JP3416035B2

JP3416035B2 - ヒト副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体

Info

Publication number: JP3416035B2
Application number: JP25873997A
Authority: JP
Inventors: 功佐藤; 裕二若原; 尚弘藪田
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-09-26
Filing date: 1997-09-24
Publication date: 2003-06-16
Anticipated expiration: 2017-09-24
Also published as: JPH1192500A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、副甲状腺ホルモン
関連ペプチドに対するマウスモノクローナル抗体の可変
領域（Ｖ領域）とヒト抗体の定常領域（Ｃ領域）とから
なるヒト／マウスキメラ抗体、副甲状腺ホルモン関連ペ
プチドに対するマウスモノクローナル抗体の軽鎖（Ｌ
鎖）Ｖ領域及び重鎖（Ｈ鎖）Ｖ領域の相捕性決定領域が
ヒト抗体に移植されているヒト型化（humanized）抗
体、該抗体のＬ鎖及びＨ鎖、並びに該抗体のＬ鎖又はＨ
鎖を構成するＶ領域を含むポリペプチドに関する。

【０００２】本発明はさらに、上記の抗体、特にそのＶ
領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、及びＶ領域を
含むＬ鎖又はＨ鎖をコードするＤＮＡに関する。本発明
はさらに、該ＤＮＡを含む組換えベクター、及び該ベク
ターにより形質転換された宿主に関する。

【０００３】本発明はさらに、副甲状腺ホルモン関連ペ
プチドに対するキメラ抗体及びヒト型化抗体の製造方法
に関する。本発明はさらに、副甲状腺ホルモン関連ペプ
チドに対する抗体を有効成分として含む医薬組成物並び
に高カルシウム血症抑制剤及び低リン血症改善剤に関す
る。

【０００４】

【従来の技術】悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症は、全
悪性腫瘍患者の５〜20％にみられる重篤な合併症状であ
り、放置すれば確実に死に至るため悪性腫瘍の末期的症
状であると考えられている。高カルシウム血症のコント
ロールは患者の治療予後とQOL（Quality of Life）に大
きく影響することから、臨床的に重要な役割を持つ。

【０００５】悪性腫瘍患者における高カルシウム血症
は、一般に、腫瘍産生性の体液性骨吸収因子によるHHM
（Humoral hypercalcemia of malignancy）と、骨に転
移又は浸潤した腫瘍の局所的な作用によるLOH（Local O
steolytic hypercalcemia）とに大別される。HHMでは骨
吸収又は骨破壊の亢進によりカルシウムの流出が増加
し、腎のカルシウム排泄能の低下とあいまって高カルシ
ウム血症を生ずると考えられている（和田誠基及び永田
直一，内科69, 644-648 ）。

【０００６】高カルシウム血症は、血清カルシウム値が
12mg/dlを超えるとその症状が現れると考えられ、その
症状として、初期に食思不振、悪心、嘔吐が悪性腫瘍患
者において非特異的に認められる。高カルシウム血症が
悪化すると、腎遠位尿細管の障害で水分の濃縮力が低下
するために多尿となり、また、悪心、嘔吐により水分が
十分に摂取されないため脱水を伴う。

【０００７】悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症のうちHH
Mを起こす液性因子として、PTH（副甲状腺ホルモン；Pa
rathyroid Hormone）様の物質である副甲状腺ホルモン
関連ペプチド（Parathyroid Hormone related Peptid
e、以下「PTHrP」という）がMoseley, J. M.らにより見
いだされた（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987)、84,
5048-5052）。

【０００８】その後、PTHrPをコードする遺伝子が単離
され（Suva, L. J. et al., Science(1987) 237, 893）
その解析から、ヒトPTHrPは遺伝子の選択的スプライシ
ングに基づく139、141及び173個のアミノ酸からなる三
種が存在すること、並びに血中では全構造を有するPTHr
P（1-139）の限定分解に基づく様々なフラグメントが存
在することが明らかになった（Baba, H. Clinical Calc
ium (1995) 5, 229-223）。PTHrPは、N末端側第1位から
第13位のアミノ酸13個のうち8個がPTHと同一である他、
第14位から第34位アミノ酸部位においてもPTHと類似の
立体構造を呈するものと推定され、少なくともN末端側
においてはPTHと共通のPTH/PTHrP 受容体に結合する（J
ueppner, H. et al., Science (1991) 254, 1024-102
6、Abou-Samra, A-B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1992) 89, 2732-2736）。

【０００９】PTHrPは様々な腫瘍組織から産生されるこ
とが報告されているが、腫瘍のみならず、皮膚、中枢神
経、子宮、胎盤、授乳中の乳腺、甲状腺、副甲状腺、副
腎、肝、腎、膀胱をはじめとする、胎児から成人に至る
までの種々の正常な組織により産生されることが明らか
になった（Burtis, W. J. Clin. Chem. (1992) 38, 217
1-2183、Stewart, A. F. & Broadus, A. E. J. Clin. E
ndocrinol. (1991) 71, 1410-1414）。また、PTHrPは、
胎児期から新生児期にかけて母体より高く保たれるカル
シウム代謝調節に重要な役割を演じていると考えられて
いる。

【００１０】PTH/PTHrP 受容体は主に骨と腎に存在し
（滋野長平、Clinical Calcium (1995) 5, 355-359）、
PTHrPが受容体に結合することにより複数の細胞内シグ
ナル伝達系が活性化されることが知られている。その一
つは、アデニルシクラーゼであり、もう一つはフォスフ
ォリパーゼCである。アデニルシクラアーゼの活性化に
より、細胞内cAMP濃度が上昇しプロテインキナーゼAが
活性化される。また、フォスフォリパーゼCはフォスフ
ァチヂルイノシトール4, 5-ビスフォスフォネートを分
解してイノシトール1, 4, 5-トリフォスフォネートとジ
アシルグリセロールを生じさせる。これらのシグナル伝
達系にはG蛋白質が関与する（Coleman, D. T. et al.,
Biochemical mechanisms of parathyroid hormone acti
on. In: "Theparathyroids" (Bilezikian, J. P. et a
l.),Raven press, New York, (1994)page 239 ）。

【００１１】PTHrPは、これらのシグナル伝達系を介し
て、HHMに観察される高カルシウム血症、低リン血症、
腎リン再吸収能の低下、腎性cAMP排泄の増加などを引き
起こす。このように、PTHrPは悪性腫瘍に伴う高カルシ
ウム血症に密接に関連していることが明らかになってい
る。悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の治療には補液を
行う他、カルシトニン、ステロイド剤、インドメタシ
ン、無機リン酸塩、ビスフォスフォネート等が使用され
る。しかしながら、これらの薬剤は連続使用により効果
が低減すること、強い副作用が発現すること、又は薬効
発現が遅いことなどから、より治療効果が高く副作用の
少ない薬剤の使用が期待されている。

【００１２】一方、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症治
療の新しい試みとして、Kukreja, S. C.らは、ヒト肺ガ
ン細胞又はヒト喉頭ガン細胞を移植して高カルシウム血
症を生じた無胸腺マウスにPTHrPに対する中和抗血清を
投与すると、血中カルシウム濃度及び尿cAMPレベルが減
少したことを報告している（J. Clin. Invest. (1988)
82, 1798-1802）。佐藤幹二らは、PTHrP産生ヒト腫瘍を
移植したヌードマウスにPTHrP（1-34）に対する抗体を
投与すると、高カルシウム血症を低減させ、マウスの生
存時間を大幅に延長させたことを報告している（J. bon
e & Mine. Res.(1993) 8, 849-860）。また、特開平4-2
28089号には、ヒトPTHrP（1-34）に対するマウス／ヒト
キメラ抗体が開示されている。

【００１３】マウスのモノクローナル抗体はヒトにおい
て高度に免疫原性（「抗原性」という場合もある）を有
し、このため、ヒトにおけるマウスモノクローナル抗体
の医学療法的価値は制限されている。例えば、マウス抗
体をヒトに投与すると異物として代謝されうるので、ヒ
トにおけるマウス抗体の半減期は比較的短く、期待され
た効果を充分に発揮できない。さらに、投与したマウス
抗体に対して発生するヒト抗マウス抗体（HAMA）は、血
清病又は他のアレルギー反応など、患者にとって不都合
で危険な免疫応答を惹起する。したがって、マウスモノ
クローナル抗体をヒトに頻回投与することはできない。

【００１４】これらの問題を解決するため、非ヒト由来
の抗体、例えばマウス由来のモノクローナル抗体の免疫
原性を低減させる方法が開発された。その一つが、抗体
の可変領域（Ｖ領域）はもとのマウスモノクローナル抗
体に由来し、定常領域（Ｃ領域）は適当なヒト抗体に由
来するキメラ抗体を作製する方法である。

【００１５】得られるキメラ抗体はもとのマウス抗体の
可変領域を完全な形で含有するので、もとのマウス抗体
と同一の特異性をもって抗原に結合することが期待でき
る。さらに、キメラ抗体ではヒト以外に由来するアミノ
酸配列の比率が実質的に滅少しており、それ故にもとの
マウス抗体に比べて免疫原性が低いと予想される。キメ
ラ抗体はもとのマウスモノクローナル抗体と同等に抗原
に結合し、かつ免疫原性が低いが、それでもなおマウス
可変領域に対する免疫応答が生ずる可能性がある（LoBu
glio,A.F.et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,4220-42
24,1989)。

【００１６】マウス抗体の免疫原性を低減させるための
第二の方法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体の潜
在的な免疫原性をさらに大幅に低下させることが期待さ
れる。この方法においては、マウス抗体の可変領域から
相補性決定領域（complementarity determining regio
n；ＣＤＲ）のみをヒト可変領域に移植して「再構成」
（reshaped）ヒト可変領域を作製する。ただし、必要に
よっては、再構成ヒト可変領域のＣＤＲの構造をより一
層もとのマウス抗体の構造に近づけるために、ＣＤＲを
支持しているフレームワーク領域（ＦＲ）の一部のアミ
ノ酸配列をマウス抗体の可変領域からヒト可変領域に移
植する場合がある。

【００１７】次に、これらのヒト型化された再構成ヒト
可変領域をヒト定常領域に連結する。最終的に再構成さ
れたヒト型化抗体のヒト以外のアミノ酸配列に由来する
部分は、ＣＤＲ及び極く一部のＦＲのみである。ＣＤＲ
は超可変アミノ酸配列により構成されており、これらは
種特異的配列を示さない。このため、マウスＣＤＲを担
持するヒト型化抗体は、もはやヒトＣＤＲを含有する天
然ヒト抗体より強い免疫原性を有しないはずである。

【００１８】ヒト型化抗体については、さらに、Riechm
ann,L.et al.,Nature,332,323-327,1988; Verhoeye,M.e
t al, Science,239,1534-1536,1988; Kettleborough,
C.A.et al.,Protein Engng.,4,773-783,1991; Maeda,H.
et al.,Human Antibodies andHybridoma,2,124-134,199
1; Gorman,S.D.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,8
8,4181-4185,1991; Tempest,P.R.et al., Bio/Technolo
gy, 9, 266-271, 1991; Co,M.S.et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. USA,88,2869-2873, 1991; Carter,P.et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,4285-4289,1992; C
o, M. S. et al.,J.Immunol.,148,1149-1154,1992; 及
びSato, K.et al., Cancer Res., 53, 851-856, 1993を
参照のこと。

【００１９】前記のごとく、ヒト型化抗体は療法目的の
ために有用であると予想されるが、PTHrPに対するヒト
型化抗体は知られておらず、前記文献にはその示唆もな
されていない。また、ヒト型化抗体の製造方法において
任意の抗体に普遍的に適用し得る画一的な方法は存在せ
ず、特定の抗原に対して十分な結合活性、中和活性を示
すヒト型化抗体を作製するためには種々の工夫が必要で
ある（例えば、Sato,K. et al., Cancer Res.,53,851-8
56,1993を参照のこと）。

【００２０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、PTHrPに対
するマウスモノクローナル抗体の可変領域（Ｖ領域）と
ヒト抗体の定常領域（Ｃ領域）とからなるヒト／マウス
キメラ抗体、PTHrPに対するマウスモノクローナル抗体
の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域及び重鎖（Ｈ鎖）Ｖ領域の相捕性
決定領域がヒト抗体に移植されているヒト型化（humani
zed ）抗体、該抗体のＬ鎖及びＨ鎖、並びに該抗体のＬ
鎖又はＨ鎖を構成するＶ領域を含むポリペプチドを提供
することを目的とする。

【００２１】本発明はさらに、上記の抗体、特にそのＶ
領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、及びＶ領域を
含むポリペプチドを含むＬ鎖又はＨ鎖をコードするＤＮ
Ａを提供することを目的とする。本発明はさらに、該Ｄ
ＮＡを含む組換えベクター、及び該ベクターにより形質
転換された宿主を提供することを目的とする。本発明は
さらに、PTHrPに対するキメラ抗体及びヒト型化抗体の
製造方法を提供することを目的とする。本発明はさら
に、中和活性が高いPTHrPに対する抗体を提供すること
を目的とする。本発明はさらに、PTHrPに対する抗体又
はヒト型化抗体を有効成分として含む医薬組成物並びに
高カルシウム血症抑制剤、低リン血症改善剤及びアルカ
ローシス改善剤を提供することを目的とする。

【００２２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
に基づいて鋭意研究を行った結果、PTHrPに対するマウ
スモノクローナル抗体のヒトにおける免疫原性が低減さ
れている抗体を得ることに成功し、本発明を完成するに
至った。すなわち、本発明は、ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域、
及びPTHrPに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ
領域を含むキメラＬ鎖である。Ｌ鎖Ｖ領域としては、配
列番号45で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げら
れ、Ｌ鎖Ｃ領域としてはＣλ領域のものが挙げられる。

【００２３】さらに、本発明は、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領
域、及びPTHrP に対するマウスモノクローナル抗体のＨ
鎖Ｖ領域を含むキメラＨ鎖である。Ｈ鎖Ｖ領域として
は、配列番号46で表されるアミノ酸配列を含むものが挙
げられ、Ｃ領域としてはＣγ１領域のものが挙げられ
る。さらに、本発明は、前記キメラＬ鎖及びキメラＨ鎖
を含む、PTHrPに対するキメラモノクローナル抗体であ
る。

【００２４】さらに、本発明は、ヒト抗体のＬ鎖Ｖ領域
のフレームワーク領域１〜４、及びPTHrPに対するマウ
スモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域の相補性決定領域１
〜３を含む、ヒト型化抗体のＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプ
チドである。相補性決定領域１〜３としては、それぞれ
配列番号59〜61で表されるアミノ酸配列を含むものが挙
げられる。フレームワーク領域１〜３としてはそれぞれ
ヒト抗体HSU03868のフレームワーク領域１〜３由来のも
の、かつ、フレームワーク領域４としてはヒト抗体S257
55のフレームワーク４由来のものが挙げられる。あるい
は、フレームワーク領域１〜３としてはそれぞれヒト抗
体HSU03868のフレームワーク領域１〜３と実質的に同一
のもの、かつ、フレームワーク領域４としてはヒト抗体
S25755のフレームワーク領域４と実質的に同一のものが
挙げられる。

【００２５】ここで、「実質的に同一」とは、ヒト型化
抗体において使用されるヒト抗体のフレームワーク領域
において、ヒト型化抗体がマウスモノクローナル抗体と
同等の活性を有するように、マウスモノクローナル抗体
の相補性決定領域を形成するために必要なアミノ酸の欠
失、置換、付加等を生じてもよいことを意味する。

【００２６】さらに、本発明は、フレームワーク領域中
のKabatの規定(Kabat,E.A.et al.,US Dept. Health and
Human Services,US Government Printing Offices,199
1)による第36番目のアミノ酸がチロシンであり、かつ、
同第49番目のアミノ酸がアスパラギン酸である、ヒト型
化抗体のＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプチドである。

【００２７】さらに、本発明は、配列番号48〜51で表さ
れるいずれかのアミノ酸配列を含む、ヒト型化抗体のＬ
鎖Ｖ領域を含むポリペプチドである。さらに、本発明
は、フレームワーク領域中のKabat の規定による第45番
目のアミノ酸がリジンであり、かつ、同第87番目のアミ
ノ酸がイソロイシンである、ヒト型化抗体のＬ鎖Ｖ領域
を含むポリペプチドである。さらに、本発明は、配列番
号52〜55で表されるいずれかのアミノ酸配列を含む、ヒ
ト型化抗体のＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプチドである。

【００２８】さらに、本発明は、ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域
のフレームワーク領域１〜４、及びヒトPTHrP に対する
マウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域の相補性決定領
域１〜３を含む、ヒト型化抗体のＨ鎖Ｖ領域を含むポリ
ペプチドである。相補性決定領域１〜３としては、それ
ぞれ配列番号62〜64で表されるアミノ酸配列を含むもの
が挙げられ、フレームワーク領域１〜４としては、ヒト
サブグループIII (Human Subgroup III(HSG III)、Kaba
t,E.A.et al.,US Dept.Health and Human Services, US
Government Printing Offices,1991)に属するヒト抗体
のフレームワーク領域１〜４由来のもの、より詳しくは
それぞれヒト抗体S31679のフレームワーク領域１〜４由
来のものが挙げられ、あるいはヒト抗体S31679のフレー
ムワーク領域１〜４と実質的に同一のものが挙げられ
る。

【００２９】さらに、本発明は、配列番号56で表される
アミノ酸配列を含む、ヒト型化抗体のＨ鎖Ｖ領域を含む
ポリペプチドである。さらに、本発明は、前記ヒト型化
抗体のＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプチド及びヒト抗体のＬ
鎖Ｃ領域を含むポリペプチドを含む、ヒトPTHrP に対す
るヒト型化抗体のＬ鎖である。ここで、Ｃ領域としては
Ｃλ領域、フレームワーク領域１〜３としてはそれぞれ
ヒト抗体HSU03868のフレームワーク領域１〜３と実質的
に同一のもの、フレームワーク領域４としてはヒト抗体
S25755のフレームワーク領域４と実質的に同一のもの、
そして相補性決定領域１〜３のアミノ酸配列としてはそ
れぞれ配列番号59〜61で表されるものが挙げられる。

【００３０】さらに、本発明は、前記ヒト抗体のＨ鎖Ｃ
領域を含むポリペプチド及びＨ鎖Ｖ領域を含むポリペプ
チドを含む、ヒトPTHrP に対するヒト型化抗体のＨ鎖で
ある。Ｃ領域としてはＣγ１領域、フレームワーク領域
１〜４としてはHSGIIIに属するヒト抗体由来のフレーム
ワーク領域１〜４由来のもの、そして相補性決定領域１
〜３としてはそれぞれ配列番号62〜64で表されるアミノ
酸配列を含むものが挙げられる。

【００３１】さらに、本発明は、抗原性が弱く、中和活
性が高い抗PTHrP 抗体に関する。該PTHrP 抗体はヒトの
疾患の治療に供することが可能な、ヒト抗体、ヒト型化
抗体、キメラ抗体、プライマタイズド抗体などを含む。
また、該抗体は低い解離定数を有するものである。さら
に、本発明の抗体は解離定数が小さいため中和活性が高
く、ヒトの疾患の治療に供することができる。

【００３２】本発明の抗体は、1.86×10^-7[M] 以下の解
離定数、1.22×10^-1[1/Sec]以下の解離速度定数、そし
て6.55×10⁴[1/M.Sec] 以上の結合速度定数を有するも
のである。また、これらの定数は、ＲＩ標識されたリガ
ンドを用いたスキャッチャード解析や表面プラズモン共
鳴センサー等により測定することができる。

【００３３】さらに、本発明は、ヒトPTHrP に対するマ
ウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする塩基
配列を含むＤＮＡ又はＨ鎖Ｖ領域をコードする塩基配列
を含むＤＮＡである。Ｌ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｖ領域として
は、それぞれ配列番号45、46で表されるアミノ酸配列を
含むものが挙げられ、Ｌ鎖Ｖ領域をコードする塩基配列
を含むＤＮＡとしては例えば配列番号65で表されるもの
が挙げられ、Ｈ鎖Ｖ領域をコードする塩基配列を含むＤ
ＮＡとしては配列番号57で表されるものが挙げられる。

【００３４】さらに、本発明は、前記キメラＬ鎖又はキ
メラＨ鎖をコードするＤＮＡである。該Ｌ鎖をコードす
るＤＮＡとしては例えば配列番号65で表される塩基配列
を含むものが挙げられ、該Ｈ鎖をコードするＤＮＡとし
ては配列番号57で表される塩基配列を含むものが挙げら
れる。

【００３５】さらに、本発明は、前記ヒト型化抗体のＬ
鎖Ｖ領域コードする塩基配列を含むＤＮＡ又はＨ鎖Ｖ領
域をコードする塩基配列を含むＤＮＡである。Ｌ鎖Ｖ領
域をコードする塩基配列を含むＤＮＡとしては配列番号
66〜74で表されるいずれかの塩基配列を含むものが挙げ
られ、Ｈ鎖Ｖ領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡと
しては配列番号58で表されるものが挙げられる。

【００３６】さらに、本発明は、配列番号47〜55で表さ
れるいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含
む、ヒト型化抗体のＬ鎖Ｖ領域のＤＮＡである。該ＤＮ
Ａとしては、配列番号66〜74で表されるいずれかの塩基
配列を含むものが挙げられる。さらに、本発明は、配列
番号56で表されるアミノ酸配列をコードする、ヒト型化
抗体のＨ鎖Ｖ領域のＤＮＡである。該ＤＮＡとしては配
列番号58で表される塩基配列を含むものが挙げられる。

【００３７】さらに、本発明は、前記いずれかのＤＮＡ
を含む組換えベクターである。さらに、本発明は、前記
組換えベクターにより形質転換された形質転換体であ
る。さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、得ら
れる培養物からヒト副甲状腺関連ペプチドに対するキメ
ラ抗体又はヒト型化抗体を採取することを特徴とするヒ
ト副甲状腺関連ペプチドに対するキメラ抗体又はヒト型
化抗体の製造方法である。

【００３８】さらに、本発明は、前記抗体を有効成分と
して含む医薬組成物並びに高カルシウム血症抑制剤及び
低リン血症改善剤である。該カルシウム血症は悪性腫瘍
に起因するものであり、また、悪性腫瘍随伴性高カルシ
ウム血症患者においてはしばしば低リン血症が認められ
る。従って、本発明の抗体は、上記悪性腫瘍に対する治
療又は高カルシウム血症若しくは低リン血状症状の軽減
をするために使用することができる。なお、悪性腫瘍と
しては、例えば膵臓癌、肺癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、
歯肉癌、食道癌、胃癌、胆管癌、乳癌、腎癌、膀胱癌、
子宮癌、前立腺癌及び悪性リンパ腫からなる群から選ば
れる少なくとも一つが挙げられるが、これらの癌に限定
されるものではなく、高カルシウム血症をもたらす悪性
腫瘍はすべて本発明の高カルシウム血症抑制剤の適用の
対象とすることができる。以下、本発明を詳細に説明す
る。

【００３９】

【発明の実施の形態】

１．ヒトPTHrP に対するマウスモノクローナル抗体の作
製 PTHrPに対するマウスモノクローナル抗体は、抗原で免
疫した動物から得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細
胞との細胞融合によりハイブリドーマを調製し、得られ
るハイブリドーマからPTHrP活性を特異的に阻害する抗
体を産生するクローンを選択することにより調製するこ
とができる。

【００４０】(1) 抗原の調製動物の免疫に用いるPTHrPとしては、組換えＤＮＡ法又
は化学合成により調製したPTHrPのアミノ酸配列の全部
若しくは一部のペプチド、又は高カルシウム血症を惹起
する癌細胞の培養上清液由来のPTHrPなどが挙げられ
る。例えば、公知のPTHrP（Kemp,B.E. et al., Science
(1987)238,1568-1570) の第１〜34番目のアミノ酸から
なるペプチド（PTHrP(1-34)）を抗原として用いること
ができる。なお、ヒトPTHrP(1-34)は、配列番号75で表
されるアミノ酸配列を有するものである。

【００４１】得られたPTHrPをキャリアータンパク質
（例えばサイログロブリン）に結合させた後、アジュバ
ントを添加する。アジュバントとしては、フロイント完
全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等が
挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。

【００４２】(2) 免疫及び抗体産生細胞の採取上記のようにして得られた抗原を哺乳動物、例えばマウ
ス、ラット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの
哺乳動物に投与する。免疫は、既存の方法であれば何れ
の方法をも用いることができるが、主として静脈内注
射、皮下注射、腹腔内注射などにより行う。また、免疫
の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ま
しくは４〜21日間間隔で免疫する。

【００４３】最終の免疫日から２〜３日後に抗体産生細
胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リン
パ節細胞、末梢血細胞が挙げられるが、一般に脾臓細胞
が用いられる。抗原の免疫量は１回にマウス１匹当た
り、100 μg用いられる。

【００４４】(3) 抗体価の測定免疫した動物の免疫応答レベルを確認し、また、細胞融
合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選択す
るため、免疫した動物の血中抗体価、又は抗体産生細胞
の培養上清中の抗体価を測定する。抗体検出の方法とし
ては、公知技術、例えばEIA(エンザイムイムノアッセ
イ）、RIA(ラジオイムノアッセイ）、ELISA(酵素連結イ
ムノソルベントアッセイ）等が挙げられる。

【００４５】(4) 細胞融合抗体産生細胞と融合させるミエローマ（骨髄腫）細胞と
して、マウス、ラット、ヒトなど種々の動物に由来し、
当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用す
る細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態で
は選択培地（例えばＨＡＴ培地）で生存できず、融合し
た状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられ
る。一般的に８-アザグアニン耐性株が用いられ、この
細胞株は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシル
トランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミノ
プテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できないもの
である。

【００４６】ミエローマ細胞は、既に公知の種々の細胞
株、例えば、P3 (P3x63Ag8.653) (J.Immunol.(1979)12
3:1548-1550) 、P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Micr
obiology and Immunology (1978) 81:1-7)、NS-1(Kohle
r,G.and Milstein, C., Eur.J.Immunol.(1976)6:511-51
9)、MPC-11 (Margulies,D.H.et al., Cell (1976) 8:40
5-415)、SP2/0 (Shulman,M. et al., Nature(1978)276:
269-270)、FO(de St.Groth, S.F.et al., J.Immunol. M
ethods (1980) 35:1-21)、S194 (Trowbridge, I.S., J.
Exp.Med. (1978)148:313-323) 、R210 (Galfre,G. et a
l., Nature (1979) 277:131-133)等が好適に使用され
る。

【００４７】抗体産生細胞は、脾臓細胞、リンパ節細胞
などから得られる。すなわち、前記各種動物から脾臓、
リンパ節等を摘出又は採取し、これら組織を破砕する。
得られる破砕物をPBS 、DMEM、RPMI1640等の培地又は緩
衝液に懸濁し、ステンレスメッシュ等で濾過後、遠心分
離を行うことにより目的とする抗体産生細胞を調製す
る。

【００４８】次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞
とを細胞融合させる。細胞融合は、MEM 、DMEM、RPME-1
640 培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細
胞と抗体産生細胞とを、混合比１：１〜１：10で融合促
進剤の存在下、30〜37℃で１〜15分間接触させることに
よって行われる。細胞融合を促進させるためには、平均
分子量1,000〜6,000 のポリエチレングリコール、ポリ
ビニルアルコール又はセンダイウイルスなどの融合促進
剤や融合ウイルスを使用することができる。また、電気
刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販
の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞
とを融合させることもできる。

【００４９】(5) ハイブリドーマの選択及びクローニン
グ細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを
選別する。その方法として、選択培地における細胞の選
択的増殖を利用する方法等が挙げられる。すなわち、細
胞懸濁液を適切な培地で希釈後、マイクロタイタープレ
ート上にまき、各ウェルに選択培地（ HAT培地など）を
加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その
結果、生育してくる細胞をハイブリドーマとして得るこ
とができる。ハイブリドーマのスクリーニングは、限界
希釈法、蛍光励起セルソーター法等により行い、最終的
にモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得する。

