WO2006106903A1 - sc(Fv)2構造異性体 - Google Patents

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WO2006106903A1
WO2006106903A1 PCT/JP2006/306800 JP2006306800W WO2006106903A1 WO 2006106903 A1 WO2006106903 A1 WO 2006106903A1 JP 2006306800 W JP2006306800 W JP 2006306800W WO 2006106903 A1 WO2006106903 A1 WO 2006106903A1
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variable region
linker
chain variable
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Tomoyuki Igawa
Hiroyuki Tsunoda
Akiko Koga
Yasufumi Kikuchi
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen

Definitions

  • the present invention relates to a sc (Fv) 2 pharmaceutical composition and a method for producing the same.
  • sc (Fv) 2 is an antibody in which four variable regions of two light chain variable regions (VL) and two heavy chain variable regions (VH) are combined into a single chain by using a linker or the like ( Hudson et al, J Immunol. Metho ds 1999; 231: 177-189).
  • Bispecific sc (Fv) 2 is in the sequence of VH -linker- VL -linker- VH -linker- VL! /, VH
  • VL, and VH and VL (Yes! / ⁇ is VH and VL, and VH and VL)
  • Non-patent Document 5 Non-patent Document 5
  • Non-Patent Documents 3, 4, 8, and 9 are correct by confirming bispecific binding activity and show that there is a combination of Fv! /, But it is correct! /, A combination of Fv There is no description regarding the abundance ratio and quantitative evaluation of the abundance ratio.
  • Non-patent document 6 describes that the length of the linker of Bispecific sc (Fv) 2 is changed (the linker at both ends or the center). The structural change of monomer and dimer has been confirmed from this point, but the structural isomer of sc (Fv) 2 is only debated in the prediction of the molecular structure model. There is no description regarding the abundance ratio of structural isomers and the identification of structure.
  • Non-Patent Document 10 it is predicted that the length of the linker is set to 5-15-5 or 15-5-15 to take the structure of single chain diabody or bivalent scFv, respectively. This is because it has been reported that when the linker length in scFv is 12 or less, generally adjacent VH and VL are unlikely to form Fv (that is, it is difficult to form monomer).
  • Non-Patent Document 2 it is reported that a monomer is formed although the linker length is small even at Fv of 10 or 5, and the length of the linker in Non-Patent Document 10 is 5 Even in the case of -15-5 or 15-5-15, the obtained sc (Fv) 2 is not necessarily 100% single chain diabody or bival ent scFv structure.
  • Changing the length of the linker changes the distance between the two antigen-binding sites of sc (Fv) 2, so the length of the linker is dependent on its biological activity (especially the dimer of the receptor). May affect the body activity. Therefore, it is desirable that the distance between two antigen-binding sites can be arbitrarily adjusted by the length of the linker depending on the type of antigen. In addition, it has been reported that the length of the linker greatly affects the stability (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2). In scFv, it is generally known that the shorter the linker, the lower the stability. Yes.
  • Non-Patent Document 1 Protein Engineering, 1993, 6 (8), 989-995
  • Non-Patent Document 2 Protein Engineering, 1994, 7 (8), 1027-1033
  • Non-Patent Document 5 PNAS, 1995, 92, 7021-7025
  • Non-Patent Document 6 Journal of Molecular Biology, 1999, 293, 41-56
  • Non-Patent Document 7 Protein Engineering, 2001, 14 (10), 815-823
  • Non-Patent Literature 8 Journal of Molecular Biology, 2003, 330, 99-111
  • Non-Patent Document 9 Protein Eng Des Sel. 2004 Apr, 17 (4), 357-66
  • Non-Patent Document 10 Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281
  • Non-Patent Document 11 Int. J. Cancer, 1998, 77, 763-772
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object thereof is a pharmaceutical composition containing a specific structural isomer of sc (Fv) 2 as an active ingredient, a method for producing the same, and The purpose is to provide structure determination methods and standard test methods for structural isomers for drug development. Further, a method for increasing the proportion of a specific structural isomer in the sc (Fv) 2 composition, a method for increasing the activity of the sc (Fv) 2 composition using the method, and in the sc (Fv) 2 composition The object is to provide a method for analyzing the structural isomers of.
  • the present invention provides the following [1] to [44].
  • a method for producing an sc (Fv) 2 pharmaceutical composition comprising the following steps.
  • step (c) Step of obtaining a highly active structural isomer determined by step (a)
  • step (b) A step of producing an sc (Fv) 2 composition having the length of the linker determined in step (a)
  • a pharmaceutical composition wherein the ratio of the specific structural isomer in the sc (Fv) 2 composition is 80% or more.
  • composition according to [9] which is of a structural chain isomer body type, a chain chain diabody type or a bivalent scFv type.
  • a method for regulating the activity of an sc (Fv) 2 composition comprising a step of changing the proportion of structural isomers in the sc (Fv) 2 composition.
  • a method for increasing the activity of an sc (Fv) 2 composition comprising a step of increasing the proportion of a specific structural isomer in the sc (Fv) 2 composition.
  • step (c) Step of obtaining a highly active structural isomer determined by step (a)
  • a method for increasing the content ratio of a specific structural isomer in an sc (Fv) 2 composition comprising a step of heating the sc (Fv) 2 composition.
  • a method for increasing the content of a single chain diabody type in an sc (Fv) 2 composition comprising a step of incubating the sc (Fv) 2 composition at 15 ° C to 50 ° C.
  • An sc (Fv) 2 composition comprising a step of forming an interface between the heavy chain variable region and the light chain variable region of sc (Fv) 2, and substituting an amino acid residue having a charge with an amino acid residue having a charge.
  • Amino acid residue contained in the heavy chain variable region of sc (Fv) 2 and corresponding to position 45 in the amino acid sequence of the heavy chain variable region (2) Amino acid residue contained in the light chain variable region of sc (Fv) 2 and corresponding to position 44 in the amino acid sequence of the light chain variable region
  • a specific structural isomer in the sc (Fv) 2 composition comprising the step of substituting one of the following amino acid residues (1) and (2) with a charged amino acid residue: A method to increase the content ratio.
  • a sc (Fv) 2 composition comprising a step of forming an interface between a heavy chain variable region and a light chain variable region of sc (Fv) 2, and substituting an amino acid residue having a charge with an amino acid residue having a charge. To increase the activity.
  • a method for increasing the activity of an sc (Fv) 2 composition comprising the step of substituting the amino acid residues described in (1) and (2) below with amino acid residues having the same kind of charge.
  • a method for increasing the activity in an sc (Fv) 2 composition comprising the step of substituting the amino acid residues described in (1) and (2) below with amino acid residues having the same kind of charge.
  • a method for increasing the activity of an sc (Fv) 2 composition comprising the step of substituting one of the following amino acid residues (1) and (2) with a charged amino acid residue:
  • Amino acid residue contained in the heavy chain variable region of sc (Fv) 2 and corresponding to position 45 in the amino acid sequence of the heavy chain variable region (2) Amino acid residue contained in the light chain variable region of sc (Fv) 2 and corresponding to position 44 in the amino acid sequence of the light chain variable region
  • a method for adjusting the proportion of structural isomers in an sc (Fv) 2 composition comprising the step of adjusting the length of the sc (Fv) 2 linker.
  • Ratio of single chain diabody type in sc (Fv) 2 composition including the step of adjusting the linker at both ends of sc (Fv) 2 to 0-12 amino acids and the central linker at 10-30 amino acids How to increase.
  • the content of single chain diabody type is 80% or more, including the step of adjusting the linker at both ends of sc (Fv) 2 to 0-12 amino acids and the central linker at 0-10 amino acids.
  • Fv A method for producing two compositions.
  • the content of bivalent scFv type is 80% or more, including the step of adjusting the linker at both ends of sc (Fv) 2 to 12-30 amino acids and the central linker at 0-10 amino acids. 2) A method for producing a composition.
  • a method for analyzing structural isomers in an sc (Fv) 2 composition comprising a step of cleaving a linker or a region near the linker of sc (Fv) 2.
  • a method for analyzing structural isomers in an sc (Fv) 2 composition comprising the following steps.
  • FIG. 1 (a) is a view showing the VHl-linker-VLl-linker-VH2-linker-VL2 structure of VB22B sc (Fv) 2.
  • (b) shows two structural isomers of the VHl-linker-VLl-linker-VH2-linker-VL2 structure.
  • a bivalent scFv structure in which VH1 / VL1 and VH2 / VL2 are associated with each other (left) and a single chain diabody structure in which VH1 / VL2 and VH2 / VL1 are associated with each other (right) are shown.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of separation of peak 1 and peak 2 by anion exchange chromatography.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of reduction SDS-PAGE before and after subtilisin treatment of peak1, peak2, and VB22B sc (Fv) 2. The estimated structure of the obtained band is shown on the right.
  • FIG. 4 A diagram showing the difference in degradation pattern after subtilisin limited digestion caused by the difference in structure between bivalent scFv and single chain antibody.
  • Bivalent scFv structure a low molecular weight fragment surrounded by a dotted line is generated.
  • FIG. 5 shows the results of gel filtration chromatography after limited decomposition of peakl, peak2, and VB22B sc (Fv) 2 by Subtilisin.
  • the elution position of the low molecular weight peak is indicated by an arrow.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of TPO-like antigen activity evaluation of VB22B sc (Fv) 2 structural isomers.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of separation of peakl and peak2 by cation exchange chromatography.
  • FIG. 8 is a diagram showing peptide mapping of peak 1 and peak 2 separated by cation exchange chromatography.
  • FIG. 9 is a photograph and drawing showing the results of reducing SDS-PAGE after subtilisin treatment of peak1, peak2, and hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2. The structure of the obtained band is shown on the right.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of gel filtration chromatography after limited decomposition of peakl, peak2, and hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 by Subtilisin.
  • the arrow indicates the elution position of the low molecular weight peak.
  • FIG. L l A graph showing the results of TPO-like antigen activity evaluation of hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 structural isomers.
  • FIG. 12 is a diagram showing a construct of each linker variant.
  • Gxx has a central linker length of XX
  • Lxx has a linker length of XX at both ends
  • each construct uses (GGGGS (SEQ ID NO: ll)) n sequence as a linker.
  • L8 is a construct using a GG GGSGGS sequence (SEQ ID NO: 20) having a linker length of 8 at both ends.
  • L12 has a linker length of 12 at both ends and is a construct using the GGGGSGGGGSGS sequence (SEQ ID NO: 21).
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of anion exchange chromatography analysis of each modified linker and the obtained abundance ratio of structural isomers. Indicated by percent of bivalent scFv type structure.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of gel filtration chromatography analysis of the chromatogram of the hydroxyapatite column and the purified fraction.
  • FIG. 15 is a diagram showing the results of analyzing a chromatogram of a SOURCE 15S column.
  • FIG. 16 is a view showing an analysis result of cation exchange chromatography.
  • FIG. 17 is a photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of hVB22B u2- wz4 sc (Fv) 2 peakl and hVB22B u2- wz4 sc (Fv) 2 peak2 which were purified in large quantities.
  • FIG. 18 is a diagram showing the results of gel filtration analysis of hVB22B u2- wz4 sc (Fv) 2 peak1 and hVB22B u2- wz4 sc (Fv) 2 peak2 which were purified in large quantities.
  • FIG. 19 is a diagram showing the results of gel filtration chromatography of u2-wz4, variant vl, and variant v3.
  • FIG. 20 shows the results of cation exchange chromatography of u2-wz4, variant vl, and variant v3.
  • FIG. 21 is a photograph showing the results of isoelectric focusing of u2-wz4, u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, variant vl, variant v3.
  • FIG. 22 shows the results of gel filtration chromatography analysis after limited digestion of proteases of u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, variant vl, variant v3.
  • FIG. 23 is a graph showing the results of TPO-like agonist activity evaluation of u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, variant vl, and variant v3.
  • FIG. 24 is a diagram showing the results of DSC analysis of u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, variant vl, and variant v3.
  • FIG. 25 is a diagram showing the results of gel filtration chromatography analysis in a thermal acceleration test of u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, modified vl, and modified v3.
  • FIG. 26 shows the results of cation exchange chromatography analysis in a thermal acceleration test of u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, variant vl, and variant v3.
  • FIG. 27 is a diagram showing the results of separation of humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 by peakl and peak2 cation exchange chromatography.
  • FIG. 28 is a view showing the analysis results of cation exchange chromatography of peak 1 and peak 2 of purified human anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2;
  • FIG. 29 is a photograph showing the result of reduction SDS-PAGE of the humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 after peakl and peak2 subtilisin treatment. The estimated structure of the obtained band is shown on the right.
  • FIG. 30 is a diagram showing the results of gel filtration chromatography after limited decomposition of peakl and peak2 of humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 by Subtilisin.
  • the arrow indicates the elution position of the low molecular weight peak.
  • FIG. 31 shows the results of evaluation of IL-6 neutralization activity of humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 peakl and peak2 in BaF3 / gpl30.
  • FIG. 34 is a graph showing the isomerism of peak 2 by incubating hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 peakl at 25 ° C for 10 days under various conditions.
  • the present inventors have found that in the process of analyzing the structural isomer of sc (Fv) 2, a difference occurs in the activity between the structural isomers. Furthermore, it was found that the ratio of structural isomers in the sc (Fv) 2 composition can be adjusted, and that specific structural isomers in the sc (Fv) 2 composition can be separated and obtained.
  • the present invention is based on these findings.
  • the present invention separates structural isomers in the sc (Fv) 2 composition, and among the separated structural isomers,
  • the manufacturing method of a pharmaceutical composition including the process of acquiring a specific structural isomer is provided.
  • sc (Fv) 2 is a low molecular weight antibody in which four or more antibody variable regions are combined with a linker or the like to form a single chain.
  • sc (Fv) 2 is usually an antibody in which four variable regions of two VLs and two VHs are combined with a linker to form a single chain (Hudson et al, J Immunol. Methods). 1999; 231: 177-189). The two VH and VL may be derived from different monoclonal antibodies! /.
  • sc (Fv) 2 can be prepared by a method known to those skilled in the art.
  • sc (Fv) 2 can be prepared by linking scFv with a linker.
  • scFv contains antibody VH and VL, and these regions are present in a single polypeptide chain (for a review of scFv, see Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibomes J Vol.llj (Rosenburg and Moore ed ( Springer Verlag, New York) pp.269-315, 1994)).
  • sc (Fv) 2 of the present invention includes two VH and two VL forces.
  • the VH, VL, VH, VL ([VH] linker [ VL] Linker 1 [VH] Linker 1 [VL])
  • the antibody is characterized by being arranged in this order.
  • the order of the two VHs and the two VLs is not particularly limited to the above arrangement, but any order It may be arranged in. For example, the following arrangement can also be mentioned.
  • sc (Fv) 2 of the present invention may contain an amino acid sequence other than the antibody variable region and the linker.
  • variable region of the antibody used in the present invention may be the full length of the variable region, or may be a partial sequence of the variable region as long as the binding activity to the antigen is maintained. Further, the amino acid sequence in the variable region may be substituted, deleted, added, inserted or the like. For example, in order to reduce antigenicity, chimerism may be humanized.
  • the sc (Fv) 2 of the present invention may be fused with another protein such as the Fc portion of IgG at its N-terminus or C-terminus (Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281). ).
  • a protein to be fused can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • sc (Fv) 2 of the present invention binds two scFvs to the N terminus of each hinge of Fc, and serves as the central linker (linker 1). It may be in the form of (scFv) 2-Fc using a zone (J Immunol Methods. 2005; 306 (1-2): 93- 1 03.).
  • the sc (Fv) 2 of the present invention may be conjugated with a carrier polymer such as PEG or an organic compound such as an anticancer agent. Further, a sugar chain addition sequence may be inserted to add a sugar chain.
  • any peptide linker that can be introduced by genetic engineering, or a synthetic compound linker see, for example, Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996)
  • a peptide linker is preferable.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose. However, the preferred length is 5 amino acids or more (the upper limit is not particularly limited, but usually 30 amino acids or less, Preferably it is 20 amino acids or less), particularly preferably 15 amino acids.
  • sc (Fv) 2 contains three peptide linkers, the same length peptide linkers may be used, or different length peptide linkers may be used.
  • n is an integer of 1 or more].
  • the length and sequence of the peptide linker can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose.
  • Synthetic chemical linkers are commonly used for cross-linking peptides such as N-hydroxysuccinimide (NHS), disuccinimidyl suberate (DSS), bismuth. (Sulfosuccinimidyl) suberate (BS 3 ), dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP), dithiopis (sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP), ethylene glycol Bis (succinimidyl succinate) (EGS), ethylene glycol bis (sulfosuccinimidyl succinate) (sulfo EGS), disuccinimidyl tartrate (DST), disulfosuccinimidyl tartrate (Sulfo-DST), bis [2- (succinimidoxycarboxyl) ethyl] sulfone (BSOCOES), bis [2- (sulfosuccinimidoc) ethyl] sulf
  • sc (Fv) 2 composition refers to a composition containing one or more structural isomers of sc (Fv) 2.
  • the sc (Fv) 2 composition can be prepared by methods well known to those skilled in the art.
  • an sc (Fv) 2 composition can be prepared by introducing a vector into which a DNA encoding sc (Fv) 2 is inserted into a host cell, expressing sc (Fv) 2, and collecting the expression product.
  • the vector is not particularly limited as long as it can stably hold the inserted DNA.
  • a cloning vector such as pBluescript vector (Stratagene) may be used. Preferable! /, But you can use various vectors sold by the company.
  • An expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of producing the sc (Fv) 2 of the present invention.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses sc (Fv) 2 in vitro, in E. coli, in cultured cells, or in an individual organism.
  • pBEST vector Promega
  • PET vector manufactured by Invitrogen for Escherichia coli
  • pME18S-FL3 vector GenBank Accession No. AB009864
  • pME18S vector Mol Cell Biol. 8: 466-47 for individual organisms 2 (1988)
  • the insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons, section 1 1.4-11.11).
  • the host cell is not particularly limited, and various host cells can be used depending on the purpose.
  • Examples of cells for expressing sc (Fv) 2 include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus), insects Examples include cells (eg, Drosophila S2, Spodoptera SF9), animal cells (eg, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells) and plant cells.
  • bacterial cells eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis
  • fungal cells eg, yeast, Aspergillus
  • insects include cells (eg, Drosophila S2, Spodoptera SF9), animal cells (eg, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3,
  • Vector introduction into host cells can be carried out by, for example, calcium phosphate precipitation method, Nores method (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al., 1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), Lipofuctamine method (GIBCO -Manufactured by BRL Co., Ltd.) and a known method such as a microinjection method.
  • calcium phosphate precipitation method Nores method (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al., 1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9)
  • Lipofuctamine method GIBCO -Manufactured by BRL Co., Ltd.
  • a known method such as a microinjection method.
  • the sc (Fv) 2 composition can be collected by recovering the medium when the sc (Fv) 2 of the present invention is secreted into the medium.
