DE60028830T2

DE60028830T2 - Anti-april antikörper und hybridomazellen

Info

Publication number: DE60028830T2
Application number: DE60028830T
Authority: DE
Inventors: J. Avi San Mateo ASHKENAZI; H. Kelly San Mateo DODGE; Iqbal Fremont GREWAL; Jin Kyung Cupertino KIM; A. Scot San Carlos MARSTERS; M. Robert El Cerrito PITTI; Minhong Burlingame YAN
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2000-02-16
Filing date: 2000-11-28
Publication date: 2007-01-18
Anticipated expiration: 2020-11-29
Also published as: EP1255558B1; EP1666052B1; AU2048501A; JP5062606B2; DK1255558T3; EP1255558A1; DE60028830D1; WO2001060397A1; CY1105212T1; ES2267593T3; US20060073146A1; HK1093674A1; ATE329610T1; JP2003522800A; DK1666052T3; CA2396793A1; EP1666052A1; ATE511857T1; WO2001060397A9; IL150755A0

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen Antikörper, die die Aktivität von Molekülen modulieren, die mit Tumornekrosefaktor (TNF) und TNF-Rezeptor (TNFR) verwandt sind, und im Speziellen das APRIL genannte Element der TNF- und TNFR-Familien. Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren für die In-vitro-, In-situ- und/oder In-vivo-Diagnose und/oder -Behandlung von Säugetierzellen oder mit TALL-1, APRIL, TACI oder BCMA assoziierten Krankheitszuständen unter Verwendung von einem oder mehreren Agonisten- oder Antagonistenmolekülen.
Hintergrund der Erfindung
Verschiedene Moleküle, wie z.B. Tumornekrosefaktor-α („TNF-α"), Tumornekrosefaktor-β („TNF-β" oder „Lymphotoxin-α"), Lymphotoxin-β („LT-β"), CD30-Ligand, CD27-Ligand, CD40-Ligand, OX-40-Ligand, 4-1BB-Ligand, Apo-1-Ligand (auch als Fas-Ligand oder CD95-Ligand bezeichnet), Apo-2-Ligand (auch als TRAIL bezeichnet), Apo-3-Ligand (auch als TWEAK bezeichnet), Osteoprotegerin (OPG), APRIL, RANK-Ligand (auch als TRANCE bezeichnet) und TALL-1 (auch als BlyS, BAFF oder THANK bezeichnet), sind als Elemente der Tumornekrosefaktor-(„TNF"-)Familie von Cytokinen identifizierf worden (siehe z.B. Gruss und Dower, Blood 85, 3378–3404 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem. 271, 12687–12690 (1996); Wiley et al., Immunity 3, 673–682 (1995); Browning et al., Cell 72, 847–856 (1993); Armitage et al., Nature 357, 80–82 (1992), WO 97/01633, veröffentlicht am 16. Jänner 1997; WO 97/25428, veröffentlicht am 17. Juli 1997; Marsters et al., Curr. Biol. 8, 525–528 (1998); Simonet et al., Cell 89, 309–319 (1997); Chicheportiche et al., Biol. Chem. 272, 32401–32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med. 188, 1185–1190 (1998); WO 98/28426, veröffentlicht am 2. Juli 1998; WO 98/4675, veröffentlicht am 22. Oktober 1998; WO 98/18921, veröffentlicht am 7. Mai 1998; Moore et al., Science 285, 260–263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol. 65, 680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med. 189, 1747–1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem. 274, 15978–15981 (1991)). Unter diesen Molekülen ist von TNF-α, TNF-β, CD30-Ligand, 4-1BB- Ligand, Apo-1-Ligand, Apo-2-Ligand (Apo2L/TRAIL) und Apo-3-Ligand (TWEAK) berichtet worden, dass sie am apoptotischen Zelltod beteiligt sind. Von TNF-α sowie TNF-β ist berichtet worden, dass sie den apoptotischen Tod in empfindlichen Tumorzellen auslösen (Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol. 17, 689 (1987)).
Verschiedene Moleküle in der TNF-Familie weisen außerdem (eine) angebliche Rolle(n) bei der Funktion und Entwicklung des Immunsystems auf (Gruss et al., Blood 85, 3378 (1995)). Zheng et al. haben berichtet, dass TNF-α an der Poststimulus-Apoptose CD8-positiver T-Zellen beteiligt ist (Zheng et al., Nature 377, 348–351 (1995)). Andere Forscher haben berichtet, dass der CD30-Ligand an der Deletion selbst-reaktiver T-Zellen im Thymus beteiligt ist (Amakawa et al., Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, Abstr. Nr. 10 (1995)). Der CD40-Ligand aktiviert zahlreiche Funktionen von B-Zellen, einschließlich Proliferation, Immunglobulinsekretion und Überleben (Renshaw et al., J. Exp. Med. 180, 1889 (1994)). Von einem weiteren kürzlich identifizierten Cytokin der TNF-Familie, TALL-1 (BlyS), ist berichtet worden, dass es unter bestimmten Bedingungen die B-Zellen-Proliferation und Immunglobulinsekretion induziert (Moore et al., siehe oben; Schneider et al., siehe oben; Mackay et al., J. Exp. Med. 190, 1697 (1999)).
Mutationen in den Maus-Fas/Apo-1-Rezeptor- oder -Liganden-Genen (die lpr bzw. gld genannt werden) sind mit einigen Autoimmunstörungen in Zusammenhang gebracht worden, was darauf hinweist, dass der Apo-1-Ligand eine Rolle bei der Regulierung der klonalen Deletion selbst-reaktiver Lymphozyten in der Peripherie spielen könnte (Krammer et al., Curr. Op. Immunol. 6, 279-289 (1994); Nagata et al., Science 267, 1449–1456 (1995)). Vom Apo-1-Ligand ist außerdem berichtet worden, dass er die Poststimulus-Apoptose in CD4-positiven T-Lymphozyten und in B-Lymphozyten induziert und an der Eliminierung aktivierter Lymphozyten beteiligt sein könnte, wenn ihre Funktion nicht länger benötigt wird (Krammer et al., siehe oben; Nagata et al., siehe oben). Von monoklonalen Agonisten-Maus-Antikörpern, die spezifisch an den Apo-1-Rezeptor binden, ist berichtet worden, dass sie eine Zelltötungsaktivität aufweisen, die ähnlich der von TNF-α oder mit der von TNF-α vergleichbar ist (Yonehara et al., J. Exp. Med. 169, 1747–1756 (1989)).
Es wird angenommen, dass die Induktion verschiedener Zellreaktionen, die durch derartige Cytokine der TNF-Familie vermittelt werden, durch ihre Bindung an spezifische Zellrezeptoren ausgelöst wird. Bisher wurden zwei unterschiedliche TNF-Rezeptoren von ungefähr 55 kDa (TNFR1) und 75 kDa (TNFR2) identifiziert (Hohman et al., J. Biol. Chem. 264, 14927–14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3127–3131 (1990); EP 417.563 , veröffentlicht am 20. März 1991; Loetscher et al., Cell 61, 351 (1990); Schall et al., Cell 61, 361 (1990); Smith et al., Science 248, 1019–1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2830–2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol. 11, 3020–3026 (1991)). Es wurde gefunden, dass diese TNFRs die typische Struktur von Zelloberflächenrezeptoren, einschließlich extrazellulärer, Transmembran- und intrazellulärer Regionen, gemeinsam haben. Die extrazellulären Abschnitte beider Rezeptoren wurden in der Natur auch als lösliche TNF-bindende Proteine gefunden (Y. Nophar et al., EMBO J. 9, 3269 (1990); und T. Kohno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8331 (1990); Hale et al., J. Cell. Biochem. Supplement 15F; S. 113 (P424) (1991)).
Der extrazelluläre Abschnitt der TNFRs vom Typ 1 und Typ 2 (TNFR1 und TNFR2) enthält ein repetitives Aminosäuresequenzmuster von vier Cystein-reichen Domänen (CRDs), die beginnend vom NH₂-Terminus mit 1 bis 4 bezeichnet sind (Schall et al., siehe oben; Loetscher et al., siehe oben; Smith et al., siehe oben; Nophar et al., siehe oben; Kohno et al., siehe oben; Banner et al., Cell 73, 431–435 (1993)). Ein ähnliches repetitives Muster von CDRs existiert in mehreren anderen Zelloberflächenproteinen, einschließlich dem p75-Nervenwachstumsfaktorrezeptor (NGFR) (Johnson et al., Cell 47, 545 (1986); Radeke et al., Nature 325, 593 (1987)), dem B-Zellen-Antigen CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J. 8, 1403 (1989)), dem T-Zellen-Antigen OX40 (Mallet et al., EMBO J. 9, 1063 (1990)) und dem Fas-Antigen (Yonehara et al., siehe oben, und Itoh et al., Cell 66, 233–243 (1991)). CDRs finden sich außerdem in den löslichen TNFR-(sTNFR-)ähnlichen T2-Proteinen der Shope- und Myxom-Po ckenviren (Upton et al., Virology 160, 20–29 (1987); Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 176, 335 (1991); Upton et al., Virology 184, 370 (1991)). Die optimale Angleichung dieser Sequenzen weist darauf hin, dass die Positionen der Cysteinreste sehr konserviert sind. Diese Rezeptoren werden manchmal zusammen als Elemente der TNF/NGF-Rezeptorüberfamilie bezeichnet.
Die bisher identifizierten Liganden der TNF-Familie sind mit Ausnahme von Lymphotoxin-α Transmembranproteine vom Typ II, deren C-Terminus extrazellulär ist. Im Gegensatz dazu sind die meisten bislang identifizierten Rezeptoren in der TNF-Rezeptor-(TNFR-)Familie Transmembranproteine des Typs I. Bei der TNF-Liganden- sowie -Rezeptor-Familie ist jedoch die unter den Familienelementen identifizierte Homologie hauptsächlich in der extrazellulären Domäne („ECD") gefunden worden. Mehrere der Cytokine der TNF-Familie, einschließlich TNF-α, Apo-1-Ligand und CD40-Ligand, werden an der Zelloberfläche proteolytisch gespalten; das resultierende Protein bildet in allen Fällen typischerweise ein homotrimeres Molekül, dass als lösliches Cytokin fungiert. Proteine der TNF-Rezeptorfamilie werden außerdem üblicherweise proteolytisch gespalten, um lösliche Rezeptor-ECDs freizusetzen, die als Inhibitoren der zugehörigen Cytokine fungieren können.
Vor kurzem sind andere Elemente der TNFR-Familie identifiziert worden. In von Bulow et al., Science 278, 138–141 (1997), beschreiben Wissenschafter einen Plasmamembranrezeptor, der als „Transmembrane Activator und CAML-Interactor" oder „TACI" bezeichnet wird. Vom TACI-Rezeptor wird berichtet, dass er ein Cystein-reiehes Motiv enthält, das für die TNFR-Familie charakteristisch ist und auf B-Zellen sowie aktivierten T-Zellen vorhanden ist. In einem In-vitro-Test führte die Vernetzung von TACI auf der Oberfläche transfizierter Jurkat-Zellen mit TACI-spezifischen Antikörpern zur Aktivierung von NF-KB (siehe auch WO 98/39361, veröffentlicht am 18. September 1998).
Laabi et al., EMBO J. 11, 3897–3904 (1992), beschrieben die Identifizierung eines neuen, „BCM" genannten Gens, dessen Expression mit der terminalen B-Zellen-Rei fung zusammenfiel. Das offene Leseraster der normalen BCM-cDNA sagte ein 184 Aminosäuren langes Polypeptid mit einer einzigen Transmembrandomäne vorher. Diese Forscher nannten dieses Gen später „BCMA" (Laabi et al., Nucleic Acids Res. 22, 1147–1154 (1994)). Es wurde berichtet, dass BCMA-mRNA in menschlichen bösartigen B-Zelllinien, die das Pro-B-Lymphozyten-Stadium darstellen, nicht exprimiert wird und dass daher angenommen wird, dass sie mit dem Stadium der Differenzierung von Lymphozyten verbunden ist (Gras et al., Int. Immunology 7, 1093–1106 (1995)). In Madry et al., Int. Immunology 10, 1693–1702 (1998), wurde die Klonierung muriner BCMA-cDNA beschrieben. Es wurde berichtet, dass murine BCMA-cDNA für ein 185 Aminosäuren langes Polypeptid kodiert, das 62% Identität mit dem menschlichen BCMA-Polypeptid aufweist. Die Angleichung der murinen und menschlichen BCMA-Proteinsequenzen offenbarte ein konserviertes Motiv von sechs Cysteinen in der N-terminalen Region, was nahe legt, dass das BCMA-Protein der TNFR-Überfamilie angehört (Madry et al., siehe oben).
In Marsters et al., Curr. Biol. 6, 750 (1996), beschreiben Forscher ein menschliches Polypeptid voller Länge und nativer Sequenz, das Apo-3 genannt wurde, das in seinen extrazellulären Cystein-reichen Wiederholungen eine Ähnlichkeit zur TNFR-Familie aufweist und TNFR1 und CD95 insofern gleicht, als dass es eine cytoplasmatische Todesdomänen-Sequenz enthält (siehe auch Marsters et al., Curr. Biol. 6, 1669 (1996)). Apo-3 ist von anderen Forschern auch als DR3, ws1-1, TRAMP und LARD bezeichnet worden (Chinnaiyan et al., Science 274, 990 (1996); Kitson et al., Nature 384, 372 (1996); Bodmer et al., Immunity 6, 79 (1997); Screaton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4615–4619 (1997)).
Pan et al. haben ein weiteres Element der TNF-Rezeptorfamilie offenbart, das als „DR4" bezeichnet wurde (Pan et al., Science 276, 111–113 (1997); siehe auch WO 98/32856, veröffentlicht am 30. Juli 1998). Vom DR4 wurde berichtet, dass es eine cytoplasmatische Todesdomäne aufweist, die zum Einschalten des Zellsuizidapparats fähig ist. Pan et al. offenbaren, dass von DR4 angenommen wird, dass es ein Rezeptor für den als Apo2L/TRAIL bekannten Liganden ist.
In Sheridan et al., Science 277, 818–821 (1997), und Pan et al., Science 277, 815–818 (1997), wird ein anderes Molekül beschrieben, von dem angenommen wird, dass es ein Rezeptor für Apo2L/TRAIL ist (siehe auch WO 98/51793, veröffentlicht am 19. November 1998; WO 98/41629, veröffentlicht am 24. September 1998). Dieses Molekül wird als DR5 bezeichnet (es ist wahlweise auch als Apo-2, TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 oder KILLER bezeichnet worden (Screaton et al., Curr. Biol. 7, 693–696 (1997); Walczak et al., EMBO J. 16, 5386–5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics 17, 141–143 (1997); WO 98/35986, veröffentlicht am 20. August 1998; EP 870.827 , veröffentlicht am 14. Oktober 1998; WO 98/46643, veröffentlicht am 22. Oktober 1998; WO 99/02653, veröffentlicht am 21. Jänner 1999; WO 99/09165, veröffentlicht am 25. Februar 1999; WO 99/11791, veröffentlicht am 11. März 1999). Wie von DR4 wird von DR5 berichtet, dass es eine cytoplasmatische Todesdomäne enthält und fähig ist, Apoptose zu signalisieren. Die Kristallstruktur des zwischen Apo2L/TRAIL und DR5 gebildeten Komplexes wird in Hymowitz et al., Molecular Cell 4, 563–571 (1999), beschrieben.
Noch ein weiterer Todesdomänen-enthaltender Rezeptor, DR6, wurde unlängst identifiziert (Pan et al., FEBS Letters 431, 351–356 (1998)). Abgesehen von den enthaltenen vier mutmaßlichen extrazellulären Cystein-reichen Domänen und einer cytoplasmatischen Todesdomäne wird von DR6 angenommen, dass es eine mutmaßliche Leucin-Zipper-Sequenz enthält, die mit einem an Prolin reichen Motiv in der cytoplasmatischen Region überlappt. Das an Prolin reiche Motiv ähnelt Sequenzen, die an src-Homologie-3-Domänen binden, die sich in zahlreichen intrazellulären signalübertragenden Molekülen finden.
Eine weitere Gruppe von unlängst identifizierten Rezeptoren wird als „Decoy-Rezeptoren" bezeichnet, von denen angenommen wird, dass sie als Inhibitoren und nicht als Überträger der Signalisierung fungieren. Diese Gruppe umfasst DCR1 (auch als TRID, LIT oder TRAIL-R3 bezeichnet) (Pan et al., Science 276, 111–113 (1997); Sheridan et al., Science 277, 818–821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem. 272, 25417–25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters 416, 329–334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med. 186, 1165–1170 (1997); und Mongkolsapaya et al., J. Im munol. 160, 3–6 (1998)) und DCR2 (auch als TRUNDD oder TRAIL-R4 bezeichnet) (Marsters et al., Curr. Biol. 7, 1003–1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters 424, 41–45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity 7, 813–820 (1997)), beide Zelloberflächenmoleküle, sowie OPG (Simonet et al., siehe oben; Emery et al., siehe unten) und DCR3 (Pitti et al., Nature 396, 699–703 (1998)), wobei beide sekretierte lösliche Proteine sind.
Weitere neu identifizierte Elemente der TNFR-Familie umfassen CAR1, HVEM, GITR, ZTNFR-5, NTR-1 und TNFL1 (Brojatsch et al., Cell 87, 845–855 (1996); Montgomery et al., Cell 87, 427–436 (1986); Marsters et al., J. Biol. Chem. 272, 14029–14032 (1997); Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 6216–6221 (1997); Emery et al., J. Biol. Chem. 273, 14363–14367 (1998); WO 99/04001, veröffentlicht am 28. Jänner 1999; WO 99/07738, veröffentlicht am 18. Februar 1999; WO 99/33980, veröffentlicht am 8. Juli 1999).
Wie von Tewari et al. im Überblick beschrieben, modulieren TNFR1, TNFR2 und CD40 die Expression von entzündungsfördernden und costimulatorischen Cytokinen, Cytokinrezeptoren und Zelladhäsionsmolekülen über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB (Tewari et al., Curr. Op. Genet. Develop. 6, 39–44 (1996)). NF-κB ist ein Prototyp einer Familie dimerer Transkriptionsfaktoren, deren Untereinheiten konservierte Rel-Regionen enthalten (Verma et al., Genes Develop. 9, 2723–2735 (1996); Baldwin, Ann. Rev. Immunol. 14, 649–681 (1996)). In seiner latenten Form ist NF-κB mit Elementen der lκB-Inhibitorfamilie komplexiert; nach Inaktivierung des lkB als Reaktion auf gewisse Stimuli verlagert sich freigesetztes NF-κB in den Kern, wo es an spezifische DNA-Sequenzen bindet und Gentranskription aktiviert. Wie oben beschrieben, ist bei den bislang identifizierten TNFR-Elementen eine intrazelluläre Todesdomänenregion entweder enthalten oder fehlend. Manche TNFR-Moleküle, denen eine Todesdomäne fehlt, wie z.B. TNFR2, CD40, HVEM und GITR, sind zur Modulation der NF-κB-Aktivität fähig (siehe z.B. Lotz et al., J. Leukocyte Biol. 60, 1–7 (1996)).
Für einen Überblick über die TNF-Familie von Cytokinen und ihre Rezeptoren siehe Ashkenazi und Dixit, Science 281, 1305–1308 (1998); Golstein, Curr. Biol. 7, 750–753 (1997); Gruss und Dower, siehe oben, und Nagata, Cell 88, 355–365 (1997).
Zusammenfassung der Erfindung
Die Anmelder haben überraschenderweise gefunden, dass der als TALL-1 bezeichnete Ligand der TNF-Familie an den TACI-Rezeptor und an den BCMA-Rezeptor bindet. Die Anmelder haben außerdem überraschenderweise gefunden, dass der als APRIL bezeichnete Ligand der TNF-Familie an die TACI- sowie BCMA-Rezeptoren bindet. Obgleich gewisse TALL-1- und APRIL-Liganden und gewisse TACI- und BCMA-Rezeptoren früher beschrieben worden sind, war auf dem Gebiet der Erfindung nicht bekannt, dass TALL-1 und APRIL an die TACI- und BCMA-Rezeptoren binden und diese aktivieren. Die vorliegende Erfindung stellt daher neue Antikörper-Antagonisten dieser TNF-verwandten APRIL-Liganden gemäß den Ansprüchen bereit. Die hierin beschriebenen Antagonisten sind unter anderem für die In-vitro-, In-situ- oder In-vivo-Diagnose oder Behandlung von Säugetierzellen oder Krankheitszuständen von Nutzen, die mit der Gegenwart (oder Abwesenheit) von TALL-1, APRIL, TACI oder BCMA in Zusammenhang stehen.
Verwendungen davon umfassen die Behandlung von Leiden oder Krankheiten in Säugetieren, die mit erhöhter TALL-1- oder APRIL-Expression und/oder -Aktivität assoziiert sind oder daraus resultieren. Für die Behandlung können TALL-1-Antagonisten oder APRIL-Antagonisten dem Säugetier verabreicht werden, das an einem/r derartigen Leiden oder Krankheit leidet. Die hierin beschriebenen TALL-1-Antagonisten und APRIL-Antagonisten umfassen TACI-Rezeptor-Immunadhäsine oder BCMA-Rezeptor-Immunadhäsine sowie Antikörper gegen den TACI-Rezeptor oder BCMA-Rezeptor, die vorzugsweise die entsprechende Rezeptorbindung oder -Aktivierung durch den TALL-1-Liganden oder APRIL-Liganden blockieren oder schwächen. Beispielsweise können TACI-Rezeptor-Immunadhäsine eingesetzt werden, um rheumatische Arthritis oder multiple Sklerose zu behandeln. Die hierin beschriebenen TALL-1-Antagonisten und APRIL-Antagonisten umfassen weiters Anti-TALL-1-Antikörper oder Anti-APRIL-Antikörper, die fähig sind, die Bindung der entsprechenden Liganden an die TACI- oder BCMA-Rezeptoren zu blockieren oder zu schwächen. Noch weitere Antagonistenmoleküle umfassen kovalent modifizierte Formen oder Fusionsproteine, die TACI oder BCMA umfassen. Beispielhaft können derartige Antagonisten pegyliertes TACI oder BCMA und an heterologe Sequenzen, wie z.B. Epitop-Marker oder Leucin-Zipper, fusioniertes TACI oder BCMA umfassen. Gegebenenfalls ist/sind das/die eingesetzte/n Antagonistenmolekül/e fähig, die Aktivität von TALL-1 sowie APRIL zu blockieren oder zu neutralisieren, z.B. ein Doppel-Antagonist, der die Aktivität von beiden, TALL-1 und APRIL, blockiert oder neutralisiert. Es kann eine einzige Art von Antagonistenmolekül oder eine Kombination von zwei oder mehreren Arten von Antagonisten verwendet werden.
Die Erfindung ist gemäß den Ansprüchen definiert und stellt außerdem spezielle Antagonistenmoleküle bereit, die Anti-APRIL-Antikörper umfassen. Derartige Antikörper umfassen monoklonale Antikörper, Hybridantikörper, humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper. In einer der Ausführungsformen umfassen die Anti-APRIL-Antikörper die in den unten stehenden Beispielen offenbarten monoklonalen Anti-APRIL-Antikörper. Außerdem werden hierin Hybridome bereitgestellt, die verschiedene monoklonale Anti-APRIL-Antikörper sekretieren.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1A–1B zeigen eine Polynucleotidsequenz, die für ein menschliches TACI nativer Sequenz (Seq.-ID Nr. 1) kodiert (die reverse komplementäre Sequenz wird in Seq.-ID Nr. 11 bereitgestellt), und seine mutmaßliche Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2).
2 zeigt eine Polynucleotidsequenz, die für ein menschliches BCMA natürlicher Sequenz (Seq.-ID Nr. 3) kodiert (die reverse komplementäre wird in Seq.-ID Nr. 12 bereitgestellt), und seine mutmaßliche Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 4).
3 zeigt eine Polynucleotidsequenz, die für ein menschliches TALL-1 natürlicher Sequenz (Seq.-ID Nr. 5) kodiert (die reverse komplementäre wird in Seq.-ID Nr. 13 bereitgestellt), und seine mutmaßliche Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 6).
4A–4B zeigen eine Polynucleotidsequenz, die für ein menschliches APRIL natürlicher Sequenz (Seq.-ID Nr. 7) kodiert (die reverse komplementäre wird in Seq.-ID Nr. 14 bereitgestellt), und seine mutmaßliche Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 8).
5A–5B zeigen beispielhafte Verfahren zur Berechnung der % Aminosäureidentität der als „Comparison Protein" (Vergleichsprotein) bezeichneten Aminosäuresequenz mit der als „PRO" bezeichneten Aminosäuresequenz. Für die Zwecke hierin kann die „PRO"-Sequenz die in 1, 2, 3 oder 4 hierin genannte TACI-, BCMA-, TALL-1- bzw. APRIL-Sequenz sein.
6 zeigt eine Angleichung von zwei Aminosäuresequenzen für den „hTACI (265)" (Seq.-ID Nr. 9), von dem angenommen wird, dass er eine Spleißvariante ist, und „hTACI" genannten TACI-Rezeptor, die auch in1A–1B genannt sind (Seq.-ID Nr. 2).
7A–7D zeigen die Ergebnisse eines In-situ-Tests, Färbung auf AP-Aktivität. COS-7-Zellen wurden mit TACI (7A–7C) oder Vektorplasmid (7D) transfiziert und mit AP-TALL-1 (7A, 7D); AP-TNF-α (7B); oder AP-EDA (7C) inkubiert.
8A–8H zeigen die Ergebnisse (mittels Western-Blot-Analyse) verschiedener Co-Immunopräzipitationstests von TALL-1 oder APRIL mit TACI- oder BCMA-Immunadhäsinen, wie in Beispiel 2 ausführlich beschrieben wird. In 8A–8H wird TALL-1 als „Blys/TALL-1" bezeichnet.
9A–9B zeigen die Ergebnisse weiterer Bindungstests, um nachzuweisen, dass TALL-1 und APRIL Liganden für TACI und BCMA sind. In 9A wurden COS-7- Zellen mit TALL-1 (9a–9c); APRIL (9d–9f); oder TNF-α (9g–9i) transfiziert und mit BCMA-Fc (9a, 9d und 9g); TACI-Fc (9b, 9e und 9h); oder TNFR1-Fc (9c, 9f und 9i) inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen, fixiert und die Bindung von Fc-Protein durch biotinylierten Ziegen-Anti-Human-Antikörper, gefolgt von Cy3-Streptavidin nachgewiesen. In 9B wurden COS-7-Zellen mit TACI (1, 2 und 3); BCMA (4, 5 und 6); oder Vektor (7, 8 und 9) transfiziert und mit konditioniertem Medium inkubiert, das AP-TALL-1 (1, 4 und 7), AP-April (2, 5 und 8) oder AP-TNF-α (3, 6 und 9) enthielt. Die Zellen wurden gewaschen, fixiert und auf AP-Aktivität in situ gefärbt. In 9A–9B wird TALL-1 als „BlyS/TALL-1" bezeichnet.
10 zeigt ein Balkendiagramm, das die Ergebnisse eines IgM-ELISA illustriert, wobei die Wirkungen der bezeichneten Cytokine, Liganden und Rezeptoren auf die IgM-Produktion in Target-PBLs getestet wurden.
11A–11D zeigen die Ergebnisse von Tests, die nachweisen, dass die Wechselwirkung zwischen TALL-1 oder APRIL und TACI oder BCMA in der Aktivierung von NF-KB resultiert. In 11A die Stimulation von TACI/BCMA-vermittelter NF-KB-Aktivierung durch TALL-1 oder APRIL. In 11B und 11C die Stimulation von TACI-/BCMA-vermittelter NF-KB-Aktivierung durch Cotransfektion von TALL-1 oder APRIL voller Länge. In 11D resultierte die Behandlung von nicht transfizierten IM-9-Zellen mit Flag-TALL-1 ebenfalls in der Aktivierung von NF-KB, gemessen mittels Gel-Retentionsanalyse.
12 zeigt ein Balkendiagramm, das die Ergebnisse eines ELISA illustriert, der die Wirkungen der Blockierung von TALL-1/TACI- und TALL-1/BCMA-Wechselwirkungen auf die Produktion von NP-spezifischem IgM, niedrigaffinem IgG1 und hochaffinem IgG1 testete.
13-1 (Tafeln A, B und C) und 13-2 (Tafeln A, B und C) zeigen die immunohistochemische Analyse von Milzschnitten aus immunisierten, mit TACI-Fc oder BCMA-Fc behandelten Mäusen und werden in Beispiel 5 ausführlicher beschrieben.
14A zeigt die Ergebnisse eines ELISA, der die Bindung verschiedener Anti-APRIL-Antikörper an Flag-APRIL testete.
14B zeigt eine Tabelle, die die verschiedenen Ergebnisse von Tests der monoklonalen Antikörper 3C6.4.2; 5E8.7.4; 5E11.1.2; und 5G8.2.2 einschließlich Isotypanalyse zeigt.
15A–15D zeigen Balkendiagramme, die die Ergebnisse von kompetitiven Bindungs-ELISAs der Anti-APRIL-Antikörper 3C6.4.2 („3C6") (15A); 5E8.7.4 („5E8") (15B); 5E11.1.2 („5E11") (15C); und 5G8.2.2 („5G8") (15D) illustrieren, die in Beispiel 9 ausführlicher beschrieben sind.
16A und 16B zeigen die Ergebnisse von Tests, die die Hemmung von Kollegeninduzierter Arthritis durch TACI-Fc-Behandlung in einem murinen In-vivo-Modell nachweisen. Die Beobachtungen der arthritischen Bewertung werden in Beispiel 10 beschrieben.
17A–17F zeigen histochemische und radiologische Profile von Gelenken von mit TACI-Fc behandelten CIA-Mäusen oder Kontrollen.
18A–18E zeigen die Ergebnisse von Tests, die durch TACI-Fc gehemmte Anti-Kollagen-Immunantworten im murinen CIA-Modell nachweisen. 18A und 18B zeigen Serumspiegel von Anti-BCII-IgG1- und -IgG2a-Isotyp-Antikörpern; 18C illustriert die Wirkungen von TACI-Fc auf proliferative T-Zellen-Reaktionen; 18D illustriert die Wirkungen von TACI-Fc auf die IL-2-Produktion durch T-Zellen; 18E illustriert die Wirkungen von TACI-Fc auf die Interferon-γ-Produktion durch T-Zellen.
19A–19B zeigen die hemmenden Wirkungen von TACI-Fc auf die Anti-CD3-induzierte Proliferation naiver T-Zellen (19A) und auf die Anti-CD3-induzierte IL-2-Produktion durch naive T-Zellen, wie sie durch In-vitro-Tests gemessen wurden.
20 zeigt die Ergebnisse eines Tests, der die Hemmung experimenteller allergischer Enzephalomyelitis (EAE) durch TACI-Fc-Behandlung in einem murinen In-vivo-Modell zeigt. Die klinischen EAE-Bewertungs-Beobachtungen sind in Beispiel 11 beschrieben.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
1. Definitionen
Die Ausdrücke „TACI" oder „TACI-Polypeptid" oder „TACI-Rezeptor" umfassen bei Verwendung hierin „TACI-Polypeptide nativer Sequenz" und „TACI-Varianten" (die hierin weitergehend definiert werden). „TACI" ist eine Bezeichnung, die jenen Polypeptiden verliehen wird, die kodiert werden von Nucleinsäuremolekülen, die die in 1 gezeigten Polynucleotidsequenzen umfassen, und Varianten oder Fragmenten davon, Nucleinsäuremolekülen, die die in 1 gezeigte Sequenz umfassen, und Varianten davon sowie Fragmenten der obigen. Die TACI-Polypeptide können aus einer Vielzahl von Quellen, wie z.B. aus menschlichen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle, isoliert oder durch rekombinante und/oder synthetische Verfahren hergestellt werden.
