JP4708190B2

JP4708190B2 - 抗Ｍｐｌ抗体

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Publication number: JP4708190B2
Application number: JP2005516202A
Authority: JP
Inventors: 浩行角田; 清孝中野; 哲郎織田; 政幸土屋; 裕一平田
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2003-12-12
Filing date: 2004-12-10
Publication date: 2011-06-22
Anticipated expiration: 2024-12-10
Also published as: JPWO2005056604A1; US20110059488A1; CA2548567A1; US7993642B2; IL175710A0; US8008073B2; BRPI0417077A; AU2004297111A1; NO20063224L; KR20060107572A; US20060222643A1; WO2005056604A1; TW200530269A; MXPA06006289A; EP1616881A4; EP1616881A1

Description

本発明は、抗Ｍｐｌ抗体に関する。

トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＴＰＯ）は、血小板の前駆細胞である巨核球が、造血幹細胞から分化して血小板へと分化成熟することを促進する因子であり、血小板数の調節に主要な役割を担うサイトカインである。ＴＰＯは、３５３アミノ酸からなるＴＰＯ前駆体から切り出されて活性体となる。
ＭｐｌはＴＰＯの受容体であり、ヒトＭｐｌ分子は５７２および６３５アミノ酸からなる２つの型が知られている。ヒトＭｐｌの遺伝子配列は既に解析されている（非特許文献１又は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＮＭ＿００５３７３参照）。
サイトカイン受容体の多くは、リガンドの結合により受容体が２量体化し、シグナルが細胞内に伝達される。ＴＰＯにおいても、その特異的レセプターであるＭＰＬと結合し、受容体を２量体化することにより、細胞内に情報を伝え、生理作用を示すことが報告されている（非特許文献２参照）。

このような性質をもつ受容体に結合する抗体の中で、アゴニスト活性を示す抗体が存在することが報告されている。
例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体に対する抗体がエリスロポエチン機能を代替することが報告されており、この抗体を一価（Ｆａｂ）にするとＥＰＯ受容体への結合能を維持したまま、シグナル伝達能を失うことから、二価の結合によるエリスロポエチン受容体の二量体形成が必要と考えられる（非特許文献３参照）。

又、Ｍｐｌに結合し、ＴＰＯアゴニスト活性を有する抗体も報告されている（非特許文献４および５参照）。これは、ＭＰＬに関しても２価である抗体の結合によるレセプターの２量体化の誘導を示唆している。
一方で、ＴＰＯアゴニスト活性を示す一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が報告されている（特許文献１参照）。しかしながら、ｓｃＦｖがＴＰＯアゴニスト活性を示す機序として、ｓｃＦｖの一部が二量体（Ｄｉａｂｏｄｙ）化し、そのＤｉａｂｏｄｙが活性本体であることが明らかになっている（特許文献２〜４参照）。

米国特許第６３４２２２０号国際公開第０１／７９４９４号国際公開第０２／３３０７２号国際公開第０２／３３０７３号Ｐａｌａｃｉｏｓら著、Ｃｅｌｌ、１９８５年、Ｖｏｌ．４１、ｐ．７２７−７３４Ｓｏｕｙｒｉら著、Ｃｅｌｌ、１９９０年、Ｖｏｌ．６３、ｐ．１１３７−１１４７ＥｌｌｉｏｔｔＳら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６年、Ｖｏｌ．２７１（４０）、ｐ．２４６９１−２４６９７Ａｂｅら著、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９９８年、Ｖｏｌ．６１、ｐ．７３−７８ＢｉｊｉａＤｅｎｇら著、Ｂｌｏｏｄ、１９９８年、Ｖｏｌ．９２、ｐ．１９８１−１９８８

本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的はＴＰＯアゴニスト活性を有する新規な抗Ｍｐｌ抗体を提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行なった。本発明者らは、抗ヒトＭｐｌ抗体ＶＢ２２Ｂを取得・精製し、遺伝子工学的手法を用いて一本鎖抗体の発現系を構築した。具体的には、まず抗ヒトＭｐｌ抗体の可変領域をクローニングし、抗ヒトＭｐｌ抗体Ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターｐＣＸＮＤ３−ＶＢ２２Ｂｄｂを作製した。さらに該ベクターｐＣＸＮＤ３−ＶＢ２２Ｂｄｂを用いて、抗ヒトＭｐｌ抗体ｓｃ（Ｆｖ）２発現ベクターｐＣＸＮＤ３−ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２を作製した。この発現ベクターｐＣＸＮＤ３−ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２をＣＨＯ−ＤＧ４４細胞で発現させ、培養上清から抗ヒトＭｐｌｓｃ（Ｆｖ）２を精製した。なお対照として、上記ベクターｐＣＸＮＤ３−ＶＢ２２ＢｄｂをＣＯＳ７細胞で一過性発現させ、培養上清よりＶＢ２２ＢＤｉａｂｏｄｙを精製した。

また、ＶＢ２２ＢＤｉａｂｏｄｙおよびＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２のＴＰＯ様アゴニスト活性を評価したところ、ＶＢ２２ＢＩｇＧに対して、ＶＢ２２ＢＤｉａｂｏｄｙおよびＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２は高いアゴニスト活性を示し、天然リガンドであるｈｕｍａｎＴＰＯと同等以上の活性を示すことが分かった。
また、本発明者らは５種類のヒト化ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２を作製することに成功した。また、ヒト化することによるＴＰＯ様アゴニスト活性の変化は見られないことが分かった。

本発明はより具体的には、以下の〔１〕〜〔３８〕を提供するものである。
〔１〕２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域を含み、ＴＰＯ受容体（Ｍｐｌ）への結合活性を有する一本鎖ポリペプチドであることを特徴とする抗体。
〔２〕２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域が、一本鎖ポリペプチドのＮ末端側を基点として重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖可変領域の順に並んでいることを特徴とする、〔１〕に記載の抗体。
〔３〕２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域がリンカーで結合されていることを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載の抗体。
〔４〕リンカーが１５アミノ酸であることを特徴とする、〔３〕に記載の抗体。
〔５〕Ｍｐｌに結合するキメラ抗体。
〔６〕ヒト化抗体である、〔５〕に記載の抗体。
〔７〕低分子化抗体である、〔５〕または〔６〕に記載の抗体。
〔８〕可溶型Ｍｐｌに結合する抗体。
〔９〕ヒトＭｐｌ及びサルＭｐｌに結合する抗体。
〔１０〕ヒトＭｐｌ及びサルＭｐｌに対してアゴニスト活性を有する抗体。
〔１１〕可溶型Ｍｐｌへの結合活性がＫＤ＝１０^−６Ｍ以下である抗体。
〔１２〕可溶型Ｍｐｌへの結合活性がＫＤ＝１０^−７Ｍ以下である抗体。
〔１３〕ＴＰＯアゴニスト活性がＥＣ５０＝１００ｎＭ以下である抗体。
〔１４〕ＴＰＯアゴニスト活性がＥＣ５０＝３０ｎＭ以下である抗体。
〔１５〕ＴＰＯアゴニスト活性がＥＣ５０＝１０ｎＭ以下である抗体。
〔１６〕以下の（１）〜（１７）のいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域を含む抗体。
（１）配列番号：３、４、５
（２）配列番号：６、７、８
（３）配列番号：９、１０、１１
（４）配列番号：１５、１６、１７
（５）配列番号：１８、１９、２０
（６）配列番号：２１、２２、２３
（７）配列番号：２４、２５、２６
（８）配列番号：２７、２８、２９
（９）配列番号：３０、３１、３２
（１０）配列番号：３３、３４、３５
（１１）配列番号：３６、３７、３８
（１２）配列番号：３９、４０、４１
（１３）配列番号：４２、４３、４４
（１４）配列番号：４８、４９、５０
（１５）配列番号：５１、５２、５３
（１６）配列番号：５４、５５、５６
（１７）配列番号：５７、５８、５９
〔１７〕以下の（１）〜（１０）のいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
（１）配列番号：６０、６１、６２
（２）配列番号：６３、６４、６５
（３）配列番号：７８、７９、８０
（４）配列番号：８４、８５、８６
（５）配列番号：９３、９４、９５
（６）配列番号：９６、９７、９８
（７）配列番号：１０２、１０３、１０４
（８）配列番号：１０８、１０９、１１０
（９）配列番号：１１１、１１２、１１３
（１０）配列番号：１１４、１１５、１１６
〔１８〕以下の（１）〜（１８）のいずれかに記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体。
（１）配列番号：３、４、５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：６０、６１、６２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
（２）配列番号：６、７、８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：６３、６４、６５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
（３）配列番号：９、１０、１１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：６３、６４、６５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
（４）配列番号：１５、１６、１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：６３、６４、６５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
（５）配列番号：１８、１９、２０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：６３、６４、６５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
（６）配列番号：２１、２２、２３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：７８、７９、８０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
（７）配列番号：２４、２５、２６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：６３、６４、６５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
（８）配列番号：２７、２８、２９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：８４、８５、８６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
（９）配列番号：３０、３１、３２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：６３、６４、６５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
（１０）配列番号：３３、３４、３５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：６３、６４、６５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
（１１）配列番号：３６、３７、３８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：９３、９４、９５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
（１２）配列番号：３９、４０、４１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：９６、９７、９８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
（１３）配列番号：４２、４３、４４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：７８、７９、８０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
（１４）配列番号：４５、４６、４７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：１０２、１０３、１０４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
（１５）配列番号：４８、４９、５０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：６３、６４、６５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
（１６）配列番号：５１、５２、５３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：１０８、１０９、１１０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
（１７）配列番号：５４、５５、５６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：１１１、１１２、１１３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
（１８）配列番号：５７、５８、５９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：１１４、１１５、１１６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
〔１９〕配列番号：１１８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体。
〔２０〕配列番号：１２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
〔２１〕配列番号：１１８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号：１２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
〔２２〕配列番号：１２２または２６４に記載のアミノ酸配列を有する抗体。
〔２３〕以下の（１）〜（５）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する重鎖可変領域を含む抗体。
（１）配列番号：２３０、２３２、２３４、２３６
（２）配列番号：２６５、２６７、２６９、２７１
（３）配列番号：２７９、２８１、２８３、２８５
（４）配列番号：２９８、２９９、３００、３０１
（５）配列番号：２９８、２９９、３０６、３０１
〔２４〕以下の（１）〜（４）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
（１）配列番号：２３９、２４１、２４３、２４５（２）配列番号：２７２、２７４、２７６、２７８
（３）配列番号：３０２、３０３、３０４、３０５
（４）配列番号：３０２、３０７、３０８、３０５
〔２５〕以下の（１）〜（５）のいずれかに記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体。
（１）配列番号：２３０、２３２、２３４、２３６に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する重鎖可変領域、および配列番号：２３９、２４１、２４３、２４５に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する軽鎖可変領域
（２）配列番号：２６５、２６７、２６９、２７１に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する重鎖可変領域、および配列番号：２７２、２７４、２７６、２７８に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する軽鎖可変領域
（３）配列番号：２７９、２８１、２８３、２８５に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する重鎖可変領域、および配列番号：２７２、２７４、２７６、２７８に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する軽鎖可変領域
（４）配列番号：２９８、２９９、３００、３０１に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する重鎖可変領域、および配列番号：３０２、３０３、３０４、３０５に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する軽鎖可変領域
（５）配列番号：２９８、２９９、３０６、３０１に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する重鎖可変領域、および配列番号：３０２、３０７、３０８、３０５に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する軽鎖可変領域
〔２６〕配列番号：２２９、２５６、２６２、２８９または２９５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体。
〔２７〕配列番号：２３８、２５８、２９１または２９７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
〔２８〕以下の（１）〜（５）のいずれかに記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体。
（１）配列番号：２２９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号：２３８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
（２）配列番号：２５６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号：２５８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
（３）配列番号：２６２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号：２５８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
（４）配列番号：２８９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号：２９１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
（５）配列番号：２９５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号：２９７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
〔２９〕配列番号：２、２５４、２６０、２８７または２９３に記載のアミノ酸配列を有する抗体。
〔３０〕〔１６〕〜〔２９〕のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入され、かつ〔１６〕〜〔２９〕のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
〔３１〕〔１６〕〜〔３０〕のいずれかに記載の抗体が認識するエピトープを認識する抗体。
〔３２〕ヒトＭｐｌの２６番目から２７４番目のアミノ酸部位を認識する抗体。
〔３３〕ＴＰＯアゴニスト活性を有する、〔１〕〜〔３２〕のいずれかに記載の抗体。
〔３４〕〔１〕〜〔３３〕のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
〔３５〕〔３４〕に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ〔１〕〜〔３３〕のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするポリヌクレオチド。
〔３６〕〔３４〕または〔３５〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔３７〕〔３４〕または〔３５〕に記載のポリヌクレオチドまたは〔３６〕に記載のベクターを保持する宿主細胞。
〔３８〕〔１〕〜〔３３〕のいずれかに記載の抗体を含有する、医薬組成物。

［図１］図１は、一本鎖抗体ｓｃ（Ｆｖ）２の作製過程を示す図である。
［図２］図２は、Ｍｐｌ発現ＣＨＯ細胞株を用いたＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２の結合活性評価の結果を示すグラフである。ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２精製品を使用した。
［図３］図３は、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌを用いたＶＢ２２Ｂ抗体のアゴニスト活性評価の結果を示すグラフである。
［図４］図４は、ＢａＦ３−ｍｏｎｋｅｙＭｐｌを用いたＶＢ２２Ｂ抗体のアゴニスト活性評価の結果を示すグラフである。
［図５］図５は、Ｍ−０７ｅを用いたＶＢ２２Ｂ抗体のアゴニスト活性評価の結果を示すグラフである。
［図６］図６は、低分子化により高いアゴニスト活性を示す抗ヒトＭｐｌ抗体のアミノ酸配列（Ｈ鎖）を示す図である。
［図７］図７は、低分子化により高いアゴニスト活性を示す抗ヒトＭｐｌ抗体のアミノ酸配列（Ｌ鎖）を示す図である。
［図８］図８は、Ｍｐｌ発現ＣＨＯ細胞株を用いたＡＢ３１７Ｄｉａｂｏｄｙの結合活性評価の結果を示すグラフである。ＶＢ２２ＢＤｉａｂｏｄｙ（実線）、ＡＢ３１７Ｄｉａｂｏｄｙ（破線）ともにＣＯＳ７培養上清を使用した。
［図９］図９は、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌを用いたＡＢ３２４ＤｉａｂｏｄｙおよびＡＢ３１７Ｄｉａｂｏｄｙのアゴニスト活性評価の結果を示すグラフである。
［図１０］図１０は、ＢａＦ３−ｍｏｎｋｅｙＭｐｌを用いたＡＢ３２４ＤｉａｂｏｄｙおよびＡＢ３１７Ｄｉａｂｏｄｙのアゴニスト活性評価の結果を示すグラフである。
［図１１］図１１は、ＢａＦ３−ｍｏｕｓｅＭｐｌを用いたＡＢ３２４ＤｉａｂｏｄｙおよびＡＢ３１７Ｄｉａｂｏｄｙのアゴニスト活性評価の結果を示すグラフである。
［図１２］図１２は、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌ細胞におけるＤｉａｂｏｄｙのアゴニスト活性を示す図である。縦軸は、Ｏ．Ｄ．４５０／６５５ｎｍを示し、横軸は濃度を示す。
［図１３］図１３は、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌ（Ｇ３０５Ｃ）細胞におけるＤｉａｂｏｄｙのアゴニスト活性を示す図である。縦軸は、Ｏ．Ｄ．４５０／６５５ｎｍを示し、横軸は濃度を示す。
［図１４］図１４は、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌ細胞におけるＴＡ１３６ｄｂ、ＴＡ１３６ｓｃ（Ｆｖ）２のアゴニスト活性を示す図である。縦軸はＯ．Ｄ．４５０／６５５ｎｍを示し、横軸は濃度を示す。
［図１５］図１５は、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌ（Ｇ３０５Ｃ）細胞におけるＴＡ１３６ｄｂ、ＴＡ１３６ｓｃ（Ｆｖ）２のアゴニスト活性を示す図である。縦軸はＯ．Ｄ．４５０／６５５ｎｍを示し、横軸は濃度を示す。
［図１６］図１６は、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌ（Ｃ７６９Ｔ）細胞におけるＴＡ１３６ｄｂ、ＴＡ１３６ｓｃ（Ｆｖ）２のアゴニスト活性を示す図である。縦軸はＯ．Ｄ．４５０／６５５ｎｍを示し、横軸は濃度を示す。
［図１７］図１７は、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌ（Ｃ８２３Ａ）細胞におけるＴＡ１３６ｄｂ、ＴＡ１３６ｓｃ（Ｆｖ）２のアゴニスト活性を示す図である。縦軸はＯ．Ｄ．４５０／６５５ｎｍを示し、横軸は濃度を示す。
［図１８］図１８は、ヒト化重鎖配列（ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚ、ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅ、ｈＶＢ２２Ｂｅ、ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４およびｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５：ＶＨ）およびヒト化軽鎖配列（ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚ、ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅ、ｈＶＢ２２Ｂｅ、ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４およびｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５：ＶＬ）、ならびにＦＲおよびＣＤＲの対応について示す図である。
［図１９］図１９は、マウス型ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２およびｈＶＢ２２Ｂｅｓｃ（Ｆｖ）２、ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅｓｃ（ＦＶ）２を用いて、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌでのＴＰＯ様アゴニスト活性を評価した結果を示す図である。縦軸は吸光度（４５０ｎｍ／６５５ｎｍ）を示し、横軸は濃度を示す。
［図２０］図２０は、マウス型ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２およびｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚｓｃ（Ｆｖ）２、ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ｓｃ（Ｆｖ）２を用いて、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌでのＴＰＯ様アゴニスト活性を評価した結果をに示す図である。縦軸は吸光度（４５０ｎｍ／６５５ｎｍ）を示し、横軸は濃度を示す。
［図２１］図２１は、マウス型ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２およびｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ｓｃ（Ｆｖ）２を用いて、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌでのＴＰＯ様アゴニスト活性を評価した結果を示す図である。縦軸は吸光度（４５０ｎｍ／６５５ｎｍ）を示し、横軸は濃度を示す。