  • sc (Fv) 2 is produced intracellularly, the cell is first lysed, and then the sc (Fv) 2 composition is recovered.
  • the sc (Fv) 2 composition of the present invention may be in any state as long as it is a composition containing one or more sc (Fv) 2 structural isomers.
  • a crude composition such as a replacement cell culture, a purified composition, and the like can be exemplified, but these are not restrictive.
  • structural isomers refer to proteins having the same amino acid sequence but different steric structures (secondary structure or tertiary structure). Usually, structural isomers differ in at least one of chemical, biological, or physical properties.
  • Examples of structural isomers in sc (Fv) 2 include single chain diabody type and bivalent scF v type structural isomers.
  • single chain diabody type means that sc (Fv) 2 is [variable region 1] (linker 1) [variable region 2] (linker 1) [variable region 3] (linker 1 )
  • sc (Fv) 2 is [variable region 1] (linker 1) [variable region 2] (linker 1) [variable region 3] (linker 1 )
  • linker 1 When arranged in the order of [variable region 4], the structure in which variable region 1 and variable region 4 are associated, and variable region 2 and variable region 3 are associated Sc (Fv) 2 having
  • the bivalent scFv type refers to sc (Fv) 2 having a structure in which variable region 1 and variable region 2 are associated and powerful variable region 3 and variable region 4 are associated. I mean.
  • Examples of the single chain diabody type and bivalent scFv type include sc (Fv) 2 having the structure shown in Fig. Lb.
  • the structural isomerism of sc (Fv) 2 It can be confirmed by the identification method of structural isomers described later whether it has a structure of the ngle chain diabody type or bivalent scFv type. It can also be identified by NMR analysis and crystal structure analysis.
  • sc (Fv) 2 composition Separation and acquisition (purification) of structural isomers in sc (Fv) 2 composition
  • sc (Fv) 2 composition is applied to an ion exchange column or Hydroxyapatite column to obtain a specific structural isomer.
  • various chromatographic power rams, filters, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis It can be carried out by methods known to those skilled in the art such as electrophoresis, isoelectric focusing, chiral isoelectric focusing, permeation, and recrystallization.
  • chromatography examples include ion exchange chromatography, adsorption chromatography, isoelectric focusing, gel filtration, reverse phase chromatography, hydrophobic chromatography, and affinity chromatography (Strategies). for Protein Puri fication ana Characterization: A Laboratory and ourse Manual. ti, d Daniel R. Marshak et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Chromatography can be performed using liquid chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC or FPLC.
  • the type of ion exchange column used is not particularly limited, and either a cation exchange column or an anion exchange column can be used. It can be determined as appropriate.
  • SP ion exchange ram, Q ion exchange ram, etc. can be used, but are not limited to these.
  • Adsorption chromatography is not limited to the power that can be exemplified by Hydroxyapatite chromatography.
  • a purified product of a specific structural isomer can be obtained using these purification methods. Tochidaru.
  • the method for producing the pharmaceutical composition of the present invention allows the activity of the structural isomer of sc (Fv) 2 when there is a difference in activity between the structural isomers in the sc (Fv) 2 composition.
  • the highly active structural isomers can be determined in advance, and the structural isomers in the sc (Fv) 2 composition can also be separated and obtained.
  • the method for producing the pharmaceutical composition of the present invention can be used to separate the structural isomers in the sc (Fv) 2 composition by the method described below before separating the structural isomers in the sc (Fv) 2 composition.
  • the length of the linker can be determined so that the ratio is a preferable value, and an sc (Fv) 2 composition having the determined linker length can be produced.
  • multiple sc (Fv) 2 compositions with different linker lengths were prepared and analyzed for the structural isomer ratio described later.
  • the ratio of structural isomers is analyzed by the method, and the ratio of structural isomers in the sc (Fv) 2 composition is preferred, and sc (Fv) 2 having a value linker is selected, and the selected sc ( A sc (Fv) 2 composition of Fv) 2 can also be made.
  • the sc (Fv) 2 composition of the selected sc (Fv) 2 can also be prepared by modifying the amino acid residue that forms an interface between VH and VL by the method described later.
  • a highly active structural isomer refers to a structural isomer having a high activity, preferably a structural isomer having the highest activity, when there is a difference in activity between the structural isomers.
  • the structural isomer with higher activity corresponds to the highly active structural isomer referred to in the present invention.
  • Determination of a highly active structural isomer can be performed by a method known to those skilled in the art. For example, each structural isomer is isolated and the target activity is measured under the same conditions. Thus, a highly active structural isomer can be determined.
  • the activity is not particularly limited and may be any activity such as binding activity, neutralization activity, cytotoxic activity, agonist activity, antagonist activity, enzyme activity, etc. It is preferable to have an activity that causes a quantitative and Z or qualitative change or influence on cells, proteins, DNA, RNA, etc. Particularly, an agonist activity is preferable.
  • the antigenic activity is an activity that induces a change in some physiological activity by binding a signal to an antigen such as a receptor, whereby a signal is transmitted into a cell.
  • physiological activities include proliferation activity, survival activity, differentiation activity, transcription activity, membrane transport activity, Powers that can include binding activity, proteolytic activity, phosphoric acid Z dephosphorylating activity, redox activity, transfer activity, nucleolytic activity, dehydration activity, cell death inducing activity, apoptosis inducing activity, etc. It is not limited to.
  • the antigen is not particularly limited, and any antigen can be used!
  • antigens include receptors, cancer antigens, MHC antigens, differentiation antigens, and the like.
  • receptors include, for example, hematopoietic factor receptor family, cytoforce-in receptor family, tyrosine kinase type receptor family, serine Z threonine kinase type receptor family, TNF receptor family, G protein coupled receptor Examples include receptors belonging to the receptor family such as family, GPI-anchored receptor family, tyrosine phosphatase-type receptor family, adhesion factor family, and hormone receptor family. Numerous references exist regarding receptors belonging to these receptor families and their characteristics.
  • Specific receptors belonging to the above receptor family include, for example, human or mouse erythropoietin (EPO) receptor, human or mouse granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) receptor, human or mouse thrombopoi Etine (TPO) receptor, human or mouse insulin receptor, human or mouse Flt-3 ligand receptor, human or mouse platelet derived growth factor (PDGF) receptor, human or mouse interferon (IFN)-a, j8 receptor , Human or mouse leptin receptor, human or mouse growth hormone (GH) receptor, human or mouse interleukin (IL) -10 receptor, human or mouse insulin-like growth factor (IGF) -I receptor, human or mouse Leukemia inhibitory factor (LIF) receptor, human or mouse ciliary neurotrophic factor (CNTF) receptor, etc.
  • EPO erythropoietin
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • TPO thrombopoi Etine
  • human or mouse insulin receptor human or mouse Flt-3
  • HTPOR Simon, S. et al. (1990) Blood 76, 31-35 .
  • mEPOR D 'Andrea, AD. Et al. (1989) Cell 57, 277-285 .
  • hG- CSFR Fukunaga, R. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 8702— 8706 .
  • mG— CSFR Fukunaga, R. et al. (1990) Cell 61, 341-350.
  • HTPOR Vigon, I. et al. (1992) 89, 5640-5644.
  • MTPOR Skoda, RC. Et al.
  • Cancer antigens are antigens that are expressed as cells become malignant, and are also called tumor-specific antigens.
  • abnormal sugar chains appearing on the cell surface and protein molecules when cells become cancerous also become cancer antigens, and are particularly called cancer sugar chain antigens.
  • cancer antigens include CA19-9, CA 15-3, serial SSEA-1 (SLX), and the like.
  • MHC antigens are roughly classified into MHC class I antigens and MHC class II antigens, and MHC class I antigens include HLA-LA, - ⁇ , -C, - ⁇ , -F, -G,- H is included, and MHC class II antigens include HLA-DR, -DQ, -DP.
  • Anti-antigens include CDl, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CDlla, CDllb, CDllc, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21 , CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126, CDwl30, etc. are included.
  • any index can be used as long as a quantitative and Z or qualitative change can be measured.
  • a cell-free (cell free assay) index a cell-based (ceU-based assay) index, a thread and woven index, and a biological index can be used.
  • an enzymatic reaction or quantitative and Z or qualitative changes in protein, DNA, and RNA can be used.
  • the enzyme reaction include amino acid transfer reaction, sugar A transfer reaction, dehydration reaction, dehydrogenation reaction, substrate cleavage reaction and the like can be used.
  • protein phosphorylation, dephosphorylation, dimerization, multimerization, degradation, dissociation, etc., and DNA, RNA amplification, cleavage, and extension can be used.
  • a phosphate of a protein existing downstream in the signal transduction pathway can be used as a detection index.
  • Cell line indicators include changes in cell phenotype, such as quantitative and Z or qualitative changes in the product, changes in proliferative activity, changes in cell number, changes in morphology, changes in properties, etc. Can be used. As production substances, secreted proteins, surface antigens, intracellular proteins, mRNA, and the like can be used. Changes in morphology include protrusion formation and change in the number of Z or protrusions, change in flatness, change in elongation, change in Z aspect ratio, change in cell size, change in internal structure, and deformity as a cell population Z uniformity, changes in cell density, etc. can be used. These morphological changes can be confirmed by microscopic observation.
  • Cell motility includes cell invasion activity and cell migration activity.
  • changes in intracellular substances include enzyme activity, mRNA levels, intracellular signaling substances such as Ca 2+ and cAMP, and intracellular protein levels.
  • changes in cell proliferation activity induced by receptor stimulation can be used as an index.
  • tissue index a change in function according to the tissue used can be used as a detection index.
  • Biological indicators include tissue weight changes, blood system changes such as changes in blood cell count, protein content, enzyme activity, changes in electrolysis mass, and changes in the circulatory system such as blood pressure and heart rate. Or the like can be used.
  • the absorption spectrum can be measured with a commonly used photometer, plate reader, etc.
  • the emitted light can be measured with a luminometer
  • the fluorescence can be measured with a fluorometer.
  • Mass is mass It can be measured using an analyzer. Radioactivity is measured using a gamma counter or other measuring device according to the type of radiation, fluorescence polarization is measured by BEACON (Takara Shuzo), surface plasmon resonance signal is measured by BIACORE, time-resolved fluorescence, fluorescence resonance energy transfer is measured by ARVO, etc. it can.
  • a flow cytometer or the like can also be used for measurement.
  • more measurement methods can be used by measuring two or more types simultaneously and Z or continuously. It is also possible to measure the detection index. For example, fluorescence and fluorescence resonance energy transfer can be measured simultaneously with a fluorometer.
  • the agonist activity can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, as described in the examples, determination can be made by a method of measuring the agonist activity using cell proliferation as an index. More specifically, an antibody whose agonist activity is to be measured is added to cells that exhibit agonist-dependent growth and cultured. Then, it is possible to measure the absorbance by adding a reagent that exhibits a color reaction at a specific wavelength according to the number of living cells such as WST-8, and measure the agonist activity using the obtained absorbance as an index. .
  • Cells exhibiting antigen-dependent growth can also be produced by methods known to those skilled in the art.
  • the receptor is used.
  • An expressing cell may be used.
  • the antigen is a receptor that does not emit a cell proliferation signal
  • a chimeric receptor consisting of an intracellular region of a receptor that emits a cell proliferation signal and an extracellular region of a ⁇ receptor that does not emit a cell proliferation signal. Create and express the chimeric receptor in cells!
  • Examples of receptors that emit cell proliferation signals include G-CSF receptor, mpl, neu, GM-CSF receptor, EPO receptor, c-kit, FLT-3 and the like.
  • Examples of cells that express the receptor include BaF3, NFS60, FDCP-1, FDCP-2, CTLL-2, DA-1, and KT-3.
  • the sc (Fv) 2 pharmaceutical composition refers to an sc (Fv) 2 composition intended to be administered to a human for treatment or prevention of a disease.
  • the present invention contains sc (Fv) 2 structurally separated or obtained by the above method, or sc (Fv) 2 composition with an increased proportion of specific structural isomers as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition is also provided.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and media include, for example, sterilized water and physiological saline, stabilizers, excipients, antioxidants (such as ascorbic acid), buffers (phosphoric acid, citrate, etc. Organic acids, etc.), preservatives, surfactants (PEG, Tween, etc.), chelating agents (EDTA, etc.), binders and the like.
  • antioxidants such as ascorbic acid
  • buffers phosphoric acid, citrate, etc. Organic acids, etc.
  • preservatives such as ascorbic acid
  • surfactants PEG, Tween, etc.
  • EDTA chelating agents
  • binders and the like include, for example, sterilized water and physiological saline, stabilizers, excipients, antioxidants (such as ascorbic acid), buffers (phosphoric acid, citrate, etc. Organic acids, etc.), preservatives, surfactants (PEG, Tween, etc.), chelating agents (EDTA, etc.), binders
  • the sugar may contain alcohol.
  • isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannthol, and sodium chloride salt. It may also be used in combination with a suitable solubilizing agent such as alcohol (ethanol etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50) and the like.
  • microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, and poly (methacrylic acid)
  • colloid drug delivery systems ribosomes, albumin microspheres, microemulsions, nano Particle and nano force psenore etc.
  • a method of making a drug a sustained-release drug is also known and can be applied to the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; U.S. Pat. No. 3,773,919; European Patent Application Publication (EP) 58,481; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556? 133,988).
  • the sc (Fv) 2 pharmaceutical composition of the present invention is not limited to the method described above, and can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • parenteral administration The ability to be administered to a patient by either oral or parenteral administration is preferred, preferably parenteral administration.
  • parenteral administration Specifically, injection, nasal administration, pulmonary administration, trans
  • a skin administration type For example, a skin administration type.
  • the injection form can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, and the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms.
  • As the dosage for example
  • the dose can be selected within the range of 0.001 to 100000 mg / body per patient.
  • the present invention is not limited to these dosages and administration methods.
  • the present invention provides an sc (Fv) 2 composition having a specific structural isomer content of 80% or more, preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more. More specifically, the content ratio of the single chain dia body type is 80% or more, preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more of the sc (Fv) 2 composition, or the content ratio of the bivalent scFv type is 80%.
  • the sc (Fv) 2 composition can be mentioned above, preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more.
  • the content ratio of a specific structural isomer is 80% means that the ratio of the specific structural isomer to all structural isomers contained in the sc (Fv) 2 composition is 80%. It means that there is.
  • the content ratio of single chain diabody type is 80%. This means that the ratio force of bivalent scFv type is 0:20.
  • the upper limit of the content ratio of 80% or more, 90% or more, or 95% or more is not particularly limited, but is preferably 100% or close to 100%.
  • the upper limit is close to 100%, and depends on the purification technique and analysis technique of those skilled in the art, for example, 99.999%, 99.99%, 99.9%, 99%, etc.
  • the content ratio of structural isomers can be measured by separating the structural isomers using, for example, ion exchange chromatography, isoelectric focusing, or chiral isoelectric focusing.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising as an active ingredient an sc (Fv) 2 composition having a specific structural isomer content of 80% or more.
  • sc (Fv) 2 When sc (Fv) 2 is used as a pharmaceutical composition, it is usually preferable that the activity is high.Therefore, an sc (Fv) 2 composition containing 80% or more of a highly active structural isomer is an active ingredient.
  • U preferred to contain as.
  • the anti-Mpl antibody has a higher antigen activity in the single chain diabody type, so when sc (Fv) 2 against Mpl is used as the antigen, the content of the single chain diabody type is 80%. % Or more sc (Fv) 2 composition is preferably a pharmaceutical composition containing as an active ingredient. Good.
  • the present invention provides a method of modulating the activity of a sc (Fv) 2 composition, comprising changing the proportion of structural isomers in the sc (Fv) 2 composition.
  • the activity of the sc (Fv) 2 composition can be regulated by changing the content ratio of a specific structural isomer.
  • a specific method for regulating the activity of the sc (Fv) 2 composition for example, by changing the ratio of the single chain diabody type and the bivalent scFv type contained in the sc (Fv) 2 composition, sc It is possible to regulate the activity of the (Fv) 2 composition.
  • the present invention also provides a method for increasing the activity of an sc (Fv) 2 composition, comprising the step of increasing the proportion of a particular structural isomer in the sc (Fv) 2 composition. It can be carried out by using the method for separating and obtaining a specific structural isomer in the sc (Fv) 2 composition described above.
  • the activity of single chain diabody type is higher than that of bivalent scFv type.
  • sc (Fv) 2 composition by increasing the content of single chain diabody type in sc (Fv) 2 composition, sc (Fv) 2 composition The activity can be increased, and the activity of the sc (Fv) 2 composition can be decreased by increasing the content of the bivalent scFv type.
  • the activity of the bivalent scFv type is higher than the angle chain diabody type, the activity of the sc (Fv) 2 composition can be increased by increasing the content of the bivalent scFv type in the sc (Fv) 2 composition.
  • the activity of the sc (Fv) 2 composition can be reduced by increasing the content of the single chain diabody type. Whether a single chain diabody type or a bivalent scFv type is highly active depends on the target activity, but those skilled in the art can easily determine by a known method.
  • sc (Fv) 2 When sc (Fv) 2 is used as a pharmaceutical composition, it is usually preferable that the activity is higher V. Therefore, the proportion of a specific structural isomer contained in the sc (Fv) 2 composition By changing In other words, it is possible to increase the activity of the pharmaceutical composition.
  • sc (Fv) 2 may be a higher content ratio of a specific conformational isomer after obtaining the composition, such that the content of specific structure isomers higher sc (Fv) 2 You may design the DNA which codes.
  • the target structural isomer is obtained from the obtained sc (Fv) 2 composition.
  • a method of isolation (or removal of structural isomers for no purpose) can be mentioned. Isolation of the target structural isomer can be carried out by methods for separating and obtaining proteins known to those skilled in the art as described above.
  • the content ratio of a specific structural isomer can be increased by heating the sc (Fv) 2 composition.
  • the present inventors have found that the content ratio of the single chain diabody type can be increased by incubating the sc (Fv) 2 composition at a constant temperature.
  • incubating the sc (Fv) 2 composition at 15 ° C to 50 ° C, preferably 20 ° C to 40 ° C, particularly preferably 25 ° C to 35 ° C, a single chain diabody type It is possible to increase the content of.
  • the incubated sc (Fv) 2 composition maintains the increased single chain diabody content even if it is then returned to its original temperature.
  • the content ratio of a specific structural isomer in the sc (Fv) 2 composition is increased! It is also possible to Specifically, the DNA encoding sc (Fv) 2 should be modified to change the amino acid residue that forms the interface of the variable region of sc (Fv) 2.
  • controlling the association means controlling so as to obtain a desired state of association. More specifically, it refers to controlling so that an undesirable association is not formed in sc (Fv) 2.
  • the "interface” usually refers to an association surface at the time of association (interaction), and the amino acid residue that forms the interface is usually sc (Fv) 2 used for the association.
  • Fv sc
  • the interaction includes a case where amino acid residues approaching at the time of association form a hydrogen bond, an electrostatic interaction, a salt bridge, and the like.