Ein TACI-Polypeptid „nativer Sequenz" umfasst ein Polypeptid, das dieselbe Aminosäuresequenz wie das entsprechende aus der Natur stammende TACI-Polypeptid aufweist. Derartige TACI-Polypeptide nativer Sequenz können aus der Natur isoliert oder durch rekombinante und/oder synthetische Mittel hergestellt werden. Der Ausdruck „TACI-Polypeptid nativer Sequenz" umfasst im Speziellen natürlich vorkommende trunkierte oder sekretierte Formen (z.B. eine Sequenz einer extrazellulären Domäne), natürlich vorkommende Variantenformen (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende allelische Varianten des Polypeptids. Die TACI-Polypeptide umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die von Bulow et al., siehe oben, und in der am 11. September 1998 veröffentlichten WO 98/39361 beschriebenen Polypeptide, die Spleißvariante (oben als „hTACI (265)" bezeichnet und in 6 (Seq.-ID Nr. 9) gezeigt) und das TACI-Polypeptid, das die zusammenhängende Sequenz der Aminosäurereste 1–293 aus 1A–1B (Seq.-ID Nr. 2) umfasst.
Eine „extrazelluläre Domäne" oder „ECD" von TACI bezieht sich auf eine Form des TACI-Polypeptids, die im Wesentlichen frei von Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen ist. Für gewöhnlich wird eine TACI-Polypeptid-ECD weniger als ungefähr 1% derartiger Transmembran- und/oder cytoplasmatischer Domänen aufweisen und wird vorzugsweise weniger als ungefähr 0,5% derartiger Domänen aufweisen. Es versteht sich, dass jegliche für die TACI-Polypeptide identifizierte(n) Transmembrandomäne(n) gemäß Kriterien identifiziert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung routinemäßig zur Identifizierung dieses Typs hydrophober Domänen eingesetzt werden. Die genauen Grenzen einer Transmembrandomäne können variieren, jedoch höchstwahrscheinlich um nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren an einem der beiden Enden der ursprünglich identifizierten Domäne. ECD-Formen von TACI umfassen jene, die in von Bulow et al., siehe oben, und WO 98/39361 beschrieben sind.
Unter „TACI-Variante" wird ein TACI-Polypeptid verstanden, das zumindest ungefähr 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz eines TACI oder einer TACI-ECD nativer Sequenz und voller Länge aufweist. Vorzugesweise agiert eine derartige TACI-Variante als unten definierter TALL-1-Antagonist oder APRIL-Antagonist. Derartige TACI-Variantenpolypeptide umfassen beispielsweise TACI-Polypeptide, worin ein oder mehrere Aminosäurereste addiert oder deletiert sind, und zwar am N- und/oder C-Terminus sowie innerhalb einer oder mehrerer interner Domänen der Aminosäuresequenz voller Länge. Fragmente der TACI-ECD sind ebenfalls vorgesehen. Für gewöhnlich wird eine TACI-Polypeptid-Variante zumindest ungefähr 80% Aminosäuresequenzidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 81% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 82% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 83% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 84% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 85% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 86% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 87% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 88% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 89% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 90% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 91% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 92% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 93% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 94% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 95% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 96% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 97% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 98% Aminosäureidentität und noch bevorzugter zumindest ungefähr 99% Aminosäureidentität, mit einem TACI-Polypeptid aufweisen, das von einem in 1 gezeigten Nucleinsäuremolekül oder einem spezifizierten Fragment davon kodiert wird. TACI-Variantenpolypeptide umfassen nicht die native TACI-Polypeptidsequenz. Für gewöhnlich weisen TACI-Variantenpolypeptide eine Länge von zumindest ungefähr 10 Aminosäuren, häufig eine Länge von zumindest ungefähr 20 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 30 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 40 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 50 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 60 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 70 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 80 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 90 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 100 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 150 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 200 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 250 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 300 Aminosäuren oder mehr auf.
Die Ausdrücke „BCMA" oder „BCMA-Polypeptid" oder „BCMA-Rezeptor" umfassen bei Verwendung hierin „BCMA-Polypeptide nativer Sequenz" und „BCMA-Varianten" (die hierin weitergehend definiert werden). „BCMA" ist eine Bezeichnung, die jenen Polypeptiden verliehen wird, die kodiert werden von den Nucleinsäuremolekülen, die die in 2 gezeigten Polynucleotidsequenzen umfassen, sowie Varianten davon, Nucleinsäuremolekülen, die die in 2 gezeigte Sequenz umfassen, und Varianten davon sowie Fragmenten der obigen. Die BCMA-Polypeptide können aus einer Vielzahl von Quellen, wie z.B. aus menschlichen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle isoliert oder durch Rekombinations- und/oder Syntheseverfahren, hergestellt werden.
Ein BCMA-Polypeptid „nativer Sequenz" umfasst ein Polypeptid, das dieselbe Aminosäuresequenz wie das entsprechende aus der Natur stammende BCMA-Polypeptid aufweist. Derartige BCMA-Polypeptide nativer Sequenz können aus der Natur isoliert oder durch rekombinante und/oder synthetische Mittel hergestellt werden. Der Ausdruck „BCMA-Polypeptid nativer Sequenz" umfasst im Speziellen natürlich vorkommende trunkierte oder sekretierte Formen (z.B. eine Sequenz einer extrazellulären Domäne), natürlich vorkommende Variantenformen (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende allelische Varianten des Polypeptids. Die BCMA-Polypeptide umfassen die in Laabi et al., EMBO J. 11, 3897–3904 (1992); Laabi et al., Nucleic Acids Res. 22, 1147–1154 (1994); Gras et al., Int. Immunology 7, 1093–1106 (1995); Madry et al., Int. Immunology 10, 1693–1702 (1998), beschriebenen Polypeptide und das BCMA-Polypeptid, das die zusammenhängende Sequenz der Aminosäurereste 1–184 aus 2 (Seq.-ID Nr. 4) umfasst.
Eine „extrazelluläre Domäne" oder „ECD" von BCMA bezieht sich auf eine Form des BCMA-Polypeptids, die im Wesentlichen frei von Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen ist. Für gewöhnlich wird eine BCMA-Polypeptid-ECD weniger als ungefähr 1% derartiger Transmembran- und/oder cytoplasmatischer Domänen aufweisen und wird vorzugsweise weniger als ungefähr 0,5% derartiger Domänen aufweisen. Es versteht sich, dass jegliche für die BCMA-Polypeptide identifizierte(n) Transmembrandomäne(n) gemäß Kriterien identifiziert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung routinemäßig zur Identifizierung dieses Typs hydrophober Domänen eingesetzt werden. Die genauen Grenzen einer Transmembrandomäne können variieren, jedoch höchstwahrscheinlich um nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren an einem der beiden Enden der ursprünglich identifizierten Domäne. ECD-Formen von BCMA umfassen jene, die in Laabi et al., EMBO J. 11, 3897–3904 (1992); Laabi et al., Nucleic Acids Res. 22, 1147–1154 (1994); Gras et al., Int. Immunology 7, 1093–1106 (1995); Madry et al., Int. immunology 10, 1693–1702 (1998), beschrieben sind.
Unter „BCMA-Variante" wird ein BCMA-Polypeptid verstanden, das zumindest ungefähr 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz eines/r Nativsequenz-BCMA oder BCMA-ECD aufweist. Vorzugsweise agiert eine derartige BCMA-Variante als unten definierter TALL-1-Antagonist oder APRIL-Antagonist. Derartige BCMA-Variantenpolypeptide umfassen beispielsweise BCMA-Polypeptide, worin ein oder mehrere Aminosäurereste addiert oder deletiert sind, und zwar am N- und/oder C-Terminus sowie innerhalb einer oder mehrerer interner Domänen der Aminosäuresequenz voller Länge. Fragmente der BCMA-ECD sind ebenfalls vorgesehen. Für gewöhnlich wird eine BCMA-Variante zumindest ungefähr 80% Aminosäuresequenzidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 81% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 82% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 83% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 84% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 85% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 86% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 87% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 88% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 89% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 90% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 91% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 92% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 93% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 94% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 95% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 96% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 97% Aminosäureidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 98% Aminosäureidentität und noch bevorzugter zumindest ungefähr 99% Aminosäureidentität, mit einem BCMA-Polypeptid aufweisen, das von einem in 2 gezeigten Nucleinsäuremolekül oder einem spezifizierten Fragment davon kodiert wird. BCMA-Variantenpolypeptide umfassen nicht die native BCMA-Polypeptidsequenz. Für gewöhnlich weisen BCMA-Variantenpolypeptide eine Länge von zumindest ungefähr 10 Aminosäuren, häufig eine Länge von zumindest ungefähr 20 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 30 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 40 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 50 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 60 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 70 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 80 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 90 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 100 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 150 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 200 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 250 Aminosäuren, häufiger eine Länge von zumindest ungefähr 300 Aminosäuren oder mehr auf.
Die Ausdrücke „TALL-1" oder „TALL-1-Polypeptid" umfassen bei Verwendung hierin „TALL-1-Polypeptide nativer Sequenz" und „TALL-1-Varianten". „TALL-1" ist eine Bezeichnung, die jenen Polypeptiden verliehen wird, die kodiert werden von den Nucleinsäuremolekülen, die die in 3 gezeigten Polynucleotidsequenzen umfassen, sowie Varianten davon, Nucleinsäuremolekülen, die die in 3 gezeigte Sequenz umfassen, und Varianten davon sowie Fragmenten der obigen, die die biologische Aktivität von TALL-1 nativer Sequenz aufweisen. Varianten von TALL-1 werden vorzugsweise zumindest 80%, bevorzugter zumindest 90% und noch bevorzugter zumindest 95%, Aminosäuresequenzidentität mit dem in 3 gezeigten TALL-1-Polypeptid nativer Sequenz aufweisen. Ein TALL-1-Polypeptid „nativer Sequenz" umfasst ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie das entsprechende aus der Natur stammende TALL-1-Polypeptid. Derartige TALL-1-Polypeptide nativer Sequenz können aus der Natur isoliert oder durch rekombinante und/oder synthetische Mittel hergestellt werden. Der Ausdruck „TALL-1-Polypeptid nativer Sequenz" umfasst im Speziellen natürlich vorkommende trunkierte oder sekretierte Formen (z.B. eine Sequenz einer extrazellulären Domäne), natürlich vorkommende Variantenformen (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende allelische Varianten des Polypeptids. Der Ausdruck „TALL-1" umfasst jene Polypeptide, die in Shu et al., GenBank-Zugriffsnummer AF136293; WO 98/18921, veröffentlicht am 7. Mai 1998; EP 869.180 , veröffentlicht am 7. Oktober 1998; WO 98/27114, veröffentlicht am 25. Juni 1998; WO 99/12964, veröffentlicht am 18. März 1999; WO 99/33980, veröffentlicht am 8. Juli 1999; Moore et al., siehe oben; Schneider et al., siehe oben; und Mukhopadhyay et al., siehe oben, beschrieben sind.
Die Ausdrücke „APRIL" oder „APRIL-Polypeptid" umfassen bei Verwendung hierin „APRIL-Polypeptide nativer Sequenz" und „APRIL-Varianten". „APRIL" ist eine Bezeichnung, die jenen Polypeptiden verliehen wird, die kodiert werden von den Nucleinsäuremolekülen, die die in 4 gezeigten Polynucleotidsequenzen umfassen, sowie Varianten davon, Nucleinsäuremolekülen, die die in 4 gezeigte Sequenz umfassen, und Varianten davon sowie Fragmenten der obigen, die die biologische Aktivität von APRIL nativer Sequenz aufweisen. Varianten von APRIL werden vorzugsweise zumindest 80%, bevorzugter zumindest 90% und noch bevorzugter zumindest 95%, Aminosäuresequenzidentität mit dem in 4 gezeigten APRIL-Polypeptid nativer Sequenz aufweisen. Ein APRIL-Polypeptid „nativer Sequenz" umfasst ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie das entsprechende aus der Natur stammende APRIL-Polypeptid. Derartige APRIL-Polypeptide nativer Sequenz können aus der Natur isoliert oder durch rekombinante und/oder synthetische Mittel hergestellt werden. Der Ausdruck „APRIL-Polypeptid nativer Sequenz" umfasst im Speziellen natürlich vorkommende trunkierte oder sekretierte Formen (z.B. eine Sequenz einer extrazellulären Domäne), natürlich vorkommende Variantenformen (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende allelische Varianten des Polypeptids. Der Ausdruck „APRIL" umfasst jene Polypeptide, die in Hahne et al., J. Exp. Med. 188, 1185–1190 (1998); GenBank-Zugriffsnummer AF046888; WO 99/00518, veröffentlicht am 7. Jänner 1999; WO 99/12965, veröffentlicht am 18. März 1999; WO 99/33980, veröffentlicht am 8. Juli 1999; WO 97/33902, veröffentlicht am 18. September 1997; WO 99/11791, veröffentlicht am 11. März 1999; EP 911.633 , veröffentlicht am 28. März 1999; und WO 99/50416, veröffentlicht am 7. Oktober 1999, beschrieben sind.
„Prozentuelle (%) Aminosäuresequenzidentität" bezüglich der hierin identifizierten Liganden- oder Rezeptorpolypeptidsequenzen ist als jener prozentueller Anteil von Aminosäureresten in einer Kandidatsequenz definiert, die mit den Aminosäureresten in einer derartigen, hierin identifizierten Liganden- oder Rezeptorsequenz identisch sind, und zwar nach Angleichung der Sequenzen und, falls notwendig, Einführung von Lücken, um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erzielen, wobei jegliche konservative Substitutionen als Teil der Sequenzidentität unberücksichtigt blei ben. Die Angleichung zum Zwecke der Ermittlung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität kann auf zahlreiche Weisen, die dem Fachmann bekannt sind, erzielt werden, beispielsweise unter Verwendung öffentlich verfügbarer Computersoftware, wie z.B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN-, ALIGN-2- oder Megalign-(DNASTAR-)Software. Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung kann die geeigneten Parameter zur Messung der Angleichung ermitteln, einschließlich jeglichen Algorithmus, der zur Erzielung der maximalen Angleichung über die volle Länge der verglichenen Sequenzen notwendig ist. Zum Zwecke hierin werden jedoch %-Aminosäuresequenzidentitätswerte wie unten beschrieben unter Verwendung des Sequenzvergleichscomputerprogramms ALIGN-2 erlangt, wobei der vollständige Quellcode für das ALIGN-2-Programm in der unten stehenden Tabelle bereitgestellt wird. Das ALIGN-2-Sequenzvergleichscomputerprogramm wurde von Genentech, Inc., geschrieben, und der in der unten stehenden Tabelle dargestellte Quellcode ist mit einer Benutzerdokumentation beim U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, eingereicht worden, wo es unter der U.S. Copyright Registration Nr. TXU510087 registriert ist. Das ALIGN-2-Programm ist über Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien, öffentlich erhältlich oder kann vom in der untenstehenden Tabelle bereitgestellten Quellcode kompiliert werden. Das ALIGN-2-Programm sollte zur Verwendung an einem UNIX-Betriebssystem, vorzugsweise „digital UNIX V4.0D", kompiliert werden. Alle Sequenzvergleichsparameter sind vom ALIGN-2-Programm eingestellt und variieren nicht.
Tabelle – Quellcode
Zum Zwecke hierin wird die %-Aminosäuresequenzidentität einer gegebenen Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine(r) gegebene(n) Aminosäuresequenz B (was alternativ dazu auch als eine gegebene Aminosäuresequenz A ausgedrückt werden kann, die eine gewisse %-Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine(r) gegebene(n) Aminosäuresequenz B aufweist oder umfasst) wie folgt berechnet:
100 mal der Bruch X/Y
wobei X die Anzahl an Aminosäureresten ist, die durch das Sequenzangleichungsprogramm ALIGN-2 bei der Angleichung von A und B in diesem Programm als identische Übereinstimmungen gewertet werden, und wobei Y die Gesamtanzahl an Aminosäureresten in B ist. Es versteht sich, dass in dem Fall, wo die Länge der Aminosäuresequenz A nicht gleich der Länge der Aminosäuresequenz B ist, die %-Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich der %-Aminosäuresequenzidentität von B zu A ist. Als Beispiele von %-Aminosäuresequenzidentitätsberechnungen zeigen 5A–5B, wie die %-Aminosäuresequenzidentität der als „Comparison Protein" bezeichneten Aminosäuresequenz zur als „PRO" bezeichneten Aminosäuresequenz berechnet wird.
Wenn nicht anders angegeben, werden alle hierin verwendeten Werte für %-Aminosäuresequenzidentität wie oben beschrieben unter Verwendung des Sequenzvergleichscomputerprogramms ALIGN-2 erlangt. Jedoch kann die %-Aminosäuresequenzidentität auch unter Verwendung des Sequenzvergleichsprogramms NCBI-BLAST2 ermittelt werden (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389–3402 (1997)). Das Sequenzvergleichsprogramm NCBI-BLAST2 kann von der NCBI-Internetwebsite herunter geladen werden. NCBI-BLAST2 verwendet mehrere Suchparameter, worin alle diese Suchparameter auf Standardwerte eingestellt sind, einschließlich beispielsweise unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 und scoring matrix = BLOSUM62.
In Situationen, wo NCBI-BLAST2 für Aminosäuresequenzvergleiche eingesetzt wird, wird die %-Aminosäuresequenzidentität einer gegebenen Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine(r) gegebene(n) Aminosäuresequenz B (was alternativ dazu auch als eine gegebene Aminosäuresequenz A ausgedrückt werden kann, die eine gewisse %-Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine(r) gegebene(n) Aminosäuresequenz B aufweist oder umfasst) wie folgt berechnet:
100 mal der Bruch X/Y
wobei X die Anzahl an Aminosäureresten ist, die durch das Sequenzangleichungsprogramm NCBI-BLAST2 bei der Angleichung von A und B in diesem Programm als identische Übereinstimmungen gewertet werden, und wobei Y die Gesamtanzahl an Aminosäureresten in B ist. Es versteht sich, dass in dem Fall, wo die Länge der Aminosäuresequenz A nicht gleich der Länge der Aminosäuresequenz B ist, die %-Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich der %-Aminosäuresequenzidentität von B zu A ist.
Der Ausdruck „Epitop-tagged" (Epitop-markiert) bezieht sich bei Verwendung hierin auf ein Hybridpolypeptid, das ein an ein „Marker-Polypeptid" fusioniertes Polypeptid umfasst. Das Marker-Polpeptid weist eine ausreichende Anzahl an Resten auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann. Das Marker-Polypeptid ist außerdem vorzugsweise ziemlich einzigartig, sodass der Antikörper im Wesentlichen nicht mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Marker-Polypeptide weisen im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurereste und üblicherweise zwischen etwa 8 und 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen etwa 10 und 20 Aminosäurereste) auf.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „Immunadhäsin" antikörperähnliche Moleküle, die die Bindungsspezifität eines heterologen Proteins (eines „Adhäsins") mit den Effektorfunktionen von konstanten Immunglobulindomänen vereinen. Strukturell umfassen die Immunadhäsine eine Fusion einer Aminosäuresequenz mit der gewünschten Bindungsspezifität, die nicht die Antigenerkennungs- und Bindungsstel le eines Antikörpers ist (d.h. „heterolog" ist), und einer konstanten Immunglobulindomänensequenz. Der Adhäsin-Abschnitt eines Immunadhäsinmoleküls ist typischerweise eine zusammenhängende Aminosäuresequenz, die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder eines Liganden umfasst. Die konstante Immunglobulindomänensequenz im Immunadhäsin kann aus jeglichem Immunglobulin, wie z.B. IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- oder IgG-4-Subtypen, IgA (einschließlich IgA-1 und IgG-2), IgE, IgD oder IgM, erlangt werden.
Der Ausdruck „Antagonist" wird im weitesten Sinne verwendet und umfasst jegliches Molekül, das eine oder mehrere biologische Aktivitäten von TALL-1-Polypeptid, APRIL-Polypeptid oder beiden, TALL-1 sowie APRIL, in vitro, in situ oder in vivo teilweise oder vollständig blockiert, hemmt oder neutralisiert. Beispiele derartiger biologischer Aktivitäten von TALL-1- und APRIL-Polypeptiden umfassen die Bindung von TALL-1 oder APRIL an TACI oder BCMA, Aktivierung von NF-KB und Aktivierung der Proliferation und Ig-Sekretion durch B-Zellen, immunbedingte Leiden, wie z.B. rheumatische Arthritis, sowie jene, die darüber hinaus in der Literatur beschrieben sind. Ein Antagonist kann auf direkte oder indirekte Weise arbeiten. Beispielsweise kann der Antagonist so arbeiten, dass er eine oder mehrere biologische Aktivitäten von TALL-1-Polypeptid, APRIL-Polypeptid oder von beiden, TALL-1 sowie APRIL, in vitro, in situ oder in vivo als Resultat seiner direkten Bindung an TALL-1, APRIL, TACI oder BCMA teilweise oder vollständig blockiert, hemmt oder neutralisiert. Der Antagonist kann auch indirekt wirken, um eine oder mehrere biologische Aktivitäten von TALL-1-Polypeptid, APRIL-Polypeptid oder von beiden, TALL-1 sowie APRIL, in vitro, in situ oder in vivo als Resultat von z.B. Blockierung oder Hemmung eines weiteren Effektormoleküls teilweise oder vollständig zu blockieren, zu hemmen oder zu neutralisieren. Das Antagonistenmolekül kann eine „Doppel"-Antagonistenaktivität umfassen, worin das Molekül zur teilweisen oder vollständigen Blockierung, Hemmung oder Neutralisierung einer biologischen Aktivität von TALL-1 sowie APRIL fähig ist.
Der Ausdruck „Agonist" wird im weitesten Sinne verwendet und umfasst jegliches Molekül, das eine oder mehrere biologische Aktivitäten von TACI-Polypeptid, BCMA- Polypeptid oder von beiden, TACI sowie BCMA, in vitro, in situ oder in vivo teilweise oder vollständig steigert, stimuliert oder aktiviert. Beispiele derartiger biologischer Aktivitäten von TACI und BCMA umfassen Aktivierung von NF-KB, Induktion von Immunglobulinproduktion und -Sekretion und Zellproliferation sowie jene, die darüber hinaus in der Literatur beschrieben sind. Ein Agonist kann auf direkte oder indirekte Weise arbeiten. Beispielsweise kann der Agonist so arbeiten, dass er eine oder mehrere biologische Aktivitäten von TACI-Polypeptid, BCMA-Polypeptid oder von beiden, TACI sowie BCMA, in vitro, in situ oder in vivo als Resultat seiner direkten Bindung an TACI oder BCMA teilweise oder vollständig verstärkt, stimuliert oder aktiviert, was die Rezeptoraktivierung oder Signalübertragung bewirkt. Der Agonist kann auch indirekt arbeiten, um eine oder mehrere biologische Aktivitäten von TACI-Polypeptid, BCMA-Polypeptid oder von beiden, TACI sowie BCMA, in vitro, in situ oder in vivo als Resultat von z.B. Stimulation eines weiteren Effektormoleküls teilweise oder vollständig zu verstärken, zu stimulieren oder zu aktivieren, was dann die TACI- oder BCMA-Rezeptoraktivierung oder Signalübertragung bewirkt. Es ist vorgesehen, dass ein Agonist als Verstärkermolekül agieren kann, das indirekt arbeitet, um die TACI- oder BCMA-Aktivierung oder -Aktivität zu verstärken oder zu erhöhen. Zum Beispiel kann der Agonist die Aktivität von endogenem TALL-1 oder APRIL in einem Säugetier verstärken. Dies könnte beispielsweise erzielt werden, indem TACI oder BCMA vorkomplexiert werden oder indem Komplexe des entsprechenden Liganden mit dem TACI- oder BCMA-Rezeptor stabilisiert werden (wie z.B. das Stabilisieren des zwischen TALL-1 und TACI oder APRIL und TACI gebildeten nativen Komplexes).
Der Ausdruck „TALL-1-Antagonist" oder „APRIL-Antagonist" bezieht sich auf jegliches Molekül, das eine biologische Aktivität von TALL-1 bzw. APRIL oder von beiden TALL-1 und APRIL teilweise oder vollständig blockiert, hemmt oder neutralisiert, und umfasst, ist jedoch nicht eingeschränkt auf, lösliche Formen von TACI-Rezeptor oder BCMA-Rezeptor, wie z.B. eine Sequenz einer extrazellulären Domäne von TACI oder BCMA, TACI-Rezeptor-Immunadhäsine, BCMA-Rezeptor-Immunadhäsine, TACI-Rezeptor-Fusionsproteine, BCMA-Rezeptor-Fusionsproteine, kovalent modifizierte Formen von TACI-Rezeptor, kovalent modifizierte Formen von BCMA-Rezeptor, TACI-Varianten, BCMA-Varianten, TACI-Rezeptor-Antikörper, BCMA-Rezeptor- Antikörper, TALL-1-Antikörper und APRIL-Antikörper. Um zu ermitteln, ob ein TALL-1-Antagonistenmolekül eine biologische Aktivität von TALL-1 oder APRIL teilweise oder vollständig blockiert, hemmt oder neutralisiert, können Tests durchgeführt werden, um die Wirkung(en) des Antagonistenmoleküls auf z.B. die Bindung von TALL-1 oder APRIL an TACI oder an BCMA oder die NF-KB-Aktivierung durch den entsprechenden Liganden festzustellen. Derartige Tests können in bekannten In-vitro- oder In-vivo-Testformaten, z.B. in BCMA und/oder TACI exprimierenden Zellen, durchgeführt werden. Vorzugsweise wird der in den hierin beschriebenen Verfahren eingesetzte TALL-1-Antagonist fähig sein, zumindest eine Art von TALL-1-Aktivität zu blockieren oder zu neutralisieren, die gegebenenfalls in Tests, wie sie hierin beschrieben sind, bestimmt werden kann. Um zu ermitteln, ob ein APRIL-Antagonistenmolekül eine biologische Aktivität von TALL-1 oder APRIL teilweise oder vollständig blockiert, hemmt oder neutralisiert, können Tests durchgeführt werden, um die Wirkung(en) des Antagonistenmoleküls auf z.B. die Bindung von TALL-1 oder APRIL an TACI oder an BCMA oder die NF-KB-Aktivierung durch den Liganden festzustellen. Derartige Tests können in bekannten In-vitro- oder In-vivo-Formaten, z.B. unter Verwendung von Zellen, die mit TACI oder BCMA (oder mit TACI sowie BCMA) transfiziert wurden (vorzugsweise in relativ niedrigen Ausmaßen transfiziert), durchgeführt werden. Vorzugsweise wird der in den hierin beschriebenen Verfahren eingesetzte APRIL-Antagonist fähig sein, zumindest eine Art von APRIL-Aktivität zu blockieren oder zu neutralisieren, die gegebenenfalls in einem Bindungstest oder einem IgM-Produktionstest bestimmt werden kann. Gegebenenfalls wird ein TALL-1-Antagonist oder APRIL-Antagonist fähig sein, die Bindung von entweder TALL-1 oder APRIL (oder TALL-1 sowie APRIL) an TACI oder BCMA um zumindest 50%, vorzugsweise um zumindest 90%, bevorzugter um zumindest 99% und insbesondere bevorzugt um 100%, im Vergleich zu einem Negativkontrollmolekül in einem Bindungstest zu vermindern oder zu hemmen. Der TALL-1-Antagonist oder APRIL-Antagonist kann Antikörper umfassen, die die Bindung eines weiteren Liganden oder Antikörpers an TACI oder BCMA kompetitiv hemmen. Verfahren zur Ermittlung der Spezifität und Affinität von Antikörpern durch kompetitive Hemmung sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt (siehe z.B. Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Colligan et al., Cur rent Protocols in Immunology, Green Publishing Assoc., NY (1992; 1993); Muller, Meth. Enzym. 92, 589–601 (1983)).
Der Ausdruck „TACI-Agonist" oder „BCMA-Agonist" bezieht sich auf jegliches Molekül, das eine biologische Aktivität von TACI bzw. BCMA oder TACI sowie BCMA teilweise oder vollständig verstärkt, stimuliert oder aktiviert, und umfasst, ist jedoch nicht eingeschränkt auf, Anti-TACI-Rezeptor-Antikörper und Anti-BCMA-Rezeptor-Antikörper. Um zu ermitteln, ob ein TACI-Agonistenmolekül eine biologische Aktivität von TACI oder BCMA teilweise oder vollständig verstärkt, stimuliert oder aktiviert, können Tests durchgeführt werden, um die Wirkung(en) des Agonistenmoleküls beispielsweise auf PBLs oder TACI- oder BCMA-transfizierte Zellen festzustellen. Derartige Tests können in bekannten In-vitro- oder In-vivo-Testformaten durchgeführt werden. Vorzugsweise wird der in den hierin beschriebenen Verfahren eingesetzte TACI-Agonist fähig sein, zumindest eine Art von TACI-Aktivität zu verstärken oder zu aktivieren, die gegebenenfalls in Tests, wie sie hierin beschrieben sind, bestimmt werden kann. Um zu ermitteln, ob ein BCMA-Agonistenmolekül eine biologische Aktivität von TACI oder BCMA teilweise oder vollständig verstärkt, stimuliert oder aktiviert, können Tests durchgeführt werden, um die Wirkung(en) des Antagonistenmoleküls, z.B. auf eine Aktivität von APRIL oder TACI, zu beurteilen. Derartige Tests können in In-vitro- oder In-vivo-Formaten, z.B. unter Verwendung von PBLs oder TACI- oder BCMA-transfizierten Zellen, durchgeführt werden. Vorzugsweise wird der TACI-Agonist oder BCMA-Agonist fähig sein, TACI bzw. BCMA in einem Ausmaß zu stimulieren oder zu aktivieren, wie es vom nativen Liganden für die TACI- oder BCMA-Rezeptoren erzielt wird.
Der Ausdruck „Antikörper" wird im weitesten Sinne verwendet und umfasst im Speziellen beispielsweise einzelne monoklonale Antikörper gegen TALL-1, APRIL, TACI oder BCMA, Antikörperzusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität, Einzelkettenantikörper und Fragmente von Antikörpern.
Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper" bezieht sich bei Verwendung hierin auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikör pern erlangt wurde, d.h. dass die die Population umfassenden einzelnen Antikörper mit Ausnahme möglicher natürlich vorkommender Mutationen, die in geringfügigen Mengen vorhanden sein können, identisch sind. Monoklonale Antikörper sind höchst spezifisch und richten sich gegen eine einzige Antigenstelle. Darüber hinaus ist jeder monoklonale Antikörper im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, die typischerweise verschiedene, gegen unterschiedliche Determinanten (Epitope) gerichtete Antikörper umfassen, gegen eine einzige Determinante auf dem Antigen gerichtet. Zusätzlich zu ihrer Spezifität sind die monoklonalen Antikörper dahingehend vorteilhaft, als dass sie von der Hybridomkultur frei von Verunreinigung durch andere Immunglobuline synthetisiert werden. Der Modifikator „monoklonal" weist auf die Eigenschaft des Antikörpers hin, dass er aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern gewonnen wird, und ist nicht dahingehend auszulegen, als dass die Produktion des Antikörpers durch irgendein bestimmtes Verfahren erforderlich ist. Beispielsweise können die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden monoklonalen Antikörper mit dem erstmals von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschriebenen Verfahren hergestellt werden oder können durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden (siehe z.B. US-Patent Nr. 4.816.567). Die „monoklonalen Antikörper" können außerdem aus Phagenantikörperbibliotheken unter Anwendung der beispielsweise in Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991), beschriebenen Techniken isoliert werden.
Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen im Speziellen „Hybrid"-Antikörper (Immunglobuline), bei denen ein Abschnitt der Schwer- und/oder Leichtkette mit/zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern identisch oder homolog ist, die aus einer bestimmten Spezies stammen oder einer bestimmten Antiköperklasse oder -unterklasse angehören, während der Rest der Kette(n) mit/zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern identisch oder homolog ist, die aus einer anderen Spezies stammen oder einer anderen Antikörperklasse oder -unterklasse angehören, sowie Fragmente derartiger Antikörper, solange sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen (US-Patent Nr. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984)). Verfahren zur Herstellung von Hybridantikörpern sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
„Humanisierte" Formen nicht-menschlicher (z.B. muriner) Antikörper sind Hybridimmunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere antigenbindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine vom nicht-menschlichen Immunglobulin abstammende Minimalsequenz enthalten. Humanisierte Antikörper sind meistens menschliche Immunglobuline (Empfängerantikörper), bei denen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Empfängers durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie z.B. Maus, Ratte oder Kaninchen mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität, ersetzt sind. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstregion-(FR-)Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Darüber hinaus können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die sich weder im Empfängerantikörper noch in den importieren CDR- oder Gerüstsequenzen finden. Diese Modifizierungen werden vorgenommen, um die Leistungsfähigkeit des Antikörpers weiter zu verfeinern und zu maximieren. Im Allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen umfassen, in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulinsequenz sind. Der humanisierte Antikörper wird im Optimalfall außerdem zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins, umfassen. Für weitere Einzelheiten siehe Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992). Der humanisierte Antikörper umfasst einen PRIMATIZED^TM-Antikörper, worin die antigenbindende Region des Antikörpers von einem Antikörper stammt, der durch Immunisierung von Makaken mit dem Antigen von Interesse hergestellt wird. Verfahren zur Herstellung humanisierter Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Menschliche Antikörper können außerdem unter Anwendung von verschiedenen, auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Techniken, wie z.B. Phagen-Display-Bibliotheken, hergestellt werden. Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991). Die Techniken von Cole et al. und Boerner et al. sind zur Herstellung menschlicher monoklonaler Antikörper ebenfalls verfügbar. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86–95 (1991).
Unter „isoliert" wird bei Verwendung zur Beschreibung der verschiedenen hierin offenbarten Proteine Protein verstanden, das identifiziert und von/aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung abgetrennt und/oder gewonnen worden ist. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise die diagnostischen und therapeutischen Verwendungen für das Protein stören und umfassen Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nicht proteinartige Gelöststoffe. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Protein gereinigt, und zwar (1) auf ein Ausmaß, das zur Erlangung von zumindest 15 Resten N-terminaler oder interner Aminosäuresequenz durch Verwendung eines Spinning-Cup-Sequenators ausreicht, oder (2) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfärbung. Isoliertes Protein umfasst Protein in situ innerhalb rekombinanter Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Proteins nicht vorhanden ist. Für gewöhnlich wird jedoch ein isoliertes Protein durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
„Behandlung" oder „Therapie" bezieht sich auf therapeutische Behandlung sowie prophylaktische oder präventive Maßnahmen.
„Säugetier" bezieht sich zum Zwecke der Behandlung oder Therapie auf jegliches als Säugetier klassifiziertes Tier, einschließlich Mensch, Haus- und Nutztiere, und Zoo-, Sport- oder Haustiere, wie z.B. Hunde, Pferde, Katzen, Rinder usw. Vorzugsweise ist das Säugetier der Mensch.
„TALL-1-bedingter Krankheitszustand" und „APRIL-bedingter Krankheitszustand" beziehen sich auf Pathologien oder Zustände, die mit abnormalen Ausmaßen der Expression oder Aktivität von TALL-1 bzw. APRIL in Verbindung stehen, die die Ausmaße der Expression oder Aktivität in normalen gesunden Säugetieren überschreiten oder unterschreiten, wobei derartige erhöhte oder verminderte Ausmaße systemisch, lokalisiert oder in einem bestimmten Gewebe- oder Zelltyp oder Ort im Körper auftreten. TALL-1-bedingte Krankheitszustände und APRIL-bedingte Krankheitszustände umfassen akute und chronische immunbedingte Krankheiten und Krebsformen.
Die Ausdrücke „Krebs", „kanzerös", „bösartig" und „maligne" beziehen sich auf oder beschreiben den physiologischen Zustand in Säugetieren, der typischerweise durch unreguliertes Zellwachstum gekennzeichnet ist. Beispiele von Krebs umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Karzinome, einschließlich Adenokarzinom, Lymphom, Blastom, Melanom, Sarkom und Leukämie. Speziellere Beispiele derartiger Krebsformen umfassen Plattenepithelkrebs, kleinzelligen Lungenkrebs, nicht-kleinzelligen Lungenkrebs, Magen-Darm-Krebs, Hodgkin- und Nicht-Hodgkin-Lymphom, Pankreaskrebs, Glioblastom, Zervixkrebs, Eierstockkrebs, Leberkrebs, wie z.B. Leberkarzinom und Hepatom, Blasenkrebs, Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Kolon-Rektum-Krebs, Endometriumkrebs, Speicheldrüsenkrebs, Nierenkrebs, wie z.B. Grawitz-Tumor und Wilms-Tumoren, Basalzellenkarzinom, Melanom, Prostatakrebs, Vulvakrebs, Schilddrüsenkrebs, Hodenkrebs, Speiseröhrenkrebs und verschiedene Arten von Kopf- und Nackenkrebs. Gegebenenfalls wird der Krebs mit der Krebszelle assoziiertes TALL-1, APRIL, TACI oder BCMA aufweisen oder diese exprimieren. Beispielsweise wurde von Dickdarm-, Lungen- und Melanom-Krebsformen in der Literatur berichtet, dass sie APRIL exprimieren. Die bevorzugten Krebsformen zur Behandlung hierin umfassen Lymphom, Leukämie und Myelom sowie Unterarten davon, wie z.B. Burkitt-Lymphom, multiples Myelom, akute lymphoblastische oder lymphozytische Leukämie, Nicht-Hodgkin- und Hodgkin-Lymphom und akute myeloische Leukämie.
Unter dem Ausdruck „immunbedingte Krankheit" wird eine Krankheit verstanden, bei der eine Komponente des Immunsystems eines Säugetiers eine Morbidität im Säugetier bewirkt, vermittelt oder anderweitig dazu beiträgt. Ebenso umfasst sind Krankheiten, bei denen die Stimulation oder Intervention der Immunreaktion eine bessernde Wirkung auf den Fortschritt der Krankheit hat. In diesem Ausdruck umfasst sind Autoimmunerkrankungen, immunvermittelte entzündliche Krankheiten, nicht-immunvermittelte entzündliche Krankheiten, infektiöse Krankheiten und Immunschwächeerkrankungen. Beispiele von immunbedingten und entzündlichen Krankheiten, wovon einige immun- oder T-Zellen-vermittelt sind, die gemäß der Erfindung behandelt werden können, umfassen systemische Lupus erythematosus, rheumatische Arthritis, juvenile chronische Arthritis, Spondyloarthropathien, systemische Sklerose (Skleroderma), idiopathische entzündliche Myopathien (Dermatomyositis, Polymyositis), Sjögren-Syndrom, systemische Vaskulitis, Sarkoidose, Autoagglutinationsanämie (Immunpancytopenie, paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie), Autoimmun-Thrombocytopenie (idiopathische thrombocytopenische Purpura, immunvermittelte Thrombocytopenie), Thyreoiditis (Graves-Krankheit, Hashimoto-Thyreoiditis, juvenile lymphozytische Thyreoiditis, atrophische Thyreoiditis), Diabetes mellitus, immunvermittelte Nierenkrankheit (Glomerulonephritis, tubulointerstitielle Nephritis), Demyelinationskrankheiten des zentralen und peripheren Nervensystems wie z.B. multiple Sklerose, idiopathische Demyelinationspolyneuropathie oder Landry-Guillain-Barré-Syndrom und chronische entzündliche Demyelinationspolyneuropathie, Leber-Gallen-Krankheiten wie z.B. infektiöse Hepatitis (Hepatitis-A-, -B-, -C-, -D-, -E- und andere nicht-hepatotrope Viren), chronisch aktive Autoimmun-Hepatitis, primäre biliäre Zirrhose, granulomatöse Hepatitis und sklerosierende Cholangitis, entzündliche und fibrotische Lungenkrankheiten, wie z.B. entzündliche Darmerkrankung (ulzeröse Kolitis: Crohn-Krankheit), Heubner-Herter'sche Krankheit und Whipple-Krankheit, Autoimmun- oder immunvermittelte Hautkrankheiten, einschließlich Hautblasenkrankheiten, Erythema multiforma und Kontaktdermatitis, Psoriasis, allergische Krankheiten, wie z.B. Asthma, allergische Rhinitis, atopische Dermatitis, Nahrungsmittelallergie und Urtikaria, immunologische Krankheiten der Lunge, wie z.B. eosinophile Pneumonie, idiopathische Lungenfibrose und exogene allergische Alveolitis, mit Transplantationen in Verbindung stehende Krankheiten, wie z.B. Transplantatabstoßung und Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit. Infektiöse Krankheiten umfassen AIDS (HIV-Infektion), Hepatitis A, B, C, D und E, bakterielle Infektionen, Pilzinfektionen, Protozoeninfektionen und Parasiteninfektionen.
„Autoimmunerkrankung" wird hierin in einem breiten, allgemeinen Sinn verwendet, um sich auf Störungen und Zustände in Säugetieren zu beziehen, bei denen eine Zerstörung von normalem oder gesundem Gewebe von humoralen oder zellulären Immunreaktionen des jeweiligen Säugetiers gegen seine oder ihre eigenen Gewebekomponenten herrührt. Beispiele umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Lupus erythematodes, Thyreoiditis, rheumatische Arthritis, Psoriasis, multiple Sklerose, Autoimmundiabetes und entzündliche Darmerkrankung (IBD).
Der Ausdruck „cytotoxisches Mittel" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine Substanz, die die Funktion von Zellen hemmt oder verhindert und/oder die Zerstörung von Zellen bewirkt. Der Ausdruck umfasst radioaktive Isotope (z.B. I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰ und Re¹⁸⁶), chemotherapeutische Mittel und Toxine wie z.B. enzymatisch aktive Toxine bakteriellen, pilzlichen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder Fragmente davon.
Ein „chemotherapeutisches Mittel" ist eine chemische Verbindung, die bei der Krankheitsbehandlung zweckdienlich ist. Beispiele chemotherapeutischer Mittel umfassen Adriamycin, Doxorubicin, Epirubicin, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid („Ara-C"), Cyclophosphamid, Thiotepa, Busulfan, Cytoxin, Taxoide, z.B. Paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) und Doxetaxel (Taxotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Rnace), Toxotere, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, CPT-11, Vinblastin, Bleomycin, Etoposide, Ifosfamid, Mitomycin C, Mitoxantron, Vincristin, Vinorelbin, Carboplatin, Teniposid, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycine, Esperamicine (siehe US-Patent Nr. 4.675.187), Melphalan und andere verwandte Stickstofflosts. In dieser Definition ebenfalls umfasst sind hormonelle Mittel, die die Hormonwirkung regulieren oder hemmen, wie z.B. Tamoxifen und Onapriston.
Ein „wachstumshemmendes Mittel" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine Verbindung oder Zusammensetzung, die das Wachstum einer Zelle entweder in vitro oder in vivo hemmt. Folglich ist ein wachstumshemmendes Mittel eines, das den prozentuellen Anteil an Zellen, die derartige Gene in der S-Phase überexprimieren, signifikant vermindert. Beispiele von wachstumshemmenden Mitteln umfassen Mittel, die das Forschreiten des Zellzyklus blockieren (an einer Stelle, die nicht die S-Phase ist), wie z.B. Mittel, die G1-Arretierung und M-Phasen-Arretierung induzieren. Klassische M-Phasenblocker umfassen die Vincas-(Vincristin und Vinblastin), Taxol- und Topo-II-Inhibitoren, wie z.B. Doxorubicin, Epirubicin, Daunorubicin, Etoposid und Bleomycin. Jene Mittel, die G1 arretieren, spiele auch bei der S-Phasen-Arretierung eine Rolle, beispielsweise DNA-alkylierende Mittel, wie z.B. Tamoxifen, Prednison, Dacarbazin, Mechlorethamin, Cisplatin, Methotrexat, 5-Fluoruracil und Ara-C. Weitere Informationen finden sich in The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn und Israel (Hrsg.), Kapitel 1, mit dem Titel „Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" von Murakami et al., WB Saunders, Philadelphia (1995), insbesondere S. 13.
Der Ausdruck „Cytokin" ist ein allgemeiner Begriff für Proteine, die durch eine Zellpopulation freigesetzt werden, die auf eine andere Zelle als intrazelluläre Vermittler wirken. Beispiele derartiger Cytokine sind Lymphokine, Monokine und herkömmliche Polypeptidhormone. Von den Cytokinen umfasst sind Wachstumshormon, wie z.B. menschliches Wachstumshormon, menschliches N-Methionyl-Wachstumshormon und Rinderwachstumshormon; Parathormon; Thyroxin; Insulin; Proinsulin; Relaxin; Prorelaxin; Glykoproteinhormone, wie z.B. follikelstimulierendes Hormon (FSH), thyroidstimulierendes Hormon (TSH) und luteinisierendes Hormon (LH); Leberwachstumsfaktor; Fibroblastenwachstumsfaktor; Prolactin; Plazentalaktogen; Tumornekrosefaktor-α und -β; Muller-hemmende Substanz; Maus-Gonadotropin-assoziiertes Peptid; Inhibin; Activin; Gefäßendothelwachstumsfaktor; Integrin; Thrombopoietin (TPO); Nervenwachstumsfaktoren; Blutplättchenwachstumsfaktor; transformierende Wachstumsfaktoren (TGFs), wie z.B. TGF-α und TGF-β; Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-I und -II; Erythropoietin (EPO); osteoinduktive Faktoren; Interferone, wie z.B. Interferon-α, -β und -gamma; koloniestimulierende Faktoren (CSFs), wie z.B. Makrophagen-CSF (M-CSF); Granulozyten-Makrophagen-CSF (GM-CSF); und Granulozyten-CSF (G-CSF); Interleukine (ILs), wie z.B. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-8, IL-11, IL-12; und andere Polypeptidfaktoren, einschließlich LIF und kit-Ligand (KL). Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck Cytokin Proteine aus natürlichen Quellen oder aus rekombinanter Zellkultur und biologisch aktive Äquivalente der Cytokine nativer Sequenz.
II. Verfahren und Materialien
Im Allgemeinen umfassen Verfahren zur Modulierung der TALL-1, APRIL-, TACI- und/oder BCMA-Aktivität in Säugetierzellen das Exponieren der Zellen mit einer gewünschten Menge Antagonist oder Agonist, der die TALL-1- oder APRIL-Wechselwirkung mit TACI oder BCMA beeinflusst. Vorzugsweise wird die eingesetzte Menge an Antagonist oder Agonist eine Menge sein, die wirksam ist, um die Bindung und/oder Aktivität des entsprechenden Liganden oder entsprechenden Rezeptors zu beeinflussen, um eine therapeutische Wirkung zu erzielen. Dies kann in vivo oder ex vivo, beispielsweise gemäß den unten und in den Beispielen beschriebenen Verfahren, erzielt werden. Beispielhafte Leiden oder Störungen, die mit derartigen TALL-1-Antagoisten oder APRIL-Antagonisten zu behandeln sind, umfassen Leiden in Säugetieren, die klinisch als Autoimmunerkrankungen bezeichnet werden, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, rheumatische Arthritis, multiple Sklerose, Psoriasis und Lupus oder andere Krankheitszustände, bei denen (die) B-Zellen-Reaktion(en) in Säugetieren abnormal upreguliert ist, wie z.B. bei Krebs. Wie in den unten stehenden Beispielen gezeigt wird, bewirkten TACI-Immunadhäsinmoleküle eine wesentliche Hemmung von durch Immunisierung mit Kollagen Typ II induzierter arthritischer Erkrankung, Verminderung der Gelenksentzündung und Bildung von Anti-Kollagen-Antikörpern, Verhinderung von Knochen- und Knorpelzerstörung und Blockierung der Stimulation autoreaktiver T-Zellen. Diese Ergebnisse bedeuten, dass TACI mit T-Zellen-vermittelter Autoimmunität in Verbindung steht, und legen nahe, dass die Blockierung oder Hemmung von TACI-Wechelwirkungen mit TALL-1 und/oder APRIL einen therapeutischen Nutzen für Autoimmunerkrankungen, wie z.B. RA, haben könnte. Beispielhafte Leiden oder Störungen, die mit TACI-Agonisten oder BCMA-Agonisten zu behandeln sind, umfassen Immundefizienz und Krebs.
Diagnostische Verfahren werden ebenfalls beschrieben. Beispielsweise können die Antagonisten oder Agonisten eingesetzt werden, um die jeweiligen Liganden (TALL-1 oder APRIL) oder Rezeptoren (TACI oder BCMA) in Säugetieren nachzuweisen, die bekanntermaßen einen TALL-1-bedingten Krankheitszustand oder APRIL-bedingten Krankheitszustand aufweisen oder bei denen dies vermutet wird. Das Antagonisten- oder Agonistenmolekül kann z.B. in Immuntests verwendet werden, um TALL-1 oder APRIL in einer Probe nachzuweisen oder zu quantifizieren. Eine Probe, wie z.B. aus einem Tier erlangte Zellen, kann in Gegenwart eines markierten Antagonisten- oder Agonistenmoleküls inkubiert und der Nachweis des in der Probe gebundenen, markierten Antagonisten oder Agonisten durchgeführt werden. Derartige Tests, einschließlich verschiedene klinische Testverfahren, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise in Voller et al., Immunoassays, University Park (1981), beschrieben.
A. Materialien
Die Antagonisten und Agonisten, die im Verfahren eingesetzt werden können, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, lösliche Formen von TACI- und BCMA-Rezeptoren, TACI-Rezeptor-Immunadhäsine und BCMA-Rezeptor-Immunadhäsine, TACI oder BCMA umfassende Fusionsproteine, kovalent modifizierte Formen von TACI oder BCMA, TACI-Rezeptorvarianten und BCMA-Rezeptorvarianten, TACI- oder BCMA-Rezeptorantikörper und TALL-1 oder APRIL-Antikörper. Verschiedene Techniken, die zur Herstellung der Antagonisten und Agonisten eingesetzt werden können, werden unten beschrieben.
Im Allgemeinen können die Zusammensetzungen unter Anwendung rekombinanter Techniken hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Die unten stehende Beschreibung bezieht sich auf Verfahren der Herstellung derartiger Polypeptide durch Kultivieren von Wirtszellen, die mit einem Vektor transformiert oder transfiziert sind, der die kodierende Nucleinsäure enthält, und das Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur. (Siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989); Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995).)
Die für das gewünschte Polypeptid kodierende Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA) kann in einen replizierbaren Vektor zur weiteren Klonierung (Amplifikation von DNA) oder zur Expression insertiert werden. Es sind verschiedene Vektoren öffentlich erhältlich. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, eine oder mehrere der folgenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz, wobei alle davon unten beschrieben werden. Optionale Signalsequenzen, Replikationsstartpunkte, Markergene, Enhancer-Elemente und Transkriptionsterminationssequenzen, die eingesetzt werden können, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und in WO 97/25428 ausführlicher beschrieben.
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der vom Wirtsorganismus erkannt wird und operabel an die kodierende Nucleinsäuresequenz gebunden ist. Promotoren sind untranslatierte Sequenzen, die sich stromauf (5') des Startcodons eines Strukturgens befinden (im Allgemeinen innerhalb von 100 bis 1.000 bp), die die Transkription und Translation einer bestimmten Nucleinsäuresequenz kontrollieren, an die sie operabel gebunden sind. Derartige Promotoren fallen typischerweise in zwei Klassen, induzierbare und konstitutive. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die erhöhte Transkriptionsausmaße aus DNA unter ihrer Kontrolle als Reaktion auf eine gewisse Änderung der Kultivierungsbedingungen, z.B. die Gegenwart oder Abwesenheit eines Nährstoffs oder eine Temperaturänderung, auslösen. Derzeit ist eine große Anzahl an Promotoren wohlbekannt, die von einer Reihe möglicher Wirtszellen erkannt werden. Diese Promotoren werden operabel an die kodierende DNA gebunden, indem der Promotor durch Restriktions enzymverdau aus der Quell-DNA entfernt und die isolierte Promotorsequenz in den Vektor insertiert wird.
Zur Verwendung mit prokaryotischen und eukaryotischen Wirten geeignete Promotoren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden in WO 97/25428 ausführlicher beschrieben.
Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der oben aufgezählten Komponenten enthalten, setzt standardmäßige Ligationstechniken ein. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, maßgeschneidert und in der gewünschten Form neu ligiert, um die erforderlichen Plasmide zu erzeugen. Zur Analyse zur Bestätigung korrekter Sequenzen in konstruierten Plasmiden können die Ligationsgemische verwendet werden, um E. coli K12, Stamm 294 (ATCC 31.446), zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten können durch Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenz ausgewählt werden, wo geeignet. Plasmide aus den Transformanten werden hergestellt, mittels Restriktionsendonucleaseverdau analysiert und/oder unter Anwendung von Standardtechniken sequenziert, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind (siehe z.B. Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981); Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980)).
Es können Expressionsvektoren eingesetzt werden, die für die vorübergehende Expression der kodierenden DNA in Säugetierzellen sorgen. Im Allgemeinen umfasst die vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der fähig ist, sich in einer Wirtszelle effizient zu replizieren, sodass die Wirtszelle zahlreiche Kopien des Expressionsvektors akkumuliert und dann hohe Ausmaße eines gewünschten Polypeptids synthetisiert, das vom Expressionsvektor kodiert wird (Sambrook et al., siehe oben). Vorübergehende Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen die bequeme positive Identifizierung von durch klonierte DNAs exprimierten Polypeptiden sowie das schnelle Screenen derartiger Polypeptide auf gewünschte biologische oder physiologische Eigenschaften.
Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Anpassung an die Synthese des gewünschten Polypeptids in rekombinanter Vertebratenzellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40–46 (1979); EP 117.060 ; und EP 117.058 beschrieben.
Geeignete Wirtszellen zur Klonierung und Expression der DNA in Vektoren hierin umfassen Prokaryoten-, Hefe- oder höhere eukaryotische Zellen. Geeignete Prokaryoten zu diesem Zweck umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Eubakterien, wie z.B. Gram-negative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae, wie z.B. Escherichia, z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli, wie z.B. B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z.B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle minimale Mengen proteolytischer Enzyme sekretieren.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroorganismen, wie z.B. Fadenpilze oder Hefe, geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für Vektoren. Geeignete Wirtszellen zur Expression glykosylierter Polypeptide stammen aus mehrzelligen Organismen. Beispiele aller derartiger Wirtszellen sind in WO 97/25428 näher beschrieben.
Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen Expressions- und Klonierungsvektoren transfiziert und vorzugsweise transformiert und in Nährmedien kultiviert, die zum Induzieren von Promotoren, Selektieren von Transformanten oder Amplifizieren der für die gewünschten Sequenzen kodierenden Gene in geeigneter Weise modifiziert sind.
Transfektion bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle unabhängig davon, ob jegliche kodierenden Sequenzen tatsächlich exprimiert werden oder nicht. Dem gewöhnlichen Fachmann sind zahlreiche Transfektionsverfahren bekannt, beispielsweise CaPO₄ und Elektroporation. Eine erfolgreiche Transfektion wird im Allgemeinen erkannt, wenn irgendein Anzeichen der Funktion dieses Vektors in der Wirtszelle auftritt.
Unter Transformation wird die Einführung von DNA in einen Organismus verstanden, sodass die DNA replizierbar ist, entweder als extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration. In Abhängigkeit von den verwendeten Wirtszellen wird die Transformation unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die für derartige Zellen geeignet sind. Die Calciumchlorid einsetzende Calciumbehandlung, wie sie von Sambrook et al., siehe oben, beschrieben wird, oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation gewisser Pflanzenzellen verwendet, wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und in der am 29. Juni 1989 veröffentlichten WO 89/05859 beschrieben wird. Zusätzlich können Pflanzen unter Anwendung von Ultraschallbehandlung transfiziert werden, wie in der am 10. Jänner 1991 veröffentlichten WO 91/00358 beschrieben wird.
Für Säugetierzellen ohne derartige Zellwände kann das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham und van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), eingesetzt werden. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystem-Transformationen sind im US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979), durchgeführt. Jedoch können andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, wie z.B. durch Kernmikroinjektion, Elektroporation, Bakterienprotoplastenfusion mit intakten Zellen, oder Polykationen, z.B. Polybren, Polyornithin, ebenfalls verwendet werden. Zu verschiedenen Techniken der Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
Prokaryotische Zellen können in geeigneten Kulturmedien wie allgemein von Sambrook et al., siehe oben, beschrieben kultiviert werden. Beispiele von im Handel erhältlichen Kulturmedien umfassen Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium („MEM", Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium („DMEM", Sigma). Jedes derartige Medium kann wie erforderlich mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z.B. Insulin, Transferrin oder Epidermiswachstumsfaktor), Salzen (wie z.B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z.B. HEPES), Nucleosiden (wie z.B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z.B. Gentamycin^TM-Medikament), Spurenelementen (als anorganische Verbindungen definiert, die üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorhanden sind) und Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Beliebige andere notwendige Ergänzungen können ebenfalls in geeigneten Konzentrationen enthalten sein, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung üblicherweise bekannt sind. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH und dergleichen, sind jene, die mit der zur Expression gewählten Wirtszelle früher verwendet worden sind, und sind dem Durchschnittsfachmann offensichtlich.
Im Allgemeinen finden sich Prinzipien, Arbeitsvorschriften und praktische Techniken zur Maximierung der Produktivität von Säugetierzellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991).
Die exprimierten Polypeptide können aus dem Kulturmedium als sekretiertes Polypeptid gewonnen werden, obgleich sie auch aus Wirtszelllysaten gewonnen werden können, wenn sie direkt ohne ein Sekretionssignal produziert werden. Falls das Polypeptid membrangebunden ist, kann es unter Verwendung einer geeigneten Tensidlösung (z.B. Triton-X 100) aus der Membran freigesetzt werden, oder es kann seine extrazelluläre Region durch enzymatische Spaltung freigesetzt werden.
Wenn das Polypeptid in einer rekombinanten Zelle produziert wird, die nicht menschlichen Ursprungs ist, ist es frei von Proteinen oder Polypeptiden menschlichen Ursprungs. Jedoch ist es üblicherweise notwendig, das Polypeptid aus rekombinanten Zellproteinen oder -polypeptiden zu gewinnen oder zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die im Wesentlichen homogen sind. Als erster Schritt kann das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert werden, um partikuläre Zelltrümmer zu entfernen.
Die folgenden Verfahren sind beispielgebend für geeignete Reinigungsverfahren: mittels Fraktionierung an einer Ionentauschersäule; Ethanolpräzipitation; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Silika oder an einem Kationentauscherharz, wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatpräzipitation; Gelfiltration, unter Verwendung von z.B. Sephadex G-75; und Protein-A-Sepharose-Säulen, um Verunreinigungen, wie z.B. IgG, zu entfernen.
TACI-Rezeptorvarianten und BCMA-Rezeptorvarianten können unter Verwendung einer beliebigen Technik auf dem Gebiet der Erfindung hergestellt werden. Die Rezeptorvarianten können durch Einführen geeigneter Nucleotidänderungen in die Rezeptor-DNA und/oder durch Synthese des gewünschten Rezeptorpolypeptids hergestellt werden. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung werden anerkennen, dass Aminosäureänderungen posttranslationelle Prozesse des Rezeptors verändern können, wie z.B. die Änderung der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen oder Änderung der Membranverankerungseigenschaften.
Variationen im Rezeptor nativer Sequenz oder in verschiedenen Domänen der hierin beschriebenen Rezeptoren können beispielsweise unter Anwendung beliebiger Techniken und Anleitungen für konservative und nicht-konservative Mutationen vorgenommen werden, die beispielsweise im US-Patent Nr. 5.364.934 dargelegt sind. Variationen können eine Substitution, Deletion oder Insertion von einem oder mehreren Codons sein, die für den Rezeptor kodieren, die in einer Änderung der Aminosäuresequenz des Rezeptors im Vergleich zum Rezeptor nativer Sequenz resultiert. Gegebenenfalls erfolgt die Variation durch Substitution von zumindest einer Aminosäure durch jegliche andere Aminosäure in einer oder mehreren Domänen des Rezeptors. Eine Entscheidungshilfe bei der Ermittlung der Aminosäurereste, die insertiert, substituiert oder deletiert werden können, ohne die gewünschte Aktivität zu beeinträchtigen, liefert der Vergleich der Sequenz des Rezeptors mit jener homologer bekannter Proteinmoleküle und Minimierung der Anzahl an Aminosäuresequenzänderungen, die in Regionen hoher Homologie vorgenommen werden. Aminosäuresubstitutionen können das Resultat des Ersetzens einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften sein, wie z.B. der Ersatz eines Leucins durch ein Serin, d.h. konservative Aminosäureersetzungen. Insertionen oder Deletionen können gegebenenfalls im Bereich von etwa 1 bis 5 Aminosäuren liegen. Die erlaubte Variation kann ermittelt werden, indem systematisch Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in der Sequenz vorgenommen und die resultierenden Varianten auf Aktivität getestet werden, die von der Volllängen- oder reifen Nativsequenz gezeigt wird.
TACI- oder BCMA-Polypeptidfragmente werden hierin bereitgestellt. Derartige Fragmente können am N-Terminus oder C-Terminus trunkiert sein oder es können interne Reste fehlen, beispielsweise im Vergleich zu einem nativen Protein voller Länge. Gewissen Fragmenten fehlen Aminosäurereste, die für eine gewünschte biologische Aktivität des Rezeptorpolypeptids nicht essenziell sind. Gegebenenfalls umfassen die TACI- oder BCMA-Polypeptidfragmente ECD-Deletionsvarianten, bei denen ein oder mehrere Aminosäurereste vom N-Terminus oder C-Terminus der Rezeptor-ECD-Sequenz deletiert worden sind. Vorzugsweise weisen derartige ECD-Deletionsvarianten zumindest eine biologische Aktivität im Vergleich zur nativen Rezeptorsequenz auf.
