DE60313859T2

DE60313859T2 - Induktion der anti-tumor-ctl-immunität durch in-vivo-aktivierung von 4-1bb und/oder cd40

Info

Publication number: DE60313859T2
Application number: DE60313859T
Authority: DE
Inventors: Linda Diehl; Geertje Van Mierlo; Cornelis J. Melief; Rene Toes; Rienk Offringa
Original assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Current assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Priority date: 2002-04-04
Filing date: 2003-04-04
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2023-04-05
Also published as: EP1490407B1; NZ535729A; CA2480162C; DE60313859D1; KR20040098048A; CA2480162A1; AU2003225431A1; ATE362491T1; US20030118588A1; WO2003084999A1; AU2003225431B2; CN1646566A; DK1490407T3; KR100717901B1; ES2285157T3; EP1490407A1; JP2005538043A; SI1490407T1

Description

Umfeld der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen für die Behandlung von Tumoren oder Infektionskrankheiten, worin die Zusammensetzung einen agonistischen anti-CD40-Antikörper oder eines dessen Fragmente enthält. Die Zusammensetzungen können außerdem Polypeptide oder Nukleinsäuresequenzen enthalten, die ein Klasse-I-MHC- oder Klasse-II-MHC-restringiertes T-Zellen-Epitop besitzt oder kodiert.
Stand der Technik
Viele Tumoren entgehen der Überwachung durch unser Immunsystem. Bei Krebspatienten liegt offensichtlich eine quantitative und/oder qualitative Störung des spezifischen Mechanismus des Immunsystems zur Beseitigung von Tumorzellen vor. Eines dieser Mechanismen wird von den cytotoxischen T-Zellen (CTL) bereitgestellt, die Zellen erkennen und Abtöten können, die von Viren infiziert oder in Krebszellen umgewandelt sind. Früher ist postuliert worden, dass dendritische Zellen (DC) T-Helferzellen stimulieren, die wiederum die Aktivierung der CTL unterstützen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bewiesen, dass die Helferzelle die Helfersignale nicht unmittelbar (durch Absonderung von IL2) an die CTL abgibt, sondern eher ein Helfersignal an die DC abgibt, welches noch nicht beschriebene Zelloberflächen- und/oder zelllösliche Moleküle induziert, die fähig sind, CTL in Abwesenheit der T-Helferzellen zu Aktivieren. Das von der T-Helferzelle an die DC abgegebene Signal wird über die CD40L-CD40-Interaktion vermittelt. Diese neue Erkenntnis bietet eine einmalige Gelegenheit für die Immuntherapie bei Krebs.
Das Immunsystem ist fähig, autologe Zellen abzutöten, die von Viren infiziert oder in Krebszellen umgewandelt sind. Ein potentiell so gefährlicher Mechanismus muss zweifellos unter strenger Kontrolle gehalten werden. Die CTL des Immunsystems zirkulieren als inaktive Vorläufer. Um aktiviert zu werden, muss der Vorläufer der T-Killerzelle das für ihn spezifische Antigenpeptid erkennen, das ihm in Form von MHC-Klasse-I-Molekülen von professionellen APC präsentiert wird. Um diese T-Zellen zu primen, müssen die APC das Antigen aber auch in einem entsprechenden costimulierenden Kontext präsentieren, wie ihn u. a. die costimulierenden Moleküle B7.1 und B7.2 und die IL-12-Lymphokine bereitstellen.
Bis vor kurzem glaubte man, eine Vollaktivierung der CTL bedürfe einer T-Helferzelle, die dasselbe Antigen auf demselben APC erkennt. Die spezifische T-Helferzelle liefere die zur Aktivierung der CTL notwendigen Cytokine wie z.B. IL-2. Guerder und Matzinger (J. Exp. Med. 176:553 (1992)) haben dagegen das Lizenzierungsmodell für die Aktivierung der CTL vorgeschlagen. Im Rahmen dieses Modells wird behauptet, dass die T-Helferzellen, wenn sie ihr Antigen auf einer professionellen APC erkennen, ein Aktivierungssignal an die APC abgeben, die demzufolge befähigt ist, einen CTL zu aktivieren, ohne dass eine T-Helferzelle anwesend sein muss. Erst unlängst ist der Molekularmechanismus des Lizenzierungsmodells erklärt worden. Schoenberger et al. (Nature 393:480 (1998)) haben die Rolle des CD40L-CD40-Signalwegs im Lizenzierungsmodell erläutert. Die Interaktion zwischen der T-Helferzelle und der DC über die CD40-CD40L-Bindung führt zur DC-Aktivierung, wodurch die DC für das effiziente Priming naiver CTL befähigt werden.
DC zirkulieren in unseren Körpergeweben und könne auf diese Weise Antigene aufnehmen, verarbeiten und präsentieren. Nach Aufnahme der Antigene, migrieren sie zu den dränierenden Lymphknoten, wo sie das Antigen den T-Zellen präsentieren. Es ist bekannt, dass die DC aktiviert werden müssen, um optimal zu agieren. Ruhende DC exprimieren nur mäßige Konzentrationen an MHC und costimulierenden Molekülen und sind schwache Stimulatoren für T-Zellen. DC können von inflammatorischen Cytokinen und bakteriellen Produkten Aktiviert werden, was zur Hochregulierung von MHC und von costimulierenden Molekülen führt. Die Aktivierung der DC zu völlig reifen DC, die optimale Konzentrationen an MHC-Molekülen, costimulierenden Molekülen und Lymphokinen wie z.B. IL-12 exprimieren, erfordert eine zusätzliche Auslösung des Prozesses in diesen Zellen durch den CD40-Rezeptor. Dementsprechend führt die Kombination inflammatorischer Cytokine an der Stelle der Antigenaufnahme mit der CD40L-CD40-Interaktion während der Mitwirkung der T-Helferzelle zu einer optimalen Fähigkeit, die DC für die CTL-Aktivierung zu lizenzieren.
Viele Tumoren entgehen der Immunüberwachung durch spezifische CTL-Mechanismen. Erfolgt die Aufnahme der Tumorantigene durch die DC unter nicht inflammatorischen Bedingungen, so kann die Anzahl der dadurch Aktivierten T-Helferzellen zu gering sein, um genügend aktivierbare CTL für eine angemessene Antitumor-Reaktion zu induzieren. Diese Vorstellung hat die Forscher auf den Gedanken gebracht, das Immunsystem durch Verabreichung von Cytokinen, wie z.B. von IL-2 und IL-12, die die CTL-Tätigkeit direkt stimulieren, oder durch die Antigenpräsentation fördernde Verabreichung von mit GM-CSF transfektierten Tumorzellen zu unterstützen. Diese Vorgehensweise hat zu verschiedenen aber ermutigenden Ergebnissen geführt.
Es steht fest, dass es weiterhin äußerst notwendig ist, Wege zur Generierung und/oder Verstärkung durch Zell- und humorale Immunität vermittelter, schützender Antitumor-Antworten zu finden. Der Aktivierungssignalweg über CD40 wurde als wichtiger immunregulierender Mechanismus zur Ausbildung von primären Zell- und humoralen Immunantworten erkannt. Wie obenstehend beschrieben, ist der CD40-Signalweg bei DC für die Induktion von Antitumor-Immunantworten der CTL verantwortlich. Zudem fördert die Aktivierung des CD40-Signalwegs bei Makrophagen eine nachhaltige, die Tumorzellen abtötende Wirkung.
Die Hauptfolge des CD40-Triggerns durch CD40L⁺-T_H-Zellen oder durch den agonistischen anti-CD40 AK (falls nicht genügend T-Zell-Hilfe erreicht werden kann), ist das Reifen der DC, das diese Zellen befähigt, Antigene im costimulierenden Kontext zu präsentieren, der für das Priming der naiven CTL erforderlich ist (5). Das von CD80 und CD86, die jeweils in hoher Konzentration auf reifen DC exprimiert werden, an den CD28-Rezeptor der T-Zellen gelieferte costimulierende Signal ist besonders weitgehend erforscht worden (rezensiert in: (6, 7)). Obwohl dieses Signal eine grundlegende Rolle bei der Aktivierung der T-Zelle spielt, tragen auch einige zusätzliche costimulierende Signalwege zu diesem Prozess bei. Bei dem einen handelt es sich um das Rezeptor-Ligand-Paar 4-1BB/4-1BBL. 4-1BB gehört zur Familie der TNF-Rezeptoren (TNFR) und wird auf aktivierten CD8⁺- und CD4⁺-T-Zellen exprimiert (8,9). Dessen natürlicher Ligand, 4-1BBL, wird auf B-Zellen, Makrophagen und DC exprimiert (10-12). In-vitro-Studien haben gezeigt, dass die Stimulierung von T-Zellen mit agonistischem anti-4-1BB-AK zur Steigerung der TCR-induzierte Proliferation und der Cytokinproduktion der T-Zellen führt. Obwohl gleichermaßen CD4⁺-TH-Zellen und CD8⁺-CTL auf diese Weise costimuliert werden konnten, waren CD8⁺-Zellen leichter durch das 4-1BB-Triggern ansprechbar als CD4⁺-T-Zellen (8, 13). Demgemäß wurde nachgewiesen, dass die In-vitro-Blockierung der 4-1BB-Costimulation zur Inhibierung der APC-vermittelten T-Zellen-Aktivierung führt (14,15), weshalb 4-1BBL-defiziente Mäuse eine verminderte Fähigkeit aufwiesen, CTL-Immunität gegen Vireninfektionen aufzubauen. Umgekehrt erwies sich, dass die Verabreichung von agonistischem anti-4-1BB AK an Mäuse die Generierung von CTL in einem murinen Modell der Graft-versus-Host-Reaktion erhöht (13), und auch zur Abstoßung schwach immunogener Tumoren bei Tumorkranken Mäusen führte (19).
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft CD40-bindende Moleküle, die als solche oder zusammen mit CTL-aktivierenden Peptiden, einschließlich Tumor-Antigenen oder Antigenen von Infektionserregern, in einer pharmazeutischen Zusammensetzung eingesetzt werden können. Eine derartige Zusammensetzung kann zur Verstärkung der Antitumor-Wirkung einer Peptidvaccinierung gegen Tumoren oder zur andersartigen Aktivierung der CTL eingesetzt werden, sodass die aktivierten CTL gegen die Tumor- oder die infizierten Zellen agieren können. CD40-bindende Moleküle können Antikörpermoleküle sowie deren homologe, analoge und modifizierte oder abgeleitete Formen enthalten, einschließlich Immunoglobulinfragmente wie Fab, (Fab')₂ und Fv, sowie kleine Moleküle, einschließlich Peptide, Oligonukleotide, peptidomimetische und organische Verbindungen, die an CD40 binden und die CTL-Antwort aktivieren. Zu den CTL-aktivierende Peptiden gehören das vom Adenovirus stammende E1A Peptid, mit der Sequenz SGPSNTPPE1 (Sequenzkennzahl: 2) und das vom humanen Papillomavirus Typ 16 stammende HPV16-E7-Peptid mit der Sequenz RAHYNIVTF (Sequenzkennzahl: 3)
Das an CD40 bindende Molekül und das CTL-aktivierende Peptid können dem Patienten in geeigneter Weise, u.a. als Injektion oder in Form von Genkonstrukten, die ein derartiges Molekül und Peptid kodieren, verabreicht werden, wobei das Molekül und das Peptid dadurch in vivo oder ex vivo erzeugt werden. Eine derartige Gentherapie wird nach den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt. Wird die Transfektion oder die Infektion der Genkonstrukte ex vivo vorgenommen, so können die infizierten oder transfektierten Zellen dem Patienten verabreicht werden; oder diese Schritte erfolgen in vivo, indem das Molekül und das Peptid endogen erzeugt werden. Wird die Transfektion oder Infektion ex vivo durchgeführt, kann sie durch übliche Methoden u.a. durch Elektroporation, Calciumphosphat-Transfektion, Mikroinjektion oder durch Einverleibung des Genkonstrukts in geeignete Liposome erfolgen. Zur Einverleibung der Genkonstrukte können Vektoren, z.B. ein Retrovirus-, ein Adenovirus- oder ein Parvovirusvektor, oder Plasmide eingesetzt werden, die danach in vivo oder ex vivo exprimiert werden.