  • amino acid residues that form the interface in the present invention, if specifically, S C (Fv) which constitutes the interface 2 of the variable regions Nio Te, the amino acid residues contained in the variable region Say.
  • Modification of an amino acid residue in the method of the present invention specifically refers to substitution of the original (before modification) amino acid residue with another amino acid residue, or the original amino acid residue. Deletion, addition of a new amino acid residue, and the like. Preferably, it refers to substitution of the original amino acid residue with another amino acid residue.
  • modifying DNA means modifying DNA so as to correspond to the amino acid residue introduced by “modification” in the present invention. More specifically, it means that the DNA encoding the original amino acid residue is modified to DNA encoding the amino acid residue introduced by the modification. Usually, it means genetic manipulation or mutagenesis that inserts, deletes, or substitutes at least one base into the original DNA so that it becomes a codon encoding the target amino acid residue. That is, the codon encoding the original amino acid residue is replaced by a codon encoding the amino acid residue introduced by the modification.
  • DNA modification can be appropriately performed by those skilled in the art using known techniques such as site-specific mutagenesis, PCR mutagenesis, and the like.
  • two or more amino acid residues forming the interface of the variable region of sc (Fv) 2 are attached to the interface so that they have the same type of charge. Introduce amino acid residue mutations. It is considered that the association of these amino acid residues is inhibited by the repulsive force of the charge by modifying two or more amino acid residues involved in the association at the interface so that they have the same kind of charge. Therefore, in the above method, the amino acid modified The acid residues are preferably two or more amino acid residues that are close to each other during association between the variable regions of sc (Fv) 2 that form the interface.
  • amino acid residues that approach during the association are analyzed, for example, by the three-dimensional structure of sc (Fv) 2, and the amino acid sequence of the variable region that forms the interface during the association of the sc (Fv) 2 It can be found by examining. Amino acid residues that are close to each other at the interface are preferred targets for “modification” in the method of the present invention.
  • amino acids charged amino acids are known.
  • lysine arginine (R), and histidine (H) are known as positively charged amino acids (positively charged amino acids).
  • Aspartic acid (D), glutamic acid (E), and the like are known as negatively charged amino acids (negatively charged amino acids). Therefore, preferably, in the present invention, the same type of charged amino acids means amino acids having positive charges or amino acids having negative charges.
  • the same amino acid is more preferable.
  • the modified amino acid residues may be lysine and arginine, but two lysines, more preferably two arginines! / ,.
  • amino acid residues when there are a plurality of amino acid residues introduced by modification, these amino acid residues may have a small number of amino acid residues without charge.
  • the number of amino acid residues subjected to modification in the method of the present invention is not particularly limited, but it is preferable to modify as few amino acid residues as possible in order not to reduce the binding activity to the antigen.
  • the “small number” represents, for example, 1 to: about LO number, preferably about 1 to 5, more preferably about 1 to 3, most preferably 1 or 2.
  • an interface that forms the interface of the variable region of sc (Fv) 2 is used.
  • the amino acid residue mutation is introduced into the interface such that the amino acid residue forming the hydrophobic core present at the interface becomes a charged amino acid residue.
  • hydrophobic core refers to a portion formed by the assembly of hydrophobic amino acid side chains inside an associated polypeptide.
  • Hydrophobic amino acids include, for example, alanine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, proline, tryptophan, and norin.
  • the formation of the hydrophobic core may involve amino acid residues other than hydrophobic amino acids (eg tyrosine).
  • This hydrophobic core serves as a driving force for advancing the association of water-soluble polypeptides together with the hydrophilic surface where the side chains of hydrophilic amino acids are exposed to the outside.
  • Hydrophobic amino acids of two different domains are present on the surface of the molecule, and exposure to water molecules increases entropy and free energy.
  • the two domains associate with each other to reduce and stabilize the free energy, and the hydrophobic amino acid at the interface is buried inside the molecule, forming a hydrophobic core.
  • the formation of the hydrophobic core is inhibited by changing the amino acid residue forming the formed hydrophobic core to a polar amino acid having a charge. It is thought that peptide association is inhibited.
  • the polypeptide sc (Fv) 2 also forms a hydrophobic core by association of variable regions. Thus, substitution of the amino acid residue of the hydrophobic core with an amino acid having a charge is considered to be an easy way to control the association of the variable regions.
  • knobs-into-holes special table 2001-523971
  • k nobs-into-holes allows specific and complementary interactions at the interface between the first polypeptide and the second polypeptide to promote heteromultimer formation and inhibit homomultimer formation.
  • a free chelate-containing residue at the interface of the first polypeptide so that a non-natural disulfide bond is formed between the first polypeptide and the second polypeptide.
  • knobs-into-holes This is a technique known to those skilled in the art, and those skilled in the art can appropriately introduce it into sc (Fv) 2. Further, the above techniques can be used in combination.
  • the variable region is usually composed of three CDR regions and four FR regions.
  • the amino acid residue subjected to “modification” can be appropriately selected from, for example, amino acid residues located in the CDR region or the FR region.
  • modification of amino acid residues in the CDR region may reduce the ability to bind to an antigen. Therefore, the amino acid residues to be used for “modification” in the present invention are not particularly limited! /, But it is preferable to appropriately select the intermediate forces of amino acid residues located in the FR region.
  • variable region 1 and variable region 2 and the association of variable region 3 and variable region 4 are suppressed, and variable region 1 and variable are variable.
  • substitution mutations are introduced into the amino acid residues forming the interface of the variable region so as not to suppress (or facilitate) the association of region 4 and the association of variable region 2 and variable region 3.
  • variable region 1 and variable region 3 when a structural isomer having a structure in which variable region 1 and variable region 3 are associated and variable region 2 and variable region 4 are associated is formed, Inhibiting and preventing (or facilitating) the association of variable region 1 and variable region 4 and the association of variable region 2 and variable region 3 to form a variable region interface Introduces substitution mutations in amino acid residues.
  • [Variable region 1] (Linker 1) [Variable region 2] (Linker 1) [Variable region 3] (Linker 1) [Variable region 4] ) 2 illustrates a method for increasing the content of the bivalent scFv type.
  • variable region 1 and variable region 4 When a single chain diabody type occurs in sc (Fv) 2, the association of variable region 1 and variable region 4 and the association of variable region 2 and variable region 3 are suppressed, and variable region 1 and variable are variable. Introduce substitution mutations in the amino acid residues that form the interface of the variable region, so as not to suppress the association of region 2 and the association of variable region 3 and variable region 4 .
  • variable region 1 and variable region 3 when a structural isomer having a structure in which variable region 1 and variable region 3 are associated and variable region 2 and variable region 4 are associated is formed, Inhibiting and suppressing (or facilitating) the association of variable region 1 and variable region 2 and the association of variable region 3 and variable region 4 form a variable region interface. Introduces substitution mutations in amino acid residues.
  • variable region 1 and the variable region 3 when a structural isomer having a structure in which the variable region 1 and the variable region 3 are associated is formed, this association is suppressed, and the variable region 1 and the variable region 2 Yes, so as not to inhibit (or promote) association and association of variable region 3 and variable region 4 A substitution mutation is introduced into an amino acid residue forming the interface of the variable region.
  • the ratio of bivalent scFv type is reduced, and single chain diabody type
  • the amino acid residue forming the interface between VH1 and VL2 is replaced with an amino acid residue having the same type of charge to form an interface between VH3 and VL4.
  • the group is replaced with an amino acid residue having the same kind of charge and having a charge (preferably an affinity charge) that does not repel the amino acid residue introduced into VH1 and VL2.
  • the amino acid side chain forming the interface between VH1 and VL2 is replaced with a larger side chain (knob), and the amino acid side chain forming the interface between VH3 and VL4 is replaced with a smaller side chain. Replace with (hole).
  • the association between VH1 and VL2 and the association between VH3 and VL4 can be suppressed, and the association between VH1 and VL4 and the association between VL2 and VH3 can be controlled (or promoted).
  • [VH1] linker 1 [VL2] linker 1 [VH3] linker 1 [VL4] are arranged in this order! /,
  • sc (Fv) 2 the proportion of single chain diabody type is reduced and bivalent
  • the amino acid residue forming the interface between VH1 and VL4 is replaced with an amino acid residue having the same kind of charge, and the interface between VH3 and VL2 is formed.
  • the amino acid residue is replaced with an amino acid residue having the same kind of charge and having a charge (preferably an affinity charge) that does not repel the amino acid residue introduced into VH1 and VL4.
  • the amino acid side chain forming the interface between VH1 and VL4 is replaced with a larger side chain (knob), and the amino acid side chain forming the interface between VH3 and VL2 is replaced with the smaller side chain.
  • the method includes the step of substituting the amino acid residue having the same kind of charge as the amino acid residue of the following (1) and (2) or (3) and (4): , Sc (Fv) 2 provides a method for increasing the content of a particular structural isomer in a composition.
  • the present invention relates to any one of the following amino acid residues (1) and (2), or any one of (3) and (4): Provided is a method for increasing the content of a specific structural isomer in an sc (Fv) 2 composition, comprising the step of substituting a group.
  • amino acid residues described in (1) to (4) above are usually (1) glutamine (Q), (2) glutamine (Q), (3) in humans and mice, respectively.
  • leucine (L) and (4) proline (P) they are not necessarily limited to this amino acid residue, and may be other amino acids corresponding to this amino acid.
  • the amino acid corresponding to position 38 in the amino acid sequence on VL may be histidine (H), for example.
  • H histidine
  • the sc (Fv) 2 composition contains It is also possible to suppress the isomeric reaction of structural isomers described later.
  • the present invention includes a step of replacing an amino acid residue formed by forming an interface between a heavy chain variable region and a light chain variable region of sc (Fv) 2 with a charged amino acid residue.
  • a method of inhibiting the isomerization reaction of structural isomers in the composition is also provided.
  • the specific embodiment of the step of replacing the amino acid residue with a charged amino acid residue when the heavy chain variable region and the light chain variable region of sc (Fv) 2 form an interface is as described above. is there.
  • the present invention adjusts the proportion of structural isomers in the sc (Fv) 2 composition by adjusting the length of the linker or Z at both ends of sc (Fv) 2 and the length of the central linker.
  • sc (Fv) 2 is defined as [variable region 1] (linker 1) [variable region 2] (linker 1 2) [variable region 3] (linker 1) 3 [variable region 4] ]
  • Linker 1 and Linker 1 are the linkers at both ends, and Linker 1 is the center linker.
  • the ratio of single chain diabody type in the sc (Fv) 2 composition is increased by setting the linkers at both ends to 0 to 12 amino acids and the central linker to 10 to 30 amino acids.
  • Increase the ratio of bivalent scFv type in the sc (Fv) 2 composition by setting the linkers at both ends to 12-30 amino acids and the central linker to 0-10 amino acids.
  • the content ratio of the single chain diabody type is 80% or more, preferably 90% or more, particularly preferably.
  • the content ratio of the bivalent scFv type is adjusted to 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, by adjusting the length of the linker at both ends and / or the central linker.
  • a method for producing a sc (Fv) 2 composition is provided.
  • sc (Fv) 2 having a single chain diabody type content ratio of 80% or more by setting the linkers at both ends to 0 to 12 amino acids and the central linker to 0 to 10 amino acids.
  • the present invention provides a method for identifying the structure of a structural isomer in an sc (Fv) 2 composition, comprising the step of cleaving the linker site of sc (Fv) 2.
  • the partial position of the linker means a portion including the linker and the vicinity of the linker.
  • the near-linker region refers to a region having 20 amino acid strength from the amino acid adjacent to the linker to the 20th amino acid from the amino acid to the variable region side.
  • the linker site is a site in which a region of about 20 amino acids is added to both ends of the linker.
  • This method is a simpler method than the analysis method of single chain diabody type and bivalent scFv type by chromatography or the like. Even if structural isomers can be separated by chromatography, the structure of the separated sc (Fv) 2 cannot be identified. It is possible to identify the structure of structural isomers separated by chromatography etc. by this method.
  • the single chain diabody type and the bivalent scFv type have different steric structures, so if one of the three linker partial positions is cleaved by an enzyme, etc., the single chai n diabody type and the bivalent scFv type The mold makes a difference in the product after cutting.
  • sc (Fv) 2 is [variable region 1] (linker 1) [variable region 2] (linker 1) 2 [variable region 3] (linker 3) [variable region 4]
  • linker 1 When arranged in order, in bivalent scFv type, when the linker is cleaved at 1 or 3 sites, the four variable regions are covalently or non-covalently bound, so they are separated into two scFvs. However, when cleaved at the site of linker 1, it is separated into two scFvs, scFv consisting of variable regions 1 and 2 and scFv consisting of variable regions 3 and 4.
  • sc (Fv) 2 is converted to a single chain diabody type by cleaving one of the sc (Fv) linker sites with an enzyme and comparing the products after cleavage. It is possible to examine whether it is bivalent scFv type. Accordingly, the present invention provides a method for analyzing the type of structural isomer in sc (Fv) 2 composition, comprising the step of cleaving the linker site of sc (Fv).
  • the linker part of sc (Fv) 2 does not have a higher-order structure, and is therefore susceptible to degradation by proteases and the like (Hoedemaeker et al, J Biol Chem. 1997; 27 2: 29784-29789)
  • the method for cleaving the linker is not particularly limited, but cleavage with an enzyme is preferred, and cleavage with a protease is particularly preferred.
  • the protease to be used is not particularly limited and may be either an exopeptidase or an endopeptidase, but endopeptidase is preferable for the purpose of cleaving the linker.
  • the endopeptidase can be any one such as serine protease, thiorebeptidase, acid 'protease, meta-protease, etc., and can be appropriately selected according to the type of linker and amino acid sequence. It is.
  • serine proteases include trypsin that specifically hydrolyzes the C-terminal side of Arg and Lys residues, and subtilisin that hydrolyzes protein non-specifically.
  • thiol proteases include pyroglutamate aminopeptidase, which specifically hydrolyzes the pGlu residue at the N-terminal of protein 'peptide, and papain, which hydrolyzes protein / peptide nonspecifically.
  • the number of linkers to be cut is not limited, but is preferably one.
  • the conditions for cutting one linker can be determined by methods known to those skilled in the art.
  • the molecular weight or structure of the product after cleavage can be determined by measuring noncovalent bonds between variable regions. For example, it is possible to use a native page or gel filtration.
  • Anti-human Mpl antibody VB22B sc (Fv) 2 was prepared as shown in PCT / JP2004 / 18506 (International Publication WO2005 / 56604). Specifically, the antibody variable region cDNA of mouse hyperpridoma VB22B that produces anti-human Mpl antibody is cloned, and the nucleotide sequence encoding the linker sequence (GlyGlyGlyGlySer) x3 (SEQ ID NO: 1) and the FLAG sequence (AspTyrLysAspAspAspLys) ( Using the base sequence encoding SEQ ID NO: 2), create a DNA having a base sequence (SEQ ID NO: 3) consisting of VH linker sequence VL linker sequence VH linker sequence VL—Flag tag sequence did.
  • This DNA fragment was cloned into the expression vector pCXND3 to construct a VB22B sc (Fv) 2 expression vector, and the gene was introduced into CHO-DG44 cells to produce a stable expression cell line. Specifically, 0.75 mL of CHO-DG44 cells (1 X 10 7 cells / mL) suspended in PBS mixed with an expression vector (25 ⁇ g) was cooled on ice for 10 minutes and transferred to a cuvette. Later, a pulse was applied at a capacity of 1.5 kV and 25 ⁇ FD using Gene Pulserll (BioRad).
  • the cells treated with electoporation were selected by addition to CHO-S-SFMII medium (Invitrogen) containing g / mL Geneticin (Invitrogen), and VB22B sc (Fv ) 2 production CHO cell line was established.
  • the culture supernatant from this cell line was applied to a Macr 0-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I (Bio-Rad) column equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 6.8), and 250 mM phosphate buffer was applied. Elute stepwise with liquid (PH6.8).
  • the elution fraction was concentrated using an ultrafiltration membrane and then subjected to gel filtration chromatography using a HiLoad 26/60 Superdex200pg column, and a fraction corresponding to a molecular weight of about 70 kD to 40 kD was collected.
  • This fraction was added to 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 It was adsorbed on an Anti-Flag M2 Affinity Gel (SIGMA-ALDRIC H) column equilibrated with mM NaCl, 0.05% Tween 20, and eluted with 100 mM Glycine-HCl (pH 3.5). The eluted fraction was immediately neutralized with 1M Tris-HCl (pH 8.0) and subjected to gel filtration chromatography using a HiLoad 26/60 Superdex200pg (Amersham-Bioscience) column. As the buffer for the gel filtration chromatography, 20 mM acetic acid (pH 6.0), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 80 was used.
  • VB22B sc (Fv) 2 is sc (Fv) 2 having the sequence of VH -linker- VL -linker- VH -linker- VL
  • VH and VL form Fv, respectively, bivalent scFv type, VH and VL, VH and VL
  • Mobile phase B 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8.0
  • VB22B sc (Fv) 2 was separated into four peaks.
  • the chromatograms shown in Fig. 2 were obtained, and the peaks with short retention times were named pre peakl, pre peak2, peak 1, and peak2, respectively.
  • VB22B sc (Fv) 2 has no sugar chain, and peakl and peak2 have the same primary amino acid sequence. It was suggested that peakl and peak2 are conformational isomers because they have different steric structures separated by ion exchange chromatography. In the public literature, the existence of structural isomers was suggested. This study made it possible to separate structural isomers for the first time.
  • VB22B sc (Fv) 2 is sc (Fv) 2 having the sequence of VH -linker- VL -linker- VH -linker- VL
  • H and VL each form Fv, VH and VL, VH and VL are F respectively
  • protease limited digestion method was found as an analytical method for identifying two types of structural isomers.
  • the linker part of sc (Fv) 2 is considered to have a relatively free structure, and is considered to have low resistance to protease.
  • Subtilisin A a kind of protease, is used under the following conditions, peakl and peak2 And VB22B bulk (peakl: peak2 to 1: 3).
  • peakl was identified as bivalent scFv type and peak2 as single chain diabody type.
  • the anti-human Mpl antibody VB22B sc (Fv) 2 has been reported in the literature (Blood 2005; 105: 562-566) to exhibit TPO-like agonist activity. Therefore, we evaluated the TPO-like agonist activity of structural isomers isolated using BaF3-human Mp or BaF3-monkey Mpl, which show TPO-dependent growth.
  • WST-8 reagent Cell Count Reagent SF, Nacalai Tesque
  • WST-8 reagent Cell Count Reagent SF, Nacalai Tesque
  • Fig. 6 shows the results of evaluating the TPO-like antigen activity in BaF3-human Mpl and BaF3-monkey Mpl using the purified structural isomer of VB22B sc (Fv) 2. Comparison of the peak activity of the structural isomers of peakl and peak 2 revealed that peak2 showed significantly higher activity. This suggests that the anti-Mpl antibody sc (Fv) 2 must have a single chain diabody structure in order to exhibit TPO-like antigen activity.
