanza para instruir a los estudiantes sobre cómo preparar columnas de cromatografía de afinidad para purificar Ztnfr12, clonar y secuenciar el polinucleótido que codifica un anticuerpo, y, así, como práctica para enseñar a un estudiante cómo diseñar anticuerpos humanizados. El gen Ztnfr12, el polipéptido o un anticuerpo serían empaquetados por empresas de reactivos y se venderían a instituciones educativas, de forma que los estudiantes adquirieran conocimientos en la técnica de la biología molecular. Debido a que cada gen y proteína son únicos, cada gen y proteína crean desafíos y experiencias educativas únicas para los estudiantes en una práctica de laboratorio. Tales equipos educativos que contienen el gen Ztnfr12, el polipéptido o un anticuerpo se consideran dentro del alcance de la presente invención.

Para cada polipéptido Ztnfr12, lo que incluye las variantes y las proteínas de fusión, una persona de experiencia habitual en la técnica puede generar fácilmente una secuencia polinucleotídica completamente degenerada que codifique esa variante mediante el uso de la información expuesta en las Tablas 1 y 2 anteriormente. Además, los expertos en la técnica pueden usar programas informáticos habituales para idear variantes de Ztnfr12 basándose en las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos descritas en el presente documento. Por lo tanto, la presente memoria descriptiva describe un medio legible informáticamente que tiene codificada una estructura de datos que proporciona al menos una de las siguientes secuencias: SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, y SEQ ID Nº:3. Las formas adecuadas de medios legibles informáticamente incluyen los medios magnéticos y los medios legibles ópticamente. Los ejemplos de medios magnéticos incluyen un disco duro o fijo, un circuito integrado de memoria de acceso aleatorio (RAM), un disco flexible, una cinta lineal digital (DLT), una memoria de disco, y un disco ZIP. Los medios legibles ópticamente se ejemplifican mediante discos compactos (p.ej., CD-memoria de sólo lectura (ROM), CD-reescribible (RW), y CD-grabable), discos versátiles/video digitales (DVD) (p.ej., DVD-ROM, DVD-RAM, y DVD+RW).

5. Producción de Polipéptidos Ztnfr12

Los polipéptidos descritos en el presente documento, que incluyen los polipéptidos de tamaño completo, los fragmentos funcionales, y las proteínas de fusión, se pueden producir en células hospedadoras recombinantes mediante técnicas convencionales. Para expresar un gen Ztnfr12, se debe unir de forma operable una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido a secuencias reguladoras que controlan la expresión transcripcional en un vector de expresión, y después se debe introducir en una célula hospedadora. Además de las secuencias reguladoras transcripcionales, tales como promotores y potenciadores, los vectores de expresión pueden incluir secuencias reguladoras transcripcionales y un gen marcador que es adecuado para la selección de las células que portan el vector de expresión.

Los vectores de expresión que son adecuados para la producción de una proteína exógena en células eucarióticas contienen típicamente (1) elementos de ADN procarióticos que codifican un origen de replicación bacteriano y un marcador de resistencia a antibióticos para posibilitar el crecimiento y la selección del vector de expresión en un hospedador bacteriano; (2) elementos de ADN eucarióticos que controlan la iniciación de la transcripción, tales como un promotor; y (3) elementos de ADN que controlan el procesamiento de los transcritos, tales como una secuencia de terminación de la transcripción/poliadenilación. Como se discutió anteriormente, los vectores de expresión pueden incluir también secuencias nucleotídicas que codifican una secuencia secretora que dirige al polipéptido heterólogo hacia la ruta secretora de una célula hospedadora. Por ejemplo, un vector de expresión de Ztnfr12 puede comprender un gen Ztnfr12 y una secuencia secretora derivada de cualquier gen secretado.

La expresión de Ztnfr12 se puede llevar a cabo mediante el uso de moléculas de ácido nucleico que incluyen o no incluyen porciones no codificantes del gen Ztnfr12. Sin embargo, se puede obtener una eficacia mayor en la producción a partir de ciertas células hospedadoras recombinantes cuando se incluye al menos una secuencia intrónica de Ztnfr12 en el vector de expresión.

Las proteínas Ztnfr12 de la presente invención se pueden expresar en células mamíferas. Los ejemplos de células hospedadoras mamíferas adecuadas incluyen células de riñón de mono verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), células de riñón embrionario humano (293-HEK; ATCC CRL 1573), células de riñón de cría de hámster (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), células de riñón canino (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovario de hámster chino (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), células hipofisarias de rata (GH1; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células de hepatoma de rata (H-4-II-E; ATCC CRL 1548) células de riñón de mono transformadas con SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650) y células embrionarias murinas (NIH-3T3; ATCC CRL 1658).

Para un hospedador mamífero, las señales reguladoras transcripcionales y traduccionales pueden proceder de fuentes virales, tales como adenovirus, papilomavirus bovino, virus del simio, o similares, en las que las señales reguladoras están asociadas a un gen particular que tiene un nivel de expresión elevado. Las secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales adecuadas se pueden obtener también a partir de genes mamíferos, tales como los genes de actina, colágeno, miosina y metalotioneina.

Las secuencias reguladoras transcripcionales incluyen una región promotora suficiente para dirigir la iniciación de la síntesis del ARN. Los promotores eucarióticos adecuados incluyen el promotor del gen metalotioneina I de ratón (Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982)), el promotor TK del virus Herpes (McKnight, Cell 31:355 (1982)), el promotor temprano de SV40 (Benoist et al., Nature 290:304 (1981)), el promotor del virus del sarcoma de Rous (Gorman et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:6777 (1982)), el promotor de citomegalovirus (Foecking et al., Gene 45:101 (1980)), y el promotor del virus de tumor mamario de ratón (véase, en general, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", en Protein Engineering Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)).

De forma alternativa, se puede usar un promotor procariótico, tal como el promotor de la ARN polimerasa de bacteriófago T3, para controlar la expresión del gen Ztnfr12 en las células mamíferas si el promotor procariótico se regula mediante un promotor eucariótico (Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990), y Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991)).

Se puede introducir un vector de expresión en las células hospedadoras mediante el uso de una diversidad de técnicas habituales, que incluyen la transfección con fosfato cálcico, la transfección mediada por liposomas, la administración mediada por microproyectiles, la electroporación, y similares. Las células transfectadas se pueden seleccionar y propagar para proporcionar células hospedadoras recombinantes que comprenden el vector de expresión integrado de manera estable en el genoma de la célula hospedadora. Las técnicas para introducir vectores en las células eucarióticas y las técnicas para seleccionar tales transformantes estables mediante el uso de un marcador seleccionable dominante fueron descritas, por ejemplo, por Ausubel (1995) y por Murray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991).

Por ejemplo, un marcador seleccionable adecuado es un gen que proporciona resistencia hacia el antibiótico neomicina. En este caso, la selección se lleva a cabo en presencia de un fármaco de tipo neomicina, tal como G-418 o similar. También se pueden usar sistemas de selección para incrementar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso denominado "amplificación". La amplificación se lleva a cabo cultivando transfectantes en presencia de un nivel bajo del agente selectivo, y después incrementando la cantidad del agente selectivo para seleccionar las células que producen niveles elevados de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable amplificable adecuado es la dihidrofolato reductasa, que confiere resistencia a metotrexato. También se pueden usar otros genes de resistencia a fármacos (p.ej., resistencia a higromicina, resistencia a múltiples fármacos, puromicina acetiltransferasa). De forma alternativa, se pueden usar marcadores que introducen un fenotipo alterado, tal como la proteína fluorescente verde, o las proteínas de la superficie celular tales como CD4, CD8, MHC de clase I, fosfatasa alcalina placentaria para separar las células transfectadas de las células sin transfectar mediante medios tales como FACS o las técnicas de separación con esferas magnéticas.

También se pueden producir los polipéptidos Ztnfr12 mediante células mamíferas cultivadas con el uso de un sistema de administración viral. Los virus ejemplares para este propósito incluyen los adenovirus, herpesvirus, virus vaccinia y virus adenoasociado (AAV). El adenovirus, un virus de ADN bicatenario, es actualmente el vector de transferencia génica mejor estudiado para la administración de un ácido nucleico heterólogo (para una revisión, véase Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994), y Douglas y Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)). Las ventajas del sistema de adenovirus incluyen la capacidad para albergar insertos de ADN relativamente grandes, la capacidad de cultivo hasta un título elevado, la capacidad de infectar un amplio grupo de tipos celulares mamíferos, y la flexibilidad que permite el uso de un gran número de vectores disponibles que contienen diferentes promotores.

Mediante la deleción de porciones del genoma del adenovirus, se pueden albergar insertos mayores (hasta 7 kb) de ADN heterólogo. Estos insertos se pueden incorporar en el ADN viral mediante ligadura directa o mediante recombinación homóloga con un plásmido co-transfectado. Una opción es delecionar el gen E1 esencial del vector viral, lo que da como resultado la incapacidad de replicarse a menos que la célula hospedadora proporcione el gen E1. Las células 293 humanas infectadas con un vector de adenovirus (ATCC Nºs CRL-1573, 45504, 45505), por ejemplo, se pueden cultivar como células adherentes o en cultivo en suspensión con una densidad celular relativamente elevada para producir cantidades significativas de proteína (véase Garnier et al., Cytotechnol. 15:145 (1994)).

También se puede expresar Ztnfr12 en otras células eucarióticas superiores, tales como células aviares, fúngicas, de insectos, de levaduras, o vegetales. El sistema de baculovirus proporciona un medio eficaz para introducir genes Ztnfr12 clonados en las células de insectos. Los vectores de expresión adecuados se basan en el virus de la polihedrosis nuclear múltiple en Autographa californica (AcMNPV), y contienen promotores muy conocidos tales como el promotor 70 de la proteína de choque térmico de Drosophila (hsp), el promotor del gen inmediatamente temprano del virus de la polihedrosis nuclear en Autographa californica (ie-1) y el promotor 39K temprano retardado, el promotor p10 de baculovirus, y el promotor de metalotioneina de Drosophila. Un segundo método para producir baculovirus recombinantes utiliza un sistema basado en transposones descrito por Luckow (Luckow, et al., J. Virol. 67:4566 (1993)). Este sistema, que utiliza vectores de transferencia, se comercializa en el equipo BAC-to-BAC (Life Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza un vector de transferencia, PFASTBAC (Life Technologies) que contiene un transposón Tn7 para mover el ADN que codifica el polipéptido Ztnfr12 a un genoma de baculovirus mantenido en E. coli en forma de un plásmido grande denominado "bácmido". Véase, Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), y Chazenbalk, y Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión en el marco de lectura con un ADN que codifica un marcador de epítopo en el extremo C- o N-terminal del polipéptido Ztnfr12 expresado, por ejemplo, un marcador de epítopo Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 82:7952 (1985)). Mediante el uso de un método conocido en la técnica, se transforma un vector de transferencia que contiene un gen Ztnfr12 en E. coli, y se criba en busca de bácmidos, que contienen un gen lacZ interrumpido indicativo del baculovirus recombinante. El ADN del bácmido que contiene el genoma de baculovirus recombinante se aísla después mediante el uso de técnicas
habituales.

El vector PFASTBAC ilustrativo se puede modificar en un grado considerable. Por ejemplo, se puede eliminar el promotor de polihedrina y sustituirlo con el promotor de la proteína básica de baculovirus (también conocido como Pcor, p6.9 o promotor MP) que se expresa de forma temprana en la infección por baculovirus, y que se ha demostrado que es ventajoso para expresar proteínas secretadas (véase, por ejemplo, Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), y Chazenbalk y Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). En tales construcciones de vectores de transferencia, se puede usar una versión corta o larga del promotor de la proteína básica. Además, se pueden construir vectores de transferencia que sustituyen las secuencias señal secretoras de Ztnfr12 nativo con secuencias señal secretoras derivadas de las proteínas de insectos. Por ejemplo, se puede usar una secuencia señal secretora de Ecdisteroide Glucosiltransferasa (EGT), melitina de miel de abeja (Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA), o gp67 de baculovirus (PharMingen: San Diego, CA) en construcciones para sustituir la secuencia señal secretora de Ztnfr12 nativo.

El virus recombinante o el bácmido se usa para transfectar las células hospedadoras. Las células hospedadoras de insecto adecuadas incluyen las líneas celulares derivadas de IPLB-Sf-21, una línea celular ovárica de crisálida de Spodoptera frugiperda, tal como Sf9 (ATCC CRL 1711), Sf21AE, y Sf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA), así como células Schneider-2 de Drosophila, y la línea celular HIGH FIVEO (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (patente de EE.UU. nº 5.300.435). Se pueden usar medios exentos de suero disponibles comercialmente para cultivar y mantener las células. Los medios adecuados son Sf900 II^{TM} (Life Technologies) o ESF 921^{TM} (Expression Systems) para las células Sf9; y Ex-cellO405^{TM} (JRH Biosciences, Lenexa, KS) o Express FiveO^{TM} (Life Technologies) para las células de T. ni. Cuando se usa un virus recombinante, las células se cultivan en general a partir de una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 10^{5} células hasta una densidad de 1-2 x 10^{6} células, en cuyo momento se añade una disolución de reserva viral recombinante a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 a 10, más generalmente cercana a 3.

Las técnicas establecidas para producir proteínas recombinantes en sistemas de baculovirus se proporcionan en Bailey et al., "Manipulation of Baculovirus Vectors", en Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), páginas 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991), en Patel et al., "The baculovirus expression system", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), páginas 205-244 (Oxford University Press 1995), en Ausubel (1995) en las páginas 16-37 a 16-57, en Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995), y en Lucknow, "Insect Cell Expression Technology", en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996).

También se pueden usar células fúngicas, que incluyen las células de levaduras, para expresar los genes descritos en el presente documento. Las especies de levaduras de interés particular a este respecto incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, y Pichia methanolica. Los promotores adecuados para la expresión en levaduras incluyen los promotores de GAL1 (galactosa), PGK (fosfoglicerato quinasa), ADH (alcohol deshidrogenasa), AOX1 (alcohol oxidasa), HIS4 (histidinol deshidrogenasa), y similares. Se han diseñado muchos vectores de clonación en levaduras, y están fácilmente disponibles. Estos vectores incluyen los vectores basados en YIp, tales como YIp5, los vectores YRp, tales como YRp17, los vectores YEp, tales como YEp13, y los vectores YCp, tales como YCp19. Los métodos para transformar células de S. cerevisiae con ADN exógeno y para producir polipéptidos recombinantes a partir de él se describen, por ejemplo, en Kawasaki, patente de EE.UU. nº 4.599.311, Kawasaki et al., patente de EE.UU. nº 4.931.373, Brake, patente de EE.UU. nº 4.870.008, Welch et al., patente de EE.UU. nº 5.037.743, y Murray et al., patente de EE.UU. nº 4.845.075. Las células transformadas se seleccionan por el fenotipo determinado por el marcador seleccionable, habitualmente la resistencia a un fármaco o la capacidad de crecer en ausencia de un nutriente particular (p.ej., leucina). Un sistema de vector adecuado para el uso en Saccharomyces cerevisiae es el sistema del vector POT1 descrito por Kawasaki et al. (patente de EE.UU. nº 4.931.373), que permite seleccionar las células transformadas mediante el cultivo en medios que contienen glucosa. Los promotores y terminadores adecuados adicionales para el uso en levaduras incluyen los de los genes de las enzimas glicolíticas (véase, p.ej., Kawasaki, patente de EE.UU. nº 4.599.311, Kingsman et al., patente de EE.UU. nº 4.615.974, y Bitter, patente de EE.UU. nº 4.977.092) y de los genes de la alcohol deshidrogenasa. Véanse además las patentes de EE.UU. nºs 4.990.446, 5.063.154, 5.139.936, y 4.661.454.

Se conocen en la técnica sistemas de transformación para otras levaduras, que incluyen Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa. Véase, por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986), y Cregg, patente de EE.UU. nº 4.882.279. Se pueden utilizar células de Aspergillus según los métodos de McKnight et al., patente de EE.UU. nº 4.935.349. Los métodos para transformar Acremonium chrysogenum se describen en Sumino et al., patente de EE.UU. nº 5.162.228. Los métodos para transformar Neurospora se describen en Lambowitz, patente de EE.UU. nº 4.486.533.

Por ejemplo, se describe el uso de Pichia methanolica como hospedador para la producción de proteínas recombinantes en Raymond, patente de EE.UU. nº 5.716.808, Raymond, patente de EE.UU. nº 5.736.383, Raymond et al., Yeast 14:11-23 (1998), y en las publicaciones internacionales nºs WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536, y WO 98/02565. Las moléculas de ADN para el uso en la transformación de P. methanolica se prepararán habitualmente en forma de plásmidos circulares bicatenarios, que se pueden linealizar antes de la transformación. Para la producción de polipéptidos en P. methanolica, el promotor y el terminador del plásmido pueden ser los de un gen de P. methanolica, tal como un gen de utilización de alcohol de P. methanolica (AUG1 o AUG2). Otros promotores útiles incluyen los de los genes de dihidroxiacetona sintasa (DHAS), formiato deshidrogenasa (FMD), y catalasa (CAT). Para facilitar la integración del ADN en el cromosoma del hospedador, se puede flanquear todo el segmento de expresión del plásmido en ambos extremos con secuencias de ADN del hospedador. Un marcador seleccionable adecuado para el uso en Pichia methanolica es un gen ADE2 de P. methanolica, que codifica fosforribosil-5-aminoimidazol carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21), y que permite que las células hospedadoras ade2 crezcan en ausencia de adenina. Para los procesos industriales a gran escala, en los que es deseable minimizar el uso de metanol, se pueden usar células hospedadoras en las que ambos genes de utilización de metanol (AUG1 y AUG2) estén delecionados. Para la producción de proteínas secretadas, las células hospedadoras pueden ser deficientes en los genes de proteasas vacuolares (PEP4 y PRB1). Se usa la electroporación para facilitar la introducción de un plásmido que contiene ADN que codifica un polipéptido de interés en las células de P. methanolica. Las células de P. methanolica se pueden transformar mediante electroporación con el uso de un campo eléctrico pulsátil exponencialmente descendente, que tiene una intensidad del campo de 2,5 a 4,5 kV/cm, preferiblemente alrededor de 3,75 kV/cm, y una constante de tiempo (t) de 1 a 40 milisegundos, lo más preferiblemente alrededor de 20 milisegundos.

Los vectores de expresión se pueden introducir también en protoplastos vegetales, tejidos vegetales intactos, o células vegetales aisladas. Los métodos para introducir los vectores de expresión en el tejido vegetal incluyen la infección directa o el co-cultivo del tejido vegetal con Agrobacterium tumefaciens, la administración mediada por microproyectiles, la inyección de ADN, la electroporación, y similares. Véase, por ejemplo, Horsch et al., Science 227:1229 (1985), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992), y Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants", en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1993).

De forma alternativa, los genes Ztnfr12 se pueden expresar en células hospedadoras procarióticas. Los promotores adecuados que se pueden usar para expresar los polipéptidos Ztnfr12 en un hospedador procariótico son muy conocidos para los expertos en la técnica, e incluyen los promotores capaces de reconocer las polimerasas T4, T3, Sp6 y T7, los promotores P_{R} y P_{L} del bacteriófago \lambda, los promotores de trp, recA, choque térmico, lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA, y lacZ de E. coli, los promotores de B. subtilis, los promotores de los bacteriófagos de Bacillus, los promotores de Streptomyces, el promotor int del bacteriófago \lambda, el promotor bla de pBR322, y el promotor CAT del gen de cloranfenicol acetiltransferasa. Los promotores procarióticos han sido revisados por Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987), y por Ausubel et al. (1995).

Los hospedadores procarióticos adecuados incluyen E. coli y Bacillus subtilis. Las cepas adecuadas de E. coli incluyen BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, y ER1647 (véase, por ejemplo, Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Las cepas adecuadas de Bacillus subtilis incluyen BR151, YB886, MI119, MI120, y B170 (véase, por ejemplo, Hardy, "Bacillus Cloning Methods", en DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)).

Cuando se expresa un polipéptido Ztnfr12 en bacterias tales como E. coli, el polipéptido puede quedar retenido en el citoplasma, en general en forma de gránulos insolubles, o se puede dirigir al espacio periplásmico mediante una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células se lisan y los gránulos se recuperan y se desnaturalizan mediante el uso, por ejemplo, de isotiocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado se puede replegar después y dimerizar diluyendo el desnaturalizante, tal como mediante diálisis con una disolución de urea y una combinación de glutatión reducido y oxidado, seguido de diálisis con una solución salina tamponada. En el segundo caso, el polipéptido se puede recuperar del espacio periplásmico en una forma soluble y funcional rompiendo las células (por ejemplo, mediante sonicación o choque osmótico) para liberar el contenido del espacio periplásmico y recuperar la proteína, por lo que se evita la necesidad de desnaturalización y replegamiento.

Los métodos para expresar proteínas en hospedadores procarióticos son muy conocidos para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995), Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995), y Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria", en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), página 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)).

Los métodos habituales para introducir vectores de expresión en células bacterianas, de levaduras, de insectos y vegetales se proporcionan, por ejemplo, en Ausubel (1995).

Los métodos generales para expresar y recuperar proteínas exógenas producidas mediante un sistema celular mamífero se proporcionan, por ejemplo, en Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Las técnicas habituales para recuperar proteínas producidas mediante un sistema bacteriano se proporcionan, por ejemplo, en Grisshammer et al., "Purification of over-produced proteins from E. coli cells", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), páginas 59-92 (Oxford University Press 1995). Los métodos establecidos para aislar proteínas recombinantes a partir de un sistema de baculovirus se describen en Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995).

Como alternativa, los polipéptidos de la presente invención se pueden sintetizar mediante síntesis en fase sólida exclusiva, métodos en fase sólida parcial, condensación de fragmentos o síntesis en disolución clásica. Los expertos en la técnica conocen bien estos métodos de síntesis (véase, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2ª edición), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer y Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986), Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989), Fields y Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis", Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997), y Lloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)). Las variaciones de las estrategias de síntesis química total, tales como la "ligadura química nativa" y la "ligadura de proteínas expresadas" son también habituales (véase, por ejemplo, Dawson et al., Science 266:776 (1994), Hackeng et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6705 (1998), y Severinov y Muir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998)).

Los péptidos y polipéptidos descritos en el presente documento comprenden al menos seis, al menos nueve, o al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos de SEQ ID Nº:2. Como ilustración, los polipéptidos pueden comprender al menos seis, al menos nueve, o al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos de los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 79 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 69 de SEQ ID Nº:2, o los residuos de aminoácidos 7 a 79 de SEQ ID Nº:2. Los polipéptidos pueden comprender 20, 30, 40, 50, 100, o más residuos contiguos de estas secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, los polipéptidos pueden comprender al menos 30 residuos de aminoácidos contiguos de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) los residuos de aminoácidos 1 a 184 de SEQ ID Nº:2, (b) los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:2, (c) los residuos de aminoácidos 1 a 79 de SEQ ID Nº:2, (d) los residuos de aminoácidos 7 a 69 de SEQ ID Nº:2, y (e) los residuos de aminoácidos 7 a 79 de SEQ ID Nº:2. Las moléculas de ácido nucleico que codifican tales péptidos y polipéptidos son útiles como cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa y como sondas, y estos péptidos y polipéptidos son útiles para producir anticuerpos hacia Ztnfr12.

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6. Producción de proteínas de fusión y conjugados de Ztnfr12

Una clase general de análogos de Ztnfr12 son variantes que tienen una secuencia de aminoácidos que es una mutación de la secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento. Otra clase general de análogos de Ztnfr12 se proporciona mediante anticuerpos anti-idiotipo, y los fragmentos de los mismos, como se describe más adelante. Además, se pueden usar anticuerpos recombinantes que comprenden dominios variables anti-idiotipo como análogos (véase, por ejemplo, Monfardini et al., Proc. Assoc. Am. Physicians 108:420 (1996)). Debido a que los dominios variables de los anticuerpos anti-idiotipo de Ztnfr12 imitan a Ztnfr12, estos dominios pueden proporcionar una actividad de unión de Ztnfr12. Los expertos en la técnica conocen los métodos para producir anticuerpos catalíticos anti-idiotípicos (véase, por ejemplo, Joron et al., Ann. N Y Acad. Sci. 672:216 (1992), Friboulet et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47:229 (1994), y Avalle et al., Ann. N Y Acad. Sci. 864:118 (1998)).

Otra aproximación para identificar los análogos de Ztnfr12 se proporciona mediante el uso de bibliotecas combinatorias. Los métodos para construir y cribar bibliotecas de expresión en fagos y otras bibliotecas combinatorias se proporcionan, por ejemplo, en Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press 1996), Verdine, patente de EE.UU. nº 5.783.384, Kay, et. al., patente de EE.UU. nº 5.747.334, y Kauffman et al., patente de EE.UU. nº 5.723.323.

Los polipéptidos Ztnfr12 tienen usos in vivo e in vitro. Como ilustración, se puede añadir una forma soluble de Ztnfr12 a un medio de cultivo de células para inhibir el efecto del ZTNF4 producido por las células cultivadas, o añadido al medio de ensayo.

Las proteínas de fusión de Ztnfr12 se pueden usar para expresar Ztnfr12 en un hospedador recombinante, y para aislar el Ztnfr12 producido. Como se describe más adelante, las proteínas de fusión de Ztnfr12 también tienen usos en el diagnóstico y la terapia. Un tipo de proteína de fusión comprende un péptido que guía un polipéptido Ztnfr12 desde una célula hospedadora recombinante. Para dirigir a un polipéptido Ztnfr12 hacia la ruta secretora de una célula hospedadora eucariótica, se proporciona una secuencia señal secretora (también conocida como péptido señal, secuencia líder, secuencia prepro o pre-secuencia) en el vector de expresión de Ztnfr12. Aunque la secuencia señal secretora puede proceder de Ztnfr12, una secuencia señal adecuada puede proceder también de otra proteína secretada o sintetizada de novo. La secuencia señal secretora se une de forma operable a una secuencia que codifica Ztnfr12, de forma que las dos secuencias están unidas en el marco de lectura correcto y colocadas para dirigir al polipéptido recién sintetizado hacia la ruta secretora de la célula hospedadora. Las secuencias señal secretoras se colocan habitualmente en 5' respecto de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias señal secretoras se pueden colocar en otro sitio de la secuencia de nucleótidos de interés (véase, p.ej., Welch et al., patente de EE.UU. nº 5.037.743; Holland et al., patente de EE.UU. nº 5.143.830).

Aunque la secuencia señal secretora de Ztnfr12 o de otra proteína producida por las células mamíferas (p.ej., la secuencia señal del activador de plasminógeno de tipo tisular, como se describió, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.641.655) es útil para la expresión de Ztnfr12 en hospedadores mamíferos recombinantes, se prefiere una secuencia señal de levadura para la expresión en células de levadura. Los ejemplos de secuencias señal de levadura adecuadas son las obtenidas de la feromona sexual de levaduras factor \alpha (codificado por el gen Mf\alphaI), invertasa (codificada por el gen SUC2), o la fosfatasa ácida (codificada por el gen PHO5). Véase, por ejemplo, Romanos et al., "Expression of Cloned Genes in Yeast", en DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2ª edición, Glover y Hames (eds.), páginas 123-167 (Oxford University Press 1995).

En las células bacterianas, a menudo es deseable expresar una proteína heteróloga en forma de una proteína de fusión para disminuir la toxicidad, incrementar la estabilidad, y aumentar la recuperación de la proteína expresada. Por ejemplo, se puede expresar Ztnfr12 como una proteína de fusión que comprende un polipéptido de glutatión S-transferasa. Las proteínas de fusión de glutatión S-transferasa son en general solubles, y fácilmente purificables a partir de lisados de E. coli en columnas con glutatión inmovilizado. En las aproximaciones similares, se puede aislar una proteína de fusión de Ztnfr12 que comprende una proteína de unión a maltosa con una columna de resina de amilosa, mientras una proteína de fusión que comprende el extremo C-terminal de un gen de proteína A truncado se puede purificar mediante el uso de IgG-sefarosa. Las técnicas establecidas para expresar un polipéptido heterólogo en forma de una proteína de fusión en una célula bacteriana se describen, por ejemplo, en Williams et al., "Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies", en DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2ª edición, Glover y Hames (Eds.), páginas 15-58 (Oxford University Press 1995). Además, hay sistemas de expresión disponibles comercialmente. Por ejemplo, el sistema de purificación de proteínas PINPOINT Xa (Promega Corporation; Madison, WI) proporciona un método para aislar una proteína de fusión que comprende un polipéptido que se biotinila durante la expresión con una resina que comprende avidina.

Los marcadores peptídicos que son útiles para aislar polipéptidos heterólogos expresados por células procarióticas o eucarióticas incluyen los marcadores de poliHistidina (que tienen afinidad por las resinas quelantes de níquel), marcadores c-myc, la proteína de unión a calmodulina (aislada con una cromatografía de afinidad a calmodulina), sustancia P, el marcador RYIRS (que se une a anticuerpos anti-RYIRS), el marcador Glu-Glu, y el marcador FLAG (que se une a anticuerpos anti-FLAG). Véase, por ejemplo, Luo et al., Arch. Biochem. Biophys. 329:215 (1996), Morganti et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 23:67 (1996), y Zheng et al., Gene 186:55 (1997). Hay disponibles moléculas de ácido nucleico que codifican tales marcadores peptídicos, por ejemplo, de Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO).

Otra forma de proteína de fusión comprende un polipéptido Ztnfr12 y una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina, generalmente un fragmento F_{c}, que contiene dos o tres dominios de la región constante y una región de la bisagra, pero que carece de la región variable. Las proteínas de fusión que comprenden un resto de Ztnfr12 y un resto de Fc se pueden usar, por ejemplo, como herramienta de ensayo in vitro. Por ejemplo, la presencia de un ligando de Ztnfr12 en una muestra biológica se puede detectar mediante el uso de una proteína de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina, en la que el resto de Ztnfr12 se usa para unir el ligando, y se usa una macromolécula, tal como proteína A o anticuerpo anti-Fc, para unir la proteína de fusión a un soporte sólido. Tales sistemas se pueden usar para identificar los agonistas y antagonistas que interfieren con la unión de un ligando de Ztnfr12 a su receptor.

Como ilustración, Chang et al., patente de EE.UU. nº 5.723.125, describe una proteína de fusión que comprende un interferón humano y un fragmento Fc de inmunoglobulina humana. El extremo C-terminal del interferón está unido al extremo N-terminal del fragmento Fc mediante un resto espaciador peptídico. Un ejemplo de un espaciador peptídico es un péptido que comprende principalmente una secuencia inerte para las células T, que es inmunológicamente inerte. Un espaciador peptídico ejemplar es la secuencia de aminoácidos: GGSGG SGGGG SGGGG S (SEQ ID Nº:4). En esta proteína de fusión, un resto de Fc ilustrativo es una cadena \gamma4 humana, que es estable en disolución y tiene poca o ninguna actividad de activación del complemento. Por lo tanto, la presente memoria descriptiva describe una proteína de fusión de Ztnfr12 que comprende un resto de Ztnfr12 y un fragmento Fc humano, en la que el extremo C-terminal del resto de Ztnfr12 está unido al extremo N-terminal del fragmento Fc por medio de un espaciador peptídico, tal como un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:4. El resto de Ztnfr12 puede ser una molécula de Ztnfr12 o un fragmento de la misma. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender un fragmento Fc (p.ej., un fragmento Fc humano), y los residuos de aminoácidos 1 a alrededor de 69 de SEQ ID Nº:2, o los residuos de aminoácidos 1 a 79 de SEQ ID Nº:2.

