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Die
Induktion einer Antigen-spezifischen Antwort von T-Zellen erfordert
vielfältige
Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren der Zelloberfläche einer
T-Zelle und Liganden einer Antigen präsentierenden Zelle. Die primäre Wechselwirkung
findet zwischen dem T-Zell-Rezeptor/CD3-Komplex und einem Molekül des Haupt-Histokompatibilitätskomplexes
statt, der dem T-Zell-Rezeptor ein Peptid mit antigener Wirkung
präsentiert,
wodurch ein Antigen-spezifisches Signal in den T-Zellen ausgelöst wird. Zusätzlich zu
diesem Antigen-spezifischen Signal benötigt eine T-Zell-Antwort ein
zweites, costimulatorisches Signal. Ein costimulatorisches Signal
kann in einer T-Zelle durch Stimulation der T-Zelle durch einen
Zelloberflächenrezeptor
CD28 erzeugt werden (Harding, F. A. (1992) Nature 356, 607–609). Liganden
für CD28
sind auf Antigen präsentierenden
Zellen (APCs) identifiziert worden. CD28-Liganden umschließen Mitglieder
der B7-Familie von Proteinen wie etwa B7-1 (CD80) und B7-2 (CD86)
(Freedman, A. S. et al. (1987) J. Immunol. 137, 3260–3267; Freeman, G.
J. et al. (1989) J. Immunol. 143, 2714–2722; Freeman, G. J. et al.
(1991) J. Exp. Med. 174, 625–631;
Freeman, G. J. et al. (1993) Science 262, 909–911; Azuma, M. et al. (1993)
Nature 366, 76–79;
Freeman, G. J. et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 2185–2192).
Zusätzlich
ist gezeigt worden, dass B7-1 und B7-2 einen weiteren Oberflächenrezeptor
auf T-Zellen, der mit CD28 verwandt ist, binden, genannt CTLA-4
(Linsley, P. S. (1991) J. Exp. Med. 174, 561–569; Freeman, G. J. et al.
(1993) Science 262, 901–911).
Im Gegensatz zu CD28, der konstitutiv auf T-Zellen exprimiert wird,
wird CTLA-4 auf T-Zellen durch Aktivierung induziert (Linsley, P.
S. et al. (1992) J. Exp. Med. 176, 1595–1604). Obwohl eine funktionale
Rolle für
CTLA-4 nicht bekannt ist, gibt es einige Hinweise, dass CTLA-4 bei
der Aussendung eines costimulatorischen Signals an eine T-Zelle
mit CD28 zusammenwirkt (Linsley, P. S. et al. (1992) J. Exp. Med.
176, 1595–1604;
Damle, N. K. et al. (1994) J. Immunol. 153, 2686–2697).
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Aussendung
eines Antigen-spezifischen Signals an eine T-Zelle in Abwesenheit
eines costimulatorischen Signals induziert keine T-Zell-Antwort,
sondern es stellte sich im Gegenteil heraus, dass ein T-Zell-Status
der Reaktionslosigkeit oder Anergie induziert wird (vgl. Schwartz,
R. H. (1990) Science 248, 1349; Jenkins, M. K. et al. (1988) J.
Immunol. 140, 3324). Bei einer Reihe klinischer Situationen ist
es wünschenswert, T-Zell-Antworten
zu unterbinden (z. B. bei Transplantation oder Autoimmun-Defekten).
Daher wurden therapeutische Ansätze
vorangetrieben, Antigen-spezifische Reaktionslosigkeit von T-Zellen
durch Blockierung eines costimulatorischen Signals in T-Zellen hervorzurufen.
Zum Beispiel ist ein CTLA-4-Ig-Fusionsprotein,
das sowohl B7-1 als auch B7-2 bindet, verwendet worden, um die Abstoßung von
allogenen und xenogenen Transplantaten zu verhindern (vgl. z. B.
Turka, L. A. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11102–11105;
Lenschow, D. J. et al. (1992) Science 257, 789–792). In ähnlicher Weise sind Antikörper, die
mit B7-1 und/oder B7-2 reagieren, verwendet worden, um T-Zell-Proliferation
und IL-2-Produktion
in vitro zu verhindern und primäre
Immunantworten auf Antigen in vivo zu hemmen (Hathcock K. S. et
al. (1993) Science 262, 905–907; Azuma
M. et al. (1993) Nature 366, 76–79;
Powers, G. D. et al. (1994) Cell. Immunol. 153, 298–311; Chen,
C. et al. (1994) J. Immunol. 152, 2105–2114).
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Ein
alternativer Ansatz zur Induktion von Anergie zur Vermeidung einer
unerwünschten
T-Zell-Antwort auf ein Antigen ist, auf dem Wege der Clonierung
für das
Antigen spezifische T-Zellen zu zerstören, wodurch die Antigen-spezifischen
T-Zellen aus dem
T-Zell-Repertoire entfernt werden. In vivo beinhaltet die T-Zell-Reifung im Thymus
clonale Deletion von potentiell autoreaktiven T-Zellen. Zusätzlich gibt
es sich mehrende Hinweise, dass zuvor aktivierte T-Zellen selektiv
in der Peripherie verringert werden, nachdem clonale Expansion und
Effektor-Funktion stattgefunden haben (Webb, S. et al. (1990) Cell
63, 1249–1256;
Rocha, B. et al. (1991) Science 251, 1225–1227 und Russell, J. H. et
al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2151–2155). Deletion oder Elimination
von vielen Zelltypen, einschließlich
T-Zellen, kann durch
einen Mechanismus, der Apoptose oder programmierter Zelltod genannt
wird, auftreten. Das Auftreten von Apoptose in einer Zelle ist durch
Eigenschaften gekennzeichnet, die Zellschrumpfung, Zellkern-Kollaps
und DNA-Fragmentierung
einschließen (Überblick
bei Cohen, J. J. et al. (1992) Ann. Rev. Immunol. 10, 267–293). Mehrere
Moleküle
der Zelloberfläche sind
identifiziert worden, die bei Bindung Apoptose einer Zelle auslösen können, einschließlich Rezeptoren
für Fas-
und Tumornekrose-Faktoren (Yonehara, S. et al. (1989) J. Exp. Med.
169, 1747–1756;
Trauth, B. C. et al. (1989) Science 245, 301–305; Itoh, N. et al. (1991)
Cell 66, 233–239
und Greenblatt, M. S. et al. (1992) Blood 80, 1339–1344).
Jedoch ist keines dieser apoptotischen Moleküle auf die T-Zell-Linie begrenzt,
noch induzieren sie Apoptose in einer Antigen-spezifischen Weise.
Die Fähigkeit,
T-Zellen auf dem Wege der Clonierung in einer Weise zu deletieren,
die von antigener Stimulation abhängig ist, würde ein Mittel zur Langzeit-Hemmung
von T-Zell-Antworten
bei einer Reihe von klinischen Situationen bereitstellen, ohne dass
eine chronische generelle Immunsuppression mit den von ihr verursachten
zerstörerischen
Nebenwirkungen bei einem Lebewesen notwendig wäre.
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Diese
Erfindung basiert, zumindestens zum Teil, auf der Entdeckung eines
in vitro-Verfahrens
zur Hemmung von T-Zell-Proliferation oder Interleukin-2(IL-2)-Akkumulation und
zur Induktion eines CTLA-4 assoziierten apoptotischen Signals durch
eine aktivierte T-Zelle, das das Inkontaktbringen einer Population
von Zellen, die die aktivierte T-Zelle enthält, mit einem Agens umfasst,
das ein Epitop auf einem CTLA-4-Molekül bindet, welches sich von
einer B7-1- oder B7-2-Bindungsstelle auf CTLA-4 unterscheidet, wobei
das Epitop die Aminosäuresequenz
(Xaa)n-Leu-Thr-Phe-Leu-Asp-Asp-(Xaa)n (SEQ
ID NO. 33) umfasst, worin (Xaa)n eine beliebige
Aminosäure
und n = 0–20
ist, wobei dieses Agens ein CTLA-4 assoziiertes Signal in der aktivierten T-Zelle
in der Weise stimuliert, dass T-Zell-Proliferation oder IL-2-Akkumulation durch
die aktivierte T-Zelle gehemmt und Apoptose in der aktivierten T-Zelle
induziert wird.
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Darüber hinaus
basiert die Erfindung auf der Verwendung eines Agens, das, wie vorstehend
genannt, definiert ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur
Stimulation eines CTLA-4 assoziierten apoptotischen Signals in einer
aktivierten T-Zelle eines Lebewesens in der Weise, dass Apoptose
in der aktivierten T-Zelle induziert wird.
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Bevorzugt
ist das Agens ein Antikörper
oder Fragment eines Antikörpers,
der das T-Zell-Oberflächenmolekül CTLA-4,
besonders menschliches CTLA-4 bindet. Diese anti-CTLA-4-Antikörper binden
ein Epitop auf CTLA-4, das sich von dem (den) Epitop(en) unterscheidet,
die von den bekannten CTLA-4-Liganden B7-1 und B7-2 erkannt werden,
zur Antigen-spezifischen T-Zell-Apoptose. Die Antikörper können polyclonale
oder monoclonale Antikörper
oder Fragmente hiervon sein. Chimäre und humanisierte monoclonale
Antikörper
und Fragmente hiervon werden von der Erfindung eingeschlossen. In
einer anderen Ausführungsform
besteht das Agens aus einer löslichen
Form eines natürlichen
CTLA-4-Liganden, exprimiert auf einer B-Lymphoblastoid-Zelle, die sich von B7-1
und B7-2 unterscheidet und T-Zell-Apoptose induzieren kann.
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Die
vorliegende Erfindung verwendet Agenzien, die ein Epitop auf CTLA-4
binden, das sich von einem Epitop unterscheidet, das von den bekannten
B7-1- und B7-2-Liganden
gebundenen wird, und die Apoptose in einer T-Zelle induzieren. Das
CTLA-4-Epitop, das von dem Agens, z. B. einem Antikörper erkannt
wird, umschließt
eine Aminosäuresequenz:
(Xaa)n-Leu-Thr-Phe-Leu-Asp-Asp-(Xaa)n (SEQ
ID NO.: 33)
worin Xaa eine beliebige Aminosäure und n = 0–20, bevorzugt
0–5, mehr
bevorzugt 0–3
ist. Dieses CTLA-4-Epitop wird in menschlichem CTLA-4 an den Aminosäurepositionen
59 bis 64 angetroffen. Daher sind Xaa typischerweise zusätzliche
Aminosäurereste,
die entweder an der Amino- oder Carboxyseite oder sowohl an den
Amino- als auch an den Carboxyseiten des Epitops in der CTLA-4-Aminosäuresequenz
des Menschen (SEQ ID NO.: 36) angetroffen werden. Alternativ kann
Xaa ein Aminosäurerest
sein, der die Löslichkeit
des resultierenden Peptids erhöht
oder die Immunogenität
des resultierenden Peptids bei der Verwendung als ein Immunogen
verstärkt.
Zum Beispiel kann Xaa eine geladene Aminosäure sein (z. B. Lysin, Arginin),
die angefügt
werden kann, um die Löslichkeit
des Peptids zu erhöhen.
Alternativ kann Xaa aus Cysteinmolekülen bestehen, hinzugefügt, um die
Dimerisierung des resultierenden Peptids zu erhöhen.
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Die
vorstehend definierten Agenzien können, wenn sie mit einem pharmazeutisch
verträglichen
Trägerstoff
kombiniert werden, in Zusammensetzungen verwendet werden, die zur
pharmazeutischen Verabreichung geeignet sind.
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Die
vorstehend definierten Agenzien sind hilfreich bei der clonalen
Deletion von aktivierten T-Zellen in einer Antigen-spezifischen
Weise, entweder in vitro oder in vivo, durch Induktion von T-Zell-Apoptose.
In einer Ausführungsform
wird eine aktivierte T-Zelle in vitro mit einem ersten Agens in
Kontakt gebracht, das die T-Zelle durch den TCR/CD3-Komplex stimuliert,
und dann mit einem zweiten Agens, dem vorstehend genannten Agens,
das ein Epitop auf CTLA-4 querverknüpft und Apoptose in der T-Zelle
induziert. Alternativ wird das zweite Agens einem Lebewesen zusammen
mit einem pharmazeutisch verträglichen
Trägerstoff
verabreicht, um T-Zell-Apoptose in vivo in dem Lebewesen zu induzieren.
Ein bevorzugtes zweites Agens ist ein anti-CTLA-4-Antikörper der
Erfindung. Zusätzlich
zur Induktion der Apoptose durch einen CTLA-4-vermittelten Weg können einem
Lebewesen ein oder mehrere weitere Agenzien verabreicht werden,
um die Aussendung von stimulierenden Signalen an eine T-Zelle zu
hemmen. Zum Beispiel kann ein Agens, das die Produktion oder Funktion
eines oder mehrerer Wachstumsfaktoren von T-Zellen in einem Lebewesen
hemmt, wie etwa ein anti-IL-2-Rezeptor-Antikörper, ein
anti-IL-2-Antikörper
oder Cyclosporin A, einem Lebewesen ebenfalls verabreicht werden.
Alternativ oder zusätzlich
kann auch ein anderes Agens, das die Aussendung eines costimulativen
Signals an die T-Zelle hemmt, wie etwa ein Molekül (z. B. Antikörper oder
lösliches
Fusionsprotein), das eine Wechselwirkung zwischen CD28 und B7-1
und/oder B7-2 hemmt, in Verbindung mit einem Agens, das T-Zell-Apoptose
induziert, verabreicht werden.
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Clonale
Deletion von T-Zellen durch Induktion von Apoptose in Übereinstimmung
mit den hierin beschriebenen Verfahren ist bei einer Reihe klinischer
Situationen anwendbar. Zum Beispiel können alloreaktive T-Zellen
eines Transplantatempfängers
deletiert werden, um Abstoßung
der transplantierten Zellen, Gewebe oder Organe zu verhindern. Zusätzlich können alloreaktive
T-Zellen von Knochenmarkspendern vor der Knochenmarktransplantation
deletiert werden, um eine Graft-versus-host-Erkrankung in einem
Transplantatempfänger
zu vermeiden.
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Bei
anderen Anwendungen werden autoreaktive T-Zellen deletiert, um Autoimmunkrankheiten
zu behandeln, und Allergen-spezifische T-Zellen werden deletiert,
um Allergien zu behandeln. Virus-infizierte oder maligne T-Zellen,
die CTLA-4 an ihrer Oberfläche
exprimieren, können
mit den Verfahren der Erfindung ebenfalls eliminiert werden.
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1A ist eine grafische Darstellung von T-Zell-Antworten
(Proliferation, IL-2-Produktion
oder Apoptose) von aktivierten DR7-spezifischen T-Zell-Clonen bei
wiederholtem Kontakt mit dem Antigen (t-DR7) und der angezeigten
zweiten Signale, wodurch die Induktion von Apoptose durch einen
monoclonalen anti-CTLA-4-Antikörper (mAb)
dargestellt wird.
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1B ist eine grafische Darstellung von T-Zell-Antworten
(Proliferation, IL-2-Produktion
oder Apoptose) von normalen peripheren CD4+ T-Zellblasten
aus dem Blut auf wiederholten Kontakt mit anti-CD3 und der angezeigten
zweiten Signale, wodurch die Induktion von Apoptose durch einen
anti-CTLA-4-mAb dargestellt wird.
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2A ist eine grafische Darstellung von T-Zell-Antworten
(Proliferation, IL-2-Produktion
oder Apoptose) von aktivierten DR7-spezifischen T-Zell-Clonen auf
wiederholten Kontakt mit Zellen, die Antigen allein (t-DR7) exprimieren,
oder Zellen, die sowohl Antigen als auch entweder B7-1 (tDR7/B7-1)
oder B7-2 (tDR7/b7-2) exprimieren, wodurch gezeigt wird, dass weder
B7-1 noch B7-2 Antigen-spezifische Apoptose induziert.
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2B ist eine grafische Darstellung von T-Zell-Antworten
(Proliferation, IL-2-Produktion
oder Apoptose) von aktivierten DR7-spezifischen T-Zell-Clonen auf
wiederholten Kontakt mit den angezeigten Zellen zusammen mit den
angezeigten mAbs oder Fusionsproteinen, wodurch gezeigt wird, dass
Antigen-spezifische Apoptose durch einen nicht-B7-1-, nicht B7-2-CTLA-4-Bindungsliganden
induziert wird.
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Die
vorliegende Erfindung basiert, wenigstens zum Teil, auf der Entdeckung,
dass Querverknüpfung eines
T-Zell-Oberflächenmoleküls wie etwa
CTLA-4 auf einer aktivierten T-Zelle zusammen mit der Aussendung
eines Signals an die aktivierte T-Zelle durch den TCR/CD3-Komplex Apoptose
in der T-Zelle induziert. Wenn ein Antigen verwendet wird, um das
Signal durch den TCR/CD3-Komplex zu senden, ist das Ergebnis eine
Antigen-spezifische Apoptose. Demzufolge liefert die Erfindung ein
Mittel, um aktivierte T-Zellen auf clonalem Weg in einer Antigen-spezifischen
Weise zu deletieren.
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Ein
Aspekt der Erfindung liefert ein in vitro-Verfahren zur Hemmung
von T-Zell-Proliferation
oder Interleukin-2(IL-2)-Akkumulation durch eine aktivierte T-Zelle,
die das Inkontaktbringen einer Population von Zellen, die die aktivierte
T-Zelle enthält,
mit einem Agens umfasst, das ein Epitop auf einem CTLA-4-Molekül bindet, das
sich von einer B7-1- oder B7-2-Bindungsstelle auf CTLA-4 unterscheidet,
wobei das Epitop die Aminosäuresequenz
(Xaa)n-Leu-Thr-Phe-Leu-Asp-Asp-(Xaa)n (SEQ ID NO.: 33) umfasst, worin Xaan eine beliebige Aminosäure und n = 0–20 ist,
und wobei dieses Agens ein CTLA-4 assoziiertes Signal in der aktivierten
T-Zelle stimuliert, sodass T-Zell-Proliferation oder IL-2-Akkumulation
durch die aktivierte T-Zelle gehemmt wird.
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Wie
hier verwendet, ist „Agens" ein Molekül, das spezifische
Reaktivität
für ein
Zielmolekül
aufweist (d. h. dieses spezifisch erkennt und bindet). Das in dieser
Erfindung verwendete Agens bindet ein T-Zell-spezifisches Oberflächenmolekül, um ein
apoptotisches Signal in der T-Zelle hervorzurufen. Ein Oberflächenmolekül, das „T-Zell-spezifisch" ist, wird im Vergleich
zu anderen Zelltypen ausschließlich
oder bevorzugt (d. h. überwiegend)
auf T-Lymphocyten exprimiert. Ein bevorzugtes T-Zell-Oberflächenmolekül, an das
ein in der Erfindung verwendetes Agens bindet, ist CTLA-4. In einer
Ausführungsform
bezeichnet CTLA-4 ein menschliches Protein, das eine Aminosäuresequenz,
wie in SEQ ID NO.: 36 dargestellt, aufweist (vgl. auch Harper, K. et
al. (1991) J. Immunol. 147, 1037–1044) und von einer cDNA codiert
wird, die eine Nucleotidsequenz, wie in SEQ ID NO.: 35 dargestellt,
aufweist (vgl. auch Dariavach, F. et al. (1988) Eur. J. Immunol.
18, 1901–1905).
In einer anderen Ausführungsform
bezeichnet CTLA-4 ein Homolog des menschlichen Proteins von einer
anderen Säugerart,
wie etwa CTLA-4 der Maus (eine cDNA, die CTLA-4 der Maus codiert,
wird von Brunet, J.-F. et al. (1987) Nature 328, 267–270 beschrieben).
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Zusätzlich ist
die Verwendung von Agenzien in der Erfindung eingeschlossen, die
Proteine binden, die eine strukturelle Ähnlichkeit zu CTLA-4 aufweisen
(z. B. eine homologe Aminosäuresequenz
aufweisen), T-zell-spezifische Expression zeigen und in der Lage
sind, Antigen-spezifische Apoptose in T-Zellen auszulösen.
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Die
in der Erfindung verwendeten Agenzien sind in der Lage, Apoptose
oder ein apoptotisches Signal in aktivierten T-Zellen in einer Antigen-spezifischen
Weise zu induzieren. Der Ausdruck „Apoptose" soll einen zellulären Prozess des programmierten
Zelltods beschreiben, der durch das Auftreten von Zellschrumpfung, Kernkollaps
und, besonders typisch, zelluläre
DNA-Fragmentierung gekennzeichnet ist. „Antigen-spezifische" Apoptose soll bedeuten,
dass Apoptose innerhalb einer Population von T-Zellen nur in jenen
T-Zellen auftritt, die Spezifität
für ein
bestimmtes Antigen wie etwa ein Alloantigen oder ein Autoantigen
aufweisen. Antigen-spezifische Apoptose wird durch Stimulierung
einer aktivieren T-Zelle sowohl mit einem Antigen als auch mit einem
CTLA-4-Liganden der Erfindung erreicht. Alternativ kann eine nicht-Antigen-spezifische
(d. h. polyclonale) Apoptose erreicht werden, indem ein nicht-Antigen-spezifisches
Signal durch den TCR/CD3-Komplex an
die T-Zelle ausgesendet wird, z. B. mit einem anti-CD3-Antikörper zusammen
mit einem CTLA-4-Liganden der Erfindung. Apoptose wird in einer „aktivierten" T-Zelle induziert,
die CTLA-4 auf ihrer Oberfläche
exprimiert. Eine T-Zelle
kann aktiviert werden, CTLA-4 in einer Antigen-spezifischen Weise
zu exprimieren, z. B. durch Stimulation der T-Zelle mit einem Antigen
zusammen mit einem costimulatorischen Signal (z. B. Signalisierung durch
den CD28-Weg). Alternativ können
T-Zellen polyclonal aktiviert werden, zum Beispiel durch Kultivierung mit
einem Mitogen wie etwa Phytohämagglutinin
(PHA) oder einen Phorbolester wie etwa Phorbolmyristinacetat (PMA).
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist ein in der Erfindung verwendetes Agens ein Antikörper, der CTLA-4
bindet (hierin auch als ein anti-CTLA-4 Antikörper bezeichnet). Der hierin
verwendete Ausdruck „Antikörper" bezeichnet Immunglobulinmoleküle und immunologisch
aktive Teile der Immunglobulinmoleküle, d. h. Moleküle, die
eine Antigen-Bindungsstelle enthalten, die spezifisch ein Antigen
wie etwa CTLA-4 bindet (mit diesem immunreagiert). Strukturell besteht
der einfachste natürlich
vorkommende Antikörper
(z. B. IgG) aus vier Polypeptidketten, zwei schweren (H) Ketten
und zwei leichten (L) Ketten, die über Disulfidbrücken miteinander
verbunden sind. Es ist gezeigt worden, dass die Antigen-Bindungsfunktion
eines Antikörpers
durch Fragmente eines natürlich
vorkommenden Antikörpers
ausgeführt
werden kann. Daher sollen diese Antigen-Bindungsfragmente ebenfalls
in den Ausdruck „Antikörper" eingeschlossen sein.
Beispiele, die in den Ausdruck Antikörper eingeschlossen sind, umschließen (i)
ein Fab-Fragment, das aus den Domänen VL, VH, CL und CH1 besteht;
(ii) ein Fd-Fragment, das aus den Domänen VH und CH1 besteht; (iii)
ein Fv-Fragment, das aus den Domänen
VL und VH eines einzelnen Arms eines Antikörpers besteht, (iv) ein dAb-Fragment
(Ward et al. (1989) Nature 341, 544–546), das aus einer VH-Domäne besteht;
(v) eine isolierte komplementäre
Determinierungsregion (CDR) und (vi) ein F(ab')2-Fragment,
ein bivalentes Fragment, das zwei Fab-Fragmente umfasst, die durch
eine Disulfidbrücke
an der Gelenkregion verbunden sind. Obwohl die beiden Domänen des Fv-Fragments
von zwei getrennten Genen codiert werden, kann darüber hinaus
ein synthetischer Linker durch rekombinante Verfahren hergestellt
werden, die es ermöglicht,
sie als eine einzelne Proteinkette herzustellen (bekannt als Einzelketten-Fv (scFv); Bird et
al. (1988) Science 242, 423–426
und Huston et al. (1988) PNAS 85, 5879–5883). Solche Einzelketten-Antikörper sind
ebenfalls in dem Ausdruck „Antikörper" eingeschlossen. Bevorzugte
Antikörperfragmente
zur Induzierung von Apoptose sind jene, die in der Lage sind, ihr
Ziel-Antigen querzuverknüpfen,
z. B. bivalente Fragmente wie etwa F(ab')2-Fragmente.