TACI- oder BCMA-Fragmente können auf jegliche von zahlreichen herkömmlichen Techniken hergestellt werden. Gewünschte Peptidfragmente können chemisch synthetisiert werden. Ein alternativer Ansatz umfasst das Erzeugen von Rezeptorfragmenten durch enzymatischen Verdau, z.B. durch Behandeln des Proteins mit einem Enzym, das bekanntermaßen Proteine an Stellen spaltet, die durch bestimmte Aminosäurereste definiert sind, oder durch Verdauen der DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen und Isolieren des gewünschten Fragments. Noch eine weitere geeignete Technik umfasst das Isolieren und Amplifizieren eines für ein gewünschtes Polypeptidfragment kodierenden DNA-Fragments durch Polymerasekettenreaktion (PCR). Oligonucleotide, die die gewünschten Termini des DNA-Fragments definieren, werden als die 5'- und 3'-Primer in der PCR eingesetzt.
Konservative Substitutionen von Interesse sind in Tabelle 1 unter der Überschrift „Bevorzugte Substitutionen" dargestellt. Falls derartige Substitutionen in einer Verän derung der biologischen Aktivität resultieren, dann werden substantiellere Änderungen, die in Tabelle 1 beispielhafte Substitutionen genannt sind oder wie sie unten in Bezug auf Aminosäureklassen ausführlicher beschrieben sind, eingeführt und die Produkte gescreent.
Tabelle 1
Wesentliche Modifizierungen der Funktion oder immunologischen Identität des Rezeptorpolypeptids werden erzielt, indem Substitutionen gewählt werden, die sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Erhaltung (a) der Struktur des Polypeptidgerüsts im Bereich der Substitution, beispielsweise als Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküle an der Zielstelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette signifikant unterscheiden. Natürlich vorkommende Reste werden auf Basis gemeinsamer Seitenketteneigenschaften in Gruppen unterteilt:

(1) hydrophob: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutral hydrophil: Cys, Ser, Thr;
(3) sauer: Asp, Glu;
(4) basisch: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) Reste, die die Kettenausrichtung beeinflussen: Gly, Pro; und
(6) aromatisch: Trp, Tyr, Phe.

Nicht-konservative Substitutionen bedingen üblicherweise das Austauschen eines Elements einer dieser Klassen durch eine andere Klasse. Derartige substituierte Reste können außerdem in konservative Substitutionsstellen oder bevorzugter in die verbleibenden (nicht-konservierten) Stellen eingeführt werden.
Die Variationen können unter Anwendung von Verfahren vorgenommen werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z.B. Oligonucleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, Alanin-Scanning und PCR-Mutagenese. Ortsgerichtete Mutagenese (Carter et al., Nucl. Acids Res. 13, 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)), Kassettenmutagenese (Wells et al., Gene 34, 315 (1985)), Restriktionsselektionsmutagenese (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)) und andere bekannte Techniken können an der klonierten DNA durchgeführt werden, um die Rezeptor-Varianten-DNA herzustellen.
Scanning-Aminosäureanalyse kann ebenfalls eingesetzt werden, um eine oder mehrere Aminosäuren entlang einer zusammenhängenden Sequenz zu identifizieren. Unter den bevorzugten Scanning-Aminosäuren sind relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Derartige Aminosäuren umfassen Alanin, Glycin, Serin und Cystein. Alanin ist typischerweise eine bevorzugte Scanning-Aminosäure in dieser Gruppe, da sie die Seitenkette über den β-Kohlenstoff hinaus eliminiert und mit geringerer Wahrscheinlichkeit die Hauptkettenkonformation der Variante beeinflusst (Cunningham und Wells, Science 244, 1081–1085 (1989)). Alanin ist außerdem typischerweise bevorzugt, da es die häufigste Aminosäure ist. Darüber findet es sich häufig in verborgenen und exponierten Positionen (Creighton, The Proteins, W. H. Freeman & Co, N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150, 1 (1976)). Falls Alanin-Substitution keine ausreichende Mengen an Variante liefert, kann eine isostere Aminosäure verwendet werden.
Lösliche Formen von TACI-Rezeptoren und BCMA-Rezeptoren können auch als Antagonisten eingesetzt werden. Derartige lösliche Formen von TACI oder BCMA können aus extrazellulären Domänen des jeweiligen Rezeptors bestehen oder diese umfassen (und die Transmembrandomänen und intrazellulären Domänen des jeweiligen Rezeptors können fehlen). Die extrazellulären Domänensequenzen von TACI oder BCMA können selbst als Antagonisten verwendet werden oder können wie unten beschrieben weiter modifiziert werden (wie z.B. durch Fusionieren an Immunglobulin, Epitop-Marker oder Leucin-Zipper). Gewisse Regionen extrazellulärer Domänen von TACI und BCMA sind in der Literatur beschrieben worden und könnten unter Anwendung von Techniken eingehender beschrieben werden, die dem geübten Fachmann bekannt sind. Die Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung sind üblicherweise in der Lage, ohne übermäßiges Experimentieren eine gewünschte extrazelluläre Domänensequenz von entweder TACI oder BCMA auszuwählen, um sie als Antagonist einzusetzen.
Immunadhäsinmoleküle können in den Verfahren hierin verwendet werden. TACI-Rezeptor-Immunadhäsine können verschiedene Formen von TACI umfassen, wie z.B. das Polypeptid voller Länge sowie lösliche Formen des Rezeptors, die eine extrazelluläre Domänen-(ECD-)Sequenz oder eine Fragment der ECD-Sequenz umfassen. Das Molekül kann eine Fusion eines TACI-Rezeptors mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine bivalente Form von Immunadhäsin könnte eine derartige Fusion die an die Fc-Region eines IgG-Moleküls sein. Die Ig-Fusionen umfassen vorzugsweise die Substitution einer löslichen (Transmembrandomänen-deletierten oder inaktivierten) Form des Rezeptorpolypeptids anstelle von zumindest einer variablen Region in einem Ig-Molekül. Die Immunglobulinfusion kann die Gelenk-, CH2- und CH3- oder die Gelenk-, CH1-, CH2- und CH3-Regionen eines IgG1-Moleküls umfassen. Zur Produktion von Immunglobulinfusionen siehe auch US-Patent Nr. 5.428.130, ausgegeben am 27. Juni 1995, und Chamow et al., TIBTECH 14, 52–60 (1996).
Die einfachste und unkomplizierteste Immunadhäsinkonstruktion kombiniert die Bindungsdomäne(n) des Adhäsins (z.B. die extrazelluläre Domäne (ECD) eines Rezeptors) mit der Fc-Region einer Immunglobulin-Schwerkette. Für gewöhnlich wird bei der Herstellung der Immunadhäsine der vorliegenden Erfindung für die Bindungsdomäne des Adhäsins kodierende Nucleinsäure C-terminal an Nucleinsäure fusioniert, die für den N-Terminus einer konstanten Immunglobulindomänensequenz kodiert, jedoch sind N-terminale Fusionen ebenfalls möglich.
Typischerweise wird in derartigen Fusionen das kodierte Hybridpolypeptid zumindest funktionell aktive Gelenk-, C_H2- und C_H3-Domänen der konstanten Region einer Immunglobulin-Schwerkette beibehalten. Fusionen werden außerdem am C-Terminus des Fc-Abschnitts einer konstanten Domäne oder unmittelbar N-terminal zum C_H1 der Schwerkette oder der entsprechenden Region der Leichtkette vorgenommen. Die exakte Stelle, an der die Fusion vorgenommen wird, ist nicht entscheidend; spezielle Stellen sind wohlbekannt und können ausgewählt werden, um biologische Aktivität, Sekretion oder Bindungseigenschaften des Immunadhäsins zu optimieren.
Die Adhäsinsequenz kann an den N-Terminus der Fc-Region von Immunglobulin G₁ (IgG₁) fusioniert werden. Es ist möglich, die gesamte konstante Schwerkettenregion an die Adhäsinsequenz zu fusionieren. Jedoch werden bevorzugter eine Sequenz, die in der Gelenkregion unmittelbar stromauf der Papain-Spaltstelle beginnt, die IgG-Fc chemisch definiert (d.h. Rest 216, wobei der erste Rest der konstanten Schwerkettenregion mit 114 angenommen wird), oder analoge Stellen aus anderen Immunglobulinen bei der Fusion verwendet. Die Adhäsin-Aminosäuresequenz kann (a) an die Gelenkregion und C_H2- und C_H3-Domänen oder (b) an die C_H1-, Gelenk-, C_H2- und C_H3-Domänen einer IgG-Schwerkette fusioniert werden.
Für bispezifische Immunadhäsine werden die Immunadhäsine als Multimere und insbesondere als Heterodimere oder Heterotetramere assembliert. Im Allgemeinen werden diese assemblierten Immunglobuline bekannte Einheitsstrukturen aufweisen. Eine grundlegende Vierketten-Struktureinheit ist jene Form, in der IgG, IgD und IgE existieren. Eine Vierketten-Einheit wird in den höhermolekularen Immunglobulinen wiederholt; IgM besteht im Allgemeinen als Pentamer von vier Grundeinheiten, die durch Disulfidbrücken zusammengehalten werden. IgA-Globulin und gelegentlich IgG-Globulin können außerdem in multimerer Form im Serum existieren. Im Falle eines Multimers kann jede der vier Einheiten gleich oder verschieden sein.
Verschiedene beispielhafte assemblierte Immunadhäsine sind unten schematisch dargestellt:

(a) AC_L-AC_L;
(b) AC_H-(AC_H, AC_L-AC_H, AC_L-V_HC_H, oder V_LC_L-AC_H);
(c) AC_L-AC_H-(AC_L-AC_H, AC_L-V_HC_H, V_LC_L-AC_H, oder V_LC_L-V_HC_H)
(d) AC_L-V_HC_H-(AC_H, oder AC_L-V_HC_H, oder V_LC_L-AC_H);
(e) V_LC_L-AC_H-(AC_L-V_HC_H, oder V_LC_L-AC_H); und
(g) (A-Y)_n-(V_LC_L-V_HC_H)₂,

_L

_H

_L

_H

Der Kürze halber zeigen die vorangehenden Strukturen nur Schlüsseleigenschaften; sie bezeichnen weder Verbindungs-(J-) oder andere Domänen der Immunglobuline, noch sind Disulfidbindungen dargestellt. Wo jedoch derartige Domänen für die Bindungsaktivität notwendig sind, sollen sie so konstruiert sein, dass sie an den üblichen Orten vorliegen, die sie in den Immunglobulinmolekülen einnehmen.
Alternativ dazu können die Adhäsinsequenzen zwischen Immunglobulin-Schwerketten- und -Leichtketten-Sequenzen insertiert werden, sodass ein Immunglobulin erlangt wird, das eine Hybridschwerkette umfasst. In dieser Ausführungsform sind die Adhäsinsequenzen an das 3'-Ende einer Immunglobulin-Schwerkette in jedem Arm eines Immunglobulins, entweder zwischen dem Gelenk und der C_H2-Domäne oder zwischen den C_H2- und C_H3-Domänen, fusioniert. Ähnliche Konstrukte sind von Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28, 1027–1037 (1991), beschrieben worden.
Obgleich die Gegenwart einer Immunglobulin-Leichtkette in den Immunadhäsinen der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist, kann eine Immunglobulin-Leichtkette vorhanden sein, die entweder kovalent an ein Adhäsin-Immunglobulin-Schwerkettenfusionspolypeptid gebunden oder direkt an das Adhäsin fusioniert ist. Im ersteren Fall wird für eine Immunglobulin-Leichtkette kodierende DNA typischerweise mit der für das Adhäsin-Immunglobulin-Schwerkettenfusionsprotein kodierenden DNA coexprimiert. Nach der Sekretion sind die Hybrid-Schwerkette und die Leichtkette kovalent verbunden, um eine Immunglobulin-ähnliche Struktur bereitzustellen, die zwei disulfidverbundene Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paare umfasst. Zur Herstellung derartiger Strukturen geeignete Verfahren sind beispielsweise im am 28. März 1989 ausgegebenen US-Patent Nr. 4.816.567 offenbart.
Immunadhäsine werden am zweckdienlichsten durch In-frame-Fusionieren der für den Adhäsin-Abschnitt kodierenden cDNA an eine Immunglobulin-cDNA-Sequenz konstruiert. Jedoch kann die Fusion an genomische Immunglobulinfragmente ebenfalls verwendet werden (siehe z.B. Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990); und Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)). Der letztere Fusionstyp erfordert die Gegenwart von Ig-Regulationssequenzen zur Expression. Für die konstanten IgG-Schwerkettenregionen kodierende cDNAs können auf Basis veröffentlichter Sequenzen aus cDNA-Bibliotheken isoliert werden, die von Milz- oder Peripherblut-Lymphozyten herrühren, und zwar mittels Hybridisierungs- oder mittels Polymerasekettenreaktions-(PCR-)Techniken. Die für die „Adhäsin"- und die Immunglobulin-Abschnitte des Immunadhäsins kodierenden cDNAs werden hintereinander in einen Plasmidvektor insertiert, der die effiziente Expression in den ausgewählten Wirtszellen steuert.
Beispiele derartiger löslicher ECD-Sequenzen umfassen Polypeptide, die die Aminosäuren 2–166 der in 1 gezeigten TACI-Sequenz umfassen und in den unten stehenden Beispielen ausführlicher beschrieben sind. Das TACI-Rezeptor-Immunadhäsin kann nach einem beliebigen der auf dem Gebiet der Erfindung beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
BCMA-Rezeptor-Immunadhäsine können auf ähnliche Weise konstruiert werden. Beispiele löslicher ECD-Sequenzen zur Verwendung bei der Konstruktion von BCMA-Immunadhäsinen können Polypeptide umfassen, die die Aminosäuren 5–51 der in 2 gezeigten BCMA-Sequenz umfassen und in den unten stehenden Beispielen ausführlicher beschrieben sind.
Der TACI- oder BCMA-Rezeptor kann kovalent modifiziert werden, indem das Rezeptorpolypeptid an eines einer Vielzahl nicht-proteinartiger Polymere gebunden wird, z.B. an Polyethylenglykol (PEG), Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, und zwar auf eine Weise, wie sie in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 dargelegt ist. Derartige pegylierte Formen des TACI- oder BCMA-Rezeptors können mittels Techniken hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
Leucin-Zipper-Formen dieser Moleküle werden ebenfalls beschrieben. "Leucin-Zipper" ist ein Begriff auf dem Gebiet der Erfindung, der verwendet wird, um sich auf eine Leucin-reiche Sequenz zu beziehen, die die Dimerisierung oder Trimerisierung des Fusionspartners (z.B. der Sequenz oder des Moleküls, an die/das der Leucin-Zipper fusioniert oder gebunden ist) verstärkt, fördert oder antreibt. Es sind verschiedene Leucin-Zipper-Polypeptide auf dem Gebiet der Erfindung beschrieben worden. Siehe z.B. Landschulz et al., Science 240, 1759 (1988); US-Patent Nr. 5.716.805; WO 94/10308; Hoppe et al., FEBS Letters 344, 1991 (1994); Maniatis et al., Nature 341, 24 (1989). Der Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass eine Leucin-Zipper-Sequenz entweder am 5'- oder am 3'-Ende des TACI- oder BCMA-Rezeptormoleküls fusioniert werden kann.
Die TACI- oder BCMA-Polypeptide können außerdem auf eine Weise modifiziert werden, um Hybridmoleküle zu bilden, indem das Rezeptormolekül an ein(e) andere(s), heterologe(s) Polypeptid oder Aminosäuresequenz fusioniert wird. Vorzugsweise ist ein(e) derartige(s) heterologe(s) Polypeptid oder Aminosäuresequenz eine(s), das/die so agiert, dass das Hybridmolekül oligomerisiert wird. Ein derartiges Hybridmolekül kann eine Fusion des TACI- oder BCMA-Rezeptor-Polypeptids mit einem Marker-Polypeptid umfassen, das ein Epitop bereitstellt, an das ein Anti-Marker-Antikörper selektiv binden kann. Der Epitop-Marker wird im Allgemeinen an den Amino- oder Carboxylterminus des Rezeptorpolypeptids gesetzt. Die Gegenwart derartiger Epitop-Marker-Formen des Rezeptors kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Marker-Polypeptid nachgewiesen werden. Außerdem ermöglicht die Bereitstellung des Epitop-Markers die einfache Reinigung des Rezeptors mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Anti-Marker-Antikörpers oder einer anderen Art von Affinitätsmatrix, die an den Epitop-Marker bindet. Verschiedene Marker-Polypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Beispiele umfassen Poly-Histidin-(Poly-His-)oder Poly-Histidin-Glycin-(Poly-His-Gly-)Marker; das flu-HA-Marker-Polypeptid und seinen Antikörper 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)); den c-myc-Marker und die Antikörper 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 und 9E10 dagegen (Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610–3616 (1985)); und den Herpes-simplex-Virus-Glykoprotein-D-(gD-)Marker und seinen Antikörper (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547–553 (1990)). Andere Marker-Polypeptide umfassen das Flag-Peptid (Hopp et al., Bio-Technology 6, 1204–1210 (1988)); das KT3-Epitop-Peptid (Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)); ein α-Tubulin-Epitop-Peptid (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)); und den T7-Gen-10-Protein-Peptid-Marker (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990)).
Anti-TACI-Rezeptor-Antikörper, Anti-BCMA-Rezeptor-Antikörper, Anti-TALL-1-Antikörper oder Anti-APRIL-Antikörper können in den Verfahren ebenfalls eingesetzt werden. Beispiele derartiger Moleküle umfassen neutralisierende oder blockierende Antikörper, die vorzugsweise die Bindung von TALL-1 oder APRIL an die TACI- oder an die BCMA-Rezeptoren hemmen können. Die Anti-TACI-Antikörper, Anti-BCMA-, Anti-TALL-1- oder Anti-APRIL-Antikörper können monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter Anwendung von Hybridomverfahren hergestellt werden, wie z.B. mit jenen, die von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurden. Bei einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirtstier typischerweise mit einem immunisierenden Mittel immunisiert, um Lymphozyten anzuregen, die Antikörper produzieren oder zur Produktion von Antikörpern fähig sind, die spezifisch an das immunisierende Mittel binden werden. Alternativ dazu können Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
Das immunisierende Mittel wird typischerweise das TACI- oder BCMA-Polypeptid oder TALL1- oder APRIL-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Im Allgemeinen werden entweder Peripherblutlymphozyten („PBLs") verwendet, wenn Zellen menschlichen Ursprungs gewünscht sind, oder es werden Milzzellen oder Lymphknotenzellen verwendet, wenn nicht-menschliche Säugetierquellen gewünscht sind. Die Lymphozyten werden dann mit einer immortalisierten Zelllinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionierungsmittels, wie z.B. Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, S. 59–103 (1986)). Immortalisierte Zelllinien sind üblicherweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere Myelomzellen, die aus Nagern, Rind oder Mensch stammen. Üblicherweise werden Ratten- oder Maus-Myelomzelllinien eingesetzt. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der unfusionierten, immortalisierten Zellen hemmen. Wenn den elterlichen Zellen beispielsweise das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, wird das Kulturmedium typischer weise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin („HAT-Medium") enthalten, wobei diese Substanzen das Wachstum HGPRT-defekter Zellen verhindern.
Bevorzugte immortalisierte Zelllinien sind jene, die effizient fusionieren, eine stabile Antikörperexpression in hohem Ausmaß durch die gewählten Antikörperproduzierenden Zellen fördern und gegen ein Medium, wie z.B. HAT-Medium empfindlich sind. Bevorzugtere immortalisierte Zelllinien sind murine Myelomlinien, die beispielsweise vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, und der American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, erhalten werden können. Menschliche Myelomzelllinien und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien sind zur Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper ebenfalls beschrieben worden (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, S. 51–63 (1987)).
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann dann auf die Gegenwart von gegen TACI, BCMA, TALL-1 oder APRIL gerichteten monoklonalen Antikörpern getestet werden. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität der von den Hybridomzellen produzierten Antikörper mittels Immunpräzipitation oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z.B. Radioimmuntest (RIA) oder Enzyme-linked-immunoabsorbent-assay (ELISA), ermittelt. Derartige Techniken und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise mit der Scatchard-Analyse von Munson und Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), ermittelt werden. Gegebenenfalls werden die Anti-TACI-, Anti-BCMA-, Anti-TALL-1- oder Anti-APRIL-Antikörper eine in einem Bindungstest ermittelte Bindungsaffinität von zumindest 10 nM, vorzugsweise zumindest 5 nM und bevorzugter zumindest 1 nM, für den jeweiligen Rezeptor oder Liganden aufweisen.
Nachdem die gewünschten Hybridomzellen identifiziert worden sind, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels Standardverfahren gezüchtet werden (Goding, siehe oben). Geeignete Kulturmedien zu diesem Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium und RPMI-1640- Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in vivo als Aszites in einem Säugetier gezüchtet werden.
Die von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper können aus dem Kulturmedium oder aus der Aszitesflüssigkeit durch herkömmliche Immunglobulinreinigungsverfahren, wie z.B. Protein-A-Sepharose-, Hydroxylapatitchromatographie, Elektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, isoliert oder gereinigt werden.
Die monoklonalen Antikörper können außerdem durch DNA-Rekombinationsverfahren, wie z.B. jene, die im US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben sind, hergestellt werden. Für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodierende DNA kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren leicht isoliert und sequenziert werden (z.B. durch Verwendung von Oligonucleotidsonden, die fähig sind, spezifisch an Gene zu binden, die für die Schwer- und Leichtketten muriner Antikörper kodieren). Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als eine bevorzugte Quelle derartiger DNA. Wenn sie einmal isoliert ist, kann die DNA in Expressionsvektoren gesetzt werden, die dann in Wirtszellen, wie z.B. Simian-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zellen oder Myelomzellen, transfiziert werden, die ansonsten kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erlangen. Die DNA kann außerdem modifiziert werden, beispielsweise durch Substituieren der kodierenden Sequenz für menschliche konstante Schwer- und Leichtkettendomänen anstelle der homologen murinen Sequenzen (US-Patent Nr. 4.816.567; Morrison et al., siehe oben) oder durch kovalentes Binden der gesamten oder eines Teils der kodierenden Sequenz für ein Nicht-Immunglobulinpolypeptid an die für Immunglobulin kodierende Sequenz. Die konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung können durch ein derartiges Nicht-Immunglobulinpolypeptid substituiert werden oder es können die variablen Domänen von einer der Antigenkombinierenden Stellen des Antikörpers der Erfindung dadurch substituiert werden, um einen bivalenten Hybridantikörper zu erzeugen.
Die Antikörper können monovalente Antikörper sein. Verfahren zur Herstellung monovalenter Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Beispielsweise umfasst eines der Verfahren die rekombinante Expression von Immunglobulin-Leichtkette und modifizierter Schwerkette. Die Schwerkette ist im Allgemeinen an einem beliebigen Punkt der Fc-Region trunkiert, sodass die Schwerkettenvernetzung verhindert wird. Alternativ dazu werden maßgebliche Cysteinreste durch einen anderen Aminosäurerest substituiert oder werden deletiert, sodass die Vernetzung verhindert wird.
In-vitro-Verfahren sind ebenfalls zur Herstellung monovalenter Antikörper geeignet. Der Verdau von Antikörpern, um Fragmente davon, insbesondere Fab-Fragmente, herzustellen, kann unter Anwendung von Routinetechniken erzielt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
Antikörper oder Antikörperfragmente können aus Antikörper-Phagenbibliotheken unter Anwendung der in McCafferty et al., Nature 348, 552–554 (1990), beschriebenen Techniken isoliert werden. Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991), beschreiben die Isolierung muriner bzw. menschlicher Antikörper unter Verwendung von Phagenbibliotheken. Anschließende Veröffentlichungen beschreiben die Herstellung hochaffiner (nM-Bereich) menschlicher Antikörper durch „Chain-Shuffling" (Marks et al., Bio/Technology 10, 779–783 (1992)) sowie kombinatorische Infektion und In-vivo-Rekombination als Strategie zur Konstruktion sehr großer Phagenbibliotheken (Waterhouse et al., Nuc. Acids Res. 21, 2265–2266 (1993)). Daher sind diese Techniken brauchbare Alternativen zu herkömmlichen monoklonalen Antikörper-Hybridom-Verfahren zur Isolierung monoklonaler Antikörper.
Die DNA kann außerdem modifiziert werden, beispielsweise durch Substituieren der kodierenden Sequenz für menschliche konstante Schwer- und Leichtkettendomänen anstelle der homologen murinen Sequenzen (US-Patent Nr. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984)) oder durch kovalentes Binden der gesamten oder eines Abschnitts der kodierenden Sequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid an eine Immunglobulin-Kodiersequenz.
Typischerweise werden die konstanten Domänen eines Antikörpers durch derartige Nicht-Immunglobulin-Polypeptide substituiert oder es werden die variablen Domänen einer der Antigen-kombinierenden Stellen eines Antikörpers damit substituiert, um einen bivalenten Hybridantikörper zu erzeugen, der eine Antigen-kombinierende Stelle mit Spezifität für ein Antigen und eine weitere Antigen-kombinierende Stelle mit Spezifität für ein anderes Antigen umfasst.
Ein humanisierter Antikörper weist einen oder mehrere in ihn eingeführte Aminosäurereste aus einer Quelle auf, die nicht-menschlich ist. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden häufig als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise einer variablen „Import"-Domäne entnommen sind. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern durchgeführt werden (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)), indem Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durch die entsprechenden Sequenzen aus Nager-CDRs oder -CDR-Sequenzen substituiert werden. Demgemäß sind derartige „humanisierte" Antikörper Hybridantikörper (US-Patent Nr. 4.816.567), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte variable menschliche Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies ersetzt worden ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, bei denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nagerantikörpern ersetzt sind.
Die Auswahl menschlicher variabler Domänen, sowohl schwerer als auch leichter Domänen, die bei der Herstellung der humanisierten Antikörper zu verwenden sind, ist zur Verminderung der Antigenität sehr wichtig. Nach dem so genannten „Best-fit"-Verfahren wird die Sequenz der variablen Domäne eines Nagerantikörpers gegen die gesamte Bibliothek bekannter menschlicher Sequenzen variabler Domänen gescreent. Jene menschliche Sequenz, die jener des Nagers am nächsten kommt, wird dann als das menschliche Gerüst (FR) für den humanisierten Antikörper akzeptiert (Sims et al., J. Immunol. 151, 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)). Ein weiteres Verfahren verwendet ein bestimmtes Gerüst, das sich von der Konsensussequenz aller menschlichen Antikörper einer bestimmten Untergruppe von Leicht- oder Schwerketten herleitet. Dasselbe Gerüst kann für mehrere verschiedene humanisierte Antikörper verwendet werden (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151, 2623 (1993)).
Es ist ferner wichtig, dass Antikörper mit Erhaltung hoher Affinität für das Antigen und anderer vorteilhafter biologischer Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden humanisierte Antikörper nach einem bevorzugten Verfahren durch einen Prozess der Analyse der elterlichen Sequenzen und der verschiedenen konzeptionellen humanisierten Produkte unter Verwendung dreidimensionaler Modelle der elterlichen und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulinmodelle sind allgemein verfügbar und dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung geläufig. Es sind Computerprogramme verfügbar, die mögliche dreidimensionale Konformationsstrukturen gewählter Kandidat-Immunglobulinsequenzen illustrieren und darstellen. Die Prüfung dieser Darstellungen ermöglicht die Analyse der wahrscheinlichen Rolle des Rests bei der Funktion der Kandidat-Immunglobulinsequenz, d.h. die Analyse von Resten, die die Fähigkeit des Kandidat-Immunglobulins beeinflussen, sein Antigen zu binden. Auf diese Weise können FR-Reste aus den Empfänger- und Importsequenzen gewählt und kombiniert werden, sodass die gewünschte Antikörpereigenschaft, wie z.B. erhöhte Affinität für das/die Zielantigen(e), erzielt wird. Im Allgemeinen sind die CDR-Reste direkt und sehr wesentlich an der Beeinflussung der Antigenbindung beteiligt.
Alternativ dazu ist es nunmehr möglich, transgene Tiere (z.B. Mäuse) herzustellen, die fähig sind, nach Immunisierung ein vollständiges Repertoire menschlicher Antikörper in Abwesenheit endogener Immunglobulinproduktion zu produzieren. Beispielsweise ist beschrieben worden, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerketten-Verbindungsregion-(J_H-)Gens in chimären und keimbahnmutierten Mäusen in der vollständigen Hemmung endogener Antikörperproduktion resultiert.
Die Übertragung der menschlichen Keimbahn-Immunglobulin-Genanordnung in derartige keimbahnmutierte Mäuse wird in der Produktion menschlicher Antikörper nach Antigenexposition resultieren. Siehe z.B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255–258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7, 33 (1993); und Duchosal et al., Nature 355, 258 (1992). Menschliche Antikörper können auch aus Phagen-Display-Bibliotheken hergeleitet werden (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991); Vaughan et al., Nature Biotech. 14, 309 (1996)).
Wie in den Beispielen unten beschrieben wird, sind bestimmte Anti-APRIL-Antikörper hergestellt worden. Vier dieser Antikörper, 3C6.4.2, 5G8.2.2, 5E8.7.4 und 5E11.1.2, sind bei ATCC hinterlegt worden und erhielten die Zugriffsnummern PTA-1347, PTA-1345, PTA-1344 und PTA-1346. Anti-APRIL-Antikörper können dieselben biologischen Eigenschaften wie jene monoklonalen Antikörper der Erfindung aufweisen, die von den unter den Zugriffsnummern PTA-1347, PTA-1345, PTA-1344 oder PTA-1346 hinterlegten Hybridomzelllinien sekretiert werden. Der Ausdruck „biologische Eigenschaften" wird verwendet, um sich auf die In-vitro- und/oder In-vivo-Aktivitäten oder -Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers zu beziehen, wie z.B. auf die Fähigkeit, an APRIL zu binden oder die TACI- oder BCMA-Bindung oder Aktivierung durch APRIL wesentlich zu blockieren oder zu vermindern. Der monoklonale Anti-APRIL-Antikörper kann dieselbe Blockierungsaktivität wie der 3C6.4.2-Antikörper aufweisen, wie durch seine Fähigkeit zur Blockierung der Bindung von APRIL an TACI oder BCMA ermittelt wird. Ein monoklonaler Anti-APRIL-Antikörper kann an dasselbe Epitop binden wie die in den unten stehenden Beispielen offenbarten 5G8.2.2-Antikörper, 5E8.7.4-Antikörper, 3C6.4.2-Antikörper oder 5E11.1.2-Antikörper. Eine derartige Epitop-Bindungseigenschaft kann beispielsweise in einem kompetitiven Inhibitionsbindungstest ermittelt werden, wobei diese Techniken auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Ein derartiger Anti-APRIL-Antikörper wird vorzugsweise die Bindung von entweder 5G8.2.2-Antikörper, 5E8.7.4-Antikörper, 3C6.4.2-Antikörper oder 5E11.1.2-Antikörper an APRIL kompetitiv hemmen. Es ist vorgesehen, dass chimäre oder humanisierte Anti-APRIL-Antikörper konstruiert werden können (wie z.B. durch Anwendung der oben beschriebenen Techniken), indem ausgewählte Fragmente oder Domänensequenzen aus irgendeinem der vorhin erwähnten hinterlegten Anti-APRIL-Antikörper verwendet oder inkorporiert werden.
B. Testverfahren
Ligand/Rezeptor-Bindungsuntersuchungen können in jedem bekannten Testverfahren durchgeführt werden, beispielsweise in kompetitiven Bindungstests, direkten und indirekten Sandwichtests und Immunpräzipitationstests. Auf Zellen basierende Tests und Tiermodelle können verwendet werden, um die Wechselwirkung zwischen den hierin identifizierten Liganden und Rezeptoren und die Entwicklung und Pathogenese der hierin benannten Leiden und Krankheiten besser zu verstehen.