本発明は、ＴＰＯ受容体（Ｍｐｌ）に結合する抗体を提供する。
本発明の抗体には、低分子化された抗体、ヒト化抗体やキメラ化抗体などのアミノ酸配列が改変された抗体、他の分子（例えば、ポリエチレングリコールなどの高分子等）が結合した修飾抗体、糖鎖が改変された抗体、など如何なる抗体も含まれる。

本発明のＭｐｌは、変異受容体であっても構わない。本発明において変異受容体とは、通常、５０％未満の頻度で存在する受容体であり、好ましくは２０％未満の頻度で存在する受容体であり、さらに好ましくは１０％未満の頻度で存在する受容体であり、特に好ましくは１％未満の頻度で存在する受容体である。頻度は通常、任意に抽出された被験者において計算された頻度が用いられるが、国や地域、性別などにより頻度に偏りがある場合もあるので、例えば、日本、アメリカ、欧州などのように国や地域を限定して頻度を算出したり、性別を限定して頻度を算出するなどしてもよい。又、１つの受容体について変異が複数個所に存在する場合には、複数の個所を組み合わせて頻度を算出してもよいし、１つの変異個所に絞って頻度を算出してもよい。変異受容体の判断は上述のように頻度で行うことが好ましいが、例えば、シグナル伝達能力等で変異受容体の判断を行うことも可能である。具体的には、例えば、２つの異なる受容体が存在する場合、天然リガンドが結合した際にシグナル伝達が強い方を非変異受容体とし、シグナル伝達が弱い方を変異受容体としてもよい。

本発明の変異受容体の一つの態様としては、疾患の発症と関連している受容体を挙げることができる。変異受容体が疾患の発症と関連するとは、天然のリガンドに対する反応性が失われることが一因となり、疾患の発症が誘発されることをいう。本発明においては、変異受容体は疾患の発症の一因を担っていればよく、変異受容体が疾患の発症の全ての原因である必要はない。現在までに変異受容体と疾患の発症の関連については多くの報告があるが、既に報告されている関連以外にも、変異受容体が疾患の発症と関連するか否かは統計的解析方法（例えば、相関解析など）により確認することも可能である。相関解析はケースコントロール研究とも言われ、当業者によく知られた解析方法である（例えば、西村泰治：多型の統計学的用法、最新医学４６：９０９−９２３，（１９９１）、ＯｋａＡｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｅｃｓ８，２１６５−２１７０（１９９０）、ＯｔａＭｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６４，１４０６−１４１０（１９９９）、ＯｚａｗａＡｅｔａｌ．，ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ５３，２６３−２６８（１９９９）など）。例えば、患者と健常者で変異受容体の頻度を測定し、患者において有意に変異受容体の頻度が上昇しているか否かを調べることにより、変異受容体と疾患の間の相関を調べることができる。通常、頻度の違いは、χ検定で検討され、χはχ^２＝Σ（観察値−期待値）^２／期待値で得られる。得られたχ^２からｐ値を得ることができる。変異受容体と疾患が相関しているか否かはｐ値から判定することができ、例えば、ｐ＜０．０５の場合、変異受容体と疾患が相関していると判定することができる。トロンボポイエチン（ＴＰＯ）受容体の変異受容体は既に報告されている（ＭａｔｔｈｉａｓＢａｌｌｍａｉｅｒｅｔａｌ．，ＢＬＯＯＤ、（２００１）、Ｖｏｌ．９７、Ｎｏ．１、Ｐ１３９、など）。

本発明の抗体は、Ｍｐｌに対してアゴニスト活性を有することが好ましい。
本発明の好ましい態様の一つとして、低分子化抗体が挙げられる。
低分子化抗体は、全長抗体（ｗｈｏｌｅａｎｔｉｂｏｄｙ、例えばｗｈｏｌｅＩｇＧ等）の一部分が欠損している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。本発明における低分子化抗体は、ｗｈｏｌｅ抗体と比較して、高い活性を有する。本発明の抗体断片は、全長抗体の一部分であれば特に限定されないが、重鎖可変領域（ＶＨ）又は／及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでいることが好ましい。ＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入がされていてもよい。さらに抗原への結合能を有する限り、ＶＨ又は／及びＶＬの一部を欠損させてもよい。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎＦｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃ（Ｆｖ）２（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎ（Ｆｖ）２）などを挙げることができる。

ここで、「Ｆｖ」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。「Ｆｖ」断片は１つのＶＨおよびＶＬが非共有結合により強く連結されたダイマー（ＶＨ−ＶＬダイマー）である。各可変領域の３つの相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）が相互作用し、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。６つのＣＤＲが抗体に抗原結合部位を付与している。しかしながら、１つの可変領域（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。

ｓｃＦｖには、抗体のＶＨおよびＶＬが含まれ、これらの領域は単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、ＦｖポリペプチドはさらにＶＨおよびＶＬの間にポリペプチドリンカーを含んでおり、これによりｓｃＦｖは、抗原結合のために必要な構造を形成することができる（ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ『ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ』Ｖｏｌ．１１３（ＲｏｓｅｎｂｕｒｇａｎｄＭｏｏｒｅｅｄ（ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ）ｐｐ．２６９−３１５，１９９４）を参照）。本発明におけるリンカーは、その両端に連結された抗体可変領域の発現を阻害するものでなければ特に限定されない。

Ｄｉａｂｏｄｙは、遺伝子融合により構築された二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）の抗体断片を指す（ＨｏｌｌｉｇｅｒＰｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８（１９９３）、ＥＰ４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号等）。Ｄｉａｂｏｄｙは、２本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーであり、通常、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中でＶＬ及びＶＨが、互いに結合できない位に短い、例えば、５残基程度のリンカーにより結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされるＶＬとＶＨとは、その間のリンカーが短いため単鎖可変領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成するため、Ｄｉａｂｏｄｙは２つの抗原結合部位を有することとなる。

ｓｃ（Ｆｖ）２は、２つのＶＨ及び２つのＶＬをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Ｈｕｄｓｏｎｅｔａｌ、ＪＩｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１９９９；２３１：１７７−１８９）。ｓｃ（Ｆｖ）２は、全長抗体や他の低分子化抗体と比較して、特に高いアゴニスト活性を示す。ｓｃ（Ｆｖ）２は、例えば、ｓｃＦｖをリンカーで結ぶことによって作製できる。
また２つのＶＨ及び２つのＶＬが、一本鎖ポリペプチドのＮ末端側を基点としてＶＨ、ＶＬ、ＶＨ、ＶＬ（［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましい。

２つのＶＨと２つのＶＬの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような、配置も挙げることができる。
［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］
［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］
［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］
［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］
［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］

抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー（例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９（３），２９９−３０５，１９９６参照）に開示されるリンカー等を用いることができるが、本発明においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通常、１〜１００アミノ酸、好ましくは３〜５０アミノ酸、更に好ましくは５〜３０アミノ酸、特に好ましくは１２〜１８アミノ酸（例えば、１５アミノ酸）である。

例えば、ペプチドリンカーの場合：
Ｓｅｒ
Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
（Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ）ｎ
（Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ）ｎ
［ｎは１以上の整数である］等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。

よって本発明において特に好ましいｓｃ（Ｆｖ）２の態様としては、例えば、以下のｓｃ（Ｆｖ）２を挙げることができる。
［ＶＨ］ペプチドリンカー（１５アミノ酸）［ＶＬ］ペプチドリンカー（１５アミノ酸）［ＶＨ］ペプチドリンカー（１５アミノ酸）［ＶＬ］

合成化学物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ^３）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−ＤＳＴ）、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）などであり、これらの架橋剤は市販されている。

４つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、３つのリンカーが必要となるが、全て同じリンカーを用いてもよいし、異なるリンカーを用いてもよい。本発明において好ましい低分子化抗体はＤｉａｂｏｄｙ又はｓｃ（Ｆｖ）２であり、特に好ましくはｓｃ（Ｆｖ）２である。このような低分子化抗体を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し、抗体断片を生成させるか、又はこれら抗体断片をコードするＤＮＡを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄＨｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄＳｋｅｒｒａ，Ａ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄＷａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。

全長抗体を低分子化、特にｓｃ（Ｆｖ）２にすることにより、非常に高いアゴニスト活性を有する抗体を作製することが可能である。
本発明における抗体の好ましい態様の一つとして、Ｍｐｌに結合するキメラ抗体又はヒト化抗体等の改変抗体を挙げることができる。これらの改変抗体は既知の方法を用いて製造することができる。

キメラ抗体は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体などである。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡとヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。

ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３号公報、ＷＯ９６／０２５７６号公報参照）。

具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。

ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。

キメラ抗体及びヒト型化抗体の定常領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体定常領域を修飾してもよい。

一般的に、キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域および定常領域とからなる。
なお、キメラ抗体やヒト化抗体を作製した後に、可変領域（例えば、ＦＲ）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等してもよい。

キメラ抗体における可変領域、又はヒト化抗体におけるＣＤＲの由来は特に限定されず、どのような動物由来でもよい。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体などの配列を用いることが可能である。
抗体のキメラ化やヒト化において、通常、由来となった抗体のアゴニスト活性を維持したままキメラ化やヒト化を行うことは困難であるが、本発明においては、マウス抗体と同等のアゴニスト活性を有するヒト化抗体の取得に成功した。

本発明において好ましいヒト化抗体は、配列番号：２２９（ヒト化重鎖配列：ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＨ）、配列番号：２５６（ヒト化重鎖配列：ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＨ）、配列番号：２６２（ヒト化重鎖配列：ｈＶＢ２２ＢｅＶＨ）、配列番号：２８９（ヒト化重鎖配列：ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＨ）あるいは配列番号：２９５（ヒト化重鎖配列：ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＨ）に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する抗体、又は配列番号：２３８（ヒト化軽鎖配列：ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＬ）、配列番号：２５８（ヒト化軽鎖配列：ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＬあるいはｈＶＢ２２ＢｅＶＬ）、配列番号：２９１（ヒト化軽鎖配列：ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＬ）あるいは配列番号：２９７（ヒト化軽鎖配列：ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＬ）に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体であり、特に好ましくは以下の（１）〜（５）のいずれかに記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗体である。
（１）配列番号：２２９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号：２３８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
（２）配列番号：２５６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号：２５８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
（３）配列番号：２６２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号：２５８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
（４）配列番号：２８９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号：２９１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
（５）配列番号：２９５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号：２９７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域

そのような抗体の例としては、配列番号：２、２５４、２６０、２８７または２９３（ヒト化ｓｃ（Ｆｖ）２配列（ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚｓｃ（Ｆｖ）２、ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅｓｃ（Ｆｖ）２、ｈＶＢ２２Ｂｅｓｃ（Ｆｖ）２、ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４またはｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５）に記載のアミノ酸配列を有する抗体を挙げることができる。
ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＨの塩基配列を配列番号：２２８、ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＨの塩基配列を配列番号：２５５、ｈＶＢ２２ＢｅＶＨの塩基配列を配列番号：２６１、ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＨの塩基配列を配列番号：２８８、ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＨの塩基配列を配列番号：２９４、ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＬの塩基配列を配列番号：２３７、ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＬおよびｈＶＢ２２ＢｅＶＬの塩基配列を配列番号：２５７、ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＬの塩基配列を配列番号：２９０、ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＬの塩基配列を配列番号：２９６に記載する。

配列番号：２２９（ヒト化重鎖配列：ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＨ）、配列番号：２５６（ヒト化重鎖配列：ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＨ）、配列番号：２６２（ヒト化重鎖配列：ｈＶＢ２２ＢｅＶＨ）、配列番号：２８９（ヒト化重鎖配列：ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＨ）または配列番号：２９５（ヒト化重鎖配列：ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＨ）に記載のアミノ酸配列において、
アミノ酸番号：３１〜３５がＣＤＲ１、
アミノ酸番号：５０〜６６がＣＤＲ２、
アミノ酸番号：９９〜１０７がＣＤＲ３、
アミノ酸番号：１〜３０がＦＲ１、
アミノ酸番号：３６〜４９がＦＲ２、
アミノ酸番号：６７〜９８がＦＲ３、
アミノ酸番号：１０８〜１１８がＦＲ４に相当する。

又、配列番号：２３８（ヒト化軽鎖配列：ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＬ）、配列番号：２５８（ヒト化軽鎖配列：ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＬまたはｈＶＢ２２ＢｅＶＬ）、配列番号：２９１（ヒト化軽鎖配列：ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＬ）または配列番号：２９７（ヒト化軽鎖配列：ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＬ）に記載のアミノ酸配列において、
アミノ酸番号：２４〜３９がＣＤＲ１、
アミノ酸番号：５５〜６１がＣＤＲ２、
アミノ酸番号：９４〜１０２がＣＤＲ３、
アミノ酸番号：１〜２３がＦＲ１、
アミノ酸番号：４０〜５４がＦＲ２、
アミノ酸番号：６２〜９３がＦＲ３、
アミノ酸番号：１０３〜１１２がＦＲ４に相当する。

本発明において、ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＨ配列におけるＣＤＲおよびＦＲと配列番号との対応は以下の通りである。
ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＨ：ＦＲ１／配列番号：２３０
ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＨ：ＣＤＲ１／配列番号：３６
ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＨ：ＦＲ２／配列番号：２３２
ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＨ：ＣＤＲ２／配列番号：３７
ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＨ：ＦＲ３／配列番号：２３４
ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＨ：ＣＤＲ３／配列番号：３８
ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＨ：ＦＲ４／配列番号：２３６

本発明において、ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＬ配列におけるＣＤＲおよびＦＲと配列番号との対応は以下の通りである。
ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＬ：ＦＲ１／配列番号：２３９
ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＬ：ＣＤＲ１／配列番号：９３
ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＬ：ＦＲ２／配列番号：２４１
ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＬ：ＣＤＲ２／配列番号：９４
ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＬ：ＦＲ３／配列番号：２４３
ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＬ：ＣＤＲ３／配列番号：９５
ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚＶＬ：ＦＲ４／配列番号：２４５

本発明において、ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＨ配列におけるＣＤＲおよびＦＲと配列番号との対応は以下の通りである。
ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＨ：ＦＲ１／配列番号：２６５
ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＨ：ＣＤＲ１／配列番号：３６
ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＨ：ＦＲ２／配列番号：２６７
ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＨ：ＣＤＲ２／配列番号：３７
ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＨ：ＦＲ３／配列番号：２６９
ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＨ：ＣＤＲ３／配列番号：３８
ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＨ：ＦＲ４／配列番号：２７１

本発明において、ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＬ配列におけるＣＤＲおよびＦＲと配列番号との対応は以下の通りである。
ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＬ：ＦＲ１／配列番号：２７２
ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＬ：ＣＤＲ１／配列番号：９３
ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＬ：ＦＲ２／配列番号：２７４
ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＬ：ＣＤＲ２／配列番号：９４
ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＬ：ＦＲ３／配列番号：２７６
ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＬ：ＣＤＲ３／配列番号：９５
ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅＶＬ：ＦＲ４／配列番号：２７８

本発明において、ｈＶＢ２２ＢｅＶＨ配列におけるＣＤＲおよびＦＲと配列番号との対応は以下の通りである。
ｈＶＢ２２ＢｅＶＨ：ＦＲ１／配列番号：２７９
ｈＶＢ２２ＢｅＶＨ：ＣＤＲ１／配列番号：３６
ｈＶＢ２２ＢｅＶＨ：ＦＲ２／配列番号：２８１
ｈＶＢ２２ＢｅＶＨ：ＣＤＲ２／配列番号：３７
ｈＶＢ２２ＢｅＶＨ：ＦＲ３／配列番号：２８３
ｈＶＢ２２ＢｅＶＨ：ＣＤＲ３／配列番号：３８
ｈＶＢ２２ＢｅＶＨ：ＦＲ４／配列番号：２８５

本発明において、ｈＶＢ２２ＢｅＶＬ配列におけるＣＤＲおよびＦＲと配列番号との対応は以下の通りである。
ｈＶＢ２２ＢｅＶＬ：ＦＲ１／配列番号：２７２
ｈＶＢ２２ＢｅＶＬ：ＣＤＲ１／配列番号：９３
ｈＶＢ２２ＢｅＶＬ：ＦＲ２／配列番号：２７４
ｈＶＢ２２ＢｅＶＬ：ＣＤＲ２／配列番号：９４
ｈＶＢ２２ＢｅＶＬ：ＦＲ３／配列番号：２７６
ｈＶＢ２２ＢｅＶＬ：ＣＤＲ３／配列番号：９５
ｈＶＢ２２ＢｅＶＬ：ＦＲ４／配列番号：２７８

本発明において、ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＨ配列におけるＣＤＲおよびＦＲと配列番号との対応は以下の通りである。
ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＨ：ＦＲ１／配列番号：２９８
ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＨ：ＣＤＲ１／配列番号：３６
ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＨ：ＦＲ２／配列番号：２９９
ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＨ：ＣＤＲ２／配列番号：３７
ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＨ：ＦＲ３／配列番号：３００
ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＨ：ＣＤＲ３／配列番号：３８
ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＨ：ＦＲ４／配列番号：３０１