Alternativ kann ein Antikörperfragment,
das selbst nicht sein Ziel-Antigen querverknüpft (z. B. ein Fab-Fragment), in Verbindung
mit einem sekundären
Antikörper
verwendet werden, der dazu dient, das Antikörperfragment querzuverknüpfen, wodurch das
Ziel-Antigen querverknüpft
wird. Zusätzlich
kann ein nicht querverknüpfendes
Antikörperfragment
(z. B. ein Fab-Fragment) verwendet werden, um Apoptose zu blockieren
oder zu hemmen, wie nachstehend beschrieben. Antikörper können, wie
hierin beschrieben, unter Verwendung herkömmlicher Techniken fragmentiert
werden, und die Fragmente können
in gleicher Weise auf ihre Nützlichkeit
durchmustert werden, wie für ganze
Antikörper
beschrieben. Ein Antikörper
der Erfindung soll darüber
hinaus bispezifische und chimäre
Moleküle,
die einen CTLA-4-Bindungsabschnitt haben, einschließen.
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Der
Ausdruck „eine
erwünschte
Bindungsspezifität
für ein
CTLA-4-Epitop",
ebenso wie der allgemeinere Ausdruck „eine Antigen-Bindungsstelle,
die spezifisch bindet (immunreagiert mit)", betrifft die Fähigkeit von individuellen Antikörpern, spezifisch
mit einem Oberflächenmolekül der T-Zelle,
z. B. CTLA-4, eine Immunreaktion einzugehen. Das heißt, er betrifft
eine nicht zufällige
Bindungsreaktion zwischen einem Antikörpermolekül und einer antigenen Determinate
von CTLA-4. Die erwünschte
Bindungsspezifität
wird typischerweise vom Referenzpunkt der Fähigkeit des Antikörpers bestimmt,
differentiell ein CTLA-4-Antigen und ein nicht verwandtes Antigen
zu binden und damit zwischen zwei unterschiedlichen Antigenen zu
unterscheiden, besonders in dem Fall, dass die beiden Antigene einmalige
Epitope aufweisen. Ein Antikörper,
der spezifisch an ein CTLA-4-Epitop bindet, wird als „spezifischer
Antikörper" bezeichnet.
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Der
hierin verwendete Ausdruck „Antikörper-Kombinationsstelle" bezeichnet den strukturellen
Abschnitt eines Antikörpermoleküls, der
variable und hypervariable Regionen einer schweren und leichten
Kette umfasst und spezifisch Antigen bindet (mit diesem immunreagiert).
Der Ausdruck „immunreagieren" oder „ist reaktiv
mit" in seinen verschiedenen
Formen wird hierin verwendet, um die Bindung zwischen einem antigenen,
eine Determinante enthaltenden Molekül und einem Molekül, das eine
Antikörper-Kombinationsstelle
enthält,
wie etwa ein vollständiges
Antikörpermolekül oder ein
Abschnitt hiervon zu bezeichnen.
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Der
hierin verwendete Ausdruck „Epitop" bezeichnet den genauen
strukturellen Abschnitt des Antigens, der immunologisch durch die
Antikörper-Kombinationsstelle
gebunden wird. Der Ausdruck wird auch austauschbar mit dem Ausdruck „antigene
Determinante" verwendet.
Das in der Erfindung verwendete Agens, z. B. ein Antikörper, bindet
an ein Epitop von CTLA-4, das von dem(n) Epitop(en), das (die) von
B7-1 oder B7-2 gebunden werden, verschieden ist (d. h. sich von
diesen unterscheidet). Das heißt,
der CTLA-4-Ligand bindet an eine Stelle von CTLA-4, die von der
B7-1- oder B7-2-Bindungsstelle von CTLA-4 verschieden ist. Die Bindung
eines CTLA-4-Liganden an ein CTLA-4-Epitop, das von der B7-1- oder
B7-2-Bindungsstelle
verschieden ist, wird durch die Unfähigkeit des Liganden angezeigt,
die Bindung von B7-1 oder B7-2 an CTLA-4 zu verhindern oder anders
herum (d. h. die Unfähigkeit
von B7-1 oder B7-2, die Bindung des CTLA-4-Liganden an CTLA-4 zu
verhindern). Dies kann zum Beispiel mit Hilfe der Verwendung einer
enzymverbundenen Immunadsorptionsuntersuchung (ELISA) und löslichen
B7-1-, B7-2- und
CTLA-4-Fusionsproteinen, wie in Beispiel 2 beschrieben, untersucht
werden. Bevorzugt wird ein Fab-Fragment verwendet, um die Fähigkeit
eines Antikörpers
zu untersuchen, die Bindung von B7-1 oder B7-2 an CTLA-4 zu hemmen,
um nicht spezifische Hemmung aufgrund von sterischen Gründen zu
reduzieren.
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Das
menschliche CTLA-4-Epitop, an das ein in der Erfindung verwendetes
CTLA-4-Agens bindet,
umschließt
eine Aminosäuresequenz:
(Xaa)n-Leu-Thr-Phe-Leu-Asp-Asp-(Xaa)n (SEQ
ID NO.: 33),
worin Xaa eine beliebige Aminosäure und
n = 0–20,
mehr bevorzugt 0–10,
noch mehr bevorzugt 0–5,
am meisten bevorzugt 0–3
ist. In natürlichem
menschlichen CTLA-4 liegt diese Sequenz in der extrazellulären Domäne in der
Komplementarität
bestimmenden Region 2(CDR2)-ähnlichen
Region an den Aminosäurepositionen
59 bis 64 der SEQ ID NO.: 36. Xaa sind daher typischerweise zusätzliche
Aminosäurereste,
die entweder an der Amino- oder an der Carboxyseite oder sowohl
an der Amino- als auch an der Carboxyseite des Kernepitops im menschlichen
CTLA-4 (dessen Aminosäuresequenz
in SEQ ID NO.: 36 in voller Länge
dargestellt ist) angetroffen werden. Fachleuten auf dem Gebiet wird
klar sein, dass in dem natürlichen
Protein zusätzliche
nicht benachbarte Aminosäurereste
ebenfalls zur Konformation des Epitops, das vom Antikörper erkannt
wird, beitragen können.
Synthetische Peptide können
hergestellt werden, die das Epitop umschließen, das andere Aminosäurereste,
als die sechs, die der Kern flankieren, umschließt (d. h. Xaa kann alternativ
aus anderen Aminosäureresten
als aus jenen bestehen, die im natürlichen CTLA-4-Protein gefunden
werden). Diese flankierenden Aminosäuren können bewirken, dass sich die
Eigenschaften das resultierenden Peptids verändern, zum Beispiel dass die
Löslichkeit
ansteigt, die Immunogenität
verstärkt
wird oder die Dimerisation des resultierenden Peptids unterstützt wird.
Wenn das Peptid als ein Immunogen verwendet werden soll, können eine oder
mehrere geladene Aminosäuren
(z. B. Lysin, Arginin) eingeschlossen werden, um die Löslichkeit
des Peptids zu erhöhen
und/oder die Immunogenität
des Peptids zu verstärken.
Alternativ können
Cysteinreste eingeschlossen werden, um die Dimerisation des resultierenden
Peptids zu erhöhen.
-
Diese
und andere Ausführungsformen
der Erfindung werden in weiteren Einzelheiten im den nachstehenden
Abschnitten beschrieben:
-
1. CTLA-4 und anti-CTLA-4-Antikörper
-
Das
CTLA-4-Antigen ist ein Mitglied aus einer Familie von Oberflächenmolekülen von
T-Zellen, das costimulatorische Moleküle binden kann, die an der
Oberfläche
von B-Lymphocyten, professionellen Antigen präsentierenden Zellen (z. B.
Monocyten, dendritische Zellen, Langerhans-Zellen) und anderen Zellen
(z. B. Keratinocyten, Endothelzellen, Astrocyten, Fibroblasten,
Oligodendrocyten) angetroffen werden, die den Immunzellen Antigen
präsentieren.
Ein anderes Mitglied dieser Familie ist das T-Zell-Oberflächenmolekül CD28, das
31% der gesamten Aminosäureidentität mit CTLA-4
teilt (Harper, K. et al. (1991) J. Immunol. 147, 1037–1044).
Die CD28- und CTLA-4-Moleküle
binden beide costimulatorische Moleküle wie etwa B7-1 und B7-2.
Die Beobachtung jedoch, dass ein anti-CD28 Fab-Fragment T-Zell Antworten auf Costimulation
sowohl durch B7-1 als auch durch B7-2 vollständig hemmt, unterstützt die
Hypothese, dass Costimulation durch die B7-Familie überwiegend über CD28 vermittelt wird (vgl.
Gimmi, C. D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6575–6579 und
Freeman, G. J. et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 2185–2192).
Im Gegensatz dazu ist nun entdeckt worden, dass T-Zell-Apoptose über CTLA-4
durch Wechselwirkung mit einem neuartigen CTLA-4-Liganden vermittelt
werden kann.
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Das
CTLA-4-Molekül
wird nicht auf ruhenden T-Zellen exprimiert, wird aber durch Aktivierung
induziert. Zum Beispiel wird CTLA-4-mRNA nach Stimulation normaler,
ruhender menschlicher T-Zellen mit PHA oder PMA über 24 Stunden in den beiden
Untersätzen
CD4+ und CD8+ exprimiert
(vgl. Freeman, G. J. et al. (1992) J. Immunol. 149, 3795–3801).
Darüber
hinaus wurde CTLA-4-Expression bei HTLV-I- und HIV infizierten T-Zelllinien
beobachtet (vgl. Freeman, G. J. et al. (1992) J. Immunol. 149, 3795–3801; Haffar,
O. K. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11094–11098).
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Techniken
zur Reinigung von T-Zell-Oberflächenmolekülen wie
etwa CTLA-4 sind entwickelt worden, und zusätzlich sind CTLA-4-Gene und
cDNA sowohl vom Menschen als auch von der Maus cloniert worden (vgl.
zum Beispiel Dariavach, F. et al. (1988) Eur. J. Immunol. 18, 1901–1905 und
Brunet, J.-F. et al. (1987) Nature 328, 267–270). Die Nucleotidsequenz
und abgeleitete Aminosäuresequenz
des menschlichen CTLA-4 werden in SEQ ID NO.: 35 beziehungsweise
36 dargestellt. Ein CTLA-4-Protein oder Peptid hieraus kann durch
Reinigung des natürlichen
Proteins oder durch rekombinante Expression erhalten werden. Eine
modifizierte rekombinante Form von CTLA-4 wie etwa eine extrazelluläre CTLA-4-Domäne kann
exprimiert werden, indem eine CTLA-4 codierende DNA in einen Expressionsvektor
eingefügt
und der Vektor in eine Wirtszelle, entweder eine prokaryontische
oder eine eukaryontische Zelle, überführt wird.
Zum Beispiel kann eine extrazelluläre CTLA-4-Domäne
oder ein Peptid hiervon in Bakterienzellen wie etwa E. coli, Insektenzellen
(z. B. unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystems), Hefe
oder Säugerzellen
wie etwa Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO), COS- oder NS0-Zellen
exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen und Expressionsvektoren
können
bei Goeddel, (1990) vorstehend, nachgeschlagen werden oder sind
Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Beispiele für Vektoren zur Expression in
der Hefe S. cerivisae umschließen
pYepSec1 (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6, 229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz
(1982) Cell 30, 933–943),
pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54, 113–123) und pYES2 (Invitrogen
Corporation, San Diego, CA). Baculovirus-Vektoren, verfügbar zur
Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (SF 9-Zellen),
umschließen die
pAc-Serien (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3, 2156–2165) und
die pVL-Serien (Lucklow, V. A. und Summers, M. D. (1989) Virology
170, 31–39).
Allgemein werden COS-Zellen (Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175–182) in
Verbindung mit solchen Vektoren wie pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature
329, 840) zur vorübergehenden
Ampifikation/Expression in Säugerzellen
verwendet, während
CHO-(dhfr– Chinese
Hamster Ovary, Ovarien des chinesischen Hamsters)Zellen mit Vektoren
wie etwa pMT2PC (Kaufmann et al. (1987) EMBO J. 6, 187–195) zur
stabilen Amplifikation/Expression in Säugerzellen verwendet werden.
Rekombinante Proteine können
in der NS0-Myelom-Zelllinie (erhältlich
bei der ECACC; Katalog #85110503) hergestellt werden, wie von Galfre, G.
und Milstein, C. (1981) Methods in Enzymology 73 (13), 3–46 und
Preparation of Monoclonal Antibodies: Strategies and Procedures,
Academic Press, N. Y., N. Y.) beschrieben.
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Alternativ
kann ein rekombinanter extrazellulärer Abschnitt von CTLA-4 in
Bakterienzellen wie etwa E. coli exprimiert werden. Bevorzugte E.
coli-Expressionssysteme
umschließen
die induzierbaren Expressionsvektoren pTrc (Amann et al. (1988)
Gene 69, 301–315)
und den pET 11 (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods
in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990)
60–89;
käuflich
zu erwerben bei Novagen). In dem pTrc-Vektorsystem wird das inserierte Gen
mit einer pelB-Signalsequenz durch Transkription mit RNA-Polymerase
des Wirtes von einem trp-lac-Hybrid-Fusionspromotor exprimiert. Nach der Induktion
kann rekombinantes CTLA-4 aus der periplasmatischen Fraktion gereinigt
werden. In dem pET 11-Vektorsystem wird das Zielgen als nicht-Fusionsprotein
durch Transkription von T7 gn10-lac-0-Fusionspromotor, vermittelt durch eine
coexprimierte virale RNA-Polymerase (T7 gn1), exprimiert. Diese
virale Polymerase wird von den E. coli-Wirtsstämmen BL21(DE3) oder HMS174(DE3)
von einem innewohnenden λ-Prophagen,
der T7 gn1 unter der transkriptionalen Kontrolle des lacUV 5-Promotors
beherbergt, bereitgestellt. In diesem System kann rekombinantes
CTLA-4 aus Einschlusskörpern
in einer denaturierten Form gereinigt werden und, falls erwünscht, durch
Stufengradientdialyse renaturiert werden, um denaturierende Substanzen
zu entfernen. Die Expression der extrazellulären Domäne von menschlichem CTLA-4
in E. coli wird genauer in Beispiel 6 beschrieben.
-
Eine
rekombinante Zelloberflächenform
von CTLA-4 kann durch Modifikation des transmembranen und/oder cytoplasmatischen
Abschnittes des Proteins auf einer Säugerzelle exprimiert werden
(die natürliche Form
des Proteins in voller Länge
wird auf der Oberfläche
vieler Säugerzellen
nicht wirksam exprimiert). Zum Beispiel können die transmembranen und
cytoplasmatischen Domänen
durch eine alternative Struktur ersetzt werden, um das Molekül an der
Zelloberfläche
zu befestigen, etwa durch einen Glycophosphatidylinosit-(gpi)Anker
(wie in Beispiel 1 beschrieben) oder einen Fettsäureanker. Alternativ kann Expression
von CTLA-4 an der Zelloberfläche
erreicht werden, indem eine heterologe Transmembran-Domäne verwendet
wird oder durch Entfernung der cytoplasmatischen Domäne. CTLA-4
kann in Säugerzellen
auch als ein lösliches Fusionsprotein
exprimiert werden (z. B. ein Immunglobulin-Fusionsprotein), wie
von Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med. 174, 561–569) beschrieben
wurde.
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Zur
Expression in Säugerzellen
wird Vektor-DNA mit Hilfe von herkömmlichen Techniken wie etwa
der Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Co-Fällung, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektin
oder Elektroporation in Säugerzellen
eingebracht. Geeignete Verfahren zur Transformation von Wirtszellen
können bei
Sambrook et al. (Molekular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) und in anderen Laborhandbüchern nachgeschlagen
werden. Bei der Verwendung in Säugerzellen
werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors oft durch genetisches
Material von Viren bereitgestellt. Zum Beispiel stammen gewöhnlich verwendete
Promotoren vom Polyoma-, Adenovirus 2, Cytomegalievirus und am häufigsten
vom Affenvirus 40.
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CTLA-4-Proteine
oder Peptide hiervon, exprimiert in Säugerzellen oder anderswo, können nach
Standardverfahren des Fachgebietes, einschließlich der Ammoniumsulfat-Fällung, fraktionierten
Säulenchromatographie
(z. B. Ionenaustausch, Gelfiltration, Elektrophorese, Affinitätschromatographie
etc.) und schließlich
der Kristallisation gereinigt werden (vgl. allgemein „Enzyme
Purification and Related Techniques" Methods in Enzymology 22, 233–577 (1971)).
-
Anti-CTLA-4-Antikörper können von
Fachleuten auf dem Gebiet mit Hilfe von Standardtechniken hergestellt
werden. Zum Beispiel können
CTLA-4-Moleküle
von einer Reihe von Arten, entweder in löslicher Form oder an Membran
gebunden, verwendet werden, um die Bildung von anti-CTLA-4-Antikörpern zu
induzieren. Solche Antikörper
können
entweder polyclonale oder monoclonale Antikörper oder Antigen bindende
Fragmente solcher Antikörper
sein. Von Bedeutung für
die therapeutischen Anwendungen der vorliegenden Erfindung sind
Antikörper,
die eine Querverknüpfung
mit einem Epitop auf CTLA-4 eingehen, das T-Zell-Apoptose induziert.
Die Erfindung umfasst sowohl Antikörper, die an menschliches CTLA-4
binden (z. B. ein menschlicher anti-CTLA-4-mAb, bevorzugt ein menschlicher
oder humanisierter mAb) als auch Antikörper, die an CTLA-4-Proteine
von anderen Arten binden, z. B. Affen, Rindern, Pferden, Ziegen,
Schafen, Hunden, Katzen, Ratten, Mäusen etc., die zu tiermedizinischen
Zwecken verwendet werden können.
Verfahren zur Herstellung von anti-CTLA-4-Antikörpern werden nachstehend genauer
beschrieben:
-
A. Das Immunogen
-
Der
Ausdruck „Immunogen" wird hierin verwendet,
um eine Zusammensetzung zu beschreiben, die ein CTLA-4-Peptid oder
Protein als einen aktiven Inhaltstoff enthält, der zur Herstellung von
Antikörpern
gegen CTLA-4 verwendet wird. Wenn ein CTLA-4-Peptid oder -Protein verwendet wird,
um Antikörper
zu induzieren, ist es klar, dass das Peptid allein oder verbunden
mit einem Trägerstoff
als ein Konjugat oder als ein Peptid-Polymer verwendet werden kann.
-
Um
geeignete anti-CTLA-4-Antikörper
zu erzeugen, sollte das Immunogen eine wirksame, immunogene Menge
eines CTLA-4-Peptids oder -Proteins enthalten, ggf. als ein Konjugat
an einen Trägerstoff
gebunden. Die wirksame Menge an Peptid pro Dosierungseinheit hängt, neben
anderen Dingen, von der geimpften Tierart, dem Körpergewicht des Tiers und dem
gewählten
Immunisierungsschema ab, was auf dem Fachgebiet gut bekannt ist.
Das Immunogenpräparat
wird typischerweise Peptidkonzentrationen von etwa 10 Mikrogramm bis
etwa 500 Milligramm pro Immunisierungsdosis enthalten, bevorzugt
etwa 50 Mikrogramm bis etwa 50 Milligramm pro Dosis. Eine Immunisierungspräparat kann
auch einen Hilfsstoff als Teil der Verdünnungslösung einschließen. Hilfsstoffe
wie etwa vollständiges
Freudsches Adjuvans (CFA), unvollständiges Freudsches Adjuvans
(IFA) und Alaun sind auf dem Fachgebiet gut bekannte Materialien,
und sie sind über
mehrere Quellen zu beziehen.
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Fachleute
auf dem Gebiet werden wissen, dass statt der Verwendung von natürlich vorkommenden Formen
von CTLA-4 zur Immunisierung alternativ synthetische Peptide eingesetzt
werden können,
gegen die Antikörper
zur Verwendung in dieser Erfindung erzeugt werden können. Sowohl
lösliche
als auch an Membran gebundene CTLA-4-Protein- oder -Peptidfragmente
sind für
die Verwendung als ein Immunogen geeignet und können gleichfalls auch durch
Immunaffinitätsreinigung
isoliert werden. Eine gereinigte Form des CTLA-4-Proteins, das,
wie vorstehend beschrieben, oder auf in dem Fachgebiet bekannte
Weise isoliert worden sein kann, kann selbst direkt als ein Immunogen
verwendet werden oder kann alternativ mit herkömmlichen Verfahren an ein geeignetes
Trägerprotein
gebunden sein, einschließlich
durch chemische Kopplungsmittel als auch durch Gentechnik, indem
ein cloniertes Gen des CTLA-4-Proteins verwendet wird. Das gereinigte
CTLA-4-Protein kann auch kovalent oder nicht kovalent mit nicht-Protein-Materialien
wie etwa Lipiden oder Kohlenhydraten modifiziert werden, um Immunogenität oder Löslichkeit
zu erhöhen.
Alternativ kann ein gereinigtes CTLA-4-Protein mit einem viralen
Partikel, einem replizierenden Virus oder anderen Mikroorganismen
gekoppelt oder in diese inkorporiert werden, um die Immunogenität zu verstärken. Das
CTLA-4-Protein kann zum Beispiel chemisch an das virale Partikel
oder den Mikroorganismus oder einen immunogenen Abschnitt davon
gebunden werden.
-
In
einer erläuternden
Ausführungsform
wird ein gereinigtes CTLA-4-Protein oder ein Peptidfragment hiervon
(z. B. hergestellt durch begrenzte Proteolyse oder rekombinante
DNA-Techniken) an einen Trägerstoff gebunden,
der in Tieren Immunogen ist. Bevorzugte Trägerstoffe umschließen Proteine
wie etwa Albumine, Serumproteine (z. B. Globuline und Lipoproteine)
und Polyaminosäuren.
Beispiele nützlicher
Proteine umschließen
Rinderserumalbumin, Kaninchenserumalbumin, Thyroglobulin, KLH „keyhole
limpet hemocyanin", Ei-Ovalbumin
und Rinder-Gammaglobuline.
Synthetische Polyaminosäuren
wie etwa Polylysin oder Polyarginin sind ebenfalls nützliche
Trägerstoffe.
Für die
kovalente Anbindung des CTLA-4-Proteins
oder -Peptidfragments an einen geeigneten immunogenen Trägerstoff
gibt es eine Reihe von chemischen querverknüpfenden Agenzien, die Fachleuten
auf dem Gebiet bekannt sind. Bevorzugte querverknüpfende Agenzien
sind heterobifunktionale querverknüpfende Substanzen, die verwendet
werden können, um
Proteine schrittweise zu verbinden. Eine breite Vielfalt von heterobifunktionalen
querverknüpfenden
Substanzen ist auf dem Fachgebiet bekannt, einschließlich Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat
(SMCC), m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester
(MBS); N-Succinimidyl(4-jodacetyl)aminobenzoat
(SIAB), Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat (SMPB), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid
(EDC); 4-Succinimidyloxycarbonyl-a-methyl-a-(2-pyridyldithio)-toluol
(SMPT), N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat
(SPDP), Succinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propionat]hexanoat (LC-SPDP).
-
Es
kann auch wünschenswert
sein, ein Tier einfach mit ganzen Zellen zu immunisieren, die ein
CTLA-4-Protein auf ihrer Oberfläche
exprimieren. Verschiedene Zelllinien können als Immunogene verwendet werden,
um monoclonale Antikörper
gegen ein CTLA-4-Antigen zu erzeugen, einschließlich, aber nicht hierauf begrenzt,
gegen aktivierte T-Zellen. Zum Beispiel können periphere Blutzellen,
die einem Lebewesen entnommen wurden, in vitro mit anti-CD3-Antikörpern, PHA
oder PMA aktiviert werden. Alternativ kann ein Antigen-spezifischer (z.