  • a humanized antibody was prepared by grafting a complementary antigen determining region (hereinafter referred to as CDR) into the framework region (hereinafter referred to as FR) of the variable region of VB22B sc (Fv) 2 prepared in Example 1.
  • CDR complementary antigen determining region
  • FR framework region
  • VH linker sequence VL linker sequence VH linker sequence VL It is designed to hybridize about 20base synthetic oligo DNA so that the gene has SEQ ID NO: 4), and these synthetic oligo DNAs are assembled by PCR to encode each variable region.
  • An expression vector was constructed and a constant expression CHO-DG44 cell line was prepared in the same manner as in Example 1-1 so that the obtained gene was expressed in animal cells, and the culture supernatant was collected. Since the humanized antibody hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 is not tagged with a Flag tag, purification from the culture supernatant was performed using MG10 (human), an epitope recognized by VB22B sc (Fv) 2. Mpl amino acid sequence Gln213 to Ala231) and GST fusion protein were used. The MG10 and GST fusion protein was purified using Glutathione Sepharose 4B (Amersham Biosciences) according to the manufacturer's protocol.
  • MG10 and GST fusion protein was immobilized on HiTrap NHS-activated HP (Amersham Biosciences) according to the manufacturer's protocol to produce an affinity column.
  • the cell culture supernatant is applied to an MG10-GST fusion protein-fixed column, adsorbed with the humanized antibody hVB22B u2 -wz4 sc (Fv) 2, and eluted with lOOmM Glycine-HCl (pH 3.5), 0.01% Tween80
  • the eluted fraction was immediately neutralized with 1M Tris-HCl (pH 7.4) and subjected to gel filtration chromatography using HiLoad 16/60 Superdex200 pg (Amersham Biosciences).
  • As a buffer for gel filtration chromatography 20 mM citrate buffer (pH 7.5), 300 mM NaCl, 0.01% Tween
  • hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 has the sequence of VH -linker- VL -linker- VH -linker- VL
  • sc (Fv) 2 is similar to that of VB22B sc (Fv) 2, and the structure is Fv (a molecule that is non-covalently bound between VH and VL). Forming bivale
  • nt scFv type VH and VL ⁇ VH and VL form Fv, respectively, single chain diabody type
  • Mobile phase A 20 mM sodium phosphate, pH 7.5
  • Mobile phase B 20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH 7.5
  • peakl and peak2 the molecular weight was measured using a Q-TOF mass spectrometer (Q Tof Ultima, Micro Mass). The sample solution was introduced into the Q-TOF by infosion, and the resulting polyvalent ion spectrum (+) was deconvoluted using the attached software (MassLynx), resulting in a peakl molecular weight of 53768 Da and a peak2 molecular weight. As a result, 53769 Da was obtained. From this force, it was found that peakl and peak2 have the same molecular weight.
  • Peptide mapping was performed for peakl and peak2. Reduced denaturation, carboxymethyl After digestion, it was decomposed into peptide fragments using trypsin, and a peptide map was obtained by reverse phase chromatography (YMC-Pack-ODS). When the peptide maps of Peakl and peak2 were compared, the mapping patterns of peakl and peak2 were the same as shown in FIG. 8, and thus it was found that the amino acid primary structure was the same.
  • hVB22B u2- wz4 sc (Fv) 2 has a sugar chain and peakl and peak2 have the same molecular weight according to TOF-MASS measurement, and peakl and peak2 have the same mapping pattern. It was found that peakl and peak2 are conformational isomers having different steric structures.
  • hVB22B u2— wz4 sc (Fv) 2 has VH—linker—VL -linker—VH—linker—VL sequence
  • VH and VL and VH and VL form Fv by combining Fv (molecules that are non-covalently bound between VH and VL), respectively.
  • Bivalent scFv bivalent scFv
  • VH and VL each form Fv, single chain diabody type
  • peakl and peak2 have either bivalent scFv type or single chain diab ody type structure, respectively.
  • protease-limited degradation method As an analytical method for identifying two types of structural isomers, a protease-limited degradation method was found.
  • the linker part of sc (Fv) 2 has a relatively free structure and is considered to have low resistance to protease.
  • subtilisin A a kind of protease, peakl and It was reacted with peak2 and hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 (peakl: peak2 to 1: 4).
  • VB22B sc (Fv) 2 has the sequence of VH -linker- VL -linker- VH -linker- VL sc (Fv) 2
  • the structure is determined by the combination of Fv (molecules non-covalently bonded between VH and VL).
  • Fv molecules non-covalently bonded between VH and VL.
  • Bivalent scFv type in which H and VL, VH and VL form Fv, VH and VL, VH and VL, respectively
  • Mobile phase B 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8.0
  • two structural isomers can be separated by the analysis method shown in Example 2 using a linker having an arbitrary length, and the content ratio of structural isomers is determined. I was able to measure. It turns out that the ratio of the bivalent scFv type to the single chain diabody type can be controlled by the length of the linker, and by using this analysis method, an appropriate linker that can obtain the desired structural isomer ratio can be obtained. It became possible to design a chief.
  • the culture supernatant strength of the CHO cells expressing hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 used in Example 2-1 was also purified.
  • the culture supernatant was diluted 3-fold with purified water and then adjusted to pH 6.0 with 1 M acetic acid. Then, it is applied to a 20 mM sodium acetate buffer, SP Sepharose Fast Flow column (Amersham Biosciences) equilibrated with pH 6.0, the column is washed with the same buffer, and then 0 M NaCl in the same buffer up to 0.5 M is added.
  • the polypeptide adsorbed on the column was eluted with a linear concentration gradient (first step).
  • the obtained fraction was analyzed by reducing SDS-PAGE using TrisGlycine SDS gel 12%, and fractions containing hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 were collected.
  • the hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 fraction in the first step was applied to a hydroxyapatite column, type I, 20 m (BIO-RAD) equilibrated with 10 mM phosphate buffer, pH 6.8. After adding the column and washing the column with the same buffer, the pH 6.8 phosphate buffer concentration was linearly increased to 160 mM to elute the polypeptide adsorbed on the force ram (Fig. 14). A small peak eluted after the main peak, and SDS-PAGE analysis confirmed that both were hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2. As shown on the right of Fig.
  • the main peak is mostly hVB 22B u2-wz4 sc (Fv) 2 monomer by analytical gel filtration using Superdex 200 PC 3.2 / 30 column (Amersham Biosciences).
  • the back peak was found to be an aggregate fraction of more than one dimer of hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2. From the above, it was found that the monomer fraction of hVB22B u 2-wz4 sc (Fv) 2 can be separated in this step.
  • the monomer fraction of hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 obtained in the second step was diluted 5-fold with purified water and then equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0. Apply to a SOURCE 15S column (Amersham Biosciences), wash the column with the same buffer, apply a linear gradient of NaCl up to 36 mM of 0 mM force in the same buffer, and then separate the two peaks to the maximum. The NaCl concentration was fixed at 36 mM. As shown in Fig.
  • the amino acid described in the 39th position of VH (SEQ ID NO: 289 of WO2005 / 56604), which is the amino acid that forms the VH / VL interface of hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 (hereinafter, u2-wz4) prepared in Example 2 Gin at the 39th position in the sequence and Gin at the 38th position in the VL (position 43 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 291 of WO2005 / 56604) were modified as follows.
  • u2-wz4 is linked by the amino acid linker sequence (GlyGlyGlyGlySer) x3 (SEQ ID NO: 1) in the order of [VH1] linker [VL2] linker [VH3] linker [VL4] and described in SEQ ID NO: 4. Transcribed and translated with the base sequence.
  • the 39th Gin of VH1 is Glu (gene codon GAG)
  • the 38th Gin of VL2 is Lys (gene codon AAG)
  • the 39th Gin of VH3 (gene codon).
  • Gene hVB22B u2-wz4 (v3) sc (Fv) 2 (hereinafter referred to as codon CAG) modified to Lys (gene codon AAG) and 38th Gin of VL4 (gene codon CAG) to Glu (gene codon GAG) v3, the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 7 and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 8).
  • a point mutation was introduced using QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (manufactured by STRATAGENE) according to the manufacturer's protocol.
  • the DNA fragment was cloned into the expression vector pCXND3 to construct an expression vector, and the gene was introduced into CHO-DG44 cells to produce a stable expression cell line.
  • a mixture of expression vector (20 ⁇ g) and 0.75 mL of CHO-DG44 cells (1 X 107 cells / mL) suspended in PBS was cooled on ice for 10 minutes and transferred to a cuvette.
  • a pulse was applied using a Gene Pulser Xcell (BioRad) at a capacity of 1.5 kV and 25 ⁇ FD.
  • electorporation-treated cells were selected by adding to CHO-S-SFMII medium (Invitrogen) containing 500 g / mL Geneticin (Invitrogen), and the vl-producing CHO cell line And a v3 producing CHO cell line was established.
  • VH / VL interface modified sc (Fv) 2 is attached with a Flag tag! /
  • the purification from the culture supernatant is the epitope recognized by VB22B sc (Fv) 2 MG10 (human Mpl amino acid sequence Gin 213 to Ala231) and GST fusion protein were used.
  • the MG10 and GST fusion protein was purified using Glutathione Sepharose 4B (Amersham Biosciences) according to the manufacturer's protocol.
  • purified MG10 and GST fusion protein was immobilized on HiTrap NHS-activated HP (Amersham Biosciences) according to the manufacturer's protocol to produce an affinity column.
  • the culture supernatant of vl-expressing CHO cell line or v3-expressing CHO cell line is applied to MG10-GST fusion protein fixed column, adsorbed vl or v3, and eluted with lOOmM Glycine-HCl (pH3.5), 0.01% Tween80 I let you.
  • the eluted fraction was immediately neutralized with 1M Tris-HCl (pH 7.4) and subjected to gel filtration chromatography using HiLoad 16/60 Superdex200pg (Amersham Biosciences) to purify the monomer molecule.
  • PhastGel Dry IEF gel (Amersham Biosciences) was swollen with the following gel swelling solution for 30 minutes or more. The sample was added to the previously swollen gel and electrophoresed by PhastSystem under the following electrophoresis conditions. After electrophoresis, the sample was immersed in a 20% TCA solution for 30 minutes, then washed with milli-Q water for 5 minutes x 3 times or more, and stained with Komashi or silver depending on the protein concentration of the sample. In Kumasi staining, staining is performed using 0.02% CBB containing 0.1% CuSO (w / v) as a staining solution, and decolorized with 30% methanol containing 10% acetic acid.
  • Silver stain kit Protein (Amersham Biosciences) was used, and staining was performed according to the standard protocol attached to the kit.
  • Step 1 2000V 2.5mA 3.5W 15 ° C 75Vh
  • Step 2 200V 2.5mA 3.5W 15 ° C 15Vh
  • reaction solution was analyzed by gel filtration chromatography under the following conditions.
  • u2- wz4 is 24% bivalent scFv type, 76% is single chain dia body type Is expressed as a mixture of both structural isomers, whereas the variant vl is expressed as a 100 ng chain diabody structural isomer, and the variant v3 is 100% bival ent scFv type The fact that it was expressed as an isomer was a force. Also, as shown in FIG.
  • modified v3 has a low molecular weight peak similar to u2-wz4 purified peakl, and modified vl has a low molecular weight similar to u2-wz4 purified peak2.
  • modified vl was expressed as a single chain diabody-type structural isomer. It was shown that the variant v3 is expressed as a structural isomer of the bivalent scFv type.
  • the agonist activity of VH / VL interface variants vl and v3 was evaluated.
  • the peak activity of the sinval chain diabody structure is very high, whereas the peak activity of the bivalent scFv structure is different. The activity is extremely reduced.
  • variant vl showed activity equivalent to peak 2
  • variant v3 showed activity almost equivalent to peakl. From the above, it was confirmed that in the biological activity, the variant vl formed a single chain diabody structure and the variant v3 formed a bivalent s cFv structure.
  • Tm value intermediate denaturation temperature
  • Solution conditions 20 mM sodium citrate, 300 mM NaCl, pH 7.0
  • Solution conditions 20 mM sodium citrate, pH 6.0
  • VH / VL interface modification applied to vl and v3, it can be expressed in a state where only one of the two structural isomers exists. I found it.
  • a VH / VL interface control for obtaining a single-chain antibody of a target structure a method of controlling the structure of a bispecific diabody using knobs-into-hole technology (Protein Sci. 1997 Apr; 6 (4): 78 ⁇ -8, Remodeling domain interfaces to enhance heterodimer forma tion., Zhu Z, Presta LG, Zapata G, Carter P.).
  • the formation rate of the target heterodimer structure increased from 72% to 92% by modifying a total of 4 amino acids per VH / VL interface.
  • the present invention modifies 4 amino acids (2 amino acids per VH / VL interface) to achieve 100% of the target structure without degrading thermostability and structural isomer stability. In the ratio Successfully acquired.
  • the vector obtained by inserting the mouse cytomegaloinores (mCMV) enhancer and promoter and the late polyadul site of simian virus-40 (SV40) into the pUC19 vector was named pMC.
  • mCMV mouse cytomegaloinores
  • SV40 late polyadul site of simian virus-40
  • pMCDN An expression vector in which the DHFR gene expression site of pCHOI and the Neomycin metagene expression site of the restriction enzyme of pCXN (Niwa et al., Gene 1991; 108: 193-200) were inserted into the pMC vector was named pMCDN.
  • the constructed humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 expression vector was linearized with a restriction enzyme, and then introduced into a CHO-DG44 cell to establish an antibody-expressing cell line.
  • the stable expression cell line was prepared as follows. The gene was introduced into the cells by the electopore position method using GenePulserXcell (Bio-Rad). A mixture of each antibody expression vector and 0.75 mL of CHO cells (1 X 10 7 cells / mL) suspended in PBS, cooled on ice for 10 minutes, transferred to a cuvette, then 1.5 kV, 25 ⁇ FD capacity A pulse was given. After a recovery period of 10 minutes at room temperature, the cells treated with electopore suspension were suspended in 40 mL of CHO-S-SFMII medium (Invitrogen) containing HT supplement (Invitrogen) at a 1-fold concentration. A 10-50-fold diluted solution was prepared with the same medium and dispensed at 100 L / well onto a 96-well culture plate. After incubation for 24 hours in a CO incubator (5% CO 2), Geneticin (Invitro)
  • Humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 expression CHO cell culture supernatant utilizing the binding of L chain of humanized anti-human IL-6 receptor antibody to Protein L was passed through a column packed with Protein L (manufactured by Actigen) to adsorb the humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 and eluted with lOOmM Glycine-HCl (pH 2.7). The eluted fraction was immediately neutralized with 1M Tris-HCl (pH 8.5) and subjected to Genore filtration chromatography using HiLoad 26/60 Superdex200pg (Amersham Biosciences). Dulbecco PBS was used as the buffer for gel filtration chromatography.
  • Human ⁇ anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 is a VH—linker—VL—linker—VH—linker—VL
  • the humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 was separated into two peaks.
  • a chromatogram as shown in Fig. 27 was obtained.
  • the peak with short retention time was named peakl and the long peak was named peak2.
  • Peakl and peak2 could be purified by the same method.
  • the results of cation exchange chromatography analysis of p eakl and peak 2 after purification are shown in FIG.
  • Peakl and peak2 of the fractionated humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 are considered structural isomers Therefore, the protease limited degradation method performed in Examples 2 and 3 was used as an analysis method for identifying two types of structural isomers. Reaction was performed with peakl and peak2 of humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 under the following conditions.
  • peakl was a single chain diabody type and peak2 was a bivalent scFv type. From Fig. 27, the amount of peak2 in human ⁇ anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 is higher than that in peakl, so in humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2
  • the bivalent scFv type was the main component, and the single chain diabody type was a minor component.
  • a human gpl30-expressing BaF3 cell line (hereinafter referred to as “Human interleukin-6 (R & D)”, lOOng / mL human interleukin-6 soluble receptor (R & D systems) and RPMI1640 medium containing 10% FBS were selected. BaF3 / gpl30) was established. 7-2. Evaluation of HL-6 neutralizing activity of structural isomers of humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2
  • IL-6 neutralizing activity was evaluated using BaF3 / gpl30, which shows IL-6-dependent proliferation.
  • the structural isomer of the purified humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 was diluted in RPMI1640 containing 10% FBS so as to be 10 / zg / mL. Using this solution, a dilution series with a dilution ratio of 3 and a total of 6 series was prepared, and 50 ⁇ L was dispensed into each well of a 96weU-plate (FALCON).
  • the difference in the activity of the two structural isomers of sc (Fv) 2 may differ depending on the type of target antigen and the amino acid sequence of the sc (Fv) 2 molecule.
  • separation of structural isomers, structural identification, and control of structural isomers are considered important.
  • each isomer may undergo an isomerization reaction during storage, and from the point of view of the quality specifications of the sc (Fv) 2 formulation, Control of isomers is considered important.
  • peakl is significantly less active than peak2 which is a single chain diabody, so bivalent scFv peakl is incubated at 20 mM sodium acetate, 150 mM NaCl, pH 6.0, 40 ° C. As a result, it was possible to transform the structure into peak 2, a highly active single chain diabody (the structural isomers become isomerized).
  • Bivalent scFv (peakl) purified from hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 in Example 4 was added to 20 mM sodium citrate, 0 mM / 150 mM / 300 mM NaCl, pH 3.0 / 3.5 / 4.0 / 4.5 / 5.0 / 5.5 / 6.0 / 6.5. / 7 Incubation for 10 days at 25 ° C under 30 conditions of 7.0 / 7.5.
  • the abundance ratio of peak 2 was increased as compared to before incubation.
  • a method for separating and obtaining two structural isomers in an sc (Fv) 2 composition a method for identifying the structure of the two separated structural isomers, A method for quantitative analysis of structural isomers was provided. Also provided is a method for increasing the proportion of specific structural isomers in the sc (Fv) 2 composition by adjusting the linker length. Further provided is a method for controlling the formation of structural isomers by modifying the amino acid in the variable region.
  • sc (Fv) 2 which defines the content ratio of structural isomers with the same structure, as a pharmaceutical composition by standard tests necessary for development as a pharmaceutical.