Hierin wird unter Beweis gestellt, dass T-Zell-Hilfe für das CTL-Priming über die CD40-CD40-Ligand-(CD40L)-Interaktion vermittelt wird, und dass das in Abwesenheit der CD4⁺-T-Zellen ausbleibende CTL-Priming durch über monoklonale Antikörper (mAK)-vermittelte CD40-Aktivierung von Knochenmark-APC in Gegenwart von CTL-aktivierenden Peptiden einschließlich Tumor-Antigenen wiederhergestellt wird. Des Weiteren führt die Blockierung des von CD4⁺-Zellen exprimierten CD40L zum Ausbleiben des Aufbaus von CTL-Immunität. Diesem Fehler kann durch In-vivo-Triggern von CD40 entgegengewirkt werden. Das In-vivo-Triggern von CD40 kann zu einer bedeutenden Steigerung der Effektivität peptidgestützter Antitumor-Vaccinierungen, bzw. die CTL anderweitig zum Erreichen einer gegen Tumorzellen bzw. infizierte Zellen gerichtete Antwort zu aktivieren.
Zu erwähnen ist ebenfalls, dass ein CTL-aktivierendes Peptid in Abwesenheit von anti-CD40 toleranzinduzierend wirken kann, d.h., dass die Wirt-Antwort gegen die dieses Peptid exprimierenden Zellen inhibiert wird. Allerdings schlägt die Toleranz, falls solch ein Peptid an einen aktivierenden anti-CD40-Antikörper bindet, in starke CTL-Aktivierung um. Zudem kann, wie obenstehend erwähnt, die CD40-Bindung eine bereits schützende tumorspezifische Peptidvaccinierung mit der Fähigkeit versehen, therapeutische CTL-Immunität bei Tumoren aufweisenden Mäusen zu induzieren.
Dieser Befund stellt unter Beweis, dass das CD40-CD40-Ligand-Paar gleich einem Weichensteller bestimmt, ob naive periphere CTL durch Priming aktiviert oder aber tolerant gehalten werden. Demzufolge können an CD40 bindende Agenten wie z.B. monoklonale Antikörper und andere stimulierende Liganden effektiv zusammen mit einem CTL-aktivierenden Peptid eingesetzt werden.
Des Weiteren wird hierin gezeigt, dass das Triggern von 4-1BB z.B. durch anti-4-1-Antikörper ein starkes costimulierendes Signal an die CTL liefert, welches auf wirksame Weise die sonst notwendige CD4⁺-T-Zell-Hilfe beim Cross-Priming zur antigenspezifischen CTL-Immunität ersetzen kann. 4-1BB kann eine sonst toleranzinduzierende Peptidvaccinierung zu einer zum wirksamen CTL-Priming fähigen Formulierung werden lassen. Die Erstaktivierung naiver CTL kann in Abwesenheit der 4-1BB Costimulierung stattfinden, dieses Signal gestattet aber eine erhöhte Überlebensrate von antigenstimulierten CTL. Das Triggern der T-Helfer-unabhängigen CTL-Immunität durch 4-1BB erfordert die vorherige Stimulierung des TCR und CD-28-abhängige Costimulierung. Das über 4-1BB vermittelte Überlebenssignal ist also dem antigenspezifischen TCR-Triggern und der CD-28-abhängigen Costimulierung der naiven CTL nachgeschaltet. An 4-1BB bindende Moleküle als solche oder in Verbindung mit an CD40 bindenden Molekülen und/oder CTL-aktivierenden Peptiden können also zur Herstellung von Arzneimitteln zur Induktion, Verstärkung und Beibehaltung antigenspezifischer CTL-Antworten, wie z.B. zur Erhöhung der Wirkung von Antitumor-Vaccinierungen, eingesetzt werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Das Cross-Priming E1B-spezifischer CTL erfordert CD4⁺-Helferzellen
Splenozyten von mit Ad5E1-BALB/c-MEC immunisierten normalen (a) bzw. CD4-depletierten B6-Mäusen (b) wurden bei verschiedenen Effektor/Ziel Verhältnissen auf die Lyse genidentischer MEC-Zielzellen untersucht, die mit dem vom humanen Adenovirus abgeleiteten E1B_192-200-Peptid (durchgezogene Linie) mit der Sequenz VNIRNCCYI (Sequenzkennzahl 1) bzw. mit einem D^d-restringierten Kontrollpeptid HPV-16 E7_49-57 (gestrichelte Linie) beladen waren. Jede Linie steht für eine Maus. Die aufgezeigten Daten entstammen einem der drei durchgeführten ergebnisgleichen Versuche.
2: Die CD40-Aktivierung ersetzt die CD4⁺-Helferzellen
Splenozyten von CD-depletierten (a, b) bzw. Klasse-II-defizienten I-AK-Knock-out (KO) (c, d) B6-Mäusen wurden mit Ad5E1-BALB/c-MEC Zellen immunisiert und entweder mit dem CD4-Aktivierenden Antikörper (AK) FGK45 (a, c) oder einem isotypischen Kontroll-Antikörper (b, d) behandelt. Die Splenozyten wurden auf eine E1B-spezifische CTL-Aktivität gegenüber genidentischen MEC-Zielzellen untersucht, die entweder mit dem E1B_192-200-Peptid (durchgezogene Linie), oder mit dem Kontrollpeptid HPV-16 E7_49-57 (gestrichelte Linie) beladen waren. Jede Linie steht für eine einzelne Maus. Die aufgezeigten Daten stammen von zwei voneinander unabhängigen Versuchen. E/T-ratio bedeutet Effektor/Ziel Verhältnis.
3: Die B-Zellen sind weder als APC für das Cross-Priming, noch für die über anti- CD40 vermittelte Wiederherstellung des Cross-Priming wesentlich.
Splenozyten wurden von unbehandelten (a) bzw. CD4-depletierten B-Zell-defizienten B6 MT-Mäusen (b, c) entnommen, die mit Ad5E1-BALB/c-MEC immunisiert und denen entweder ein isotypischer Kontroll-Antikörper (b) oder ein CD4-aktivierender Antikörper FGK45 (c) verabreicht wurde. Die Splenozyten wurden auf eine E1B-spezifische CTL-Aktivität gegenüber genidentischen MEC-Zielzellen untersucht, die entweder mit dem E1B_192-200-Peptid (durchgezogene Linie) oder mit dem Kontrollpeptid HPV E7_49-57 (gestrichelte Linie) beladen waren. Jede Linie steht für eine Maus. Die aufgezeigten Daten stellen einen der zwei durchgeführten ergebnisgleichen Versuche dar.
4: Die CD40L-Blockade beugt dem Cross-Priming von E1B-spezifischen CTL vor
Die Splenozyten wurden von mit Ad5E1-BALB/c-MEC immunisierten und mit dem CD40L blockierenden MR-1-Antikörper behandelten Mäusen (a), von mit dem Kontrollantikörper behandelten B6-Mäusen (b) oder von mit dem CD40L-blockierenden MR-1-Antikörper zusammen mit dem CD40-Aktivierenden Antikörper FGK45 behandelten Mäusen (c) 24 Stunden nach der Immunisierung entnommen. Die Splenozyten wurden auf eine E1B-spezifische CTL-Tätigkeit gegenüber genidentischen MEC-Zielzellen untersucht, die entweder mit dem E1B_192-200-Peptid (durchgezogene Linie), oder mit dem Kontrollpeptid HPV-16 E7_49-57 (gestrichelte Linie) beladen waren. Jede Linie steht für eine Maus. Die aufgezeigten Daten stellen eines der drei durchgeführten ergebnisgleichen Experimente dar. E/T-ratio = Effektor/Ziel Verhältnis.
5: Mit dem E1A-Peptid s.c. injizierte Mäuse sind nicht mehr fähig, E1A-spezifische CTL zu erzeugen
C57BL/6-Mäuse wurden zweimal (einmal in der Woche) mit 20 μg E1A-Peptid (a, b) bzw. Kontrollpeptid (c, d) in IFA s.c. injiziert und einen Tag darauf mit SAMB7 (b, d), einer große Mengen an E1A-Peptid exprimierenden Zelllinie i.p. konfrontiert. Von diesen Mäusen abgeleitete Massenzellkulturen wurden auf E1A-spezifische Cytotoxizität gegenüber mit E1A-Peptid
bzw. mit dem HPV16 E7-Peptid (-O-) gepulsten Zielzellen geprüft. Dargestellt wird die spezifische Lyse maßgeblicher Massenzellkulturen bei verschiedenen Effektor/Ziel (E/T) Verhältnissen. Der Versuch wurde viermal mit vergleichbaren Ergebnissen wiederholt.
6: Nach der s.c.-Injektion in IFA, verteilt sich das toleranzinduzierende E1A-Peptid rasch systemisch
Von unbehandelten C57BL/6-Mäusen (-), bzw. von 16 Stunden vorher mit 100μg E1A- oder HPV16 E7-Peptid in IFA s.c. injizierten Mäusen abgeleitete Milzzellen wurden als stimulierende Zellen für einen E1A-spezifischen CTL-Klon eingesetzt. Die [³H]-Thymidin-Aufnahme (cpm) +/- SEM wird für verschiedene Effektor/Stimulator-Konzentrationen ohne Abzug des Leerwertes angegeben. Die Ergebnisse sind für 5 voneinander unabhängige Versuche maßgeblich.
7: Die Induktion von CTL-Toleranz wird nach dem In-vivo-CD40-Triggern zu CTL-Priming umgekehrt.
C57BL/6-Wildtyp-Mäuse (a, b) und H-2^b CD40^_/_-Mäuse (c, d) wurden mit 20 μg E1A-Peptid in IFA allein (c), zusammen mit einem Ratten-IgG2a-Kontrollantikörper (a), bzw. zusammen mit dem anti-CD40-mAK FGK-45 (b, d) s.c. injiziert. Von diesen Mäusen abgeleitete Massenzellkulturen wurden auf E1A-spezifische Cytotoxizität gegenüber den mit E1A-Peptid
bzw. mit dem HPV16 E7-Peptid (-O-) gepulsten Zielzellen, bzw. gegenüber Ad5E1-veränderten Tumorzellen
geprüft. Die spezifische Lyse maßgeblicher Massenzellkulturen bei verschiedenen E/T-Verhältnissen wird dargestellt. Der Versuch wurde mit vergleichbaren Ergebnissen für 18 B6-Mäuse und 2 CD4^_/_-Mäuse wiederholt. In (e) wird die spezifische prozentuelle Lyse von 23 bzw. 37 von den mit E1A-Peptid in IFA allein (links), bzw. zusammen mit dem anti-CG40 mAK (rechts) injizierten B6-Mäusen abgeleiteten CTL-Massenzellkulturen bei einem E/T-Verhältnis gleich 60 wiedergegeben. Der Mittelwert und die Standardabweichung werden für jede Gruppe angegeben (E1A gegen E1A+anti-CD40: p < 0.01, Student-Test).
