JP4261907B2 - 低分子化アゴニスト抗体 - Google Patents

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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞表面分子または細胞内分子を架橋することによりアゴニスト作用を示す、モノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む改変抗体に関する。当該改変抗体は、細胞表面分子を架橋することにより細胞内にシグナルを伝達しうるアゴニスト作用を有しており、種々の医薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
特開平９−２９５９９９号公報は、脾臓間質細胞を識別し得る特定の抗体を開発することを目標として当該脾臓間質細胞株を感作抗原とするモノクローナル抗体の作製を試み、抗原としてマウスIntegrin Associated Protein（マウスＩＡＰ）を認識する新規モノクローナル抗体の取得を記載している。また、特開平９−２９５９９９号公報は、モノクローナル抗体が骨髄系細胞にアポトーシスを誘起する特性を有することを開示している。
【０００３】
ＷＯ９９／１２９７３は、ヒトのIntegrin Associated Protein（以下ヒトＩＡＰとする；J. Cell Biol., 123, 485-496, 1993にアミノ酸配列及び塩基配列が記載；Journal of Cell Science, 108, 3419-3425, 1995）を抗原とするモノクローナル抗体であって、当該ヒトＩＡＰを有する有核血液細胞（骨髄系細胞及びリンパ球）にアポトーシスを誘起させる特性を有するモノクローナルＭＡＢＬ−１抗体、ＭＡＢＬ−２抗体、これを産生するハイブリドーマ、ＭＡＢＬ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１００）及びＭＡＢＬ−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１０１）を記載している。
【０００４】
特願平１１−６３５５７号は、ヒトＩＡＰを抗原とするモノクローナル抗体から、ヒトＩＡＰを有する有核血液細胞にアポトーシスを誘起する特性を有する一本鎖のＦｖ領域を有する一本鎖Ｆｖを得たことを開示している。
【０００５】
しかし、ＩＡＰを抗原とするモノクローナル抗体の投与は、ＩＡＰを有する有核血液細胞にアポトーシスを誘起するものの、in vitroで赤血球の凝集作用をもたらす。これは、ＩＡＰを抗原とするモノクローナル抗体を多量に生体内に投与した場合、赤血球の凝集という弊害が生じる可能性があることを示唆するものである。
【０００６】
本発明者らは、ヒトＩＡＰを抗原とするモノクローナル抗体を用いて、上記の血液疾患の治療薬等として利用するべく鋭意研究した結果、ヒトＩＡＰを有する有核血液細胞にアポトーシスを誘起する特性を有する一本鎖のＦｖ領域を有する一本鎖Ｆｖを得た。
【０００７】
一方、改変抗体、特に低分子化抗体、例えば一本鎖Ｆｖは、その低分子化により組織、腫瘍等への移行性を改善し、遺伝子工学的に調製する目的で開発されたものであるが、近年、一本鎖Ｆｖのダイマー、特に、二重特異性［bispecific］のダイマーが細胞同士の架橋を目的として使用されている。このようなダイマーとしては、代表的には癌細胞抗原とＮＫ細胞や好中球など宿主細胞抗原を認識する一本鎖Ｆｖのヘテロダイマーが知られている（Kipriyanov et al., Int. J. Cancer, 77, 9763-9772, 1998）。これらは、細胞間架橋を誘導させることにより癌を治療するためのより効率的な改変抗体として、一本鎖Ｆｖの構築技術から作成されたものである。このため、抗体およびその断片（例えばＦａｂ断片など）および二重特異性の改変抗体、さらには単一特異性である一本鎖Ｆｖのダイマーでも細胞間の架橋が誘導されると考えられていた。
【０００８】
また、細胞表面分子を架橋してシグナルを伝達しうるモノクローナル抗体として、例えば細胞の分化・増殖に関与するＥＰＯ受容体に対する抗体（特開２０００−９５８００号公報）、ＭｕＳＫ受容体に対する抗体（Xie et al., Nature Biotech. 15, 768-771, 1997）などが知られている。しかし、低分子化した改変抗体については報告はない。
【０００９】
そこで、先ず本発明者は上記ＭＡＢＬ−１およびＭＡＢＬ−２抗体から作製した一本鎖Ｆｖのモノマーは細胞にアポトーシスを誘起せず、一本鎖ＦｖのダイマーがＩＡＰを有する細胞に対してアポトーシスを誘導することに注目し、これらが細胞表面上のＩＡＰ受容体を架橋（２量体化）することにより当該細胞にシグナルが伝達されて、その結果アポトーシスが誘導されたことを突き止めた。即ち、これは、単一特異性の一本鎖Ｆｖダイマーが細胞表面上の分子（例えば受容体）を架橋することにより、リガンドと同様にシグナルを伝達し、これによりアゴニスト作用を示しうること示唆するものである。
【００１０】
次に細胞間の架橋形成に注目したところ、前記モノクローナル抗体は赤血球凝集を引き起こすが、前記一本鎖Ｆｖのダイマーは赤血球凝集を起こさないことを見出した。同様の結果は、一本鎖２価抗体（２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖ポリペプチド）でも観察された。即ち、これはモノクローナル抗体では細胞間で架橋が形成される可能性があるのに対して、一本鎖Ｆｖダイマーまたは一本鎖２価抗体等の改変抗体では、細胞表面上の分子を架橋するが、細胞間の架橋を形成しないことを示唆するものである。
【００１１】
本発明者は、これらの結果から、一本鎖Ｆｖダイマーや一本鎖２価抗体等の改変抗体が、従来知られていた細胞間の架橋への使用に限らず、同じ細胞の細胞表面分子あるいは細胞内分子を架橋する、当該分子に対するリガンド（特に天然のリガンドの作用を模倣するようなリガンド）として特に適していることを初めて見出した。
【００１２】
さらに、本発明者は、抗体分子（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）を一本鎖Ｆｖダイマーまたは一本鎖２価抗体などの改変抗体にすることにより、細胞間の架橋などによる副作用を軽減し、且つ細胞表面上の分子を架橋して、細胞に所望の作用のみを誘起しうる新規な医薬品を提供しうることを見出し、本発明を完成させた。また、本発明の改変抗体は、ＴＰＯ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦなどの天然のリガンドまたは当該改変抗体と同じＶ領域を有するｗｈｏｌｅの抗体（ＩｇＧ）と比較して顕著に高い活性を有しており、さらに抗体分子に比べ分子量が小さく、定常領域を有しないという特徴から、組織移行性が向上しているという特徴を有している。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、細胞表面分子または細胞内の分子を架橋することによりアゴニスト作用を示す、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む低分子化アゴニスト改変抗体を提供することである。
【００１４】
従って、本発明は、細胞表面分子または細胞内の分子を架橋することによりアゴニスト作用を示す、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上、好ましくは各々２〜６、さらに好ましくは各々２〜４、特に好ましくは各々２つ含む改変抗体に関する。
【００１５】
本明細書において「改変抗体」とは、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含み、これら各Ｖ領域を直接的あるいはリンカー等を介して共有結合および／または非共有結合により結合した任意の物質を意味する。具体的には、抗体の各Ｖ領域をペプチドリンカー、化学架橋剤等のリンカーで結合したポリペプチドまたは化合物等があげられる。なお、本発明の改変抗体において、抗体由来の２つ以上のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は各々、同一または異なる抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域であってもよい。
【００１６】
本発明の改変抗体は、好ましくは１つのＨ鎖Ｖ領域及び１つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖのダイマー、トリマー、テトラマー等のマルチマーであるか、又は２つ以上のＨ鎖Ｖ領域及び２つ以上のＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖ポリペプチドである。本発明の改変抗体が１つのＨ鎖Ｖ領域及び１つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖのダイマー、トリマー、テトラマー等のマルチマーである場合、同じ鎖上のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は互いに連合して１つの抗原結合部位を形成していないものが好ましい。
【００１７】
特に好ましくは、１つのＨ鎖Ｖ領域及び１つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖのダイマー、又は２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖ポリペプチドである。該改変抗体中において、Ｈ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は、好ましくはリンカーを介して連結されている。
【００１８】
本明細書において「アゴニスト作用」とは、細胞表面分子または細胞内分子を架橋することにより細胞内にシグナルが伝達されて該細胞に生じる生物学的作用をいい、具体的には、アポトーシス誘導、細胞増殖誘導、細胞分化誘導、細胞分裂誘導、細胞周期調節作用等の作用をいう。
【００１９】
本発明において、アゴニスト作用のED50値は、公知のアゴニスト作用の測定法より求めることができる。具体的には、アゴニスト特異的な細胞死、細胞増殖、細胞分化特異的なタンパク質（例えば特異的抗原）の発現の検出、細胞周期特異的なキナーゼ活性の測定などが挙げられ、反応容量曲線の最大活性を１００％とし、その反応率５０％となる用量をＥＤ５０％値とする。
【００２０】
本発明の改変抗体は、当該改変抗体と同一の抗原結合領域を有する抗体、即ち、当該改変抗体の抗原結合領域を形成するＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域の対と同一のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域の対を有するＩｇＧ等のwholeの抗体（以下、親抗体という）と比較して同等以上のアゴニスト作用（ED50値）を示すものが好ましい。さらに、親抗体と比較して２倍以上、好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上のアゴニスト作用（ED50値）を示すものが好ましい。また、標的の細胞表面分子または細胞内分子には結合するが、該分子に対するアゴニスト作用を実質的に有さない親抗体と同一の抗原結合領域を形成するＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域の対を有する改変抗体であって、当該改変抗体はアゴニスト作用を有するものも本発明に含まれる。
【００２１】
本発明の抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む化合物とは、細胞
表面分子または細胞内分子に結合する天然のリガンドと比較して同等以上のアゴニスト作用（ED50値）を示し、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む化合物であればいかなるものでもよく、当該分子に結合する天然のリガンドと比較して２倍以上、好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上のアゴニスト作用（ED50値）を示す化合物が好ましい。
【００２２】
ここでいう「化合物」とは、本発明の改変抗体に限らず、ｗｈｏｌｅの抗体、Ｆ(ａｂ')2等、２つ以上、好ましくは２〜６、さらに好ましくは２〜４、特に好ましくは２つの抗原結合部位を有するものであればいかなるものも含まれる。
【００２３】
本発明の抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む改変抗体または化合物は、細胞間接着作用を実質的に有さないものが好ましい。また、本発明の改変抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域が同一のモノクローナル抗体由来である場合、もとのモノクローナル抗体と比較して、1/１０以下の細胞間接着作用（ED50値）を示すものが好ましい。
【００２４】
本発明において、細胞間接着作用のED50値とは、公知のアゴニスト作用の測定法より求めることができる。具体的には、前記細胞表面分子を発現する細胞の凝集作用、例えば赤血球凝集作用の測定が挙げられる。
【００２５】
本発明は前記改変抗体をコードするＤＮＡに関する。
本発明は前記改変抗体を産生する動物細胞または微生物に関する。
本発明は前記改変抗体のアゴニストとしての使用に関する。
【００２６】
本発明は前記改変抗体を用いて細胞表面分子または細胞内分子を架橋することにより細胞内にシグナル伝達を起し、該細胞にアポトーシス誘導、細胞増殖誘導、細胞分化誘導、細胞分裂誘導、細胞周期調節作用等のアゴニスト作用を生じさせる方法に関する。
【００２７】
本発明は、上記改変抗体を有効成分として含む医薬に関する。
本発明は、上記改変抗体の医薬としての使用に関する。
【００２８】
本発明は、細胞表面分子または細胞内分子を架橋することによりアゴニスト作用を示す、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む改変抗体のスクリーニング方法又は測定方法であって、１）当該分子に特異的に結合する抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む改変抗体を作製し、２）当該分子を発現している細胞と該改変抗体とを接触させ、３）当該分子を架橋することにより該細胞に生ずるアゴニスト作用を測定する、工程を含むスクリーニング方法又は測定方法に関する。本発明の測定方法は、本発明の改変抗体を医薬品として製造する場合の品質管理等に用いることができる。
【００２９】
前記一本鎖Ｆｖのダイマーは、非共有結合によるダイマー、架橋基を介した共有結合によるダイマー、さらに前記一本鎖Ｆｖと結合しうる架橋剤（抗体、抗体断片、又は２価の改変抗体）を介したダイマーが包含される。ダイマーを形成させる架橋基は、ペプチドの架橋に用いられている公知の架橋基を用いることができるが、例えばシステイン残基によるジスルフィド架橋、他の架橋基、例えばＣ4〜Ｃ10アルキレン（例えば、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、ヘプタメチレンおよびオクタメチレンなど）またはＣ4〜Ｃ10アルケニレン（cis／trans−３−ブテニレン、cis／trans−２−ペンテニレン、cis／trans−３−ペンテニレンおよびcis／trans−３−ヘキセニレンなど）である。
【００３０】
また、一本鎖Ｆｖと結合しうる架橋剤は、例えばＦｖ中に随意に導入しうるアミノ酸配列、例えばＦＬＡＧ配列等に対する抗体もしくはその断片、またはその抗体由来の改変抗
体、例えば一本鎖Ｆｖである。
【００３１】
本発明はまた、細胞表面分子または細胞内分子に結合する第１のリガンドと第２のリガンドを投与し、さらに第１及び第２のリガンドに結合して、前記第１及び第２のリガンドを架橋する物質を投与することを特徴とする、細胞にアゴニスト作用を誘導する方法に関する。ここで、第１及び第２のリガンドは、当該分子に対する結合部位を１つ有し、架橋されることによりアゴニスト作用を誘導しうるものであればいかなるものでもよいが、好ましくは同一又は異なる一本鎖Ｆｖモノマー、抗体断片等の一価の改変抗体である。また、前記リガンドを架橋する物質は、第１のリガンドと第２のリガンドを架橋して細胞にアゴニスト作用を誘導する物質であればいかなるものでもよいが、好ましくは抗体、抗体断片、Ｆ（ａｂ）2又は２価の改変抗体である。ここで、２価の抗体の例としては、Ｆ（ａｂ)2、１つのＨ鎖Ｖ領域及び１つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖのダイマーであるか、又は２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖ポリペプチドが挙げられる。本方法は、架橋されてシグナルを細胞に伝達する受容体の探索に有効なだけでなく、薬剤のターゲット分子へのＤＤＳへの応用も期待でき、副作用の抑制や、所望の時期に所望の時間薬剤の効力を発揮させうる薬剤投与システムとして有用である。
【００３２】
本発明の改変抗体はまた、抗体（例えば、ＭＡＢＬ−１抗体、ＭＡＢＬ−２抗体、１２Ｂ５抗体、１２Ｅ１０抗体など）のＬ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｖ領域を含み、細胞表面分子または細胞内分子、例えば蛋白質（受容体またはシグナル伝達に関与する蛋白質）、または前記蛋白質もしくは細胞膜タンパク質の糖鎖を特異的に認識して当該分子を架橋し、これにより細胞内にシグナルを伝達しうるものであればいかなるものでもよく、さらには、このＶ領域のアミノ酸配列の一部を改変した改変抗体も包含される。
【００３３】
本発明の改変抗体は、結合する細胞表面分子または細胞内分子、具体的には個々の細胞表面分子または細胞内分子の構造や作用機序等に応じて、単一特異性（mono-specific）改変抗体でも、二重特異性（bi-specific）改変抗体等の多重特異性（multi-specific）改変抗体であってもよい。結合する分子がhomodimer化してシグナルが細胞内に伝達される受容体分子（たとえば、エリスロポエチン受容体、トロンボポエチン受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＳＣＦ受容体、ＥＧＦ受容体、ＩＡＰ（ＣＤ47）など）の場合は、mono-specificな改変抗体であることが好ましく、結合する分子がheterodimer化してシグナルが細胞内に伝達される受容体分子（たとえば、ＩＬ-６受容体、ＬＩＦ受容体。ＩＬ−１１受容体）の場合は、bi-specificな改変抗体が好ましい。結合する分子がheterotrimer化してシグナルが細胞内に伝達される受容体分子（たとえば、ＩＬ−２受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＯＳＭ受容体）の場合は、tri-specificな改変抗体が好ましい。二重特異性の一本鎖Ｆｖダイマーの製造方法は、たとえばWO9413804号等により公知である。
【００３４】
本発明はまた、改変抗体のＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域が、ヒト抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及び／又はヒト抗体由来のＬ鎖Ｖ領域である改変抗体に関する。ヒト抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は、例えばＷＯ９９/１０４９４号公報に記載された方法のように、ヒトモノクローナル抗体のライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。また、トランスジェニックマウス等から作製されたヒトモノクローナル抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域も包含される。
【００３５】
さらに本発明は、改変抗体のＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域が、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域及び／又はヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域である改変抗体に関する。詳細には、ヒトモノクローナル抗体Ｌ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）とヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、サルなど）のモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域の相補性決定領域（complementarity determining region；以下ＣＤＲとする）を含むヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域及び／又はヒトモノクローナル抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲとヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、サルなど）モノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲを含むヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域から構成される。この場合、ＣＤＲおよびＦＲのアミノ酸配列を一部改変（例えば、欠失、置換又は付加）してもよい。
【００３６】
本発明はまた、改変抗体のＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域が、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリなど）のモノクローナル抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域も包含される。この場合、ＣＤＲおよびＦＲのアミノ酸配列を一部改変（例えば、欠失、置換又は付加）してもよい。
【００３７】
本発明はまた、前記種々の改変抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成る組換えベクターを製造する遺伝子工学的方法に関する。
【００３８】
本発明はまた、該組換えベクターにより形質転換された宿主に関する。宿主は、例えばヒト細胞、マウス細胞などの動物細胞、又は大腸菌、枯草菌、酵母などの微生物である。
【００３９】
本発明はまた、上記の宿主を培養し、培養物から改変抗体を採取することを特徴とする、改変抗体の製造方法に関する。
【００４０】
さらに本発明は、一本鎖Ｆｖを産生する宿主動物細胞を無血清培地で培養して該培地中に一本鎖Ｆｖを分泌させ、該培地中で形成された一本鎖Ｆｖのダイマーを含む該培地上清を精製することを特徴とする一本鎖Ｆｖのダイマーの製造方法に関する。
【００４１】
本発明はまた、改変抗体のアゴニストとしての使用に関する。即ち、前記得られた改変抗体を有効成分として含有するシグナル伝達アゴニストに関する。本発明において改変抗体は、細胞表面分子または細胞内分子を架橋して、これによりシグナル伝達を誘起しうるものであるため、当該分子は、リガンドと結合して、オリゴマー化、例えば２量体化が促進され、その結果シグナルを細胞内に伝達しうる分子であればいかなるものもよい。
【００４２】
そのような細胞表面分子には、例えばホルモン受容体やサイトカイン受容体が包含される。ホルモン受容体には、例えばエストロゲン受容体等が包含される。サイトカイン受容体等には、造血因子受容体、リンホカイン受容体、増殖因子受容体および分化抑制因子受容体等が包含される。サイトカイン受容体の例としては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体、トロンボポエチン（ＴＰＯ）受容体、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体、マクロフアージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）受容体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体、インターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体、インターロイキン−３（ＩＬ−３）受容体、インターロイキン−４（ＩＬ−４）受容体、インターロイキン−５（ＩＬ−５）受容体、インターロイキン−６（ＩＬ−６）受容体、インターロイキン−７（ＩＬ−７）受容体、インターロイキン−９（ＩＬ−９）受容体、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）受容体、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）受容体、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）受容体、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）受容体、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）受容体、インターフエロン−α（ＩＦＮ−α）受容体、インターフエロン−β（ＩＦＮ−β）受容体、インターフエロン−γ（ＩＦＮ−γ）受容体、成長ホルモン（ＧＨ）受容体、インスリン受容体、血液幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）受容体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体、神経成長因子（ＮＧＦ）受容体、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体、トランスフオーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）受容体、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）受容体、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）受容体およびＮｏｔｃｈファミリー受容体等を挙げることができる。
【００４３】
また、細胞内分子としては、例えばＴＡＫ１とＴＡＢ１が挙げられる。ＴＡＫ１とＴＡＢ１は、ＴＧＦ−βのシグナル伝達経路で作用し、ヘテロダイマーを形成することによりマップキナーゼを活性し、一連のシグナルを伝達する。多くの癌細胞では、その増殖を抑制するＴＧＦ−βの受容体に変異があり、ＴＧＦ−βによるシグナルが伝達されない。このため、ＴＡＫ１とＴＡＢ１を架橋することによりシグナルを伝達しうる改変抗体は、ＴＡＫ１／ＴＡＢ１に結合してアゴニステックに作用してＴＧＦ−βシグナルを誘導することができる。そのような本発明の改変抗体はＴＧＦ−β抵抗性の癌細胞の増殖を抑制し得るため、本発明により新たな癌の治療法が提供される。他の細胞内分子の例として、細胞増殖に作用する転写因子Ｅ２ＦホモダイマーおよびＥ２Ｆ／ＤＰ１ヘテロダイマーが挙げられる。こうした分子に対しても本発明の改変抗体はアゴニスト作用を誘導しうるものであり、細胞増殖に関連する種々の疾患の治療に用いることができる。また、本発明の改変抗体を用いて、アポトーシス誘導に関わるシグナル伝達に関連する細胞内因子を架橋してアゴニスト作用を誘導し、癌細胞または自己免疫疾患に関わる細胞にアポトーシス細胞死を誘導することができる。
【００４４】
細胞内分子に本発明の改変抗体を作用させる場合、細胞内に当該改変抗体を輸送する手法として、例えば、細胞膜透過機能を有するペプチド（例えばPegelin やPenetratinなど）を付加すること（Martine Mazel etal., Doxorubicin-peptide conjugates overcome multidrug resistance. Anti-Cancer Drugs 2001, 12、Dcrossi D. et al., The third helix of the antennapedia homeodomain translocates through biological membranes, J. Biol. Chem. 1994, 269, 10444-10450.）により本発明の改変抗体を細胞内に輸送させることが可能である。
【００４５】
故に、本発明のアゴニスト改変抗体を有効成分として含有する医薬製剤は、癌、炎症、ホルモン異常、血液疾患、自己免疫疾患などの治療及び／又は予防に有用である。
【００４６】
受容体タンパク質が形成しうるオリゴマーは、ホモオリゴマーであっても、ヘテロオリゴマーであってもよいし、ダイマー、トリマー、テトラマー、などのいずれのオリゴマーであってもよい。例えば、エリスロポエチン受容体、トロンボポエチン受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＳＣＦ受容体、ＥＧＦ受容体などは、ホモダイマーを形成し、ＩＬ−６受容体、ＬＩＦ受容体、ＩＬ−１１受容体はヘテロダイマーを形成し、ＩＬ−２受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＯＳＭ受容体はヘテロトリマーを形成することが知られている。
【００４７】
本発明の改変抗体は、モノクローナル抗体に由来するＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む。当該改変抗体の構成としては、好ましくは１つのＨ鎖Ｖ領域及び１つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖのダイマー又は２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプチドとすることができる。該改変抗体中において、Ｈ鎖およびＬ鎖のＶ領域は、１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーを介して連結されているのが好ましい。これらの改変抗体は、モノクローナル抗体の可変領域を含有し、もとのモノクローナル抗体と同一の特異性をもって抗原に結合する。
【００４８】
【発明を解決するための手段】
Ｈ鎖Ｖ領域
本発明において、抗体に由来するＨ鎖Ｖ領域には、細胞表面分子または細胞内分子、例えば蛋白質（受容体またはシグナル伝達に関与する蛋白質）、または前記蛋白質もしくは細胞膜上の糖鎖を認識し、且つ前記分子を架橋してオリゴマー化、例えば２量体化することにより、細胞内にシグナルを伝達しうる、抗体のＨ鎖Ｖ領域であって、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、サルなど）に由来するＨ鎖Ｖ領域又は前記Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を一部改変したＨ鎖Ｖ領域も本発明におけるＨ鎖Ｖ領域に包含されるが、ヒトモノクローナル抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲとマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲを含むヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域が好ましい。さらに、組換え技術を使用して作成し得る、ヒト由来のアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域も好ましい。また、本発明のＨ鎖Ｖ領域には、前記Ｈ鎖Ｖ領域の断片であって、抗原結合性を保持する領域も包含される。
【００４９】
Ｌ鎖Ｖ領域
本発明におけるＬ鎖Ｖ領域には、細胞表面分子または細胞内分子、例えば蛋白質（受容体またはシグナル伝達に関与する蛋白質）、または前記蛋白質もしくは細胞膜上の糖鎖を認識し、且つ前記分子を架橋してオリゴマー化、例えば２量体化することにより、細胞内にシグナルを伝達しうる、抗体のＬ鎖Ｖ領域であって、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、サルなど）に由来するＬ鎖Ｖ領域又は前記Ｌ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を一部改変したＬ鎖Ｖ領域も本発明におけるＬ鎖Ｖ領域に包含されるが、ヒトモノクローナル抗体Ｌ鎖Ｖ領域のＦＲとマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲを含むヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域が好ましい。さらに、組換え技術を使用して作成し得る、ヒト抗体由来のアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域も好ましい。また、本発明のＬ鎖Ｖ領域には、前記Ｌ鎖Ｖ領域の断片であって、抗原結合性を保持する領域も包含される。
【００５０】
相補性決定領域（ＣＤＲ）
Ｌ鎖及びＨ鎖の各Ｖ領域は抗原結合部位を形成し、Ｌ鎖及びＨ鎖上の可変領域は共通性のある比較的保存された４個のフレームワークと３個の超可変又は相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている（Kabat, E. A.ら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」US Dept. Health and Human Services, 1983）。
【００５１】
前記４個のフレームワーク領域（ＦＲ）の多くの部分はβ−シート構造をとり、その結果３個のＣＤＲはループを形成し、ＣＤＲは場合によりβ−シート構造の一部分を形成することもある。３個のＣＤＲはＦＲによって相互に立体的に非常に近い位置に保持され、そして対をなす領域の３個のＣＤＲと共に抗原結合部位の形成に寄与する。
これらのＣＤＲ領域は、得られた抗体のＶ領域のアミノ酸配列と既知抗体のＶ領域の既知アミノ酸配列とを照合することによって、Kabat, E. A.ら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」の経験則から見出すことができる。
【００５２】
一本鎖Ｆｖ
一本鎖Ｆｖは、モノクローナル抗体に由来する、連結したＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプチドのモノマーであり、得られる一本鎖Ｆｖはもとのモノクローナル抗体の可変領域を含有し、相補性決定領域を保存するため、もとのモノクローナル抗体と同一の特異性をもって抗原に結合する（特願平１１−６３５５７号）。さらに、本発明の一本鎖Ｆｖにおいて、前記可変領域および／またはＣＤＲの一部またはそのアミノ酸配列の一部を改変（例えば、欠失、置換又は付加）することができる。本発明の一本鎖Ｆｖを構成するＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は上述したものであり、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を直接又はリンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結することができ、その構成としては、［Ｈ鎖Ｖ領域］−［Ｌ鎖Ｖ領域］、［Ｌ鎖Ｖ領域］−［Ｈ鎖Ｖ領域］のいずれでもよい。本発明においては、これら一本鎖Ｆｖはダイマー、トリマー又はテトラマーを形成させ、本発明の改変抗体とすることができる。
【００５３】
一本鎖改変抗体
本発明の２つ以上のＨ鎖Ｖ領域及び２つ以上のＬ鎖Ｖ領域、好ましくは各々２〜４、特に好ましくは各々２つ含む一本鎖改変抗体は、上述のような２つ以上のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域をそれぞれ含有する。このポリペプチドにおいて各領域は、該一本鎖改変抗体が特定の立体構造、具体的には一本鎖Ｆｖのダイマーが構成する立体構造を模倣し得るよう配置させる必要があり、例えば
［Ｈ鎖Ｖ領域］−［Ｌ鎖Ｖ領域］−［Ｈ鎖Ｖ領域］−［Ｌ鎖Ｖ領域］
又は
［Ｌ鎖Ｖ領域］−［Ｈ鎖Ｖ領域］−［Ｌ鎖Ｖ領域］−［Ｈ鎖Ｖ領域］
の順序で各領域が配置され、これらの領域はリンカーを介して連結される。
【００５４】
リンカー
本発明において、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー、例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996に開示されるリンカーを用いることができる。これらのリンカーは同一分子内で同じ又は異なっていてもよい。ペプチドリンカーを所望する場合、各々のリンカーの例としては：
Ｓｅｒ
Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
(Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ)ｎ
(Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ)ｎ
［ｎは１以上の整数である］を挙げることができる。好ましいリンカーペプチドの長さは抗原となる受容体によって異なるが、一本鎖Ｆｖにおいては通常１〜２０アミノ酸であるのが好ましい。２つ以上のＨ鎖Ｖ領域及び２つ以上のＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖改変抗体においては、［Ｈ鎖Ｖ領域］−［Ｌ鎖Ｖ領域］（又は［Ｌ鎖Ｖ領域］−［Ｈ鎖Ｖ領域］）からなる同一の抗原結合部位を形成するもの同士を連結するためのペプチドリンカーの長さは１〜３０アミノ酸、好ましくは１〜２０アミノ酸、さらに好ましくは３〜１８アミノ酸である。また、［Ｈ鎖Ｖ領域］−［Ｌ鎖Ｖ領域］（又は［Ｌ鎖Ｖ領域］−［Ｈ鎖Ｖ領域］）からなる同一の抗原結合部位を形成しないもの同士を連結するためのペプチドリンカーの長さは１〜４０アミノ酸、好ましくは３〜３０アミノ酸、さらに好ましくは５〜２０アミノ酸である。これらのリンカーを導入する方法は本発明の改変抗体をコードするＤＮＡの構築方法の説明において述べる。
【００５５】
本発明における化学合成物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−ＤＳＴ）、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）などであり、これらの架橋剤は市販されている。また、化学合成物リンカーの長さは、上述のペプチドリンカーの長さに相当する長さであるのが好ましい。
【００５６】
特に、一本鎖Ｆｖのダイマーを形成させる場合、宿主細胞で産生された一本鎖モノマーを培地等の溶液中で、２０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上ダイマー化するのに適したリンカーを選択することが好ましく、具体的には２〜１２アミノ酸、より好ましくは３〜１０アミノ酸、またはこれに相当する他のリンカーが好ましい。
【００５７】
改変抗体の製造
改変抗体は、細胞表面分子に特異的に結合する既知または新規なモノクローナル抗体由来のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを前述のリンカーを介して連結することにより得られる。一本鎖Ｆｖの例として、ＭＡＢＬ−１抗体、ＭＡＢＬ−２抗体に由来するＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を有するものをＭＡＢＬ１−ｓｃＦｖ、ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖとする。２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖ポリペプチドの例としては、前記モノクローナル抗体由来のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を有するものをＭＡＢＬ１−ｓｃ(Ｆｖ)2、ＭＡＢＬ２−ｓｃ(Ｆｖ)2とする。
【００５８】
これらポリペプチドを製造するにあたり、該ポリペプチドが分泌性であることを所望する場合は、そのＮ−末端にシグナルペプチドを付加することができる。また、該ポリペプチドの効率的精製等のために、ポリペプチド精製において有用である公知の配列、例えばＦＬＡＧ配列などを挿入することができる。この場合、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてダイマー形成させることもできる。
【００５９】
本発明の改変抗体を作製するためには、これをコードするＤＮＡ、即ち一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡ又は再構成一本鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡを得る必要がある。これらのＤＮＡは、例えばＭＡＢＬ１−ｓｃＦｖ、ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ、ＭＡＢＬ１−ｓｃ(Ｆｖ)2及び／又はＭＡＢＬ２−ｓｃ(Ｆｖ)2の場合には前記Ｆｖ由来のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコ−ドするＤＮＡを用いて、又はこれらのＤＮＡを鋳型とし、その配列内の所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を、その両端を規定するプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅することにより得ることができる。
【００６０】
各Ｖ領域について、アミノ酸配列の一部改変を所望する場合には、ＰＣＲ法を用いる公知の方法によって１又は数個のアミノ酸が改変された、即ち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するＶ領域を得ることができる。特定の抗原に対して十分に活性がある改変抗体を作製するために、ＰＣＲ法を用いる公知の方法によって前記Ｖ領域のアミノ酸配列の一部を改変することが望ましい。
【００６１】
ＰＣＲに用いるプライマーを決定するにあたり、所望のモノクローナル抗体由来のＨ鎖及びＬ鎖のタイピングをして両鎖の型を決める必要がある。ＭＡＢＬ−１抗体、ＭＡＢＬ−２抗体の場合、ＭＡＢＬ−１抗体はκ型Ｌ鎖及びγ１型のＨ鎖を有し、ＭＡＢＬ−２抗体はκ型Ｌ鎖及びγ２ａ型のＨ鎖を有することが明らかになっている（特願平１１−６３５５７号）。前記ＭＡＢＬ−１抗体及び／又はＭＡＢＬ−２抗体のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコ−ドするＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅するには、Jones, S. T.ら、Bio/Technology, 9, 88-89, 1991に記載されているプライマーを用いることができる。
【００６２】
次に、ＰＣＲ法を用いてＭＡＢＬ−１抗体及びＭＡＢＬ−２抗体のＬ鎖Ｖ領域を増幅するため、５'−末端オリゴヌクレオチドプライマー及び３'−末端オリゴヌクレオチドプライマーを上述のように決定する。同様にして、ＭＡＢＬ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域及びＭＡＢＬ−２抗体のＨ鎖Ｖ領域の増幅のため、それぞれ５'−末端プライマー及び３'−末端プライマーを決定する。
【００６３】
その例として本発明においては、５'−末端プライマーはその５'−末端近傍に制限酵素
ＨｉｎｆＩ切断部位を提供する配列ＧＡＮＴＣを含有し、そして３'−末端プライマーはその５'−末端近傍に制限酵素ＸｍａＩ切断部位を提供するヌクレオチド配列ＣＣＣＧＧＧを含有するものを使用している。これらの制限酵素切断部位は可変領域をコードする目的のＤＮＡ断片をクローニングベクターにサブクローニングするために用いられる限り、他の制限酵素切断部位でもよい。
【００６４】
特に設計されたＰＣＲプライマーを用いて、ＭＡＢＬ−１、ＭＡＢＬ−２抗体の各Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをそれらの５'−及び３'−末端において適当な塩基配列を導入して、それらが発現ベクターに容易に挿入されるように、且つそれらが該発現ベクター中で適切に機能するようにした（例えば、本発明ではＫｏｚａｋ配列の導入により翻訳効率を上げるように工夫されている）。次に、これらのプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して得たＭＡＢＬ−１、ＭＡＢＬ−２抗体の各Ｖ領域を、所望のヒトＣ領域をすでに含有するＨＥＦ発現ベクター（ＷＯ９２−１９７５９参照）に挿入した。クローン化されたＤＮＡの配列決定は任意の常法、例えば、自動ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems社製）を用いて行うことができる。
【００６５】
本発明の改変抗体において、リンカー、例えばペプチドリンカーは次のように導入することができる。即ち、上述のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域のためのプライマーと一部相補的な配列を有し、且つ該リンカーのＮ−末端またはＣ−末端をコードするようにプライマーを設計し、これを用いてＰＣＲを行うことによって所望のアミノ酸配列および長さを有するペプチドリンカーをコードするＤＮＡを作成することができる。そして、該ＤＮＡを介してＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを連結すれば、所望のペプチドリンカーを有する本発明の改変抗体をコードするＤＮＡを得ることができる。さらに、１つの改変抗体をコードするＤＮＡを得ることができれば、前記ＤＮＡを鋳型にして、そして種々のリンカー用のプライマーを設計し、これを用いてＰＣＲを実施すれば、所望のペプチドリンカーを有する改変抗体又はリンカーを有さない改変抗体をコードするＤＮＡは容易に得ることができる。
【００６６】
また、本発明における改変抗体の各鎖Ｖ領域は、従来の技術（例えば、Sato, K.ら、Cancer Res., 53, 1-6 (1993)を参照のこと）を用いることによって、ヒト型化することが可能であり、また一旦ヒト型化された各鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡが作製されれば、ヒト型化一本鎖Ｆｖ、ヒト型化一本鎖Ｆｖ断片、ヒト型化モノクローナル抗体あるいはヒト型化モノクローナル抗体断片は、常法に従って容易に作出する事が可能である。さらに、必要な場合、これらのＶ領域のアミノ酸配列の一部を改変することも可能である。
【００６７】
さらに、遺伝子工学における慣用技術を用いて上述のマウス由来のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡと同様に、これらに相当する他の哺乳動物由来のＤＮＡ、例えばヒト抗体由来の各鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡを用いて、他の哺乳動物、特にヒト抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域、ヒト由来の一本鎖Ｆｖ及びその断片、並びにヒト由来のモノクローナル抗体及びその断片を得ることができる。
【００６８】
本発明の改変抗体が、二重特異性（bi-specific）改変抗体である場合、公知の方法（例えば、WO9413804号公報に記載の方法）により作製することができる。
【００６９】
以上のように、目的とする改変抗体の各鎖Ｖ領域、ヒト型化改変抗体の各鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡが作製されれば、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができる。また、常法に従って宿主を培養し、産生した再構成一本鎖Ｆｖ、再構成ヒト型化一本鎖Ｆｖ、ヒト型化モノクローナル抗体及びヒト型化モノクローナル抗体断片は、細胞内又は細胞外から分離し均一にまで精製することができる。この場合、通常の蛋白質で用いられる分離・精製方法、例えば各種クロマトグラフィー、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組合せて、本発明の改変抗体を分離・精製することができるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
再構成一本鎖Ｆｖを動物細胞、例えば、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞などの動物培養細胞、好ましくはＣＨＯ細胞で産生する場合、無血清培地で該再構成一本鎖Ｆｖを産生させると、培地中で形成した該一本鎖Ｆｖのダイマーを安定的に高収率で回収・精製することができる。さらに、このようにして精製された該ダイマーは、長期間、安定してダイマーの状態で保存することができる。この場合に用いることができる無血清培地は、通常組み換えタンパク質の産生に用いられている培地であればいかなるものでもよく、特に限定されるものではない。
【００７１】
本発明の改変抗体の製造のために任意の発現系、例えば真核細胞、例えば動物細胞、例えば樹立された哺乳類細胞系、真糸状菌細胞、及び酵母細胞、並びに原核細胞、例えば細菌細胞、例えば大腸菌細胞等を使用することができる。好ましくは、本発明の改変抗体は哺乳類細胞、例えばＣＯＳ７細胞又はＣＨＯ細胞中で発現される。
【００７２】
これらの場合、哺乳類細胞での発現のために有用な常用のプロモーターを用いることができる。例えば、ヒト・サイトメガロウイルス（Human cytomegalo-virus：ＨＣＭＶ）前期（immediate early）プロモーターを使用するのが好ましい。ＨＣＭＶプロモーターを含有する発現ベクターの例には、ＨＣＭＶ−ＶＨ−ＨＣγ１、ＨＣＭＶ−ＶＬ−ＨＣＫ等であって、ＰＳＶ２ｎｅｏに由来するプラスミドベクター（国際公開公報ＷＯ９２／１９７５９参照）が包含される。
【００７３】
また、その他に、本発明のために用いることのできる哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモーターとしてはレトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスプロモーターやヒト・ポリペプチドチェーン・エロンゲーション・ファクター１α（ＨＥＦ−１α）などの哺乳動物細胞由来のプロモーターを用いればよい。例えばＳＶ４０のプロモーターを使用する場合は、Mulligan, R. C.らの方法（Nature, 277, 108-114, (1979)）、また、ＨＥＦ−１αプロモーターを使用する場合は、Mizushima, S.らの方法（Nucleic Acids Research, 18, 5322, (1990)）に従えば容易に実施することができる。
【００７４】
複製起原（ｏｒｉ）としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、牛パピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のｏｒｉを用いることができ、さらに発現ベクターは選択マーカーとして、ホスホトランスフエラーゼＡＰＨ（３'）IIあるいはＩ（ｎｅｏ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフエラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子等を含むことができる。
【００７５】
上述のように作成した改変抗体の抗原結合活性は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素標識固相免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）または表面プラズモン共鳴等の既知の方法で測定することができる。また、元のモノクローナル抗体の結合阻害能を指標にして、具体的には該モノクローナル抗体のその抗原への濃度依存的阻害作用の有無を指標にして評価することができる。
【００７６】
詳細には、本発明の改変抗体をコードするＤＮＡを包含する発現ベクターで形質転換した動物細胞、例えばＣＯＳ７細胞又はＣＨＯ細胞を培養し、前記培養した細胞及び／又はその培養上清、又はこれらから精製した改変抗体を用いて抗原への結合を測定する。対照として発現ベクターのみで形質転換した細胞の培養上清などを用いる。抗原、例えばＭＡ
ＢＬ−１抗体、ＭＡＢＬ−２抗体の場合にはヒトＩＡＰを発現するマウス白血病細胞株Ｌ１２１０細胞に、本発明の改変抗体などの試験試料又は対照の培養上清を加え、例えばフローサイトメトリーを実施して抗原結合活性を評価する。
【００７７】
in vitro でのシグナル伝達誘起効果（ＭＡＢＬ−１抗体、ＭＡＢＬ−２抗体の場合はアポトーシス誘導効果）は、抗原を発現する細胞又は該抗原遺伝子を導入した細胞に、前述の改変抗体の試験試料を添加し、当該細胞においてシグナル伝達による変化（例えば、ヒトＩＡＰ抗原特異的に細胞死を誘導するか否か）を既知の測定方法で評価することができる。
【００７８】
in vivo での評価試験は、例えば改変抗体がヒトＩＡＰを認識する場合（例えばＭＡＢＬ−１抗体、ＭＡＢＬ−２抗体由来の改変抗体）、アポトーシス誘起効果として、次の通りに行う。先ずヒト骨髄腫のモデルマウスを作成し、当該マウスにＩＡＰを有する有核血液細胞にアポトーシスを誘起するモノクローナル抗体、本発明の改変抗体を静脈投与する。対照群にはＰＢＳのみを投与する。そして、アポトーシス誘起を、抗腫瘍効果としてマウス血清中のヒトＩｇＧの量の変化及び生存期間によって評価する。
【００７９】
上述のように、標的である細胞表面分子又は細胞内分子に特異的に結合する、Ｈ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む改変抗体を作製し、例えば上記のIn vitroまたはIn vivoでの評価試験により本発明の改変抗体をスクリーニングすることによって、本発明の改変抗体を取得することができる。
【００８０】
本発明の改変抗体は、２つ以上のＨ鎖Ｖ領域及び２つ以上のＬ鎖Ｖ領域、好ましくは各々２〜４、特に好ましくは各々２つ含むものであり、１つのＨ鎖Ｖ領域及び１つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖのダイマー、又は２つ以上のＨ鎖Ｖ領域及び２つ以上のＬ鎖Ｖ領域を連結した一本鎖ポリペプチドである。このような構成をとることで、天然のリガンドの立体構造を模倣して、優れた抗原結合性及びアゴニスト活性を保持するものと考えられる。
【００８１】
本発明の改変抗体は、抗体分子（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）と比較して顕著な低分子化が達成されているため、組織、腫瘍への移行性に優れており、さらにもとのアゴニスト抗体分子よりも高い活性を有する。このため、本発明の改変抗体の親抗体を適宜選択することによって、種々のシグナルを細胞内に伝達して、当該細胞において種々の作用、例えばアポトーシス誘導、細胞増殖誘導、細胞分化誘導、細胞分裂誘導または細胞周期調節作用を誘導することがでる。故に、これを含有する医薬製剤は、シグナル伝達の誘起が疾病の治療に有効である、例えば癌、炎症、ホルモン異常、自己免疫疾患並びに白血病、悪性リンパ腫、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群および真性多血症などの血液疾患の治療薬としての利用が期待される。また、ＲＩ標識による造影剤としての利用も期待され、ＲＩ化合物やトキシン等の他の化合物と結合させることにより、効力を増強させることも可能である。
【００８２】
【発明の実施の形態】
次に、本発明を下記の実施例により具体的に説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
【００８３】
本発明の改変抗体の製造方法を、下記の一本鎖Ｆｖの作製を例にして説明する。本発明の改変抗体の製造方法において用いる、ヒトＩＡＰに対するマウスＭＡＢＬ−１、ＭＡＢＬ−２抗体を産生するハイブリドーマ、ＭＡＢＬ−１及びＭＡＢＬ−２は、公的微生物寄託機関である通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、１９９７年９月１１日に、受託番号それぞれＦＥＲＭ ＢＰ−６１００、Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６１０１として国際寄託されている。
【００８４】
【実施例】
実施例１ （ヒトＩＡＰに対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡのクローン化）
ヒトＩＡＰに対するマウスモノクローナル抗体ＭＡＢＬ−１及びＭＡＢＬ−２の可変領域をコードするＤＮＡを次のようにしてクローン化した。
１．１ メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の調製
ハイブリドーマＭＡＢＬ−１及びＭＡＢＬ−２からのｍＲＮＡを、ｍＲＮ Purification Kit（Pharmacia Biotech社製）を用いて調製した。
【００８５】
１．２ 二本鎖ｃＤＮＡの合成
約１μｇのｍＲＮＡよりMarathon cDNA Amplification Kit（CLONTECH社製）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成し、アダプターを連結した。
【００８６】
１．３ 抗体可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲ法による増幅
Thermal Cycler（PERKIN ELMER社製）を用いてＰＣＲ法を行った。
（１）ＭＡＢＬ−１Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の増幅
ＰＣＲ法に使用するプライマーは、アダプターの部分配列とハイブリダイズする配列番号：１に示すアダプタープライマー１（CLONTECH社製）、及びマウスカッパ型Ｌ鎖Ｃ領域配列とハイブリダイズする配列番号：２に示すＭＫＣ（Mouse Kappa Constant）プライマー（Bio/Technology, 9, 88-89, 1991）を用いた。
ＰＣＲ溶液５０μｌは、５μｌの１０×ＰＣＲ Buffer II、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.１６ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、２.５ユニットのＤＮＡポリメラーゼAmpliTaq Gold（以上PERKIN ELMER社製）、０.２μＭの配列番号：１に示すアダプタープライマーと０.２μＭの配列番号：２に示すＭＫＣプライマー及びＭＡＢＬ−１由来の二本鎖ｃＤＮＡ ０.１μｇを含有し、９４℃の初期温度にて９分間そして次に９４℃にて１分間、６０℃にて１分間及び７２℃にて１分２０秒間、この順序で加熱した。この温度サイクルを３５回反復した後、反応混合物を更に７２℃で１０分間加熱した。
【００８７】
（２）ＭＡＢＬ−１Ｈ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの増幅
ＰＣＲのためのプライマーとして配列番号：１に示すアダプタープライマー１、及び配列番号：３に示すＭＨＣ−γ１（Mouse Heavy Constant）プライマー（Bio/Technology, 9, 88-89, 1991）を用いた。
ｃＤＮＡの増幅は、０.２μＭのＭＫＣプライマーの代わりに０.２μＭのＭＨＣ−γ１プライマーを用いて増幅した点を除いて、前記１．３（１）においてＬ鎖Ｖ領域遺伝子の増幅について記載したのと同じ方法により行った。
【００８８】
（３）ＭＡＢＬ−２Ｌ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの増幅
ＰＣＲのためのプライマーとして配列番号：１に示すアダプタープライマー１、及び配列番号：２に示すＭＫＣプライマーを用いた。
ｃＤＮＡの増幅は、ＭＡＢＬ−１由来の二本鎖ｃＤＮＡ ０.１μｇの代わりにＭＡＢＬ−２由来の二本鎖ｃＤＮＡ ０.１μｇを用いて増幅した点を除いて、前記１．３（１）においてＭＡＢＬ−１Ｌ鎖Ｖ領域遺伝子の増幅について記載したのと同じ方法により行った。
【００８９】
（４）ＭＡＢＬ−２Ｈ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの増幅
ＰＣＲのためのプライマーとして配列番号：１に示すアダプタープライマー１、及び配列番号：４に示すＭＨＣ−γ２ａプライマー（Bio/Technology, 9, 88-89, 1991）を用い
た。
ｃＤＮＡの増幅は、０.２μＭのＭＫＣプライマーの代わりに０.２μＭのＭＨＣ−γ２ａプライマーを用いて増幅した点を除いて、前記１．３（３）においてＬ鎖Ｖ領域遺伝子の増幅について記載したのと同じ方法により行った。
【００９０】
１．４ ＰＣＲ生成物の精製
前記のようにしてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片をQIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製し、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）に溶解した。
【００９１】
１．５ 連結及び形質転換
上記のようにして調製したＭＡＢＬ−１由来マウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片約１４０ｎｇをｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Promega社製）５０ｎｇと、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ユニット Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Promega社製）を含有する反応混合液中で、１５℃にて３時間反応させ連結した。
【００９２】
次に、１μｌの上記連結混合液を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（東洋紡社製）５０μｌに加え、そしてこの細胞を氷上で３０分間、４２℃にて１分間そして再び氷上で２分間静置した。次いで１００μｌのＳＯＣ培地（GIBCO BRL社製）を加え、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（SIGMA社製）を含有するＬＢ（Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）寒天培地上にこの大腸菌を塗布し、３７℃にて終夜培養して大腸菌形質転換体を得た。
この形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地３ｍｌ中で３７℃にて終夜培養し、そしてこの培養物からQIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
【００９３】
こうして得られた、ハイブリドーマＭＡＢＬ−１に由来するマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをｐＧＥＭ−Ｍ１Ｌと命名した。
上記の同じ方法に従って、ハイブリドーマＭＡＢＬ−１に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドを精製ＤＮＡ断片から作製し、ｐＧＥＭ−Ｍ１Ｈと命名した。
【００９４】
また、ハイブリドーマＭＡＢＬ−２に由来するマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドを精製ＤＮＡ断片から作製し、ｐＧＥＭ−Ｍ２Ｌと命名した。
また、ハイブリドーマＭＡＢＬ−２に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドを精製ＤＮＡ断片から作製し、ｐＧＥＭ−Ｍ２Ｈと命名した。
【００９５】
実施例２ （ＤＮＡの塩基配列の決定）
前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列の決定は、自動ＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystem社製）及びABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（Applied Biosystem社製）を用いて、メーカー指定のプロトコールに従って行った。
【００９６】
プラスミドｐＧＥＭ−Ｍ１Ｌに含まれるマウスＭＡＢＬ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：５に示す。
【００９７】
また、プラスミドｐＧＥＭ−Ｍ１Ｈに含まれるマウスＭＡＢＬ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：６に示す。
【００９８】
また、プラスミドｐＧＥＭ−Ｍ２Ｌに含まれるマウスＭＡＢＬ−２抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：７に示す。
【００９９】
また、プラスミドｐＧＥＭ−Ｍ２Ｈに含まれるマウスＭＡＢＬ−２抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：８に示す。
【０１００】
実施例３ （ＣＤＲの決定）
Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域の全般的構造は、互いに類似性を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３つの超可変領域、即ち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較的良く保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Kabat, E. A.ら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」US Dept. Health and Human Services, 1983）。
【０１０１】
このような事実に基づき、ヒトＩＡＰに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔらにより作製された抗体のアミノ酸配列のデータベースにあてはめ、相同性を調べることによりＣＤＲ領域を表１に示す如く決定した。
【０１０２】
【表１】
Figure 0004261907
【０１０３】
実施例４ （クローン化ｃＤＮＡの発現の確認（キメラＭＡＢＬ−１抗体及びキメラＭＡＢＬ−２抗体の作製））
４．１ キメラＭＡＢＬ−１抗体発現ベクターの作製
キメラＭＡＢＬ−１抗体を発現するベクターを作製するため、それぞれマウスＭＡＢＬ−１Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡクローンｐＧＥＭ−Ｍ１Ｌ及びｐＧＥＭ−Ｍ１ＨをＰＣＲ法により修飾した。そしてＨＥＦ発現ベクター（国際公開公報ＷＯ９２／１９７５９参照）に導入した。
【０１０４】
Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＭＬＳ（配列番号：９）及びＨ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＭＨＳ（配列番号：１０）は、各々のＶ領域のリーダー配列の最初をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（J. mol. Biol., 196, 947-950, 1987）及びＨｉｎｄ III制限酵素部位を有するように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＭＬＡＳ（配列番号：１１）及びＨ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＭＨＡＳ（配列番号：１２）は、Ｊ領域の末端をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズし且つスプライスドナー配列及びＢａｍＨＩ制限酵素部位を有するように設計した。
【０１０５】
ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０μｌの１０×ＰＣＲ Buffer II、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.１６ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼAmpliTaq Gold、０.４μＭずつの各プライマー、及び８ｎｇの鋳型ＤＮＡ（ｐＧＥＭ−Ｍ１Ｌ及びｐＧＥＭ−Ｍ１Ｈ）を含有し、９４℃の初期温度にて９分間そして次に９４℃にて１分間、６０℃にて１分間及び７２℃にて１分２０秒間、この順序で加熱した。この温度サイクルを３５回反復した後、反応混合物を更に７２℃で１０分間加熱した。
【０１０６】
ＰＣＲ生成物をQIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製し、Ｈｉｎｄ III及びＢａｍＨＩで消化し、そしてＬ鎖Ｖ領域については、ＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−κに、Ｈ鎖Ｖ領域についてはＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−γにそれぞれクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをそれぞれＨＥＦ−Ｍ１Ｌ、ＨＥＦ−Ｍ１Ｈと命名した。
【０１０７】
４．２ キメラＭＡＢＬ−２抗体発現ベクターの作製
ｃＤＮＡの修飾及びクローニングは、ｐＧＥＭ−Ｍ１Ｌ及びｐＧＥＭ−Ｍ１Ｈの代わりにｐＧＥＭ−Ｍ２Ｌ及びｐＧＥＭ−Ｍ２Ｈを鋳型ＤＮＡに増幅した点を除いて、前記４．１において記載したのと同じ方法により増幅及びクローニングを行い、ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをそれぞれＨＥＦ−Ｍ２Ｌ、ＨＥＦ−Ｍ２Ｈと命名した。
【０１０８】
４．３ ＣＯＳ７細胞への遺伝子導入
キメラＭＡＢＬ−１抗体及びキメラＭＡＢＬ−２抗体の一過性発現を観察するため、前記発現ベクターをＣＯＳ７細胞において試験した。
（１）キメラＭＡＢＬ−１抗体の遺伝子導入
ＨＥＦ−Ｍ１ＬとＨＥＦ−Ｍ１Ｈベクターを、Gene Pulser装置（BioRad社製）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ７細胞に同時形質転換した。各ＤＮＡ（１０μｇ）と、ＰＢＳ中１×１０7細胞／ｍｌの０.８ｍｌをキュベットに加え、１.５ｋＶ、２５μＦの容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のγ−グロブリンフリーウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培養液（GIBCO BRL社製）に加えた。７２時間培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去して回収培養上清を得た。
【０１０９】
（２）キメラＭＡＢＬ−２抗体の遺伝子導入
キメラＭＡＢＬ−２抗体遺伝子の導入は、ＨＥＦ−Ｍ１ＬとＨＥＦ−Ｍ１Ｈベクターの代わりにＨＥＦ−Ｍ２ＬとＨＥＦ−Ｍ２Ｈベクターを用いた点を除いて、前記４．３（１）に記載したのと同じ方法によりＣＯＳ７細胞に同時形質転換し、回収培養上清を得た。
【０１１０】
４．４ フローサイトメトリー
抗原への結合を測定するため、前記ＣＯＳ７細胞培養上清を用いてフローサイトメトリーを行った。ヒトＩＡＰを発現するマウス白血病細胞株Ｌ１２１０細胞４×１０5個に、キメラＭＡＢＬ−１抗体を発現させたＣＯＳ７細胞の培養上清あるいはキメラＭＡＢＬ−２抗体を発現させたＣＯＳ７細胞の培養上清あるいはコントロールとしてヒトＩｇＧ１抗体（SIGMA社製）を加え、氷上にてインキュベーション及び洗浄の後、ＦＩＴＣ標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Cappel社製）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、ＦＡＣＳｃａｎ装置（BECTON DICKINSON社製）にて蛍光強度を測定した。
その結果、キメラＭＡＢＬ−１抗体及びキメラＭＡＢＬ−２抗体は、ヒトＩＡＰを発現するＬ１２１０細胞に特異的に結合したことにより、これらのキメラ抗体がマウスモノクローナル抗体ＭＡＢＬ−１及びＭＡＢＬ−２のそれぞれのＶ領域の正しい構造を有することが明らかとなった（図１〜３）。
【０１１１】
実施例５ （再構成ＭＡＢＬ−１抗体及び再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）領域の作製）
５．１ 再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖Ｆｖの作製
再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖Ｆｖを次の様にして作製した。再構成ＭＡＢＬ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域、リンカー領域、及び再構成ＭＡＢＬ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域をそれぞれＰＣＲ法を用いて増幅し、連結することにより、再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖Ｆｖを作製した。この方法を図４に模式的に示す。再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖Ｆｖの作製のために６個のＰＣＲプライマー（Ａ〜Ｆ）を使用した。プライマーＡ、Ｃ及びＥはセンス配列を有し、プライマーＢ、Ｄ及びＦはアンチセンス配列を有する。
【０１１２】
Ｈ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＶＨＳ（プライマーＡ、配列番号：１３）は、Ｈ鎖
Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＮｃｏＩ制限酵素認識部位を有するように設計した。Ｈ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＶＨＡＳ（プライマーＢ、配列番号：１４）は、Ｈ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つリンカーとオーバーラップするように設計した。
【０１１３】
リンカーのための前方プライマーＬＳ（プライマーＣ、配列番号：１５）は、リンカーのＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＨ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡとオーバーラップするように設計した。リンカーのための後方プライマーＬＡＳ（プライマーＤ、配列番号：１６）は、リンカーのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＬ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡとオーバーラップするように設計した。
【０１１４】
Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＶＬＳ（プライマーＥ、配列番号：１７）は、リンカーのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＬ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにオーバーラップするように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＶＬＡＳ−ＦＬＡＧ（プライマーＦ、配列番号：１８）は、Ｌ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＦＬＡＧペプチドをコードする配列（Hopp, T. P.ら、Bio/Technology, 6, 1204-1210, 1988）、２個の転写停止コドン及びＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を有するように設計した。
【０１１５】
第一ＰＣＲ段階において３つの反応Ａ−Ｂ、Ｃ−Ｄ及びＥ−Ｆを行い、そして各ＰＣＲ生成物を精製した。第一ＰＣＲから得られた３つのＰＣＲ生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブルさせた。次に、プライマーＡ及びＦを加えて、再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖Ｆｖをコードする全長ＤＮＡを増幅した（第二ＰＣＲ）。なお、第一ＰＣＲにおいては、再構成ＭＡＢＬ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするプラスミドｐＧＥＭ−Ｍ１Ｈ（実施例２を参照）、Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ（配列番号：１９）からなるリンカー領域をコードするＤＮＡ配列（Huston, J. S.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
85, 5879-5883, 1988）を含んで成るプラスミドｐＳＣ−ＤＰ１、及び再構成ＭＡＢＬ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするプラスミドｐＧＥＭ−Ｍ１Ｌ（実施例２を参照）をそれぞれ鋳型として用いた。
【０１１６】
第一ＰＣＲ段階の溶液５０μｌは、５μｌの１０×ＰＣＲ Buffer II、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.１６ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２.５ユニットのＤＮＡポリメラーゼAmpliTaq Gold（以上PERKIN ELMER社製）、０.４μＭずつの各プライマー及び５ｎｇの各鋳型ＤＮＡを含有し、９４℃の初期温度にて９分間そして次に９４℃にて１分間、６５℃にて１分間及び７２℃にて１分２０秒間、この順序で加熱した。この温度サイクルを３５回反復した後、反応混合物を更に７２℃で７分間加熱した。
【０１１７】
ＰＣＲ生成物Ａ−Ｂ（３７１ｂｐ）、Ｃ−Ｄ（６３ｂｐ）、及びＥ−Ｆ（３８４ｂｐ）をQIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製し、第二ＰＣＲでアッセンブルした。第二ＰＣＲにおいて、鋳型として１２０ｎｇの第一ＰＣＲ生成物Ａ−Ｂ、２０ｎｇのＰＣＲ生成物Ｃ−Ｄ及び１２０ｎｇのＰＣＲ生成物Ｅ−Ｆ、１０μｌの１０×ＰＣＲ Buffer II、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.１６ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼAmpliTaq Gold（以上PERKIN ELMER 社製）を含有する９８μｌのＰＣＲ混合液を、９４℃の初期温度にて８分間そして次に９４℃にて２分間、６５℃にて２分間及び７２℃にて２分間、この順序で加熱した。この温度サイクルを２回反復した後、それぞれ０.４μＭのプライマーＡ及びＦを加えた。そして９４℃の初期温度にて１分間そして次に９４℃にて１分間、６５℃にて１分間及び７２℃にて１分２０秒間、この順序で加熱し、この温度サイクルを３５回反復した後、反応混合物を７２℃にて７分間加熱した。
【０１１８】
第二ＰＣＲにより生じた８４３ｂｐのＤＮＡ断片を精製し、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＳＣＦＶＴ７ベクターにクローニングした。なお、本発現ベクターｐＳＣＦＶＴ７は、大腸菌ペリプラズム分泌発現系に適するｐｅｌＢシグナル配列（Lei, S. P.ら、J. Bacteriology, 169, 4379-4383, 1987）を含んでいる。ＤＮＡ配列決定の後、再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖Ｆｖの正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐｓｃＭ１と命名した（図５を参照）。本プラスミドｐｓｃＭ１に含まれる再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖Ｆｖの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：２０に示す。
【０１１９】
次に、哺乳動物細胞にて再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖Ｆｖを発現するベクターを作製するため、ｐｓｃＭ１ベクターをＰＣＲ法により修飾した。そして得られたＤＮＡ断片をｐＣＨＯ１発現ベクターに導入した。なお、本発現ベクターｐＣＨＯ１は、ＤＨＦＲ−ΔＥ−ｒｖＨ−ＰＭ１−ｆ（ＷＯ９２／１９７５９参照）から、ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩ消化により抗体遺伝子を削除し、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ Ａｄａｐｔｏｒ（宝酒造社製）を連結することにより構築したベクターである。
【０１２０】
ＰＣＲに使用するプライマーは、前方プライマーとしてＨ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＳａｌＩ制限酵素認識部位を有する配列番号：２１に示すＳａｌ−ＶＨＳプライマー及び後方プライマーとして第一フレームワーク配列の最後をコードするＤＮＡにハイブリダイズする配列番号：２２に示すＦＲＨ１ａｎｔｉプライマーを用いた。
【０１２１】
ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０μｌの１０×ＰＣＲ Buffer II、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.１６ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼAmpliTaq Gold、０.４μＭずつの各プライマー、及び８ｎｇの鋳型ＤＮＡ（ｐｓｃＭ１）を含有し、９５℃の初期温度にて９分間そして次に９５℃にて１分間、６０℃にて１分間及び７２℃にて１分２０秒間、この順序で加熱した。この温度サイクルを３５回反復した後、反応混合物を更に７２℃で７分間加熱した。