【００５０】(6) モノクローナル抗体の採取取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取
する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等が
挙げられる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを
10〜20％ウシ胎児血清含有 RPMI-1640培地、MEM 培地、
又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養
条件（例えば37℃，５％CO₂濃度）で２〜14日間培養
し、その培養上清から抗体を取得する。

【００５１】腹水形成法においては、ミエローマ細胞由
来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にハイブリドーマを
投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、
１〜４週間後に腹水又は血清を採取する。上記抗体の採
取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫
安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択
して、又はこれらを組み合わせることにより精製する。

【００５２】２．キメラ抗体の構築（１）ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗
体のＶ領域をコードする塩基配列を含むDNAのクローニ
ング (i) mRNAの調製ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体のＶ
領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡのクローニング
を行うため、回収されたハイブリドーマから公知の方
法、例えばグアニジン−超遠心法（Chirgwin,J.M. ら、
Biochemistry (1979), 18, 5294-5299) 、ＡＧＰＣ法
（Chomczynski,P ら、Analytical Biochemistry (198
7), 162, 156-159）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮ
Ａ Purification Kit (Pharmacia 社製）に添付された
Oligo(dT)-セルローススパンカラム等によりｍＲＮＡを
調製する。また、Quick Prep mRNA Purification Kit
(Pharmacia 社製) を用いることにより、全ＲＮＡの抽
出操作を経ずに、ｍＲＮＡの調製を行うこともできる。

【００５３】(ii)ｃＤＮＡの調製及び増幅上記(i) で得たｍＲＮＡから、逆転写酵素を用いてＬ鎖
及びＨ鎖のＶ領域におけるｃＤＮＡをそれぞれ合成す
る。ｃＤＮＡの合成は、Oligo-dTプライマー又はＬ鎖Ｃ
領域若しくはＨ鎖Ｃ領域とハイブリダイズする適当なプ
ライマー（例えば配列番号１で表される塩基配列を有す
るＭＨＣ２プライマー）を用いることが出来る。ｃＤＮ
Ａ合成反応は、前記ｍＲＮＡとプライマーとを混合し、
逆転写酵素の存在下で例えば５２℃で３０分の反応を行
う。

【００５４】ｃＤＮＡの増幅は、Ｌ鎖及びＨ鎖ともに
5’-Ampli FINDER RACE kit (CLONTECH社)を用いた５’
−ＲＡＣＥ法（Frohman,M. A.ら, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 85, 8998-9002, 1988、Belyavsky,A.ら, Nucle
ic Acids Res. 17, 2919-2932,1989)に基づくＰＣＲ
（ポリメラーゼ連鎖反応）にて行うことが出来る。すな
わち、上記で合成したｃＤＮＡの５’末端にAmpli FIND
ER Anchor（配列番号４２）を連結し、Ｌ鎖Ｖ領域及び
Ｈ鎖Ｖ領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡ（以下、
Ｌ鎖Ｖ領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡを「Ｌ鎖
Ｖ領域のＤＮＡ」又は「Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮ
Ａ」と略記することもある（Ｈ鎖Ｖ領域、Ｃ領域等につ
いても同様））についてＰＣＲを行う。

【００５５】Ｌ鎖Ｖ領域のＤＮＡを増幅するためのプラ
イマーとして、例えばＡｎｃｈｏｒプライマー（配列番
号２）及びマウス抗体のＬ鎖λ鎖定常領域（Ｃλ領域）
の保存配列から設計したプライマー（例えば配列番号４
で表される塩基配列を有するＭＬＣプライマー）を用い
ることが出来る。また、Ｈ鎖Ｖ領域のＤＮＡを増幅する
ためのプライマーとして、例えばＡｎｃｈｏｒプライマ
ー（配列番号２）及びＭＨＣ−Ｇ１プライマー（配列番
号３）（S.T.Jones ら, Biotechnology, 9, 88, 1991)
を用いることが出来る。

【００５６】(iii) ＤＮＡの精製及び塩基配列の決定ＰＣＲ産物について、公知手法に従ってアガロースゲル
電気泳動を行い、目的とするＤＮＡ断片を切り出した
後、ＤＮＡの回収及び精製を行い、ベクターＤＮＡに連
結する。ＤＮＡの精製は、市販のキット（例えばGENECL
EAN II; BIO101) を用いて行われる。ＤＮＡ断片を保持
するためのベクターＤＮＡには公知のもの（例えばpUC1
9 、Bluescript等)を用いることができる。

【００５７】前記ＤＮＡと上記ベクターＤＮＡとを、公
知のライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結さ
せ、組換えベクターを得る。次に、得られる組換えベク
ターを大腸菌JM109 等に導入した後アンピシリン耐性コ
ロニーを選抜し、公知方法に基づいてベクターＤＮＡを
調製する（J.Sambrook, et al., Molecular Cloning,Co
ld Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 。目的と
するＤＮＡの塩基配列は、上記ベクターＤＮＡを制限酵
素で消化した後、公知方法（例えばジデオキシ法）によ
り決定する（J.Sambrook, et al., Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 。本発
明では、自動塩基配列決定装置（DNA Sequencer 373A;
ABI 社) を用いることができる。

【００５８】(iv)相補性決定領域Ｈ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は、抗原結合部位を形成し、
その全般の構造は互いに類似性を有している。すなわ
ち、それぞれ４つのフレームワーク領域（ＦＲ）部分
が、３つの超可変領域、すなわち相補性決定領域（ＣＤ
Ｒ）により連結されている。ＦＲのアミノ酸配列は比較
的よく保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸
配列の変異性は極めて高い（Kabat,E.A.ら、「Sequence
of Proteinsof Immunological Interest」 US Dept. H
ealth and Human Services, 1983)。

【００５９】前記４個のＦＲの多くの部分は、β−シー
ト構造をとり、その結果３個のＣＤＲはループを形成す
る。ＣＤＲは、ある場合にはβ−シート構造の一部を形
成することもある。従って、３個のＣＤＲはＦＲによっ
て相互に立体的に非常に近い位置に保持され、そしてＦ
Ｒは対をなす領域の３個のＣＤＲと共に抗原結合部位を
形成する。

【００６０】このような事実に基づき、ヒトＰＴＨｒＰ
に対するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ
酸配列をＫａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸
配列のデータベース（「Sequence of Proteins of Immu
nological Interest」 US Dept. Health and Human Ser
vices, 1983)にあてはめて、相同性を調べることにより
ＣＤＲ領域を見い出すことが出来る。

【００６１】（２）キメラ抗体の発現ベクターの作製マウスモノクローナル抗体のマウスＬ鎖（以下、抗体の
Ｌ鎖又はＨ鎖を表す場合は、マウスについては「マウス
Ｌ鎖」、ヒト抗体のＨ鎖については「ヒトＨ鎖」のよう
に略記することもある。）及びＨ鎖Ｖ領域をコードする
ＤＮＡ断片がクローニングされれば、これらのマウスＶ
領域をコードするＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコード
するＤＮＡと連結して発現させることによってキメラ抗
ヒトＰＴＨｒＰ抗体が得られる。

【００６２】キメラ抗体を作製するための基本的な方法
は、クローン化されたｃＤＮＡに存在するマウスリーダ
ー配列及びＶ領域配列を、哺乳類細胞の発現ベクター中
にすでに存在するヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連
結することを含んでなる。あるいは、クローン化された
ｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列及びＶ領域の配
列をヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連結した後、哺
乳類細胞発現ベクターに連結することを含んでなる。

【００６３】ヒト抗体Ｃ領域を含むポリペプチドは、任
意のヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域及びヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域の
ものとすることができ、例えばヒトＨ鎖のものについて
はＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４、及びＬ鎖のもの
についてはＣλ又はＣκを各々挙げることができる。

【００６４】キメラ抗体の製造のためには、まず、２種
類の発現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモータ
ー系のごとき発現制御領域による制御のもとでマウスＬ
鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコー
ドするＤＮＡを含む発現ベクター、並びにエンハンサー
／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでマウス
Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコ
ードするＤＮＡを含む発現ベクターを作製する。次に、
これらの発現ベクターにより哺乳類細胞のごとき宿主細
胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をイン
−ビトロ又はイン−ビボで培養してキメラ抗体を製造す
る（例えば、ＷＯ９１／１６９２８参照）。

【００６５】あるいは、クローン化されたｃＤＮＡに存
在するマウスリーダー配列並びにマウスＬ鎖Ｖ領域をコ
ードするＤＮＡ及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ
と、マウスリーダー配列並びにマウスＨ鎖Ｖ領域をコー
ドするＤＮＡ及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと
を単一の発現ベクター（例えば、ＷＯ９４／１１５２３
参照）に導入し、そして該ベクターを用いて宿主細胞を
形質転換し、次にこの形質転換された宿主をイン−ビボ
又はイン−ビトロで培養して目的とするキメラ抗体を生
産させる。

【００６６】(i) キメラ抗体Ｈ鎖の構築キメラ抗体のＨ鎖発現ベクターは、マウスのＨ鎖Ｖ領域
をコードする塩基配列を含むｃＤＮＡ（以下、「Ｈ鎖Ｖ
領域のｃＤＮＡ」ともいう）を、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域
をコードする塩基配列を含むゲノムＤＮＡ（以下、「Ｈ
鎖Ｃ領域のゲノムＤＮＡ」ともいう）又は当該領域をコ
ードするｃＤＮＡ（以下、「Ｈ鎖Ｃ領域のｃＤＮＡ」と
もいう）を含む適当な発現ベクターに導入することによ
り得ることが出来る。Ｈ鎖Ｃ領域としては、例えばＣγ
１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４領域が挙げられる。

【００６７】(i-a) Ｈ鎖Ｃ領域をコードするゲノムＤＮ
Ａを含むキメラＨ鎖発現ベクターの構築Ｈ鎖Ｃ領域をコードするゲノムＤＮＡを有する発現ベク
ターとしては、Ｃγ１領域をコードするものについて
は、例えばＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１（ＷＯ９２／１９７
５９参照）又はＤＨＦＲ−△Ｅ−ＲＶｈ−ＰＭ１−ｆ
（ＷＯ９２／１９７５９参照）が挙げられる。

【００６８】ここで、マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃ
ＤＮＡをこれらの発現ベクターに挿入するにあたり、Ｐ
ＣＲ法により該ｃＤＮＡに適当な塩基配列を導入するこ
とが出来る。例えば、該ｃＤＮＡの５’−末端に適当な
制限酵素の認識配列を有するように、そして転写効率を
よくするため該ｃＤＮＡの開始コドン直前にＫｏｚａｋ
コンセンサス配列を有するように設計したＰＣＲプライ
マー、及び、該ｃＤＮＡの３’−末端に適当な制限酵素
の認識配列を有するように、そしてゲノムＤＮＡの一次
転写産物が正しくスプライスされｍＲＮＡとなるための
スプライスドナー部位を有するように設計したＰＣＲプ
ライマーを用いてＰＣＲを行うことで、これら適当な塩
基配列を発現ベクターに導入することができる。

【００６９】こうして構築したマウスＨ鎖Ｖ領域をコー
ドするｃＤＮＡを適当な制限酵素で処理した後、上記発
現ベクターに挿入して、Ｈ鎖Ｃ領域（Ｃγ１領域）をコ
ードするゲノムＤＮＡを含むキメラＨ鎖発現ベクターを
構築する。

【００７０】(i-b) Ｈ鎖をコードする塩基配列を含むｃ
ＤＮＡを含むキメラＨ鎖発現ベクターの構築Ｈ鎖Ｃ領域（例えばＣγ１領域）をコードするｃＤＮＡ
を有する発現ベクターは、以下のようにして構築するこ
とができる。すなわち、ヒト型化ＰＭ１抗体のＨ鎖Ｖ領
域及びヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１のゲノムＤＮＡ（N. T
akahashi, et al., Cell 29, 671-679 1982）をコード
するＤＮＡを含む発現ベクターＤＨＦＲ−△Ｅ−ＲＶｈ
−ＰＭ１−ｆ（ＷＯ９２／１９７５９参照）と、ヒト型
化ＰＭ１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のゲノムＤＮＡびヒト抗体Ｌ鎖
κ鎖Ｃ領域のゲノムＤＮＡをコードするＤＮＡを含む発
現ベクターＲＶｌ−ＰＭ１ａ（ＷＯ９２／１９７５９参
照）とを導入したＣＨＯ細胞からｍＲＮＡを調製し、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ法により、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域コ
ードするｃＤＮＡ及びヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域（Ｃγ１）を
コードするｃＤＮＡをクローニングし、該ｃＤＮＡを適
当な制限酵素処理を行った動物細胞発現用ベクターに連
結することにより、目的とする発現ベクターが構築され
る。

【００７１】ここで、マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃ
ＤＮＡを、ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃＤ
ＮＡと直接連結するにあたり、Ｈ鎖Ｖ領域をコードする
ｃＤＮＡを含む断片に、ＰＣＲ法により適当な塩基配列
を導入することが出来る。例えば、該ｃＤＮＡの５’−
末端に適当な制限酵素の認識配列を有するように、そし
て転写効率をよくするために該ｃＤＮＡの開始コドン直
前にＫｏｚａｋコンセンサス配列を有するように設計し
たＰＣＲプライマー、及び、該ｃＤＮＡの３’−末端に
Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１のＤＮＡと直接連結するための適当な
制限酵素の認識配列を有するように設計したＰＣＲプラ
イマーを用いてＰＣＲを行うことで、これら適当な塩基
配列を該ｃＤＮＡに導入する。

【００７２】こうして構築したマウスＨ鎖Ｖ領域をコー
ドするｃＤＮＡを適当な制限酵素で処理して、上記Ｈ鎖
Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃＤＮＡと連結して、ｐＣＯ
Ｓ１又はｐＣＨＯ１のごとき発現ベクターに挿入するこ
とにより、キメラＨ鎖をコードするｃＤＮＡを含む発現
ベクターを構築することが出来る。

【００７３】(ii)キメラ抗体Ｌ鎖の構築キメラ抗体のＬ鎖発現ベクターは、マウスＬ鎖Ｖ領域を
コードするｃＤＮＡと、ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域をコード
するゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡとを連結し、適当な発現
ベクターに導入することにより得ることが出来る。Ｌ鎖
Ｃ領域としては、例えばκ鎖又はλ鎖が挙げられる。

【００７４】(ii-a) キメラＬ鎖λ鎖をコードするｃＤ
ＮＡを含む発現ベクターの構築マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを含む発現ベク
ターを構築するにあたり、ＰＣＲ法により適当な塩基配
列を該発現ベクターに導入することが出来る。例えば、
該ｃＤＮＡの５’−末端に適当な制限酵素の認識配列を
有するように、そして転写効率をよくするためのＫｏｚ
ａｋコンセンサス配列を有するように設計したＰＣＲプ
ライマー、及び、３’−末端に適当な制限酵素の認識配
列を有するように設計したＰＣＲプライマーを用いてＰ
ＣＲを行うことで、これら適当な塩基配列を該ｃＤＮＡ
に導入する。

【００７５】ヒトＬ鎖λ鎖Ｃ領域をコードするｃＤＮＡ
は、全塩基配列をＤＮＡ合成機で合成し、ＰＣＲ法によ
り構築することが出来る。ヒトＬ鎖λ鎖Ｃ領域は、アイ
ソタイプの違いにより少なくとも４種類の存在が知ら
れ、いずれのアイソタイプも発現ベクターの構築に用い
ることが可能である。例えば、クローニングしたマウス
モノクローナル抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域との相同性の検索か
ら、ヒトＬ鎖λ鎖Ｃ領域断片のアイソタイプとしてＭｃ
ｇ＋Ｋｅ＋Ｏｚ− （accession No. X57819) (P.D
ariavachら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9
078, 1987)のものを選択して発現ベクターの構築に用い
ることが出来る。公知のヒトＬ鎖λ鎖Ｃ領域、例えばＭ
ｃｇ＋Ｋｅ＋Ｏｚ− のｃＤＮＡを構築するため
に、例えば配列番号１１から１４に示す４本の下記プラ
イマーに分ける。プライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１（配列番
号１１）及びＭＢＣ１ＨＧＰ３（配列番号１３）はセン
スＤＮＡ配列を有し、ＭＢＣ１ＨＧＰ２（配列番号１
２）及びＭＢＣ１ＨＧＰ４（配列番号１４）はアンチセ
ンスＤＮＡ配列を有し、それぞれのプライマーの両端に
２０から２３ｂｐの相補的配列を有する様に設計する。

【００７６】ＭＢＣ１ＨＧＰＳ（配列番号１５）及びＭ
ＢＣ１ＨＧＰＲ（配列番号１６）は外部プライマーと呼
ばれ、ＭＢＣ１ＨＧＰ１、ＭＢＣ１ＨＧＰ４とそれぞれ
相同な配列を有しており、それぞれ適当な制限酵素の認
識配列をそれぞれ含んでいる。ＰＣＲ法を用いて、４本
のプライマーをアセンブリさせ、完全長のｃＤＮＡ合成
し、さらに外部プライマーを加えｃＤＮＡの増幅を行
う。ＰＣＲ法によるアセンブリとは、ＭＢＣ１ＨＧＰ１
とＭＢＣ１ＨＧＰ２、又はＭＢＣ１ＨＧＰ３とＭＢＣ１
ＨＧＰ４とがその相補的配列によりアニーリングし、Ｍ
ＢＣ１ＨＧＰ１−ＭＢＣ１ＨＧＰ２断片とＭＢＣ１ＨＧ
Ｐ３−ＭＢＣ１ＨＧＰ４断片が合成され、さらに、各断
片の相補的配列によりアニーリングして、完全長のヒト
Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域をコードするｃＤＮＡが合成されること
を指す。

【００７７】このようにして構築したヒトＬ鎖λ鎖Ｃ領
域をコードするｃＤＮＡと、上記のようにして構築した
マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡとを、適当な制
限酵素部位間で連結し、さらにｐＣＯＳ１又はｐＣＨＯ
１のごとき発現ベクターに挿入することにより、キメラ
抗体のＬ鎖λ鎖をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクタ
ーを構築することが出来る。

【００７８】(ii-b)キメラＬ鎖κ鎖をコードするｃＤＮ
Ａを含む発現ベクターの構築マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを含む発現ベク
ターを構築するにあたり、ＰＣＲ法により、該ｃＤＮＡ
に適当な塩基配列を導入することが出来る。例えば、該
ｃＤＮＡの５’−末端に適当な制限酵素の認識配列を有
するように、そして転写効率をよくするためのＫｏｚａ
ｋコンセンサス配列を有するように設計したＰＣＲプラ
イマー、及び、３’−末端に適当な制限酵素の認識配列
を有するように設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣ
Ｒを行うことで、これら適当な塩基配列を該ｃＤＮＡに
導入する。

【００７９】マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡと連
結させるためのヒトＬ鎖κ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ
は、例えばゲノムＤＮＡを含むＨＥＦ-PM1k-gk（ＷＯ９
２／１９７５９参照）から構築することが出来る。ＰＣ
Ｒ法により、Ｌ鎖κ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡの５’
−末端及び３’−末端に適当な制限酵素の認識配列を導
入し、上記のようにして構築したマウスＬ鎖Ｖ領域をコ
ードするＤＮＡとＬ鎖κ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと
を連結し、ｐＣＯＳ１又はｐＣＨＯ１のごとき発現ベク
ターに挿入することにより、キメラ抗体のＬ鎖κ鎖をコ
ードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを構築することが
出来る。

【００８０】３．ヒト型化抗体の作製（１）ヒト抗体との相同性検索マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト抗体に移植さ
れているヒト型化抗体を作製するためには、マウスモノ
クローナル抗体のＦＲとヒト抗体のＦＲとの間に高い相
同性が存在することが望ましい。従って、マウス抗ヒト
ＰＴＨｒＰモノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域
を、プロテイン・データ・バンクを用いて構造が解明さ
れているすべての既知抗体のＶ領域と比較する。また、
同時にＫａｂａｔらにより、抗体のＦＲの長さ、アミノ
酸の相同性等によって分類されたヒト抗体のサブグルー
プ（ＨＳＧ：Human subgroup)(Kabat, E.A. ら、US De
p.Health and Human Services, US Government Printin
g Offices,1991) との比較を行う。

【００８１】ヒトＨ鎖Ｖ領域の場合は、Ｋａｂａｔらに
よるＨＳＧ分類により、ＨＳＧＩ〜IIIに分類すること
が出来、マウス抗ヒトＰＴＨｒＰモノクローナル抗体Ｈ
鎖Ｖ領域は、ＨＳＧIIIのコンセンサス配列と82.7％の
ホモロジーを有する。一方、ヒトＬ鎖λ鎖Ｖ領域は、Ｋ
ａｂａｔらによるＨＳＧ分類により、ＨＳＧＩ〜VIに分
類することが出来、マウス抗ヒトＰＴＨｒＰモノクロー
ナル抗体Ｌ鎖λ鎖Ｖ領域は、いずれのサブグループに属
するヒトＬ鎖λ鎖Ｖ領域のコンセンサス配列とも高いホ
モロジーを有さない。

【００８２】従って、マウス抗ヒトＰＴＨｒＰモノクロ
ーナル抗体をヒト型化する際には、ヒトＨ鎖Ｖ領域とし
てＨＳＧIIIに属し、最も相同性の高いヒトＨ鎖Ｖ領
域、又はカノニカルストラクチャー（Chothia C, et a
l., J. Mol. Biol. 196, 901-917,1987)の一致するＦＲ
の構造を有するヒトＨ鎖Ｖ領域をヒト型化抗体の構築に
使用することが望ましい。また、ヒトＬ鎖λ鎖Ｖ領域の
サブグループには相同性の高いコンセンサス配列がない
ことより、プロテイン・データ・バンクに登録されてい
る最も高い相同性を有するヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｖ領域をヒ
ト型化抗体の構築に使用することが望ましい。

【００８３】（２）ヒト型化抗体Ｖ領域をコードするＤ
ＮＡの設計ヒト型化抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡの設計における
第一段階は、設計の基礎となるヒト抗体Ｖ領域を選択す
ることである。本発明においては、マウス抗体Ｖ領域の
ＦＲと８０％以上ホモロジーを有するヒト抗体Ｖ領域の
ＦＲを、ヒト型化抗体に用いることができる。ここで、
Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲとしては、サブグループIIIに属する
もの、例えばS31679(NBRF-PDB、Cuisinier A.M.ら、Eu
r.J.Immunol. 23,110-118,1993) 由来のＦＲを実質的に
同一なＦＲの断片として挙げることができる。また、Ｌ
鎖Ｖ領域のＦＲとしては、例えばヒト抗体ＨＳＵ０３８
６８（GEN-BANK、Deftos Mら、Scand. J. Immunol. 39,
95-103, 1994)由来のＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３と、ヒ
ト抗体Ｓ２５７５５（ＮＢＲＦ-ＰＤＢ）由来のＦＲ４
とを実質的に同一なＦＲの断片として挙げることができ
る。なお、ヒト抗体Ｓ３１６７９は、ヒト胎児肝臓のｃ
ＤＮＡライブラリーよりクローニングされた抗体であ
り、ヒト抗体ＨＳＵ０３８６８は新規ヒトＬ鎖λ鎖Ｖ領
域の遺伝子としてクローニングされた抗体である。

【００８４】（３）ヒト型化抗体Ｖ領域を含むポリペプ
チドの作製本発明のヒト型化抗体は、該抗体のＣ領域、及びＶ領域
のフレームワーク（ＦＲ）領域がヒト由来のものであ
り、Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）がマウス由来の
ものである（図１）。本発明のヒト型化抗体のＶ領域を
含むポリペプチドは、鋳型となるヒト抗体のＤＮＡ断片
が入手可能ならば、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−グラフティ
ングと呼ばれる手法により作製することができる。「Ｃ
ＤＲ−グラフティング」とは、マウス由来のＣＤＲをコ
ードするＤＮＡ断片を作製し、これを鋳型となるヒト抗
体のＣＤＲと入れ換える手法をいう。

【００８５】また、鋳型となるヒト抗体のＤＮＡ断片が
入手できない場合は、データベースに登録されている塩
基配列をＤＮＡ合成機で合成し、ＰＣＲ法によりヒト型
化抗体Ｖ領域のＤＮＡを作製することができる。さら
に、アミノ酸配列のみデータベースに登録されている場
合は、そのアミノ酸配列を基に、Kabat, E. A.らの報告
（US Dep. Health and Human Services, US Government
Printing Offices, 1991)している抗体のコドン使用頻
度に基づいて、全塩基配列を類推することができる。こ
の塩基配列をＤＮＡ合成機で合成し、ＰＣＲ法によりヒ
ト型化抗体Ｖ領域のＤＮＡを作製し、これを適当な宿主
に導入して発現させることにより、目的のポリペプチド
を作製することができる。以下に、鋳型となるヒト抗体
のＤＮＡ断片が入手できる場合の、ＰＣＲ法によるＣＤ
Ｒ−グラフティングの一般的な概要を示す。

【００８６】(i) ＣＤＲ−グラフティング図２に示すように、Ｖ領域をコードするＤＮＡがＦＲ
１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及
びＦＲ４をコードするＤＮＡの順で連結されているもの
とする。

【００８７】まず、それぞれのＣＤＲに対応するマウス
由来のＤＮＡ断片を合成する。ＣＤＲ１〜３は、先にク
ローニングしたマウスＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域の塩基
配列を基に合成されたＤＮＡである。グラフティングプ
ライマーＢは、センス方向のマウスＣＤＲ１とヒト抗体
のＦＲ２にハイブリダイズする配列を有し、グラフティ
ングプライマーＥは、アンチセンス方向のＣＤＲ１とヒ
ト抗体のＦＲ１にハイブリダイズする配列を有するよう
に合成する（グラフティングプライマーＣとＦ、グラフ
ティングプライマーＤとＧについても同様）（図２(1)
）。また、ＦＲ１の上流の領域及びＦＲ４の下流の領
域にハイブリダイズすることができる適当なプライマー
（外部プライマーという；図２(1) のＡ及びＨ）も合成
する。なお、グラフティングプライマーの分離、抽出
は、公知の手法により行うことができる（Sambrook,et
al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold S
pringHarbor Laboratory Press, 1989)。

【００８８】次に、グラフティングプライマーＥと外部
プライマーＡ、グラフティングプライマーＢとＦ、グラ
フティングプライマーＣとＧ、グラフティングプライマ
ーＤと外部プライマーＨとを用いて第一ＰＣＲを行う。
その結果、それぞれ断片Ａ−Ｅ、断片Ｂ−Ｆ、断片Ｃ−
Ｇ及び断片Ｄ−Ｈが得られる（図２(2) ）。

【００８９】前記の通り、グラフティングプライマーＢ
の上流とグラフティングプライマーＥの下流の一部の領
域とが重複するように設計されているので（グラフティ
ングプライマーＣとＦ、ＤとＧについても同様）、これ
らの断片は、適当な温度条件で反応させることにより、
それぞれの相補的配列にアニーリングし、ＰＣＲを行う
ことによりＡからＨまでの長さを有するＤＮＡにアセン
ブリーすることが可能である。そして、Ｖ領域をコード
する１本のＤＮＡ断片が得られたところで外部プライマ
ーＡとＨを加え、第二ＰＣＲを行うことにより、ＦＲ１
〜４はヒト由来のものであるがＣＤＲ１〜３はマウス由
来のものとなったヒト型抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡ
を得る。そして、これを適当な宿主に導入して発現させ
ることにより、目的のポリペプチドを得ることができる
（図２(3) ）。

【００９０】(ii)ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮ
Ａ及び発現ベクターの構築本発明では、ヒト型化抗体の鋳型となるヒト抗体のＨ鎖
Ｖ領域をコードするＤＮＡを天然から入手することがで
きないため、当該ＤＮＡはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮ
Ａの全塩基配列をＤＮＡ合成機で合成し、ＰＣＲ法によ
り構築することが出来る。