8: Therapie von HPV16 E6- und E7-veränderten Zellen durch Kombinationsbehandlung mit dem Peptid zusammen mit dem In-vivo-Triggern von CD40.
Die Mäuse wurden mit 25.000 HPV16-veränderten genidentischen Zellen (TC-1) injiziert. 57BL/6-Mäuse wurden unbehandelt gelassen (-O-), bzw. erhielten nach 6 Tagen 100 μg HPV16 E7-Peptid i.p. in IFA
100 μg HPV16 E7-Peptid i.p. in IFA zusammen mit dem anti-CD40-mAK FGK-45
bzw. ein Kontrollpeptid i.p. in IFA zusammen mit dem anti-CD40-mAK FGK-45
Der Prozentsatz der tumortragenden Mäuse wird in (a) für verschiedene Behandlungsgruppen aufgezeigt (n = 10). Die Unterschiede zwischen der mit HPV16-Peptid und dem anti-CD40 mAK behandelten Gruppe und den anderen drei Gruppen waren statistisch aussagekräftig (p < 0,01) (Log-Rank Test). In (b) wird der Prozentsatz überlebender Tiere dargestellt (mit E7-Peptid behandelte Gruppe gegenüber der mit E7-Peptid und anti-CD40 behandelten Gruppe:
p = 0,002, Log-Rank-Test).
9: In-vivo-Triggern durch 4-1BB macht das Priming Ad5-spezifischer CTL in Abwesenheit der T-Zell-Hilfe wieder möglich
Nicht depletierte (a) bzw. CD4⁺-T-Zellen-depletierte (b, c, d) B6-Mäuse wurden mit 10⁷ TAP k.o. Ad5E1MEC s.c. kombiniert mit systemischen Dosen von Kontroll-AK (b), anti-CD40-AK (c) oder anti-4-1BB-AK (d) vacciniert. In einem getrennten Versuch, wurde den normalen B6-Mäusen eine Dosis von 20 μg E1A Peptid in IFA entweder kombiniert mit systemischen Dosen von Kontroll-AK (e), anti-CD40 (f) oder anti-4-1BB-AK (g) verabreicht. Von den immunisierten Mäusen stammende Splenozyten wurden in vitro 6 Tage lang restimuliert und anschließend auf antigenspezifische Cytotoxizität gegenüber mit dem E1B-Peptid (Darstellungen a-d), dem E1A-Peptid (Darstellungen e-g),
dem HPV16 E7-Peptid
bzw. Ad5E1 MEC (O grau) beladenen Zielzellen untersucht. Die stimulierenden Auswirkungen von 4-1BB AK auf das Priming von Ad5-spezifischen CTL durch die Tumorzellen und die Peptidvaccinierung konnten jeweils in drei getrennten Versuchen reproduzierbar festgestellt werden.
10: Systemische Verabreichung von anti-4-1BB AK induziert keine DC-Aktivierung in vivo.
a: B6-Mäuse wurden zweimal mit 100 μg Kontroll-AK (hellgraue Histogramme), anti-CD40 AK (hellgrau, Darstellung links), bzw. anti-4-1BB AK (dunkelgrau, Darstellung rechts) injiziert. Drei Tage später wurden Milzzellen isoliert und mit anti-CD11c und anti-CD86 gefärbt. Dargestellt sind die Werte der CD86-Expression auf CD11-Zellen der Milz, b: B6-Knochenmark wurde isoliert und in vitro 7 Tage lang in GM-CSF-haltigem Medium kultiviert. Am 7. Tag wurden die Zellen durch Versetzen mit 10 μg/ml Poly I:C Aktiviert, bzw. unbehandelt gelassen. Nach 48 Stunden wurden die Zellen auf 4-1BB-Expression (schwarze Linie) untersucht oder mit einem Kontrollantikörper gefärbt (hellgrau, voll). Die Aktivierung der mit Poly I:C behandelten BMDC wurde durch Messen der CD86-Expression (nicht dargestellt) bestätigt.
11: Costimulierung durch 4-1BB ist Antigen-abhängig und führt zu einer erhöhten Überlebensrate antigenspezifischer T-Zellen.
a: B6-Mäuse wurden mit 5 × 10⁶ Ad5E1A-spezifischen TCR-transgenen, mit CFSE in-vitro-markierten, CD8⁺-T-Zellen injiziert. Nach drei Tagen erhielten die Mäuse eine Kombination aus E1A-Peptid und AK, wie in der Figur angegeben. Die Peptidvaccinierung bestand aus einer einzigen 20 μg-Dosis in IFA, während an drei aufeinander folgenden Tagen 100 μg-Dosen AK i.p. verabreicht wurden. Drei Tage nach dem Injizieren des Peptids wurden Milzzellen isoliert und mit FACS auf Anwesenheit von CD8⁺CFSE⁺-T-Zellen untersucht. Das Histogramm zeigt die CFSE Intensität der CD8⁺-T-Zellen. b: B6Thy1.1-Mäuse wurden mit 5 × 10⁶ E1A-spezifischen TCR-transgenen, von B6-Thy-1.2 stammenden CD8⁺-T-Zellen injiziert. Drei Tage später erhielten die Mäuse eine Kombination bestehend aus der E1A-Peptid-Vaccinierung und AK, wie in der Figur angegeben (Dosen und Zeitplan wie vorher). 11 Tage nach dem Injizieren des Peptids, wurden Blutproben entnommen und mit FACS auf Anwesenheit von CD8⁺/Thy1.2⁺ T-Zellen (E1A-Peptid-spezifischer, TCR-transgener Herkunft) untersucht.
12: 4-1BBL wird auf Aktivierten DC hochreguliert. B6-Knochenmark wurde isoliert und in vitro 7 Tage lang in GM-CSF-haltigem Medium kultiviert.
Am 7. Tag wurden die Zellen unbehandelt gelassen (a) mit 10 μg/ml Poly I:C (b), bzw. mit 2 μg/ml murinem CD40L-Trimer (c) Aktiviert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen zum Nachweis von CD11c gefärbt, in Kombination entweder mit AK (schwarze Linien) oder mit anti-4-1BBL-AK (grau ausgefüllte Linie). Die Histogramme geben die CD11c⁺-Zellpopulation an.
13: Sowohl CD28 als auch 4-1BB tragen zum Cross-Priming von tumorspezifischen CTL bei.
B6-Mäuse wurden unbehandelt gelassen, bzw. in Kombination mit blockierendem 1BBL-AK, isotypischem Kontroll-AK und/oder CTLA4-Ig, s.c. mit 10⁷ Ad5E1-veränderten Tumorzellen immunisiert, wie in der Figur angegeben. 10 Tage nach der Immunisierung wurden Milzzellen isoliert und 6 Tage lang in vitro restimuliert. Die Massenzellkulturen wurden nach Stimulierung über Nacht mit 1 μg/ml des E1B-kodierten CTL-Epitops durch Doppelfärbung mit dem anti-CD8-Antikörper und einem anti-INFγ-AK auf die Anwesenheit von antigenspezifischen CTL untersucht. Die angegebenen Daten stellen den Mittelwert dreier voneinander unabhängiger Versuche dar. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung des Mittelwerts (SEM-Werte) an.
14: Die Costimulierung durch CD28-Signalisierung ist Voraussetzung für die Wirksamkeit der Behandlung mit anti-4-1BB AK.
Nicht depletierte (a) bzw. CD4⁺-T-Zellen-depletierte (b-d) B6-Mäuse wurden mit 10⁷ Ad5E1MEC kombiniert mit Kontroll-AK (b), anti-4-1BB AK (c) bzw. anti-4-1BB AK kombiniert mit CTLA4-Ig (d) s.c. vacciniert. Splenozyten wurden 10 Tage nach der Immunisierung geerntet und 7 Tage lang in vitro restimuliert. Die Massenzellkulturen wurden auf E1B-spezifische Cytotoxizität gegenüber mit E1B-Peptid
bzw. mit dem HPV16 E7-Peptid
beladenen Zielzellen, bzw. mit Ad5E1 veränderten Tumorzellen (grau O) untersucht. (e) Dargestellt wird die gemittelte Lysewirkung der Massenkulturen auf E1B-Peptid-beladene Zielzellen bei einem Effektor/Ziel-Verhältnis von 60:1. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des innerhalb zweier voneinander unabhängiger Versuche für 6 Mäuse erhaltenen Mittelwerts dar.
15: Die CD28-KoAktivierung fördert die Induktion der 4-1BB-Expression auf TCR-getriggerten T-Zellen.
B6 Milzzellen wurden in Gegenwart der angegebenen Mengen plattengebundener anti-CD3-AK und/oder plattengebundener anti-CD28 AK (5 μg/ml) kultiviert. Nach 24 Stunden wurden die CD8⁺-T-Zellen auf 4-1BB-Expression untersucht.
16: Die 4-1BB-Signalisierung wirkt synergetisch mit der CD40-Signalisierung zusammen zur In-vivo-Induktion von E1A-spezifischen CTL.
C57BL/6-Mäuse wurden mit E1A-Peptid s.c. mit 100 Mikrogramm anti-CD40-AK FGK-45, anti-4-1BB-AK 3H3, bzw. einer aus beiden bestehenden Kombination i.p. in PBS vacciniert. Zehn Tage später, wurden Milzzellen isoliert und durch Staining mit CD8- APC und D^b-E1A-Tetrameren auf Anwesenheit von E1A-spezifischen CTL untersucht. Dargestellt werden die absoluten Anzahlen von CD8⁺-T-Zellen in der Milz (Darstellung oben) und der Prozentsatz von E1A-spezifischen CTL in der CD8⁺-Population (Darstellung unten).
17: Die CD40-Bindung in vivo führt zur Eliminierung ausgebildeter Tumoren.
Mäuse wurden mit Ad5E1A-exprimierenden Tumorzellen injiziert. Zum Zeitpunkt, da sich bei den Mäusen palpable Tumoren entwickelt hatten, wurden die Mäuse unbehandelt gelassen (geschlossene Kreise), bzw. mit einem CD40-Aktivierenden Antikörper injiziert (offene Kreise). Die Mäuse wurden bei Überschreitung der Tumorgröße von 1 cm³ getötet, um unnötiges Leiden zu vermeiden.