B. alloreaktiver) T-Zell-Clon aktiviert werden, CTLA-4 zu exprimieren,
indem der T-Zelle Antigen zusammen mit einem costimulatorischen
Signal präsentiert
wird. Ganze Zellen, die als Immunogene verwendet werden können, um
CTLA-4-spezifische Antikörper
zu erzeugen, umschließen
auch rekombinante Transfektanten. Zum Beispiel können COS- und CHO-Zellen durch
Transfizierung mit einer CTLA-4-gpi-cDNA verändert werden, wie in Beispiel
1 beschrieben, um Zellen zu produzieren, die CTLA-4 auf ihrer Oberfläche exprimieren.
Diese transfizierten Zellen können
dann als Immunogene verwendet werden, um anti-CTLA-4-Antikörper zu erzeugen. Andere Beispiele
von transfizierten Zellen sind bekannt, besonders eukaryontische
Zellen sind in der Lage, das CTLA-4-Protein zu glycosylieren, jedes
Verfahren jedoch, das in der Lage ist, transfizierte CTLA-4-Gene
auf der Zelloberfläche
zu exprimieren, könnte
verwendet werden, um das ganzzellige Immunogen zu erzeugen.
-
Alternativ
zu einer CTLA-4 exprimierenden Zelle oder einem isolierten CTLA-4-Protein können Peptidfragmente
von CTLA-4 als Immunogene verwendet werden, um anti-CTLA-4-Antikörper zu
erzeugen. In der vorliegenden Erfindung umfasst das CTLA-4-Epitop,
das vom Antikörper
gebunden wird, eine Aminosäuresequenz:
(Xaa)n-Leu-Thr-Phe-Leu-Asp-Asp-(Xaa)n (SEQ ID NO.: 33), worin Xaa eine beliebige
Aminosäure
und n = 0–20,
bevorzugt 0–10,
mehr bevorzugt 0–5,
am meisten bevorzugt 0–3
ist. Daher kann ein Peptid, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO.:
33 aufweist, als ein Immunogen verwendet werden.
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Zur
Verwendung als Immunogene können
Peptide modifiziert werden, um die Löslichkeit zu erhöhen und/oder
die Immunogenität
zu verstärken,
wie vorstehend beschrieben.
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Als
eine Alternative zur Verwendung eines Proteins oder Peptids als
Immunogen ist es möglich,
Nucleinsäure
(z. B. DNA), die das Protein oder Peptid codiert, als ein Immunogen
für die
so genannte genetische Immunisierung zu verwenden. Daher soll der
Ausdruck „Immunogen" auch Nucleinsäure einschließen, die
ein Protein oder Peptid codiert, gegen das Antikörper erzeugt werden sollen.
Um Antikörper
durch genetische Immunisierung zu erzeugen, wird eine Konstruktion
eines Expressionsvektors, der die Nucleinsäure enthält, die das interessierende
Protein (z. B. CTLA-4 oder ein Peptid hiervon) codiert, intrazellulär in die
Haut eines Tieres (z. B. Maus) eingebracht, indem Partikel (z. B.
Goldpartikel) mit der Konstruktion überzogen werden und diese Partikel
in die Haut injiziert werden. Dies führt zur Antigenproduktion in
der Haut und Entwicklung einer spezifischen Antikörper-Antwort
(vgl. z. B. Tang, D. C. et al. (1992) Nature 356, 152–154; Eisenbraun,
M. D. et al. (1993) DNA Cell Biol. 12, 791–797; Wang, B. et al. (1993)
DNA Cell Biol. 12, 799–805).
-
B. Polyclonale anti-CTLA-4-Antikörper
-
Polyclonale
Antikörper
gegen ein gereinigtes CTLA-4-Protein oder Peptidfragment hiervon
können
allgemein in Tieren durch mehrere subkutane (sc) oder intraperitoneale
(ip) Injektionen eines CTLA-4-Immunogens
wie etwa der extrazellulären
Domäne
des CTLA-4-Proteins und eines Hilfsstoffs erzeugt werden. Ein polyclonales
anti-CTLA-4-Antiserum kann zum Beispiel erzeugt werden, wie von
Lindsten, T. et al. (1993) J. Immunol. 151, 3489– 3499 beschrieben. In einer
erläuternden
Ausführungsform
werden Tiere typischerweise gegen das immunogene CTLA-4-Protein,
-Peptid oder -Derivat immunisiert, indem etwa 1 μg bis 1 mg Protein mit vollständigem Freundschen
Adjuvans kombiniert werden und die Lösung intradermal an mehreren
Stellen injiziert wird. Einen Monat später wird die Impfung der Tiere
mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen
Menge des Immunogens in vollständigem
Freundschen Adjuvans (oder einem anderen geeigneten Adjuvans) durch
subkutane Injektion an mehreren Stellen aufgefrischt. Sieben bis
14 Tage später
wird den Tieren Blut entnommen, und das Serum wird auf den anti-CTLA-4-Titer
untersucht (z. B. durch ELISA). Tiere werden wiederholt geimpft,
bis ihr Titer ein Plateau erreicht. Es können auch aggregierende Agenzien
wie etwa Alaun verwendet werden, um die Immunantwort zu verstärken.
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Solche
von Säugern
produzierten Populationen von Antikörpermolekülen werden als „polyclonal" bezeichnet, weil
die Population Antikörper
mit sich unterscheidenden Immunspezifitäten und Affinitäten für CTLA-4
umfasst. Die Antikörpermoleküle werden
dann aus dem Säuger
gewonnen (z. B. aus dem Blut) und mit Hilfe gut bekannter Techniken
wie etwa Protein A-Chromatographie isoliert, um die IgG-Fraktion zu erhalten. Um
die Spezifität
des Antikörpers
zu erhöhen,
können
die Antikörper
durch Immunaffinitätschromatographie unter
Verwendung eines Festphasen fixierten Immunogens gereinigt werden.
Der Antikörper
wird über
einen Zeitraum mit dem Festphasen fixierten Immunogen in Kontakt
gebracht, der ausreichend ist, dass das Immunogen mit den Antikörpermolekülen immunreagieren
kann, um einen Festphasen fixierten Immunkomplex zu bilden. Die
gebundenen Antikörper
werden mit Hilfe von Standardtechniken aus dem Komplex abgetrennt.
-
C. Monoclonale anti-CTLA-4-Antikörper
-
Der
hierin verwendete Ausdruck "monoclonaler
Antikörper" oder "monoclonale Antikörperzusammensetzung" bezeichnet eine
Population von Antikörpermolekülen, die
nur eine Form einer Antigen bindenden Stelle enthalten, die in der
Lage ist, mit einem bestimmten Epitop eines CTLA-4-Antigens eine
Immunreaktion einzugehen. Eine monoclonale Antikörperzusammensetzung zeigt daher
typischerweise eine alleinige Bindungsaffinität für ein bestimmtes CTLA-4-Protein,
mit dem sie eine Immunreaktion eingeht. Bevorzugt ist der monoclonale
Antikörper,
der in dem vorliegenden Verfahren verwendet wird, darüber hinaus
dadurch gekennzeichnet, dass er mit einem vom Menschen stammenden
CTLA-4 eine Immunreaktion eingeht.
-
Monoclonale
Antikörper
die für
die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung nützlich sind, sind
in der Weise auf ein Epitop eines CTLA-4-Antigens auf aktivierten
T-Zellen gerichtet, dass Komplexbildung zwischen dem Antikörper und
dem CTLA-4-Antigen (hierin auch als Ligation bezeichnet) Apoptose
in den aktivierten T-Zellen induziert. Ein monoclonaler Antikörper gegen
ein Epitop von CTLA-4 kann unter Verwendung einer Technik hergestellt
werden, die zur Produktion von Antikörpermolekülen Kulturen kontinuierlicher Zelllinien
verwendet. Diese umschließen,
sind aber nicht darauf begrenzt, die Hybridom-Technik, die ursprünglich von
Köhler
und Milstein (1975, Nature 256, 495–497) beschrieben wurde, und
die neuere Hybridom-Technik für
menschliche B-Zellen (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4, 72),
die EBV-Hybridom-Technik (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies
and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96) und Triom-Techniken. Andere
Verfahren, mit denen man wirksam monoclonale Antikörper erhalten
kann, die für
die vorliegende Erfindung nützlich
sind, umschließen
Phagen-Display-Techniken
(Marks et al. (1992) J. Biol. Chem. 16007–16010).
-
In
einer Ausführungsform
ist die Antikörperherstellung,
die in dem vorliegenden Verfahren verwendet wird, ein monoclonaler
Antikörper,
der durch eine Hybridom-Zelllinie
hergestellt wird. Hybridom-Fusionstechniken wurden zuerst von Köhler und
Milstein eingeführt
(Köhler
et al. Nature (1975) 256, 495–97;
Brown et al. (1981) J. Immunol. 127, 539–46; Brown et al. (1980) J.
Biol. Chem. 255, 4980–83;
Yeh et al. (1976) PNAS 76, 2927–31
und Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29, 269–75). Daher können die
monoclonalen Antikörperzusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung durch das folgende Verfahren hergestellt
werden, welches die nachstehenden Schritte umfasst:
- (a) Immunisierung eines Tieres mit einem CTLA-4-Protein oder
Peptid hiervon. Die Immunisierung wird typischerweise durchgeführt, indem
das CTLA-4-Immunogen an einen immunologisch gesunden Säuger in einer
immunologisch wirksamen Menge verabreicht wird, d. h. in einer Menge,
die ausreichend ist, um eine Immunantwort hervorzurufen. Bevorzugt
ist der Säuger
ein Nagetier wie etwa ein Kaninchen, eine Ratte oder Maus. Der Säuger wird
dann über
einen Zeitraum gehalten, der ausreichend ist, dass der Säuger Zellen
produzieren kann, die Antikörpermoleküle sekretieren,
die mit dem CTLA-4-Immunogen eine Immunreaktion eingehen. Eine solche
Immunreaktion wird nachgewiesen, indem die auf diese Weise produzierten Antikörpermoleküle auf Immunreaktivität mit einem
Präparat
des Immunogen-Proteins
durchmustert werden. Bei Bedarf kann es wünschenswert sein, die Antikörpermoleküle mit einem
Präparat
des Proteins in der Form zu durchmustern, in der es von den Antikörpermolekülen in einer
Untersuchung erkannt werden soll, z. B. einer Membran-gebundenen
Form von CTLA-4. Diese Durchmusterungsverfahren sind Fachleuten
auf dem Gebiet gut bekannt, z. B. enzymverbundene Immunabsorptionsuntersuchung
(ELISA) und/oder Durchflusscytometrie.
- (b) Dann wird eine Suspension von Antikörper produzierenden Zellen
hergestellt, die jedem einzelnen immunisierten Säuger entnommen werden und den
gewünschten
Antikörper
sekretieren. Nach einem ausreichenden Zeitraum wird die Maus getötet, und
somatische Antikörper
produzierende Lymphocyten werden entnommen. Antikörper produzierende
Zellen können
von den Lymphknoten, der Milz und aus dem peripheren Blut der behandelten
Tiere stammen. Milzzellen werden bevorzugt und können in einem physiologisch
verträglichen
Medium auf mechanischem Weg unter Verwendung von auf dem Fachgebiet
gut bekannten Verfahren in individuelle Zellen getrennt werden.
Lymphocyten der Maus ergeben einen höheren Prozentsatz an stabilen
Fusionen mit den nachstehend beschriebenen Maus-Myelomen. Somatische
Zellen von Ratte, Kaninchen und Frosch können ebenfalls verwendet werden.
Die Milzzell-Chromosomen, die die gewünschten Immunglobuline codieren,
werden durch Fusionierung der Milzzellen mit Myelomzellen unsterblich
gemacht, gewöhnlich
in Anwesenheit eines Fusionsagens wie etwa Polyethylenglycol (PEG). Jede
einer Reihe von Myelom-Zelllinien kann als Fusionspartner nach den
Standardtechniken verwendet werden; zum Beispiel die Myelom-Linien
P3-NS1/1-Ag4-1,
P3-x63-Ag8.653 oder Sp2/O-Ag14. Diese Myelom-Linien können von
der American Culture Collection (ATCC), Rockville, Md. bezogen werden.
-
Die
resultierenden Zellen, die die gewünschten Hybridom-Zellen einschließen, werden
dann in einem selektiven Medium wie etwa HAT-Medium gezüchtet, in
dem nicht fusionierte elterliche Myelomzellen oder Lymphocyten schließlich absterben.
Nur die Hybridom-Zellen überleben
und können
unter begrenzenden Verdünnungsbedingungen
gezüchtet
werden, um isolierte Clone zu erhalten. Die Überstände der Hybridome werden auf
die Anwesenheit von Antikörpern
mit der erwünschten
Spezifität
durchmustert, z. B. mit Hilfe von Immununtersuchungstechniken, die
das Antigen verwenden, das zur Immunisierung verwendet worden ist.
Positive Clone können
dann unter begrenzenden Verdünnungsbedingungen
subcloniert werden, und der produzierte monoclonale Antikörper kann
isoliert werden. Zahlreiche herkömmliche
Verfahren bestehen zur Isolierung und Reinigung der monoclonalen
Antikörper,
wie auch um sie von anderen Proteinen und Verunreinigungen zu befreien.
Gewöhnlich
verwendete Verfahren zur Reinigung monoclonaler Antikörper umschließen Ammoniumsulfat-Fällung, Ionenaustausch-Chromatographie und
Affinitätschromatographie
(vgl. z. B. Zola et al. in: Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques
And Applications, Hurell (Hrsg.) S. 51–52 (CRC Press 1982)). Die
nach diesen Verfahren erzeugten Hybridome können in vitro oder in vivo
(in Bauchwasser) unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten
Techniken gezüchtet
werden.
-
Allgemein
kann die individuelle Zelllinie in vitro gezüchtet werden, zum Beispiel
in Labor-Kulturgefäßen, und
das Kulturmedium, das hohe Konzentrationen eines einzelnen, spezifischen
monoclonalen Antikörpers
enthält,
kann durch Abgießen,
Filtern oder Zentrifugation geerntet werden. Alternativ kann die
Ausbeute an monoclonalem Antikörper
erhöht
werden, indem einem histokompatiblen Tier des verwendeten Typs eine Probe
des Hybridoms injiziert wird, um die somatischen und Myelomzellen
für die
ursprüngliche
Fusion bereitzustellen. Tumore, die den spezifischen monoclonalen
Antikörper
sekretieren, der von dem fusionierten Zellhybrid produziert wird,
entwickeln sich in dem injizierten Tier. Die Körperflüssigkeiten des Tieres wie etwa Bauchwasser
oder Serum liefern monoclonale Antikörper in hohen Konzentrationen.
Wenn menschliche Hybridome oder EBV-Hybridome verwendet werden,
ist es notwendig, Abstoßung
des Transplantates zu verhindern, das in Tiere wie Mäuse injiziert
worden ist. Immundefekte oder nackte Mäuse können verwendet werden, oder
das Hybridom kann zunächst
bestrahlte, nackte Mäuse
als ein solider, subkutaner Tumor durchlaufen, in vitro kultiviert
werden und dann intraperitoneal in mit Pristan sensibilisierten
bestrahlten, nackten Mäusen
injiziert werden, die Bauchwasser-Tumore entwickeln, welche große Mengen
an spezifischen, menschlichen monoclonalen Antikörpern sekretieren.
-
Sowohl
Medien als auch Tiere, die für
die Herstellung dieser Zusammensetzungen nützlich sind, sind in dem Fachgebiet
gut bekannt und käuflich
zu erwerben und umschließen
synthetische Kulturmedien, aus Inzucht hervorgegangene Mäuse und
dergleichen. Ein beispielhaftes synthetisches Medium ist minimales
essentielles Dulbecco-Medium (DMEM; Dulbecco et al. (1959) Virol.
8, 396), ergänzt
mit 4,5 g/l Glucose, 20 mM Glutamin und 20% fötalem Kälberserum. Ein beispielhafter
Inzuchtstamm ist die Balb/c-Maus.
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Beispiel
1 beschreibt die Herstellung von murinen monoclonalen anti-menschlichen
CTLA-4-Antikörpern,
die in den vorliegenden Verfahren und Zusammensetzungen verwendet
werden können.
Die Hybridome ER5.4D3, ES5.3D6, ER5.3D8, ES5.4E3 und ER4.7G11, die
die entsprechenden Antikörper
ER5.4D3 (auch als 4D3 oder CTLA-4.1 bezeichnet), ES5.3D6 (auch als
3D6 oder CTLA-4.2 bezeichnet), ER5.3D8 (auch als 3D8 oder CTLA-4.3
bezeichnet), ES5.4E3 (auch als 4E3 oder CTLA-4.4 bezeichnet) und
ER4.7G11 (auch als 7G11 bezeichnet) produzieren, wurden nach den
Bedingungen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture
Collection, Parklawn Drive, Rockville, Md., am 3. Juni 1994 hinterlegt.
Dem ER5.4D3-Hybridom wurde die ATCC-Zugangsnummer HB 11645 zugeteilt.
Dem ES5.3D6-Hybridom wurde die ATCC-Zugangsnummer HB 11644 zugeteilt.
Dem ER5.3D8-Hybridom wurde die ATCC-Zugangsnummer HB 11641 zugeteilt.
Dem ES5.4E3-Hybridom wurde die ATCC-Zugangsnummer HB 11643 zugeteilt.
Dem ER4.7G11-Hybridom wurde die ATCC-Zugangsnummer ___ zugeteilt.
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D. Chimäre und humanisierte
anti-CTLA-4-Antikörper
-
Wenn
Antikörper,
die in nicht menschlichen Lebewesen produziert wurden, therapeutisch
beim Menschen eingesetzt werden, werden sie in unterschiedlichen
Maßen
als körperfremd
erkannt, und es kann eine Immunantwort im Patienten hervorgerufen
werden. Ein Ansatz zur Minimierung oder Beseitigung dieses Problems,
der einer allgemeinen Immunsuppression vorzuziehen ist, besteht
darin, chimäre
Antikörperderivate
zu erzeugen, d. h. Antikörpermoleküle, die
eine variable, nicht menschliche, tierische Region und eine konstante menschliche
Region miteinander kombinieren. Solche Antikörper sind die Äquivalente
zu den monoclonalen und polyclonalen Antikörpern, die vorstehend beschrieben
wurden, sollten aber weniger immunogen sein, wenn sie Menschen verabreicht
werden, und es ist dadurch wahrscheinlicher, dass sie besser vom
Patienten toleriert werden.
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Chimäre monoclonale
Maus-Mensch-Antikörper
(d. h. chimäre
Antikörper),
die mit CTLA-4 reaktiv sind, können
mit rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden, die in dem Fachgebiet
gut bekannt sind. Zum Beispiel wird ein Gen, das eine konstante
Region eines CTLA-4-Antikörpermoleküls einer
murinen (oder einer anderen) Art codiert, durch ein Gen ersetzt,
das eine menschliche konstante Region codiert (vgl. Robinson. et
al. Internationale Patentschrift PCT/US86/02269; Akira et al. Europäische Patentanmeldung
Nr. 184187; Taniguchi, M., Europäische
Patentanmeldung Nr. 171.496; Morrison et al., Europäische Patentanmeldung
Nr. 173.494; Neuberger et al., PCT-Anmeldung WO 86/01533; Cabilly
et al. US-Patent Nr. 4,816,567; Cabilly et al., Europäische Patentanmeldung
Nr. 12.5.023; Better et al. (1988 Science 240, 1041–1043);
Liu et al. (1987) PNAS 84, 3439–3443;
Liu et al. (1987) J. Immunol. 139, 3521–3526; Sun et al. (1987) PNAS
84, 214–218;
Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47, 999–1005; Wood et al. (1985) Nature
314, 446–449
und Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80, 1553–1559).
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Ein
chimärer
Antikörper
kann weiter "humanisiert" werden, indem Abschnitte
der variablen Region, die nicht an der Bindung des Antigens beteiligt
sind, durch äquivalente
Abschnitte variabler Regionen des Menschen ersetzt werden. Allgemeine Überblicke über „humanisierte" chimäre Antikörper werden
von Morrison, S. L. (1985) Science 229, 1202–1207 und von Oi et al. (1986)
BioTechniques 4, 214 gegeben. Diese Verfahren umschließen Isolierung,
Manipulation und Expression der Nucleinsäuresequenz, die die gesamte
oder einen Teil einer variablen Region von mindestens einer der
schweren oder leichten Kette eines Immunglobulins codiert. Quellen
für solche
Nucleinsäuren
sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt und können zum Beispiel von einem
anti-CTLA-4-Antikörper
produzierenden Hybridom gewonnen werden. Die cDNA, die den chimären Antikörper oder
ein Fragment hiervon codiert, kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor
cloniert werden. Geeignete „humanisierte" Antikörper können alternativ
durch CDR- oder CEA-Substitution
produziert werden (vgl. US.-Patent Nr. 5,225,539 von Winter; Jones
et al. (1986) Nature 321, 552–525;
Verhoeyan et al. (1988) Science 239, 1534 und Beidler et al. (1988)
J. Immunol. 141: 4053–4060).
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Als
eine Alternative zur Humanisierung eines mAb einer Maus oder einer
anderen Art kann ein menschlicher mAb, der gegen ein menschliches
Protein gerichtet ist, erzeugt werden. Es wurden transgene, Repertoires
menschlicher Antikörper
tragende Mäuse
erzeugt, die mit menschlichem CTLA-4 immunisiert werden können. Milzzellen
dieser immunisierten transgenen Mäuse können dann zur Erzeugung von
Hybridomen verwendet werden, die menschliche mAbs sekretieren, die
spezifisch reaktiv mit menschlichem CTLA-4 sind. (vgl. z. B. Wood
et al., PCT-Offenlegungsschrift
WO 91/00906, Kucherlapati et al., PCT-Offenlegungsschrift WO 91/10741;
Lonberg et al., PCT-Offenlegungsschrift WO 92/03918; Kay et al.
PCT-Offenlegungsschrift 92/03917;
Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368, 856–859; Green, L. L. et al. (1994)
Nature Genet. 2, 13–21; Morrison,
S. L. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855; Bruggeman
et al. (1993) Year Immunol. 7, 33–40, Tuaillon et al. (1993)
PNAS 90, 3720–3724;
Bruggeman et al. (1991) Eur. J. Immunol. 21, 1323–1326).
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E. Kombinatorische anti-CTLA-4-Antikörper
-
Monoclonale
Antikörperzusammensetzungen
der Erfindung können
auch mit Hilfe anderer Verfahren hergestellt werden, die Fachleuten
auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie gut bekannt sind. Ein alternatives
Verfahren, als Verfahren des „kombinatorischen
Antikörper-Displays" bezeichnet, wurde
entwickelt, um Antikörperfragmente
zu identifizieren und zu isolieren, die eine besondere Antigen- Spezifität aufweisen,
und kann verwendet werden, monoclonale anti-CTLA-4-Antikörper zu
erzeugen (für
Beschreibungen der kombinatorischen Antikörper-Displays vgl. z. B. Sastry et al. (1989)
PNAS 86, 5728; Huse et al. (1989) Science 246, 1275 und Orlandi
et al. (1989) PNAS 86, 3833). Nach der Immunisierung eines Tiers
mit einem CTLA-4-Immunogen, wie vorstehend beschrieben, wird das
Antikörper-Repertoire
des resultierenden B-Zellen-Pools cloniert. Verfahren zur direkten
Gewinnung der DNA-Sequenz der variablen Regionen einer gemischten
Population von Immunglobulin-Molekülen unter Verwendung eines
Gemisches von oligomeren Primern und PCR sind allgemein bekannt.
Zum Beispiel können
sowohl gemischte Oligonucleotid-Primer, die den 5'-Leader-(Signalpeptid)Sequenzen
und/oder Gerüst
1-(FR1-)Sequenzen entsprechen, als auch Primer für einen konservierten konstanten
3'-Region-Primer
für die
PCR-Amplifikation der variablen Regionen der schweren und leichten
Kette einer Reihe von murinen Antikörpern verwendet werden (Larrick
et al. (1991) Biotechniques 11, 152–156). Eine ähnliche
Strategie kann auch verwendet werden, um menschliche variable Regionen
der schweren und leichten Kette von menschlichen Antikörpern zu
amplifizieren (Larrick et al. (1991) Methods: Companion to Methods
in Enzymology 2, 106–110).
