JPWO2005056798A1 - 抗体の活性を増強させる方法 - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕2つ以上の重鎖可変領域と、2つ以上の軽鎖可変領域をリンカーで結合し、一本鎖ポリペプチドにすることにより、抗体の活性を増強させる方法、
〔2〕抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む第一のポリペプチドと、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む第二のポリペプチドをリンカーで結合することにより、抗体の活性を増強させる方法、
〔3〕抗体をsc(Fv)2にすることにより、抗体の活性を増強させる方法、
〔4〕活性がアゴニスト活性である〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の方法、
〔5〕リンカーがペプチドリンカーであることを特徴とする、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の方法、
〔6〕ペプチドリンカーの長さが5〜30アミノ酸であることを特徴とする、〔5〕に記載の方法、
〔7〕ペプチドリンカーの長さが12〜18アミノ酸であることを特徴とする、〔6〕に記載の方法、
〔8〕ペプチドリンカーの長さが15アミノ酸であることを特徴とする、〔7〕に記載の方法、
〔9〕〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の方法により、活性が増強された抗体、
〔10〕以下の工程を含む、〔9〕に記載の抗体の製造方法、
(a)2つ以上の抗体重鎖可変領域、2つ以上の抗体軽鎖可変領域、及び各可変領域を結合するペプチドリンカーをコードするDNAを作製する工程、
(b)該DNAを含むベクターを作製する工程、
(c)該ベクターを宿主細胞に導入する工程、
(d)該宿主細胞を培養する工程
〔11〕DNAが、2つの重鎖可変領域、2つの軽鎖可変領域、3つのペプチドリンカーをコードしていることを特徴とする、〔10〕に記載の製造方法、
〔12〕DNAが、重鎖可変領域、ペプチドリンカー、軽鎖可変領域、ペプチドリンカー、重鎖可変領域、ペプチドリンカー、軽鎖可変領域の順でコードしていることを特徴とする、〔11〕に記載の製造方法、に関する。
本発明の方法により、活性が増強される抗体は如何なる抗体でもよく、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体など、どのような動物由来の抗体でもよい。さらに、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体などのアミノ酸配列を置換した改変抗体でもよいし、又、各種分子を結合させた抗体修飾物、抗体断片、糖鎖改変抗体など、いかなる抗体でもよい。
又、本発明の抗体によって活性が増強される抗体は、全長抗体でもよいし、Diabodyなどの低分子化抗体でもよい。
抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む第一のポリペプチドと、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む第二のポリペプチドは、同一のポリペプチドでもよいし、異なるポリペプチドでもよい。第一のポリペプチドと第二のポリペプチドが異なる場合、同一の抗原又はエピトープを認識する抗体でもよいし、異なる抗原又はエピトープを認識する二種特異性抗体(bispecific antibody)であってもよい。
[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]
[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]
本発明においては、好ましくは、[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]の配置を有するsc(Fv)2である。
アミノ酸の置換、欠失、付加及び/又は挿入や、ヒト化、キメラ化などのアミノ酸配列の改変は、本発明の方法により活性を増強させた後に行ってもよいし、又、アミノ酸配列の改変を行った後に本発明の方法により活性を増強させてもよい。
キメラ抗体は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体などである。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体V領域をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。
CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい(Sato,K.et al.,Cancer Res.(1993)53,851−856)。
一般的に、キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびC領域とからなる。
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly)n
[nは1以上の整数である]等を挙げることができる。
また本発明は、上記方法により活性が増強された抗体も提供する。
(a)2つ以上の抗体重鎖可変領域、2つ以上の抗体軽鎖可変領域、及び各可変領域を結合するペプチドリンカーをコードするDNAを作製する工程、
(b)該DNAを含むベクターを作製する工程、