Bei einem der Ansätze können Säugetierzellen mit den hierin beschriebenen Liganden und Rezeptoren transfiziert und die Fähigkeit der Agonisten oder Antagonisten analysiert werden, die Bindung oder Aktivität zu stimulieren oder zu hemmen. Geeignete Zellen können mit dem gewünschten Gen transfiziert und auf Aktivität überprüft werden. Derartige transfizierte Zelllinien können dann verwendet werden, um die Fähigkeit von Antagonist(en) oder Agonist(en) zu testen, zu hemmen oder zu stimulieren, beispielsweise um die B-Zellen-Proliferation oder Ig-Sekretion zu modulieren. Mit der kodierenden Sequenz der hierin identifizierten Gene transfizierte Zellen können weiters verwendet werden, um Medikament-Kandidaten für die Behandlung von immunbedingten Krankheiten oder Krebs zu identifizieren.
Zusätzlich können von transgenen Tieren hergeleitete Primärkulturen in auf Zellen basierenden Tests verwendet werden. Techniken zur Herleitung kontinuierlicher Zelllinien aus transgenen Tieren sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt (siehe z.B. Small et al., Mol. Cell. Biol. 5, 642–648 (1985)).
Einer der geeigneten, auf Zellen basierenden Tests ist die Zugabe von Epitop-markierten Liganden (z.B. AP oder Flag) zu Zellen, die den entsprechenden Rezeptor aufweisen oder exprimieren, und die Analyse der Bindung (in Gegenwart oder Abwesenheit von potenziellen Antagonisten) mittels FACS-Färbung mit Anti-Marker-Anti körpern. In einem weiteren Test wird die Fähigkeit eines Antagonisten getestet, die TALL-1- oder APRIL-induzierte Proliferation von B-Zellen zu hemmen. B-Zellen oder B-Zelllinien werden mit TALL-1 oder APRIL in Gegenwart oder Abwesenheit von potenziellen Antagonisten kultiviert, und die Proliferation von B-Zellen kann mittels ³H-Thymidin-Inkorporation oder Zellzahl gemessen werden.
Die Ergebnisse der auf Zellen basierenden In-vitro-Tests können unter Verwendung von In-vivo-Tiermodellen weiter verifiziert werden. Es kann eine Vielfalt an wohlbekannten Tiermodellen verwendet werden, um die Rolle der hierin identifizierten Agonisten und Antagonisten bei der Entwicklung und Pathogenese von z.B. immunbedingten Krankheiten oder Krebs besser zu verstehen und um die Wirksamkeit der therapeutischen Kandidat-Mittel zu testen. Die In-vivo-Beschaffenheit derartiger Modelle macht sie insbesondere prognostisch bei menschlichen Patienten. Tiermodelle von immunbedingten Krankheiten umfassen sowohl nicht-rekombinante, als auch rekombinante (transgene) Tiere. Nicht-rekombinante Tiermodelle umfassen beispielsweise Nager, z.B. murine Modelle. Derartige Modelle können erzeugt werden, indem Zellen in syngenetische Mäuse unter Anwendung von Standardtechniken, z.B. subkutane Injektion, Schwanzveneninjektion, Milzimplantation, intraperitoneale Implantation und Implantation unter die Nierenkapsel eingeführt werden.
Tiermodelle für beispielsweise Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit sind bekannt. Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheiten treten auf, wenn immunkompetente Zellen in immunsupprimierte oder tolerante Patienten transplantiert werden. Die Spenderzellen erkennen und reagieren auf die Wirtsantigene. Die Reaktion kann von lebensbedrohender schwerer Entzündung bis zu leichten Fällen von Diarrhöe und Gewichtsverlust variieren. Modelle der Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit stellen ein Mittel bereit, T-Zellen-Reaktivität gegen MHC-Antigene und untergeordnete Transplantatantigene zu beurteilen. Ein geeignetes Verfahren wird in Current Protocols in Immunology, Abschnitt 4.3 ausführlich beschrieben.
Ein Tiermodell für Hautallotransplantatabstoßung ist ein Mittel zum Testen der Fähigkeit von T-Zellen zur Vermittlung von Gewebezerstörung in vivo, die ein Nachweis für deren Rolle bei Anti-Virus- und Tumorimmunität und ein Maß dafür ist. Die gebräuchlichsten und akzeptierten Modelle verwenden murine Schwanzhaut-Transplantate. Wiederholte Experimente haben gezeigt, dass Hautallotransplantatabstoßung von T-Zellen, Helfer-T-Zellen und Killer-Effektor-T-Zellen und nicht von Antikörpern vermittelt wird. (H. Auchincloss Jr. und D. H. Sachs, Fundamental Immunology, 2. Aufl., W. E. Paul (Hrsg.), Raven Press, NY, 889–992 (1989)). Ein geeignetes Verfahren wird ausführlich in Current Protocols in Immunology, Abschnitt 4.4 beschrieben. Andere Transplantatabstoßungsmodelle, die verwendet werden können, um die Zusammensetzungen der Erfindung zu testen, sind die allogenen Herztransplantatmodelle, die von M. Tanabe et al., Transplantation 58, 23 (1994) und S. A. Tinubu et al., J. Immunol., 4330–4338 (1994) beschrieben werden.
Tiermodelle für den verzögerten Typ von Hypersensitivität stellen ebenfalls einen Test der zellvermittelten Immunfunktion bereit. Hypersensitivitätsreaktionen vom verzögerten Typ sind eine T-Zellen-vermittelte In-vivo-Immunreaktion, die durch Entzündung gekennzeichnet ist, die bis zum Verstreichen eines Zeitraums nach Exposition mit Antigen nicht ihren Höchststand erreicht. Diese Reaktionen treten auch bei gewebespezifischen Autoimmunerkrankungen, wie z.B. multipler Sklerose (MS) und experimenteller Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE, einem Modell für MS) auf. Ein geeignetes Verfahren wird ausführlich in Current Protocols in Immunology, Abschnitt 4.5 beschrieben.
Ein Tiermodell für Arthritis ist Kollagen-induzierte Arthritis. Dieses Modell teilt klinische, histologische und immunologische Eigenschaften mit menschlicher Autoimmunarthritis. Maus- und Rattenmodelle sind durch Gelenkentzündung, Erosion von Knorpel und subchondralen Knochen gekennzeichnet. Die Verbindungen der Erfindung können auf Aktivität gegen Autoimmunarthritis getestet werden, und zwar unter Verwendung der in Current Protocols in Immunology, siehe oben, Abschnitte 15.5 beschriebenen Protokolle. Siehe auch das in A. C. Issekutz et al., Immunology 88, 569 (1996) beschriebene Modell unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen CD18 und VLA-4-Integrine. Beispiel 10 beschreibt unten ausführlicher ein murines CIA-Modell.
Ein Modell von Asthma ist beschrieben worden, bei dem Antigen-induzierte Luftwegshyperreaktivität, Lungen-Eosinophilie und Entzündung durch Sensibilisierung eines Tiers mit Ovalbumin und anschließende Exposition des Tiers mit demselben, mittels Aerosol zugeführten Protein induziert werden. Mehrere Tiermodelle (Meerschweinchen, Ratte, nicht-menschlicher Primat) zeigen bei Exposition mit Aerosol-Antigenen Symptome, die atopischem Asthma im Menschen ähnlich sind. Murine Modelle weisen viele der Eigenschaften menschlichen Asthmas auf. Geeignete Verfahren zum Testen der Zusammensetzungen der Erfindung auf Aktivität und Wirksamkeit bei der Behandlung von Asthma werden von W. W. Wolyniec et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 18, 777 (1998) und in den darin zitierten Literaturstellen beschrieben.
Zusätzlich können die Verbindungen der Erfindung an Tiermodellen für Psoriasisähnliche Krankheiten getestet werden. Die Verbindungen der Erfindung können im von M. P. Schon et al., Nat. Med. 3, 183 (1997) beschriebenen SCID/SCID-Mausmodell getestet werden, bei dem die Mäuse histopathologische Hautläsionen zeigen, die Psoriasis gleichen. Ein weiteres geeignetes Modell ist das wie von B. J. Nickoloff et al., Am. J. Path. 146, 580 (1995) beschrieben hergestellte menschliche Haut/SCID-Maus-Hybrid.
Es sind verschiedene Tiermodelle zum Testen von Antikrebsaktivität einer therapeutischen Kandidat-Zusammensetzung wohlbekannt. Diese umfassen heterogenes Transplantieren von menschlichem Tumor in athymische Nacktmäuse oder SCID/SCID-Mäuse, oder genetische murine Tumormodelle, wie z.B. p53-Knockout-Mäuse.
Rekombinante (transgene) Tiermodelle können konstruiert werden, indem der kodierende Abschnitt der hierin identifizierten Moleküle in das Genom von Tieren von Interesse eingeführt wird, wobei Standardtechniken zur Herstellung transgener Tiere angewendet werden. Tiere, die als Ziel für die transgene Manipulation dienen können, umfassen ohne Einschränkung Mäuse, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen, Schafe, Ziegen, Schweine und nicht-menschliche Primaten, z.B. Paviane, Schimpansen und Affen. Auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Techniken zur Einführung eines Transgens in derartige Tiere umfassen Pronukleus-Mikroinjektion (Hoppe und Wanger, US-Patent Nr. 4.873.191); Retrovirus-vermittelten Gentransfer in Keimbahnen (z.B. Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148–615 (1985)); Gen-Targeting in embryonale Stammzellen (Thompson et al., Cell 56, 313–321 (1989)); Elektroporation von Embryros (Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803–1814 (1983)); Spermien-vermittelten Gentransfer (Lavitrano et al., Cell 57, 717–73 (1989)). Für einen Überblick siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4.736.866.
Transgene Tiere umfassen jene, die das Transgen nur in einem Teil ihrer Zellen tragen („Mosaik-Tiere"). Das Transgen kann entweder als einzelnes Transgen oder in Konkatemeren, z.B. Kopf-an-Kopf- oder Kopf-an-Schwanz-Tandems integriert sein. Die selektive Einführung eines Transgens in einen bestimmten Zelltyp ist ebenfalls möglich, indem beispielsweise die Technik von Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232–636 (1992) befolgt wird.
Die Expression des Transgens in transgene Tiere kann durch Standardtechniken überprüft werden. Beispielsweise kann Southern-Blot-Analyse oder PCR-Amplifikation verwendet werden, um die Integration des Transgens zu verifizieren. Das Ausmaß der mRNA-Expression kann dann unter Verwendung von Techniken, wie z.B. In-situ-Hybridisierung, Northern-Blot-Analyse, CR oder Immuncytochemie analysiert werden. Die Tiere können auf Anzeichen von Immunerkrankungspathologie weiter untersucht werden, beispielsweise durch histologische Untersuchung, um die Infiltration von Immunzellen in spezielle Gewebe zu ermitteln, oder auf die Gegenwart von kanzerösem oder malignem Gewebe.
Alternativ dazu können „Knockout"-Tiere konstruiert werden, die ein defektes oder verändertes Gen aufweisen, das für ein hierin identifiziertes Polypeptid kodiert, und zwar als Resultat der homologen Rekombination zwischen dem für das Polypeptid kodierenden endogenen Gen und veränderter genomischer DNA, die für dasselbe Polypeptid kodiert, eingeführt in eine Embryonalzelle des Tiers. Beispielsweise kann eine für ein bestimmtes Polypeptide kodierende cDNA verwendet werden, um für dieses Polypeptid kodierende genomische DNA nach etablierten Techniken zu klo nieren. Ein Abschnitt der für das bestimmte Polypeptid kodierenden genomischen DNA kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt werden, wie z.B. durch ein Gen, das für einen Selektionsmarker kodiert, der verwendet werden kann, um die Integration zu überprüfen. Typischerweise werden mehrere Kilobasen unveränderter flankierender DNA (sowohl an den 5'-Enden, als auch an den 3'-Enden) in den Vektor aufgenommen (siehe z.B. Thomas und Capecchi, Cell 51, 503 (1987) für eine Beschreibung von Vektoren zur homologem Rekombination). Der Vektor wird in eine embryonale Stammzelllinie (z.B. durch Elektroporation) eingeführt, und es werden Zellen selektiert, in denen die eingeführte DNA homolog mit der endogenen DNA rekombiniert hat (siehe z.B. Li et al., Cell 69, 915 (1992)). Die selektierten Zellen werden dann in eine Blastozyste eines Tiers (z.B. einer Maus oder Ratte) injiziert, um Aggregationshybride auszubilden (siehe z.B. Bradley, in: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson (Hrsg.), IRL, Oxford, S. 113–152 (1987)). Ein Hybridembryo kann dann in ein geeignetes, pseudoträchtiges weibliches Ziehtier implantiert und der Embryo geboren werden, um ein „Knockout"-Tier zu erzeugen. Nachkommen, die die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen tragen, können mittels Standardtechniken identifiziert und verwendet werden, um Tiere zu züchten, bei denen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knockout-Tiere können beispielsweise entsprechend ihrer Fähigkeit, sich gegen gewisse Krankheitszustände zu wehren, sowie ihrer Entwicklung von Krankheitszuständen aufgrund der Abwesenheit des Polypeptids charakterisiert werden.
C. Formulierungen
Die hierin beschriebenen Antagonisten oder Agonisten werden vorzugsweise in einem Träger eingesetzt. Geeignete Träger und ihre Formulierungen sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, Oslo et al. (Hrsg.), 16. Aufl., Mack Publishing Co. (1980) beschrieben. Typischerweise wird eine geeignete Menge eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes im Träger verwendet, um die Formulierung isotonisch zu machen. Beispiele des Trägers umfassen Salzlösung, Ringer-Lösung und Dextroselösung. Der pH der Lösung ist vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 8 und bevorzugter von etwa 7,4 bis etwa 7,8. Es ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung für gewöhnlich offensichtlich, dass gewisse Träger bevorzugter sein können, und zwar in Abhängigkeit von z.B. Verabreichungsweg und Konzentration des verabreichten Mittels. Der Träger kann die Form einer lyophilisierten Formulierung oder wässrigen Lösung einnehmen.
Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind in den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen für Zellen und/oder Empfänger vorzugsweise nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure und Methionin; Konservierungsmittel (wie z.B. Octadecyldimethylbenzylammoniumchlorid; Hexamethoniumchlorid; Benzalkoniumchlorid, Benzethoniumchlorid; Phenol, Butyl- oder Benzylalkohol; Alkylparabene, wie z.B. Methyl- oder Propylparaben; Catechin; Resorcin; Cyclohexanol; 3-Pentanol; und m-Kresol); niedermolekulare (weniger als etwa 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Histidin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Komplexbildner, wie z.B. EDTA; Zucker, wie z.B. Sucrose, Mannit, Trehalose oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z.B. TWEEN^TM, PLURONICS^TM oder Polyethylenglykol (PEG).
Die Formulierung kann außerdem, falls für die jeweilige zu behandelnde Indikation erforderlich, mehr als eine aktive Verbindung enthalten, vorzugsweise solche mit komplementären Aktivitäten, die sich gegenseitig nicht nachteilig beeinflussen.
Der Antagonist oder Agonist kann außerdem eingeschlossen sein, und zwar in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Koazervationstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, beispielsweise Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, in kolloidalen Medikamentenabgabesystemen (beispielsweise Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen.
Derartige Techniken sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Oslo (Hrsg.) (1980) offenbart.
Die zur In-vivo-Verabreichung verwendeten Formulierungen sollten steril sein. Dies wird leicht mittels Filtration durch sterile Filtrationsmembranen erzielt.
Es können Depotpräparate hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Depotpräparate umfassen semipermeable Matrices fester hydrophober Polymere, die den Antikörper enthalten, wobei die Matrices in Form von Formteilchen, z.B. Filmen oder Mikrokapseln vorliegen. Beispiele für Depotmatrices umfassen Polyester, Hydrogele (beispielsweise Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat, nicht abbaubare Ethylen-Vinylacetat- und abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie z.B. das LUPRON DEPOT^TM (injizierbare Mikrokügelchen, die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat zusammengesetzt sind) und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere, wie z.B. Ethylen-Vinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure eine Freisetzung für über 100 Tage ermöglichen, setzen gewisse Hydrogele Proteine in kürzeren Zeiträume frei.
D. Therapiearten
Die hierin beschriebenen Antagonisten- und Agonistenmoleküle sind bei der Behandlung verschiedener Krankheitszustände, wie z.B. immunbedingten Krankheiten oder Krebs, zweckdienlich. Diese Leiden können durch Stimulieren oder Hemmen einer gewählten, mit TALL-1, APRIL, TACI oder BCMA in Zusammenhang stehenden Aktivität in einem Säugetier durch Verabreichung von einem oder mehreren Antagonisten oder Agonisten behandelt werden.
Die Diagnose der verschiedenen hierin beschriebenen Krankheitszustände in Säugetieren kann vom geübten praktischen Arzt vorgenommen werden. Es sind auf dem Gebiet der Erfindung Diagnosetechniken verfügbar, die z.B. die Diagnose oder De tektion von Krebs oder immunbedingten Krankheiten in einem Säugetier ermöglichen. Beispielsweise können Krebsformen durch Techniken identifiziert werden, die Abtasten, Blutanalyse, Röntgenstrahlen, NMR und dergleichen umfassen, jedoch nicht darauf eingeschränkt sind. Immunbedingte Krankheiten können ebenfalls leicht identifiziert werden. Bei systemischer Lupus erythematodes ist der zentrale Krankheitsvermittler die Produktion autoreaktiver Antikörper gegen Selbst-Proteine/Gewebe und die anschließende Ausbildung immunbedingter Entzündung. Mehrere Organe und Systeme werden klinisch beeinträchtigt, einschließlich Niere, Lunge, Muskel-Skelett-System, Schleimhaut, Auge, Zentralnervensystem, Herz-Kreislauf-System, Magen-Darm-Trakt, Knochenmark und Blut.
Rheumatische Arthritis (RA) ist eine chronische, systemische, entzündliche Autoimmunerkrankung, die hauptsächlich die Synovialmembran mehrerer Gelenke mit resultierender Läsion der Gelenkknorpel umfasst. Die Pathogenese ist T-Lymphozyten-abhängig und ist mit der Produktion von Rheumafaktoren, gegen Selbst-IgG gerichteten Auto-Antikörpern mit resultierender Bildung von Immunkomplexen verbunden, die in Gelenkflüssigkeit und Blut hohe Ausmaße erlangen. Diese Komplexe im Gelenk können die ausgeprägte Infiltration von Lymphozyten und Monozyten in die Synovialmembran und anschließende ausgeprägte Veränderungen der Synovialmembran auslösen; die Gelenkhöhle/Gelenkflüssigkeit wird durch ähnliche Zellen und zusätzlich durch Neutrophile infiltriert. Beeinträchtigte Gewebe sind in erster Linie die Gelenke, häufig in symmetrischem Muster. Jedoch tritt die extraartikuläre Erkrankung ebenfalls in zwei Hauptformen auf. Eine Form ist die Entwicklung extraartikulärer Läsionen mit anhaltender fortschreitender Gelenkserkrankung und typische Läsionen von Lungenfibrose, Vaskulitis und Hautgeschwüren. Die zweite Form extraartikulärer Erkrankung ist das so genannte Felty-Syndrom, das spät im Verlauf der RA-Krankheit auftritt, manchmal nachdem die Gelenkserkrankung ruhend geworden ist, wobei es die Gegenwart von Neutropenie, Thrombocytopenie und Splenomegalie umfasst. Dies kann von Vaskulitis in mehreren Organen mit Bildung von Infarkten, Hautgeschwüren und Brand begleitet sein. Patienten entwickeln außerdem häufig rheumatische Knötchen im Subkutis-Gewebe, die über den betroffenen Gelenken liegen; die Knötchen weisen im Spätstadium nekrotische Zentren auf, die von einem gemischten entzündlichen Zellinfiltrat umgeben sind. Andere Erscheinungsformen, die bei RA auftreten können, umfassen: Perikarditis, Pleuritis, Koronaritis, interstitielle Pneumonie mit Lungenfibrose, Keratoconjunktivitis sicca und rheumatische Knötchen.
Juvenile chronische Arthritis ist eine chronische, idiopathische Entzündungserkrankung, die häufig mit einem Alter von weniger als 16 Jahren beginnt. Ihr Phänotyp hat einige Ähnlichkeiten mit RA; manche Patienten, die Rheumafaktor-positiv sind, werden als juvenile rheumatische Arthritis klassifiziert. Die Krankheit kann in drei Hauptkategorien unterteilt werden: wenige Gelenke betreffend, mehrere Gelenke betreffend und systemisch. Die Arthritis kann schwerwiegend sein und ist typischerweise destruktiv und führt zu Ankylose und verzögertem Wachstum. Andere Ausprägungen können chronische Uveitis anterior und systemische Amyloidose umfassen.
Spondyloarthropathien sind eine Gruppe von Störungen mit einigen gemeinsamen klinischen Eigenschaften und der gemeinsamen Verbindung mit der Expression des Genprodukts HLA-B27. Die Störungen umfassen: Spondylarthritis, Reiter-Syndrom (reaktive Arthritis), mit entzündlicher Darmerkrankung assoziierte Arthritis, mit Psoriasis assoziierte Spondylitis, juvenile Spondyloarthropathie und undifferenzierte Spondyloarthropathie. Unterscheidende Merkmale umfassen Sakrokoxitis mit oder ohne Spondylitis, entzündliche asymmetrische Arthritis; Assoziation mit HLA-B27 (ein serologisch definiertes Allel des HLA-B-Locus von MHC der Klasse I); Augenentzündung und Fehlen von mit anderer Rheumaerkrankung assoziierten Autoantikörpern. Die Zelle, die am ehesten der Schlüssel zur Krankheitsauslösung ist, ist der CD8⁺-Lymphozyt, eine Zelle, die auf Antigen abzielt, das von MHC-Molekülen der Klasse I präsentiert wird. CD8⁺-T-Zellen können gegen das Klasse-I-MHC-Allel HLA-B27 reagieren, als ob es ein fremdes Peptid wäre, das von MHC-Molekülen der Klasse I exprimiert wird. Es ist die Hypothese aufgestellt worden, dass ein Epitop von HLA-B27 ein bakterielles oder anderes mikrobielles antigenes Epitop nachahmen und daher eine CD8⁺-T-Zellen-Reaktion auslösen könnte.
Systemische Sklerose (Skleroderma) hat eine unbekannte Ätiologie. Ein Kennzeichen der Krankheit ist die Verhärtung der Haut; wahrscheinlich wird dies durch einen aktiven Entzündungsprozess ausgelöst. Skleroderma kann lokal oder systemisch auftreten; Gefäßverletzungen sind häufig und Endothelzellenverletzung in den Mikrogefäßen ist ein frühes und bedeutsames Ereignis bei der Entwicklung von systemischer Sklerose; die Gefäßverletzung kann immunvermittelt sein. Eine immunologische Basis ist durch die Gegenwart einkerniger Zellinfiltrate in den Hautläsionen und die Gegenwart von Anti-Kern-Antikörpern in vielen Patienten impliziert. ICAM-1 ist an der Zelloberfläche von Fibroblasten bei Hautläsionen häufig upreguliert, was nahe legt, dass eine Wechselwirkung von T-Zellen mit diesen Zellen eine Rolle bei der Pathogenese der Krankheit spielen könnte. Andere beteiligte Organe umfassen: den Magen-Darm-Trakt: Glattmuskelatrophie und Fibrose, resultierend in abnormaler Peristaltik/Motilität; Niere: konzentrische subendotheliale Intimaproliferation, die die kleinen Bogenarterien und Interlobulararterien mit resultierendem verminderten Nierenrindenblutfluss beeinträchtigen, resultiert in Proteinurie, Azothermie und Bluthochdruck; Skelettmuskel: Atrophie, interstitielle Fibrose; Entzündung; Lunge: interstitielle Pneumonie und interstitielle Fibrose; und Herz: Kontraktionsringnekrose, Vernarbung/Fibrose.
Idiopathische entzündliche Myopathien einschließlich Dermatomyositis, Polymyositis und andere sind Störungen chronischer Muskelentzündung unbekannter Ätiologie, die in Muskelschwäche resultiert. Muskelverletzung/Entzündung ist häufig symmetrisch und progressiv. Autoantikörper sind mit den meisten Formen assoziiert. Diese Myositis-spezifischen Autoantikörper richten sich gegen und hemmen die Funktion von an der Proteinsynthese beteiligten Komponenten, Proteinen und RNAs.
Das Sjögren-Syndrom tritt infolge immunvermittelter Entzündung und anschließender funktioneller Zerstörung der Tränendrüsen und Speicheldrüsen auf. Die Krankheit kann mit entzündlichen Bindegewebserkrankungen assoziiert oder davon begleitet sein. Die Krankheit ist mit der Produktion von Autoantikörpern gegen Ro- und La-Antigene verbunden, wobei beide kleine RNA-Proteinkomplexe sind. Läsionen resultieren in Keratoconjunktivitis sicca, Xerostomie mit anderen Ausprägungen oder Be gleiterscheinungen, einschließlich biliärer Leberzirrhose, peripherer oder sensorischer Neuropathie und tastbarer Purpurn.
Systemische Gefäßentzündungen sind Krankheiten, bei denen die primäre Läsion Entzündung und anschließender Schaden an Blutgefäßen ist, der in Ischämie/Nekrose/Degeneration von durch die beeinträchtigten Gefäße versorgten Geweben und in manchen Fällen letztlich in Endorganfunktionsstörung resultiert. Gefäßentzündungen können auch als sekundäre Läsion oder Folgeerscheinung anderer Immun-Entzündungs-vermittelter Krankheiten auftreten, wie z.B. rheumatischer Arthritis, systemischer Sklerose usw., insbesondere bei Krankheiten, die auch mit der Bildung von Immunkomplexen verbunden sind. Krankheiten in der Gruppe der primären systemischen Gefäßentzündungen umfassen: systemische nekrotisierende Vaskulitis: Polyarteritis nodosa, allergische Angiitis und Granulomatose, Polyangiitis; Wegener-Granulomatose; lymphomatoide Granulomatose; und Riesenzellenarteritis. Sonstige Gefäßentzündungen umfassen: mukokutanes Lymphknotensyndrom (MLNS oder Kawasaki-Krankheit), isolierte CNS-Vaskulitis, Behet-Krankheit, Thromboangiitis obliterans (Buerger'sche Krankheit) und kutane nekrotisierende Venulitis. Es wird angenommen, dass der pathogene Mechanismus der meisten aufgezählten Gefäßentzündungstypen in erster Linie die Ablagerung von Immunglobulinkomplexen in der Gefäßwand und anschließende Auslösung einer entzündlichen Reaktion entweder über ADCC, Komplementaktivierung oder beide ist.
Sarkoidose ist ein Leiden unbekannter Ätiologie, das durch Anwesenheit von epithelartigen Granulomen in nahezu allen Geweben im Körper gekennzeichnet ist; Beteiligung der Lunge ist am häufigsten. Die Pathogenese umfasst die Beständigkeit von aktivierten Makrophagen und Lymphzellen an Krankheitsstellen mit anschließender chronischer Folgekrankheit, die aus der Freisetzung von lokal und systemisch aktiven Produkten resultiert, die von diesen Zelltypen freigesetzt werden.
Hämolytische Autoimmun-Anämie einschließlich hämolytische Autoimmun-Anämie, Immunpancytopenie und paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie ist ein Resultat der Produktion von Antikörpern, die mit Antigenen reagieren, die an der Oberfläche roter Blutzellen (und in manchen Fällen an anderen Blutzellen, auch einschließlich Blutplättchen) exprimiert werden und spiegelt die Entfernung dieser Antikörperbeschichteten Zellen über Komplement-vermittelte Lyse und/oder ADCC/Fc-Rezeptor-vermittelte Mechanismen wider.
Bei Autoimmun-Thrombocytopenie, einschließlich thrombocytopenischer Purpura und immunvermittelter Thrombocytopenie unter anderen klinischen Umständen tritt Blutplättchen-Zerstörung/Entfernung als Resultat von entweder Antikörper- oder Komplement-Anhaftung an Blutplättchen und anschließender Entfernung durch Komplement-Lyse, ADCC- oder FC-Rezeptor-vermittelte Mechanismen auf.
Thyreoiditis, einschließlich Graves-Krankheit, Hashimoto-Thyreoiditis, juvenile lymphozytäre Thyreoiditis und atrophische Thyreoiditis sind das Resultat einer Autoimmunreaktion gegen Schilddrüsen-Antigene mit Produktion von Antikörpern, die mit in der Schilddrüse vorhandenen Proteinen reagieren und häufig für diese spezifisch sind. Es existieren experimentelle Modelle einschließlich spontane Modelle: Ratten (BUF- und BB-Ratten) und Hühner (Obese-Hühnerstamm); induzierbare Modelle: Immunisierung von Tieren mit entweder Thyroglobulin, mikrosomalem Schilddrüsenantigen (Schilddrüsen-Peroxidase).
Diabetes mellitus vom Typ I oder Insulin-abhängiger Diabetes ist die autoimmune Zerstörung von Insel-β-Zellen des Pankreas; diese Zerstörung wird von Autoantikörpern und autoreaktiven T-Zellen vermittelt. Antikörper gegen Insulin oder den Insulinrezeptor können ebenfalls den Phänotyp der Insulin-Nichtreaktivität hervorrufen.
Immunvermittelte Nierenkrankheiten, einschließlich Glomerulonephritis und tubulointerstitielle Nephritis sind das Resultat von Antikörper- oder T-Lymphozyten-vermittelter Verletzung von Nierengewebe entweder direkt als Resultat der Produktion von autoreaktiven Antikörpern oder T-Zellen gegen Nierenantigene oder indirekt als Resultat der Ablagerung von Antikörpern und/oder Immunkomplexen in der Niere, die gegen andere, Nicht-Nieren-Antigene reaktiv sind. Folglich können andere immun vermittelte Krankheiten, die in der Bildung von Immunkomplexen resultieren, ebenfalls die immunvermittelte Nierenkrankheit als indirekte Folgekrankheit auslösen. Sowohl direkte, als auch indirekte Immunmechanismen resultieren in einer entzündlichen Reaktion, die die Entwicklung einer Läsion in Nierengeweben mit resultierender Beeinträchtigung der Organfunktion hervorruft/auslöst, die in manchen Fällen zum Nierenversagen fortschreitet. Humorale sowie zelluläre Mechanismen können an der Pathogenese von Läsionen beteiligt sein.
Es wird angenommen, das Demyelinisationskrankheiten des zentralen und peripheren Nervensystems, einschließlich multiple Sklerose; idiopathische demyelinisierende Polyneuropathie oder Guillain-Barré-Syndrom; und chronische entzündliche demyelinisierende Polyneuropathie eine autoimmune Basis aufweisen und als Resultat einer Schädigung von Oligodendrozyten oder Myelin direkt zu Nervendemyelinisation führen. Bei MS gibt es Belege, die nahe legen, dass die Auslösung und das Fortschreiten der Krankheit von T-Lymphozyten abhängen. Multiple Sklerose ist eine Demyelinisationskrankheit, die von T-Lymphozyten abhängt und entweder einen rezidiven-nachlassenden Verlauf oder einen chronischen progressiven Verlauf aufweist. Die Ätiologie ist unbekannt; jedoch tragen Virusinfektionen, genetische Veranlagung, Umwelt und Autoimmunität alle dazu bei. Läsionen enthalten Infiltrate von vorwiegend T-Lymphozyten-vermittelten Mikrogliazellen und infiltrierenden Makrophagen; Cd4⁺-T-Lymphozynten sind der vorwiegende Zelltyp bei Läsionen. Der Mechanismus des Absterbens von Oligodendrozyten-Zellen und der anschließenden Demyelinisation ist nicht bekannt, wird jedoch wahrscheinlich von T-Lymphozyten gesteuert.