18: Die CD40-Bindung in vivo führt zur systemischen Verbreitung von tumorspezifischen CTL
Mäuse wurden mit Ad5E1A-exprimierenden Tumorzellen injiziert. Zum Zeitpunkt, da sich bei den Mäusen palpable Tumoren entwickelt hatten, wurden sie entweder unbehandelt gelassen oder mit anti-CD40-mAb behandelt. Zehn Tage nach dem Injizieren mit anti-CD40, wurden die Mäuse getötet und Blut, Milz und Lymphknoten wurden der FACS-Analyse unterzogen. Bei über 30% der unbehandelten Mäuse (n = 23) wurden E1A-spezifische CTL nur in den Tumor dränierenden Lymphknoten (A) nachgewiesen, während bei den anderen Tieren dieser Gruppe keine E1A-spezifischen CTL beobachtet wurden (nicht dargestellt). Demgegenüber konnten bei den mit anti-CD40-mAb (n = 29; B) behandelten, tumortragenden Mäusen leicht E1A-spezifische CTL nachgewiesen werden. C: Die Anzahl der E1A-spezifischen CD8⁺-T-Zellen wird als Prozentsatz von der Gesamtanzahl der CD8⁺-T-Zellen im Blut dargestellt (Mittelwert + SEM). Dargestellt wird ein maßgeblicher von 4 Versuchen. *Student-Test (T-Test): p < 0.01.
19: Das Vorhandensein des E1A-abgeleiteten CTL-Epitops wird nur im den Tumor dränierenden Lymphknoten nachgewiesen
4·10⁶ CFSE-markierte E1A-spezifische transgene T-Zellen wurden Ad5E1A-exprimierende Tumoren tragenden Mäusen injiziert. Sieben Tage später wurden die Milz, der den Tumor dränierende Lymphknoten und ein diesen nicht dränierender Lymphknoten entnommen und durch FACS auf die Teilung E1A-spezifischer CTL untersucht. Dargestellt werden die für den den Tumor drainierenden Lymphknoten (schwarze Oberfläche) und die Milz (graue Linie) erhaltenen, für 12 Mäuse maßgeblichen Daten. Die Ergebnisse für anti-CD40-behandelte und unbehandelte Mäuse waren vergleichbar.
20: Das In-vitro-CD40-Triggern führt zur Infiltration des Tumors mit Ad5E1A-spezifischen CTL.
Mäuse wurden mit Ad5E1A-exprimierenden Tumorzellen injiziert. Zum Zeitpunkt, da sich bei den Mäusen palpable Tumoren entwickelt hatten, wurden die Mäuse unbehandelt gelassen, bzw. mit dem CD40-Aktivierenden Antikörper i.v. behandelt. Fünf Tage danach, wurden die Mäuse getötet und die Tumorinfiltration mit E1A-spezifischen CTL durch die FACS-Analyse bestimmt. Die Zahlen in der Ecke oben rechts stellen den Prozentsatz TM-positiver Zellen vom gesamten CD8⁺-Zellen-Pool dar.
21: Lokale CD40-Aktivierung führt zu systemischer Antitumor-Immunität
Mäuse wurden mit Ad5E1A-exprimierenden Tumorzellen auf beiden Seiten injiziert. Zum Zeitpunkt, da sich bei den Mäusen auf beiden Seiten palpable Tumoren entwickelt hatten, wurde in einen der Tumoren anti-CD40, bzw. PBS, als Kontrolle, intratumoral verabreicht. A) Zehn Tage nach der Behandlung, wurden Blutproben entnommen und der FACS-Analyse zur Bestimmung der Anwesenheit von Ad5E1A-spezifischen CTL unterzogen. Die Ergebnisse stellen die Anzahl der E1A-spezifischen CD8⁺-T-Zellen als Prozentsatz vom gesamten CD8-Pool dar. (Mittelwert + SEM, n = 7). *Student-Test: p < 0,05; **Student-Test: p > 0,01; kein aussagekräftiger Unterschied zwischen der intratumoralen und der anti-CD40 Behandlung. B) Prozentsatz der auf der behandelten Seite ein Tumor tragenden Mäuse. C) Prozentsatz der auf der nicht behandelten Seite ein Tumor tragenden Mäuse. p = 0,05
22: Die CD8⁺-T-Zellen nicht aber die CD4⁺-T-Zellen sind für die Beseitigung der Tumoren nach der In-vivo-CD40-Bindung ausschlaggebend
Mäuse wurden mit Ad5E1A-exprimierenden Tumorzellen injiziert. Zum Zeitpunkt, da sich bei den Mäusen palpable Tumoren entwickelt hatten, wurde die Behandlung begonnen. Die Mäuse wurden gar nicht, bzw. mit anti-CD40-mAb, oder mit einer Kombination bestehend aus anti-CD40-mAb und einem CD8- bzw. CD4-depletierenden AK behandelt. Die Mäuse wurden bei Überschreitung der Tumorgröße von 1 cm³ getötet, um unnötiges Leiden zu vermeiden.
23: Die Ad5E1A-exprimierenden Tumoren exprimieren kein CD40
Die mit PE-markiertem anti-CD40-Antikörper (schwarze Linie) bzw. mit Kontroll-Antikörper (graue Fläche) gefärbte Zellen wurden der FACS-Analyse unterzogen. LPS-aktivierte dendritische Zellen wurden als positive Kontrolle (gestrichelte Linie) eingesetzt.
Beschreibung
Die erfindungsgemäßen an CD40 bindenden Moleküle können durch übliche Herstellungs- und Screening-Techniken erhalten werden. Ein monoklonaler Ratten- und ein Hamster-anti-Maus-CD40-Antikörper („MAK") sind jeweils in Nature 393; 474-77 (1998) beschrieben und sind auch im Handel erhältlich (Pharmingen, Inc., CA). Der FGK45 benannte anti-Maus-CD40-MAK, der in den weiter unten beschriebenen Versuchen eingesetzt wird, ist von Rotlink A. et al, Immunity 5,319-330 (1996) beschrieben worden. Agonistische anti-4-1BB Antikörper werden in Hurtado et al. (1997) und Shuford et al. (1997) beschrieben. Anti-human-CD40 MAK können nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren erzeugt werden, und wurden von C. Milstein (Nature, 1975:256:495-497) beschrieben. MAK können durch Immunisierung der Nagetiere (z.B. Mäuse, Ratten, Hamster und Meerschweinchen) entweder mit arteigenem CD40, wie es auf den Zellen exprimiert oder aus humanem Plasma oder Urin getrennt und gereinigt wird, oder mit in einem eukariotischen oder prokariotischen System exprimiertem rekombinantem CD40 oder dessen Fragmenten erzeugt wird. Zur Immunisierung können andere Tiere, z.B. nicht-humane Primaten, humane Immunoglobuline exprimierende transgene Mäuse und am schweren kombiniertem Immundefekt (SCID) leidende, mit humanen B-Lymphozyten transplantierte Mäuse, dienen. Hybridomas können mit Hilfe üblicher Verfahren durch Verschmelzung von B-Lymphozyten von den immunisierten Tieren mit Myeloma-Zellen (z.B. Sp2/0 und NSO) erzeugt werden, wie von G. Köhler und C. Milstein (s. o.) beschrieben wurde. Außerdem können anti-CD40 mAK durch Screening von rekombinanten einzelkettigen Fv- oder Fab-Bibliotheken in humanen B-Lymphozyten im Phagendisplaysystem erzeugt werden. Die Spezifizität der mAK gegenüber CD40 kann durch den Enzym-gekoppelten Immunosorbens-Assay (ELISA), Western Immunoblotting oder andere immunchemische Verfahren geprüft werden. Die Aktivierende Wirkung der Antikörper gegenüber den CTL in Gegenwart eines CTL-aktivierenden Peptids, kann durch Verwendung der weiter unten beschriebenen Tests eingeschätzt werden.
Zur Behandlung von Menschen, wären die anti-CD40-mAb bevorzugt als chimärische, deimmunisierte, humanisierte oder humane Antikörper eingesetzt. Derartige Antikörper können die Immunogenität herabsetzen und dadurch die Antwort humaner Anti-Maus-Antikörper (HAMA) vermeiden. Die Antikörper sind bevorzugt IgG4, IgG2, oder weitere genetisch mutierte IgG oder IgM, die keine Steigerung der Antikörper-abhängigen zellulären Toxizität (S.M. Canfield und S.L. Morrison, J. Exp. Med, 1991:173:1483-1491) und der vom Komplement vermittelten Cytolyse (Y.Xu et al., J. Biol. Chem., 1994: 269:3468-3474; V.L. Pulito et al, J. Immunol., 1996; 156: 2840-2850) hervorrufen.
Chimärische Antikörper werden durch das im Stand der Technik bekannte Rekombinationsverfahren erzeugt, und haben einen veränderlichen Tier- und einen konstanten Humanbereich. Humanisierte Antikörper besitzen gegenüber chimärischen Antikörpern einen höheren Anteil an humanen Peptidsequenzen. In einem humanisierten Antikörper sind nur die für die Bindung von und die Spezifizität gegenüber Antigenen unentbehrlichen, die Komplementarität bestimmenden Bereiche (CDR) vom Tier abgeleitet und besitzen eine dem Tier-Antikörper entsprechende Aminosäurensequenz, während im Wesentlichen alle verbleibenden Teile des Moleküls (außer in einigen Fällen kleine Teile des Rahmenbereichs im variablen Bereich) humaner Ableitung sind und in ihren Aminosäurensequenzen einem humanen Antikörper entsprechen. Siehe L. Riechmann et al., Nature, 1988; 332:323-327; G. Winter, US. 5,225,539 ; C.Queen et al., US 5,530,101 .
Deimmunisierte Antikörper sind von T- und B-Zellen-Epitopen befreite Antikörper, wie im Internationalen Patentanmeldung PCT/GB98/01473 beschrieben. Sie verfügen bei In-vivo-Einsatz, über verminderte Immunogenität.
Humane Antikörper können auf zahlreichen, unterschiedlichen Wegen erzeugt werden, auch durch Verwendung von Expressionsbibliotheken humanen Immunoglobulins (Stratagene Corp., La Jolla, California) zur Erzeugung von Fragmenten humaner Antikörper (VH, VL, Fv, Fd, Fab, oder (Fab')₂), und durch den Einsatz dieser Fragmente, um unter Verwendung ähnlicher Verfahren wie bei der Erzeugung chimärischer Antikörper, ganze humane Antikörper aufzubauen. Humane Antikörper können auch in transgenen Mäusen mit einem Genom humanen Immunoglobulins erzeugt werden. Derartige Mäuse sind von Fa. Abgenix, Inc., Fremont, California, und Fa. Medarex, Inc., Annandale, New Jersey erhältlich.
Es können ebenfalls einzelne Peptidketten verbindende Moleküle geschaffen werden, in welchen die schweren und die leichten Fv-Bereiche miteinander verbunden sind. Einkettige Antikörper („ScFv") und das zu deren Aufbau einzusetzende Verfahren werden im US 4,946,778 beschrieben. Alternativ kann durch ähnliche Mittel (M.J. Evans et al., J. Immunol. Meth., 1995; 184:123-138) Fab aufgebaut und exprimiert werden. Alle vollkommen oder teilweise humanen Antikörper sind weniger immunogen als vollkommen murine mAK, und die Fragmente und Einkettenantikörper sind ebenfalls weniger immunogen. Für all diese Antikörpertypen ist deshalb die Wahrscheinlichkeit geringer, eine Immun- oder eine allergische Antwort auszubilden. Dementsprechend sind sie zur In-vivo-Verabreichung an Menschen besser geeignet als gänzlich tierische Antikörper, besonders wenn eine wiederholte oder Langzeitverabreichung erforderlich ist. Zudem können die kleineren Abmessungen des Antikörperfragments zur Verbesserung der Verfügbarkeit im Gewebe beitragen, die in Akuten Krankheitsverordnungen wie die Tumorbehandlung, für eine bessere Dosisaufnahme von kritischer Bedeutung sein kann.