Abstract

　ヒトMpl抗体およびヒト化抗ヒトMpl抗体のsc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離し、得られた構造異性体のリンカーを切断することにより、構造異性体がsingle chain diabody型とbivalent scFv型であることを確認した。また、これら構造異性体のアゴニスト活性が著しく異なることを明らかにした。さらに、本発明者らは、温度変化やsc(Fv)2のリンカーの長さおよび可変領域のアミノ酸の改変により、sc(Fv)2組成物中の構造異性体の含有比率を調節可能であることを明らかにした。

Description

sc(Fv)2構造異性体
技術分野
[0001] 本発明は、 sc(Fv)2医薬組成物、並びにその製造方法に関する。
背景技術
[0002] sc(Fv)2は 2つの軽鎖可変領域 (VL)と 2つの重鎖可変領域 (VH)の 4つの可変領域 をリンカ一などで結合して一本鎖にした抗体である（Hudson et al、 J Immunol. Metho ds 1999 ; 231 : 177-189)。
[0003] 例えば、 VH -linker- VL -linker- VH -linker- VLや VL -linker- VH -linker- VL - lin
1 2 3 4 2 1 4 ker-VHの配列を有する一本鎖抗体が知られている。 sc(Fv)2の構造は、 Fv(VH,VL
3
間で非共有結合した分子）の組み合わせにより、 VH
1と VL
2、 VH
3と VL
4がそれぞれ Fv を形成する sc(Fv)2と、 VHと VL、 VHと VLがそれぞれ Fvを形成する sc(Fv)2の 2種類
1 4 3 2
の構造異性体が存在すると考えられる。
[0004] しかしながら、これまで、 sc(Fv)2の研究は Bispecific sc(Fv)2に関するものが多かつ た為、 sc(Fv)2の構造異性体にっ ヽてはほとんど報告がな!、。
[0005] Bispecific sc(Fv)2は、 VH -linker- VL -linker- VH -linker- VLの配列にお!/、て、 VH
1 2 3 4
と VL、および、 VHと VL (ある!/ヽは VHと VL、および、 VHと VL )力 ^異なるモノクロ一
1 4 3 2 1 2 3 4
ナル抗体由来の可変領域をもつ sc(Fv)2である。 Bispecific sc(Fv)2の場合には、 VH
1 と VL、または、 VHと VL (あるいは VHと VL、または、 VHと VL )が同じモノクローナ
4 3 2 1 2 3 4
ル抗体由来であることから Fvを形成する効率が高くなり、構造異性体の出現はある程 度抑制されると考えられる。実際に、リンカ一長を 15- 5-15と 15-15-15の bispecific sc( Fv)2を作製しても、活性は変らないことが報告されている (非特許文献 5)。従って、 Bi specific sc(Fv)2の場合は構造異性体に関しては詳細な言及がされて ヽな 、ことが多 い。例えば、非特許文献 3、 4、 8、 9は、 bispecificな結合活性を確認することにより正 し 、組み合わせの Fvが存在することは示して!/、るが、正しくな!/、Fvの組み合わせの 存在比率や両者の存在比の定量的な評価に関する記載はない。また、非特許文献 6は、 Bispecific sc(Fv)2のリンカ一の長さを変化させること（両端あるいは中央のリンカ 一の長さの改変）〖こより、 monomer, dimerの構造変換を確認しているが、 sc(Fv)2の構 造異性体については分子構造モデル予測での議論に留まっており、実際の試料に おける構造異性体の存在比率や構造の同定に関する記載はない。
[0006] また、 sc(FV)2の構造異性体にっ 、て着目されて 、な力つたので、構造異性体の制 御についても詳細な検討はなされていない。非特許文献 10においても、リンカ一の 長さを 5-15-5あるいは 15-5-15にすることで、それぞれ single chain diabodyあるいは b ivalent scFvの構造を取ることを予測している。これは、 scFvにおいてリンカ一の長さ が 12以下の場合、一般的に隣り合う VHと VLは Fvを形成しにくい（つまり monomerを形 成しにくい）ことが報告されているためである。し力しながら、非特許文献 2において、 リンカ一の長さが 10あるいは 5の Fvにおいても少量だが monomerが形成することが報 告されており、非特許文献 10におけるリンカ一の長さを 5-15-5あるいは 15- 5-15の場 合においても、得られた sc(Fv)2は必ずしも 100%の single chain diabodyあるいは bival ent scFvの構造であるとは限らない。
[0007] これまでの報告では構造異性体に関しては Fvの組み合わせとリンカ一の長さから の構造予測のみで、構造異性体の含有比率の定量的分析や得られた構造が目的の 構造であるかどうかの確認'証明は行われておらず、構造異性体が十分に評価およ び制御されているとは言えない。すなわち、いかなるリンカ一の長さの sc(Fv)2におい ても、 Fvの組み合わせとリンカ一の長さからは構造異性体の存在比を予測することは 極めて困難であり、 2組の VH、 VLを有する sc(Fv)2型分子においては 2つの構造異性 体の存在は考えなければならない問題である。
[0008] 低分子化合物に関しては、光学異性体や幾何異性体の分離方法は多数知られて いるが、これまでにタンパク質の異性体を分離する方法は報告されていない。タンパ ク質の 1アミノ酸の違いを分離するような方法はすでに多数報告されている力 完全 に同一なアミノ酸一次配列を有する 2つの構造的な異性体を分離する方法はこれま でに報告がない。 sc(Fv)2の構造異性体に関しても同様で、従来技術では sc(Fv)2の 2 種類の構造異性体の分離分析法、確認方法はこれまでに存在しなカゝつた。
[0009] これまでに sc(Fv)2の構造異性体の分離方法が存在しな力つたことから、 2種類の構 造異性体の間での活性の違いに着目した報告はない。 Bispecific sc(Fv)2においては 、構造異性体により正し 、Fvの組み合わせと正しくな 、Fvの組み合わせの間で活性 が大きく異なることは当然予想される力 Monospecific sc(Fv)2においては、同じ 2価 である構造異性体間で活性の違いに関しては予想し難し 、。非特許文献 10にお ヽ ては、 2つの構造異性体間で活性が異なる可能性は考えず、活性 (結合活性)は構 造異性体の混合物で測定して!/、る。これは sc(Fv)2の構造異性体の分離精製の困難 さから、それぞれの構造異性体を高純度に調製し活性を厳密に比較することができ なかったためである。
[0010] リンカ一の長さを改変した sc(Fv)2においても、リンカ一の長さ力も想定される 2つの 構造異性体をそれぞれモデル予測ではなぐ同定"し、その構造異性体の含有比率 を定量的に評価することはこれまで不可能であった。そのため、 sc(Fv)2のリンカ一の 長さと構造異性体の含有比率の関係を明らかにした定量的な検討はこれまで実施さ れておらず、実質的にリンカ一の長さにより構造異性体の含有比率をコントロールし た報告はない。
[0011] リンカ一の長さを変化させることは sc(Fv)2の 2つの抗原結合部位間の距離を変える ことになることから、リンカ一の長さはその生物活性 (特にレセプターを二量体ィ匕する ようなァゴ-スト活性）に影響する可能性がある。そのため抗原の種類により、 2つの 抗原結合部位間距離はリンカ一の長さによって任意に調節可能であることが望まし い。また、リンカ一の長さは安定性に大きく影響を及ぼすことが報告されており（非特 許文献 1、非特許文献 2)、 scFvでは一般にリンカ一が短いほど安定性が低いことが 知られている。 sc(Fv)2においても同様に考えられ、中央のリンカ一を短くすることによ つて、会合体 (dimer)が生成しやすくなることが報告されており（非特許文献 6)、安定 性の高い sc(Fv)2を作製するためにはリンカ一の長さは任意に調節可能であることが 望ましい。このようなこと力ら、 sc(Fv)2を医薬品として開発する場合、任意のリンカ一 の長さにおいて目的の構造異性体を単離できることが望ましいと考えられる。しかし ながら、これまで任意のリンカ一長を持つ sc(Fv)2において、 bivalent scFvと single cha in diabodyの 2種類の構造異性体をそれぞれ単離した報告はな ヽ。
[0012] 構造異性体を含む sc(Fv)2を医薬品として開発するためには、目的の構造異性体の みを分離精製し、構造異性体の一方のみを含む原薬を製造すること、あるいは、原 薬が構造異性体混合物の場合には、 2種類の構造異性体の性質を決定し、各構造 異性体の含有比率を定量的に分析する規格試験を実施することが必要となる。しか しながら、これまで sc(Fv)2の構造異性体の分離精製'定量的分析'構造同定する方 法は知られていない。
[0013] また、リンカ一の長さによる scFvの monomer/dimer/trimer/tetramerの存在比率を制 御する方法が報告されている力 sc(Fv)2の構造異性体に関しては、上述のとおり、 構造異性体の定量的分析法が見出されていないため、リンカ一の長さによる構造異 性体存在比率の制御方法はこれまでに報告されて！ヽな ヽ。
[0014] 非特許文献 1： Protein Engineering, 1993, 6(8), 989-995
非特許文献 2 : Protein Engineering, 1994, 7(8), 1027-1033
非特許文献 3 Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374
非特許文献 4 Journal of Immunology, 1995, 154, 4576-4582
非特許文献 5 : PNAS, 1995, 92, 7021-7025
非特許文献 6 Journal of Molecular Biology, 1999, 293, 41-56
非特許文献 7 : Protein Engineering, 2001, 14(10), 815-823
非特許文献 8 Journal of Molecular Biology, 2003, 330, 99-111
非特許文献 9 : Protein Eng Des Sel. 2004 Apr,17(4),357-66
非特許文献 10 : Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281
非特許文献 11 : Int. J. Cancer, 1998, 77, 763-772
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0015] 本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、 sc(Fv)2の特定 の構造異性体を有効成分として含有する医薬組成物、およびその製造方法、および 医薬品開発のための構造異性体の構造決定方法と規格試験法を提供することにあ る。また、 sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の割合を増加させる方法、該方法を 利用した sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体を 分析する方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段 [0016] ヒト Mpl抗体およびヒト化抗ヒト Mpl抗体の sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離し、 得られた構造異性体のリンカ一又はリンカ一近傍領域を切断することにより、構造異 性体力 ngle chain diabody型と bivalent scFv型であることを確認した。また、これら構 造異性体のァゴニスト活性が著しく異なることを明らかにした。
[0017] さらに、本発明者らは、 sc(Fv)2のリンカ一の長さの改変により、 sc(Fv)2組成物中の 構造異性体の含有比率を調節可能であることを明らかにした。
[0018] 本発明は、以下の〔1〕〜〔44〕を提供するものである。
〔1〕以下の工程を含む sc(Fv)2医薬組成物の製造方法。
(a) SC(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(b)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程
〔2〕以下の工程を含む sc(Fv)2医薬組成物の製造方法。
(a) SC(Fv)2の構造異性体の活性を比較して高活性の構造異性体をあらかじめ決定 する工程
(b) sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(c)工程 (a)により決定された高活性の構造異性体を取得する工程
〔3〕以下の工程を含む sc(Fv)2医薬組成物の製造方法。
(a) sc(Fv)2組成物中の構造異性体の比率が好ましい値になるようにリンカ一の長さを 決定する工程
(b)工程 (a)で決定されたリンカ一の長さを有する sc(Fv)2組成物を作製する工程
(c)作製された sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(d)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程
〔4〕以下の工程を含む sc(Fv)2医薬組成物の製造方法。
(a)リンカ一の長さが異なる複数の sc(Fv)2組成物を作製する工程
(b) sc(Fv)2組成物中の構造異性体の比率が好まし 、値となるリンカ一を有する sc(Fv )2を選択する工程
(c)工程 (b)で選択された sc(Fv)2のリンカ一と同じ長さのリンカ一を有する sc(Fv)2組 成物を作製する工程
(d)作製された sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程 (e)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程
[5]構造異性体力 ngle chain diabody型又は bivalent scFv型である〔1〕〜〔4〕の!ヽ ずれかに記載の方法。
〔6〕構造異性体がァゴニスト活性を有することを特徴とする〔 1〕〜〔5〕の ヽずれかに 記載の製造方法。
〔7〕 sc(Fv)2のリンカ一が 15アミノ酸であることを特徴とする〔1〕〜〔6〕の 、ずれかに記 載の製造方法。
〔8〕〔1〕〜〔7〕の 、ずれかに記載の製造方法により作製された医薬組成物。
〔9〕 sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の割合が 80%以上であることを特徴とする 医薬組成物。
〔10〕構造異性体力 ngle chain diabody型又は bivalent scFv型である〔9〕に記載の 医薬組成物。
〔11〕構造異性体が受容体に結合することを特徴とする〔9〕または〔10〕に記載の医 薬組成物。
〔12〕構造異性体がァゴニスト活性を有することを特徴とする〔9〕〜〔11〕のいずれか に記載の医薬組成物。
〔13〕 sc(Fv)2のリンカ一が 15アミノ酸である〔9〕〜〔12〕のいずれかに記載の医薬組成 物。
〔14〕 sc(Fv)2組成物中の構造異性体の割合を変化させる工程を含む、 sc(Fv)2組成 物の活性を調節する方法。
〔15〕 sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の割合を増加させる工程を含む、 sc(Fv) 2組成物の活性を増加させる方法。
〔16〕以下の工程を含む sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(a) SC(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(b)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程
〔17〕以下の工程を含む sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(a) SC(Fv)2の構造異性体の活性を比較して高活性の構造異性体をあらかじめ決定 する工程 (b) sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(c)工程 (a)により決定された高活性の構造異性体を取得する工程
〔18〕以下の工程を含む sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(a) sc(Fv)2組成物をイオン交換カラムにかける工程
(b)特定の構造異性体を除去する工程
〔19〕構造異性体が single chain diabody型又は bivalent scFv型である〔14〕〜〔18〕 のいずれかに記載の方法。
〔20〕 sc(Fv)2組成物を加熱する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体 の含有割合を増加させる方法。
〔21〕構造異性体が single chain diabody型又は bivalent scFv型である〔20〕に記載の 方法。
[22] sc(Fv)2組成物を 15°C〜50°Cでインキュベートする工程を含む、 sc(Fv)2組成物 中の single chain diabody型の含有割合を増加させる方法。
〔23〕 sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成して 、るアミノ酸残基を、 電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む sc(Fv)2組成物中の特定の構造異 性体の含有割合を増加させる方法。
〔24〕以下の（1)および（2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残 基に置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有割合を増 加させる方法。
(1) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域の 39位 に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 38位に相当するアミノ酸残基
〔25〕以下の（1)および（2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残 基に置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有割合を増 加させる方法。
(1) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のァミノ 酸配列における 45位に相当するアミノ酸残基 (2) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 44位に相当するアミノ酸残基
〔26〕以下の（1)および（2)の 、ずれか一方のアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸 残基に置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有割合を 増加させる方法。
(1) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のァミノ 酸配列における 45位に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 44位に相当するアミノ酸残基
[27] sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成して 、るアミノ酸残基を、 電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む sc(Fv)2組成物の活性を増加させる 方法。
〔28〕以下の（1)および（2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残 基に置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(1) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域の 39位 に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 38位に相当するアミノ酸残基
〔29〕以下の（1)および（2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残 基に置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の活性を増加させる方法。
(1) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のァミノ 酸配列における 45位に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 44位に相当するアミノ酸残基
〔30〕以下の（1)および（2)の 、ずれか一方のアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸 残基に置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(1) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のァミノ 酸配列における 45位に相当するアミノ酸残基 (2) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 44位に相当するアミノ酸残基
〔31〕sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成しているアミノ酸残基を、 電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む sc(Fv)2組成物中の構造異性体の 異性化反応を抑制する方法。
〔32〕以下の（1)および（2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残 基に置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体の異性化反応を抑制する 方法。
(1) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域の 39位 に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 38位に相当するアミノ酸残基
〔33〕以下の（1)および（2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残 基に置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体の異性化反応を抑制する 方法。
(1) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のァミノ 酸配列における 45位に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 44位に相当するアミノ酸残基
〔34〕以下の（1)および（2)の 、ずれか一方のアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸 残基に置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体の異性化反応を抑制 する方法。
(1) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のァミノ 酸配列における 45位に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 44位に相当するアミノ酸残基
〔35〕 sc(Fv)2のリンカ一の長さを調節する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の構造異性 体の割合を調節する方法。 〔36〕構造異性体が single chain diabody型又は bivalent scFv型である〔35〕に記載の 方法。
〔37〕 sc(Fv)2の両端のリンカ一を 0〜12アミノ酸、中央のリンカ一を 10〜30アミノ酸に 調節する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の single chain diabody型の割合を増加させる 方法。
〔38〕 sc(Fv)2の両端のリンカ一を 12〜30アミノ酸、中央のリンカ一を 0〜10アミノ酸に 調節する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の bivalent scFv型の割合を増加させる方法。
〔39〕 sc(Fv)2の両端のリンカ一を 0〜12アミノ酸、中央のリンカ一を 0〜10アミノ酸に調 節する工程を含む、 single chain diabody型の含有割合が 80%以上である sc(Fv)2組 成物を製造する方法。
〔40〕 sc(Fv)2の両端のリンカ一を 12〜30アミノ酸、中央のリンカ一を 0〜10アミノ酸に 調節する工程を含む、 bivalent scFv型の含有割合が 80%以上である sc(Fv)2組成物 を製造する方法。
〔41〕 sc(Fv)2のリンカ一又はリンカ一近傍領域を切断する工程を含む、 sc(Fv)2組成 物中の構造異性体を分析する方法。