(c)該ベクターを宿主細胞に導入する工程、
(d)該宿主細胞を培養する工程
この方法においてはまず、2つ以上の抗体重鎖可変領域、2つ以上の抗体軽鎖可変領域、及び各可変領域を結合するペプチドリンカーをコードするDNAを作製する。このようなDNAとしては、例えば2つの重鎖可変領域(VH)、2つの軽鎖可変領域(VL)、3つのペプチドリンカーをコードしているDNAが挙げられ、好ましくはsc(Fv)2が挙げられる。
[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]
[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]
本発明においては、[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]の配置が好ましい。
ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌(例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue)などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子(例えば、なんらかの薬剤(アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール)により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR−Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM−T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌(E.coli)、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
分化抗原には、
CD1,CD2,CD3,CD4,CD5,CD6,CD7,CD8,CD10,CD11a,CD11b,CD11c,CD13,CD14,CD15s,CD16,CD18,CD19,CD20,CD21,CD23,CD25,CD28,CD29,CD30,CD32,CD33,CD34,CD35,CD38,CD40,CD41a,CD41b,CD42a,CD42b,CD43,CD44,CD45,CD45RO,CD48,CD49a,CD49b,CD49c,CD49d,CD49e,CD49f,CD51,CD54,CD55,CD56,CD57,CD58,CD61,CD62E,CD62L,CD62P,CD64,CD69,CD71,CD73,CD95,CD102,CD106,CD122,CD126,CDw130などが含まれる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
1.1 Mpl発現BaF3細胞株の樹立
TPO依存増殖性細胞株を得るために、全長Mpl遺伝子を発現するBaF3細胞株の樹立を行った。全長ヒトMpl cDNA(Palaciosら、Cell 1985;41:727−734)(GenBank#NM_005373)をPCRにより増幅し、pCHOI(Hirataら、FEBS Letter 1994;356:244−248)のDHFR遺伝子発現部位を除去し、HEF−VH−gγ1(Satoら、Mol Immunol.1994;31:371−381)のNeomycin耐性遺伝子発現部位を挿入した発現ベクターpCOS2にクローニングし、pCOS2−hMplfullを構築した。また、カニクイザル骨髄細胞から抽出したTotal RNAからSMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech社製)を用いて、カニクイザルMpl cDNA(配列番号:1、該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:2)をクローニングした。得られたカニクイザルcDNAをpCOS2に挿入し、pCOS2−monkeyMplfullを構築した。
Flow Cytometryを用いた結合活性評価用の細胞株を得るために、全長Mpl遺伝子を発現するCHO細胞株の樹立を行った。はじめに、pCXN2(Niwaら、Gene 1991;108:193−199)のHindIII部位にpCHOIのDHFR遺伝子発現部位を挿入して、発現ベクターpCXND3を作製した。pCOS2−hMplfull、pCOS2−monkeyMplfullを鋳型にして、His−tag配列を含むPrimerを用いてPCRにより増幅した各Mpl遺伝子をpCXND3にクローニングし、pCXND3−hMpl−HisおよびpCXND3−monkey Mpl−Hisを構築した。
可溶型ヒトMplタンパク質を調製するため、昆虫細胞Sf9細胞で分泌産生する発現系を以下のように構築した。ヒトMplの細胞外領域(Gln26からTrp491)の下流にFLAGタグを付加した遺伝子を作製し、pBACSurf−1 Transfer Plasmid(Novagen社製)のPstI−SmaI部位に挿入し、pBACSurf1−hMpl−FLAGを作製した。続いて、Bac−N−Blue Transfection Kit(Invitrogen)を用いて、4μgのpBACSurf1−hMpl−FLAGをSf9細胞に導入した。培養3日後に培養上清を回収し、プラークアッセイにより組換えウイルスを単離した。ウイルスストックを調製後にSf9細胞に感染させて培養上清を回収した。