Auf Grund der Kenntnis der Molekularstrukturen der verschiedenen Bereiche des anti-CD40-mAK oder der bekannten CTL-aktivierenden Peptide, könnte die Modellierung der Molekülstruktur und der rationale Moleküldesign zur Generierung und zum Screening von Molekülen eingesetzt werden, die die Molekularstruktur des bindenden Bereiches der Antikörper bzw. der Peptide nachahmen und die CTL Aktivieren. Diese kleinen Moleküle können Peptide, Peptidomimetika, Oligonukleotiden, oder andere organische Verbindungen darstellen. Die Struktur-nachahmenden Moleküle können zur Behandlung von Krebserkrankungen und Infektionen eingesetzt werden. Alternativ können in der Branche übliche, groß angelegte Screeningverfahren zur Isolierung geeigneter Moleküle aus Verbindungsbibliotheken eingesetzt werden.
Ein Aspekt der Offenbarung betrifft eine Zusammensetzung, die einen agonistischen anti-4-1BB-Antikörper oder eines dessen den 4-1BB-Rezeptor stimulierenden Fragmente enthält. Bevorzugt enthält die Zusammensetzung ferner einen agonistischen anti-CD40 Antikörper oder eines dessen Fragmente, die den CD40-Rezeptor stimulieren.
Ein weiterer Aspekt der Offenbarung betrifft eine Zusammensetzung enthaltend (a) einen agonistischen anti-CD40-Antikörper oder eines dessen Fragmente, das den CD40-Rezeptor stimuliert, welche ferner ein oder mehrere Moleküle enthält, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Polypeptiden, Peptiden, Viren und Nukleinsäuresequenzen, die ein Klasse-I- oder Klasse-II-MHC-restringiertes T-Zell-Epitop besitzen oder kodieren.
Verfahren zur Auswahl und Herstellung geeigneter Klasse-I- oder Klasse-II-MHC-restringierter T-Zell-Epitope sind z.B. in WO 07/41440 und in WO 02/070006 beschrieben. Bevorzugt stellen die Klasse-I- oder Klasse-II-MHC-restringierten T-Zell-Epitope Peptide dar. Bevorzugt weisen die Peptide eine Länge von mindestens 8, besonders bevorzugt mindestens 22 Aminosäuren auf. Bevorzugte Peptide weisen eine Länge von 8 bis 10, besonders bevorzugt 22 bis 45 Aminosäuren auf.
Ein weiterer Aspekt der Offenbarung betrifft die Verwendung (a) von einem agonistischen anti-4-1BB Antikörper, oder einem dessen Fragmente, das den 4-1BB Rezeptor aktiviert, (b) von einem agonistischen anti-CD40 Antikörper, oder einem dessen Fragmente, das den CD40-Rezeptor aktiviert, bzw. (c) beidem zur Herstellung eines Arzneimittels zur Induktion systemischer T-Zellen-Immunität gegen ein Antigen. Das Arzneimittel kann ferner mindestens ein Molekül enthalten, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Polypeptiden, Peptiden, Viren und Nukleinsäuresequenzen, die ein Klasse-I- oder Klasse-II-MHC-restringiertes T-Zell-Epitop besitzen oder kodieren. Das Antigen ist bevorzugt ein Klasse-I- oder Klasse-II-MHC-restringiertes T-Zell-Epitop. Das Antigen ist bevorzugt ein Antigen eines Tumors oder von Tumorzellen. Besonders bevorzugt ist das Antigen ein tumorspezifisches Antigen. Alternativ kann dieses Antigen ein Antigen eines Infektionserregers sein. Ein bevorzugtes Antigen ist ein HPV-Antigen, besonders bevorzugt ist das HPV-Antigen ein Peptid mit der Sequenz RAHYNIVTF (Sequenzkennzahl: 3). Ein anderer Aspekt der Offenbarung betrifft die Verwendung eines agonistischen anti-CD40-Antikörpers, oder eines dessen Fragmente, das den CD40-Rezeptor aktiviert, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines Tumors oder eines Infektionserregers durch Induktion systemischer T-Zellen-Immunität, wobei die Behandlung keine Immunisierung (z.B. Vaccinierung) mit einem Antigen des Tumors oder des Infektionserregers umfasst.
Die Dosierung der erfindungsgemäßen Moleküle kann leicht durch Extrapolieren auf Grund der weiter unten beschriebenen In-vitro-Versuche und -Assays oder auf Grund von Tierversuchen oder klinischen Erprobungen bestimmt werden. Die erfindungsgemäßen Moleküle sollten, im Falle von Antikörpern oder Proteinen bevorzugt als Injektion verabreicht werden, obwohl bestimmte kleine Moleküle für die orale Gabe geeignet sein können. Im Folgenden werden die Assays und Versuche beschrieben, die die Wirksamkeit der Erfindung aufzeigen.
Beispiele
Beispiel 1: Signalisierung durch CD40 kann die CD4⁺-T-Helferzellen beim Priming von CTL ersetzen.
Zur Prüfung des Mechanismus der T-Zell-Hilfe bei der primären In-vitro-Aktivierung der CD8⁺-CTL-Antworten wurde ein eingehend beschriebenes Modellsystem verwendet. Mit allogenen, die frühe Region 1 (Ad5EI-BALB/c-MEC) des humanen Adenovirus Typ 5 exprimierenden BALB/c (H-2^d)-Mausembriozellen (MEC) immunisierte C57BL/6-Mäuse (mit dem Hauptgewebekompatibilitätskomplex (MHC) H-2^b) generierten starke Antworten gegen ein H-2D^b-restringiertes Epitop des E1B-Proteins (E1B_192-200) des Adenovirus (1a). Da die von den Ad5E1-BALC/c-MEC exprimierten allogenen H-2^d MHC-Moleküle zum Priming von H-2^b-restringierten Wirts-CTL unfähig sind, ist die Generierung von E1B-spezifischen CTL auf Cross-Priming angewiesen, d.h. auf die Aufnahme und H-2^b-restringierte erneute Präsentation des Antigens durch Wirts-APC. Das Cross-Priming E1B-spezifischer CTL ist streng Helferabhängig (1b), zumal CD4⁺-T-Helfer-(Th)-Zellen-depletierte Mäuse vor der Immunisierung keine E1B-spezifische CTL-Antwort mehr ausbildeten.
Um zu erforschen, ob das Signalisieren über CD40 die CD4⁺-Helfer-T-Zellen im CTL-Priming ersetzen kann, wurden Mäuse in vivo, vor der Immunisierung mit d5E1BALB/c-MEC, der CD4⁺-T-Zellen depletiert. Einen Tag nach der Immunisierung wurde den Mäusen eine einzige Injektion mit dem Aktivierenden Antikörper anti-Maus CD40-mAK FGK45, bzw. mit einem auf das Isotyp abgestimmten Kontrollantikörper verabreicht. Die Verabreichung von FGK45 an CD4-depletierte, immunisierte Mäuse führte im Unterschied zur Behandlung mit dem Kontrollantikörper (2b), zur wirksamen Wiederausbildung der E1B-spezifischen CTL-Antworten (2a). Bei naiven, mit FGK45 allein behandelten Mäusen (nicht dargestellt) wurde das Priming E1B-spezifischer CTL nicht festgestellt. Um die Möglichkeit einer Vermittlung der Wirkung von FGK45 über die trotz der Depletierung durch Behandlung mit dem anti-CD4-Antikörper übrig gebliebener D4⁺-Zellen zu erörtern, wurden B61-A^b-knockout-Mäuse, denen mature, funktionstüchtige Periphere CD4⁺-Zellen fehlen, mit Ad5E1-BALB/c-MEC immunisiert. Die Antwort auf die Immunisierung dieser Mäuse ist jener der CD4-depletierten Mäuse gleich, im Sinne dass E1B-spezifische CTL nur bei den mit dem CD40-aktivierenden Antikörper behandelten Mäusen (2c), nicht aber bei den mit dem Kontrollantikörper behandelten Mäusen (2d) nachgewiesen werden konnten.
Es wurde ebenfalls untersucht, ob die für das Priming der CTL bei CD4-depletierten Mäusen erforderliche Mitwirkung der anti-CD40-Antikörper durch die als wirksame Induktoren proinflammatorischer Cytokine bekannten bakteriellen Lypopolysaccharide (LPS) (50 mg intravenös) oder durch die Verabreichung von IL-2 (1 × 10⁵ Einheiten in inkomplettem Freund Adjuvans, subkutan) nach Immunisierung mit Ad5E1-BALB/c-MEC ersetzt werden könnte. Während CD4-depletierte mit FGK45 behandelte Mäuse rege E1B-spezifische CTL-Aktivität aufwiesen, führten weder LPS- noch IL-2-Behandlungen zu nachweisbarem CTL-Priming (nicht dargestellt).
Das Binden von CD40 an B-Zellen führt zur Hochregulierung deren costimulierender Aktivität, was auf eine Rolle dieser Zellen in der Wiederaufnahme des CTL-Primings durch CD40-Aktivierung hinweist. Um dieser Frage nachzugehen, wurden B6 DMT-Mäuse, die keine maturen B-Zellen besaßen, mit den allogenen Ad5E1-BALB/c-MEC immunisiert. Für das Cross-Priming E1B-spezifischer CTL waren keine maturen B-Zellen erforderlich (3a). Wenn die Mäuse allerdings der CD4-Zellen depletiert wurden, generierten die B-Zell-defizienten Mäuse keine E1B-spezifische CTL-Antwort (3b). Die Aktivierung über CD40 mit dem FGK45 monoklonalen Antikörper führte zur vollkommenen Wiederherstellung der Fähigkeit CD4-depletierter DMT-Mäuse, E1B-spezifischer CTL zu primen (3c). Die B-Zellen sind demnach weder als APC oder als Nebenzellen für das Cross-Priming in diesem Modellsystem erforderlich, noch werden sie für die CD40-vermittelte Wiederherstellung des Primings von CTL in Abwesenheit der CD4⁺-T-Helferzellen benötigt. Diese Ergebnisse beweisen, dass die Aktivierung vom Knochenmark abgeleiteter APC über CD40 die Notwendigkeit der Mitwirkung von CD4⁺-T-Helferzellen beim Priming E1B-spezifischer CTL umgehen kann.
Beispiel 2: Die Blockierung der Fähigkeit der CD4⁺-T-Helferzellen, mit AFC über den CD40L-CD40-Signalweg zusammenzuarbeiten, verhindert bei normalen Mäusen antigenspezifische CTL-Antworten.
Stellt die CD40L-CD40 Interaktion den von den CD4⁺-T-Helferzellen benützten physiologischen Signalweg zur Hilfeleistung an die CTL dar, so wäre zu erwarten dass die Blockierung der Fähigkeit der CD4⁺-T-Zellen, mit den APC über die CD40L-CD40 Interaktion zusammenzuwirken, das Priming der E1B-spezifischen CTL-Antworten bei normalen Mäusen herabsetzen würde. B6-Mäuse wurden mit Ad5E1-BALB/c-MEC immunisiert und anschließend entweder mit dem CD40L-blockierenden Antiköper MR1 bzw. mit Kontrollantikörper behandelt. Die Blockade des CD40L führt zu drastisch verminderten E1B-spezifischen CTL-Antworten (4a) verglichen mit dem bei mit Kontrollantikörpern behandelten Mäusen beobachteten wirksamen CTL-Priming (4). Der durch die CD40-Blockade induzierte Priming-Defekt wurde nach CD40-Siganlisierng durch FGK45 vollkommen behoben (4c). Der durch die CD40-Blockade induzierte CTL-Priming-Defekt liegt also eher am Versagen der T_H-Zellen, die CD40-vermittelten Signale zu senden, als zu empfangen.