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In
einer erläuternden
Ausführungsform
wird RNA aus aktivierten B-Zellen isoliert, zum Beispiel aus peripheren
Blutzellen, Knochenmark oder Milzpräparaten, unter Verwendung von
Standardprotokollen (z. B. US.-Patent Nr. 4,683,202; Orlandi, et
al. PNAS (1989) 86, 3833–3837;
Sastry et al., PNAS (1989) 86, 5728–5732 und Huse et al. (1989)
Science 246, 1275–1281).
cDNA des ersten Stranges wird unter Verwendung von Primern synthetisiert,
die für
die konstante Region der schweren Kette(n) und jede der leichten κ- und λ-Ketten spezifisch
sind, als auch von Primern für
die Signalsequenz. Mit Verwendung von PCR-Primern für die variablen
Regionen werden sowohl die variablen Regionen der schweren als auch
die leichten Ketten amplifiziert, jede für sich allein oder zusammen,
und in geeignete Vektoren zur weiteren Manipulation zur Erzeugung
der Display-Pakete eingefügt.
Oligonucleotid-Primer,
die für
die Amplifizierungsprotokolle nützlich sind,
können
einmalig oder degeneriert sein oder Inosin an degenerierten Positionen
inkorporiert haben. Erkennungssequenzen für Restriktions-EndoNucleasen
können
ebenso in die Primer integriert sein, um das Clonieren des amplifizierten
Fragments in einen Vektor in einen vorbestimmten Leserahmen zur
Expression zu ermöglichen.
-
Die
V-Gen-Bibliothek, die aus dem aus der Immunisierung stammenden Antikörper-Repertoire cloniert wurde,
kann von einer Population von Display-Paketen, bevorzugt von einem
filamentösen
Phagen stammend, exprimiert werden, und eine Antikörper-Display-Bibliothek
zu bilden. Idealerweise enthält
das Display-Paket ein System, das die Auswahl von sehr stark variierenden
Antikörper-Display-Bibliotheken,
schnelles Aussortieren nach jeder Runde der Affinitätstrennung
und einfache Isolation des Antikörpergens
aus den gereinigten Display-Paketen gestattet. Zusätzlich zu
den käuflich
zu beziehenden Kits zur Erzeugung von Phagen-Display-Paketen (z.
B. das Recombinant Phage Antibody System von Pharmacia, Katalog
Nr. 27-9400-01; und der Stratagene SurfZAPTM-Phagendisplay-Kit,
Katalog Nr. 240612) können
Beispiele von Verfahren und Reagenzien, die für die Verwendung zur Erzeugung
einer breit gefächerten
Display-Bibliothek für
anti-CTLA-4-Antikörper
besonders geeignet sind, in der Literatur gefunden werden, zum Beispiel
bei Ladner et al., US.-Patent Nr. 5.223,409; Kang et al., Internationale
Offenlegungsschrift Nr. WO 92/18619; Dower et al., Internationale Offenlegungsschrift
Nr. WO 91/17271; Winter et al., Internationale Offenlegungsschrift
Nr. WO 92/20791; Markland et al., Internationale Offenlegungsschrift
Nr. WO 92/15679; Breitling et al., Internationale Offenlegungsschrift
Nr. WO 93/01288; McCafferty et al., Internationale Offenlegungsschrift
Nr. WO 92/01047; Garrard et al., Internationale Offenlegungsschrift
Nr. WO 92/09690; Ladner et al., Internationale Offenlegungsschrift
Nr. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9, 1370–1372; Hay
et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3, 81–85; Huse et al. (1989) Science
246, 1275–1281;
Griffths et al. (1993) EMBO J. 12, 725–734; Hawkins et al. (1992)
J. Mol. Biol. 226, 889–896;
Clackson et al. (1991) Nature 352, 624–628; Gram et al. (1992) PNAS 89,
3576–3580;
Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9, 1373–1377; Hoogenboom et al. (1991)
Nuc. Acid. Res. 19, 4133–4137
und Barbas et al. (1991) PNAS 88, 7978–7982.
-
In
bestimmten Ausführungsformen
können
die Domänen
der V-Regionen der schweren und leichten Ketten auf dem gleichen
Polypeptid exprimiert werden, um, verbunden durch einen flexiblen
Linker, ein Einzelketten-Fv-Fragment zu bilden, und das scFv-Gen
kann nachfolgend in den gewünschten
Expressionsvektor oder in das gewünschte Phagengenom cloniert
werden. Wie allgemein von McCafferty et al., Nature (1990) 348,
552–554
beschrieben, können
vollständige
VH- und VL-Domänen eines
Antikörpers,
die durch einen flexiblen (Gly4-Ser)3 Linker verbunden sind, verwendet werden,
um einen Einzelketten-Antikörper
zu erzeugen, der das Display-Paket
basierend auf Antigen-Affinität
auftrennen kann. Isolierte scFv-Antikörper, die mit CTLA-4 immunreaktiv
sind, können
nachfolgend zur Verwendung in dem vorliegenden Verfahren in einer
pharmazeutischen Zubereitung formuliert werden.
-
Sobald
die Antikörper-Bibliothek
an der Oberfläche
eines Display-Pakets (z. B. eines filamentösen Phagen) gezeigt wird, wird
sie mit einem CTLA-4-Protein oder Peptidfragment hiervon durchmustert,
um Pakete zu identifizieren und zu isolieren, die einen Antikörper mit
Spezifität
für CTLA-4
exprimieren. Nucleinsäure, die
den ausgewählten
Antikörper
codiert, kann aus dem Display-Paket gewonnen werden (z. B. aus dem
Phagen-Genom) und mit Standardtechniken der DNA-Rekombination in
andere Expressionsvektoren subcloniert werden.
-
F. Hybridome und Verfahren
zur Herstellung
-
Hybridome,
die nützlich
für die
vorliegende Erfindung sind, sind jene, die dadurch gekennzeichnet sind,
dass sie die Fähigkeit
haben, einen monoclonalen Antikörper
zu erzeugen, der spezifisch mit einem CTLA-4-Antigen eine Immunreaktion
eingeht. Wie nachstehend beschrieben, kann die Hybridom-Zelle, die
anti-CTLA-4-Antikörper
produziert, direkt in das empfangende Tier implantiert werden, um
eine konstante Quelle für
Antikörper
zu haben. Die Verwendung von immunisolatorischen Mitteln zur Einkapselung
der Hybridomkultur kann sowohl vor immunogener Reaktion gegen die
implantierten Zellen schützen,
als auch ungeprüfte
Proliferation der Hybridomzelle in einem abwehrgeschwächten Wirt
verhindern. Ein bevorzugtes Hybridom der vorliegenden Erfindung
ist durch die Produktion von Antikörper-Molekülen gekennzeichnet, die spezifisch
mit einem Epitop auf einem CTLA-4-Molekül, das auf den Zelloberflächen von
aktivierten menschlichen T-Zellen exprimiert wird, eine Immunreaktion
eingehen, wodurch bei Ligation Apoptose in der T-Zelle induziert
wird.
-
Verfahren
zur Erzeugung von Hybridomen, die Antikörpermoleküle mit einer gewünschten
Immunspezifität
produzieren, z. B. sekretieren, d. h. die die Fähigkeit aufweisen, mit einem
bestimmten CTLA-4 und/oder einem identifizierbaren Epitop von CTLA-4
eine Immunreaktion einzugehen, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Besonders gut anzuwenden ist die Hybridom-Technologie, die von Niman
et al. (1983) PNAS 80, 4949–4953
und von Galfre et al. (1981) Meth. Enzymol. 73, 3–46 beschrieben
wird.
-
II. Andere Agenzien, die
Apoptose auslösen
-
Alternativ
zu einem anti-CTLA-4-Antikörper
oder Fragment hiervon kann Apoptose durch eine isolierte, lösliche Form
eines neuartigen natürlichen
CTLA-4-Liganden induziert werden. Wie in Beispiel 5 beschrieben, kann
T-Zell-Apoptose durch einen neuartigen nicht-B7-1, nicht-B7-2, CTLA-4-bindenden
Liganden induziert werden, der auf der Oberfläche einer B-lymphoblastoiden
Zelllinie (LBL) anzutreffen ist, der an ein Epitop bindet, das die
Aminosäuresequenz
(Xaa)n-Leu-Thr-Phe-Leu-Asp-Asp-(Xaa)n (SEQ
ID NO.: 33) umfasst, worin Xaan eine beliebige
Aminosäure
und n = 0–20
ist. Eine cDNA, die diesen neuartigen CTLA-4-Liganden codiert, kann
durch Expressionsclonierung, wie in Beispiel 5 beschrieben, isoliert
werden. Ein auf diese Weise isolierter apoptotischer CTLA-4-Ligand
kann mit Hilfe von Standardtechniken rekombinant exprimiert werden,
etwa wie vorstehend beschrieben. Genauer wird eine lösliche,
rekombinante Form des natürlichen
CTLA-4-Liganden exprimiert und isoliert, zum Beispiel durch Expression
der extrazellulären
Domäne
des Proteins allein oder als ein Fusionsprotein (z. B. ein Immunglobulin-Fusionsprotein).
Eine isolierte, lösliche
Form des natürlichen
CTLA-4-Liganden, die in der Lage ist, ein Epitop auf CTLA-4 querzuverknüpfen, was
T-Zell-Apoptose induziert, kann verwendet werden, um nach den Verfahren
der Erfindung clonal T-Zellen zu deletieren. Zusätzlich kann der neuartige CTLA-4-Ligand
auf einer Zelloberfläche
exprimiert werden, und die Zelle, die den CTLA-4-Liganden exprimiert,
kann verwendet werden, um T-Zell-Apoptose zu induzieren (z. B. kann
der Ligand auf allogenen Zellen exprimiert werden, um clonal alloreaktive
T-Zellen zu deletieren).
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Peptidfragmente
bekannter oder neuartiger CTLA-4-Liganden, Peptid-Nachahmer und
andere kleine Moleküle
(z. B. Arzneistoffe), die an ein Epitop auf CTLA-4 binden und es
querverknüpfen,
was Apoptose der T-Zelle induziert, befinden sich gleichfalls innerhalb
des Rahmens der Erfindung. Ein kleines Molekül als Auslöser der T-Zell-Apoptose kann identifiziert
werden, indem Substanzen mit Hilfe eines Systems durchmustert werden,
etwa wie es in den Beispielen beschrieben wird, oder durch rationales
Arzneistoffdesign, zum Beispiel durch Entwerfen eines Moleküls zur Wechselwirkung
mit einem Epitop auf CTLA-4, das T-Zell-Apoptose induziert (d. h.
mit dem in SEQ ID NO: 33 dargestellten Epitop).
-
Ein
anderer Typ eines apoptotischen Agens, das von der Erfindung eingeschlossen
ist, ist eine Nucleinsäure,
die einen apoptotischen CTLA-4-Liganden, wie hierin beschrieben,
codiert. Zum Beispiel kann Nucleinsäure (z. B. DNA), die einen
anti-CTLA-4-Antikörper (oder
ein Fragment hiervon) codiert, der ein Epitop auf CTLA-4 querverknüpft, was
Apoptose induziert, oder Nucleinsäure, die einen neuartigen CTLA-4-Liganden (oder
einen Abschnitt hiervon) codiert, der Apoptose induziert, als Gentherapie
in vitro in Zellen eingeführt
oder in vivo einem Lebewesen verabreicht werden, um clonal aktivierte
T-Zellen zu deletieren. Rekombinante Expressionsvektoren zur Expression
von Proteinen oder Peptiden in Zellen (z. B. rekombinante virale
Vektoren) und Liefermechanismen für Nucleinsäure, die für die Gentherapie in vitro
oder in vivo geeignet sind, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Ein Expressionsvektor, der eine lösliche, sekretierte Form eines
anti-CTLA-4-Antikörpers oder
eines anderen CTLA-4-Liganden codiert, kann verwendet werden, um
innerhalb von Zellen einen CTLA-4-apoptotischen Liganden zu produzieren,
der dann von den Zellen sekretiert wird und an CTLA-4 auf aktivierten
T-Zellen bindet (z. B. in Kultur oder in vivo), um Apoptose zu induzieren.
-
III. Therapeutische Verwendungen
von CTLA-4-Liganden, die T-Zell-Apoptose induzieren
-
Die
CTLA-4 bindenden Agenzien, die in der Erfindung verwendet werden,
z. B. querverknüpfende
Antikörper,
können
zu therapeutischen Zwecken verwendet werden, um aktivierte T-Zellen
clonal durch Induktion von Apoptose in den T-Zellen zu deletieren
und dadurch T-Zell-Antworten zu unterbinden. Apoptotische Liganden
können
durch ihre Fähigkeit
erkannt werden, Apoptose zu induzieren, wenn sie zu einer in vitro-Kultur
von aktivierten T-Zellen in Anwesenheit eines TCR/CD3-Stimulus zugegeben
werden, wie in den Beispielen beschrieben. Der TCR/CD3-Stimulus
kann Antigen-spezifisch sein, wie etwa Antigen, das einem T-Zell-Clon durch
Antigen-präsentierende
Zellen präsentiert
wird, oder er kann nicht spezifisch sein, wie etwa die Querverknüpfung von
CD3 durch anti-CD3-Antikörper.
Apoptose wird typischerweise durch Messung der zellulären DNA-Fragmentierung
untersucht, wie etwa durch Nachweis von DNA-Fragmenten nucleosomaler
Länge auf elektrophoretischen
Agarose-Gels (vgl. z. B. Quingsheng, T. et al. (1991) Cell 67, 629–639). Andere
geeignete Untersuchungsmethoden für Apoptose umschließen Aufnahme
des 33342-Farbstoffs von Hoechst (vgl. z. B. Hardin, J. A. et al.
(1992) J. Immunol. Methods 154, 99–107), Nachweis von Schädigung der
Kern-DNA unter Verwendung des intercalierenden Farbstoffs p-Phenylenediamin
(vgl. z. B. Salcedo, T. W. et al. (1992) J. Immunol. Methods 148,
209–216)
und Durchflusscytometrie-Untersuchungen,
wie bei Darzynkiewicz, Z. et al. (1992) Cytometry 13, 795–808 beschrieben.
-
Zusätzlich zu
der direkten Untersuchung des Auftretens von Apoptose in einer Population
von T-Zellen kann die clonale Deletion von T-Zellen innerhalb einer
Population von T-Zellen als ein Ergebnis von Apoptose untersucht
werden, indem die Population von T-Zellen erneut mit einem antigen
wirkenden Stimulus herausgefordert wird, und untersucht wird, ob
T-Zell-Antworten wie etwa Proliferation und/oder Produktion von
Cytokin auftreten. Zum Beispiel kann Apoptose in alloreaktiven,
aktivierten T-Zellen innerhalb einer T-Zell-Population durch Kontakt
mit allogenen Zellen und einem CTLA-4-bindenden Agens, wie es in
der Erfindung verwendet wird, induziert werden. Nachfolgend kann
die clonale Deletion der alloreaktiven T-Zellen durch Herausfordern
der T-Zell-Population mit den allogenen Zellen und der Messung von
T-Zell-Proliferation und/oder Cytokin-Produktion (z. B. IL-2) untersucht
werden. T-Zell-Proliferation wird typischerweise durch Aufnahme von
Tritium-Thymidin gemessen, während
Cytokin-Produktion durch Nachweis des Cytokins (z. B. IL-2) im Kulturüberstand
etwa durch ELISA-Verfahren untersucht werden kann. Clonale Deletion
von alloreaktiven T-Zellen wird durch einen Mangel an T-Zell-Antworten
auf Restimulierung durch allogene Zellen angezeigt.
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Um
Apoptose in aktivierten T-Zellen im Einklang mit der Erfindung zu
induzieren, wird ein Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches
Signal stimuliert, mit der T-Zelle in Kontakt gebracht. Dieses Agens wirkt
durch Querverknüpfung
eines Epitops auf CTLA-4, was Apoptose induziert (d. h., ein Epitop,
das die in SEQ ID NO: 33 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst). Ein bevorzugtes
querverknüpfendes
Agens ist ein anti-CTLA-4-Antikörper,
wie vorstehend definiert, wie etwa ein monoclonaler anti-Mensch-CTLA-4-Antikörper. Andere
Agenzien (z. B. lösliche
natürliche
CTLA-4-Liganden, chemische Agenzien etc.), die CTLA-4 querverknüpfen können, um
die gewünschten
Ergebnisse (d. h. Apoptose) hervorzurufen, können jedoch ebenfalls verwendet
werden. Eine aktivierte T-Zelle (d. h eine T-Zelle, die zuvor entweder
Antigen-spezifisch oder nicht spezifisch stimuliert worden ist,
CTLA-4 auf ihrer Oberfläche
zu exprimieren) kann durch den Kontakt mit einem CTLA-4-Liganden der Erfindung
oder einem anderen Agens, das ein Epitop auf CTLA-4 querverknüpft, was Apoptose
induziert, angeregt werden, die Apoptose zu durchlaufen. Um Apoptose
zu durchlaufen, benötigt
die T-Zelle zusätzlich
zur Induktion eines CTLA-4 assoziierten Signals (z. B. durch Querverknüpfung von
CTLA-4) auch die Stimulierung durch (ein) andere(s) Oberflächenmolekül(e), besonders
durch den TCR/CD3-Komplex, z. B. durch Kontakt mit Antigen oder
mit einem nicht spezifischen Stimulus wie etwa einem anti-CD3-Antikörper. Wenn
Antigen verwendet wird, um die T-Zelle durch ihren T-Zell-Rezeptor
(TCR) zu stimulieren, erfolgt Antigen-spezifische Apoptose. Daher
offenbart die Erfindung Verfahren zur Induzierung Antigen-spezifischer Apoptose
in aktivierten T-Zellen. Die Fähigkeit
von apoptotischen CTLA-4-Liganden, clonal T-Zellen auf Antigen-spezifische Weise
zu deletieren, kann verwendet werden, um spezifische antigene T-Zell-Antworten
zu verhindern und eine Antigen-spezifische Langzeit-Immunsuppression
und/oder Toleranz hervorzurufen. Stimulation von anderen Oberflächenmolekülen der
T-Zellen in Verbindung mit Stimulation eines CTLA-4- assoziierten apoptotischen
Signals kann ebenfalls T-Zell-Apoptose auf eine nicht Antigen-spezifische
Weise induzieren.
-
T-Zellen
können
durch Induktion von Apoptose nach den Verfahren der Erfindung entweder
in vitro oder in vivo clonal deletiert werden. Um T-Zell-Apoptose
in vitro zu induzieren, werden aktivierte T-Zellen sowohl mit einem
ersten Agens, das die T-Zellen
durch den TCR/CD3-Komplex stimuliert, als auch mit einem zweiten
Agens, dem vorstehend beschriebenen Agens, in Kontakt gebracht,
welches ein CTLA-4-assoziiertes Signal
zur Apoptose stimuliert, wie etwa ein Agens, das ein Epitop auf
CTLA-4 querverknüpft,
was Apoptose in einer T-Zelle induziert (z. B. ein CTLA-4-Ligand oder ein anderes
Agens, das CTLA-4 querverknüpft).
Das erste Agens kann ein nicht spezifisches Agens sein, wie etwa
ein anti-CD3-Antikörper,
um polyclonale T-Zell-Apoptose zu induzieren. Mehr bevorzugt wird
Antigen-spezifische Apoptose durch Stimulierung der T-Zelle durch
den TCR mit Antigen induziert, zum Beispiel Antigen, das von einer
Antigen präsentierenden
Zelle präsentiert
wird oder Alloantigen an der Oberfläche von allogenen Zellen (d.
h. das erste Agens ist Antigen, das der T-Zelle in einer Form präsentiert
wird, die geeignet ist, ein Signal durch den TCR zu stimulieren).
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das zweite Agens ein anti-CTLA-4-Antikörper, bevorzugt ein monoclonaler
Antikörper.
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Um
T-Zell-Apoptose in vivo zu induzieren, wird das vorstehend beschriebene
Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal in der T-Zelle
stimuliert (z. B. ein Agens, das ein Epitop auf CTLA-4 querverknüpft, was
Apoptose in der T-Zelle induziert) einem Lebewesen verabreicht.
In diesem Fall erhalten die aktivierten T-Zellen die erforderliche Stimulation
durch den TCR/CD3-Komplex durch einen endogenen Stimulus in vivo
(z. B. ein Autoantigen oder fremdes Antigen, präsentiert durch Antigen präsentierende
Zellen in vivo). Alternativ kann ein antigener Stimulus zusammen
mit dem Agens verabreicht werden, das CTLA-4 querverknüpft (z.
B. kann, um Apoptose in Allergen-spezifischen T-Zellen zu induzieren,
das Allergen zusammen mit dem Agens, das CTLA-4 querverknüpft, verabreicht
werden, oder um Apoptose in Autoantigen-spezifischen T-Zellen zu
induzieren, kann das Autogen mitverabreicht werden). Ein bevorzugtes
CTLA-4 querverknüpfendes
Agens zur Verabreichung an ein Lebewesen, um T-Zell-Apoptose zu
induzieren, ist ein anti- CTLA-4-Antikörper, wie
vorstehend beschrieben, bevorzugt ein monoclonaler anti-CTLA-4-Antikörper.
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Wenn
T-Zell-Apoptose in vivo durch Verabreichung eines Agens induziert
wird, das ein CTLA-4-assoziiertes apoptotisches Signal in einem
Lebewesen stimuliert, kann zusätzliche
Behandlung des Lebewesens notwendig sein, um stimulatorische Signale,
die an T-Zellen in der Mikroumgebung in vivo ausgesandt werden und
T-Zell-Proliferation
und/oder andere T-Zell-Antworten bewirken, zu hemmen oder zu blockieren.
Zum Beispiel kann, wie in Beispiel 4 beschrieben, die Anwesenheit
des Lymphokins Interleukin-2 (IL-2) die durch Querverknüpfung von
CTLA-4 vermittelte Induktion von Apoptose verhindern. Demzufolge
kann es bei den Verfahren zur Induktion von T-Zell-Apoptose vorteilhaft
sein, auch die Produktion oder Funktion von T-Zell-Wachstumsfaktoren
(z. B. IL-2) im Lebewesen zu hemmen. Daher kann zusätzlich zu
einem Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal stimuliert,
dem Lebewesen ein anderes Agens verabreicht werden, das Produktion
oder Funktion von T-Zell-Wachstumsfaktoren hemmt, um T-Zell-Apoptose
zu bewirken. Beispiele für geeignete
Agenzien zur Hemmung der Produktion oder Funktion von T-Zell-Wachstumsfaktoren
umschließen einen
anti-IL-2-Antikörper,
einen anti-IL-2-Rezeptor-Antikörper
oder einen immunsuppressiven Arzneistoff, welcher IL-2-Spiegel im
Lebewesen senkt, wie etwa Cyclosporin A.
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Um
Apoptose in einem Lebewesen zu induzieren, kann es zusätzlich oder
alternativ vorteilhaft sein, T-Zellen daran zu hindern oder davor
zu bewahren, ein costimulatorisches Signal in vivo zu empfangen,
wie etwa das costimulatorische Signal, das durch die Wechselwirkung
von CD28 entweder mit B7-1 oder B7-2 vermittelt wird. Demzufolge
kann zusätzlich
zu der Verabreichung eines Agens an ein Lebewesen, das ein CTLA-4 assoziiertes
apoptotisches Signal stimuliert, dem Lebewesen auch ein weiteres
Agens verabreicht werden, welches die Erzeugung eines costimulatorischen
Signals in T-Zellen verhindert, wie etwa ein blockierendes Molekül, das an
CD28, B7-1 oder B7-2 bindet. Beispiele für geeignete blockierende Moleküle umschließen ein anti-CD28
Fab-Fragment, anti-B7-1 oder anti-B7-2 blockierende Antikörper (d.
h. Antikörper,
die CD28-B7-1/B7-2-Wechselwirkungen blockieren, aber kein costimulatorisches
Signal in T-Zellen induzieren) und lösliche Formen von CD28, B7-1
oder B7-2 (z. B. Immunglobulin-Fusionsproteine, die CD28-B7-1/B7-2-Wechselwirkungen
blockieren, aber kein costimulatorisches Signal in T-Zellen induzieren). Zusätzlich können Kombinationen
von blockierenden Molekülen,
z. B. ein anti-B7-1-Antikörper
und ein anti-B7-2 Antikörper
verwendet werden.
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Die
Verfahren der Erfindung zur Induktion von T-Zell-Apoptose sind bei
einer Reihe von klinischen Situationen anwendbar, bei denen es wünschenswert
ist, eine spezifische Population von reaktiven T-Zellen clonal zu
deletieren, wie genauer in den nachstehenden Unterabschnitten beschrieben
wird.