〔42〕酵素で処理することによりリンカ一又はリンカ一近傍領域を切断することを特徴 とする〔41〕に記載の方法。
〔43〕構造異性体が single chain diabody型又は bivalent scFv型である〔41〕または〔4 2〕に記載の方法。
〔44〕以下の工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分析する方法。
(a) sc(Fv)2組成物を酵素で処理する工程
(b)処理後の生成物の分子量または構造を測定する工程
図面の簡単な説明
[図 l](a) VB22B sc(Fv)2の VHl- linker- VLl- linker- VH2- linker- VL2構造を示す図で ある。 (b) VHl-linker-VLl-linker-VH2-linker-VL2構造の 2種類の構造異性体を示 す図である。 VH1/VL1と VH2/VL2がそれぞれ会合した bivalent scFv構造（左）と、 V H1/VL2と VH2/VL1がそれぞれ会合した single chain diabody構造（右）を示す。
[図 2]peaklと peak2の陰イオン交換クロマトグラフィーよる分離の結果を示す図である [図 3]peakl、 peak2、 VB22B sc(Fv)2の subtilisin処理前後の還元 SDS- PAGEの結果を 示す写真である。得られたバンドの推定構造を右に示した。
[図 4]bivalent scFvと single chain antibodyの構造の違いにより生じる subtilisin限定分 解後の分解パターンの違いを示す図である。 Bivalent scFv構造の場合、点線で囲つ た低分子量断片が生じる。
[図 5]Subtilisinによる peakl、 peak2、 VB22B sc(Fv)2の限定分解後のゲルろ過クロマト グラフィ一の結果を示す図である。矢印により低分子量ピークの溶出位置を示した。
[図 6]VB22B sc(Fv)2構造異性体の TPO様ァゴ-スト活性評価の結果を示す図である
[図 7]peaklと peak2の陽イオン交換クロマトグラフィーよる分離の結果を示す図である
[図 8]陽イオン交換クロマトグラフィーより分離した peaklと peak2のペプチドマッピング を示す図である。
[図 9]peakl、 peak2、 hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2の subtilisin処理後の還元 SDS- PAGEの 結果を示す写真及び図である。得られたバンドの構造を右に示した。
[図 10]Subtilisinによる peakl、 peak2、 hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2の限定分解後のゲルろ 過クロマトグラフィーの結果を示す図である。矢印により低分子量ピークの溶出位置 を示した。
[図 l l]hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2構造異性体の TPO様ァゴ-スト活性評価の結果を示 す図である。
[図 12]各リンカ一改変体のコンストラクトを示す図である。 Gxxは中央のリンカ一長が X Xであり、 Lxxは両端のリンカ一長が XXであり、それぞれリンカ一として (GGGGS (配列 番号： l l))n配列を用いたコンストラクトである。 L8は両端のリンカ一長が 8であり、 GG GGSGGS配列（配列番号： 20)を用いたコンストラクトである。 L12は両端のリンカ一長 が 12であり、 GGGGSGGGGSGS配列（配列番号： 21)を用いたコンストラクトである。 Px Xはリンカ一として (GGPGS (配列番号： 17))n配列を用いて中央のリンカ一長を XXにし たコンストラクトである。 圆 13]各リンカ一改変体の陰イオン交換クロマトグラフィー分析結果と構造異性体の 得られた存在比率を示す図である。 bivalent scFv型構造のパーセントにより示した。
[図 14]hydroxyapatiteカラムのクロマトグラムと精製画分のゲルろ過クロマトグラフィー 分析の結果を示す図である。
[図 15]SOURCE 15Sカラムのクロマトグラムの分析結果を示す図である。
圆 16]陽イオン交換クロマトグラフィーの分析結果を示す図である。
[図 17]大量精製した hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2 peaklと hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2 peak2 の SDS-PAGEの分析結果を示す写真である。
[図 18]大量精製した hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2 peaklと hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2 peak2 のゲルろ過分析結果を示す図である。
[図 19]u2-wz4、改変体 vl、改変体 v3のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す図で ある。
[図 20]u2-wz4、改変体 vl、改変体 v3の陽イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す 図である。
[図 21]u2- wz4、 u2-wz4精製 peakl、 u2- wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3の等電 点電気泳動の結果を示す写真である。
[図 22]u2-wz4精製 peakl、 u2-wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3のプロテアーゼ 限定分解後のゲルろ過クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。
[図 23]u2-wz4精製 peakl、 u2-wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3の TPO様ァゴニ スト活性評価の結果を示す図である。
[図 24]u2- wz4精製 peakl、 u2- wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3の DSC分析の結 果を示す図である。
[図 25]u2-wz4精製 peakl、 u2-wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3の熱加速試験に おけるゲルろ過クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。
[図 26]u2-wz4精製 peakl、 u2-wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3の熱加速試験に おける陽イオン交換クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。
[図 27]ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の peaklと peak2の陽イオン交換クロマトグ ラフィーよる分離の結果を示す図である。 [図 28]精製したヒトイ匕抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の peaklと peak2の陽イオン交換 クロマトグラフィーよる分析結果を示す図である。
[図 29]ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の peaklと peak2の subtilisin処理後の還 元 SDS-PAGEの結果を示す写真である。得られたバンドの推定構造を右に示した。
[図 30]Subtilisinによるヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の peaklと peak2の限定分 解後のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す図である。矢印により低分子量ピー クの溶出位置を示した。
[図 31]ヒト化抗ヒト IL- 6受容体抗体 sc(Fv)2の peaklと peak2の BaF3/gpl30における I L-6中和活性評価の結果を示す図である。
[図 32]VB22B sc(Fv)2の peaklを 20mM sodium acetate, 150mM NaCl, pH6.0, 40°Cで インキュベートした試料の陰イオン交換クロマトグラフィー分析し経時的に peak2が増 加することを示した図である。
[図 33]VB22B sc(Fv)2の peakl、 peak2、及び、 40°Cで 6日間 incubateした試料のァゴ- スト活性を評価し、 peaklが peak2に異性ィ匕することによって活性が増加することを確 認した図である。
[図 34]hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の peaklを 25°Cで 10日間、各条件下で incubateするこ とによる peak2への異性ィ匕を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0020] 本発明者らは、 sc(Fv)2の構造異性体を解析する過程で、構造異性体間の活性に 差が生じることを見出した。さらに、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体の割合を調節でき ること、また、 sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体を分離取得できることを見出した
。本発明は、これら知見に基づくものである。
[0021] 本発明は、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離し、分離された構造異性体のうち
、特定の構造異性体を取得する工程を含む、医薬組成物の製造方法を提供する。
[0022] 本発明にお 、て sc(Fv)2は、 4つ以上の抗体可変領域をリンカ一等で結合して一本 鎖にした低分子化抗体である。例えば、 [可変領域 1] (リンカ一 1) [可変領域 2] (リンカ 一 2) [可変領域 3] (リンカ一 3) [可変領域 4]の順に並んでいることを特徴とする抗体が 挙げられる。 [0023] また、通常、 sc(Fv)2は 2つの VLと 2つの VHの 4つの可変領域をリンカ一などで結合 して一本鎖にした抗体である（Hudson et al、 J Immunol. Methods 1999 ;231 : 177-189 )。この 2つの VHと VLは異なるモノクローナル抗体由来であってもよ!/、。
[0024] sc(Fv)2は、当業者に公知の方法で作製することができ、例えば、 scFvをリンカ一で 結ぶことによって作製できる。 scFvには、抗体の VHおよび VLが含まれ、これらの領域 は単一のポリペプチド鎖中に存在する（scFvの総説については、 Pluckthun『The Pha rmacology of Monoclonal AntibomesJVol.llj (Rosenburg and Moore ed (Springer Ve rlag, New York) pp.269-315, 1994)を参照）。
[0025] また、本発明の sc(Fv)2としては、 2つの VH及び 2つの VL力 一本鎖ポリペプチドの N末端側を基点として VH、 VL、 VH、 VL ( [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [V L])の順に並んでいることを特徴とする抗体が挙げられる力 2つの VHと 2つの VLの 順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば 以下のような、配置も挙げることができる。
[VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]
[VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]
[VH]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VL]
[VL]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VH]
[VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]
[0026] 本発明の sc(Fv)2は抗体可変領域、リンカ一以外のアミノ酸配列を含んでいてもよい
[0027] 本発明で用いられる抗体の可変領域は、可変領域の全長でもよいが、抗原への結 合活性を維持する限り可変領域の部分配列でもよい。又、可変領域中のアミノ酸配 列を置換、欠失、付加、挿入などがされていてもよい。例えば、抗原性を低下させる ために、キメラ化ゃヒト化されていてもよい。
[0028] また本発明の sc(Fv)2は、その N末端あるいは C末端に IgGの Fc部分等の別のタンパ ク質を融合してもよい（Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281)。融合するタ ンパク質は当業者が適宜選択することができる。また本発明の sc(Fv)2は、 Fcの各 hin geの N末端に 2つの scFvを結合させ、中央のリンカ一（リンカ一 2)として抗体の Fc領 域を用いた (scFv)2- Fcの形であってもよい（J Immunol Methods. 2005;306(1- 2):93- 1 03.)。
また本発明の sc(Fv)2は、 PEG等のキャリアー高分子ゃ抗がん剤等の有機化合物を コンジュゲートしてもよい。また糖鎖付加配列を挿入し、糖鎖を付加してもよい。
[0029] 抗体の可変領域を結合するリンカ一としては、遺伝子工学により導入し得る任意の ペプチドリンカ一、又は合成化合物リンカ一（例えば、 Protein Engineering, 9(3), 299 -305, 1996参照）に開示されるリンカ一等を用いることができる力 本発明においては ペプチドリンカ一が好ましい。ペプチドリンカ一の長さは特に限定されず、 目的に応じ て当業者が適宜選択することが可能であるが、好ましい長さは 5アミノ酸以上 (上限は 特に限定されないが、通常、 30アミノ酸以下、好ましくは 20アミノ酸以下)であり、特に 好ましくは 15アミノ酸である。 sc(Fv)2に 3つのペプチドリンカ一が含まれる場合には、 全て同じ長さのペプチドリンカ一を用いてもよいし、異なる長さのペプチドリンカ一を もちいてもよい。
[0030] 例えば、ペプチドリンカ一の場合：
Ser
GlySer
GlyGlySer
Sef ulyuly
Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号： 9)
Ser'Gly'Gly'Gly (配列番号： 10)
Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号：11)
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号： 12)
Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号：13)
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号： 14)
Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号：15)
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号：16)
(Gly Gly Gly Gly Ser (配列番号： 11) )n
(Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号： 12) )n [nは 1以上の整数である]等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカ一の長さや 配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
[0031] 合成化学物リンカ一 (ィ匕学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋 剤、例えば N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS)、ジスクシンイミジルスべレート（DSS)、ビ ス（スルホスクシンィミジル)スべレート（BS3)、ジチォビス（スクシンィミジルプロビオネ ート）（DSP)、ジチオピス（スルホスクシンィミジルプロピオネート）（DTSSP)、エチレン グリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS)、エチレングリコールビス（スルホ スクシンイミジルスクシネート）（スルホー EGS)、ジスクシンィミジル酒石酸塩（DST)、 ジスルホスクシンィミジル酒石酸塩 (スルホー DST)、ビス [2- (スクシンイミドォキシカ ルポ-ルォキシ）ェチル]スルホン（BSOCOES)、ビス [2- (スルホスクシンイミドォキシ カルボ-ルォキシ）ェチル]スルホン (スルホ- BSOCOES)などであり、これらの架橋剤 は市販されている。
[0032] 4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、 3つのリンカ一が必要となる力 全 て同じリンカ一を用いてもょ 、し、異なるリンカ一を用いてもょ 、。
[0033] 本発明にお 、て sc(Fv)2組成物とは、 sc(Fv)2の構造異性体を 1または複数含有する 組成物を指す。
[0034] sc(Fv)2組成物は、当業者に周知の方法で作製することができる。例えば、 sc(Fv)2 をコードする DNAを挿入したベクターを宿主細胞へ導入し、 sc(Fv)2を発現させ、発現 産物を回収することで、 sc(Fv)2組成物を作製できる。
[0035] 該ベクターとしては、挿入した DNAを安定に保持するものであれば特に制限されず 、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローユング用ベクターとしては pBluesc riptベクター (Stratagene社製）などが好まし!/、が、巿販の種々のベクターを利用するこ とができる。本発明の sc(Fv)2を生産する目的においてベクターを用いる場合には、 特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養 細胞内、生物個体内で sc(Fv)2を発現するベクターであれば特に制限されないが、例 えば、試験管内発現であれば pBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であれば pET ベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であれば pME18S- FL3ベクター（GenBank Acce ssion No. AB009864)、生物個体であれば pME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-47 2(1988))などが好ましい。ベクターへの本発明の DNAの挿入は、常法により、例えば 、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons, section 1 1.4-11.11)。
[0036] 上記宿主細胞としては特に制限はなぐ 目的に応じて種々の宿主細胞が用いられ る。 sc(Fv)2を発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例:ストレプトコッカ ス、スタフイロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞 (例:酵母、ァス ペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフイラ S2、スポドプテラ SF9)、動物細胞（例： CHO、 COS, HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 HEK293、 Bowesメラノーマ細胞）および植物細胞を 例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿 法、 ノヽノレス し法 (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.、 1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9)、リポフエクタミン法（GIBCO- BR L社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
[0037] sc(Fv)2組成物の回収は、本発明の sc(Fv)2が培地に分泌される場合は、培地を回 収することで実施できる。また、 sc(Fv)2が細胞内に産生される場合は、その細胞をま ず溶解し、その後に sc(Fv)2組成物を回収する。
[0038] 本発明の sc(Fv)2組成物は、 sc(Fv)2の構造異性体を 1または複数含有する組成物 である限り、どのような状態であってもよぐ例えば、糸且換え細胞培養物等のクルード な状態の組成物、精製された状態の組成物等が例示できるが、これら〖こ制限されるも のではない。
[0039] 本発明において構造異性体とは、アミノ酸配列は同一であるが、立体構造 (二次構 造あるいは三次構造)が異なるタンパク質同士のことをいう。通常、構造異性体同士 では化学的、生物学的、又は物理的性質のうち少なくとも 1つは異なる。
[0040] sc(Fv)2における構造異性体としては、例えば、 single chain diabody型と bivalent scF v型の構造異性体が存在する。
[0041] 本発明において single chain diabody型とは、 sc(Fv)2が、 [可変領域 1] (リンカ一 1) [可 変領域 2] (リンカ一 2) [可変領域 3] (リンカ一 3) [可変領域 4]の順で並んで 、る場合、可 変領域 1と可変領域 4が会合し、かつ可変領域 2と可変領域 3が会合した状態の構造 を有する sc(Fv)2をいう。
[0042] また、本発明にお 、て bivalent scFv型とは、可変領域 1と可変領域 2が会合し、力 つ可変領域 3と可変領域 4が会合した状態の構造を有する sc(Fv)2のことをいう。
[0043] single chain diabody型、 bivalent scFv型としては、例えば図 lbに記載の構造を有す る sc(Fv)2が挙げられる。 sc(Fv)2の構造異性体力 ngle chain diabody型または bivalen t scFv型のどちらの構造を有しているかは、後述される構造異性体の同定方法によつ て確認することができる。また、 NMRを用いた解析、結晶構造解析などにより同定す ることがでさる。
[0044] sc(Fv)2組成物中の構造異性体の分離および取得 (精製）は、例えば、 sc(Fv)2組成 物をイオン交換カラムや Hydroxyapatiteカラムにかけ、特定の構造異性体を取得ある いは除去することで行うことができるが、これに制限されず、各種クロマトグラフィー力 ラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリ アクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、キヤビラリ一等電点電気泳動、透 析、再結晶等の当業者に公知の方法により行うことが可能である。
[0045] クロマトグラフィーとしては、例えばイオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフ ィー、等電点クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、疎水性クロマトグ ラフィー、ァフィ-ティークロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Puri fication ana Characterization: A Laboratoryし ourse Manual. ti,d Daniel R. Marshak e t al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。クロマトグラフィーは、液ネ目クロマ トグラフィー、例えば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができ る。
[0046] イオン交換クロマトグラフィーを用いる場合、使用されるイオン交換カラムの種類は 特に制限されず、陽イオン交換カラム、陰イオン交換カラムのいずれも使用すること ができ、 目的の抗体や構造異性体などにより適宜決定することができる。例えば、 SP イオン交換体力ラム、 Qイオン交換体力ラムなどを用いることが可能であるが、これら に限定されるものではない。吸着クロマトグラフィーとしては、 Hydroxyapatiteクロマト グラフィ一が例示できる力 これに限定されるものではない。
[0047] 本発明により、これらの精製方法を用い、特定の構造異性体の精製品を取得するこ とちでさる。