Beispiel 3: Das Fehlen einer E1A-spezifischen CTL-Antwort nach Verabreichung des Peptids
Es wurde ein bereits beschriebenes Modellsystem (Toes et al., J. Immunol. 156:3911 (1996)) verwendet. Man hat nämlich herausgefunden, dass die s.c. Vaccinierung mit dem Ad5E1A-abgleleiteten CTL-Epitop SGPSNTPPEI (Sequenzkennzahl: 2) in IFA Mäuse daran hindert, das Wachsen von Ad5E1A exprimierenden Tumoren unter Kontrolle zu halten. Dies weist darauf hin, dass die E1A/IFA-Vaccinierung eher eine Suppression als eine Induktion der E1A-spezifischen CTL verursacht hat. Außerdem führte die Verabreichung der E1A/IFA-Vaccinierung an T-Zellen-Rezeptor-(TCR)-transgene Mäuse, die die α- und β-Ketten eines E1A-spezifischen CTL-Klons exprimieren, zur nachhaltigen Supression der tumorspezifischen CTL-vermittelten Immunität. Diese Versuche hatten das Prüfen der Auswirkungen der Verabreichung von Peptiden an eine monoklonale CTL-Population zum Ziel. Um festzustellen, ob die s.c. E1A-Peptid-Vaccinierung auch E1A-spezifische Toleranz auf polyklonaler Ebene induziert, wurden Wildtyp (wt) C57BL/6-Mäuse entweder mit E1A-Peptid (5a und 5b) oder mit einem Kontrollpeptid (5c und 5d) injiziert. Am folgenden Tag wurden die Mäuse mit einer genidentischen, eine hohe E1A-Peptid-Pegel auf deren Oberfläche exprimierenden Zelllinie geboostet (5b und 5d). Das Injizieren dieser Zelllinie in mit dem Kontrollpeptid geprimte Mäuse induziert E1A-spezifische Immunität (5d). Allerdings wurde die Fähigkeit der Mäuse, E1A-spezifische CTL-Antworten auszubilden, nach dem Injizieren der E1A/IFA-Vaccinierung (5b) aufgehoben. Diese Daten weisen daraufhin, dass das Injizieren des E1A-Peptids nicht nur bei TCR-transgenen Mäusen zu E1A-spezifischer Toleranz führt, sondern auch bei Mäusen, die ein polyklonales, E1A-spezifisches T-Zell-Repertoir exprimieren.
Da das s.c. Injizieren der E1A/IFA-Vaccinierung zu systemischer CTL-Toleranz führt, wurde geprüft, ob das E1A-Peptid systemisch verteilt und den CTL-Vorläufern im peripheren Bereich präsentiert wird. Dazu wurden Mäuse s.c. mit E1A-Peptid, bzw. mit einem vom Humanen Papillpomavirus (HPV) 16 E7 abgeleiteten, in IFA emulgierten Kontrollpeptid injiziert. Nach 16 Stunden wurden Milzzellen dieser Mäuse isoliert und als Stimulator-Zellen für einen E1A-spezifischen CTL-Klon in vitro eingesetzt. Splenozyten der mit dem E1A-Peptid s.c. injizierten Mäuse induzierten eine spezifische Proliferation, während diese bei Splenozyten von mit dem E7-Peptid s.c. injizierten Mäusen ausblieb (6). Außerdem blieb die Proliferation eines CTL-Kontrollklons auf den von mit E1A injizierten Mäusen stammenden Milzzellen aus (nicht dargestellte Daten). Diese Daten weisen also daraufhin, dass das s.c. in IFA injizierte E1A-Peptid systematisch im peripheren Bereich u. a. durch Splenozyten präsentiert wird.
Angesichts der obenstehend beschriebenen Toleranzauswirkungen der E1A-Peptid-Vaccinierung, stellte sich die Frage, ob das CD40-Triggern in vivo zur Verhinderung peripherer Toleranzausbildung der CTL und zur Wiederherstellung des CTL-Priming ausreichend ist. Deshalb wurde geprüft, ob das Injizieren toleranzinduzierender Peptide zusammen mit dem In-vivo-CD40-Triggern die Induktion peripherer CTL-Toleranz verhindern und zu tumorspezifischer CTL-Immunität führen könnte.
Es wurde in den Beispielen 1 und 2 bewiesen, dass das CD40-Triggern in vivo die Aufgabe der CD4⁺-T-Helferzellen im Priming helferabhängiger CTL-Antworten übernehmen kann. Da die über CD4⁺-T-Zellen vermittelte Helfertätigkeit bei der Verhinderung der Induktion peripherer CTL-Toleranz eine Rolle spielt, stellten sich die Erfinder die Frage, ob das in vivo CD40-Triggern ausreichend ist, um die periphere Induktion E1A-spezifischer CTL-Toleranz zu verhindern. Zu diesem Zweck wurden Mäuse mit der E1A/IFA-Vaccinierung in Kombination mit dem Aktivierenden CD40-mAK FGK-45 injiziert. Die Mäuse, denen diese Kombination verabreicht wurde, bildeten starke E1A-spezifische CTL-Antworten aus (7b und 7e), während diese bei den Mäusen, denen die E1A/IFA-Vaccinierung (7e) bzw. der mAK alleine verabreicht wurden, ausblieben (nicht dargestellt). Die Kombination von E1A/IFA-Vaccinierung und anti-CD40-mAB brachte keine CTL bei CD40-defizienten Mäusen (7c und 7d) hervor. Außerdem konnte das gleichzeitige Injizieren der E1A/IFA-Vaccinierung mit einem auf das Isotyp abgestimmten Kontrollantikörper (6a), bzw. mit IL-2 die von der E1A/IFA-Vaccinierung induzierte Toleranz nicht in CTL-Priming umkehren (nicht dargestellt). Der Bereich und die Variation der Antworten auf die E1A-Epitope bei mit E1A-Peptid allein, bzw. mit E1A-Peptid plus anti-CD40 vaccinierten Tieren ist in 7e dargestellt. Die systemische CD40-Aktivierung kann also die vom Peptid induzierte CTL-Toleranz in peptid- und tumorspezifische CTL-vermittelte Immunität umkehren.
Die Induktion E1A-spezifischer Immunität korrelierte stark mit der Anwesenheit von CD8⁺-Zellen in der Milz der vaccinierten Mäuse, die mit das E1A-Peptid enthaltenden PE-konjugierten H-2-D^b-Tetrameren (D^b/E1A) gefärbt wurden. Innerhalb von 10 Tagen nach der Vaccinierung konnten mit D^b/E1A Tetrameren sich färbende Zellen durch Flusscytometrie bei mit E1A-Peptid und dem anti-CD40-mAK injizierten Mäusen nachgewiesen werden, jedoch nicht bei mit E1A-Peptid allein injizierten Mäusen. Bei den mit E1A-Peptid injizierten Mäusen lag der Prozentsatz der mit den D^b/E1A Tetrameren färbenden CD8⁺-Zellen bei etwa 3 %. Bei Mäusen, die nur mit Adenovirus vacciniert wurden, der eine starke E1A-spezifische Immunität induziert, wurden vergleichbare Mengen D^b/E1A Tetramer-reaktiver CD8⁺-Milzzellen nachgewiesen. Diese Ergebnisse weisen daraufhin, dass die Verbreitung der E1A-spezifischen CD8⁺-T-Zellen bei Mäusen, denen die E1A/IFA-Vaccinierung in Kombination mit dem anti-CD40-mAK verabreicht wurde, beachtlich und der bei Virus-vaccinierten Tieren verzeichneten gleichwertig war.
Beispiel 4: Das Cd40-Triggern verbessert die Wirksamkeit der peptidgestützten Anti-Krebs-Impfung in erhöhtem Maß
Obwohl der obenstehend beschriebene Befund zeigt, dass die Gewährleistung von Hilfe durch CD40-Triggern ausreicht, um der Induktion von CTL-Toleranz nach Verabreichung einer toleranzinduzierenden Peptidvaccinierung vorzubeugen, beantwortet er die Frage nicht, ob die Wirksamkeit von Anti-Krebs-Vaccinierungen, die normalerweise statt Toleranz Immunschutz induzieren, durch Aktivierung über CD40 gesteigert werden kann. Es wurde geprüft, ob das CD40-Triggern in vivo für den Erfolg der Vaccinierung mit einem HPV16 E7-abgeleiteten Peptid von Vorteil ist. Die Vaccinierung mit diesem Peptid induziert CTL-vermittelten Immunschutz gegen eine Gefährdung durch HPV16-veränderte Tumorzellen. Außerdem kann dieses Peptid, wenn Aktivierte DC damit in vitro beladen werden, in einem therapeutischen Rahmen eingesetzt werden, wobei nahe liegt, dass die Stärke einer Antitumor-Antwort bei Präsentation durch aktivierte DC erhöht ist.
Die Mäuse, denen das E7-Peptid in Kombination mit dem CD40-Triggern verabreicht wurde, bildeten eine nachhaltigere CTL-Antwort aus als die mit E7-Peptid allein behandelte Mäuse (nicht dargestellte Daten), was darauf hinweist, dass die Wirksamkeit der HPV E7-Peptid-Vaccinierung zugleich durch das CD40-Triggern erhöht wird, was den obenstehend beschriebenen Befund über das E1A-Peptid bestätigt. Ferner sind die Mäuse, die 6 Tage nach dem s.c. Injizieren von CD40-negativen HPV16 E6/E7-veränderten Tumorzellen mit HPV16 E7-Peptid allein behandelt wurden (offene Quadrate) im Stande, das Tumorwachstum zu verlangsamen, doch erliegen die meisten Tiere letztendlich dem Tumor (8). Wurde allerdings die HPV16 E7-Peptid-Vaccinierung mit dem Injizieren des anti-CD40-mAK kombiniert, so wurde das Wachsen des Tumors bedeutend herabgesetzt und 7 von 10 Mäusen stießen den Tumor ab, während die mit einem Kontrollpeptid und dem anti-CD40 mAK injizierten Tiere das Wachsen des Tumors nicht unter Kontrolle halten konnten. Diese Ergebnisse zeigen dass der Erfolg der Vaccinierung bedeutend erhöht werden kann, wenn die Immunisierung mit In-vivo-CD40-Triggern kombiniert wird. Diese Daten schaffen die Grundlage für die Entwicklung neuer extrem potenter Antitumor-Vaccinierungen für Krebspatienten.
Beispiel 5: Das In-vivo-Triggern durch 4-1BB liefert den naiven CTL eine Erlaubnis zu töten.