Entzündliche und fibrotische Lungenkrankheit, einschließlich eosinophile Pneumonien; idiopathische Lungenfibrose und exogene allergische Alveolitis könnten eine fehlregulierte immunentzündliche Reaktion umfassen. Die Hemmung dieser Reaktion wäre von therapeutischem Nutzen.
Autoimmun- oder immunvermittelte Hautkrankheit, einschließlich Hautblasenerkrankungen, Erythema multiforme und Kontaktdermatitis werden durch Autoantikörper vermittelt, deren Entstehung von T-Lymphozyten abhängig ist.
Psoriasis ist eine T-Lymphozyten-vermittelte Krankheit. Läsionen enthalten Infiltrate von T-Lymphozyten, Makrophagen und Antigen-verarbeitenden Zellen und einigen Neutrophilen.
Allergische Krankheiten, einschließlich Asthma; allergische Rhinitis; atopische Dermatitis; Nahrungsmittelallergie; und Urtikaria sind von T-Lymphozyten abhängig. Diese Krankheiten werden vorwiegend durch T-Lymphozyten-induzierte Entzündung, IgE-vermittelte Entzündung oder einer Kombination aus beiden vermittelt.
Mit Transplantationen in Verbindung stehende Krankheiten, einschließlich Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit (GVDH) sind von T-Lymphozyten abhängig; Hemmung der T-Lymphozytenfunktion wirkt meliorativ.
Andere Krankheiten, bei denen eine Intervention der Immun- und/oder Entzündungsreaktion von Nutzen ist, sind infektiöse Krankheiten, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf Virusinfektion (einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf AIDS, Hepatitis A, B, C, D, E), bakterielle Infektion, Pilzinfektionen und Protozoen- und Parasiteninfektionen (Moleküle (oder Derivate/Agonisten), die MLR stimulieren, können therapeutisch eingesetzt werden, um die Immunreaktion auf infektiöse Reagenzien zu verstärken), Immundefizienzkrankheiten (Moleküle/Derivate, Agonisten, die MLR stimulieren, können therapeutisch eingesetzt werden, um die Immunreaktion für Leiden vererbter, erworbener, infektiös induzierter (wie bei HIV-Infektion) oder iatrogener (d.h. durch Chemotherapie) Immundefizienz zu verstärken) und Neoplasie.
Der/die Antagonist(en) oder Agonist(en) kann/können nach bekannten Verfahren verabreicht werden, wie z.B. durch intravenöse Verabreichung als Bolus oder durch kontinuierliche Infusion über einen Zeitraum, durch intramuskuläre, intraperitoneale, intrazerebrospinale, subkutane, intraartikuläre, infrasynoviale, intrathekale, orale, topische oder inhalatorische Wege.
Gegebenenfalls kann die Verabreichung durch Minipumpeninfusion unter Verwendung verschiedener erhältlicher Vorrichtungen durchgeführt werden. Die Antagonis ten oder Agonisten können auch unter Anwendung von Gentherapietechniken eingesetzt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung beschrieben worden sind.
Wirksame Dosierungen und Regime für die Verabreichung von Antagonisten oder Agonisten können empirisch ermittelt werden und derartige Ermittlungen können vom Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung vorgenommen werden. Es können einzelne oder mehrere Dosierungen eingesetzt werden. Es wird gegenwärtig angenommen, dass eine wirksame Dosis oder Menge von alleine verwendetem Antagonist oder Agonist im Bereich von etwa 1 μg/kg bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht oder mehr pro Tag liegen kann. Eine zwischenartliche Skalierung von Dosierungen kann auf eine Weise durchgeführt werden, wie sie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, z.B. wie sie in Mordenti et al., Pharmaceut. Res. 8, 1351 (1991) offenbart ist.
Wenn die In-vivo-Verabreichung eines Agonisten oder Antagonisten davon eingesetzt wird, können normale Dosismengen von etwa 10 ng/kg bis zu 100 mg/kg Säugetierkörpergewicht oder mehr pro Tag, vorzugsweise etwa 1 μg/kg/Tag bis 10 mg/kg/Tag in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg variieren.
Anleitungen bezüglich bestimmter Dosierungen und Verfahren der Abgabe werden in der Literatur bereitgestellt; siehe beispielsweise die US-Patente Nr. 4.657.760; 5.206.344; oder 5.225.212. Es wird erwartet, dass unterschiedliche Formulierungen für unterschiedliche Behandlungsverbindungen und unterschiedliche Störungen wirksam sein werden, dass die Verabreichung, die beispielsweise auf ein Organ oder Gewebe abzielt, die Abgabe auf eine Weise erfordern könnte, die sich von der an ein anderes Organ oder Gewebe unterscheidet. Dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung ist verständlich, dass die Dosierung von Antagonist oder Agonist, die verabreicht werden muss, beispielsweise abhängt vom Säugetier, das den Antagonisten oder Agonisten erhält, dem Weg der Verabreichung und anderen Medikamenten oder Therapien, die dem Säugetier verabreicht werden.
In Abhängigkeit vom Zelltyp und/oder von der Schwere der Krankheit ist 1 μg/kg bis 15 mg/kg (z.B. 0,1–20 mg/kg) Antagonist-Antikörper oder Agonist-Antikörper eine anfängliche Kandidatdosis zur Verabreichung, ob sie beispielsweise durch eine oder mehrere gesonderte Verabreichungen oder durch kontinuierliche Infusion verabreicht wird. Eine typische Tagesdosierung kann von etwa 1 μg/kg bis 100 mg/kg oder mehr in Abhängigkeit von den oben erwähnten Faktoren reichen. Für wiederholte Verabreichungen über mehrere Tage oder länger wird die Behandlung in Abhängigkeit vom Leiden aufrechterhalten, bis eine gewünschte Unterdrückung von Krankheitssymptomen auftritt. Jedoch können andere Dosisregime zweckdienlich sein.
Gegebenenfalls kann vor der Verabreichung eines jeglichen Antagonisten oder Agonisten das Säugetier oder der Patient getestet werden, um Ausmaße oder Aktivitäten von TALL-1 oder APRIL, oder TACI oder BCMA zu ermitteln. Derartige Tests können mittels ELISA oder FACS von Serumproben oder Peripherblutleukozyten durchgeführt werden.
Es kann ein einziger Typ von Antagonist oder Agonist in den Verfahren eingesetzt werden. Beispielsweise kann ein TALL-1-Antagonist, wie z.B. ein TACI-Rezeptor-Immunadhäsinmolekül verabreicht werden. Alternativ dazu kann der geübte Praktiker sich dafür entscheiden, eine Kombination von Antagonisten oder Agonisten in den Verfahren einzusetzen, z.B. eine Kombination eines TACI-Rezeptor-Immunadhäsins und eines Anti-APRIL-Antikörpers. Es kann außerdem wünschenswert sein, einen Doppelantagonisten einzusetzen, d.h. einen Antagonisten, der sowohl TALL-1, als auch APRIL hemmt oder blockiert. Ein derartiges Antagonistenmolekül kann beispielsweise an Epitope binden, die unter TALL-1 und APRIL, oder TACI und BCMA konserviert sind.
Es ist auch vorgesehen, dass noch weitere Therapien in den Verfahren eingesetzt werden können. Die eine Therapie oder mehreren anderen Therapien können die Verabreichung von Strahlentherapie, Cytokin(en), wachstumshemmenden/-m Mittel(n), chemotherapeutischen/-m Mittel(n), cytotoxischen/-m Mittel(n), Tyrosinkinase-Inhibitoren, ras-Farnesyltransferaseinhibitoren, Angiogeneseinhibitoren und Cyclin abhängigen Kinaseinhibitoren umfassen, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und im obigen Abschnitt I genau beschrieben sind, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Zusätzlich können Therapien auf Basis therapeutischer Antikörper eingesetzt werden, die auf Tumorantigene abzielen, wie z.B. Rituxan^TM oder Herceptin^TM sowie antiangiogene Antikörper, wie z.B. Anti-VEGF.
Herstellungs- und Dosierungsschemata für chemotherapeutische Mittel können nach den Anleitungen des Herstellers oder wie vom geübten Praktiker ermittelt verwendet werden. Herstellungs- und Dosierungsschemata für eine derartige Chemotherapie werden auch in Chemotherapy Service, M. C. Perry (Hrsg.), Williams & Wilkins, Baltimore, MD, USA (1992) beschrieben. Das chemotherapeutische Mittel kann der Verabreichung von z.B. einem Antagonisten vorangehen oder folgen oder kann gleichzeitig damit verabreicht werden. Der Antagonist kann außerdem mit einer Anti-Östrogen-Verbindung, wie z.B. Tamoxifen oder einem Anti-Progesteron, wie z.B. Onapriston (siehe EP-A-616.812) in Dosierungen kombiniert werden, die für derartige Moleküle bekannt sind.
Es kann wünschenswert sein, außerdem Antikörper gegen andere Antigene zu verabreichen, wie z.B. Antikörper, die an CD20, CD11a, CD18, CD40, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 oder Gefäßendothelfaktor (VEGF) binden. Alternativ dazu oder zusätzlich können dem Patienten zwei oder mehr Antikörper mit verabreicht werden, die dasselbe oder zwei verschiedene hierin offenbarte Antigene binden. Manchmal kann es vorteilhaft sein, dem Patienten außerdem ein oder mehrere Cytokine zu verabreichen. Die Antagonisten hierin können zusammen mit einem wachstumshemmenden Mittel verabreicht werden. Beispielsweise kann das wachstumshemmende Mittel zuerst verabreicht werden, gefolgt von einem Antagonisten der vorliegenden Erfindung.
Der Antagonist oder Agonist (und eine oder mehrere andere Therapien) können gleichzeitig oder hintereinander verabreicht werden. Nach der Verabreichung von Antagonist oder Agonist können behandelte Zellen in vitro analysiert werden. Wenn eine In-vivo-Behandlung erfolgt ist, kann ein behandeltes Tier auf verschiedene Arten beobachtet werden, die dem geübten Praktiker wohlbekannt sind. Beispielsweise können Marker der B-Zellenaktivität, wie z.B. Ig-Produktion (nichtspezifisch oder antigenspezifisch) getestet werden.
III. Screeningverfahren
Es können Verfahren zum Screenen von Molekülen durchgeführt werden, um jene zu identifizieren, die als Agonisten oder Antagonisten der APRIL/TACI/BCMA-Wechselwirkung oder TALL-1/TACI/BCMA-Wechselwirkung agieren können. Derartige Moleküle können kleine Moleküle oder Polypeptide, einschließlich Antikörper umfassen. Beispiele von kleinen Molekülen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf kleine Peptide oder peptidähnliche Moleküle, vorzugsweise lösliche Peptide und synthetische organische oder anorganische Nicht-Peptidyl-Verbindungen. Die Screeningtests für Medikamentkandidaten sind konstruiert, um Verbindungen oder Moleküle zu identifizieren, die die hierin identifizierten Liganden- oder Rezeptorpolypeptide binden oder komplexieren oder die Wechselwirkung dieser Polypeptide mit anderen Zellproteinen anderweitig stören. Derartige Screeningtests werden Tests umfassen, die dem Hochdurchsatz-Screening chemischer Bibliotheken zugänglich sind, was sie insbesondere zur Identifizierung von kleinen Medikamentkandidatmolekülen geeignet macht.
Die Tests können in einer Vielzahl von Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindungstests, biochemische Screeningtests, Immuntests und auf Zellen basierende Tests, die alle auf dem Gebiet der Erfindung gut beschrieben sind.
Tests auf beispielsweise Antagonisten haben gemein, dass sie das Kontaktieren des Medikamentkandidaten mit einem hierin identifizierten Liganden- oder Rezeptorpolypeptid unter Bedingungen und für einen Zeit erfordern, die ausreichen, um die Wechselwirkung dieser beiden Komponenten zu ermöglichen.
Bei Bindungstests ist die Wechselwirkung die Bindung und der gebildete Komplex kann im Reaktionsgemisch nachgewiesen oder isoliert werden. In einer speziellen Ausführungsform wird das hierin identifizierte Liganden- oder Rezeptorpolypeptid oder der Medikamentkandidat an einer Festphase, z.B. auf einer Mikrotiterplatte durch kovalente oder nicht-kovalente Anhaftung immobilisiert. Eine nicht-kovalente Anhaftung wird im Allgemeinen erzielt, indem die Festphasenoberfläche mit einer Lösung des Liganden- oder Rezeptßrpolypeptids beschichtet und getrocknet wird. Alternativ dazu kann ein immobilisierter Antikörper, z.B. ein für das zu immobilisierende Liganden- oder Rezeptorpolypeptid spezifischer monoklonaler Antikörper verwendet werden, um es an einer festen Oberfläche zu verankern. Der Test wird durchgeführt, indem die nicht-immobilisierte Komponente, die durch einen nachweisbaren Marker markiert sein kann, der immobilisierten Komponente, z.B. der die verankerte Komponente enthaltenden, beschichteten Oberfläche zugegeben wird. Wenn die Reaktion beendet ist, werden die nicht umgesetzten Komponenten z.B. durch Waschen entfernt und die an der festen Oberfläche verankerten Komplexe nachgewiesen. Wenn die ursprünglich nicht immobilisierte Komponente einen nachweisbaren Marker trägt, zeigt der Nachweis von an der Oberfläche immobilisiertem Marker an, dass eine Komplexierung aufgetreten ist. Wenn die ursprünglich nicht-immobilisierte Komponente keinen Marker trägt, kann die Komplexierung beispielsweise durch Verwendung eines markierten, den immobilisierten Komplex spezifisch bindenden Antikörpers nachgewiesen werden.
Falls die Kandidatverbindung mit einem bestimmten hierin identifizierten Liganden- oder Rezeptorpolypeptid wechselwirkt, jedoch nicht daran bindet, kann seine Wechselwirkung mit diesem Polypeptid durch Verfahren getestet werden, die zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen wohlbekannt sind. Derartige Tests umfassen herkömmliche Ansätze, wie z.B. Vernetzung, Co-Immunpräzipitation und Co-Reinigung über Gradienten oder chromatographische Säulen. Zusätzlich können Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Verwenden eines auf Hefe basierenden genetischen Systems beobachtet werden, das von Fields und Mitarbeitern beschrieben (Fields und Song, Nature (London) 340, 245–246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578–9582 (1991)) und von Chevray und Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789–5793 (1991) offenbart wurde. Viele Transkriptionsaktivatoren, wie z.B. GAL4 bestehen aus zwei physisch unterschiedlichen modularen Domä nen, wovon eine als die DNA-bindende Domäne agiert und die andere als Transkriptionsaktivierungsdomäne wirkt. Das in den vorhergehenden Veröffentlichungen beschriebene Hefeexpressionssystem (in Allgemeinen als „Zweihybridsystem" bezeichnet) macht sich diese Eigenschaft zunutze und setzt zwei Hybridproteine ein, wobei in einem davon das Zielprotein an die DNA-Bindungsdomäne von GAL4 fusioniert ist und im anderen die aktivierenden Kandidatproteine an die Aktivierungsdomäne fusioniert sind. Die Expression eines GAL1-lacZ-Reportergens unter der Kontrolle eines GAL4-aktivierten Promotors hängt von der Wiederherstellung von GAL4-Aktivität über Protein-Protein-Wechselwirkung ab. Wechselwirkende Polypeptide enthaltende Kolonien werden mit einem chromogenen Substrat für β-Galactosidase nachgewiesen. Ein vollständiges Set (MATCHMAKER^TM) zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei bestimmten Proteinen unter Verwendung der Zweihybridtechnik ist im Handel von Clontech erhältlich. Dieses System kann auch erweitert werden, um Proteindomänen zu kartieren, die an spezifischen Proteinwechselwirkungen beteiligt sind sowie um Aminosäurereste genau zu bestimmen, die für diese Wechselwirkungen entscheidend sind.
Verbindungen und Moleküle, die die Wechselwirkung eines hierin identifizierten Liganden- oder Rezeptorpolypeptids und anderer intra- und extrazellulärer Komponenten stören, können wie folgt getestet werden: üblicherweise wird ein Reaktionsgemisch hergestellt, das das Produkt des Gens und die intra- oder extrazelluläre Komponente unter Bedingungen und für eine Zeit enthält, die die Wechselwirkung und Bindung der beiden Produkte ermöglichen. Um die Fähigkeit einer Kandidatverbindung zu testen, die Bindung zu hemmen, wird die Reaktion in Abwesenheit und Anwesenheit der Testverbindung durchgeführt. Zusätzlich kann ein Placebo einem dritten Reaktionsgemisch zugesetzt werden, um als positive Kontrolle zu dienen. Die Bindung (Komplexbildung) zwischen der Testverbindung und der im Gemisch vorhandenen intra- oder extrazellulären Komponente wird wie hierin oben beschrieben überprüft. Die Bildung eines Komplexes in der/den Kontrollreaktion(en), nicht jedoch im die Testverbindung enthaltenden Reaktionsgemisch weist darauf hin, dass die Testverbindung die Wechselwirkung der Testverbindung und seines Reaktionspartners stört.
Um auf Antagonisten zu testen, kann das Liganden- oder Rezeptorpolypeptid einer Zelle zusammen mit der auf eine bestimmte Aktivität zu screenenden Verbindung zugegeben werden, wobei die Fähigkeit der Verbindung, die Aktivität von Interesse in Gegenwart des Liganden- oder Rezeptorpolypeptids zu hemmen, anzeigt, dass die Verbindung ein Antagonist gegen das Liganden- oder Rezeptorpolypeptid ist. Alternativ dazu können Antagonisten detektiert werden, indem das Liganden- oder Rezeptorpolypeptid und ein möglicher Antagonist mit membrangebundenen Polypeptidrezeptoren oder rekombinanten Rezeptoren unter geeigneten Bedingungen für einen kompetitiven Hemmtest kombiniert wird. Das Liganden- oder Rezeptorpolypeptid kann markiert sein, wie z.B. durch Radioaktivität, sodass die Anzahl von an den Rezeptor gebundenen Polypeptidmolekülen verwendet werden kann, um die Wirksamkeit des möglichen Antagonisten zu ermitteln. Das für den Rezeptor kodierende Gen kann durch zahlreiche Verfahren identifiziert werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, beispielsweise mittels Liganden-Panning und FACS-Sortierung. Coligan et al., Current Protocols in Immun. 1(2), Kap. 5 (1991). Vorzugsweise wird Expressionsklonierung eingesetzt, worin polyadenylierte RNA aus einer Zelle präpariert wird, die auf das Liganden- oder Rezeptorpolypeptid reaktiv ist, und eine aus dieser RNA erzeugte cDNA-Bibliothek wird in Pools unterteilt und verwendet, um COS-Zellen oder andere Zellen zu transfizieren, die nicht auf das Liganden- oder Rezeptorpolypeptid reagieren. Transfizierte Zellen, die auf Glasobjektträgern gezüchtet werden, werden dem markierten Liganden- oder Rezeptorpolypeptid ausgesetzt. Das Liganden- oder Rezeptorpolypeptid kann auf zahlreiche Arten, einschließlich Iodierung oder Aufnahme einer Erkennungsstelle für eine ortsspezifische Proteinkinase markiert werden. Nach Fixierung und Inkubation werden die Objektträger der autoradiographischen Analyse unterzogen. Positive Pools werden identifiziert und es werden Sub-Pools hergestellt und unter Verwendung eines interaktiven Sub-Pooling- und wiederholten Screening-Prozesses wiederholt transfiziert, was letztendlich in einem einzigen Klon resultiert, der für den mutmaßlichen Rezeptor kodiert.
Als alternativer Ansatz kann ein markiertes Liganden-Polypeptid über Photoaffinität mit einer Zellmembran oder Extraktpräparaten verbunden werden, die das Rezeptormolekül exprimieren. Vernetztes Material wird mittels PAGE aufgelöst und Röntgenfilm damit belichtet. Der den Rezeptor enthaltende markierte Komplex kann herausgeschnitten, in Peptidfragmente aufgelöst und Protein-Mikrosequenzierung unterzogen werden. Die aus der Mikrosequenzierung erlangte Aminosäuresequenz kann üblicherweise verwendet werden, um einen Satz degenerierter Oligonucleotidsonden zu konstruieren, μm eine cDNA-Bibliothek zu screenen, um das für den mutmaßlichen Rezeptor kodierende Gen zu identifizieren.
IV. Fertigartikel
Es wird ein Fertigartikel beschrieben, der für die Behandlung der oben beschriebenen Störungen zweckdienliche Materialien enthält. Der Fertigartikel umfasst einen Behälter und ein Etikett. Geeignete Behälter umfassen beispielsweise Flaschen, Fläschchen, Spritzen und Teströhrchen. Die Behälter können aus einer Reihe von Materialien bestehen, wie z.B. Glas oder Kunststoff. Der Behälter enthält eine Zusammensetzung, die zur Behandlung des Leidens wirksam ist, und kann eine sterile Einfüllöffnung aufweisen (beispielsweise kann der Behälter ein Beutel für intravenöse Lösungen oder ein Fläschchen sein, das einen von einer Injektionsnadel durchstechbaren Stopfen aufweist). Die aktiven Mittel in der Zusammensetzung können TALL-1-Antagonist(en) oder APRIL-Antagonist(en), oder TACI-Agonist(en) oder BCMA-Agonist(en) umfassen. Das Etikett, das am Behälter angebracht oder mit ihm verbunden ist, weist darauf hin, dass die Zusammensetzung zur Behandlung des Leidens der Wahl verwendet wird. Der Fertigartikel kann außerdem einen zweiten Behälter umfassen, der einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer, wie z.B. phosphatgepufferte Salzlösung, Ringer-Lösung und Dextroselösung umfasst. Er kann außerdem andere Materialien umfassen, die vom wirtschaftlichen und Nutzerstandpunkt wünschenswert sind, einschließlich andere Puffer, Verdünner, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Gebrauchsanweisungen.
Die folgenden Beispiele werden zur Illustration und nicht als Einschränkung bereitgestellt.
Beispiel 1
Identifizierung und Expressionsklonierung von TACI einem Rezeptor für den TALL-1-Liganden
Ein Hybridprotein, das als „AP-TALL-1" bezeichnet wird, wurde unter Verwendung von alkalischer Phosphatase (AP) aus menschlicher Plazenta hergestellt, die an den N-Terminus eines aus den Aminosäuren 136–285 bestehenden, in 3 gezeigten TALL-1-Polypeptids fusioniert war. Die AP wurde durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von pAPtag-5 (Genehunter Corporation) als Templat erhalten und in den Expressionsvektor pCMV-1-Flag (Sigma) mit AP am N-Terminus von TALL-1 fusioniert und kloniert. AP-TALL-1 wurde vorübergehend transfiziert (unter Verwendung von Lipofectamin-Reagens; Gibco-BRL) und in menschlichen embryonalen Nieren-293-Zellen (ATCC) exprimiert. AP-TNF-α (Pennica et al., siehe unten) wurde auf ähnliche Weise hergestellt. AP-EDA (umfassend die Aminosäuren 241–391 von EDA; Srivastava et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13069–13074 (1997)) wurde ebenfalls auf ähnliche Weise hergestellt. Das konditionierte Medium aus den transfizierten 293-Zellen wurde filtriert (0,45 μm), bei 4°C in einem 20 mM Hepes (pH 7,0) und 1 mM Natriumazid enthaltenden Puffer gelagert und für anschließende Zellfärbeverfahren verwendet.
Außerdem wurde eine N-terminate Flag-markierte Form von TALL-1 in einem pCMV-1-Flag-Vektor konstruiert. Um die Trimerisierung dieses Flag-markierten TALL-1-Konstrukts zu fördern, wurde eine trimere Form der Leucin-Zipper-Sequenz (Science 262, 1401–1407 (1993)) zwischen dem Flag-Marker und dem TALL-1 (bestehend aus den Aminosäuren 136–285 aus 3) insertiert und dieses Konstrukt als „Flag-LZP-TALL-1" bezeichnet. Flag-LZP-TALL-1 wurde unter Verwendung von M2-Agarosegel (Sigma) aus serumfreiem Medium von 293-Zellen gereinigt, die mit dem Flag-LZP-TALL-1 exprimierenden Plasmid transfiziert waren.
AP-Reaktivität konnte leicht nachgewiesen werden, wenn AP-TALL-1-konditioniertes Medium, nicht jedoch Kontroll-AP-konditioniertes Medium auf IM-9-Zellen (ATCC) angewendet wurde, von denen gezeigt worden ist, dass sie hohe Ausmaße an TALL-1-Bindungsaktivität zeigen (Daten nicht dargestellt). Das gereinigte Flag-LZP-TALL-1 band auch an die IM-9-Zellen, wie mittels FACS-Analyse ermittelt wurde (Daten nicht dargestellt). Es ist von Bedeutung, dass die Bindung von AP-TALL-1 an IM-9-Zellen durch Vorinkubation mit gereinigtem Flag-LZP-TALL-1, nicht jedoch mit gereinigtem TNF-α (hergestellt im Wesentlichen wie in Pennica et al., Nature 312, 724–729 (1984) beschrieben) wirksam blockiert wurde, was nahe legt, dass beide Formen von TALL-1 funktionstüchtig waren und die entsprechende Bindung von AP-TALL-1 und Flag-LZP-TALL-1 an IM-9-Zellen spezifisch war.
Um einen Rezeptor für TALL-1 zu identifizieren, wurde eine cDNA-Expressionsbibliothek im pRK5-Vektor konstruiert ( EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989), und zwar unter Verwendung von aus den IM-9-Zellen stammender PolyA⁺-mRNA (Flanagan et al., Cell 63, 185 (1990)). Pools von 1.000 DNA-Klonen (Miniprep DNA (Qiagen)) aus der Bibliothek wurden in COS-7-Zellen (ATCC) in 6-Napf-Platten transfiziert (unter Verwendung von Lipofectamin), die dann nach 36–48 Stunden mit AP-TALL-1-konditioniertem Medium inkubiert, gewaschen und auf AP-Aktivität in situ gefärbt wurden. Ein positiver Pool wurde in immer kleinere Pools unterteilt. Nach drei Screening-Umläufen wurde eine einzelne cDNA identifiziert, die für eine AP-TALL-1-Bindungsaktivität kodiert. Die Sequenzierung des cDNA-Inserts offenbarte ein einzelnes offenes Leseraster, von dem vorhergesagt wird, dass es für ein Protein aus 265 Aminosäuren kodiert. Dieses Polypeptid aus 265 Aminosäuren (in 6 als „hTACI (265)" bezeichnet) offenbarte bei Angleichung an die in 1 gezeigte TACI-Sequenz (in 6 als „hTACI" bezeichnet) eine hohe prozentuelle Sequenzidentität insbesondere in der ECD. Die Angleichung dieser beiden TACI-Sequenzen wird in 6 gezeigt. Es wird angenommen, dass die TACI-Form mit 265 Aminosäuren eine Spleißvariante der in 1 gezeigten TACI-Sequenz sein könnte.
In einem In-vitro-Test wurden COS-7-Zellen (ATCC) in 12-Napf-Platten 24 Stunden vor der Transfektion eingeimpft. Die Zellen wurden dann mit 1 Mikrogramm TACI (die oben beschriebene, in pRK5B-Vektor klonierte menschliche TACI-Form von 265 Aminosäuren, siehe unten) oder Vektorplasmid (pRK5B) alleine transfiziert. 18–24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit AP-TALL-1; AP-TNF-α; oder AP-EDA enthaltendem konditionierten Medium für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und auf AP-Aktivität in situ wie in Tartaglia et al., Cell 83, 1263–1271 (1995) beschrieben gefärbt.
Wie in 7 gezeigt ist, wurde gefunden, dass AP-TALL-1 (7A), nicht jedoch AP-TNF-α (7B) oder AP-EDA (7C) an mit TACI transfizierte COS-7-Zellen bindet. Das AP-TALL-1 färbte nicht mit Vektorplasmid alleine transfizierte Zellen (7D). AP-TALL-1-Bindung an die TACI-transfizierten COS-7-Zellen wurde durch eine Flag-markierte Form von TALL-1 wirksam blockiert, nicht jedoch durch eine Flag-markierte Form von LIGHT (Mauri et al., siehe oben), einem weiteren TNF-Homolog (Daten nicht dargestellt).
Beispiel 2
Bindung von TALL-1 oder ARPIL an TACI-IgG und BCMA-IgG
Flag-markierte Liganden wurden wie folgt hergestellt. Die Aminosäuren 82–240 von LIGHT (Mauri et al., Immunity 8, 21–30 (1998)) wurden in pCMV-1-Flag (Sigma) unter Verwendung einer NotI-Stelle subkloniert, um die Aminosäuren 1–27 des Flag-Signals und die Markersequenz stromauf der LIGHT-Sequenz zu fusionieren. Die Aminosäuren 105–250 von APRIL (siehe 4) wurden auf ähnliche Weise in pCMV-1-Flag (Sigma) mit der Ausnahme kloniert, dass eine HindIII-Stelle verwendet wurde, was in der Fusion an den Aminosäuren 1–24 des Flag-Signals und der Marker-Sequenz resultierte. Die Aminosäuren 124–285 von TALL-1 (siehe 3) wurden an die Aminosäuren 1–27 des Flag-Signals und der Marker-Sequenz wie oben für Flag-LIGHT beschrieben fusioniert. AP-APRIL wurde durch Klonieren der Aminosäuren 105–250 von APRIL (siehe 4) in einen pCMV-1-Flag-Vektor kloniert, der für alkalische Phosphatase menschlicher Plazenta kodiert, sodass die für APRIL kodierende Sequenz C-terminal an AP fusioniert wurde, während AP C-terminal an Flag fusioniert wurde. AP-TALL-1 wurde durch Klonieren der Aminosäuren 135–285 von TALL-1 (siehe 3) in den pCMV-1-Flag, AP-Vektor wie oben für AP-APRIL beschrieben hergestellt. Die jeweiligen markierten Proteine wurden dann in 293-Zellen oder CHO-Zellen exprimiert und unter Verwendung von M2-Anti-Flag-Harz (Sigma) gereinigt.
Ein μg von gereinigtem menschlichen Flag-LIGHT (Kontrolle), Flag-APRIL oder Flag-TALL-1 oder Flag-AP-APRIL oder Flag-AP-TALL-1 wurde mit 1 μg gereinigtem menschlichen Immunadhäsin, das die IgG1-Fc-FUsion der ECD von DcR3 (Kontrolle; Pitti et al., Nature 396, 699–703 (1998)) oder TACI oder BCMA enthielt, über Nacht bei 4°C in doppelter Ausführung inkubiert. Die TACI-ECD.hFc-Immunadhäsine wurden mittels Verfahren hergestellt, die in Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535–10539 (1991) beschrieben sind. Die Immunadhäsinkonstrukte bestanden aus den Aminosäuren 2–166 des menschlichen TACI-Polypeptids (siehe 1). Die TACI-ECD-Konstrukte wurden in CHO-Zellen unter Verwendung einer heterologen Signalsequenz (Pre-Pro-Trypsin-Aminosäuren 1–17 von pCMV-1-Flag (Sigma)), die für die menschliche IgG1-Fc-Region stromab der TACI-Sequenz kodiert, exprimiert und dann mittels Protein-A-Affinitätschromatographie gereinigt. Die BCMA-ECD-Immunadhäsine wurden mittels Verfahren hergestellt, die von Ashkenazi et al. (oben zitiert) beschrieben sind. Die Immunadhäsinkonstrukte bestanden aus den Aminosäuren 5–51 des menschlichen BCMA-Polypeptids (siehe 2). Die BCMA-ECD-Konstrukte wurden in CHO-Zellen unter Verwendung einer heterologen Signalsequenz (Prä-Pro-Trypsin-Aminosäuren 1–17 von pCMV-1-Flag (Sigma)), die für die menschliche IgG1-Fc-Region stromab der BCMA-Sequenz kodiert, exprimiert und dann mittels Protein-A-Affinitätschromatographie gereinigt.