En otra variación, una proteína de fusión de Ztnfr12 comprende una secuencia de IgG, un resto de Ztnfr12 unido covalentemente al extremo aminoterminal de la secuencia de IgG, y un péptido señal que está unido covalentemente al extremo aminoterminal del resto de Ztnfr12, en la que la secuencia de IgG consiste en los siguientes elementos, en el siguiente orden: una región de la bisagra, un dominio CH_{2}, y un dominio CH_{3}. Por lo tanto, la secuencia de IgG carece de un dominio CH_{1}. El resto de Ztnfr12 exhibe actividad de Ztnfr12, como se describe en el presente documento, tal como la capacidad de unirse a un ligando de Ztnfr12 (p.ej., ZTNF4). Esta aproximación general para producir proteínas de fusión que comprenden tanto porciones de anticuerpo como porciones que no son de anticuerpo se ha descrito en LaRochelle et al., documento EP 742830 (documento WO 95/21258).

El Ejemplo 4 describe la construcción de una proteína de fusión de Ztnfr12, en la que el resto de inmunoglobulina, derivado de IgG, contiene ciertas mutaciones. Se han identificado cinco clases de inmunoglobulinas, IgG, IgA, IgM, IgD, e IgE, en los vertebrados superiores. Las proteínas IgG, IgD, e IgE son, de forma característica, heterotetrámeros unidos por puentes disulfuro que consisten en dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. En general, IgM se halla como pentámero de un tetrámero, mientras IgA se da como un dímero de un tetrá-
mero.

IgG comprende la clase principal, ya que normalmente existe como la segunda proteína más abundante hallada en plasma. En los humanos, IgG consiste en cuatro subclases, denominadas IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Como se muestra en la Figura 1, cada cadena pesada de inmunoglobulina posee una región constante que consiste en los dominios proteicos de la región constante (C_{H1}, bisagra, C_{H2}, y C_{H3}) que son invariables para una subclase dada. Las regiones constantes de la cadena pesada de la clase IgG se identifican con la letra griega \gamma. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la subclase IgG1 contienen una región constante de la cadena pesada \gamma1.

El fragmento Fc, o dominio Fc, consiste en las regiones de la bisagra de las cadenas pesadas unidas por puentes disulfuro y los dominios C_{H2} y C_{H3}. En las proteínas de fusión con inmunoglobulinas, se usan a menudo los dominios Fc de la subclase IgG1 como resto de inmunoglobulina, porque IgG1 tiene la semivida en suero más larga de todas las proteínas séricas. La semivida larga en suero puede ser una característica deseable de la proteína para estudios en animales y para el uso terapéutico potencial en humanos. Además, la subclase IgG1 posee la capacidad más intensa de llevar a cabo las funciones efectoras mediadas por los anticuerpos. La función efectora principal que puede ser la más útil en una proteína de fusión con inmunoglobulina es la capacidad de un anticuerpo IgG1 de actuar como mediador en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Por otra parte, ésta podría ser una función indeseable para una proteína de fusión cuya función principal fuera la de un antagonista. Se han identificado varios de los residuos de aminoácidos específicos que son importantes para la actividad mediada por la región constante de un anticuerpo de la subclase IgG1. La inclusión o la exclusión de estos aminoácidos específicos permite por lo tanto la inclusión o la exclusión de una actividad mediada por la región constante de la inmunoglobulina específica.

El Ejemplo 4 describe dos versiones de un Fc de IgG1 humano modificado que se generaron para crear una proteína de fusión Ztnfr12-Fc. Fc4 y Fc5 contienen mutaciones para reducir las funciones efectoras mediadas por el Fc reduciendo la unión de Fc\gammaRI y la unión de C1q del complemento. De forma específica, se introdujeron tres sustituciones de aminoácidos para reducir la unión de Fc\gammaRI. Estas son las sustituciones en las posiciones del índice EU 234, 235, y 237 (residuos de aminoácidos 38, 39, y 41 de SEQ ID Nº:17, que es una secuencia de una región \gamma1 de una inmunoglobulina natural). Se ha demostrado que las sustituciones en estas posiciones reducen la unión a Fc\gammaRI (Duncan et al., Nature 332:563 (1988)). Estas sustituciones de aminoácidos pueden reducir también la unión de Fc\gammaRIIa, así como la unión de Fc\gammaRIII (Sondermann et al., Nature 406:267 (2000); Wines et al., J. Immunol. 164:5313 (2000)).

Varios grupos han descrito la relevancia de las posiciones del índice EU 330 y 331 (residuos de aminoácidos 134 y 135 de SEQ ID Nº:17) en la unión de C1q del complemento y la posterior fijación del complemento (Canfield y Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991); Tao et al., J. Exp. Med. 178:661 (1993)). Se introdujeron sustituciones de aminoácidos en estas posiciones en Fc4 para reducir la fijación del complemento. El dominio C_{H}3 de Fc4 es idéntico al hallado en el polipéptido de tipo natural correspondiente, excepto por el codón de parada, que se cambió de TGA a TAA para eliminar un sitio de metilación dam potencial cuando el ADN clonado se cultiva en cepas dam positivas de E. coli.

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En Fc5, el residuo de arginina en la posición del índice EU 218 se mutó de vuelta a lisina, porque el esquema de clonación de BglII no se usó en las proteínas de fusión que contenían este Fc particular. El resto de la secuencia de Fc5 coincide con la descripción anterior de Fc4.

Otras variantes de Fc útiles incluyen Fc6, Fc7, y Fc8. Fc6 es idéntico a Fc5, excepto en que se ha eliminado el codón de lisina carboxiterminal. La lisina C-terminal de las inmunoglobulinas maduras se elimina a menudo de las inmunoglobulinas maduras de forma post-traduccional antes de la secreción desde las células B, o se elimina durante la circulación en el suero. Por lo tanto, el residuo de lisina C-terminal no se halla generalmente en los anticuerpos circulantes. Como en Fc4 y Fc5 anteriormente, el codón de parada en la secuencia de Fc6 se cambió a TAA.

Fc7 es idéntico al Fc de \gamma1 de tipo natural, excepto por una sustitución de aminoácido en la posición del índice EU 297 localizada en el dominio C_{H2}. La posición del índice EU Asn-297 (residuo de aminoácido 101 de SEQ ID Nº:17) es un sitio de unión de carbohidratos unidos a N. El carbohidrato unido a N introduce una fuente de variabilidad potencial en una proteína expresada de forma recombinante debido a las variaciones potenciales de producción en la estructura de los carbohidratos. En un intento de eliminar esta variabilidad potencial, Asn-297 se mutó a un residuo de glutamina para evitar la unión del carbohidrato unido a N en esa posición del residuo. El carbohidrato del residuo 297 está implicado también en la unión de Fc al Fc\gammaRIII (Sondermann et al., Nature 406:267 (2000)). Por lo tanto, la eliminación del carbohidrato debería disminuir la unión de las proteínas de fusión que contienen Fc7 recombinante a los Fc\gammaRs en general. Como se mencionó anteriormente, el codón de parada en la secuencia de Fc7 se mutó a TAA.

Fc8 es idéntico a la región \gamma1 de inmunoglobulina de tipo natural mostrada en SEQ ID Nº:17, excepto porque el residuo de cisteína en la posición del índice EU 220 (residuo de aminoácido 24 de SEQ ID Nº:17) se sustituyó por un residuo de serina. Esta mutación eliminó el residuo de cisteína que normalmente forma enlaces disulfuro con la región constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina.

La presente memoria descriptiva describe proteínas de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina que comprenden un resto del receptor Ztnfr12 que consiste en los residuos de aminoácidos 7 a 69 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 79 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 39 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 19 a 35 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 79 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 71 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 71 de SEQ ID Nº:2, o los residuos de aminoácidos 1 a 39 de SEQ ID Nº:2. Más en general, la presente memoria descriptiva describe proteínas de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina, en las que el resto de receptor Ztnfr12 consiste en un fragmento de los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 71 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 71 de SEQ ID Nº:2, o los residuos de aminoácidos 1 a 79 de SEQ ID Nº:2, y en la que el resto de receptor Ztnfr12 se une a ZTNF4.

El resto de inmunoglobulina de una proteína de fusión descrita en el presente documento comprende al menos una región constante de una inmunoglobulina. Preferiblemente, el resto de inmunoglobulina representa un segmento de una inmunoglobulina humana. La secuencia de inmunoglobulina humana puede ser una secuencia de aminoácidos de tipo natural, o una secuencia de aminoácidos de tipo natural modificada, que tiene al menos una de las mutaciones de aminoácidos discutidas anteriormente.

La secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana puede variar también de la de tipo natural por tener una o más mutaciones características de un determinante alotípico conocido. La Tabla 5 muestra los determinantes alotípicos de la región constante de IgG\gamma1 humana (Putman, The Plasma Proteins, Vol. V, páginas 49 a 140 (Academic Press, Inc. 1987)). Las posiciones del índice EU 214, 356, 358, y 431 definen los alotipos de IgG\gamma1 conocidos. La posición 214 está en el dominio C_{H1} de la región constante de IgG\gamma1, y, por lo tanto, no reside dentro de la secuencia de Fc. La secuencia de Fc de tipo natural de SEQ ID Nº:17 incluye los alotipos G1m(1) y G1m(2-). Sin embargo, se puede modificar el resto de Fc de una proteína TACI-Fc para reflejar cualquier combinación de estos alotipos.

TABLA 5 Determinantes Alotípicos de la Región Constante \gamma1 de Inmunoglobulina Humana

7

Los ejemplos de proteínas Ztnfr12-Fc descritas en el presente documento comprenden las regiones constantes de IgG1 humana. Sin embargo, los restos de inmunoglobulina adecuados incluyen también polipéptidos que comprenden al menos una región constante, tales como una región constante de la cadena pesada de cualquiera de las siguientes inmunoglobulinas: IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, e IgM. La presente invención contempla también las proteínas de fusión que comprenden un resto de receptor Ztnfr12, como se describió anteriormente, y albúmina o \beta2-macroglobulina, y similares, para producir dímeros y multímeros de Ztnfr12. Los expertos en la técnica conocen restos proteicos adicionales adecuados para producir dímeros y multímeros de proteínas de fusión de Ztnfr12.

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En el tratamiento de ciertas enfermedades, puede ser ventajoso combinar una proteína de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina con al menos una proteína de fusión TACI-inmunoglobulina y una proteína de fusión BCMA-inmunoglobulina. Esta terapia de combinación se puede llevar a cabo administrando diversos tipos de proteínas de fusión con inmunoglobulinas, por ejemplo en forma de dímeros, o administrando heterodímeros de proteínas de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina, TACI-inmunoglobulina y BCMA-inmunoglobulina.

Las proteínas de fusión pueden tener la forma de polipéptidos de cadena única, dímeros, trímeros o múltiplos de dímeros o trímeros. Los dímeros pueden ser homodímeros o heterodímeros, y los trímeros pueden ser homotrímeros o heterotrímeros. Los ejemplos de heterodímeros incluyen un polipéptido Ztnfr12-inmunoglobulina con un polipéptido BCMA-inmunoglobulina, un polipéptido Ztnfr12-inmunoglobulina con un polipéptido TACI-inmunoglobulina, y un polipéptido BCMA-inmunoglobulina con un polipéptido TACI-inmunoglobulina. Los ejemplos de heterotrímeros incluyen un polipéptido Ztnfr12-inmunoglobulina con dos polipéptidos BCMA-inmunoglobulina, un polipéptido Ztnfr12-inmunoglobulina con dos polipéptidos TACI-inmunoglobulina, un polipéptido BCMA-inmunoglobulina con dos polipéptidos Ztnfr12-inmunoglobulina, dos polipéptidos TACI-inmunoglobulina con un polipéptido BCMA-inmunoglobulina, un polipéptido TACI-inmunoglobulina con dos polipéptidos Ztnfr12-inmunoglobulina, dos polipéptidos BCMA-inmunoglobulina con un polipéptido TACI-inmunoglobulina, y un trímero de un polipéptido TACI-inmunoglobulina, un polipéptido BCMA-inmunoglobulina, y un polipéptido Ztnfr12-inmuno-
globulina.

El resto de receptor TACI puede comprender al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nº:8: los residuos de aminoácidos 30 a 154, los residuos de aminoácidos 34 a 66, los residuos de aminoácidos 71 a 104, los residuos de aminoácidos 47 a 62, y los residuos de aminoácidos 86 a 100. El resto de receptor BCMA puede comprender al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nº:7: los residuos de aminoácidos 1 a 48, los residuos de aminoácidos 8 a 41, y los residuos de aminoácidos 21 a 37. El resto de receptor Ztnfr12 puede comprender al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nº:2: los residuos de aminoácidos 7 a 69, los residuos de aminoácidos 7 a 79, los residuos de aminoácidos 7 a 39, los residuos de aminoácidos 19 a 35, los residuos de aminoácidos 1 a 69, los residuos de aminoácidos 1 a 79 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 1 a 71 de SEQ ID Nº:2, los residuos de aminoácidos 7 a 71 de SEQ ID Nº:2, o los residuos de aminoácidos 1 a 39.

Las proteínas de fusión con inmunoglobulina se pueden producir mediante el uso de métodos habituales. Como ilustración, el Ejemplo 4 describe el uso de métodos de PCR usados para construir la proteína de fusión Ztnfr12-Fc5 ilustrativa.

Otros ejemplos de proteínas de fusión de anticuerpos incluyen los polipéptidos que comprenden un dominio de unión a antígeno y un fragmento de Ztnfr12 que contiene un dominio extracelular de Ztnfr12. Se pueden usar tales moléculas para seleccionar como objetivo tejidos particulares para que se beneficien de la actividad de unión de Ztnfr12.

La presente memoria descriptiva describe una diversidad de otras fusiones polipeptídicas. Por ejemplo, todo o parte de un/varios dominio(s) que confiere(n) una función biológica se puede(n) intercambiar entre Ztnfr12 de la presente invención con el/los dominio(s) funcionalmente equivalente(s) de otro miembro de la familia de receptores de factores de necrosis tumoral. Las fusiones polipeptídicas se pueden expresar en células hospedadoras recombinantes para producir una diversidad de análogos de fusión de Ztnfr12. Se puede fusionar un polipéptido Ztnfr12 con dos o más restos o dominios, tales como un marcador de afinidad para la purificación y un dominio de selección del objetivo. Las fusiones polipeptídicas pueden comprender también uno o más sitios de escisión, especialmente entre los dominios. Véase, por ejemplo, Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1 (1996).

Las proteínas de fusión se pueden preparar mediante métodos conocidos para los expertos en la técnica, preparando cada componente de la proteína de fusión y conjugándolos químicamente. De forma alternativa, se puede generar un polinucleótido que codifica ambos componentes de la proteína de fusión en el marco de lectura apropiado mediante el uso de técnicas conocidas, y expresarlo mediante los métodos descritos en el presente documento. Los métodos generales para la escisión enzimática y química de las proteínas de fusión se describen, por ejemplo, en Ausubel (1995) en las páginas 16-19 a 16-25.

Ztnfr12 puede unirse a ligandos distintos de ZTNF4. Se pueden usar los polipéptidos Ztnfr12 para identificar y aislar tales ligandos de Ztnfr12 adicionales potenciales. Por ejemplo, se pueden inmovilizar las proteínas y los péptidos de la presente invención en una columna, y usarlos para unir ligandos de una muestra biológica que se hace pasar a través de la columna (Hermanson et al. (eds.), Immobilized Affinity Ligand Techniques, páginas 195-202 (Academic Press 1992)).

La actividad de un polipéptido Ztnfr12 se puede observar mediante un microfisiómetro con biosensor basado en silicio, que mide la velocidad de acidificación extracelular o la excreción de protones asociada a la unión al receptor y las respuestas celulares fisiológicas subsiguientes. Un dispositivo ejemplar es el CYTOSENSOR Microphysiometer fabricado por Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Se puede medir una diversidad de respuestas celulares, tales como la proliferación celular, el trasporte de iones, la producción de energía, la respuesta inflamatoria, la activación reguladora y la activación de los receptores, y similares, mediante este método (véase, por ejemplo, McConnell et al., Science 257:1906 (1992), Pitchford et al., Meth. Enzymol. 228:84 (1997), Arimilli et al., J. Immunol. Meth. 212:49 (1998), Van Liefde et al., Eur. J. Pharmacol. 346:87 (1998)). El microfisiómetro se puede usar para analizar células eucarióticas, procarióticas, adherentes o no adherentes. Al medir los cambios de la acidificación extracelular en los medios celulares a lo largo del tiempo, el microfisiómetro mide directamente las respuestas celulares a diversos estímulos, que incluyen los agonistas, ligandos o antagonistas de Ztnfr12.

Por ejemplo, el microfisiómetro se usa para medir las respuestas de una célula eucariótica que expresa Ztnfr12, en comparación con una célula eucariótica de control que no expresa el polipéptido Ztnfr12. Las células adecuadas que responden a los estímulos moduladores de Ztnfr12 incluyen las células hospedadoras recombinantes que comprenden un vector de expresión de Ztnfr12, y las células que expresan de forma natural Ztnfr12. La acidificación extracelular proporciona una medida de la respuesta celular modulada por Ztnfr12. Además, esta aproximación se puede usar para identificar los ligandos, los agonistas y los antagonistas de los ligandos de Ztnfr12. Por ejemplo, se puede identificar una molécula como agonista de un ligando de Ztnfr12 proporcionando células que expresan un polipéptido Ztnfr12, cultivando una primera porción de las células en ausencia del compuesto de ensayo, cultivando una segunda porción de las células en presencia del compuesto ensayo, y determinando si la segunda porción exhibe una respuesta celular, en comparación con la primera porción.

De forma alternativa, se puede usar un sistema de fase sólida para identificar un ligando de Ztnfr12 nuevo, o un agonista o antagonista de ZTNF4. Por ejemplo, se puede inmovilizar un polipéptido Ztnfr12 o una proteína de fusión de Ztnfr12 sobre la superficie de un chip receptor de un instrumento biosensor disponible comercialmente (BIACORE, Biacore AB; Uppsala, Suecia). El uso de este instrumento se describe, por ejemplo, en Karlsson, Immunol. Methods 145:229 (1991), y Cunningham y Wells, J. Mol. Biol. 234:554 (1993).

Brevemente, un polipéptido o una proteína de fusión de Ztnfr12 se une covalentemente, mediante el uso de la química de aminas o de sulfhidrilos, a fibras de dextrano que están unidas a una película de oro dentro de una celda de flujo. Después se hace pasar una muestra de ensayo a través de la celda. Si hay presente un ligando en la muestra, se unirá al polipéptido o a la proteína de fusión inmovilizada, lo que provocará un cambio en el índice de refracción del medio, que se detecta como un cambio de resonancia de plasmón superficial de la película de oro. Este sistema permite la determinación de las velocidades de asociación y disociación, a partir de las cuales se puede calcular la afinidad de unión, y la determinación de la estequiometría de la unión. Este sistema se puede usar también para examinar las interacciones anticuerpo-antígeno, y las interacciones de otras parejas complemento/anti-complemento.

Los dominios de unión de Ztnfr12 se pueden caracterizar adicionalmente mediante el análisis físico de la estructura, tal como se determina mediante técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcadores de fotoafinidad, junto con la mutación de los aminoácidos de los supuestos sitios de contacto de los agonistas de los ligandos de Ztnfr12. Véase, por ejemplo, de Vos et al., Science 255:306 (1992), Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899 (1992), y Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59 (1992).

La presente memoria descriptiva describe composiciones de Ztnfr12 modificadas químicamente, en las que un polipéptido Ztnfr12 está unido a un polímero. Los polipéptidos Ztnfr12 ilustrativos son polipéptidos solubles que carecen de un dominio transmembrana funcional, tales como un polipéptido que consiste en los residuos de aminoácidos 1 a alrededor de 69 de SEQ ID Nº:2, o un polipéptido que consiste en los residuos de aminoácidos 1 a alrededor de 79 de SEQ ID Nº:2. En general, el polímero es hidrosoluble, de forma que el conjugado de Ztnfr12 no precipita en un medio acuoso, tal como un medio fisiológico. Un ejemplo de un polímero adecuado es uno que se ha modificado para que tenga un único grupo reactivo, tal como un éster activo para la acilación, o un aldehído para la alquilación. De esta manera, se puede controlar el grado de polimerización. Un ejemplo de un aldehído reactivo es polietilenglicol propionaldehído, o los derivados mono-(C_{1}-C_{10}) alcoxi o ariloxi de los mismos (véase, por ejemplo, Harris, et al., patente de EE.UU. nº 5.252.714). El polímero puede estar ramificado o sin ramificar. Además, se puede usar una mezcla de polímeros para producir conjugados de Ztnfr12.

Los conjugados de Ztnfr12 usados para la terapia pueden comprender restos poliméricos hidrosolubles farmacéuticamente aceptables. Los polímeros hidrosolubles adecuados incluyen polietilenglicol (PEG), monometoxi-PEG, mono-(C_{1}-C_{10})alcoxi-PEG, ariloxi-PEG, poli-(N-vinil pirrolidona)PEG, tresil monometoxi PEG, PEG propionaldehído, carbonato de bis-succinimidil PEG, homopolímeros de propilen glicol, un copolímero de poli(óxido de propileno/óxido de etileno), polioles polioxietilados (p.ej., glicerol), poli(alcohol vinílico), dextrano, celulosa, u otros polímeros basados en carbohidratos. Los PEG adecuados pueden tener un peso molecular de alrededor de 600 a alrededor de 60.000, lo que incluye, por ejemplo, 5.000, 12.000, 20.000 y 25.000. Un conjugado de Ztnfr12 puede comprender también una mezcla de tales polímeros hidrosolubles.

Un ejemplo de un conjugado de Ztnfr12 comprende un resto de Ztnfr12 y un resto de poli(óxido de alquilo) unido al extremo N-terminal del resto de Ztnfr12. El PEG es un poli(óxido de alquilo) adecuado. Como ilustración, Ztnfr12 se puede modificar con PEG, un proceso conocido como "PEGilación". La PEGilación de Ztnfr12 se puede llevar a cabo mediante cualquiera de las reacciones de PEGilación conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, el documento EP 0 154 316, Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992), Duncan y Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994), y Francis et al., Int J Hematol 68:1 (1998)). Por ejemplo, la PEGilación se puede llevar a cabo mediante una reacción de acilación o mediante una reacción de alquilación con una molécula reactiva de polietilenglicol. En una aproximación alternativa, los conjugados de Ztnfr12 se forman condensando PEG activado, en el que un grupo hidroxilo o amino terminal de PEG se ha sustituido por un espaciador activado (véase, por ejemplo, Karasiewicz et al., patente de EE.UU. nº 5.382.657).

La PEGilación mediante acilación requiere generalmente hacer reaccionar un derivado de éster activo de PEG con un polipéptido Ztnfr12. Un ejemplo de un éster de PEG activado es PEG esterificado con N-hidroxisuccinimida. Como se usa en el presente documento, el término "acilación" incluye los siguientes tipos de enlaces entre Ztnfr12 y un polímero hidrosoluble: amida, carbamato, uretano, y similares. Los métodos para preparar Ztnfr12 PEGilado mediante acilación comprenderán generalmente las etapas de (a) hacer reaccionar un polipéptido Ztnfr12 con PEG (tal como un éster reactivo de un derivado de aldehído de PEG) en condiciones por las que uno o más grupos PEG se unen a Ztnfr12, y (b) obtener el/los producto(s) de reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación se determinarán basándose en los parámetros conocidos y en los resultados deseados. Por ejemplo, cuanto mayor sea la proporción PEG:Ztnfr12, mayor será el porcentaje de producto de Ztnfr12 poliPEGilado.

El producto de la PEGilación mediante acilación es generalmente un producto de Ztnfr12 poliPEGilado, en el que los grupos \varepsilon-amino de lisina están PEGilados por medio de un grupo espaciador acilo. Un ejemplo de un enlace de conexión es una amida. En general, el Ztnfr12 resultante estará al menos un 95% mono-, di- o tri-pegilado, aunque se pueden formar algunas especies con grados mayores de PEGilación dependiendo de las condiciones de reacción. Las especies PEGiladas se pueden separar de los polipéptidos Ztnfr12 sin conjugar mediante el uso de métodos de purificación habituales, tales como diálisis, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, y similares.

La PEGilación mediante alquilación implica en general hacer reaccionar un derivado de aldehído terminal de PEG con Ztnfr12 en presencia de un agente reductor. Los grupos PEG se pueden unir al polipéptido por medio de un grupo -CH_{2}-NH.

La derivatización por medio de alquilación reductora para producir un producto monoPEGilado aprovecha la reactividad diferencial de los diferentes tipos de grupos amino primarios disponibles para la derivatización. En general, la reacción se lleva a cabo a un pH que permite aprovechar las diferencias de pKa entre los grupos \varepsilon-amino de los residuos de lisina y el grupo \alpha-amino del residuo N-terminal de la proteína. Mediante tal derivatización selectiva, se controla la unión de un polímero hidrosoluble que contiene un grupo reactivo, tal como un aldehído, a la proteína. La conjugación con el polímero se da de forma predominante en el extremo N-terminal de la proteína, sin una modificación significativa de otros grupos reactivos tales como los grupos amino de las cadenas laterales de las lisinas. La presente invención proporciona una preparación sustancialmente homogénea de conjugados Ztnfr12-monopolímero.

La alquilación reductora para producir una población sustancialmente homogénea de moléculas conjugadas monopolímero-Ztnfr12 puede comprender las etapas de: (a) hacer reaccionar un polipéptido Ztnfr12 con un PEG reactivo en condiciones de alquilación reductoras a un pH adecuado para permitir la modificación selectiva del grupo \alpha-amino en el extremo aminoterminal de Ztnfr12, y (b) obtener el/los producto(s) de reacción. El agente reductor usado para la alquilación reductora debería ser estable en disolución acuosa, y ser capaz de reducir solamente la base de Schiff formada en el proceso inicial de alquilación reductora. Los agentes reductores ilustrativos incluyen borohidruro sódico, cianoborohidruro sódico, borano de dimetilamina, borano de trimetilamina, y borano de piridina.

Para una población sustancialmente homogénea de conjugados monopolímero-Ztnfr12, las condiciones de reacción de alquilación reductora son aquellas que permiten la unión selectiva del resto de polímero hidrosoluble al extremo N-terminal de Ztnfr12. Tales condiciones de reacción proporcionan en general diferencias de pKa entre los grupos amino de las lisinas y el grupo \alpha-amino del extremo N-terminal. El pH también afecta a la proporción de polímero respecto de la proteína a usar. En general, si el pH es menor, se deseará un exceso mayor de polímero respecto de la proteína, porque cuanto menos reactivo es el grupo \alpha N-terminal, más polímero se necesita para alcanzar las condiciones óptimas. Si el pH es mayor, la proporción polímero:Ztnfr12 no necesita ser tan elevada, porque hay disponibles grupos más reactivos. En general, el pH estará en el intervalo de 3 a 9, o 3 a 6.

Otro factor a considerar es el peso molecular del polímero hidrosoluble. En general, cuanto mayor sea el peso molecular del polímero, menor será el número de moléculas de polímero que se pueden unir a la proteína. Para las reacciones de PEGilación, el peso molecular típico es de alrededor de 2 kDa a alrededor de 100 kDa, alrededor de 5 kDa a alrededor de 50 kDa, o alrededor de 12 kDa a alrededor de 25 kDa. La proporción molar de polímero hidrosoluble respecto de Ztnfr12 estará en general en el intervalo de 1:1 a 100:1. En general, la proporción molar de polímero hidrosoluble respecto de Ztnfr12 será 1:1 a 20:1 para la poliPEGilación, y 1:1 a 5:1 para la monoPEGilación.

Los métodos generales para producir conjugados que comprenden un polipéptido y restos de polímeros hidrosolubles se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Karasiewicz et al., patente de EE.UU. nº 5.382.657, Greenwald et al., patente de EE.UU. nº 5.738.846, Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997)).

La presente memoria descriptiva describe composiciones que comprenden un péptido o polipéptido descrito en el presente documento. Tales composiciones pueden comprender además un vehículo. El vehículo puede ser un vehículo orgánico o inorgánico convencional. Los ejemplos de vehículos incluyen agua, solución tamponada, alcohol, propilenglicol, macrogol, aceite de sésamo, aceite de maíz, y similares.

Además, las composiciones pueden comprender un vehículo, un polipéptido Ztnfr12, y al menos uno de un polipéptido TACI o un polipéptido BCMA. Ciertas composiciones pueden comprender formas solubles de estos receptores. Los ejemplos de tales composiciones incluyen las composiciones que comprenden un vehículo, un polipéptido Ztnfr12 que comprende los residuos de aminoácidos 7 a 69 de SEQ ID Nº:2 (p.ej., un polipéptido que consiste en los residuos de aminoácidos 1 a 79, 1 a 69, 7 a 79, 1 a 71, o 7 a 71, de SEQ ID Nº:2), y (1) un polipéptido BCMA que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 51 de SEQ ID Nº:7, (2) un polipéptido TACI que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 166 de SEQ ID Nº:8, o (3) un polipéptido BCMA que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 51 de SEQ ID Nº:7, y un polipéptido TACI que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 166 de SEQ ID Nº:8.

7. Ensayos de Polipéptidos y Proteínas de Fusión de Ztnfr12

La función de los polipéptidos Ztnfr12 y de las proteínas de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina se puede examinar mediante el uso de una diversidad de aproximaciones para determinar la capacidad de las proteínas de fusión de unirse a ZTNF4. Por ejemplo, una aproximación mide la capacidad de los polipéptidos Ztnfr12 o de la proteína de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina para competir con placas revestidas con Ztnfr12 por la unión de ZTNF4 marcado con ^{125}I. Como ilustración, se pueden marcar 50 \mug de ZTNF4 con 4 mCi de ^{125}I mediante el uso de una única IODO-BEAD (Pierce; Rockford, IL). La reacción se para con una disolución del 0,25% de albúmina de suero bovino, y se elimina el ^{125}I libre mediante filtración en gel con el uso de una columna PD-10 (Pierce). La radiactividad específica de las preparaciones de ^{125}I-ZTNF4 se determina mediante precipitación con ácido tricloroacético antes y después de la etapa de desalación. Se añade un fragmento N-terminal del receptor Ztnfr12, denominado "Ztnfr12-N", a las placas de 96 pocillos (p.ej., 100 \mul de 0,1 \mug/ml), y se incuba durante la noche a 4ºC. Las placas se lavan, se bloquean con SUPERBLOCK (Pierce), y se lavan de nuevo. Los polipéptidos Ztnfr12 o las construcciones Ztnfr12-Fc, a diversas concentraciones que oscilan de 0 a alrededor de 12 ng/ml, se mezclan con una concentración fija de ^{125}I-ZTNF4, y se incuban durante alrededor de dos horas a 37ºC en la placa revestida con Ztnfr12-N. Los controles contienen Ztnfr12-N en disolución, o carecen de polipéptidos Ztnfr12 o de construcciones Ztnfr12-Fc. Tras la incubación, las placas se lavan y se lleva a cabo el recuento.

En otra aproximación, se incuban concentraciones crecientes de ZTNF4 marcado con ^{125}I con polipéptidos Ztnfr12 o construcciones Ztnfr12-Fc, y se determina la radiactividad asociada a los complejos precipitados ZTNF4-polipéptido Ztnfr12, o ZTNF4-Ztnfr12-Fc. Como ilustración, se puede incubar una concentración de alrededor de 0,05 nM de polipéptidos Ztnfr12 o de construcción Ztnfr12-Fc con alrededor de 0,4 pM a alrededor de 1,5 nM de ^{125}I-ZTNF4 durante 30 minutos a temperatura ambiente en un volumen total de 0,25 ml/tubo. Se añade una suspensión de Pansorbin (Staph A) a cada tubo, y después de 15 minutos se centrifugan las muestras, se lavan dos veces, y se realiza el recuento en los sedimentos. Se determina la unión inespecífica mediante la adición de ZTNF4 130 nM sin marcar a la mezcla ^{125}I-ZTNF4/polipéptido Ztnfr12, o a la mezcla ^{125}I-ZTNF4/Ztnfr12-Fc. La unión específica se calcula restando las cpm unidas en presencia de ZTNF4 sin marcar de las cpm totales unidas a cada concentración de ^{125}I-ZTNF4.