Das in vivo CD40-Triggern von APC durch Verabreichung eines agonistischen anti-CD40-Antikörpers (Ab) kann die CD4⁺-T-Helfer-(T_H)-Aktivität beim Cross-Priming von Ad5-spezifischen CTL übernehmen. Wir injizierten mit Ad5E1 veränderte Mausembriozellen (Ad5MEC) in genidentische CD4⁺-Th-Zellen-depletierte C57BL/6-(B6)-Mäuse in Kombination mit entweder anti-CD40 oder anti-4-1BB AK. Diese Ad5E1-MEC waren von TAP-defizienten Mäusen abgeleitet und deswegen unfähig, die Ad5E1-kodierten CTL-Epitope im Kontext ihres eigenen MHC zu präsentieren (20).
Demzufolge stützt sich das Priming Ad5E1B-spezifischer CTL in diesem Zusammenhang auf Cross-Präsentation von Tumorantigenen durch Wirts-APC. Die Induktion Ad5E1-spezifischer CTL ist CD4⁺-Th-abhängig, da CD4⁺-T-Zellen-depletierte Mäuse keine E1B-spezifische CTL-Antwort mehr ausbilden können (9b). Die systemische Verabreichung von agonistischen anti-CD40-AK an diese CD4-depletierten Tiere stellte das E1B-spezifische Cross-Priming wieder her (9c). Interessanter Weise führte die systemische Verabreichung von agonistischen anti-4-1BB-AK zu gleichermaßen wirksamem Priming von E1B-spezifischen CTL in Abwesenheit der CD4⁺-T-Zell-Hilfe (9d). Eine andere Methode, antigenspezifische CTL-Immunität gegen Tumoren zu induzieren, besteht in der Vaccinierung mit minimalen Peptid-Epitopen in Adjuvans (IFA). Bemerkenswert ist, dass im Falle von Ad5E1A und E1B abgeleiteter Epitope, solche Peptid-gestützte Vaccinierungen eher CTL-Toleranz induzieren als Priming, soweit nicht anti-CD40-AK mit verabreicht wird (4). Deshalb prüften wir, ob in diesem Zusammenhang ein Triggern durch 4-1BB das CTL-Priming ermöglichen könnte, indem wir B6-Mäuse mit der E1A-PeptidVaccinierung kombiniert mit anti-4-1BB-AK, anti-CD40-AK oder mit Kontrollantikörper injizierten. Tatsächlich erreichte nicht nur das Mitverabreichen von anti-CD40, sondern auch das Mitverabreichen von anti-4-1BB, dass die Toleranz ausbildende Peptidvaccinierung in eine immunogene Formulierung umgewandelt wurde. (1E-G). Ähnliche Ergebnisse wurden durch Überwachen der E1A-spezifischen CTL-Immunität durch Staining von Splenozyten mit H-2D^d/E1A-Peptid-Tetrameren erhalten (nicht dargestellt). Das In-vivo-Triggern von 4-1BB kann also der Induktion der Peptid-spezifischen Toleranz vorbeugen und stattdessen zum Priming einer starken E1A-spezifischen CTL-Antwort führen. Insgesamt stellen diese Daten unter Beweis, dass das 4-1BB-Signal den CTL eine wirksame Ermächtigung zu töten liefert, und dadurch das CD40-Triggern durch T_H-Zellen oder die Verabreichung agonistischer anti-CD40-AK ersetzen kann.
Beispiel 6: Anti-4-1BB AK induzieren keine DC-Aktivierung
Aktuelle Kenntnisse über die Expressionspatterns von CD40 und 4-1BB könnte den Einwand rechtfertigen, dass das durch In-vivo-Verabreichung von anti-CD40-AK erzeugte Signal an die APC geliefert wird, während jenes vom anti-4-1BB-AK direkt an die CTL geht. Um die Möglichkeit auszuschalten, dass der anti-4-1BB-Antikörper, statt die antigenspezifischen T-Zellen direkt zu stimulieren, seine Wirkung auf das CTL-Priming (9) auf indirekte Weise durch Aktivierung der Antigen-präsentierenden DC vermittelt, untersuchten wir, ob das Injizieren des anti-4-1BB Antikörpers die DC in vivo aktiviert. B6-Mäuse wurden mit anti-4-1BB, anti-CD40 bzw. Kontroll-AK injiziert und die CD86 (B7.2)-Expression auf von den Milzen dieser Mäuse isolierten CD11c⁺ DC analysiert. Wie zu erwarten war, führte das In-vivo-Triggern von CD40 zu einer erhöhten Expression von CD86, was auf die In-vivo-Aktivierung der DC hinweist. Dagegen wurde die Expression von CD86 auf den DC nach In-vivo-4-1BB-Triggern bzw. Verabreichung von Kontroll-Ratten-AK nicht erhöht. (10a). Das Ausfallen der Induktion der DC-Aktivierung durch den anti-4-1BB-AK stimmt mit der Tatsache überein, dass weder immature noch mature DC nachweisbare Konzentrationen von 4-1BB exprimieren, was impliziert, dass die DC für das 4-1BB-Triggern nicht ansprechbar sind (10b). Deshalb scheint der anti-4-1BB-Antikörper die DC-Population nicht zu beeinträchtigen, sondern vermittelt eher deren stimulierende Auswirkung auf das CTL-Priming durch direkte Stimulation der CD8⁺-Zellen.
Beispiel 7: Costimulierung durch 4-1BB führt zu gesteigerten Überlebensraten von Antigen-stimulierten CTL
Um zu untersuchen, auf welche Weise der agonistische anti-4-1BB-AK T-Helferunabhängiges Priming von Ad5-spezifischen CTL ermöglicht, haben wir durch Adoption transferierte T-Zell-Populationen von Ad5E1A-Peptid-spezifischen T-Zellen-Rezeptor-(TCR)-transgenen Mäusen (21) ausgewertet. Die Verfolgung dieser Zellen in vivo wurde auf zwei verschiedene Arten vorgenommen. Vorerst wurden die transgenen T-Zellen mit dem Farbstoff CFSE fluoreszent markiert und in normale B6-Mäuse transferiert, wonach die Mäuse mit dem Ad5E1A-Peptid in IFA, mit bzw. ohne anti-4-1BB-AK-Behandlung vacciniert wurden. Interessanterweise gaben die erhaltenen Daten zu erkennen, dass die Proliferation der TCR-transgenen T-Zellen gleichermaßen bei Mäusen getriggert wurde, denen das E1A-Peptid mit bzw. ohne anti-4-1BB AK verabreicht worden war (11a). Deshalb ermöglichen anti-4-1BB-AK kein CTL-Priming durch Steigerung der Anfangsaktivierung bzw. der Proliferationsfähigkeit der antigenspezifischen T-Zellen.
In einem zweiten Ansatz transferierten wir Ad5E1A-spezifische TCR-transgene T Zellen der B6-Thyl.2-Herkunft in B6Thy1.1 kongene Mäuse. Die Mäuse wurden mit dem Ad5E1A-Peptid in IFA mit bzw. ohne anti-4-1BB-Behandlung vacciniert. 3a zeigt, dass 11 Tage nach der Vaccinierung eine massive Verbreitung von CD8⁺-T-Zellen TCR-transgener Herkunft in den allein mit E1A-Peptid in Kombination mit anti-4-1B-AK, doch nicht in den mit E1A-Peptid bzw. anti-4-1BB-AK allein vaccinierten Mäusen. Deshalb war zur Akkumulierung E1A-spezifischer CTL die Anwesenheit des 4-1BB-costimulatorischen Signals erforderlich. Außerdem war die Stimulation der CD8⁺-CTL-Immunität von der Anwesenheit eines antigenspezifischen Triggers abhängig. Insgesamt beweisen die Daten in 3, dass das 4-1BB-Triggern für die anfängliche CTL-Aktivierung nicht entscheidend ist, aber das Überleben der Antigen-stimulierten CTL fördert, und dadurch die Verbreitung dieser CTL ermöglicht.
Beispiel 8: Mitwirkung von 4-1BBL/4-1BB-Interaktionen im CTL-Priming
Da das In-vivo-Triggern von 4-1BB das CTL-Priming in Abwesenheit des CD40-abhängigen DC-Aktivierungssignals ermöglicht (9), bedeutet dies, dass die Antigenpräsentation durch nicht aktivierte DC kombiniert mit einem aktivierenden anti-4-1BB-AK zum wirksamen CTL-Priming genügt. Die Notwendigkeit der Mitverabreichung von anti-4-1BB-AK ließ ebenfalls darauf schließen, dass nicht Aktivierte DC anscheinend nicht fähig waren, die CTL durch 4-1BB zu stimulieren. Deshalb haben wir die Expression des natürlichen Liganden für diesen Rezeptor, 4-1BBL, auf immaturen und maturen DC untersucht. Nicht Aktivierte DC exprimieren niedere 4-1BBL-Pegel (12a), während die Expression dieses Moleküls nach der Aktivierung in Gegenwart des CD40L-Trimers oder von Poly I:C stark erhöht ist (12b und bzw. c). Die Induktion von 4-1BBL wurde nach CD40-Triggern von DC in vivo beobachtet. Der Anstieg des 4-1BBL-Expressionspegels ging mit erhöhten CD86-Pegeln auf den Aktivierten DC einher. Das weist daraufhin, dass beide costimulierenden Signale zur Fähigkeit maturer DC mitwirken, im Gegensatz zu immaturen DC, die CTL-Immunität zu induzieren.
Wir haben Versuche zur Immunisierung von Tumorzellen in für normale CD4⁺-Zellen profizienten B6-Mäusen durchgeführt, in denen das für das CTL-Cross-Priming notwendige Th-abhängige Signal zur DC-Maturierung intakt ist. Die Blockade der CD28- und 4-1BB-Signale wurde durch Verabreichung von blockierendem anti-4-1BBL-AK bzw. CTLA4-Ig durchgeführt. B6-Mäuse wurden mit Ad5E1MEC in Kombination mit systemischen Dosen von anti-4-1BBL AK und/oder CTLA4-Ig immunisiert. Interessanterweise führte die anti-4-1BBL-invivo-Blockade zu einer merklichen Minderung der Anzahl antigenspezifischer, von der Tumorzell-Vaccinierung induzierten CTL (13). Durch die Blockade der CD28-Costimulierung wurde die CTL-Induktion vollkommen inhibiert, und deshalb hatte das zusätzliche 4-1BB-Blockieren in Kombination mit CTLA4-Ig keine weitere Auswirkung. Diese Daten geben zu erkennen, dass die 4-1BBL/4-1BB-Interaktionen für das Cross-Priming antigenspezifischer CTL von Bedeutung sind, da die Blockierung der Wechselwirkung dieser Moleküle die Anzahl der tumorspezifischen aufrechterhaltenen CTL stark herabsetzt. Allerdings ist das von 4-1BBL gelieferte Signal, in Abwesenheit des costimulierenden von entsprechend Aktivierten DC über CD28 gelieferten Signals anscheinend nicht im Stande, das CTL-Priming zu ermöglichen, und demzufolge wird die Induktion von Antitumor-CTL-Immunität vollkommen aufgehoben.