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A. Organtransplantation/GVHD
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Clonale
Deletion von alloreaktiven T-Zellen durch Induktion einer alloantigen-spezifischen
Apoptose in aktivierten T-Zellen ist nützlich in Situationen von Zell-,
Gewebe-, Haut- und Organtransplantationen und bei Knochenmarkstransplantationen
(z. B. zur Verhinderung von Graft-versus-Host-Erkrankungen (GVHD)). Zum Beispiel kann
die Deletion von alloreaktiven T-Zellen reduzierte GewebeDeletion
bei Transplantation von Gewebe und Langzeit-Akzeptanz des Transplantats ohne die
Notwendigkeit einer allgemeinen Immunsuppression zur Folge haben.
Typischerweise wird die Abstoßung
des Transplantats bei Gewebetransplantationen durch die Erkennung
als körperfremd
durch die T-Zellen eingeleitet, gefolgt von einer Immunreaktion,
die das Transplantat zerstört.
Die Verabreichung eines Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches
Signal stimuliert, wie etwa ein monoclonaler anti-CTLA-4-Antikörper der
Erfindung, an einen Transplantatempfänger zusammen mit den transplantierten
Zellen kann Apoptose in alloreaktiven T-Zellen des Empfängers induzieren, die
durch die transplantierten körperfremden
Zellen aktiviert werden. Das Behandlungsprotokoll kann vorherige
Sensibilisierung (d. h. Aktivierung) der alloreaktiven T-Zellen
des Empfängers
auf Spender-Antigene durch Verabreichung einer Probe von Spenderzellen
(z. B. hämatopoetische
Zellen) an den Empfänger
vor der Transplantation beinhalten. Diese Vorbehandlung aktiviert
Spender-spezifische alloreaktive T-Zellen im Empfänger dazu,
CTLA-4+ zu werden, um auf diese Weise zu
ermöglichen,
bei wiederholter Exposition gegen Spender-Antigene (z. B. des Transplantats)
in Anwesenheit eines Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches
Signal stimuliert, clonal deletiert zu werden.
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Ein
alternatives Behandlungsprotokoll kann beinhalten, T-Zellen des
Empfängers
in vitro Spenderzellen (z. B. hämatopoetische
Zellen des Transplantatspenders) auszusetzen, bevor das Transplantat
in den Empfänger übertragen
wird, um Alloantigen-spezifische T-Zellen zu aktivieren (d. h. CTLA-4
auf der Oberfläche
der alloreaktiven Zellen zu induzieren) und, sobald sie aktiviert
sind, die T-Zellen des Empfängers
in vitro sowohl mit den Spenderzellen als auch mit einem Agens,
das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal stimuliert (z.
B. anti-CTLA-4-mAb), in Kontakt zu bringen, wodurch Apoptose in
den aktivierten alloreaktiven Zellen induziert wird. Sobald die
alloreaktiven T-Zellen in vitro clonal deletiert worden sind, können die
verbleibenden T-Zellen dem Empfänger
reinjiziert werden, und die Transplantation kann durchgeführt werden.
Zusätzlich
kann dem Lebewesen ein CTLA-4-querverknüpfendes Agens verabreicht werden,
um Apoptose in all jenen alloreaktiven T-Zellen zu induzieren, die
noch in vivo vorhanden sind (d. h. kann der Ansatz einer kombinierten
in vitro-Abreicherung, in vivo-Behandlung verwendet werden).
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Die
vorstehend beschriebenen Ansätze
können
in ähnlicher
Weise auf die Situation der Knochenmarktransplantation angewendet
werden, um spezifisch alloreaktive T-Zellen aus Spenderknochenmark abzureichern.
Die Entfernung von alloreaktiven T-Zellen aus dem Transplantat bei Bewahrung
der Anwesenheit anderer T-Zellen ist vorteilhaft für die Verhinderung
des Auftretens der Graft-versus-host-Erkrankung, fördert das Einwachsen
des Knochenmarks im Transplantatempfänger und schützt vor
der anti-Leukämie-Aktivität (d. h. der
Transplantat-gegen-Leukämie-Reaktion)
der Spenderzellen im Transplantat. Um alloreaktive T-Zellen im Transplantat
clonal zu deletieren, kann Spenderknochenmark vor der Transplantation
in vitro mit Zellen des Empfängers
(z. B. hämatopoetischen
Zellen) inkubiert werden, um alloreaktive T-Zellen im Knochenmark zu aktivieren.
Nach der Aktivierung können
alloreaktive T-Zellen
durch in vitro-Inkubation sowohl mit Empfängerzellen als auch mit einem
Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal stimuliert,
clonal aus dem Knochenmark deletiert werden. Zusätzliche Agenzien, die die Erzeugung
von stimulatorischen Signalen in T-Zellen hemmen (z. B. anti-B7-1-
und/oder anti-B7-2-Antikörper, ein
anti-IL-2R-Antikörper
etc., wie vorstehend beschrieben), können in die Inkubation eingeschlossen
werden. Spezifisch um alloreaktive Zellen abgereichertes Knochenmark
kann dann dem Empfänger
verabreicht werden, der weiterhin mit dem Agens behandelt werden
kann, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotischens Signal in vivo
stimuliert, um Apoptose in etwa noch vorhanden gebliebenen alloreaktiven
Zellen in vivo zu induzieren. Zusätzliche Behandlungen, die die
Erzeugung eines costimulatorischen Signals in T-Zellen im Empfänger hemmen
oder die die Produktion oder Funktion eines oder mehrerer T-Zell-Wachstumsfaktoren
(z. B. IL-2) im Empfänger
hemmen, können
ebenso in vivo verabreicht werden, um darüber hinaus die Induktion von
T-Zell-Apoptose im Empfänger
zu fördern.
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Die
Wirksamkeit eines bestimmten Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes
apoptotischens Signal stimuliert (z. B. anti-CTLA-4-Antikörper), um
Abstoßung
von Organtransplantaten oder GVHD zu verhindern, kann mit Hilfe
von Tiermodellen untersucht werden, von denen Rückschlüsse auf die Wirksamkeit beim
Menschen gezogen werden können.
Aufgrund der Homologie zwischen CTLA-4-Molekülen der verschiedenen Arten nimmt
man an, dass die funktional wichtigen Aspekte von CTLA-4 zwischen
den Arten strukturell konserviert sind und auf diese Weise gestatten,
dass Tiersysteme als Modelle für
die Wirksamkeit in Menschen verwendet werden können. Beispiele für geeignete
Systeme, die verwendet werden können,
umschließen
allogene Herztransplantate bei Ratten und xenogene Transplantate
von Inselzellen der Bauchspeicheldrüse bei Mäusen, welche beide verwendet
worden sind, um die immunsuppressiven Wirkungen von CTLA-4-Ig-Fusionsproteinen
in vivo zu untersuchen, wie von Lenschow et al., (1992) Science
257, 789–792
und Turka et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11102–11105 beschrieben.
Zusätzlich
können
murine Modelle von GVHD (vgl. Paul (Hrsg.), Fundamental Immunology,
Raven Press, New York, 1989, S. 846–847) verwendet werden, um die
Wirkung der Induktion von T-Zell-Apoptose über ein CTLA-4-assoziiertes
apoptotisches Signal (durch Behandlung von T-Zellen in vitro und/oder
in vivo) auf die Entwicklung dieser Krankheit zu untersuchen.
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Als
eine erläuternde
Ausführungsform
kann ein anti-CTLA-4-Antikörper
in einem Rattenmodell zur Organtransplantation verwendet werden,
um die Fähigkeit
des Antikörpers
zu ermitteln, alloantigene Reaktionen in vivo zu blockieren. Lewis-Ratten
als Empfänger
erhalten ein allogenes Herztransplantat eines Brown-Norway-Rattenstamms, das
mit Gefäßen im Nacken
verbunden wird, wie von Bolling, S. F. et al., Transplant 453, 283–286 (1992)
beschrieben. Die Transplantate werden durch Abtasten auf ihre mechanische
Funktion und durch Elektrokardiogramm auf ihre elektrophysiologische
Funktion überwacht.
Man definiert, das Abstoßung des
Transplantats am letzten Tag der tastbaren Kontraktionsfunktion
eingetreten ist. Als eine erste Untersuchung werden die Tiere über 7 Tage
mit täglichen
Injektionen von monoclonalen anti-CTLA-4-Antikörpern oder einem zum Isotyp
passenden monoclonalen Kontroll-Antikörper behandelt. Die Antikörper werden
in einem Dosierungsbereich von etwa 0,015 mg/Tag bis 0,5 mg/Tag
verabreicht. In parallel laufenden Experimenten erhalten empfangende
Lewis-Ratten vor der allogenen Herztransplantation eine Probe von
Brown-Norway-Zellen (z. B. periphere Blutzellen oder Milzzellen),
um alloreaktive T-Zellen in den Empfängern zu aktivieren. Nach diesem
Präsensibilisierungsschritt
wird das allogene Transplantat zusammen mit der Verabreichung von
anti-CTLA-4-Antikörpern
transplantiert. Unbehandelte Lewis-Ratten stoßen heterotopische allogene
Brown-Norway-Transplantate typischerweise in etwa 7 Tagen ab. Die
Abstoßung
allogener Transplantate in mit Antikörpern behandelten Tieren wird
im Vergleich zu unbehandelten Kontrolltieren untersucht.
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Ein
unbehandeltes Tier und ein mit Antikörpern behandeltes Tier werden
für die
histologische Untersuchung getötet.
Die allogenen Herztransplantate werden vom unbehandelten Tier und
vom mit Antikörpern behandelten
Tier vier Tage nach der Transplantation entfernt. Die allogenen
Transplantate werden in Formalin fixiert, und Gewebeschnitte werden
mit Hämatoxylin-Eosin
angefärbt.
Das Herzgewebe der unbehandelten und behandelten Tiere wird histologisch
auf schwere akute zelluläre
Abstoßungsreaktionen
einschließlich
eines hervortretenden monoNuclearen interstitiellen Zellinfiltrats
mit Ödembildung,
Deletion von Myocyten und Infiltration von Arterienwänden untersucht.
Die Wirksamkeit der Behandlung mit Antikörpern zur Verhinderung der
Abstoßung
von Transplantaten wird durch das Fehlen einer akuten zellulären Abstoßungsreaktion
im Herzgewebe der mit Antikörpern
behandelten Tiere gestützt.
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Um
zu bestimmen, ob Antikörpertherapie
eine Langzeit-Akzeptanz des Transplantats begründet, die nach der Antikörperbehandlung
weiter besteht, werden Tiere, die über 7 Tage mit täglichen
Injektionen von Antikörpern
behandelt worden sind, ohne zusätzliche
Therapie bis zum Stillstand der Funktion des Transplantats beobachtet.
Die Tiere erhalten entweder keine Behandlung, Behandlung mit anti-CTLA-4-Antikörpern oder
mit einem dem Isotyp entsprechenden monoclonalen Kontroll-Antikörper. Die
Antikörperbehandlung
beginnt zum Zeitpunkt der Transplantation und wird über 7 Tage
fortgesetzt. Das Überleben
des Transplantats wird täglich, wie
vorstehend beschrieben, untersucht. Allogene Transplantate von Tieren,
in denen das Transplantat seine Funktion eingestellt hat, werden
histologisch untersucht, wie vorstehend beschrieben. Induktion von
Toleranz des Transplantats durch Antikörperbehandlung wird durch das
fortgesetzte Funktionieren des Transplantats nach Beendung der Antikörperbehandlung
angezeigt.
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Nach
verlängerter
Transplantat-Akzeptanz kann ein mit Antikörpern behandeltes Tier getötet werden, und
die Lymphocyten des Empfängers
können
auf ihre funktionalen Antwortreaktionen untersucht werden. Diese
Antwortreaktionen werden mit denen von Lymphocyten einer Kontroll-Lewis-Ratte
(ohne Transplantat) verglichen, und Ergebnisse werden als prozentuale
Angaben der Kontroll-Antwortreaktionen normiert. Die proliferative
Antwort von T-Zellen auf ConA und auf Zellen einer Brown-Norway-Ratte und
einer dritten Art, einer ACI-Ratte, können untersucht werden. Zusätzlich können Thymus
und Milz von den unbehandelten und behandelten Tieren in Größe, Anzahl
der Zellen und Art der Zellen verglichen werden (z. B. mit Hilfe
von Durchflusscytometrie-Untersuchungen von Thymus, Lymphknoten
und Milzzellen). Spezifische Nicht-Reaktivität auf Alloantigene in den behandelten
Tieren als ein Ergebnis der spezifischen clonalen Deletion alloreaktiver
Zellen wird durch die Fähigkeit
der T-Zellen angezeigt, auf ConA und Stimulatoren einer dritten
Art (z. B. ACI-Zellen von Ratten) zu antworten, nicht aber auf Zellen
von Brown-Norway-Ratten.
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B. Autoimmun-Erkrankungen
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Clonale
Deletion von T-Zellen durch Induktion Antigen-spezifischer T-Zell-Apoptose
kann auch bei der Behandlung von Autoimmun-Erkrankungen therapeutisch
nutzbringend eingesetzt werden. Viele Autoimmun-Störungen sind
das Ergebnis von unangemessener Aktivierung von T-Zellen, die reaktiv
gegen Eigengewebe sind (d. h. reaktiv gegen Autoantigene) und welche
die Produktion von Cytokinen und Autoantikörpern voran treiben, die an
der Pathologie dieser Erkrankungen beteiligt sind. Die Verhinderung
der Aktivierung autoreaktiver T-Zellen kann daher die Krankheitssymptome
vermindern oder beseitigen. Die Verabreichung eines Agens, das ein
CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal stimuliert, wie etwa ein
anti-CTLA-4-Antikörper
der Erfindung, der an ein Epitop von CTLA-4 bindet, wodurch T-Zell-Apoptose
induziert wird, kann verwendet werden, um autoreaktive T-Zellen
zu deletieren, wodurch Antworten der T-Zellen gehemmt und die Produktion
von Autoantikörpern
oder von T-Zellen stammenden Cytokinen, die an dem Verlauf der Krankheit
beteiligt sein können,
verhindert werden. Zusätzlich
kann eine Langzeit-Erholung von dieser Erkrankung erreicht werden,
da autoreaktive T-Zellen eleminiert werden können anstatt einfach nur toleriert
zu werden.
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Um
eine Autoimmun-Störung
zu behandeln, wird ein Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches
Signal stimuliert (d. h. das CTLA-4-bindende, vorstehend beschriebene
Agens), einem Lebewesen, das einer Behandlung bedarf, verabreicht.
Autoreaktive T-Zellen, die zuvor durch ein Autoantigen in vivo aktiviert wurden,
werden durch antigene Stimulation mittels Autoantigen in vivo dazu
angeregt, Apoptose zu durchlaufen. Alternativ kann bei Autoimmun-Störungen mit
einem bekannten Autoantigen dem Lebewesen das Autoantigen zusammen
mit dem apoptotischen Agens verabreicht werden. Da nur aktivierte
T-Zellen durch diese Behandlung eliminiert werden, sollten ruhende
T-Zellen, die für
andere Antigene spezifisch sind, von dieser Behandlung unberührt bleiben.
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Dieses
Verfahren kann verwendet werden, um eine Reihe von Autoimmun-Erkrankungen und
Störungen
zu behandeln, die einen Autoimmun-Anteil aufweisen, einschließlich Diabetis
mellitus, Arthritis (einschließlich
rheumatoide Arthritis, jugendliche rheumatoide Artritis, Osteoarthritis,
psoriatischer Arthritis), multipler Sklerose, Myasthenia gravis,
systemischem Lupus erythematodes, autoimmuner Thyroiditis, Dermatitis (einschließlich atopischer
Dermatitis und ekzematöser
Dermatitis), Psoriasis, Sjögren-Syndrom,
einschließlich Keratoconjunctivitis
sicca nach Sjögren-Syndrom,
Alopecia areata, allergischer Reaktionen auf Arthropodenbiss-Reaktionen,
Morbus Crohn, aphthösem
Geschwür,
Iritis, Conjunctivitis, Keratoconjunctivitis, ulcerativer Colitis,
Asthma, allergischem Asthma, cutanösem Lupus erythematodes, Scleroderma,
Vaginitis, Proctitis, Arzneistoffdermatitis, lepröser Umkehrreaktionen,
Erythema nodosum leprosum, Autoimmun-Uveitis, allergischer Enzephalomyelitis,
akuter nekrotischer hämorrhagischer
Enzephalopathie, idiopathischem progressivem sensorineuralem Hörverlust,
aplastischer Anämie,
Anämie
der roten Blutkörperchen,
idiopathischer Thrombocytopenie, Polychondritis, Wegenersche Granulomatose,
chronischer aktiver Hepatitis, Stevens-Johnson-Syndrom, idiopathischer
Sprue, Lichen planus, Morbus Crohn, Graves Ophthalmopathie, Sarcoidosis,
primärer
biliärer
Zirrhose, Uveitis posterior und interstitieller Lungenfibrose.
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Die
Wirksamkeit von CTLA-4 querverknüpfenden
Agenzien bei der Verhinderung oder Erleichterung von Autoimmun-Störungen kann
bestimmt werden, indem eine Reihe von gut untersuchten Tiermodellen menschlicher
Autoimmun-Erkrankungen verwendet wird. Beispiele umschließen murine
experimentelle Autoimmun-Enzephalitis,
systemischen Lupus erythematodes in MRL/Ipr/Ipr-Mäusen oder
NZB-Hybridmäusen, murine
Autoimmun-Kollagen-Arthritis, Diabetes mellitus in NOD-Mäusen und BB-Ratten und murine
experimentelle Myasthenia gravis (vgl. Paul (Hrsg.), Fundamental
Immunology, Raven Press, New York, 1989, S. 840–856).
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Experimentelle
Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Nager- und Primatenmodell
für multiple Sklerose.
In einer erläuternden
Ausführungsform
werden in einem passiven EAE-Modell Spendermäuse mit 0,4 mg Myelin-Basisprotein
(MBP) in einer Lösung
mit vollständigem
Freundschen Adjuvans (CFA), über
vier Quadranten verteilt, immunisiert. Die drainierenden Lymphknoten
der Achseln und Leisten werden 11 Tage später entfernt. Die Lymphknotenzellen
(4 × 106/ml) werden in 2 ml-Kulturen in Anwesenheit
von 25 μg/ml
MBP auf Platten mit 24 Vertiefungen aufgebracht. Nach 4 Tagen in
Kultur werden je 30 × 106 der behandelten Zellen in die Schwanzvenen
unbehandelter, syngener Empfängermäuse injiziert.
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Die
empfangenden Mäuse
entwickeln eine vorübergehende,
rezidivierende Erkrankung und werden unter Verwendung der folgenden
Kriterien bewertet:
0 | normal,
gesund |
1 | schlaffer
Schwanz, Inkontinenz; gelegentlich ist das erste Anzeichen der Erkrankung
ein "Umkippen" |
2 | Schwäche der
Hinterbeine, Schwerfälligkeit |
3 | milde
Paraparese |
4 | schwere
Paraparese |
5 | Quadriplegie |
6 | Tod |
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Mit
der Verwendung des passiven EAE-Modells wird die Auswirkung der
Behandlung der Spenderzellen mit anti-CTLA-4-Antikörpern auf
die resultierende Schwere der Erkrankung in einem empfangenden Tier
in Mäusen
(z. B. dem Stamm PLSJLF1/J) untersucht. Die Kultivierung von Lymphzellen
mit MBP in vitro wird entweder in Anwesenheit oder in Abwesenheit
von etwa 30 μg/ml
eines anti-CTLA-4-Antikörpers
durchgeführt. Die
behandelten Zellen werden dann in eine syngene Empfängermaus überführt. Die
Auswirkung von Antikörperbehandlung
der Spenderzellen auf die Schwere des ersten Abschnitts der Erkrankung
beim Empfänger
im Vergleich zu Mäusen,
die unbehandelte Zellen erhalten haben, kann mit Hilfe der vorstehend
genannten Kriterien zur Bestimmung der Schwere der Erkrankung untersucht
werden. Zusätzlich
können
nachfolgende Rückfälle bei
Mäusen,
die mit Antikörpern behandelte
Zellen erhalten hatten, gegenüber
unbehandelten Zellen mit den vorstehend beschriebenen Kriterien
untersucht werden.
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Darüber hinaus
kann die Auswirkung auf die klinische Schwere der Erkrankung des
Empfängers
untersucht werden, wenn sowohl die Spendermäuse als auch die kultivierten
Spenderzellen mit anti-CTLA-4-Antikörpern behandelt worden sind.
In diesen Experimenten werden Spendermäusen (z. B. vom Stamm SJL/J), die
mit MBP immunisiert worden sind, entweder 100 μg eines anti-CTLA-4-Antikörpers (allein
oder in Kombination) oder 100 μg
eines vom Isotyp passenden Kontroll-Antikörpers intraperitoneal täglich über 11 Tage
verabreicht. Die Zellen werden dann von den Lymphknoten dieser Spender
isoliert und mit MBP in vitro in Anwesenheit von entweder 30 μg/ml eines
anti-CTLA-4-Antikörpers
(allein oder in Kombination) oder eines Kontroll-Antikörpers kultiviert.
Die behandelten Zellen werden dann in einen syngenen Empfänger überführt. Die Auswirkung
der Antikörperbehandlung
auf die Schwere der nachfolgenden Erkrankung im Empfänger wird dann
anhand der vorstehend genannten Kriterien untersucht.
-
Studien,
die ein direktes (aktives) Modell für EAE verwenden, können ebenfalls
durchgeführt
werden. In diesen Experimenten wird ein anti-CTLA-4-Antikörper Mäusen direkt
verabreicht, die mit MBP immunisiert und mit Pertussis-Toxin (PT)
behandelt worden sind. Mäuse
(z. B. der Stamm PLSJLFI/J) werden mit MBP an Tag 0 immunisiert,
erhalten PT an den Tagen 0 und 2 intravenös injiziert und erhalten entweder
einen anti-CTLA-4-Antikörper
oder einen vom Isotyp passenden Kontroll-Antikörper an den Tagen 0 bis 7.
Die Auswirkung der direkten Antikörperbehandlung der MBP immunisierten
Mäuse auf
die Schwere der nachfolgenden Erkrankung wird dann anhand der vorstehend
genannten Kriterien untersucht.
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C. Allergie
-
Die
IgE-Antikörperreaktion
bei atopischer Allergie ist in hohem Maße von T-Zellen abhängig, und
daher kann clonale Deletion von Allergen-spezifischen T-Zellen durch Induktion
von Apoptose von therapeutischem Nutzen bei der Behandlung von Allergie
und allergenen Reaktionen sein. Zum Beispiel kann ein anti-CTLA-4-Antikörper einem
allergischen Lebewesen, das einem Allergen ausgesetzt ist, verabreicht
werden, um Apoptose in Allergen-spezifischen Zellen zu induzieren,
um auf diese Weise allergische Reaktionen im Lebewesen herunterzuregeln.
Die Verabreichung eines Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches
Signal bei einem allergischen Lebewesen stimuliert, kann davon begleitet
sein, das Lebewesen einer allergenen Umgebung auszusetzen oder gleichzeitig
das Allergen zu verabreichen. Allergene Reaktionen können systemischer
oder örtlicher
Natur sein, abhängig
vom Eingangsweg des Allergens und dem Ablagerungsmuster von IgE
auf Mastzellen oder basophilen Zellen. Es kann daher notwendig sein,
Allergen-spezifische T-Zell-Apoptose durch geeignete Injektion eines
Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal (z. B. anti-CTLA-4-Antikörper) stimuliert,
lokal oder systemisch zu induzieren. Zum Beispiel werden in einer
Ausführungsform
einem allergischen Lebewesen ein anti-CTLA-4-Antikörper und ein Allergen gemeinsam
subkutan verabreicht.
-
D. Virus-infizierte oder
maligne T-Zellen
-
Die
Verfahren der Induktion von T-Zell-Apoptose durch Querverknüpfung von
CTLA-4 können
bei jeder T-Zelle angewendet werden, die CTLA-4 an ihrer Oberfläche exprimiert.
Zusätzlich
zu T-Zellen, die durch Aussetzen gegenüber einem bestimmten Antigen
aktiviert werden, exprimieren auch andere Formen von T-Zellen CTLA-4
an ihrer Oberfläche.