本発明において、ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＬ配列におけるＣＤＲおよびＦＲと配列番号との対応は以下の通りである。
ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＬ：ＦＲ１／配列番号：３０２
ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＬ：ＣＤＲ１／配列番号：９３
ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＬ：ＦＲ２／配列番号：３０３
ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＬ：ＣＤＲ２／配列番号：９４
ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＬ：ＦＲ３／配列番号：３０４
ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＬ：ＣＤＲ３／配列番号：９５
ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ＶＬ：ＦＲ４／配列番号：３０５

本発明において、ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＨ配列におけるＣＤＲおよびＦＲと配列番号との対応は以下の通りである。
ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＨ：ＦＲ１／配列番号：２９８
ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＨ：ＣＤＲ１／配列番号：３６
ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＨ：ＦＲ２／配列番号：２９９
ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＨ：ＣＤＲ２／配列番号：３７
ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＨ：ＦＲ３／配列番号：３０６
ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＨ：ＣＤＲ３／配列番号：３８
ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＨ：ＦＲ４／配列番号：３０１

本発明において、ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＬ配列におけるＣＤＲおよびＦＲと配列番号との対応は以下の通りである。
ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＬ：ＦＲ１／配列番号：３０２
ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＬ：ＣＤＲ１／配列番号：９３
ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＬ：ＦＲ２／配列番号：３０７
ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＬ：ＣＤＲ２／配列番号：９４
ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＬ：ＦＲ３／配列番号：３０８
ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＬ：ＣＤＲ３／配列番号：９５
ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ＶＬ：ＦＲ４／配列番号：３０５

なお、ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚ配列、ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅ配列、ｈＶＢ２２Ｂｅ配列、ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４配列、およびｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５配列におけるＣＤＲおよびＦＲの対応を、図１８に示した。

従って本発明において、その他の好ましいヒト化抗体の態様は、以下の（１）〜（５）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する重鎖可変領域を有するヒト化抗体、
（１）配列番号：２３０、２３２、２３４、２３６（ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚ：Ｈ鎖ＦＲ１、２、３、４）
（２）配列番号：２６５、２６７、２６９、２７１（ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅ：Ｈ鎖ＦＲ１、２、３、４）
（３）配列番号：２７９、２８１、２８３、２８５（ｈＶＢ２２Ｂｅ：Ｈ鎖ＦＲ１、２、３、４）
（４）配列番号：２９８、２９９、３００、３０１（ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４：Ｈ鎖ＦＲ１、２、３、４）
（５）配列番号：２９８、２９９、３０６、３０１（ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５：Ｈ鎖ＦＲ１、２、３、４）
以下の（１）〜（４）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する軽鎖可変領域をを有するヒト化抗体、
（１）配列番号：２３９、２４１、２４３、２４５（ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚ：Ｌ鎖ＦＲ１、２、３、４）
（２）配列番号：２７２、２７４、２７６、２７８（ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅまたはｈＶＢ２２Ｂｅ：Ｌ鎖ＦＲ１、２、３、４）
（３）配列番号：３０２、３０３、３０４、３０５（ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４：Ｌ鎖ＦＲ１、２、３、４）
（４）配列番号：３０２、３０７、３０８、３０５（ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５：Ｌ鎖ＦＲ１、２、３、４）
以下の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域を有するヒト化抗体
配列番号：３６、３７、３８（ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚ、ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅｈＶＢ２２Ｂｅ、ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４またはｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）
又は
以下の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域を有するヒト化抗体
配列番号：９３、９４、９５（ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅ、ｈＶＢ２２Ｂｅ、ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４またはｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
である。

さらに他の好ましい態様は、以下の（１）〜（５）のいずれかに記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有するヒト化抗体、
（１）配列番号：２３０、２３２、２３４、２３６に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する重鎖可変領域、および配列番号：２３９、２４１、２４３、２４５に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する軽鎖可変領域
（２）配列番号：２６５、２６７、２６９、２７１に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する重鎖可変領域、および配列番号：２７２、２７４、２７６、２７８に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する軽鎖可変領域
（３）配列番号：２７９、２８１、２８３、２８５に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する重鎖可変領域、および配列番号：２７２、２７４、２７６、２７８に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する軽鎖可変領域
（４）配列番号：２９８、２９９、３００、３０１に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する重鎖可変領域、および配列番号：３０２、３０３、３０４、３０５に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する軽鎖可変領域
（５）配列番号：２９８、２９９、３０６、３０１に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する重鎖可変領域、および配列番号：３０２、３０７、３０８、３０５に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有する軽鎖可変領域、又は
以下に記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有するヒト化抗体
配列番号：３６、３７、３８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する重鎖可変領域、および配列番号：９３、９４、９５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有する軽鎖可変領域
である。

キメラ抗体やヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、治療目的などでヒトに投与する場合に有用と考えられる。
本発明における抗体の好ましい態様の一つとして、可溶型Ｍｐｌに結合する抗体を挙げることができる。ここでいう可溶型Ｍｐｌとは、細胞膜上に発現しているＭｐｌ以外のＭｐｌのことをいう。可溶型Ｍｐｌの具体的な例としては、膜貫通領域の一部又は全部が欠損しているＭｐｌを挙げることができる。ヒトＭｐｌの場合、膜貫通領域は配列番号：１２３において４９２番目のアミノ酸〜５１３番目のアミノ酸の部分が相当する。

可溶型組換えＭｐｌに結合する抗体は、エピトープの詳細な解析や結合における反応速度論的解析に利用できるだけでなく、ｉｎｖｉｖｏ試験における血中濃度や体内動態を評価することにも有用である

本発明における抗体の好ましい態様の一つとして、ヒトＭｐｌとサルＭｐｌの両方に対して結合活性を有する抗体を挙げることができる。また本発明は、ヒトＭｐｌ及びサルＭｐｌに対してアゴニスト活性を有する抗体を提供する。ヒトＭｐｌとサルＭｐｌの両方に対してアゴニスト活性を有する抗体は、通常、ヒトにおいて測定することが困難な体内動態やｉｎｖｉｖｏでの効果を、サルを用いて検証できることから、非常に有用であると考えられる。

これらの抗体は、さらに、ヒト及びサル以外の動物（例えば、マウスなど）のＭｐｌに対して、結合活性やアゴニスト活性を有していてもよい。

さらに本発明の抗体には、ＴＰＯアゴニスト活性（Ｍｐｌに対するアゴニスト活性）がＥＣ５０＝１００ｎＭ以下、好ましくはＥＣ５０＝３０ｎＭ以下、さらに好ましくはＥＣ５０＝１０ｎＭ以下である抗体が含まれる。

アゴニスト活性の測定方法は、当業者に公知の方法により行うことが可能であり、例えば、後述する方法により行うことが可能である。
ヒトＭｐｌ（Ｐａｌａｃｉｏｓら、Ｃｅｌｌ１９８５；４１：７２７−７３４、ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＭ＿００５３７３）、カニクイザルＭｐｌ（塩基配列を配列番号：１６４、アミノ酸配列を配列番号：１６５に記載）、マウスＭｐｌ（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＭ＿０１０８２３）の配列は既に公知である。
さらに本発明は可溶型Ｍｐｌへの結合活性がＫＤ＝１０^−６Ｍ以下、好ましくはＫＤ＝１０^−７Ｍ以下の抗体を含む。

本発明において、可溶型組換えＭｐｌへの結合活性がＫＤ＝１０^−６Ｍ以下の抗体であるか否かは、当業者に公知の手段を使用して測定することができる。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅを用いた表面プラズモン共鳴を利用して測定することが可能である。すなわちＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐ上に可溶型ＭＰＬ−Ｆｃ蛋白質、可溶型Ｍｐｌ蛋白質、または抗体が認識するエピトープペプチドなどを固定させ、抗体とそれらのタンパク質又はペプチドの相互作用を測定値から反応速度定数として算出することができる。Ｃｈｉｐ上に固定するタンパク質としては特に限定されないが、例えば、実施例記載のＭＧ１０（Ｇｌｎ２１３からＡｌａ２３１）−ＧＳＴ融合蛋白質、Ｍｐｌ−ＩｇＧＦｃ融合蛋白質などを用いることができる。二つの抗原結合部位を有する二価抗体であるため、その結合活性は、一価での値として、二価での値として、又は一価と二価が混合した状態での値として算出することができるが、本発明においてはそのいずれの値でもよい。
また、結合活性の評価には、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、被験抗体が結合する抗原をコーティングしたプレートに、被験抗体を含む試料、例えば、被験抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。

結合活性の上限は特に限定されないが、例えば、当業者が技術的に作製可能な範囲の上限を設定することができる。しかしながら、技術的に作製可能な範囲は、技術の進歩により拡大される。

本発明における抗体の好ましい態様の一つとして、以下の（Ｉ）〜（ＸＩＩ）のいずれかに記載の抗体が認識するエピトープを認識する抗体を挙げることができる。（Ｉ）〜（ＸＩＩ）のいずれかに記載の抗体は好ましくは低分子化抗体である。

（Ｉ）
以下の（１）〜（１７）のいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有するＶＨを含む抗体（カッコの中に各抗体の名称および該抗体中のＨ鎖ＣＤＲを示す）。
（１）配列番号：３、４、５（ＶＡ７：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（２）配列番号：６、７、８（ＶＡ１３０またはＶＢ１７Ｂ：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（３）配列番号：９、１０、１１（ＶＡ２５９：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（４）配列番号：１５、１６、１７（ＶＢ１２Ｂ：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（５）配列番号：１８、１９、２０（ＶＢ１４０：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（６）配列番号：２１、２２、２３（ＶＢ３３：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（７）配列番号：２４、２５、２６（ＶＢ４５Ｂ：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（８）配列番号：２７、２８、２９（ＶＢ８Ｂ：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（９）配列番号：３０、３１、３２（ＶＢ１１５：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（１０）配列番号：３３、３４、３５（ＶＢ１４Ｂ：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（１１）配列番号：３６、３７、３８（ＶＢ２２Ｂ、ＶＢ４Ｂ、ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚ、ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅ、ｈＶＢ２２Ｂｅ、ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４またはｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（１２）配列番号：３９、４０、４１（ＶＢ１６：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（１３）配列番号：４２、４３、４４（ＶＢ１５７：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（１４）配列番号：４８、４９、５０（ＶＢ５１：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（１５）配列番号：５１、５２、５３（ＡＢ３１７：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（１６）配列番号：５４、５５、５６（ＡＢ３２４：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（１７）配列番号：５７、５８、５９（ＴＡ１３６：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）

（ＩＩ）
以下の（１）〜（１０）のいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、２、３を有するＶＬを含む抗体（カッコの中に各抗体の名称および該抗体中のＬ鎖ＣＤＲを示す）。
（１）配列番号：６０、６１、６２（ＶＡ７：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（２）配列番号：６３、６４、６５（ＶＡ１３０、ＶＡ２５９、ＶＢ１７Ｂ、ＶＢ１２Ｂ、ＶＢ１４０、ＶＢ４５Ｂ、ＶＢ１１５、ＶＢ１４ＢまたはＢ５１：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（３）配列番号：７８、７９、８０（ＶＢ３３またはＶＢ１５７：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（４）配列番号：８４、８５、８６（ＶＢ８Ｂ：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（５）配列番号：９３、９４、９５（ＶＢ２２Ｂ、ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚ、ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅ、ｈＶＢ２２Ｂｅ、ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４またはｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（６）配列番号：９６、９７、９８（ＶＢ１６：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（７）配列番号：１０２、１０３、１０４（ＶＢ４Ｂ：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（８）配列番号：１０８、１０９、１１０（ＡＢ３１７：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（９）配列番号：１１１、１１２、１１３（ＡＢ３２４：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（１０）配列番号：１１４、１１５、１１６（ＴＡ１３６：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）

（ＩＩＩ）
以下の（１）〜（２４）のいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列からなるＶＨを含む抗体。
（１）配列番号：１２４（ＶＡ７：ＶＨ）
（２）配列番号：１２６（ＶＡ１３０：ＶＨ）
（３）配列番号：１２８（ＶＡ２５９：ＶＨ）
（４）配列番号：１３０（ＶＢ１７Ｂ：ＶＨ）
（５）配列番号：１３２（ＶＢ１２Ｂ：ＶＨ）
（６）配列番号：１３４（ＶＢ１４０：ＶＨ）
（７）配列番号：１３６（ＶＢ３３：ＶＨ）
（８）配列番号：１３８（ＶＢ４５Ｂ：ＶＨ）
（９）配列番号：１４０（ＶＢ８Ｂ：ＶＨ）
（１０）配列番号：１４２（ＶＢ１１５：ＶＨ）
（１１）配列番号：１４４（ＶＢ１４Ｂ：ＶＨ）
（１２）配列番号：１１８（ＶＢ２２Ｂ：ＶＨ）
（１３）配列番号：１４６（ＶＢ１６：ＶＨ）
（１４）配列番号：１４８（ＶＢ１５７：ＶＨ）
（１５）配列番号：１５０（ＶＢ４Ｂ：ＶＨ）
（１６）配列番号：１５２（ＶＢ５１：ＶＨ）
（１７）配列番号：１５５（ＡＢ３１７：ＶＨ）
（１８）配列番号：１５９（ＡＢ３２４：ＶＨ）
（１９）配列番号：１６２（ＴＡ１３６：ＶＨ）
（２０）配列番号：２２９（ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚ：ＶＨ）
（２１）配列番号：２５６（ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅ：ＶＨ）
（２２）配列番号：２６２（ｈＶＢ２２Ｂｅ：ＶＨ）
（２３）配列番号：２８９（ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４：ＶＨ）
（２４）配列番号：２９５（ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５：ＶＨ）

（ＩＶ）
以下の（１）〜（１８）のいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列からなるＶＬを含む抗体。
（１）配列番号：１２５（ＶＡ７：ＶＬ）
（２）配列番号：１２７（ＶＡ１３０、ＶＢ１７Ｂ、ＶＢ１２Ｂ、ＶＢ１１５またはＶＢ１４Ｂ：ＶＬ）
（３）配列番号：１２９（ＶＡ２５９：ＶＬ）
（４）配列番号：１３５（ＶＢ１４０またはＶＢ４５Ｂ：ＶＬ）
（５）配列番号：１３７（ＶＢ３３：ＶＬ）
（６）配列番号：１４１（ＶＢ８Ｂ：ＶＬ）
（７）配列番号：１２０（ＶＢ２２Ｂ：ＶＬ）
（８）配列番号：１４７（ＶＢ１６：ＶＬ）
（９）配列番号：１４９（ＶＢ１５７：ＶＬ）
（１０）配列番号：１５１（ＶＢ４Ｂ：ＶＬ）
（１１）配列番号：１５３（ＶＢ５１：ＶＬ）
（１２）配列番号：１５７（ＡＢ３１７：ＶＬ）
（１３）配列番号：１６１（ＡＢ３２４：ＶＬ）
（１４）配列番号：１６３（ＴＡ１３６：ＶＬ）
（１５）配列番号：２３８（ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚ：ＶＬ）
（１６）配列番号：２５８（ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅ：ＶＬまたはｈＶＢ２２Ｂｅ：ＶＬ）
（１７）配列番号：２９１（ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４：ＶＬ）
（１８）配列番号：２９７（ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５：ＶＬ）

（Ｖ）
以下の（１）〜（１８）のいずれかに記載のＶＨおよびＶＬを含む抗体。
（１）配列番号：３、４、５（ＶＡ７：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）、配列番号：６０、６１、６２（ＶＡ７：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（２）配列番号：６、７、８（ＶＡ１３０またはＶＢ１７Ｂ：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）、配列番号：６３、６４、６５（ＶＡ１３０またはＶＢ１７Ｂ：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（３）配列番号：９、１０、１１（ＶＡ２５９：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）、配列番号：６６、６７、６８（ＶＡ２５９：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（４）配列番号：１５、１６、１７（ＶＢ１２Ｂ：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）、配列番号：７２、７３、７４（ＶＢ１２Ｂ：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（５）配列番号：１８、１９、２０（ＶＢ１４０：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）、配列番号：７５、７６、７７（ＶＢ１４０：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（６）配列番号：２１、２２、２３（ＶＢ３３：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）、配列番号：７８、７９、８０（ＶＢ３３：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（７）配列番号：２４、２５、２６（ＶＢ４５Ｂ：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）、配列番号：８１、８２、８３（ＶＢ４５Ｂ：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（８）配列番号：２７、２８、２９（ＶＢ８Ｂ：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）、配列番号：８４、８５、８６（ＶＢ８Ｂ：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（９）配列番号：３０、３１、３２（ＶＢ１１５：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）、配列番号：８７、８８、８９（ＶＢ１１５：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（１０）配列番号：３３、３４、３５（ＶＢ１４Ｂ：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）、配列番号：９０、９１、９２（ＶＢ１４Ｂ：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（１１）配列番号：３６、３７、３８（ＶＢ２２Ｂ、ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚ、ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅ、ｈＶＢ２２Ｂｅ、ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４またはｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）、配列番号：９３、９４、９５（ＶＢ２２Ｂ、ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚ、ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅ、ｈＶＢ２２Ｂｅ、ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４またはｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（１２）配列番号：３９、４０、４１（ＶＢ１６：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）、配列番号：９６、９７、９８（ＶＢ１６：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（１３）配列番号：４２、４３、４４（ＶＢ１５７：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）、配列番号：９９、１００、１０１（ＶＢ１５７：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（１４）配列番号：４５、４６、４７（ＶＢ４Ｂ：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）、配列番号：１０２、１０３、１０４（ＶＢ４Ｂ：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（１５）配列番号：４８、４９、５０（ＶＢ５１：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）、配列番号：１０５、１０６、１０７（ＶＢ５１：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（１６）配列番号：５１、５２、５３（ＡＢ３１７：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）、配列番号：１０８、１０９、１１０（ＡＢ３１７：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（１７）配列番号：５４、５５、５６（ＡＢ３２４：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）、配列番号：１１１、１１２、１１３（ＡＢ３２４：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）
（１８）配列番号：５７、５８、５９（ＴＡ１３６：Ｈ鎖ＣＤＲ１、２、３）、配列番号：１１４、１１５、１１６（ＴＡ１３６：Ｌ鎖ＣＤＲ１、２、３）