【０１２２】
ＰＣＲ生成物をQIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製し、ＳａｌＩ及びＭｂｏ IIで消化し、Ｎ末端側再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡ断片を得た。また、ｐｓｃＭ１ベクターをＭｂｏ II及びＥｃｏＲＩで消化し、Ｃ末端側再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡ断片を得た。そして、ＳａｌＩ−Ｍｂｏ II ＤＮＡ断片及びＭｂｏ II−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片をｐＣＨＯ１−Ｉｇｓベクターにクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐＣＨＯＭ１と命名した（図６を参照）。なお、本発現ベクターｐＣＨＯ１−Ｉｇｓは、哺乳動物細胞分泌発現系に適するマウスＩｇＧ１シグナル配列（Nature, 332, 323-327, 1988）を含んでいる。本プラスミドｐＣＨＯＭ１に含まれる再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖Ｆｖの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：２３に示す。
【０１２３】
５．２ 再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖの作製
再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖを前記５．１に従って作製した。第一ＰＣＲにおいては、ｐＧＥＭ−Ｍ１Ｈの代わりに再構成ＭＡＢＬ−２抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするプラスミドｐＧＥＭ−Ｍ２Ｈ（実施例２を参照）、及びｐＧＥＭ−Ｍ１Ｌの代わりに再構成ＭＡＢＬ−２抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするプラスミドｐＧＥＭ−Ｍ２Ｌ（実施例２を参照）を使用し、再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖの正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドｐｓｃＭ２を得た。本プラスミドｐｓｃＭ２に含まれる再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：２４に示す。
【０１２４】
また、ｐｓｃＭ２ベクターの修飾により再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖの正しいア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含む哺乳動物細胞発現用ｐＣＨＯＭ２ベクターを得た。本プラスミドｐＣＨＯＭ２に含まれる再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：２５に示す。
【０１２５】
５．３ ＣＯＳ７細胞への遺伝子導入
再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖの一過性発現を観察するため、ｐＣＨＯＭ２ベクターをＣＯＳ７細胞において試験した。
ｐＣＨＯＭ２ベクターを、Gene Pulser装置（BioRad社製）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ７細胞に形質転換した。ＤＮＡ（１０μｇ）と、ＰＢＳ中１×１０7細胞／ｍｌの０.８ｍｌをキュベットに加え、１.５ｋＶ、２５μＦの容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のウシ胎児血清を含有するＩＭＤＭ培養液（GIBCO BRL社製）に加えた。７２時間培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去して回収培養上清を得た。
【０１２６】
５．４ ＣＯＳ７細胞培養上清中の再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖの検出
ｐＣＨＯＭ２ベクターを遺伝子導入したＣＯＳ７細胞培養上清中における再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖをウェスタンブロッティング法により確認した。
ｐＣＨＯＭ２ベクターを遺伝子導入したＣＯＳ７細胞培養上清及びコントロールとしてｐＣＨＯ１ベクターを遺伝子導入したＣＯＳ７細胞培養上清についてＳＤＳ電気泳動を行い、ＲＥＩＮＦＯＲＣＥＤ ＮＣ膜（Schleicher ＆ Schuell社製）に転写した。５％スキムミルク（森永乳業社製）にてブロッキングを行い、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて洗浄後、抗ＦＬＡＧ抗体（SIGMA社製）を加えた。室温にてインキュベーション及び洗浄の後、アルカリフォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Zymed社製）を加え、室温にてインキュベーション及び洗浄後、基質溶液（Kirkegaard Perry Laboratories社製）を添加し、発色させた（図７）。
その結果、ｐＣＨＯＭ２ベクター導入ＣＯＳ７細胞培養上清中にのみＦＬＡＧペプチド特異的なタンパク質が検出され、この培養上清中に再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖが分泌されていることが明らかとなった。
【０１２７】
５．５ フローサイトメトリー
抗原への結合を測定するため、前記ＣＯＳ７細胞培養上清を用いてフローサイトメトリーを行った。ヒトIntegrin Associated Protein（ＩＡＰ）を発現するマウス白血病細胞株Ｌ１２１０細胞、あるいはコントロールとしてｐＣＯＳ１ベクターを形質転換したＬ１２１０細胞２×１０5個に、再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖを発現させたＣＯＳ７細胞の培養上清あるいはコントロールとしてｐＣＨＯ１ベクターを形質転換したＣＯＳ７細胞の培養上清を加え、氷上にてインキュベーション及び洗浄の後、マウス抗ＦＬＡＧ抗体（SIGMA社製）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＩｇＧ抗体（BECTON DICKINSON社製）を加えた。再度インキュベーション及び洗浄の後、ＦＡＣＳｃａｎ装置（BECTON DICKINSON社製）にて蛍光強度を測定した。
その結果、再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖは、ヒトＩＡＰを発現するＬ１２１０細胞に特異的に結合したことにより、この再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖ＦｖがヒトIntegrin Associated Proteinに対するアフィニティーを有することが明らかとなった（図８〜１１）。
【０１２８】
５．６ Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ
マウスモノクローナル抗体の抗原結合に対する阻害活性を指標に、再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖの抗原結合活性を測定した。
１μｇ／ｍｌに調整した抗ＦＬＡＧ抗体を９６ウェルプレートの各ウェルに加え、３７℃にて２時間インキュベートした。洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳにてブロッキングを行った。室温にてインキュベート及び洗浄後、分泌型ヒトＩＡＰ抗原遺伝子（配列番号：２６）を導入したＣＯＳ７細胞培養上清をＰＢＳにて２倍希釈したものを各ウェルに加えた。室温にてインキュベート及び洗浄後、１００ｎｇ／ｍｌに調整したビオチン化ＭＡＢＬ−２抗体５０μｌ及び順次希釈した再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖ発現ＣＯＳ７細胞培養上清５０μｌを混和したものを各ウェルに加えた。室温にてインキュベート及び洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジン（Zymed 社製）を加えた。室温にてインキュベート及び洗浄後、基質溶液（SIGMA 社製）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１２９】
その結果、再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖ（ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ）は、コントロールのｐＣＨＯ１導入ＣＯＳ７細胞培養上清に比較して明らかに濃度依存的にマウスＭＡＢＬ−２抗体のヒトＩＡＰ抗原への結合を阻害した（図１２）。このことから、再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖは、マウスモノクローナル抗体ＭＡＢＬ−２のそれぞれのＶ領域の正しい構造を有することが示唆された。
【０１３０】
５．７ in vitro でのアポトーシス誘起効果
ヒトＩＡＰを遺伝子導入したＬ１２１０細胞、及びコントロールとしてｐＣＯＳ１ベクターを遺伝子導入したＬ１２１０細胞、及びＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を用い、再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖのアポトーシス誘起作用をＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ（BOEHRINGER MANNHEIM社製）染色により検討した。
各細胞１×１０5個に、再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖ発現ＣＯＳ７細胞培養上清あるいはコントロールとしてｐＣＨＯ１ベクター導入ＣＯＳ７細胞培養上清を終濃度５０％で添加し、２４時間培養した。その後、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色を行い、ＦＡＣＳｃａｎ装置（BECTON DICKINSON社製）にて蛍光強度を測定した。
【０１３１】
Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色による解析の結果を図１３〜１８にそれぞれ示した。ここで、図の左下の領域にあるドットは生細胞を、右下の領域はアポトーシス初期の細胞を、右上の領域はアポトーシス後期の細胞を示す。その結果、再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖ（ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ）はＬ１２１０細胞においてヒトＩＡＰ抗原特異的に著しい細胞死を誘導した（図１３〜１６）。また、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞においてもコントロールに比較して著しい細胞死を誘導した（図１７〜１８）。
【０１３２】
５．８ ＣＨＯ細胞におけるＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖポリペプチドの発現
ＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖ（ポリペプチド）の恒常的発現ＣＨＯ細胞株を樹立するため、ｐＣＨＯＭ２ベクターをＣＨＯ細胞に遺伝子導入した。
ｐＣＨＯＭ２ベクターを、Gene Pulser装置（BioRad社製）を用いてエレクトロポレーションによりＣＨＯ細胞に形質転換した。ＤＮＡ（１０μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＨＯ細胞（１×１０7細胞／ｍｌ）の０.７ｍｌを混合したものをキュベットに加え、１.５ｋＶ、２５μＦの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のウシ胎児血清を含有する核酸不含α−ＭＥＭ培地（GIBCO BRL社製）に加え培養した。得られたクローンについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて目的とするタンパク質の発現を確認し、発現量の高いクローンをＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖの産生細胞株として選択した。１０ｎＭ methotrexate（SIGMA社製）を含む無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ II（GIBCO BRL社製）にて培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去して回収培養上清を得た。
【０１３３】
５．９ ＣＨＯ細胞産生のＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖの精製
５．８で得た一本鎖Ｆｖ発現ＣＨＯ産生株の培養上清を人工透析用カートリッジ（ＰＡＮ１３０ＳＦ、旭メディカル）を用いて約２０倍まで濃縮した。濃縮液は−２０℃で保存し、精製時解凍して用いた。
ＣＨＯ細胞培養上清から一本鎖Ｆｖの精製は、Blue-sepharose、ハイドロキシアパタイト及びゲル濾過の三種のクロマトグラフィーにより行った。
（１）Blue-sepharoseカラムクロマトグラフィー
培養上清の濃縮液を２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ６.０）にて１０倍希釈し、遠心分離（１００００ｒｐｍ×３０分）により不溶物を除去した。上清を同緩衝液で平衡化したBlue-sepharoseカラム（２０ｍｌ）に添加し、同緩衝液でカラムを洗浄後、同緩衝液中ＮａＣｌ濃度を０.１、０.２、０.３、０.５及び１.０Ｍまで段階的に上げ、カラムに吸着した蛋白質を溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで素通り及び各溶出画分を分析し、一本鎖Ｆｖが確認された画分（０.１〜０.３Ｍ ＮａＣｌ溶出画分）をプールし、Centriprep-10（アミコン）を用いて約２０倍濃縮した。
【０１３４】
（２）ハイドロキシアパタイト
（１）の濃縮液を１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７.０）にて１０倍希釈し、ハイドロキシアパタイトカラム（２０ｍｌ、BioRad）に添加した。６０ｍｌの１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７.０）でカラムを洗浄後、リン酸緩衝液濃度を２００ｍＭまで直線的に上げ、カラムに吸着した蛋白質を溶出した（図１９）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各画分を分析した結果、画分Ａ及び画分Ｂに一本鎖Ｆｖが確認された。
【０１３５】
（３）ゲル濾過
（２）の画分Ａ及びＢをそれぞれCentriprep-10を用いて濃縮し、０.１５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ６.０）で平衡化したＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＧカラム（２１.５×６００ｍｍ）に添加した。クロマトグラムを図２０に示す。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、いずれも主要ピーク（ＡＩ、ＢＩ）が目的の一本鎖Ｆｖであり、ゲル濾過で分析した結果、画分Ａでは見かけ上の分子量約３６ｋＤ、画分Ｂでは同７６ｋＤに溶出された。精製した一本鎖Ｆｖ（ＡＩ、ＢＩ）を１５％−ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて分析した。サンプルを還元剤添加、非添加で処理し、Ｌａｅｍｍｌｉの方法に準じて電気泳動を行い、泳動後蛋白質をクマシーブリリアントブルー染色した。図２１に示すように、ＡＩ、ＢＩいずれも還元剤の添加の有無に関わらず、見かけ上の分子量約３５ｋＤに単一バンドを与えた。以上の結果から、ＡＩは一本鎖Ｆｖのモノマーで、ＢＩは一本鎖Ｆｖの非共有結合性ダイマーと考えられる。画分ＡＩ及びＢＩをＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラム（７.５×６０ｍｍ）を用いたゲル濾過により分析した結果、画分ＡＩはモノマーのピークのみ、画分ＢＩはダイマーのピークのみ検出された（図２２を参照）。また、ダイマー画分（画分ＢＩ）は、全一本鎖Ｆｖの約４％であった。該ダイマー画分中のダイマーは、その９０％以上が４℃で１ヶ月以上安定的に維持された。
【０１３６】
５．１０ 大腸菌細胞でのＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖポリペプチド発現ベクターの構築
ＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖを大腸菌菌体内にて効率的に発現するベクターを作製するため、ｐｓｃＭ２ベクターをＰＣＲ法により修飾した。得られたＤＮＡ断片をｐＳＣＦＶＴ７発現ベクターに導入した。
ＰＣＲに使用するプライマーは、前方プライマーとしてＨ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つ開始コドン及びＮｄｅＩ制限酵素認識部位を有する配列番号：２７に示すＮｄｅ−ＶＨＳｍ０２プライマー及び後方プライマーとしてＬ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つ２個の停止コドン及びＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を有する配列番号：２８に示すＶＬＡＳプライマーを用いた。なお、前方プライマーのＮｄｅ−ＶＨＳｍ０２は大腸菌菌体内にて効率的に発現するため、Ｈ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズする部分に５カ所の点変異を含んでいる。
【０１３７】
ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０μｌの１０×ＰＣＲ Buffer ＃１、１ｍＭ ＭｇＣｌ2
、０.２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５ユニットのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（以上東洋紡社製）、１μＭずつの各プライマー、及び１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ（ｐｓｃＭ２）を含有し、９８℃にて１５秒間、６５℃にて２秒間及び７４℃にて３０秒間、この順序で加熱した。この温度サイクルを２５回反復した。
【０１３８】
ＰＣＲ生成物をQIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製し、ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＳＣＦＶＴ７ベクターにクローニングした。なお、本発現ベクターｐＳＣＦＶＴ７はＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化したことによりｐｅｌＢシグナル配列が削除されている。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐｓｃＭ２ＤＥｍ０２と命名した（図２３を参照のこと）。本プラスミドｐｓｃＭ２ＤＥｍ０２に含まれるＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：２９に示す。
【０１３９】
５．１１ 大腸菌細胞におけるＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖポリペプチドの発現
ＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖポリペプチドを発現する大腸菌株を得るため、ｐｓｃＭ２ＤＥｍ０２ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（STRATAGENE社製）に形質転換した。得られたクローンについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて目的とするタンパク質の発現を検討し、発現量の高いクローンをＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖポリペプチドの産生株として選択した。
【０１４０】
５．１２ 大腸菌細胞産生のＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖポリペプチドの精製
形質転換して得られた大腸菌のシングルコロニーをＬＢ培地３ｍｌにて２８℃で７時間培養し、これを７０ｍｌのＬＢ培地に植え継ぎ、２８℃にて一夜培養を行った。このｐｒｅ−ｃｕｌｔｕｒｅを７Ｌの ＬＢ培地に植え継ぎ、ジャーファーメンターを用いて２８℃、攪拌速度３００ｒｐｍにて培養した。Ｏ.Ｄ.＝１.５のときに１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導をかけ、その後３時間培養を行った。
【０１４１】
培養液を遠心分離（１００００×ｇ、１０分）し、沈殿として回収した菌体に５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）を加え、超音波（out put：４、duty cycle：70％、１分×１０回）により菌体を破砕した。この懸濁液を遠心分離（１２０００×ｇ、１０分）にかけ、沈殿として回収した封入体に５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）を加え、再度超音波処理（out put：４、duty cycle：50％、30秒×２）を行い、遠心分離（１２０００×ｇ、１０分）により目的蛋白質を沈殿として回収し、上清にくる夾雑蛋白質を除去した。
【０１４２】
目的蛋白質を含んだ封入体を６Ｍ Ｕｒｅａ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）に溶解し、４Ｍ Ｕｒｅａ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ メルカプトエタノールを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００（５×９０ｃｍ、AMERSHAM PHARMACIA社製）ゲル濾過カラムに、流速５ｍｌ／分で添加し、会合している高分子量の一本鎖Ｆｖを除去した。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、純度の高い画分について、Ｏ.Ｄ280＝０.２５になるようにゲル濾過で用いた溶媒で希釈後、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、０.５Ｍ Ａｒｇ、２ｍＭ 還元型グルタチオン、０.２ｍＭ 酸化型グルタチオンを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）に対して透析を３回行うことにより、巻き戻し操作を行った。さらに０.１５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ６.０）に対して３回透析し、溶媒交換を行った。
【０１４３】
わずかに含まれる分子間でＳ−Ｓ結合で架橋された高分子を分離除去するため、０.１５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ６.０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（２.６×６０ｃｍ、AMERSHAM PHARMACIA社製）ゲル濾過カラムに添加した。図２４に示すように、高分子量の会合体と考えられるブロードなピークのあと、主要ピークとサブピークの２つのピークが検出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析（図２１参照）及びゲル濾過の溶出位置から、主要ピークは一本鎖Ｆｖポリペプチドのモノマーであり、サブピークは非共有結合性のダイマーと考えられる。なお、形成された非共有結合性のダイマーは、全一本鎖Ｆｖポリペプチドの約４％であった。
【０１４４】
５．１３ ＭＡＢＬ−２抗体由来の精製一本鎖Ｆｖポリペプチドの in vitro でのアポトーシス誘起効果
ヒトＩＡＰを遺伝子導入したＬ１２１０細胞（ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０）を用い、ＣＨＯ細胞及び大腸菌細胞産生のＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖポリペプチド（ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ）のアポトーシス誘起作用を、次の２つのプロトコールにてＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ（BOEHRINGER MANNHEIM社製）染色により検討した。
【０１４５】
第一のプロトコールは、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞５×１０4個に、抗体試料を終濃度３μｇ／ｍｌで添加し、２４時間培養した。抗体試料として、実施例５．９で得たＣＨＯ細胞由来ＭＡＢＬ２一本鎖Ｆｖのモノマー及びダイマー、さらに実施例５．１２で得た大腸菌細胞由来の同モノマー及びダイマー、そしてコントロールとしてマウスＩｇＧ抗体について検討した。培養後、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色を行い、ＦＡＣＳｃａｎ装置（BECTON DICKINSON社製）にて蛍光強度を測定した。
【０１４６】
また、第二のプロトコールは、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞５×１０4個に、抗体試料を終濃度３μｇ／ｍｌで添加し、２時間培養後に抗ＦＬＡＧ抗体（SIGMA社製）を終濃度１５μｇ／ｍｌで添加し、更に２２時間培養した。抗体試料として、５．９で得たＣＨＯ細胞由来ＭＡＢＬ２一本鎖Ｆｖのモノマー及びコントロールとしてマウスＩｇＧ抗体について検討した。培養後、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色を行い、ＦＡＣＳｃａｎ装置にて蛍光強度を測定した。
【０１４７】
Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色による解析の結果を図２５〜３１にそれぞれ示した。その結果、ＣＨＯ細胞及び大腸菌細胞産生のＭＡＢＬ−２抗体由来一本鎖Ｆｖポリペプチドのダイマーはコントロール（図２５）と比較して著しい細胞死を誘導した（図２６、２７）が、ＣＨＯ細胞及び大腸菌細胞産生の一本鎖Ｆｖポリペプチドのモノマーのアポトーシス誘導作用は認められなかった（図２８、２９）。また、抗ＦＬＡＧ抗体の添加により、ＣＨＯ細胞産生のＭＡＢＬ−２抗体由来一本鎖Ｆｖポリペプチドのモノマーはコントロール（図３０）と比較して著しい細胞死を誘導した（図３１）。
【０１４８】
５．１４ ｓｃＦｖ／ＣＨＯポリペプチドのモノマー及びダイマーのヒト骨髄腫マウスモデルに対する抗腫瘍効果
（１）マウス血清ヒトＩｇＧ定量法
マウス血清中における、ヒト骨髄腫細胞が産生するヒトＩｇＧ（Ｍタンパク質）の定量は、以下のＥＬＩＳＡで行った。０.１％重炭酸緩衝液（ｐＨ９.６）で１μｇ／ｍｌに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（BIOSOURCE社製、Ｌｏｔ＃７９０２）１００μｌを９６ウェルプレート（Nunc社製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化した。ブロッキングの後、段階希釈したマウス血清あるいは標品としてヒトＩｇＧ（Cappel社製、Ｌｏｔ＃００９１５）１００μｌを添加し、室温にて２時間インキュベーションした。洗浄後、５０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（BIOSOURCE社製、Ｌｏｔ＃６２０２）１００μｌを加え、室温にて１時間インキュベーションした。洗浄後、基質溶液を加え、インキュベーションの後、MICROPLATE READER Model 3550（BioRad社製）を用いて４０５ｎｍの吸光度を測定し、標品のヒトＩｇＧの吸光度より得られた検量線から、マウス血清中のヒトＩｇＧ（Ｍタンパク質）濃度を算出した。
【０１４９】
（２）投与抗体の調製
ｓｃＦｖ／ＣＨＯポリペプチドのモノマー及びダイマーは、投与当日、濾過滅菌したＰＢＳ（−）を用いて、それぞれ０.４ｍｇ／ｍｌ、０.２５ｍｇ／ｍｌになるように調製し、投与試料とした。
【０１５０】
（３）ヒト骨髄腫マウスモデルの作製
ヒト骨髄腫マウスモデルは以下のように作製した。ＳＣＩＤマウス（日本クレア）を用いてin vivo 継代したＫＰＭＭ２細胞（特開平７−２３６４７５号公報）を１０％ウシ胎児血清（GIBCO BRL社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（GIBCO BRL社製）で３×１０7個／ｍｌになるように調製した。あらかじめ前日抗アシアロＧＭ１抗体（和光純薬社製、１バイアルを５ｍｌで溶解）１００μｌを皮下投与したＳＣＩＤマウス（オス、６週齢）（日本クレア）に上記ＫＰＭＭ２細胞懸濁液２００μl（６×１０6個／マウス）を尾静脈より注入した。
【０１５１】
（４）抗体投与
（３）で作製したヒト骨髄腫マウスモデルに対し、ＫＰＭＭ２細胞移植後３日目より、１日２回、３日間、上記（２）で調製した投与試料、モノマーは２５０μｌ、ダイマーは４００μｌを、尾静脈より投与した。対照として、濾過滅菌したＰＢＳ（−）を同様に１日２回、３日間、２００μｌ、尾静脈より投与した。両群とも、１群７匹で行った。
【０１５２】
（５）ｓｃＦｖ／ＣＨＯポリペプチドのモノマー及びダイマーのヒト骨髄腫移植マウスモデルに対する抗腫瘍効果の評価
ｓｃＦｖ／ＣＨＯポリペプチドのモノマー及びダイマーのヒト骨髄腫マウスモデルの抗腫瘍効果については、当該骨髄腫細胞が産生するヒトＩｇＧ（Ｍタンパク質）のマウス血清中の量の変化、及び生存期間で評価した。マウス血清中のヒトＩｇＧ量の変化については、ＫＰＭＭ２細胞移植後２４日目に血清を採取し、上記（１）で述べたＥＬＩＳＡを用いてヒトＩｇＧ量を測定した。その結果、ＰＢＳ（−）投与群では、血清ヒトＩｇＧ（Ｍタンパク質）量が約８５００μｇ／ｍｌまで上昇しているのに対し、ｓｃＦｖ／ＣＨＯダイマー投与群では対照群の１／１０以下と顕著に低値であり、ｓｃＦｖ／ＣＨＯダイマーがＫＰＭＭ２細胞の増殖を非常に強く抑制していることが示された（図３２）。一方、生存期間についても図３３に示すとおり、ｓｃＦｖ／ＣＨＯダイマー投与群ではＰＢＳ（−）投与群と比較して顕著な生存期間の延長が認められた。
以上より、ｓｃＦｖ／ＣＨＯダイマーがヒト骨髄腫マウスモデルに対して、抗腫瘍効果を有することが示された。本発明の改変抗体であるｓｃＦｖ／ＣＨＯダイマーの抗腫瘍効果は、当該改変抗体が有するアポトーシス誘起作用に基づくと考えられる。
【０１５３】
５．１５ 赤血球凝集試験
赤血球凝集試験及び赤血球凝集の判定法は、続生化学実験講座の免疫生化学研究法（日本生化学会編、東京化学同人）に準じて実施した。
健常人の血液をヘパリン処理した注射筒により採血し、ＰＢＳ（−）により３回洗浄した後、ＰＢＳ（−）にて最終濃度が２％の赤血球浮遊液を作製した。検査サンプルは、対照としてマウスＩｇＧ（Zymed社製）を用い、ＭＡＢＬ−２抗体、ＣＨＯ細胞産生の一本鎖Ｆｖポリペプチドモノマー、ダイマー、大腸菌産生の一本鎖Ｆｖポリペプチドのモノマーとダイマーを使用した。赤血球の凝集作用を検討するために、ファルコン社製のＵ底の９６ウェルプレートを使用し、上記の抗体サンプルを５０μｌ／ウェル添加した中に、２％赤血球浮遊液をさらに５０μｌ添加、混和し、３７℃で２時間インキュベーション後、４℃で一昼夜保存し、凝集を判定した。また、対照として、ＰＢＳ（−）を５０μｌ／ウェル添加し、抗体サンプルと同様にして凝集試験を行った。抗体の最終濃度は、マウスＩｇＧ、ＭＡＢＬ−２抗体は、０.０１、０.１、１、１０、１００μｇ／ｍｌ、一本鎖Ｆｖは、０.００４、０.０４、０.４、４、４０、８０μｇ／ｍｌで大腸菌産生の一本鎖Ｆｖポリペプチドのダイマーのみさらに１６０μｇ／ｍｌの用量を設定した。その結果は、下記の表２に示す通り、ＭＡＢＬ−２抗体では、０.１μｇ／ｍｌ以上で赤血球凝集が見られたのに対し、一本鎖Ｆｖポリペプチドではモノマー、ダイマー共に赤血球凝集は認められなかった。
【０１５４】
【表２】
Figure 0004261907
【０１５５】
実施例６ ２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む改変抗体ｓｃ(Ｆｖ)2及び種々の長さのペプチドリンカーを有するＭＡＢＬ−２抗体ｓｃＦｖ
６．１ ＭＡＢＬ−２抗体ｓｃ ( Ｆｖ ) 2 発現プラスミドの構築
ＭＡＢＬ−２抗体由来の２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む改変抗体［ｓｃ(Ｆｖ)2］を発現するプラスミドを作製するため、前述ｐＣＨＯＭ２（ＭＡＢＬ−２抗体由来のｓｃＦｖをコードするＤＮＡを含む）を以下に示す通りＰＣＲ法により修飾し、得られたＤＮＡ断片をｐＣＨＯＭ２に導入した。
ＰＣＲに使用するプライマーは、センスプライマーとしてＥＦ１αをコードするＤＮＡにハイブリダイズするＥＦ１プライマー（配列番号：３０）を使用し、アンチセンスプライマーとしてＬ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つリンカー領域をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１９）及びＳａｌＩ制限酵素認識部位を有するＶＬＬＡＳプライマー（配列番号：３１）を使用した。
【０１５６】
ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０μｌの１０×ＰＣＲ Buffer ＃１、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、５ユニットのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（以上東洋紡社製）、１μＭの各プライマー、及び１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ（ｐＣＨＯＭ２）を含有する。ＰＣＲ溶液を９４℃にて３０秒間、５０℃にて３０秒間及び７４℃にて１分間、この順序で加熱した。この温度サイクルを３０回反復した。
【０１５７】
ＰＣＲ生成物をQIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製し、ＳａｌＩで消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ+ベクター（東洋紡社製）にクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをＳａｌＩで消化し、得られたＤＮＡ断片をＳａｌＩで消化したｐＣＨＯＭ２にRapid DNA Ligation Kit（BOEHRINGER MANNHEIM社製）を用いて連結した。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐＣＨＯＭ２(Ｆｖ)2と命名した（図３４を参照）。本プラスミドｐＣＨＯＭ２(Ｆｖ)2に含まれるＭＡＢＬ−２抗体ｓｃ(Ｆｖ)2領域の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：３２に示す。
【０１５８】
６．２ 種々の長さのペプチドリンカーを有するＭＡＢＬ−２抗体ｓｃＦｖ発現プラスミドの作製
種々の長さのペプチドリンカーを有し、そして［Ｈ鎖］−［Ｌ鎖］（以下ＨＬ）、［Ｌ鎖］−［Ｈ鎖］（以下ＬＨ）となるようにＶ領域を連結したｓｃＦｖを、ＭＡＢＬ−２由来のＨ鎖及びＬ鎖ｃＤＮＡを鋳型として以下の通りに作製した。
ＨＬタイプのｓｃＦｖを作製するために、まずｐＣＨＯＭ２(Ｆｖ)2を鋳型としてＣＦＨＬ−Ｆ１（配列番号：３３）及びＣＦＨＬ−Ｒ２（配列番号：３４）プライマー、ＣＦＨＬ−Ｆ２（配列番号：３５）及びＣＦＨＬ−Ｒ１プライマー（配列番号：０３６）によりＫＯＤポリメラーゼにて９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分間の反応を３０回繰り返すＰＣＲ反応を行い、５'側にリーダー配列を含むＨ鎖、及び３'側にＦＬＡＧ配列を含むＬ鎖のｃＤＮＡ遺伝子を作製した。得られたＨ鎖及びＬ鎖ｃＤＮＡを鋳型として混合し、ＫＯＤポリメラーゼにて９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分間の反応を５回繰り返すＰＣＲ反応を行い、ＣＦＨＬ−Ｆ１及びＣＦＨＬ−Ｒ１プライマーを加えてさらに３０サイクル反応することによりリンカーを含まないＨＬ−０タイプのｃＤＮＡを作製した。
【０１５９】
ＬＨタイプのｓｃＦｖを作製するために、まずＭＡＢＬ−２のＬ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡを含むプラスミドｐＧＥＭ−Ｍ２Ｌ及びｐＧＥＭ−Ｍ２Ｈ（特願平１１−６３５５７参照）を鋳型として、それぞれＴ７（配列番号：３７）及びＣＦＬＨ−Ｒ２（配列番号：３８）プライマー、ＣＦＬＨ−Ｆ２（配列番号：３９）及びＣＦＬＨ−Ｒ１（配列番号：４０）プライマーを用いてＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡）にて９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分間の反応を３０回繰り返すＰＣＲ反応を行い、５'側にリーダー配列を含むＬ鎖、及び３'側にＦＬＡＧ配列を含むＨ鎖のｃＤＮＡ遺伝子を作製した。得られたＬ鎖及びＨ鎖ｃＤＮＡを鋳型として混合し、ＫＯＤポリメラーゼにて９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分間の反応を５回繰り返すＰＣＲ反応を行い、Ｔ７及びＣＦＬＨ−Ｒ１プライマーを加えてさらに３０サイクル反応した。この反応産物を鋳型とし、ＣＦＬＨ−Ｆ４（配列番号：４１）及びＣＦＬＨ−Ｒ１プライマーを用いて９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分間の反応を３０回繰り返すＰＣＲ反応を行うことによりリンカーを含まないＬＨ−０タイプのｃＤＮＡを作製した。
【０１６０】
こうして作製したＬＨ−０、ＨＬ−０タイプのｃＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ（宝酒造）処理し、ＸｈｏＩ制限酵素切断部位を含まない哺乳動物発現プラスミドＩＮＰＥＰ４にLigation High（東洋紡）を用いて導入し、Competent E. coli ＪＭ１０９（ニッポンジーン）を形質転換した。形質転換した大腸菌よりQIAGEN Plasmid Maxi Kit（QIAGEN）にてプラスミドを精製した。こうしてプラスミドｐＣＦ２ＬＨ−０及びｐＣＦ２ＨＬ−０を作製した。
【０１６１】