【００９１】マウス抗ヒトＰＴＨｒＰモノクローナル抗
体Ｈ鎖Ｖ領域は、ヒトサブグループIIIに属するＳ３１
６７９と高い相同性を有する。このヒト抗体を鋳型とし
てヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを構築するた
めに、例えば配列番号２３から２６に示す４本のプライ
マーに分けて使用する。プライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１
（配列番号２３）及びＭＢＣ１ＨＧＰ３（配列番号２
４）はセンスＤＮＡ配列を有し、ＭＢＣ１ＨＧＰ２（配
列番号２５）及びＭＢＣ１ＨＧＰ４（配列番号２６）は
アンチセンスＤＮＡ配列を有し、それぞれのプライマー
の両端に１５から２１ｂｐの相補的配列を有する様に設
計する。

【００９２】外部プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ１（配列番
号２７）、ＭＢＣ１ＨＶＲ１（配列番号２８）はＭＢＣ
１ＨＧＰ１、ＭＢＣ１ＨＧＰ４とそれぞれ相同な配列を
有しており、それぞれ適当な制限酵素の認識配列をそれ
ぞれ含んでいる。ＰＣＲ法を用いて、４本のプライマー
をアセンブリさせ完全長のｃＤＮＡ合成し、さらに外部
プライマーを加えＤＮＡの増幅を行う。ＰＣＲ法による
アセンブリとは、ＭＢＣ１ＨＧＰ１とＭＢＣ１ＨＧＰ
２、又はＭＢＣ１ＨＧＰ３とＭＢＣ１ＨＧＰ４とがその
相補的配列によりアニーリングし、ＭＢＣ１ＨＧＰ１−
ＭＢＣ１ＨＧＰ３断片とＭＢＣ１ＨＧＰ２−ＭＢＣ１Ｈ
ＧＰ４断片が合成され、さらに、各断片の相補的配列に
よりアニーリングして、完全長のヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域の
ＤＮＡが合成されることを指す。

【００９３】ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域は任意のヒトＨ鎖Ｃ領
域であることができ、例えばヒトＨ鎖Ｃγ１、Ｃγ２、
Ｃγ３又はＣγ４を挙げることができる。前記のように
して構築したヒト型化抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＤＮＡは、任意
のヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域、例えばヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１領
域のＤＮＡと連結することができる。キメラ抗体Ｈ鎖の
構築で述べたように、適当な制限酵素にて処理した後、
エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域の
もとでヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、ヒ
ト型化Ｈ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域のＤＮＡを含む発
現ベクターを作製する。

【００９４】(iii) ヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤ
ＮＡ及び発現ベクターの構築本発明では、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡの場合と同
様、鋳型となるヒト抗体のＬ鎖Ｖ領域のＤＮＡを天然か
ら入手することができないため、Ｌ鎖Ｖ領域をコードす
るＤＮＡの全塩基配列をＤＮＡ合成機で合成し、ＰＣＲ
法により構築することが出来る。

【００９５】マウス抗ヒトＰＴＨｒＰモノクローナル抗
体Ｌ鎖Ｖ領域と最も相同性を有するヒト抗体ＨＳＵ０３
８６８を鋳型としてヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域のＤＮＡを構築
するために、例えば配列番号２９から３２に示す４本の
プライマーに分けて使用する。プライマーＭＢＣ１ＬＧ
Ｐ１（配列番号２９）及びＭＢＣ１ＬＧＰ３（配列番号
３０）はセンスＤＮＡ配列を有し、ＭＢＣ１ＬＧＰ２
（配列番号３１）及びＭＢＣ１ＬＧＰ４（配列番号３
２）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、それぞれのプラ
イマーの両端に１５から２１ｂｐの相補的配列を有する
様に設計する。

【００９６】外部プライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１（配列番
号３３）、ＭＢＣ１ＬＶＲ１（配列番号３４）はＭＢＣ
１ＬＧＰ１、ＭＢＣ１ＬＧＰ４とそれぞれ相同な配列を
有しており、それぞれ適当な制限酵素の認識配列をそれ
ぞれ含んでいる。ＰＣＲ法を用いて、４本のプライマー
をアセンブリさせ完全長のＤＮＡ合成し、さらに外部プ
ライマーを加えＤＮＡの増幅を行う。ＰＣＲ法によるア
センブリとは、ＭＢＣ１ＬＧＰ１とＭＢＣ１ＬＧＰ３、
又はＭＢＣ１ＬＧＰ２とＭＢＣ１ＬＧＰ４とがその相補
的配列によりアニーリングし、ＭＢＣ１ＬＧＰ１−ＭＢ
Ｃ１ＬＧＰ３断片とＭＢＣ１ＬＧＰ２−ＭＢＣ１ＬＧＰ
４断片が合成され、さらに、各断片の相補的配列により
アニーリングして、完全長のヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域をコー
ドするＤＮＡが合成されることを指す。

【００９７】ヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域は任意のヒトＬ鎖Ｃ領
域であることができ、例えばヒトＬ鎖ＣλやＣκを挙げ
ることができる。前記のようにして構築したヒト型化抗
体Ｌ鎖Ｖ領域のＤＮＡは、任意のヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域、
例えばヒトＬ鎖Ｃλ領域のものと連結することができ
る。適当な制限酵素で処理した後、エンハンサー／プロ
モーター系のごとき発現制御領域のもとでヒトＬ鎖λ鎖
Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、ヒト型化Ｌ鎖Ｖ領
域及びヒトＬ鎖λ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む発
現ベクターを作製する。

【００９８】前記のようにして、ヒト型化抗体のＶ領域
を含むポリペプチドが作製されても、該ポリペプチドが
抗体としての活性（抗原に対する結合活性、中和活性
等）を有するか否かは必ずしも明らかではない。特にＬ
鎖の場合は、マウス抗ヒトＰＴＨｒＰモノクローナル抗
体Ｌ鎖Ｖ領域が、非常に希なＶλｘ遺伝子由来であるた
め、ヒト型化Ｈ鎖との組み合わせによりＣＯＳ−７のご
とき動物細胞で発現させ、活性の有無を検討する必要が
ある。

【００９９】ヒト型化抗体Ｖ領域のどのＦＲが、ヒト型
化抗体の結合活性及び中和活性に寄与するのかを明らか
にする方法として、ハイブリッドＶ領域を構築し（Ohto
mo,T. et al. Molecular Immunology, 32,407-416,199
5)、確認するのが有効である。本発明のヒト型化抗体Ｌ
鎖Ｖ領域において、どのアミノ酸を変異させれば活性を
有するものが得られるかを調べるため、ヒト型化抗体の
ＦＲ領域の断片をマウス由来のＦＲ領域の断片と組換え
たものをコードするＤＮＡを構築し、ヒト型化のための
各領域の評価を行う。

【０１００】図３に示すように、ＦＲ１及びＦＲ２はヒ
ト抗体由来であるがＦＲ３及びＦＲ４をマウス抗体由来
に組み換えたＶ領域を含むポリペプチドを有する抗体
（このような組み換えた断片を有する抗体を「ハイブリ
ッド抗体」という）、ＦＲ１のみをヒトのものに組み換
えたハイブリッド抗体、ＦＲ２のみをヒトのものに組み
換えたハイブリッド抗体を作製する。そして、これらの
ハイブリッド抗体をコードするＤＮＡを発現ベクターに
組み込み、ヒト型化抗体を一過性に発現させ、抗体の活
性の有無を調べる。

【０１０１】本発明者は、この方法を用いてＬ鎖Ｖ領域
を含むポリペプチドの抗原結合活性及び中和活性につい
て検討した結果、ＦＲ２及びＦＲ３に、置換すべきアミ
ノ酸が存在することが判明した。本発明者は、ＦＲ２及
びＦＲ３領域に活性に寄与するアミノ酸が存在すること
が判明し、Kabat, E.A. ら（US Dep. Health and Human
Services, US Government Printing Offices,1991) に
より決定された抗体のアミノ酸番号の第36、45及び49番
目のアミノ酸（ＦＲ２領域に存在する）、並びに第87番
目のアミノ酸（ＦＲ３領域に存在する）が活性に寄与す
るアミノ酸であることを明らかにした。

【０１０２】そこで、本発明では、これらのアミノ酸を
変異（例えば置換）させたＶ領域を含むポリペプチドを
作製する。まず、前記ＣＤＲ−グラフティングにより、
アミノ酸の変異を導入させるための基本となるアミノ酸
配列を有するＶ領域を含むポリペプチドを調製する。こ
の基本となるポリペプチドは、配列番号47で表されるア
ミノ酸配列を含むものであり、「バージョンａ」とする
（表１のａ）。

【０１０３】次に、このバージョンａを基準として、Ｆ
Ｒのいくつかのアミノ酸を変異させた種々の変異型断片
を作製する。変異の導入は、目的の変異を導入しようと
するアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドプライマ
ー（変異原プライマー）を設計し、該プライマーを用い
たＰＣＲにより行うことができる。このようにして、Ｆ
Ｒ２及びＦＲ３の特定のアミノ酸を変異させたＶ領域を
含むポリペプチド（バージョンｂ〜ｔ）が作製される
（表１のｂ〜ｔ）。

【０１０４】

【表１】

【０１０５】前記のようにして構築したヒト型化抗体Ｌ
鎖Ｖ領域各バージョンをコードするＤＮＡは、任意のヒ
ト抗体Ｌ鎖Ｃ領域、例えばヒトＬ鎖Ｃλ領域のＤＮＡと
連結することができる。適当な制限酵素で処理した後、
エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域の
もとでヒトＬ鎖λ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結
し、ヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域各バージョンをコードするＤＮ
Ａと、ヒト型化Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡとを
含む発現ベクターを作製する。

【０１０６】また、前記のようにして構築したヒト型化
抗体Ｈ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ
と、ヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードす
るＤＮＡとを、単一の発現ベクター（例えば、ＷＯ９４
／１１５２３参照）に導入し、そして該ベクターを用い
て宿主細胞を形質転換し、次にこの形質転換された宿主
をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とするヒ
ト型化抗体を生産させることができる。

【０１０７】４．キメラ抗体及びヒト型抗体の製造キメラ抗体又はヒト型化抗体を製造するためには、前記
のようなそれぞれ２種類の発現ベクターを作製する。す
なわち、キメラ抗体については、エンハンサー／プロモ
ーター系のごとき発現制御領域による制御のもとでマウ
スＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを
含む発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター
系のごとき発現制御領域のもとでマウスＬ鎖Ｖ領域及び
ヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクター
を作製し、ヒト型化抗体については、エンハンサー／プ
ロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとで
ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤ
ＮＡを含む発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモ
ーター系のごとき発現制御領域のもとでヒト型化Ｌ鎖Ｖ
領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む発現
ベクターを作製する。

【０１０８】次に、これらの発現ベクターにより哺乳類
細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転
換された細胞をイン−ビトロ又はイン−ビボで培養して
キメラ抗体又はヒト型化抗体を製造する（例えば、ＷＯ
９１／１６９２８参照）。

【０１０９】また、Ｈ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｃ領域をコード
するＤＮＡ、並びにＬ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｃ領域をコード
するＤＮＡを単一ベクターに連結し、適当な宿主細胞を
形質転換し、抗体を産生させることができる。すなわ
ち、キメラ抗体の発現には、クローニングされたｃＤＮ
Ａに存在するマウスリーダー配列並びにマウスＨ鎖Ｖ領
域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと、マウスリ
ーダー配列並びにマウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域
をコードするＤＮＡとを単一の発現ベクター（例えば、
ＷＯ９４／１１５２３参照）に導入する。ヒト型化抗体
の発現には、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域を
コードするＤＮＡと、ヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖
Ｃ領域をコードするＤＮＡとを単一の発現ベクター（例
えば、ＷＯ９４／１１５２３参照）に導入する。そし
て、これらのベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、
次にこの形質転換された宿主をイン−ビボ又はイン−ビ
トロで培養して目的とするキメラ抗体又はヒト型化抗体
を生産させる。

【０１１０】以上のようにして目的とするキメラ抗体又
はヒト型化抗体をコードするＤＮＡで形質転換した形質
転換体を培養し、産生したキメラ抗体又はヒト型化抗体
は、細胞内又は細胞外から分離し均一にまで精製するこ
とができる。なお、本発明の目的蛋白質であるキメラ抗
体又はヒト型化抗体の分離・精製を、プロテインＡアガ
ロースカラムを用いて行うことができる。また、その他
に、通常の蛋白質で用いられる分離・精製方法を使用す
ればよく、何ら限定されるものではない。例えば各種ク
ロマトグラフィー、限外濾過、塩折、透析等を適宜選
択、組合せれば、キメラ抗体又はヒト型化抗体を分離・
精製することができる。

【０１１１】ヒトＰＴＨｒＰに対する本発明のキメラ抗
体又はヒト型化抗体を製造するために、任意の発現系を
使用することができる。例えば、真核細胞を用いる場合
は動物細胞（例えば樹立された哺乳類細胞系）、真糸状
菌細胞又は酵母細胞などが挙げられ、原核細胞を用いる
場合は細菌細胞（例えば大腸菌細胞等）などを使用する
ことができる。好ましくは、本発明のキメラ抗体又はヒ
ト型化抗体は哺乳類細胞、例えばＣＯＳ細胞又はＣＨＯ
細胞中で発現される。

【０１１２】これらの場合、哺乳類細胞での発現のため
に有用な常用のプロモーターを用いることができる。例
えば、ヒト・サイトメガロウィルス前期（human cytome
galovirus immediate early; HCMV)プロモーターを使用
するのが好ましい。ＨＣＭＶプロモーターを含有する発
現ベクターの例には、ＨＣＭＶ−ＶＨ−ＨＣγ１，ＨＣ
ＭＶ−ＶＬ−ＨＣＫ等であって、ｐＳＶ２ｎｅｏに由来
するもの（ＷＯ９２−１９７５９）が含まれる。

【０１１３】また、その他に、本発明のために用いるこ
とのできる哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモー
ターとしては、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、
アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）な
どのウイルスプロモーターやヒト・ポリペプチド・チェ
ーン・エロンゲーション・ファクター１α（ＨＥＦ−１
α）などの哺乳動物細胞由来のプロモーターを用いれば
よい。例えばＳＶ４０のプロモーターを使用する場合
は、Mulliganらの方法（Nature 277,108,1979)、また、
ＨＥＦ−１αプロモーターを使用する場合は、Mizushim
a, S. らの方法（Nucleic Acids Research, 18, 5322,
1990) に従えば容易に実施することができる。

【０１１４】複製起原としては、ＳＶ４０、ポリオーマ
ウイルス、アデノウイルス、牛パピローマウイルス（Ｂ
ＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに宿主
細胞系中での遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクター
は選択マーカーとして、ホスホトランスフェラーゼＡＰ
Ｈ（３' ）II又はＩ（ｎｅｏ）遺伝子、チミジンキナー
ゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホ
リボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、
ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子等を含むこと
ができる。

【０１１５】５．キメラ抗体及びヒト型抗体の抗原結合
活性及び中和活性の評価 (1) 抗体の濃度測定得られた精製抗体の濃度の測定は、ELISAにより行うこ
とができる。抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレート
を次のようにして調製する。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレー
ト（例えばMaxisorp, NUNC）の各穴を、例えば１μｇ／
ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体100 μl で
固相化する。200 μl の希釈バッファー（例えば50mM T
ris-HCl 、１mM MgCl₂、0.1M NaCl 、0.05％ Tween20、
0.02％ NaN₃、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、pH7.
2 ）でブロッキングの後、キメラ抗体、ハイブリッド抗
体若しくはヒト型化抗体を発現させたＣＯＳ−７細胞若
しくはＣＨＯ細胞の培養上清、又は精製キメラ抗体、ハ
イブリッド抗体若しくはヒト型化抗体を段階希釈して各
穴に加え、次にアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒ
トＩｇＧ抗体100 μl を加え、１mg/ml の基質溶液（Si
gma 104、ｐ−ニトロフェニルリン酸、SIGMA ）を加
え、次に405nm での吸光度をマイクロプレートリーダー
（Bio Rad ）で測定する。濃度測定のスタンダードとし
て、Hu IgG1λ Purified (The Binding Site)を用いる
ことができる。

【０１１６】(2) 抗原結合能の測定抗原結合測定のためのＥＬＩＳＡプレートでは、次のよ
うにして調製する。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートの各穴
を１μg/mlの濃度に調製したヒトＰＴＨｒＰ（1-34) 10
0 μl で固相化する。200 μl の希釈バッファーでブロ
ッキングの後、キメラ抗体、ハイブリッド抗体若しくは
ヒト型化抗体を発現させたＣＯＳ−７細胞若しくはＣＨ
Ｏ細胞の培養上清、又は精製キメラ抗体、ハイブリッド
抗体若しくはヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加え、
次にアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗
体100 μl を加え、１mg/ml の基質溶液（Sigma 104 、
ｐ−ニトロフェニルリン酸、SIGMA ）を加え、次に405n
m での吸光度をマイクロプレートリーダー（BioRad）で
測定する。

【０１１７】(3) 中和活性の測定マウス抗体、キメラ抗体及びヒト型化抗体の中和活性の
測定は、例えばラット骨肉腫細胞株ＲＯＳ１７／２．８
-５細胞（Sato,K.et al.,Acta Endocrinology116,113-1
20,1987)を用て行うことができる。すなわち、ＲＯＳ１
７／２．８-５細胞を、４ｍＭのヒドロコルチゾンで刺
激し、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターを誘導する。１ｍ
Ｍのイソブチル-1-メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、ＳＩ
ＧＭＡ）でｃＡＭＰの分解酵素を阻害し、中和活性を測
定するマウス抗体、キメラ抗体又はヒト型化抗体をＰＴ
ＨｒＰ（１−３４）と等量混合し、各抗体とＰＴＨｒＰ
（１−３４）の混合液を各穴に添加する。ＰＴＨｒＰの
刺激により、ラット骨肉腫細胞株ＲＯＳ１７／２．８-
５細胞が産生するｃＡＭＰの量を測定することにより、
マウス抗体、キメラ抗体又はヒト型抗体の中和能を評価
することができる。

【０１１８】(4) PTHrP と抗PTHrP 抗体との相互作用に
おける速度論的解析本発明では、PTHrP と抗PTHrP 抗体との相互作用におけ
る速度論を、様々な手法を用いて解析することができ
る。具体的には、スキャッチャード解析やBIACORE と呼
ばれる表面プラズモン共鳴センサー（ファルマシアバイ
オテク社により開発・実用化された）により解離定数、
解離速度定数、結合速度定数を測定することが可能であ
るが、本発明では、その一例として、BIACORE と呼ばれ
る表面プラズモン共鳴センサーにより解析する場合を説
明する。

【０１１９】BIACOREの基本構造は、光源とプリズム、
ディテクターとマイクロ流路から成っている。実際に
は、カセット式のセンサーチップ上にリガンドを固定化
し、そこにアナライトをインジェクションする。両者に
親和性があれば、その結合量が光学的に検出される。

【０１２０】その検出原理は表面プラズモン共鳴と呼ば
れる現象である。すなわち、ガラスと金属薄膜との界面
に全反射するように入射した光のうち、ある角度の入射
光は表面プラズモンの励起に使われ減衰してしまう。そ
の角度が金属薄膜（センサー）に接している溶媒の濃度
変化に依存して変動する。BIACORE はこの変動を検出す
るというものである。

【０１２１】BIACOREではこの変化を共鳴シグナル（SPR
signal）と呼び、0.1度の変化を1000RU（resonance un
its ）としている。1000RUは表面積1mm²の薄金センサー
上に約１ngの蛋白質が結合した場合の変化量であり、蛋
白質であれば50RU（50pg）程度の変化を十分検出するこ
とができる。検出されたシグナルは、BIACOREに付属し
ているコンピューターがセンサーグラムと呼ばれる結合
曲線に変換し、リアルタイムにコンピューターディスプ
レイ上に描き出される（夏目徹他、（1995）実験医
学、13，p563-569．）（Karlsson，R. et al.,（1991）
J.Immunol.Methods 145,p229-240.)。

【０１２２】上記BIACORE によって本発明の抗PTHrP 抗
体のカイネティクスパラメーター、すなわち解離定数
（ＫＤ）、解離速度定数（Ｋdiss) および結合速度定数
（Ｋass)を測定することができる。本発明の抗PTHrP 抗
体は、解離定数（ＫＤ値）が小さい値であるほど中和活
性を有する点で好ましい。本発明の抗PTHrP 抗体におい
て、ＫＤ値は1.86×10^-7以下であることが好ましく、1.
86×10^-8以下であることがより好ましく、3.58×10^-10
以下のものが最も好ましい。

【０１２３】また、ＫＤ値は解離速度定数（Ｋdiss) お
よび結合速度定数（Ｋass)の２つのパラメーターから決
定される（ＫＤ＝Ｋdiss／Ｋass ）。したがって、Ｋdi
ssの値が小さく、Ｋass の値が大きければＫＤ値が小さ
くなることは明らかである。具体的には、本発明の抗PT
HrP 抗体の場合、Ｋdissの値が1.22×10^-1 [1/Sec]以下
であればよい。好ましくは、Ｋdissの値が1.22×10^-2以
下であり、より好ましくは3.16×10^-4以下であり、最も
好ましくは2.32×10^-4 [1/Sec]以下である。

【０１２４】一方、Ｋass の値は6.55×10⁴ [1/M.Sec]
以上であればよい。好ましくはＫass の値は6.55×10⁵
以上であり、より好ましくは0.883 ×10⁶以上であり、
最も好ましくは1.03×10⁶ [1/M.Sec]以上である。さら
に、Ｋdissの値が1.22×10^-1 [1/Sec]以下であり、か
つ、Ｋass の値が6.55×10⁴ [1/M.Sec]以上の抗PTHrP
抗体も好ましい。

【０１２５】さらに具体的には、本発明の抗PTHrP 抗体
は、ＫＤ値がＫＤ値は1.02×10^-11〜1.86×10^-7[M] の
範囲であり、1.02×10^-10〜1.86×10^-8[M] のものが好
ましく、1.34×10^-10〜3.58×10^-10[M]のものがより好
ましく、2.25×10^-10〜3.58×10^-10[M] のものが最も好
ましい。また、Ｋdiss値は7.38×10^-6〜1.22×10^-1[1/S
ec]の範囲であり、7.38×10^-5〜1.22×10^-2[1/Sec]のも
のが好ましく、1.66×10^-4〜3.16×10^-4[1/Sec]のもの
がより好ましく、1.66×10^-4〜2.32×10^-4[1/Sec]のも
のが最も好ましい。

【０１２６】そしてＫass 値は、6.55×10⁴〜1.24×10⁷
[1/M.Sec] の範囲であり、6.55×10⁵〜1.24×10⁶[1/M.S
ec] のものが好ましく、7.23×10⁵〜1.03×10⁶ [1/M.S
ec]のものがより好ましく、0.883 ×10⁶〜1.03×10⁶[1/
M.Sec] のものが最も好ましい。これらのＫＤ値、Ｋdis
s値およびＫass 値はスキャッチャード解析、あるいはB
IACORE などの表面プラズモン共鳴センサー等により得
ることができるが、BIACORE を用いて得ることが好まし
い。

【０１２７】６．抗PTHrP 抗体又はヒト型化抗体を有効
成分として含む医薬組成物及び高カルシウム血症抑制剤 PTHrPに対する抗体又はヒト型化抗体の治療効果を確認
するには、PTHrPに対する抗体又はヒト型化抗体を、高
カルシウム血症を呈した動物に投与し、高カルシウム血
症の指標を測定することによりその治療効果を確認する
ことができる。また、高カルシウム血症を呈した動物及
び高カルシウム血症患者においては、しばしば低リン血
症が認められるが、本発明の抗体は、この低リン血症を
改善するために用いることもできる。

【０１２８】本発明で使用される抗体は、前記解離定
数、解離速度定数及び結合速度定数を有する抗PTHrP 抗
体（ヒト抗体、キメラ抗体、プライマタイズド抗体を含
む）、あるいはPTHrPに対するヒト型化された抗体であ
る。この抗体は、PTHrPに結合することにより、PTHrPの
活性を中和する抗体であり、特に、好ましくはヒト型化
された#23-57-137-1抗体が挙げられる。ヒト型化#23-57
-137-1抗体の作製方法は、実施例１〜３に記載されてい
る。

【０１２９】本発明で使用される抗体は、塩析法、HPLC
等を用いたゲル濾過法、プロテインAカラム等を用いた
アフィニティークロマトグラフィー法等の通常の精製手
段を組み合わせて高純度に精製することができる。この
ように精製された抗体は、放射免疫測定法（RIA）、酵
素免疫測定法（EIA、ELISA）、あるいは蛍光抗体法（Im
munofluorescence Analysis）等の通常の免疫学的手段
により、高精度にPTHrPを認識することを確認できる。

【０１３０】高カルシウム血症を呈する動物には、PTHr
Pを産生する腫瘍細胞を免疫機能が低下又は欠失した実
験動物に移植することにより作製したモデル動物を使用
することができる。移植される腫瘍細胞としては、ヒト
由来の腫瘍細胞が好ましく、例えば、ヒト膵臓癌PAN-7
が挙げられる。また、腫瘍細胞を移植される免疫機能が
低下又は欠失した動物としてはヌードマウス、SCIDマウ
スが挙げられる。高カルシウム血症の抑制の評価は、血
中カルシウム濃度、体重減少、あるいは運動量の低下を
経時観察し、その改善の程度を評価することによって行
われる。

【０１３１】本発明のPTHrPに対する抗体又はヒト型化
抗体を有効成分として含む医薬組成物及び高カルシウム
血症抑制剤は、非経口的に全身又は局所的に投与するこ
とができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注
射、腹腔内注射、皮下注射を選択することができ、患者
の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができ
る。有効投与量は、一回につき体重1kgあたり0.01mgか
ら1000mgの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり5〜1
0000 mg/body、好ましくは50〜1000mg/bodyの投与量を
選ぶことができる。

【０１３２】本発明のPTHrPに対する抗体又はヒト型化
抗体を有効成分として含む医薬組成物及び高カルシウム
血症抑制剤は、投与経路次第で医薬的に許容される担体
や添加物を共に含むものであってもよい。このような担
体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機
溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニル
ピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメ
チルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウ
ム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カル
ボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセ
ルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビ
アゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、グ
リセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコ
ール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、
ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（HSA）、マンニト
ール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許
容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加
物は、本発明の剤形に応じて上記の中から適宜又は組み
合わせて選択されるが、これらに限定されるものではな
い。

【０１３３】なお、本発明の抗体は、種々の癌（悪性腫
瘍）によって誘発される高カルシウム血症に広く使用す
ることができる。これらの癌種は特に限定されるもので
はなく、単一の癌のみならず複数の癌が併発したものも
含まれる。癌種としては、例えば膵臓癌、肺癌、咽頭
癌、喉頭癌、舌癌、歯肉癌、食道癌、胃癌、胆管癌、乳
癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、前立腺癌又は悪性リンパ腫
などが挙げられる。

【０１３４】

〔参考例１〕

抗ＰＴＨｒＰ（１−３４）マウスモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマの作製ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対するモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ＃23-57-154 および＃23-57-137-
1の作製は、佐藤幹二らによって行われた（Sato, K.et
al., J.Bone Miner.Res.8,849-860,1993)。

【０１３５】免疫原として使用するために、ＰＴＨｒＰ
（１−３４）（Peninsula 製）とキャリアータンパクで
あるサイログロブリンをカルボジイミド（Dojinn）を用
いて結合した。サイログロブリンと結合したＰＴＨｒＰ
（１−３４）を透析し、タンパク濃度として２μｇ/ml
となるように調製した後、フロイントアジュバント（Di
fco)と１:１で混合し、エマルジョン作製後、16匹の雌
性BALB/Cマウスの背部皮下又は腹腔内に動物あたり100
μｇを11回免疫した。初回免疫は、フロイント完全アジ
ュバントを用い、二回目以降の追加免疫にはフロイント
不完全アジュバントを使用した。

【０１３６】免疫したマウスの血清中の抗体価の測定
は、以下の方法で行った。すなわち、マウス尾静脈より
採血し、血清分離後ＲＩＡバッファーで希釈した抗血清
と¹²⁵I標識ＰＴＨｒＰ（１−３４）を混合し、結合活性
を測定した。抗体価の上昇したマウスの腹腔に、キャリ
アータンパクを結合していないＰＴＨｒＰ（１−３４）
を動物あたり50μｇを最終免疫した。