（ＶＩ）
以下の（１）〜（２４）のいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列からなるＶＨおよびＶＬを含む抗体。
（１）配列番号：１２４（ＶＡ７：ＶＨ）、配列番号：１２５（ＶＡ７：ＶＬ）
（２）配列番号：１２６（ＶＡ１３０：ＶＨ）、配列番号：１２７（ＶＡ１３０：ＶＬ）
（３）配列番号：１２８（ＶＡ２５９：ＶＨ）、配列番号：１２９（ＶＡ２５９：ＶＬ）
（４）配列番号：１３０（ＶＢ１７Ｂ：ＶＨ）、配列番号：１２７（ＶＢ１７Ｂ：ＶＬ）
（５）配列番号：１３２（ＶＢ１２Ｂ：ＶＨ）、配列番号：１２７（ＶＢ１２Ｂ：ＶＬ）
（６）配列番号：１３４（ＶＢ１４０：ＶＨ）、配列番号：１３５（ＶＢ１４０：ＶＬ）
（７）配列番号：１３６（ＶＢ３３：ＶＨ）、配列番号：１３７（ＶＢ３３：ＶＬ）
（８）配列番号：１３８（ＶＢ４５Ｂ：ＶＨ）、配列番号：１３５（ＶＢ４５Ｂ：ＶＬ）
（９）配列番号：１４０（ＶＢ８Ｂ：ＶＨ）、配列番号：１４１（ＶＢ８Ｂ：ＶＬ）
（１０）配列番号：１４２（ＶＢ１１５：ＶＨ）、配列番号：１２７（ＶＢ１１５：ＶＬ）
（１１）配列番号：１４４（ＶＢ１４Ｂ：ＶＨ）、配列番号：１２７（ＶＢ１４Ｂ：ＶＬ）
（１２）配列番号：１１８（ＶＢ２２Ｂ：ＶＨ）、配列番号：１２０（ＶＢ２２Ｂ：ＶＬ）
（１３）配列番号：１４６（ＶＢ１６：ＶＨ）、配列番号：１４７（ＶＢ１６：ＶＬ）
（１４）配列番号：１４８（ＶＢ１５７：ＶＨ）、配列番号：１４９（ＶＢ１５７：ＶＬ）
（１５）配列番号：１５０（ＶＢ４Ｂ：ＶＨ）、配列番号：１５１（ＶＢ４Ｂ：ＶＬ）
（１６）配列番号：１５２（ＶＢ５１：ＶＨ）、配列番号：１５３（ＶＢ５１：ＶＬ）
（１７）配列番号：１５５（ＡＢ３１７：ＶＨ）、配列番号：１５７（ＡＢ３１７：ＶＬ）
（１８）配列番号：１５９（ＡＢ３２４：ＶＨ）、配列番号：１６１（ＡＢ３２４：ＶＬ）
（１９）配列番号：１６２（ＴＡ１３６：ＶＨ）、配列番号：１６３（ＴＡ１３６：ＶＬ）
（２０）配列番号：２２９（ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚ：ＶＨ）、配列番号：２３８（ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚ：ＶＬ）
（２１）配列番号：２５６（ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅ：ＶＨ）、配列番号：２５８（ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅ：ＶＬ）
（２２）配列番号：２６２（ｈＶＢ２２Ｂｅ：ＶＨ）、配列番号：２５８（ｈＶＢ２２Ｂｅ：ＶＬ）
（２３）配列番号：２８９（ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４：ＶＨ）、配列番号：２９１（ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４：ＶＬ）
（２４）配列番号：２９５（ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５：ＶＨ）、配列番号：２９７（ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５：ＶＬ）

（ＶＩＩ）
配列番号：１２２に記載のアミノ酸配列からなる抗体（ＶＢ２２Ｂ：ｓｃＦｖ）。

（ＶＩＩＩ）
配列番号：２（ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚ：ｓｃ（Ｆｖ）２）、配列番号：２５４（ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅ：ｓｃ（Ｆｖ）２）、配列番号：２６０（ｈＶＢ２２Ｂｅ：ｓｃ（Ｆｖ）２）、配列番号：２８７（ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４：ｓｃ（Ｆｖ）２）、または配列番号：２９３（ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５：ｓｃ（Ｆｖ）２）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるヒト化抗体。

（ＩＸ）
有するＶＨを含む抗体。
（１）配列番号：２３０、２３２、２３４、２３６（ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚ：Ｈ鎖ＦＲ１、２、３、４）
（２）配列番号：２６５、２６７、２６９、２７１（ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅ：Ｈ鎖ＦＲ１、２、３、４）
（３）配列番号：２７９、２８１、２８３、２８５（ｈＶＢ２２Ｂｅ：Ｈ鎖ＦＲ１、２、３、４）
（４）配列番号：２９８、２９９、３００、３０１（ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４：Ｈ鎖ＦＲ１、２、３、４）
（５）配列番号：２９８、２９９、３０６、３０１（ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５：Ｈ鎖ＦＲ１、２、３、４）
（Ｘ）

以下の（１）〜（４）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有するＶＬを含む抗体。
（１）配列番号：２３９、２４１、２４３、２４５（ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚ：Ｌ鎖ＦＲ１、２、３、４）
（２）配列番号：２７２、２７４、２７６、２７８（ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅまたはｈＶＢ２２Ｂｅ：Ｌ鎖ＦＲ１、２、３、４）
（３）配列番号：３０２、３０３、３０４、３０５（ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４：Ｌ鎖ＦＲ１、２、３、４）
（４）配列番号：３０２、３０７、３０８、３０５（ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５：Ｌ鎖ＦＲ１、２、３、４）
（ＸＩ）

以下の（１）〜（５）のいずれかに記載のＶＨおよびＶＬを含む抗体。
（１）配列番号：２３０、２３２、２３４、２３６に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有するＶＨ、および配列番号：２３９、２４１、２４３、２４５に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有するＶＬ
（２）配列番号：２６５、２６７、２６９、２７１に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有するＶＨ、および配列番号：２７２、２７４、２７６、２７８に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有するＶＬ
（３）配列番号：２７９、２８１、２８３、２８５に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有するＶＨ、および配列番号：２７２、２７４、２７６、２７８に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有するＶＬ
（４）配列番号：２９８、２９９、３００、３０１に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有するＶＨ、および配列番号：３０２、３０３、３０４、３０５に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有するＶＬ
（５）配列番号：２９８、２９９、３０６、３０１に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有するＶＨ、および配列番号：３０２、３０７、３０８、３０５に記載のアミノ酸配列からなる、ＦＲ１、２、３、４を有するＶＬ

（ＸＩＩ）
配列番号：２６４に記載のアミノ酸配列からなる抗体（ＶＢ２２Ｂ：ｓｃ（Ｆｖ）２）。

上記（Ｉ）〜（ＸＩＩ）のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入され、かつ（Ｉ）〜（ＸＩＩ）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
ここで「機能的に同等」とは、対象となる抗体が本発明の抗体と同様の生物学的あるいは生化学的活性を有することを指す。このような活性としては、例えば、結合活性あるいはアゴニスト活性を例示することができる。

あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ１５２，２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ，ａｎｄＳｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔａｌ．（１９８４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２，９４４１−９４５６、ＫｒａｍｅｒＷ，ａｎｄＦｒｉｔｚＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．８２，４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明の抗体のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。このような変異体における、変異数は、活性が保持されている限り、特に制限されない。変異するアミノ酸数は、通常、５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内）であると考えられる。さらに、変異部位は、活性が保持されている限り、特に制限されない。

アミノ酸変異は、１または複数のアミノ酸残基（好ましくは非必須アミノ酸残基）に生じうる。ここで、「非必須アミノ酸残基」とは、生物学的な活性を変化させずに、タンパク質の野生型アミノ酸配列から変化可能なアミノ酸残基であるが、「必須アミノ酸残基」とは、生物学的な活性に必要なアミノ酸残基である。アミノ酸は、好ましくは、アミノ酸側鎖の性質の保存を可能にする異なるアミノ酸に置換される。よって、本願において「保存的アミノ酸置換」とは、下記のグループの１つに属するアミノ酸残基を、化学的に同様な側鎖を有する同じグループに属する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本願分野でよく知られている。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。

あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。

本発明の抗体のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された抗体には、これら抗体を含む融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質は、これら抗体と他のペプチド又はタンパク質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチド又はポリペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６，１２０４−１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、ＰｒｏｔｅｉｎＣの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと融合させ、これにより調製された融合ポリヌクレオチドを発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。

本発明の抗体は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が、本発明の抗体と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明の抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加される。本発明の抗体はこのような抗体も包含する。

上記（Ｉ）〜（ＸＩＩ）のいずれかの抗体が認識するエピトープを認識する抗体は、高いアゴニスト活性を有すると考えられる。（Ｉ）〜（ＸＩＩ）のいずれかの抗体が認識するエピトープを認識する抗体は当業者に公知の方法により得ることが可能である。例えば、（Ｉ）〜（ＸＩＩ）のいずれかの抗体が認識するエピトープを通常の方法により決定し、該エピトープに含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドを免疫原として抗体を作製する方法や、通常の方法で作製された抗体のエピトープを決定し、（Ｉ）〜（ＸＩＩ）のいずれかの抗体とエピトープが同じ抗体を選択する方法などにより得ることができる。

本発明においては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する抗体が認識するエピトープを認識する抗体が特に好ましい。配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する抗体は、ヒトＭｐｌの２６番目のＧｌｕから２７４番目のＬｅｕまでの領域、好ましくは１８９番目のＡｌａから２４５番目のＧｌｙの領域、さらに好ましくは２１３番目のＧｌｎから２３１番目のＡｌａまでの領域を認識していると予想される。従って、ヒトＭｐｌの２６番目〜２７４番目、あるいは１８９番目〜２４５番目、あるいは２１３番目〜２３１番目の領域を認識する抗体も本発明に含まれる。

ヒトＭｐｌのアミノ酸配列（配列番号：１２３）の２６番目〜２７４番目、あるいは１８９番目〜２４５番目、あるいは２１３番目〜２３１番目の領域を認識する抗体は、当業者に公知の方法により得ることが可能であり、例えば、ヒトＭｐｌのアミノ酸配列（配列番号：１２３）の２６番目〜２７４番目、あるいは１８９番目〜２４５番目、あるいは２１３番目〜２３１番目のペプチドを免疫原として抗体を作製する方法や、通常の方法で作製した抗体が認識するエピトープを決定し、本発明の抗体と同じエピトープを認識する抗体を選択する方法などにより得ることが可能である。

本発明は、上記（Ｉ）〜（ＸＩＩ）に記載の抗体を提供する。本発明の好ましい態様の一つとして、上記（Ｖ）に記載の抗体を挙げることができる。より好ましくは（ＶＩ）、さらに好ましくは（ＶＩＩＩ）の抗体を挙げることができる。

また本発明は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードする限り、特に限定されず、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基または塩基対からなる重合体である。天然以外の塩基を含んでいてよい。本発明のポリヌクレオチドは、抗体を遺伝子工学的な手法により発現させる際に使用することができる。また本発明の抗体と同等な機能を有する抗体をスクリーニングする際に、プローブとして用いることもできる。即ち本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、またはその一部をプローブとして用い、ハイブリダイゼーション、遺伝子増幅技術（例えばＰＣＲ）等の技術により、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするＤＮＡを得ることができる。このようなＤＮＡも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄｅｄ．，９．４７−９．５８，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）は当業者によく知られた技術である。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により得られるポリヌクレオチドがコードする、本発明の抗体と機能的に同等な抗体は、通常、これら抗体とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明の抗体には、本発明の抗体と機能的に同等であり、かつ該抗体のアミノ酸配列と高い相同性を有する抗体も含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。ポリペプチドの相同性を決定するには、文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。

本発明のベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。

本発明のベクターとしては、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢＪ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。

また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔａｌＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。

大腸菌以外にも、例えば、本発明のベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「ＰｉｃｈｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＫｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。

ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。

さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。

本方法においては次いで、該ベクターを宿主細胞に導入する。ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。宿主細胞は、例えば、本発明の抗体の製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。

真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙｈａｍｓｔｅｒｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。本発明においては、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１、ＣＯＳ７細胞、ＢＨＫ細胞が好適に用いられる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。

植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が蛋白質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）が知られている。

原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。

本方法においては次いで上記宿主細胞を培養する。目的とするポリヌクレオチドにより形質転換された細胞をｉｎｖｉｔｒｏで培養することにより、抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、ＦＢＳ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。

一方、ｉｎｖｉｖｏでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするポリヌクレオチドを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。
本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。

動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（ＶｉｃｋｉＧｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、目的とするポリヌクレオチドを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギヘ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的の抗体を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生される抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。

また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的の抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の抗体を得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。

さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とする抗体をコードするポリヌクレオチドを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得ることができる（ＪｕｌｉａｎＫ．−Ｃ．Ｍａｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。

これにより得られた抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。本明細書において、あるポリペプチドに関して「実質的に純粋」であるとは、そのポリペプチドが、その他の天然の高分子、培地（組み換え技術によって生産する場合）、または化学前駆物質（化学的に合成する場合）のような不純物を実質的に含まないことを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、乾燥重量で、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５、９０、９５、または９９％純粋である。純度は、任意の適当な標準的な方法、例えばクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳導、またはＨＰＬＣ分析などで測定できる。

クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（ＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ．ＥｄＤａｎｉｅｌＲ．Ｍａｒｓｈａｋｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡを用いたカラムとして、ＨｙｐｅｒＤ，ＰＯＲＯＳ，ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。

なお、抗体の精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。

Ｍｐｌに結合する抗体は当業者に公知の方法により作成することができる。
例えば、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、Ｍｐｌタンパク質又はＭｐｌ発現細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。

具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるＭｐｌタンパク質を、Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＮＭ＿００５３７３に開示されたＭｐｌ遺伝子／アミノ酸配列を発現することによって得る。すなわち、Ｍｐｌをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトＭｐｌタンパク質を公知の方法で精製する。

次に、この精製Ｍｐｌタンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、Ｍｐｌの部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトＭｐｌのアミノ酸配列より化学合成により得ることも可能である。
本発明の抗ＭＰＬ抗体の認識するＭｐｌ分子上のエピトープは特定のものに限定されず、Ｍｐｌ分子上に存在するエピトープならばどのエピトープを認識してもよい。従って、本発明の抗Ｍｐｌ抗体を作製するための抗原は、Ｍｐｌ分子上に存在するエピトープを含む断片ならば、如何なる断片も用いることが可能である。

感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。

感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。

このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。

前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅＳｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。

前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。

免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。

細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００−６０００程度）を通常３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。

このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。

また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎｖｉｔｒｏでＭｐｌに感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、Ｍｐｌへの結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＭｐｌを投与して抗Ｍｐｌ抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＭｐｌに対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９４／２５５８５号公報、ＷＯ９３／１２２２７号公報、ＷＯ９２／０３９１８号公報、ＷＯ９４／０２６０２号公報参照）。

このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型の抗体を作製することも可能である（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。

具体的には、抗Ｍｐｌ抗体を産生するハイブリドーマから、抗Ｍｐｌ抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。

得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５’−ＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲＲＡＣＥＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。

得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
目的とする抗Ｍｐｌ抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。

本発明で使用される抗Ｍｐｌ抗体を製造するには、通常、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。

抗体遺伝子の発現は、Ｈ鎖またはＬ鎖をコードするポリヌクレオチドを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするポリヌクレオチドを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ９４／１１５２３号公報参照）。

アゴニスト活性とは、受容体などの抗原に抗体が結合することにより、細胞内にシグナルが伝達される等して、何らかの生理的活性の変化を誘導する活性である。生理的活性としては、例えば、増殖誘導活性、増殖活性、生存活性、分化誘導活性、分化活性、転写活性、膜輸送活性、結合活性、蛋白質分解活性、リン酸化／脱リン酸化活性、酸化還元活性、転移活性、核酸分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性、アポトーシス誘導活性、などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。

一般的に、Ｍｐｌに対するアゴニスト活性とは、巨核球又はその親細胞である造血幹細胞から血小板へと分化することを促進する活性、又は血小板を増殖させる活性である。
アゴニスト活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可能である。又、アゴニスト活性の測定は、本来の活性を指標に測定するだけでなく、他の活性を指標に測定することも可能である。

例えば、実施例に記載のように細胞増殖を指標にアゴニスト活性を測定する方法により判定することが可能である。より具体的には、アゴニスト依存性増殖を示す細胞にアゴニスト活性を測定したい抗体を添加し、培養する。その後、ＷＳＴ−８のような生細胞数に応じて特定の波長において発色反応を呈する試薬を添加して吸光度を測定し、得られた吸光度を指標にアゴニスト活性を測定することが可能である。

アゴニスト依存性増殖を示す細胞も当業者に公知の方法により作製することが可能であり、例えば、抗原が細胞増殖シグナルを発する受容体である場合には、該受容体を発現している細胞を用いればよい。又、抗原が細胞増殖シグナルを出さない受容体である場合には、細胞増殖シグナルを発する受容体の細胞内領域と、細胞増殖シグナルを出さない受容体の細胞外領域からなるキメラ受容体を作製し、該キメラ受容体を細胞で発現させればよい。細胞増殖シグナルを発する受容体の例としては、例えば、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ｍｐｌ、ｎｅｕ、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ＥＰＯ受容体、ｃ−ｋｉｔ、ＦＬＴ−３等を挙げることができる。受容体を発現させる細胞としては、例えば、ＢａＦ３、ＮＦＳ６０、ＦＤＣＰ−１、ＦＤＣＰ−２、ＣＴＬＬ−２、ＤＡ−１、ＫＴ−３等を挙げることができる。