次に、リンカーサイズの異なる発現プラスミドを作製するためにＨＬタイプではｐＣＦ２ＨＬ−０を鋳型としてＣＦＨＬ−Ｘ３（配列番号：４２）、ＣＦＨＬ−Ｘ４（配列番号：４３）、ＣＦＨＬ−Ｘ５（配列番号：４４）、ＣＦＨＬ−Ｘ６（配列番号：４５）、又はＣＦＨＬ−Ｘ７（配列番号：４６）のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとしてベクター配列に相補的なＢＧＨ−１（配列番号：４７）プライマーを用いてＫＯＤポリメラーゼにて９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分間の反応を３０回繰り返すＰＣＲ反応を行い、得られた反応産物を制限酵素ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ（宝酒造）にて処理した。得られた断片をｐＣＦ２ＨＬ−０のＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩサイトにLigation High（東洋紡）を用いて導入し、Competent E. coli ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換した大腸菌よりQIAGEN Plasmid Maxi Kitにてプラスミドを精製した。こうして、発現プラスミドｐＣＦ２ＨＬ−３、ｐＣＦ２ＨＬ−４、ｐＣＦ２ＨＬ−５、ｐＣＦ２ＨＬ−６及びｐＣＦ２ＨＬ−７を作製した。更にＣＯＳ７細胞での一過的発現に用いる発現プラスミドを作製するために、ｐＣＦ２ＨＬ−０、ｐＣＦ２ＨＬ−３、ｐＣＦ２ＨＬ−４、ｐＣＦ２ＨＬ−５、ｐＣＦ２ＨＬ−６及びｐＣＦ２ＨＬ−７を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（宝酒造）にて処理し、約８００ｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動によるゲルからの回収により精製した。得られた断片を哺乳動物細胞発現プラスミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩサイトにLigation Highを用いて導入し、Competent E. coli ＤＨ５α（東洋紡）を形質転換した。形質転換した大腸菌よりQIAGEN Plasmid Maxi Kitにてプラスミドを精製した。こうして、発現プラスミドＣＦ２ＨＬ−０／ｐＣＯＳ１、ＣＦ２ＨＬ−３／ｐＣＯＳ１、ＣＦ２ＨＬ−４／ｐＣＯＳ１、ＣＦ２ＨＬ−５／ｐＣＯＳ１、ＣＦ２ＨＬ−６／ｐＣＯＳ１及びＣＦ２ＨＬ−７／ｐＣＯＳ１を作製した。代表的な例として、プラスミドＣＦ２ＨＬ−０／ｐＣＯＳ１の構造を図３５に示し、これに含まれるＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ−０＞の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：４８に示す。また各プラスミドのリンカー部分の塩基配列及びアミノ酸配列を図３６に示す。
【０１６２】
また、リンカーサイズの異なるＬＨタイプの発現プラスミドを作製するため、ｐＣＦ２ＬＨ−０を鋳型としてＣＦＬＨ−Ｘ３（配列番号：４９）、ＣＦＬＨ−Ｘ４（配列番号：５０）、ＣＦＬＨ−Ｘ５（配列番号：５１）、ＣＦＬＨ−Ｘ６（配列番号：５２）又はＣＦＬＨ−Ｘ７（配列番号：５３）のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとしてベクター配列に相補的なＢＧＨ−１プライマーを用いてＫＯＤポリメラーゼにて９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分間の反応を３０回繰り返すＰＣＲ反応を行い、得られた反応産物を制限酵素ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩにて処理した。得られた断片をｐＣＦ２ＬＨ−０のＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩサイトにLigation Highを用いて導入し、Competent E. coli ＤＨ５α（東洋紡）を形質転換した。形質転換した大腸菌よりQIAGEN Plasmid Maxi Kitにてプラスミドを精製した。こうして、発現プラスミドｐＣＦ２ＬＨ−３、ｐＣＦ２ＬＨ−４、ｐＣＦ２ＬＨ−５、ｐＣＦ２ＬＨ−６及びｐＣＦ２ＬＨ−７を作製した。更にＣＯＳ７細胞での一過的発現に用いる発現プラスミドを作製するために、ｐＣＦ２ＬＨ−０、ｐＣＦ２ＬＨ−３、ｐＣＦ２ＬＨ−４、ｐＣＦ２ＬＨ−５、ｐＣＦ２ＬＨ−６及びｐＣＦ２ＬＨ−７を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（宝酒造）にて処理し、約８００ｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動によるゲルからの回収により精製した。得られた断片を哺乳動物細胞発現プラスミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩサイトにLigation Highを用いて導入し、Competent E. coli ＤＨ５α（東洋紡）を形質転換した。形質転換した大腸菌よりQIAGEN Plasmid Maxi Kitにてプラスミドを精製した。こうして、発現プラスミドＣＦ２ＬＨ−０／ｐＣＯＳ１、ＣＦ２ＬＨ−３／ｐＣＯＳ１、ＣＦ２ＬＨ−４／ｐＣＯＳ１、ＣＦ２ＬＨ−５／ｐＣＯＳ１、ＣＦ２ＬＨ−６／ｐＣＯＳ１及びＣＦ２ＬＨ−７／ｐＣＯＳ１を作製した。代表的な例として、プラスミドＣＦ２ＬＨ−０／ｐＣＯＳ１の構造を図３７に示し、これに含まれるＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＬＨ−０＞の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：５４に示す。また各プラスミドのリンカー部分の塩基配列及びアミノ酸配列を図３８に示す。
【０１６３】
６．３ ＣＯＳ７細胞におけるｓｃＦｖ及びｓｃ ( Ｆｖ ) 2 の発現
（１）有血清培地での培養上清の調製
ＨＬタイプ、ＬＨタイプｓｃＦｖ及びｓｃ(Ｆｖ)2の発現のために、ＣＯＳ７細胞（ＪＣＲＢ９１２７、ヒューマンサイエンス振興財団）での一過的発現を行った。ＣＯＳ７細胞は１０％牛胎児血清（HyClone）を含むＤＭＥＭ培地（GIBCO BRL社製）にて、３７℃の炭酸ガス恒温槽中で経代培養した。
６．２で構築したＣＦ２ＨＬ−０，３〜７／ｐＣＯＳ１、もしくはＣＦ２ＬＨ−０，３〜７／ｐＣＯＳ１又はｐＣＨＯＭ２(Ｆｖ)2ベクターを、Gene Pulser装置（BioRad社製）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ７細胞にトランスフェクションした。
ＤＮＡ（１０μｇ）とＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ，５ｍＭ ＢＥＳ（ＳＩＧＭＡ社））培地中２×１０7細胞／ｍｌの０.２５ｍｌをキュベットに加え、１０分間静置の後に０.１７ｋＶ、９５０μＦの容量にてパルスを与えた。１０分間静置の後、エレクトロポレーションされた細胞をＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地に混合し、７５ｃｍ3フラスコに加えた。７２時間培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、更に０.２２μｍボトルトップフィルター（ＦＡＬＣＯＮ）にて濾過し、これを培養上清（ＣＭ）とした。
【０１６４】
（２）無血清培地での培養上清の調製
上記（１）と同様の方法でトランスフェクションした細胞をＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地に加え７５ｃｍ3フラスコにて一夜培養した後、培養上清を捨て、ＰＢＳにて洗浄後、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ II培地（GIBCO BRL社製）を添加した。７２時間培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、更に０.２２μｍボトルトップフィルターにて濾過し、ＣＭを得た。
【０１６５】
６．４ ＣＯＳ７ ＣＭ中のｓｃＦｖ及びｓｃ ( Ｆｖ ) 2 の検出
前記６．３（２）で調製したＣＯＳ７のＣＭ中における種々のＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ及びｓｃ(Ｆｖ)2のポリペプチドを下記の通りにウェスタンブロッティング法により検出した。
各ＣＯＳ７ ＣＭについてについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＲＥＩＮＦＯＲＣＥＤ ＮＣ膜（Schleicher & Schuell社製）に転写した。５％スキムミルク（森永乳業社製）にてブロッキングを行い、ＴＢＳにて洗浄後、抗ＦＬＡＧ抗体（SIGMA社製）を加えた。室温にてインキュベーション及び洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson Immuno Research社製）を加え、室温にてインキュベーション及び洗浄後、基質溶液を添加し、発色させた（図３９）。
【０１６６】
６．５ フローサイトメトリー
ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ及びｓｃ(Ｆｖ)2のヒトIntegrin Assosiated Protein（ＩＡＰ）抗原への結合を測定するため、前記６．３（１）にて調製したＣＯＳ７細胞培養上清を用いてフローサイトメトリーを行った。ヒトＩＡＰを発現するマウス白血病細胞株Ｌ１２１０細胞２×１０5個に、実施例６．３（１）で得られた培養上清あるいは対照としてＣＯＳ７細胞の培養上清を加え、氷上にてインキュベーション及び洗浄の後、１０μｇ／ｍｌのマウス抗ＦＬＡＧ抗体（SIGMA社製）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（BECTON DICKINSON社製）を加えた。再度インキュベーション及び洗浄の後、ＦＡＣＳｃａｎ装置（BECTON DICKINSON社製）にて蛍光強度を測定した。その結果、各ＣＯＳ７培養上清中の種々の長さのペプチドリンカーを有するＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ及びｓｃ(Ｆｖ)2は、ヒトＩＡＰに対して高い親和性を有することが示された（図４０ａ及びｂ）。
【０１６７】
６．６ in vitro でのアポトーシス誘起効果
前記１．３（１）にて調製したＣＯＳ７細胞培養上清について、ヒトＩＡＰを遺伝子導入したＬ１２１０細胞（ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０）に対するアポトーシス誘導作用をＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ（BOEHRINGER MANNHEIM社製）染色により検討した。
ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞５×１０4個に、各ベクターを形質転換したＣＯＳ７細胞培養上清あるいはコントロールとしてＣＯＳ７細胞培養上清を終濃度１０％で添加し、２４時間培養した。その後、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ／ＰＩ染色を行い、ＦＡＣＳｃａｎ装置（BECTON DICKINSON社製）にて蛍光強度を測定した。その結果、ＣＯＳ７ ＣＭ中のｓｃＦｖ＜ＨＬ３，４，６，７、ＬＨ３，４，６，７＞及びｓｃ(Ｆｖ)2はｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に対して顕著な細胞死を誘導した。得られた結果を図４１にそれぞれ示す。
【０１６８】
６．７ ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ及びｓｃ ( Ｆｖ ) 2 のＣＨＯ細胞用発現ベクターの構築
前記ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ及びｓｃ(Ｆｖ)2を培養上清から精製することを目的として、これらをＣＨＯ細胞にて発現させるための発現ベクターを以下のように構築した。
前記１．２にて調製したｐＣＦ２ＨＬ−０，３〜７及びｐＣＦ２ＬＨ−０，３〜７のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ＣＨＯ細胞用発現ベクターｐＣＨＯ１のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位にLigation Highを用いて導入し、Competent E. coli ＤＨ５αを形質転換した。形質転換した大腸菌よりQIAGEN Plasmid Midi Kit（QIAGEN）にてプラスミドを精製した。このようにして発現プラスミドｐＣＨＯＭ２ＨＬ−０，３〜７及びｐＣＨＯＭ２ＬＨ−０，３〜７を作製した。
【０１６９】
６．８ ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ−０，３〜７＞、ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＬＨ−０，３〜７＞及びｓｃ ( Ｆｖ ) 2 発現ＣＨＯ細胞の作製並びにその培養上清の調製
前記１．７にて構築した発現プラスミドｐＣＨＯＭ２ＨＬ−０，３〜７及びｐＣＨＯＭ２ＬＨ−０，３〜７並びにｐＣＨＯＭ２(Ｆｖ)2ベクターを以下の通りにＣＨＯ細胞に形質転換し、各改変抗体を恒常的に発現するＣＨＯ細胞を作製した。その代表的な例としてＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞、ｓｃ(Ｆｖ)2を恒常的に発現するＣＨＯ細胞の作製を下記に示す。
発現プラスミドｐＣＨＯＭ２ＨＬ−５及びｐＣＨＯＭ２(Ｆｖ)2を制限酵素ＰｖｕＩにて消化して直鎖状にし、これらをGene Pulser装置（BioRad社製）を用いてエレクトロポ
レーションによりＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。ＤＮＡ（１０μｇ）と、ＰＢＳ中１×１０7細胞／ｍｌの０.７５ｍｌをキュベットに加え、１.５ｋＶ、２５μＦの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のウシ胎児血清を含有する核酸含有α−ＭＥＭ培地（GIBCO BRL社製）に加え培養した。一夜培養後、培養上清を除去し、ＰＢＳにてリンスした後、１０％のウシ胎児血清を含有する核酸不含α−ＭＥＭ培地（GIBCO BRL社製）を加え培養した。約２週間培養後、methotrexate（SIGMA社製）を終濃度１０ｎＭで含有する培地で更に培養し、その後５０ｎＭ、そして１００ｎＭと濃度を順次上げて培養を続けた。こうして得られた細胞をローラーボトル中で無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ II（GIBCO BRL社製）にて培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、更に０.２０μｍフィルターにて濾過し、それぞれのＣＭを得た。
同様にして、ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ−０，３，４，６，７＞及び＜ＬＨ−０，３，４，５，６，７＞を恒常的に発現するＣＨＯ細胞及びそれらのＣＭを得た。
【０１７０】
６．９ ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞のダイマー及びｓｃ ( Ｆｖ ) 2 の精製
下記の２種類の精製法により前記６．８で得られたＣＭからＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞及びｓｃ(Ｆｖ)2の精製を行った。
＜精製法１＞ ＨＬ−５及びｓｃ(Ｆｖ)2を、そのポリペプチドのＣ末端のＦｌａｇ配列を利用した抗Ｆｌａｇ抗体アフィニティカラムクロマトグラフィー及びゲル濾過を用いて精製した。１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、ｐＨ７.５（ＴＢＳ）で平衡化した抗Flag M2 Affinity gel（SIGMA）で作成したカラム（７.９ｍｌ）に前記６．８で得られたＣＭ（１Ｌ）を添加し、ＴＢＳでカラムを洗浄後、０.１Ｍグリシン塩酸緩衝液、ｐＨ３.５でｓｃＦｖをカラムから溶出させた。得られた画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析し、ｓｃＦｖの溶出を確認した。ｓｃＦｖ画分を終濃度が０.０１％となるようにＴｗｅｅｎ２０を加え、Centricon-10（MILLIPORE）で濃縮した。濃縮液を１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０.０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ 酢酸緩衝液、ｐＨ６.０で平衡化したＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷカラム（７.５×６００ｍｍ）にかけた。流速０.４ｍｌ／ｍｉｎでｓｃＦｖは２８０ｎｍの吸収で検出した。ＨＬ−５は主要ピークとしてダイマーの位置に、ｓｃ(Ｆｖ)2はモノマーの位置にそれぞれ溶出された。
【０１７１】
＜精製法２＞ ＨＬ−５及びｓｃ(Ｆｖ)2をイオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイト及びゲル濾過の三工程で精製した。イオン交換クロマトグラフィーでは、ＨＬ―５ではQ Sepharose fast flowカラム（ファルマシア）をｓｃ(Ｆｖ)2ではSP-sepharose fast flowカラムを用い、第二工程以降はＨＬ−５とｓｃ(Ｆｖ)2で同じ条件を用いた。
【０１７２】
（第一工程）ＨＬ−５
ＨＬ−５のＣＭは、０.０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、ｐＨ９.０で２倍希釈した後に、１Ｍ ＴｒｉｓでｐＨを９.０に調整した。この後、０.０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、ｐＨ８.５で平衡化したQ Sepharose fast flowカラムにかけ、同緩衝液中０.１Ｍから０.５５ＭまでのＮａＣｌの直線濃度勾配でカラムに吸着したポリペプチドを溶出した。得られた画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析し、ＨＬ−５を含む画分を集め、第二工程のハイドロキシアパタイトにかけた。
【０１７３】
（第一工程）ｓｃ(Ｆｖ)2
ｓｃ(Ｆｖ)2のＣＭは、０.０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ 酢酸緩衝液、ｐＨ５.５で２倍希釈した後に、１Ｍ酢酸でｐＨを５.５に調整した。０.０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ 酢酸緩衝液、ｐＨ５.５で平衡化したSP-Sepahrose fast flowカラムにかけ、同緩衝液中、ＮａＣｌ濃度を０から０.５Ｍまで直線的に上げ、カラムに吸着したポリペプチドを溶出した。得られた画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析し、ｓｃ(Ｆｖ)2を含む画分を集め、第二工程のハイドロキシアパタイトにかけた。
【０１７４】
（第二工程）ＨＬ−５及びｓｃ(Ｆｖ)2のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
第一工程で得られたＨＬ−５画分及びｓｃ(Ｆｖ)2画分をそれぞれ０.０２％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７.０で平衡化したハイドロキシアパタイトカラム（BioRad、タイプＩ）に添加し、同緩衝液でカラムを洗浄後、リン酸緩衝液濃度を０.５Ｍまで直線的に上げ、カラムに吸着したポリペプチドを溶出した。各画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析し、所望のポリペプチドが含まれる画分を集めた。
【０１７５】
（第三工程）ＨＬ−５及びｓｃ(Ｆｖ)2のゲル濾過
第二工程で得られた各画分をそれぞれCentriprep-10（MILLIPORE）で濃縮し、０.０２％Ｔｗｅｅｎ２０及び０.１５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ 酢酸緩衝液、ｐＨ６.０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（２.６×６０ｃｍ、ファルマシア）にかけた。ＨＬ−５はダイマーに位置に、ｓｃ(Ｆｖ)ＨＬ−５及びｓｃ(Ｆｖ)2はモノマーの位置にそれぞれ主要ピークとして溶出された。
いずれの精製法においても、ＨＬ−５モノマーは殆ど検出されなかったことから、一本鎖Ｆｖのリンカーのアミノ酸残基数が５個程度であれば、効率的に一本鎖Ｆｖのダイマーが形成できることが判明した。ＨＬ−５ダイマーおよびｓｃ(Ｆｖ)2はいずれも精製された後も４℃で１ヶ月間安定的に維持された。
【０１７６】
６．１０ 精製ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞のダイマー及びｓｃ ( Ｆｖ ) 2 の抗原結合活性評価
精製されたＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー及びｓｃ(Ｆｖ)2のヒトIntegrin Assosiated Protein（ＩＡＰ）抗原への結合を測定するため、フローサイトメトリーを行った。ヒトＩＡＰを発現するマウス白血病細胞株Ｌ１２１０細胞（ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０）又は対照としてｐＣＯＳ１ベクターをトランスフェクションしたＬ１２１０細胞（ｐＣＯＳ１／Ｌ１２１０）２×１０5個に、１０μｇ／ｍｌの精製ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー、ＭＡＢＬ２−ｓｃ(Ｆｖ)2、陽性対照としてモノクローナル抗体ＭＡＢＬ−２、陰性対照としてマウスＩｇＧ（Zymed社製）を加え、氷上にてインキュベーション及び洗浄の後、１０μｇ／ｍｌのマウス抗ＦＬＡＧ抗体（SIGMA社製）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（BECTON DICKINSON社製）を加えた。再度インキュベーション及び洗浄の後、ＦＡＣＳｃａｎ装置（BECTON DICKINSON社製）にて蛍光強度を測定した。
その結果、精製ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー及びＭＡＢＬ２−ｓｃ(Ｆｖ)2はｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に特異的に結合したことにより、ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー及びｓｃ(Ｆｖ)2がヒトＩＡＰに対して高い親和性を有することが示された（図４２）。
【０１７７】
６．１１ 精製ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞のダイマー及びｓｃ ( Ｆｖ ) 2 の in vitro アポトーシス誘起効果
精製したＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー及びｓｃ(Ｆｖ)2について、ヒトＩＡＰを遺伝子導入したＬ１２１０細胞（ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０）及びヒト白血病細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭに対するアポトーシス誘導作用をＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ（BOEHRINGER MANNHEIM社製）染色により検討した。
ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞５×１０4個あるいはＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞１×１０5個に、精製ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー、ＭＡＢＬ２−ｓｃ(Ｆｖ)2、陽性対照としてモノクローナル抗体ＭＡＢＬ−２、陰性対照としてマウスＩｇＧを様々な濃度で添加し、２４時間培養した。その後、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色を行い、ＦＡＣＳｃａｎ装置（BECTON DICKINSON社製）にて蛍光強度を測定した。その結果、ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー及びＭＡＢＬ２−ｓｃ(Ｆｖ)2はｈＩＡＰ／Ｌ１２１０、ＣＣＲＦ−ＣＥＭの両細胞に対して濃度依存的に細胞死を誘導した（図４３）。この結果、ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー及びＭＡＢＬ２−ｓｃ(Ｆｖ)2は、もとのモノクローナル抗体ＭＡＢＬ−２と比較して改善されたアポトーシス誘導作用を有することが示された。
【０１７８】
６．１２ 精製ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞のダイマー及びｓｃ ( Ｆｖ ) 2 の赤血球凝集試験
実施例５．１５に従って、種々の濃度の精製したｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞のダイマー及びｓｃ(Ｆｖ)2の血液凝集試験を実施した。
モノクローナル抗体ＭＡＢＬ−２（陽性対照）では血液凝集が起こるのに対して、一本鎖抗体のＭＡＢＬ２−ｓｃ(Ｆｖ)2及びＭＡＢＬ２−ｓｃ(Ｆｖ)＜ＨＬ５＞は凝集しなかった。また、ＭＡＢＬ−２抗体を用いた緩衝液の差もほとんどみられなかった。その結果を下記の表３に示す。
【０１７９】
【表３】
Figure 0004261907
【０１８０】
６．１３ 精製ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞のダイマー及びｓｃ ( Ｆｖ ) 2 のヒト骨髄腫マウスモデルに対する抗腫瘍効果
実施例６．８及び６．９にて作製、精製したｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞のダイマー及びｓｃ(Ｆｖ)2について、その抗腫瘍効果を試験した。具体的には実施例５．１４（３）で作製したヒト骨髄腫マウスモデルを用いて、マウス血清中における、ヒト骨髄腫細胞が産生するＭタンパク質をＥＬＩＳＡにより定量し、併せてマウスの生存日数を記録した。そして、血清中のＭタンパク質量の変化および生存日数により、ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞のダイマー及びｓｃ(Ｆｖ)2の抗腫瘍効果を評価した。
なお、本試験においてＨＬ−５及びｓｃ(Ｆｖ)2は、ｖｅｈｉｃｌｅ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０.０２％Ｔｗｅｅｎ及び２０ｍＭ 酢酸緩衝液，ｐＨ６.０）中の０.０１、０.１又は１ｍｇ／ｍｌの溶液として、投与量が０.１、１または１０ｍｇ／ｋｇになるようにマウスに投与した。また、対照はｖｅｈｉｃｌｅのみを投与した。
ヒト骨髄腫細胞移植後２６日目に血清を採取し、血清中のＭタンパク質量をＥＬＩＳＡにより実施例５．１４に従って測定した。その結果、ＨＬ−５投与群及びダイマー及びｓｃ(Ｆｖ)2投与群共に、血清中のＭタンパク質量が投与量依存的に減少していた（図４４を参照）。また、その生存期間については、ＨＬ−５投与群（図４５）及びｓｃ(Ｆｖ)2投与群（図４６）共に対照（ｖｅｈｉｃｌｅ投与群）と比較して有意な生存期間の延長が観察された。これらの結果は、本発明のＨＬ−５及びｓｃ(Ｆｖ)2がインビボにおいても優れた抗腫瘍作用を有することを示している。
【０１８１】
実施例７ ヒトＭＰＬに対するヒト抗体１２Ｂ５のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖ
ヒトＭＰＬに対するヒトモノクローナル抗体１２Ｂ５のＶ領域をコードするＤＮＡを次のようにして構築した。
７．１ １２Ｂ５Ｈ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の構築
ヒトＭＰＬに結合するヒト抗体１２Ｂ５Ｈ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子は、該遺伝子の塩基配列（配列番号５５）を用いて、その５'末端にヒト抗体遺伝子由来のリーダー配列（配列番号５６）（Eur. J. Immunol. 1996; 26: 63-69）を連結させることで設計した。設計した塩基配列はそれぞれ１５ｂｐのオーバーラップ配列を持つように４本のオリゴヌクレオチド（１２Ｂ５ＶＨ−１、１２Ｂ５ＶＨ−２、１２Ｂ５ＶＨ−３、１２Ｂ５ＶＨ−４）に分割し、１２Ｂ５ＶＨ−１（配列番号５７）及び１２Ｂ５ＶＨ−３（配列番号：５９）はセンス方向で、１２Ｂ５ＶＨ−２（配列番号：５８）及び１２Ｂ５ＶＨ−４（配列番号：６０）はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。各合成オリゴヌクレオチドはそれぞれの相補性によりアッセンブリさせた後、外側プライマー（１２Ｂ５ＶＨ−Ｓ及び１２Ｂ５ＶＨ−Ａ）を加え、全長の遺伝子を増幅した。なお、１２Ｂ５ＶＨ−Ｓ（配列番号：６１）は前方プライマーでリーダー配列の５'末端にハイブリダイズし、且つＨｉｎｄ III制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、また１２Ｂ５ＶＨ−Ａ（配列番号：６２）は後方プライマーでＨ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードする塩基配列にハイブリダイズし、且つスプライスドナー配列ならびにＢａｍＨＩ制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
【０１８２】
ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０μｌの１０×ＰＣＲ Gold Buffer II、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.０８ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼAmpliTaq Gold（以上PERKIN ELMER社製）、２.５ピコモル［p mole］ずつの合成オリゴヌクレオチド１２Ｂ５ＶＨ−１〜４を含有し、９４℃の初期温度にて９分間そして次に９４℃にて２分間、５５℃にて２分間及び７２℃にて２分間のサイクルを２回反復した後、１００ｐｍｏｌｅずつの外側プライマー１２Ｂ５ＶＨ−Ｓ及び１２Ｂ５ＶＨ−Ａを加え、さらに９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間及び７２℃にて１分間のサイクルを３５回反復した後、反応混合物を更に７２℃で５分間加熱した。
ＰＣＲ生成物は１.５％低融点アガロースゲル（Sigma社製）を用い精製した後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ IIIで消化し、ヒトＨ鎖発現ベクターＨＥＦ−ｇγ１にクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−１２Ｂ５Ｈ−ｇγ１と命名した。
【０１８３】
さらに、ＨＥＦ−１２Ｂ５Ｈ−ｇγ１を制限酵素ＥｃｏＲＩならびにＢａｍＨＩで消化し、１２Ｂ５ＶＨをコードする遺伝子を調製した後、ヒトＦａｂＨ鎖発現ベクターｐＣＯＳ−Ｆｄに挿入しｐＦｄ−１２Ｂ５Ｈを得た。なお、ヒトＦａｂＨ鎖発現ベクターはヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域と定常領域をコードする遺伝子間に存在するイントロン領域ならびにヒトＨ鎖定常領域の一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号６３）をＰＣＲ法を用い増幅した後、動物細胞発現ベクターｐＣＯＳ１に挿入することで構築したベクターである。ヒトＨ鎖定常領域はＨＥＦ−ｇγ１を鋳型とし、上記と同様の条件下にて遺伝子の増幅を行い、前方プライマーとしてイントロン１の５'端の配列とハイブリダイズし、且つＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素認識配列を有するように設計したＧ１ＣＨ１−Ｓ(配列番号６４)を、後方プライマーとしてヒトＨ鎖定常領域ＣＨ１ドメインの３'端のＤＮＡにハイブリダイズし、且つヒンジ領域の一部をコードする配列、二個の停止コドンおよびＢｇｌ II制限酵素認識部位を有するように設計したＧ１ＣＨ１−Ａ(配列番号６５)を用いた。
プラスミドＨＥＦ−１２Ｂ５Ｈ−ｇγ１及びｐＦｄ−１２Ｂ５Ｈに含まれる再構成１２Ｂ５Ｈ鎖可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：６６に示す。
【０１８４】
７．２ １２Ｂ５Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の構築
ヒトＭＰＬに結合するヒト抗体１２Ｂ５Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子は、該遺伝子の塩基配列（配列番号６７）を用い、その５'末端にヒト抗体遺伝子３Ｄ６（Nuc. Acid Res. 1990: 18; 4927）由来のリーダー配列（配列番号６８）を連結させることで設計した。設計した塩基配列は上記と同様にそれぞれ１５ｂｐのオーバーラップ配列を持つように４本のオリゴヌクレオチド（１２Ｂ５ＶＬ−１、１２Ｂ５ＶＬ−２、１２Ｂ５ＶＬ−３、１２Ｂ５ＶＬ−４）に分割し、それぞれ合成した。１２Ｂ５ＶＬ−１（配列番号：６９）及び１２Ｂ５ＶＬ−３（配列番号：７１）はセンス配列、１２Ｂ５ＶＬ−２（配列番号：７０）及び１２Ｂ５ＶＬ−４（配列番号：７２）はアンチセンス配列を有し、各合成オリゴヌクレオチドはそれぞれの相補性によりアッセンブリさせた後、外側プライマー（１２Ｂ５ＶＬ−Ｓ及び１２Ｂ５ＶＬ−Ａ）を加え、全長の遺伝子を増幅した。なお、１２Ｂ５ＶＬ−Ｓ（配列番号：７３）は前方プライマーでリーダー配列の５'末端にハイブリダイズし、且つＨｉｎｄ III制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、また１２Ｂ５ＶＬ−Ａ（配列番号：７４）は後方プライマーでＬ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードする塩基配列にハイブリダイズし、且つスプライスドナー配列ならびにＢａｍＨＩ制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
【０１８５】
ＰＣＲ反応は上記と同様に行い、ＰＣＲ生成物は１.５％低融点アガロースゲル（Sigma社製）を用い精製した後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ IIIで消化し、ヒトＬ鎖発現ベクターＨＥＦ−ｇκにクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−１２Ｂ５Ｌ−ｇκと命名した。本プラスミドＨＥＦ−１２Ｂ５Ｌ−ｇκに含まれる再構成１２Ｂ５Ｌ鎖Ｖ領域の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：７５に示す。
【０１８６】
７．３ 再構成１２Ｂ５一本鎖Ｆｖ ( ｓｃＦｖ ) の作製
再構成１２Ｂ５抗体一本鎖Ｆｖは１２Ｂ５ＶＨ−リンカー−１２Ｂ５ＶＬの順とし、そのＣ末端には検出及び精製を容易にするためにＦＬＡＧ配列（配列番号：７６）を付加することで設計した。さらに、リンカー配列は(Ｇｌｙ4Ｓｅｒ)3の１５アミノ酸からなるリンカー配列を用い、再構成１２Ｂ５一本鎖Ｆｖ（ｓｃ１２Ｂ５）を構築した。
（１）１５アミノ酸からなるリンカー配列を用いた再構成１２Ｂ５一本鎖Ｆｖの作製
１５アミノ酸からなるリンカーを用いた再構成１２Ｂ５抗体一本鎖Ｆｖをコードする遺伝子は１２Ｂ５Ｈ鎖Ｖ領域、リンカー領域、及び１２Ｂ５Ｌ鎖Ｖ領域をそれぞれＰＣＲ法を用いて増幅し、連結することにより構築した。この方法を図４７に模式的に示す。再構成１２Ｂ５一本鎖Ｆｖの作製のために６個のＰＣＲプライマー（Ａ〜Ｆ）を使用した。プライマーＡ、Ｃ及びＥはセンス配列を有し、プライマーＢ、Ｄ及びＦはアンチセンス配列を有する。
Ｈ鎖Ｖ領域のための前方プライマー１２Ｂ５−Ｓ（プライマーＡ、配列番号：７７）は、Ｈ鎖リーダー配列の５'末端にハイブリダイズし且つＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を有するように設計した。Ｈ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＨｕＶＨＪ３（プライマーＢ、配列番号：７８）は、Ｈ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズするように設計した。
【０１８７】
リンカーのための前方プライマーＲＨｕＪＨ３（プライマーＣ、配列番号：７９）は、リンカーのＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＨ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡとオーバーラップするように設計した。リンカーのための後方プライマーＲＨｕＶＫ１（プライマーＤ、配列番号：８０）は、リンカーのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＬ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡとオーバーラップするように設計した。
Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＨｕＶＫ１.２（プライマーＥ、配列番号：８１）はＬ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズするように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマー１２Ｂ５Ｆ−Ａ（プライマーＦ、配列番号：８２）は、Ｌ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＦＬＡＧペプチドをコードする配列（Hopp, T. P.ら、Bio/Technology，6，1204-1210, 1988）、２個の転写停止コドン及びＮｏｔＩ制限酵素認識部位を有するように設計した。
【０１８８】
第一ＰＣＲ段階において３つの反応Ａ−Ｂ、Ｃ−Ｄ及びＥ−Ｆを行い、そして第一ＰＣＲから得られた３つのＰＣＲ生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブリさせた。次に、プライマーＡ及びＦを加えて、１５アミノ酸からなるリンカーを用いた再構成１２Ｂ５一本鎖Ｆｖをコードする全長ＤＮＡを増幅した（第二ＰＣＲ）。なお、第一ＰＣＲにおいては、再構成１２Ｂ５Ｈ鎖Ｖ領域をコードするプラスミドＨＥＦ−１２Ｂ５Ｈ−ｇγ１（実施例７．１を参照）、Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒからなるリンカー領域をコードするＤＮＡ配列（配列番号：８３）（Huston, J. S.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883, 1988）を含んで成るプラスミドｐＳＣＦＶＴ７−ｈＭ２１（ヒト型化ＯＮＳ−Ｍ２１抗体）（Ohtomo, T.ら、Anticancer Res. 18 (1998), 4311-4316）、及び再構成１２Ｂ５Ｌ鎖Ｖ領域をコードするプラスミドＨＥＦ−１２Ｂ５Ｌ−ｇκ（実施例７．２を参照）をそれぞれ鋳型として用いた。
【０１８９】
第一ＰＣＲ段階の溶液５０μｌは、５μｌの１０×ＰＣＲ Gold Buffer II、１.５ｍＭ
ＭｇＣｌ2、０.０８ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼAmpliTaq Gold（以上PERKIN ELMER社製）、１００ｐｍｏｌｅずつの各プライマー及び１００ｎｇの各鋳型ＤＮＡを含有し、９４℃の初期温度にて９分間そして次に９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間及び７２℃にて１分間のサイクルを３５回反復した後、反応混合物を更に７２℃で５分間加熱した。
ＰＣＲ生成物Ａ−Ｂ、Ｃ−Ｄ、及びＥ−Ｆは第二ＰＣＲでアッセンブリした。第二ＰＣＲにおいて、鋳型として１μｌの第一ＰＣＲ反応物Ａ−Ｂ、０.５μｌのＰＣＲ反応物Ｃ−Ｄ及び１μｌのＰＣＲ反応物Ｅ−Ｆ、１０μｌの１０×ＰＣＲ Gold Buffer II、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.０８ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼAmpliTaq
Gold（以上PERKIN ELMER 社製）を含有する９８μｌのＰＣＲ混合液を、９４℃の初期温度にて９分間そして次に９４℃にて２分間、６５℃にて２分間及び７２℃にて２分間のサイクルを２回反復した後、それぞれ１００ｐｍｏｌｅずつのプライマーＡ及びＦを加えた。そして９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間及び７２℃にて１分間のサイクルを３５回反復した後、反応混合物を７２℃にて５分間加熱した。
【０１９０】
第二ＰＣＲにより生じたＤＮＡ断片を１.５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＣＨＯ１ベクターおよびｐＣＯＳ１ベクター（特願平８−２５５１９６）にクローニングした。なお、本発現ベクターｐＣＨＯ１は、ＤＨＦＲ−ΔＥ−ｒｖＨ−ＰＭ１−ｆ（ＷＯ９２／１９７５９参照）から、ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩ消化により抗体遺伝子を削除し、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ Ａｄａｐｔｏｒ（宝酒造社製）を連結することにより構築したベクターである。ＤＮＡ配列決定の後、再構成１２Ｂ５一本鎖Ｆｖの正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐＣＨＯ−ｓｃ１２Ｂ５及びｐＣＯＳ−ｓｃ１２Ｂ５と命名した。本プラスミドｐＣＨＯ−ｓｃ１２Ｂ５及びｐＣＯＳ−ｓｃ１２Ｂ５に含まれる再構成１２Ｂ５一本鎖Ｆｖの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：８４に示す。