【０１３７】最終免疫３日目にマウスを屠殺し、脾臓を
摘出後、脾臓細胞とマウスミエローマ細胞株P3x63Ag8U.
1 を、50％ポリエチレングリコール4000を用いる常法に
したがって細胞融合した。細胞融合した細胞を２×10⁴
／ウェルの細胞数で85枚の96穴プレートに蒔き込んだ。
ハイブリドーマの選別はＨＡＴ培地を用いて行った。

【０１３８】ハイブリドーマのスクリーニングは、ＨＡ
Ｔ培地中で生育の認められた穴の培養上清を固相化ＲＩ
Ａ法にてＰＴＨｒＰ認識抗体の有無を測定し選択するこ
とにより行った。抗体との結合能の認められた穴からハ
イブリドーマを回収し、15％ＦＣＳを含むRPMI-1640 培
地にＯＰＩ-supplement(Sigma)を添加した培地に懸濁
し、限界希釈法にてハイブリドーマの単一化を実施し
た。ＰＴＨｒＰ（１−３４）との結合能の強いクローン
＃23-57-154 および＃23-57-137-1 を得た。

【０１３９】なお、ハイブリドーマクローン＃23-57-13
7-1 は、mouse-mouse hybridoma ＃23-57-137-1 とし
て、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば
市東１丁目１番３号）に、平成８年８月１５日に、FERM
BP-5631としてブダペスト条約に基づき国際寄託されて
いる。

【０１４０】〔実施例１〕ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）
に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードす
るＤＮＡのクローニングヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対するマウスモノクロー
ナル抗体＃23-57-137-1 の可変領域をコードするＤＮＡ
を次の様にしてクローニングした。 (1) ｍＲＮＡの調製ハイブリドーマ＃23-57-137-1 からのｍＲＮＡをQuick
Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia Biotech社) を
用いて調製した。ハイブリドーマ＃23-57-137-1 の細胞
を抽出バッファーで完全にホモジナイズし、キット添付
の処方に従い、オリゴ(dT)-セルローススパンカラム(Ol
igo(dT)-Cellulose Spun Column) にてｍＲＮＡを精製
し、エタノール沈殿をおこなった。ｍＲＮＡ沈殿物を溶
出バッファーに溶解した。

【０１４１】(2) マウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子
のｃＤＮＡの作製および増幅 (i) ＃23-57-137-1 抗体Ｈ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡのクローニ
ングヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体のＨ
鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのクローニングは、5'-RAC
E 法（Frohman,M.A.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A.et al., Nucl
eic Acids Res.17, 2919-2932, 1989) により行った。
5'-RACE 法には5'-Ampli FINDER RACE kit(CLONETECH
社) を用い、操作はキット添付の処方にしたがって行っ
た。ｃＤＮＡ合成に使用するプライマーは、マウスＨ鎖
定常領域（Ｃ領域）とハイブリダイズするＭＨＣ２プラ
イマー（配列番号１）を用いた。前記のようにして調製
したｍＲＮＡ約２μｇを鋳型としてＭＨＣ２プライマー
10pmole を加え、逆転写酵素と52℃、30分間反応させる
ことによりｃＤＮＡへの逆転写を行った。

【０１４２】６Ｎ NaOH でＲＮＡを加水分解（65℃、30
分間）した後、エタノール沈殿によりｃＤＮＡを精製し
た。Ｔ４ＲＮＡリガーゼで37℃で６時間、室温で16時間
反応することにより、合成したｃＤＮＡの５’末端にAm
pli FINDER Anchor(配列番号42) を連結した。これを鋳
型としてＰＣＲにより増幅するためのプライマーとして
Anchorプライマー（配列番号２）およびＭＨＣ−Ｇ１プ
ライマー（配列番号３）（S.T.Jones,et al.,Biotechno
logy,9,88,1991) を使用した。

【０１４３】ＰＣＲ溶液は、その50μｌ中に10mM Tris-
HCl(pH8.3)、50mM KCl、0.25mM dNTPs(dATP, dGTP, dCT
P, dTTP)、1.5 mM MgCl₂、2.5 ユニットのTaKaRa Taq
（宝酒造）、10pmole のAnchorプライマー、並びにＭＨ
Ｃ−Ｇ１プライマー及びAmpliFINDER Anchor を連結し
たｃＤＮＡの反応混合物１μｌを含有する。この溶液に
50μｌの鉱油を上層した。ＰＣＲはThermal Cycler Mod
el 480J(Perkin Elmer)を用い、94℃にて45秒間、60℃
にて45秒間、72℃にて２分間の温度サイクルで30回行っ
た。

【０１４４】(ii)＃23-57-137-1 抗体Ｌ鎖Ｖ領域のｃＤ
ＮＡのクローニングヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体のＬ
鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのクローニングは、5'-RAC
E 法（Frohman,M.A.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 85, 8998-9002, 1988 ; Belyavsky,A. et al., Nucl
eic Acids Res.17, 2919-2932, 1989)により行った。5'
-RACE 法には５'-Ampli Finder RACE Kit(Clonetech)を
用い、操作は添付の処方に従った。ｃＤＮＡ合成に使用
するプライマーは、oligo-dTプライマーを用いた。前記
のように調製したｍＲＮＡ約２μｇを鋳型としてoligo-
dTプライマーを加え、逆転写酵素と52℃、30分間反応さ
せることによりｃＤＮＡへの逆転写を行った。６N NaOH
でＲＮＡを加水分解（65℃、30分間）した後、エタノー
ル沈殿によりｃＤＮＡを精製した。合成したｃＤＮＡの
５’末端に前記Ampli FINDER Anchor をＴ４ＲＮＡリガ
ーゼで37℃で６時間、室温で16時間反応させることによ
り連結した。

【０１４５】マウスＬ鎖λ鎖定常領域の保存配列からＰ
ＣＲプライマーＭＬＣ（配列番号４）を設計し、394 DN
A/RNA シンセサイザー(ABI社）を用いて合成した。ＰＣ
Ｒ溶液は、その100 μｌ中に10 mM Tris-HCl（pH８．
３）、50mM KCl、0.25mM ｄＮＴＰｓ（dATP, dGTP，dC
TP，dTTP）、1.5Mm MgCl₂、2.5 ユニットの AmpliTaq
（PERKIN ELMER）、50pmole のAnchorプライマー（配列
番号２）、並びにＭＬＣ（配列番号４）およびAmpli FI
NDER Anchor を連結したｃＤＮＡの反応混合物１μｌを
含有する。この溶液に50μｌの鉱油を上層した。ＰＣＲ
はThermal CyclerModel 480J （Perkin Elmer）を用
い、94℃にて45秒間、60℃にて45秒間、72℃にて２分間
の温度サイクルで３５回行った。

【０１４６】(3) ＰＣＲ生成物の精製および断片化前記のようにしてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を
３％Nu Sieve GTGアガロース（FMC Bio. Products)を用
いたアガロースゲル電気泳動により分離した。Ｈ鎖Ｖ領
域として約550bp 長、Ｌ鎖Ｖ領域として約550bp 長のＤ
ＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、GENECLEAN
II Kit(BIO101)を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ
断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿さ
せた後、10mM Tris-HCl (pH7.4) 、１mM EDTA 溶液20μ
ｌに溶解した。得られたＤＮＡ溶液１μｌを制限酵素Ｘ
ｍａＩ（New England Biolabs)により37℃で１時間消化
し、次いで制限酵素EcoRI （宝酒造）により37℃で１時
間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホ
ルムで抽出し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し
た。こうして、５’−末端にEcoRI 認識配列を有し、
３’−末端にＸｍａＩ認識配列を有するマウスＨ鎖Ｖ領
域をコードするＤＮＡおよびＬ鎖Ｖ領域をコードするＤ
ＮＡを得た。

【０１４７】上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領
域をコードするＤＮＡおよびＬ鎖Ｖ領域をコードするＤ
ＮＡを含むEcoRI-XmaIＤＮＡ断片と、EcoRI 及びXmaIで
消化することにより調製したpUC19 ベクターとを、ＤＮ
Ａライゲーションキットver.2 （宝酒造）を用い、添付
の処方に従い16℃で１時間反応させ連結した。次に10μ
ｌの上記連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細
胞（ニッポンジーン）100 μｌに加え、この細胞を氷上
で15分間、42℃にて１分間、さらに氷上で１分間静置し
た。次いで300 μｌのＳＯＣ培地（Molecular Cloning:
A LabgoratoryManual, Sambrook,et al., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989)を加えて37℃にて30
分間インキュベートした後、100 μｇ／ｍｌ又は50μｇ
／ｍｌのアンピシリン、0.1mM のIPTG、20μｇ／ｍｌの
Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地または２ｘＹＴ寒天培地
（Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, Sambroo
k,et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 198
9)上にこの大腸菌をまき、37℃にて一夜インキュベート
して大腸菌形質転換体を得た。

【０１４８】この形質転換体を100 μｇ／ｍｌ又は50μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地または２×
ＹＴ培地２ｍｌで37℃にて一夜培養し、菌体画分からプ
ラスミド抽出機PI-100Σ（クラボウ）又はQIAprep Spin
Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドＤＮＡを調製
し、塩基配列の決定を行った。

【０１４９】(4) マウス抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡ
の塩基配列決定前記プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列を、
ダイターミネーターサイクルシークエンシングキット(D
ye Terminator Cycle Sequencing kit(Perkin-Elmer))
を用い、ＤＮＡシークエンサー373A (ABI 社Perkin-Elm
er）により決定した。配列決定用プライマーとしてM13
Primer M4 （宝酒造）（配列番号５）及びM13 Primer R
V （宝酒造）（配列番号６）を用い、両方向の塩基配列
を確認することにより配列を決定した。

【０１５０】こうして得られたハイブリドーマ＃23-57-
137-1 に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ
を含有するプラスミドをMBC1H04 、Ｌ鎖Ｖ領域をコード
するＤＮＡを含有するプラスミドをMBC1L24 と命名し
た。プラスミドMBC1H04 およびMBC1L24 に含まれるマウ
ス＃23-57-137-1 抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域を
コードするＤＮＡの塩基配列（対応するアミノ酸配列を
含む）をそれぞれ配列番号57、65に示す。Ｈ鎖Ｖ領域を
含むポリペプチド及びＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプチド
は、いずれも、それぞれ配列番号57、65で表される塩基
配列の第58番目（グルタミンをコードする）から開始さ
れている。これらのアミノ酸配列を、Ｈ鎖Ｖ領域含むポ
リペプチドについては配列番号46、Ｌ鎖Ｖ領域含むポリ
ペプチドについては配列番号45に示す。

【０１５１】なお、前記プラスミドMBC1H04 およびMBC1
L24 を有する大腸菌は、Escherichia coli JM109（MBC1
H04 ）およびEscherichia coli JM109（MBC1L24 ）とし
て、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば
市東１丁目１番３号）に、平成８年８月１５日に、Esch
erichia coli JM109 (MBC1H04)についてはFERM BP-562
8、Escherichia coli JM109 (MBC1L24)についてはFERM
BP-5627としてブダペスト条約に基づき国際寄託されて
いる。

【０１５２】(5) ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノク
ローナル抗体＃23-57-137-1 のＣＤＲの決定Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の全般の構造は、互いに類
似性を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分
が３つの超可変領域、すなわち相補性決定領域（ＣＤ
Ｒ）により連結されている。フレームワークのアミノ酸
配列は、比較的よく保存されているが、一方、ＣＤＲ領
域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Kabat,E.A.et
al., 「Sequence of Proteins of Immunological Inte
rest」US Dept. Health and Human Services, 1983) 。

【０１５３】このような事実に基づき、ヒトＰＴＨｒＰ
に対するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ
酸配列をKabat らにより作成された抗体のアミノ酸配列
のデータベースにあてはめて、相同性を調べることによ
りＣＤＲ領域を表２に示すごとく決定した。なお、Ｌ鎖
Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列についてはそれぞ
れ配列番号59〜61に示し、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３の
アミノ酸配列についてはそれぞれ配列番号62〜64に示し
た。

【０１５４】

【表２】

【０１５５】〔実施例２〕キメラ抗体の構築 (1) キメラ抗体Ｈ鎖の構築 (i) Ｈ鎖Ｖ領域の構築ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のゲノムＤＮＡを含む発現ベクタ
ーに連結するために、クローニングしたマウスＨ鎖Ｖ領
域をコードするＤＮＡをＰＣＲ法により修飾した。後方
プライマーＭＢＣ１−Ｓ１（配列番号７）はＶ領域のリ
ーダー配列の５’−側をコードするＤＮＡにハイブリダ
イズし且つKozak コンセンサス配列（Kozak, M. et a
l., J.Mol.Biol., 196, 947-950,1987)及び制限酵素Hin
d IIIの認識配列を有するように設計した。前方プライ
マーＭＢＣ１−ａ（配列番号８）はＪ領域の３’−側を
コードするＤＮＡ配列にハイブリダイズし、且つ、スプ
ライスドナー配列及び制限酵素BamHIの認識配列を有す
るように設計した。ＰＣＲは、TaKaRa Ex Taq （宝酒
造）を用い、50μｌの反応混合液に鋳型ＤＮＡとして0.
07μｇのプラスミドMBC1H04 、プライマーとしてMBC1-a
およびMBC1-S1 をそれぞれ50pmole 、2.5UのTaKaRa Ex
Taq 、0.25mMのｄＮＴＰ含む条件で添付緩衝液を使用し
て50μｌの鉱油を上層し、94℃にて１分間、55℃にて１
分間、72℃にて２分間の温度サイクルで30回行った。Ｐ
ＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を３％NuSieve GTGア
ガロース（FMC Bio. Products)を用いたアガロースゲル
電気泳動により分離した。

【０１５６】437bp 長のＤＮＡ断片を含有するアガロー
ス片を切取り、GENECLEAN II Kit(BIO101)を用い、キッ
ト添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。精製したＤ
ＮＡをエタノール沈殿で回収した後、10mM Tris-HCl (p
H7.4) 、１mM EDTA 溶液20μｌに溶解した。得られたＤ
ＮＡ溶液１μｌを制限酵素BamHI、Hind III（宝酒造）
により37℃１時間消化した。この消化混合物をフェノー
ル及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりＤ
ＮＡを回収した。

【０１５７】上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領
域をコードするＤＮＡを含むHind III-BamHIＤＮＡ断片
をHind IIIおよびBamHIで消化することにより調製したp
UC19ベクターにサブクローニングした。このプラスミド
の塩基配列を確認するためプライマーM13 Primer M4 お
よびM13 Primer RV をプライマーとして、ダイターミネ
ーターサイクルシークエンシングキット(Perkin-Elmer)
を用い、ＤＮＡシークエンサー373A (Perkin-Elmer) に
より塩基配列を決定した。正しい塩基配列を有するハイ
ブリドーマ＃23-57-137-1 に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域
をコードするＤＮＡを含有し、５’−側にHind III認識
配列及びKozak 配列、３’−側にBamHI認識配列を持つ
プラスミドをMBC1H/pUC19 と命名した。

【０１５８】(ii)ｃＤＮＡタイプのマウス−ヒトキメラ
Ｈ鎖を作製するためのＨ鎖Ｖ領域の構築ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のｃＤＮＡと連結するために、上
記のようにして構築したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする
ＤＮＡをＰＣＲ法により修飾した。Ｈ鎖Ｖ領域を修飾す
るための後方プライマーMBC1HVS2（配列番号９）はＶ領
域のリーダー配列の最初をコードする配列の２番のアス
パラギンをグリシンに変換し、且つKozak コンセンサス
配列（Kozak,M.et al.,J.Mol.Biol.,196,947-950,1987)
並びにHind IIIおよびEcoRI 認識配列を有するように設
計した。Ｈ鎖Ｖ領域を修飾するための前方プライマーMB
C1HVR2（配列番号10）はＪ領域の３’−側をコードする
ＤＮＡ配列にハイブリダイズし、且つ、Ｃ領域の５’−
側の配列をコードしＡpaＩおよびSmaI認識配列を有する
ように設計した。

【０１５９】ＰＣＲはTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を用
い、50μｌの反応混合液に鋳型ＤＮＡとして0.6 μｇの
プラスミドMBC1H/pUC19 、プライマーとしてMBC1HVS2お
よびMBC1HVR2をそれぞれ50pmole 、TaKaRa Ex Taq を2.
5U、0.25mMのｄＮＴＰ含む条件で、添付の緩衝液を使用
して、50μｌの鉱油を上層して94℃１分間、55℃１分
間、72℃１分間の温度サイクルで30回行った。ＰＣＲ法
により増幅したＤＮＡ断片を１％Sea Kem GTG アガロー
ス（FMC Bio.Products) を用いたアガロースゲル電気泳
動により分離した。456bp 長のＤＮＡ断片を含有するア
ガロース片を切取り、GENECLEAN II Kit(BIO101)を用
い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。精
製したＤＮＡをエタノール沈殿させた後、10mM Tris-HC
l(pH7.4)、１mMEDTA 溶液20μｌに溶解した。

【０１６０】得られたＤＮＡ溶液１μｌを制限酵素EcoR
I およびSmaI（宝酒造）により37℃で１時間消化した。
この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出
し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。上記のよ
うにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ
を含むEcoRI-SmaIＤＮＡ断片を、EcoRI およびSmaIで消
化することにより調製したpUC19 ベクターにサブクロー
ニングした。このプラスミドの塩基配列を確認するた
め、プライマーM13 Primer M4 及びM13 Primer RVをプ
ライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエ
ンシングキット(Perkin-Elmer)を用い、ＤＮＡシークエ
ンサー373A(Perkin-Elmer)により塩基配列を決定した。
正しい塩基配列を有するハイブリドーマ＃23-57-137-1
に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含有
し、５’−側にEcoRI およびHind III認識配列及びKoza
k 配列、３’−側にＡpaＩおよびSmaI認識配列を持つプ
ラスミドをMBC1Hv/pUC19と命名した。

【０１６１】(iii) キメラ抗体Ｈ鎖の発現ベクターの構
築ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１を含むｃＤＮＡは、以下のよ
うにして調製した。すなわち、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖
Ｖ領域およびヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域ＩｇＧ１のゲノムＤＮ
Ａ（N. Takahashi, et al., Cell 29, 671-679 1982）
をコードする発現ベクターDHFR-△E-RVh-PM-1-f（WO92/
19759参照）と、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のＤＮ
Ａおよびヒト抗体Ｌ鎖κ鎖Ｃ領域のゲノムＤＮＡをコー
ドする発現ベクターRV1-PM1a（WO92/19759参照）とを導
入したＣＨＯ細胞よりｍＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ
法でヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領
域Ｃγ１を含むｃＤＮＡをクローニングし、pUC19 のHi
nd IIIとBamHI部位にサブクローニングした。塩基配列
を確認した後、正しい配列を持つプラスミドをpRVh-PM1
f-ｃＤＮＡと命名した。

【０１６２】DHFR-△E-RVh-PM-1-f上のＳＶ４０プロモ
ーターとＤＨＦＲ遺伝子との間にあるHind III部位、お
よびＥＦ−１αプロモーターとヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖
Ｖ領域との間にあるEcoRI 部位を欠失した発現ベクター
を作製し、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗
体Ｃ領域Ｃγ１を含むｃＤＮＡの発現ベクターの構築の
ために使用した。

【０１６３】pRVh-PM1f-ｃＤＮＡをBamHIで消化した
後、Klenowフラグメントで平滑化し、さらにHind IIIで
消化し、Hind III-BamHI平滑化断片を調製した。このHi
nd III-BamHI平滑化断片を、上記のHind III部位および
EcoRI 部位が欠失したDHFR-△E-RVh-PM1-f をHind III
およびSmaIで消化することにより調製した発現ベクター
に連結し、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗
体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクタ
ーRVh-PM1f−ｃＤＮＡを構築した。

【０１６４】ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト
抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃＤＮＡを含む発現ベク
ターRVh-PM1f−ｃＤＮＡをApaIおよびBamHIで消化した
後、Ｈ鎖Ｃ領域を含むＤＮＡ断片を回収し、ApaIおよび
BamHIで消化することにより調製したMBC1Hv/pUC19に導
入した。こうして作製したプラスミドをMBC1HcDNA ／pU
C19 と命名した。このプラスミドはマウス抗体のＨ鎖Ｖ
領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃＤＮＡ
を含み、５'-末端にEcoRI およびHind III認識配列、
３'-末端にBamHI認識配列を持つ。

【０１６５】プラスミドMBC1HcDNA/pUC19 をEcoRI およ
びBamHIで消化し、得られたキメラ抗体のＨ鎖をコード
する塩基配列を含むＤＮＡ断片を、EcoRI およびBamHI
で消化することにより調製した発現ベクターｐＣＯＳ１
に導入した。こうして得られたキメラ抗体の発現プラス
ミドをＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１と命名した。な
お、発現ベクターｐＣＯＳ１は、HEF-PMh-gγ1（WO92/1
9759参照）から、EcoRI およびSmaI消化により抗体遺伝
子を削除し、EcoRI-NotI-BamHI Adaptor（宝酒造）を連
結することにより構築した。

【０１６６】さらにＣＨＯ細胞での発現に用いるための
プラスミドを作製するため、プラスミドMBC1HcDNA/pUC1
9 をEcoRI およびBamHIで消化し、得られたキメラ抗体
Ｈ鎖配列を含むＤＮＡ断片を、EcoRI およびBamHIで消
化することにより調製した発現プラスミドｐＣＨＯ１に
導入した。こうして得られたキメラ抗体の発現プラスミ
ドをMBC1HcDNA/pCHO1 と命名した。なお、発現ベクター
ｐＣＨＯ１は、DHFR-△E-rvH-PM1-f （WO92/19759参
照）から、EcoRI およびSmaI消化により抗体遺伝子を削
除し、EcoRI-NotI-BamHI Adaptor（宝酒造）を連結する
ことにより構築した。

【０１６７】(2) ヒトＬ鎖定常領域の構築 (i) クローニングベクターの作製ヒトＬ鎖定常領域を含むpUC19 ベクターを構築するため
に、Hind III部位欠失pUC19 ベクターを作製した。pUC1
9 ベクター２μｇを20mM Tris-HCl（pH8.5 ）、10mM M
gCl₂、１mM DTT、100 mM KCl、８Ｕの Hind III （宝酒
造）を含有する反応混合液20μｌ中で37℃にて１時間消
化した。消化混合液をフェノールおよびクロロホルムで
抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿により回収した。

【０１６８】回収したＤＮＡを50mM Tris-HCl （pH7.
5)、10mM MgCl₂、１mM DTT、100mM NaCl、0.5mM dNTP、
６ＵのKlenowフラグメント（GIBCO BRL)を含有する50μ
ｌの反応混合液中で室温にて20分間反応させ、末端を平
滑化させた。反応混合液をフェノールおよびクロロホル
ムで抽出し、ベクターＤＮＡをエタノール沈殿により回
収した。

【０１６９】回収したベクターＤＮＡを50mM Tris-HCl
（pH7.6)、 10mM MgCl₂、１mM ATP、１mM DTT、５％(v
/v) ポリエチレングリコール-8000 、0.5 ＵのT4 DNAリ
ガーゼ（GIBCO BRL)を含有する反応混合液10μｌ中で16
℃で２時間反応させ、自己連結させた。反応混合液５μ
ｌを大腸菌JM109 コンピテント細胞（ニッポンジーン）
100 μｌに加え、氷上で30分間静置した後、42℃にて１
分間、さらに氷上で１分間静置した。ＳＯＣ培地500 μ
ｌを加えて、37℃で１時間インキュベーションした後、
X-gal とIPTGを表面に塗布した２×ＹＴ寒天培地（50μ
ｇ/ml アンピシリン含有）（Molecular Cloning: A Lab
goratory Manual, Sambrook,et al., Cold Spring Harb
or Laboratory Press, 1989)にまき、３７℃で一夜培養
して形質転換体を得た。

【０１７０】形質転換体を、50μｇ/ml アンピシリンを
含有する２×ＹＴ培地20mlで37℃一夜培養し、菌体画分
からPlasmid Mini Kit(QIAGEN)を用いて、添付の処方に
従ってプラスミドＤＮＡを精製した。精製したプラスミ
ドをHind IIIで消化し、HindIII部位が欠失しているこ
とを確認したプラスミドをpUC19 ΔHind IIIと命名し
た。

【０１７１】(ii)ヒトＬ鎖λ鎖定常領域をコードするＤ
ＮＡの構築ヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域は、Ｍｃｇ＋Ｋｅ＋Ｏｚ−
、Ｍｃｇ− Ｋｅ−Ｏｚ−、Ｍｃｇ− Ｋｅ− Ｏｚ
＋、Ｍｃｇ− Ｋｅ＋Ｏｚ− の少なくとも４種類
のアイソタイプが知られている（P.Dariavach,et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,9074-9078,1987) 。＃23-5
7-137-1 マウスＬ鎖λ鎖Ｃ領域と相同性を有するヒト抗
体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域をＥＭＢＬデータベースで検索した結
果、アイソタイプがＭｃｇ＋Ｋｅ＋Ｏｚ− （acce
ssion No. X57819)（P.Dariavach,et al., Proc.Natl.A
cad.Sci.USA,84,9074-9078,1987) のヒト抗体Ｌ鎖λ鎖
が最も高い相同性を示し、＃23-57-137-1 マウスＬ鎖λ
鎖Ｃ領域との相同性はアミノ酸配列で64.4％、塩基配列
で73.4％であった。

【０１７２】そこで、このヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域をコ
ードするＤＮＡの構築を、ＰＣＲ法を用いて行った。各
プライマーの合成は、394 DNA/RNA シンセサイザー(ABI
社)を用いて行った。HLAMB1（配列番号11）およびHLAMB
3（配列番号13）はセンスＤＮＡ配列を有し、HLAMB2
（配列番号１２）およびHLAMB4（配列番号１４）はアン
チセンスＤＮＡ配列を有し、それぞれのプライマーの両
端に20から23bpの相補的配列を有する。

【０１７３】外部プライマーHLAMBS（配列番号15）、HL
AMBR（配列番号16）はHLAMB1、HLAMB4とそれぞれ相同な
配列を有しており、またHLAMBSはEcoRI 、Hind III、Bl
nI認識配列を、HLAMBRはEcoRI 認識配列をそれぞれ含ん
でいる。第一ＰＣＲでHLAMB1-HLAMB2 とHLAMB3-HLAMB4
の反応を行った。反応後、それらを等量混合し、第二Ｐ
ＣＲでアセンブリを行った。さらに外部プライマーHLAM
BSおよびHLAMBRを添加し、第三ＰＣＲにより全長ＤＮＡ
を増幅させた。

【０１７４】ＰＣＲはTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を使
い、添付の処方に従って行った。第一ＰＣＲでは、５pm
ole のHLAMB1および 0.5pmole のHLAMB2と５ＵのTaKaRa
Ex Taq （宝酒造）とを含有する100 μｌの反応混合
液、あるいは0.5pmoleのHLAMB3および５pmole のHLAMB4
と５ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）とを含有する100 μ
ｌの反応混合液を用い、50μｌの鉱油を上層して94℃に
て１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイ
クルで５回行った。第二ＰＣＲは、反応液を50μｌずつ
混合し、50μｌの鉱油を上層して94℃にて１分間、60℃
にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで３回行っ
た。第三ＰＣＲは、反応液に外部プライマーHLAMBSおよ
びHLAMBRを各50pmole ずつ添加し、94℃にて１分間、60
℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで30回行
った。

【０１７５】第三ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を３％低融点
アガロースゲル（NuSieve GTG Agarose, FMC) で電気泳
動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用い、添付の処
方に従ってゲルから回収、精製した。得られたＤＮＡ断
片を50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl₂、１mM DTT、 1
00mMNaCl 、８ＵのEcoRI （宝酒造）を含有する20μｌ
の反応混合液中で37℃にて１時間消化した。消化混合液
をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエ
タノール沈殿で回収した後、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１
mM EDTA 溶液８μｌに溶解した。