その他、アゴニスト活性を測定する為に用いる検出指標としては、量的及び／又は質的な変化が測定可能である限り使用することができる。例えば、無細胞系（ｃｅｌｌｆｒｅｅａｓｓａｙ）の指標、細胞系（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄａｓｓａｙ）の指標、組織系の指標、生体系の指標を用いることができる。無細胞系の指標としては、酵素反応やタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡの量的及び／又は質的な変化を用いることができる。酵素反応としては、例えば、アミノ酸転移反応、糖転移反応、脱水反応、脱水素反応、基質切断反応等を用いることができる。また、タンパク質のリン酸化、脱リン酸化、二量化、多量化、分解、乖離等や、ＤＮＡ、ＲＮＡの増幅、切断、伸長を用いることができる。例えばシグナル伝達経路の下流に存在するタンパク質のリン酸化を検出指標とすることができる。細胞系の指標としては、細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的及び／又は質的変化、増殖活性の変化、細胞数の変化、形態の変化、特性の変化等を用いることができる。産生物質としては、分泌タンパク質、表面抗原、細胞内タンパク質、ｍＲＮＡ等を用いることができる。形態の変化としては、突起形成及び／又は突起の数の変化、偏平度の変化、伸長度／縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変化、細胞集団としての異形性／均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。これらの形態の変化は検鏡下での観察で確認することができる。特性の変化としては、足場依存性、サイトカイン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細胞遊走活性、拍動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性としては、細胞浸潤活性、細胞遊走活性がある。また、細胞内物質の変化としては例えば、酵素活性、ｍＲＮＡ量、Ｃａ^２＋やｃＡＭＰ等の細胞内情報伝達物質量、細胞内タンパク質量等を用いることができる。また、細胞膜受容体の場合には、受容体の刺激によって誘導される細胞の増殖活性の変化を指標とすることができる。組織系の指標としては、使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることができる。生体系の指標としては組織重量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変化、タンパク質量や、酵素活性、電解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、血圧、心拍数の変化等を用いることができる。

これらの検出指標を測定する方法としては、特に制限はなく、吸光、発光、発色、蛍光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動、等を用いることができる。これらの測定方法は当業者にとっては周知であり、目的に応じて、適宜選択することができる。例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータやプレートリーダ等、発光はルミノメータ等、蛍光はフルオロメータ等で測定することができる。質量は質量分析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマカウンターなどの測定機器を用いて、蛍光偏光度はＢＥＡＣＯＮ（宝酒造）、表面プラズモン共鳴シグナルはＢｉａｃｏｒｅ、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動などはＡＲＶＯなどにより測定できる。さらに、フローサイトメータなども測定に用いることができる。これらの測定方法は、一つの測定方法で２種以上の検出指標を測定しても良く、簡便であれば、２種以上の測定を同時及び／又は連続して測定することによりさらに多数の検出指標を測定することも可能である。例えば、蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を同時にフルオロメータで測定することができる。

また本発明は、本発明の抗体を含有する医薬組成物を提供する。本発明の抗体を含有する医薬組成物は血小板減少症などの治療および／または予防に有用である。また、血小板成分献血後に、本抗体を投与することにより、血小板数の正常値への回復の期間の短縮させたり、また本抗体の事前投与により、採血時の血小板成分量を増加させるために使用することができる。

本発明の抗体を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。

注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。

油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。

投与は好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。

また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
さらに本発明は、本発明の抗体を用いることにより、Ｍｐｌを発現する細胞にシグナルを誘起する方法に関する。具体的には、本発明の抗体をＭｐｌを発現する細胞に接触させることにより、該細胞にシグナルを誘起する方法に関する。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］抗ヒトＭｐｌ抗体の作製
１．１Ｍｐｌ発現ＢａＦ３細胞株の樹立
ＴＰＯ依存増殖性細胞株を得るために、全長Ｍｐｌ遺伝子を発現するＢａＦ３細胞株の樹立を行った。
全長ヒトＭｐｌｃＤＮＡ（Ｐａｌａｃｉｏｓら、Ｃｅｌｌ１９８５；４１：７２７−７３４）（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＭ＿００５３７３）をＰＣＲにより増幅し、ｐＣＨＯＩ（Ｈｉｒａｔａら、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒ１９９４；３５６：２４４−２４８）のＤＨＦＲ遺伝子発現部位を除去し、ＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１（Ｓａｔｏら、ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．１９９４；３１：３７１−３８１）のＮｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子発現部位を挿入した発現ベクターｐＣＯＳ２にクローニングし、ｐＣＯＳ２−ｈＭｐｌｆｕｌｌを構築した。
また、カニクイザル骨髄細胞から抽出したＴｏｔａｌＲＮＡからＳＭＡＲＴＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、カニクイザルＭｐｌｃＤＮＡ（配列番号：１６４）をクローニングした。得られたカニクイザルｃＤＮＡをｐＣＯＳ２に挿入し、ｐＣＯＳ２−ｍｏｎｋｅｙＭｐｌｆｕｌｌを構築した。
さらに、全長マウスＭｐｌｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＭ＿０１０８２３）をＰＣＲにより増幅し、ｐＣＯＳ２に挿入し、ｐＣＯＳ２−ｍｏｕｓｅＭｐｌｆｕｌｌを構築した。

作製した各ベクター（２０μｇ）をＰＢＳに懸濁したＢａＦ３細胞（１ｘ１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）に混合し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒキュベットに加え、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて０．３３ｋＶ，９５０μＦＤの容量でパルスを加えた。エレクトロポーレーション処理により遺伝子導入したＢａＦ３細胞を１ｎｇ／ｍＬマウスインターロイキン３（以下、ｍＩＬ−３、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、５００μｇ／ｍＬＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に加えて選抜し、ヒトＭｐｌ発現ＢａＦ３細胞株（以下、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌ）、サルＭｐｌ発現ＢａＦ３細胞株（以下、ＢａＦ３−ｍｏｎｋｅｙＭｐｌ）およびマウスＭｐｌ発現ＢａＦ３細胞株（以下、ＢａＦ３−ｍｏｕｓｅＭｐｌ）を樹立した。選抜後は、１ｎｇ／ｍＬｒｈＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ社製）、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養、維持した。

１．２Ｍｐｌ発現ＣＨＯ細胞株の樹立
ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙを用いた結合活性評価用の細胞株を得るために、全長Ｍｐｌ遺伝子を発現するＣＨＯ細胞株の樹立を行った。
はじめに、ｐＣＸＮ２（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ１９９１；１０８：１９３−１９９）のＨｉｎｄＩＩＩ部位にｐＣＨＯＩのＤＨＦＲ遺伝子発現部位を挿入して、発現ベクターｐＣＸＮＤ３を作製した。
ｐＣＯＳ２−ｈＭｐｌｆｕｌｌ、ｐＣＯＳ２−ｍｏｎｋｅｙＭｐｌｆｕｌｌおよびｐＣＯＳ２−ｍｏｕｓｅＭｐｌｆｕｌｌを鋳型にして、Ｈｉｓ−ｔａｇ配列を含むプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した各Ｍｐｌ遺伝子をｐＣＸＮＤ３にクローニングし、ｐＣＸＮＤ３−ｈＭｐｌ−Ｈｉｓ、ｐＣＸＮＤ３−ｍｏｎｋｅｙＭｐｌ−ＨｉｓおよびｐＣＸＮＤ３−ｍｏｕｓｅＭｐｌ−Ｈｉｓを構築した。

作製した各ベクター（２５μｇ）をＰＢＳに懸濁したＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（１ｘ１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）に混合し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒキュベットに加え、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて１．５ｋＶ，２５μＦＤの容量でパルスを加えた。エレクトロポーレーション処理により遺伝子導入したＣＨＯ細胞を５００μｇ／ｍＬＧｅｎｅｔｉｃｉｎ、１ｘＨＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に加えて選抜し、ヒトＭｐｌ発現ＣＨＯ細胞株（以下、ＣＨＯ−ｈｕｍａｎＭｐｌ）およびサルＭｐｌ発現ＣＨＯ細胞株（以下、ＣＨＯ−ｍｏｎｋｅｙＭｐｌ）およびマウスＭｐｌ発現ＣＨＯ細胞株（以下、ＣＨＯ−ｍｏｕｓｅＭｐｌ）を樹立した。

１．３可溶型ヒトＭｐｌタンパク質の調製
可溶型ヒトＭｐｌタンパク質を調製するため、昆虫細胞Ｓｆ９細胞で分泌産生する発現系を以下のように構築した。
ヒトＭｐｌの細胞外領域（Ｇｌｎ２６からＴｒｐ４９１）の下流にＦＬＡＧタグを付加した遺伝子を作製し、ｐＢＡＣＳｕｒｆ−１ＴｒａｎｓｆｅｒＰｌａｓｍｉｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＰｓｔＩ−ＳｍａＩ部位に挿入し、ｐＢＡＣＳｕｒｆ１−ｈＭｐｌ−ＦＬＡＧを作製した。続いて、Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、４μｇのｐＢＡＣＳｕｒｆ１−ｈＭｐｌ−ＦＬＡＧをＳｆ９細胞に導入した。培養３日後に培養上清を回収し、プラークアッセイにより組換えウイルスを単離した。ウイルスストックを調製後にＳｆ９細胞に感染させて培養上清を回収した。

得られた培養上清を用いて、以下のように可溶型ヒトＭｐｌタンパク質を精製した。培養上清をＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に吸着させた後に、５０ｍＭＮａ−ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒ，０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，５００ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．２）を用いて溶出した。溶出液をＦＬＡＧＭ２−Ａｇａｒｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）に吸着させた後に、１００ｍＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ３．５）を用いて溶出した。溶出後、直ちに１ＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）により中和し、ＰＤ−１０ｃｏｌｕｍｎ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、ＰＢＳ（−），０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０に置換を行った。精製した可溶型Ｍｐｌタンパク質をｓｈＭｐｌ−ＦＬＡＧと称する。

１．４ヒトＭｐｌ−ＩｇＧＦｃ融合タンパク質の調製
ヒトＭｐｌ−ＩｇＧＦｃ融合タンパク質遺伝子は、Ｂｅｎｎｅｔｔらの方法（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１；２６６：２３０６０−２３０６７）に従って作製した。ヒトＭｐｌの細胞外領域（Ｇｌｎ２６からＴｒｐ４９１）をコードする塩基配列をヒトＩｇＧ−γ１のＦｃ領域（Ａｓｐ２１６よりの下流の領域）をコードする塩基配列に連結し、連結部にＦｕｓｉｏｎＬｉｎｋｅｒとしてＢｓｔＥＩＩ配列（アミノ酸Ｖａｌ−Ｔｈｒ）を付加した。シグナル配列は、ヒトＩｇＧＨ鎖可変領域のシグナルペプチド１９アミノ酸を使用した。得られたヒトＭｐｌ−ＩｇＧＦｃ融合タンパク質遺伝子をｐＣＸＮＤ３にクローニングし、ｐＣＸＮＤ３−ｈＭｐｌ−Ｆｃを構築した。
作製したベクター（２５μｇ）をＰＢＳに懸濁したＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（１ｘ１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）に混合し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒキュベットに加え、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて１．５ｋＶ，２５μＦＤの容量でパルスを加えた。エレクトロポーレーション処理により遺伝子導入したＣＨＯ細胞を５００μｇ／ｍＬＧｅｎｅｔｉｃｉｎ、１ｘＨＴを含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地に加えて選抜し、ｓｈＭＰＬ−Ｆｃ発現ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−ｈＭｐｌ−Ｆｃ）を樹立した。

得られた培養上清を用いて、以下のようにヒトＭｐｌ−ＩｇＧＦｃ融合タンパク質を精製した。
培養上清をＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に吸着させた後に、５０ｍＭＮａ−ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒ，０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，１ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．６）を用いて溶出した。溶出液をＨｉＴｒａｐｐｒｏｔｅｉｎＧＨＰカラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に吸着させた後に、０．１ＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ２．７）を用いて溶出した。溶出後、直ちに１ＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）により中和し、ＰＤ−１０ｃｏｌｕｍｎ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、ＰＢＳ（−），０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０に置換を行った。精製した可溶型Ｍｐｌタンパク質をｈＭｐｌ−Ｆｃと称する。

１．５ｓｈＭｐｌ−ＦＬＡＧまたはＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌの免疫およびハイブリドーマの選抜
ＭＲＬ／ＭｐＪＵｍｍＣｒｊ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（以下、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス、日本チャールス・リバーより購入）を用いて、８週齢より免疫を開始した。初回免疫は１００μｇ／匹のｓｈＭＰＬ−ＦＬＡＧにフロイント完全アジュバント（Ｈ３７Ｒａ、ベクトン・ディッキンソン社製）を加え、エマルジョン化したものを皮下に投与した。追加免疫は５０μｇ／匹のｓｈＭＰＬ−ＦＬＡＧにフロイント不完全アジュバント（ベクトン・ディッキンソン社製）を加え、エマルジョン化したものを皮下に投与した。合計６回免疫を行ったマウス３匹に対し、５０μｇ／匹のｓｈＭＰＬ−ＦＬＡＧを尾静脈内投与することにより最終免疫を行った。マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１、ＡＴＣＣより購入）とマウス脾臓細胞を混合し、ＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅＧｌｙｃｏｌ１５００（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を加えながら混合することにより細胞融合を行った。翌日よりＨＡＴ培地を用いて選抜を行い、培養上清を用いてｓｈＭｐｌ−ＦＬＡＧまたはｈＭｐｌ−Ｆｃを固相化したイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡおよびＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌを用いた細胞増殖活性を指標としたスクリーニングを実施した。また、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌをＢａｌｂ／Ｃマウスに１．０ｘ１０^７細胞ずつ１週間から５ヶ月の間隔で腹腔内投与し、合計１１回免疫した。同様に細胞融合によりハイブリドーマを作製し、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌを用いた細胞増殖活性を指標としたスクリーニングを実施した。陽性クローンについて、限界希釈法によりモノクローン化した後に、拡大培養を行い、培養上清を回収した。

１．６抗ヒトＭｐｌ抗体の解析
抗体濃度はヤギ抗マウスＩｇＧ（ｇａｍｍａ）（ＺＹＭＥＤ社製）とアルカリフォスファターゼ−ヤギ抗マウスＩｇＧ（ｇａｍｍａ）（ＺＹＭＥＤ社製）を用いたマウスＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、Ｉｓｏｔｙｐｅの等しい市販抗体をスタンダードにして、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，ＵＳＡ）を用いて検量線を作成し、抗体濃度の換算を行った。
抗体のアイソタイプは、アイソタイプ特異的な二次抗体を用いた抗原依存的ＥＬＩＳＡにて決定した。ｈＭｐｌ−Ｆｃを１μｇ／ｍＬとなるようにｃｏａｔｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（０．１ｍＭＮａＨＣＯ_３（ｐＨ９．６），０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ_３）で希釈したものを加え、４℃にて一晩反応し、コーティングした。Ｄｉｌｕｅｎｔｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１），１ｍＭＭｇＣｌ_２，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ_３，１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）にてブロッキング処理を行った後、ハイブリドーマの培養上清を加え、室温で１時間放置した。Ｒｉｎｓｅｂｕｆｆｅｒ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＢＳ）にて洗浄した後、Ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識したアイソタイプ特異的二次抗体を加え、室温で１時間放置した。発色はＳＩＧＭＡ１０４（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を１ｍｇ／ｍＬとなるようにＳｕｂｓｔｒａｔｅＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＮａＨＣＯ_３（ｐＨ９．８），１０ｍＭＭｇＣｌ_２）に希釈したものを用い、４０５ｎｍの吸光度をＢｅｎｃｈｍａｒｋＰｌｕｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にて測定した。

ｓｈＭｐｌ−ＦＬＡＧおよびｈＭＰＬ−Ｆｃに対する結合活性は、ＥＬＩＳＡにより評価した。精製したｓｈＭｐｌ−ＦＬＡＧおよびｈＭＰＬ−Ｆｃを１μｇ／ｍＬになるようにコーティングし、Ｄｉｌｕｅｎｔｂｕｆｆｅｒにてブロッキング処理を行った。ハイブリドーマの培養上清を加え、室温で１時間放置した後、ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を加え、上記方法と同様に発色を行った。室温で１時間発色させた後に４０５ｎｍの吸光度を測定し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを用いてＥＣ_５０値を算出した。
ＣＨＯ−ｈｕｍａｎＭｐｌまたはＣＨＯ−ｍｏｎｋｅｙＭｐｌを回収し、１ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＦＡＣＳＢｕｆｆｅｒ（１％ＦＢＳ／ＰＢＳ）に懸濁した。１００μＬ／ｗｅｌｌとなるようにＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に分注し、遠心操作にて培養上清を除去した。５μｇ／ｍＬになるように希釈した培養上清を加え、氷上にて３０分間反応させた。細胞をＦＡＣＳｂｕｆｆｅｒにて１回洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製）を添加し、氷上にて３０分間反応させた。反応後、５００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を除き、ＦＡＣＳＢｕｆｆｅｒ４００μＬに懸濁し、ＥＰＩＣＳＥＬＩＴＥＥＳＰ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を用いてフローサイトメトリーを行った。前方散乱光（ｆｏｒｗａｒｄｓｃａｔｔｅｒ）及び側方散乱光（ｓｉｄｅｓｃａｔｔｅｒ）のヒストグラムにて生細胞集団にゲートを設定した。