ヒトMpl−IgG Fc融合タンパク質遺伝子はBennettらの方法(Bennettら、J.Biol.Chem.1991;266:23060−23067)に従って作製した。ヒトMplの細胞外領域(Gln26からTrp491)をコードする塩基配列をヒトIgG−γ1のFc領域(Asp216よりの下流の領域)をコードする塩基配列に連結し、連結部にFusion LinkerとしてBstEII配列(アミノ酸Val−Thr)を付加した。シグナル配列は、ヒトIgG H鎖可変領域のシグナルペプチド19アミノ酸を使用した。得られたヒトMpl−IgG Fc融合タンパク質遺伝子をpCXND3にクローニングし、pCXND3−hMpl−Fcを構築した。
MRL/MpJUmmCrj−lpr/lprマウス(以下、MRL/lprマウス、日本チャールス・リバーより購入)を用いて、8週令より免疫を開始した。初回免疫は100μg/匹のshMPL−FLAGにフロイント完全アジュバント(H37 Ra、ベクトン・ディッキンソン社製)を加え、エマルジョン化したものを皮下に投与した。追加免疫は50μg/匹のshMPL−FLAGにフロイント不完全アジュバント(ベクトン・ディッキンソン社製)を加え、エマルジョン化したものを皮下に投与した合計6回免疫を行ったマウス3匹に対し、50μg/匹のshMPL−FLAGを尾静脈内投与することにより最終免疫を行った。マウスミエローマ細胞P3−X63Ag8U1(P3U1、ATCCより購入)とマウス脾臓細胞を混合し、Polyethylene Glycol 1500(Roche Diagnostics社製)を加えながら混合することにより細胞融合を行った。翌日よりHAT培地を用いて選抜を行い、培養上清を用いてshMpl−FLAGまたはhMpl−Fcを固相化したイムノプレートを用いたELISAおよびBaF3−hMplを用いた細胞増殖活性を指標としたスクリーニングを実施した。陽性クローンについて、限界希釈法によりモノクローン化した後に、拡大培養を行い、培養上清を回収した。この方法により、抗ヒトMpl抗体を産生するハイブリドーマVB22B,VB16,VB140,VB45Bを取得した。
抗体濃度はヤギ抗マウスIgG(gamma)(ZYMED社製)とアルカリフォスファターゼ−ヤギ抗マウスIgG(gamma)(ZYMED社製)を用いたマウスIgGサンドイッチELISAを行い、アイソタイプの等しい市販抗体をスタンダードにして、GraphPad Prism(GraphPad Software,USA)を用いて検量線を作成し、抗体濃度の換算を行った。
ハイブリドーマの培養上清を用いて、以下のように抗ヒトMpl抗体を精製した。培養上清をHiTrap proteinG HPカラム(Amersham Biosciences社製)に吸着させた後に、0.1M Glycine−HCl(pH2.7)を用いて溶出した。溶出後、直ちに1M Tris−Cl(pH9.0)により直ちに中和し、PBSで一昼夜透析を行い、バッファー置換を行った。
以下に抗ヒトMpl抗体VB22Bの一本鎖抗体作製例について示す。
2.1 抗ヒトMpl抗体可変領域のクローニング
抗ヒトMpl抗体を産生するハイブリドーマより抽出したTotal RNAを用いて、RT−PCR法によって増幅した。Total RNAは、RNeasy Plant Mini Kits(QIAGEN社製)を用いて1x107細胞のハイブリドーマより抽出した。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、
5μLの10×Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix
(以上の成分はいずれもCLONTECH社製)
2.5μLの逆転写反応産物、
10pmolの合成オリゴヌクレオチドMHC−IgG2bまたはkappa
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間、
94℃/5秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、70℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復、
94℃/5秒間、68℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを25回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
5アミノ酸からなるリンカー配列を用いたVB22B一本鎖Fv(以下、VB22B Diabody)をコードする遺伝子は、VB22B−VHをコードする遺伝子の3’末端およびVB22B−VLをコードする遺伝子の5’末端に(Gly4Ser)1から成るリンカーをコードする塩基配列を付加させた遺伝子について、それぞれPCR法を用いて増幅し、連結することにより構築した。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×PCR Buffer、
0.4mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
2.5ユニットのDNAポリメラーゼTaKaRa Ex Taq
(以上の成分はいずれも宝酒造社製)、
10ngのVB22B−VHまたはVB22B−VL遺伝子を含むpGEM−T Easyベクター、
10pmolの合成オリゴヌクレオチド70・115HF、33・115HRまたは33・115LF、33・115LR
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間、
94℃/15秒間、72℃/2分間のサイクルを5回反復