【０１７６】プラスミドpUC19 ΔHind III 0.8μｇを同
様にEcoRI で消化し、フェノールおよびクロロホルムで
抽出し、エタノール沈殿により回収した。消化したプラ
スミドpUC19 ΔHind IIIを50 mM Tris-HCl（pH9.0)、１
mM MgCl₂、アルカリホスファターゼ(E.coli C75,宝酒
造）を含有する反応混合液50μｌ中で37℃、30分間反応
させ脱リン酸処理（ＢＡＰ処理）した。反応液をフェノ
ールおよびクロロホルムで抽出、ＤＮＡをエタノール沈
殿により回収した後、10mM Tris-HCl (pH7.4)、１mM ED
TA 溶液10μｌに溶解した。

【０１７７】上記のＢＡＰ処理したプラスミドpUC19 Δ
Hind III１μｌと先のＰＣＲ産物４μｌとを、DNA Liga
tion Kit Ver.2（宝酒造）を用いて連結し、大腸菌JM10
9 コンピテント細胞に形質転換した。得られた形質転換
体を50μｇ/ml アンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２
mlで一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin PlasmidKi
t (QIAGEN) を用いてプラスミドを精製した。

【０１７８】上記プラスミドについて、クローニングさ
れたＤＮＡの塩基配列の確認を行った。塩基配列の決定
には373A DNAシークエンサー(ABI社) を用い、プライマ
ーにはM13 プライマー M4 およびM13 プライマーRV（宝
酒造）を用いた。その結果、クローニングされたＤＮＡ
の内部に12bpの欠失があることが判明した。このＤＮＡ
を含むプラスミドをＣλΔ／pUC19 と命名した。そこ
で、その部分を補うためのプライマーHCLMS （配列番号
17）、 HCLMR（配列番号18）を新たに合成し、ＰＣＲで
再度正しいＤＮＡの構築を行った。

【０１７９】第一ＰＣＲで欠失ＤＮＡを含むプラスミド
ＣλΔ／pUC19 を鋳型とし、プライマーHLAMBSとHCLMR
、HCLMS とHLAMB4で反応を行った。ＰＣＲ産物をそれ
ぞれ精製し、第二ＰＣＲでアセンブリを行った。さらに
外部プライマーHLAMBSおよびHLAMB4を添加し、第三ＰＣ
Ｒにより全長ＤＮＡを増幅させた。

【０１８０】第一ＰＣＲでは、鋳型としてＣλΔ／pUC1
9 0.1μｇ、プライマーHLAMBSおよびHCLMR 各50pmole
、あるいはHCLMS およびHLAMB4各50pmole 、５ＵのTaK
aRa Ex Taq （宝酒造）を含有する100 μｌの反応混合
液を用い、50μｌの鉱油を上層して94℃にて１分間、60
℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで30回行
った。

【０１８１】ＰＣＲ産物HLAMBS-HCLMR(236bp) 、HCLMS-
HLAMB4(147bp) をそれぞれ３％低融点アガロースゲルで
電気泳動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲ
ルから回収、精製した。第二ＰＣＲでは精製ＤＮＡ断片
各40ng、１ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を含有する20
μｌの反応混合液を用い、25μｌの鉱油を上層して94℃
にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サ
イクルを５回行った。

【０１８２】第三ＰＣＲでは、第二ＰＣＲ反応液２μ
ｌ、外部プライマーHLAMBS、HLAMB4各50pmole 、５Ｕの
TaKaRa Ex Taq （宝酒造）を含有する100 μｌの反応混
合液を用い、50μｌの鉱油を上層した。ＰＣＲは、94℃
にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サ
イクルで30回行った。第三ＰＣＲ産物である357bp のＤ
ＮＡ断片を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した
後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、
精製した。

【０１８３】得られたＤＮＡ断片0.1μｇをEcoRI で消
化した後、ＢＡＰ処理したプラスミド pUC19ΔHind III
にサブクローニングした。大腸菌ＪＭ１０９コンピテン
ト細胞に形質転換し、50μｇ/ml アンピシリンを含有す
る２×ＹＴ培地２mlで一夜培養し、菌体画分からQIApre
p Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドを精製
した。精製したプラスミドについて塩基配列をM13 プラ
イマー M4 、M13 プライマーRV （宝酒造）を用い、373
A DNAシークエンサー(ABI社）にて決定した。欠失のな
い正しい塩基配列を有していることが確認されたプラス
ミドをＣλ／pUC19 とした。

【０１８４】(iii) ヒトＬ鎖κ鎖定常領域をコードする
ＤＮＡの構築プラスミドHEF-PM1k-gk （WO92/19759）からＬ鎖κ鎖Ｃ
領域をコードするＤＮＡ断片を、ＰＣＲ法を用いてクロ
ーニングした。394 DNA/RNA シンセサイザー(ABI社）を
用いて合成した前方プライマーHKAPS （配列番号19）は
EcoRI 、Hind III、BlnI認識配列を、後方プライマーHK
APA （配列番号20）はEcoRI 認識配列を有するように設
計した。

【０１８５】鋳型となるプラスミドHEF-PM1k-gk 0.1 μ
ｇ、プライマーHKAPS 、HKAPA 各50pmole 、５ＵのTaKa
Ra Ex Taq （宝酒造）を含有する100 μｌの反応混合液
を用い、50μｌの鉱油を上層した。94℃にて１分間、60
℃にて１分間、72℃にて１分間の反応を30サイクル行っ
た。360bp のＰＣＲ産物を３％低融点アガロースゲルで
電気泳動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲ
ルから回収、精製した。

【０１８６】得られたＤＮＡ断片をEcoRI で消化した
後、ＢＡＰ処理したプラスミドpUC19ΔHind IIIにクロ
ーニングした。大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形
質転換し、50μｇ/ml アンピシリンを含有する２×ＹＴ
培地２mlで一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Pla
smid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドを精製した。精製
したプラスミドの塩基配列をM13 プライマー M4 、M13
プライマー RV （宝酒造）を用い、373A DNAシークエン
サー(ABI社）にて決定した。正しい塩基配列を有してい
ることが確認されたプラスミドをＣκ／pUC19 とした。

【０１８７】(3) キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターの構築キメラ＃23-57-137-1 抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築し
た。プラスミドＣλ／pUC19 、Ｃκ／pUC19 のヒト抗体
定常領域の直前にあるHind III、BlnI部位に、＃23-57-
137-1 Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを連結することに
よって、それぞれキメラ＃23-57-137-1 抗体Ｌ鎖Ｖ領域
およびＬ鎖λ鎖またはＬ鎖κ鎖定常領域をコードするＤ
ＮＡを含むpUC19 ベクターを作製した。EcoRI 消化によ
ってキメラ抗体Ｌ鎖をコードするＤＮＡを切り出し、Ｈ
ＥＦ発現ベクターへサブクローニングを行った。

【０１８８】すなわち、プラスミドMBC1L24 から＃23-5
7-137-1 抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを、ＰＣＲ
法を用いてクローニングした。各プライマーの合成は、
394DNA/RNA シンセサイザー(ABI社）を用いて行った。
後方プライマーMBCCHL1 （配列番号２１）はHind III認
識配列とKozak 配列（Kozak,M.et al.,J.Mol.Biol.196,
947-950,1987) を、前方プライマーMBCCHL3 （配列番号
２２）はBglII 、EcoRI 認識配列を有するように設計し
た。

【０１８９】ＰＣＲは、10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM K
Cl、1.5mM MgCl₂、0.2mM ｄＮＴＰ、0.1 μｇのMBC1L2
4 、プライマーとしてMBCCHL1 およびMBCCHL3 を各50pm
ole、１μｌの AmpliTaq(PERKIN ELMER) を含有する100
μｌの反応混合液を用い、50μｌの鉱油を上層して94℃
にて45秒間、60℃にて45秒間、72℃にて２分間の温度サ
イクルで30回行った。

【０１９０】444bp のＰＣＲ産物を３％低融点アガロー
スゲルで電気泳動した後、GENECLEAN II kit(BIO101)を
用いてゲルから回収、精製し、10mM Tris-HCl (pH7.4)
、１mM EDTA 溶液20μｌに溶解した。ＰＣＲ産物１μ
ｌをそれぞれ10mM Tris-HCl （pH7.5)、10mM MgCl₂、１
mM DTT、50mM NaCl 、８ＵのHind III（宝酒造）および
８ＵのEcoRI （宝酒造）を含有する反応混合液20μｌ中
で37℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノールお
よびクロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿で
回収し、10mM Tris-HCl （pH7.4)、１mM EDTA 溶液８μ
ｌに溶解した。

【０１９１】プラスミドpUC19 １μｇを同様にHind III
およびEcoRI で消化し、フェノールおよびクロロホルム
で抽出し、エタノール沈殿により回収し、アルカリホス
ファターゼ(E.coli C75 ，宝酒造）でＢＡＰ処理した。
反応液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、ＤＮＡ
をエタノール沈殿で回収した後、10mM Tris-HCl (pH7.
4) 、１mM EDTA 溶液10μｌに溶解した。

【０１９２】ＢＡＰ処理したプラスミドpUC19 １μｌと
先のＰＣＲ産物４μｌをDNA Ligation Kit Ver.2（宝酒
造）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細
胞（ニッポンジーン）に前述と同様に形質転換した。こ
れを、50μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ寒
天培地にまき、３７℃で一夜培養した。得られた形質転
換体を、50μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ
培地２mlで37℃で一夜培養した。菌体画分からQIAprep
Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドを精製し
た。塩基配列を決定後、正しい塩基配列を有するプラス
ミドをCHL/pUC19 とした。

【０１９３】プラスミドＣλ／pUC19 、Ｃκ／pUC19 各
１μｇをそれぞれ20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM MgCl₂、
１mM DTT、100mM KCl、８Ｕの Hind III（宝酒造）お
よび２ＵのBlnI（宝酒造）を含有する反応混合液20μｌ
中で37℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノール
およびクロロホルムで抽出、ＤＮＡをエタノール沈殿で
回収した後、37℃で30分間ＢＡＰ処理を行った。反応液
をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエ
タノール沈殿で回収し、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM E
DTA 溶液10μｌに溶解した。

【０１９４】＃23-57-137-1 Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤ
ＮＡを含むプラスミドCHL/pUC19 から８μｇを同様にHi
nd IIIおよびBlnIで消化した。得られた409bp のＤＮＡ
断片を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、GE
NECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製
し、10mM Tris-HCl（pH7.4)、１mM EDTA 溶液10μｌに
溶解した。

【０１９５】このＬ鎖Ｖ領域ＤＮＡ４μｌを、ＢＡＰ処
理したプラスミドＣλ／pUC19 またはＣκ／pUC19 各１
μｌにサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９コンピテ
ント細胞に形質転換した。50μｇ/ml アンピシリンを含
有する２×ＹＴ培地３mlで一夜培養し、菌体画分からQI
Aprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN) を用いてプラスミド
を精製した。これらをそれぞれプラスミドMBC1L(λ)/pU
C19 、MBC1L(κ)/pUC19 とした。プラスミドMBC1L(λ)/
pUC19 およびMBC1L(κ)/pUC19 をそれぞれEcoRI で消化
し、３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、743b
p のＤＮＡ断片をGENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲ
ルから回収、精製し、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM EDT
A 溶液10μｌに溶解した。

【０１９６】発現ベクターとしてプラスミドHEF-PM1k-g
k 2.7 μｇをEcoRI で消化し、フェノールおよびクロロ
ホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収した。
回収したＤＮＡ断片をＢＡＰ処理した後、１％低融点ア
ガロースゲルで電気泳動し、6561bpのＤＮＡ断片をGENE
CLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製し、
10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM EDTA 溶液10μｌに溶解し
た。

【０１９７】ＢＡＰ処理したＨＥＦベクター２μｌを上
記プラスミドMBC1L(λ) またはMBC1L(κ) EcoRI 断片各
３μｌと連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に
形質転換した。50μｇ/ml アンピシリンを含有する２×
ＹＴ培地２mlで培養し、菌体画分からQIAprep Spin Pla
smid Kit (QIAGEN) を用いてプラスミドを精製した。

【０１９８】精製したプラスミドを、20mM Tris-HCl (p
H8.5) 、10mM MgCl₂、１mM DTT、100mM KCl 、８ＵのHi
nd III（宝酒造）および２ＵのPvuI（宝酒造）を含有す
る反応混合液20μｌ中で37℃にて１時間消化した。断片
が正しい方向に挿入されていれば5104/2195bp 、逆方向
に挿入されていれば4378/2926bp の消化断片が生じるこ
とより、正しい方向に挿入されていたプラスミドをそれ
ぞれMBC1L(λ)/neo 、MBC1L(κ)/neo とした。

【０１９９】(4) ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクショ
ンキメラ抗体の抗原結合活性および中和活性を評価するた
め、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞で一過性に発
現させた。すなわちキメラ抗体の一過性発現は、プラス
ミドＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とＭＢＣ１Ｌ
（λ）／ｎｅｏ、またはＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ
１とＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｎｅｏとの組み合わせでGene P
ulser 装置（Bio Rad ）を用いてエレクトロポレーショ
ンによりＣＯＳ−７細胞に同時形質導入した。ＰＢＳ
（−）中に１×10⁷細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されて
いるＣＯＳ−７細胞0.8mlに、各プラスミドＤＮＡ10μ
ｇを加え、1,500 Ｖ，25μＦの静電容量にてパルスを与
えた。室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレ
ーション処理された細胞を２％のUltra Low IgG ウシ胎
児血清（GIBCO)を含有するＤＭＥＭ培地（GIBCO)に懸濁
し、10ｃｍ培養皿を用いてＣＯ₂インキュベーターにて
培養した。72時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分
離により細胞破片を除去し、ELISA の試料に供した。ま
た、ＣＯＳ−７細胞の培養上清からのキメラ抗体の精製
は、AffiGel Protein A MAPSIIキット（BioRad）を用い
てキット添付の処方に従って行った。

【０２００】(5) ＥＬＩＳＡ (i) 抗体濃度の測定抗体濃度測定のためのELISA プレートを次のようにして
調製した。ELISA 用96穴プレート（Maxisorp, NUNC) の
各穴を、固相化バッファー（0.1M NaHCO₃、0.02％ NaN
₃）で１μg/mlの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体
（TAGO）100 μl で固相化し、200 μl の希釈バッファ
ー（50mM Tris-HCl 、１mM MgCl₂、0.1MNaCl 、0.05％
Tween20、0.02％ NaN₃、１％牛血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）、pH7.2)でブロッキングの後、キメラ抗体を発現
させたＣＯＳ細胞の培養上清あるいは精製キメラ抗体を
段階希釈して各穴に加えた。１時間室温にてインキュベ
ートし、PBS-Tween20 で洗浄後、アルカリフォスファタ
ーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（TAGO）100 μl を加え
た。１時間室温にてインキュベートし、PBS-Tween20 で
洗浄の後、１mg/ml の基質溶液（Sigma104、ｐ−ニトロ
フェニルリン酸、SIGMA ）を加え、次に405nm での吸光
度をマイクロプレートリーダー(Bio Rad) で測定した。
濃度測定のスタンダードとして、Hu IgG1λ Purified
(The BindingSite)を用いた。

【０２０１】(ii)抗原結合能の測定抗原結合測定のためのＥｌＩＳＡプレートでは、次のよ
うにして調製した。ＥＬＩＳＡ用96穴プレートの各穴
を、固相化バッファーで１μｇ／ｍｌの濃度に調製した
ヒトＰＴＨｒＰ（1-34）（ペプチド研究所）100 μｌで
固相化した。200μｌの希釈バッファーでブロッキング
の後、キメラ抗体を発現させたＣＯＳ細胞の培養上清あ
るいは精製キメラ抗体を段階希釈して各穴に加えた。室
温にてインキュベートし、PBS-Tween20 で洗浄後、アル
カリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（TAG
O）100 μｌを加えた。室温にてインキュベートし、PBS
-Tween20 で洗浄の後、１mg/ml の基質溶液（Sigma10
4、ｐ−ニトロフェニルリン酸、SIGMA ）を加え、次に4
05nm での吸光度をマイクロプレートリーダー（Bio Ra
d)で測定した。

【０２０２】その結果、キメラ抗体は、ヒトＰＴＨｒＰ
（1-34) に対する結合能を有しており、クローニングし
たマウス抗体Ｖ領域の正しい構造を有することが示され
た（図４）。また、キメラ抗体においてＬ鎖Ｃ領域がλ
鎖あるいはκ鎖のいずれであっても抗体のＰＴＨｒＰ
（1-34) に対する結合能は変化しないことから、ヒト型
化抗体のＬ鎖Ｃ領域は、ヒト型化抗体Ｌ鎖λ鎖を用いて
構築した。

【０２０３】(6) ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立キメラ抗体の安定産生細胞株を樹立するため、前記発現
プラスミドをＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１）に導入した。す
なわちキメラ抗体の安定産生細胞株樹立は、ＣＨＯ細胞
用発現プラスミドＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１とＭ
ＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、またはＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／
ｐＣＨＯ１とＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｎｅｏとの組み合わせ
で、Gene Pulser 装置（Bio Rad ）を用いてエレクトロ
ポレーションによりＣＨＯ細胞に同時形質導入した。そ
れぞれの発現ベクターを制限酵素ＰｖｕＩで切断して直
鎖ＤＮＡにし、フェノールおよびクロロホルム抽出後、
エタノール沈殿でＤＮＡを回収してエレクトロポレーシ
ョンに用いた。ＰＢＳ（−）中に１×10⁷細胞／ｍｌの
細胞濃度で懸濁されているＣＨＯ細胞0.8ml に、各プラ
スミドＤＮＡ10μｇを加え、1,500 Ｖ，25μＦの静電容
量にてパルスを与えた。室温にて10分間の回復期間の
後、エレクトロポレーション処理された細胞を10％ウシ
胎児血清（GIBCO ）を添加したＭＥＭ−α培地（GIBCO
）に懸濁し、３枚の96穴プレート（Falcon）を用いて
ＣＯ₂インキュベーターにて培養した。培養開始翌日
に、10％ウシ胎児血清（GIBCO ）および500mg/mlのGENE
TICIN （G418Sulfate 、GIBCO ）添加、リボヌクレオシ
ドおよびデオキリボヌクレオシド不含ＭＥＭ−α培地
（GIBCO ）の選択培地を交換し、抗体遺伝子の導入され
た細胞を選択した。選択培地交換後、２週間前後に顕微
鏡下で細胞を観察し、順調な細胞増殖が認められた後
に、上記抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにて抗体産生量を測定
し、抗体産生量の多い細胞を選別した。

【０２０４】樹立した抗体の安定産生細胞株の培養を拡
大し、ローラーボトルにて２％のUltra Law IgG ウシ胎
児血清添加、リボヌクレオシドおよびデオキリボヌクレ
オシド不含ＭＥＭ培地を用いて、大量培養を行った。培
養３ないし４日目に培養上清を回収し、0.2 μｍのフィ
ルター（Millipore ）により細胞破片を除去した。ＣＨ
Ｏ細胞の培養上清からのキメラ抗体の精製は、ＰＯＲＯ
ＳプロテインＡカラム（PerSeptive Biosystems ）を用
いて、ＣｏｎＳｅｐＬＣ１００（Millipore ）にて添
付の処方に従って行い、中和活性の測定および高カルシ
ウム血症モデル動物での薬効試験に供した。得られた精
製キメラ抗体の濃度および抗原結合活性は、上記ＥＬＩ
ＳＡ系にて測定した。

【０２０５】〔実施例３〕ヒト型化抗体の構築 (1) ヒト型化抗体Ｈ鎖の構築 (i) ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域の構築ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体Ｈ鎖を、ＰＣＲ
法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。ヒト
抗体S31679(NBRF-PDB、Cuisinier A.M.ら、Eur.J.Immuno
l.,23,110-118,1993)由来のＦＲを有するヒト型化＃２
３−５７−１３７−１抗体Ｈ鎖（バージョン”ａ”）の
作製のために６個のＰＣＲプライマーを使用した。ＣＤ
Ｒ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１（配列
番号２３）及びＭＢＣ１ＨＧＰ３（配列番号２４）はセ
ンスＤＮＡ配列を有し、そしてＣＤＲグラフティングプ
ライマーＭＢＣ１ＨＧＰ２（配列番号２５）及びＭＢＣ
１ＨＧＰ４（配列番号２６）はアンチセンスＤＮＡ配列
を有し、そしてそれぞれプライマーの両端に１５から２
１ｂｐの相補的配列を有する。外部プライマーＭＢＣ１
ＨＶＳ１（配列番号２７）及びＭＢＣ１ＨＶＲ１（配列
番号２８）はＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１
ＨＧＰ１及びＭＢＣ１ＨＧＰ４とホモロジーを有する。

【０２０６】ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ
１ＨＧＰ１、ＭＢＣ１ＨＧＰ２、ＭＢＣ１ＨＧＰ３およ
びＭＢＣ１ＨＧＰ４は尿素変性ポリアクリルアミドゲル
を用いて分離し（Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess, 1989)、ゲルからの抽出はcrush andsoak法（Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら, Col
d Spring Harbor Laboratory Press, 1989)にて行っ
た。

【０２０７】すなわち、それぞれ１ｎｍｏｌｅのＣＤＲ
−グラフティングプライマーを６％変性ポリアクリルア
ミドゲルで分離し、目的の大きさのＤＮＡ断片の同定を
シリカゲル薄層板上で紫外線を照射して行い、crush an
d soak法にてゲルから回収し２０μｌの１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭＥＤＴＡ溶液に
溶解した。ＰＣＲは、TaKaRa Ex Taq（宝酒造）を用
い、１００μｌの反応混合液に上記の様に調製したＣＤ
Ｒ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１、ＭＢ
Ｃ１ＨＧＰ２、ＭＢＣ１ＨＧＰ３およびＭＢＣ１ＨＧＰ
４をそれぞれ１μｌ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ並びに
２．５ＵのTaKaRa Ex Taqを含む条件で、添付緩衝液を
使用して９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃
にて１分間の温度サイクルで５回行った。さらに５０ｐ
ｍｏｌｅの外部プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ１及びＭＢＣ
１ＨＶＲ１を加え、同じ温度サイクルを３０回行った。
ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を４％Nu Sieve GTG
アガロース（FMC Bio. Products）を用いたアガロース
ゲル電気泳動により分離した。

【０２０８】４２１ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガ
ロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ（Ｂ
ＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断
片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させ
た後、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１
ｍＭＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。得られたＰＣ
Ｒ反応混合物を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消
化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニン
グし、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラス
ミドをｈＭＢＣＨｖ／ｐＵＣ１９と命名した。

【０２０９】（ii) ヒト型化Ｈ鎖ｃＤＮＡのためのＨ鎖
Ｖ領域の構築ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のｃＤＮＡと連結するために、上
記のようにして構築したヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のＤＮＡを
ＰＣＲ法により修飾した。後方プライマーＭＢＣ１ＨＶ
Ｓ２はＶ領域のリーダー配列の５’−側をコードする配
列とハイブリダイズし、且つＫｏｚａｋコンセンサス配
列（Kozak,M,ら、J.Mol.Biol.196,947-950,1987)、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ認識配列を有するように設
計した。Ｈ鎖Ｖ領域のＤＮＡを修飾するための前方プラ
イマーＭＢＣ１ＨＶＲ２は、Ｊ領域の３’―側をコード
するＤＮＡ配列にハイブリダイズし、且つＣ領域の５’
−側の配列をコードしＡｐａＩおよびＳｍａＩ認識配列
を有するように設計した。

【０２１０】ＰＣＲはＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（宝
酒造）を用い、鋳型ＤＮＡとして０．４μｇのｈＭＢＣ
Ｈｖ／ｐＵＣ１９を用い、プライマーとしてＭＢＣ１Ｈ
ＶＳ２およびＭＢＣ１ＨＶＲ２をそれぞれ５０ｐｍｏｌ
ｅ、２．５ＵのＴａＫａＲａＥｘＴａｑ、０．２５ｍ
ＭのｄＮＴＰを含む条件で添付緩衝液を使用し、９４℃
にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温
度サイクルで３０回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤ
ＮＡ断片を３％ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧアガロース（FMC
Bio.Products）を用いたアガロースゲル電気泳動により
分離した。

【０２１１】４５６ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガ
ロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ（Ｂ
ＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断
片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させ
た後、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１
ｍＭＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。得られたＰＣ
Ｒ反応混合物を、ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで消化する
ことで調製したｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基
配列を決定した。こうして得られたハイブリドーマ＃２
３−５７−１３７−１に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコ
ードするＤＮＡを含有し、５’−側にＥｃｏＲＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列、３’−側
にＡｐａＩおよびＳｍａＩ認識配列を持つプラスミドを
ｈＭＢＣ１Ｈｖ／ｐＵＣ１９と命名した。

【０２１２】（２）ヒト型化抗体Ｈ鎖の発現ベクターの
構築ｈＰＭ１抗体Ｈ鎖ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドＲＶ
ｈ−ＰＭ１ｆ−ｃＤＮＡをＡｐａＩおよびＢａｍＨＩに
て消化し、Ｈ鎖Ｃ領域をコードする塩基配列を含むＤＮ
Ａ断片を回収し、ＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで消化する
ことにより調製したｈＭＢＣ１Ｈｖ／ｐＵＣ１９に導入
した。こうして作製したプラスミドをｈＭＢＣ１ＨｃＤ
ＮＡ／ｐＵＣ１９と命名した。このプラスミドはヒト型
化＃２３−５７−１３７−１抗体のＨ鎖Ｖ領域及びヒト
Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１をコードするＤＮＡを含み、５'-末端
にＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ認識配列、３'-末端
にＢａｍＨＩ認識配列を持つ。プラスミドｈＭＢＣ１Ｈ
ｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９に含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョ
ン”ａ”の塩基配列および対応するアミノ酸配列を配列
番号５８に示す。また、バージョンａのアミノ酸配列を
配列番号５６に示す。

【０２１３】ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９をＥｃ
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られたＨ鎖配列を
含むＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化
することにより調製した発現プラスミドｐＣＯＳ１に導
入した。こうして得られたヒト型化抗体の発現プラスミ
ドをｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１と命名した。

【０２１４】さらにＣＨＯ細胞での発現に用いるための
プラスミドを作製するためｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵ
Ｃ１９をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られ
たＨ鎖配列を含むＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＢａ
ｍＨＩで消化することにより調製した発現プラスミドｐ
ＣＨＯ１に導入した。こうして得られたヒト型化抗体の
発現プラスミドをｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１と
命名した。

【０２１５】（３）Ｌ鎖ハイブリッド可変領域の構築 (i) ＦＲ１，２／ＦＲ３，４ハイブリッド抗体の作製ヒト型化抗体とマウス（キメラ）抗体のＦＲ領域を組み
換えたＬ鎖をコードするＤＮＡを構築し、ヒト型化のた
めの各領域の評価を行った。ＣＤＲ２内にある制限酵素
ＡｆｌＩＩ切断部位を利用することによって、ＦＲ１及
び２はヒト抗体由来、ＦＲ３及び４はマウス抗体由来と
するハイブリッド抗体を作製した。

【０２１６】プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ及び
ｈＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ各１０μｇを、１０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ₂，
１ｍＭＤＴＴ，５０ｍＭＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／
ｖ）ＢＳＡ，ＡｆｌＩＩ（宝酒造）１０Ｕを含有する反
応混合液１００μｌ中で３７℃にて１時間消化した。反
応液を２％低融点アガロースゲルで電気泳動し、プラス
ミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから６２８２ｂｐの断片
（ｃ１とする）および１０２２ｂｐの断片（ｃ２とす
る）、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから６２
８２ｂｐの断片（ｈ１とする）および１０２２ｂｐの断
片（ｈ２とする）を、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ
（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製した。回
収したｃ１、ｈ１断片各１μｇについてＢＡＰ処理を行
った。ＤＮＡをフェノールおよびクロロホルムで抽出
し、エタノール沈殿で回収した後、１０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭＥＤＴＡ溶液１０μｌ
に溶解した。