De forma alternativa, los polipéptidos Ztnfr12 y las proteínas de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina se pueden caracterizar mediante la capacidad de inhibir la estimulación de las células B humanas mediante ZTNF4 soluble, como describió Gross et al., publicación internacional nº WO00/40716. Brevemente, se aíslan células B humanas de las células mononucleares de sangre periférica mediante el uso de esferas magnéticas CD19 y el sistema de separación magnético VarioMacs (Miltenyi Biotec; Auburn, CA) según las instrucciones del fabricante. Las células B purificadas se mezclan con ZTNF4 soluble (25 ng/ml) e IL-4 humano recombinante (10 ng/ml, Pharmingen), y las células se colocan en placas de 96 pocillos de fondo redondo a 1 x 10^{5} células por pocillo.

Los polipéptidos Ztnfr12 o las proteínas Ztnfr12-inmunoglobulina se pueden diluir desde alrededor de 5 \mug/ml hasta alrededor de 6 ng/ml, e incubarlas con las células B durante cinco días, aplicándoles durante la noche en el cuarto día 1 \muCi de ^{3}H-timidina por pocillo. Como control, los polipéptidos Ztnfr12 o la proteína Ztnfr12-inmunoglobulina se pueden incubar también con células B e IL-4 sin ZTNF4. Las placas se recogen mediante el uso de un recolector de placas Packard, y se lleva a cabo el recuento mediante el uso del lector Packard.

Hay disponibles modelos animales bien establecidos para ensayar la eficacia in vivo de los polipéptidos Ztnfr12 o de las proteínas Ztnfr12-inmunoglobulina en ciertos estados patológicos. Por ejemplo, los polipéptidos Ztnfr12 o las proteínas Ztnfr12-inmunoglobulina se pueden ensayar en varios modelos animales de enfermedad autoinmunitaria, tales como cepas de ratones congénicos MRL-lpr/lpr o NZB x NZW F1, que sirven como modelo de LES (lupus eritematoso sistémico). Tales modelos animales se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Cohen y Miller (Eds.), Autoimmune Disease Models: A Guidebook (Academic Press, Inc. 1994).

La descendencia de un cruce entre ratones New Zealand Black (NZB) y New Zealand White (NZW) desarrolla una forma espontánea de LES que se parece mucho al LES de humanos. Los ratones de la descendencia, conocidos como NZBW, comienzan a desarrollar autoanticuerpos IgM contra las células T en el primer mes de vida, y a los cinco a siete meses de vida, los autoanticuerpos anti-ADN son la inmunoglobulina dominante. La hiperactividad de las células B policlonales conduce a la sobreproducción de autoanticuerpos. La deposición de estos autoanticuerpos, en particular los dirigidos contra el ADN monocatenario, está asociada al desarrollo de glomerulonefritis, que se manifiesta clínicamente como proteinuria, azotemia, y muerte por insuficiencia renal.

La insuficiencia renal es la causa principal de muerte en los ratones afectados de LES espontáneo, y en la cepa NZBW este proceso es crónico y destructivo. La enfermedad es más rápida y grave en las hembras que en los machos, con una supervivencia media de solamente 245 días en comparación con 406 días para los machos. Aunque muchos de los ratones hembra tendrán síntomas (proteinuria) del séptimo al noveno mes de vida, algunos pueden ser mucho más jóvenes o viejos cuando desarrollan los síntomas. La nefritis inmunitaria fatal observada en los ratones NZBW es muy similar a la glomerulonefritis observada en LES humano, lo que hace a este modelo murino espontáneo muy atractivo para el ensayo de agentes terapéuticos potenciales para LES (Putterman y Naparstek, "Murine Models of Spontaneous Systemic Lupus Erythematosus", en Autoimmune Disease Models: A Guidebook, páginas 217-234 (Academic Press, Inc., 1994); Mohan et al., J. Immunol. 154:1470 (1995); y Daikh et al., J. Immunol. 159:3104 (1997)).

Como describió Gross et al., publicación internacional nº WO00/40716, las proteínas TACI-inmunoglobulina, que se unen a ZTNF4, se pueden administrar a ratones NZBW para monitorizar su efecto inhibidor sobre las células B a lo largo del período de cinco semanas, cuando se cree que, como media, la producción de autoanticuerpos por las células B está a niveles elevados en los ratones NZBW. Este método se puede aplicar para determinar la eficacia de un polipéptido Ztnfr12 o de una proteína de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina. Brevemente, se pueden dividir cien ratones (NZB x NZW)F_{1} hembra de 8 semanas en seis grupos de 15 ratones. Antes del tratamiento se monitorizan en los ratones las proteínas en orina una vez al mes, y se extrae sangre para realizar un hemograma y almacenar el suero. El suero se puede cribar en función de la presencia de autoanticuerpos. Debido a que la proteinuria es el signo característico de la glomerulonefritis, se monitorizan los niveles de proteínas en orina mediante una tira reactiva a intervalos regulares durante el transcurso del estudio. El tratamiento puede comenzar cuando los ratones tienen aproximadamente cinco meses de vida. Los ratones pueden recibir inyecciones intraperitoneales de vehículo solamente (solución salina tamponada con fosfato) o inmunoglobulina humana (proteína de control) o proteína Ztnfr12-inmunoglobulina (p.ej., 20 a 100 \mug de proteína de ensayo por dosis) tres veces por semana durante cinco semanas. Se pueden llevar a cabo estudios similares con polipéptidos Ztnfr12.

Se recoge sangre dos veces durante el tratamiento, y se recogerá al menos dos veces tras el tratamiento. Se determinan los valores de la tira reactiva de orina para la proteinuria y los pesos corporales cada dos semanas después del comienzo del tratamiento. Se recoge sangre, el valor de la tira reactiva de orina y el peso corporal en el momento de la eutanasia. El bazo y el timo se dividen para un análisis de separación de células activada por fluorescencia y para la histología. También se recogen para la histología las glándulas salivales submandibulares, la cadena de nódulos linfáticos mesentéricos, el lóbulo hepático con la vesícula biliar, el ciego y el intestino grueso, el estómago, el intestino delgado, el páncreas, el riñón derecho, la glándula suprarrenal, la lengua con la tráquea y el esófago, el corazón y los pulmones.

Los modelos murinos de encefalomielitis alérgica experimental se han usado como herramienta para investigar los mecanismos de la enfermedad mediada por el sistema inmunitario y los métodos de intervención terapéutica potencial. El modelo se parece a la esclerosis múltiple humana, y produce la desmielinización como resultado de la activación de las células T hacia neuroproteínas tales como la proteína básica de la mielina, o la proteína proteolipídica. La inoculación con antígeno conduce a la inducción de células T CD4+, restringidas al MHC de clase II (Th1). Los cambios en el protocolo de la encefalomielitis alérgica experimental pueden producir variantes agudas, crónicas-recidivantes, o de transferencia pasiva del modelo (Weinberg et al., J. Immunol. 162:1818 (1999); Mijaba et al., Cell. Immunol. 186:94 (1999); y Glabinski, Meth. Enzym. 288:182 (1997)).

Gross et al., publicación internacional nº WO00/40716, describe una aproximación para determinar la eficacia de las proteínas TACI-inmunoglobulina en la mejora de los síntomas asociados a encefalitis alérgica experimental. Brevemente, se administra a 25 ratones PLxSJL F1 hembra (12 semanas de vida) una inyección subcutánea de 125 \mug/ratón de antígeno (proteína proteolipídica de mielina, PLP, residuos 139-151), formulado en adyuvante completo de Freund. Los ratones se dividen en cinco grupos de cinco ratones. Las inyecciones intraperitoneales de toxina pertussis (400 ng) se administran en el día 0 y 2. Se administra a los grupos una dosis 1x, 10x, o 100x de proteína TACI-inmunoglobulina, un grupo recibirá vehículo solamente, y un grupo no recibirá tratamiento. La terapia de prevención comienza en el día 0, la terapia de intervención comienza en el día 7, o en el inicio de los signos clínicos. Los signos de enfermedad, pérdida de peso y parálisis, se manifiestan en aproximadamente 10 a 14 días, y duran alrededor de una semana. Los animales se estudian diariamente recogiendo los pesos corporales y asignando una puntuación clínica que se corresponde al grado de los síntomas. Los signos clínicos de encefalomielitis alérgica experimental aparecen en 10 a 14 días tras la inoculación, y persisten durante aproximadamente una semana. Al final del estudio, todos los animales se sacrifican mediante sobredosis de gas, y se realiza la necropsia. Se recoge el cerebro y la columna vertebral para el estudio histológico, o se congelan para el análisis del ARNm. Los datos del peso corporal y de la puntuación clínica se representan individualmente y en grupo. Esta aproximación se puede usar para ensayar los polipéptidos Ztnfr12 o las proteínas de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina.

En el modelo de artritis inducida por colágeno los ratones desarrollan artritis inflamatoria crónica, que se parece mucho a la artritis reumatoide humana. Debido a que la artritis inducida por colágeno comparte características inmunológicas y patológicas similares con la artritis reumatoide, esto hace de ella un modelo ideal para cribar compuestos antiinflamatorios potenciales para humanos. Otra ventaja del uso del modelo de artritis inducida por colágeno es que se conocen los mecanismos de la patogénesis. Se han identificado los epítopos de las células T y B en el colágeno tipo II, y se han determinado diversos parámetros inmunológicos (hipersensibilidad de tipo retardado y anticuerpos anti-colágeno) e inflamatorios (citocinas, quimiocinas, y enzimas de degradación de la matriz) relacionados con la artritis mediada por el sistema inmunitario, y se pueden usar para estudiar la eficacia de los compuestos de ensayo en los modelos (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407 (1999); Williams et al., Immunol. 89:9784 (1992); Myers et al., Life Sci. 61:1861 (1997); y Wang et al., Immunol. 92:8955 (1995)).

Gross et al., publicación internacional nº WO00/40716, describe un método para determinar la eficacia de proteínas TACI-inmunoglobulina en la mejora de los síntomas asociados a la artritis inducida por colágeno. Brevemente, se dividen ratones DBA/1J macho de ocho semanas de vida (Jackson Labs) en grupos de cinco ratones/grupo, y se les administran dos inyecciones subcutáneas de 50 a 100 \mul de 1 mg/ml de colágeno (de origen aviar o bovino), a intervalos de tres semanas. Un control no recibe inyecciones de colágeno. La primera inyección se formula en adyuvante completo de Freund, y la segunda inyección se formula en adyuvante incompleto de Freund. La proteína TACI-inmunoglobulina se administra de forma profiláctica antes o durante la segunda inyección, o después de que el animal desarrolle una puntuación clínica de dos o más que persista al menos 24 horas. Los animales comienzan a mostrar síntomas de artritis tras la segunda inyección de colágeno, habitualmente en dos a tres semanas. Por ejemplo, se puede administrar de forma profiláctica TACI-Fc, una proteína de control, IgFc humano, o solución salina tamponada con fosfato (vehículo) comenzando siete días antes de la segunda inyección (día -7). Las proteínas se pueden administrar a 100 \mug, tres veces por semana en forma de una inyección intraperitoneal de 200 \mul, y continuar durante cuatro semanas. El grado de la enfermedad se determina en cada pata mediante el uso de un calibre para medir el grosor de la pata y asignar una puntuación clínica a cada pata. Por ejemplo, una puntuación clínica de "0" indica un ratón normal, una puntuación de "1" indica que uno o más dedos están inflamados, una puntuación de "2" indica una inflamación leve de la pata, una puntuación de "3" indica una inflamación moderada de la pata, y una puntuación de "4" indica una inflamación grave de la pata. Los animales se sacrifican después de que la enfermedad se haya establecido durante un período fijo de tiempo, habitualmente siete días. Las patas se recogen para la histología o el análisis del ARNm, y se recoge el suero para los ensayos de inmunoglobulinas y de citocinas. El modelo de artritis inducida por colágeno se puede usar para ensayar los polipéptidos Ztnfr12 o las proteínas de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina.

La miastenia gravis es otra enfermedad autoinmunitaria para la que hay disponibles modelos murinos. La miastenia gravis es un trastorno de la transmisión neuromuscular que implica la producción de autoanticuerpos dirigidos contra el receptor nicotínico de acetilcolina. Esta enfermedad se adquiere o se hereda con características clínicas que incluyen una debilidad anormal y fatiga por esfuerzo.

Se ha establecido un modelo murino de miastenia gravis (Christadoss et al., "Establishment of a Ratón Model of Myasthenia gravis Which Mimics Human Myasthenia gravis Pathogenesis for Immune Intervention", en Immunobiology of Proteins and Peptides VIII, Atassi y Bixler (Eds.), páginas 195-199 (1995)). La miastenia gravis autoinmunitaria experimental es una enfermedad mediada por anticuerpos caracterizada por la presencia de anticuerpos hacia el receptor de acetilcolina. Estos anticuerpos destruyen el receptor, lo que conduce a impulsos eléctricos neuromusculares defectuosos, lo que da como resultado la debilidad muscular. En el modelo de miastenia gravis autoinmunitaria experimental, los ratones se inmunizan con el receptor nicotínico de acetilcolina. Los signos clínicos de miastenia gravis se hacen evidentes semanas después de la segunda inmunización. La miastenia gravis autoinmunitaria experimental se estudia mediante diversos métodos, que incluyen la medida de los niveles séricos de anticuerpos hacia el receptor de acetilcolina mediante radioinmunoensayo (Christadoss y Dauphinee, J. Immunol. 136:2437 (1986); Lindstrom et al., Methods Enzymol. 74:432 (1981)), midiendo el receptor de acetilcolina muscular, o mediante electromiografía (Coligan et al. (Eds.), Protocols in Immunology, Vol. 3, página 15.8.1 (John Wiley & Sons, 1997)).

El efecto de los polipéptidos Ztnfr12 o de las proteínas de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina sobre la miastenia gravis autoinmunitaria experimental se puede determinar administrando las proteínas de fusión durante la miastenia gravis clínica en curso en ratones B6. Por ejemplo, se inmunizan 100 ratones B6 con 20 \mug de receptor de acetilcolina en adyuvante completo de Freund en los días 0 y 30. Aproximadamente del 40 al 60% de los ratones desarrollarán miastenia gravis clínica moderada (grado 2) a grave (grado 3) tras la dosis de refuerzo con el receptor de acetilcolina. Los ratones con enfermedad clínica de grado 2 y 3 se dividen en tres grupos (con grados iguales de debilidad) y se pesan (los ratones con debilidad también pierden peso, debido a que tienen dificultades para consumir alimentos y agua), y se les extrae sangre para el estudio del suero (anticuerpos anti-receptor de acetilcolina y nivel de isotipos antes del tratamiento). Al grupo A se le inyecta LP con solución salina tamponada con fosfato, al grupo B se le inyecta de forma intraperitoneal IgG-Fc humano como proteína de control (100 \mug), y al grupo C se le inyectan 100 \mug de polipéptidos Ztnfr12 o de proteínas de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina tres veces por semana durante cuatro semanas. Los ratones se criban en busca de debilidad muscular dos veces por semana, y se pesan y se les extrae sangre para el estudio del suero 15 y 30 días después del comienzo del tratamiento. Se extrae sangre completa en el día 15 para determinar la proporción de células T/B mediante un análisis de separación de células activada por fluorescencia mediante el uso de los marcadores B220 y CD5. Los ratones supervivientes se sacrifican 30 a 45 días después del inicio del tratamiento, y sus cadáveres se congelan para la extracción posterior del receptor de acetilcolina muscular para determinar la pérdida del receptor de acetilcolina muscular, la patología principal en la miastenia gravis (véase, por ejemplo, Coligan et al. (Eds.), Protocols in Immunology. Vol. 3, página 15.8.1 (John Wiley & Sons,
1997)).

Los anticuerpos séricos hacia el receptor de acetilcolina muscular de ratón se pueden determinar mediante un radioinmunoensayo establecido, y los isotipos de los anticuerpos anti-receptor de acetilcolina (IgM, IgG1, IgG2b e IgG2c) se miden mediante ELISA. Se conocen tales métodos. Se determina el efecto de los polipéptidos Ztnfr12 o de las proteínas de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina en la miastenia gravis clínica en curso, el nivel de anticuerpos anti-receptor de acetilcolina y de isotipos, y la pérdida de receptores de acetilcolina musculares.

Se pueden inmunizar aproximadamente 100 ratones con 20 \mug de receptor de acetilcolina en adyuvante completo de Freund en el día 0 y 30. Los ratones con miastenia gravis clínica se dividen en cuatro grupos. Al grupo A se le inyectan de forma intraperitoneal 100 \mug de Fc de control, al grupo B se le inyectan 20 \mug de Fc de control, al grupo C se le inyectan 100 \mug de polipéptido Ztnfr12 o de proteína de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina, y al grupo D se le inyectan 20 \mug de polipéptido Ztnfr12 o de proteína de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina tres veces por semana durante cuatro semanas. Los ratones se pesan y se les extrae sangre para estudiar el suero antes y 15 y 30 días después del inicio del tratamiento. Se analiza en el suero el anticuerpo anti-receptor de acetilcolina y los isotipos como se describió anteriormente. También se puede medir la pérdida de receptores de acetilcolina musculares.

Estos ensayos in vitro e in vivo se pueden usar también para determinar los componentes de anticuerpos hacia Ztnfr12, las proteínas de fusión de anticuerpos, los inmunoconjugados, y similares. Los expertos en la técnica pueden determinar otros ensayos adecuados de polipéptidos Ztnfr12, proteínas de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina, o componentes de anticuerpos hacia Ztnfr12.

8. Aislamiento de Polipéptidos Ztnfr12

Los polipéptidos de la presente invención se pueden purificar hasta al menos alrededor de un 80% de pureza, hasta al menos alrededor de un 90% de pureza, hasta al menos alrededor de un 95% de pureza, o más de un 95% de pureza con respecto a las macromoléculas contaminantes, en particular otras proteínas y ácidos nucleicos, y pueden estar exentos de agentes infecciosos y pirógenos. Los polipéptidos de la presente invención se pueden purificar también hasta un estado farmacéuticamente puro, que es una pureza mayor del 99,9%. En ciertas preparaciones, el polipéptido purificado está sustancialmente exento de otros polipéptidos, en particular otros polipéptidos de origen animal.

Se puede usar el fraccionamiento y/o los métodos de purificación convencionales para obtener preparaciones de Ztnfr12 purificado a partir de fuentes naturales (p.ej., tejido de nódulos linfáticos), polipéptidos Ztnfr12 sintéticos, y polipéptidos Ztnfr12 recombinantes y polipéptidos Ztnfr12 de fusión purificados a partir de células hospedadoras recombinantes. En general, se puede usar la precipitación con sulfato amónico y la extracción con ácidos o agentes caotrópicos para el fraccionamiento de las muestras. Las etapas de purificación ejemplares pueden incluir hidroxiapatito, exclusión por tamaño, FPLC y cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa. Los medios cromatográficos adecuados incluyen dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices especiales, y similares. Los derivados PEI, DEAE, QAE y Q son adecuados. Los medios cromatográficos ejemplares incluyen los medios derivatizados con grupos fenilo, butilo, u octilo, tales como Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl Butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) y similares; o las resinas poliacrílicas, tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos adecuados incluyen esferas de vidrio, resinas basadas en sílice, resinas celulósicas, esferas de agarosa, esferas de agarosa reticulada, esferas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticulada y similares, que son insolubles en las condiciones en las que se deben usar. Estos soportes se pueden modificar con grupos reactivos que permiten la unión de proteínas mediante grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o restos de carbohidratos.

Los ejemplos de procedimientos químicos de acoplamiento incluyen la activación mediante bromuro de cianógeno, la activación con N-hidroxisuccinimida, la activación mediante epóxido, la activación mediante sulfhidrilo, la activación mediante hidrazida, y los derivados de carboxilo y amino para los procedimientos químicos de acoplamiento mediante carbodiimida. Estos y otros medios sólidos se conocen bien y se usan de forma generalizada en la técnica, y están disponibles de proveedores comerciales. La selección de un método particular para el aislamiento y la purificación de un polipéptido es una cuestión de diseño rutinario, y se determina en parte mediante las propiedades del soporte elegido. Véase, por ejemplo, Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988), y Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996).

Los expertos en la técnica pueden idear variaciones adicionales en el aislamiento y la purificación de Ztnfr12. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos anti-Ztnfr12, obtenidos como se describe más adelante, para aislar grandes cantidades de proteína mediante purificación por inmunoafinidad.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden aislar también aprovechando propiedades particulares. Por ejemplo, se puede usar la cromatografía de adsorción mediante iones metálicos inmovilizados (IMAC) para purificar proteínas ricas en histidina, lo que incluye aquellas que comprenden marcadores de polihistidina. Brevemente, primero se carga un gel con iones metálicos divalentes para formar un quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)). Las proteínas ricas en histidina se adsorberán en esta matriz con diferentes afinidades, dependiendo del ión metálico usado, y se eluirán mediante elución competitiva, disminuyendo el pH, o mediante el uso de agentes intensamente quelantes. Otros métodos de purificación incluyen la purificación de proteínas glicosiladas mediante cromatografía de afinidad con lectina y cromatografía de intercambio iónico (M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:529 (1990)). En las realizaciones adicionales de la invención, se puede construir una fusión del polipéptido de interés y un marcador de afinidad (p.ej., una proteína de unión a maltosa, un dominio de inmunoglobulina) para facilitar la purificación.

Los polipéptidos Ztnfr12 o los fragmentos de los mismos se pueden preparar también por medio de síntesis química, como se describió anteriormente. Los polipéptidos Ztnfr12 pueden ser monómeros o multímeros; pueden estar glicosilados o sin glicosilar; PEGilados o sin PEGilar; y pueden o no incluir un residuo de aminoácido de metionina inicial.

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9. Producción de anticuerpos hacia proteínas Ztnfr12

Los anticuerpos hacia Ztnfr12 se pueden obtener, por ejemplo, mediante el uso del producto de un vector de expresión de Ztnfr12, o Ztnfr12 aislado a partir de una fuente natural como antígeno. Los anticuerpos anti-Ztnfr12 especialmente útiles "se unen específicamente" a Ztnfr12. Se considera que los anticuerpos se unen específicamente si los anticuerpos exhiben al menos una de las dos propiedades siguientes: (1) los anticuerpos se unen a Ztnfr12 con un nivel umbral de actividad de unión, y (2) los anticuerpos no reaccionan significativamente de forma cruzada con polipéptidos relacionados con Ztnfr12.

Con respecto a la primera característica, los anticuerpos se unen específicamente si se unen a un polipéptido, péptido o epítopo de Ztnfr12 con una afinidad de unión (K_{a}) de 10^{6} M^{-1} o más, preferiblemente 10^{7} M^{-1} o más, más preferiblemente 10^{8} M^{-1} o más, y lo más preferiblemente 10^{9} M^{-1} o más. Alguien de experiencia habitual en la técnica puede determinar fácilmente la afinidad de unión de un anticuerpo, por ejemplo, mediante análisis de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660 (1949)). Con respecto a la segunda característica, los anticuerpos no reaccionan significativamente de forma cruzada con las moléculas polipeptídicas relacionadas, por ejemplo, si detectan Ztnfr12, pero no polipéptidos conocidos actualmente mediante el uso de un análisis de transferencia de Western habitual. Los ejemplos de polipéptidos relacionados conocidos incluyen los receptores de factores de necrosis tumoral. Por ejemplo, ciertos anticuerpos anti-Ztnfr12 se unen a Ztnfr12, pero no a TACI o BCMA.

Se pueden producir anticuerpos anti-Ztnfr12 mediante el uso de péptidos y polipéptidos que albergan epítopos de Ztnfr12 antigénicos. Los péptidos y polipéptidos que albergan epítopos antigénicos descritos en el presente documento pueden contener una secuencia de al menos nueve, o de 15 a alrededor de 30 aminoácidos contenida en SEQ ID Nº:2, u otra secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento. Sin embargo, los péptidos o polipéptidos que comprenden una porción mayor de una secuencia de aminoácidos de la invención, que contienen de 30 a 50 aminoácidos, o cualquier longitud hasta y que incluye la secuencia de aminoácidos completa de un polipéptido de la invención, son también útiles para inducir anticuerpos que se unen a Ztnfr12. Es deseable que la secuencia de aminoácidos del péptido que alberga los epítopos se seleccione para proporcionar una solubilidad sustancial en disolventes acuosos (es decir, la secuencia incluye residuos relativamente hidrófilos, mientras se evitan generalmente los residuos hidrófobos). Además, las secuencias de aminoácidos que contienen residuos de prolina pueden ser deseables también para la producción de anticuerpos.

Como ilustración, se identificaron sitios antigénicos potenciales en Ztnfr12 mediante el uso del método de Jameson-Wolf, Jameson y Wolf, CABIOS 4:181, (1988), implementado mediante el programa PROTEAN (versión 3.14) de LASERGENE (DNASTAR; Madison, WI). Se usaron los parámetros por defecto en este análisis.

El método de Jameson-Wolf predice determinantes antigénicos potenciales combinando seis subrutinas principales para la predicción estructural de proteínas. Brevemente, el método de Hopp-Woods, Hopp et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78:3824 (1981), se usó primero para identificar secuencias de aminoácidos que representan áreas de hidrofobicidad local máxima (parámetro: media de siete residuos). En la segunda etapa se usó el método de Emini, Emini et al., J. Virology 55:836 (1985), para calcular las probabilidades superficiales (parámetro: umbral de decisión superficial (0,6) = 1). En tercer lugar, se usó el método de Karplus-Schultz, Karplus y Schultz, Naturwissenschaften 72:212 (1985), para predecir la flexibilidad de la cadena del esqueleto (parámetro: umbral de flexibilidad (0,2) = 1). En la cuarta y quinta etapas del análisis, se aplicaron predicciones de la estructura secundaria a los datos mediante el uso de los métodos de Chou-Fasman, Chou, "Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition", en Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Fasman (ed.), páginas 549-586 (Plenum Press 1990), y de Garnier-Robson, Garnier et al., J. Mol. Biol. 120:97 (1978) (parámetros de Chou-Fasman: tabla de conformación = 64 proteínas; umbral de la región \alpha = 103; umbral de la región \beta = 105; parámetros de Garnier-Robson: constantes de decisión \alpha y \beta = 0). En la sexta subrutina, se combinaron los parámetros de flexibilidad y los factores de hidropatía/accesibilidad del disolvente para determinar un valor del contorno superficial, denominado "índice antigénico". Finalmente, se aplicó una función de ampliación de máximos al índice antigénico, lo que amplía los máximos de la superficie principal añadiendo un 20, 40, 60 u 80% del valor del máximo respectivo para tener en cuenta la energía libre adicional derivada de la movilidad de las regiones superficiales respecto de las regiones interiores. Este cálculo no se aplicó, sin embargo, a cualquier máximo principal que residiese en una región helicoidal, ya que las regiones helicoidales tienden a ser menos flexibles.

Los resultados de este análisis indicaron que las siguientes secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nº:2 proporcionarían moléculas antigénicas adecuadas: aminoácidos 1 a 17, aminoácidos 39 a 64, 102 a 129, aminoácidos 135 a 142, aminoácidos 146 a 159, y aminoácidos 174 a 182. La presente memoria descriptiva describe el uso de cualquiera de estas secuencias de aminoácidos antigénicas para generar anticuerpos hacia Ztnfr12. La presente memoria descriptiva describe polipéptidos que comprenden al menos una de estas moléculas antigénicas.

De forma similar, los resultados del análisis de Jameson-Wolf indicaron que las siguientes secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nº:13 proporcionarían moléculas antigénicas adecuadas: aminoácidos 10 a 26, aminoácidos 45 a 69, 106 a 113, y aminoácidos 139 a 151. La presente memoria descriptiva describe el uso de cualquiera de estas secuencias de aminoácidos antigénicas para generar anticuerpos hacia Ztnfr12 murino. La presente memoria descriptiva también describe polipéptidos que comprenden al menos una de estas moléculas antigénicas.

Los anticuerpos útiles se pueden producir también mediante el uso de moléculas antigénicas que comprenden al menos un exón de Ztnfr12 del gen humano. Por ejemplo, tales moléculas antigénicas pueden comprender polipéptidos que consisten en las siguientes secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nº:2: los residuos de aminoácidos 1 a 45, los residuos de aminoácidos 47 a 122, y los residuos de aminoácidos 124 a 184.

Los anticuerpos que bloquean la transducción de la señal de ZTNF4 pueden ser útiles en las aplicaciones terapéuticas. Se pueden identificar anticuerpos bloqueantes anti-Ztnfr12, por ejemplo, por su inhibición de la unión de biotina-ZTNF4 a Ztnfr12 en líneas de células tumorales. También se pueden usar los anticuerpos que se unen al dominio intracelular de Ztnfr12 para bloquear la transducción de la señal inducida por ZTNF4. Tales anticuerpos se pueden unir al dominio intracelular de Ztnfr12 en los residuos de aminoácidos 101 a 184 de SEQ ID Nº:2. Además, un dominio de unión de TRAF potencial reside en los residuos de aminoácidos 159 a 178 de SEQ ID Nº:2. Así, ciertos anticuerpos bloqueantes de la señal se pueden unir al dominio intracelular de Ztnfr12 en esta región. La presente invención incluye anticuerpos que se unen a Ztnfr12 en los residuos de aminoácidos 159 a 178 de SEQ ID Nº:2. Hay disponibles métodos estándar para introducir anticuerpos en el compartimiento intracelular de las células. Por ejemplo, tales anticuerpos se pueden encapsular en liposomas.

También son útiles los anticuerpos anti-Ztnfr12 inductores de señales. Los anticuerpos que inducen una señal mediante la unión a un receptor Ztnfr12 se pueden identificar también mediante el uso de una línea adecuada de células indicadoras que contienen un elemento indicador transcripcional y Ztnfr12. Como ilustración, se puede usar una línea de células mamíferas modificadas (p.ej., Jurkat), que expresan Ztnfr12, y un gen indicador transcripcional para ensayar la capacidad de estimular la transcripción de un gen indicador (p.ej., luciferasa) por parte de anticuerpos monoclonales anti-Ztnfr12.

Los anticuerpos policlonales hacia la proteína Ztnfr12 recombinante o hacia Ztnfr12 aislado a partir de fuentes naturales se pueden preparar mediante el uso de métodos bien conocidos para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera", en Immunochemical Protocols (Manson, ed.), páginas 1-5 (Humana Press 1992), y Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995). La inmunogenicidad de un polipéptido Ztnfr12 se puede incrementar por medio del uso de un adyuvante, tal como alumbre (hidróxido de aluminio) o adyuvante completo o incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para la inmunización incluyen también los polipéptidos de fusión, tales como las fusiones de Ztnfr12 o de una porción del mismo con un polipéptido de inmunoglobulina o con una proteína de unión a maltosa. El inmunógeno polipeptídico puede ser una molécula de tamaño completo o una porción de la misma. Si la porción de polipéptido es "similar a hapteno", tal porción se puede unir o enlazar de forma ventajosa a un portador macromolecular (tal como hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino (BSA) o toxoide tetánico) para la inmunización.