抗体のアゴニスト活性は、ＴＰＯ依存性増殖を示すＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌまたはＢａＦ３−ｍｏｎｋｅｙＭｐｌを用いて評価した。各細胞をそれぞれ４ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、６０μＬ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに分注した。ｒｈＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ社製）およびハイブリドーマ培養上清の濃度を振り、各ｗｅｌｌに４０μＬ加え、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で、２４時間培養した。１０μＬ／ｗｅｌｌでＣｅｌｌＣｏｕｎｔＲｅａｇｅｎｔＳＦ（ナカライテスク社製）を加え、２時間培養後に、４５０ｎｍの吸光度（対照６５５ｎｍ）をＢｅｎｃｈｍａｒｋＰｌｕｓにて測定し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを用いてＥＣ_５０値を算出した。
これらの解析により、ヒトＭｐｌに結合するマウスモノクローナル抗体を合計１６３個取得した。
以下に記載する抗ヒトＭｐｌ抗体の中で、ＴＡ１３６はＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌ免疫マウスより樹立され、それ以外の抗体はｓｈＭｐｌ−Ｆｌａｇ免疫マウスより樹立した。

１．７抗ヒトＭｐｌ抗体の精製
ハイブリドーマの培養上清を用いて、以下のように抗ヒトＭｐｌ抗体を精製した。
培養上清をＨｉＴｒａｐｐｒｏｔｅｉｎＧＨＰカラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に吸着させた後に、０．１ＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）を用いて溶出した。溶出後、直ちに１ＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ９．０）により直ちに中和し、ＰＢＳで一昼夜透析を行い、バッファー置換を行った。

１．８抗ヒトＭｐｌ抗体ＶＢ２２Ｂのエピトープの決定
抗ヒトＭｐｌ抗体ＶＢ２２Ｂがｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇに使用可能である性質を利用し、ヒトＭｐｌの部分配列とＧＳＴの融合蛋白質を構築しＶＢ２２Ｂのエピトープ解析を行った。ＭＧ１（Ｇｌｎ２６からＴｒｐ４９１）、ＭＧ２（Ｇｌｎ２６からＬｅｕ２７４）の領域をそれぞれＰＣＲ増幅し、ＧＳＴ融合蛋白質として発現されるようにｐＧＥＸ−４Ｔ−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）へクローニングした。プラスミドＤＮＡをＤＨ５αへ導入し形質転換体を得、対数増殖期にある形質転換体に１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えることによりＧＳＴ融合蛋白質の発現を誘導し、２時間培養後に菌体を回収した。Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎにより破砕後、ＸＬ−８０Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｒｏｔｏｒ７０．１Ｔｉ）を用い３５，０００ｒｐｍで３０分遠心後の培養上清を回収し、ＧＳＴＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＭｏｄｕｌｅｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて精製した。１０％−ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、ＰＶＤＦ膜にトランスファーし、ＶＢ２２Ｂマウス抗体を用いたｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。ＶＢ２２ＢはＭＧ−１、ＭＧ−２を認識した事から、ＶＢ２２ＢのエピトープはＧｌｎ２６からＬｅｕ２７４の領域にあることが判明した。

次に、ＭＧ３（Ｇｌｎ２６からＡｌａ１８９）、ＭＧ４（Ｇｌｎ２６からＰｒｏ１０６）、ＭＧ５（Ｇｌｎ２６からＧｌｕ２５９）、ＭＧ６（Ｇｌｎ２６からＧｌｙ２４５）の領域とＧＳＴの融合蛋白を作製し同様にｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇを行った結果、ＶＢ２２ＢはＭＧ５、ＭＧ６を認識したが、ＭＧ３、ＭＧ４を認識しなかった事から、ＶＢ２２ＢのエピトープはＡｌａ１８９からＧｌｙ２４５の周辺に存在する事が予想された。さらにＭＧ７（Ｇｌｎ２６からＡｌａ２３１）、ＭＧ８（Ｇｌｎ２６からＰｒｏ２１７）とＧＳＴの融合蛋白質を作製し評価した結果、ＶＢ２２ＢはＭＧ７を認識したが、ＭＧ８は認識しなかった事から、ＶＢ２２ＢのエピトープはＧｌｎ２１７からＡｌａ２３１の周辺に存在することが示された。さらにＭＧ１０（Ｇｌｎ２１３からＡｌａ２３１）とＧＳＴの融合蛋白質との結合が確認されたことから、ＶＢ２２ＢのエピトープはＧｌｎ２１３からＡｌａ２３１の１９アミノ酸に限定された。

１．９抗ヒトＭｐｌ抗体ＶＢ２２Ｂの抗原抗体反応の反応速度論的解析
抗ヒトＭｐｌ抗体ＶＢ２２Ｂが可溶型組換えＭｐｌに結合する性質を利用し、実施例１．４で示したヒトＭｐｌ−ＩｇＧＦｃ融合タンパク質とＶＢ２２ＢＩｇＧとの抗原抗体反応における速度論的な解析を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）にＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）をセットし、アミンカップリング法にてヒトＭｐｌ−ＩｇＧＦｃ融合タンパク質を固定化した。次に、ＨＢＳ−ＥＰＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を用いて１．２５〜２０μｇ／ｍＬのＶＢ２２ＢＩｇＧを調製し、ＶＢ２２ＢＩｇＧを２分間添加し、結合領域を得た後に、ＨＢＳ−ＥＰＢｕｆｆｅｒを２分間添加することで解離領域を得た。ＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐ上のヒトＭｐｌ−ＩｇＧＦｃ融合タンパク質に結合したＶＢ２２ＢＩｇＧは、１０ｍＭＮａＯＨを１５秒間添加して除去し、ＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐを再生した。ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰＢｕｆｆｅｒを用い、流速は２０μＬ／ｍｉｎとした。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎｖｅｒ．３．１ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を用いて、各濃度で得られたセンサーグラムより反応速度定数を算出した。その結果、ＶＢ２２ＢＩｇＧの解離定数（ＫＤ）は１．６７±０．７１３×１０^−９Ｍであった。

［実施例２］抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体の作製
取得した抗ヒトＭｐｌ抗体の中で、結合活性およびアゴニスト活性が高かった２３種類の抗体について、遺伝子工学的手法により一本鎖抗体の発現系を構築した。以下に抗ヒトＭｐｌ抗体ＶＢ２２Ｂの一本鎖抗体作製例について示す。

２．１抗ヒトＭｐｌ抗体可変領域のクローニング
抗ヒトＭｐｌ抗体を産生するハイブリドーマより抽出したＴｏｔａｌＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した。ＴｏｔａｌＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて１ｘ１０^７細胞のハイブリドーマより抽出した。
１μｇのＴｏｔａｌＲＮＡを使用して、ＳＭＡＲＴＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて、マウスＩｇＧ２ｂ定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドＭＨＣ−ＩｇＧ２ｂ（配列番号：１６６）またはマウスκ鎖定常領域塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドｋａｐｐａ（配列番号：１６７）を用いて、５’末端側遺伝子断片を増幅した。逆転写反応は４２℃で１時間３０分間反応させた。

ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＡｄＶａｎｔａｇｅ２ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、
５μＬの１０×ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｉｍｅｒＡＭｉｘ、
０．２ｍＭｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ２ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＭｉｘ
（以上の成分はいずれもＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、
２．５μＬの逆転写反応産物、
１０ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチドＭＨＣ−ＩｇＧ２ｂまたはｋａｐｐａ
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／５秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復、
９４℃／５秒間、７０℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復、
９４℃／５秒間、６８℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを２５回反復、
最後に反応産物を７２℃で７分間加熱した。

ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングした。さらに、ＡＢＩ３７００ＤＮＡＡｎａｌｙｚｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて塩基配列を決定した。
クローニングしたＶＢ２２ＢＨ鎖可変領域（以下、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨ）の塩基配列を配列番号：１１７、アミノ酸配列を配列番号：１１８、およびＬ鎖可変領域（以下、ＶＢ２２Ｂ−ＶＬ）の塩基配列を配列番号：１１９、アミノ酸配列を配列番号：１２０に示す。

２．２抗ヒトＭｐｌ抗体Ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターの作製
５アミノ酸からなるリンカー配列を用いたＶＢ２２Ｂ一本鎖Ｆｖ（以下、ＶＢ２２ＢＤｉａｂｏｄｙ）をコードする遺伝子は、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨをコードする遺伝子の３’末端およびＶＢ２２Ｂ−ＶＬをコードする遺伝子の５’末端に（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_１から成るリンカーをコードする塩基配列を付加させた遺伝子について、それぞれＰＣＲ法を用いて増幅し、連結することにより構築した。

ＶＢ２２Ｂ−ＶＨの前方プライマー７０・１１５ＨＦ（配列番号：１６８）は、ＥｃｏＲＩ部位を有するように設計し、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨの後方プライマー３３・１１５ＨＲ（配列番号：１６９）は、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、かつ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_１から成るリンカーをコードする塩基配列ならびにＶＢ２２Ｂ−ＶＬのＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズする塩基配列を有するように設計した。ＶＢ２２Ｂ−ＶＬの前方プライマー３３・１１５ＬＦ（配列番号：１７０）は、ＶＢ２２Ｂ−ＶＬのＮ末端をコードする塩基配列ならびに（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_１から成るリンカーをコードする塩基配列、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨのＣ末端をコードする塩基配列を有するように設計した。ＶＢ２２Ｂ−ＶＬの後方プライマー３３・１１５ＬＲ（配列番号：１７１）は、ＶＢ２２Ｂ−ＶＬのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、かつＦＬＡＧタグ（ＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ／配列番号：１７２）をコードする塩基配列を有し、さらにＮｏｔＩ部位を有するように設計した。

第一ＰＣＲにおいて、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨおよびリンカー配列とＶＢ２２Ｂ−ＶＬおよびリンカー配列を含む２つのＰＣＲ反応物を以下のように合成した。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、
０．４ｍＭｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａＥＸＴａｑ
（以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
１０ｎｇのＶＢ２２Ｂ−ＶＨまたはＶＢ２２Ｂ−ＶＬ遺伝子を含むｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙベクター、
１０ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチド７０・１１５ＨＦ、３３・１１５ＨＲまたは３３・１１５ＬＦ、３３・１１５ＬＲ
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／１５秒間、７２℃／２分間のサイクルを５回反復、
９４℃／１５秒間、７０℃／２分間のサイクルを５回反復、
９４℃／１５秒間、６８℃／２分間のサイクルを２８回反復、
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。

約４００ｂｐのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、各ＰＣＲ産物の一部を用いて以下のように第二ＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、
０．４ｍＭｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａＥＸＴａｑ
（以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
１μＬの第一ＰＣＲ産物（２種類）、
１０ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチド７０・１１５ＨＦ、３３・１１５ＬＲ
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／１５秒間、７２℃／２分間のサイクルを５回反復、
９４℃／１５秒間、７０℃／２分間のサイクルを５回反復、
９４℃／１５秒間、６８℃／２分間のサイクルを２８回反復、
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。

約８００ｂｐのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ｐＣＸＮＤ３にクローニングし、ｐＣＸＮＤ３−ＶＢ２２Ｂｄｂを作製した。

２．３抗ヒトＭｐｌ抗体ｓｃ（Ｆｖ）２発現ベクターの作製
ＶＢ２２Ｂ由来の２つのＨ鎖可変領域および２つのＬ鎖可変領域を含む改変抗体
［ｓｃ（Ｆｖ）２］を発現するプラスミドを作製するために、前述のｐＣＸＮＤ３−ＶＢ２２Ｂｄｂを用いて以下のようにＰＣＲ法により修飾した。ｓｃ（Ｆｖ）２遺伝子の構築過程について、図１に示した。

はじめに、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨをコードする遺伝子の３’末端およびＶＢ２２Ｂ−ＶＬをコードする遺伝子の５’末端に１５アミノ酸から成るリンカー（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３をコードする塩基配列を付加させた遺伝子について、それぞれＰＣＲ法を用いて増幅し、連結することにより構築した。この構築過程において、３種類のプライマーを新たに設計した。ＶＢ２２Ｂ−ＶＨの前方プライマーＶＢ２２Ｂ−ｆｐｖｕ（プライマーＡ，配列番号：１７３）は、５’末端にＥｃｏＲＩ部位を有し、ＶＢ２２ＢｄｂのＧｌｎ２２およびＬｅｕ２３がＰｖｕＩＩ部位に変換するように設計した。ＶＢ２２Ｂ−ＶＨの後方プライマーｓｃ−ｒＬ１５（プライマーＢ，配列番号：１７４）は、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、かつ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３から成るリンカーをコードする塩基配列ならびにＶＢ２２Ｂ−ＶＬのＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズする塩基配列を有するように設計した。ＶＢ２２Ｂ−ＶＬの前方プライマーｓｃ−ｆＬ１５（プライマーＣ，配列番号：１７５）は、ＶＢ２２Ｂ−ＶＬのＮ末端をコードする塩基配列ならびに（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３から成るリンカーをコードする塩基配列、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨのＣ末端をコードする塩基配列を有するように設計した。

第一ＰＣＲにおいて、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨおよびリンカー配列とＶＢ２２Ｂ−ＶＬおよびリンカー配列を含む２つのＰＣＲ反応物を以下のように合成した。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、
０．４ｍＭｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａＥＸＴａｑ
（以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
１０ｎｇのｐＣＸＮＤ３−ＶＢ２２Ｂｄｂ、
１０ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチドＶＢ２２Ｂ−ｆｐｖｕ、ｓｃ−ｒＬ１５またはｓｃ−ｆＬ１５、３３・１１５ＬＲ
（プライマーＤ）
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／１５秒間、７２℃／２分間のサイクルを５回反復、
９４℃／１５秒間、７０℃／２分間のサイクルを５回反復、
９４℃／１５秒間、６８℃／２分間のサイクルを２８回反復、
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。

約８００ｂｐのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ｐＢａｃＰＡＫ９（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）にクローニングし、ｐＢａｃＰＡＫ９−ｓｃＶＢ２２Ｂを作製した。

次に、ｐＢａｃＰＡＫ９−ｓｃＶＢ２２ＢのＰｖｕＩＩ部位に挿入する断片を作製した。すなわちＮ末端が欠けたＶＢ２２Ｂ−ＶＨとＶＢ２２Ｂ−ＶＬを（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３から成るリンカーで連結したアミノ酸をコードする遺伝子をさらにＶＢ２２Ｂ−ＶＨのＮ末端をコードする遺伝子と（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３から成るリンカーをコードする塩基配列で連結する断片で、両末端がＰｖｕＩＩ認識配列となる断片である。２種類のプライマーを新たに設計し、ＰＣＲ法を用いて、この断片を作製した。目的断片の前方プライマーＦｖ２−ｆ（プライマーＥ，配列番号：１７６）は、５’末端にＰｖｕＩＩ部位を有し、ＶＢ２２Ｂ−ＶＨの５’末端側の配列を持つように設計した。目的断片の後方プライマーＦｖ２−ｒ（プライマーＦ，配列番号：１７７）は、ＶＢ２２Ｂ−ＶＬのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、かつ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３から成るリンカーをコードする塩基配列ならびにＶＢ２２Ｂ−ＶＨのＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズする塩基配列、さらにＰｖｕＩＩ部位を有するように設計した。ｐＢａｃＰＡＫ９−ｓｃＶＢ２２Ｂを鋳型にして、以下のようにＰＣＲを行った。

ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、
０．４ｍＭｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａＥＸＴａｑ
（以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
１０μｇのｐＢａｃＰＡＫ９−ｓｃＶＢ２２Ｂ、
１０ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチドＦｖ２−ｆ、Ｆｖ２−ｒ
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／１５秒間、７２℃／２分間のサイクルを５回反復、
９４℃／１５秒間、７０℃／２分間のサイクルを５回反復、
９４℃／１５秒間、６８℃／２分間のサイクルを２８回反復、
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。

約８００ｂｐのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングした。塩基配列の決定後、制限酵素ＰｖｕＩＩ（宝酒造社製）で消化した後に、目的断片を回収した。ｐＢａｃＰＡＫ９−ｓｃＶＢ２２Ｂを制限酵素ＰｖｕＩＩ（宝酒造社製）で消化した後に、回収した断片を連結し、ｐＢａｃＰＡＫ９−ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２を作製した。作製したベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約１６００ｂｐの断片をアガロースゲルから精製し、発現ベクターｐＣＸＮＤ３にクローニングし、ｐＣＸＮＤ３−ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２を作製した。

２．４動物細胞を用いた抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体の発現
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を用いた一本鎖抗体の安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。発現ベクター（２５μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（１×１０^７細胞／ｍＬ）の０．７５ｍＬを混合したものを氷上で１０分間冷却し、キュベットに移した後に１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、５００μｇ／ｍＬＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に加えて選抜し、発現ＣＨＯ細胞株を樹立した。ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２は、この方法で安定発現細胞株およびその培養上清を調製した。

ＣＯＳ７細胞を用いた一本鎖抗体の一過性発現は次のようにして行った。発現ベクター（１０μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＯＳ７細胞（１×１０^７細胞／ｍＬ）の０．７５ｍＬを混合したものを氷上で１０分間冷却し、キュベットに移した後に１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）に加え、一晩培養した後に、ＰＢＳで洗浄後にＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地を加えて約３日間培養した。ＶＢ２２ＢＤｉａｂｏｄｙは、この方法で培養上清を調製した。