【０２１７】ＢＡＰ処理したｃ１及びｈ１断片１μｌを
それぞれｈ２、ｃ２断片４μｌに連結し（４℃、一
夜）、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換し
た。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培
地２ｍｌで培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid
Kit（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。

【０２１８】精製したプラスミドを、１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ₂及び１ｍ
ＭＤＴＴ並びにＡｐａＬＩ（宝酒造）２Ｕ、ＢａｍＨＩ
（宝酒造）８Ｕ又はＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）８Ｕを含
有する反応混合液２０μｌ中で３７℃、１時間消化し
た。ｃ１-ｈ２が正しく連結されていれば、ＡｐａＬＩ
で５５６０／１２４６／４９８ｂｐ、ＢａｍＨＩ／Ｈｉ
ｎｄＩＩＩで７１３４／２６９ｂｐの消化断片が生じる
ことにより、プラスミドの確認を行った。

【０２１９】ヒトＦＲ１，２／マウスＦＲ３，４ハイブ
リッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｈ／ｍＭＢ
Ｃ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとした。一方、ｈ１-ｃ２のクロ
ーンが得られなかったので、ｐＵＣベクター上で組換え
てからＨＥＦベクターにクローニングした。その際、ア
ミノ酸置換のないヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする
ＤＮＡを含むプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１
９、及びＦＲ３内の９１位（Ｋａｂａｔの規定によるア
ミノ酸番号８７位）のチロシンをイソロイシンに置換し
たヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含むプ
ラスミドｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９を鋳型として用
いた。

【０２２０】プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｐＵＣ１
９、ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９及びｈＭＢＣ１Ｌｄ
λ／ｐＵＣ１９の各１０μｇを、１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ₂，１ｍＭＤＴ
Ｔ，５０ｍＭＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，
ＨｉｎｄＩＩＩ１６Ｕ，ＡｆｌＩＩ４Ｕを含有する反応
混合液３０μｌ中で３７℃、１時間消化した。反応液を
２％低融点アガロースゲルで電気泳動し、プラスミドＭ
ＢＣ１Ｌ（λ）／ｐＵＣ１９から２１５ｂｐ（ｃ
２'）、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９およ
びｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９からそれぞれ３２１８
ｂｐ（ｈａ１'，ｈｄ１'）のＤＮＡ断片をＧＥＮＥＣＬ
ＥＡＮＩＩＫｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから
回収、精製した。

【０２２１】ｈａ１'、ｈｄ１'断片をそれぞれｃ２'断
片に連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質
転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×
ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ
ＳｐｉｎＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い
てプラスミドを精製した。ｈａ１'、ｈｄ１'断片を含む
プラスミドを、それぞれプラスミドｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａ
λ／ｐＵＣ１９、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９と
した。

【０２２２】得られたプラスミドｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ
／ｐＵＣ１９、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９をＥ
ｃｏＲＩで消化した。それぞれ７４３ｂｐのＤＮＡ断片
を２％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、ＧＥＮ
ＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲ
ルから回収、精製し、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．４），１ｍＭＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解し
た。

【０２２３】各ＤＮＡ断片４μｌを前述のＢＡＰ処理し
たＨＥＦベクター１μｌに連結し、大腸菌ＪＭ１０９コ
ンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピ
シリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画
分からQIAprep Spin PlasmidKit(QIAGEN)を用いてプラ
スミドを精製した。

【０２２４】精製した各プラスミドを、２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０ｍＭＭｇＣｌ₂，１ｍ
ＭＤＴＴ，１００ｍＭＫＣｌ，ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒
造）８Ｕ，ＰｖｕＩ（宝酒造）２Ｕを含有する反応混合
液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。断片が正し
い方向に挿入されていれば５１０４／２１９５ｂｐ、逆
方向に挿入されていれば４３７８／２９２６ｂｐの消化
断片が生じることより、プラスミドの確認を行った。こ
れらを、それぞれマウスＦＲ１，２／ヒトＦＲ３，４ハ
イブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターｍ／ｈＭ
ＢＣ１Ｌａλ／ｎｅｏ、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｎｅｏ
とした。

【０２２５】(ii)ＦＲ１／ＦＲ２ハイブリッド抗体の作
製ＣＤＲ１内にあるＳｎａＢＩ切断部位を利用することに
よって、同様にＦＲ１とＦＲ２のハイブリッド抗体を作
製した。プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ及びｈ／
ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏの各１０μｇを１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９），１０ｍＭＭｇＣｌ
₂，１ｍＭＤＴＴ，５０ｍＭＮａＣｌ，０．０１％
（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＳｎａＢＩ（宝酒造）６Ｕを含有す
る反応混合液２０μｌ中で、３７℃にて１時間消化し
た。次に２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１
０ｍＭＭｇＣｌ_２，１ｍＭＤＴＴ，１００ｍＭＫ
Ｃｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＰｖｕＩ６Ｕを含
有する反応混合液５０μｌ中で３７℃にて１時間消化し
た。

【０２２６】反応液を１．５％低融点アガロースゲルで
電気泳動した後、プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ
から４９５５ｂｐ（ｍ１）および２３４９ｂｐ（ｍ
２）、プラスミドｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから
４９５５ｂｐ（ｈｍ１）および２３４９ｂｐ（ｈｍ２）
の各ＤＮＡ断片を、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ
（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭＥＤ
ＴＡ溶液４０μｌに溶解した。

【０２２７】ｍ１、ｈｍ１断片１μｌをそれぞれｈｍ
２、ｍ２断片４μｌに連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピ
テント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリ
ンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分か
らＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ（ＱＩ
ＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。精製した各
プラスミドを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５），１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭＤＴＴ及びＡｐａＩ
（宝酒造）８ＵまたはＡｐａＬＩ（宝酒造）２Ｕを含有
する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化し
た。

【０２２８】各断片が正しく連結されていれば、Ａｐａ
Ｉで７３０４ｂｐ、ＡｐａＬＩで５５６０／１２４６／
４９８ｂｐ（ｍ１-ｈｍ２）、ＡｐａＩで６５３８／７
６６ｂｐ、ＡｐａＬＩで３５３５／２０２５／１２４６
／４９８ｂｐ（ｈｍ１-ｍ２）の消化断片が生じること
により、プラスミドの確認を行った。ヒトＦＲ１／マウ
スＦＲ２，３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発
現ベクターをｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、マウス
ＦＲ１／ヒトＦＲ２／マウスＦＲ３，４ハイブリッド抗
体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｍｈｍＭＢＣ１Ｌ
（λ）／ｎｅｏとした。

【０２２９】（４）ヒト型化抗体Ｌ鎖の構築ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体Ｌ鎖を、ＰＣＲ
法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。ヒト
抗体ＨＳＵ０３８６８（GEN-BANK、Deftos Mら,Scand.J.
Immunol.,39,95-103,1994)由来のＦＲ１、ＦＲ２および
ＦＲ３、並びにヒト抗体Ｓ２５７５５（ＮＢＲＦ-ＰＤ
Ｂ）由来のＦＲ４を有するヒト型化＃２３−５７−１３
７−１抗体Ｌ鎖（バージョン”ａ”）の作製のために６
個のＰＣＲプライマーを使用した。

【０２３０】ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ
１ＬＧＰ１（配列番号２９）及びＭＢＣ１ＬＧＰ３（配
列番号３０）はセンスＤＮＡ配列を有し、そしてＣＤＲ
グラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ２（配列番号
３１）及びＭＢＣ１ＬＧＰ４（配列番号３２）はアンチ
センスＤＮＡ配列を有し、そしてそれぞれプライマーの
両端に１５から２１ｂｐの相補的配列を有する。外部プ
ライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１（配列番号３３）及びＭＢＣ
１ＬＶＲ１（配列番号３４）はＣＤＲグラフティングプ
ライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１及びＭＢＣ１ＬＧＰ４とホモ
ロジーを有する。

【０２３１】ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ
１ＬＧＰ１、ＭＢＣ１ＬＧＰ２、ＭＢＣ１ＬＧＰ３およ
びＭＢＣ１ＬＧＰ４は尿素変性ポリアクリルアミドゲル
を用いて分離し(Molecular Cloning:A Laboratory Manu
al,Sambrookら, Cold SpringHarbor Laboratory Press,
1989)、ゲルからの抽出はcrush and soak法(Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら, Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press, 1989)にて行った。

【０２３２】すなわち、それぞれ１ｎｍｏｌｅのＣＤＲ
−グラフティングプライマーを６％変性ポリアクリルア
ミドゲルで分離し、目的の大きさのＤＮＡ断片の同定を
シリカゲル薄層板上で紫外線を照射して行い、crush an
d soak法にてゲルから回収し、２０μｌの１０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭＥＤＴＡ溶液に
溶解した。

【０２３３】ＰＣＲは、ＴａＫａＲａＥｘＴａｑ
（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に上記の様
に調製したＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１
ＬＧＰ１、ＭＢＣ１ＬＧＰ２、ＭＢＣ１ＬＧＰ３および
ＭＢＣ１ＬＧＰ４をそれぞれ１μｌ、０．２５ｍＭのｄ
ＮＴＰ並びに２．５ＵのＴａＫａＲａＥｘＴａｑを
含む条件で、添付緩衝液を使用して９４℃にて１分間、
５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで
５回行い、この反応混合液に５０ｐｍｏｌｅの外部プラ
イマーＭＢＣ１ＬＶＳ１及びＭＢＣ１ＬＶＲ１を加え、
さらに同じ温度サイクルで３０回反応させた。ＰＣＲ法
により増幅したＤＮＡ断片を３％ＮｕＳｉｅｖｅＧ
ＴＧアガロース（ＦＭＣＢｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）
を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。

【０２３４】４２１ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガ
ロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ（Ｂ
ＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断
片を精製した。得られたＰＣＲ反応混合物を、ＢａｍＨ
ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製した
ｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列を決定し
た。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣＬ／ｐＵＣ
１９と命名した。しかしながらＣＤＲ４の１０４位（Ｋ
ａｂａｔの規定によるアミノ酸番号９６位）のアミノ酸
がアルギニンになっていたため、これをチロシンに修正
するための修正プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１０Ｒ（配列
番号３５）を設計し、合成した。ＰＣＲはＴａＫａＲａ
Ｔａｑ（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に
鋳型ＤＮＡとして０．６μｇのプラスミドｈＭＢＣＬ／
ｐＵＣ１９、プライマーとしてＭＢＣ１ＬＶＳ１及びＭ
ＢＣ１ＬＧＰ１０Ｒをそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、２．５
ＵのＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（宝酒造）０．２５ｍ
ＭのｄＮＴＰを含む条件で添付の緩衝液を使用して５０
μｌの鉱油を上層して９４℃にて１分間、５５℃にて１
分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３０回行っ
た。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を３％ＮｕＳ
ｉｅｖｅＧＴＧアガロース（ＦＭＣＢｉｏ．Ｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分
離した。

【０２３５】４２１ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガ
ロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ（Ｂ
ＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断
片を精製した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｍＨＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐ
ＵＣ１９にサブクローニングした。

【０２３６】Ｍ１３ＰｒｉｍｅｒＭ４プライマー及
びＭ１３ＰｒｉｍｅｒＲＶプライマーを用いて塩基
配列を決定した結果、正しい配列を得ることができたの
で、このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで
消化し、４１６ｂｐの断片を１％アガロースゲル電気泳
動により分離した。ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ
（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮ
Ａ断片を精製した。得られたＰＣＲ反応混合物を、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化することにより調製し
たプラスミドＣλ／ｐＵＣ１９に導入し、プラスミドｈ
ＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と命名した。このプラスミ
ドをＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードするＤＮ
ＡをプラスミドｐＣＯＳ１に導入し、ＥＦ１αプロモー
ターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するよう
にした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌａ
λ／ｐＣＯＳ１と命名した。ヒト型化Ｌ鎖バージョン"
ａ"の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）を配列番号6
6に示す。また、バージョンａのアミノ酸配列を配列番
号47に示す。

【０２３７】バージョン"ｂ"をＰＣＲ法による変異導入
を用いて作製した。バージョン"ｂ"では４３位（Ｋａｂ
ａｔの規定によるアミノ酸番号４３位）のグリシンをプ
ロリンに、４９位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番
号４９位）のリジンをアスパラギン酸に変更するように
設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ５Ｒ（配列
番号３６）とプライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１により、プラ
スミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてＰＣ
Ｒを行い、得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉ
ｎｄＩＩＩで消化し、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ，Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。塩基配列決定
後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｆｌＩＩで消化
し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｆｌＩＩで消化したｈＭＢ
Ｃ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と連結した。

【０２３８】こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１
Ｌｂλ／ｐＵＣ１９とし、このプラスミドをＥｃｏＲＩ
で消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードするＤＮＡを含む断片
をプラスミドｐＣＯＳ１に導入し、ＥＦ１αプロモータ
ーの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するように
した。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｂλ
／ｐＣＯＳ１と命名した。

【０２３９】バージョン"ｃ"をＰＣＲ法による変異導入
を用いて作製した。バージョン"ｃ"では８４位（Ｋａｂ
ａｔの規定によるアミノ酸番号８０位）のセリンをプロ
リンに変更するように設計した。変異原プライマーＭＢ
Ｃ１ＬＧＰ６Ｓ（配列番号３７）とプライマーＭ１３
ＰｒｉｍｅｒＲＶによりプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ
／ｐＵＣ１９を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮ
Ａ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｂ
ａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調
製したｐＵＣ１９にサブクローニングした。塩基配列
決定後、制限酵素ＢｓｔＰＩおよびＡｏｒ５１ＨＩで消
化し、ＢｓｔＰＩおよびＡｏｒ５１ＨＩで消化したｈＭ
ＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と連結した。こうして得られ
たプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｃλ／ｐＵＣ１９とし、こ
のプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ
鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドｐＣＯＳ１
のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下
流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。
こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｃλ／ｐＣ
ＯＳ１と命名した。

【０２４０】バージョン"ｄ" 、"ｅ" 及び"ｆ" をＰＣ
Ｒ法による変異導入を用いて作製した。各バージョンと
も順に"ａ" 、"ｂ" 、"ｃ" バージョンの９１位（Ｋａ
ｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンを
イソロイシンに変更するように設計した。変異原プライ
マーＭＢＣ１ＬＧＰ１１Ｒ（配列番号３８）とプライマ
ーＭ-Ｓ１（配列番号４４）によりそれぞれｈＭＢＣ１
Ｌａλ／ｐＣＯＳ１，ｈＭＢＣ１Ｌｂλ／ｐＣＯＳ１，
ｈＭＢＣ１Ｌｃλ／ｐＣＯＳ１を鋳型としてＰＣＲを行
い、得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化
することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニング
した。塩基配列決定後、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩ
で消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化するこ
とより調製したＣλ／ｐＵＣ１９と連結した。

【０２４１】こうして得られたプラスミドを順にｈＭＢ
Ｃ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９、ｈＭＢＣ１Ｌｅλ／ｐＵＣ１
９、ｈＭＢＣ１Ｌｆλ／ｐＵＣ１９とした。これらのプ
ラスミドをＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードす
る配列を含む配列をプラスミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ
部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化
Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得ら
れたプラスミドをそれぞれ順にｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＣ
ＯＳ１、ｈＭＢＣ１Ｌｅλ／ｐＣＯＳ１、ｈＭＢＣ１Ｌ
ｆλ／ｐＣＯＳ１と命名した。

【０２４２】バージョン"ｇ" 及び"ｈ" をＰＣＲ法によ
る変異導入を用いて作製した。各バージョンとも順に"
ａ" 、"ｄ" バージョンの３６位（Ｋａｂａｔの規定に
よるアミノ酸番号３６位）のヒスチジンをチロシンに変
更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧ
Ｐ９Ｒ（配列番号３９）およびＭ１３ＰｒｉｍｅｒＲ
Ｖをプライマーとして用いて、ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵ
Ｃ１９を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物
とＭ１３ＰｒｉｍｅｒＭ４をプライマーとして用い
て、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型と
してさらにＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片をＨｉ
ｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩお
よびＢｌｎＩで消化することで調製したプラスミドＣλ
／ｐＵＣ１９にサブクローニングした。このプラスミド
を鋳型として、プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１３Ｒ（配列
番号４０）とＭＢＣ１ＬＶＳ１をプライマーとしたＰＣ
Ｒを行った。得られたＰＣＲ断片をＡｐａＩおよびＨｉ
ｎｄＩＩでＩ消化し、ＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで
消化したプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９およ
びｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９に導入した。塩基配列
を決定し、正しい配列を含むプラスミドを順にｈＭＢＣ
１Ｌｇλ／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｈλ／ｐＵＣ
１９とし、これらのプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ消
化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラ
スミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１α
プロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置
するようにした。こうして得られたプラスミドをそれぞ
れ順にｈＭＢＣ１Ｌｇλ／ｐＣＯＳ１およびｈＭＢＣ１
Ｌｈλ／ｐＣＯＳ１と命名した。

【０２４３】バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｋ" 、"ｌ"
、"ｍ" 、"ｎ" および"ｏ" をＰＣＲ法による変異導入
を用いて作製した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１
４Ｓ（配列番号４１）とプライマーＶｌＲＶ（λ）（配
列番号４３）によりプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵ
Ｃ１９を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片
をＡｐａＩおよびＢｌｎＩで消化し、ＡｐａＩおよびＢ
ｌｎＩで消化することにより調製したプラスミドｈＭＢ
Ｃ１Ｌｇλ／ｐＵＣ１９にサブクローニングした。塩基
配列決定を行い、それぞれのバージョンに対応した変異
が導入されたクローンを選択した。こうして得られたプ
ラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＵＣ１９（ｘ＝ｉ，
ｊ，ｋ，ｌ，ｍ，ｎ，ｏ）とし、このプラスミドをＥｃ
ｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配
列をプラスミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ部位に導入し、
ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コド
ンが位置するようにした。こうして得られたプラスミド
をｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＣＯＳ１（ｘ＝ｉ，ｊ，ｋ，
ｌ，ｍ，ｎ，ｏ）と命名した。バージョン"ｊ" 、"ｌ"
、"ｍ" および"ｏ" の塩基配列（対応するアミノ酸を
含む）をそれぞれ配列番号67、68、69、70に示す。ま
た、これらの各バージョンのアミノ酸配列をそれぞれ配
列番号48、49、50、51に示す。

【０２４４】バージョン"ｐ" 、"ｑ" 、"ｒ" 、"ｓ" お
よび"ｔ" は、バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｍ" 、"ｌ"
または"ｏ" のアミノ酸配列の８７位のチロシンをイソ
ロイシンに置換したバージョンであり、ＦＲ３内にある
制限酵素Ａｏｒ５１ＭＩ切断部位を利用して、バージョ
ン"ｈ" を、各バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｍ" 、"ｌ"ま
たは"ｏ" とつなぎ換えることにより作製したものであ
る。すなわち、発現プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＣ
ＯＳ１（ｘ＝ｉ，ｊ，ｍ，ｌ，ｏ）中、ＣＤＲ３並びに
ＦＲ３の一部及びＦＲ４を含むＡｏｒ５１ＨＩ断片５１
４ｂｐを除き、ここに発現プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｈλ
／ｐＣＯＳ１中、ＣＤＲ３並びにＦＲ３の一部及びＦＲ
４を含むＡｏｒ５１ＨＩ断片５１４ｂｐをつなぐことに
より９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７
位）のチロシンがイソロイシンとなるようにした。塩基
配列決定を行い、各バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｍ" 、"
ｌ" および"ｏ" の９１位（Ｋａｂａｔの規定によるア
ミノ酸番号８７位）のチロシンがイソロイシンに置換さ
れたクローンを選択し、対応するバージョンをそれぞ
れ"ｐ" 、"ｑ" 、"ｓ" 、"ｒ" および"ｔ" とし、得ら
れたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＣＯＳ１（ｘ＝
ｐ，ｑ，ｓ，ｒ，ｔ）と命名した。バージョン"ｑ" 、"
ｒ" 、"ｓ" および"ｔ" の塩基配列（対応するアミノ酸
を含む）をそれぞれ配列番号71、72、73、74に示す。ま
た、これらの各バージョンのアミノ酸配列をそれぞれ配
列番号52、53、54、55に示す。

【０２４５】プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＣＯＳ１
をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＵＣ１
９にサブクローニングし、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｑλ
／ｐＵＣ１９と命名した。ヒト型化Ｌ鎖の各バージョン
における置換アミノ酸の位置を表３に示す。

【０２４６】

【表３】

【０２４７】表中、Ｙはチロシン、Ｐはプロリン、Ｋは
リジン、Ｖはバリン、Ｄはアスパラギン酸、Ｉはイソロ
イシンを示す。

【０２４８】なお、前記プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮ
Ａ／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９を
有する大腸菌は、それぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
ｏｌｉＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１
９）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ
１０９（ｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９）として、工業
技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁
目１番３号）に、平成８年８月１５日に、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１ＨｃＤ
ＮＡ／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭＢＰ−５６２
９、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０９
（ｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭ
ＢＰ−５６３０としてブダペスト条約に基づき国際寄
託されている。

【０２４９】（５）ＣＯＳ−７細胞へのトランスフェク
ションハイブリッド抗体およびヒト型化＃２３−５７−１３７
−１抗体の抗原結合活性および中和活性を評価するた
め、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞で一過性に発
現させた。すなわちＬ鎖ハイブリッド抗体の一過性発現
では、プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１と
ｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮ
Ａ／ｐＣＯＳ１とｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｎｅｏ、ｈＭ
ＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ
／ｎｅｏ、ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｈｍｍ
ＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、またはｈＭＢＣ１ＨｃＤＮ
Ａ／ｐＣＯＳ１とｍｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとの
組み合わせを、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａ
ｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７
細胞に同時形質導入した。ＰＢＳ（−）中に１×10⁷細
胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＯＳ−７細胞
０．８ｍｌに、各プラスミドＤＮＡ１０μｇを加え、
１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与え
た。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレ
ーション処理された細胞を２％のＵｌｔｒａＬｏｗＩｇ
Ｇウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ培養
液（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、１０ｃｍ培養皿を用いてＣ
Ｏ₂インキュベーターにて培養した。７２時間の培養の
後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去
し、ＥＬＩＳＡの試料に供した。

【０２５０】ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体の
一過性発現では、プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐ
ＣＯＳ１とｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＣＯＳ１（ｘ＝ａ〜
ｔ）のいずれかの組み合わせをＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装
置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、前記ハイブリッド抗体の
場合と同様の方法によりＣＯＳ−７細胞にトランスフェ
クションし、得られた培養上清をＥＬＩＳＡに供した。
また、ＣＯＳ−７細胞の培養上清からのハイブリッド抗
体またはヒト型化抗体の精製は、ＡｆｆｉＧｅｌＰｒ
ｏｔｅｉｎＡＭＡＰＳＩＩキット（ＢｉｏＲａｄ）
を用いて、キット添付の処方に従って行った。

【０２５１】（６）ＥＬＩＳＡ (i) 抗体濃度の測定抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のように
して調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Ｍａｘｉ
ｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）の各穴を固相化バッファー（０．
１ＭＮａＨＣＯ₃、０．０２％ＮａＮ₃）で１μｇ
／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧ
Ｏ）１００μｌで固相化し、２００μｌの希釈バッファ
ー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＭｇＣ
ｌ₂、０．１ＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０、０．０２％ＮａＮ₃、１％牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）、ｐＨ７．２）でブロッキングの後、ハイブ
リッド抗体またはヒト型化抗体を発現させたＣＯＳ−７
細胞の培養上清あるいは精製ハイブリッド抗体またはヒ
ト型化抗体を段階希釈して各穴に加えた。１時間室温に
てインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、
アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体
（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。１時間室温にてイン
キュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍ
ｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフ
ェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍで
の吸光度をマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）
で測定した。濃度測定のスタンダードとして、ＨｕＩ
ｇＧ１λ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（ＴｈｅＢｉｎｄｉｎｇ
Ｓｉｔｅ）を用いた。

【０２５２】(ii)抗原結合能の測定抗原結合測定のためのＥＬＩＳＡプレートを、次のよう
にして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートの各穴を
固相化バッファーで１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヒト
ＰＴＨｒＰ（１−３４）１００μｌで固相化した。２０
０μｌの希釈バッファーでブロッキングの後、ハイブリ
ッド抗体またはヒト型化抗体を発現させたＣＯＳ―７細
胞の培養上清あるいは精製ハイブリッド抗体またはヒト
型化抗体を段階希釈して各穴に加えた。室温にてインキ
ュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリ
フォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧ
Ｏ）１００μｌを加えた。室温にてインキュベートしＰ
ＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質
溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、
ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイ
クロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。

【０２５３】（７）活性確認 (i) ヒト型化Ｈ鎖の評価ヒト型化Ｈ鎖バージョン"ａ"とキメラＬ鎖を組み合わせ
た抗体は、キメラ抗体とＰＴＨｒＰ結合能が同等であっ
た（図５）。この結果は、Ｈ鎖Ｖ領域のヒト型化はバー
ジョン”ａ”で十分なことを示す。以下、ヒト型化Ｈ鎖
バージョン"ａ"をヒト型化抗体のＨ鎖として供した。

【０２５４】(ii)ハイブリッド抗体の活性 (ii-a) ＦＲ１，２／ＦＲ３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖がｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合、活性は全く認め
られなかったが、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλあるいはｍ／ｈ
ＭＢＣ１Ｌｄλの場合はいずれもキメラ＃２３−５７−
１３７−１抗体と同等の結合活性を示した（図６）。こ
れらの結果は、ＦＲ３，４はヒト型化抗体として問題な
いが、ＦＲ１，２内に置換すべきアミノ酸残基が存在す
ることを示唆する。

【０２５５】(ii-b)ＦＲ１／ＦＲ２ハイブリッド抗体Ｌ鎖がｍｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合、活性は全く認め
られなかったが、ｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合はキメ
ラ＃２３−５７−１３７−１抗体と同等の結合活性を示
した（図７）。これらの結果は、ＦＲ１，２のうちＦＲ
１はヒト型化抗体として問題ないが、ＦＲ２内に置換す
べきアミノ酸残基が存在することを示唆する。

【０２５６】(iii) ヒト型化抗体の活性Ｌ鎖としてバージョン"ａ" から"ｔ" の各々一つを用い
たヒト型化抗体について、抗原結合活性を測定した。そ
の結果、Ｌ鎖バージョン"ｊ" 、"ｌ" 、" ｍ"、"ｏ"
、"ｑ" 、"ｒ" 、"ｓ" 、"ｔ" を有するヒト型化抗体
はキメラ抗体と同等のＰＴＨｒＰ結合能を示した（図８
〜11）。

【０２５７】（８）ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立ヒト型化抗体の安定産生細胞株を樹立するため、前記発
現プラスミドをＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１）に導入した。
すなわちヒト型化抗体の安定産生細胞株樹立は、ＣＨＯ
細胞用発現プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ
１とｈＭＢＣ１Ｌｍλ／ｐＣＯＳ１、またはｈＭＢＣ１
ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１とｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＣＯＳ
１、あるいはｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１とｈＭ
ＢＣ１Ｌｒλ／ｐＣＯＳ１との組み合わせで、Ｇｅｎｅ
Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いてエレクトロ
ポレーションによりＣＨＯ細胞に同時形質導入した。そ
れぞれの発現ベクターを制限酵素ＰｖｕＩで切断して直
鎖ＤＮＡにし、フェノールおよびクロロホルム抽出後、
エタノール沈殿でＤＮＡを回収し、エレクトロポレーシ
ョンに用いた。ＰＢＳ（−）中に１ｘ１０⁷細胞／ｍｌ
の細胞濃度で懸濁されているＣＨＯ細胞０．８ｍｌに、
各プラスミドＤＮＡ１０μｇを加え、１，５００Ｖ，２
５μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分
間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された
細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を添加した
ＭＥＭ―α培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、９６穴プレー
ト（Ｆａｌｃｏｎ）を用いてＣＯ₂インキュベーターに
て培養した。培養開始翌日に、１０％ウシ胎児血清（Ｇ
ＩＢＣＯ）および５００ｍｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩ
Ｎ（Ｇ４１８Ｓｕｌｆａｔｅ、ＧＩＢＣＯ）添加、リボ
ヌクレオシドおよびデオキリボヌクレオシド不含のＭＥ
Ｍ―α選択培地（ＧＩＢＣＯ）に交換し、抗体遺伝子の
導入された細胞を選択した。選択培地交換後、２週間前
後に顕微鏡下で細胞を観察し、順調な細胞増殖が認めら
れた後に、上記抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにて抗体産生量
を測定し、抗体産生能の高い細胞を選別した。