Aunque los anticuerpos policlonales se generan en general en animales tales como caballos, vacas, perros, gallinas, ratas, ratones, conejos, conejillos de indias, cabras, u ovejas, el anticuerpo anti-Ztnfr12 de la presente invención puede proceder también de un anticuerpo de primate subhumano. Las técnicas generales para generar anticuerpos útiles en diagnóstico y terapia en babuinos se pueden hallar, por ejemplo, en Goldenberg et al., publicación de patente internacional nº WO 91/11465, y en Losman et al., Int. J. Cancer 46:310 (1990).

De forma alternativa, se pueden generar anticuerpos anti-Ztnfr12 monoclonales. Se pueden obtener anticuerpos monoclonales de roedores hacia antígenos específicos mediante métodos conocidos para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Kohler et al., Nature 256:495 (1975), Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, páginas 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan"], Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)).

Brevemente, se pueden obtener anticuerpos monoclonales inyectando a ratones una composición que comprende un producto del gen Ztnfr12, verificando la presencia de la producción de anticuerpos extrayendo una muestra de suero, extrayendo el bazo para obtener linfocitos B, fusionando los linfocitos B con células de mieloma para producir hibridomas, clonando los hibridomas, seleccionando los clones positivos que producen anticuerpos hacia el antígeno, cultivando los clones que producen anticuerpos hacia el antígeno, y aislando los anticuerpos a partir de los cultivos de hibridomas.

Además, un anticuerpo anti-Ztnfr12 de la presente invención puede proceder de un anticuerpo monoclonal humano. Los anticuerpos monoclonales humanos se obtienen de ratones transgénicos que se han modificado para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a la exposición al antígeno. En esta técnica, se introducen elementos del locus de las cadenas pesada y ligera humanas en cepas de ratones derivadas de líneas de células pluripotenciales embrionarias que contienen interrupciones seleccionadas de los loci endógenos de la cadena pesada y la cadena ligera. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para antígenos humanos, y se pueden usar los ratones para producir hibridomas que secretan anticuerpos humanos. Los métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos se describen, por ejemplo, en Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994), y Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994).

Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar y purificar a partir de cultivos de hibridomas mediante una diversidad de técnicas bien establecidas. Tales técnicas de aislamiento incluyen la cromatografía de afinidad con proteína A-sefarosa, la cromatografía de exclusión por tamaño, y la cromatografía de intercambio iónico (véase, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y en las páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)).

Para usos particulares, puede ser deseable preparar fragmentos de anticuerpos anti-Ztnfr12. Tales fragmentos de anticuerpos se pueden obtener, por ejemplo, mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo. Se pueden obtener fragmentos de anticuerpos mediante digestión con pepsina o papaína a partir de anticuerpos completos mediante métodos convencionales. Como ilustración, se pueden producir fragmentos de anticuerpos mediante escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab')_{2}. Este fragmento se puede escindir posteriormente mediante el uso de un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes Fab' 3,5S. De forma opcional, la reacción de escisión se puede llevar a cabo mediante el uso de un grupo bloqueante para los grupos sulfhidrilo que da como resultado la escisión de los enlaces disulfuro. Como alternativa, una escisión enzimática mediante el uso de pepsina produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, en Goldenberg, patente de EE.UU. nº 4.331.647, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960), Porter, Biochem. J. 73:119 (1959), Edelman et al., en Methods in Enzymology Vol. 1, página 422 (Academic Press 1967), y Coligan en las páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10.-2.10.4.

También se pueden usar otros métodos para escindir los anticuerpos, tales como la separación de las cadenas pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadenas ligera-pesada, la escisión posterior de los fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, con tal de que los fragmentos se unan al antígeno que reconoce el anticuerpo intacto.

Por ejemplo, los fragmentos Fv comprenden una asociación de cadenas V_{H} y V_{L}. Esta asociación puede ser no covalente, como se describió en Inbar et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659 (1972). De forma alternativa, las cadenas variables pueden estar unidas por un enlace disulfuro intermolecular o entrecruzadas mediante productos químicos tales como glutaraldehído (véase, por ejemplo, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)).

Los fragmentos Fv pueden comprender cadenas V_{H} y V_{L}, que están conectadas mediante un espaciador peptídico. Estas proteínas de unión a antígenos de cadena simple (scFv) se preparan construyendo un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican los dominios V_{H} y V_{L}, que están conectadas mediante un oligonucleótido. El gen estructural se inserta en un vector de expresión, que se introduce posteriormente en una célula hospedadora, tal como E. coli. Las células hospedadoras recombinantes sintetizan una cadena polipeptídica simple con un péptido espaciador que une los dos dominios V. Los métodos para producir scFvs se describen, por ejemplo, en Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991) (véase también Bird et al., Science 242:423 (1988), Ladner et al., patente de EE.UU. nº 4.946.778, Pack et al., Bio/Technology 11:1271 (1993), y Sandhu, anteriormente mencionado).

Como ilustración, se puede obtener un scFV exponiendo linfocitos al polipéptido Ztnfr12 in vitro, y seleccionando las bibliotecas de expresión de anticuerpos en fagos o en vectores similares (por ejemplo, por medio del uso de proteína o péptido Ztnfr12 inmovilizado o marcado). Los genes que codifican los polipéptidos que tienen dominios de unión a polipéptidos Ztnfr12 potenciales se pueden obtener mediante el cribado de bibliotecas de péptidos aleatorios expresadas en fagos (expresión en fagos) o en bacterias, tales como E. coli. Se pueden obtener secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos de varias maneras, tales como por medio de mutagénesis aleatoria y síntesis de polinucleótidos aleatorios. Estas bibliotecas de expresión de péptidos aleatorios se pueden usar para cribar en busca de péptidos que interaccionan con un objetivo conocido, que puede ser una proteína o un polipéptido, tal como un ligando o un receptor, una macromolécula biológica o sintética, o sustancias orgánicas o inorgánicas. Las técnicas para crear y cribar tales bibliotecas de expresión de péptidos aleatorios se conocen en la técnica (Ladner et al., patente de EE.UU. nº 5.223.409, Ladner et al., patente de EE.UU. nº 4.946.778, Ladner et al., patente de EE.UU. nº 5.403.484, Ladner et al., patente de EE.UU. nº 5.571.698, y Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)), y hay disponibles comercialmente bibliotecas de expresión de péptidos aleatorios y equipos para el cribado de tales bibliotecas, por ejemplo de CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA), y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Las bibliotecas de expresión de péptidos aleatorios se pueden cribar mediante el uso de las secuencias de Ztnfr12 descritas en el presente documento para identificar las proteínas que se unen a Ztnfr12.

Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica una única región determinante de la complementariedad (CDR). Los péptidos CDR ("unidades mínimas de reconocimiento") se pueden obtener construyendo los genes que codifican las CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes se preparan, por ejemplo, mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable del ARN de las células productoras de anticuerpos (véase, por ejemplo, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106 (1991), Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), página 166 (Cambridge University Press 1995), y Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).

Otro anticuerpo anti-receptor útil es un anticuerpo quimérico. Un anticuerpo quimérico comprende los dominios variables y las regiones determinantes de la complementariedad procedentes de un anticuerpo de roedor, mientras el resto de la molécula de anticuerpo procede de un anticuerpo humano. Véase, por ejemplo, Verma y Boleti, "Engineering Antibody Molecules", en Diagnostic and Therapeutic Antibodies, George y Urch (Eds.), páginas 35-52 (Humana Press, Inc. 2000).

De manera alternativa, un anticuerpo anti-Ztnfr12 puede proceder de un anticuerpo monoclonal "humanizado". Los anticuerpos monoclonales humanizados se producen transfiriendo las regiones determinantes de la complementariedad de ratón de las cadenas variables pesada y ligera de la inmunoglobulina de ratón a un dominio variable humano. Los residuos típicos de los anticuerpos humanos se sustituyen después en las regiones de la estructura de los equivalentes murinos. El uso de componentes de anticuerpos procedentes de anticuerpos monoclonales humanizados evita problemas potenciales asociados a la inmunogenicidad de las regiones constantes murinas. Las técnicas generales para clonar dominios variables de inmunoglobulinas murinas se describen, por ejemplo, en Orlandi et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833 (1989). Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales humanizados se describen, por ejemplo, en Jones et al., Nature 321:522 (1986), Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992), Singer et al., J. Immun. 150:2844 (1993), Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995), Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies", en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), y Queen et al., patente de EE.UU. nº 5.693.762 (1997).

La presente memoria descriptiva describe el uso de composiciones que comprenden un componente de anticuerpo que se une a la región extracelular de Ztnfr12, y un componente de anticuerpo que se une a al menos uno de una región extracelular de TACI y una región extracelular de BCMA. Por ejemplo, tal "composición de anticuerpos multiespecíficos" puede comprender una mezcla de heteroanticuerpos (es decir, un agregado de al menos dos componentes de anticuerpos, en el que cada uno tiene una especificidad de unión diferente), un anticuerpo biespecífico (es decir, un componente de anticuerpo con dos sitios combinados diferentes), un polipéptido biespecífico de cadena simple, y similares.

Los anticuerpos biespecíficos se pueden hacer mediante una diversidad de métodos convencionales. Como ilustración, se han preparado anticuerpos biespecíficos mediante escisión oxidativa de fragmentos Fab' que resultan de la escisión reductora de anticuerpos diferentes. Véase, por ejemplo, Winter et al., Nature 349:293 (1991). Esto se puede llevar a cabo mezclando dos fragmentos F(ab')_{2} diferentes producidos mediante digestión con pepsina de dos anticuerpos diferentes, escisión reductora para formar una mezcla de fragmentos Fab', seguido de reformación oxidativa de los enlaces disulfuro para producir una mezcla de fragmentos F(ab')_{2} que incluyen anticuerpos biespecíficos que contienen una porción Fab' específica de cada uno de los epítopos originales. Las técnicas generales para la preparación de tales anticuerpos biespecíficos se pueden hallar, por ejemplo, en Nisonhoff et al., Arch Biochem. Biophys. 93:470 (1961), Hammerling et al., J. Exp. Med. 128:1461 (1968), y la patente de EE.UU. nº 4.331.647.

De forma alternativa, se puede llevar a cabo la unión mediante el uso de un espaciador heterobifuncional tal como un éster de maleimida-hidroxisuccinimida. La reacción del éster con un anticuerpo o fragmento derivatizará los grupos amino del anticuerpo o del fragmento, y el derivado se puede hacer reaccionar después, por ejemplo, con un fragmento Fab de un anticuerpo que tiene grupos sulfhidrilo libres (o un fragmento mayor o un anticuerpo intacto con grupos sulfhidrilo unidos a él, por ejemplo, mediante reactivo de Traut). Es menos probable que tal espaciador entrecruce grupos en el mismo anticuerpo, y mejora la selectividad de la unión.

Como otro ejemplo, se pueden producir anticuerpos F(ab')_{2} biespecíficos uniendo dos fragmentos Fab' por medio de los grupos SH de la región de la bisagra mediante el uso del entrecruzador bifuncional o-fenilendimaleimida. Véase, por ejemplo, Tso, "F(ab')_{2} Fusion Proteins and Bispecific F(ab')_{2}", en Chamow y Ashkenazi (Eds.), Antibody Fusion Proteins, páginas 127-150 (Wiley-Liss, Inc. 1999), y French, "How to Make Bispecific Antibodies", en George y Urch (Eds.), Diagnostic and Therapeutic Antibodies, páginas 333-339 (Humana Press, Inc. 2000).

Es ventajoso unir los anticuerpos o los fragmentos en sitios lejanos de los sitios de unión al antígeno. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante la unión a grupos sulfhidrilo intercatenarios escindidos, como se indicó anteriormente. Otro método implica hacer reaccionar un anticuerpo que tiene una porción de carbohidrato oxidada con otro anticuerpo que tiene al menos una función amina libre. Esto da como resultado un enlace de base de Schiff inicial (imina), que se puede estabilizar mediante la reducción hasta una amina secundaria, por ejemplo, mediante reducción con borohidruro, para formar el compuesto final. Tales enlaces específicos de sitio se describen, para moléculas pequeñas, en la patente de EE.UU. nº 4.671.958, y para las moléculas más grandes en la patente de EE.UU. nº
4.699.784.

De forma alternativa, se pueden producir anticuerpos biespecíficos fusionando dos líneas de células de hibridoma, una línea celular que produce un anticuerpo monoclonal anti-Ztnfr12, y una línea celular que produce un anticuerpo monoclonal anti-BCMA o un anticuerpo monoclonal anti-TACI. Las técnicas para producir tetradomas se describen, por ejemplo, en Milstein et al., Nature 305:537 (1983), y Pohl et al., Int. J. Cancer 54:418 (1993).

También se pueden producir anticuerpos biespecíficos mediante ingeniería genética. Por ejemplo, se pueden introducir vectores que contienen ADN que codifica los dominios variables de un anticuerpo monoclonal anti-Ztnfr12 en hibridomas que secretan anticuerpos anti-TACI, o anticuerpos anti-BCMA. Los transfectomas resultantes producen anticuerpos biespecíficos que se unen a Ztnfr12 y BCMA o TACI. De forma alternativa, se pueden diseñar genes quiméricos que codifican un dominio de unión anti-Ztnfr12 y al menos un dominio de unión anti-BCMA o un dominio de unión anti-TACI. Los expertos en la técnica tienen a su disposición una diversidad de estrategias genéticas para producir anticuerpos biespecíficos. En una aproximación, por ejemplo, se producen F(ab')_{2} biespecíficos mediante el uso de cremalleras de leucina. Véase, por ejemplo, Tso, "F(ab')_{2} Fusion Proteins and Bispecific F(ab')_{2}", en Chamow y Ashkenazi (Eds.), Antibody Fusion Proteins, páginas 127-150 (Wiley-Liss, Inc. 1999). Las técnicas generales para producir anticuerpos biespecíficos mediante ingeniería genética se describen, por ejemplo, en Songsivilai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164:271 (1989), Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991), y Weiner et al., J. Immunol. 147:4035 (1991).

Una molécula biespecífica puede ser también una molécula biespecífica de cadena simple, tal como un anticuerpo biespecífico de cadena simple, una molécula biespecífica de cadena simple que comprende un anticuerpo de cadena simple y un determinante de unión, o una molécula biespecífica de cadena simple que comprende dos determinantes de unión.

Los anticuerpos biespecíficos se pueden cribar mediante el uso de técnicas habituales, tales como un ELISA biespecífico.

La presente memoria descriptiva describe anticuerpos anti-idiotipo policlonales, que se pueden preparar mediante la inmunización de animales con anticuerpos anti-Ztnfr12 o fragmentos de anticuerpos, mediante el uso de técnicas habituales. Véase, por ejemplo, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera", en Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), páginas 1-12 (Humana Press 1992). Además, véase Coligan en las páginas 2.4.1-2.4.7. De forma alternativa, se pueden preparar anticuerpos anti-idiotipo monoclonales mediante el uso de anticuerpos anti-Ztnfr12 o fragmentos de anticuerpos como inmunógenos con las técnicas descritas anteriormente. Como otra alternativa, se pueden preparar anticuerpos anti-idiotipo humanizados o anticuerpos anti-idiotipo de primates subhumanos mediante el uso de las técnicas descritas anteriormente. Los métodos para producir anticuerpos anti-idiotipo se describen, por ejemplo, en Irie, patente de EE.UU. nº 5.208.146, Greene, et. al., patente de EE.UU. nº 5.637.677, y Varthakavi y Minocha, J. Gen. Virol. 77:1875 (1996).

Los componentes de anticuerpos anti-Ztnfr12 y los anticuerpos anti-idiotipo de la presente invención pueden ser útiles para neutralizar los efectos de un ligando de Ztnfr12 (p.ej., ZTNF4) para el tratamiento de leucemias de células pre-B o de células B, tales como leucemia de células plasmáticas, leucemia linfocítica crónica o aguda, mielomas tales como mieloma múltiple, mieloma de células plasmáticas, mieloma endotelial y osteoclastoma, y linfomas tales como linfoma no hodgkiniano, que están asociados a un incremento de un ligando de Ztnfr12 (p.ej., ZTNF4). Los ejemplos adicionales de linfomas de células B que se pueden tratar con las moléculas descritas en el presente documento incluyen el linfoma de Burkitt, el linfoma no Burkitt, linfoma folicular, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células grandes, linfoma de zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma de células grandes (p.ej., linfoma inmunoblástico), linfoma linfocítico pequeño, y otros linfomas de las células B.

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10. Uso de Secuencias Nucleotídicas de Ztnfr12 para Detectar la Expresión Génica y la Estructura Génica

Se pueden usar moléculas de ácido nucleico para detectar la expresión de un gen Ztnfr12 en una muestra biológica. Las moléculas que son adecuadas incluyen las moléculas de ácido nucleico bicatenarias que comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº:1, o una porción de la misma, así como las moléculas de ácido nucleico monocatenarias que tienen el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº:1, o una porción de la misma. Las moléculas de sondas pueden ser ADN, ARN, oligonucleótidos, y similares. Como se usa en el presente documento, el término "porción" se refiere de al menos ocho nucleótidos a al menos 20 o más nucleótidos. Las sondas ilustrativas se unen a regiones del gen Ztnfr12 que tienen una similitud de secuencias baja respecto de regiones comparables en otros genes de receptores de factores de necrosis tumoral.

En un ensayo básico, una molécula de sonda monocatenaria se incuba con ARN, aislado a partir de una muestra biológica, en condiciones de temperatura y fuerza iónica que favorecen la formación de emparejamientos de bases entre la sonda y la especie de ARN de Ztnfr12 seleccionada como objetivo. Después de separar la sonda sin unir de las moléculas hibridadas, se detecta la cantidad de híbridos.

Los métodos de hibridación establecidos para la detección de ARN incluyen el análisis de Northern y la hibridación de transferencias en mancha/banda (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 4-1 a 4-27, y Wu et al. (eds.), "Analysis of Gene Expression at the RNA Level", en Methods in Gene Biotechnology, páginas 225-239 (CRC Press, Inc. 1997)). Las sondas de ácido nucleico se pueden marcar de forma detectable con radioisótopos tales como ^{32}P o ^{35}S. De forma alternativa, se puede detectar ARN de Ztnfr12 con un método de hibridación no radiactivo (véase, por ejemplo, Isaac (ed.), Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes (Humana Press, Inc. 1993)). En general, la detección no radiactiva se lleva a cabo mediante la conversión enzimática de sustratos cromógenos o quimioluminiscentes. Los restos no radiactivos ilustrativos incluyen biotina, fluoresceína, y digoxigenina.

Las sondas oligonucleotídicas de Ztnfr12 son útiles también para el diagnóstico in vivo. Como ilustración, se pueden administrar oligonucleótidos marcados con ^{18}F a un sujeto, y se pueden visualizar mediante tomografía de emisión de positrones (Tavitian et al., Nature Medicine 4:467 (1998)).

Numerosos procedimientos diagnósticos aprovechan la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para incrementar la sensibilidad de los métodos de detección. Las técnicas habituales para llevar a cabo la PCR se conocen bien (véase, en general, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek y Walaszek (eds.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (ed.), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc. 1998), y Meltzer (ed.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998)).

Se pueden diseñar los cebadores de PCR para amplificar una porción del gen Ztnfr12 que tiene una similitud de secuencias baja respecto de una región comparable en otras proteínas, tales como otras proteínas de receptores de factores de necrosis tumoral.

Una variación de la PCR para ensayos de diagnóstico es la transcriptasa inversa-PCR (RT-PCR). En la técnica de RT-PCR, se aísla ARN a partir de una muestra biológica, se transcribe inversamente hasta cADN, y el cADN se incuba con cebadores de Ztnfr12 (véase, por ejemplo, Wu et al. (eds.), "Rapid Isolation of Specific cDNAs or Genes by PCR", en Methods in Gene Biotechnology, páginas 15-28 (CRC Press, Inc. 1997)). Después se lleva a cabo la PCR, y los productos se analizan mediante el uso de técnicas habituales.

Como ilustración, se aísla ARN a partir una muestra biológica mediante el uso, por ejemplo, del procedimiento de lisis celular con tiocianato de guanidinio descrito anteriormente. De forma alternativa, se puede usar una técnica de fase sólida para aislar el ARNm a partir un lisado celular. Se puede llevar a cabo una reacción de transcripción inversa con el ARN aislado mediante el uso de oligonucleótidos aleatorios, homopolímeros cortos de dT, u oligómeros complementarios de Ztnfr12. Los cebadores de oligo-dT ofrecen la ventaja de que se amplifican diversas secuencias nucleotídicas de ARNm que pueden proporcionar secuencias seleccionadas como objetivo de control. Las secuencias de Ztnfr12 se amplifican mediante la reacción en cadena de la polimerasa con el uso de los cebadores oligonucleotídicos flanqueantes que tienen en general una longitud de 20 bases.

Los productos de amplificación de la PCR se pueden detectar mediante el uso de una diversidad de aproximaciones. Por ejemplo, los productos de la PCR se pueden fraccionar mediante electroforesis en gel, y se pueden visualizar mediante tinción con bromuro de etidio. De forma alternativa, los productos de la PCR fraccionados se pueden transferir a una membrana, hibridarlos con una sonda de Ztnfr12 marcada de forma detectable, y examinarlos mediante autorradiografía. Las aproximaciones alternativas adicionales incluyen el uso de trifosfatos de ácidos desoxirribonucleicos marcados con digoxigenina para proporcionar una detección mediante quimioluminiscencia, y el ensayo colorimétrico C-TRAK.

Otra aproximación para la detección de la expresión de Ztnfr12 es la tecnología de sondas cíclicas, en la que una molécula objetivo de ADN monocatenaria se une a un exceso de sonda quimérica ADN-ARN-ADN para formar un complejo, la porción de ARN se escinde con una RNasa H, y se detecta la presencia de la sonda quimérica escindida (véase, por ejemplo, Beggs et al., J. Clin. Microbiol. 34:2985 (1996), Bekkaoui et al., Biotechniques 20:240 (1996)). Los métodos alternativos para la detección de secuencias de Ztnfr12 pueden utilizar aproximaciones tales como la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos, la amplificación cooperativa de moldes mediante hibridación cruzada, y la reacción en cadena de la ligasa (véase, por ejemplo, Marshall et al., patente de EE.UU. nº 5.686.272 (1997), Dyer et al., J. Virol. Methods 60:161 (1996), Ehricht et al., Eur. J. Biochem. 243:358 (1997), y Chadwick et al., J. Virol. Methods 70:59 (1998)). Los expertos en la técnica conocen otros métodos habituales.

También se pueden usar sondas y cebadores de Ztnfr12 para detectar y localizar la expresión del gen Ztnfr12 en muestras de tejidos. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para tal hibridación in situ (véase, por ejemplo, Choo (ed.), In Situ Hybridization Protocols (Humana Press, Inc. 1994), Wu et al. (eds.), "Analysis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive In Situ Hybridization (RISH)", en Methods in Gene Biotechnology, páginas 259-278 (CRC Press, Inc. 1997), y Wu et al. (eds.), "Localization of DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization (RISH)", en Methods in Gene Biotechnology, páginas 279-289 (CRC Press, Inc. 1997)). Los expertos en la técnica conocen bien diversas aproximaciones diagnósticas adicionales (véase, por ejemplo, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), Coleman y Tsongalis, Molecular Diagnostics (Humana Press, Inc. 1996), y Elles, Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc., 1996)). Las muestras de ensayo adecuadas incluyen sangre, orina, saliva, biopsia de tejido, y material de
autopsia.

El gen Ztnfr12 reside en el cromosoma 22q13.2, una región que está asociada a enfermedades y trastornos tales como síndrome de Fechtner, distrofia de Sorsby, sordera, y síndrome de inmunodeficiencia de neutrófilos. Además, las mutaciones de los receptores de citocinas están asociadas a enfermedades particulares. Por ejemplo, los polimorfismos de los receptores de citocinas están asociados a proteinosis alveolar pulmonar, fiebre periódica familiar, y eritroleucemia. Así, las secuencias de nucleótidos de Ztnfr12 se pueden usar en ensayos basados en ligamiento para diversas enfermedades, y para determinar si los cromosomas de un sujeto contienen una mutación en el gen Ztnfr12. Las alteraciones cromosómicas detectables en el locus del gen Ztnfr12 incluyen, pero sin limitación, aneuploidía, cambios en el número de copias del gen, inserciones, deleciones, cambios en los sitios de restricción y reordenamientos. Son de interés particular las alteraciones genéticas que inactivan un gen Ztnfr12.

Las alteraciones asociadas al locus de Ztnfr12 se pueden detectar mediante el uso de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención empleando métodos de genética molecular, tales como el análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción, el análisis de las repeticiones cortas en tándem mediante el empleo de técnicas de PCR, el análisis del sistema de mutaciones refractarias a la amplificación, la detección de polimorfismos conformacionales de cadenas monocatenarias, los métodos de escisión mediante RNasa, la electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante, el análisis de apareamientos erróneos asistido por fluorescencia, y otros métodos de análisis genético conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), Marian, Chest 108:255 (1995), Coleman y Tsongalis, Molecular Diagnostics (Humana Press, Inc. 1996), Elles (ed.) Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (ed.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996), Birren et al. (eds.), Genome Analysis, Vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998), Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998), y Richards y Ward, "Molecular Diagnostic Testing", en Principles of Molecular Medicine, páginas 83-88 (Humana Press, Inc. 1998)).

Como ilustración, se pueden detectar grandes deleciones en un gen Ztnfr12 mediante el uso de análisis de hibridación de Southern o amplificación mediante PCR. Los deleciones en un exón de Ztnfr12 particular se pueden detectar mediante el uso de cebadores de PCR que flanquean el exón. La Tabla 1 proporciona las localizaciones de los exónes de Ztnfr12 presentes en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID Nºs:1 y 9. Esta información se puede usar para diseñar cebadores que amplifican exónes particulares.

Las mutaciones se pueden detectar también hibridando una sonda oligonucleotídica que comprende una secuencia de Ztnfr12 normal con una transferencia de Southern o con productos de PCR unidos a una membrana. La discriminación se lleva a cabo hibridando en condiciones de rigurosidad elevada, o lavando en condiciones de rigurosidad variable. Este análisis se puede dirigir a una secuencia codificante particular. De forma alternativa, esta aproximación se usa para examinar sitios donantes de corte y empalme o sitios aceptores de corte y empalme en las secuencias de los intrones inmediatamente flanqueantes, en las que a menudo se localizan mutaciones que provocan enfermedades. Los oligonucleótidos adecuados se pueden diseñar extendiendo la secuencia en un exón de elección, mediante el uso de la información proporcionada en la Tabla 1 y en SEQ ID Nºs:1 y 9.

La duplicación de todo o parte de un gen puede provocar un trastorno cuando la inserción del material duplicado se inserta en el marco de lectura del gen y provoca la terminación prematura de la traducción. La duplicación y la inserción se pueden examinar directamente analizando un ADN genómico de un sujeto con los métodos habituales, tales como hibridación de Southern, hibridación in situ de fluorescencia, análisis de gel de campo pulsado, o PCR. Además, se puede detectar el efecto de la duplicación con el ensayo de truncamiento de proteínas descrito más adelante.

Una mutación puntual puede llevar a un cambio no conservativo que dé como resultado la alteración de la función de Ztnfr12, o un cambio de un codón de aminoácido hasta un codón de parada. Si se da una mutación puntual dentro de un intrón, la mutación puede afectar a la fidelidad del corte y empalme. Se puede detectar una mutación puntual mediante el uso de técnicas habituales, tales como análisis de hibridación de Southern, análisis de PCR, secuenciación, reacción en cadena de ligadura, y otras aproximaciones. En el análisis de polimorfismos conformacionales de cadenas monocatenarias, por ejemplo, los fragmentos amplificados mediante PCR se separan en cadenas monocatenarias, y se fraccionan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes. La velocidad de la migración a través del gel es una función de la conformación, que depende de la secuencia de bases. Una mutación puede alterar la velocidad de migración de una o ambas cadenas monocatenarias. En una aproximación mediante escisión química, se producen moléculas híbridas entre el ADN de ensayo y de control (p.ej., ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:2). Los sitios de apareamiento erróneo de bases debidos a una mutación estarán emparejados erróneamente, y las cadenas serán susceptibles a la escisión química en estos sitios.

El ensayo de truncamiento de proteínas es útil también para detectar la inactivación de un gen en el que las mutaciones de terminación de la traducción producen solamente porciones de la proteína codificada (véase, por ejemplo, Stoppa-Lyonnet et al., Blood 91:3920 (1998)). Según esta aproximación, se aísla el ARN a partir de una muestra biológica, y se usa para sintetizar cADN. Después se usa la PCR para amplificar la secuencia objetivo de Ztnfr12 y para introducir un promotor de ARN polimerasa, una secuencia de iniciación de la traducción y un triplete ATG en el marco de lectura. Los productos de la PCR se transcriben mediante el uso de una ARN polimerasa, y los transcritos se traducen in vitro con un sistema de lisado de reticulocitos acoplado a T7. Los productos de la traducción se fraccionan después mediante SDS-PAGE para determinar las longitudes de los productos de la traducción. El ensayo de truncamiento de proteínas se describe, por ejemplo, en Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, páginas 9.11.1-9.11.18 (John Wiley & Sons 1998).

En una aproximación alternativa, se puede detectar una mutación mediante el uso de ribonucleasa A, que escindirá la cadena de ARN de un híbrido ARN-ADN en el sitio de un apareamiento incorrecto de la secuencia. Brevemente, una secuencia amplificada mediante PCR de un gen Ztnfr12 o cADN de un sujeto se hibrida con sondas de ARN marcadas transcritas in vitro preparadas a partir del ADN de un individuo sano normal elegido de la población general. Los híbridos ARN-ADN se digieren con ribonucleasa A y se analizan mediante el uso de electroforesis en gel desnaturalizante. Los apareamientos erróneos de secuencia entre las dos cadenas provocarán la escisión del fragmento protegido, y los fragmentos pequeños adicionales se detectarán en las muestras procedentes de un sujeto que tiene un gen Ztnfr12 mutado. El sitio de mutación se puede deducir a partir de los tamaños de los productos de escisión.

El análisis del ADN cromosómico mediante el uso de la secuencia polinucleotídica de Ztnfr12 es útil para correlacionar una enfermedad con las anormalidades localizadas en el cromosoma 22q, en particular en el cromosoma 22q13.2. Los métodos descritos en el presente documento pueden proporcionar un método para detectar una anormalidad en el cromosoma 22q13.2 en una muestra de un individuo que comprende: (a) obtener ARN de Ztnfr12 a partir de la muestra, (b) generar cADN de Ztnfr12 mediante reacción en cadena de la polimerasa, y (c) comparar la secuencia de nucleótidos del cADN de Ztnfr12 con la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID Nº:1. La diferencia entre la secuencia del cADN de Ztnfr12 o el gen Ztnfr12 de la muestra y la secuencia de Ztnfr12 mostrada en SEQ ID Nºs:1 ó 9 puede indicar una anormalidad del cromosoma 22q13.2.

La presente memoria descriptiva describe métodos para detectar en una muestra de un individuo una anormalidad del cromosoma 22q13.2 asociada a una alteración de la actividad de ZTNF4, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto las moléculas de ácido nucleico de la muestra con una sonda de ácido nucleico que hibrida con una molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº:1, sus complementos o fragmentos, en condiciones rigurosas, y (b) detectar la presencia o ausencia de hibridación de la sonda con las moléculas de ácido nucleico de la muestra, en la que la ausencia de hibridación indica una anormalidad del cromosoma 22q13.2, tal como una anormalidad que provoca una disminución de la respuesta hacia ZTNF4.