２．５培養上清中の抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体の定量
ＣＯＳ細胞に一過性発現させた抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体の培養上清中の濃度は、表面プラズモン共鳴を利用して測定した。すなわちＢｉａｃｏｒｅ２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）にＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）をセットし、ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧＭ２ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を結合した。流速５ｍＬ／ｓｅｃで適濃度のサンプルを流し、５０ｍＭジエチルアミンを流して結合した抗体を解離させた。サンプルを流したときの質量変化を測定し、標準品の質量変化に基づいて作成した検量線を用いて、濃度を算出した。Ｄｉａｂｏｄｙについての標準品は、ｄｂ１２Ｅ１０（ＷＯ０２／３３０７３、ＷＯ０２／３３０７２参照）を使用し、ｓｃ（Ｆｖ）２についての標準品は同じ遺伝子構造を持つ１２Ｅ１０ｓｃ（Ｆｖ）２を使用した。

２．６抗ヒトＭｐｌＤｉａｂｏｄｙおよび一本鎖抗体の精製
ＶＢ２２ＢＤｉａｂｏｄｙ発現ＣＯＳ７細胞あるいはＣＨＯ細胞の培養上清を、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で平衡化したＡｎｔｉ−ＦｌａｇＭ２ＡｆｆｉｎｉｔｙＧｅｌ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）カラムに吸着させ、１００ｍＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．５）で溶出させた。溶出画分は、直ちに１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和を行い、ＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）カラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマトグラフィーのバッファーは、ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。

ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２発現ＣＯＳ７細胞あるいはＣＨＯ細胞の培養上清を、Ｄｉａｂｏｄｙ精製と同一条件で精製を行った。また、大量に調製する場合には、ＣＨＯ細胞の培養上清を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したＭａｃｒｏ−ＰｒｅｐＣｅｒａｍｉｃＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅＴｙｐｅＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）カラムにかけ、２５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で段階的に溶出した。溶出画分は、限外ろ過膜を用いて濃縮後、ＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、分子量が約４０ｋＤ〜７０ｋＤに相当する画分を分取した。この画分を、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で平衡化したＡｎｔｉ−ＦｌａｇＭ２ＡｆｆｉｎｉｔｙＧｅｌカラムに吸着させ、１００ｍＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．５）で溶出させた。溶出画分は、直ちに１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和を行い、ＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマトグラフィーのバッファーは、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０），１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を使用した。各精製ステップにおいて、Ｄｉａｂｏｄｙおよびｓｃ（Ｆｖ）２の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｆｌａｇ抗体（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＬＩＣＨ社）を用いたＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇを用いて行なった。それぞれ、分取したピーク画分をＬａｅｍｌｉの方法に準じて電気泳動し、クマシーブリリアントブルーで染色した結果、Ｄｉａｂｏｄｙでは、見かけ上の分子量約２９ｋＤａに、またｓｃ（Ｆｖ）２では、見かけ上の分子量約５５ｋＤａに、それぞれ単一のバンドが検出された。

２．７ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙによる抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体の結合活性の評価
ＣＨＯ−ｈｕｍａｎＭｐｌ、ＣＨＯ−ｍｏｎｋｅｙＭｐｌおよびＣＨＯ−ｍｏｕｓｅＭｐｌを回収し、１ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＦＡＣＳＢｕｆｆｅｒ（１％ＦＢＳ／ＰＢＳ）に懸濁した。１００μＬ／ｗｅｌｌとなるようにＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＨＶＦｉｌｔｅｒＰｌａｔｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に分注し、遠心操作にて上清を除去した。適濃度のＤｉａｂｏｄｙまたはｓｃ（Ｆｖ）２を加え、氷上にて３０分間反応させた。細胞を２００μＬのＦＡＣＳｂｕｆｆｅｒにて１回洗浄し、１０μｇ／ｍＬのＡＮＴＩ−ＦＬＡＧＭ２ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を添加し、氷上にて３０分間反応させた。次に２００μＬのＦＡＣＳｂｕｆｆｅｒにて細胞を１回洗浄した後、１００倍希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製）を添加し、氷上にて３０分間反応させた。最後に遠心し上清を除き、ＦＡＣＳＢｕｆｆｅｒ４００μＬに懸濁し、ＥＰＩＣＳＥＬＩＴＥＥＳＰ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社）を用いてＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙに供した。前方散乱光（ｆｏｒｗａｒｄｓｃａｔｔｅｒ）及び側方散乱光（ｓｉｄｅｓｃａｔｔｅｒ）のヒストグラムにて生細胞集団にゲートを設定した。

精製したＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２を用いて、各種Ｍｐｌを発現させたＣＨＯ細胞に対する結合活性を評価した結果を図２に示す。宿主細胞であるＣＨＯおよびＣＨＯ−ｍｏｕｓｅＭｐｌに対しては結合活性を示さず、ＣＨＯ−ｈｕｍａｎＭｐｌおよびＣＨＯ−ｍｏｎｋｅｙＭｐｌに特異的に結合することが確認された。この結合活性の傾向は、ＶＢ２２ＢＩｇＧと変わらないことから、低分子化により抗体の結合部位は変化していないことが推測された。

２．８抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体のＴＰＯ様アゴニスト活性の評価
ＴＰＯ依存性増殖を示すＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌまたはＢａＦ３−ｍｏｎｋｅｙＭｐｌを用いてＴＰＯ様アゴニスト活性を評価した。
各細胞を１％ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で２回洗浄した後、４ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍを含むＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、６０μＬ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに分注した。ｒｈＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ社製）、ＣＯＳ７培養上清または精製品の濃度を振り、各ｗｅｌｌに４０μＬ加え、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で、２４時間培養した。１０μＬ／ｗｅｌｌでＷＳＴ−８試薬（ＣｅｌｌＣｏｕｎｔＲｅａｇｅｎｔＳＦ、ナカライテスク社製）を加え、直後にＢｅｎｃｈｍａｒｋＰｌｕｓを用いて４５０ｎｍの吸光度（対照６５５ｎｍ）を測定し、２時間培養後に、再度４５０ｎｍの吸光度（対照６５５ｎｍ）を測定した。ＷＳＴ−８試薬は生細胞数に応じて４５０ｎｍの発色反応を呈することから、２時間の吸光度変化を指標にＴＰＯ様アゴニスト活性を評価した。また、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを用いてＥＣ_５０値を算出した。

また、ＴＰＯ依存性増殖を示すヒト白血病細胞株であるＭ−０７ｅ（ＤＳＭＺより購入）を使用して、ＴＰＯ様アゴニスト活性を評価した。Ｍ−０７ｅを１％ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍを含むＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄した後、５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍを含むＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、５０μＬ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに分注した。ｒｈＴＰＯ、ＣＯＳ７培養上清または精製品の濃度を振り、各ｗｅｌｌに５０μＬ加え、３７℃、５％ＣＯ_２件下で、４８時間培養した。１０μＬ／ｗｅｌｌでＷＳＴ−８試薬（ＣｅｌｌＣｏｕｎｔＲｅａｇｅｎｔＳＦ、ナカライテスク社製）を加え、直後にＢｅｎｃｈｍａｒｋＰｌｕｓを用いて４５０ｎｍの吸光度（対照６５５ｎｍ）を測定し、４時間培養後に、再度４５０ｎｍの吸光度（対照６５５ｎｍ）を測定した。４時間の吸光度変化を指標にＴＰＯ様アゴニスト活性を評価した。

精製したＶＢ２２ＢＩｇＧ、ＶＢ２２ＢＤｉａｂｏｄｙおよびＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２を用いて、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌ、ＢａＦ３−ｍｏｎｋｅｙＭｐｌ、Ｍ−０７ｅでのＴＰＯ様アゴニスト活性を評価した結果をそれぞれ図３、図４、図５に示す。アゴニスト活性は、抗原結合部位が二価であることが重要であるが、抗原結合部位間の距離や角度も重要な要素であると考えられる（ＷＯ０２／３３０７３、ＷＯ０２／３３０７２参照）。新たに取得した抗ヒトＭｐｌ抗体も同様であり、ＶＢ２２ＢＩｇＧ（ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌＥＣ_５０：＞３０ｎＭ）に対して、ＶＢ２２ＢＤｉａｂｏｄｙおよびＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２は高いアゴニスト活性（ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌＥＣ_５０：それぞれ６１ｐＭ，２７ｐＭ）であり、天然リガンドであるｈｕｍａｎＴＰＯ（ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌＥＣ_５０：７６ｐＭ）と同等以上の活性を示した。ＶＢ２２ＢＤｉａｂｏｄｙと比較してＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２が高い活性を示したことから、一本鎖抗体はリンカー配列の長さや分子形状によって構造が大きく変化し、アゴニスト活性も変化することが推測される。このような高いアゴニスト活性を示す１６種類の抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体を取得した。代表的な抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域のアミノ酸配列についてそれぞれ図６および図７に示す。

２．９抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体のヒト化
ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２のヒト化を実施するために、公開されているＫａｂａｔＤａｔａｂａｓｅ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｋａｂａｔ／）より抗体の配列データを入手し、Ｈ鎖可変領域、Ｌ鎖可変領域に分けてホモロジー検索を行った。その結果、Ｈ鎖可変領域はＤＮ１３（Ｓｍｉｔｈｓｏｎら、ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．１９９９；３６：１１３−１２４）と高い相同性を持つことが分かった。また、Ｌ鎖可変領域はＴｏＰ０２７（Ｈｏｕｇｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；１６２：２２４−２３７）と高い相同性を持つことが分かった。これらの抗体のフレームワーク領域（以下、ＦＲ）に相補性抗原決定領域（以下、ＣＤＲ）を移植したヒト化抗体を作製した。ヒト化抗体ｓｃ（Ｆｖ）２をＣＨＯ−ＤＧ４４細胞にて発現させ、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌを用いたアゴニスト活性を評価した。アゴニスト活性を指標に、ＦＲ内にアミノ酸置換を加え、マウス型ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２と同等のアゴニスト活性を有するヒト化ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２を作製した。

具体的には、５０ｂａｓｅ程度の合成オリゴＤＮＡを約２０ｂａｓｅ程度ハイブリダイズするように設計し、これらの合成オリゴＤＮＡをＰＣＲ法によりアッセンブリさせて各可変領域をコードする遺伝子を作製した。これらの遺伝子を用いて、実施例２．３の方法と同様に、ｓｃ（Ｆｖ）２を作製し、発現ベクターｐＣＸＮＤ３にクローニングし、ヒト化ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２を挿入した各発現ベクターｐＣＸＮＤ３−ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚｓｃ（Ｆｖ）２、ｐＣＸＮＤ３−ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅｓｃ（Ｆｖ）２、ｐＣＸＮＤ３−ｈＶＢ２２Ｂｅｓｃ（Ｆｖ）２、ｐＣＸＮＤ３−ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ｓｃ（Ｆｖ）２、ｐＣＸＮＤ３−ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ｓｃ（Ｆｖ）２を作製した。本プラスミドに含まれるｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚｓｃ（Ｆｖ）２の塩基配列を配列番号：１に、アミノ酸配列を配列番号：２に、ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅｓｃ（Ｆｖ）２の塩基配列を配列番号：２５３に、アミノ酸配列を配列番号：２５４に、ｈＶＢ２２Ｂｅｓｃ（Ｆｖ）２の塩基配列を配列番号：２５９に、アミノ酸配列を配列番号：２６０に、ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ｓｃ（Ｆｖ）２の塩基配列を配列番号：２８６に、アミノ酸配列を配列番号：２８７に、ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ｓｃ（Ｆｖ）２の塩基配列を配列番号：２９２に、アミノ酸配列を配列番号：２９３に示す。またマウス型ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２の塩基配列を配列番号：２６３に、アミノ酸配列を配列番号：２６４に示す。実施例２．４の方法と同様にＣＨＯ−ＤＧ４４細胞に発現させ、培養上清を回収した。ヒト化ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２はＦｌａｇタグを付加していないことから、培養上清からの精製は、実施例１．８に記載したＶＢ２２Ｂが認識するエピトープであるＭＧ１０（Ｇｌｎ２１３からＡｌａ２３１）とＧＳＴ融合蛋白質を利用して行った。ＭＧ１０とＧＳＴ融合蛋白質の精製は、ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、メーカーのプロトコールに従って精製した。さらに、精製したＭＧ１０とＧＳＴ融合蛋白質をメーカーのプロトコールに従って、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄＨＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に固定化し、アフィニティカラムを作製した。ヒト化ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２発現ＣＨＯ細胞の培養上清を、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０で平衡化したＭＧ１０−ＧＳＴ融合蛋白質固定化カラムに流し、ヒト化ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２を吸着させ、１００ｍＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．５），０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０で溶出させた。溶出画分は直ちに１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で中和を行い、ＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマトグラフィーの緩衝液は、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５），３００ｍＭＮａＣｌ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を使用した。得られた精製品を用いて、実施例２．８の方法と同様にＴＰＯ様アゴニスト活性を評価した。精製したマウス型ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２、ｈＶＢ２２Ｂｐ−ｚｓｃ（Ｆｖ）２、ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ｓｃ（Ｆｖ）２、ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ｓｃ（Ｆｖ）２およびヒト化したｈＶＢ２２Ｂｅｓｃ（Ｆｖ）２、ｈＶＢ２２Ｂｇ−ｅｓｃ（Ｆｖ）２を用いて、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌでのＴＰＯ様アゴニスト活性を評価した結果を図１９、２０、２１に示す。各種ヒト化ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２のアゴニスト活性はほぼ同等であり、ヒト化による活性変化は無いことが示された。

２．１０抗ヒトＭｐｌ抗体ＶＢ２２ＢＩｇＧ，ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２およびヒト化ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２の抗原抗体反応における反応速度論的解析
抗ヒトＭｐｌ抗体ＶＢ２２Ｂが可溶型組換えＭｐｌに結合する性質を利用し、実施例１．８で示したＭＧ１０（Ｇｌｎ２１３からＡｌａ２３１）−ＧＳＴ融合蛋白質とＶＢ２２ＢＩｇＧ，ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２およびヒト化ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２との抗原抗体反応における速度論的解析を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）にＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を装着し、アミンカップリング法にてＭＧ１０−ＧＳＴ融合蛋白質を固定化した。測定のランニングバッファーはＨＢＳ−ＥＰＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を使用し、流速は２０μＬ／ｍｉｎとした。ここにＨＢＳ−ＥＰＢｕｆｆｅｒで５．５〜１７５．０ｎＭの濃度に調製したＶＢ２２ＢＩｇＧをそれぞれ２分間添加して、各濃度での結合領域を得た後に、解離領域を２分間測定した。ＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐ上のＭＧ１０−ＧＳＴ融合蛋白質に結合したＶＢ２２ＢＩｇＧは、２０ｍＭＨＣｌを１分間添加して除去し、ＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐを再生した。同様に、４．７〜１５０．１ｎＭのＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２、５．３〜１６８．９ｎＭのｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ｓｃ（Ｆｖ）２、４．９〜１５６．８ｎＭのｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ｓｃ（Ｆｖ）２を調製し、ＭＧ１０−ＧＳＴ融合蛋白質を固定化したチップに添加して、測定を実施した。
いずれも二価抗体であるため、各濃度で得られたセンサーグラムでは、一価と二価の両方の結合が混在した状態になる。このため、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎｖｅｒ．３．１ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）のＢｉｖａｌｅｎｔａｎａｌｙｔｅｍｏｄｅｌを適用して解析することにより、一価の状態での反応速度定数を算出した。以上の解析は全ての抗体について３回実施した。このようにして算出された、いずれも一価での結合速度定数（ｋａ）と解離速度定数（ｋｄ）および解離定数（ＫＤ）を表１に示した。ＶＢ２２ＢＩｇＧ、ＶＢ２２Ｂｓｃ（Ｆｖ）２、ｈＶＢ２２Ｂｑ−ｗｚ５ｓｃ（Ｆｖ）２、ｈＶＢ２２Ｂｕ２−ｗｚ４ｓｃ（Ｆｖ）２の解離定数（ＫＤ）は、それぞれ１．１５ｘ１０^−８Ｍ、１．１７ｘ１０^−８Ｍ、１．３６ｘ１０^−８Ｍ、１．０２ｘ１０^−８であり、ＭＧ１０−ＧＳＴ融合蛋白質に対して、ほぼ同等の結合活性を持つことが確認された。

［実施例３］ＡＧＳ法による抗Ｍｐｌ抗体Ｄｉａｂｏｄｙの作製
ＡＧＳ（ａｕｔｏｃｒｉｎｅｇｒｏｗｔｈｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）法（ＷＯ０３／９１４２４参照）によりアゴニスト活性を有する抗Ｍｐｌ抗体Ｄｉａｂｏｄｙを作製した。

３．１レトロウイルスライブラリの構築
実施例１．５に従って、ｓｈＭＰＬ−Ｆｌａｇを免疫したＭＲＬ／ｌｐｒマウスより脾臓を摘出し、ＴＲＩＺＯＬＲｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えた後、ダウンスホモジナイザーを用いて破砕した。クロロホルムを添加し振とうした後、水相を分取し、イソプロパノール沈殿によりＴｏｔａｌＲＮＡを抽出した後、ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔＳｙｓｔｅｍ１０００（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてｍＲＮＡを精製した。２．５μｇ相当のｍＲＮＡを使用して、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＦｉｒｓｔｓｔｒａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｓｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、及び添付のオリゴｄＴプライマーを用いて、４２℃にて５０分反応することによりｃＤＮＡを作製した。

ＰＣＲ反応溶液（２５０μＬ）の組成を次に示す。
２５μＬの１０×ＫＯＤＰｌｕｓＢｕｆｆｅｒ、
２５μＬの２ｍＭｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１０μＬの２．５ｍＭＭｇＳＯ_４、
７．５μＬのＫＯＤＰｌｕｓ、
（以上の成分はいずれも東洋紡社製）、
２５μＬの逆転写反応産物、
５００ｐｍｏｌのＨ鎖またはＬ鎖の可変領域に相補的なｍｉｘｐｒｉｍｅｒ
また反応温度条件は次のとおりである。
９８℃の初期温度にて３分間、
９８℃／２０秒間、５８℃／２０秒間、７２℃／３０秒間のサイクルを３２回反復、
最後に反応産物を７２℃で６分間加熱した。