【０２５８】樹立した抗体の安定産生細胞株の培養を拡
大し、ローラーボトルにて２％のＵｌｔｒａＬｏｗＩｇ
Ｇウシ胎児血清添加、リボヌクレオシドおよびデオキリ
ボヌクレオシド不含のＭＥＭ―α選択培地を用いて、大
量培養を行った。培養３ないし４日目に培養上清を回収
し、０．２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に
より細胞破片を除去した。ＣＨＯ細胞の培養上清から
のヒト型化抗体の精製は、ＰＯＲＯＳプロテインＡカラ
ム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を
用いて、ＣｏｎＳｅｐＬＣ１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ）にて添付の処方に従って行い、中和活性の測定およ
び高カルシウム血症モデル動物での薬効試験に供した。
得られた精製ヒト型化抗体の濃度および抗原結合活性
は、上記ＥＬＩＳＡ系にて測定した。

【０２５９】〔実施例４〕中和活性の測定マウス抗体、キメラ抗体およびヒト型化抗体の中和活性
の測定は、ラット骨肉腫細胞株ＲＯＳ１７／２．８-５
細胞を用いて行った。すなわち、ＲＯＳ１７／２．８-
５細胞を、１０％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含むＨａ
ｍ'ＳＦ-１２培地（ＧＩＢＣＯ）中にて、ＣＯ₂インキ
ュベーターで培養した。ＲＯＳ１７／２．８-５細胞を
９６穴プレートに１０⁴細胞／１００μｌ／穴で蒔込
み、１日間培養し、４ｍＭのヒドロコルチゾンと１０％
牛胎児血清を含むＨａｍ'ＳＦ-１２培地（ＧＩＢＣＯ）
に交換する。さらに３ないし４日間培養した後、２６０
μｌのＨａｍ'ＳＦ-１２培地（ＧＩＢＣＯ）にて洗浄
し、１ｍＭのイソブチル-1-メチルキサンチン（ＩＢＭ
Ｘ、ＳＩＧＭＡ）および１０％の牛胎児血清と１０ｍＭ
のＨＥＰＥＳを含む８０μｌのＨａｍ'ｓＦ-１２を加
え、３０分間３７℃でインキュベートした。

【０２６０】中和活性を測定するマウス抗体、キメラ抗
体またはヒト型化抗体を、あらかじめ１０μｇ／ｍｌ、
３．３μｇ／ｍｌ、１．１μｇ／ｍｌおよび０．３７μ
ｇ／ｍｌの群、１０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、０．５
μｇ／ｍｌおよび０．０１μｇ／ｍｌの群、または１０
μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．
６３μｇ／ｍｌおよび０．３１μｇ／ｍｌの群に段階希
釈し、４ｎｇ／ｍｌに調製したＰＴＨｒＰ（１−３４）
と等量混合し、各抗体とＰＴＨｒＰ（１−３４）との混
合液８０μｌを各穴に添加した。各抗体の最終濃度は、
上記抗体濃度の４分の１になり、ＰＴＨｒＰ（１−３
４）の濃度は、１ｎｇ／ｍｌになる。１０分間室温にて
処理した後、培養上清を捨て、ＰＢＳにて３回洗浄した
した後、１００μｌの０．３％塩酸９５％エタノールに
て細胞内のｃＡＭＰを抽出する。水流アスピレーターに
て塩酸エタノールを蒸発させ、ｃＡＭＰＥＩＡｋｉ
ｔ（ＣＡＹＭＡＮＣＨＥＭＩＣＡＬ'Ｓ）付属のＥＩＡ
バッファー１２０μｌを添加してｃＡＭＰを抽出後、ｃ
ＡＭＰＥＩＡｋｉｔ（ＣＡＹＭＡＮＣＨＥＭＩＣＡ
Ｌ'Ｓ）添付の処方に従ってｃＡＭＰを測定した。その
結果、キメラ抗体と同等の抗原結合を有するＬ鎖バージ
ョンのうち、９１位のチロシンをイソロイシンに置換し
たバージョン”ｑ”、”ｒ”、”ｓ”、”ｔ”を有する
ヒト型化抗体がキメラ抗体に近い中和能を示し、その中
でも、バージョン”ｑ”がもっとも強い中和能を示した
（図12〜14）。

【０２６１】〔実施例５〕高カルシウム血症モデル動物
での薬効試験(1) ヒト腫瘍−ヌードマウス移植系の高カルシウム血症モデ
ル動物を用いて、ＰＴＨｒＰに対するキメラ抗体および
Ｌ鎖バージョン”ｍ”、”ｒ”および”ｑ”を有するヒ
ト型化抗体について高カルシウム血症に対する治療効果
を検討した。

【０２６２】高カルシウム血症モデル動物としてヒト膵
臓癌ＰＡＮ−７（（財）実験動物中央研究所より購入）
移植ヌードマウスを用いた。ヒト膵臓癌ＰＡＮ−７を移
植されたヌードマウスは、腫瘍の増加に伴い血中カルシ
ウム濃度が上昇し、体重減少や運動量の低下などの高カ
ルシウム血症を発症する。高カルシウム血症に対する治
療効果の検討は、キメラ抗体およびヒト型化抗体が、ヒ
ト膵臓癌ＰＡＮ−７によって引き起こされる高カルシウ
ム血症を改善することを、体重および血中カルシウム濃
度を指標にして評価した。

【０２６３】ヒト膵臓癌ＰＡＮ−７の継代は、ＢＡＬＢ
／ｃ−ｎｕ／ｎｕヌードマウス（日本チャールズリバ
ー）を用いてｉｎｖｉｖｏで行った。薬効評価には、
５週齢雄性ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕヌードマウス（日
本チャールズリバー）を購入し、１週間の馴化の後、６
週齢の動物を使用した。高カルシウム血症モデル動物の
作製および群分けは、以下のようにして行った。すなわ
ち、継代しているヒト膵臓癌ＰＡＮ−７を摘出し、３ｍ
ｍ角ブロックに細かく刻んだ腫瘍塊をマウスの脇腹皮下
に１匹あたり１個ずつ移植した。腫瘍塊移植後、２ない
し３週間して腫瘍体積が十分に大きくなったのを確認し
た後、腫瘍体積、血中カルシウム濃度および体重を指標
として各指標が平均化するように群分けし、高カルシウ
ム血症モデル動物とした。

【０２６４】高カルシウム血症に対する治療効果の検討
は、以下のようにして行った。すなわち、上記で作製、
群分けした高カルシウム血症モデル動物に、マウス１匹
あたり１０μｇまたは３０μｇのＰＴＨｒＰに対するキ
メラ抗体またはＬ鎖バージョンｍ、ｒを有するヒト型化
抗体を尾静脈内に単回投与した。Ｌ鎖バージョン”ｑ”
を有するヒト型化抗体は、マウス１匹あたり２０μｇま
たは６０μｇを尾静脈内に単回投与した。キメラ抗体お
よびヒト型化抗体投与後、１日、４日、７日、１１日目
に血中カルシウム濃度および体重を測定し、各抗体の薬
効評価を行った。腫瘍体積は、腫瘍の長径（ａｍｍ）お
よび短径（ｂｍｍ）を測定し、ギャランの計算式ａｂ²
／２により腫瘍体積として算出した。血中カルシウム濃
度は、眼窩よりヘマトクリット管で採血し、６４３自動
Ｃａ＋＋／ｐＨアナライザー（ＣＩＢＡ−ＣＯＲＮＩＮ
Ｇ）を用いて全血イオン化カルシウム濃度として測定し
た。

【０２６５】その結果、キメラ抗体およびＬ鎖バージョ
ン”ｍ”、”ｒ”および”ｑ”を有するヒト型化抗体を
投与することにより、体重および血中カルシウム濃度の
速やかな改善および持続性が認められた。このことか
ら、本発明のキメラ抗体およびヒト型化抗体の悪性腫瘍
に伴う高カルシウム血症治療薬としての有用性が示され
た（図15〜16）。

【０２６６】〔実施例６〕高カルシウム血症モデル動物
での薬効試験(2) ヒト腫瘍−ヌードマウス移植系の高カルシウム血症モデ
ル動物を用いて、ＰＴＨｒＰに対するキメラ抗体および
Ｌ鎖バージョン”ｑ”を有するヒト型化抗体について、
高カルシウム血症に対する治療効果を検討した。高カル
シウム血症に対する治療効果の検討は、以下のようにし
て行った。すなわち、上記で作製、群分けした高カルシ
ウム血症モデル動物に、マウス１匹あたり10μgまたは3
0μgのPTHrP に対するキメラ抗体またはL鎖バージョ
ン”q”を有するヒト型化抗体を尾静脈内に単回投与し
た。キメラ抗体およびヒト型化抗体投与後、１日、３
日、７日、10日目に血中カルシウム濃度および体重を測
定し、各抗体の薬効評価を行った。血中カルシウム濃度
は、眼窩よりヘマトクリット管で採血し、643自動Ca++
／pHアナライザー（CIBA-CORNING) を用いて全血イオン
化カルシウム濃度として測定した。

【０２６７】その結果、ヒト膵臓癌PAN-7移植高カルシ
ウム血症モデルにおいて、キメラ抗体およびL鎖バージ
ョン”q”を有するヒト型化抗体を投与することによ
り、体重および血中カルシウム濃度の速やかな改善およ
び待続性が認められた。このことから、本発明のキメラ
抗体およびヒト型化抗体の悪性腫瘍に伴う高カルシウム
血症治療薬としての有用性が示された（図17）。

【０２６８】〔実施例７〕高カルシウム血症モデル動物
での薬効試験(3) ヒト腫瘍-ヌードマウス移植系の高カルシウム血症モデ
ル動物（ヒト肺癌ＬＣ−６移植高カルシウム血症モデ
ル）を用いて、ＰＴＨｒＰに対するキメラ抗体および
L鎖バージョン”q”を有するヒト型化抗体について高カ
ルシウム血症に対する治療効果を検討した。高カルシウ
ム血症モデル動物としてヒト肺癌LC-6（（財）実験動物
中央研究所より購入）移植ヌードマウスを用いた。ヒト
肺癌LC-6を移植されたヌードマウスは、腫瘍の増加に伴
い血中カルシウム濃度が上昇し、体重減少や運動量の低
下などの高カルシウム血症を発症する。

【０２６９】高カルシウム血症に対する治療効果の検討
は、キメラ抗体およびヒト型化抗体が、ヒト肺癌LC-6に
よって引き起こされる高カルシウム血症を改善すること
を、体重および血中カルシウム濃度を指標にして評価し
た。ヒト肺癌LC-6の継代は、BALB/c-nu/nuヌードマウス
（日本チャールズリバー）を用いてin vivo で行った。
薬効評価には、５週齢雄性BALB/c-nu/nuヌードマウス
（日本チャールズリバー）を購入し、１週間の馴化の
後、６週齢の動物を使用した。

【０２７０】高カルシウム血症モデル動物の作製および
群分けは、以下のようにして行った。すなわち、継代し
ているヒト肺癌LC-6を摘出し、3mm 角ブロックに細かく
刻んだ腫瘍塊をマウスの脇腹皮下に１匹あたり１個ずつ
移植した。腫瘍塊移植後、２ないし３週間して腫瘍体積
が十分に大きくなったのを確認した後、腫瘍体積、血中
カルシウム濃度および体重を指標として各指標が平均化
するように群分けし、高カルシウム血症モデル動物とし
た。

【０２７１】高カルシウム血症に対する治療効果の検討
は、以下のようにして行った。すなわち、上記で作製、
群分けした高カルシウム血症モデル動物に、マウス１匹
あたり10μgまたは30μgのPTHrP に対するキメラ抗体ま
たはL鎖バージョン”q”を有するヒト型化抗体を尾静脈
内に単回投与した。キメラ抗体およびヒト型化抗体投与
後、１日、３日、６日、10日目に血中カルシウム濃度お
よび体重を測定し、各抗体の薬効評価を行った。血中カ
ルシウム濃度は、眼窩よりヘマトクリット管で採血し、
643自動Ca++/pH アナライザー（CIBA-CORNING）を用い
て全血イオン化カルシウム濃度として測定した。

【０２７２】その結果、ヒト肺癌LC-6移植高カルシウム
血症モデルにおいて、キメラ抗体およびL鎖バージョ
ン”q”を有するヒト型化抗体を投与することにより、
体重および血中カルシウム濃度の速やかな改善および持
続性が認められた。このことから、本発明のキメラ抗体
およびヒト型化抗体の悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症
治療薬としての有用性が示された（図18）。

【０２７３】〔実施例８〕BIACORE を用いたPTHrPと抗P
THrP抗体の相互作用における速度論的解析 BIACORE を用いて、抗原抗体反応の速度論的解析を行っ
た。抗原としてPTHrP(1-34+Cys) を用い、Ｃ末端部位特
異的にセンサーチップ上に固定化し、種々の濃度に調製
した精製抗体をアナライトとした。得られたセンサーグ
ラムから、カイネティクスパラメーター（結合速度定数
kass及び解離速度定数kdiss)を算出した。速度論的解析
に関して、文献「Kinetic analysis of monoclonal ant
ibody-antigen interactions with a new biosensor ba
sed analytical system 」(Karlsson,R. et al.,(1991)
J.Immunol.Methods 145,p229-240.) を参考にした。

【０２７４】(1) センサーチツプヘのPTHrP（1-34＋C）
の固定化センサーチップ CM5(Pharmacia）へPTHrP（1-34＋C）を
固定化する。ランニングバッファーとしてHBS(10mM HEP
ES pH7.4，0.15M NaCl, 3.4mM EDTA, 0.005％ Surfacta
nt P20）を用い、流速は５μl/分とした。センサーチッ
プCM5 上のカルボキシメチルデキストランのカルボキシ
ル基を100 μl の0.05M N-ヒドロキシコハク酸イミド(N
HS)/0.2M塩酸 N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピ
ル)-カルボジイミド(EDC) のインジェクトおよび100 μ
l の80mM塩酸 2-(2-ピリジニルジチオ) エタンアミン(P
DEA)/0.1M ホウ酸緩衝液 pH8.5のインジェクトにより活
性化した。引き続き、10μl の5 μg/ml PTHrP（1-34＋
C)/ 10mM酢酸ナトリウム緩衝液 pH5.0をインジェクト
し、PTHrP(1-34＋C)のC末端のCys残基特異的に固定化し
た。さらに、100 μl の50mM (L)-システイン/1M NaCl/
0.1M 蟻酸ナトリウム緩衝液 pH4.3をインジェクトする
ことにより、過剰の活性基をブロックした。さらに、10
μl の0.1Mグリシン-塩酸緩衝液 pH2.5および10μl の1
0mM塩酸をインジェクトすることにより、非共有結合を
している物質を洗浄した。このときのPTHrP(1-34＋C)の
固定量は、226.4 RU(resonance units) であった（図１
９）。

【０２７５】(2) 固定化PTHrP(1-34＋C)とマウス抗PTHr
P精製抗体との相互作用ランニングバッファーとしてHBSを用い、流速は20μl/
分とした。抗体は、ハイブリドーマ細胞をBalb/cマウス
に腹水化し、採取した腹水をプロテインA カラムを用い
て精製した。精製した#23-57-137-1抗体をMBC、精製し
た3F5 抗体を3F5と表記した。これらの抗体を、HBSを用
いて1.25、2.5 、5 、10、20μg/mlの濃度に調製した。
分析は、抗体溶液の40μl をインジェクトする2分間を
結合相とし、その後HBSに切り換え、２分間の解離相と
した。解離相終了後、10μl の10mM塩酸をインジェクト
することにより、センサーチツプを再生した。この結合
・解離・再生を分析の１サイクルとし、各種抗体溶液を
インジェクトし、センサーグラムを得た。

【０２７６】(3) 固定化PTHrP(1-34＋C)とヒト型化抗PT
HrP 精製抗体との相互作用ランニングバッファーとしてHBSを用い、流速は20μl/
分とした。抗体は、CHO細胞に産生させ、プロテインA
カラムを用いて精製した。精製したキメラ抗体をchMB
C、精製したヒト型化抗体バージョンm をhMBCm 、バー
ジョンq をhMBCqと表記した。これらの抗体を、HBSを用
いて1.25、2.5 、5 、10、20μg/mlの濃度に調製した。
分析は、抗体溶液の40μl をインジェクトする2分間を
結合相とし、その後HBSに切り換え、2分間の解離相とし
た。解離相終了後、10μl の10mM HClをインジェクトす
ることにより、センサーチツプを再生した。この結合・
解離・再生を分析の１サイクルとし、各種抗体溶液をイ
ンジェクトし、センサーグラムを得た。

【０２７７】(4) 相互作用の速度論的解析目的のデータファイルを読み込み、目的の反応領域につ
いて重ね書きによる反応パターンの比較を行った（図２
０〜２４）。さらに、カーブフィッティングによるカイ
ネティクスパラメーター（結合速度定数kassおよび解離
速度定数kdiss)の算定を行うBIACORE 専用の解析ソフト
ウエアである「BIAevaluation 2.1 」(Pharmacia) を用
いて、相互作用の速度論的解析を行った（表４〜５）。
なお、図２０〜２４において、各曲線は、図の上方から
下方に向かってそれぞれ1.25、2.5 、5 、10、20μg/ml
の抗体濃度のものである。

【０２７８】

【表４】

【０２７９】

【表５】

【０２８０】なお、結合速度定数を求める際には、解析
モデルタイプ４を用いた（BIAevaluation 2.1 Software
Handbook, A1〜A5) 。

【０２８１】〔実施例９〕悪性腫瘍随伴性高カルシウム
血症モデルでのリン排泄抑制作用悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症（HHM）は腫瘍が産生
するPTHrPがその原因物質であり、PTHrPは骨吸収および
腎尿細管でのカルシウム再吸収を亢進し、高カルシウム
血症を惹起することが知られている。一方、リンに関し
ては、PTHrPは腎尿細管において再吸収を抑制する結
果、排泄促進作用を示し、臨床HHM患者においてしばし
ば低リン血症が認められる。そこで、ラット悪性腫瘍随
伴性高カルシウム血症モデルを用いて、ヒト型化抗PTHr
P抗体の腎におけるリン排泄に対する効果を検討した。

【０２８２】モデル動物としてヒト肺癌株LC-6（（財）
実験動物中央研究所より購入）を移植したヌードラット
を用いた。ヒト肺癌株LC-6を皮下移植されたヌードラッ
トは、腫瘍の増加に伴い血中カルシウム濃度が上昇し、
体重減少や運動量の低下などの高カルシウム血症症状を
呈する。本モデルを用い、腎クリアランス法にてヒト型
化抗PTHrP抗体の腎におけるリン排泄に対する効果をリ
ン排泄率（後述）を指標に評価した。ヒト肺癌株LC-6の
継代は、BALB/c-nu/nuヌードマウス（日本クレア）を用
いてin vivoで行った。薬効評価には、5週齢雄性F344/N
Jcl-rnuヌードラット（日本クレア）を購入し、１週間
の馴化の後、6週齢の動物を使用した。

【０２８３】悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症モデルの
作製は、以下のようにして行った。すなわち、継代して
いるヒト肺癌株LC-6腫瘍を摘出し、3mm角ブロックに細
かく刻んだ腫瘍塊をラットの脇腹皮下に１匹あたり１個
ずつ移植した。腫瘍塊移植後、30日目前後に腫瘍体積が
十分に大きくなった（3000mm³）のを確認した後、血中
カルシウム濃度、体重を指標として悪性腫瘍随伴性高カ
ルシウム血症モデル動物とした。腎クリアランス法によ
るリン排泄の検討は、以下のようにして行った。

【０２８４】（1）腎クリアランス法悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症モデル動物をペントバ
ルビタール（ネンブタール、大日本製薬(株)）で麻酔
し、37℃の保温マット上に背位固定し、採尿用に膀胱カ
ニューレ（ポリエチレンチューブ、PE50、日本ベクトン
ディッキンソン）を挿入した。次に大腿静脈にインフュ
ージョン用にカニューレ（ポリエチレンチューブ、PE1
0、日本ベクトンディッキンソン）を挿入し、インフュ
ージョン溶液（組成： 0.7% イヌリン、 5% マンニトー
ル、0.2%ペントバルビタール、0.9%塩化ナトリウム）を
インフュージョンポンプ（テルフュージョンシリンジポ
ンプ、STC-525、テルモ）にて流速2 ml/hrでインフュー
ジョンした。50分間の平衡化の後、20分間間隔で5回
（ピリオド-1からピリオド-5まで）の採尿を膀胱カニュ
ーレより行い、尿サンプルとした。また各採尿の中間点
において，右頚静脈より血液サンプルをヘパリン処理し
た注射筒にて約0.25ml採取した。

【０２８５】（2）抗体の投与上記したクリアランス実験のピリオド-2の採尿開始時点
で、ヒト型化抗PTHrP抗体を1mg/ml/kg 静脈内投与し
た。（3）尿中および血中イヌリンおよびリン濃度測定ピリオド-1からピリオド-5より得られた尿サンプルは尿
量を測定後、イヌリンおよびリン濃度を測定した。また
同様に得られた血液サンプルは冷却遠心分離後、血漿サ
ンプルとしてイヌリンおよびリン濃度を測定した。イヌ
リン濃度はアンスロン-硫酸法（Roe,J.H.ら、J Biol Ch
em 178, 839-845, 1949）にて測定した。リン濃度は日
立自動分析装置7170型にて無機リン測定用試薬、オート
セラIP（第一化学薬品）を用いて、測定のマニュアル通
りに測定した（フィスケ・サバロー法）。

【０２８６】（4）イヌリンクリアランス、リンクリア
ランスおよびリン排泄率の算出イヌリンクリアランス（inulin clearance、Cin）、リ
ンクリアランス（phosphate clearance、Cp）およびリ
ン排泄率（fractional excretion of phosphate、FEp）
は以下の式により算出した。

【０２８７】イヌリンクリアランス（inulin clearanc
e、Cin）の算出 Cin = Uin V / Pin Cinはイヌリンクリアランス（ml/kg/min）を表す。 Uin
は尿中イヌリン濃度（mg/ml）を表す。 Vは単位時間当
たりの尿量（ml/kg/min）を表す。 Pinは血中イヌリン
濃度（mg/ml）を表す。

【０２８８】リンクリアランス（phosphate clearance、Cp）の算出 Cp = Up V / Pp Cpはリンクリアランス（ml/kg/min）を表す。 Up は尿
中リン濃度（mg/ml）を表す。 Vは単位時間当たりの尿
量（ml/kg/min）を表す。 Pp は血中リン濃度（mg/ml）
を表す。

【０２８９】リン排泄率（fractional excretion of ph
osphate、FEp）の算出 FEp = Cp / Cin FEpはリン排泄率を表す。 Cinはイヌリンクリアランス
（ml/kg/min）を表す。Cpはリンクリアランス（ml/kg/m
in）を表す。実験は4匹の動物を用いて行った。結果は
その平均値±標準誤差で示す。

【０２９０】リン排泄率および血中リン濃度の結果を図
25および図26に示す。図25はクリアランスの各ピリオド
（１ピリオドは２０分間）と、腎からのリン排泄率（＝
リンクリアランス／イヌリンクリアランス）との関係を
示すグラフである。なお、ヒト型化抗PTHrP抗体、１mg/
kg（i.v.）はピリオド-2のはじめに投与した。

【０２９１】図26はクリアランスの各ピリオド（１ピリ
オドは２０分間）と、血漿中のリン濃度との関係を示す
グラフである。ヒト型化抗PTHrP抗体、１mg/kg（i.v.）
はピリオド-2のはじめに投与した。以上の結果より、抗
体投与前のリン排泄率(ピリオド-1)に対して、抗体投与
後のリン排泄率（ピリオド-2からピリオド-5）は明らか
な抑制を示した。すなわち、中和抗体を投与すること
で、リン排泄亢進（FEp>0.2）により低リン血症状態を
呈する病態に対してリン再吸収を正常化レベル（リン再
吸収率＝1-FEp＞0.8%）付近まで回復させ、その結果、
血中リン濃度が正常化する傾向が示された。このよう
に、PTHrPが原因で起こるリン排泄亢進や低リン血症な
どの治療薬として本抗体の有用性が示された。

【０２９２】PTHrP は悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症
の原因物質であるため、PTHrPによるリン排泄の増加や
組織中高エネルギー有機リン酸濃度の低下が予想され
る。従って、低リン血症を伴う疾患、例えば低リン血性
くる病、低リン血性ビタミンＤ抵抗性くる病などでは尿
中へのリン排泄増加が主たる病因であり、本抗体にはこ
れら疾患の治療薬として有用である。

【０２９３】〔実施例10〕悪性腫瘍随伴性高カルシウム
血症の臨床諸症状の改善悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症は腫瘍が産生するＰＴ
ＨｒＰがその原因物質であり、ＰＴＨｒＰは骨吸収およ
び腎尿細管でのカルシウム再吸収を亢進し、高カルシウ
ム血症を惹起することが知られている。また、悪性腫瘍
に伴う高カルシウム血症では、Performance statusの悪
化、意識障害、全身倦怠感、口渇感や悪心・嘔吐（食欲
不振）などの臨床症状の悪化が認められる。これら臨床
症状に対する抗ＰＴＨｒＰ抗体の効果をヒト腫瘍−ヌー
ドマウス移植系およびヒト腫瘍−ヌードラット移植系の
高カルシウム血症モデル動物を用いて検討した。

【０２９４】高カルシウム血症モデル動物としてヒト肺
癌ＬＣ−６（（財）実験動物中央研究所より購入）移植
ヌードマウスおよびヌードラットを用いた。ヒト肺癌Ｌ
Ｃ−６を移植されたヌードマウスおよびヌードラット
は、腫瘍の増加に伴い血中カルシウム濃度が上昇し、体
温低下、体重減少や運動量の低下などの高カルシウム血
症症状を発症する。

【０２９５】悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症の一般臨
床症状に対するマウス抗ＰＴＨｒＰ抗体の改善効果を、
ヒト肺癌ＬＣ−６−ヌードマウス移植系を用いて写真で
示した。また、運動量の改善、体温改善並びに摂食量低
下の改善効果は、ヒト肺癌ＬＣ−６−ヌードラット移植
系を用いて評価した。

【０２９６】１．高カルシウム血症に伴う外観上の臨床
症状の改善ヒト肺癌ＬＣ−６の継代は、ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ
ヌードマウス（日本クレア）を用いてｉｎｖｉｖｏで
行った。薬効評価には、５週齢雄性ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ
／ｎｕヌードマウス（日本クレア）を購入し、１週間の
馴化の後、６週齢の動物を使用した。

【０２９７】高カルシウム血症モデル動物の作製および
群分けは、以下のようにして行った。すなわち、継代し
ているヒト肺癌ＬＣ−６を摘出し、３ｍｍ角ブロックに
細かく刻んだ腫瘍塊をマウスの脇腹皮下に１匹あたり１
個ずつ移植した。腫瘍塊移植後、２７日目して腫瘍体積
が十分に大きくなったのを確認した後、腫瘍体積、血中
カルシウム濃度および体重を指標として各指標が平均化
するように群分けし、高カルシウム血症モデル動物とし
た。

【０２９８】腫瘍体積は、腫瘍の長径（ａｍｍ）および
短径（ｂｍｍ）を測定し、ギャランの計算式ａｂ²／２
により腫瘍体積として算出した。血中カルシウム濃度
は、眼窩よりヘマトクリット管で採血し、６４３自動Ｃ
ａ＋＋／ｐＨアナライザー（ＣＩＢＡ−ＣＯＲＮＩＮ
Ｇ）を用いて全血イオン化カルシウム濃度として測定し
た。