La presente memoria descriptiva describe métodos para detectar en una muestra de un individuo una anormalidad del gen Ztnfr12 asociada a una alteración de la actividad de ZTNF4, que comprende: (a) aislar moléculas de ácido nucleico que codifican Ztnfr12 a partir de la muestra, y (b) comparar la secuencia de nucleótidos de la secuencia que codifica Ztnfr12 aislada con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº:1, en la que la diferencia entre la secuencia que codifica Ztnfr12 aislada, o un polinucleótido que codifica el polipéptido Ztnfr12 generado a partir de la secuencia que codifica Ztnfr12 aislada, y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº:1 indica una anormalidad del gen Ztnfr12 asociada a una enfermedad o susceptibilidad hacia una enfermedad en un individuo, tal como una anormalidad que provoca una disminución en la respuesta hacia ZTNF4.

La presente memoria descriptiva describe métodos para detectar en una muestra de un individuo una anormalidad en la expresión del gen Ztnfr12 asociada a una enfermedad o susceptibilidad hacia una enfermedad, que comprende: (a) obtener ARN de Ztnfr12 a partir de la muestra, (b) generar cADN de Ztnfr12 mediante una reacción en cadena de la polimerasa a partir del ARN de Ztnfr12, y (c) comparar la secuencia de nucleótidos del cADN de Ztnfr12 con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº:1, en la que una diferencia entre la secuencia del cADN de Ztnfr12 y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº:1 indica una anormalidad en la expresión del gen ZTNFR12 asociada a una enfermedad o susceptibilidad hacia una enfermedad.

En otros aspectos, la presente memoria descriptiva describe métodos para detectar en una muestra de un individuo una anormalidad de un gen Ztnfr12, que comprende: (a) poner en contacto las moléculas de ácido nucleico de la muestra con una sonda de ácido nucleico, en la que la sonda hibrida con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº:1, sus complementos o fragmentos, en condiciones rigurosas, y (b) detectar la presencia o ausencia de hibridación que es indicativa de una anormalidad de Ztnfr12.

La hibridación in situ proporciona otra aproximación para identificar anormalidades del gen Ztnfr12. Según esta aproximación, se marca una sonda de Ztnfr12 con un marcador detectable mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la sonda se puede marcar directamente mediante cebado aleatorio, marcaje de los extremos, PCR, o desplazamiento de mella. Los marcadores directos adecuados incluyen los marcadores radiactivos tales como ^{32}P, ^{3}H, y ^{35}S, y los marcadores no radiactivos tales como marcadores fluorescentes (p.ej., fluoresceína, rojo Texas, azul AMCA (7-amino-4-metil-cumarina-3-acetato), amarillo lucifer, rodamina, etc.), colorantes de cianina, que son detectables con luz visible, enzimas, y similares. Las sondas marcadas con una enzima se pueden detectar por medio de una reacción colorimétrica proporcionando un sustrato para la enzima. En presencia de diversos sustratos se producen diferentes colores mediante la reacción, y estos colores se pueden visualizar para detectar por separado múltiples sondas, si se desea. Los sustratos adecuados para la fosfatasa alcalina incluyen fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo y nitroazul de tetrazolio. Un sustrato adecuado para la peroxidasa de rábano es diaminobenzoato.

Un método ilustrativo para detectar anormalidades cromosómicas con hibridación in situ se describe en Wang et al., patente de EE.UU. nº 5.856.089. Siguiendo esta aproximación, por ejemplo, un método para llevar a cabo una hibridación in situ con una sonda de Ztnfr12 para detectar una anormalidad estructural cromosómica en una célula a partir de una muestra de tejido fijada obtenida de un sujeto puede comprender las etapas de: (1) obtener una muestra de tejido fijada del paciente, (2) pretratar la muestra de tejido fijada obtenida en la etapa (1) con una composición de ión bisulfito, (3) digerir la muestra de tejido fijada con una proteinasa, (4) llevar a cabo una hibridación in situ con las células obtenidas de la muestra de tejido fijada digerida de la etapa (3) con una sonda que hibrida específicamente con el gen Ztnfr12, en la que se obtiene un patrón de señales de las sondas hibridadas, (5) comparar el patrón de señales de la sonda hibridada en la etapa (4) con un patrón de señales predeterminado de la sonda hibridada obtenida cuando se lleva a cabo la hibridación in situ con células que tienen una región cromosómica crítica normal de interés, y (6) detectar una anormalidad estructural cromosómica en las células del paciente, detectando una diferencia entre el patrón de señales obtenido en la etapa (4) y el patrón de señales predeterminado. Los ejemplos de anormalidades del gen Ztnfr12 incluyen deleciones, amplificaciones, translocaciones, inversiones, y similares. Tal ensayo se puede usar, por ejemplo, para analizar el tejido de un sujeto que se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno asociado a una respuesta alterada a ZTNF4.

La presente memoria descriptiva describe equipos para llevar a cabo un ensayo de diagnóstico de la expresión del gen Ztnfr12, o para detectar mutaciones en el gen Ztnfr12. Tales equipos comprenden sondas de ácido nucleico, tales como moléculas de ácido nucleico bicatenarias que comprenden la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 27 a 578 de SEQ ID Nº:1, los nucleótidos 27 a 233 de SEQ ID Nº:1, o una porción de las mismas, así como moléculas de ácido nucleico monocatenarias que tienen el complemento de la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 27 a 578 de SEQ ID Nº:1, los nucleótidos 27 a 233 de SEQ ID Nº:1, o una porción de las mismas. Las moléculas de sondas pueden ser ADN, ARN, oligonucleótidos, y similares. Los equipos pueden comprender cebadores de ácido nucleico para llevar a cabo la PCR.

Tales equipos pueden contener todos los elementos necesarios para llevar a cabo un ensayo de diagnóstico de ácido nucleico como se describió anteriormente. Un equipo comprenderá al menos un recipiente que comprende una sonda o cebador de Ztnfr12. El equipo puede comprender también un segundo recipiente que comprende uno o más reactivos capaces de indicar la presencia de las secuencias de Ztnfr12. Los ejemplos de tales reactivos indicadores incluyen marcadores detectables tales como marcadores radiactivos, fluorocromos, agentes quimioluminiscentes, y similares. Un equipo puede comprender también un medio para comunicar al usuario que se usan las sondas y los cebadores de Ztnfr12 para detectar la expresión del gen Ztnfr12. Por ejemplo, las instrucciones escritas pueden indicar que las moléculas de ácido nucleico adjuntas se pueden usar para detectar una molécula de ácido nucleico que codifica Ztnfr12, o una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria respecto de una secuencia de nucleótidos que codifica Ztnfr12. El material escrito se puede aplicar directamente a un recipiente, o se puede proporcionar el material escrito en forma de un folleto.

11. Uso de Anticuerpos Anti-Ztnfr12 para Detectar Ztnfr12

La presente memoria descriptiva describe el uso de anticuerpos anti-Ztnfr12 para cribar in vitro muestras biológicas en busca de la presencia de Ztnfr12. En un tipo de ensayo in vitro, se usan anticuerpos anti-Ztnfr12 en fase líquida. Por ejemplo, se puede analizar la presencia de Ztnfr12 en una muestra biológica mezclando la muestra biológica con una cantidad mínima de Ztnfr12 marcado y un anticuerpo anti-Ztnfr12 en condiciones que favorecen la unión entre Ztnfr12 y su anticuerpo. Los complejos de Ztnfr12 y de anti-Ztnfr12 de la muestra se pueden separar de la mezcla de reacción poniendo en contacto el complejo con una proteína inmovilizada que se une al anticuerpo, tal como un anticuerpo Fc o una proteína A de Staphylococcus. La concentración de Ztnfr12 en la muestra biológica será inversamente proporcional a la cantidad de Ztnfr12 marcado unido al anticuerpo, y directamente relacionada con la cantidad de Ztnfr12 marcado libre. Las muestras biológicas ilustrativas incluyen sangre, orina, saliva, biopsia de tejido, y material de autopsia.

De forma alternativa, se pueden llevar a cabo ensayos in vitro en los que el anticuerpo anti-Ztnfr12 se une a un portador en fase sólida. Por ejemplo, se puede unir un anticuerpo a un polímero, tal como aminodextrano, para unir el anticuerpo a un soporte insoluble tal como una esfera, una placa o un tubo revestidos de polímero. Otros ensayos in vitro adecuados serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica.

En otra aproximación, se pueden usar anticuerpos anti-Ztnfr12 para detectar Ztnfr12 en cortes de tejido preparados a partir de una muestra de biopsia. Tal detección inmunoquímica se puede usar para determinar la abundancia relativa de Ztnfr12 y para determinar la distribución de Ztnfr12 en el tejido examinado. Las técnicas generales de inmunoquímica están bien establecidas (véase, por ejemplo, Ponder, "Cell Marking Techniques and Their Application", en Mammalian Development: A Practical Approach, Monk (ed.), páginas 115-38 (IRL Press 1987), Coligan en las páginas 5.8.1-5.8.8, Ausubel (1995) en las páginas 14.6.1 a 14.6.13 (Wiley Interscience 1990), y Manson (ed.), Methods In Molecular Biology, Vol. 10: Immunochemical Protocols (The Humana Press, Inc. 1992)).

La detección inmunoquímica se puede llevar a cabo poniendo en contacto una muestra biológica con un anticuerpo anti-Ztnfr12, y después poniendo en contacto la muestra biológica con una molécula marcada de forma detectable, que se une al anticuerpo. Por ejemplo, la molécula marcada de forma detectable puede comprender un resto de anticuerpo que se une al anticuerpo anti-Ztnfr12. De forma alternativa, el anticuerpo anti-Ztnfr12 se puede conjugar con avidina/estreptavidina (o biotina), y la molécula marcada de forma detectable puede comprender biotina (o avidina/estreptavidina). Los expertos en la técnica conocen numerosas variaciones de esta técnica básica.

De forma alternativa, se puede conjugar un anticuerpo anti-Ztnfr12 con un marcador detectable para formar un inmunoconjugado anti-Ztnfr12. Los marcadores detectables adecuados incluyen, por ejemplo, un radioisótopo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimático, un marcador bioluminiscente u oro coloidal. Las personas de experiencia habitual en la técnica conocen bien los métodos para producir y detectar tales inmunoconjugados marcados de forma detectable, y se describen con más detalle más adelante.

El marcador detectable puede ser un radioisótopo que se detecta mediante autorradiografía. Los isótopos que son especialmente útiles para los fines de la presente invención son ^{3}H, ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S y ^{14}C.

Los inmunoconjugados anti-Ztnfr12 se pueden marcar también con un compuesto fluorescente. La presencia de un anticuerpo marcado de forma fluorescente se determina exponiendo al inmunoconjugado a luz de una longitud de onda apropiada, y detectando la fluorescencia resultante. Los compuestos para el marcaje fluorescente incluyen isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina.

De forma alternativa, los inmunoconjugados anti-Ztnfr12 se pueden marcar de forma detectable acoplando un componente de anticuerpo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del inmunoconjugado marcado de forma quimioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos de marcaje quimioluminiscente incluyen luminol, isoluminol, un éster de acridinio aromático, un imidazol, una sal de acridinio y un éster de oxalato.

De forma similar, se puede usar un compuesto bioluminiscente para marcar los inmunoconjugados anti-Ztnfr12 de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia hallada en sistemas biológicos, en los cuales una proteína catalítica incrementa la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes que son útiles para el marcaje incluyen luciferina, luciferasa y aequorina.

De forma alternativa, los inmunoconjugados anti-Ztnfr12 se pueden marcar de forma detectable uniendo un componente de anticuerpo anti-Ztnfr12 a una enzima. Cuando se incuba el conjugado anti-Ztnfr12-enzima en presencia del sustrato apropiado, el resto de enzima reacciona con el sustrato para producir un resto químico que se puede detectar, por ejemplo, mediante medios espectrofotométricos, fluorimétricos o visuales. Los ejemplos de enzimas que se pueden usar para marcar de forma detectable inmunoconjugados poliespecíficos incluyen \beta-galactosidasa, glucosa oxidasa, peroxidasa y fosfatasa alcalina.

Los expertos en la técnica conocerán otros marcadores adecuados, que se pueden emplear de acuerdo con la presente invención. La unión de los restos de marcador a los anticuerpos anti-Ztnfr12 se puede llevar a cabo mediante el uso de métodos habituales conocidos en la técnica. La metodología general a este respecto se describe en Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1 (1976), Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1 (1977), Shih et al., Int'l J. Cancer 46:1101 (1990), Stein et al., Cancer Res. 50:1330 (1990), y Coligan, anteriormente mencionado.

Además, se puede incrementar la comodidad y la versatilidad de la detección inmunoquímica mediante el uso de anticuerpos anti-Ztnfr12 que se han conjugado a avidina, estreptavidina, y biotina (véase, por ejemplo, Wilchek et al. (eds.), "Avidin-Biotin Technology", Methods In Enzymology, Vol. 184 (Academic Press 1990), y Bayer et al., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology", en Methods In Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), páginas 149-162 (The Humana Press, Inc. 1992).

Los métodos para llevar a cabo inmunoensayos están bien establecidos. Véase, por ejemplo, Cook y Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays", en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter y Ladyman (eds.), páginas 180-208, (Cambridge University Press, 1995), Perry, "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology", en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch y Lennox (eds.), páginas 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995), y Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996).

La presente memoria descriptiva describe equipos para llevar a cabo un ensayo de diagnóstico inmunológico para la expresión del gen Ztnfr12. Tales equipos comprenden al menos un recipiente que comprende un anticuerpo anti-Ztnfr12, o fragmento de anticuerpo. Un equipo puede comprender también un segundo recipiente que comprende uno o más reactivos capaces de indicar la presencia de un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo hacia Ztnfr12. Los ejemplos de tales reactivos indicadores incluyen los marcadores detectables tales como un marcador radiactivo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimático, un marcador bioluminiscente, oro coloidal, y similares. Un equipo puede comprender también un medio para comunicar al usuario que los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpos hacia Ztnfr12 se usan para detectar la proteína Ztnfr12. Por ejemplo, las instrucciones escritas pueden indicar que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo adjunto se puede usar para detectar Ztnfr12. El material escrito se puede aplicar directamente a un recipiente, o se puede proporcionar el material escrito en forma de un folleto.

12. Usos Terapéuticos de Polipéptidos que Tienen Actividad de Ztnfr12

Se pueden usar las secuencias de aminoácidos que tienen actividad de Ztnfr12 para modular el sistema inmunitario mediante la unión de un ligando de Ztnfr12 (p.ej., ZTNF4), y así, evitar la unión del ligando de Ztnfr12 con el receptor Ztnfr12 endógeno. Por lo tanto, la presente memoria descriptiva describe el uso de proteínas, polipéptidos y péptidos que tienen actividad de Ztnfr12 (tales como polipéptidos Ztnfr12, análogos de Ztnfr12 (p.ej., anticuerpos anti-idiotipo anti-Ztnfr12), y proteínas de fusión de Ztnfr12) en un sujeto que carece de una cantidad adecuada de polipéptidos Ztnfr12, o que produce un exceso de ZTNF4. Los antagonistas de Ztnfr12 (p.ej., anticuerpos anti-Ztnfr12) se pueden usar también para tratar a un sujeto que produce un exceso de ZTNF4 o Ztnfr12. Estas moléculas se pueden administrar a cualquier sujeto que necesite el tratamiento, y la presente invención contempla los usos terapéuticos veterinarios y humanos. Los sujetos ilustrativos incluyen los sujetos mamíferos, tales como animales de granja, animales domésticos, y pacientes humanos. Se pueden usar polipéptidos Ztnfr12 humanos o murinos para estas aplicaciones.

Las moléculas que tienen actividad de Ztnfr12 se pueden usar para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, tumores de células B, inmunomodulación, EII, y cualquier patología mediada por anticuerpos (p.ej., ITCP, miastenia gravis y similares), enfermedades renales, respuesta inmunitaria de células T indirecta, rechazo de injertos, y enfermedad de injerto contra huésped. Los polipéptidos descritos en el presente documento se pueden dirigir a la regulación específica de las respuestas de las células B durante la respuesta inmunitaria. Además, los polipéptidos descritos en el presente documento se pueden usar para modular el desarrollo de las células B, el desarrollo de otras células, la producción de anticuerpos, y la producción de citocinas. Los polipéptidos descritos en el presente documento pueden modular también la comunicación de las células T y B mediante la neutralización de los efectos proliferativos de ZTNF4.

Los polipéptidos Ztnfr12 descritos en el presente documento pueden ser útiles para neutralizar el efecto de ZTNF4 para tratar leucemias de células B o pre-B, tales como leucemia de células plasmáticas, leucemia linfocítica crónica o aguda, mielomas tales como mieloma múltiple, mieloma de células plasmáticas, mieloma endotelial y osteoclastoma, y linfomas tales como linfoma no hodgkiniano, para los que hay asociado un incremento de los polipéptidos ZTNF4. Los ejemplos adicionales de los linfomas de células B que se pueden tratar con las moléculas descritas en el presente documento incluyen el linfoma de Burkitt, linfoma no Burkitt, linfoma folicular, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células grandes, linfoma de zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma de células grandes (p.ej., linfoma inmunoblástico), linfoma linfocítico pequeño, y otros linfomas de células B.

ZTNF4 se expresa en las células CD8^{+}, monocitos, células dendríticas, monocitos activados, lo que indica que, en ciertos trastornos autoinmunitarios, las células T citotóxicas podrían estimular la producción de células B por medio de la producción en exceso de ZTNF4. Las proteínas inmunosupresoras que bloquean de forma selectiva la acción de los linfocitos B serían útiles en el tratamiento de la enfermedad. La producción de autoanticuerpos es habitual en varias enfermedades autoinmunitarias, y contribuye a la destrucción tisular y al empeoramiento de la enfermedad. Los autoanticuerpos pueden llevar también a la existencia de complicaciones debidas a la deposición de complejos inmunitarios, y pueden llevar a muchos síntomas de lupus eritematoso sistémico, que incluyen insuficiencia renal, síntomas neurálgicos y muerte. La modulación de la producción de anticuerpos independiente de la respuesta celular sería beneficiosa también en muchos estados patológicos. También se ha demostrado que las células B desempeñan un papel en la secreción de inmunoglobulinas artritogénicas en la artritis reumatoide. Como tal, la inhibición de la producción de anticuerpos estimulados por ZTNF4 sería beneficiosa en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como miastenia gravis y artritis reumatoide. Los agentes terapéuticos inmunosupresores, tales como Ztnfr12 soluble que bloquea o neutraliza de forma selectiva la acción de los linfocitos B, sería útil para tal
propósito.

La memoria descriptiva describe métodos que emplean polipéptidos Ztnfr12, fusiones, anticuerpos, agonistas o antagonistas para bloquear o neutralizar de forma selectiva la acción de las células B asociada a enfermedades renales en fase terminal, que pueden o no estar asociadas a enfermedades autoinmunitarias. Tales métodos serían también útiles para el tratamiento de las enfermedades renales inmunológicas. Tales métodos serían útiles para el tratamiento de la glomerulonefritis asociada a enfermedades tales como nefropatía membranosa, nefropatía por IgA o enfermedad de Berger, nefropatía por IgM, enfermedad de Goodpasture, glomerulonefritis post-infecciosa, enfermedad mesangioproliferativa, leucemia linfoide crónica, síndrome nefrótico de cambio mínimo. Tales métodos servirían también como aplicaciones terapéuticas para el tratamiento de la glomerulonefritis secundaria o vasculitis asociada a enfermedades tales como lupus, poliarteritis, Henoch-Schonlein, esclerodermia, enfermedades relacionadas con el VIH, amiloidosis o síndrome urémico hemolítico. Los métodos descritos en el presente documento serían útiles también como parte de una aplicación terapéutica para el tratamiento de la nefritis intersticial o la pielonefritis asociada a pielonefritis crónica, abuso de analgésicos, nefrocalcinosis, nefropatía provocada por otros agentes, nefrolitiasis, o nefritis intersticial crónica o aguda.

Los métodos descritos en el presente documento incluyen también el uso de polipéptidos Ztnfr12, fusiones, anticuerpos, agonistas o antagonistas en el tratamiento de enfermedades hipertensivas o de los vasos sanguíneos grandes, que incluyen la estenosis u oclusión de la arteria renal y émbolos de colesterol o émbolos renales.

La presente memoria descriptiva describe métodos para el tratamiento de neoplasias urológicas o renales, mielomas múltiples, linfomas, neuropatía por cadenas ligeras o amiloidosis.

La memoria descriptiva describe métodos para bloquear o inhibir células B activadas mediante el uso de polipéptidos Ztnfr12, fusiones, anticuerpos, agonistas o antagonistas para el tratamiento del asma y otras enfermedades crónicas de las vías respiratorias tales como bronquitis y enfisema.

También se describen métodos para inhibir o neutralizar una respuesta de células T efectoras mediante el uso de polipéptidos Ztnfr12, fusiones, anticuerpos, agonistas o antagonistas para el uso en la inmunosupresión, en particular para el uso terapéutico para una enfermedad de injerto contra huésped y rechazo de injerto. Además, los polipéptidos Ztnfr12, fusiones, anticuerpos, agonistas o antagonistas serían útiles en protocolos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como diabetes mellitus insulinodependiente (DMID) y enfermedad de Crohn. Los métodos descritos en el presente documento tendrían un valor terapéutico adicional para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, en particular para disminuir el dolor articular, hinchazón, anemia y otros síntomas asociados, así como para tratar el choque séptico.

Los compuestos identificados como agonistas de Ztnfr12 son también útiles para potenciar la respuesta inmunitaria humoral. Las respuestas de células B son importantes para combatir enfermedades infecciosas, que incluyen las infecciones bacterianas, virales, protozoarias y parasitarias. Los anticuerpos contra los microorganismos infecciosos pueden inmovilizar al patógeno uniéndose a un antígeno, seguido de la lisis mediada por el complemento o el ataque mediado por células. Un agonista de Ztnfr12 serviría para potenciar la respuesta humoral, y sería un agente terapéutico útil para los individuos con riesgo de una enfermedad infecciosa, en un estado inmunocomprometido, o como complemento para la vacunación.

Hay disponibles modelos animales bien establecidos para analizar la eficacia in vivo de los polipéptidos Ztnfr12 solubles en ciertos estados patológicos. En particular, los polipéptidos Ztnfr12 solubles y los fragmentos de polipéptidos se pueden ensayar in vivo en varios modelos animales de enfermedad autoinmunitaria, tales como las cepas de ratones congénicos MRL-lpr/lpr o NZB x NZW F1, que sirven como modelo de LES (lupus eritematoso sistémico). Tales modelos animales se conocen en la técnica, y los modelos ilustrativos se describieron anteriormente, e incluyen los ratones NZBW que desarrollan una forma espontánea de LES, los modelos murinos para encefalomielitis alérgica experimental, el modelo murino de artritis inducida por colágeno, miastenia gravis autoinmunitaria murina experimental, y similares.

En general, la dosis de Ztnfr12 administrado (o de análogo o proteína de fusión de Ztnfr12) variará dependiendo de factores tales como la edad del sujeto, el peso, la altura, el sexo, la condición médica general y el historial médico previo. En general, es deseable proporcionar al receptor una dosis de polipéptido Ztnfr12 que esté en el intervalo de alrededor de 1 pg/kg a 10 mg/kg (cantidad de agente/peso corporal del sujeto), aunque también se puede administrar una dosis menor o mayor, según lo dicten las circunstancias.

La administración de un polipéptido Ztnfr12 a un sujeto puede ser intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, mediante perfusión por medio de un catéter regional, o mediante inyección intralesional directa. Cuando se administran proteínas terapéuticas mediante inyección, la administración puede ser mediante infusión continua o mediante inyecciones rápidas únicas o múltiples.

Las vías adicionales de administración incluyen la administración oral, a través de membranas mucosas, la pulmonar, y la transcutánea. La administración oral es adecuada para las microesferas de poliésteres, microesferas de ceínas, microesferas de proteinoides, microesferas de policianoacrilato, y sistemas basados en lípidos (véase, por ejemplo, DiBase y Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins", en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 255-288 (Plenum Press 1997)). La viabilidad de una administración intranasal se ejemplifica mediante un modo de administración de insulina (véase, por ejemplo, Hinchcliffe e Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)). Se pueden preparar partículas secas o líquidas que comprenden Ztnfr12 e inhalarlas con la ayuda de dispensadores de polvo seco, generadores de aerosoles líquidos, o nebulizadores (p.ej., Pettit y Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)). Esta aproximación se ilustra mediante el sistema de tratamiento de diabetes AERX, que es un inhalador electrónico manual que administra insulina en aerosol a los pulmones. Los estudios han demostrado que se han administrado proteínas de un tamaño de hasta 48.000 kDa a través de la piel a concentraciones terapéuticas con la ayuda de ultrasonidos de baja frecuencia, lo que ilustra la viabilidad de la administración transcutánea (Mitragotri et al., Science 269:850 (1995)). La administración transdérmica mediante el uso de electroporación proporciona otro medio para administrar una molécula que tiene actividad de unión de Ztnfr12 (Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)).

Se puede formular una composición farmacéutica que comprende una proteína, polipéptido, o péptido que tiene actividad de unión de Ztnfr12 según los métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, mediante los cuales las proteínas terapéuticas se combinan en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se dice que una composición es un "vehículo farmacéuticamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor. La solución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los expertos en la técnica conocen bien otros vehículos adecuados. Véase, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19ª edición (Mack Publishing Company 1995).

Para propósitos terapéuticos, las moléculas que tienen actividad de unión de Ztnfr12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administran a un paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Se dice que una combinación de una proteína, polipéptido, o péptido que tienen actividad de unión de Ztnfr12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administran en una "cantidad terapéuticamente eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor. Por ejemplo, un agente usado para tratar la inflamación es fisiológicamente significativo si su presencia alivia la respuesta inflamatoria. Como otro ejemplo, un agente usado para inhibir el crecimiento de células tumorales es fisiológicamente significativo si la administración del agente da como resultado una disminución del número de células tumorales, una metástasis disminuida, una disminución en el tamaño de un tumor sólido, o una necrosis incrementada de un tumor.

Una composición farmacéutica que comprende Ztnfr12 (o un análogo o proteína de fusión de Ztnfr12) se puede proporcionar en forma líquida, en aerosol, o en forma sólida. Las formas líquidas se ilustran mediante las soluciones inyectables y las suspensiones orales. Las formas sólidas ejemplares incluyen cápsulas, comprimidos, y formas de liberación controlada. Esta última forma se ilustra mediante bombas miniosmóticas e implantes (Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery", en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps", en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant", en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)).

Los liposomas proporcionan un medio para administrar polipéptidos terapéuticos a un sujeto de forma intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, subcutánea, o por medio de administración oral, inhalación, o administración intranasal. Los liposomas son vesículas microscópicas que consisten en una o más bicapas lipídicas que rodean compartimentos acuosos (véase, en general, Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1):S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993), y Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers", en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 3-24 (CRC Press 1995)). Los liposomas son similares en composición a las membranas celulares y, como resultado, se pueden administrar liposomas de forma segura, y son biodegradables. Dependiendo del método de preparación, los liposomas pueden ser unilamelares o multilamelares, y los liposomas pueden variar en tamaño, con diámetros que oscilan de 0,02 \mum a más de 10 \mum. Se puede encapsular una diversidad de agentes en liposomas: partición de agentes hidrófobos en las bicapas y partición de agentes hidrófilos dentro de el/los espacio(s) acuoso(s) interno(s) (véase, por ejemplo, Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987), y Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)). Además, es posible controlar la disponibilidad terapéutica del agente encapsulado variando el tamaño de los liposomas, el número de bicapas, la composición lipídica, así como la carga y las características superficiales de los liposomas.

Los liposomas se pueden absorber en prácticamente cualquier tipo de célula, y después liberan lentamente el agente encapsulado. De forma alternativa, un liposoma absorbido puede ser endocitado por las células que son fagocíticas. La endocitosis va seguida por la degradación intralisosómica de los lípidos liposómicos y la liberación de los agentes encapsulados (Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368 (1985)). Tras la administración intravenosa, los liposomas pequeños (0,1 a 1,0 \mum) son absorbidos en general por las células del sistema reticuloendotelial, localizadas principalmente en el hígado y el bazo, mientras los liposomas mayores de 3,0 \mum se depositan en el pulmón. Esta absorción preferente de los liposomas más pequeños por las células del sistema reticuloendotelial se ha usado para administrar agentes quimioterápicos a macrófagos y a tumores del hígado.

El sistema reticuloendotelial se puede evitar mediante varios métodos, que incluyen la saturación con grandes dosis de partículas liposomales, o la inactivación selectiva de los macrófagos por medios farmacológicos (Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984)). Además, se ha demostrado que la incorporación de fosfolípidos derivatizados con glicolípidos o polietilenglicol en las membranas de los liposomas da como resultado una absorción significativamente reducida por el sistema reticuloendotelial (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).

También se pueden preparar liposomas para seleccionar como objetivo células u órganos particulares variando la composición de fosfolípidos o insertando receptores o ligandos en los liposomas. Por ejemplo, se han usado liposomas, preparados con un contenido elevado de un tensoactivo no iónico, para seleccionar como objetivo el hígado (Hayakawa et al., patente japonesa 04-244.018; Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993)). Estas formulaciones se prepararon mezclando fosfatidilcolina de soja, \alpha-tocoferol, y aceite de ricino hidrogenado y etoxilado (HCO-60) en metanol, concentrando la mezcla al vacío, y después reconstituyendo la mezcla con agua. También se ha demostrado que una formulación liposómica de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) con una mezcla de esteroilglucósido derivado de soja (SG) y colesterol (Ch) selecciona como objetivo el hígado (Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997)).

De forma alternativa, se pueden unir diversos ligandos de selección del objetivo a la superficie de los liposomas, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, carbohidratos, vitaminas, y proteínas de transporte. Por ejemplo, se pueden modificar los liposomas con derivados de galactosil-lípidos de tipo ramificado para seleccionar como objetivo los receptores de asialoglicoproteína (galactosa), que se expresan exclusivamente en la superficie de las células hepáticas (Kato y Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)). De forma similar, Wu et al., Hepatology 27:772 (1998), han demostrado que el marcaje de los liposomas con asialofetuina condujo a una semivida plasmática acortada de los liposomas, y a una absorción enormemente incrementada de los liposomas marcados con asialofetuina por los hepatocitos. Por otra parte, la acumulación hepática de liposomas que comprenden derivados de galactosil-lípidos de tipo ramificado se puede inhibir mediante la preinyección de asialofetuina (Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)). Los liposomas de albúmina de suero humano poliaconitinilados proporcionan otra aproximación para dirigir los liposomas a las células hepáticas (Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997)). Además, Geho, et al. patente de EE.UU. nº 4.603.044, describe un sistema de administración de vesículas liposómicas dirigidas a los hepatocitos que tiene especificidad por los receptores hepatobiliares asociados a las células metabólicas especializadas del hígado. Además, se pueden usar componentes de anticuerpos anti-Ztnfr12 para dirigir a los liposomas hacia las células que expresan Ztnfr12, tales como las células tumorales originadas a partir de células B.

En una aproximación más general a la selección como objetivo de tejidos, las células objetivo se marcan previamente con anticuerpos biotinilados específicos para un ligando expresado por la célula objetivo (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)). Tras la eliminación del plasma del anticuerpo libre, se administran los liposomas conjugados a estreptavidina. En otra aproximación, los anticuerpos de selección del objetivo se unen directamente a los liposomas (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)).

Los polipéptidos que tienen actividad de unión de Ztnfr12 se pueden encapsular en liposomas mediante el uso de técnicas habituales de microencapsulación de proteínas (véase, por ejemplo, Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson et al., Cancer Res. 50:1853 (1990), y Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving et al. "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies", en Liposome Technology, 2ª edición, Vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef et al., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)). Como se indicó anteriormente, los liposomas terapéuticamente útiles pueden contener una diversidad de componentes. Por ejemplo, los liposomas pueden comprender derivados lipídicos de polietilenglicol (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).