94℃/15秒間、70℃/2分間のサイクルを5回反復、
94℃/15秒間、68℃/2分間のサイクルを28回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×PCR Buffer、
0.4mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
2.5ユニットのDNAポリメラーゼTaKaRa Ex Taq
(以上の成分はいずれも宝酒造社製)、
1μLの第一PCR産物(2種類)、
10pmolの合成オリゴヌクレオチド70・115HF、33・115LR
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間、
94℃/15秒間、72℃/2分間のサイクルを5回反復
94℃/15秒間、70℃/2分間のサイクルを5回反復、
94℃/15秒間、68℃/2分間のサイクルを28回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
VB22B由来の2つのH鎖可変領域および2つのL鎖可変領域を含む改変抗体[sc(Fv)2]を発現するプラスミドを作製するために、前述のpCXND3−VB22B dbを用いて以下のようにPCR法により修飾した。sc(Fv)2遺伝子の構築過程について、図2に示した。
VB22B−VHの後方プライマーsc−rL15(プライマーB,配列番号:15)は、VB22B−VHのC末端をコードするDNAにハイブリダイズし、かつ(Gly4Ser)3から成るリンカーをコードする塩基配列ならびにVB22B−VLのN末端をコードするDNAにハイブリダイズする塩基配列を有するように設計した。VB22B−VLの前方プライマーsc−fL15(プライマーC,配列番号:16)は、VB22B−VLのN末端をコードする塩基配列ならびに(Gly4Ser)3から成るリンカーをコードする塩基配列、VB22B−VHのC末端をコードする塩基配列を有するように設計した。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×PCR Buffer、
0.4mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
2.5ユニットのDNAポリメラーゼTaKaRa Ex Taq
(以上の成分はいずれも宝酒造社製)、
10ngのpCXND3−VB22B db、
10pmolの合成オリゴヌクレオチドVB22B−fpvu、sc−rL15またはsc−fL15、33・115LR(プライマーD)
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間、
94℃/15秒間、72℃/2分間のサイクルを5回反復
94℃/15秒間、70℃/2分間のサイクルを5回反復、
94℃/15秒間、68℃/2分間のサイクルを28回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×PCR Buffer、
0.4mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
2.5ユニットのDNAポリメラーゼTaKaRa Ex Taq
(以上の成分はいずれも宝酒造社製)、
1μLの第一PCR産物(2種類)、
10pmolの合成オリゴヌクレオチド70・115HF、33・115LR
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間、
94℃/15秒間、72℃/2分間のサイクルを5回反復
94℃/15秒間、70℃/2分間のサイクルを5回反復、
94℃/15秒間、68℃/2分間のサイクルを28回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×PCR Buffer、
0.4mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
2.5ユニットのDNAポリメラーゼTaKaRa Ex Taq
(以上の成分はいずれも宝酒造社製)、
10μgのpBacPAK9−scVB22B、
10pmolの合成オリゴヌクレオチドFv2−f、Fv2−r
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間、
94℃/15秒間、72℃/2分間のサイクルを5回反復
94℃/15秒間、70℃/2分間のサイクルを5回反復、
94℃/15秒間、68℃/2分間のサイクルを28回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
CHO−DG44細胞を用いた一本鎖抗体の安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。Gene PulserII(BioRad社製)を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。発現ベクター(25μg)とPBSに懸濁したCHO−DG44細胞(1×107細胞/mL)の0.75mLを混合したものを氷上で10分間冷却し、キュベットに移した後に1.5kV、25μFDの容量にてパルスを与えた。室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、500μg/mL Geneticin(Invitrogen社製)を含むCHO−S−SFMII培地(Invitrogen社製)に加えて選抜し、発現CHO細胞株を樹立した。VB22B sc(Fv)2は、この方法で安定発現細胞株およびその培養上清を調製した。