【０２９９】高カルシウム血症に対する治療効果の検討
は、以下のようにして行った。すなわち、上記で作製、
群分けした高カルシウム血症モデル動物に、マウス１匹
あたり１００μｇのＰＴＨｒＰに対するマウス抗体を、
腫瘍移植後、２７、３０、３４、３７日目に尾静脈内に
投与した。対照群には、リン酸緩衝生理食塩水を同様に
尾静脈内に投与した。抗体投与群並びに対照群の中から
典型的な１匹をそれぞれ選び、正常動物とともに、腫瘍
移植４１日目に写真撮影を行った。

【０３００】その結果、ヒト肺癌ＬＣ−６移植高カルシ
ウム血症モデルにおいて、抗体投与動物（図27の中央及
び図28の中央）は、対照動物（図27の右及び図28の右）
と同程度の腫瘍塊を保持するにも関わらず正常動物（図
27の左及び図28の左）と同等の外見を呈し、抗ＰＴＨｒ
Ｐ抗体投与により外見上の臨床症状の改善が認められた
（図27及び28）。

【０３０１】２．高カルシウム血症に伴う運動量低下の
改善ヒト肺癌株ＬＣ−６の継代は、ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎ
ｕヌードマウス（日本クレア）を用いてｉｎｖｉｖｏ
で行った。薬効評価には、5週齢雄性Ｆ３４４／ＮＪ
ｃｌ−ｒｎｕヌードラット（日本クレア）を購入し、１
週間の馴化の後、６週齢の動物を使用した。

【０３０２】悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症モデルの
作製は、以下のようにして行った。すなわち、継代して
いるヒト肺癌株ＬＣ−６を摘出し、３ｍｍ角ブロックに
細かく刻んだ腫瘍塊をラットの脇腹皮下に１匹あたり１
個ずつ移植した。腫瘍塊移植後、３０日目前後に腫瘍体
積が十分に大きくなったのを確認した後、血中カルシウ
ム濃度、体重を指標として悪性腫瘍随伴性高カルシウム
血症モデル動物とした。血中カルシウム濃度は、眼窩よ
りヘマトクリット管で採血し、６４３自動Ｃａ＋＋／ｐ
Ｈアナライザー（ＣＩＢＡ−ＣＯＲＮＩＮＧ）を用いて
全血イオン化カルシウム濃度として測定した。

【０３０３】（1）自発運動量測定法自発運動量の測定は自発運動量測定装置アニメックス
（ANIMEX activity meter type SE、FARAD Electronics、
Sweden)を用いて、個体毎に個別飼育しているポリ製ケ
ージ（給水、給餌下）を装置の所定の位置に置き行っ
た。この装置はラットの運動量を計測するもので、一定
時間当たりのカウントとして記録される。測定は午後７
時から翌日午前８時までの１３時間行い、測定結果は１
時間当たりのカウント数とした。

【０３０４】（2）抗体の投与上記したように高カルシウム血症を発症したラットを用
い、ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体を５ｍｇ／０．５ｍｌ／
ｋｇ尾静脈内投与した。また、対照には、生理食塩水を
同様に尾静脈内に投与した。測定は抗体投与個体と対照
個体を交互に測定した。測定日は抗体投与個体は抗体投
与０（投与前日）、２、４、７、１４日目に、また対照
個体は１、３、５、８、１５日目に行った。その結果、
対照個体の自発運動量は実験期間中変化がないかまたは
減少傾向を示すのに対して、抗体投与個体は４日目以降
自発運動量の増加が認められた（図29）。

【０３０５】３．高カルシウム血症に伴う体温低下の改
善ヒト肺癌株ＬＣ−６の継代および悪性腫瘍随伴性高カル
シウム血症モデルの作製は、上記２で示した方法と同様
に実施した。（1）体温測定法体温の測定はデジタル温度計を用い、個体はペントバル
ビタール（ネンブタール、大日本製薬（株））で麻酔
し、温度センサープローブを直腸に挿入して行った。

【０３０６】（2）抗体の投与上記したように高カルシウム血症を発症したラットを用
い、ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体を１ｍｇ／ｍｌ／ｋｇ尾
静脈内投与した。また、対照には、生理食塩水を同様に
尾静脈内に投与した。さらに、正常ラット（無投与）の
体温についても同時に測定した。体温測定は抗体投与個
体、対照個体および正常ラットいずれも、投与０（投与
当日）、１、２、３日目に行った。

【０３０７】その結果、正常ラットの体温は実験期間中
34.2〜34.4℃とほとんど変化なく推移した。悪性腫瘍随
伴性高カルシウム血症ラットでは、正常ラットに比べ、
約2℃の体温の低下が認められた。このモデルにヒト型
化抗ＰＴＨｒＰ抗体を投与すると、投与３日目で正常ラ
ットの体温まで回復することが確認された。このよう
に、ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体は悪性腫瘍随伴性高カル
シウム血症モデルでの体温低下に対して改善する作用を
有することが示された（図30）。

【０３０８】４．高カルシウム血症に伴う摂食量低下の
改善ヒト肺癌株ＬＣ−６の継代および悪性腫瘍随伴性高カル
シウム血症モデルの作製は、上記２で示した方法と同様
に実施した。作製したモデルは血中カルシウム濃度およ
び体重を指標として各指標が平均化するように群分け
し、以下の実験に使用した。（1）摂食量測定法ラットは実験期間中、個別飼育用の代謝ケージに入れ、
給水、給餌下で飼育した。摂食量は当日午前９時から翌
日午前９時までの２４時間摂食量とし、給餌器の重量を
測定し、予め測定した重量（風袋重量）との差をその個
体の摂食量（ｇ）とした。

【０３０９】（2）抗体の投与上記したように高カルシウム血症を発症したラット（Ｈ
ＨＭラット）を用い、ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体を５ｍ
ｇ／０．５ｍｌ／ｋｇ尾静脈内投与した。また、対照群
には、生理食塩水を同様に静脈内に投与した。さらに、
正常ラットについても生理食塩水を同様に尾静脈内に投
与した。摂食量測定は、抗体投与群、対照群および正常
ラット群のいずれも、投与０（投与前日から当日）、１
（投与当日から翌日）、３（投与３日目から翌日）、５
日目（投与５日目から翌日）に行った。

【０３１０】その結果、投与前値の摂食量は高カルシウ
ム血症ラット（個体５から９）では平均で８．１１ｇで
あり、正常ラットは平均１２．０６ｇであった。このよ
うに明らかに高カルシウム血症ラットでは摂食量の低下
が認められた。このモデルにヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体
を投与すると、対照群ではあまり摂食量に変化がないの
に比べ、抗体投与群では投与１日目以降正常ラットの摂
食量まで回復することが確認された。このように、ヒト
型化抗ＰＴＨｒＰ抗体は悪性腫瘍随伴性高カルシウム血
症モデルでの摂食量低下に対して改善する作用のあるこ
とが示された（表６）。

【０３１１】

【表6】

【０３１２】以上の結果より、本発明のキメラ抗体およ
びヒト型化抗体の悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の臨
床諸症状の改善薬としての有用性が示された。５．高カルシウム血症に伴う血液ｐＨの改善ヒト肺癌株ＬＣ−６の継代および悪性腫瘍随伴性高カル
シウム血症モデルの作製は、上記２で示した方法と同様
に実施した。作製したモデルは血中カルシウム濃度およ
び体重を指標として各指標が平均化するように群分け
し、以下の実験に使用した。 (1)血液ｐＨ測定法血液ｐＨは、ヘパリン処理した注射筒を用い、心臓採血
法にて血液を採取し、６４３自動Ｃａ++／ｐＨアナライ
ザー(CIBA-CORNING)を用いて血液ｐＨを測定した。

【０３１３】（2）抗体の投与上記したように高カルシウム血症を発症したラット（Ｈ
ＨＭラット）を用い、ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体を５ｍ
ｇ／０．５ｍｌ／ｋｇ尾静脈内投与した(ｎ＝３)。ま
た、対照群には、生理食塩水を同様に静脈内に投与した
(ｎ＝２)。血液ｐＨ測定は、抗体投与群および対照群の
いずれも、投与０（投与当日）、１、７日目に行った。
結果は各群ともにその平均値で示した。

【０３１４】その結果、高カルシウム血症ラットの抗体
投与前の血液ｐＨは約7.49であり（正常ラットの血液ｐ
ＨはｐＨ7.40±0.02）、本モデルは明らかに代謝性アル
カローシスの病態を示していた。このモデルにヒト型化
抗ＰＴＨｒＰ抗体を投与すると、対照群ではほとんど血
液ｐＨの変化はないのに比べ、抗体投与群では投与7日
目には正常ラットの血液ｐＨに近い値まで改善している
ことが確認された。悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症
（ＨＨＭ）における臨床諸症状の一つに腎臓での重炭酸
イオン（ＨＣＯ₃ ^-）の排泄阻害に基づく代謝性アルカロ
ーシスが報告されている。ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体の
投与は本モデルで血液ｐＨを正常化したことから、ＨＨ
Ｍで見られる代謝性アルカローシスを改善する作用を有
することが示された(図31)。以上の結果より、本発明の
キメラ抗体及びヒト型化抗体は、悪性腫瘍に伴う高カル
シウム血症の臨床諸症状を改善するための改善薬として
有用であることが示された。

【０３１５】

【発明の効果】本発明により、ＰＴＨｒＰに対する抗
体、キメラ抗体およびヒト型化抗体が提供される。これ
らの抗体は、ヒトにおける抗原性が低いことから、高カ
ルシウム血症、低リン血症等の治療薬として有用であ
る。

【０３１６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： AAATAGCCCT TGACCAGGCA 20

【０３１７】配列番号：２配列の長さ：３８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 38

【０３１８】配列番号：３配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG 28

【０３１９】配列番号：４配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GGATCCCGGG TCAGRGGAAG GTGGRAACA 29

【０３２０】配列番号：５配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GTTTTCCCAG TCACGAC 17

【０３２１】配列番号：６配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CAGGAAACAG CTATGAC 17

【０３２２】配列番号：７配列の長さ：３１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GTCTAAGCTT CCACCATGAA ACTTCGGGCT C 31

【０３２３】配列番号：８配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： TGTTGGATCC CTGCAGAGAC AGTGACCAGA 30

【０３２４】配列番号：９配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GTCTGAATTC AAGCTTCCAC CATGGGGTTT GGGCTG ３６

【０３２５】配列番号：１０配列の長さ：４１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列：ＴＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧ
ＧＴＧＡＣＣＡＧ 41

【０３２６】配列番号：１１配列の長さ：１０９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCCCACGGTC ACCCTGTTCC 60 CGCCCTCCTC TGAGGAGCTC CAAGCCAACA AGGCCACACT AGTGTGTCT 109

【０３２７】配列番号：１２配列の長さ：１１０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GGTTTGGTGG TCTCCACTCC CGCCTTGACG GGGCTGCCAT CTGCCTTCCA GGCCACTGTC 60 ACAGCTCCCG GGTAGAAGTC ACTGATCAGA CACACTAGTG TGGCCTTGTT １１
０

【０３２８】配列番号：１３配列の長さ：９８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列：ＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＣ
ＡＡＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣ 60 CTGAGCCTGA CGCCCGAGCA GTGGAAGTCC CACAGAAG 98

【０３２９】配列番号：１４配列の長さ：１０６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： TGTTGAATTC TTACTATGAA CATTCTGTAG GGGCCACTGT CTTCTCCACG GTGCTCCCTT 60 CATGCGTGAC CTGGCAGCTG TAGCTTCTGT GGGACTTCCA CTGCTC 106

【０３３０】配列番号：１５配列の長さ：４３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCC ４３

【０３３１】配列番号：１６配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列：ＴＧＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＡＴＧＡＡ
20

【０３３２】配列番号：１７配列の長さ：３９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CAACAAGTAC GCGGCCAGCA GCTACCTGAG CCTGACGCC 39

【０３３３】配列番号：１８配列の長さ：３９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GTAGCTGCTG GCCGCGTACT TGTTGTTGCT CTGTTTGGA 39

【０３３４】配列番号：１９配列の長さ：４６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GTCTGAATTC AAGCTTAGTC CTAGGTCGAA CTGTGGCTGC ACCATC 46

【０３３５】配列番号：２０配列の長さ：３４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： TGTTGAATTC TTACTAACAC TCTCCCCTGT TGAA 34

【０３３６】配列番号：２１配列の長さ：３５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GTCTAAGCTT CCACCATGGC CTGGACTCCT CTCTT 35

【０３３７】配列番号：２２配列の長さ：４８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： TGTTGAATTC AGATCTAACT ACTTACCTAG GACAGTGACC TTGGTCCC 48

【０３３８】配列番号：２３配列の長さ：１２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG AGCTGGGTTT TCCTCGTTGC TCTTTTAAGA 60 GGTGTCCAGT GTCAGGTGCA GCTGGTGGAG TCTGGGGGAG GCGTGGTCCA GCCTGGGAGG 120 TCCCTGAG 128

【０３３９】配列番号：２４配列の長さ：１２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： ACCATTAGTA GTGGTGGTAG TTACACCTAC TATCCAGACA GTGTGAAGGG GCGATTCACC 60 ATCTCCAGAG ACAATTCCAA GAACACGCTG TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAGAGCTGAG 120 GACAC 125

【０３４０】配列番号：２５配列の長さ：１３２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CTACCACCAC TACTAATGGT TGCCACCCAC TCCAGCCCCT TGCCTGGAGC CTGGCGGACC 60 CAAGACATGC CATAGCTACT GAAGGTGAAT CCAGAGGCTG CACAGGAGAG TCTCAGGGAC 120 CTCCCAGGCT GG 132

【０３４１】配列番号：２６配列の長さ：１１０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG GTTCCCTGGC CCCAGTAAGC AAAGTAAGTC 60 ATAGTAGTCT GTCTCGCACA GTAATACACA GCCGTGTCCT CAGCTCTCAG 110

【０３４２】配列番号：２７配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG ３０

【０３４３】配列番号：２８配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列：ＴＧＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧ
30

【０３４４】配列番号：２９配列の長さ：１３３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： ACAAAGCTTC CACCATGGCC TGGACTCCTC TCTTCTTCTT CTTTGTTCTT CATTGCTCAG 60 GTTCTTTCTC CCAGCTTGTG CTGACTCAAT CGCCCTCTGC CTCTGCCTCC CTGGGAGCCT 120 CGGTCAAGCT CAC 133

【０３４５】配列番号：３０配列の長さ：１１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： AGCAAGATGG AAGCCACAGC ACAGGTGATG GGATTCCTGA TCGCTTCTCA GGCTCCAGCT 60 CTGGGGCTGA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGTC TGAGGATGAG GCTGACTA 118

【０３４６】配列番号：３１配列の長さ：１２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CTGTGGCTTC CATCTTGCTT AAGTTTCATC AAGTACCGAG GGCCCTTCTC TGGCTGCTGC 60 TGATGCCATT CAATGGTGTA CGTACTGTGC TGACTACTCA AGGTGCAGGT GAGCTTGACC 120 GAGGCTCC 128

【０３４７】配列番号：３２配列の長さ：１１４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CCCTCACAAA 60 TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GTAATAGTCA GCCTCATCCT CAGA 114

【０３４８】配列番号：３３配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： ACAAAGCTTC CACCATG 17

【０３４９】配列番号：３４配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CTTGGATCCG GGCTGACCT 19

【０３５０】配列番号：３５配列の長さ：７５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA 60 TTGTTCCTTA ATTGT 75

【０３５１】配列番号：３６配列の長さ：４３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： AAAGGATCCT TAAGATCCAT CAAGTACCGA GGGGGCTTCT CTG 43

【０３５２】配列番号：３７配列の長さ：４６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： ACAAAGCTTA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGCC TGAGGA 46

【０３５３】配列番号：３８配列の長さ：１１１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA 60 TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GATATAGTCA GCCTCATCCT C 111

【０３５４】配列番号：３９配列の長さ：４２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CTTCTCTGGC TGCTGCTGAT ACCATTCAAT GGTGTACGTA CT ４２

【０３５５】配列番号：４０配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列：ＣＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧ
26

【０３５６】配列番号：４１配列の長さ：３５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GAGAAGGGCC CTARGTACST GATGRAWCTT AAGCA 35

【０３５７】配列番号：４２配列の長さ：３５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CACGAATTCA CTATCGATTC TGGAACCTTC AGAGG 35

【０３５８】配列番号：４３配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GGCTTGGAGC TCCTCAGA 18

【０３５９】配列番号：４４配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GACAGTGGTT CAAAGTTTTT 20

【０３６０】配列番号：４５配列の長さ：１１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Pro Lys 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg 65 70 75 Tyr Leu Ser Ile Ser Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Met Tyr 80 85 90 Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro 110 115

【０３６１】配列番号：４６配列の長さ：１１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60 Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe 95 100 105 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 110 115

【０３６２】配列番号：４７配列の長さ：１１６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 110 115

【０３６３】配列番号：４８配列の長さ：１１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 110 115

【０３６４】配列番号：４９配列の長さ：１１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 110 115

【０３６５】配列番号：５０配列の長さ：１１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 110 115

【０３６６】配列番号：５１配列の長さ：１１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 110 115

【０３６７】配列番号：５２配列の長さ：１１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 110 115

【０３６８】配列番号：５３配列の長さ：１１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 110 115

【０３６９】配列番号：５４配列の長さ：１１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 110 115

【０３７０】配列番号：５５配列の長さ：１１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 110 115

【０３７１】配列番号：５６配列の長さ：１１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60 Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe 95 100 105 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115

【０３７２】配列番号：５７配列の長さ：４１１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列： ATG AAC TTC GGG CTC AGC TTG ATT TTC CTT GCC CTC ATT TTA AAA 45 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys -15 -10 -5 GGT GTC CAG TGT GAG GTG CAA CTG GTG GAG TCT GGG GGA GAC TTA 90 Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu 1 5 10 GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135 Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 15 20 25 TTC ACT TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG ATT CGC CAG ACT CCA 180 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro 30 35 40 GAC AAG AGG CTG GAG TGG GTC GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT 225 Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser 45 50 55 TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC 270 Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 60 65 70 AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTA TAC CTG CAA ATG AGC AGT CTG 315 Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu 75 80 85 AAG TCT GAG GAC ACA GCC ATG TTT TAC TGT GCA AGA CAG ACT ACT 360 Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr 90 95 100 ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC 405 Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 105 110 115 TCT GCA 411 Ser Ala

【０３７３】配列番号：５８配列の長さ：４１１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列： ATG GGG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTC GTT GCT CTT TTA AGA 45 Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg -15 -10 -5 GGT GTC CAG TGT CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG 90 Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 1 5 10 GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135 Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 15 20 25 TTC ACC TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG GTC CGC CAG GCT CCA 180 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro 30 35 40 GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT 225 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser 45 50 55 TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC 270 Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 60 65 70 AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG 315 Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 75 80 85 AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA CAG ACT ACT 360 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr 90 95 100 ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC 405 Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 105 110 115 TCC TCA 411 Ser Ser

【０３７４】配列番号：５９配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【０３７５】配列番号：６０配列の長さ：７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【０３７６】配列番号：６１配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【０３７７】配列番号：６２配列の長さ：５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【０３７８】配列番号：６３配列の長さ：１６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列： Ser Ile Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly 1 5 10 15

【０３７９】配列番号：６４配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【０３８０】配列番号：６５配列の長さ：４１１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAA CTT GTG CTC ACT CAG TCA TCT TCA GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser 1 5 10 TTC TCC CTG GGA GCC TCA GCA AAA CTC ACG TGC ACC TTG AGT AGT 135 Phe Ser Leu Gly Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAA CAG CCA CTC 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu 30 35 40 AAG CCT CCT AAG TAT GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCT GGA TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGT GCT GAT CGC TAC CTT AGC ATT TCC AAC ATC CAG CCA GAA GAT 315 Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser Ile Ser Asn Ile Gln Pro Glu Asp 75 80 85 GAA GCA ATG TAC ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Met Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAT GTT TTC GGC GGT GGG ACC AAG GTC ACT GTC CTA GGT 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gln Pro

【０３８１】配列番号：６６配列の長さ：４０５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG CAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT CGG TAC TTG ATG AAA CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGT 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 １１５

【０３８２】配列番号：６７配列の長さ：４１１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gln Pro

【０３８３】配列番号：６８配列の長さ：４１１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gln Pro

【０３８４】配列番号：６９配列の長さ：４１１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gln Pro

【０３８５】配列番号：７０配列の長さ：４１１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gln Pro

【０３８６】配列番号：７１配列の長さ：４１１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gln Pro

【０３８７】配列番号：７２配列の長さ：４１１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gln Pro

【０３８８】配列番号：７３配列の長さ：４１１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gln Pro

【０３８９】配列番号：７４配列の長さ：４１１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gln Pro

【０３９０】配列番号：７５配列の長さ：３４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列： Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile 1 5 10 15 Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu 20 25 30 Ile His Thr Ala

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の抗体の模式図である

【図２】ＣＤＲ−グラフティングの概要を示す図であ
る。

【図３】Ｖ領域のＦＲ及びＣＤＲの評価を示す図であ
る。

【図４】抗体結合活性の測定結果を示す図である。

【図５】抗体結合活性の測定結果を示す図である。

【図６】抗体結合活性の測定結果を示す図である。

【図７】抗体結合活性の測定結果を示す図である。

【図８】抗体結合活性の測定結果を示す図である。

【図９】抗体結合活性の測定結果を示す図である。

【図１０】抗体結合活性の測定結果を示す図である。

【図１１】抗体結合活性の測定結果を示す図である。

【図１２】ヒト型化抗体の中和活性を示す図である。

【図１３】ヒト型化抗体の中和活性を示す図である。

【図１４】ヒト型化抗体の中和活性を示す図である。

【図１５】高カルシウム血症モデル動物に対する本発明
の抗体の効果を示す図である。

【図１６】高カルシウム血症モデル動物に対する本発明
の抗体の効果を示す図である。

【図１７】高カルシウム血症モデル動物に対する本発明
の抗体の効果を示す図である。

【図１８】高カルシウム血症モデル動物に対する本発明
の抗体の効果を示す図である。

【図１９】センサーチップへのPTHrP の固定化のセンサ
ーグラムを示す図である。

【図２０】本発明の抗体の速度論的解析結果を示す図で
ある。

【図２１】本発明の抗体の速度論的解析結果を示す図で
ある。

【図２２】本発明の抗体の速度論的解析結果を示す図で
ある。

【図２３】本発明の抗体の速度論的解析結果を示す図で
ある。

【図２４】本発明の抗体の速度論的解析結果を示す図で
ある。

【図２５】本発明のヒト型化抗体についてリン排泄率に
及ぼす影響を試験した結果を示す図である。

【図２６】本発明のヒト型化抗体について血漿中リン濃
度濃度に及ぼす影響を試験した結果を示す図である。

【図２７】高カルシウム血症マウスに抗ＰＴＨｒＰ抗体
を投与した後の外見上の臨床諸症状を観察した結果を示
す写真である(生物の形態)。

【図２８】高カルシウム血症マウスに抗ＰＴＨｒＰ抗体
を投与した後の外見上の臨床諸症状を観察した結果を示
す写真である(生物の形態)。

【図２９】高カルシウム血症モデルを用いて、抗ＰＴＨ
ｒＰ抗体投与後の自発運動量の経日変化を、対照群（生
理食塩水投与）と比較した図である。

【図３０】高カルシウム血症モデルを用いて、抗ＰＴＨ
ｒＰ抗体投与後の体温の経日変化を、対照群（生理食塩
水投与）と比較した図である。

【図３１】高カルシウム血症モデルを用いて、抗ＰＴＨ
ｒＰ抗体投与後の血液ｐＨの経日変化を、対照群（生理
食塩水投与）と比較した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 16/46 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:19 Ｃ１２Ｐ 21/08 1:91 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献特開平４−228089（ＪＰ，Ａ) 医学のあゆみ，Ｖｏｌ．167，Ｎｏ. ５（1993），ｐ．457−462 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．238 （1987），ｐ．1568−1570 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 16/00 - 16/46 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号48〜51で表されるいずれかのア
ミノ酸配列を含む、ヒト副甲状腺ホルモン関連ペプチド
に対するヒト型化抗体のＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプチ
ド。
【請求項２】配列番号52〜55で表されるいずれかのア
ミノ酸配列を含む、ヒト副甲状腺ホルモン関連ペプチド
に対するヒト型化抗体のＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプチ
ド。
【請求項３】配列番号56で表されるアミノ酸配列を含
む、ヒト副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対するヒト型
化抗体のＨ鎖Ｖ領域を含むポリペプチド。
【請求項４】ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域を含むポリペプチ
ド、及び請求項１または２に記載のＬ鎖Ｖ領域を含むポ
リペプチドを含む、ヒト副甲状腺ホルモン関連ペプチド
に対するヒト型化抗体のＬ鎖。
【請求項５】ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域を含むポリペプチ
ド、及び請求項３記載のＨ鎖Ｖ領域を含むポリペプチド
を含む、ヒト副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対するヒ
ト型化抗体のＨ鎖。
【請求項６】請求項４記載のヒト型化抗体のＬ鎖、及
び請求項５記載のヒト型化抗体のＨ鎖を含む、ヒト副甲
状腺ホルモン関連ペプチドに対するヒト型化抗体。
【請求項７】Ｌ鎖のフレームワーク領域中のKabatの
規定による第87番目のアミノ酸がドナー由来のものであ
る、請求項６記載のヒト型化抗体。
【請求項８】Ｌ鎖のフレームワーク領域中のKabatの
規定による第36番目、第45番目および／または第49番目
のアミノ酸がドナー由来のものである、請求項６または
７記載のヒト型化抗体。
【請求項９】Ｈ鎖のフレームワーク領域のアミノ酸が
ドナー抗体のアミノ酸残基で置換されていない、請求項
６〜８のいずれか一項に記載のヒト型化抗体。
【請求項１０】請求項１または２に記載のポリペプチ
ドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項１１】請求項３記載のポリペプチドをコード
する塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項１２】請求項４記載のヒト型化抗体のＬ鎖を
コードするＤＮＡ。
【請求項１３】請求項５記載のヒト型化抗体のＨ鎖を
コードするＤＮＡ。
【請求項１４】請求項６〜９のいずれか１項に記載の
ヒト型化抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項１５】請求項１０〜１４のいずれか１項に記
載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１６】請求項１５記載の組換えベクターによ
り形質転換された形質転換体。
【請求項１７】請求項１２記載のＤＮＡを含む発現ベ
クター、及び請求項１３記載のＤＮＡを含む発現ベクタ
ーにより形質転換された形質転換体を培養し、得られる
培養物からヒト副甲状腺関連ペプチドに対するヒト型化
抗体を採取することを特徴とするヒト副甲状腺関連ペプ
チドに対するヒト型化抗体の製造方法。
【請求項１８】請求項６〜９のいずれか１項に記載の
ヒト副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対するヒト型化抗
体を有効成分として含む高カルシウム血症抑制剤。
【請求項１９】請求項６〜９のいずれか１項に記載の
ヒト副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対するヒト型化抗
体を有効成分として含む、悪性腫瘍に伴う高カルシウム
血症抑制剤。
【請求項２０】悪性腫瘍が、膵臓癌、肺癌、咽頭癌、
喉頭癌、舌癌、歯肉癌、食道癌、胃癌、胆管癌、乳癌、
腎癌、膀胱癌、子宮癌、前立腺癌及び悪性リンパ腫から
なる群から選ばれる少なくとも一つである請求項１９記
載の高カルシウム血症抑制剤。
【請求項２１】請求項６〜９のいずれか１項に記載の
ヒト副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対するヒト型化抗
体を有効成分として含む低リン血症改善剤。
【請求項２２】低リン血症が低リン血性くる病である
請求項２１記載の低リン血症改善剤。
【請求項２３】低リン血症が低リン血性ビタミンＤ抵
抗性くる病である請求項２１記載の低リン血症改善剤。