【０１９１】
７．４ 動物細胞を用いた各１２Ｂ５抗体（ＩｇＧ、Ｆａｂ）及び一本鎖Ｆｖポリペプチドの発現
１２Ｂ５抗体（ＩｇＧ、Ｆａｂ）及び１２Ｂ５抗体由来の一本鎖Ｆｖ（ポリペプチド）はＣＯＳ−７細胞又はＣＨＯ細胞を用い発現させた。
ＣＯＳ−７細胞を用いた一過的な発現は次のようにして行った。すなわち、Gene Pulser装置（BioRad社製）を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。１２Ｂ５抗体（ＩｇＧ）の発現には前述の発現ベクターＨＥＦ−１２Ｂ５Ｈ−ｇγ１及びＨＥＦ−１２Ｂ５Ｌ−ｇκ各１０μｇずつを、１２Ｂ５Ｆａｂ断片の発現にはｐＦｄ−１２Ｂ５ＨとＨＥＦ−１２Ｂ５Ｌ−ｇκ各１０μｇずつを、一本鎖Ｆｖの発現にはｐＣＯＳ−ｓｃ１２Ｂ５（１０μｇ）をＰＢＳに懸濁したＣＯＳ−７細胞（１×１０7細胞／ｍｌ）０.８ｍｌに混合し、キュベットに加え、１.５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地（GIBCO BRL社製）に加え培養した。終夜培養後、細胞をＰＢＳで一回洗浄し、さらに無血清培地ＣＨＯ-Ｓ-ＳＦＭ II培地を加え、さらに２日間培養した。培養上清を遠心し細胞破砕物を除去した後、０.２２μｍのフィルターを通すことで調製した。
【０１９２】
また、１２Ｂ５抗体由来の一本鎖Ｆｖ（ポリペプチド）の恒常的発現ＣＨＯ細胞株を樹立するため、ｐＣＨＯ−ｓｃ１２Ｂ５発現ベクターを下記のようにＣＨＯ細胞に遺伝子導入した。
【０１９３】
すなわち、Gene Pulser装置（BioRad 社製）を用いたエレクトロポレーション法により発現ベクターをＣＨＯ細胞に導入した。制限酵素ＰｖｕＩで消化し直鎖状にしたＤＮＡ（１００μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＨＯ細胞（１×１０7細胞／ｍｌ）の０.８ｍｌを混合したものをキュベットに加え氷中で１０分間静置した後、１.５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のウシ胎児血清を含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ II（GIBCO BRL社製）に加え培養した。培養２日後に５ｎＭ メトトレキサート（SIGMA社製）ならびに１０％ウシ胎児血清を含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ II（GIBCO BRL社製）にて培養した。得られたクローンについて発現量の高いクローンを１２Ｂ５一本鎖Ｆｖの産生細胞株として選択した。５ｎＭメトトレキサート（SIGMA社製）を含む無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ II（GIBCO BRL 社製）にて培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去して培養上清を得た。
【０１９４】
７．５ ＣＨＯ細胞産生の１２Ｂ５由来の一本鎖Ｆｖの精製
７．４で得られた１２Ｂ５一本鎖Ｆｖ発現ＣＨＯ産生株の培養上清からの精製は、抗ＦＬＡＧ抗体カラム及びゲル濾過カラムにより行った。
（１）抗ＦＬＡＧ抗体カラム
培養上清は、ＰＢＳで平衡化した抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲル（SIGMA社製）に添加した。同緩衝液でカラムを洗浄後、緩衝液を０.１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３.５）でカラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出画分は、溶出後直ちに１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）を加えて中和した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで溶出画分を分析し、一本鎖Ｆｖが確認された画分をCentricon-10（MILLIPORE社製）を用いて濃縮した。
【０１９５】
（２）ゲル濾過
（１）の濃縮液は、０.０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（１０×３００ｍｍ、AMERSHAM PHARMACIA社製）に添加した。
ｓｃ１２Ｂ５は２つのピーク（Ａ、Ｂ）に分かれて溶出した（図４８を参照）。画分Ａ、Ｂを１４％−ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて分析した。サンプルを還元剤添加、非添加で処理し、Ｌａｅｍｍｌｉの方法に準じて電気泳動を行い、泳動後蛋白質をクマシーブリリアントブルー染色した。図４９に示すように、画分Ａ、Ｂいずれも還元剤の添加の有無に関わらず、見かけ上の分子量約３１ｋＤに単一バンドを与えた。画分Ａ及びＢをＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＰＣ ３.２／３０（３.２×３００ｍｍ、AMERSHAM PHARMACIA社製）を用いたゲル濾過により分析した結果、画分Ａでは見かけ上の分子量約４４ｋＤ、画分Ｂでは同２２ｋＤに溶出された（図５０ａ及びｂを参照）。以上の結果から、画分Ａはｓｃ１２Ｂ５一本鎖Ｆｖの非共有結合性ダイマーで、Ｂはモノマーである。
【０１９６】
７．６ 各種一本鎖ＦｖのＴＰＯ様アゴニスト活性の測定
ヒトＴＰＯ受容体（ＭＰＬ）を発現するＢａ／Ｆ３細胞（BaF/mpl）に対する増殖活性を測定することによって、抗ＭＰＬ一本鎖抗体のＴＰＯ様活性を評価した。ＢａＦ／Ｍｐｌ細胞を、１％ウシ胎児血清（GIBCO社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（GIBCO社製）で２回洗浄したのち、５×１０5細胞／ｍｌの細胞密度になるように培地に懸濁した。抗ＭＰＬ一本鎖抗体またはヒトＴＰＯ（R&D Systems社製）を培地で適当に希釈し、細胞懸濁液５０μｌに抗体またはヒトＴＰＯ希釈液５０μｌを加えて９６穴マイクロウェル平底プレート（Falcon社製）に分注し、ＣＯ2インキュベーター（ＣＯ2濃度：５％）で２４時間培養した。培養後、ＷＳＴ−８試薬（生細胞数測定試薬ＳＦ：ナカライテスク社製）を１０μｌ加え、直後に蛍光吸光光度計SPECTRA Fluor（TECAN社製）を用いて測定波長４５０ｎｍ、対照波長６２０ｎｍの吸光度を測定した。ＣＯ2インキュベーター（ＣＯ2濃度：５％）で２時間インキュベートした後、SPECTRA Fluorを用いて再度測定波長４５０ｎｍ、対照波長６２０ｎｍの吸光度を測定した。ＷＳＴ−８試薬は生細胞数に応じて波長４５０ｎｍの発色反応を呈することから、２時間の吸光度変化を指標にＢａＦ／Ｍｐｌ増殖活性を次のように算出したＥＤ５０値により評価した。先ず、縦軸を吸光度、横軸を抗体濃度とし、その増殖反応曲線がプラトーに達した吸光度を反応率１００％とした。反応率５０％付近の数値に基づく直線近似により近似式を得て、これから反応率５０％となる抗体濃度を算出し、これをＥＤ５０値とした。
【０１９７】
各種１２Ｂ５抗体分子を発現させたＣＯＳ−７細胞の培養上清を用い、ＭＰＬに対するアゴニスト活性を測定した結果、図５１に示すように抗原結合部位が二価である１２Ｂ５ ＩｇＧでは濃度依存的に吸光度の上昇が認められＴＰＯ様のアゴニスト活性を示したのに対し（ＥＤ５０；２９ｎＭ）、抗原結合部位が一価である１２Ｂ５Ｆａｂのアゴニスト活性は非常に弱いものであった（ＥＤ５０；３４,７２４ｎＭ）。それに対し、Ｆａｂと同様に抗原結合部位が一価である一本鎖Ｆｖ（ｓｃ１２Ｂ５）においてはＥＤ５０値が７５ｎＭと強いアゴニスト活性が認められた。しかしながら、一本鎖ＦｖではＨ鎖、Ｌ鎖各可変領域は非共有結合で介合しているために、溶液中で各可変領域が解離し他の分子の可変領域と介合し二量体等の多量体を形成することが知られている。そこで、ゲル濾過を用い精製ｓｃ１２Ｂ５の分子量を測定した結果、確かに単量体（モノマー）と二量体（ダイマー）と考えられる分子が認められた（図４８を参照）。続いて、モノマーとダイマーのｓｃ１２Ｂ５をそれぞれ単離し（図５０を参照）、それらのＭＰＬに対するアゴニスト活性を測定した結果、図５１及び５２に示すようにｓｃ１２Ｂ５モノマーではＥＤ５０値が４４３８.７ｎＭとＣＯＳ−７細胞の培養上清を用いた結果に比べ、アゴニスト活性の減弱が確認された。それに対し、二価の抗原結合部位を持つ一本鎖Ｆｖ（ｓｃ１２Ｂ５ダイマー）では一価のｓｃ１２Ｂ５に対し約４００倍強いアゴニスト活性を示した（ＥＤ５０；１０.１ｎＭ）。さらに、二価の一本鎖ＦｖではヒトＴＰＯならびに１２Ｂ５ＩｇＧのアゴニスト活性と同等もしくはそれ以上のアゴニスト活性を示した。
【０１９８】
実施例８ （ヒトＭＰＬに対するヒト抗体１２Ｅ１０可変領域をコードする遺伝子の構築）
ヒトＭＰＬに対するヒトモノクローナル抗体１２Ｅ１０の可変領域をコードするＤＮＡを次のようにして構築した。
８．１ １２Ｅ１０Ｈ鎖可変領域をコードする遺伝子の構築
ヒトＭＰＬに結合するヒト抗体１２Ｅ１０Ｈ鎖可変領域をコードする遺伝子はＷＯ９９／１０４９４に記載のアミノ酸配列（配列番号８５）を基に配列番号８６に示す塩基配列を設計した。さらに、その５'端にヒト抗体遺伝子由来のリーダー配列（配列番号８７）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ０６２２５２）を連結させることで全長の塩基配列を設計した。設計した塩基配列はそれぞれ１５ｂｐのオーバーラップ配列を持つように４本のオリゴヌクレオチド（１２Ｅ１０ＶＨ１、１２Ｅ１０ＶＨ２、１２Ｅ１０ＶＨ３、１２Ｅ１０ＶＨ４）に分割し、１２Ｅ１０ＶＨ１（配列番号：８８）及び１２Ｅ１０ＶＨ３（配列番号：９０）はセンス方向で、１２Ｅ１０ＶＨ２（配列番号：８９）及び１２Ｅ１０ＶＨ４（配列番号：９１）はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。各合成オリゴヌクレオチドはそれぞれの相補性によりアッセンブリさせた後、外側プライマー（１２Ｅ１０ＶＨＳ及び１２Ｅ１０ＶＨＡ）を加え、全長の遺伝子を増幅した。なお、１２Ｅ１０ＶＨＳ（配列番号：９２）は前方プライマーでリーダー配列の５'端にハイブリダイズし、且つＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、また１２Ｅ１０ＶＨＡ（配列番号：９３）は後方プライマーでＨ鎖可変領域のＣ末端をコードする塩基配列にハイブリダイズし、且つスプライスドナー配列ならびにＢａｍＨＩ制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
【０１９９】
ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０μｌの１０×ＰＣＲ Ｇｏｌｄ ＢｕｆｆｅｒＩＩ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.０８ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（以上PERKIN ELMER 社製）、２．５ピコモルずつの合成オリゴヌクレオチド１２Ｅ１０ＶＨ−１〜４を含有し、９４℃の初期温度にて９分間そして次に９４℃にて２分間、５５℃にて２分間及び７２℃にて２分間のサイクルを２回反復した後、１００ｐｍｏｌｅずつの外側プライマー１２Ｅ１０ＶＨＳ及び１２Ｅ１０ＶＨＡを加え、さらに９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間及び７２℃にて１分間のサイクルを３５回反復した後、反応混合物を更に７２℃で５分間加熱した。
【０２００】
ＰＣＲ生成物は１．５％低融点アガロースゲル（Sigma社製）を用い精製した後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ヒトＨ鎖発現ベクターＨＥＦ−ｇγ１にクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−１２Ｅ１０Ｈ−ｇγ１と命名した。
【０２０１】
さらに、ＨＥＦ−１２Ｅ１０Ｈ−ｇγ１を制限酵素ＥｃｏＲＩならびにＢａｍＨＩで消化し、１２Ｅ１０ＶＨをコードする遺伝子を調製した後、ヒトＦａｂＨ鎖発現ベクターｐＣＯＳ−Ｆｄに挿入しｐＦｄ−１２Ｅ１０Ｈを得た。なお、ヒトＦａｂＨ鎖発現ベクターはヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域と定常領域をコードする遺伝子間に存在するイントロン領域ならびにヒトＨ鎖定常領域の一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号６３）についてＰＣＲ法を用いて増幅した後、動物細胞発現用ベクターｐＣＯＳ１に挿入することで構築したベクターである。ヒトＨ鎖定常領域はＨＥＦ−ｇγ１を鋳型とし、上記と同様の条件下にて遺伝子の増幅を行い、前方プライマーとしてイントロン１の５'端の配列とハイブリダイズし、且つＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素認識配列を有するように設計したＧ１ＣＨ１−Ｓ（配列番号６４）を、後方プライマーとしてヒトＨ鎖定常領域ＣＨ１ドメインの３'端のＤＮＡにハイブリダイズし、且つヒンジ領域の一部をコードする配列、二個の停止コドンおよびＢｇｌII制限酵素認識部位を有するように設計したＧ１ＣＨ１−Ａ（配列番号６５）を用いた。
プラスミドＨＥＦ−１２Ｅ１０Ｈ−ｇγ１及びｐＦｄ−１２Ｅ１０Ｈに含まれる再構成１２Ｅ１０Ｈ鎖可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：９４に示す。
【０２０２】
８．２ １２Ｅ１０Ｌ鎖可変領域をコードする遺伝子の構築
ヒトＭＰＬに結合するヒト抗体１２Ｅ１０Ｌ鎖可変領域をコードする遺伝子はＷＯ９９／１０４９４に記載のアミノ酸配列（配列番号９５）を基に配列番号９６に示す塩基配列を設計した。さらに、その５'端にヒト抗体遺伝子由来のリーダー配列（配列番号９７）（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２；２９：１５１５−１５１８）を連結させることで設計した。設計した塩基配列は上記と同様にそれぞれ１５ｂｐのオーバーラップ配列を持つように４本のオリゴヌクレオチド（１２Ｅ１０ＶＬ１、１２Ｅ１０ＶＬ２、１２Ｅ１０ＶＬ３、１２Ｅ１０ＶＬ４）に分割し、それぞれ合成した。１２Ｅ１０ＶＬ１（配列番号：９８）及び１２Ｅ１０ＶＬ３（配列番号：１００）はセンス配列、１２Ｅ１０ＶＬ２（配列番号：９９）及び１２Ｅ１０ＶＬ４（配列番号：１０１）はアンチセンス配列を有し、各合成オリゴヌクレオチドはそれぞれの相補性によりアッセンブリさせた後、外側プライマー（１２Ｅ１０ＶＬＳ及び１２Ｅ１０ＶＬＡ）を加え、全長の遺伝子を増幅した。なお、１２Ｅ１０ＶＬＳ（配列番号：１０２）は前方プライマーでリーダー配列の５'端にハイブリダイズし、且つＥｃｏＲＩ制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、また１２Ｅ１０ＶＬＡ（配列番号：１０３）は後方プライマーでＬ鎖可変領域のＣ末端をコードする塩基配列にハイブリダイズし、且つＢｌｎＩ制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
【０２０３】
ＰＣＲ反応は上記と同様に行い、ＰＣＲ生成物は１.５％低融点アガロースゲル（Sigma社製）を用い精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢｌｎＩで消化し、ヒトラムダ鎖定常領域遺伝子を含有するｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、１２Ｅ１０Ｌ鎖可変領域及びヒトラムダ鎖定常領域をコードする遺伝子を調製し、さらに発現ベクターｐＣＯＳ１に挿入し、１２Ｅ１０Ｌ鎖遺伝子（配列番号：１０４）を持つプラスミドをｐＣＯＳ−１２Ｅ１０Ｌと命名した。
【０２０４】
８．３ 再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの作製
再構成１２Ｅ１０抗体一本鎖Ｆｖは１２Ｅ１０ＶＨ−リンカー−１２Ｅ１０ＶＬの順とし、そのＣ末端には検出及び精製を容易にするためにＦＬＡＧ配列（配列番号：１０５）を付加することで設計した。リンカー配列は（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3の１５アミノ酸からなるリンカー配列、またはを（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）1の５アミノ酸からなるリンカー配列用い、再構成１２Ｅ１０鎖Ｆｖ（ｓｃ１２Ｅ１０およびｄｂ１２Ｅ１０）を構築した。
（１） ５アミノ酸からなるリンカー配列を用いた再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの作製
５アミノ酸からなるリンカー配列を用いた再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖをコードする遺伝子は１２Ｅ１０Ｈ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の３'端、及び１２Ｅ１０Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の５'端に（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）1からなるリンカーをコードする塩基配列を付加させた遺伝子についてそれぞれＰＣＲ法を用いて増幅し、連結することにより構築した。再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの作製のために４個のＰＣＲプライマー（Ａ〜Ｄ）を使用した。プライマーＡ及びＣはセンス配列を有し、プライマーＢおよびＤはアンチセンス配列を有する。
【０２０５】
Ｈ鎖Ｖ領域のための前方プライマーは１２Ｅ１０Ｓ（プライマーＡ、配列番号：１０６）を用い、Ｈ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＤＢ２（プライマーＢ、配列番号：１０７）は、Ｈ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、且つ（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）1からなるリンカーをコードする塩基配列ならびにＬ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードする塩基配列を有するように設計した。
【０２０６】
Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＤＢ１（プライマーＣ、配列番号：１０８）はＬ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、且つ（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）1からなるリンカーをコードする塩基配列ならびにＨ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードする塩基配列を有するように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマーは１２Ｅ１０ＦＡ（プライマーＤ、配列番号：１０９）はＬ鎖可変領域Ｃ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、且つＦＬＡＧをコードする塩基配列を有し、さらにＮｏｔＩ制限酵素認識部位を有するように設計した。
【０２０７】
第一ＰＣＲ段階において２つの反応Ａ−Ｂ及びＣ−Ｄを行い、そして第一ＰＣＲから得られた２つのＰＣＲ生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブリさせた。次に、プライマーＡ及びＤを加えて、５アミノ酸からなるリンカーを用いた再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖをコードする全長ＤＮＡを増幅した（第二ＰＣＲ）。なお、第一ＰＣＲにおいては、再構成１２Ｅ１０Ｈ鎖Ｖ領域をコードするプラスミドＨＥＦ−１２Ｅ１０Ｈ−ｇγ１（実施例８．１を参照）及び再構成１２Ｅ１０Ｌ鎖Ｖ領域をコードするプラスミドｐＣＯＳ−１２Ｅ１０Ｌ（実施例８．２を参照）をそれぞれ鋳型として用いた。
【０２０８】
第一ＰＣＲ段階の溶液５０μｌは、５μｌの１０×ＰＣＲ Ｇｏｌｄ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.０８ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（以上PERKIN ELMER 社製）、１００ピコモルずつの各プライマー及び１００ｎｇの各鋳型ＤＮＡを含有し、９４℃の初期温度にて９分間そして次に９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間及び７２℃にて１分間のサイクルを３５回反復した後、反応混合物を更に７２℃で５分間加熱した。
【０２０９】
ＰＣＲ生成物Ａ−Ｂ（４２９ｂｐ）及びＣ−Ｄ（３９５ｂｐ）は第二ＰＣＲでアッセンブリした。第二ＰＣＲにおいて、鋳型として１μＬずつの第一ＰＣＲ反応物Ａ−Ｂ及びＰＣＲ反応物Ｃ−Ｄ、１００ピコモルずつの各プライマー、１０μｌの１０×ＰＣＲ Ｇｏｌｄ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.０８ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（以上PERKIN ELMER 社製）を含有する９８μｌのＰＣＲ混合液を、上記と同様の条件下で反応させた。
【０２１０】
第二ＰＣＲにより生じた７９５ｂｐのＤＮＡ断片について１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製した後、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＣＨＯ１ベクターまたはｐＣＯＳ１ベクターにクローニングした。なお、本発現ベクターｐＣＨＯ１は、ＤＨＦＲ−ΔＥ−ＲＶＨ−ＰＭ１−ｆ（ＷＯ９２／１９７５９参照）から、ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩ消化により抗体遺伝子を削除し、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ Ａｄａｐｔｏｒ（宝酒造社製）を連結することにより構築したベクターである。ＤＮＡ配列決定の後、再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐＣＨＯ−ｄｂ１２Ｅ１０、及びｐＣＯＳ−ｄｂ１２Ｅ１０と命名した。本プラスミドｐＣＨＯ−ｄｂ１２Ｅ１０及びｐＣＯＳ−ｄｂ１２Ｅ１０に含まれる再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：１１０に示す。
【０２１１】
（２）１５アミノ酸からなるリンカー配列を用いた再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの作製
１５アミノ酸からなるリンカー配列を用いた再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖをコードする遺伝子は１２Ｅ１０Ｈ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の３'端、及び１２Ｅ１０Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の５'端にそれぞれ（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3からなるリンカーをコードする塩基配列を付加させた遺伝子について、それぞれＰＣＲ法を用いて増幅し、連結することにより構築した。再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの作製のために４個のＰＣＲプライマー（Ａ〜Ｄ）を使用した。プライマーＡ及びＣはセンス配列を有し、プライマーＢおよびＤはアンチセンス配列を有する。
【０２１２】
Ｈ鎖Ｖ領域のための前方プライマーは１２Ｅ１０Ｓ（プライマーＡ、配列番号：１０６）を用い、Ｈ鎖Ｖ領域のための後方プライマーｓｃ４.３（プライマーＢ、配列番号：１１１）は、Ｈ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、且つ（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3からなるリンカーをコードする塩基配列ならびにＬ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードする塩基配列を有するように設計した。
【０２１３】
Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマーｓｃ１.３（プライマーＣ、配列番号：１１２）はＬ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、且つ（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3からなるリンカーをコードする塩基配列ならびにＨ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードする塩基配列を有するように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマーは１２Ｅ１０ＦＡ（プライマーＤ、配列番号：１０９）はＬ鎖可変領域Ｃ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、且つＦＬＡＧをコードする塩基配列を有し、さらにＮｏｔＩ制限酵素認識部位を有するように設計した。
【０２１４】
第一ＰＣＲ段階において２つの反応Ａ−Ｂ及びＣ−Ｄを行い、そして第一ＰＣＲから得られた２つのＰＣＲ生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブリさせた。次に、プライマーＡ及びＤを加えて、１５アミノ酸からなるリンカーを用いた再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖをコードする全長ＤＮＡを増幅した（第二ＰＣＲ）。なお、第一ＰＣＲにおいては、再構成１２Ｅ１０一本鎖ＦｖをコードするプラスミドｐＣＯＳ−ｄｂ１２Ｅ１０（実施例８.３ (1)を参照）を鋳型として用いた。
【０２１５】
第一ＰＣＲ段階の溶液５０μｌは、５μｌの１０×ＥｘＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ、０.４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２.５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ（以上宝酒造社製）、１００ピコモルずつの各プライマー及び１０ｎｇの各鋳型ＤＮＡを含有し、９４℃の初期温度にて３０秒間そして次に９４℃にて１５秒間及び７２℃にて２分間のサイクルを５回、９４℃にて１５秒間及び７０℃にて２分間のサイクルを５回、９４℃にて１５秒間及び６８℃にて２分間のサイクルを２８回反復した後、反応混合物を更に７２℃で５分間加熱した。
ＰＣＲ生成物Ａ−Ｂ（４７７ｂｐ）及びＣ−Ｄ（４４７ｂｐ）は第二ＰＣＲでアッセンブリした。第二ＰＣＲにおいて、鋳型として１μＬずつの第一ＰＣＲ反応物Ａ−Ｂ及びＰＣＲ反応物Ｃ−Ｄ、１００ピコモルずつのプライマーＡ及びＤ、５μｌの１０×ＥｘＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ、０.４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２.５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ（以上宝酒造社製）を混合し、上記と同様の条件下で反応させた。
【０２１６】
第二ＰＣＲにより生じた８２５ｂｐのＤＮＡ断片について１．０％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＣＨＯ１ベクターまたはｐＣＯＳ１ベクターにクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐＣＨＯ−ｓｃ１２Ｅ１０及びｐＣＯＳ−ｓｃ１２Ｅ１０と命名した。本プラスミドｐＣＨＯ−ｓｃ１２Ｅ１０及びｐＣＯＳ−ｓｃ１２Ｅ１０に含まれる再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：１１３に示す。
【０２１７】
８．４ 動物細胞を用いた各１２Ｅ１０抗体（ＩｇＧ、Ｆａｂ）及び一本鎖Ｆｖポリペプチドの発現
１２Ｅ１０抗体（ＩｇＧ、Ｆａｂ）ならびに１２Ｅ１０抗体由来の一本鎖Ｆｖ（リンカー配列５アミノ酸、１５アミノ酸）はＣＯＳ−７細胞もしくはＣＨＯ細胞を用い発現させた。
ＣＯＳ-７細胞を用いた一過的な発現は次のようにして行った。すなわち、Ｇｅｎｅ ＰｕｌｓｅｒＩＩ装置（BioRad 社製）を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。１２Ｅ１０抗体（ＩｇＧ）の発現には前述の発現ベクターＨＥＦ−１２Ｅ１０Ｈ−ｇγ１及びｐＣＯＳ−１２Ｅ１０Ｌ各１０μｇずつを、１２Ｅ１０Ｆａｂ断片の発現にはｐＦｄ−１２Ｅ１０ＨとｐＣＯＳ−１２Ｅ１０Ｌ各１０μｇずつを、一本鎖Ｆｖの発現にはｐＣＯＳ−ｓｃ１２Ｅ１０（１０μｇ）またはｐＣＯＳ−ｄｂ１２Ｅ１０（１０μｇ）をＰＢＳに懸濁したＣＯＳ−７細胞（１×１０7細胞／ｍｌ）０.８ｍｌに混合したものをキュベットに加え、１.５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地（GIBCO BRL 社製）に加え培養した。終夜培養後、細胞をＰＢＳで一回洗浄し、さらに無血清培地ＣＨＯ-Ｓ-ＳＦＭＩＩ培地（GIBCO BRL 社製）を加え、さらに３日間培養した。培養上清を遠心し細胞破砕物を除去した後、０.２２μｍのフィルターを通すことで調製した。
【０２１８】
また、１２Ｅ１０抗体由来の一本鎖Ｆｖ（ポリペプチド）の恒常的発現ＣＨＯ細胞株を樹立するため、ｐＣＨＯ−ｓｃ１２Ｅ１０またはｐＣＨＯ−ｄｂ１２Ｅ１０発現ベクターをそれぞれＣＨＯ細胞に遺伝子導入した。
各発現ベクターを、Ｇｅｎｅ ＰｕｌｓｅｒＩＩ装置（BioRad 社製）を用いたエレクトロポレーション法によりＣＨＯ細胞に遺伝子導入した。ＰｖｕＩ消化により直鎖状にしたＤＮＡ（１００μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＨＯ細胞（１×１０7細胞／ｍｌ）の０.８ｍｌを混合したものをキュベットに加え、氷中で１０分間静置した後、１.５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％の透析ウシ胎児血清ならびに核酸を含有するＣＨＯ-Ｓ-ＳＦＭＩＩ培地（GIBCO BRL 社製）に加え培養した。培養２日後に１０％の透析ウシ胎児血清を含有する核酸不含ＣＨＯ-Ｓ-ＳＦＭＩＩ培地（GIBCO BRL 社製）にて培養した。得られたクローンについて発現量の高いクローンを１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの産生細胞株として選択した。この細胞株を無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（GIBCO BRL 社製）にて培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去後に、０.２２μｍのフィルターを通すことで培養上清を調製した。
【０２１９】
８．５ ＣＨＯ細胞産生の１２Ｅ１０由来の一本鎖Ｆｖの精製
実施例８．４で得た一本鎖Ｆｖ発現ＣＨＯ産生株（ｓｃ１２Ｅ１０，ｄｂ１２Ｅ１０）それぞれの培養上清から抗ＦＬＡＧ抗体カラム、及びゲルろ過カラムを用いて一本鎖Ｆｖを精製した
（１）抗ＦＬＡＧ抗体カラムを用いた精製
培養上清（ｓｃ１２Ｅ１０，ｄｂ１２Ｅ１０）を、それぞれ１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス-塩酸緩衝液（ｐＨ７.４）にて平衡化した抗 ＦＬＡＧ Ｍ２ アフィニティゲル（ＳＩＧＭＡ社製）カラムに添加し、同緩衝液でカラムを洗浄後、１００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ３.５）でカラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出画分は直ちに１Ｍ トリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）を加えて中和した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで各溶出画分を分析し、一本鎖Ｆｖが確認された画分を、それぞれプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ―１０（アミコン社製）を用いて約２０倍濃縮した。
【０２２０】
（２）ゲル濾過
（１）の画分を、０.０１％ Ｔｗｅｅｎ２０含むＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラム（１０ｘ３００ｍｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製 ）に添加した。クロマトグラムを図５３および５４に示す。その結果、ｓｃ１２Ｅ１０においては２つのピーク（Ａ，Ｂ）が検出された（図５３）。また、ｄｂ１２Ｅ１０では、２つのピーク（Ｃ，Ｄ）が検出された（図５４）。それぞれのピーク画分を分取し、還元剤添加、非添加で処理し、Ｌａｅｍｍｌｉの方法に準じて電気泳動を行い、泳動後蛋白質をクマシーブリリアントブルー染色した。図５５に示すように、画分Ａ、画分Ｂ、画分Ｃ、画分Ｄいずれも還元剤の添加の有無に関わらず、見かけ上の分子量約３１ｋＤに単一バンドを与えた。これらの画分を、前述のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラムを用いたゲルろ過で分析した結果、画分Ａは見かけ上の分子量約４２ｋＤ、画分Ｂは同２０ｋＤに溶出された（図５６を参照）。一方、画分Ｃは見かけ上の分子量約６９ｋＤ、画分Ｄは同４１ｋＤに溶出された（図５７を参照）以上の結果から、ｓｃ１２Ｅ１０由来の画分Ａは一本鎖Ｆｖの非共有結合性ダイマーで、画分Ｂは一本鎖Ｆｖのモノマーであり、また、ｄｂ１２Ｅ１０由来の画分Ｃは一本鎖Ｆｖの非共有結合性トリマー、画分Ｄは一本鎖Ｆｖの非共有結合性ダイマーであることが示唆された。
【０２２１】
８．６ 各種一本鎖ＦｖのＴＰＯ様アゴニスト活性の測定
ヒトＴＰＯ受容体（ＭＰＬ）を発現するＢａ/Ｆ３細胞（BaF/mpl）に対する増殖活性を測定することによって、抗ｍｐｌ一本鎖抗体のＴＰＯ様活性の評価を行った。
ＢａＦ/ｍｐｌ細胞を、１％ウシ胎児血清（GIBCO社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（GIBCO社製）で２回洗浄したのち、５×１０5細胞／ｍＬの細胞密度になるように培地に懸濁した。抗ＭＰＬ一本鎖抗体またはヒトＴＰＯ（R&D Systems社製）を培地で適当に希釈し、細胞懸濁液５０μＬに抗体またはヒトＴＰＯ希釈液５０μＬを加えて９６穴マイクロウェル平底プレート（Corning社製）に分注し、ＣＯ2インキュベーター（ＣＯ2濃度：５％）で２４時間培養した。培養後、ＷＳＴ−８試薬（生細胞数測定試薬ＳＦ：ナカライテスク社製）を１０μＬ加え、直後に吸光光度計Benchmark Plus（BioRad社製）を用いて測定波長４５０ｎｍ、対照波長６５５ｎｍの吸光度を測定した。ＣＯ2インキュベーター（ＣＯ2濃度：５％）で２時間インキュベートした後、Benchmark Plusを用いて再度測定波長４５０ｎｍ、対照波長６５５ｎｍの吸光度を測定した。ＷＳＴ−８試薬は生細胞数に応じて波長４５０ｎｍの発色反応を呈することから、２時間の吸光度変化を指標にＢａＦ/ｍｐｌ細胞増殖活性を評価した。
【０２２２】
各種１２Ｅ１０抗体分子を発現させたＣＯＳ−７細胞の培養上清を用い、ＭＰＬに対するアゴニスト活性を測定した結果を図５８に示す。リンカー配列５アミノ酸（ｄｂ１２Ｅ１０）および１５アミノ酸（ｓｃ１２Ｅ１０）の一本鎖Ｆｖでは濃度依存的に吸光度の上昇が認められ、ＴＰＯ様のアゴニスト活性を示したのに対し（ＥＤ５０；それぞれ９ｐＭおよび５１ｐＭ）、１２Ｅ１０ＩｇＧおよび１２Ｅ１０Ｆａｂでは全く活性が認められなかった。
【０２２３】
一本鎖Ｆｖはリンカー配列の長さによっては、Ｈ鎖とＬ鎖が分子内だけでなく、分子間でも介合することによって二量体等の多量体を形成することが知られている。そこで、１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖを発現させたＣＨＯ細胞の培養上清をゲルろ過分画して、ＭＰＬに対するアゴニスト活性を測定した。その結果を図５９に示す。ｓｃ１２Ｅ１０中にわずかに含まれる二量体（ｓｃ１２Ｅ１０ダイマー、ＥＤ５０；１.９ｐＭ）は単量体（ｓｃ１２Ｅ１０モノマー、ＥＤ５０；＞１０ｎＭ）に比べて、５０００倍以上強いＴＰＯ様アゴニスト活性を示し、その活性はＴＰＯ（ＥＤ５０；２７ｐＭ）よりも強かった。また、ｄｂ１２Ｅ１０の二量体（ｄｂ１２Ｅ１０ダイマー、ＥＤ５０；２.０ｐＭ）はｓｃ１２Ｅ１０ダイマーとほぼ同等の強い活性を示した。ゲルろ過分子量から三量体と推定されたｄｂ１２Ｅ１０トリマー（ＥＤ５０；７.４ｐＭ）もｄｂ１２Ｅ１０ダイマーには劣るが高い活性を示した。以上の結果から、アゴニスト抗体１２Ｅ１０の活性には、抗原結合部位が二価（ダイマー）であることが重要と考えられるが、１２Ｅ１０ ＩｇＧには活性が見られなかったことから、単に二価であるだけでなく、抗原結合部位間の距離や角度といった要素も重要と推測される。
【０２２４】
産業上の利用可能性
本発明の改変抗体は、細胞表面上の分子を架橋することにより該細胞内にシグナルを伝達しうるアゴニスト作用を有しており、また親抗体（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）と比較して低分子化が達成されているため、組織、腫瘍への移行性に優れているという特徴を有している。さらに本発明によれは、ＴＰＯ等の天然のリガンドや親抗体（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）より顕著に高いアゴニスト活性を有する改変抗体が提供される。特に、親抗体分子でアゴニスト活性が認められない場合においても天然のリガンドより高いアゴニスト活性を有する改変抗体が提供できる。これは本発明の改変抗体が抗体分子に比べてよりリガンドに近い形態であるためと考えられる。従って、当該改変抗体は、シグナル伝達アゴニストとして使用して、アポトーシス誘導、細胞増殖誘導、細胞分化誘導、細胞分裂誘導または細胞周期調節作用を奏することができる。また、本発明によれば、抗体分子を本発明の改変抗体にすることにより、細胞間の架橋などによる副作用を軽減し、且つ細胞表面上の分子を架橋して所望の作用のみを誘起しうる新規な医薬品が提供される。本発明の改変抗体を有効成分とする医薬製剤は、癌、炎症、ホルモン異常、自己免疫疾患並びに白血病、悪性リンパ腫、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群および真性多血症などの血液疾患の予防及び／又は治療薬として有用である。
【０２２５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA
<120> Small remodeling agonist antibody
<130> FP1052
<131> JP2002-536442
<141> 2001-10-22
<150> JP2000-321821
<151> 2000-10-20
<150> JP2000-321822
<151> 2000-10-20
<150> PCT/JP01/01912
<151> 2001-03-12
<150> PCT/JP01/03288
<151> 2001-04-17
<150> JP2001-277314
<151> 2001-09-12
<160> 113
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 1
ccatcctaat acgactcact atagggc 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 2
ggatcccggg tggatggtgg gaagatg 27
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 3
ggatcccggg ccagtggata gacagatg 28