Ein Satz von Reaktionen (8; Tafeln A–C) wurde einer Immunpräzipitation durch das Rezeptor-Immunadhäsin mit Protein-A-Agarose (Repligen) unterzogen. Der zweite Satz von Reaktionen (8; Tafeln D–F) wurde einer Immunpräzipitation durch den Flag-markierten Liganden mit Anti-Flag-mAb-M2-Agarose (Sigma) unter zogen. Die Immunpräzipitate wurden dann mittels Western-Blot mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Anti-Flag-M2-mAb (Sigma) analysiert, um die Flag-markierten Liganden nachzuweisen (8A–C), oder mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Ziegen-Anti-Human-IgG-pAb (Amersham), um die Rezeptor-Immunadhäsine nachzuweisen (8D–F).
Die Daten zeigen, dass Flag-LIGHT an DcR3-IgG band, nicht jedoch an TACI-IgG oder BCMA-IgG. Flag-APRIL und Flag-AP-APRIL banden an TACI-IgG und BCMA-IgG, nicht jedoch an DcR3-IgG. Gleichermaßen banden Flag-TALL-1 und Flag-AP-TALL-1 an TACI-IgG und BCMA-IgG, nicht jedoch an DcR3-IgG. Diese Testergebnisse zeigten, dass APRIL und TALL-1 beide auf spezifische und stabile Weise an TACI und an BCMA binden können.
In einem auf ähnliche Weise durchgeführten Co-Immunpräzipitationstest wurden TACI-Fc (beschrieben in Beispiel 2), HVEM-Fc (Montgomery et al., siehe oben); DR3-Fc (Chinnaiyan et al., Science 274, 990 (1996); Marsters et al., Curr. Biol. 6, 1669 (1996)); oder DR6-Fc (Pan et al., FEBS Letters 431, 351–356 (1998)) (1 μg/ml) mit Flag-TALL-1 (1 μg/ml; hergestellt wie beschrieben in Beispiel 2) inkubiert. Ein Satz von Reaktionen wurde der Immunpräzipitation durch die Rezeptor-Fc-Fusion mit Protein-A-Agarose unterzogen; der zweite Satz von Reaktionen wurde der Immunpräzipitation durch den Liganden mit Anti-Flag-Antikörper unterzogen. Die Proben wurden mittels Western-Blot wie oben analysiert. Flag-TALL-1 wurde in der Anti-Fc-Co-Immunpräzipitation mit den Fc-Fusionskonstrukten von HVEM, DR3 oder DR6 nicht detektiert (8G). Im Gegensatz dazu wurde TACI-Fc in Anti-Flag-Co-Immunpräzipitationen mit HVEM-Fc, DR3-Fc oder DR6-Fc nicht detektiert (siehe 8H).
Zusätzliche Tests wurden durchgeführt, um zu ermitteln, ob TACI als Rezeptor für andere Elemente der TNF-Familie von Liganden dienen könnte. COS-7-Zellen (ATCC) wurden vorübergehend mit Membranformen verschiedener Liganden der TNF-Familie transfiziert (unter Verwendung von Lipofectamin-Reagens). Unter den getesteten Liganden waren APRIL, TALL-1, 4-1BBL, CD27L, CD30L, CD40L, EDA, Fast, GITRL, LT-α, OX-40L, RANKL, TNF-α, TNF-β und Apo2L/TRAIL.
Menschliches TNF-α wurde in den Vektor pRK5B kloniert (pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, der die SfiI-Stelle nicht enthält; siehe Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991)). Zum Nachweis der TNF-α-Expression an der Zelloberfläche wurde ein Flag-Marker zwischen Aminosäure 70 und Aminosäure 71 insertiert (unter Verwendung der Nummerierung gemäß der Sequenz in Pennica et al. siehe oben). Eine extrazelluläre Region von TALL-1 (AS 75-285; siehe 3), 4-1BBL (AS 59-254; Goodwin et al., Eur. J. Immunol. 23, 2631–2641 (1993)), CD27-Ligand (AS 40-193; Goodwin et al., Cell 1349–1360 (1993)), RANKL (AS 71-317; siehe WO 98/28426), Apo-2-Ligand (AS 40-281; siehe WO 97/25428) oder Apo-3L (AS 46-249; siehe WO 99/19490) wurden einzeln an der BamHI-Stelle kloniert. Dies resultierte in einem Hybridliganden mit den intrazellulären und Transmembranregionen aus TNF-α und der extrazellulären Region aus den verschiedenen Liganden. Für APRIL (siehe 4) und EDA (Srivastava et al., siehe oben) wurden cDNA-Klone voller Länge ohne Flag-Marker verwendet.
Transfizierte COS-7-Zellen wurden anschließend mit (wie oben beschrieben hergestelltem) TACI.ECD.hFC-Immunadhäsin inkubiert. Die Zellen wurden mit dem TACI-ECD-IgG (oder einem TNFR1-IgG-Konstrukt, das wie in Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535–10539 (1991) beschrieben hergestellt wurde) bei 1 μg/ml für 1 Stunde in PBS inkubiert. Die Zellen wurden anschließend drei Mal mit PBS gewaschen und mit 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert. Zellfärbung wurde durch Inkubation mit biotinyliertem Ziegen-Anti-Human-Antikörper (Jackson Labs, in einer Verdünnung von 1:200), gefolgt von Cy3-Streptavidin (Jackson Labs, in einer Verdünnung von 1:200) sichtbar gemacht.
Um (einen) mögliche(n) Liganden von BCMA zu identifizieren, wurden ähnliche Bindungsexperimente wie oben für TACI beschrieben durchgeführt. Es wurde ein BCMA-ECD.hFc-Immunadhäsin wie oben beschrieben hergestellt.
Ähnlich wie TACI wechselwirkte BCMA nur mit APRIL und TALL-1. Wie in 9A gezeigt, banden TACI-hFc und BCMA-hFc an mit TALL-1 oder April, nicht jedoch an mit TNF-α transfizierte Zellen. Im Gegensatz dazu banden AP-TALL-1 oder AP-APRIL spezifisch an mit TACI oder BCMA transfizierte Zellen (9B).
Beispiel 3
Induktion von IgM-Produktion durch TALL-1 und APRIL und Hemmung der Induktion durch TACI-IqG und BCMA-IqG
Menschliche einkernige Peripherblutzellen (PBMC) wurden an einem Ficol-Gradienten nach den Anleitungen des Herstellers (LSM-Medium, ICN/Cappel, OH) isoliert. Peripherblutleukozyten (PBL) wurden dann aus den PBMC unter Anwendung standardmäßiger Entfernung von an Kunststoff anhaftenden Zellen erlangt. PBLs wurden in 48-Napf-Schalen ausplattiert (3 × 10⁴ Zellen/Napf auf 0,3 ml 10% FBS enthaltendem RPM11640-Medium) und für 72 Stunden bei 37°C, 5% CO₂ mit PBS (Kontrolle) oder IL-4 (100 ng/ml, Kontrolle, R & D Systems, Minneapolis, MN) oder Flag-TALL-1 (wie im obigen Beispiel 2 beschrieben) (1 μg/ml) inkubiert. Für die Hemmanalyse wurden die Zellen mit jedem der obigen in Kombination mit 20 μg/ml TACI-IgG oder BCMA-IgG (wie im obigen Beispiel 2 beschrieben hergestellt) oder einer Isotyp-übereinstimmenden Immunadhäsin-Kontrolle inkubiert. Zellüberstände wurden gesammelt und auf IgM-Spiegel unter Verwendung eines IgM-ELISA-Sets nach den Anleitungen des Herstellers (Bethyl Laboratories, TX) analysiert.
Die Ergebnisse sind in 10 dargestellt. IL-4, das als positive Kontrolle verwendet wurde, induzierte IgM-Produktion im Vergleich zur PBS-Kontrolle. TALL-1 oder APRIL induzierten zumindest soviel IgM-Produktion wie IL-4. Die Kombination von TALL-1 und APRIL zeigte keine weitere Induktion von IgM im Vergleich zu jedem Liganden alleine. TACI-IgG blockierte nicht die Wirkung von IL-4, es blockierte jedoch die Wirkung von TALL-1 und/oder APRIL vollständig.
BCMA-IgG blockierte nicht die Wirkung von IL-4, blockierte jedoch die Wirkung von TALL-1 und/oder APRIL wesentlich, wenn auch nicht vollständig. Das Kontroll-Immunadhäsin blockierte keinen der Liganden. Diese Ergebnisse zeigen, dass TALL-1 und APRIL die IgM-Produktion in PBL induzieren können. Darüber hinaus zeigen die Daten, dass TACI-IgG und BCMÄ-IgG die Wirkungen von TALL-1 oder APRIL auf die IgM-Produktion blockieren können, was ihre jeweilige Fähigkeit bestätigt, an jeden Liganden zu binden und ihre jeweilige Fähigkeit beweist, die Aktivität des Liganden auf Zielzellen zu blockieren.
Beispiel 4
Wechselwirkung zwischen TALL-1 oder APRIL mit TACI und/oder BCMA führt zur Aktivierung von NF-kB
293-Zellen (ATCC) wurden 24 Stunden vor Transfektion mit 1 × 10⁵ Zellen/Napf in 12-Napf-Platten eingeimpft und mit 0,25 μg ELAM-Luciferase-Reportergenplasmid, 25 ng pRL-TK (Promega) und den angegebenen Mengen jedes Expressionskonstrukts (siehe 11) transfiziert. Die Gesamtmenge an transfizierter DNA wurde durch Ergänzung mit leerem pRK5B-Vektor (siehe Beispiel 2) auf 1 mg konstant gehalten. In manche Testnäpfe wurden Flag-markierte Liganden (wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt) in den angegebenen Konzentrationen 4 Stunden nach der Transfektion zugegeben. In anderen Testnäpfen wurden die Zellen mit TALL-1 (3) oder RANKL (WO 98/28426) cotransfiziert. Die Zellen wurden 20–24 Stunden nach Transfektion geerntet und die Reportergenaktivität mit dem Doppel-Luciferase-Reporter-Assay-System (Promega) ermittelt.
Es wurde eine nur minimale Aktivierung von NF-kB beobachtet, wenn TACI oder BCMA in niedrigem Ausmaß (wie z.B. 0,1 ng) alleine exprimiert wurden. Die Aktivierung von NF-kB wurde jedoch durch Zugabe von Flag-TALL-1 oder Flag-APRIL (11A) oder durch Cotransfektion mit TALL-1 oder APRIL voller Länge (11B; 11C) stark gesteigert.
Die Behandlung nicht transfizierter IM-9-Zellen mit Flag-TALL-1 resultierte außerdem in der Aktivierung von NF-kB (siehe 11D). Die IM-9-Zellen (ATCC) wurden mit Flag-TALL-1 (0,3 μg/ml) oder PBS alleine oder in Kombination mit 20 μg/ml TACI-IgG oder TNFR1-IgG (wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt) inkubiert. Die NF-kB-Aktivität wurde durch Gel-Retentionsanalyse wie in Montgomery et al., Cell 87, 427–436 (1996); Marsters et al., J. Biol. Chem. 272, 14029 (1997); Chinnaiyan et al., Science 274, 990 (1996); Marsters et al., Curr. Biol. 6, 1669 (1996); Pan et al., FEBS Letters 431, 351 (1998) beschrieben gemessen.
Die Daten legen nahe, dass eine der physiologischen Auswirkungen der TALL-1/APRIL-TACI/BCMA-Wechselwirkung die Aktivierung des NF-kB-Stoffwechselwegs ist.
Beispiel 5
Hemmung der Keimzentrumsbildung und Antikörperproduktion in TACI-IgG- oder BCMA-IgG-behandelten, immunisierten Mäusen
Es wurden In-vivo-Tests durchgeführt, um zu ermitteln, ob die Blockierung der TALL-1/TACI- oder TALL-1/BCMA-Wechselwirkung die humoralen Immunreaktionen beeinträchtigt. Drei Gruppen weiblicher C57BL/6-Mäuse im Alter von 6–8 Wochen wurden intraperitoneal (i.p.) mit 100 μg Acetyl-konjugiertem, in Alaun (4-Hydroxy-3-nitrophenyl) präzipitiertem Hühner-γ-Globulin (NP₂₃-CgG) (Biosource Technologies) immunisiert. Die Tiergruppen wurden täglich für 14 Tage mit 50 μg TACI-Fc oder BCMA-Fc (hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben) in 100 μl Salzlösung mittels i.p.-Injektion behandelt (und Kontrolltiere wurden mit 100 ml Salzlösung behandelt).
Nach 14 Tagen wurden Mausseren auf NP-spezifisches IgM, IgG1 niedriger Affinität und IgG1 hoher Affinität mittels ELISA-Standardverfahren analysiert. NP-spezifisches IgG1, beide Antikörper hoher Affinität und Gesamt-(hohe plus niedrige Affinität)Antikörper wurden mittels ELISA in Näpfen quantifiziert, die mit NP₂₅- bzw. NP₂₃-konjugiertem Rinderserumalbumin beschichtet waren. Gebundene Antikörper wur den mit AP-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgM oder IgG1 (Pharmingen) nachgewiesen.
Die Ergebnisse sind in 12 dargestellt. TACI-Fc und BCMA-Fc hemmten die Produktion von NP-spezifischen Antikörpern im Vergleich zur Kontrolle wesentlich (12A), was anzeigt, dass TALL-1/TACI- und TALL-1/BCMA-Wechselwirkungen (und APRIL/TACI- und APRIL-/BCMA-Wechselwirkungen) während der frühen Phase der B-Zellen-Aktivierung wichtig sind, die zur IgM-Sekretion führt. TACI-Fc und BCMA-Fc hemmten auch NP-spezifische IgG1-Reaktionen niedriger und hoher Affinität (12B, C), was nahe legt, dass TALL-1/TACI- sowie TALL-1/BCMA-Wechselwirkungen (und APRIL/TACI- sowie APRIL/BCMA-Wechselwirkungen) auch für Ig-Klassenwechsel und Affinitätsreifung wichtig sind.
Während des frühen Abschnitts einer antigenspezifischen Antikörperreaktion, differenzieren sich B-Zellen zu Antikörper bildenden Zellen (AFC). Dies findet in extrafollikulären Bereichen der Milz statt, die aus periarteriolären Lymphscheiden (PALS) zusammengesetzt sind (Gray et al., Immunology 65, 73 (1988); NacLennan, Ann. Rev. Immunol. 12, 117 (1988)), wo anschließend der Ig-Klassenwechsel auftritt. Die PALS-assoziierten Regionen aus Milzen NP₂₃-CgG-immunisierter Mäuse wurden verglichen, die für 10 Tage mit Kontroll-Ig, TACI-Fc oder BCMA-Fc ähnlich wie oben beschrieben behandelt worden waren. Eine immunohistochemische Analyse der verschiedenen Milzschnitte wurde dann durchgeführt. Milzschnitte, die 10 Tage nach Immunisierung hergestellt und mit FITC-konjugiertem Anti-IgG1 gefärbt wurden, sind in 13-1 (Tafel A) und 13-2 (Tafel A) gezeigt. Wie erwartet zeigten Kontrollmäuse eine große Anzahl gehäufter AFC-Herde, die mit Anti-IgG1 intensiv angefärbt wurden und zahlreiche Immunoblasten-ähnliche Zellen enthielten (13-1, Tafel A, links). Im Gegensatz dazu zeigten TACI-Fc-behandelte Mäuse nur wenige vereinzelte IgG1-positive Zellen ohne Bildung von AFC-Herden (13-1, Tafel A, rechts). BCMA-Fc-behandelte Mäuse zeigten gleichermaßen nur wenige vereinzelte IgG1-positive Zellen ohne Bildung von AFC-Herden (13-2, Tafel A). Folglich sind TALL-1/TACI- und TALL-1/BCMA-(und APRIL/TACI- und APRIL/BCMA-)Wechsel wirkungen für die extrafollikuläre Differenzierung von B-Zellen wichtig, die dem Ig-Klassenwechsel in PALS-assoziierten Bereichen der Milz vorangeht.
Um die mögliche Rolle von TALL-1/TACI- und TALL-1/BCMA-Wechselwirkungen bei der Antikörperaffinitätsreifung zu untersuchen, wurde die Bildung von Keimzentren (GC) in den Milzen NP₂₃-CgG-immunisierter Mäuse am Tag 14 untersucht. Milzschnitte wurden 14 Tage nach Immunisierung hergestellt und mit FITC-konjugiertem Anti-PNA (grüne Fluoreszenz) und Texasrot-konjugiertem Anti-IgM (rote Fluoreszenz) gefärbt.
Wie erwartet zeigten Milz-Follikel aus Kontrollen eine kräftige Färbung mit Erdnuss-Agglutinin (PNA), einem Lectin, das spezifisch an GC-B-Zellen bindet (13-1, Tafel B, links). Im krassen Gegensatz waren Milz-Follikel aus TACI-Fc-behandelten Mäusen frei von GCs und zeigten nur wenige vereinzelte PNA-färbende Zellen (13-1, Tafel B, rechts). Milz-Follikel aus den BCMA-Fc-behandelten Mäusen waren ebenfalls frei von GCs und zeigten nur wenige vereinzelte PNA-färbende Zellen (13-2, Tafel B).
Trotz des Fehlens von GCs bestanden keine Abnormalitäten der Bauweise von Milz-Follikeln bei TACI-Fc- oder BCMA-Fc-behandelten Mäusen, wie durch Hämatoxilin- und Eosinfärbung von Milzschnitten am Tag 14 beurteilt wurde (13-1 – Tafel C, links (Kontrollen) und Tafel C, rechts (TACI-Fc-behandelt); und 13-1 – Tafel C (BCMA-Fc-behandelt)). Dies legt nahe, dass sich in TACI-Fc- oder BCMA-Fc-behandelten Mäusen manche Follikel-B-Zellen möglicherweise zu AFCs differenzieren, jedoch nicht fortschreiten konnten, um GCs zu bilden. Daher scheinen TALL-1/TACI- und TALL-1/BCMA-Wechselwirkungen (sowie APRI/TACI- und APRIL/BCMA-Wechselwirkungen für die richtige GC-Bildung entscheidend zu sein.
Die Blockierung von TALL-1/TACI- und TALL-1/BCMA-Wechselwirkungen (oder APRIL/TACI- und APRIL/BCMA-Wechselwirkungen) in Mäusen während der Primärimmunisierung hemmte mehrere Aspekte der B-Zellen-Reaktion: (a) die frühe Phase der extrafollikulären B-Zellen-Aktivierung, die zur antigenspezifischen IgM-Produktion führt; (b) die Differenzierung von B-Zellen, die zum Ig-Klassenwechsel führt; (c) die Bildung von Milz-GCs, wo die Affinitätsreifung auftritt und Gedächtnis-B-Zellen erzeugt werden. Während die GC-Bildung von TACI-Fc oder BCMA-Fc vollständig blockiert wurde, trat eine gewisse Restproduktion von IgM und IgG1 und Affinitätsreifung auf. Dass abgeschwächte Antikörperreaktionen trotz der Abwesenheit von GCs stattfinden können, ist in anderen Systemen beobachtet worden (siehe z.B. Matsumoto et al., Nature 382, 462 (1996); Kato et al., J. Immunol. 160, 4788 (1998); Futtere et al., Immunity 9, 59 (1998)). Es ist möglich, dass andere Faktoren neben TALL-1 oder APRIL und TACI oder BCMA die verbleibende Antikörperproduktion vermitteln. Alternativ dazu könnte die gewählte TACI-Fc- oder BCMA-Fc-Behandlung in vivo nicht ausreichend gewesen sein, um alle TALL-1/TACI-, TALL-1/BCMA, APRIL/TACI- oder APRIL/BCMA-Bindungsereignisse zu verhindern.
Frühere Untersuchungen weisen darauf hin, dass CD40L-CD40- (Foy et al., Ann. Rev. Immunol. 14, 591 (1996)) und CD86-CD28/CTLA-4- (Han et al., J. Immunol. 155, 556 (1995); Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol. 14, 233 (1996)) Wechselwirkungen für den Eintritt extrafollikulärer B-Zellen in GC-Bereiche und für die GC-Etablierung wichtig sind. Die Hemmung dieser Wechselwirkungen über Gen-Knockouts oder durch Behandlung mit blockierenden Antikörpern oder Rezeptor-Fc-Fusionen vermindert die Antikörperproduktion und blockiert die GC-Bildung (Lane et al., J. Exp. Med. 179, 819 (1994); Durie et al., Immunol. Today 15, 406 (1994); Hathcock et al., Science 262, 905 (1993); Linsey et al., Science 257, 7992 (1992); Renshaw et al., J. Exp. Med. 180, 1889 (1994); Xu et al., Immunity 1, 423 (1994); Kawabe et al., Immunity 1, 167 (1994); Foy et al., J. Exp. Med. 180, 157 (1994)). Es bestehen einige auffallende Ähnlichkeiten zwischen den TALL-1/TACI-, TALL-1/BCMA und CD40L-CD40-Systemen: beide Liganden sind mit TNF verwandt und werden auf aktivierten T-Zellen exprimiert und beide Rezeptoren sind TNFR-Homologe, die NF-KB stimulieren und auf B-Zellen exprimiert werden. Daher könnte die Wechselwirkung von TALL-1 oder APRIL mit TACI oder BCMA die Hilfe von T-Zellen an B-Zellen ähnlich wie CD40L und CD40 vermitteln. TALL-1 könnte außerdem zur Aktivierung von B-Zellen durch dendritische Zellen beitragen, die in der Tat den TALL-1-Liganden exprimieren. Im Unterschied zu CD40L- und CD40-Knockout-Mäusen, die beeinträchtigte IgG-, nicht jedoch IgM-Reaktionen zeigen, und im Unterschied zu CD40L-defekten Patienten mit Hyper-IgM-Syndrom (Callard et al., Immunol. Today 14, 559 (1993); Allen et al., Science 259, 990 (1993); Aruffo et al., Cell 72, 291 (1993)) zeigten TACI-Fc-behandelte oder BCMA-Fc-behandelte Mäuse einen ausgeprägten Mangel am IgM- sowie IgG-Produktion. Daher ist es möglich, dass TALL-1 oder APRIL und TACI oder BCMA früh bei der B-Zellen-Aktivierung tätig sind, sodass ihre Blockade alle Phasen der Humoralantwort beeinträchtigt. Im Gegensatz dazu sind CD40L und CD40 bei der B-Zellen-Aktivierung möglicherweise später tätig, sodass ihre Blockade nur späte Phasen der Antikörperreaktion beeinträchtigt.
Beispiel 6
Herstellung von monoklonalen Anti-APRIL-Antikörpern
Balb/c-Mäuse (erhalten von Charles River Laboratories) wurden durch Injizieren von 1 μg Flag-APRIL (verdünnt in MPL-TDM-Adjuvans, bezogen von Ribi Immunochemical Research Inc., Hamilton, MT) 10-mal in beide Hinterfußballen immunisiert. Die Immunisierung bestand aus einer Reihe von 6 Injektionen (eine Injektion/Woche für 6 Wochen). Die Tiere wurden dann für zwei Monate ruhen gelassen und anschließende Immunisierungsinjektionen wurden einmal pro Woche für 4 Wochen verabreicht. Das Flag-markierte APRIL-Fusionsprotein wurde wie im obigen Beispiel 2 hergestellt und mittels Anti-Flag-M2-Agarose-Affinitätschromatographie (Sigma) gereinigt.
Drei Tage nach dem letzten Boost wurden die Kniekehlen-Lymphknoten aus den Mäusen entfernt und eine Einzelzellensuspension in DMEM-Medium (erhalten von Biowhitakker Corp.) hergestellt, das mit 1% Penicillin-Streptomycin ergänzt war. Die Lymphknotenzellen wurden dann mit den murinen Myelomzellen P3X63AgU.1 (ATCC CRL 1597) unter Verwendung von 35% Polyethylenglykol fusioniert und in 96-Napf-Kulturplatten kultiviert. Aus der Fusion resultierende Hybridome wurden in HAT-Medium selektiert. Zehn Tage nach der Fusion wurden Hybridomkulturüberstände in einem ELISA gescreent, um auf die Gegenwart monoklonaler Antikörper zu testen, die an das Flag-APRIL-Protein binden. Als Negativkontrolle zum Verwer fen von monoklonalen Antikörpern, die an den Flag-Abschnitt des Moleküls binden, wurden die monoklonalen Antikörper auch auf jegliche Bindung an Flag-markiertes Apo-3 gescreent.
Im ELISA wurden 96-Napf-Mikrotiterplatten (Maxisorb; Nunc, Kamstrup, Dänemark) durch Zugeben von 50 μl 0,25 μg/ml Flag-APRIL oder Flag-Apo-3 in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, zu jedem Napf und Inkubieren bei 4°C über Nacht beschichtet. Die Platten wurden dann drei Mal mit Waschpuffer (0,05% Tween 20 enthaltendes PBS) gewaschen. Die Näpfe in den Mikrotiterplatten wurden dann mit 200 μl 2,0% Rinderserumalbumin in PBS geblockt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Die Platten wurden dann wiederum drei Mal mit Waschpuffer gewaschen.
Im Anschluss an die Waschschritte wurden 100 μl Hybridomüberstände oder verschiedene Konzentrationen polyklonaler Seren den vorgesehenen Näpfen zugegeben, 100 μl P3X63AgU.1-Myelomzellen-konditioniertes Medium wurden anderen vorgesehenen Näpfen als Kontrollen zugegeben. Die Platten wurden bei Raumtemperatur für 1 Stunde auf einem Schüttelgerät inkubiert und dann drei Mal mit Waschpuffer gewaschen.
Als nächstes wurden 50 μl HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG-Fc (erworben von Cappel Laboratories), 1:1.000 in Testpuffer (0,5% Rinderserumalbumin, 0,05% Tween-20, 0,01% Thimersol in PBS) verdünnt, jedem Napf zugegeben und die Platten für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Schüttelgerät inkubiert. Die Platten wurden drei Mal mit Waschpuffer gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 50 μl Substrat (TMB Mikrowell Peroxidase Substrate, Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) zu jedem Napf und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl TMB-Einkomponentenstoplösung (Diethylglykol, Kirkegaard & Perry) zu jedem Napf gestoppt und die Absorption bei 490 nm in einem automatischen Plattenlesegerät gemessen.
Die im ELISA positiv testenden Überstände wurden dann zweimal mittels Grenzverdünnung kloniert.
Wie in 14A gezeigt ist, banden die Antikörper 3C6.4.2, 5E8.7.4, 5E11.1.2 und 5G8.2.2 an Flag-APRIL.
Beispiel 7
Isotypisierung von Anti-APRIL-Antikörpern
Die Isotypen der monoklonalen Anti-APRIL-Antikörper (siehe Beispiel 6) wurden ermittelt, indem Platten mit Isotyp-spezifischem Ziegen-Anti-Maus-Ig (Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) bei 4°C über Nacht beschichtet wurden. Nachdem unspezifische Bindungsstellen mit 2% BSA blockiert worden waren, wurden 100 μl Hybridomkulturüberstände oder 0,5 μg/ml gereinigte mAbs zugegeben. Nach Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Platten mit HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-Ig für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Ausmaß von an die Platten gebundenem HRP wurde unter Verwendung von HRP-Substrat wie oben beschrieben detektiert.
Wie in der Tabelle in 14B gezeigt ist, erwiesen sich die Anti-APRIL-Antikörper 5E8.7.4, 5G8.2.2 und 3C6.4.2 als Antikörper vom Isotyp IgG2a. Anti-APRIL-Antikörper 5E11.1.2 erwies sich als Antikörper vom Isotyp IgG1.
Beispiel 8
Bindungstest, der die Blockierungsaktivität von Anti-APRIL-mAbs zeigt
Mikrotiterplatten (Nunc, Dänemark) wurden mit 50 μl/Napf Ziegen-Anti-Human-Fc-Antikörper (Böhringer Mannheim) mit 5 μg/ml in Carbonatpuffer über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden dann mit 150 μl/Napf 2% BSA in PBS-Puffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Die jeweiligen Immunadhäsine BCMA-IgG oder TACI-IgG (hergestellt wie im obigen Beispiel 2 beschrieben) wurden in einem Volumen von 50 μl/Napf mit 5 μg/ml in Blockpuffer zugegeben und bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Alle Antikörper (die bei der in Beispiel 6 beschriebenen Fusion identifiziert wurden) wurden 1:100 verdünnt und es wurden 25 μl/Napf zur Platte zusammen mit 25 μl/Napf 2 μg/ml Flag-APRIL (siehe Beispiel 2) zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das Signal wurde mit aufeinander folgenden Inkubationen mit biotinyliertem Anti-Flag-Antikörper (Sigma Aldrich, Missouri) und Streptavidin-Meerrettichperoxidase (Amersham Life Science, New Jersey) entwickelt. Allen Schritten außer dem ersten Schritt ging ein Waschschritt mit PBS/0,01% Tween 20 voraus.
Wie in obiger Tabelle gezeigt ist, blockierte der Anti-APRIL-Antikörper 3C6.4.2 wirksam die Bindung von APRIL an BCMA und an TACI. Im Test zeigte der Antikörper 5E11.1.2 auch eine partielle Blockierung der Bindung von APRIL an BCMA und an TACI.
Beispiel 9
Kompetitiver Bindungs-ELISA
Um zu ermitteln, ob die Anti-APRIL-Antikörper 3C6.4.2, 5E8.7.4, 5E11.1.2 und 5G8.2.2 (in den obigen Beispielen beschrieben) dasselbe oder unterschiedliche Epitope erkannten, wurde ein kompetitiver Bindungs-ELISA wie in J. Immunol. Methods 156, 9–17 (1992) beschrieben unter Verwendung biotinylierter Anti-APRIL-Antikörper durchgeführt. Die monoklonalen Anti-APRIL-Antikörper wurden unter Verwendung von N-Hydroxylsuccinimid wie in J. Immunol. Methods 156, 9–17 (1992) beschrieben biotinyliert. Mikrotiternäpfe wurden mit 50 μl 0,5 μg/ml Flag-APRIL (Beispiel 2) in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, über Nacht bei 4°C beschichtet. Nach dem Waschen wurden die unspezifischen Bindungsstellen mit 200 μl 2% BSA für 1 Stunde blockiert. Nach dem Waschen wurde ein Gemisch aus einer vorherbestimmten optima len Konzentration biotinylierter Anti-APRIL-Antikörper und einem 100fachen Überschuss unmarkierter monoklonaler Antikörper jedem Napf zugegeben. Im Anschluss an eine Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde wurden die Platten gewaschen und die Menge an biotinyliertem Anti-APRIL-Antikörper durch Zugabe von HRP-Streptavidin detektiert. Nach dem Waschen der Mikrotiternäpfe wurde das gebundene Enzym durch Zugabe von Substrat detektiert und die Platten wurden bei 450 nm mit einem ELISA-Plattenlesegerät gemessen.