Ｈ鎖のｍｉｘｐｒｉｍｅｒはＨＳ１−ＨＳ１９（配列番号：１７８〜配列番号：１９６）及びＨＡ１−ＨＡ４（配列番号：１９７〜配列番号：２００）を、表２に示す各配列名の隣に示した比率で混合したものを使用し、Ｌ鎖のｍｉｘｐｒｉｍｅｒはＬＳ１−ＬＳ１７（配列番号：２０１〜配列番号：２１７）、ＬＳｌａｍｂｄａ（配列番号：２１８）及びＬＡ１−ＬＡ５（配列番号：２１９〜配列番号：２２２）、ＬＡｌａｍｂｄａ（配列番号：２２３）を混合したものを使用した。各ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、アガロースゲルから精製した。Ｈ鎖及びＬ鎖可変領域は、ｓｃ−Ｓ（配列番号：２２４）、ｓｃ−ＡＳ（配列番号：２２５）を用いて以下のようにＰＣＲを行うことにより、リンカー配列（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_１を挟む形で連結した。

ＰＣＲ反応溶液（１００μＬ）の組成を次に示す。
１０μＬの１０×ＫＯＤＰｌｕｓＢｕｆｆｅｒ、
１０μＬの２ｍＭｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
４μＬの２．５ｍＭＭｇＳＯ_４
２μＬのＫＯＤＰｌｕｓ、
（以上の成分はいずれも東洋紡社製）、
４μＬのＨ鎖可変領域断片、
４μＬのＬ鎖可変領域断片、
はじめに以下の反応温度条件で反応させた。
９４℃の初期温度にて３分間、
９４℃／１分間、６３℃／４分間のサイクルを７回反復、
２５ｐｍｏｌのｓｃ−Ｓ及びｓｃ−ＡＳを添加、
次に以下の反応温度条件で反応させた。
９４℃／３０秒間、５５℃／２分間、７２℃／２分間のサイクルを３０回反復、
最後に反応産物を７２℃で６分間加熱した。

この産物は両端に制限酵素ＳｆｉＩ部位を有することから、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した後、制限酵素ＳｆｉＩ（宝酒造社製）を用いて５０℃にて一晩反応させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製されたＰＣＲ産物をウイルスベクタープラスミドｐＭＸ／ＩＬ３ｓｓＧＦＰＨｉｓのＳｆｉＩ部位に挿入した。

本プラスミドは５’末端にＥｃｏＲＩ部位、マウスＩＬ−３シグナル配列及びＳｆｉＩ部位、３’末端にＳｆｉＩサイト及びＨｉｓタグ配列、終止コドン及びＮｏｔＩサイトを有するＧＦＰ遺伝子を、ウイルスベクターｐＭＸ（Ｏｎｉｓｈｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．１８，３８７１−３８７９）のＥｃｏＲＩとＮｏｔＩサイトの間に挿入したものである。Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応物を用いてＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）によるエレクトロポレーション（２．５ｋＶ、２５μＦ、１００Ω）によりＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸＤＨ１０ＢＴ１ｐｈａｇｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）へ導入した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したＬＢ−Ａｇａｒ培地に塗沫し、一晩培養した結果、約１０^７個のコロニーが出現した。コロニーを回収し、ＱＩＡＧＥＮＰｌａｓｍｉｄＭａｘｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドを抽出した。

３．２ＡＧＳ法による自律増殖株の取得
このライブラリをパッケージング細胞Ｐｔ−Ｅ（Ｍｏｒｉｔａら、Ｇｅｎｅｔｈｒｅａｐｙｖｏｌ．７，１０６３−１０６６）にＦｕｇｅｎｅ６（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いてトランスフェクションした。すなわちＰｔ−Ｅを、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で６ｃｍｄｉｓｈに播種し、翌日Ｆｕｇｅｎｅ６とライブラリを混合したものを培地に加えた。その翌日、培養上清を交換し、２４時間後培養上清を回収した。組換えウィルスを含む培養上清に１０μｇ／ｍＬのポリブレン（ＨｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅＢｒｏｍｉｄｅ，ＳＩＧＭＡ社製）及び２ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ−３を加え、標的細胞であるＢａＦ３−ｍｏｎｋｅｙＭｐｌへ感染させた。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄後、ｍＩＬ−３を含まない１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに播種した。７日間培養を続けた結果、自律増殖する細胞株（ＡＢ３１７、ＡＢ３２４）が得られた。これら細胞よりＤＮｅａｓｙＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により抗体遺伝子を増幅した。

ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＬＡＴａｑＢｕｆｆｅｒ、
５μＬの２ｍＭｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
５μＬの２．５ｍＭＭｇＣｌ_４、
０．５μＬのＴａＫａＲａＬＡＴａｑ、
（以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
０．５μｇのゲノムＤＮＡ、
２５ｐｍｏｌのＡＧＳｄｂＳ１（配列番号：２２６）、ＡＧＳｄｂＡ１（配列番号：２２７）
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて１分間、
９４℃／３０秒間、６０℃／３０秒間、７０℃／１分間のサイクルを３０回反復、
最後に反応産物を７２℃で６分間加熱した。

クローニングしたＡＢ３１７のＨ鎖の塩基配列を配列番号：１５４、アミノ酸配列を配列番号：１５５、ＡＢ３１７のＬ鎖の塩基配列を配列番号：１５６、アミノ酸配列を配列番号：１５７、ＡＢ３２４のＨ鎖の塩基配列を配列番号：１５８、アミノ酸配列を配列番号：１５９、ＡＢ３２４のＬ鎖の塩基配列を配列番号：１６０、アミノ酸配列を配列番号：１６１に示す。

３．３ＡＧＳ法により得られたＤｉａｂｏｄｙの活性評価
取得した抗Ｍｐｌ抗体Ｄｉａｂｏｄｙを発現ベクターｐＣＸＮＤ３に挿入した。Ｄｉａｂｏｄｙの５’末端領域に相補的でＥｃｏＲＩ部位を有する合成オリゴヌクレオチドおよびＤｉａｂｏｄｙの３’末端側塩基配列に相補的でＦＬＡＧタグとＮｏｔＩ部位を有する合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をｐＣＸＮＤ３のＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ部位に挿入した。実施例２．４に従い、ＣＯＳ７細胞を用いた一過性発現を行い、培養上清を回収し、活性評価を実施した。
各種Ｍｐｌを発現させたＣＨＯ細胞株を用いてＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙによる結合活性の評価を実施した。結果を図８に示す。ＡＢ３１７はＣＨＯ−ｍｏｕｓｅＭｐｌに結合することが確認された。

また、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌ、ＢａＦ３−ｍｏｎｋｅｙＭｐｌおよびＢａＦ３−ｍｏｕｓｅＭｐｌによるＴＰＯ様アゴニスト活性の評価を行った。結果を図９、図１０、図１１に示す。ＡＢ３１７はヒト、サル、マウスＭｐｌに対して強いアゴニスト活性を有し、ＡＢ３２４はヒト、サルＭｐｌに対し強いアゴニスト活性を示した。
このことから、ＡＧＳ法を用いて強いアゴニスト活性を有する抗Ｍｐｌ抗体Ｄｉａｂｏｄｙが取得できることが確認された。

［実施例４］ＣＡＭＴ患者の持つＭｐｌ変異に対する抗Ｍｐｌ抗体のアゴニスト活性評価
４．１ＣＡＭＴ患者の持つ変異Ｍｐｌ導入ＢａＦ３細胞株の樹立
ＣＡＭＴ（Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌａｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ；先天性無巨核球性血小板減少症）患者においてＭｐｌ遺伝子中にＧ３０５Ｃ（Ｒ１０２Ｐ）変異、Ｃ７６９Ｔ（Ｒ２５７Ｃ）変異およびＣ８２３Ａ（Ｐ２７５Ｔ）変異が報告されている。各変異を持つＭｐｌ遺伝子の発現ベクターをそれぞれ構築し、ＢａＦ３細胞に導入した。正常なＭｐｌ遺伝子（塩基配列を配列番号：２４６、アミノ酸配列を配列番号：１２３）および該遺伝子の開始コドンから３０５番目の塩基をＧからＣに置換した遺伝子Ｇ３０５Ｃ（塩基配列を配列番号：２４７、アミノ酸配列を配列番号：２４８）、開始コドンから７６９番目の塩基をＣからＴに置換した遺伝子Ｃ７６９Ｔ（塩基配列を配列番号：２４９、アミノ酸配列を配列番号：２５０）および開始コドンから８２３番目の塩基をＣからＡに置換した遺伝子Ｃ８２３Ａ（塩基配列を配列番号：２５１、アミノ酸配列を配列番号：２５２）を作製した。これらのＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで切断し、動物細胞発現用ベクターｐＣＯＳ２−ＨａのＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ部位に導入し、ｐＣＯＳ２−ｈＭＰＬｆｕｌｌＧ３０５Ｃ、ｐＣＯＳ２−ｈＭＰＬｆｕｌｌＣ７６９ＴおよびｐＣＯＳ２−ｈＭＰＬｆｕｌｌＣ８２３Ａを作製した。

実施例１．１と同様にしてＢａＦ３細胞に遺伝子導入し、各Ｍｐｌ遺伝子を発現するＢａＦ３細胞株であるＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭＰＬ（Ｇ３０５Ｃ）、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭＰＬ（Ｃ７６９Ｔ）およびＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭＰＬ（Ｃ８２３Ａ）を樹立した。選抜後は、１ｎｇ／ｍＬｍＩＬ−３、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養、維持した。

４．２抗ヒトＭｐｌ抗体Ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃ（Ｆｖ）２の作製
図６および図７に示したアミノ酸配列の中で、ＶＢ８Ｂ、ＶＢ４５Ｂ、ＶＢ３３、ＶＢ１４０、ＶＢ１５７、ＴＡ１３６について、実施例２．２と同様にしてＤｉａｂｏｄｙ発現ベクターを作製した。作製した発現ベクターを実施例２．４と同様に、ＣＯＳ７細胞に導入し、得られた培養上清中のＤｉａｂｏｄｙ濃度を実施例２．５の方法で定量した。ＴＡ１３６については、実施例２．３と同様にして、ｓｃ（Ｆｖ）２発現ベクターを作製した。実施例２．４と同様にＣＨＯ−ＤＧ４４細胞に導入し、実施例２．６に従って得られた培養上清よりｓｃ（Ｆｖ）２を精製した。

４．３抗ヒトＭｐｌ抗体Ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃ（Ｆｖ）２のアゴニスト活性の評価
作製したＤｉａｂｏｄｙ、ｓｃ（Ｆｖ）２を用いて、実施例２．８と同様にして正常Ｍｐｌ発現ＢａＦ３細胞および変異Ｍｐｌ発現ＢａＦ３細胞に対するアゴニスト活性を評価した。Ｄｉａｂｏｄｙ発現培養上清を用いて、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌとＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌ（Ｇ３０５Ｃ）におけるアゴニスト活性を比較した。その結果、ＴＡ１３６Ｄｉａｂｏｄｙ（ＴＡ１３６ｄｂ）は、正常なＭｐｌ遺伝子を発現するＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌでは活性が弱いが、変異Ｍｐｌ遺伝子を発現するＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌ（Ｇ３０５Ｃ）では強いアゴニスト活性を示した。ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌ（Ｇ３０５Ｃ）に対しては、ｈＴＰＯや他のＤｉａｂｏｄｙでは強いアゴニスト活性を示すことはできなかった（図１２および図１３）。

さらに、ＴＡ１３６Ｄｉａｂｏｄｙ、ＴＡ１３６ｓｃ（Ｆｖ）２の精製品を用いて、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌ、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌ（Ｇ３０５Ｃ）、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌ（Ｃ７６９Ｔ）、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌ（Ｃ８２３Ａ）に対するアゴニスト活性を評価した。その結果、ＴＡ１３６ｓｃ（Ｆｖ）２は、３種のＴＰＯ受容体変異株全てにおいてｈＴＰＯやＴＡ１３６Ｄｉａｂｏｄｙより高いアゴニスト活性を示した（図１５〜図１７）。また、正常なＭｐｌ遺伝子を発現するＢａＦ３−ｈｕｍａｎＭｐｌにおいて、ＴＡ１３６ＤｉａｂｏｄｙはｈＴＰＯよりも弱い活性しか示さなかったが、ｓｃ（Ｆｖ）２に変換することにより、ｈＴＰＯと同等のアゴニスト活性を示すことが示された（図１４）。

組換え型ヒトＴＰＯは、化学療法剤等の治療による血小板減少症の治療薬として、さまざまな形で、臨床試験が行われてきた。その臨床試験において、一つの大きな問題として、ＴＰＯの投与による抗ＴＰＯ抗体の出現が報告されており（ＪｕｎｚｈｉＬｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００１）９８，３２４１−３２４、ＳａｒｏｊＶａｎｄｈａｎ−Ｒａｊ．ｅｔ．ａｌ．Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．（２０００）１３２，３６４−３６８）、特に内在性のＴＰＯ活性を阻害する中和抗体が産生され、その結果として、血小板減少症を発症することが報告されている。本発明によって示される抗ＴＰＯ受容体アゴニスト低分子化抗体の投与によって、内在性ＴＰＯに対する抗体の出現を誘導することはない。また抗体を低分子化することにより、高い比活性を示し、また血中半減期を短くできることから、有効血中濃度の調節が容易となり、臨床応用上有利となると考えられる。従って、天然型ＴＰＯやアゴニスト抗体よりも優れた性質をもつ、血小板減少症の治療薬となることが期待される。また、低分子化抗体は、糖鎖が結合していないことから、組換え型タンパクの発現においても、その発現系に制限はなく、哺乳動物由来の細胞株、酵母、昆虫細胞、大腸菌まで、いずれの発現系においても、作製することが可能である。また、変異型ＴＰＯ受容体に対する結合強度が、ＴＰＯとは異なることから、遺伝的にＴＰＯ受容体に変異を持ち、血小板減少症を発症するＣＡＭＴ患者で検出されるＴＰＯ受容体変異に対しても、特定の変異体に対しては結合し、アゴニスト活性を示すことが期待される。

Claims

2つの重鎖可変領域及び2つの軽鎖可変領域を含み、TPO受容体（Mpl）への結合活性を有する一本鎖ポリペプチドであることを特徴とする、ヒトMplの26番目から274番目のアミノ酸部位を認識する抗体であって、重鎖可変領域が配列番号：３６、３７、３８に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する、抗体。
軽鎖可変領域が配列番号：９３、９４、９５に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する、請求項１に記載の抗体。
配列番号：３６、３７、３８に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する重鎖可変領域、および配列番号：９３、９４、９５に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
2つの重鎖可変領域及び2つの軽鎖可変領域が、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点として重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖可変領域の順に並んでいることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体。
2つの重鎖可変領域及び2つの軽鎖可変領域がリンカーで結合されていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体。
リンカーが15アミノ酸であることを特徴とする、請求項５に記載の抗体。
可溶型Mplに結合する、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体。
ヒトMpl及びサルMplに結合する、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体。
ヒトMpl及びサルMplに対してアゴニスト活性を有する、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体。
配列番号：１１８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体。
配列番号：１２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体。
配列番号：１２２または２６４に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体。
Mplに結合するキメラ抗体である、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体。
ヒト化抗体である、請求項１３に記載の抗体。
以下の(1)〜(5)のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有する重鎖可変領域を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体。
(1)配列番号：２３０、２３２、２３４、２３６
(2)配列番号：２６５、２６７、２６９、２７１
(3)配列番号：２７９、２８１、２８３、２８５
(4)配列番号：２９８、２９９、３００、３０１
(5)配列番号：２９８、２９９、３０６、３０１
以下の(1)〜(4)のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体。
(1)配列番号：２３９、２４１、２４３、２４５
(2)配列番号：２７２、２７４、２７６、２７８
(3)配列番号：３０２、３０３、３０４、３０５
(4)配列番号：３０２、３０７、３０８、３０５
以下の(1)〜(5)のいずれかに記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体。
(1)配列番号：２３０、２３２、２３４、２３６に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有する重鎖可変領域、および配列番号：２３９、２４１、２４３、２４５に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有する軽鎖可変領域
(2)配列番号：２６５、２６７、２６９、２７１に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有する重鎖可変領域、および配列番号：２７２、２７４、２７６、２７８に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有する軽鎖可変領域
(3)配列番号：２７９、２８１、２８３、２８５に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有する重鎖可変領域、および配列番号：２７２、２７４、２７６、２７８に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有する軽鎖可変領域
(4)配列番号：２９８、２９９、３００、３０１に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有する重鎖可変領域、および配列番号：３０２、３０３、３０４、３０５に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有する軽鎖可変領域
(5)配列番号：２９８、２９９、３０６、３０１に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有する重鎖可変領域、および配列番号：３０２、３０７、３０８、３０５に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有する軽鎖可変領域
配列番号：２２９、２５６、２６２、２８９または２９５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体。
配列番号：２３８、２５８、２９１または２９７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体。
以下の(1)〜(5)のいずれかに記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体。
(1)配列番号：２２９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号：２３８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
(2)配列番号：２５６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号：２５８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
(3)配列番号：２６２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号：２５８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
(4)配列番号：２８９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号：２９１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
(5)配列番号：２９５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号：２９７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
配列番号：２、２５４、２６０、２８７または２９３に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体。
請求項１〜２１のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項２２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２３に記載のベクターを保持する宿主細胞。
請求項１〜２１のいずれかに記載の抗体を含有する、医薬組成物。