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 4
ggatcccggg agtggataga ccgatg 26
<210> 5
<211> 394
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(393)
<223> pGEM-M1L. 1-57;signal peptide, 58-394;mature peptide
<400> 5
atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gcg 48
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
tcc agc agt gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc ctt 144
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
cta cac agt aaa gga aac acc tat tta caa tgg tac cta cag aag cca 192
Leu His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg tcc gga ggg ggg acc aag ctg 384
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
gaa ata aaa c 394
Glu Ile Lys
130
<210> 6
<211> 409
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(408)
<223> pGEM-M1H. 1-57;signal peptide, 58-409;mature peptide
<400> 6
atg gaa tgg agc tgg ata ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act gca ggt 48
Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
gtc cac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gac ctg gta aag 96
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys
20 25 30
cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc 144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
gtt aac cat gtt atg cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt 192
Val Asn His Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tac aat 240
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn
65 70 75 80
gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act tca gag aaa tcc tcc agc 288
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Glu Lys Ser Ser Ser
85 90 95
gca gcc tac atg gag ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc 336
Ala Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
tac tac tgt gca aga ggg ggt tac tat agt tac gac gac tgg ggc caa 384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ser Tyr Asp Asp Trp Gly Gln
115 120 125
ggc acc act ctc aca gtc tcc tca g 409
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 7
<211> 394
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(393)
<223> pGEM-M2L. 1-57;signal peptide, 58-394;mature peptide
<400> 7
atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct ggt 48
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Gly
1 5 10 15
tcc agc agt gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc 96
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tca agt cag agc ctt 144
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
gtg cac agt aat gga aag acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca 192
Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca gtg aca gat ttc aca 288
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr
85 90 95
ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336
Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg 384
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
gaa ata aaa c 394
Glu Ile Lys
130
<210> 8
<211> 409
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(408)
<223> pGEM-M2H. 1-57;signal peptide, 58-409;mature peptide
<400> 8
atg gaa tgg agc tgg ata ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act gca ggt 48
Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
gtc cac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gaa ctg gta aag 96
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc 144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
gct aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt 192
Ala Asn His Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tat aat 240
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn
65 70 75 80
gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac aaa tcc tcc acc 288
Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr
85 90 95
aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc 336
Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg ggc caa 384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln
115 120 125
ggc acc act ctc aca gtc tcc tca g 409
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 9
cccaagcttc caccatgaag ttgcctgtta gg 32
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 10
cccaagcttc caccatggaa tggagctgga ta 32
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 11
cgcggatcca ctcacgtttt atttccagct tggt 34
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 12
cgcggatcca ctcacctgag gagactgtga gagt 34
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 13
catgccatgg cgcaggtcca gctgcagcag 30
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 14
accaccacct gaggagactg tgagagt 27
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 15
gtctcctcag gtggtggtgg ttcgggt 27
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 16
cacaacatcc gatccgccac cacccga 27
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 17
ggcggatcgg atgttgtgat gacccaa 27
<210> 18
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 18
ccggaattct cattatttat cgtcatcgtc tttgtagtct tttatttcca gcttggt 57
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker amino acid sequence and nucleotide sequence
<400> 19
ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg 45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
5 10 15
<210> 20
<211> 828
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(822)
<223> pscM1. MABL1-scFv
<400> 20
atg aaa tac cta ttg cct acg gca gcc gct gga ttg tta tta ctc gct 48
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
gcc caa cca gcc atg gcg cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gac 96
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp
20 25 30
ctg gta aag cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga 144
Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
tac acc ttc gtt aac cat gtt atg cac tgg gtg aag cag aag cca ggg 192
Tyr Thr Phe Val Asn His Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly
50 55 60
cag ggc ctt gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act 240
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr
65 70 75 80
aag tac aat gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act tca gag aaa 288
Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Glu Lys
85 90 95
tcc tcc agc gca gcc tac atg gag ctc agc agc ctg gcc tct gag gac 336
Ser Ser Ser Ala Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp
100 105 110
tct gcg gtc tac tac tgt gca aga ggg ggt tac tat agt tac gac gac 384
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ser Tyr Asp Asp
115 120 125
tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg 432
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa 480
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln
145 150 155 160
act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct 528
Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser
165 170 175
tgc aga tct agt cag agc ctt cta cac agt aaa gga aac acc tat tta 576
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu
180 185 190
caa tgg tac cta cag aag cca ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac 624
Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
195 200 205
aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt 672
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag 720
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
225 230 235 240
gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg 768
Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr
245 250 255
tcc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac 816
Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
260 265 270
gat aaa taatga 828
Asp Lys
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 21
acgcgtcgac tcccaggtcc agctgcagca g 31
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 22
gaaggtgtat ccagaagc 18
<210> 23
<211> 819
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(813)
<223> pCHOM1. MABL1-scFv
<400> 23
atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt 48
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
gtc gac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gac ctg gta aag 96
Val Asp Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys
20 25 30
cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc 144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
gtt aac cat gtt atg cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt 192
Val Asn His Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tac aat 240
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn
65 70 75 80
gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act tca gag aaa tcc tcc agc 288
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Glu Lys Ser Ser Ser
85 90 95
gca gcc tac atg gag ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc 336
Ala Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
tac tac tgt gca aga ggg ggt tac tat agt tac gac gac tgg ggc caa 384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ser Tyr Asp Asp Trp Gly Gln
115 120 125
ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt 432
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc 480
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu
145 150 155 160
tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct 528
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
165 170 175
agt cag agc ctt cta cac agt aaa gga aac acc tat tta caa tgg tac 576
Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr
180 185 190
cta cag aag cca ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc 624
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
195 200 205
aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg 672
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
210 215 220
aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga 720
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
225 230 235 240
gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg tcc gga ggg 768
Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Ser Gly Gly
245 250 255
ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac gat aaa taa 816
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
260 265 270
tga 819
<210> 24
<211> 828
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(822)
<223> pscM2. MABL2-scFv
<400> 24
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Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
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gcc caa cca gcc atg gcg cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gaa 96
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu
20 25 30
ctg gta aag cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga 144
Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
tac acc ttc gct aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca ggg 192
Tyr Thr Phe Ala Asn His Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly
50 55 60
cag ggc ctt gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act 240
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr
65 70 75 80
aag tat aat gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac aaa 288
Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys
85 90 95
tcc tcc acc aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac 336
Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp
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tct gcg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac 384
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp
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tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg 432
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ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa 480
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agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct 528
Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser
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cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac 624
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gga tca gtg aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag 720
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Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly
385 390 395 400
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val
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atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc 1296
Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala
420 425 430
tcc atc tct tgc aga tca agt cag agc ctt gtg cac agt aat gga aag 1344
Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys
435 440 445
acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc 1392
Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu
450 455 460
ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc 1440
Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
465 470 475 480
agt ggc agt gga tca gtg aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg 1488
Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val
485 490 495
gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt 1536
Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val
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MET Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val
5 10 15
gac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gaa ctg gta aag cct ggg 102
Asp Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly
20 25 30
gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc gct aac cat 153
Ala Ser Val Lys MET Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn His
35 40 45 50
gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt gag tgg att gga 204
Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
55 60 65
tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tat aat gag aag ttc aag gac 255
Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp
70 75 80 85
aag gcc act ctg act tca gac aaa tcc tcc acc aca gcc tac atg gac ctc 306
Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr MET Asp Leu
90 95 100
agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt 357
Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly
105 110 115
tac tat act tac gac gac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcg agt 408
Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
120 125 130 135
gac gtc gtg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat 459
Asp Val Val MET Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp
140 145 150
caa gcc tcc atc tct tgc aga tca agt cag agc ctt gtg cac agt aat gga 510
Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly
155 160 165 170
aag acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc 561
Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu
175 180 185
ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt 612
Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
190 195 200
ggc agt gga tca gtg aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct 663
Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu MET Ile Ser Arg Val Glu Ala
205 210 215 220
gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg 714
Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr
225 230 235
ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac gat 765
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp
240 245 250 255
aaa taa tga gga tcc 780
Lys
<210> 49
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 49
caagctcgag ataaaatccg gaggccaggt ccaattgcag cagtc 45
<210> 50
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 50
caagctcgag ataaaatccg gaggtggcca ggtccaattg cagcagtc 48
<210> 51
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 51
caagctcgag ataaaatccg gaggtggtgg ccaggtccaa ttgcagcagt c 51
<210> 52
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 52
caagctcgag ataaaatccg gaggtggtgg tggccaggtc caattgcagc agtc 54
<210> 53
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 53
caagctcgag ataaaatccg gaggtggtgg tggtggccag gtccaattgc agcagtc 57
<210> 54
<211> 780
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(768)
<223> CF2LH-0/pCOS1. MABL2-scFv<LH-0>
<400> 54
atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct ggt tcc 51
MET Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu MET Phe Trp Ile Pro Gly Ser
5 10 15
agc agt gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt 102
Ser Ser Asp Val Val MET Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu
20 25 30
gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tca agt cag agc ctt gtg cac agt 153
Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
35 40 45 50
aat gga aag acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca 204
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
55 60 65
aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg 255
Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg
70 75 80 85
ttc agt ggc agt gga tca gtg aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg 306
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu MET Ile Ser Arg Val
90 95 100
gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg 357
Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro
105 110 115
tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctc gag ata aaa cag gtc caa ttg cag 408
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gln Val Gln Leu Gln
120 125 130 135
cag tct gga cct gaa ctg gta aag cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc 459
Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys MET Ser Cys
140 145 150
aag gct tct gga tac acc ttc gct aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag 510
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn His Val Ile His Trp Val Lys Gln
155 160 165 170
aag cca ggg cag ggc ctt gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat 561
Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp
175 180 185
ggt act aag tat aat gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac 612
Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp
190 195 200
aaa tcc tcc acc aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac 663
Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr MET Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp
205 210 215 220
tct gcg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg 714
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp
225 230 235
ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca gac tac aaa gac gat gac gat 765
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp
240 245 250 255
aaa taa tga gga tcc 780
Lys
<210> 55
<211> 351
<212> DNA
<213> Human
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(351)
<223> 12B5HV. 1-351 peptide
<400> 55
cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gtc cgg ccc ggg ggg 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg agt ctc tcc tgt gca gtc tct gga atc acc ctc agg acc tac 96
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Thr Leu Arg Thr Tyr
20 25 30
ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca ggt ata tcc ttt gac gga aga agt gaa tac tat gca gac tcc gtg 192
Ala Gly Ile Ser Phe Asp Gly Arg Ser Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
cag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac agt tcc aag aac acc ctg tat 240
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga gga gca cat tat ggt ttc gat atc tgg ggc caa ggg aca atg 336
Ala Arg Gly Ala His Tyr Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
gtc acc gtc tcg agt 351
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 56
<211> 57
<212> DNA
<213> Human
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(57)
<223> reader sequence
<400> 56
atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctc gtt gct ctt tta aga ggt 48
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly
5 10 15
gtc cag tgt 57
Val Gln Cys
<210> 57
<211> 115
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12B5VH-1
<400> 57
atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg gggaggcttg gtccggcccg gggggtccct gagtc 115
<210> 58
<211> 115
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12B5VH-2
<400> 58
aaggatatac ctgccaccca ctccagcccc ttgcctggag cctggcggac ccagtgcatg 60
ccgtaggtcc tgagggtgat tccagagact gcacaggaga gactcaggga ccccc 115
<210> 59
<211> 115
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12B5VH-3
<400> 59
ggcaggtata tcctttgacg gaagaagtga atactatgca gactccgtgc agggccgatt 60
caccatctcc agagacagtt ccaagaacac cctgtatctg caaatgaaca gcctg 115
<210> 60
<211> 108
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12B5VH-4
<400> 60
actcgagacg gtgaccattg tcccttggcc ccagatatcg aaaccataat gtgctcctct 60
cgcacagtaa tacacagccg tgtcctcggc tctcaggctg ttcatttg 108
<210> 61
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12B5VH-S, PCR primer
<400> 61
ttcaagcttc caccatggag tttgggctga gc 32
<210> 62
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12B5VH-A, PCR primer
<400> 62
ttgggatcca ctcaccactc gagacggtga ccat 34
<210> 63
<211> 588
<212> DNA
<213> Human
<220>
<221> CDS
<222> (236)...(558)
<223> 1-235;intron, 236-558;Human IgG constant region (partial)
<400> 63
gaattcgtga gtggatccca agctagcttt ctggggcagg ccaggcctga ccttggcttt 60
ggggcaggga gggggctaag gtgaggcagg tggcgccagc caggtgcaca cccaatgccc 120
atgagcccag acactggacg ctgaacctcg cggacagtta agaacccagg ggcctctgcg 180
ccctgggccc agctctgtcc cacaccgcgg tcacatggca caacctctct tgca gcc 237
Ala
1
tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc 285
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
5 10 15
acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc 333
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc 381
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc 429
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60 65
agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac 477
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
70 75 80
atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa 525
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca 558
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
100 105
<210> 64
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G1CH1-S, PCR primer
<400> 64
tgagaattcg tgagtggatc ccaagct 27
<210> 65
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G1CH1-A, PCR primer
<400> 65
aaaagatctt tatcatgtgt gagttttgtc acaagatttg ggctcaactt tcttgtccac 60
<210> 66
<211> 432
<212> DNA
<213> Human
<220>
<221> CDS
<222> (12)...(419)
<223> HEF-12B5H-g gamma. 12-419 peptide
<400> 66
aagcttccac c atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctc gtt gct ctt 50
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu
1 5 10
tta aga ggt gtc cag tgt cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc 98
Leu Arg Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
15 20 25
ttg gtc cgg ccc ggg ggg tcc ctg agt ctc tcc tgt gca gtc tct gga 146
Leu Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly
30 35 40 45
atc acc ctc agg acc tac ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc 194
Ile Thr Leu Arg Thr Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
aag ggg ctg gag tgg gtg gca ggt ata tcc ttt gac gga aga agt gaa 242
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Phe Asp Gly Arg Ser Glu
65 70 75
tac tat gca gac tcc gtg cag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac agt 290
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser
80 85 90
tcc aag aac acc ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac 338
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
95 100 105
acg gct gtg tat tac tgt gcg aga gga gca cat tat ggt ttc gat atc 386
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala His Tyr Gly Phe Asp Ile
110 115 120 125
tgg ggc caa ggg aca atg gtc acc gtc tcg agt ggtgagtgga tcc 432
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 67
<211> 321
<212> DNA
<213> Human
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(321)
<223> 12B5LV. 1-321 peptide
<400> 67
gac atc cag atg acc cag tct cct tcc acc ctg tct gca tct att gga 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc atc acc tgc cgg gcc agc gag ggt att tat cac tgg 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp
20 25 30
ttg gcc tgg tat cag cag aag cca ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg atc 144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
tat aag gcc tct agt tta gcc agt ggg gcc cca tca agg ttc agc ggc 192
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
gat gat ttt gca act tat tac tgc caa caa tat agt aat tat ccg ctc 288
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
act ttc ggc gga ggg acc aag ctg gag atc aaa 321
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 68
<211> 66
<212> DNA
<213> Human
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(66)
<223> reader sequence
<400> 68
atg gac atg agg gtc ccc gct cag ctc ctg ggg ctc ctg ctg ctc tgg 48
MET Asp MET Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
5 10 15
ctc cca ggt gcc aaa tgt 66
Leu Pro Gly Ala Lys Cys
20
<210> 69
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12B5VL-1
<400> 69
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
aaatgtgaca tccagatgac ccagtctcct tccaccctgt ctgcatctat 110
<210> 70
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12B5VL-2
<400> 70
ggagtttagg ggctttccct ggcttctgct gataccaggc caaccagtga taaataccct 60
cgctggcccg gcaggtgatg gtgactctgt ctccaataga tgcagacagg 110
<210> 71
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12B5VL-3
<400> 71
aagcccctaa actcctgatc tataaggcct ctagtttagc cagtggggcc ccatcaaggt 60
tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 110
<210> 72
<211> 103
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12B5VL-4
<400> 72
tttgatctcc agcttggtcc ctccgccgaa agtgagcgga taattactat attgttggca 60
gtaataagtt gcaaaatcat caggctgcag gctgctgatg gtg 103
<210> 73
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12B5VL-S, PCR primer
<400> 73
ttcaagcttc caccatggac atgagggtcc cc 32
<210> 74
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12B5VL-A, PCR primer
<400> 74
tctaggatcc actcacgttt gatctccagc ttggt 35
<210> 75
<211> 415
<212> DNA
<213> Human
<220>
<221> CDS
<222> (12)...(398)
<223> HEF-12B5H-g kappa. 12-398 peptide
<400> 75
aagcttccac c atg gac atg agg gtc ccc gct cag ctc ctg ggg ctc ctg 50
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu
1 5 10
ctg ctc tgg ctc cca ggt gcc aaa tgt gac atc cag atg acc cag tct 98
Leu Leu Trp Leu Pro Gly Ala Lys Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
15 20 25
cct tcc acc ctg tct gca tct att gga gac aga gtc acc atc acc tgc 146
Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
30 35 40 45
cgg gcc agc gag ggt att tat cac tgg ttg gcc tgg tat cag cag aag 194
Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
50 55 60
cca ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg atc tat aag gcc tct agt tta gcc 242
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala
65 70 75
agt ggg gcc cca tca agg ttc agc ggc agt gga tct ggg aca gat ttc 290
Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
80 85 90
act ctc acc atc agc agc ctg cag cct gat gat ttt gca act tat tac 338
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
95 100 105
tgc caa caa tat agt aat tat ccg ctc act ttc ggc gga ggg acc aag 386
Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
110 115 120 125
ctg gag atc aaa cgtgagtgga tcctaga 415
Leu Glu Ile Lys
<210> 76
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLAG tag sequence
<400> 76
gac tac aag gat gac gac gat aag 24
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
5
<210> 77
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12B5-S, PCR primer
<400> 77
atagaattcc accatggagt ttgggctgag c 31
<210> 78
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HuVHJ3, PCR primer
<400> 78
tgaagagacg gtgaccattg tccc 24
<210> 79
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RhuJH3, PCR primer
<400> 79
ggacaatggt caccgtctct tcaggtgg 28
<210> 80
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RhuVK1, PCR primer
<400> 80
ggagactggg tcatctggat gtccgatccg cc 32
<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HuVK1.2, PCR primer
<400> 81
gacatccaga tgacccagtc tcc 23
<210> 82
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12B5F-A, PCR primer
<400> 82
attgcggccg cttatcactt atcgtcgtca tccttgtagt ctttgatctc cagcttggt 59
<210> 83
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker amino acid sequence and nucleotide sequence
<400> 83
ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg 45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
5 10 15
<210> 84
<211> 823
<212> DNA
<213> Human
<220>
<221> CDS
<222> (12)...(809)
<223> sc12B5, Single chain Fv
<400> 84
aagcttccac c atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctc gtt gct ctt 50
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu
1 5 10
tta aga ggt gtc cag tgt cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc 98
Leu Arg Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
15 20 25
ttg gtc cgg ccc ggg ggg tcc ctg agt ctc tcc tgt gca gtc tct gga 146
Leu Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly
30 35 40 45
atc acc ctc agg acc tac ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc 194
Ile Thr Leu Arg Thr Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
aag ggg ctg gag tgg gtg gca ggt ata tcc ttt gac gga aga agt gaa 242
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Phe Asp Gly Arg Ser Glu
65 70 75
tac tat gca gac tcc gtg cag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac agt 290
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser
80 85 90
tcc aag aac acc ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac 338
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
95 100 105
acg gct gtg tat tac tgt gcg aga gga gca cat tat ggt ttc gat atc 386
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala His Tyr Gly Phe Asp Ile
110 115 120 125
tgg ggc caa ggg aca atg gtc acc gtc tcg agt ggt ggt ggt ggt tcg 434
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gac atc cag atg acc cag 482
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
145 150 155
tct cct tcc acc ctg tct gca tct att gga gac aga gtc acc atc acc 530
Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
160 165 170
tgc cgg gcc agc gag ggt att tat cac tgg ttg gcc tgg tat cag cag 578
Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
175 180 185
aag cca ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg atc tat aag gcc tct agt tta 626
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu
190 195 200 205
gcc agt ggg gcc cca tca agg ttc agc ggc agt gga tct ggg aca gat 674
Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
210 215 220
ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct gat gat ttt gca act tat 722
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr
225 230 235
TAC TGC CAA CAA TAT AGT AAT TAT CCG CTC ACT TTC GGC GGA GGG ACC 770
Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr
240 245 250
aag ctg gag atc aaa gac tac aag gat gac gac gat aag tgataagcgg c 820
Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
255 260 265
cgc 823
<210> 85
<211> 114
<212> PRT
<213> Human
<400> 85
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 86
<211> 342
<212> DNA
<213> Human
<400> 86
caggtgcagc tgcagcagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtga ctccatcagt agttactact ggagctggat tcggcagccc 120
ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagagcca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcagacacg gccgtgtatt actgtgcgag agggcggtac 300
ttcgatgtct ggggccgtgg caccatggtc actgtctcct ca 342
<210> 87
<211> 57
<212> DNA
<213> Human
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(57)
<223> reader sequence
<308> GenBank No. AF062252
<400> 87
atg aaa cat ctg tgg ttc ttc ctt ctc ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
gtc ctg tcc 57
Val Leu Ser
<210> 88
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12E10VH1
<400> 88
atgaaacatc tgtggttctt ccttctcctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60
gtgcagctgc agcagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct 110
<210> 89
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12E10VH2
<400> 89
acccaatcca ctccagtccc ttccctgggg gctgccgaat ccagctccag tagtaactac 60
tgatggagtc accagagaca gtgcaggtga gggacagggt ctccgaaggc 110
<210> 90
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12E10VH3
<400> 90
tggagtggat tgggtatatc tattacagtg ggagcaccaa ctacaacccc tccctcaaga 60
gtcgagtcac catatcagta gacacgtcca agagccagtt ctccctgaag 110
<210> 91
<211> 114
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12E10VH4
<400> 91
tgaggagaca gtgaccatgg tgccacggcc ccagacatcg aagtaccgcc ctctcgcaca 60
gtaatacacg gccgtgtctg cggcggtcac agagctcagc ttcagggaga actg 114
<210> 92
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12E10VHS, PCR primer
<400> 92
ttcaagcttc caccatgaaa catctgtggt tc 32
<210> 93
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12E10VHA, PCR primer
<400> 93
ttgggatcca ctcacctgag gagacagtga ccat 34
<210> 94
<211> 426
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<221> CDS
<222> (12)...(417)
<223> 12E10H, H chain V region
<400> 94
aagcttccac c atg aaa cat ctg tgg ttc ttc ctt ctc ctg gtg gca gct 50
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala
1 5 10
ccc aga tgg gtc ctg tcc cag gtg cag ctg cag cag tcg ggc cca gga 98
Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly
15 20 25
ctg gtg aag cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt 146
Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
30 35 40 45
gac tcc atc agt agt tac tac tgg agc tgg att cgg cag ccc cca ggg 194
Asp Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
aag gga ctg gag tgg att ggg tat atc tat tac agt ggg agc acc aac 242
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn
65 70 75
tac aac ccc tcc ctc aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc 290
Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser
80 85 90
aag agc cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gca gac acg 338
Lys Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
95 100 105
gcc gtg tat tac tgt gcg aga ggg cgg tac ttc gat gtc tgg ggc cgt 386
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg
110 115 120 125
ggc acc atg gtc act gtc tcc tca ggtgagtgga tcccaa 426
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 95
<211> 110
<212> PRT
<213> Mus
<400> 95
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Arg
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 96
<211> 330
<212> DNA
<213> Mus
<400> 96
tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgagggca gtaaacggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caaccagaag cactcgggtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 97
<211> 57
<212> DNA
<213> Human
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(57)
<223> reader sequence
<310>
<400> 97
atg gcc tgg acc gtt ctc ctc ctc ggc ctc ctc tct cac tgc aca ggc 48
Met Ala Trp Thr Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ser His Cys Thr Gly
1 5 10 15
tct gtg acc 57
Ser Val Thr
<210> 98
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12E10VL1, PCR primer
<400> 98
atggcctgga ccgttctcct cctcggcctc ctctctcact gcacaggctc tgtgacctcc 60
tatgtgctga ctcagccacc ctcggtgtca gggtctcctg gacagtcgat 110
<210> 99
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12E10VL2, PCR primer
<400> 99
tcatgagttt gggggctttg cctgggtgct gttggtacca ggagacatag ttataaccac 60
caacgtcact gctggttcca gtgcaggaga tggtgatcga ctgtccagga 110
<210> 100
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12E10VL3, PCR primer
<400> 100
cccccaaact catgatttat gagggcagta aacggccctc aggggtttct aatcgcttct 60
ctggctccaa gtctggcaac acggcctccc tgaccatctc tgggctccag 110
<210> 101
<211> 102
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12E10VL4, PCR primer
<400> 101
taggacggtc agcttggtcc ctccgccgaa cacccgagtg cttctggttg tatatgagct 60
gcagtaataa tcagcctcgt cctcagcctg gagcccagag at 102
<210> 102
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12E10VLS, PCR primer
<400> 102
atcaagcttc caccatggcc tggaccgttc t 31
<210> 103
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12E10VLA, PCR primer
<400> 103
ctaggatccg ggctgaccta ggacggtcag cttggt 36
<210> 104
<211> 387
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(387)
<223> 12E10L, L chain V region
<310>
<400> 104
atg gcc tgg acc gtt ctc ctc ctc ggc ctc ctc tct cac tgc aca ggc 48
Met Ala Trp Thr Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ser His Cys Thr Gly
1 5 10 15
tct gtg acc tcc tat gtg ctg act cag cca ccc tcg gtg tca ggg tct 96
Ser Val Thr Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser
20 25 30
cct gga cag tcg atc acc atc tcc tgc act gga acc agc agt gac gtt 144
Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val
35 40 45
ggt ggt tat aac tat gtc tcc tgg tac caa cag cac cca ggc aaa gcc 192
Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala
50 55 60
ccc aaa ctc atg att tat gag ggc agt aaa cgg ccc tca ggg gtt tct 240
Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser
65 70 75 80
aat cgc ttc tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg acc atc 288
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile
85 90 95
tct ggg ctc cag gct gag gac gag gct gat tat tac tgc agc tca tat 336
Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr
100 105 110
Aca acc aga agc act cgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc 384
Thr Thr Arg Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
115 120 125
cta 387
Leu
<210> 105
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(24)
<223> FLAG, reader sequence
<400> 105
gac tac aag gat gac gac gat aag 24
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
<210> 106
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12E10S, PCR primer