Se han diseñado microesferas de polímeros degradables para mantener niveles sistémicos elevados de proteínas terapéuticas. Las microesferas se preparan a partir de polímeros degradables tales como poli(lactida-co-glicolida) (PLG), polianhídridos, poli(ortoésteres), polímeros de acetato de etilvinilo no biodegradables, en los que se encierran las proteínas en el polímero (Gombotz y Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery", en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos y Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery", en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281:1161 (1998); Putney y Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). Las nanoesferas revestidas con polietilenglicol (PEG) pueden proporcionar también vehículos para la administración intravenosa de proteínas terapéuticas (véase, por ejemplo, Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)).

La presente memoria descriptiva describe polipéptidos modificados químicamente que tienen actividad de unión de Ztnfr12 y antagonistas de Ztnfr12, en los que un polipéptido se une a un polímero como se describió anteriormente. Además, la presente memoria descriptiva describe composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que comprenden un vehículo, un polipéptido Ztnfr12, y al menos uno de un polipéptido BCMA y un polipéptido TACI, tal como se discutió anteriormente.

Los expertos en la técnica pueden idear otras formas de dosificación, tal como demuestran, por ejemplo, Ansel y Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5ª edición (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19ª edición (Mack Publishing Company 1995), y Ranade y Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996).

Las composiciones farmacéuticas se pueden suministrar en un equipo que comprende un recipiente que comprende un polipéptido con un dominio extracelular de Ztnfr12 o un antagonista de Ztnfr12 (p.ej., un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido Ztnfr12). Los polipéptidos terapéuticos se pueden proporcionar en forma de una solución inyectable para dosis únicas o múltiples, o como un polvo estéril que se reconstituirá antes de la inyección. De forma alternativa, tal equipo puede incluir un dispensador de polvo seco, un generador de aerosoles líquidos, o un nebulizador para la administración de un polipéptido terapéutico. Tal equipo puede comprender además información escrita sobre las indicaciones y el uso de la composición farmacéutica. Además, tal información puede incluir la indicación de que la composición de Ztnfr12 está contraindicada en pacientes con hipersensibilidad conocida hacia Ztnfr12.

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13. Usos Terapéuticos de las Secuencias de Nucleótidos de Ztnfr12

La presente memoria descriptiva describe el uso de secuencias de nucleótidos de Ztnfr12 para proporcionar Ztnfr12 a un sujeto que necesita tal tratamiento. Un aumento de la actividad de Ztnfr12 puede ser útil como parte de un tratamiento para enfermedades inmunosupresoras. Además, se puede proporcionar un vector de expresión terapéutico que inhiba la expresión del gen Ztnfr12, tal como una molécula complementaria, una ribozima, o una molécula de secuencia guía externa. La inhibición de la actividad de ZTNF4 se puede llevar a cabo introduciendo un vector de expresión que codifica una forma del receptor Ztnfr12 que no se une a ZTNF4, o que no produce una señal tras la unión a ZTNF4 (p.ej., debido a una mutación en el dominio intracelular de Ztnfr12). Para el uso terapéutico veterinario o el uso terapéutico humano, se pueden administrar tales moléculas de ácido nucleico a un sujeto que tiene un trastorno o enfermedad como se discutió anteriormente. Como ejemplo discutido anteriormente, las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión Ztnfr12-inmunoglobulina se pueden usar para el tratamiento a largo plazo de lupus eritematoso sistémico.

Existen numerosas aproximaciones para introducir un gen Ztnfr12 en un sujeto, que incluyen el uso de células hospedadoras recombinantes que expresan Ztnfr12, la administración de un ácido nucleico desnudo que codifica Ztnfr12, el uso de un vehículo lipídico catiónico con una molécula de ácido nucleico que codifica Ztnfr12, y el uso de virus que expresan Ztnfr12, tales como los retrovirus recombinantes, los virus adenoasociados recombinantes, los adenovirus recombinantes, y los virus Herpes simplex recombinantes (véase, por ejemplo, Mulligan, Science 260:926 (1993), Rosenberg et al., Science 242:1575 (1988), LaSalle et al., Science 259:988 (1993), Wolff et al., Science 247:1465 (1990), Breakfield y Deluca, The New Biologist 3:203 (1991)). En una aproximación ex vivo, por ejemplo, se aíslan células de un sujeto, se transfectan con un vector que expresa un gen Ztnfr12, y después se trasplantan al sujeto.

Para lograr la expresión del gen Ztnfr12, se construye un vector de expresión en el que una secuencia de nucleótidos que codifica el gen Ztnfr12 se une de forma operable a un promotor mínimo y opcionalmente a un elemento regulador para controlar la transcripción del gen. Los requerimientos generales de un vector de expresión se describieron anteriormente.

De forma alternativa, se puede administrar un gen Ztnfr12 mediante el uso de vectores virales recombinantes, que incluyen, por ejemplo, los vectores adenovirales (p.ej., Kass-Eisler et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:11498 (1993), Kolls et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:215 (1994), Li et al., Hum. Gene Ther. 4:403 (1993), Vincent et al., Nat. Genet. 5:130 (1993), y Zabner et al., Cell 75:207 (1993)), los vectores virales asociados a adenovirus (Flotte et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:10613 (1993)), los alfavirus tales como virus Semliki Forest y virus Sindbis (Hertz y Huang, J. Vir. 66:857 (1992), Raju y Huang, J. Vir. 65:2501 (1991), y Xiong et al., Science 243:1188 (1989)), vectores virales de herpes (p.ej., patentes de EE.UU. nºs 4.769.331, 4.859.587, 5.288.641 y 5.328.688), vectores de parvovirus (Koering et al., Hum. Gene Therap. 5:457 (1994)), vectores de poxvirus (Ozaki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193:653 (1993), Panicali y Paoletti, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:4927 (1982)), poxvirus, tales como el virus de la viruela del canario o el virus vaccinia (Fisher-Hoch et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:317 (1989), y Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86 (1989)), y retrovirus (p.ej., Baba et al., J. Neurosurg 79:729 (1993), Ram et al., Cancer Res. 53:83 (1993), Takamiya et al., J. Neurosci. Res 33:493 (1992), Vile y Hart, Cancer Res. 53:962 (1993), Vile y Hart, Cancer Res. 53:3860 (1993), y Anderson et al., patente de EE.UU. nº 5.399.346). En diversas realizaciones, se puede usar el propio vector viral, o una partícula viral que contiene el vector viral, en los métodos y composiciones descritas más adelante.

Como ilustración de un sistema, el adenovirus, un virus de ADN bicatenario, es un vector de transferencia génica bien caracterizado para la administración de una molécula de ácido nucleico heteróloga (para una revisión, véase Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994); Douglas y Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)). El sistema de adenovirus ofrece varias ventajas que incluyen: (i) la capacidad de acomodar insertos de ADN relativamente grandes, (ii) la capacidad de cultivo hasta un título elevado, (iii) la capacidad de infectar un amplio espectro de tipos celulares mamíferos, y (iv) la capacidad de ser usado con muchos promotores diferentes, que incluyen los promotores ubicuos, específicos de tejido, y regulables. Además, los adenovirus se pueden administrar mediante inyección intravenosa, porque los virus son estables en el torrente sanguíneo.

Mediante el uso de vectores de adenovirus en los que se delecionan porciones del genoma del adenovirus, se incorporan insertos en el ADN viral mediante ligadura directa o mediante recombinación homóloga con un plásmido co-transfectado. En un sistema ejemplar, el gen E1 esencial se deleciona del vector viral, y el virus no se replicará a menos que la célula hospedadora proporcione el gen E1. Cuando se administran de forma intravenosa a animales intactos, los adenovirus se dirigen principalmente hacia el hígado. Aunque un sistema de administración adenoviral con una deleción del gen E1 no se puede replicar en las células hospedadoras, el tejido del hospedador expresará y procesará la proteína heteróloga codificada. Las células hospedadoras secretarán también la proteína heteróloga si el gen correspondiente incluye una secuencia señal secretora. Las proteínas secretadas entrarán en la circulación desde el tejido que expresa el gen heterólogo (p.ej., el hígado muy vascularizado).

Además, se pueden usar vectores adenovirales que contienen diversas deleciones de los genes virales para reducir o eliminar las respuestas inmunitarias hacia el vector. Tales adenovirus tienen delecionado E1, y además, contienen deleciones de E2A o E4 (Lusky et al., J. Virol. 72:2022 (1998); Raper et al., Human Gene Therapy 9:671 (1998)). También se ha informado la deleción de E2b para reducir las respuestas inmunitarias (Amalfitano et al., J. Virol. 72:926 (1998)). Mediante la deleción del genoma del adenovirus completo, se pueden acomodar insertos muy grandes de ADN heterólogo. La generación de los adenovirus denominados "sin entrañas", en los que todos los genes virales están delecionados, es especialmente ventajosa para la inserción de insertos grandes de ADN heterólogo (para una revisión, véase Yeh. y Perricaudet, FASEB J. 11:615 (1997)).

Se pueden obtener disoluciones de reserva de título elevado de virus recombinantes capaces de expresar un gen terapéutico a partir de células mamíferas infectadas mediante el uso de métodos habituales. Por ejemplo, se puede preparar virus herpes simplex recombinante en células Vero, tal como escribió Brandt et al., J. Gen. Virol. 72:2043 (1991), Herold et al., J. Gen. Virol. 75:1211 (1994), Visalli y Brandt, Virology 185:419 (1991), Grau et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 30:2474 (1989), Brandt et al., J. Virol. Meth. 36:209 (1992), y Brown y MacLean (eds.), HSV Virus Protocols (Humana Press 1997).

De forma alternativa, se puede introducir un vector de expresión que comprende un gen Ztnfr12 en las células de un sujeto mediante lipofección in vivo con el uso de liposomas. Se pueden usar lípidos catiónicos sintéticos para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica un marcador (Felgner et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:7413 (1987); Mackey et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:8027 (1988)). El uso de lipofección para introducir genes exógenos en órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. Se pueden usar liposomas para dirigir la transfección hacia tipos celulares particulares, lo cual es especialmente ventajoso en un tejido con heterogeneidad celular, tal como el páncreas, el hígado, el riñón, y el cerebro. Los lípidos se pueden acoplar químicamente a otras moléculas con el fin de seleccionar el objetivo. Se pueden acoplar químicamente péptidos dirigidos (p.ej., hormonas o neurotransmisores), proteínas tales como anticuerpos, o moléculas no peptídicas, a los liposomas.

La electroporación es otro modo de administración alternativo. Por ejemplo, Aihara and Miyazaki, Nature Biotechnology 16:867 (1998), han demostrado el uso de la electroporación in vivo para la transferencia génica en el músculo.

En una aproximación alternativa a la terapia génica, un gen terapéutico puede codificar un ARN complementario de Ztnfr12 que inhibe la expresión de Ztnfr12. Las secuencias adecuadas para las moléculas complementarias pueden proceder de las secuencias de nucleótidos de Ztnfr12 descritas en el presente documento.

De forma alternativa, se puede construir un vector de expresión en el que un elemento regulador esté unido de forma operable a una secuencia de nucleótidos que codifica una ribozima. Se pueden diseñar ribozimas para expresar una actividad de endonucleasa que se dirija a una cierta secuencia seleccionada como objetivo en una molécula de ARNm (véase, por ejemplo, Draper y Macejak, patente de EE.UU. nº 5.496.698, McSwiggen, patente de EE.UU. nº 5.525.468, Chowrira y McSwiggen, patente de EE.UU. nº 5.631.359, y Robertson y Goldberg, patente de EE.UU. nº 5.225.337). En el contexto de la presente invención, las ribozimas incluyen secuencias de nucleótidos que se unen al ARNm de Ztnfr12.

En otra aproximación, se pueden construir vectores de expresión en los que un elemento regulador dirige la producción de transcritos de ARN capaces de favorecer la escisión mediada por RNasa P de las moléculas de ARNm que codifican un gen Ztnfr12. Según esta aproximación, se puede construir una secuencia guía externa para dirigir a la ribozima endógena, RNasa P, hacia una especie particular de ARNm intracelular, que se escinde posteriormente mediante la ribozima celular (véase, por ejemplo, Altman et al., patente de EE.UU. nº 5.168.053, Yuan et al., Science 263:1269 (1994), Pace et al., publicación internacional nº WO 96/18733, George et al., publicación internacional nº WO 96/21731, y Werner et al., publicación internacional nº WO 97/33991). Por ejemplo, la secuencia guía externa puede comprender una secuencia de diez a quince nucleótidos complementaria respecto del ARNm de Ztnfr12, y una secuencia de nucleótidos 3'-NCCA, en la que N es preferiblemente una purina. Los transcritos de la secuencia guía externa se unen a la especie de ARNm seleccionada como objetivo mediante la formación de pares de bases entre el ARNm y las secuencias guía externas complementarias, por lo que se favorece la escisión del ARNm mediante la RNasa P en el nucleótido localizado en el lado 5' de la región de bases emparejadas.

En general, la dosis de una composición que comprende un vector terapéutico que tiene una secuencia de nucleótidos de Ztnfr12, tal como un virus recombinante, variará dependiendo de factores tales como la edad del sujeto, el peso, la altura, el sexo, el estado médico general y el historial médico previo. Las vías de administración adecuadas de los vectores terapéuticos incluyen la inyección intravenosa, inyección intraarterial, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección intratumoral, e inyección en una cavidad que contiene un tumor. Como ilustración, Horton et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96:1553 (1999), demostró que la inyección intramuscular de ADN plasmídico que codifica interferón \alpha produce efectos antitumorales potentes en tumores primarios y metastásicos en un modelo murino.

Se puede formular una composición que comprende vectores virales, vectores no virales, o una combinación de vectores virales y no virales de la presente invención según los métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, mediante los cuales los vectores o virus se combinan en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se indicó anteriormente, se dice que una composición, tal como solución salina tamponada con fosfato, es un "vehículo farmacéuticamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un sujeto receptor. Los expertos en la técnica conocen bien otros vehículos adecuados (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995), y Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)).

Para fines terapéuticos, se administra un vector de expresión génica terapéutica, o un virus recombinante que comprende tal vector, y un vehículo farmacéuticamente aceptable a un sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz. Se dice que una combinación de un vector de expresión (o virus) y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administra en una "cantidad terapéuticamente eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado un cambio detectable en la fisiología de un sujeto receptor. Por ejemplo, un agente usado para tratar la inflamación es fisiológicamente significativo si su presencia alivia la respuesta inflamatoria. Como otro ejemplo, un agente usado para inhibir el crecimiento de las células tumorales es fisiológicamente significativo si la administración del agente da como resultado una disminución del número de células tumorales, una metástasis disminuida, una disminución del tamaño de un tumor sólido, o una necrosis incrementada de un tumor.

Cuando el sujeto tratado con un vector de expresión génica terapéutica o un virus recombinante es un humano, entonces la terapia es preferiblemente terapia génica de las células somáticas. Es decir, el tratamiento preferido de un humano con un vector de expresión génica terapéutica o con un virus recombinante no supone la introducción en las células de una molécula de ácido nucleico que pueda formar parte de una línea germinal humana y que se pase a las generaciones sucesivas (es decir, terapia génica de la línea germinal humana).

14. Inmunoconjugados Terapéuticamente Útiles

La presente memoria descriptiva describe el uso de anticuerpos anti-Ztnfr12 desnudos (o los fragmentos de anticuerpos desnudos de los mismos), así como el uso de inmunoconjugados para llevar a cabo el tratamiento de diversos trastornos, que incluyen las neoplasias de las células B, como se discutió anteriormente. Se pueden preparar inmunoconjugados mediante el uso de técnicas habituales. Por ejemplo, se pueden producir inmunoconjugados conjugando de forma indirecta un agente terapéutico a un componente de anticuerpo (véase, por ejemplo, Shih et al., Int. J. Cancer 41:832-839 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46:1101-1106 (1990); y Shih et al., patente de EE.UU. nº 5.057.313). Brevemente, una aproximación habitual implica hacer reaccionar un componente de anticuerpo que tiene una porción de carbohidrato oxidado con un polímero portador que tiene al menos una función amina libre y que se carga con una diversidad de fármacos, toxinas, agentes quelantes, moléculas de boro, y otro agente terapéuticos. Esta reacción da como resultado un enlace de base de Schiff (imina), que se puede estabilizar mediante la reducción hasta una amina secundaria para formar el conjugado final.

El polímero portador puede ser un aminodextrano o polipéptido de al menos 50 residuos de aminoácidos, aunque también se pueden usar otros portadores poliméricos sustancialmente equivalentes. Preferiblemente, el inmunoconjugado final es soluble en una disolución acuosa, tal como suero de mamífero, para facilitar la administración y una selección eficaz del objetivo para el uso en la terapia. Así, las funciones solubilizantes en el polímero portador incrementarán la solubilidad en suero del inmunoconjugado final.

En una aproximación alternativa para producir inmunoconjugados que comprenden un agente terapéutico polipeptídico, el agente terapéutico se acopla a aminodextrano mediante condensación con glutaraldehído o mediante reacción de los grupos carboxilo activados del polipéptido con las aminas del aminodextrano. Se pueden unir agentes quelantes a un componente de anticuerpo para preparar inmunoconjugados que comprenden radiometales o potenciadores de resonancia magnética. Los agentes quelantes ilustrativos incluyen los derivados de ácido etilendiamintetraacético y ácido dietilentriaminpentaacético. Se pueden unir moléculas de boro, tales como carboranos, a los componentes de anticuerpos mediante métodos convencionales.

Se pueden preparar también inmunoconjugados conjugando directamente un componente de anticuerpo con un agente terapéutico. El procedimiento general es análogo al método indirecto de conjugación, excepto en que se une directamente un agente terapéutico a un componente de anticuerpo oxidado.

Como ilustración adicional, un agente terapéutico se puede unir en la región de la bisagra de un componente de anticuerpo reducido por medio de la formación de enlaces disulfuro. Por ejemplo, se pueden construir péptidos de toxoide tetánico con un único residuo de cisteína que se usa para unir el péptido a un componente de anticuerpo. Como alternativa, tales péptidos se pueden unir al componente de anticuerpo mediante el uso de un espaciador heterobifuncional, tal como 3-(2-piridilditio)proprionato de N-succinilo. Yu et al., Int. J. Cancer 56:244 (1994). Los métodos generales para tal conjugación se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Wong, Chemistry Of Protein Conjugation And Cross-Linking (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods", en Monoclonal Antibodies: Principles And Applications, Birch et al. (eds.), páginas 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering And Clinical Application, Ritter et al. (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995).

Como se describió anteriormente, se pueden usar restos de carbohidratos en la región Fc de un anticuerpo para conjugar un agente terapéutico. Sin embargo, la región Fc no está presente si se usa un fragmento de anticuerpo como el componente de anticuerpo del inmunoconjugado. No obstante, es posible introducir un resto de carbohidrato en la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Véase, por ejemplo, Leung et al., J. Immunol. 154:5919 (1995); Hansen et al., patente de EE.UU. nº 5.443.953 (1995). El resto de carbohidrato modificado se usa después para unir un agente terapéutico.

Además, los expertos en la técnica reconocerán numerosas variaciones posibles de los métodos de conjugación. Por ejemplo, se puede usar el resto de carbohidrato para unir polietilenglicol para ampliar la semivida de un anticuerpo intacto, o fragmento de unión al antígeno del mismo, en la sangre, linfa, u otros líquidos extracelulares. Además, es posible construir un inmunoconjugado divalente uniendo agentes terapéuticos a un resto de carbohidrato y a un grupo sulfhidrilo libre. Tal grupo sulfhidrilo se puede localizar en la región de la bisagra del componente de anti-
cuerpo.

Un tipo de inmunoconjugado comprende un componente de anticuerpo y una citotoxina polipeptídica. Un ejemplo de una citotoxina polipeptídica adecuada es una proteína inactivante de ribosomas. Las proteínas inactivantes de ribosomas de tipo I son proteínas de cadena simple, mientras las proteínas inactivantes de ribosomas de tipo II consisten en dos subunidades no idénticas (cadenas A y B) unidas mediante un puente disulfuro (para una revisión, véase Soria et al., Targeted Diagn. Ther. 7:193 (1992)). Las proteínas de inactivación de ribosomas de tipo I útiles incluyen polipéptidos de Saponaria officinalis (p.ej., saporina-1, saporina-2, saporina-3, saporina-6), Momordica charantia (p.ej., momordina), Byronia dioica (p.ej., briodina, briodina-2), Trichosanthes kirilowii (p.ej., tricosantina, tricoquirina), Gelonium multiflorum (p.ej., gelonina), Phytolacca americana (p.ej., proteína antiviral de Phytolacca, proteína II antiviral de Phytolacca, proteína S antiviral de Phytolacca), Phytolacca dodecandra (p.ej., dodecandrina, proteína antiviral de Mirabilis), y similares. Las proteínas inactivantes de ribosomas se describen, por ejemplo, en Walsh et al., patente de EE.UU. nº 5.635.384.

Las proteínas inactivantes de ribosomas de tipo II adecuadas incluyen polipéptidos de Ricinus communis (p.ej., ricina), Abrus precatorius (p.ej., abrina), Adenia digitata (p.ej., modeccina), y similares. Debido a que las proteínas inactivantes de ribosomas de tipo II incluyen una cadena B que se une a galactósidos y una cadena A tóxica que despurina a la adenosina, los conjugados de proteína inactivante de ribosomas de tipo II deberían incluir la cadena A. Las proteínas inactivantes de ribosomas útiles adicionales incluyen bouganina, clavina, proteínas inactivantes de ribosomas del maíz, proteínas inactivantes de ribosomas de Vaccaria pyramidata, nigrina b, nigrina básica 1, ebulina, racemosina b, luffina-a, luffina-b, luffina-S, y otras proteínas inactivantes de ribosomas conocidas para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Bolognesi y Stirpe, publicación internacional nº WO98/55623, Colnaghi et al., publicación internacional nº WO97/49726, Hey et al., patente de EE.UU. nº 5.635.384, Bolognesi y Stirpe, publicación internacional nº WO95/07297, Arias et al., publicación internacional nº WO94/20540, Watanabe et al., J. Biochem. 106:6 977 (1989); Islam et al., Agric. Biol. Chem. 55:229 (1991), y Gao et al., FEBS Lett. 347:257 (1994).

Los análogos y las variantes de las proteínas inactivantes de ribosomas naturales son también adecuadas para las composiciones de selección de objetivo descritas en el presente documento, y los expertos en la técnica conocen tales proteínas. Se pueden producir proteínas inactivantes de ribosomas mediante el uso de secuencias de aminoácidos y de nucleótidos disponibles públicamente. Como ilustración, se describe una secuencia de nucleótidos que codifica saporina-6 en Lorenzetti et al., patente de EE.UU. nº 5.529.932, mientras Walsh et al., patente de EE.UU. nº 5.635.384, describe secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de proteínas inactivantes de ribosomas de maíz y cebada. Además, las proteínas inactivantes de ribosomas también están disponibles comercialmente.

Las citotoxinas de polipéptidos adicionales incluyen ribonucleasa, DNasa I, enterotoxina-A estafilocócica, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas, y endotoxina de Pseudomonas. Véase, por ejemplo, Pastan et al., Cell 47:641 (1986), y Goldenberg, CA - A Cancer Journal for Clinicians 44:43 (1994).

Otro tipo general de citotoxina útil es un inhibidor de tirosina quinasa. Debido a que se ha sugerido que la activación de la proliferación mediante tirosina quinasas desempeña un papel en el desarrollo y la progresión de tumores, esta activación se puede inhibir mediante componentes de anticuerpos anti-Ztnfr12 que administran inhibidores de tirosina quinasa. Los inhibidores de tirosina quinasa adecuados incluyen isoflavonas, tales como genisteína (5,7,4'-trihidroxiisoflavona), daidceína (7,4'-dihidroxiisoflavona), y biocanina A (4-metoxigenisteína), y similares. Los métodos para conjugar inhibidores de tirosina a un factor de crecimiento se describen, por ejemplo, en Uckun, patente de EE.UU. nº 5.911.995.

Otro grupo de citotoxinas polipeptídicas útiles incluye los inmunomoduladores. Como se usa en el presente documento, el término "inmunomodulador" incluye citocinas, factores de crecimiento de células pluripotenciales, linfotoxinas, moléculas co-estimuladoras, factores hematopoyéticos, y similares, así como los análogos sintéticos de estas moléculas. Los ejemplos de inmunomoduladores incluyen el factor de necrosis tumoral, interleucinas (p.ej., interleucina-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, e IL-21), factores estimulantes de colonias (p.ej., factor estimulante de colonias de granulocitos y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos), interferones (p.ej., interferones-\alpha, -\beta, -\gamma, -\omega, -\varepsilon, y -\tau), el factor de crecimiento de células pluripotenciales denominado "factor S1", eritropoyetina, y trombopoyetina. Los restos inmunomoduladores ilustrativos incluyen IL-2, IL-6, IL-10, interferón-\gamma, TNF-\alpha, y similares.

Los inmunoconjugados que incluyen un inmunomodulador proporcionan un medio para administrar un inmunomodulador a una célula seleccionada como objetivo, y son especialmente útiles contra las células tumorales. Los expertos en la técnica conocen bien los efectos citotóxicos de los inmunomoduladores. Véase, por ejemplo, Klegerman et al., "Lymphokines and Monokines", en Biotechnology And Pharmacy, Pessuto et al. (eds.), páginas 53-70 (Chapman & Hall 1993). Como ilustración, los interferones pueden inhibir la proliferación celular induciendo una expresión incrementada de antígenos de histocompatibilidad de clase I en la superficie de diversas células, y así incrementan la velocidad de destrucción de las células por los linfocitos T citotóxicos. Además, se cree que los factores de necrosis tumoral, tales como el factor de necrosis tumoral \alpha, producen los efectos citotóxicos mediante la inducción de la fragmentación del ADN.

La presente memoria descriptiva describe inmunoconjugados que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica una citotoxina. Como ejemplo de esta aproximación, Hoganson et al., Human Gene Ther. 9:2565 (1998), describe la administración mediada por FGF-2 de un gen de saporina mediante la producción de un conjugado FGF-2-polilisina que se condensó con un vector de expresión que comprendía un gen de saporina.

Los expertos en la técnica conocen otras toxinas adecuadas.

Se pueden preparar conjugados de polipéptidos citotóxicos y componentes de anticuerpos mediante el uso de técnicas habituales para la conjugación de polipéptidos. Por ejemplo, Lam y Kelleher, patente de EE.UU. nº 5.055.291, describe la producción de anticuerpos conjugados al fragmento A de la toxina de difteria o de toxina de ricino. La aproximación general se ilustra también mediante los métodos para la conjugación de factor de crecimiento de fibroblastos con saporina, como se describe en Lappi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:917 (1989), Soria et al., Targeted Diagn. Ther. 7:193 (1992), Buechler et al., Eur. J. Biochem. 234:706 (1995), Behar-Cohen et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 36:2434 (1995), Lappi y Baird, patente de EE.UU. nº 5.191.067, Calabresi et al., patente de EE.UU. nº 5.478.804, y Lappi y Baird, patente de EE.UU. nº 5.576.288. Véase también, Ghetie y Vitteta, "Chemical Construction of Immunotoxins", en Drug Targeting: Strategies, Principles, and Applications, Francis y Delgado (Eds.), páginas 1-26 (Humana Press, Inc. 2000), Hall (Ed.), Immunotoxin Methods and Protocols (Humana Press, Inc. 2000), y Newton y Rybak, "Construction of Ribonuclease-Antibody Conjugates for Selective Cytotoxicity", en Drug Targeting: Strategies, Principles, and Applications, Francis y Delgado (Eds.), páginas 27-35 (Humana Press, Inc. 2000).

De forma alternativa, se pueden producir proteínas de fusión que comprenden un componente de anticuerpo y un polipéptido citotóxico mediante el uso de métodos habituales. Los métodos para preparar proteínas de fusión que comprenden un resto de polipéptido citotóxico se conocen bien en la técnica de la producción de proteínas de fusión anticuerpo-toxina. Por ejemplo, las proteínas de fusión de anticuerpos que comprenden un resto de interleucina-2 se describen en Boleti et al., Ann. Oncol. 6:945 (1995), Nicolet et al., Cancer Gene Ther. 2:161 (1995), Becker et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93:7826 (1996), Hank et al., Clin. Cancer Res. 2:1951 (1996), y Hu et al., Cancer Res. 56:4998 (1996). Además, Yang et al., Hum. Antibodies Hybridomas 6:129 (1995), describe una proteína de fusión que incluye un fragmento F(ab')_{2} y un resto de factor de necrosis tumoral \alpha. Se han descrito las proteínas de fusión anticuerpo-exotoxina A de Pseudomonas en Chaudhary et al., Nature 339:394 (1989), Brinkmann et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:8616 (1991), Batra et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:5867 (1992), Friedman et al., J. Immunol. 150:3054 (1993), Wels et al., Int. J. Can. 60:137 (1995), Fominaya et al., J. Biol. Chem. 271:10560 (1996), Kuan et al., Biochemistry 35:2872 (1996), y Schmidt et al., Int. J. Can. 65:538 (1996). Se han descrito proteínas de fusión anticuerpo-toxina que contienen un resto de toxina de difteria en Kreitman et al., Leukemia 7:553 (1993), Nicholls et al., J. Biol. Chem. 268:5302 (1993), Thompson et al., J. Biol. Chem. 270:28037 (1995), y Vallera et al., Blood 88:2342 (1996). Deonarain et al., Tumor Targeting 1:177 (1995), ha descrito una proteína de fusión anticuerpo-toxina que tiene un resto de RNasa, mientras Linardou et al., Cell Biophys. 24-25:243 (1994), produjo una proteína de fusión anticuerpo-toxina que comprendía un componente de DNasa I. Se usó la gelonina como el resto de toxina en la proteína de fusión anticuerpo-toxina de Better et al., J. Biol. Chem. 270:14951 (1995). Como ejemplo adicional, Dohlsten et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:8945 (1994), informó de una proteína de fusión anticuerpo-toxina que comprendía enterotoxina A estafilocócica. Véase también, Newton y Rybak, "Preparation of Recombinant RNase Single-Chain Antibody Fusion Proteins", en Drug Targeting: Strategies, Principles, and Applications, Francis y Delgado (Eds.), páginas 77-95 (Humana Press, Inc. 2000).

Como alternativa a una citotoxina polipeptídica, los inmunoconjugados pueden comprender un radioisótopo como resto citotóxico. Por ejemplo, un inmunoconjugado puede comprender un componente de anticuerpo anti-Ztnfr12 y un radioisótopo emisor de partículas \alpha, un radioisótopo emisor de partículas \beta, un radioisótopo emisor de partículas \gamma, un emisor de electrones Auger, un agente de captura de neutrones que emite partículas \alpha, o un radioisótopo que se desintegra mediante captura de electrones. Los radioisótopos adecuados incluyen ^{198}Au, ^{199}Au, ^{32}P, ^{33}P, ^{125}I, ^{131}I, ^{123}I, ^{90}Y, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{67}Cu, ^{211}At, ^{47}Sc, ^{103}Pb, ^{109}Pd, ^{212}Pb, ^{71}Ge, ^{77}As, ^{105}Rh, ^{113}Ag, ^{119}Sb, ^{121}Sn, ^{131}Cs, ^{143}Pr, ^{161}Tb, ^{177}Lu, ^{191}Os, ^{193M}Pt, ^{197}Hg, y similares.