COS7細胞あるいはCHO細胞に一過性発現させた抗ヒトMpl一本鎖抗体の培養上清中の濃度は、表面プラズモン共鳴を利用して測定した。すなわちBIAcore2000(Biacore社製)にSensor Chip CM5(Biacore社製)をセットし、ANTI−FLAG M2 Monoclonal Antibody(SIGMA−ALDRICH社製)を結合した。流速5mL/secで適濃度のサンプルを流し、50mMジエチルアミンを流して結合した抗体を解離させた。サンプルを流したときの質量変化を測定し、標準品の質量変化に基づいて作成した検量線を用いて、濃度を算出した。Diabodyについての標準品は、db12E10(特願2001−27734参照)を使用し、sc(Fv)2についての標準品は同じ遺伝子構造を持つ12E10sc(Fv)2を使用した。
VB22B Diabody発現COS7細胞あるいはCHO細胞の培養上清を、50mM Tris−HCl(pH7.4),150mM NaCl,0.05%Tween20で平衡化したAnti−Flag M2 Affinity Gel(SIGMA−ALDRICH社製)カラムに吸着させ、100mM Glycine−HCl(pH3.5)で溶出させた。溶出画分は、直ちに1M Tris−HCl(pH8.0)で中和を行い、HiLoad26/60Superdex200pg(Amersham−Bioscience社製)カラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマトグラフィーのバッファーは、PBS、0.01%Tween20を使用した。
各精製ステップにおいて、Diabodyおよびsc(Fv)2の確認は、SDS−PAGEおよび抗Flag抗体(SIGMA−ALDLICH社)を用いたWestern Blottingを用いて行った。それぞれ、分取したピーク画分をLaemliの方法に準じて電気泳動し、クマシーブリリアントブルーで染色した結果、Diabodyでは、見かけ上の分子量約29kDaに、またsc(Fv)2では、見かけ上の分子量約55kDaに、それぞれの単一のバンドが検出された。
TPO依存性増殖を示すBaF3−human Mplを用いてTPO用アゴニスト活性を評価した。各細胞を1%Fetal Bovine Serum(Invitrogen社製)を含むRPMI1640(Invitrogen社製)で2回洗浄した後、4x105cells/mLとなるように10% Fetal Bovine Serumを含むRPMI1640に懸濁し、60μL/wellで96well plateに分注した。rhTPO(R&D社製)、COS7培養上清または精製品の濃度を振り、各wellに40μL加え、37℃、5%CO2条件下で、24時間培養した。10μL/wellでWST−8試薬(Cell Count Reagent SF、ナカライテスク社製)を加え、直後にBenchmark Plusを用いて450nmの吸光度(対照655nm)を測定し、2時間培養後に、再度450nmの吸光度(対照655nm)を測定した。WST−8試薬は生細胞数に応じて450nmの発色反応を呈することから、2時間の吸光度変化を指標にTPO様アゴニスト活性を評価した。また、GraphPad Prismを用いてEC50値を算出した。
Claims (12)
- 2つ以上の重鎖可変領域と、2つ以上の軽鎖可変領域をリンカーで結合し、一本鎖ポリペプチドにすることにより、抗体の活性を増強させる方法。
- 抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む第一のポリペプチドと、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む第二のポリペプチドをリンカーで結合することにより、抗体の活性を増強させる方法。
- 抗体をsc(Fv)2にすることにより、抗体の活性を増強させる方法。
- 活性がアゴニスト活性である請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- リンカーがペプチドリンカーであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- ペプチドリンカーの長さが5〜30アミノ酸であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- ペプチドリンカーの長さが12〜18アミノ酸であることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- ペプチドリンカーの長さが15アミノ酸であることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の方法により、活性が増強された抗体。
- 以下の工程を含む、請求項9に記載の抗体の製造方法。
(a)2つ以上の抗体重鎖可変領域、2つ以上の抗体軽鎖可変領域、及び各可変領域を結合するペプチドリンカーをコードするDNAを作製する工程、
(b)該DNAを含むベクターを作製する工程、
(c)該ベクターを宿主細胞に導入する工程、
(d)該宿主細胞を培養する工程 - DNAが、2つの重鎖可変領域、2つの軽鎖可変領域、3つのペプチドリンカーをコードしていることを特徴とする、請求項10に記載の製造方法。
- DNAが、重鎖可変領域、ペプチドリンカー、軽鎖可変領域、ペプチドリンカー、重鎖可変領域、ペプチドリンカー、軽鎖可変領域の順でコードしていることを特徴とする、請求項11に記載の製造方法。
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