<400> 106
tatgaattcc accatgaaac atctgtggtt 30
<210> 107
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DB2, PCR primer
<400> 107
taggagctac cgcctccacc tgaggagaca gtgaccat 38
<210> 108
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DB1, PCR primer
<400> 108
gtctcctcag gtggaggcgg tagctcctat gtgctgactc agcc 44
<210> 109
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12E10FA, PCR primer
<400> 109
attgcggccg cttatcactt atcgtcgtca tccttgtagt ctaggacggt cagcttggt 59
<210> 110
<211> 792
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CDS
<222> (11)...(778)
<223> 12E10, Single chain Fv
<400> 110
gaattccacc atg aaa cat ctg tgg ttc ttc ctt ctc ctg gtg gca gct 49
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala
1 5 10
ccc aga tgg gtc ctg tcc cag gtg cag ctg cag cag tcg ggc cca gga 97
Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly
15 20 25
ctg gtg aag cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt 145
Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
30 35 40 45
gac tcc atc agt agt tac tac tgg agc tgg att cgg cag ccc cca ggg 193
Asp Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
aag gga ctg gag tgg att ggg tat atc tat tac agt ggg agc acc aac 241
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn
65 70 75
tac aac ccc tcc ctc aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc 289
Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser
80 85 90
aag agc cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gca gac acg 337
Lys Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
95 100 105
gcc gtg tat tac tgt gcg aga ggg cgg tac ttc gat gtc tgg ggc cgt 385
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg
110 115 120 125
ggc acc atg gtc act gtc tcc tca ggt gga ggc ggt agc tcc tat gtg 433
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val
130 135 140
ctg act cag cca ccc tcg gtg tca ggg tct cct gga cag tcg atc acc 481
Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr
145 150 155
atc tcc tgc act gga acc agc agt gac gtt ggt ggt tat aac tat gtc 529
Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val
160 165 170
tcc tgg tac caa cag cac cca ggc aaa gcc ccc aaa ctc atg att tat 577
Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr
175 180 185
gag ggc agt aaa cgg ccc tca ggg gtt tct aat cgc ttc tct ggc tcc 625
Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser
190 195 200 205
aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg acc atc tct ggg ctc cag gct gag 673
Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu
210 215 220
gac gag gct gat tat tac tgc agc tca tat aca acc aga agc act cgg 721
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Arg Ser Thr Arg
225 230 235
gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta gac tac aag gat gac 769
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Asp Tyr Lys Asp Asp
240 245 250
gac gat aag tgataagcgg ccgc 792
Asp Asp Lys
255
<210> 111
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sc4.3, PCR primer
<400> 111
ggtggctgag tcagcacata ggacgatccg ccaccacccg aaccaccacc acccgaacca 60
cc 62
<210> 112
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sc1.3, PCR primer
<400> 112
gcaccatggt cactgtctcc tcaggtggtg gtggttcggg tggtggtggt tcgggtggtg 60
g 61
<210> 113
<211> 822
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CDS
<222> (11)...(807)
<223> sc12E10, Single chain Fv
<400> 113
gaattccacc atg aaa cat ctg tgg ttc ttc ctt ctc ctg gtg gca gct 49
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala
1 5 10
ccc aga tgg gtc ctg tcc cag gtg cag ctg cag cag tcg ggc cca gga 97
Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly
15 20 25
ctg gtg aag cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt 145
Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
30 35 40 45
gac tcc atc agt agt tac tac tgg agc tgg att cgg cag ccc cca ggg 193
Asp Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
aag gga ctg gag tgg att ggg tat atc tat tac agt ggg agc acc aac 241
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn
65 70 75
tac aac ccc tcc ctc aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc 289
Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser
80 85 90
aag agc cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gca gac acg 337
Lys Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
95 100 105
gcc gtg tat tac tgt gcg aga ggg cgg tac ttc gat gtc tgg ggc cgt 385
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg
110 115 120 125
ggc acc atg gtc act gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt 433
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg tcc tat gtg ctg act cag cca ccc tcg 481
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser
145 150 155
gtg tca ggg tct cct gga cag tcg atc acc atc tcc tgc act gga acc 529
Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr
160 165 170
agc agt gac gtt ggt ggt tat aac tat gtc tcc tgg tac caa cag cac 577
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His
175 180 185
cca ggc aaa gcc ccc aaa ctc atg att tat gag ggc agt aaa cgg ccc 625
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro
190 195 200 205
tca ggg gtt tct aat cgc ttc tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc 673
Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala
210 215 220
tcc ctg acc atc tct ggg ctc cag gct gag gac gag gct gat tat tac 721
Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
225 230 235
tgc agc tca tat aca acc aga agc act cgg gtg ttc ggc gga ggg acc 769
Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Arg Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr
240 245 250
aag ctg acc gtc cta gac tac aag gat gac gac gat aag tgataagcgg 818
Lys Leu Thr Val Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
255 260 265
ccgc 822
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトＩｇＧ１抗体が、ヒトＩＡＰを発現するＬ１２１０細胞（ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０）に結合しないことを示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図２】 キメラＭＡＢＬ−１抗体が、ヒトＩＡＰを発現するＬ１２１０細胞（ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０）に特異的に結合することを示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図３】 キメラＭＡＢＬ−２抗体が、ヒトＩＡＰを発現するＬ１２１０細胞（ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０）に特異的に結合することを示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図４】 本発明にかかる一本鎖Ｆｖの作成方法を模式的に示す図である。
【図５】 本発明の一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡを、大腸菌にて発現させるために使用可能な発現プラスミドの一例の構造を示す。
【図６】 本発明の一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡを、哺乳動物細胞にて発現させるために使用する発現プラスミドの一例の構造を示す。
【図７】 実施例５．４で得られたウエスタンブロットの結果を示す図である。左側より、分子量マーカー（上から９７.４、６６、４５、３１、２１.５、１４.５ｋＤａを示す）、ｐＣＨＯ１導入ＣＯＳ７細胞培養上清、ｐＣＨＯＭ２導入細胞培養上清。ｐＣＨＯＭ２導入細胞培養上清に再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖ（矢印）が明らかに含まれていることを示す。
【図８】 コントロールとしてのｐＣＨＯ１／ＣＯＳ７細胞培養上清の抗体は、コントロールとしてのｐＣＯＳ１／Ｌ１２１０細胞には結合しないことを示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図９】 ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ／ＣＯＳ７細胞培養上清の抗体は、コントロールとしてのｐＣＯＳ１／Ｌ１２１０細胞には結合しないことを示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図１０】 コントロールとしてのｐＣＯＳ１／ＣＯＳ７細胞培養上清の抗体は、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に結合しないことを示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図１１】 ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ／ＣＯＳ７細胞培養上清の抗体は、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に特異的に結合することを示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図１２】 実施例５．６で示すＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡの結果を示す図であり、本発明の一本鎖Ｆｖ（ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ）の抗原結合活性を、コントロールとしてのｐＣＨＯ１／ＣＯＳ７細胞培養上清と比較して、マウスモノクローナル抗体ＭＡＢＬ−２の抗原結合に対する阻害を指標として示す図である。
【図１３】 実施例５．７のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、コントロールとしてのｐＣＯＳ１／Ｌ１２１０細胞には、コントロールとしてのｐＣＨＯ１／ＣＯＳ７細胞培養上清抗体はアポトーシスを誘起しないことを示す。
【図１４】 実施例５．７のアポトーシス誘導効果の結果を示す図であり、コントロールとしてのｐＣＯＳ１／Ｌ１２１０細胞には、ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ／ＣＯＳ７細胞培養上清抗体はアポトーシスを誘起しないことを示す。
【図１５】 実施例５．７のアポトーシス誘導効果の結果を示す図であり、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞には、コントロールとしてのｐＣＨＯ１／ＣＯＳ７細胞培養上清抗体はアポトーシスを誘起しないことを示す。
【図１６】 実施例５．７のアポトーシス誘導効果の結果を示す図であり、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に対し、ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ／ＣＯＳ７細胞培養上清抗体が特異的にアポトーシスを誘起することを示す。
【図１７】 実施例５．７のアポトーシス誘導効果の結果を示す図であり、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞には、コントロールとしてのｐＣＨＯ１／ＣＯＳ７細胞培養上清抗体はアポトーシスを誘起しないことを示す（最終濃度５０％）。
【図１８】 実施例５．７のアポトーシス誘導効果の結果を示す図であり、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に対し、ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ／ＣＯＳ７細胞培養上清抗体が特異的にアポトーシスを誘起することを示す（最終濃度５０％）。
【図１９】 実施例５．９のＣＨＯ細胞産生のＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖの精製過程において、Blue-sepharoseカラムで得られた画分をハイドロキシアパタイトカラムを用いて精製した際のクロマトグラムを示す図であり、主要なピークとして画分Ａ、画分Ｂが得られたことを示す。
【図２０】 実施例５．９の（２）で得られた画分Ａ、画分Ｂについてゲル濾過により精製した結果を示す図であり、画分Ａでは見かけ上の分子量約３６ｋＤ、画分Ｂでは同７６ｋＤの位置に主要ピークが（それぞれＡＩ及びＢＩ）が溶出したことを示す。
【図２１】 実施例５．９のＣＨＯ細胞産生のＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖの精製過程において得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した図であり、何れも分子量約３５ｋＤに単一のバンドのみであることを示す。
【図２２】 ＣＨＯ細胞産生のＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖの精製において得られた画分ＡＩ及びＢＩをゲル濾過により分析した結果を示す図であり、画分ＡＩはモノマーからなり、画分ＢＩはダイマーからなることを示す。
【図２３】 本発明の一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡを、大腸菌の菌体内にて発現させるために使用可能な発現プラスミドの一例の構造を示す。
【図２４】 実施例５．１２の大腸菌細胞産生のＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖポリペプチドの精製において、得られた粗製物をゲル濾過カラムを用いて精製した結果を示す図であり、各ピークはそれぞれ大腸菌細胞産生の一本鎖Ｆｖのモノマー、ダイマーを示す。
【図２５】 実施例５．１３のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞には、コントロールとしてのマウスＩｇＧ抗体はアポトーシスを誘起しないことを示す（最終濃度３μｇ／ｍｌ）。
【図２６】 実施例５．１３のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に対し、ＣＨＯ細胞産生のＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖダイマーが顕著にアポトーシスを誘起することを示す（最終濃度３μｇ／ｍｌ）。
【図２７】 実施例５．１３のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に対し、大腸菌細胞産生のＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖダイマーが顕著にアポトーシスを誘起することを示す（最終濃度３μｇ／ｍｌ）。
【図２８】 実施例５．１３のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞には、ＣＨＯ細胞産生のＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖモノマーのアポトーシス誘起作用がコントロールと同程度であることを示す（最終濃度３μｇ／ｍｌ）。
【図２９】 実施例５．１３のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞には、大腸菌細胞産生のＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖモノマーのアポトーシス誘起作用がコントロールと同程度であることを示す（最終濃度３μｇ／ｍｌ）。
【図３０】 実施例５．１３のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞には、コントロールとしてのマウスＩｇＧ抗体は抗ＦＬＡＧ抗体の添加によってもアポトーシスを誘起しないことを示す（最終濃度３μｇ／ｍｌ）。
【図３１】 実施例５．１３のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に対し、ＣＨＯ細胞産生のＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖモノマーが抗ＦＬＡＧ抗体の添加によって顕著にアポトーシスを誘起することを示す（最終濃度３μｇ／ｍｌ）。
【図３２】 ヒト骨髄腫細胞株ＫＰＭＭ２を移植したマウスの血清中のヒトＩｇＧ量を定量したものであり、マウスにおけるヒト骨髄腫により産生されるヒトＩｇＧの量を測定した結果を示す図であり、ｓｃＦｖ／ＣＨＯダイマーがＫＰＭＭ２細胞の増殖を非常に強く抑制していることを示す。
【図３３】 腫瘍移植後のマウスの生存日数を表しており、ｓｃＦｖ／ＣＨＯダイマー投与群において生存期間が顕著に延長されていることを示している。
【図３４】 ＭＡＢＬ−２抗体由来の２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む改変抗体［ｓｃ(Ｆｖ)2］を発現するプラスミドの一例の構造を示す。
【図３５】 ［Ｈ鎖］−［Ｌ鎖］となるようにＶ領域を連結し、且つペプチドリンカーを含まないｓｃＦｖ（ＨＬタイプ）を発現するプラスミドの一例の構造を示す。
【図３６】 ＨＬタイプのポリペプチドの構造およびペプチドリンカーのアミノ酸配列を示す。
【図３７】［Ｌ鎖］−［Ｈ鎖］となるようにＶ領域を連結し、且つペプチドリンカーを含まないｓｃＦｖ（ＬＨタイプ）を発現するプラスミドの一例の構造を示す。
【図３８】 ＬＨタイプのポリペプチドの構造およびペプチドリンカーのアミノ酸配列を示す。
【図３９】 実施例６．４におけるウェスタンブロッティングの結果を示す図であり、２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む改変抗体ｓｃ(Ｆｖ)2及び種々の長さのペプチドリンカーを有するＭＡＢＬ−２抗体ｓｃＦｖが発現していることを示す。
【図４０ａ】 実施例６．３（１）にて調製したＣＯＳ７細胞培養上清を用いたフローサイトメトリーの結果を示す図であり、種々の長さのペプチドリンカーを有するＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ及びｓｃ(Ｆｖ)2は、ヒトＩＡＰに対して高い親和性を有することを示す。
【図４０ｂ】 実施例６．３（１）にて調製したＣＯＳ７細胞培養上清を用いたフローサイトメトリーの結果を示す図であり、種々の長さのペプチドリンカーを有するＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ及びｓｃ(Ｆｖ)2は、ヒトＩＡＰに対して高い親和性を有することを示す。
【図４１ａ】 実施例６．６のアポトーシス誘導効果の結果を示す図であり、ｓｃＦｖ＜ＨＬ３，４，６，７、ＬＨ３，４，６，７＞及びｓｃ(Ｆｖ)2はｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に対して顕著な細胞死を誘導することを示す。
【図４１ｂ】 実施例６．６のアポトーシス誘導効果の結果を示す図であり、ｓｃＦｖ＜ＨＬ３，４，６，７、ＬＨ３，４，６，７＞及びｓｃ(Ｆｖ)2はｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に対して顕著な細胞死を誘導することを示す。
【図４２】 実施例６．１０の抗原結合評価の結果を示す図であり、ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー及びｓｃ(Ｆｖ)2がヒトＩＡＰに対して高い親和性を有すること示す。
【図４３】 実施例６．１１のin vitroアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー及びＭＡＢＬ２−ｓｃ(Ｆｖ)2はｈＩＡＰ／Ｌ１２１０、ＣＣＲＦ−ＣＥＭの両細胞に対して濃度依存的に細胞死を誘導することを示す。
【図４４】 ヒト骨髄腫細胞株ＫＰＭＭ２を移植したマウスにおけるヒト骨髄腫により産生される血清中のＭタンパク質の量を測定した結果を示す図であり、ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞及びｓｃ(Ｆｖ)2がＫＰＭＭ２細胞の増殖を非常に強く抑制していることを示す。
【図４５】 腫瘍移植後のマウスの生存日数を表しており、ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞投与群において生存期間が顕著に延長されていることを示している。
【図４６】 腫瘍移植後のマウスの生存日数を表しており、ｓｃ(Ｆｖ)2投与群において生存期間が顕著に延長されていることを示している。
【図４７】 １５アミノ酸からなるリンカー配列を含む再構成１２Ｂ５一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡ断片の構築方法とその構造を概略的に示す。
【図４８】 実施例７．５（１）で得られた各１２Ｂ５一本鎖Ｆｖを、ゲル濾過により精製した結果を示す図であり、ｓｃ１２Ｂ５では２つのピーク（画分Ａ，Ｂ）に分かれた結果を示す。
【図４９】 実施例７．５（２）において、各画分ＡおよびＢをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果を示す。
【図５０】 実施例７．５（２）において、各画分ＡおよびＢをＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムにより分析した結果を示し、（ａ）画分Ａでは見かけ上の分子量約４４ｋＤに、（ｂ）画分Ｂでは同２２ｋＤの位置に主要ピークが溶出されたことを示す。
【図５１】 ｓｃ１２Ｂ５及び１２Ｂ５抗体（ＩｇＧ，Ｆａｂ）のＴＰＯ様アゴニスト活性の測定結果を示し、１２Ｂ５ ＩｇＧ及び一価一本鎖Ｆｖ(ｓｃ１２Ｂ５)は、濃度依存的にＴＰＯ様のアゴニスト活性を有することを示す。
【図５２】 ｓｃ１２Ｂ５モノマー及びダイマーのＴＰＯ様アゴニスト活性の測定結果を示し、二価の抗原結合部位を持つ一本鎖Ｆｖ（ｓｃ１２Ｂ５ダイマー）は一価のｓｃ１２Ｂ５より約４００倍以上強いアゴニスト活性を示し、その強さはヒトＴＰＯと同等もしくはそれ以上であることを示す。
【図５３】 得られたｓｃ１２Ｅ１０一本鎖抗体をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーで精製した結果を示す図であり、ｓｃ１２Ｅ１０では、２つのピーク（画分Ａ，Ｂ）に分かれた結果を示す。
【図５４】 得られたｄｂ１２Ｅ１０一本鎖抗体をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーで精製した結果を示す図であり、ｄｂ１２Ｅ１０では、２つのピーク（画分Ｃ，Ｄ）に分かれた結果を示す。
【図５５】 画分Ａ，Ｂ（ｓｃ１２Ｅ１０）および画分Ｃ、Ｄ（ｄｂ１２Ｅ１０）を還元、非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果を示す。
【図５６】 画分Ａ，Ｂを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーで分析した結果を示す。（１）画分Ａでは、見かけ上の分子量４２ｋＤに（２）画分Ｂでは、同２０ｋＤの位置に、主要ピークが溶出されたことを示す。
【図５７】 画分Ｃ，Ｄを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーで分析した結果を示す。（１）画分Ｃでは、見かけ上の分子量６９ｋＤに（２）画分Ｄでは、同４１ｋＤの位置に、主要ピークが溶出されたことを示す。
【図５８】 各種１２Ｅ１０抗体分子のＭＰＬに対するアゴニスト活性を示すグラフであり、一本鎖Ｆｖ（ｓｃ１２Ｅ１０，ｄｂ１２Ｅ１０）ではＴＰＯ様のアゴニスト活性を示したのに対し、１２Ｅ１０ ＩｇＧおよび１２Ｅ１０ Ｆａｂでは全く活性が認められなかったことを示す。
【図５９】 ｓｃ１２Ｅ１０モノマーおよびダイマー、並びにｄｂ１２Ｅ１０ダイマーおよびトリマーのＭＰＬに対するアゴニスト活性を示すグラフであり、ｓｃ１２Ｅ１０ダイマー、ｄｂ１２Ｅ１０ダイマーおよびトリマーのＴＰＯ様アゴニスト活性がＴＰＯよりも強力であることを示す。

Claims (21)

  1. 同じ細胞の細胞表面分子を架橋することにより、アゴニスト活性を誘導する、同じモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ及びＬ鎖Ｖ領域を２つ含む改変抗体であって、該改変抗体は、親抗体と比較して同等以上のアゴニスト作用（ＥＤ５０値）を示し、かつ
    （ａ）１つのＨ鎖Ｖ領域及び１つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖのダイマー；または、
    （ｂ）２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖ポリペプチド、
    である、改変抗体。
  2. Ｈ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域がリンカーを介して連結されている、請求項１記載の改変抗体。
  3. リンカーが、少なくとも１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーである、請求項２に記載の改変抗体。
  4. 同じ鎖上のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は互いに連合して１つの抗原結合部位を形成していない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変抗体。
  5. 改変抗体が、さらにポリペプチド精製のためのアミノ酸配列を含むポリペプチドが付加された請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変抗体。
  6. 改変抗体が精製されたものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の改変抗体。
  7. Ｈ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域が、ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域である請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変抗体。
  8. Ｈ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域が、ヒト型化されたＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域である請求項１〜７のいずれか１項に記載の改変抗体。
  9. 前記細胞表面分子又は細胞内分子が、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、チロシンキナーゼ受容体又は核内受容体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の改変抗体。
  10. 細胞表面分子又は細胞内分子が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体、トロンボポエチン（ＴＰＯ）受容体、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）受容体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体、インターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体、インターロイキン−３（ＩＬ−３）受容体、インターロイキン−４（ＩＬ−４）受容体、インターロイキン−５（ＩＬ−５）受容体、インターロイキン−６（ＩＬ−６）受容体、インターロイキン−７（ＩＬ−７）受容体、インターロイキン−９（ＩＬ−９）受容体、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）受容体、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）受容体、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）受容体、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）受容体、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）受容体、インターフエロン−α（ＩＦＮ−α）受容体、インターフエロン−β（ＩＦＮ−β）受容体、インターフエロン−γ（ＩＦＮ−γ）受容体、成長ホルモン（ＧＨ）受容体、インスリン受容体、血液幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）受容体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体、神経成長因子（ＮＧＦ）受容体、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体、トランスフオーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）受容体、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）受容体、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）受容体、Ｎｏｔｃｈファミリー受容体、Ｅ２Ｆ、Ｅ２Ｆ／ＤＰ１又はＴＡＫ１／ＴＡＢ１である請求項１〜９のいずれか１項に記載の改変抗体。
  11. アゴニスト作用が、アポトーシス誘導、細胞増殖誘導、細胞分化誘導、細胞分裂誘導または細胞周期調節作用である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の改変抗体。
  12. 親抗体と比較して２倍以上のアゴニスト作用（ＥＤ５０値）を示す、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の改変抗体。
  13. 親抗体と比較して１０倍以上のアゴニスト作用（ＥＤ５０値）を示す、請求項１２に記載の改変抗体。
  14. 親抗体がアゴニスト作用を実質的に有さない、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の改変抗体。
  15. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の改変抗体をコードするＤＮＡ。
  16. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の改変抗体を産生する動物細胞。
  17. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の改変抗体を産生する微生物。
  18. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の改変抗体を有効成分として含む医薬。
  19. 細胞表面分子または細胞内分子を架橋することによりアゴニスト作用を示す、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ及びＬ鎖Ｖ領域を２つ含む改変抗体（ここで、該改変抗体は、親抗体と比較して同等以上のアゴニスト作用（ＥＤ５０値）を示し、かつ
    （ａ）１つのＨ鎖Ｖ領域及び１つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖのダイマー；または、
    （ｂ）２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖ポリペプチド、
    である）のスクリーニング方法であって、
    （１）該細胞表面分子または細胞内分子に特異的に結合する、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ及びＬ鎖Ｖ領域を２つ含む改変抗体を作製し、
    （２）該細胞表面分子または細胞内分子を発現している細胞に該改変抗体を作用させ、
    （３）該細胞表面分子または細胞内分子を架橋することにより該細胞に生ずるアゴニスト作用を測定する、
    工程を含むスクリーニング方法。
  20. 細胞表面分子または細胞内分子を架橋することによりアゴニスト作用を示す、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ及びＬ鎖Ｖ領域を２つ含む改変抗体（ここで、該改変抗体は、親抗体と比較して同等以上のアゴニスト作用（ＥＤ５０値）を示し、かつ
    （ａ）１つのＨ鎖Ｖ領域及び１つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖのダイマー；または、
    （ｂ）２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖ポリペプチド、
    である）のアゴニスト活性の測定方法であって、
    （１）細胞表面分子または細胞内分子に特異的に結合する、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ及びＬ鎖Ｖ領域を２つ含む改変抗体を作製し、
    （２）該細胞表面分子または細胞内分子を発現している細胞に前記改変抗体を作用させ、
    （３）該細胞表面分子または細胞内分子を架橋することにより該細胞に生ずるアゴニスト作用を測定する、
    工程を含むアゴニスト活性の測定方法
  21. 細胞表面分子または細胞内分子を架橋することによりアゴニスト作用を示す、モノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ及びＬ鎖Ｖ領域を２つ含む改変抗体（ここで、該改変抗体は、親抗体と比較して同等以上のアゴニスト作用（ＥＤ５０値）を示し、かつ
    （ａ）１つのＨ鎖Ｖ領域及び１つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖのダイマー；または、
    （ｂ）２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖ポリペプチド、
    である）の製造方法であって、
    （１）請求項１６記載の動物細胞または請求項１７記載の微生物を培養して前記改変抗体を産生し、
    （２）前記改変抗体を精製する、
    工程を含む製造方法。
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