[0048] また、本発明の医薬組成物の製造方法は、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体間で活 性に差が生じる場合に、 sc(Fv)2の構造異性体の活性を比較して高活性の構造異性 体をあらかじめ決定し、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体力も高活性の構造異性体を 分離取得することができる。さらに、本発明の医薬組成物の製造方法は、 sc(Fv)2組 成物中の構造異性体を分離する前に、後述の方法により、 sc(Fv)2組成物中の構造 異性体の比率が好ましい値になるようにリンカ一の長さを決定し、決定されたリンカ一 長を有する sc(Fv)2組成物を作製することもできる。また、 sc(Fv)2組成物中の構造異 性体を分離する前に、リンカ一の長さが異なる複数の sc(Fv)2組成物を作製し、後述 される構造異性体比率の分析法によって構造異性体比率を分析し、 sc(Fv)2組成物 中の構造異性体の比率が好まし 、値となるリンカ一を有する sc(Fv)2を選択し、選択さ れた sc(Fv)2の sc(Fv)2組成物を作製することもできる。また後述の方法により、 VHと V Lが界面を形成するアミノ酸残基を改変することにより、選択された sc(Fv)2の sc(Fv)2 組成物を作製することもできる。
[0049] 本発明にお ヽて高活性の構造異性体とは、構造異性体間で活性に差が生じる場 合、活性が高い構造異性体、好ましくは最も活性の高い構造異性体のことをいう。例 えば、 2種類の構造異性体が存在する場合、活性の高い方の構造異性体が本発明 でいう高活性の構造異性体に該当する。
[0050] 高活性の構造異性体の決定は当業者に公知の方法で行うことができ、例えば、そ れぞれの構造異性体を単離し、同一の条件下で目的の活性を測定することにより高 活性の構造異性体を決定することができる。
[0051] 本発明にお 、て活性は、結合活性、中和活性、細胞傷害活性、ァゴニスト活性、ァ ンタゴ-スト活性、酵素活性など、いかなる活性でもよぐ特に限定されないが、生体 、組織、細胞、タンパク質、 DNA、 RNA等に量的及び Z又は質的な変化、影響をもた らす活性であることが好ましぐ特にァゴニスト活性が好ま 、。
[0052] ァゴ-スト活性とは、受容体などの抗原に抗体が結合することにより、細胞内にシグ ナルが伝達される等して、何らかの生理的活性の変化を誘導する活性である。生理 的活性としては、例えば、増殖活性、生存活性、分化活性、転写活性、膜輸送活性、 結合活性、タンパク質分解活性、リン酸ィ匕 Z脱リン酸ィ匕活性、酸化還元活性、転移 活性、核酸分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性、アポトーシス誘導活性、などを 挙げることができる力 これらに限定されるわけではない。
[0053] 本発明にお ヽて抗原は特に限定されず、どのような抗原でもよ!/ヽ。抗原の例として は、例えば、受容体、癌抗原、 MHC抗原、分化抗原、などを挙げることができる。受 容体の例としては、例えば、造血因子受容体ファミリー、サイト力イン受容体ファミリー 、チロシンキナーゼ型受容体ファミリー、セリン Zスレオニンキナーゼ型受容体ファミリ 一、 TNF受容体ファミリー、 Gタンパク質共役型受容体ファミリー、 GPIアンカー型受容 体ファミリー、チロシンホスファターゼ型受容体ファミリー、接着因子ファミリー、ホルモ ン受容体ファミリー、等の受容体ファミリーに属する受容体などを挙げることができる。 これら受容体ファミリーに属する受容体、及びその特徴に関しては多数の文献が存 在し、 f列 は、 Cooke BA., King RJB., van aer Molen HJ. ed. Newし omprehesive Bio chemistry V0I.I8B "Hormones and their Actions Part Ii pp.1- 46 (1988) Elsevier Sci ence Publishers BV., New York, USA, Patthy L. (1990) Cell, 61: 13-14.、 Ullrich A., et al. (1990) Cell, 61: 203— 212.、 Massagul J. (1992) Cell, 69: 1067— 1070.、 Miyajima A., et al. (1992) Annu. Rev. Immunol, 10: 295- 331.、 Taga T. and Kishimoto T. (19 92) FASEB J., 7: 3387—3396.、 Fantl WL, et al. (1993) Annu. Rev. Biochem., 62: 45 3-481., Smith CA., et al. (1994) Cell, 76: 959—962.、 Flower DR. (1999) Biochim. Bi ophys. Acta, 1422: 207-234.、宫坂昌之監修，細胞工学別冊ハンドブックシリーズ「 接着因子ハンドブック」 (1994) (秀潤社,東京， 日本)等が挙げられる。
[0054] 上記受容体ファミリーに属する具体的な受容体としては、例えば、ヒト又はマウスェ リスロポェチン (EPO)受容体、ヒト又はマウス顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)受容 体、ヒト又はマウストロンボポイエチン (TPO)受容体、ヒト又はマウスインスリン受容体、 ヒト又はマウス Flt-3リガンド受容体、ヒト又はマウス血小板由来増殖因子 (PDGF)受 容体、ヒト又はマウスインターフェロン（IFN) - a、 j8受容体、ヒト又はマウスレプチン受 容体、ヒト又はマウス成長ホルモン (GH)受容体、ヒト又はマウスインターロイキン (IL) -10受容体、ヒト又はマウスインスリン様増殖因子 (IGF) -I受容体、ヒト又はマウス白血 病抑制因子 (LIF)受容体、ヒト又はマウス毛様体神経栄養因子 (CNTF)受容体等を 例示することができる（hEPOR: Simon, S. et al. (1990) Blood 76, 31-35.; mEPOR: D' Andrea, AD. Et al. (1989) Cell 57, 277-285.; hG- CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 8702— 8706.； mG— CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Cell 61, 341-350.； hTPOR: Vigon, I. et al. (1992) 89, 5640-5644. ; mTPOR: Skoda, RC. Et al. (1993) 12, 2645-2653.; hlnsR: Ullrich, A. et al. (1985) Nature 313, 756- 761. ; hFlt-3: Small, D. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 459-463.; hPD GFR: Gronwald, RGK. Et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3435-3439.; hi FN a / j8 R: Uze, G. et al. (1990) Cell 60, 225— 234.及び Novick, D. et al. (1994) C ell 77, 391-400.) o
[0055] 癌抗原は細胞の悪性化に伴って発現する抗原であり、腫瘍特異性抗原とも呼ばれ る。又、細胞が癌化した際に細胞表面やタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も癌 抗原となり、特に癌糖鎖抗原と呼ばれる。癌抗原の例としては、例えば、 CA19-9、 CA 15-3、シリアル SSEA-l(SLX)などを挙げることができる。
[0056] MHC抗原には、 MHC class I抗原と MHC class II抗原に大別され、 MHC class I抗 原には、 HLA- Α,- Β,- C，- Ε,- F，- G，- Hが含まれ、 MHC class II抗原には、 HLA- DR,- DQ，- DPが含まれる。
[0057] 分ィ匕抗原には、 CDl,CD2,CD3,CD4,CD5,CD6,CD7,CD8,CD10,CDlla,CDllb,C Dllc,CD13,CD14,CD15s,CD16,CD18,CD19,CD20,CD21,CD23,CD25,CD28,CD29 ,CD30,CD32,CD33,CD34,CD35,CD38,CD40,CD41a,CD41b,CD42a,CD42b,CD43, CD44,CD45,CD45RO,CD48,CD49a,CD49b,CD49c,CD49d,CD49e,CD49f,CD51,C D54,CD55,CD56,CD57,CD58,CD61,CD62E,CD62L,CD62P,CD64,CD69,CD71,CD 73,CD95,CD102,CD106,CD122,CD126,CDwl30などが含まれる。
[0058] 活性の変化を測定する為に用いる検出指標としては、量的及び Z又は質的な変化 が測定可能である限り使用することができる。例えば、無細胞系 (cell free assay)の指 標、細胞系 (ceU-based assay)の指標、糸且織系の指標、生体系の指標を用いることが できる。
[0059] 無細胞系の指標としては、酵素反応やタンパク質、 DNA、 RNAの量的及び Z又は 質的な変化を用いることができる。酵素反応としては、例えば、アミノ酸転移反応、糖 転移反応、脱水反応、脱水素反応、基質切断反応等を用いることができる。また、タ ンパク質のリン酸化、脱リン酸化、二量化、多量化、分解、乖離等や、 DNA、 RNAの 増幅、切断、伸長を用いることができる。例えばシグナル伝達経路の下流に存在する タンパク質のリン酸ィ匕を検出指標とすることができる。
[0060] 細胞系の指標としては、細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的及び Z又 は質的変化、増殖活性の変化、細胞数の変化、形態の変化、特性の変化等を用い ることができる。産生物質としては、分泌タンパク質、表面抗原、細胞内タンパク質、 m RNA等を用いることができる。形態の変化としては、突起形成及び Z又は突起の数の 変化、偏平度の変化、伸長度 Z縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変 ィ匕、細胞集団としての異形性 Z均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。こ れらの形態の変化は検鏡下での観察で確認することができる。特性の変化としては、 足場依存性、サイト力イン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細 胞遊走活性、拍動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性として は、細胞浸潤活性、細胞遊走活性がある。また、細胞内物質の変化としては例えば、 酵素活性、 mRNA量、 Ca2+や cAMP等の細胞内情報伝達物質量、細胞内タンパク質 量等を用いることができる。また、細胞膜受容体の場合には、受容体の刺激によって 誘導される細胞の増殖活性の変化を指標とすることができる。
[0061] 組織系の指標としては、使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることがで きる。生体系の指標としては組織重量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変 ィ匕、タンパク質量や、酵素活性、電解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、 血圧、心拍数の変化等を用いることができる。
[0062] これらの検出指標を測定する方法としては、特に制限はなぐ吸光、発光、発色、蛍 光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量 、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動、等を用いることができる。これ らの測定方法は当業者にとっては周知であり、目的に応じて、適宜選択することがで きる。
[0063] 例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータやプレートリーダ等、発 光はルミノメータ等、蛍光はフルォロメータ等で測定することができる。質量は質量分 析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマカウ ンターなどの測定機器を用いて、蛍光偏光度は BEACON (宝酒造）、表面プラズモン 共鳴シグナルは BIACORE、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動などは ARVO などにより測定できる。さらに、フローサイトメータなども測定に用いることができる。こ れらの測定方法は、一つの測定方法で 2種以上の検出指標を測定しても良ぐ簡便 であれば、 2種以上の測定を同時及び Z又は連続して測定することによりさらに多数 の検出指標を測定することも可能である。例えば、蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を 同時にフルォロメータで測定することができる。
[0064] 本発明において、ァゴニスト活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可 能である。例えば、実施例に記載のように細胞増殖を指標にァゴ-スト活性を測定す る方法により判定することが可能である。より具体的には、ァゴニスト依存性増殖を示 す細胞に、ァゴニスト活性を測定したい抗体を添加し、培養する。その後、 WST-8の ような生細胞数に応じて特定の波長において発色反応を呈する試薬を添加して吸光 度を測定し、得られた吸光度を指標にァゴニスト活性を測定することが可能である。
[0065] ァゴ-スト依存性増殖を示す細胞も当業者に公知の方法により作製することが可能 であり、例えば、抗原が細胞増殖シグナルを発する受容体である場合には、該受容 体を発現している細胞を用いればよい。又、抗原が細胞増殖シグナルを出さない受 容体である場合には、細胞増殖シグナルを発する受容体の細胞内領域と、細胞増殖 シグナルを出さな ヽ受容体の細胞外領域からなるキメラ受容体を作製し、該キメラ受 容体を細胞で発現させればよ!ヽ。細胞増殖シグナルを発する受容体の例としては、 例えば、 G- CSF受容体、 mpl、 neu、 GM- CSF受容体、 EPO受容体、 c-kit、 FLT-3等を 挙げることができる。受容体を発現させる細胞としては、例えば、 BaF3、 NFS60、 FDC P-l、 FDCP-2、 CTLL-2、 DA-1、 KT-3等を挙げることができる。
[0066] 本発明にお 、て sc(Fv)2医薬組成物とは、疾患の治療'予防などの為にヒトに投与さ れることを目的とした sc(Fv)2組成物のことを 、う。
[0067] 本発明の方法によって分離取得された sc(Fv)2の特定の構造異性体、または、後述 の方法により、特定の構造異性体の割合が増加された sc(Fv)2組成物は、それらに対 して不活性な薬学的に許容される担体、媒体等と混和することにより医薬組成物とす ることができる。すなわち、本発明は、上記方法で分離取得された sc(Fv)2の構造異 性体、または、特定の構造異性体の割合が増加された sc(Fv)2組成物を有効成分とし て含有する医薬組成物もまた提供するものである。
[0068] 薬学的に許容される担体、媒体としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、 賦形剤、酸化防止剤 (ァスコルビン酸等)、緩衝剤 (リン酸、クェン酸、他の有機酸等)、 防腐剤、界面活性剤 (PEG、 Tween等)、キレート剤 (EDTA等)、結合剤等を挙げること ができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫 グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、ァスパラギン、アルギニン及びリシン等 のアミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、マン-トールやソルビトール等の糖 アルコールを含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩 水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、 D-ソルビトール、 D-マンノー ス、 D-マン-トール、塩ィ匕ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコー ル (エタノール等)、ポリアルコール (プロピレングリコール、 PEG等)、非イオン性界面活 性剤 (ポリソルベート 80、 HCO— 50)等と併用してもよい。
[0069] また、必要に応じ、マイクロカプセル (ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ^ チルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシス テム (リボソーム、アルブミンミクロスフエア、マイクロエマルジヨン、ナノ粒子及びナノ力 プセノレ等)とすることもできる ( Remington s Pharmaceutical Science 1り edition , Osl o Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明 に適用し得る (Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167—277; Langer, Chem . Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第 3,773,919号;欧州特許出願公開 (EP)第 58,481 号； Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547—556 ？第133,988号)。
[0070] 本発明の sc(Fv)2医薬組成物は上述の方法に限定されず、当業者に公知の方法に より作製することが可能である。
[0071] 患者への投与は経口、非経口投与のいずれでも可能である力 好ましくは非経口 投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型な どが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内 注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。また、患者の 年齢、症状によって適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば
、一回につき体重 lkgあたり O.OOOlmgから lOOOmgの範囲で選ぶことが可能である。あ るいは、例えば、患者あたり 0.001〜100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことがで きる。し力しながら、本発明はこれらの投与量および投与方法等に制限されるもので はない。
[0072] 本発明では、特定の構造異性体の含有割合が 80%以上、好ましくは 90%以上、特 に好ましくは 95%以上の sc(Fv)2組成物を提供する。より具体的には、 single chain dia body型の含有割合が 80%以上、好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上の sc( Fv)2組成物、又は bivalent scFv型の含有割合が 80%以上、好ましくは 90%以上、特 に好ましくは 95%以上の sc(Fv)2組成物を挙げることができる。
[0073] 本発明にお 、て特定の構造異性体の含有割合が 80%とは、 sc(Fv)2組成物に含ま れる全ての構造異性体に対する特定の構造異性体の割合が 80%であることを意味 する。例えば、 sc(Fv)2組成物中に single chain diabody型と bivalent scFv型の 2種類の 構造異性体が存在する場合、 single chain diabody型の含有割合が 80%とは、 sngle c hain diabody型と bivalent scFv型の比率力 0 : 20であることを意味する。
[0074] 本発明にお 、て 80%以上、 90%以上、 95%以上の含有割合の上限は特に限定さ れな 、が、 100%若しくは 100%に近 、ことが好まし 、。 100%に近 、上限は当業者の 精製技術や分析技術に依存するが、例えば、 99.999%、 99.99%、 99.9%、 99%など である。構造異性体の含有割合は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電 気泳動、キヤビラリ一等電点電気泳動等を用いて構造異性体を分離することにより、 測定することが可能である。
[0075] また、本発明は、特定の構造異性体の含有割合を 80%以上にした sc(Fv)2組成物 を有効成分として含有する、医薬組成物を提供する。 sc(Fv)2を医薬組成物として使 用する場合、通常、活性は高い方が好ましいので、高活性の構造異性体の含有割 合が 80%以上の sc(Fv)2組成物を有効成分として含有することが好ま U、。例えば、 抗 Mpl抗体のァゴ-スト活性は single chain diabody型の方が高いので、 Mplに対する s c(Fv)2をァゴ-ストとして使用する場合には、 single chain diabody型の含有割合が 80 %以上である sc(Fv)2組成物を有効成分として含有する、医薬組成物であることが好 ましい。
[0076] 本発明は、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体の割合を変化させる工程を含む、 sc(Fv) 2組成物の活性を調節する方法を提供する。
[0077] 本発明にお 、ては、 sc(Fv)2の構造異性体間にお 、て活性に著 、差があると 、う 知見を基に、 sc(Fv)2組成物に含まれる特定の構造異性体の含有割合を変化させる ことにより sc(Fv)2組成物の活性を調節することが可能であることを見出した。 sc(Fv)2 組成物の活性を調節する具体的な方法としては、例えば、 sc(Fv)2組成物中に含まれ る single chain diabody型と bivalent scFv型の割合を変化させることにより、 sc(Fv)2組 成物の活性を調節することが可能である。
[0078] また、本発明は、 sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の割合を増加させる工程を 含む、 sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法を提供する。上述した sc(Fv)2組成物 中の特定の構造異性体を分離取得する方法を使用することで実施することができる
[0079] 例えば、 sc(Fv)2組成物中の高活性の構造異性体の割合を高くすることにより、活性 が高い sc(Fv)2組成物を製造することが可能であり、逆に、 sc(Fv)2組成物中の高活性 の構造異性体の割合を低くすることにより、活性を抑えた sc(Fv)2組成物を製造するこ とが可能である。
[0080] single chain diabody型の活性力 bivalent scFv型よりも高!、場合、 sc(Fv)2組成物中 の single chain diabody型の含有割合を増加させることにより、 sc(Fv)2組成物の活性を 増加させることができ、 bivalent scFv型の含有割合を増加させることにより、 sc(Fv)2組 成物の活性を低下させることができる。逆に、 bivalent scFv型の活性力 ngle chain di abody型よりも高い場合、 sc(Fv)2組成物中の bivalent scFv型の含有割合を増加させ ることにより、 sc(Fv)2組成物の活性を増加させることができ、 single chain diabody型の 含有割合を増加させることにより、 sc(Fv)2組成物の活性を低下させることができる。 si ngle chain diabody型と bivalent scFv型のどちらが高活性であるかは、目的とする活性 に依存するが、当業者は公知の方法により容易に測定することが可能である。
[0081] sc(Fv)2を医薬組成物として使用する場合、通常、活性は高い方が好ましいことが多 V、ので、 sc(Fv)2組成物中に含まれる特定の構造異性体の割合を変化させることによ り、医薬組成物の活性を増加させることが可能である。
[0082] sc(Fv)2組成物中に含まれる特定の構造異性体の含有割合を増加させ、 sc(Fv)2組 成物の活性を増力!]させる方法は如何なる方法により行われてもよぐ例えば、 sc(Fv)2 組成物を得た後に特定の構造異性体の含有割合を高くしてもよいし、特定の構造異 性体の含有割合が高くなるように sc(Fv)2をコードする DNAを設計してもよい。
[0083] sc(Fv)2組成物を得た後に特定の構造異性体の割合を高くする具体的な方法として は、例えば、得られた sc(Fv)2組成物から目的の構造異性体を単離 (あるいは目的で な 、構造異性体を除去)する方法を挙げることができる。目的の構造異性体の単離 は、上記のように当業者に公知のタンパク質の分離取得方法により行うことが可能で ある。