Se puede unir un radioisótopo a un componente de anticuerpo directamente o indirectamente, por medio de un agente quelante. Por ejemplo, ^{67}Cu, que proporciona partículas \beta y rayos \gamma, se puede conjugar a un componente de anticuerpo mediante el uso del agente quelante, ácido p-bromoacetamido-bencil-tetraetilaminotetraacético. Chase y Shapiro, "Medical Applications of Radioisotopes", en Gennaro (Ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, páginas 843-865 (Mack Publishing Company 1995). Como alternativa, se puede acoplar ^{90}Y, que emite una partícula \beta energética, a un componente de anticuerpo mediante el uso de ácido dietilentriaminopentaacético. Además, un método adecuado ejemplar para el marcaje radioactivo directo de un componente de anticuerpo con ^{131}I se describe en Stein et al., Antibody Immunoconj. Radiopharm. 4:703 (1991). De forma alternativa, se pueden unir moléculas de boro, tales como carboranos, a los componentes de anticuerpos mediante el uso de técnicas habituales.

Otro tipo de citotoxina adecuada para la preparación de inmunoconjugados es un fármaco quimioterápico. Los fármacos quimioterápicos ilustrativos incluyen las mostazas nitrogenadas, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas, triazenos, análogos del ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, antibióticos, epipodofilotoxinas, complejos de coordinación de platino, y similares. Los ejemplos específicos de fármacos quimioterápicos incluyen metotrexato, doxorrubicina, daunorrubicina, citosinarabinósido, cis-platino, vindesina, mitomicina, bleomicina, melfalan, clorambucilo, maitansinoides, calicheamicina, taxol, y similares. Los agentes quimioterápicos adecuados se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición (Mack Publishing Co. 1995), y en Goodman And Gilman's The Pharmacological Basis Of Therapeutics, 9ª Ed. (MacMillan Publishing Co. 1995). Los expertos en la técnica conocen otros agentes quimioterápicos adecuados.

En otra aproximación, se preparan inmunoconjugados conjugando agentes o colorantes fotoactivos con un componente de anticuerpo. Se han usado agentes fluorescentes y otros cromógenos, o colorantes, tales como porfirinas sensibles a la luz visible, para detectar y tratar lesiones dirigiendo la luz adecuada a la lesión. Este tipo de "fotorradiación", "fototerapia", o terapia "fotodinámica" se describe, por ejemplo, en Mew et al., J. Immunol. 130:1473 (1983), Jori et al. (eds.), Photodynamic Therapy Of Tumors And Other Diseases (Libreria Progetto 1985), Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8744 (1986), van den Bergh, Chem. Britain 22:430 (1986), Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. 288:471 (1989), Tatsuta et al., Lasers Surg. Med. 9:422 (1989), y Pelegrin et al., Cancer 67:2529 (1991).

Los inmunoconjugados usados para la terapia pueden comprender restos poliméricos hidrosolubles farmacéuticamente aceptables. Los expertos en la técnica conocen los métodos para unir tales polímeros, y se han descrito previamente.

Las aproximaciones descritas anteriormente se pueden usar también para preparar composiciones de anticuerpos multiespecíficos que comprenden un inmunoconjugado. Las citotoxinas polipeptídicas se pueden conjugar también con un polímero soluble mediante el uso de los métodos anteriores antes o después de la conjugación a un componente de anticuerpo. Los polímeros solubles se pueden conjugar también con proteínas de fusión de anticuerpos.

En general, los inmunoconjugados anti-Ztnfr12 se pueden administrar como se discutió previamente con respecto a los usos terapéuticos de los polipéptidos Ztnfr12. Se pueden complementar los anticuerpos anti-Ztnfr12 desnudos, o fragmentos de anticuerpos, con la administración de inmunoconjugados o de proteínas de fusión de anticuerpos. En una variación, se administran anticuerpos anti-Ztnfr12 desnudos (o fragmentos de anticuerpos desnudos) con anticuerpos anti-Ztnfr12 o fragmentos de anticuerpos radiomarcados a dosis bajas. Como segunda alternativa, se administran anticuerpos anti-Ztnfr12 desnudos (o fragmentos de anticuerpos) con inmunoconjugados anticuerpo anti-Ztnfr12-citocinas radiomarcados a dosis bajas. Como tercera alternativa, se administran anticuerpos anti-Ztnfr12 desnudos (o fragmentos de anticuerpos) con inmunoconjugados anti-Ztnfr12-citocinas que no están radiomarcados. Con respecto a las "dosis bajas" de inmunoconjugados marcados con ^{131}I, una dosis preferible está en el intervalo de 15 a 40 mCi, mientras el intervalo más preferible es de 20 a 30 mCi. En contraste, una dosis preferida de inmunoconjugados marcados con ^{90}Y está en el intervalo de 10 a 30 mCi, mientras el intervalo más preferible es de 10 a 20 mCi. De forma similar, se pueden complementar los componentes de anticuerpos biespecíficos con la administración de inmunoconjugados o de proteínas de fusión de anticuerpos.

Los inmunoconjugados que tienen un portador cargado con moléculas de boro para la terapia de activación con neutrones térmicos se realizarán normalmente de una manera similar. Sin embargo, será ventajoso esperar hasta que se eliminen los inmunoconjugados que no hayan alcanzado su objetivo antes de llevar a cabo la irradiación con neutrones. La eliminación se puede acelerar mediante el uso de un anticuerpo que se une al inmunoconjugado. Véase la pat. de EE.UU. nº 4.624.846 para una descripción de este principio general.

La presente memoria descriptiva describe un método de tratamiento en el que se administran inmunomoduladores para prevenir, mitigar o invertir la toxicidad inducida por radiación o inducida por fármacos en las células normales, y especialmente en las células hematopoyéticas. La terapia inmunomoduladora adyuvante permite la administración de dosis mayores de agentes citotóxicos debido a la tolerancia incrementada del mamífero receptor. Además, la terapia inmunomoduladora adyuvante puede prevenir, paliar o invertir la toxicidad en la médula limitante de la dosis. Los ejemplos de inmunomoduladores adecuados para la terapia adyuvante incluyen el factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, trombopoyetina, IL-1, IL-3, IL-12, y similares. El método de terapia inmunomoduladora adyuvante se describe en Goldenberg, pat. de EE.UU. nº 5.120.525.

Se pueden analizar los anticuerpos anti-Ztnfr12 y los inmunoconjugados mediante el uso de las aproximaciones in vitro y los modelos animales descritos anteriormente para el estudio de los polipéptidos Ztnfr12 y de las proteínas de fusión de Ztnfr12.

La eficacia de la terapia con anticuerpos anti-Ztnfr12 se puede incrementar complementando los componentes de anticuerpos desnudos con inmunoconjugados y otras formas de terapia complementaria descritas en el presente documento. En tales regímenes multimodales, las composiciones terapéuticas complementarias se pueden administrar antes, simultáneamente o después de la administración de los anticuerpos anti-Ztnfr12 desnudos. Las terapias multimodales de la presente invención incluyen además la inmunoterapia con componentes de anticuerpos anti-Ztnfr12 desnudos complementados con la administración de inmunoconjugados anti-Ztnfr12. En otra forma de terapia multimodal, los sujetos reciben anticuerpos anti-Ztnfr12 desnudos y la quimioterapia habitual contra el cáncer.

Se pueden suministrar composiciones farmacéuticas en forma de un equipo que comprende un recipiente que comprende componentes de anticuerpos anti-Ztnfr12, o componentes de anticuerpos biespecíficos. Se pueden proporcionar moléculas terapéuticas en forma de una solución inyectable para dosis simples o múltiples, o en forma de un polvo estéril que se reconstituirá antes de la inyección. De forma alternativa, tal equipo puede incluir un dispensador de polvo seco, un generador de aerosol líquido, o un nebulizador para la administración de un componente de anticuerpo anti-Ztnfr12. Tal equipo puede comprender además información escrita sobre las indicaciones y el uso de la composición farmacéutica. Además, tal información puede incluir la indicación de que la composición está contraindicada en pacientes con hipersensibilidad conocida hacia los anticuerpos exógenos.

15. Producción de Ratones Transgénicos

Se pueden modificar ratones transgénicos para sobreexpresar el gen Ztnfr12 en todos los tejidos, o bajo el control de un elemento regulador específico de tejido o preferido por un tejido. Se pueden usar estos ratones sobreproductores de Ztnfr12 para caracterizar el fenotipo resultante de la sobreexpresión, y los animales transgénicos pueden servir como modelos para una enfermedad humana provocada por un exceso de Ztnfr12. Los ratones transgénicos que sobreexpresan Ztnfr12 proporcionan también modelos de biorreactores para la producción de Ztnfr12, tal como Ztnfr12 soluble, en la leche o la sangre de animales mayores. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para producir ratones transgénicos (véase, por ejemplo, Jacob, "Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice", en Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), páginas 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994), Monastersky y Robl (eds.), Strategies in Transgenic Animal Science (ASM Press 1995), y Abbud y Nilson, "Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice", en Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernandez y Hoeffler (eds.), páginas 367-397 (Academic Press, Inc. 1999)).

Por ejemplo, un método para producir un ratón transgénico que expresa un gen Ztnfr12 puede comenzar con machos adultos fértiles (sementales) (B6C3f1, 2-8 meses de vida (Taconic Farms, Germantown, NY)), machos vasectomizados (capones) (B6D2f1, 2-8 meses, (Taconic Farms)), hembras fértiles prepubescentes (donantes) (B6C3f1, 4-5 semanas, (Taconic Farms)) y hembras fértiles adultas (receptoras) (B6D2f1, 2-4 meses, (Taconic Farms)). Los donantes se aclimatan durante una semana, y después se les inyectan aproximadamente 8 UI/ratón de gonadotropina sérica de yegua preñada (Sigma Chemical Company; St. Louis, MO) I.P., y 46-47 horas más tarde, 8 UI/ratón de gonadotropina coriónica humana (hCG (Sigma)) I.P. para inducir una superovulación. Los donantes se aparean con los sementales después de las inyecciones hormonales. La ovulación se da generalmente dentro de las 13 horas desde la inyección de hCG. La copulación se confirma mediante la presencia de un tapón vaginal la mañana después del apareamiento.

Se recogen los huevos fertilizados bajo un microscopio quirúrgico. Se recogen los oviductos, y los huevos se liberan en portaobjetos de análisis urinario que contienen hialuronidasa (Sigma). Los huevos se lavan una vez en hialuronidasa, y dos veces en medio W640 de Whitten (descrito, por ejemplo, por Menino y O'Claray, Biol. Reprod. 77:159 (1986), y Dienhart y Downs, Zygote 4:129 (1996)) que se ha incubado con un 5% de CO_{2}, 5% de O_{2}, y un 90% de N_{2} a 37ºC. Los huevos se almacenan después en un incubador a 37ºC/5% de CO_{2} hasta la microinyección.

Se linealizan de diez a veinte microgramos de ADN plasmídico que contiene una secuencia que codifica Ztnfr12, se purifican en un gel, y se resuspenden en Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), EDTA 0,25 mM (pH 8,0), a una concentración final de 5-10 nanogramos por microlitro para la microinyección. Por ejemplo, las secuencias que codifican Ztnfr12 pueden codificar un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:2, que comprenden los residuos de aminoácidos 1 a 79 de SEQ ID Nº:2, o que comprenden los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID Nº:13.

El ADN plasmídico se microinyecta en los huevos recogidos contenidos en una gota de medio W640 cubierta por aceite mineral caliente y equilibrado con CO_{2}. El ADN se coloca en una aguja de inyección (accionada desde un capilar de vidrio de borosilicato de 1 mm de DE y 0,75 mm de DI), y se inyecta en huevos individuales. Se penetra en cada huevo con la aguja de inyección, en uno o ambos de los pronúcleos aploides.

Se inyectan picolitros de ADN en los pronúcleos, y la aguja de inyección se retira sin que entre en contacto con los nucleolos. El procedimiento se repite hasta haber realizado la inyección en todos los huevos. Los huevos microinyectados con éxito se transfieren a una placa de cultivo de tejidos de órganos con medio W640 pregasificado para su almacenamiento durante la noche en un incubador a 37ºC/5% de CO_{2}.

Al siguiente día, se transfieren los embriones de dos células a las receptoras pseudopreñadas. Las receptoras se identifican por la presencia de tapones de copulación, tras haber copulado con los capones vasectomizados. Las receptoras se anestesian y se afeitan en el lado dorsal izquierdo, y se transfieren a un microscopio quirúrgico. Se realiza una pequeña incisión en la piel y a través de la pared muscular en la parte media del área abdominal perfilada por la caja torácica, el costado y la pata trasera, en la mitad entre la rodilla y el bazo. Los órganos reproductivos se extraen sobre un paño quirúrgico pequeño. La capa grasa se retira sobre el paño quirúrgico, y se une un fórceps pequeño (Roboz, Rockville, MD) a la capa grasa y se deja colgando sobre el lomo del ratón, evitando que los órganos se deslicen de nuevo hacia el interior.

Con una pipeta de transferencia fina que contiene aceite mineral seguido por W640 y burbujas de aire alternantes, se transfieren 12-17 embriones sanos de dos células de la inyección del día anterior a la receptora. Se localiza la ampolla hinchada, y manteniendo el oviducto entre la ampolla y la bolsa, se hace una hendidura en el oviducto con una aguja de 0,32 mm cerca de la bolsa, asegurándose de no rasgar la ampolla o la bolsa.

La pipeta se transfiere a la hendidura del oviducto, y se inyectan los embriones, dejando que la primera burbuja de aire escape de la pipeta. La capa grasa se empuja suavemente hacia el peritoneo, y los órganos reproductores se dejan deslizar hacia dentro. Se cierra la pared peritoneal con una sutura, y la piel se cierra con una grapa para heridas. Los ratones se recuperan sobre una placa caliente a 37ºC durante un mínimo de cuatro horas.

Las receptoras se devuelven a las jaulas por parejas, y se permite una gestación de 19-21 días. Tras el nacimiento, se permiten 19-21 días posparto antes del destete. Se identifica el sexo de las crías y se colocan en jaulas por sexos separados, y se recorta una biopsia de 0,5 cm (usada para el genotipado) de la cola con tijeras limpias.

Se prepara ADN genómico a partir de los cortes de las colas mediante el uso, por ejemplo, de un equipo DNEASY de QIAGEN siguiendo las instrucciones del fabricante. Se analiza el ADN genómico mediante PCR con el uso de cebadores diseñados para amplificar un gen Ztnfr12 o un gen marcador seleccionable que se introdujo en el mismo plásmido. Después de confirmar que los animales son transgénicos, se retrocruzan para producir una cepa endogámica colocando una hembra transgénica con un macho de tipo natural, o un macho transgénico con una o dos hem-
bra(s) de tipo natural. A medida que las crías nacen y se destetan, se separan por sexos, y se cortan las colas para el
genotipado.

Para comprobar la expresión de un transgén en un animal vivo, se lleva a cabo una hepatectomía parcial. Se hace una preparación quirúrgica del abdomen superior directamente por debajo del apéndice xifoides. Mediante el uso de una técnica estéril, se realiza una incisión pequeña de 1,5-2 cm por debajo del esternón, y se extrae el lóbulo lateral izquierdo del hígado. Mediante el uso de seda 4-0, se realiza un nudo alrededor del lóbulo inferior asegurándolo fuera de la cavidad corporal. Se usa una grapa atraumática para mantener el nudo, mientras se coloca un segundo lazo de Dexón absorbible (American Cyanamid; Wayne, N.J.) en posición proximal respecto del primer nudo. Se realiza un corte distal desde el nudo de Dexón, y se colocan aproximadamente 100 mg del tejido hepático extirpado en una placa Petri estéril. El corte de hígado extirpado se transfiere a un tubo de fondo redondo de polipropileno de 14 ml, y se congela rápidamente en nitrógeno líquido y después se almacena con hielo seco. La zona quirúrgica se cierra con sutura y grapas para heridas, y la jaula del animal se coloca en una placa calefactora a 37ºC durante 24 horas de forma postoperatoria. El animal se comprueba diariamente de forma postoperatoria, y las grapas para heridas se eliminan 7-10 días tras la cirugía. Se examina el nivel de expresión de ARNm de Ztnfr12 para cada ratón transgénico mediante el uso de un ensayo de hibridación de disolución de ARN o reacción en cadena de la polimerasa.

Además de producir ratones transgénicos que sobreexpresan Ztnfr12, es útil modificar ratones transgénicos con una expresión anormalmente baja o inexistente del gen. Tales ratones transgénicos proporcionan modelos útiles para las enfermedades asociadas a la carencia de Ztnfr12. Como se discutió anteriormente, la expresión del gen Ztnfr12 se puede inhibir mediante el uso de genes complementarios, genes de ribozimas, o genes con secuencias guía externas. Para producir los ratones transgénicos que infra-expresan el gen Ztnfr12, tales secuencias inhibidoras se dirigen hacia el ARNm de Ztnfr12. Los expertos en la técnica conocen los métodos para producir ratones transgénicos que tienen una expresión anormalmente baja de un gen particular (véase, por ejemplo, Wu et al., "Gene Underexpression in Cultured Cells and Animals by Antisense DNA and RNA Strategies", en Methods in Gene Biotechnology, páginas 205-224 (CRC Press 1997)).

Una aproximación alternativa para producir ratones transgénicos que tienen poca o ninguna expresión del gen Ztnfr12 es generar ratones que tienen al menos un alelo normal de Ztnfr12 sustituido por un gen Ztnfr12 que no es funcional. Un método para diseñar un gen Ztnfr12 que no es funcional es insertar otro gen, tal como un gen marcador seleccionable, dentro de una molécula de ácido nucleico que codifica Ztnfr12. Los expertos en la técnica conocen los métodos habituales para producir estos "ratones con genes inactivados" (véase, por ejemplo, Jacob, "Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice", en Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), páginas 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994), y Wu et al., "New Strategies for Gene Knockout", en Methods in Gene Biotechnology, páginas 339-365 (CRC Press 1997)).

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Ejemplo 1

Aislamiento de una Molécula de Ácido Nucleico que Codifica Ztnfr12

Este estudio usó una línea de células precursoras linfoides B humanas, denominada "Reh" (ATCC No. CRL-8286). Se preparó una biblioteca de cADN a partir de las células Reh, y se ordenó mediante el uso de dieciséis placas de 96 pocillos. Cada pocillo contuvo alrededor de 250 colonias de E. coli, y cada colonia contenía un clon de cADN. Se prepararon minipreparaciones de ADN en un formato de 96 pocillos mediante el uso del equipo Qiaprep96 Turbo (Qiagen, Inc.; Valencia, CA). El ADN se dividió después en 128 mezclas que representaban 3000 clones cada una. Estas mezclas se transfectaron en células COS-7 en placas de 12 pocillos, y las mezclas positivas se determinaron mediante unión de ZTNF4 en la superficie celular.

La transfección de las células COS se llevó a cabo como sigue. Se mezclaron cinco microlitros de ADN mezclado (alrededor de 0,5-1,0 \mug) y 5 \mul de lipofectamina en 92 \mul de medio DMEM exento de suero (55 mg de piruvato sódico, 146 mg de L-glutamina, 5 mg de transferrina, 2,5 mg de insulina, 1 \mug de selenio, y 5 mg de fetuina en 500 ml de DMEM), se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos, y después se añadieron 400 \mul de medio DMEM exento de suero. Se añadieron quinientos microlitros de esta mezcla a 1,5x10^{5} células COS/pocillo colocadas en placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos pretratadas con fibronectina, y las células se incubaron durante 5 horas a 37ºC. Después, se añadieron 500 \mul de medio FBS DMEM del 20% (100 ml de FBS, 55 mg de piruvato sódico, y 146 mg de L-glutamina en 500 ml de DMEM) por pocillo, y las células se incubaron durante la noche.

El ensayo de unión a la superficie celular se llevó a cabo mediante el uso de ZTNF4 marcado con FLAG biotinilado como sigue. Se eliminaron los medios de las células con un 1% de BSA/PBS, y las células se bloquearon durante 1 hora con TNB (Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,15 M, y 0,5% de reactivo bloqueante - equipo NEN Renaissance TSA-Direct, nº de cat. NEL701 - en H_{2}O). Después, las células se incubaron durante 1 hora con 3 \mug/ml de ZTNF4 marcado con FLAG biotinilado en TNB. Las células se lavaron con un 1% de BSA/PBS, y después se incubaron durante otra hora con estreptavidina-HRP diluido 1:300 (equipo NEN) en TNB. Las células se lavaron con un 1% de BSA/PBS y después se fijaron durante 15 minutos con un 1,8% de formaldehído en PBS. A continuación, las células se lavaron con TNT (Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,15 M, y 0,05% de Tween-20 en agua). La unión se detectó incubando las células durante cuatro a cinco minutos con un reactivo de fluoresceína-tiramida diluido 1:50 en tampón de dilución (equipo NEN). Las células se lavaron con TNT, y se conservaron con medios de montaje VECTASHIELD (Vector Labs; Burlingame, CA) diluidos 1:5 en TNT. Las células se visualizaron mediante el uso de un filtro de FITC en un microscopio de fluorescencia.

Una de las mezclas de ADN positivas, "10A11", se identificó mediante el uso del método descrito anteriormente. La mezcla de ADN 10A11 se insertó mediante electroporación en E. coli DH10B, y las colonias se recogieron del filtro y se lavaron. El DNA aislado de E. coli se transfectó después en células COS, y la mezcla de ADN positiva "4D" se identificó mediante el uso del ensayo de unión de ZTNF4. Las colonias de la mezcla 4D se transfirieron a una placa de 96 pocillos, y se aisló el ADN mediante el uso del equipo Qiaprep96 Turbo. El clon positivo 4D2H-6 se identificó mediante el uso del método mencionado anteriormente. Para ensayar la especificidad de la unión de ZTNF4, el ADN del clon 4D2H-6 se transfectó en células COS, y se ensayó la unión de ZTNF4 y ZTNF2. Aunque ZTNF4 se une a las células COS transfectadas con el ADN de 4D2H-6, ZTNF2 no se unió a las células. En contraste, tanto ZTNF4 como ZTNF2 se unieron a las células COS transfectadas con ADN de TACI.

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Ejemplo 2

Expresión del Gen Ztnfr12 en Tejidos Humanos y Murinos

Se llevó a cabo un análisis de transferencia de Northern mediante el uso de transferencias de múltiples tejidos humanos (MTN I, MTN II, y MTN III) (CLONTECH Laboratories, Inc.; Palo Alto, CA), transferencia del sistema inmunitario humano (CLONTECH), transferencia de ARNm normal humano (Invitrogen, San Diego, CA) y transferencias de múltiples tejidos fetales humanos (CLONTECH). Se generó una sonda humana de 570 pares de bases mediante PCR con los oligonucleótidos 37550 (5' GCGAATTCGTCGGCACCATGAGGCGAGGG 3'; SEQ ID Nº:10) y 37549 (5' CGCTCGAGCTGCCGGCTCCCTGCTATTGTTG 3'; SEQ ID Nº: 11), en las siguientes condiciones de reacción: 94ºC durante 2 minutos; 35 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 30 segundos; seguido de 72ºC durante 5 minutos. El fragmento de PCR se purificó en gel mediante el uso de un equipo de extracción de geles QIAQUICK (QIAGEN, Inc.; Santa Clarita, CA). La sonda se marcó radiactivamente con ^{32}P mediante el uso del sistema de marcaje de ADN REDIPRIME II (AMERSHAM, Inc.; R.U.) según las indicaciones del fabricante. La sonda se purificó mediante el uso de una columna NUCTRAP (Stratagene; La Jolla, CA). Se usó una disolución EXPRESSHYB (CLONTECH) como disolución de hibridación para las transferencias. La hibridación tuvo lugar durante la noche a 65ºC.

Las transferencias se lavaron después cuatro veces con SSC 2x y un 0,05% de SDS a temperatura ambiente, seguido de dos lavados en SSC 0,1x y un 0,1% de SDS a 50ºC. Se detectó un transcrito con un tamaño de aproximadamente 4,4 kilobases.

También se examinaron transferencias de tumores con la transferencia de tumor de útero humano (Invitrogen, San Diego, CA), transferencias del panel de tumores humanos 4 y 5 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA), transferencia de linfoma humano (Invitrogen), transferencia de líneas de células cancerosas humanas (CLONTECH) y una transferencia de leucemia humana. Las transferencias en mancha se analizaron también mediante el uso de una transferencia de expresión de múltiples tejidos humanos (CLONTECH) y una transferencia de cribado de genes de cáncer humano (Biochain Institute, Inc.; Hayward, CA). Los métodos y las condiciones para los análisis de transferencia en mancha fueron los mismos que para las transferencias de múltiples tejidos discutidas anteriormente.

Se observó la expresión del gen Ztnfr12 en el bazo, nódulo linfático, linfocitos de sangre periférica, riñón, corazón, hígado, músculo esquelético, páncreas, glándula suprarrenal, testículo, cerebro, útero, estómago, médula ósea, tráquea, timo, placenta, hígado fetal y células Raji. Las señales más intensas se asociaron al tejido esplénico, tejido de nódulo linfático, y en la sangre periférica.

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Ejemplo 3

Expresión del Gen Ztnfr12 en Líneas Celulares

Se usó RT-PCR TAQMAN (Applied Biosystems; Foster City, CA) para examinar adicionalmente la expresión del gen Ztnfr12, así como de los genes TACI y BCMA. En estos estudios, se usó la expresión de \beta-glucuronidasa o gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa humanas endógenas como controles. Se compararon los niveles de ARN de Ztnfr12, TACI, y BCMA respecto de los niveles de ARN de estos genes de control.

Como se muestra en la Tabla 6, los resultados indicaron que Ztnfr12 se expresa principalmente de forma exclusiva en las células del linaje B. En particular, la expresión del gen Ztnfr12 se observó en las líneas de células de linfoma B transformadas, tales como las células derivadas de linfoma de Burkitt (p.ej., células RAMOS, células DAUDI, células RAJI, células BJAB, y células HS Sultan), células derivadas de linfoma no hodgkiniano (células RL), células de leucemia linfoblástica de células B (células IM9, SUP-B15, y REH), y las líneas de células de linfoma de células B, DOHH-2, y WSU-NHL. En contraste, no fue detectable la expresión del gen Ztnfr12 en las células de linfoma agudo de células T (Jurkat), células de leucemia monocítica (THP-1 y U937), células de leucemia promielocítica (HL-60), y células de leucemia mielógena crónica (K562).

Estos resultados indican que la proteína Ztnfr12 podría proporcionar un objetivo útil en la terapia con anticuerpos monoclonales contra el linfoma de Burkitt, linfoma no hodgkiniano, leucemia linfoblástica aguda, y una diversidad de otros linfomas de células B. La expresión de Ztnfr12 es también bastante elevada en muchas de estas líneas celulares, en comparación con los niveles de expresión de los receptores similares. Por ejemplo, BCMA parece expresarse principalmente en las células plasmáticas.

TABLA 6 Expresión Génica de Ztnfr12, TACI y BCMA

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Ejemplo 4

Construcción y Expresión de una Proteína de Fusión Ztnfr12-Fc A. Construcción del Fragmento Ig \gamma1

Para preparar la proteína de fusión Ztnfr12-Fc4, se modificó la región Fc de IgG1 humana (la región de la bisagra y los dominios CH_{2} y CH_{3}) para eliminar las funciones de unión al receptor de Fc\gamma1 (Fc\gammaRI) y al complemento (C1q). Esta versión modificada de Fc de IgG1 humana se denominó "Fc4".

Se aisló la región Fc a partir de una PCR de una biblioteca de hígado fetal humano (Clontech) mediante el uso de los cebadores oligonucleotídicos 5' ATCAGCGGAA TTCAGATCTT CAGACAAAAC TCACACATGC CCAC 3' (SEQ ID Nº:15) y 5' GGCAGTCTCT AGATCATTTA CCCGGAGACA GGGAG 3' (SEQ ID Nº:16). Se presentan las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de una región constante de \gamma1 humana de tipo natural en SEQ ID Nºs:17 y 18, respectivamente. Se introdujeron mutaciones en la región Fc mediante PCR para reducir la unión a Fc\gammaRI. El sitio de unión a Fc\gammaRI (Leu-Leu-Gly-Gly; residuos de aminoácidos 38 a 41 de SEQ ID Nº:18, que corresponden a las posiciones del índice EU 234 a 237) se mutó hasta Ala-Glu-Gly-Ala para reducir la unión a Fc\gammaR1 (véase, por ejemplo, Duncan et al., Nature 332:563 (1988); Baum et al., EMBO J. 13:3992 (1994)). Se usaron los cebadores oligonucleotídicos 5' CCGTGCCCAG CACCTGAAGC CGAGGGGGCA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC C 3' (SEQ ID Nº:19) y 5' GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A 3' (SEQ ID Nº:20) para introducir la mutación. Hasta un volumen final de 50 \mul, se añadieron 570 ng de molde de IgFc, 5 \mul de tampón de reacción Pfu 10x (Stratagene), 8 \mul de dNTPs 1,25 mM, 31 \mul de agua destilada, 2 \mul de cebadores oligonucleotídicos 20 mM. Se añadió un volumen igual de aceite mineral, y la reacción se calentó a 94ºC durante un minuto. Se añadió Pfu polimerasa (2,5 unidades, Stratagene) seguido de 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante un minuto seguido por una extensión de siete minutos a 72ºC. Los productos de la reacción se fraccionaron mediante electroforesis, y se detectó la banda que correspondía al tamaño predicho de alrededor de 676 pares de bases. Esta banda se cortó del gel y se recuperó mediante el uso de un equipo de extracción de geles QIAQUICK de QIAGEN (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Este fragmento se denominó secuencia de IgFc mutada en el sitio de unión a Fc\gammaRI.

También se usó la PCR para introducir una mutación de Ala a Ser (residuo de aminoácido 134 de SEQ ID Nº:18, que corresponde a la posición del índice EU 330) y de Pro a Ser (residuo de aminoácido 135 de SEQ ID Nº:18, que corresponde a la posición del índice EU 331) para reducir la unión a C1q del complemento o la fijación del complemento (Duncan y Winter, Nature 332:788 (1988)). Se llevaron a cabo dos primeras rondas de reacciones mediante el uso de la secuencia de IgFc mutada en el sitio de unión a Fc\gammaRI como molde. Hasta un volumen final de 50 \mul, se añadió 1 \mul de molde de IgFc mutada en el sitio de unión a Fc\gammaRI, 5 \mul de tampón de reacción Pfu 10x (Stratagene), 8 \mul de dNTPs 1,25 mM, 31 \mul de agua destilada, 2 \mul de 5' GGTGGCGGCT CCCAGATGGG TCCTGTCCGA GCC
CAGATCT TCAGACAAAA CTCAC 3' (SEQ ID Nº:21) 20 mM, un cebador de 5' que comienza en el nucleótido 36 de SEQ ID Nº:17, y 2 \mul de 5' TGGGAGGGCT TTGTTGGA 3' (SEQ ID Nº:22) 20 mM, un cebador de 3' que comienza en el complemento del nucleótido 405 de SEQ ID Nº:17. La segunda reacción contuvo 2 \mul de cada disolución de mezcla 20 mM de los cebadores oligonucleotídicos 5' TCCAACAAAG CCCTCCCATC CTCCATCGAG AAAACCATCT CC 3' (SEQ ID Nº:23), un cebador de 5' que comienza en el nucleótido 388 de SEQ ID Nº:17 y 5' GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG 3' (SEQ ID Nº:24), un cebador de 3', para introducir la mutación de Ala a Ser, un sitio de restricción XbaI y un codón de parada. Se añadió un volumen igual de aceite mineral y las reacciones se calentaron a 94ºC durante un minuto. Se añadió Pfu polimerasa (2,5 unidades, Stratagene) seguido de 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 2 minutos seguido de una extensión de siete minutos a 72ºC. Los productos de la reacción se fraccionaron mediante electroforesis, y se detectaron las bandas que correspondían a los tamaños predichos, de alrededor de 370 y alrededor de 395 pares de bases respectivamente. Las bandas se cortaron del gel y se extrajeron con un equipo de extracción de geles QIAQUICK de QIAGEN (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.