Beispiel 9: Das 4-1BB Signal hängt von der CD28-Costimulierung ab
Die In-vivo-Blockierungsversuche wiesen auf eine Dominanz der CD28-Costimulierung über das 4-1BB-Siganl hin. Deshalb untersuchten wir, ob die Verabreichung von anti-4-1BB-AK die CTL in Abwesenheit der CD28-Costimulierung immer noch mit einer Ermächtigung zu töten versehen würde. B6-Mäuse wurden an CD4⁺-T-Zellen depletiert und mit Ad5E1-MEC in Kombination mit der Verabreichung von anti-4-1BB-AK und/oder CTLA4-Ig immunisiert. Die Mäuse, denen anti-4-1BB-AK verabreicht wurde, bildeten starke E1B-spezifische CTL-Antworten aus, doch blieben diese bei den Mäusen, denen zusätzlich CTLA4-Ig verabreicht wurde, aus (14). Die Daten zeigen dass die positive Auswirkung des 4-1BB-Triggerns auf die Induktion von CTL-Immunität von der Anwesenheit eines intakten CD28-costimulierenden Signals abhängig ist. Ferner weisen diese Daten daraufhin, dass die von nicht Aktivierten DC exprimierten Grundpegel von CD80/CD86 genügend Costimulierung über CD28 sichern, um eine zusätzliche Costimulierung über den 4-1BB-Signalweg zu ermöglichen.
In-vitro-Studien haben bewiesen, dass die 4-1BB-Expression auf naiven T-Zellen fehlt und dass das TCR-Triggern, über eine Querverbindung durch den anti-CD3-AK, zu einem raschen Anstieg der Oberflächenexpression von 4-1BB führt (8). Da unsere Daten die Schlussfolgerung stützen, dass eine Costimulierung durch CD28 eine Vorbedingung für das 4-1BB-Signalisieren darstellt, haben wir untersucht, ob das CD28-Triggern zur Hochregulierung von 4-1BB auf naiven T-Zellen beiträgt. Dazu wurden naive Milzzellen in vitro mit plattengebundenen anti-CD3-AK stimuliert und 24 Stunden später auf 4-1BB-Expression untersucht (16). Es ist offensichtlich, dass starke Signale über die TCR (hohe Konzentrationen des anti-CD3 AK) zur Induktion von 4-1BB-Expression innerhalb von 24 Stunden ausreichend sind. Allerdings geht die Fähigkeit der T-Zellen, 4-1BB hochzuregulieren, größtenteils verloren, wenn sie mit kleineren anti-CD3-Konzentrationen stimuliert werden. Diese geringeren anti-CD3-Konzentrationen liefern einen schwächeren TCR-Trigger, der mit größerer Wahrscheinlichkeit einem In-vivo-Signal der von einer Tumorzellen-Vaccinierung gelieferten Art gleicht. Wesentlich ist, dass die Fähigkeit der T-Zellen, hohe 4-1BB-Pegel zu exprimieren, durch die Costimulierung über den CD28-Rezeptor unter diesen, den physiologischen Bedingungen näher gebrachten Umständen wieder hergestellt wird. Dieser Befund ist im Einklang mit der Tatsache, dass die In-vivo-Blockade des CD28-Signalwegs die Costimulierung durch 4-1BB aufhebt (14 und 15). Ferner wird dadurch die Vermutung gekräftigt, dass die CD28-Costimulierung Antigen-stimulierter T-Zellen ein wichtiges Signal für die 4-1BB-Hochregulierung auf naiven T-Zellen darstellt, wodurch diese Zellen für das 4-1BB-Triggern anfällig werden.
Beispiel 10: Ermöglichen des CTL-Primings durch eine Tumorzelle oder eine peptidgestützte Vaccinierung, indem eine synergetische Kombination von anti-CD40-AK und anti-4-1BB-AK verabreicht wird.
Da der anti-CD40-AK und der anti-4-1BB-AK das CTL-Priming durch die E1A-Peptid-Vaccinierung auf ähnliche Weise ermöglichten, während das 4-1BB-Triggern von der 4-1BB-Costimulierung abhängig war, haben wir untersucht, ob die Kombination der beiden AK zu einer noch stärkeren Induktion von CTL-Immunität führen würde. Unsere Ergebnisse lassen erkennen, dass die Kombination des E1A-Peptids mit beiden AK tatsächlich eine synergetische Auswirkung auf die Induktion der CTL-Antwort hat. Bei Mäusen, denen beide AK verabreicht wurden, waren sowohl die absoluten als auch die relativen Anzahlwerte von Tetramer-positiven CD8⁺-Zellen gegenüber den mit nur einem AK behandelten Mäusen auf das 5- bis 10-Fache erhöht (17).
Beispiel 11: Induktion therapeutischer Antitumor-Immunität durch Verabreichung von agonistischem anti-CD40-AK an tumortragende Versuchsobjekte.
Da die In-vivo-Aktivierung der APC durch Injizieren von anti-CD40-AK das Cross-Priming von tumorspezifischen CTL bei Tumorzell-immunisierten, CD4⁺-T-Zellen-depletierten Mäusen ermöglicht, könnte dieses Verfahren ebenfalls die Induktion von Antitumor-Immunität bei tumortragenden Tieren fördern. Die Auslösung von Antitumor-Antworten der CTL in tumortragenden Mäusen ist höchst wahrscheinlich wegen fehlender Antigenpräsentation durch richtig aktivierte APC erschwert. Das kann an der ungenügenden Konzentrierung von APC im Tumorbereich liegen und/oder daran, dass die mit Tumorantigen beladene APC nicht Aktiviert werden können und zum dränierenden Lymphknoten rückverteilt werden, also zu der Stelle, wo die Begegnung mit den naiven T-Zellen und deren Priming erfolgt. Zum Ausfall des Cross-Priming der Antitumor-CTL durch die APC könnten insbesondere das Fehlen inflammatorischer „Gefahrensignale", das Ausbleiben der Hilfe tumorspezifischer T-Zellen und die Absonderung immunomodulierender Cytokine durch den Tumor führen.
Angesichts dieser Erwägungen, injizierten wir immunkompetente, (subkutane) Tumoren aus AD5-veränderten Zellen tragende B6-Mäuse mit anti-CD40 AK. Während bei den Kontrolltieren die Tumoren zunehmend wuchsen, waren anti-CD40-behandelte Mäuse im Stande, ihre Tumoren abzustoßen. Interessanter Weise haben wir bei den Kontrolltieren nur eine geringe Anzahl E1A-spezifischer CTL in den dränierenden Lymphknoten nachweisen können, während die anti-CD40-behandelte Mäuse eine deutlich höhere Anzahl von E1A-spezifischen CTL sowohl im dränierenden Lymphknoten als auch im peripheren Blut aufwiesen (19a-c).
Wesentlich ist, dass die Lagerung der Antigenpräsentation in den anti-CD40-behandelten und in den Kontroll-Mäusen ähnlich ist in dem Sinne, dass diese in beiden Fällen nur im dränierenden Lymphknoten und nicht in den zusätzlichen Lymphknoten nachgewiesen wird (20). Wie bereits beschrieben, scheinen die APC wegen dem Fehlen inflammatorischer „Gefahrsignale" nicht im Stande zu sein, in den Kontrolltieren durch Cross-Priming antitumorale CTL-Antworten hervorzurufen. Im Gegensatz dazu, ermächtigt bei den anti-CD40-AK-behandelten Mäusen das CD40-Signal, diese APC wirkungsvoll eine Ad5E1A-spezifische CTL-Immnunität zu primen, und demzufolge sind diese CTL fähig, den dränierenden Lymphknoten zu verlassen und sich Zutritt zu anderen lymphoidalen Organen sowie zum Tumor zu verschaffen. Letzterer Punkt wird durch die Tatsache bestätigt, dass A5E1A-spezifische CTL vorwiegend in den Tumoren der anti-CD40-behandelten Mäuse (21) nachweisbar sind. Die Ansicht, dass die anti-CD40-Behandlung zu wirksamer systemischer CTL-Immunität führt, wird ferner von der Tatsache bestätigt, dass lokales In-vivo-Triggern durch intratumorales Injizieren des anti-CD40-AK in den Tumor an der einen Flanke auch zum Abstoßen des unbehandelten Tumors an der anderen Flanke führt (22a-c). Dieser Versuch beweist auch, dass eine wirksame antitumorale Therapie sowohl infolge systemischer als auch lokaler Verabreichung von anti-CD40-AK erreicht werden kann.
Zwei zusätzliche Experimente geben weitere Einsicht in die Mechanismen, durch welcher das Injizieren von anti-CD40-AK zur Tumorabstoßung führt. Erstens wurde die Rolle dieser CTL in der Tumorvernichtung durch die Tatsache bestätigt, dass die Antitumortherapie mit anti-CD40-AK bei CD8⁺-T-Zellen-depletierten Mäusen unwirksam ist, während sie bei CD4⁺-T-Zellen-depletierten Mäusen wirksam bleibt (23). Zweitens sei darauf aufmerksam gemacht, dass andere Forscher erkannt haben, dass anti-CD40-AK das Wachstum von CD40-exprimierenden Tumoren durch direkte Induktion von Tumorzellenapoptose (23-25) hemmt. Wichtig ist dabei, dass unseren Tumorzellen die CD40-Expression fehlt (24). Deshalb wirkt der therapeutische Effekt des anti-CD40-AK in diesem Ansatz durch die Induktion einer tumoriziden CTL-Antwort.
Beispiel 12: Induktion therapeutischer Antitumor-Immunität durch Verabreichung einer synergetischen Kombination eines anti-CD40- und eines anti-4-1BB-AK an tumortragende Versuchsobjekte.
Unsere Daten zeigen dass die Verabreichung agonistischer anti-CD40-AK, außer der Ermöglichung des CTL-Primings gegen Tumorzellen- und peptidgestützte Vaccinierungen, auch dazu fähig ist, das Immunsystem zu ermächtigen, eine therapeutische Immunität gegen vorhandene Tumoren auszubilden. Da der anti-CD40- und der anti-4-1BB-AK gleichermaßen fähig sind, die CTL-Immunität zu stimulieren und synergistisch zur Stimulierung von durch Peptidvaccinierungen induzierten Antworten zu wirken (siehe oben), ist eine besonders nachhaltige Fähigkeit dieser AK-Kombination zur Induktion von CTL-Immunität in tumortragenden Mäusen zu erwarten.
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Claims

Verwendung eines den CD40-Rezeptor stimulierenden, agonistischen anti-CD40-Antikörpers oder eines dessen Fragmente zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Tumors oder eines Infektionserregers durch Induktion systemischer T-Zellen-Immunität gegenüber einem Antigen des Tumors bzw. Infektionserregers, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung keine Immunisierung mit einem Antigen des Tumors bzw. Infektionserregers umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die infizierten Zellen bzw. die Tumorzellen den CD40-Rezeptor nicht exprimieren.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet dass der CD40-Rezeptor, auf den der agonistische anti-CD40-Antikörper abgestimmt ist, auf den dendritischen Zellen des zu behandelnden Versuchsobjekts exprimiert wird.
Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Induktion einer systemischen T-Zellen-Immunität eine Antwort der zytotoxischen T-Zellen darstellt.
Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der agonistische CD40-Antikörper oder eines dessen Fragmente human, humanisiert, chimärisch oder deimmunisiert ist.
Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment ein V_H-, V_L-, Fv-, Fd-, Fab-, (Fab)₂- oder scFv-Fragment eines humanen Antikörpers darstellt.
Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel zur Verabreichung per Injektion oder orale Gabe bestimmt ist.
Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Injektion eine intratumorale Injektion ist.
Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein tumorspezifisches Antigen ist.
Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein Antigen des humanen Papillomavirus (HPV) oder Adenvirus ist.