Zum Beispiel Virus-infizierte
T-Zellen wie etwa jene, die mit HTLV-I oder HIV infiziert sind,
können
CTLA-4+ sein (vgl. Freeman, G. J. et al.
(1992) J. Immunol. 149, 3795–3801;
Haffar, O. K. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11094–11098).
Demzufolge können
virusinfizierte CTLA-4+-T-Zellen durch Induktion
von CTLA-4 vermittelter Apoptose in den T-Zellen eliminiert werden.
Zum Beispiel können
virusinfizierte CTLA-4+-T-Zellen, die von einem
Lebewesen erhalten wurden, in vitro mit einem anti-CTLA-4-Antikörper der
Erfindung zusammen mit anti-CD3-Antikörpern kultiviert werden, um
Apoptose zu induzieren. Nach der Abreicherung der virusinfizierten
Zellen kann die verbliebene T-Zellpopulation mit Hilfe herkömmlicher
Techniken in vitro vermehrt und dem Lebewesen zurück verabreicht
werden. Zusätzlich
können maligne
T-Zellen, die CTLA-4 an ihrer Oberfläche exprimieren, durch Induktion
von Apoptose in den T-Zellen, wie
hierin beschrieben, entfernt werden.
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E. Antigen-spezifische
clonale Deletion
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Die
Verfahren der Erfindung zur Induktion von T-Zell-Apoptose können im
Wesentlichen auf jedes Antigen (z. B. Protein) angewendet werden,
um T-Zellen, die in einem Lebewesen reaktiv für dieses Antigen sind, clonal
zu deletieren. Daher kann ein Lebewesen mit dem Antigen sensibilisiert
werden, Antigen-spezifische T-Zellen zu aktivieren (d. h. CTLA-4
an der Oberfläche
Antigen-spezifischer T-Zellen zu induzieren), und bei wiederholtem
Kontakt mit dem Antigen wird ein Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes
apoptotisches Signal induziert, zusammen mit dem Antigen verabreicht,
um Antigen-spezifische T-Zell-Apoptose
zu induzieren. Das Antigen kann in einer löslichen Form oder an einen
Trägerstoff
oder Hilfsstoff (z. B. eine Perle) gebunden verabreicht werden.
Dieser Basisansatz hat ein weitreichendes Anwendungsgebiet als eine
Begleitung von Therapien, die ein potentielles immunogenes Molekül für therapeutische
Zwecke einsetzen. Zum Beispiel verwendet eine steigende Anzahl von
therapeutischen Ansätzen
ein proteinartiges Molekül
wie etwa einen Antikörper, ein
Fusionsprotein oder dergleichen zur Behandlung einer klinischen
Störung.
Eine Begrenzung für
die therapeutische Verwendung solcher Moleküle ist dadurch gegeben, dass
sie eine Immunantwort hervorrufen können, die gegen das therapeutische
Molekül
im behandelten Lebewesen gerichtet ist (z. B. wird die Wirksamkeit muriner
monoclonaler Antikörper
in menschlichen Patienten durch die Induktion einer Immunantwort
gegen die Antikörper
im menschlichen Patienten behindert). Das Verfahren der Erfindung
zur Induktion Antigen-spezifischer T-Zell-Apoptose kann in diesen
therapeutischen Situationen angewendet werden, um Langzeit-Verwendung
des therapeutischen Moleküls
im Patienten ohne Erregung einer Immunantwort zu ermöglichen.
Zum Beispiel wird ein therapeutischer Antikörper (z. B. ein muriner mAb)
einem Lebewesen (z. B. einem Menschen) verabreicht, der typischerweise
T-Zellen aktiviert,
die in dem Lebewesen spezifisch für den Antikörper sind. Um diese aktivierten
T-Zellen clonal zu zerstören,
wird der therapeutische Antikörper
dem Lebewesen erneut, zusammen mit einem Agens verabreicht, das
ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal stimuliert, wodurch Antigen-spezifische
Apoptose in den T-Zellen induziert wird. Clonale Eliminierung dieser
aktivierten T-Zellen sollte dann die fortgesetzte Wirksamkeit des
therapeutischen Antikörpers
im Patienten ermöglichen.
-
V. Verabreichung therapeutischer
Formen von CTLA-4-Liganden
-
Die
vorstehend beschriebenen CTLA-4 bindenden Agenzien (z. B. anti-CTLA-4-Antikörper) werden Patienten
in einer biologisch verträglichen
Form verabreicht, die für
die pharmazeutische Verabreichung in vivo geeignet ist, T-Zell-Apoptose
zu induzieren. Mit „biologisch
verträglicher
Form, die zur Verabreichung in vivo geeignet ist" ist eine Form des zu verabreichenden
Proteins gemeint, bei der mögliche
toxische Wirkungen von den therapeutischen Wirkungen des Liganden übertroffen
werden. Der Ausdruck Lebewesen soll lebende Organismen einschließen, in
denen eine Immunantwort erzeugt werden kann, z. B. Säuger. Beispiele
für Lebewesen
umschließen
Menschen, Affen, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten und transgene Arten
hiervon. Verabreichung des hierin beschriebenen Agens kann in jeder
pharmakologischen Form erfolgen, einschließlich einer therapeutisch aktiven
Menge des CTLA-4 bindenden Agens allein oder in Kombination mit
einem anderen therapeutischen Molekül (z. B. anti-IL-2-Rezeptor-Antikörper oder
CD28-, B7-1 oder B7-2 blockierender Antikörper etc., wie vorstehend beschrieben)
und einem pharmazeutisch verträglichen
Trägerstoff.
Verabreichung einer therapeutisch aktiven Menge der therapeutischen
Zusammensetzungen ist als eine Menge definiert, die in notwendigen
Dosierungen und Zeiträumen
bewirkt, das das gewünschte
Ergebnis erreicht wird. Zum Beispiel kann eine therapeutisch wirksame
Menge eines anti-CTLA-4-Antikörpers aufgrund
von Faktoren wie Status der Erkrankung, Alter, Geschlecht und Gewicht
des Individuums und der Fähigkeit
des Antikörpers,
eine gewünschte
Reaktion im Individuum hervorzurufen, variieren. Dosierunsprotokolle
können
angepasst werden, um die optimale therapeutische Antwort zu bekommen.
Zum Beispiel können
mehrere unterteilte Dosen pro Tag verabreicht werden, oder die Dosis
kann proportional reduziert werden, wie von den Notwendigkeiten
der therapeutischen Situation angezeigt.
-
Der
aktive Bestandteil (z. B. Antikörper)
kann auf herkömmliche
Weise wie etwa Injektion (subkutan, intravenös etc.), orale Verabreichung,
Inhalation, transdermale Applikation oder rektale Applikation verabreicht werden.
Abhängig
von der Art der Verabreichung kann der aktive Bestandteil von einem
Material ummantelt werden, um den Bestandteil vor der Aktivität von Enzymen,
Säuren
und anderen natürlichen
Bedingungen, die den Bestandteil inaktivieren können, zu schützen.
-
Um
ein CTLA-4 bindendes Agens auf einem anderen Weg als durch parenterale
Verabreichung zu verabreichen, kann es notwendig sein, das Agens
mit einem Material zu ummanteln oder zusammen zu verabreichen, das
seine Inaktivierung verhindert. Ein CTLA-4 bindendes Agens kann
einem Individuum in einem geeigneten Trägerstoff oder einer geeigneten
Verdünnungslösung zusammen
mit Enzymhemmern oder in einem geeigneten Trägerstoff, wie etwa Liposomen,
verabreicht werden. Pharmazeutisch verträgliche Verdünnungslösungen umschließen Kochsalzlösung und
wässrige
Pufferlösungen.
Enzymhemmer umschließen
Pankreastrypsin-Hemmer, Diisopropylfluorophosphat (DEP) und Trasylol.
Liposomen umschließen
Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsionen
ebenso wie herkömmliche
Liposomen (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7, 27).
-
Der
aktive Bestandteil kann auch parenteral oder intraperitoneal verabreicht
werden. Dispersionen können
auch in Glyzerin, flüssigen
Polyethylenglycolen und Gemischen hieraus und in Ölen zubereitet
werden. Unter normalen Bedingungen von Lagerung und Verwendung können diese
Präparate
ein Konservierungsmittel enthalten, um das Wachstum von Mikroorganismen
zu verhindern.
-
Arzneimittel,
die für
injizierbare Verwendung geeignet sind, umschließen sterile wässrige Lösungen (soweit
wasserlöslich)
oder Dispersionen und sterile Pulver zur Herstellung steriler injizierbarer
Lösungen
oder Dispersion direkt vor der Verwendung. In allen Fällen muss
die Zusammensetzung steril sein, und sie muss in einem Ausmaß flüssig sein,
dass leichte Injizierbarkeit besteht. Sie muss unter den Bedingungen
der Herstellung und Lagerung stabil sein und muss vor der verunreinigenden
Aktivität
von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen bewahrt werden. Der
Trägerstoff
kann ein Lösungsmittel
oder Dispersionsmedium sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol
(z. B. Glycerin, Propylenglycol und flüssigen Polyethylenglycol und
dergleichen) und geeignete Gemische hieraus enthält. Die geeignete Fluidität kann zum
Beispiel durch die Verwendung einer Ummantelung wie etwa Lecithin,
durch die Beibehaltung der erforderlichen Partikelgröße im Falle der
Dispersion und durch die Verwendung von grenzflächenaktiven Stoffen erhalten
werden. Verhinderung der Tätigkeit
von Mikroorganismen kann mit Hilfe verschiedener antibakterieller
und fungizider Agenzien, zum Beispiel Paraben, Chlorbutanol, Phenol,
Ascorbinsäure,
Thimerosal und dergleichen erreicht werden. In vielen Fällen wird
es vorteilhaft sein, isotonische Agenzien, zum Beispiel Zucker,
Polyalkohole wie etwa Mannit, Sorbit, Natriumchlorid in die Zusammensetzung
einzuschließen.
Verlangsamte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann
erreicht werden, indem ein Agens in die Zusammensetzung eingeschlossen
wird, das die Absorption verzögert,
zum Beispiel Aluminium-Monostearat und Gelatine.
-
Sterile,
injizierbare Lösungen
können
durch Einschluss des aktiven Bestandteils (z. B. anti-CTLA-4-Antikörper) in
erforderlicher Menge in ein geeignetes Lösungsmittel mit einem oder
einer Kombination aus den vorstehend aufgezählten Inhaltstoffen je nach
Anforderung mit anschließender
Filtersterilisation hergestellt werden. Allgemein werden Dispersionen
aus dem aktiven Bestandteil, der in ein steriles, ein Basis-Dispersionsmedium
enthaltendes Vehikel eingeschlossen wird, und den erforderlichen
weiteren der vorstehend aufgezählten
Inhaltstoffen hergestellt. In dem Fall steriler Pulver zur Herstellung
steriler injizierbarer Lösungen sind
die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung,
die ein Pulver des aktiven Inhaltstoffs (z. B. Antikörper) ergeben,
mit jedem zusätzlich
gewünschten
Inhaltstoff aus einer zuvor steril gefilterten Lösung hieraus.
-
Wenn
der aktive Bestandteil auf geeignete Art, wie vorstehend beschrieben,
geschützt
ist, kann der Bestandteil oral verabreicht werden, zum Beispiel
mit einer inerten Verdünnungslösung oder
einem assimilierbaren, essbaren Trägerstoff. Der hierin verwendete
Ausdruck „pharmazeutisch
verträglicher
Trägerstoff" umschließt jedes
und alle Lösungsmittel,
Dispersionsmedien, Ummantelungen, antibakteriellen und fungiziden Agenzien,
isotonische und Absorption verzögernde
Agenzien und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Agenzien
für pharmazeutisch
aktive Substanzen ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Soweit ein
herkömmliches
Medium oder Agens nicht verträglich
mit dem aktiven Bestandteil ist, ist seine Verwendung in den therapeutischen
Zusammensetzungen eingeschlossen. Ergänzende aktive Bestandteile
können
ebenfalls in den Zusammensetzungen eingeschlossen sein.
-
Es
ist besonders vorteilhaft, parenterale Zusammensetzungen in Dosierungseinheitsformen
zur leichten Verabreichung und Einheitlichkeit der Dosierung zu
formulieren. Der hierin verwendete Begriff Dosierungseinheitsform
betrifft physikalisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosierung
für die
zu behandelnden Säugerarten
geeignet sind; jede Einheit enthält
eine vorbestimmte Menge an aktivem Bestandteil, der so berechnet ist,
dass die gewünschte
therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen
Trägerstoff
erzielt wird. Die Spezifizierung der Dosierungseinheitsformen der
Erfindung wird diktiert und ist direkt abhängig von (a) den einzigartigen
Eigenschaften des aktiven Bestandteils und der jeweiligen zu erreichenden therapeutischen
Wirkung und (b) den Begrenzungen, die sich auf dem Fachgebiet der
Bildung eines solchen aktiven Bestandteils zur Behandlung der Sensitivität von Individuen
ergeben.
-
Diese
Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter erläutert, die
nicht als begrenzend betrachtet werden sollen. Die Inhalte aller
Referenzen, Patente und offengelegter Patentanmeldungen, die in
dieser Anmeldung zitiert werden, sind hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.
-
BEISPIEL 1: Herstellung
und Durchmusterung von monoclonalen anti-CTLA-4-Antikörpern
-
Produktion von monoclonalen
Antikörpern
für menschliches
CTLA-4
-
Weibliche
Balb/c-Mäuse
(bezogen von Taconic, Germantown, NY) wurden subkutan und intraperitoneal
immunisiert: entweder pro Maus mit 50 μg rekombinantem menschlichem
E. coli exprimiertem CTLA-4 (nur extrazelluläre Domäne), emulgiert in vollständigem Freundschen
Adjuvans (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) für Mäuse der
ER-Serie oder 2 × 106 PMA/Ionomycin aktivierte menschliche T-Zellen
(bezogen von Leukopaks) pro Maus für Mäuse der ES-Serie. Die Mäuse erhielten
eine Auffrischung mit 20–25 μg menschlichem
rekombinantem CTLA-4, emulgiert in unvollständigem Freundschem Adjuvans
(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) pro Maus oder 106 PMA/Ionomycin aktivierten menschlichen
T-Zellen in 14-tägigen
Intervallen nach den Anfangsimmunisierungen. Den Mäusen wurde
aus der Schwanzvene Blut entnommen, und die Seren wurden mit Hilfe
des ELISA-Verfahrens
gegen das immunisierende Protein auf Antikörper untersucht, die reaktiv
auf das Immunogen waren. Mäuse,
die einen starken serologischen Titer aufwiesen, erhielten intravenös eine Auffrischung
mit 50 μg
rekombinantem menschlichem CTLA-4 pro Maus, verdünnt in Phosphat gepufferter
Kochsalzlösung,
pH-Wert 7,2 (GIBCO, Grand Island, NY). Drei bis vier Tage nach der Auffrischung
wurden die Milzen dieser Mäuse
in einem Verhältnis
von 5 : 1 mit SP 2/0-Ag 14-Myelomzellen (ATCC, Rockville, MD) mit
PEG 1450 (ATCC, Rockville, MD) fusioniert und auf Platten mit 96
Vertiefungen ausgebracht, die bestrahlte MRC-5 Fibroblastzellen
(ATCC, Rockville, MD) in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (GIBCO,
Grand Island, NY) mit 25% CPSR-3 (Sigma Chemical Company), 2 mM
L-Glutamin, 50 U/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin, 20 μg/ml Gentamycin,
0,25 μg/ml
Fungizon und 10% NCTC-109 (GIBCO, Grand Island, NY) enthielten.
Auswahl der Hybridome wurde in Anwesenheit von Hypoxanthineaminopterin-Thymidin
(ATCC, Rockville. MD) durchgeführt.
Während
die Hybridomkolonien in den nächsten
10–21
Tagen hervorwuchsen, wurde der Überstand
aus den Vertiefungen auf Flachboden-EIA-Platten mit 96 Vertiefungen (Costar,
Cambridge, MA) durchmustert, die mit rekombinantem menschlichem
CTLA-4 als primäres
Absuchmaterial überzogen
waren. Sekundäre
Durchmusterung wurde mittels Durchflusscytometrie auf mit menschlichem
CTLA-4 transfizierte CHO-Zellen und mit PMA/Ionomycin aktivierte
menschliche T-Zellen durchgeführt.
Hybridom-Überstände, bei
denen sich herausstellte, dass sie gegen CTLA-4 gerichtete Antikörper enthielten,
wurden vermehrt und vor Ascitesproduktion und Reinigung der Antikörper durch
Affinitätschromatographie
mit Protein A-Sepharose zweimal subcloniert.
-
Primäre Durchmusterung von mAbs:
ELISA-Protokoll
-
Jede
Vertiefung einer Flachboden-EIA-Platte mit 96 Vertiefungen (Costar,
Cambridge, MA) wurde pro Vertiefung mit 50 μl einer 1 μg/ml Lösung aus rekombinantem menschlichem
CTLA-4, hergestellt in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert
7,2, über
Nacht bei 4°C überzogen.
Die CTLA-4-Lösung
wurde ausgesaugt, und die Vertiefungen wurden mit 100 μl 1% BSA
in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert 7,2, über 1 Stunde
bei Zimmertemperatur blockiert. Nach dieser Blockierungsinkubation
wurden die Vertiefungen 3 × mit
Phosphat gepufferter Kochsalzlösung,
pH-Wert 7,2, gewaschen und pro Vertiefung wurden 50 μl Hybridom-Überstand
zugegeben und 45 Minuten bei 37°C
inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Vertiefungen 3 × mit Phosphat
gepufferter Kochsalzlösung,
pH-Wert 7,2, gewaschen und dann pro Vertiefung mit 50 μl einer 1
: 4000 Verdünnung
aus Meerrettich-Peroxidase-konjugierten, affinitätsgereinigten, für anti-Maus-IgG der
Ziege (H&L) spezifischen
Antikörpern
(Zymed Laboratories, San Francisco, CA) über 45 Minuten bei 37°C inkubiert.
Die Vertiefungen wurden dann 3 × mit
Phosphat gepufferter Kochsalzlösung,
pH-Wert 7,2, gewaschen, worauf eine 30-minütige Inkubation mit 50 μl pro Vertiefung
einer Lösung
aus 1 mM ABTS (2,2 Azino-bis-3-ethylbenzthiazole-6-sulfonsäure) in
0.1 M Natriumcitrat, pH-Wert 4,2 folgte, der eine 1 : 1000-Verdünnung von
30% Wasserstoffperoxid als ein Substrat für die HPR zugegeben worden
war, um gebundene Antikörper
nachzuweisen. Die Absorption wurde dann bei 410 nm auf einem Spektralphotometer
(Molecular Devices Corp. Menlo Park, CA) gemessen.
-
Sekundäre Durchmusterung von mAbs:
Durchflusscytometrie
-
Sekundäre Durchmusterung
wurde mit Hilfe von Durchflusscytometrie auf mit menschlichem CTLA-4-gpi
transfizierten CHO-Zellen und mit PMA/Ionomycin aktivierten menschlichen
T-Zellen durchgeführt. CTLA-4
wurde durch Verbinden der extrazellulären Domäne von CTLA-4 mit einem Glycophosphatidylinosit(gpi)-Anker auf
CHO- und COS-Zellen exprimiert. DNA, die die extrazelluläre Domäne von CTLA-4
codiert, wurde aus einer menschlichen CTLA-4-cDNA mittels PCR amplifiziert,
wobei als Sense-Primer
CATGAAGCTTCTCGAGCCGCCACCATGGCTTGCCTTGGA
(SEQ ID NO: 1) verwendet wurde, der eine Hind III-Stelle, eine starke
Translation-Startstelle und die ersten 15 Nucleotide der CTLA-4
codierenden Sequenz enthielt, und als Antisense-Primer
GAGAATTCTAGACTAGCTTAAGTCAGAATCTGGGCACGGT
(SEQ ID NO: 2), der die letzten 19 Nucleotide der extrazellulären Domäne von CTLA-4
und eine Afl II-Stelle
enthielt. PCR-Bedingungen bestanden aus 94°C, 1 min, 43°C, 1 min, 72°C, 1 min über 35 Zyklen, gefolgt von
einem Zyklus mit 72°C über 10 min.
Das PCR-Produkt
wurde mit Hind III und Afl II gespalten, Gel-gereinigt und in einen
mit Hind III und Afl II gespaltenen pCDM8-Vektor ligiert, der den
gpi-Anker von menschlichem CD58 enthielt (vgl. J. Immunol. 148,
3271, freundlicherweise überlassen
von Dr. Donald Staunton, Center for Blood Research, Boston, MA).
Plasmide, die die CTLA-4-gpi-Insertion
enthielten, wurden vorübergehend
in COS-Zellen transfiziert und exprimierten stark das Zelloberflächen-CTLA-4,
wie durch Bindung von B7-Ig-Fusionsprotein
abgeschätzt
wurde. Das CTLA-4-gpi-Plasmid wurde zusammen mit einem Plasmid,
das Resistenz gegen Neomycin codierte, in CHO-Zellen transfiziert,
und stabile Transfektanten wurden mit G418 ausgewählt. CHO-Zell-Transfektanten
wurden auf der Basis von B7-Ig-Bindung sortiert und cloniert.
-
Zellen
für die
Durchflusscytometrie (entweder CHO-CTLA-4- oder aktivierte menschliche
T-Zellen) wurden gründlich
in 1% BSA in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert 7,2, gewaschen,
dann mit 50 μl
Hybridom-Überstand
oder Kulturmedium pro 106 Zellen über 30 Minuten
bei 4°C
inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen 3 × mit 1%
BSA in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert 7,2, gewaschen, dann
in 50 μl
einer 1 : 40-Verdünnungslösung aus
Fluorescein gebundenen anti-Maus-IgG(H&L)-Antikörpern der Ziege (Zymed Laboratories,
San Francisco, CA) über
30 Minuten bei 4°C
inkubiert. Die Zellen wurden dann 3 × in 1% BSA in Phosphat gepufferter
Kochsalzlösung,
pH-Wert 7,2, gewaschen und in 1% Paraformaldehyd-Lösung fixiert.
Die Zellproben wurden darauf auf einem FACScan-Durchflusscytometer
(Becton Dickinson, San Jose, CA) analysiert.
-
Primäre und sekundäre Durchmusterung
der monoclonalen anti-CTLA-4-Antikörper, wie vorstehend beschrieben,
führte
zur Isolierung von fünf
mAbs zur genaueren Untersuchung: ER4.7G11 (bezeichnet als 7G11),
ER5.3D8 (bezeichnet als 3D8) ER5.4D3 (bezeichnet als 4D3), ES5.3D6
(bezeichnet als 3D6) und ES5.4E3 (bezeichnet als 4E3). Die ER-Serie
von Antikörpern
wurde gegen rekombinantes menschliches CTLA-4 hergestellt, während die
ES-Serie von Antikörpern
gegen aktivierte menschlichen T-Zellen hergestellt wurde. Aus dieser
Gruppe wird ER4.7G11 nicht von der vorliegenden Erfindung eingeschlossen,
die Verweise hierauf in den nachstehenden Beispielen sollen jedoch
dazu dienen, die Erfindung zu erläutern.
-
BEISPIEL 2: Charakterisierung
von monoclonalen anti-CTLA-4 Antikörpern
-
Bindungsspezifität
-
Um
die Bindungsspezifität
der fünf
mAbs 7G11, 4D3, 3D6, 3D8 und 4E3 zu bestimmen, wurde ihre Bindung
entweder an CHO-Zellen, die transfiziert waren, CD28 zu exprimieren,
oder an CHO-Zellen, die transfiziert waren, CTLA-4 zu exprimieren,
mit Hilfe indirekter Immunfluoreszenz untersucht. Das Bindungsmuster der
verschiedenen anti-CTLA-4-mAbs (im Vergleich zu dem Kontroll-anti-CD28-mAb
3D10) wird nachstehend in Tabelle 1 zusammengefasst:
-
-
Es
stellte sich heraus, dass der 7G11-Antikörper sowohl an CHO-CD28 als
auch an CHO-CTLA-4 band und daher als ein anti-CD28/CTLA-4-mAb bezeichnet
wird. Im Gegensatz dazu stellte sich heraus, dass die mAbs 4D3,
3D6, 3D8 und 4E3 nur an das CHO-CTLA-4 banden und daher CTLA-4-spezifische
Antikörper sind.
Diese Antikörper
werden hierin auch als CTLA-4.1, CTLA-4.2, CTLA-4.3 bzw. CTLA-4.4
bezeichnet.