Die Ergebnisse sind in 15 dargestellt. Die Daten zeigen, dass Antikörper 3C6.4.2 und Antikörper 5E11.1.2 möglicherweise gemeinsame Epitope erkennen, das die unmarkierten Antikörper 3C6.4.2 oder 5E11.1.2 fähig waren, die Bindung beider biotinylierter Formen der Antikörper (Bio-3C6.4.2, Bio-5E11.1.2) zu hemmen. Beide Antikörper 3C6.4.2 und 5E11.1.2 erkennen Epitope, die sich von denen unterscheiden, die von 5E8.7.4 und 5G8.2.2 erkannt werden, da keiner der Antikörper die Bindung von Bio-5E8.7.4 und Bio-5G8.2.2 blockierte. Darüber hinaus waren die Antikörper 5E8.7.4 und 5G8.2.2 fähig, nur ihre eigenen biotinylierten monoklonalen Antikörper, nicht jedoch die anderen zu blockieren. Demgemäß scheint es so zu sein, dass unter den vier getesteten monoklonalen Antikörpern drei Haupt-Epitope auf APRIL detektiert wurden.
Beispiel 10
Wirkungen von TACI-Immunadhäsin im murinen Arthritismodell
Ein In-vivo-Test in einem murinen, Kollagen-induzierten Arthritis-(CIA-)Modell wurde durchgeführt, um zu ermitteln, ob die Hemmung der TACI-Wechselwirkung mit seinem/n Liganden das Fortschreiten der CIA verhindern könnte.
Rheumatische Arthritis (RA) ist eine Autoimmunerkrankung, bei der sich die Synovialmembran mehrerer Gelenke entzünden kann, was zur Zerstörung von Geweben der Gelenke, einschließlich Knochen und Knorpel führen kann. Die Synovialmembran der RA kann höchst entzündlich sein und ist typischerweise durch Infiltration von Lymphozyten und einkernigen Zellen, Aktivierung von T-Zellen und Antigen prä sentierenden Zellen, B-Zellen-Immunglobulin-(Ig-)Sekretion und entzündungsfördernde Cytokinproduktion gekennzeichnet (Potocnik et al., Scand. J. Immunol. 31, 213 (1990); Wernick et al., Arthritis Rheum. 28, 742 (1985); Ridley et al., Br. J. Rheumatology 29, 84 (1990); Thomas et al., J. Immunol. 152, 2613 (1994); Thomas et al., J. Immunol. 156, 3074 (19960. Die chronisch entzündete Synovialmembran ist üblicherweise von einer massiven CD4-T-Zellen-Infiltration begleitet (Pitzalis et al., Eur. J. Immunol. 18, 1397 (1988); Morimoto et al., Am. J. Med. 84, 817 (1988)).
Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) ist ein Tiermodell für menschliche RA, das der menschlichen Krankheit ähnelt und kann bei empfänglichen Stämmen von Mäusen durch Immunisierung mit heterologem Kollagen des Typs II (CII) induziert werden (Courtenay et al., Nature 283, 665 (1980); Cathcart et al., Lab. Invest. 54, 26 (1986)). CD4-T-Zellen sowie Antikörper gegen CII sind erforderlich, um CIA zu entwickeln. Die Übertragung von Anti-CII auf naive Tiere führt zu einer nur partiellen Histopathologie, die sich von CIA ziemlich unterscheidet, und es entwickelt sich keine vollständige CIA-Symptomatik (Holmdahl et al., Agents Action 19, 295 (1986)). Im Gegensatz dazu stellt die adoptive Übertragung von CD4-T-Zellen sowie Anti-CII-Antikörpern von CII-immunisierten Mäusen auf naive Empfänger die Symptome der klassischen CIA vollständig wieder her (Seki et al., J. Immunol. 148, 3093 (1992)). Die Beteiligung von T-Zellen und Antikörpern an der CIA steht auch im Einklang mit histopathologischen Befunden entzündeter Gelenke bei der CIA. Daher könnten Mittel, die die B-Zellen- oder T-Zellen-Funktionen blockieren oder von T-Zellen induzierte, entzündungsfördernde Cytokine hemmen, wirksam sein, um Arthritis zu verhindern oder zu behandeln. In der Tat kann die Verarmung an CD4-T-Zellen, die Blockade von CD40-CD40L-Wechselwirkungen, Neutralisierung von TNF-α oder Blockierung von IL-1-Rezeptoren alle zur Verhinderung von CIA bei Mäusen führen (Maini et al., Immunol. Rev. 144, 195 (1995); Joosten et al., Arthritis Rheum. 39, 797 (1996); Durie et al., Science 261, 1328 (1993)).
Bei der Studie der Anmelder wurden zwei Gruppen von Mäusen (7 bis 8 Wochen alte männliche DBA/1-Mäuse (Jackson Laboratory)) intradermal mit 100 μg Rinder- Kollagen vom Typ II (BCII) (Sigma Chemical Co.) immunisiert, das in Freund'schem kompletten Adjuvans (CFA) (Difco) emulgiert war. Die Mäuse wurden dann nochmals mit BCII in inkomplettem Freund'schem Adjuvans 21 Tage später exponiert. Bei den Tieren entwickelte sich eine drastische Krankheit mit klinischen Anzeichen von Arthritis, die sich mit der Zeit zu schwereren Formen entwickelte. Beginnend mit Tag 24 wurde einer Gruppe von Mäusen 100 μg TACI-Fc drei Mal pro Woche intraperitoneal für sechs Wochen (N = 9) injiziert und eine zweite Gruppe erhielt 100 μg murines IgG als Kontrolle (n = 10). Das TACI-Fc-Konstrukt wurde unter Verwendung von Primern hergestellt, die auf der menschlichen TACI-Sequenz (hierin beschrieben) basierten, um die Maus-TACI-cDNA aus einer Mausmilzbibliothek zu amplifizieren. Ein PCR-Produkt von etwa 0,45 kb wurde kloniert. Ein cDNA-Klon, der das vollständige offene Leseraster von Maus-TACI enthielt, wurde anschließend aus derselben Bibliothek isoliert (GenBank-Zugriffsnummer AF257673). Das murine TACI-Fc wurde durch Klonieren der extrazellulären Domäne von Maus-TACI (Aminosäuren 2–129) zwischen einer Pro-Trypsinsignalsequenz und Maus-IgG1-Fc-Sequenz konstruiert und das Immunadhäsin wie in den obigen Beispielen beschrieben hergestellt. Die Tiere wurden dann auf klinische Anzeichen von Arthritis beobachtet und an Ende der Studie wurde wie unten beschrieben eine radiologische und histopathologische Untersuchung durchgeführt.
Die Mäuse wurden täglich auf Anzeichen von Gelenksentzündung untersucht und wie folgt bewertet: 0, normal; 1, Erythem und leichte, auf das Sprunggelenk begrenzte Schwellung; 2, Erythem und leichte Schwellung, sich vom Knöchel zu den Mittelfuß/Mittelhandgelenken erstreckend; 3, Erythem und mäßige Schwellung, sich vom Knöchel zu den Metatarsophalangeal/Metakarpophalangealgelenken erstreckend; 4, Erythem und schwere Schwellung, sich vom Knöchel zu den Zehen erstreckend. Die maximale Arthritis-Punktezahl pro Fuß ist 4 und die maximale Krankheits-Punktezahl pro Maus ist 16; die mittlere Arthritis-Punktezahl wurde aus allen Tieren in dieser Gruppe berechnet.
Für die radiologische Analyse am Ende der Studie wurden von Vorder- sowie Hinterpfoten mittels „X-ray Faxitron Imaging System" (Faxitron X-ray Corp., Wheeling, IL) Röntgenaufnahmen angefertigt. Die Daten wurden digitalisiert und es wurden Bilder der Radiogramme angefertigt. Die Radiogramme wurden dann auf Knochenerosion und Weichgewebeschwellung untersucht. Für die histopathologische Analyse wurden Pfoten von Mäusen herausgeschnitten, in 10% Formalin fixiert, Entkalkt und in Paraffin eingebettet. Gelenksschnitte (6–8 μm) wurden hergestellt und mit Hämatoxilin und Eosin unter Anwendung von histochemischen Standardverfahren gefärbt. Die mikroskopische Beurteilung anhritischer Pfoten wurde mit Blindvergleich durchgeführt. Arthritische Veränderungen im Knöchel, Metatarsophalangeal-/Metakarpophalangeal-, proximalen Interphalangealgelenken wurden auf Gelenkknorpelerosion und subchondrale Knochenerosion untersucht.
16A illustriert die Krankheitsverläufe bei TACI-Fc-behandelten Mäusen (Kreise) oder Kontroll-IgG-Mäusen (Quadrate) und mit Salzlösung behandelten Mäusen (Dreiecke). Jeder Datenpunkt stellt einen Mittelwert +/– SD von insgesamt 9 (für die TACI-Fc-behandelte Gruppe) oder 10 (für Kontrollgruppen) Mäusen dar. Der Unterschied zwischen der TACI-Fc-behandelten Gruppe und jeder der beiden anderen Gruppen ist statistisch signifikant. Mäuse in der Kontrollgruppe entwickelten typische klinische Symptome von Arthritis, die etwa am Tag 30 begannen und schnell zu sehr hohen Arthritis-Punktezahlen fortschritten (16A). Im Gegensatz dazu war bei den mit TACI-Fc behandelten Mäusen das Forschreiten der Arthritis deutlich gehemmt. 16B zeigt die Krankheits-Punktezahlen für einzelne Füße 3 Wochen nach der zweiten Immunisierung. Jeder Datenpunkt stellt einen einzelnen Fuß dar. Die Unterschiede zwischen den Kontroll- und TACI-Fc-behandelten Gruppen sind statistisch signifikant. Die Arthritis-Punktezahlen bei den TACI-Fc-behandelten Mäusen erreichten nur bis zu 1,0 und dies geschah erst gegen Ende der Studie, wogegen bei der Kontrollgruppe die Arthritis-Punktezahlen bis zu > 7,0 erreichten. Diese Daten beweisen eindeutig, dass die TACI-Wechselwirkung mit seinem/n Liganden für die Entwicklung von CIA wichtig ist.
Um zu ermitteln, ob die TACI-Fc-Behandlung von Mäusen irgendwelche Wirkungen auf die Histopathologie von Gelenken hatte, wurde am Ende der Studie eine histopathologische Untersuchung der Mäusepfoten durchgeführt. Bei Beendigung der Studie (48 Tage nach der zweiten Immunisierung) wurden die Mäuse getötet und ihre Sprunggelenke histologisch analysiert (HE-Färbung).
Bei der Kontrollgruppe war eine schwere Arthritiserkrankung durch Synovialmembranproliferation, massive Leukozyteninfiltration, Pannus-Bildung gekennzeichnet, die in Gelenkknorpel- und Knochenerosion resultierte, die sich im proximalen Interphalangealgelenk zeigte (17A). 17A zeigt ein Zehenglied einer Kontrollmaus, die auf schwere Synovitis, Hyperplasie und Knorpel- und Knochenzerstörung hinweist. Verdickung der Synovialmembran, Leukozyteninfiltration, Gelenksknorpel-Degeneration und periartikuläre Erosion wurden außerdem im Mittelhandgelenk beobachtet (17B). 17B zeigt ein Zehengelenk einer TACI-Fc-behandelten Maus ohne Anzeichen von Synovitis oder krankhafter Pathologie. Bei den TACI-Fc-behandelten Mäusen bestanden keine Anzeichen histopathologischer Symptome, was anzeigt, dass TACI-Fc nicht nur klinische CIA-Symptome blockiert, sondern auch histopathologische Symptome hemmt (17C, D). 17C zeigt eine Mittelhand einer Kontrollmaus, die eine krankhafte Pathologie mit massiven Anzeichen von Synovitis aufweist, und 17D zeigt ein Mittelhandgelenk einer TACI-Fc-behandelten Maus ohne krankhafte Pathologie.
Bei Beendigung der Studie wurden von Vorder- sowie Hinterpfoten der Tiere außerdem Röntgenaufnahmen angefertigt und wie oben auf Knochenstrukturen untersucht. Bei der Kontrollgruppe waren Anzeichen massiver Knochenzerstörung und Entstellung offensichtlich, wogegen bei den TACI-Fc-behandelten Mäusen keine signifikanten Anzeichen von Knochenverlust oder Entstellung beobachtet wurden (17E, F). 17E zeigt ein Radiogramm einer Kontrollmaus, das Anzeichen massiver Knochenzerstörung und Entstellung zeigt. 17F zeigt ein Radiogramm einer TACI-Fc-behandelten Maus, das keine signifikanten Anzeichen von Knochenverlust oder Entstellung zeigt. Wenn Radiogramme der TACI-Fc-behandelten Mäuse mit jenen naiver Mäuse verglichen wurden, offenbarten sich keine offensichtlichen Unterschiede, was anzeigt, dass die TACI-Fc-Behandlung die Mäuse vollständig vor Knochen- und Knorpelschädigung schützte (Daten nicht dargestellt).
Da von Anti-Kollagen-Antikörpern angenommen wird, dass sie eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Arthritis spielen, wurden Serumproben der Mäuse ebenfalls analysiert, um zu ermitteln, ob die TACI-Fc-Behandlung der Mäuse in der Hemmung einer humoralen Anti-Kollagen-Immunantwort resultierte. Um humorale Immunantworten zu testen, wurde den Mäusen 14 Tage (18A) und 47 Tage (18B) nach der zweiten Immunisierung retroorbital Blut entnommen und auf die Gegenwart von Anti-Kollagen-Antikörpern analysiert.
Serumspiegel von Anti-BCII-IgG1- und IgG2a-Isotypen wurden mit einem ELISA unter Verwendung von BCII-Kollagen als Antigen gemessen. Zusammenfassend wurden Mikrotiterplatten mit 10 μg/ml nativem Rinder-CII beschichtet, blockiert und mit reihenverdünnten Testseren inkubiert. Gebundenes IgG wurde durch Inkubation mit Alkalische-Phosphatase-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG (Pharmingen), gefolgt von Substrat (Dinitrophenylphosphat) nachgewiesen. Optische Dichten wurden bei 450 nm in einem ELISA-Plattenlesegerät (Molecular Devices) gemessen.
Die Ergebnisse sind in 18 gezeigt. Jeder Datenpunkt stellt einen Mittelwert +/– SD von fünf Mäusen in jeder Gruppe dar. Serum aus Mäusen in der Kontrollgruppe zeigte die Gegenwart hoher Spiegel an Anti-Kollagen-IgG1 und IgG2a, wogegen bei der TACI-Fc-behandelten Gruppe eine beträchtliche Hemmung von Anti-Kollagen-IgG1 sowie IgG2a an den Tagen 14 und 47 nach der zweiten Immunisierung beobachtet wurde (18A, B). 18A zeigt Antikollagen-IgG1- und IgG2a-Spiegel 14 Tage nach der zweiten Immunisierung und 18B zeigt Antikollagen-IgG1- und IgG2a-Spiegel 47 Tage nach der zweiten, Immunisierung (weiße Balken, mit BSA behandelte Mäuse; schwarze Balken, mit TACI-Fc behandelte Mäuse). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die TACI-Fc-Behandlung die Entwicklung von CIA zumindest teilweise durch Blockieren von Anti-Kollagen-Antikörpern abschwächt.
Da sowohl Kollagen-spezifische B-, als auch T-Zellen CIA auslösen können, wurde außerdem ein Test durchgeführt, um zu untersuchen, ob die Prävention von TACI-Fc-vermittelter CIA auch mit der Hemmung von T-Zellen-Effektorfunktionen verbunden ist. Lymphknoten aus Milzen von Kontroll- sowie TACI-Fc-behandelten Mäusen wurden am Ende der Studie gesammelt, und es wurden In-vitro-Wiederaufruf-Reaktionen von T-Zellen gegen Kollagen und Produktion von Effektor-Cytokinen untersucht. BCII-immunisierte Mäuse wurden 47 Tage nach der zweiten Immunisierung getötet und ihre Inguinallymphknoten und Milz entnommen. Es wurden Einzelzellsuspensionen hergestellt und die Zellen in 96-Napf-Platten bei der Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml (200 μl/Napf) in DMEM kultiviert, das 5% hitzeinaktiviertes FCS, 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 × 10^–5 M 2-ME enthielt. Die Zellen wurden in Medium alleine oder in Gegenwart verschiedener Konzentrationen BCII kultiviert. Um die Lymphozytenproliferation zu testen (18C) wurden Lymphknotenzellen (1 × 10⁶ Zellen pro Napf) zuerst für 72 Stunden kultiviert, gefolgt von Zugabe von 1 μCi [³H]Thymidin (International Chemical and Nuclear, Irvine, CA) für die letzten 18 Stunden einer 5-Tage-Kultur, und die Inkorporation von Radioaktivität wurde mittels Flüssigszintillationszählung (als cpm dargestellt) unter Verwendung eines Wallac-β-Plattenzählers gemessen.
Proliferative T-Zellen-Reaktionen gegen Kollagen aus TACI-Fc-behandelten Mäusen waren nahezu vernachlässigbar im Vergleich zu jenen von Kontrollmäusen (18C; Kontrollmäuse – Quadrate; TACI-Fc-behandelte Mäuse – Kreise).
Für Cytokin-Tests wurden die Lymphknoten- und Milzzellen in 0,2 ml Medium mit oder ohne BCII kultiviert; 1 × 10⁶ Zellen/ml (200 μl/Napf) wurden im oben erwähnten Medium alleine oder in Gegenwart von BCII kultiviert. Überstände wurden nach 24 Stunden gesammelt, um auf IL-2-Sekretion zu testen, sowie 72 Stunden später, um auf IFN-γ-Produktion zu testen, was sich als optimale Inkubationszeit zur Cytokin-Bestimmung erwies. Die Überstände wurden bei –20°C bis zur Analyse gelagert. Die Menge an IL-2 und IFN-γ wurden mittels ELISA unter Verwendung eines Sets von Pharmingen (San Diego, California) detektiert. Standardkurven wurden unter Verwendung von rekombinantem IL-2 und IFN-γ aus der Maus erzeugt. Wenn die IL-2- und IFN-γ-Produktion durch T-Zellen aus diesen Mäusen gemessen wurde, zeigte die TACI-Fc-behandelte Gruppe (in 18D und 18E durch Kreise dargestellt) eine sehr geringe Produktion dieser Cytokine, wogegen T-Zellen aus der Kontrollgruppe (in 18D und 18D als Quadrate dargestellt) signifikante Ausmaße von IL-2 sowie IFN-γ sekretierten (18D (IL-2-Produktion), 18E (IFN-γ-Produktion)).
Diese Daten legen nahe, dass TACI-Fc-Behandlung von Mäusen nicht nur die Anti-Kollagen-Antikörperproduktion hemmte, sondern auch Funktionen von Effektor-T-Zellen regulierte. Daher wird angenommen, dass TACI-Wechselwirkungen mit seinem/-n Liganden auch bei T-Zellen-vermittelten Immunreaktionen von Bedeutung sind.
Da vom TACI-Rezeptor außerdem gezeigt wurde, dass er auf T-Zellen exprimiert wird und an der Aktivierung von NF-AT beteiligt ist, die mit der Aktivierung von T-Zellen verbunden ist (von Bulow et al., Science 278, 138 (1997)), wird angenommen, dass die Blockierung von TACI-Wechselwirkungen mit seinem/n Liganden direkt die Aktivierung von T-Zellen und ihren Effektorfunktionen beeinträchtigen könnte, die beispielsweise für das Fortschreiten von CIA in Mäusen erforderlich sind.
Um die direkte Rolle von TACI bei der T-Zellen-Aktivierung zu ermitteln, wurde ein In-vitro-Test der antigenspezifischen Aktivierung von T-Zellen durchgeführt. Die Aktivierung von T-Zellen durch Anti-CD3-Antikörper in vitro durch die Gegenwart von TACI-Fc wurde durch Messen der Proliferation und IL-2-Produktion durch diese T-Zellen untersucht. Milzzellen aus adulten C57BL/6-Mäusen (Jackson Laboratory) wurden in verschiedenen Konzentrationen des monoklonalen Anti-CD3-Antikörpers (10 μg/ml) (Pharmingen) mit oder ohne verschiedenen Konzentrationen an TACI-Fc in Medium wie oben beschrieben kultiviert (1 × 10⁶ Zellen/Napf). Proliferation wurde durch Aufnahme von ³H-Thymidin wie oben angegeben gemessen. Paralleltests wurden ebenfalls angesetzt, um die Wirkungen von TACI-Fc auf die Produktion von Anti-CD3-Antikörper-induzierter IL-2-Produktion in einem 24-Stunden-Kultursystem wie oben erwähnt zu messen. Ein ELISA wurde verwendet, um IL-2-Ausmaße in Überständen zu bestimmen, und zwar unter Verwendung von Antikörpern von Pharmingen und Verwendung ihrer empfohlenen Protokolle. Um die Wirkungen von TACI-Fc auf die In-vitro-Stimulierung von transgenen TCR-Zellen zu untersuchen, wurden 1 × 10⁶ Zellen aus adulten transgenen MBP-TCR-Mäusen (gezüchtet aus einem Tierbrutpaar, das von Dr. Richard Flavell, Howard Hughes Medical Institute, Yale University erhalten wurde) in Gegenwart von 10 μg/ml MBP-Ac1-11 (einem synthetischen NH2-terminalen Peptid aus „Myelic Basic Protein" mit der Aminosäuresequenz ASQKRPSQRSK (Seq.-ID Nr. 10), bei dem die erste Aminosäure acetyliert war) mit oder ohne verschiedene(n) Konzentrationen von TACI-Fc in 96-Napf-Platten in DMEM-Medium kultiviert, das mit 5% FCS, 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin ergänzt war. Proliferation wurde durch Zugabe von 1 μCi [³H]Thymidin (International Chemical and Nuclear, Irvine, CA) für die letzten 18 Stunden einer 5-Tage-Kultur gemessen und die Inkorporation von Radioaktivität wurde mittels Flüssigszintillationszählung getestet.
19A zeigt die Hemmung von Anti-CD3-Antikörper-induzierter Proliferation naiver T-Zellen durch TACI-Fc in einer dosisabhängigen Weise, während 19B die Hemmung von Anti-CD3-Antikörper-induzierter IL-2-Produktion durch native T-Zellen zeigt, wie sie durch TACI-Fc auf dosisabhängige Weise beeinflusst wird. (In 19A und 19B ist die TACI-Fc-Behandlung durch Kreise dargestellt; Kontrollen sind durch Quadrate dargestellt).
Die Aktivierung von transgenen Myelin-Basic-Protein-(MBP)-TCR-T-Zellen durch Antigen in vitro in Gegenwart von TACI-Fc wurde ebenfalls untersucht, indem die Proliferation und IL-2-Produktion durch diese T-Zellen (wie oben beschrieben) gemessen wurde. Wiederum hemmte TACI-Fc die Proliferation sowie IL-2-Produktion durch transgene MBP-TCR-T-Zellen auf dosisabhängige Weise (Daten nicht dargestellt). Diese Ergebnisse beweisen, dass der TACI-Rezeptor an der T-Zellen-Aktivierung beteiligt ist und dass diese Funktion mit TACI-Fc blockiert werden kann.
Beispiel 11
Wirkungen von TACI-Immunadhäsin im murinen EAE-Modell
Das murine EAE-Modell ist in der Literatur als Modell für menschliche multiple Sklerose beschrieben worden (Grewal et al., Science 273, 1864–1867 (1996)).
In der Studie der Anmelder wurden zwei Gruppen von jeweils 10 Mäusen (10 bis 15 Wochen alte männliche und weibliche transgene MBP-TCR-Mäuse (beschrieben in Beispiel 10) mit 10 μg MBP Ac1-11 (beschrieben im obigen Beispiel 10) in 100 μl Freund'schem Adjuvans (CFA) (Difco) subkutan immunisiert. Nach der anfänglichen Immunisierung mit Ac1-11 wurden 200 ng Pertussis-Toxin (List Biologicals, Campbell, CA) in 100 μl Salzlösung in jede Maus zu den Zeitpunkten 24 Stunden und 48 Stunden intraperitoneal injiziert. Beginnend am Tag 2 bis zum Tag 24 wurde einer Gruppe von Mäusen 100 μg TACI-Fc (beschrieben in Beispiel 10) in 100 μl steriler Salzlösung täglich intraperitoneal injiziert, und eine zweite Gruppe erhielt an jedem Tag intraperitoneal 100 μg murines IgG in 100 μl steriler Salzlösung. Die Tiere wurden dann täglich auf den Krankheitsbeginn hin überwacht. Klinische Anzeichen experimenteller allergischer Enzephalomyelitis (EAE) wurden täglich bewertet, und es wurde jeder Maus eine Punktezahl von 1 bis 5 auf Basis des etablierten EAE-Indexsystems vergeben: 0 = normale Erscheinung; 1 = Schwanzerschlaffung; 2 = abnormale Gangart; 3 = Schwäche der Extremitäten; 4 = eine Extremität umfassende Paralyse (partielle Hinterextremitätenparalyse); 5 = zwei Extremitäten umfassende Paralyse (völlige Hinterextremitätenparalyse). Dies ist ein gegenüber dem früher in Grewal et al., 273, 1864–1867 (1996) beschriebenen modifiziertes Bewertungssystem.
Die Ergebnisse sind in 20 gezeigt. Die in 20 dargestellten Daten zeigen an, dass Tiere, die das Kontroll-IgG erhielten, erwartete klinische Symptome von EAE entwickelten; der Ausbruch der Krankheit bei der kontrollbehandelten Gruppe begann am Tag 5 und erreichte Höchstausmaße innerhalb von 10 Tagen. Im Gegensatz dazu entwickelten TACI-Ig-behandelte Mäuse keine schweren Formen der EAE-Symptome. Die Krankheitspunktezahl war viel niedriger als die der Kontrollgruppe und erreichte klinische Werte von lediglich 2 (die während der Studie nicht zu höheren Werte fortschritten). Die Ergebnisse legen daher nahe, dass die TACI-Fc-Behandlung die Mäuse vor der Entwicklung offenkundiger EAE schützte.
Materialhinterlegung
Die folgenden Materialien sind bei der American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110–2209, USA (ATCC) hinterlegt worden:
Diese Hinterlegung wurde unter den Bestimmungen des „Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder" (Budapester Vertrag) vorgenommen. Dies garantiert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung für 30 Jahre vom Datum der Hinterlegung an. Die Hinterlegung wird von ATCC unter den Bedingungen des Budapester Vertrags zur Verfügung gestellt und unterliegt einer Vereinbarung zwischen Genentech Inc. und ATCC, was die ständige und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Erteilung des entsprechenden US-Patents oder bei Offenlegung jeglicher US- oder ausländischen Patentanmeldung gewährleistet, was auch immer als erstes eintrifft, und die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden vom US-Commissioner für Patente und Warenzeichen bestimmten gewährleistet, der dazu gemäß 35 USC § 122 und den einschlägigen Regelungen des Commissioners (einschließlich 37 CFR § 1,14 mit besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638) ermächtigt ist.
Der Zessionar der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass die Materialien, falls eine Kultur der hinterlegten Materialien bei Kultivierung unter geeigneten Bedingungen absterben, verloren gehen oder zerstört werden sollte, bei Benachrichtigung unverzüglich durch andere derselben ersetzt werden. Die Verfügbarkeit der hinterlegten Materialien ist nicht als Erlaubnis auszulegen, die Erfindung entgegen der un ter der Amtsgewalt jeglicher Regierungen gemäß ihrer Patentgesetze gewährten Rechte in die Praxis umzusetzen.
Die vorangehende niedergeschriebene Beschreibung wird als ausreichend erachtet, dem Fachmann zu ermöglichen, die Erfindung in die Praxis umzusetzen. Die vorliegende Erfindung wird durch die hierin präsentierten Beispiele in ihren Ansprüchen nicht eingeschränkt. Tatsächlich ergeben sich für den Fachmann verschiedene Modifizierungen der Erfindung – zusätzlich zu jenen, die hierin dargestellt und beschrieben werden, – aus der vorhergehenden Beschreibung, und diese liegen im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Monoklonaler Antikörper, der der vom bei der ATCC unter der Zugriffsnummer PTA-1347 hinterlegten Hybridom sekretierte monoklonale Antikörper 3C6.4.2 ist; oder der vom bei der ATCC unter der Zugriffsnummer PTA-1344 hinterlegten Hybridom sekretierte monoklonale Antikörper 5E8.7.4 ist; oder der vom bei der ATCC unter der Zugriffsnummer PTA-1346 hinterlegten Hybridom sekretierte monoklonale Antikörper 5E11.1.2 ist; oder der vom bei der ATCC unter der Zugriffsnummer PTA-1345 hinterlegten Hybridom sekretierte monoklonale Antikörper 5G8.2.2 ist.
Hybridomzelllinie, die den monoklonalen Antikörper 3C6.4.2 produziert und bei der ATCC unter der Zugriffsnummer PTA-1347 hinterlegt ist; oder den monoklonalen Antikörper 5E11.1.2 produziert und bei der ATCC unter der Zugriffsnummer PTA-1346 hinterlegt ist; oder den monoklonalen Antikörper 5G8.2.2 produziert und bei der ATCC unter der Zugriffsnummer PTA-1345 hinterlegt ist; oder den monoklonalen Antikörper 5E8.7.4 produziert und bei der ATCC unter der Zugriffsnummer PTA-1344 hinterlegt ist.
Hybrid-Anti-APRIL-Antikörper, der sich spezifisch an APRIL-Polypeptid bindet und Folgendes umfasst: (a) eine Sequenz, die von dem vom bei der ATCC unter der Zugriffsnummer PTA-1347 hinterlegten Hybridom sekretierten 3C6.4.2-Antikörper herrührt; oder (b) eine Sequenz, die von dem vom bei der ATCC unter der Zugriffsnummer PTA-1346 hinterlegten Hybridom sekretierten 5E11.1.2-Antikörper herrührt; oder (c) eine Sequenz, die von dem vom bei der ATCC unter der Zugriffsnummer PTA-1345 hinterlegten Hybridom sekretierten 5G8.2.2-Antikörper herrührt; oder (d) eine Sequenz, die von dem vom bei der ATCC unter der Zugriffsnummer PTA-1344 hinterlegten Hybridom sekretierten 5E8.7.4-Antikörper herrührt.
Humanisierter Anti-APRIL-Antikörper, der sich spezifisch an APRIL-Polypeptid bindet und Folgendes umfasst: (a) eine Sequenz, die von dem vom bei der ATCC unter der Zugriffsnummer PTA-1347 hinterlegten Hybridom sekretierten 3C6.4.2-Antikörper herrührt; oder (b) eine Sequenz, die von dem vom bei der ATCC unter der Zugriffsnummer PTA-1346 hinterlegten Hybridom sekretierten 5E11.1.2-Antikörper herrührt; oder (c) eine Sequenz, die von dem vom bei der ATCC unter der Zugriffsnummer PTA-1345 hinterlegten Hybridom sekretierten 5G8.2.2-Antikörper herrührt; oder (d) eine Sequenz, die von dem vom bei der ATCC unter der Zugriffsnummer PTA-1344 hinterlegten Hybridom sekretierten 5E8.7.4-Antikörper herrührt.