Se llevó a cabo una segunda ronda de reacciones para unir los fragmentos anteriores y añadir el sitio de restricción BamHI en 5' y una secuencia señal de la región variable de la cadena pesada JBL 2'C_{L} de inmunoglobulina humana (Cogne et al., Eur. J. Immunol. 18:1485 (1988)). Hasta un volumen final de 50 \mul, se añadieron 30 \mul de agua destilada, 8 \mul de dNTPs 1,25 mM, 5 \mul de tampón de reacción 10x de la Pfu polimerasa (Stratagene) y 1 \mul de cada uno de los dos primeros productos de PCR. Se añadió un volumen igual de aceite mineral, y la reacción se calentó a 94ºC durante un minuto. Se añadió Pfu polimerasa (2,5 unidades, Stratagene) seguido de cinco ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 2 minutos. La temperatura se llevó de nuevo a 94ºC, y se añadieron 2 \mul de cada una de las disoluciones de reserva de 5' GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG 3' (SEQ ID Nº:25) 20 mM, un cebador de 5' que comienza en el nucleótido 1 de SEQ ID Nº:17 que introduce un sitio de restricción BamHI, y 5' GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A 3' (SEQ ID Nº:26) seguido de 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante dos minutos, y una extensión final de siete minutos a 72ºC. Se visualizó una porción de la reacción mediante el uso de electroforesis en gel. Se detectó una banda de 789 pares de bases que correspondía al tamaño predicho. El resto del fragmento de PCR de Fc mutado se digirió con las enzimas de restricción BamHI y XbaI. El fragmento digerido se clonó y se verificó mediante análisis de la secuencia. El Fc mutado se denominó "Fc4." Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de Fc4 se proporcionan como SEQ ID Nºs:27 y 28, respectivamente.

El segmento de fusión de Ig denominado "Fc5" se generó mediante el uso de PCR para amplificar el segmento de fusión de Ig Fc4 con los cebadores oligonucleotídicos 5' GAGCCCAAAT CTTCAGACAA AACTCACACA TGCCCA 3' (SEQ ID Nº:29) y 5' TAATTGGCGC GCCTCTAGAT TATTTACCCG GAGACA 3' (SEQ ID Nº:30). Las condiciones de la amplificación mediante PCR fueron las siguientes. Hasta un volumen final de 50 \mul, se añadieron 236 ng de molde de Fc4, 5 \mul de tampón de reacción de Pfu 10x, 4 \mul de dNTPs 2,5 mM, 1 \mul de 20 \muM de cada uno de los cebadores y 1 \mul de Pfu polimerasa (2,5 unidades, Stratagene). El perfil térmico de la amplificación consistió en 94ºC durante 2 minutos, 5 ciclos a 94ºC durante 15 segundos, 42ºC durante 20 segundos, 72ºC durante 45 segundos, 20 ciclos a 94ºC durante 15 segundos, 72ºC durante un minuto 20 segundos, seguido por una extensión de siete minutos a 72ºC. El producto de la reacción se sometió a electroforesis en un gel de agarosa preparativa, y se detectó la banda que correspondía al tamaño predicho de 718 pb. La banda se cortó del gel y se recuperó mediante el uso de un equipo de extracción de geles QIAQUICK de QIAGEN (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El fragmento Fc mutado se clonó y se verificó mediante análisis de la secuencia. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de Fc5 se proporcionan como SEQ ID Nºs:31 y 32, respectivamente.

B. Construcción del Vector de Expresión de Ztnfr12-Fc5

Se generó un casete de expresión que codifica una proteína Ztnfr12-tcs-Fc5 mediante PCR solapante (Horton et al., Gene 77:61 (1989)) con el uso de un cADN de una secuencia señal de la región variable de la cadena pesada de una inmunoglobulina de ratón (Ig VH), un cADN de Ztnfr12, y un fragmento de ADN de Fc5 como moldes para la PCR. El término "tcs" indica la presencia de un sitio de escisión de trombina entre el segmento de Ztnfr12 y el segmento de Fc5.

La primera ronda de amplificaciones mediante PCR consistió en cuatro reacciones distintas que generaron los cuatro productos de PCR (denominados productos 1, 2, 3, y 4 de la primera ronda de PCR) a usar en la segunda ronda, la PCR solapante.

Los productos 1, 2, 3, y 4 de la primera ronda de PCR se generaron por separado mediante el uso de distintos cebadores oligonucleotídicos y moldes de ADN. Hasta un volumen final de 25 \mul, se añadieron aproximadamente 2 ng de ADN molde, 2,5 \mul de tampón de reacción de la Pfu Polimerasa 10x (Stratagene), 2 \mul de dNTPs 2,5 mM, 2,5 \mul de Rediload (ReGen; Huntsville, AL), 20 pmoles de cada cebador oligonucleotídico de 5' y 3' (véase más adelante), y 0,5 \mul de Pfu polimerasa (2,5 unidades, Stratagene). La reacción para generar el producto 4 de la primera ronda de PCR incluyó también la adición de 2,5 \mul de reactivo GC-Melt (Clontech). La información sobre los moldes y los cebadores usados en las amplificaciones mediante PCR se proporciona en las Tablas 7 y 8.

TABLA 7 Moldes y Cebadores Usados en la Primera Ronda de Amplificación Mediante PCR

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TABLA 8 Secuencias Oligonucleotídicas

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El perfil térmico de la amplificación consistió en 94ºC durante 3 minutos, 30 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 2 minutos, seguido por una extensión de 4 minutos a 72ºC. Los productos de la reacción se fraccionaron mediante el uso de una electroforesis en gel de agarosa, y las bandas que correspondían a los tamaños predichos se cortaron del gel y se recuperaron mediante el uso de un equipo de extracción de geles QIAQUICK de QIAGEN (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.

La segunda ronda de amplificación mediante PCR, o reacción de amplificación mediante PCR solapante, se llevó a cabo mediante el uso de los fragmentos purificados a partir del gel de la primera ronda de PCR como moldes de ADN. Las condiciones de la segunda ronda de amplificación mediante PCR fueron las siguientes. Hasta un volumen final de 50 \mul, se añadió 1 \mul de cada uno de los productos 1, 2, 3, y 4 de la primera ronda de PCR, 5 \mul de tampón de reacción de Pfu Polimerasa 10x (Stratagene), 4 \mul de dNTPs 2,5 mM, 5 \mul de Rediload (ResGen), 5 \mul de reactivo GC-Melt (Clontech), aproximadamente 40 pmoles de cada uno de ZC38.989, ZC38.874 y 0,5 \mul de Pfu Polimerasa (2,5 unidades, Stratagene). El perfil térmico de la amplificación consistió en 94ºC durante 3 minutos, 35 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72 ºC durante 3 minutos, seguido por una extensión de 6 minutos a 72ºC. El producto de la reacción, denominado "Ztnfr12-tcs-Fc5 PCR", se fraccionó mediante el uso de una electroforesis en gel de agarosa, y la banda que correspondía al tamaño predicho se cortó del gel y se recuperó mediante el uso de un equipo de extracción de geles QIAQUICK de QIAGEN (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.

El producto Ztnfr12-tcs-Fc5 PCR se clonó mediante el uso del equipo de clonación ZEROBLUNT TOPO PCR de Invitrogen siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante, y se verificó la secuencia de ADN. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de Ztnfr12-tcs-Fc5 se proporcionan como SEQ ID Nºs:41 y 42, respectivamente. En SEQ ID Nº:42, la secuencia señal VH 26-10 murina está representada por los residuos de aminoácidos 1 a 19, un dominio extracelular de Ztnfr12 está representado por los residuos de aminoácidos 20 a 90 (es decir, los residuos de aminoácidos 1 a 71 de SEQ ID Nº:2), el sitio de escisión de trombina está representado por los residuos de aminoácidos 91 a 96, y el resto de inmunoglobulina Fc5 está representado por los residuos de aminoácidos 97 a 328.

El plásmido que codificaba Ztnfr12-tcs-Fc5 de secuencia verificada se digirió con FseI y AscI para liberar el segmento codificante. El fragmento FseI - AscI se ligó en un vector de expresión de mamíferos que contenía un promotor de citomegalovirus (CMV), un segmento de poli A de SV40, y el gen de dihidrofolato reductasa murino.

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Ejemplo 5

Producción de Proteínas Ztnfr12-Fc Mediante Células de Ovario de Hámster Chino

Se usó la construcción de expresión Ztnfr12-Fc5 para transfectar, por medio de electroporación, células DG44 de ovario de hámster chino (CHO) adaptadas a una suspensión cultivadas en medio exento de proteínas animales (Urlaub et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555 (1986)). Las células DG44 de CHO carecen de un gen dihidrofolato reductasa funcional debido a deleciones en ambas localizaciones cromosómicas de dihidrofolato reductasa. El cultivo de las células en presencia de concentraciones incrementadas de metotrexato da como resultado la amplificación del gen dihidrofolato reductasa, y del gen que codifica la proteína recombinante en la construcción de expresión.

Las células DG44 de CHO se pasaron a medios PFCHO (JRH Biosciences, Lenexa, KS), L-Glutamina 4 mM (JRH Biosciences), y complemento de hipoxantina-timidina 1x (Life Technologies), y las células se incubaron a 37ºC y 5% de CO_{2} en matraces de agitación Corning a 120 RPM en una plataforma de agitación rotatoria. Las células se transfectaron por separado con plásmidos de expresión linealizados. Para asegurar la esterilidad, se llevó a cabo una única etapa de precipitación con etanol en hielo durante 25 minutos combinando 200 \mug de ADN plasmídico en un tubo Eppendorf con 20 \mul de ADN portador de esperma de salmón fragmentado (5' \rightarrow 3' Inc. Boulder, CO, 10 mg/ml), 22 \mul de NaOAc 3 M (pH 5,2), y 484 \mul de etanol del 100% (Gold Shield Chemical Co., Hayward, CA). Tras la incubación, el tubo se centrifugó a 14.000 RPM en una microcentrífuga colocada en una habitación refrigerada a 4ºC, se eliminó el sobrenadante y el sedimento se lavó dos veces con 0,5 ml de etanol del 70%, y se dejó secar al aire.

Las células DG44 de CHO se prepararon mientras el sedimento de ADN se estaba secando centrifugando un total de 10^{6} células (16,5 ml) en un tubo de centrífuga cónico de 25 ml a 900 RPM durante cinco minutos. Las células DG44 de CHO se resuspendieron en un volumen total de 300 \mul de medio de cultivo PFCHO, y se colocaron en una cubeta Gene-Pulser con una separación de electrodo de 0,4 cm (Bio-Rad). El ADN, después de un tiempo de secado de aproximadamente 50 minutos, se resuspendió en 500 \mul de medio de cultivo PFCHO y se añadió a las células en la cubeta, de forma que el volumen total no excedió 800 \mul, y se dejó asentar a temperatura ambiente durante cinco minutos para disminuir la formación de burbujas. La cubeta se colocó en una unidad Gene Pulser II de BioRad ajustada a 0,296 kV (kilovoltios) y 0,950 HC (capacitancia elevada), y se sometió a electroporación inmediatamente.

Las células se incubaron cinco minutos a temperatura ambiente antes de colocarlas en un volumen total de 20 ml de medio PFCHO en un matraz T-75 de CoStar. El matraz se colocó a 37ºC y un 5% de CO_{2} durante 48 horas, y después se contaron las células mediante un hemocitómetro utilizando exclusión de azul tripán, y se colocaron en medios de selección PFCHO sin complemento de hipoxantina-timidina y que contenían metotrexato 200 mM (Cal Biochem). Tras la recuperación del proceso de selección mediante metotrexato, los medios condicionados que contenían las proteínas Ztnfr12-Fc5 secretadas se examinaron mediante análisis de transferencia de Western.

En un estudio, se purificaron las proteínas de fusión como sigue. Se clarificaron diez litros de medios condicionados de células CHO y se filtraron de forma estéril haciéndolas pasar a través de un filtro de 0,22 \mum. La muestra de medio filtrado se aplicó después a una columna de proteína A de 72 ml (Poros 50A) para la captura de la molécula objetivo Ztnfr12-Fc5. El material que fluyó a través de la columna de la aplicación original se reprocesó dos veces en la columna de proteína A para aumentar la recuperación máxima. El análisis de SDS-PAGE no reductora indicó que el material unido recuperado en esta etapa fue multimérico y dimérico. Tras el fraccionamiento con una SDS-PAGE reductora, solamente se observó una proteína de fusión monomérica que tenía un peso molecular de 36 kD. La mezcla recuperada de la especie Ztnfr12-Fc5 se aplicó después a una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex-200 (318 ml) para purificar adicionalmente e intercambiar el tampón del material. Esta etapa proporcionó la resolución del material dimérico del material multimérico.

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Ejemplo 6

Caracterización de las Proteínas de Fusión Ztnfr12-Fc

Se llevó a cabo una degradación de Edman para identificar el extremo N-terminal de la proteína de fusión Ztnfr12-Fc. Los resultados indican que se digirió el extremo N-terminal, y que el primer aminoácido fue Ser^{7}.

Se digirió Ztnfr12-Fc con trombina mediante el uso de técnicas habituales. Brevemente, la digestión con trombina se llevó a cabo mediante la adición de trombina en una proporción 1:25 en peso respecto de la proteína, e incubando a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se detuvo mediante la inyección inmediata en una columna de HPLC de fase inversa para la parte de separación mediante LC del análisis. El eluato de la columna de fase inversa se dirigió hacia un espectrómetro de masas LCQ, y se recogieron los datos de MS y MS/MS. Cada digestión se analizó con y sin reducción, y se identificaron los picos que se observó que se recuperaban de forma diferencial mediante análisis de coincidencia de masas y de confirmación de secuencias (MS/MS) cuando fue posible. La digestión con trombina de la proteína identificó la presencia de los dos sitios de escisión siguientes en el dominio de Ztnfr12 además del sitio modificado: Arg^{39} - Thr^{40}, y Arg^{54} - Thr^{55}.

Debido a la resistencia a proteasas del dominio Fc, no se pudieron observar modificaciones mediante glicosilación en esa parte de la proteína. El único carbohidrato unido a N predicho está en el dominio Fc en Asn^{159}.

Sin embargo, se observaron numerosos O-glicanos heterogéneos unidos al dominio de Ztnfr12. La estructura completamente formada de estos O-glicanos es coherente con los O-glicanos previamente caracterizados hallados en las proteínas producidas de forma recombinante en las células CHO, y es un tetra-sacárido de la forma (N-acetil hexosamina)-(ácido N-acetil neurámico (es decir, ácido siálico))-(hexosa)-(ácido N-acetil neurámico). La forma más predominante observada es el tri-sacárido, (N-acetil hexosamina)-(hexosa)-(ácido N-acetil neurámico). Se observó que cada sitio estaba ocupado parcialmente y heterogéneamente con múltiples formas del carbohidrato, que variaban desde una única N-acetil hexosamina hasta el tetra-sacárido completamente formado. Debido a la heterogeneidad de los carbohidratos y a la naturaleza incompleta de este análisis, no fue posible proporcionar una asignación clara del porcentaje de ocupación de los sitios. Los residuos que se observó que se modificaron en cierto grado fueron Thr^{17}, Thr^{40}, Ser^{49}, Ser^{50}, Thr^{55}, y Ser^{62}. Estas modificaciones de carbohidratos distinguen esta proteína de fusión de TACI-Fc, que tiene solamente un único carbohidrato unido en N en el dominio Fc.

Se inmovilizó Ztnfr12-Fc5 en una placa revestida con anti-Fc de IgG humana de cabra, y se incubó con ZTNF4-biotina. Los resultados de este estudio demostraron que Ztnfr12-Fc5 se une a ZTNF4. Los estudios adicionales demostraron que Ztnfr12-Fc5 inhibió la proliferación de las células de la sangre periférica humana, que se habían co-activado con ZTNF4 soluble e IL-4 humano recombinante, y que Ztnfr12-Fc5 inhibió la unión de ZTNF4-biotina al receptor TACI soluble.

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Ejemplo 7

Expresión en Baculovirus de Ztnfr12 Soluble

Se diseñó un vector de expresión, pZBV37L:sTNFR12cee, para expresar el polipéptido Ztnfr12 soluble (residuos de aminoácidos 1 a 71 de SEQ ID Nº:2) con un marcador "EE" C-terminal (EYMPMD; SEQ ID Nº:45), tras la escisión del péptido señal.

A. Construcción de pZBV37L:sTNFR12cee

Se generó un fragmento sTNFR12cee de 257 pares de bases que contenía sitios de restricción BspeI y XbaI en los extremos 5' y 3', respectivamente, mediante amplificación con PCR a partir de un plásmido que contenía cADN de Ztnfr12, mediante el uso de los cebadores 5' ATGCATTCCG GAATGAGGCG AGGGCCCCGG AGCCTG 3' (SEQ ID Nº:43) y 5' ATGCATTCTA GATCAGTCCA TCGGCATGTA TTCCGCCGCC TCGCCGGCCC CCGC 3' (SEQ ID Nº:44). Las condiciones de la reacción de PCR fueron las siguientes, mediante el uso del sistema de PCR Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim) para un volumen de reacción de 100 \mul que contenía un 10% de DMSO: 1 ciclo a 94ºC durante 2 minutos; 35 ciclos a 94ºC durante 15 segundos, 50ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 45 segundos; 1 ciclo a 72ºC durante 5 min; seguido por 4ºC. Se visualizaron cinco microlitros de la mezcla de reacción mediante electroforesis en gel (agarosa del 1% de NuSieve). El resto de la mezcla de reacción se purificó por medio de un equipo de purificación de PCR de Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante, y se eluyó en 30 \mul de agua. El cADN se digirió en un volumen de 35 \mul mediante el uso de BspeI y XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA) en condiciones de tampón adecuado durante 1 h a 37ºC. La banda del producto de PCR digerido se sometió a electroforesis en un gel de un 1% de agarosa TAE, se cortó y se extrajo mediante un equipo de extracción de geles QIAQUICK (Qiagen) y se eluyó en 30 \mul de agua. El producto de PCR sTNFR12cee purificado y digerido se ligó en el MCS de un vector pZBV37L preparado previamente y digerido con enzimas de restricción (BspeI y XbaI).

El vector pZBV37L es una modificación del vector de expresión PFASTBAC1 (Life Technologies), en el que el promotor de polihedrina se ha eliminado y se ha sustituido con el promotor de la proteína básica de activación tardía y la secuencia señal líder EGT en posición 5' respecto del sitio de clonación múltiple. Se ligaron cinco microlitros de sTNFR12cee digerido con enzimas de restricción y alrededor de 50 ng del vector pZBV37L correspondiente durante la noche a 16ºC en un volumen de 20 \mul en condiciones de tampón adecuado. Se transformaron cinco microlitros de la mezcla de ligadura en 50 \mul de células ELECTOMAX DH12S (Life Technologies) mediante electroporación a 400 Ohmios, 2 V y 25 \muF en una cubeta de electroporación con un hueco de 2 mm (BTX). Las células transformadas se diluyeron en 350 \mul de medios SOC (2% de Bacto Triptona, 0,5% de extracto Bacto Yeast, 10 ml de NaCl 1 M, KCl 1,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM y glucosa 20 mM), se incubaron durante una hora a 37ºC, y se colocaron 50 \mul de la dilución en placas LB que contenían 100 \mug/ml de ampicilina.

Los clones se analizaron mediante PCR y digestión de restricción. Se seleccionaron los clones positivos, se colocaron en placas y se enviaron a secuenciar. Se confirmó una secuencia apropiada, se transformaron 25 ng del ADN del clon positivo en 100 \mul de células competentes DH10BAC MAX EFFICIENCY (GIBCO-BRL) mediante choque térmico durante 45 segundos en un bloque calefactor a 42ºC. Las células DH10BAC transformadas se diluyeron en 900 \mul de medios SOC (2% de Bacto Triptona, 0,5% de extracto Bacto Yeast, 10 ml de NaCl 1 M, KCl 1,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM y glucosa 20 mM), se incubaron a 37ºC durante una hora, y se colocaron 100 \mul en placas de agar Luria que contenían 50 \mug/ml de kanamicina, 7 \mug/ml de gentamicina, 10 \mug/ml de tetraciclina, 40 \mug/mL de IPTG y 200 \mug/mL de BLUO-GAL (5-bromo-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido). Las placas se incubaron durante 48 horas a 37ºC. Se usó una selección por color para identificar las células que habían transpuesto el ADN viral (denominado "bácmido"). Las colonias que tuvieron un color blanco se recogieron. Las colonias blancas positivas (que contenían el bácmido deseado) se seleccionaron para el cultivo y la purificación posterior del ADN del bácmido. Se transfectaron células de Spodoptera frugiperda (Sf9) tras el cultivo y el aislamiento del bácmido.

B. Transfección de Células Sf9

Se sembraron células Sf9 a 1 x 10^{6} células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se dejaron adherir durante 1 hora a 27ºC. Se diluyeron alrededor de 5 \mug de ADN del bácmido con 100 \mul de Sf-900 II SFM (Life Technologies). Se diluyeron veinte microlitros de reactivo LIPOFECTAMINE (Life Technologies) con 100 \mul de Sf-900 II SFM. Se mezclaron suavemente las disoluciones de ADN del bácmido y de lípidos y se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron ochocientos microlitros de Sf-900 II SFM a la mezcla lípidos-ADN. Se aspiraron los medios del pocillo y se añadió 1 ml de la mezcla ADN-lípidos a las células. Las células se incubaron a 27ºC durante la noche. La mezcla ADN-lípidos se aspiró, y se añadieron 2 ml de los medios Sf-900 II a cada placa. Las placas se incubaron a 27ºC, 90% de humedad, durante alrededor de siete días, y después se recogió el virus.

C. Amplificación

Se sembraron células Sf9 a 1 x 10^{6} células por pocillo en una placa de 6 pocillos en 2 ml de SF-900II. Se colocaron quinientos microlitros del virus de la placa de transfección en el pocillo, y la placa se incubó a 27ºC, 90% de humedad, durante 96 horas, tras lo cual se recogió el virus para la amplificación primaria. Se puede llevar a cabo una amplificación adicional mediante el uso del siguiente procedimiento.

Se puede desarrollar una segunda ronda de amplificación como sigue: se siembran células Sf9 a 1 x 10^{6} células por pocillo en una placa de 6 pocillos en 2 ml de SF-900II. Se colocan cien microlitros de virus de la placa de amplificación primaria en el pocillo, y la placa se incuba a 27ºC, 90% de humedad, durante 96 horas, y después se recoge el virus para completar la amplificación secundaria.

Se puede llevar a cabo una ronda adicional de amplificación. Se cultivan células Sf9 en 50 ml de Sf-900 II SFM en un matraz de agitación de 250 ml hasta una densidad aproximada de 1 x 10^{6} células/ml. Después se infectan con 500 \mul de la disolución de reserva viral de la placa anterior y se incuban a 27ºC durante 3 días, tras lo cual se recoge el virus.

Esta disolución de reserva viral se titula mediante una curva de inhibición del crecimiento, y el cultivo de titulación que indicó una MOI de 1 se deja seguir durante un total de 48 horas. Se analiza el sobrenadante por medio de un análisis de Western sin reducción mediante el uso de un anticuerpo monoclonal primario específico para GFD de zVegf4 (E3595) y un anticuerpo secundario anti-Mu de cabra conjugado a HRP. Los resultados deberían indicar una banda dimérica de alrededor de 79 kDa y especies adicionales de pesos moleculares superiores. También se puede usar el sobrenadante para un análisis de actividad.

Se genera una gran disolución de reserva viral mediante el siguiente método: se cultivan células Sf9 en IL Sf-900 II SFM en un matraz de agitación de 2800 ml hasta una densidad aproximada de 1 x 10^{6} células/ml. Después se infectan con 10 ml de la disolución de reserva viral de la última amplificación, y se incuban a 27ºC durante 96 horas, tras lo cual se recoge el virus.

Se pueden completar infecciones a mayor escala para proporcionar un material para la purificación posterior.

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<110> ZymoGenetics, Inc.

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<120> Receptor del Factor de Necrosis Tumoral Humano

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<130> 00-103PC

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<160> 46

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<170> FastSEQ para Windows, Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 586

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (27) ... (578)

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<400> 1

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11

12

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<210> 2

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<211> 184

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

13

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<210> 3

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<211> 552

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Esta secuencia nucleotídica degenerada codifica la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO:2.

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<221> misc_feature

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<222> 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 60, 63, 66, 81, 84, 87, 90, 99, 102, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 177, 186, 189, 192, 195, 198

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<223> n = A,T,C o G

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<221> misc_feature

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<222> 201, 204, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288, 291, 294, 297, 300, 306, 309, 312, 318, 321, 324, 327, 330, 333, 336, 339, 342, 348, 351, 357

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<223> n = A,T,C o G

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<221> misc_feature

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<222> 369, 372, 378, 381, 390, 399, 402, 405, 408, 414, 420, 423, 426, 429, 432, 438, 441, 444, 447, 456, 459, 462, 465, 468, 471, 474, 480, 483, 486, 489, 492, 495, 498, 504, 507, 510, 513, 519, 522, 525, 528, 534, 537, 540, 543

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<223> n = A,T,C o G

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<400> 3

14

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<210> 4

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Enlazador peptídico.

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<400> 4

15

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<210> 5

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<211> 285

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

16

1600

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<210> 6

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<211> 250

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

18

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<210> 7

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<211> 184

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 7

19

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<210> 8

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<211> 293

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

21

22

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<210> 9

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<211> 5759

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> exón

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<222> (1001)...(1136)

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<221> exón

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<222> (1443)...(1673)

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<221> exón

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<222> (2220)...(2404)

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<400> 9

23

24

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<210> 10

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<211> 29

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR.

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcgaattcgt cggcaccatg aggcgaggg

\hfill

29

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<210> 11

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<211> 31

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR.

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgctcgagct gccggctccc tgctattgtt g

\hfill

31

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<210> 12

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<211> 685

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<212> DNA

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<213> Ratón

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<220>

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<221> CDS

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<222> (36)...(560)

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<400> 12

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25

26

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<210> 13

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<211> 175

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<212> PRT

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<213> Ratón

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<400> 13

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27

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<210> 14

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<211> 525

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Esta secuencia nucleotídica degenerada codifica la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO:13.

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<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 36, 39, 42, 48, 51, 54, 57, 60, 75, 90, 93, 96, 99, 108, 111, 120, 129, 132, 138, 141, 147, 150, 153, 156, 162, 165, 168, 171, 174, 180, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 210, 213, 216, 219, 222, 225

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 252, 255, 258, 261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288, 294, 300, 309, 312, 315, 318, 321, 324, 330, 333, 339, 342, 354, 357, 366, 372, 375, 378, 381, 387, 390, 396, 399, 402, 405, 408, 414

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 417, 420, 432, 438, 441, 444, 447, 450, 456, 459, 462, 465, 468, 471, 474, 480, 483, 486, 489, 495, 498, 501, 504, 510, 513, 516, 519

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcagcggaa ttcagatctt cagacaaaac tcacacatgc ccac

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcagtctct agatcattta cccggagaca gggag

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 762

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)...(759)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgtgcccag cacctgaagc cgagggggca ccgtcagtct tcctcttccc c

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggattctaga ttatttaccc ggagacaggg a

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtggcggct cccagatggg tcctgtccga gcccagatct tcagacaaaa ctcac

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgggagggct ttgttgga

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccaacaaag ccctcccatc ctccatcgag aaaaccatct cc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcggctc ccagatg

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatggatcc atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcggctc ccagatg

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggattctaga ttatttaccc ggagacaggg a

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 718

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resto de inmunoglobulina modificado.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(696)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

32

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resto de inmunoglobulina modificado.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagcccaaat cttcagacaa aactcacaca tgccca

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taattggcgc gcctctagat tatttacccg gagaca

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 718

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resto de inmunoglobulina modificado.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(696)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resto de inmunoglobulina modificado.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccggccac catgggat

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgcctcata gagaggacac ctgcagt

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcctctcta tgaggcgagg gccccgga

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggcgtgcgt aggagcccgc aggccac

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggctcctac gcacgccgcg gccgaaacc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaaccacgc ggaaccagcg ccgcctcgcc ggccccc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggttccgc gtggttccga gcccaaatct tcagac

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcgcgcctc tagattattt acccggagac a

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 987

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ztnfr12-tcs-Fc5.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(984)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

38

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 328

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ztnfr12-tcs-Fc5.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgcattccg gaatgaggcg agggccccgg agcctg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgcattcta gatcagtcca tcggcatgta ttccgccgcc tcgccggccc ccgc

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> C-terminal tag.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\hskip1cm

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Motivo.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)...(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = N, V, P, o S.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)...(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Q, P, o E.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)...(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = T, A, E, o N.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)...(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = E o Q.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)...(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = C o Y.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)...(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = F o W.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)...(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = P, L, o S.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)...(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = V o L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)...(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = R, G, o H.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)...(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = N, H, T, o A.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)...(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = V, M, o I.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)...(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = S, A, o P.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\hskip1cm

43

Claims

1. Un polipéptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

(a): los residuos de aminoácidos 1-69 de SEQ ID Nº: 2;

(b): los residuos de aminoácidos 1-45 de SEQ ID Nº: 2;

(c): los residuos de aminoácidos 1-17 de SEQ ID Nº: 2; y

(d): los residuos de aminoácidos 39-64 de SEQ ID Nº: 2.

2. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido según la reivindicación 1.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 2, en la que dicha molécula de ácido nucleico consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada de:

(a): los nucleótidos 27-233 de SEQ ID Nº: 1; y

(b): los nucleótidos 27-162 de SEQ ID Nº: 1.

4. Una molécula de ácido nucleico aislada que consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada de:

(a): los nucleótidos 27-233 de SEQ ID Nº: 1;

(b): los nucleótidos 163-393 de SEQ ID Nº: 1;

(c): los nucleótidos 27-578 de SEQ ID Nº: 1;

(d): los nucleótidos 394-578 de SEQ ID Nº: 1; y

(e): los nucleótidos 27-162 de SEQ ID Nº: 1.

5. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico aislada según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

6. Un vector según la reivindicación 5, en el que dicho vector es un vector de expresión, que comprende además un promotor de la transcripción y un terminador de la transcripción, en el que el promotor está unido de manera operable a la molécula de ácido nucleico, y en el que la molécula de ácido nucleico está unida de manera operable al terminador de la transcripción.

7. Una célula hospedadora recombinante que comprende un vector de expresión según la reivindicación 6, en la que la célula hospedadora es una célula bacteriana, de levadura, aviar, fúngica, de insecto, mamífera o vegetal.

8. Un método para producir un polipéptido según la reivindicación 1, cuyo método comprende cultivar células hospedadoras recombinantes que comprenden un vector de expresión según la reivindicación 6 y que producen el polipéptido.

9. Un método según la reivindicación 8, que comprende además aislar el polipéptido a partir de las células hospedadoras recombinantes cultivadas.

10. Una proteína de fusión que comprende un primer polipéptido unido a un segundo polipéptido, en la que el primer polipéptido es un polipéptido ztnfr12 que consiste en un polipéptido según la reivindicación 1, y en la que el segundo polipéptido comprende un polipéptido heterólogo.

11. Una proteína de fusión según la reivindicación 10, en la que el segundo polipéptido comprende un resto de inmunoglobulina.