-
Epitopkartierung
-
Um
die Epitope zu bestimmen, die von den fünf vorstehend beschriebenen
mAbs erkannt werden, wurde Epitopkartierung mit Hilfe einer Durchmusterung
einer Phagen-Display Bibliothek (PDL) durchgeführt und unter Verwendung synthetischer
Peptide bestätigt.
Eine PDL mit 20 zufälligen
Aminosäuren
wurde durch Clonierung eines degenerierten Oligonucleotids in den
fUSE5-Vektor hergestellt (Scott, J. K. und Smith, G. P. (1990) Science
249, 386–390),
wie von Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,
6378–6382 beschrieben.
Die PDL wurde verwendet, um kurze Peptide mittels eines Mikropanning-Verfahrens,
beschrieben von Jellis, C. L. et al. (1993) Gene 137, 63–68, zu
identifizieren, die spezifisch die mAbs anti-CD28/CTLA-4 und anti-CTLA-4.1–CTLA-4.4
banden. Individuelle Phagenclone wurden auf Grund ihrer Affinität zu immobilisiertem
mAb aus der Bibliothek gereinigt, und das Zufallspeptid wurde durch
DNA-Sequenzierung ermittelt.
-
Sequenzanalyse
von 20 Clonen, die durch das Panning-Verfahren mit anti-CD28/CTLA-4 (7G11)
ausgewählt
worden waren, enthielten die neun einzigartigen nachstehend dargestellten
Peptidsequenzen.
-
Von
mAb 7G11 ausgewählte
Phagenpeptide
-
Aus
diesen neun Peptiden wurde eine Consensus-Bindungssequenz aus fünf Resten
P-P-Y-Y-L/I (SEQ ID NO: 12) identifiziert, innerhalb derer Y häufig durch
die aromatischen Reste F und W ersetzt war. Die Sequenz P-P-Y-Y-L
(SEQ ID NO: 13) wurde innerhalb der extrazellulären Domäne von hCTLA-4 identifiziert, innerhalb
oder sehr dicht an der CDR3-Domäne,
von der ein Abschnitt in dem synthetischen CTLA-4-Peptid RP 454
enthalten ist:
RP 454: KVELMYP[PPYYL]GIGNGTGG (SEQ ID NO: 14)
-
Das
Peptid RP454 wurde verwendet, um das Epitop von anti-CD28/CTLA-4
zu bestätigen
und könnte mit
natürlichem
hCTLA-4 um Bindung von anti-CD28/CTLA-4 konkurrieren. Die Sequenzidentität von CD28 und
CTLA-4 innerhalb der kartierten Region erklärt die beobachtete Kreuzreaktivität mit diesem
mAb auf CHO-CD28 und CHO-CTLA-4.
-
Die
mAbs CTLA-4.1–CTLA-4.4
wurden getrennt dem Panning-Verfahren unterworfen, und es wurde entdeckt,
dass Phagen jeder dieser individuellen Panning-Verfahren spezifisch
auf jeden der vier mAbs reagieren würde. DNA-Sequenzanalyse von 42 Phagenclonen ergab
die 14 nachstehend dargestellten Peptide:
-
Von
mAbs 4D3, 3D6, 3D8 und 4E3 ausgewählte Phagenpeptide
-
Aus
diesen Peptiden wurde das gemeinsame Epitop auf einen Strang von
sechs Resten auf hCTLA-4 kartiert, der die Aminosäuresequenz
L-T-F-L-D-D (SEQ ID NO: 29) aufweist. Dieses Epitop ist in der CDR2-ähnlichen
Region von CTLA-4 gelegen und unterscheidet sich von der Region
P-P-Y-Y-L (SEQ ID NO: 13), die vorstehend als das Epitop für den anti-CD28/CTLA-4-mAb
beschrieben wurde. Das gemeinsame anti-CTLA-4.1–CTLA-4.4-Epitop ist in dem
synthetischen CTLA-4-Peptid
RP 365 enthalten:
RP 365: AATYMMGNE[LTFLDD]SIC (SEQ ID NO:
30),
das zur Bestätigung
der Ergebnisse der Epitopkartierung verwendet wurde.
-
Kreuz-Kompetition mit
B7-1 und B7-2
-
Da
die fünf
anti-CTLA-4-mAbs an zwei verschiedene antigene Regionen des CTLA-4-Moleküls binden,
wurde untersucht, ob eine dieser Regionen Teil der Bindungsstelle
für Mitglieder
dieser Familie war. Die monoclonalen Antikörper 7G11 und 4D3 wurden auf
ihre Fähigkeit
untersucht, die Bindung von B7-1-Ig an CTLA-4-Ig zu blockieren (durchgeführt, wie
von Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173, 721–730; und
Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med 174, 561–569 beschrieben),
wobei die nachstehenden experimentellen Rahmen verwendet wurden:
-
Eine
Nunc-Maxisorp-Platte wurde über
Nacht bei Zimmertemperatur mit einer Lösung aus 20 μg/ml CTLA-4-Ig
in PBS überzogen,
dann für
1 Stunde mit PBS/1% BSA blockiert. 10 μg/ml biotinyliertes B7-1-Ig wurde
mit steigenden Mengen monoclonaler Antikörper zugegeben, bis zu 100 μg/ml. Kontrollreagenzien
(„kaltes" B7-1-Ig, CTLA-4-Ig,
anti-B7-1-Antikörper
4B2 und 6B10 und anti-HIV-Antikörper
59.1) wurden ebenfalls untersucht. Das biotinylierte B7-1-Ig wurde
mit Hilfe von Strepavidin-Meerrettich-Peroxidase (HRP) und enzymatischem
Substrat sichtbar gemacht. Die Ergebnisse, nachstehend zusammengefasst,
zeigen, dass 7G11 und 4D3 unwirksame Kompetitorsubstanzen waren:
-
TABELLE
2: Standard-Kurve für
die Bindung von biotinyliertem B7-1-Ig an CTLA-4-Ig
-
TABELLE
3: Wirkung von verschiedenen Kompetitorsubstanzen auf die Bindung
von 10 μg/ml
biotinyliertem B7-1-Ig an immobilisiertes CTLA-4-Ig
-
Im
zweiten Experiment wurde das Format „umgekehrt". Die Platte wurde über Nacht mit 20 μg/ml B7-1-Ig
in PBS überzogen,
mit PBS/1% BSA blockiert, dann mit biotinyliertem CTLA-4-Ig und
verschiedenen Kompetitor- und Kontrollsubstanzen inkubiert, wie
für das
erste Experiment beschrieben. Das biotinylierte CTLA-4-Ig wurde
mit Hilfe von Strepavidin:HRP und enzymatischem Substrat sichtbar
gemacht. Die Ergebnisse waren jenen vorstehend gezeigten ähnlich.
-
-
TABELLE
5: Wirkung verschiedener Kompetitorsubstanzen auf die Bindung von
biotinyliertem CTLA-4-Ig an immobilisiertes B7-1-Ig
-
Zusammengenommen
zeigen diese komplementären
Datensätze
an, dass die mAbs 7G11 und 4D3 nicht das Vermögen haben, die Bindung von
CTLA-4-Ig an B7-1-Ig aufzubrechen. Ähnliche Ergebnisse wurden in
Experimenten beobachtet, in denen B7-2-Ig verwendet wurde. Das Ergebnis,
dass der anti-CD28/CTLA-4-Antikörper
(7G11) die Bindung von B7-1-Ig an CTLA-4 (oder anders herum) nicht
verhinderte, war überraschend,
da zuvor vorgeschlagen worden war, dass die Sequenz M-Y-P-P-P-Y (SEQ ID NO: 31),
die sich mit dem für
den 7G11-Antikörper
kartierten P-P-Y-Y-L(SEQ ID NO: 13)-Epitop überschneidet, Teil der Bindungsstelle
sowohl von CD28 als auch von CTLA-4 an B7-1 war (vgl. Harper, K,
et al, (1991) J. Immunol, 147: 1037–1044).
-
BEISPIEL 3: Induktion
von Apoptose in T-Zellen durch anti-CTLA-4-Antikörper
-
In
diesem Beispiel wurde Apoptose in zuvor aktivierten T-Zellen durch
Bindung von CTLA-4 an der T-Zelloberfläche unter Verwendung eines
anti-CTLA-4-mAb induziert. In den ersten Serien der Experimente wurde
ein alloreaktiver T-Zell-Clon verwendet. Alloreaktive T-Zell-Clone
mit Spezifität
für HLA-DR7
wurden aus HLA-DR7-negativen Individuen hergestellt. T-Zell-Clone
wurden durch Kultur über
24 h mit einer bestrahlten, homozygoten lymphoblastoiden DR7+-Zelllinie (LBL-DR7) aktiviert, die innerhalb
von 24 h CTLA-4-Expression an der Oberfläche induziert. Die T-Zellen
wurden mit einer Konzentration von 105 Zellen/Vertiefung
in Flachboden-Mikrotiterplatten
mit 96 Vertiefungen bei 37°C,
5% CO2 kultiviert. Aktivierte T-Zell-Clone wurden allein
oder zusammen mit anti-CD28- oder anti-CTLA-4-mAbs mit NIH-3T3-Zellen
wiederholt herausgefordert, die mit menschlichem DRα und DR7β transfiziert
waren (t-DR7; beschrieben von Gimmi, C. D. et al, (1993) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90, 6586–6590),
um ein zweites Signal hervorzurufen. Einlagerung von Thymidin als
ein Index für
mitotische Aktivität
wurde durch Standardverfahren untersucht. IL-2- und IL-4-Konzentrationen
in Kulturüberständen wurden
durch Standard-ELISA-Verfahren untersucht. Apoptose wurde durch
die Anwesenheit von DNA-Fragmentierung auf Agarosegel-Elektrophorese
untersucht, wie von Quingsheng, T. et al. (1991) Cell 67, 629–639 beschrieben.
Kurz beschrieben wurde DNA aus Zellen extrahiert, und die Proben
wurden auf ein 1% Agarosegel geladen, das 0,5 μg/ml Ethidiumbromid enthielt.
Nach der Elektrophorese wurde die DNA unter UV-Licht sichtbar gemacht
und auf die Anwesenheit von Fragmenten mit Nucleosomaler Länge, die
kennzeichnend für
Apoptose ist, untersucht. Zusätzlich
wurde die Apoptose durch Aufnahmen von 33342-Farbstoff von Hoechst
untersucht, wie von Hardin, J. A. (1992) J. Immunol. Methods 154,
99–107
beschrieben.
-
Die
Ergebnisse werden grafisch in 1A dargestellt.
Aktivierte T-Zell-Clone proliferierten als Antwort auf Herausforderung
mit t-DR7 ohne nachweisbare Akkumulation von IL-2. Die Zugabe von
anti-CD28- oder anti-CD28/CTLA-4-mAb (z. B. 7G11) führte zu
signifikanter Proliferation und IL-2-Akkumulation. Im Gegensatz dazu
stimulierte die Zugabe von anti-CTLA-4.1-mAb zur mit t-DR7 stimulierten
T-Zellkultur die
Proliferation nicht, sondern führte
statt dessen zu einer signifikant erniedrigten Proliferation, keiner
nachweisbaren IL-2-Akkumulation und induzierte Apoptose, wie durch
DNA-Fragmentierung gemessen wurde. Die Zugabe von exogenem IL-2
zu der mit t-DR7 und CTLA-4.1-mAb stimulierten T-Zellkultur führte zu
signifikanter T-Zell-Proliferation, die mit jener vergleichbar war,
die bei der Zugabe von IL-2 allein zu t-DR7 beobachtet worden war,
und verhinderte die Induktion von Apoptose durch t-DR7 und anti-CTLA-4-mAb.
Nach der CTLA-4-Bindung mit CTLA-4.1
wurde nicht beobachtet, dass aktivierte T-Zell-Clone in Anwesenheit
von exogenem IL-2 proliferierten, was mit der Schlussfolgerung übereinstimmt,
dass diese Zellen Antigen-spezifische clonale Deletion durchliefen.
-
In
einer zweiten Reihe von Experimenten wurde untersucht, ob CTLA-4-Bindung
gleichfalls Apoptose in zuvor aktivierten, normalen menschlichen
T-Zellen induzieren konnte. CD4-positive T-Zellblasten wurden durch
negative Abreicherung nach einer Kultur von PBMC über vier
Tage in Medien, die Phytohämagglutinin (PHA)
enthielten, um die T-Zellen zu aktivieren, isoliert. Die Zellen
wurden ausführlich
gewaschen und dann erneut in Anwesenheit verschiedener zweiter Signale
mit anti-CD3-mAB
herausgefordert.
-
Die
Ergebnisse werden grafisch in 1B dargestellt.
Anti-CTLA-4-mAb hatte ohne anti-CD3-Behandlung keine Auswirkung
auf T-Zell-Proliferation oder IL-2-Produktion. Anti-CD3 allein induzierte
eine geringe Proliferation von PHA-Blasten, begleitet von niedrigen
Spiegeln an IL-2-Akkumulation. Die Zugabe von anti-CD28 oder anti-CD28/CTLA-4(z. B.
7G11)-mAbs verstärkte
sowohl die Proliferation als auch IL-2-Akkumulation. Ähnlich wie die vorstehend beschriebenen
Ergebnisse für
den HLA-DR7-spezifischen,
alloreaktiven T-Zell-Clon führte
anti-CD3-Stimulierung von aktivierten, normalen T-Zellen des peripheren
Blutes in Anwesenheit von jedem anti-CTLA-4-mAb (z. B. CTLA-4.1–CTLA-4.4)
zu verminderter Proliferation, Abwesenheit von IL-2-Akkumulation
und zu Apoptose. Apoptose war schon nach nur 6 h Kultur nachweisbar.
Querverknüpfung von
CTLA-4 war notwendig, denn anti-CTLA-4.1-Fab hatte keine Wirkung.
Wie bei den aktiven Zellclonen beobachtet wurde, schützte die
Zugabe von exogenem IL-2 zu anti-CTLA-4.1-mAb vor Apoptose. In ähnlicher Weise
schützte
auch die Zugabe von anti-CD28 gegen Apoptose. Die Apoptose schien
nicht nur ein Ergebnis des Verlustes der Produktion von IL-2 zu
sein, denn CD4+-PHA-Blasten, die in Medien allein über Zeiträume bis
zu 24 Stunden kultiviert wurden, durchliefen keine Apoptose. Die
Spezifität
der CTLA-4-Querverknüpfung wurde
durch den Befund gezeigt, dass anti-CD45-, anti-CD45RA-, anti-CD45RO-,
anti-CD4-, anti-CD5- oder anti-CD6-mAb-Querverknüpfung unter identischen Kulturbedingungen
in keinem einzigen der 5 durchgeführten Experimente verringerte
Proliferation oder Apoptose induzierten. Ähnliche Ausmaße an Apoptose
wurden auch bei isolierten nicht fraktionierten T-Zellen, CD28-positiven
und CD8-positiven
PHA-Blasten beobachtet, die unter identischen Kulturbedingungen
untersucht wurden.
-
BEISPIEL 4: Induktion
von Apoptose in T-Zellen durch einen neuartigen CTLA-4-Liganden
-
Wie
in Beispiel 2 beschrieben, induziert die Bindung von CTLA-4 mit
einem anti-CTLA-4-Antikörper in Anwesenheit
eines primären
Aktivierungssignals Apoptose bei zuvor aktivierten, normalen T-Zellen
und alloreaktiven T-Zell-Clonen. Als nächstes wurde untersucht, ob
einer der bekannten CTLA-4-Liganden B7-1 oder B7-2 diese Funktion
ebenfalls vermitteln könnte.
Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen identischen Systems
zur Aktivierung von T-Zellen wurden aktivierte alloreaktive T-Zell-Clone
erneut mit COS-Zellen herausgefordert, die in der Weise transfiziert
waren, dass sie HLA-DR7 allein (t-DR7) exprimierten, oder mit COS-Zellen, die in der
Weise transfiziert waren, dass sie sowohl HLA-DR7 und entweder B7-1
(tDR7/B7-1) oder B7-2 (tDR7/B7-2) zusammen exprimierten, um Signal
2 auszulösen.
Zum Schein transfizierte Kontrollzellen (t-mock) wurden nur mit
dem pCDNAI-Plasmid transfiziert. Die Ergebnisse werden grafisch
in 2A dargestellt. Wie zuvor beobachtet, wurde bei
Kultur von aktivierten T-Zell-Clonen mit t-DR7 in Anwesenheit von anti-CTLA-4.1
Proliferation unterdrückt
und Apoptose induziert. Im Gegensatz dazu induzierten sowohl t-DR7/B7-1
als auch t-DR7/B7-2 vermehrte Proliferation und induzierten keine
Apoptose. Zugabe von anti-CD28-Fab blockierte die vermehrte Proliferation,
die sowohl von B7-1 als auch von B7-2 induziert wurde (d. h. das
Ausmaß der
Proliferation war im Vergleich zu dem bei t-DR7 allein beobachteten
reduziert), wodurch gezeigt wird, dass das von B7-1 oder B7-2 gelieferte
proliferative Signal tatsächlich über CD28
vermittelt wurde. Darüber
hinaus gab es, im Vergleich zu t-DR7 allein, unter diesen Umständen, unter
denen B7-1 oder B7-2 in Abwesenheit von CD28 vermittelter Signalgebung
an CTLA-4 bindet, weder eine verminderte Proliferation noch Apoptose.
Identische Ergebnisse wurden mit PHA-aktivierten, normalen menschlichen
T-Zellen beobachtet. Aus diesen Experimenten kann geschlossen werden,
dass keiner der molekular clonierten, natürlichen CTLA-4-Liganden (z.
B. B7-1 oder B7-2) Antigen-spezifische clonale Deletion von T-Zellen
vermittelt.
-
Unter
Berücksichtigung,
dass die beiden molekular clonierten natürlichen CTLA-4-Liganden die Antigen-spezifische
clonale Deletion nicht vermittelten, wurde als Nächstes untersucht, ob ein alternativer
CTLA-4-Ligand Apoptose vermittelt. Aktivierte alloreaktive T-Zell-Clone
wurden mit LBL-DR7 allein oder in Anwesenheit verschiedener mAbs
und Ig-Fusionsproteine wiederholt herausgefordert, wie in 2B gezeigt, die die Ergebnisse des Experimentes
darstellt. Alle mAbs wurden der Kultur in einer Endkonzentration
von 10 μg/ml zugegeben.
Blockierende mAbs, die gegen B7-1, B7-2 und B7-3 gerichtet waren
(BB1-mAb), unterdrückten individuell
von LBL-DR7 induzierte Proliferation um 25%. Zugabe von CTLA-4-Ig,
nicht aber von Kontroll-Ig, unterdrückte die Proliferation um 50%
und blockierte die IL-2-Produktion
vollständig.
Die resultierende Proliferation war mit jener vergleichbar, die
mit t-DR7 allein beobachtet wurde. Die kombinierte Zugabe von anti-B7-1- und
B7-2-mAbs jedoch
unterdrückte
die Proliferation bemerkenswert stark und, noch wichtiger, die T-Zellen durchliefen
Apoptose. Weitere Zugabe von BB1-mAb oder Kontroll-Ig zu anti-B7-1-
und anti-B7-2-mAbs hatte weder auf Proliferation noch auf Apoptose
zusätzliche
Auswirkungen. Im Gegensatz dazu blockierte die Zugabe von entweder
CTLA-4-Ig oder CTLA-4.1-Fab zu anti-B7-1- und anti-B7-2-mAbs die
Apoptose vollständig und
ließ das
Ausmaß der
Proliferation auf jenes zurückkehren,
das mit t-DR7 allein
beobachtet worden war. Diese Daten zeigen, dass der auf LBL-DR7
exprimierte Ligand, der Apoptose induziert, weder B7-1 noch B7-2 ist,
sondern dass es ein CTLA-4 bindender Ligand ist, der das Signal
durch CTLA-4 sendet. Die Apoptose war Antigen-spezifisch, denn LBL-DR1-Zellen
verminderten unter identischen Kulturbedingungen die Proliferation nicht
oder induzierten keine Apoptose. Ähnlich wie bei zuvor gemachten,
in Beispiel 4 beschriebenen Beobachtungen, unterbrach die Zugabe
von IL-2 zu anti-B7-1 und anti-B7-2 die Unterdrückung von Proliferation und Apoptose.
Wiederum wurden identische Beobachtungen mit PHA-Blasten gemacht.
-
Zusammen
genommen zeigen diese Ergebnisse, dass der physiologische Ligand
für CTLA-4,
der Antigen-spezifische T-Zell-Apoptose vermittelt, folgende Eigenschaften
hat: 1) von LBL-DR7-Zellen exprimiert wird, 2) weder B7-1 noch B7-2
ist, denn Blockierung von B7-1 und B7-2 verhinderte Apoptose nicht,
3) ein CTLA-4 bindender Ligand ist, denn CTLA-4-Ig blockierte Apoptose
und 4) das Signal durch CTLA-4 vermittelt, denn anti-CTLA-4.1 blockiert
Apoptose ebenfalls. Darüber
hinaus scheint das funktionelle Epitop auf diesem natürlichen
Liganden an das identische CTLA-4-Epitop (L-T-F-L-D-D; SEQ ID NO: 29)
zu binden, das von allen vier hierin beschriebenen anti-CTLA-4-mAbs
erkannt wird, da CTLA-4.1-Fab Apoptose blockieren konnte. Diese
Ergebnisse stimmen mit der Hypothese überein, dass CTLA-4 kein redundanter,
CD28 ähnlicher
costimulatorischer Stoffwechselweg ist, sondern ein eigenständiger Weg
der Signalgebung, der in der Lage ist, unter geeigneten Bedingungen
zuvor aktivierte T-Zellen clonal zu deletieren, und darüber hinaus,
dass ein neuartiger natürlicher
CTLA-4-Ligand, der auf LBL-DR7 vorkommt, diese Apoptose vermitteln
kann.
-
Während einer
laufenden Immunantwort besteht eine Balance zwischen Signalen, die
Aktivierung/Erweiterung, und jenen, die nachfolgend Antigen-spezifische
zelluläre
Deletion induzieren. Die Querverknüpfung entweder von CD28 oder
der gemeinsamen Bindungsregion von CD28/CTLA-4 durch mAbs oder deren
natürliche
Liganden B7-1 oder B7-2 liefert ein solches positives costimulatorisches
Signal, das zur Akkumulation von IL-2 führt. Die hierin beschriebenen
Ergebnisse legen nahe, dass Signale, die IL-2-Akkumulation induzieren,
dominant sind, denn sie erweitern die Immunantwort und schützen dadurch
die laufende Immunantwort vor CTLA-4 vermittelter Apoptose. Da B7-1
und B7-2 Liganden sowohl für
CD28 als auch für
CTLA-4 sind, sollten sie in den meisten Fällen ein Signal zur Vermehrung
statt zur Verminderung von Zellen vermitteln. Während dieses Zeitraums vermittelt
die Querverknüpfung
von CTLA-4 keine Apoptose, kann aber im Gegensatz dazu ein synergistisches
costimulatorisches Signal für
CD28 liefern. Nach der T-Zell-Aktivierung
senkt die CD28-Einbeziehung durch B7-1 die CD28-Synthese und -Funktion
(Linsley, P. S. et al. (1993) J. Immunol. 150, 3161–3169),
während
die CTLA-4-Expression ansteigt. Unter Bedingungen, unter denen die
proliferative Antwort schwächer
wird, kann dann die Querverknüpfung
von CTLA-4 in Abwesenheit von CD28 vermittelter Costimulation zelluläre Deletion
der zuvor aktivierten Zellen induzieren. Diese funktionale Kapazität, abhängig von
dem Aktivierungsstatus der T-Zelle, entweder zu costimulieren oder
Apoptose zu induzieren, erinnert an das funktionelle Repertoire
von Mitgliedern der TNF-Familie von Rezeptoren (vgl. Smith et. al.
(1994) Cell 76, 959–962).
CTLA-4-Querverknüpfung vermittelt
jedoch, anders als bei der von Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie induzierten
Apoptose, Antigen-spezifische clonale Deletion, da es auch ein Signal
durch den TCR benötigt.
-
Beispiel 5: Clonierung
eines CTLA-4-Liganden, der Apoptose in aktivierten T-Zellen induziert
-
Der
natürliche
CTLA-4-Ligand, der Apoptose in T-Zellen vermittelt, wird molekular
durch Expressionsclonierung, basierend auf seiner Wechselwirkung
mit CTLA-4, isoliert. Wie in Beispiel 5 gezeigt, wird der natürliche CTLA-4-Ligand
an der Oberfläche
einer B-Lymphoblastoid-Zelllinie (LBL) exprimiert. Solche LBL-Zelllinien
sind auf dem Fachgebiet bekannt und können mit Hilfe von Standardverfahren
hergestellt werden, die für
Transformation von B-Lymphomzellen das Epstein-Barr-Virus verwenden.
Um den natürlichen
CTLA-4-Liganden, der Apoptose in T-Zellen vermittelt, zu isolieren,
wird eine cDNA-Expressionsbibliothek aus einer solchen LBL-Zelllinie wie folgt
hergestellt:
-
A. Konstruktion einer
cDNA-Expressionsbibliothek
-
Eine
cDNA-Bibliothek wird in einem eukaryontischen Expressionsvektor
wie etwa dem pCDM8-Vektor (Seed, (1987) Nature 329, 840) unter Verwendung
von Poly(A)+-RNA hergestellt, die aus der
LBL-Zelllinie, wie beschrieben, isoliert wird (Aruffo et al. (1987)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3365). Um die Gesamt-RNA zu gewinnen,
werden die LBL-Zellen aus der Kultur geerntet, und das Zellpellet
wird in einer Lösung
aus 4 M Guanidinthiocyanat, 0,5% Sarkosyl, 25 mM EDTA, pH-Wert 7,5,
0,13% Sigma-Anti-foam A und 0,7% Mercaptoethanol homogenisiert.
RNA wird aus dem Homogenisat durch Zentrifugation über 24 Stunden
bei 32.000 UpM durch eine Lösung
aus 5.7 M CsCl, 10 mM EDTA, 25 mM Na-Acetat, pH-Wert 7, gereinigt.
Das RNA-Pellet wird in 5% Sarkosyl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH-Wert
7,5, gelöst
und mit zwei Volumina aus 50% Phenol, 49% Chloroform, 1% Isoamylalkohol
extrahiert. RNA wird zweimal mit Ethanol ausgefällt. Poly(A)+-RNA,
die zur Herstellung der cDNA-Bibliothek verwendet wird, wird durch
zwei Zyklen von oligo-(dT)-Cellulose-Selektion gereinigt.
-
Komplementäre DNA wird
aus 5,5 μg
poly(A)+-RNA bei 37°C über 1 h in einem Reaktionsgemisch
synthetisiert, das 50 mM Tris, pH-Wert 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreit, 500 μM dATP, dCTP, dGTP,
dTTP, 50 μg/ml
oligo(dT)12-18, 180 Einheiten/ml RNasin und 10.000 Einheiten/ml
reverse Moloney-MLV-Transkriptase in einem Gesamtvolumen von 55 μl enthält. Nach
der reversen Transkription wird die cDNA durch Einstellung der Lösung auf
25 mM Tris, pH-Wert 8,3, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2,
je 250 μM
dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 5 mM Dithiothreit, 250 Einheiten/ml DNA-Polymerase
I, 8,5 Einheiten/ml Ribonuclease H und Inkubation bei 16°C über 2 h
in doppelsträngige
DNA umgewandelt. EDTA wird zu 18 mM zugegeben, und die Lösung wird
mit einem gleichen Volumen aus 50% Phenol, 49% Chloroform, 1% Isoamylalkohol
extrahiert. DNA wird mit zwei Volumen Ethanol in Anwesenheit von
2,5 M Ammoniumacetat und mit 4 Microgramm linearem Polyacrylamid
als Trägerstoff
ausgefällt.
Zusätzlich
wird cDNA aus 4 μg
poly(A)+-RNA
in einem Reaktionsgemisch bei 42°C über 0,67
h synthetisiert, das 50 mM Tris, pH-Wert 8,8, 50 μg/ml oligo(dT)12-18,
327 Einheiten/ml RNasin und 952 Einheiten/ml reverse AMV-Transkriptase
in einem Gesamtvolumen von 100 μl enthält. Nach
der reversen Transkription wird die reverse Transkriptase durch
Erhitzen auf 70°C über 10 min inaktiviert.
Die cDNA wird durch Zugabe von 320 μl H2O
und 80 μl
einer Lösung
aus 0,1 M Tris, pH-Wert 7,5, 25 mM MgCl2,
0.5 M KCl, 250 μg/ml
Rinderserumalbumin und 50 mM Dithiothreit und Einstellung der Lösung auf
je 200 μM
dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 50 Einheiten/ml DNA-Polymerase I, 8 Einheiten/ml
Ribonuclease H und Inkubation bei 16°C über 2 Stunden in doppelsträngige DNA
umgewandelt. EDTA wird zu 18 mM zugegeben, und die Lösung wird
mit einem gleichen Volumen aus 50% Phenol, 49% Chloroform, 1% Isoamylalkohol extrahiert.
DNA wird mit zwei Volumina Ethanol in Anwesenheit von 2,5 M Ammoniumacetat
und mit 4 Microgramm linearem Polyacrylamid als Trägerstoff
ausgefällt.
-
Die
DNA aus 4 μg
reverser AMV-Transkription und 2.0 μg reverser Moloney-MLV-Transkription werden kombiniert.
Nicht selbstkomplementäre
BstXI-Adaptoren werden der DNA wie folgt zugegeben: Die doppelsträngige cDNA
aus 6 μg
poly(A)+-RNA
wird mit 3,6 μg
eines Kinase behandelten Oligonucleotids mit der Sequenz CTTTAGAGCACA
(SEQ ID NO: 31) und 2,4 μg
eines Kinase behandelten Oligonucleotids mit der Sequenz CTCTAAAG
(SEQ ID NO: 32) in einer Lösung
bei 15°C über 16 Stunden
inkubiert, die 6 mM Tris, pH-Wert 7,5, 6 mM MgCl2,
5 mM NaCl, 350 μg/ml
Rinderserumalbumin, 7 mM Mercaptoethanol, 0.1 mM ATP, 2 mM Dithiothreit,
1 mM Spermidin und 600 Einheiten T4 DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen
von 0,45 ml enthält.
EDTA wird zu 34 mM zugegeben, und die Lösung wird mit einem gleichen
Volumen aus 50% Phenol, 49% Chloroform, 1% Isoamylalkohol extrahiert.
Die DNA wird mit zwei Volumina Ethanol in Anwesenheit von 2,5 M
Ammoniumacetat ausgefällt.
-
DNA,
die länger
als 600 Bp ist, wird wie folgt ausgewählt: die mit Adaptoren versehene
DNA wird in 10 mM Tris, pH-Wert 8, 1 mM EDTA, 600 mM NaCl, 0.1%
Sarkosyl wieder gelöst
und auf einer Sepharose-CL-4B-Säule
in der gleichen Pufferlösung
chromatographiert. DNA aus dem Leervolumen der Säule (das DNA enthält, die
größer als
600 Bp ist) wird zusammengegeben und mit Ethanol ausgefällt.
-
Der
pCDM8-Vektor für
cDNA-Clonierung wird durch Spaltung mit BstXI und Reinigung auf
einem Agarosegel hergestellt. Die mit Adaptoren versehene cDNA aus
6 μg poly(A)+-RNA wird an 2, 25 μg mit BstXI gespaltenem pCDM8
in einer Lösung,
die 6 mM Tris, pH-Wert 7,5, 6 mM MgCl2,
5 mM NaCl, 350 μg/ml
Rinderserum, 7 mM Mercaptoethanol, 0,1 mM ATP, 2 mM Dithiothreit,
1 mM Spermidin und 600 Einheiten T4-DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen
von 1.5 ml enthält,
bei 15°C über 24 h
ligiert. Das Reaktionsgemisch aus der Ligation wird dann mit Standardverfahren
in kompetente E. coli DH10B/P3 transformiert.
-
Plasmid-DNA
wird aus einer 500 ml-Kultur der ursprünglichen Transformation der
cDNA-Bibliothek hergestellt. Plasmid-DNA wird durch das alkalische
Lyse-Verfahren gereinigt, gefolgt von zweifacher Bindung in CsCl-Gleichgewichtsgradienten
(Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laborarory Manual, Cold Spring
Harbor, NY (1987)).
-
B. Clonierungsverfahren
-
Im
Clonierungsverfahren wird die cDNA-Expressionsbibliothek in eine
eukaryontische Zelllinie wie etwa COS-Zellen eingebracht, und die
Zellen werden mit CTLA-4-Protein (z. B. einem CTLA-4-Ig-Fusionsprotein)
durchmustert, um Transfektanten zu identifizieren, die einen CTLA-4-Liganden
an ihrer Oberfläche
exprimieren. Weil die cDNA-Bibliothek zusätzlich zu cDNA, die den Apoptose
induzierenden CTLA-4-Liganden codiert, vermutlich auch „verunreinigende" B7-1- und B7-2-cDNA enthält, umschließen die
zweite und dritte Runde der Durchmusterung der Bibliothek eine Vorbehandlung
mit anti-B7-1- und anti-B7-2-Antikörpern, gefolgt von
einer Abreicherung mit Hilfe immunmagnetischer Perlen unter Verwendung
von anti-Maus-Ig gebundenen magnetischen Perlen, um Clone, die diese
Proteine exprimieren, zu entfernen. In der ersten Runde der Durchmusterung
werden 30 100 mm-Schalen mit 50% konfluenten COS-Zellen mit 0,05 μg/ml DNA
der LBL-Zelllinien-Bibliothek unter Verwendung des DEAE-Dextran-Verfahrens (Seed,
B. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,3365) transfiziert.
Die Zellen werden trypsinisiert und nach 24 Stunden erneut plattiert.
Nach 47 Stunden werden die Zellen durch Inkubation in PBS/0,5 mM
EDTA, pH-Wert 7,4/0,02% Na-Azid bei 37°C über 30 min abgelöst.
-
Die
abgelösten
Zellen werden mit 10 μg/ml
CTLA-4-Ig behandelt (rekombinantes CTLA-4-menschliches Ig-Fusionsprotein
wird von Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med. 174, 561–569 und
Gimmi, C. D. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6586–6590 beschrieben).
Die Zellen werden mit dem Fusionsprotein über 45 Minuten bei 4°C inkubiert.
Die Zellen werden gewaschen und in Panningschalen verteilt, die
mit affinitätsgereinigten
anti-menschlichem IgG-Antikörper
der Ziege ausgekleidet sind und können sich bei Zimmertemperatur
anheften. Nach 3 Stunden werden die Platten sanft zweimal mit PBS/0,5
mM EDTA, pH-Wert 7,4/0,02% Na-Azid, 5% FCS und einmal mit 0,15 M
NaCl, 0,01 M Hepes, pH-Wert 7,4, 5% FCS gewaschen. Ungebundene Zellen
werden auf diese Weise entfernt, und episomale DNA wird von den
anhaftenden Zellen des Panning-Verfahrens (z. B. Zellen, die an
CTLA-4-Ig binden) mit Hilfe herkömmlicher
Verfahren gewonnen.
-
Episomale
DNA wird in E. coli DH10B/P3 transformiert. Die Plasmid-DNA wird
in COS-Zellen via Sphäroblastfusion,
wie beschrieben, zurückgeführt (Seed,
B. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3365) und der Zyklus
von Expression und Panning wird zweimal wiederholt. In den zweiten
und dritten Runden der Auslese werden nach 47 Stunden die abgelösten COS-Zellen
zuerst mit 10 μg/ml
murinem anti-B7-1-mAb (z. B. mAb 133, beschreiben von Freedman,
A. S. et al. (1987) J. Immunol. 137, 3260–3267, mAb L307, käuflich zu
erwerben bei Becton Dickinson und/oder B1.1 von Repligen Corp.)
und anti-B7-2-mAb (z. B. mAb B-70, beschrieben von Azuma, M. et
al. (1993) Nature 366, 76–79,
käuflich
zu erwerben bei Pharmingen) über
45 Minuten bei 4°C
inkubiert. Zellen, die B7-1 oder B7-2 exprimieren, werden unter
Verwendung von anti-Maus-IgG und IgM überzogenen magnetischen Perlen
entfernt. COS-Zellen werden dann mit 10 μg/ml menschlichem CTLA-4-Ig
(hCTLA-4-Ig) behandelt. Zellen, die einen neuartigen CTLA-4-Liganden
exprimieren, werden durch Panning in Schalen, die mit anti-Mensch-IgG-Antikörper der
Ziege überzogen
sind, ausgewählt.
Nach der dritten Runde der Durchmusterung wird von den einzelnen
Kolonien Plasmid-DNA hergestellt und in COS-Zellen mit Hilfe des
DEAE-Dextran-Verfahrens transfiziert. Die Expression des CTLA-4-Liganden auf transfizierten COS-Zellen
wird durch indirekte Immunfluoreszenz mit CTLA-4-Ig analysiert.
-
In
einem alternativen Ansatz werden die Clone auf Grund ihrer Bindung
an den BB1-Antikörper ausgewählt. Ein
Kandidat für
den neuartigen CTLA-4-Liganden ist B7-3, das durch die Bindung des
BB1-mAb definiert ist (Boussiotis, V. A. et al. (1993) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90, 11059–11063).
Obwohl der BB1-mAb unfähig
war, CTLA-4 vermittelte Apoptose zu blockieren (vgl. Beispiel 5),
ist es möglich,
dass B7-3 der CTLA-4-Ligand ist, der Apoptose vermittelt, dass aber
der BB1-mAb für
diese Funktion kein blockierender Antikörper ist. Demzufolge kann eine
cDNA-Expressionsbibliothek,
wie vorstehend beschrieben, auf Clone durchmustert werden, die an
den BB1-mAb binden (der BB1-mAb wird von Yokochi, T. et al. (1982)
J. Immunol. 128, 823–827
beschrieben). Die Clone werden durch Panning auf Platten isoliert,
die mit sekundärem
anti-Maus-IgM-Antikörper
der Ziege überzogen
sind. Die LBL-cDNA-Bibliothek kann verwendet werden, oder es kann
alternativ eine Bibliothek aus aktivierten menschlichen Keratinocyten,
von denen man weiß,
dass sie das BB1-Antigen exprimieren, hergestellt und, wie vorstehend
beschrieben, durchmustert werden.
-
Die
Fähigkeit
eines CTLA-4-Liganden, der, wie vorstehend beschrieben, durch Expressionsclonierung isoliert
wurde, Antigen-spezifische Apoptose in aktivierten T-Zellen zu induzieren,
kann mit Hilfe des in den vorstehenden Beispielen beschriebenen
Systems untersucht werden. Zum Beispiel kann eine cDNA aus der Durchmusterung
der Bibliothek in CHO-Zellen eingeführt werden, um CHO-Transfektanten zu
erzeugen, die den CTLA-4-Liganden auf ihrer Oberfläche exprimieren
(CHO-CTLA-4-L). Um Apoptose in normalen menschlichen T-Zellen zu
untersuchen, werden PHA aktivierte CD4+ T-Zellblasten
mit anti-CD3 und CHO-CTLA-4-L kultiviert,
und DNA-Fragmentierung wird als ein Maß für Apoptose bestimmt. Um Antigen-spezifische
Apoptose in alloreaktiven T-Zellen zu untersuchen, wird ein zuvor
aktivierter HLA-DR7-spezifischer T-Zell-Clon mit CHO-Zellen kultiviert,
die transfiziert sind, um sowohl HLA-DR7 als auch den CTLA-4-Liganden (CHO-DR7/CTLA-4-L)
zu exprimieren, und DNA-Fragmentierung und Herunterregelung von
T-Zell-Proliferation werden als ein Maß für Apoptose und biologische
Funktion untersucht.
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Beispiel 6: Expression
der menschlichen extrazellulären
Domäne
von CTLA-4 in E. coli
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Clonierung der extrazellulären CTLA-4-Domäne
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Die
extrazelluläre
Domäne
von CTLA-4 wurde nach Clonierung in den Expressionsvektor pETCm11a in
E. coli exprimiert. Dieser Vektor wurde durch Clonierung einer Chloramphenicol-Resistenzgen-Kassette
in die ScaI-Restriktionsstelle
innerhalb des Ampicillin-Resistenzgens aus dem Expressionsvektor
pET-11a (Novagen Inc., Madison WI) erhalten. Die extrazelluläre Domäne von CTLA-4
wurde aus dem Plasmid phCTLA-4 durch PCR-Amplifikation unter Verwendung
des Oligonucleotids
5'GCAGAGAGACATATGGCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGG-3' (SEQ ID NO: 37)
als vorwärts
gerichtetem Primer und des Oligonucleotids
5'-GCAGAGAGAGGATCCTCAGTCAGTTAGTCAGAATCTGGGCACGGTTCTGG-3' (SEQ ID NO: 38)
als reversem Primer hergestellt. Der vorwärts gerichtete PCR-Primer enthält eine
NdeI-Restriktionsstelle, in der der ATG-Sequenz in der NdeI-Restriktionsstelle
unmittelbar das Codon für
die erste Aminosäure
des reifen CTLA-4 folgt. Der reverse PCR-Primer enthält eine
BamHI-Restriktionsstelle, der Translations-Stoppcodons in allen
drei Leserahmen vorausgehen, denen die letzte Aminosäure direkt
vor der CTLA-4-Transmembran-Domäne
vorausgeht. PCR-Amplifikation
mit diesen Primern ergibt ein Fragment mit 416 Bp, das durch die
NdeI- und BamHI-Restriktionsstellen
begrenzt ist und DNA-Sequenzen enthält, die die extrazelluläre Domäne von CTLA-4
codiert, der ein Methionin-Codon vorausgeht. Das PCR-Produkt wurde
mit NdeI plus BamHI gespalten und in den Expressionsvektor pETCm11a
ligiert, der mit den gleichen Restriktionsenzymen gespalten wurde. Die
ligierte DNA wurde in die E. coli-Stämme BL21, HMS174, RGN714 and
RGN715 transfiziert, die den lambda-DE3-Helferphage enthielten.
Die Transformanten wurden in L-Agar, der Chloramphenicol enthielt,
selektiert. Individuelle Transformanten wurden ausgewählt und
nach Induktion durch Behandlung mit 0,5 mM IPTG auf Expression von
CTLA-4 getestet. Extrakte ganzer Zellen wurden auf SDS-PAGE-Gel
analysiert, worauf Coomassie-Blau-Färbung und Western-Blot-Analyse
folgten. Der größte Teil
des CTLA-4-Proteins in diesen Zellen wurde in Einschlußkörpern gefunden.
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Reinigung von CTLA-4 aus
Einschlußkörpern
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Rekombinantes
CTLA-4 wurde aus Zellpellets durch Behandlung der gewaschenen Zellen
in Lysis-Pufferlösung
(50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 0,5% Triton
X-100 und Lysozyme zu 0,3 mg/ml) gewonnen, worauf Ultraschallbehandlung
folgte. Die Einschlußkörperchen
wurden durch Zentrifugation bei 20.000 × g gewonnen und durch Behandlung
mit Solubilisierungspufferlösung
(50 mM Tris-HCl pH-Wert 8,0, 8 M Harnstoff, 50 mM 2-Mercaptoethanol
(2-ME)) solubilisiert. Die Solubilisierung wurde durch Durchmischung über 2 Stunden
bei Zimmertemperatur unterstützt.
Die lösliche
Fraktion enthielt CTLA-4. Das CTLA-4 wurde durch Chromatographie
auf S-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) wie folgt gereinigt.
Der CTLA-4 enthaltende Überstand
wurde durch die Zugabe von Eisessig auf einen pH-Wert von 3,4 eingestellt und
auf eine S-Sepharose-Säule
aufgetragen, die mit Säulenpufferlösung äquilibriert
war (100 mM Na-Acetat, pH-Wert
6, 5, 8 M Harnstoff, 50 mM 2-ME und 5 mM EDTA). Die Säule wurde
mit Säulenpufferlösung gewaschen,
und das gebundene CTLA-4 wurde mit einem linearen, in Säulenpufferlösung hergestellten
Salzgradienten (NaCl, 0 bis 1 M) eluiert. Peakfraktionen, die hohe
Abs280nm-Werte zeigten, wurden zusammengegeben und
gegen Dialysepufferlösung
(100 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 8 M Harnstoff, 50 mM 2-ME, 5 mM EDTA)
dialysiert. Noch verbliebene verunreinigende Proteine wurden durch
Chromatographie auf einer nach Größe auftrennenden Sephacryl
S-100 Säule
(Pharmacia, Piscataway, NJ) entfernt. Die resultierende Herstellung
ergab mehr als 95% reines CTLA-4, berechnet durch SDS-PAGE mit anschließender Coomassie-Blau-Färbung und Western-Blot
Analyse. Da die geschätzte
Größe von monomerem,
rekombinanten, in E. coli produzierten CTLA-4 etwa 15 kDa betrug,
wurden alle Schritte des Reinigungsprotokolls durch SDS-PAGE auf
die Anwesenheit eines 15 kDa großen Proteins überprüft, und
die Anwesenheit von CTLA-4 wurde durch Western-Blot-Analyse bestätigt.
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Gewinnung von sekretiertem
CTLA-4 von E.coli
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Eine
sekretierte Form von CTLA-4 wurde von E. coli wie folgt gewonnen.
Die extrazelluläre
Domäne von
CTLA-4 wurde mit der pelB(Lei, S.-P. et al. (1987) J. Bacteriol.
169, 4379–4383)-Signalsequenz
mit Hilfe von PCR verbunden, worin Plasmid phCTLA-4 als Matrize
und das Oligonucleotid
5'GGCACTAGTCATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCTGCCCAACCAGCGATGGCCGCAGCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGGG3' (SEQ ID NO: 39)
als der vorwärts
gerichtete Primer und das Oligonucleotid der SEQ ID NO: 38, vorstehend
beschrieben, als der reverse Primer verwendet wurden. Der vorwärts gerichtete
PCR-Primer enthält
eine einzelne BspHI-Restriktionsstelle, die vollständige pelB-Signalsequenz
und das 5'-Ende
der extrazellulären
Domäne
von CTLA-4. Der reverse PCR-Primer enthält eine einmalige BamHI- Restriktionsstelle,
der translationale Stoppcodons in allen drei Leserahmen voraus gehen,
denen die letzte Aminosäure
vor der transmembranen Domäne
von CTLA-4 vorausgeht. PCR-Amplifikation mit diesen Primern ergab
ein 480 Bp großes
Fragment, begrenzt von einmaligen BspHI- und BamHI-Restriktionsstellen,
das die pelB-Signalsequenz gebunden an die extrazelluläre Domäne von CTLA-4
codiert. Nach PCR-Amplifikation wurde das DNA-Fragment mit BspHI
und BamHI gespalten und in den Expressionsvektor pTrc99A (Pharmacia,
Piscataway, New Jersey), der zuvor mit NcoI und BamHI gespalten
worden war, ligiert. Dies ergab ein Plasmid, in dem die Expression
des pel-CTLA-4-Proteins vom pTrc-Promotor gesteuert wurde, der im
pTrc99A-Expressionsvektor vorhanden war. E. coli-Wirtsstämme, die
mit der ligierten DNA transformiert worden waren, wurden auf L-Agar
selektiert, der Ampicillin (50 μg/ml)
enthielt, und individuelle Clone wurden isoliert. Die Expression
von CTLA-4 in diesen Stämmen
wurde durch die Behandlung mit exponentiell wachsenden Kulturen
mit IPTG (0,5 mM) über
Nacht induziert. Extrakte, die nach Konzentration aus dem Kulturmedium
oder durch Freisetzung aus dem Periplasma hergestellt wurden (die
Zellen wurden in 20% Saccharose, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, für 15 Minuten
bei Zimmertemperatur inkubiert, durch Zentrifugation gesammelt und
in Wasser bei 4°C
resuspendiert und für
10 Minuten auf Eis gehalten), wurden auf die Anwesenheit von CTLA-4
durch SDS-PAGE, Western-Blot-Analyse und kompetitive B7 bindendes
ELISA-Verfahren untersucht.
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ÄQUIVALENTE
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Fachleute
auf dem Gebiet werden erkennen oder in der Lage sein, zu überprüfen, dass
es bei Verwendung von nicht mehr als Routine-Experimenten viele Äquvalente
der spezifischen Ausführungsformen
der hierin beschriebenen Erfindung gibt. Solche Äquivalente sollen durch die
nachfolgenen Ansprüche
eingeschlossen sein.
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