[0084] また、例えば、 sc(Fv)2組成物を加熱することにより、特定の構造異性体の含有割合 を増加させることもできる。本発明者らは、 sc(Fv)2組成物を一定温度でインキュベー トすることにより、 single chain diabody型の含有割合を増加させることが可能であるこ とを見出している。よって、 sc(Fv)2組成物を 15°C〜50°C、好ましくは 20°C〜40°C、特 に好ましくは 25°C〜35°Cにてインキュベートすることにより、 single chain diabody型の 含有割合を増加させることが可能である。インキュベートされた sc(Fv)2組成物は、そ の後、元の温度に戻しても、増加した single chain diabody型の含有割合は維持され る。
[0085] 特定の構造異性体の含有割合が高くなるように sc(Fv)2をコードする DNAを設計す る方法としては、例えば、上述のように適切なリンカ一の長さになるように DNAを設計 する方法が挙げられる。
[0086] さらに、 sc(Fv)2の可変領域の会合を制御することで、 sc(Fv)2組成物中の特定の構 造異性体の含有割合を増力！]させることも可能である。具体的には、 sc(Fv)2の可変領 域の界面を形成して ヽるアミノ酸残基を改変すベぐ sc(Fv)2をコードする DNAを改変 する。
[0087] 本発明における「会合」とは、例えば、 sc(Fv)2の可変領域が相互作用する状態を指 すちのと換言することができる。
[0088] 本発明にお 、て「会合を制御する」とは、所望の会合状態になるように制御すること を言い、より具体的には、 sc(Fv)2内において望ましくない会合が形成されないように 制御することを言う。
[0089] 本発明における「界面」とは、通常、会合湘互作用）する際の会合面を指し、界面 を形成するアミノ酸残基とは、通常、その会合に供される sc(Fv)2の可変領域に含まれ る 1もしくは複数のアミノ酸残基であって、より好ましくは、会合の際に接近し相互作用 に関与するアミノ酸残基を言う。該相互作用には、具体的には、会合の際に接近する アミノ酸残基同士が水素結合、静電的相互作用、塩橋を形成している場合等が含ま れる。
[0090] 本発明における「界面を形成するアミノ酸残基」とは、詳述すれば、界面を構成する SC(Fv)2の可変領域にぉ 、て、該可変領域に含まれるアミノ酸残基を言う。
[0091] 本発明の方法におけるアミノ酸残基の「改変」とは、具体的には、元（改変前）のアミ ノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換すること、元のアミノ酸残基を欠失させること、新 たなアミノ酸残基を付加すること等を指すが、好ましくは、元のアミノ酸残基を他のアミ ノ酸残基へ置換することを指す。
[0092] 本発明の上記方法において「DNAを改変する」とは、本発明における「改変」によつ て導入されるアミノ酸残基に対応するように DNAを改変することを言う。より具体的に は、元のアミノ酸残基をコードする DNAについて、改変によって導入されるアミノ酸残 基をコードする DNAへ改変することを言う。通常、目的のアミノ酸残基をコードするコ ドンとなるよう〖こ、元の DNAに対して、少なくとも 1塩基を挿入、欠失または置換するよ うな遺伝子操作もしくは変異処理を行うことを意味する。即ち、元のアミノ酸残基をコ ードするコドンは、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードするコドンによって置 換される。このような DNAの改変は、当業者においては公知の技術、例えば、部位特 異的変異誘発法、 PCR変異導入法等を用いて、適宜実施することが可能である。
[0093] 本発明の好ま 、態様にぉ 、ては、例えば、 sc(Fv)2の可変領域の界面を形成する 2残基以上のアミノ酸残基が、同種の電荷となるように該界面にアミノ酸残基の変異 を導入する。界面において会合に関与する 2以上のアミノ酸残基が互いに同種の電 荷となるように改変されることにより、その電荷の反発力によって、これらアミノ酸残基 の会合が阻害されるものと考えられる。従って、上記方法において、改変されるァミノ 酸残基は、界面を形成する sc(Fv)2の可変領域間において、会合の際に互いに接近 した 2以上のアミノ酸残基であることが好ま 、。
[0094] 会合の際に接近するアミノ酸残基は、例えば、 sc(Fv)2の立体構造を解析し、該 sc(F v)2の会合の際に界面を形成する可変領域のアミノ酸配列を調べることにより見出す ことができる。界面において互いに接近したアミノ酸残基は、本発明の方法における「 改変」の好まし ヽターゲットとなる。
[0095] アミノ酸の中には、電荷を帯びたアミノ酸が知られている。一般的に正の電荷を帯 びたアミノ酸（正電荷アミノ酸）としては、リジン )、アルギニン (R)、ヒスチジン (H)が知 られている。負の電荷を帯びたアミノ酸 (負電荷アミノ酸）としては、ァスパラギン酸 (D) 、グルタミン酸 (E)等が知られている。従って、好ましくは、本発明において同種の電 荷のアミノ酸とは、正の電荷同士のアミノ酸、あるいは負の電荷同士のアミノ酸を言う
[0096] 本発明においては、界面を形成するアミノ酸残基が同種の電荷となるように改変さ れることが好ましぐ同種のアミノ酸の中でも、同一のアミノ酸であればさらに好ましい 。例えば、改変後のアミノ酸残基は、リジンとアルギニンであってもよいが、 2つのリジ ン、ある 、は 2つのアルギニンであることがより好まし!/、。
[0097] また、改変によって導入されるアミノ酸残基が複数の場合、これらアミノ酸残基の中 に電荷を持たな 、アミノ酸残基が少数程度含まれて 、てもよ 、。
[0098] 本発明の方法において改変に供されるアミノ酸残基の数は、特に制限されないが、 抗原との結合活性を低下させないために、なるべく少数のアミノ酸残基を改変するこ とが好ましい。上記「少数」とは、例えば、 1〜： LO個程度の数、好ましくは、 1〜5程度 の数、より好ましくは 1〜3程度の数、最も好ましくは 1または 2を表す。
[0099] なお、元の sc(Fv)2において、界面を形成するアミノ酸残基 (X)が既に電荷を有する 場合、あるいは水素結合を形成している場合、会合の際に該アミノ酸残基と近接し相 対するアミノ酸残基を、該アミノ酸残基 (X)と同一のアミノ酸残基 (もしくは同種の電荷 のアミノ酸残基）となるように改変することも本発明の好ましい態様の一つである。この 態様にお 1ヽては、界面を形成するアミノ酸残基の一方を改変すればょ ヽ。
[0100] また、本発明の好ま 、態様にぉ 、ては、 sc(Fv)2の可変領域の界面を形成するァ ミノ酸残基の改変が、界面に存在する疎水性コアを形成するアミノ酸残基が電荷を有 するアミノ酸残基となるように、該界面にアミノ酸残基の変異を導入する。
[0101] 一般的に、「疎水性コア（hydrophobic core)」は、会合したポリペプチドの内側に疎 水性アミノ酸の側鎖が集合して形成する部分を指す。疎水性アミノ酸は、例えばァラ ニン、イソロイシン、ロイシン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン、トリプトファン、 ノ リンなどが含まれる。また、疎水性コアの形成には、疎水性アミノ酸以外のアミノ酸 残基 (例えばチロシン）が関わることもある。この疎水性コアは、親水性アミノ酸の側鎖 が外側に露出する親水性表面とともに、水溶性のポリペプチドの会合を進める駆動 力となる。異なる 2つのドメインの疎水性アミノ酸が分子表面に存在し、水分子に暴露 されるとエントロピーが増大し自由エネルギーが増大してしまう。よって、 2つのドメイン は自由エネルギーを減少させ、安定化するために、互いに会合し、界面の疎水性ァ ミノ酸は分子内部に埋もれ、疎水性コアを形成することになる。
[0102] ポリペプチドの会合の際に、形成された疎水性コアを形成するアミノ酸残基から電 荷を持つ極性アミノ酸へ改変することにより、疎水性コアの形成が阻害され、その結 果、ポリペプチドの会合が阻害されるものと考えられる。ポリペプチドである sc(Fv)2も 同様に、可変領域の会合により疎水性コアが形成される。よって、この疎水性コアの アミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸に置換することにより、可変領域の会合を制御 でさるちのと考免られる。
[0103] 当業者においては、所望の sc(Fv)2についてアミノ酸配列を解析することにより、疎 水コアの存在の有無、および形成部位 (領域)等を知ることが可能である。
[0104] また、可変領域の界面を形成して 、るアミノ酸残基にぉ 、て、望ま 、会合を促進 するために knobs-into-holes (特表 2001-523971)技術を利用することも考えられる。 k nobs-into-holesは、ヘテロマルチマー形成を促進し、ホモマルチマー形成を抑制す るように、第一のポリペプチドの界面と第二のポリペプチドの界面で特異的かつ相補 的な相互作用を導入する (例えば、非天然のジスルフイド結合が第一のポリペプチド と第二のポリペプチド間に形成されるように、第一のポリペプチドの界面に遊離チォ ール含有残基を、第二のポリペプチドの界面中に相当する遊離チオール含有残基 を導入する)方法である力 本発明に利用することができる。 knobs-into-holesは当業 者に公知の技術であり、当業者は適宜、 sc(Fv)2に導入することが可能である。さらに 、上記技術を組み合わせて利用することもできる。
[0105] 可変領域は、通常 3つの CDR領域と 4つの FR領域によって構成されて 、る。本発明 の好ましい態様において「改変」に供するアミノ酸残基としては、例えば、 CDR領域あ るいは FR領域に位置するアミノ酸残基の中から適宜選択することができる。一般的に CDR領域のアミノ酸残基の改変は、抗原に対する結合能を低下させる場合がある。 従って、本発明において「改変」に供するアミノ酸残基としては、特に限定されるもの ではな!/、が、 FR領域に位置するアミノ酸残基の中力も適宜選択することが好ま U、。
[0106] 当業者であれば、本発明の方法によって会合を制御したい所望の sc(Fv)2について 、会合した際の FRの界面にぉ 、て接近するアミノ酸残基の種類を適宜知ることが可 能である。
[0107] 例えば、会合した際の FRの界面において接近するアミノ酸残基の具体例として、 V H上の 39位 (FR2領域)のグルタミン (Q)と、相対 (接触）する VL上の 38位の (FR2領域） のグルタミン (Q)を挙げることができる。さらに、 VH上の 45位 (FR2)のロイシン (L)と、相 対する VL上の 44位の (FR2)のプロリン (P)を好適に例示することができる。なお、これら 部位のナンバーリングについては、 Kabatらの方法 (Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH) 参考にし飞いる。
[0108] これらアミノ酸残基は、ヒトおよびマウスにおいて高度に保存されていることが知られ ている 0. Mol. Recognit. 2003; 16: 113-120)ことから、実施例に示す sc(Fv)2以外の s c(Fv)2についても、上記アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を改変することによって 、 sc(Fv)2の可変領域の会合を制御することができる。
[0109] [可変領域 1] (リンカ一 1) [可変領域 2] (リンカ一 2) [可変領域 3] (リンカ一 3) [可変領域 4]の順で並んでいる sc(Fv)2において、 single chain diabody型の含有割合を増加させ る方法を例示する。
[0110] 該 sc(Fv)2において、 bivalent scFv型が生じる場合は、可変領域 1と可変領域 2の会 合および可変領域 3と可変領域 4の会合を抑制し、かつ、可変領域 1と可変領域 4の 会合および可変領域 2と可変領域 3の会合を抑制しな 、ように (あるいは促進するよう に）、可変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。 [0111] 該 sc(Fv)2において、可変領域 1と可変領域 3が会合し、かつ可変領域 2と可変領域 4が会合した状態の構造を有する構造異性体が生じる場合は、これらの会合を抑制 し、かつ、可変領域 1と可変領域 4の会合および可変領域 2と可変領域 3の会合を抑 制しな 、ように（あるいは促進するように）、可変領域の界面を形成して 、るアミノ酸残 基に置換変異を導入する。
[0112] 該 sc(Fv)2において、可変領域 1と可変領域 3が会合した状態の構造を有する構造 異性体が生じる場合は、この会合を抑制し、かつ、可変領域 1と可変領域 4の会合お よび可変領域 2と可変領域 3の会合を抑制しな 、ように (あるいは促進するように）、可 変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。
[0113] 該 sc(Fv)2において、可変領域 2と可変領域 4が会合した状態の構造を有する構造 異性体が生じる場合は、この会合を抑制し、かつ、可変領域 1と可変領域 4の会合お よび可変領域 2と可変領域 3の会合を抑制しな 、ように (あるいは促進するように）、可 変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。
[0114] また、 [可変領域 1] (リンカ一 1) [可変領域 2] (リンカ一 2) [可変領域 3] (リンカ一 3) [可 変領域 4]の順で並んでいる sc(Fv)2において、 bivalent scFv型の含有割合を増加さ せる方法を例示する。
[0115] 該 sc(Fv)2において、 single chain diabody型が生じる場合は、可変領域 1と可変領域 4の会合および可変領域 2と可変領域 3の会合を抑制し、かつ、可変領域 1と可変領 域 2の会合および可変領域 3と可変領域 4の会合を抑制しな 、ように (ある 、は促進 するように）、可変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。
[0116] 該 sc(Fv)2において、可変領域 1と可変領域 3が会合し、かつ可変領域 2と可変領域 4が会合した状態の構造を有する構造異性体が生じる場合は、これらの会合を抑制 し、かつ、可変領域 1と可変領域 2の会合および可変領域 3と可変領域 4の会合を抑 制しな 、ように（あるいは促進するように）、可変領域の界面を形成して 、るアミノ酸残 基に置換変異を導入する。
[0117] 該 sc(Fv)2において、可変領域 1と可変領域 3が会合した状態の構造を有する構造 異性体が生じる場合は、この会合を抑制し、かつ、可変領域 1と可変領域 2の会合お よび可変領域 3と可変領域 4の会合を抑制しな 、ように (あるいは促進するように）、可 変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。
[0118] 該 sc(Fv)2において、可変領域 2と可変領域 4が会合した状態の構造を有する構造 異性体が生じる場合は、この会合を抑制し、かつ、可変領域 1と可変領域 2の会合お よび可変領域 3と可変領域 4の会合を抑制しな 、ように (あるいは促進するように）、可 変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。
[0119] 以下に、より詳細な例を示す力 これに限定されるものではない。
[0120] 例えば、 [VH1]リンカ一 [VL2]リンカ一 [VH3]リンカ一 [VL4]の順に並んでいる sc(F v)2において、 bivalent scFv型の割合を減少させて、 single chain diabody型の割合を 増加させるには、例えば、 VH1と VL2の界面を形成しているアミノ酸残基を同種の電 荷を有するアミノ酸残基に置換し、 VH3と VL4の界面を形成して ヽるアミノ酸残基を同 種の電荷を有するアミノ酸残基であって、 VH1と VL2に導入したアミノ酸残基と反発し ない電荷 (好ましくは親和性のある電荷)を有するアミノ酸残基に置換する。また、例 えば、 VH1と VL2の界面を形成しているアミノ酸側鎖をより大きい側鎖 (knob;突起)に 置換し、 VH3と VL4の界面を形成しているアミノ酸側鎖をより小さい側鎖 (hole;空隙） に置換する。このような置換により、 VH1と VL2の会合および VH3と VL4の会合を抑制 し、かつ、 VH1と VL4の会合および VL2と VH3の会合を抑制しないように（あるいは促 進するように）制御できる。
[0121] また、 [VH1]リンカ一 [VL2]リンカ一 [VH3]リンカ一 [VL4]の順に並んで!/、る sc(Fv) 2において、 single chain diabody型の割合を減少させて、 bivalent scFv型の割合を増 カロさせるには、例えば、 VH1と VL4の界面を形成しているアミノ酸残基を同種の電荷 を有するアミノ酸残基に置換し、 VH3と VL2の界面を形成して ヽるアミノ酸残基を同種 の電荷を有するアミノ酸残基であって、 VH1と VL4に導入したアミノ酸残基と反発しな い電荷 (好ましくは親和性のある電荷)を有するアミノ酸残基に置換する。また、例え ば、 VH1と VL4の界面を形成しているアミノ酸側鎖をより大きい側鎖 (knob;突起)に置 換し、 VH3と VL2の界面を形成しているアミノ酸側鎖をより小さい側鎖 (hole;空隙)に 置換する。このような置換により、 VH1と VL4の会合および VH3と VL2の会合を抑制し 、かつ、 VH1と VL2の会合および VH3と VL4の会合を抑制しないように（あるいは促進 するように）制御できる。 [0122] 本発明の好ましい態様において、以下の（1)および（2)、または（3)および (4)のァ ミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成 物中の特定の構造異性体の含有割合を増加させる方法を提供する。
(1) sc(Fv)2の VHに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における 39位 に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の VLに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における 38位 に相当するアミノ酸残基
(3) sc(Fv)2の VHに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における 45位 に相当するアミノ酸残基
(4) sc(Fv)2の VLに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における 44位 に相当するアミノ酸残基
[0123] さらに本発明は、以下の（1)および（2)のいずれか一方のアミノ酸残基、または（3) および (4)の ヽずれか一方のアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換する 工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有割合を増加させる方法を 提供する。
(1) sc(Fv)2の VHに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における 39位 に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の VLに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における 38位 に相当するアミノ酸残基
(3) sc(Fv)2の VHに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における 45位 に相当するアミノ酸残基
(4) sc(Fv)2の VLに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における 44位 に相当するアミノ酸残基
[0124] 上記（1)〜(4)に記載のアミノ酸残基は、通常、ヒトおよびマウスにおいては、それ ぞれ、（1)グルタミン (Q)、 （2)グルタミン (Q)、 （3)ロイシン (L)、 （4)プロリン (P)であるが 、必ずしもこのアミノ酸残基に限定されず、このアミノ酸に相当する他のアミノ酸であつ てもよい。例えば、 VL上のアミノ酸配列における 38位に相当するアミノ酸として、ヒトの 場合、例えば、ヒスチジン (H)であってもよい。当業者においては、公知文献等 (例え ば、 J. Mol. Recognit. 2003; 16: 113-120)を参照することにより、任意の位置につい て、その位置に相当するアミノ酸残基の種類を知ることが可能である。
sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成して ヽるアミノ酸残基を、電 荷を有するアミノ酸残基に置換することで、 sc(Fv)2組成物中の後述される構造異性 体の異性ィ匕反応を抑制することもできる。本発明は、 sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖 可変領域が界面を形成して ヽるアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換す る工程を含む sc(Fv)2組成物中の構造異性体の異性化反応を抑制する方法もまた提 供するものである。 sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成して 、るァ ミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程の具体的な態様は上述の 通りである。
[0125] 本発明は sc(Fv)2の両端のリンカ一又は Z及び中央のリンカ一の長さを調節するこ とにより、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体の割合を調節する方法を提供する。本発明 において両端のリンカ一とは、 sc(Fv)2が [可変領域 1] (リンカ一 1) [可変領域 2] (リンカ 一 2) [可変領域 3] (リンカ一 3) [可変領域 4]の順で並んでいる場合、リンカ一 1とリンカ 一 3が両端のリンカ一となり、リンカ一 2が中央のリンカ一となる。
[0126] 具体的には、両端のリンカ一を 0〜12アミノ酸とし、中央のリンカ一を 10〜30アミノ酸 とすることにより、 sc(Fv)2組成物中の single chain diabody型の比率を増加することが 可能となり、両端のリンカ一を 12〜30アミノ酸とし、中央のリンカ一を 0〜10アミノ酸とす ることにより、 sc(Fv)2組成物中の bivalent scFv型の比率を増加させることが可能となる
[0127] さらに、本発明は両端のリンカ一又は Z及び中央のリンカ一の長さを調節すること により、 single chain diabody型の含有比率が 80%以上、好ましくは 90%以上、特に好 ましくは 95%以上の sc(Fv)2組成物を製造する方法を提供する。さらに、本発明は、両 端のリンカ一又は/及び中央のリンカ一の長さを調節することにより、 bivalent scFv型 の含有比率が 80%以上、好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上の sc(Fv)2 組成物を製造する方法を提供する。
[0128] 具体的には、両端のリンカ一を 0〜12アミノ酸とし、中央のリンカ一を 0〜10アミノ酸と することにより、 single chain diabody型の含有比率が 80%以上の sc(Fv)2組成物を製 造することが可能であり、両端のリンカ一を 12〜30アミノ酸とし、中央のリンカ一を 0〜 10アミノ酸とすること〖こより、 bivalent scFv型の含有比率が 80%以上の sc(Fv)2組成物 を製造することが可能となる。
[0129] さらに、本発明は、 sc(Fv)2のリンカ一部位を切断する工程を含む、 sc(Fv)2組成物 中の構造異性体の構造を同定する方法を提供する。
[0130] 本発明においてリンカ一部位とは、リンカ一およびリンカ一近傍領域を含んだ部位 のことをいう。リンカ一近傍領域とは、リンカ一に隣接したアミノ酸から、該アミノ酸から 可変領域側に 20番目のアミノ酸までの 20アミノ酸力 なる領域のことをいう。従って、リ ンカー部位は、リンカ一の両端にそれぞれ 20アミノ酸カゝらなる領域が付加された部位 となる。
[0131] この方法は、クロマトグラフィー等による single chain diabody型、 bivalent scFv型の 解析方法に比較して、より簡便な方法である。クロマトグラフィーでは構造異性体の 分離が出来ても、分離された sc(Fv)2の構造の同定を行うことは出来ない。この方法に よりクロマトグラフィー等で分離された構造異性体の構造を同定することが可能である
[0132] single chain diabody型と bivalent scFv型で立体構造が違うことから、酵素などにより 3つのリンカ一部位のうちいずれ力 1つのリンカ一部位が切断された場合、 single chai n diabody型と bivalent scFv型では切断後の生成物に違いがでる。
[0133] 具体的には、 sc(Fv)2が [可変領域 1] (リンカ一 1) [可変領域 2] (リンカ一 2) [可変領域 3 ] (リンカ一 3) [可変領域 4]の順で並んでいる場合、 bivalent scFv型では、リンカ一 1ま たは 3の部位で切断されると、 4つの可変領域は共有結合又は非共有結合で結合し ているので、 2つの scFvに分離することはないが、リンカ一 2の部位で切断された場合 、可変領域 1と 2からなる scFvと可変領域 3と 4からなる scFvの 2つの scFvに分離される 。 single chain diabody型ではリンカ一 1、 2または 3のいずれのリンカ一部位で切断さ れた場合でも 4つの可変領域は共有結合又は非共有結合に結合して 、るので、 2つ の scFvに分離することはな、（図 4参照)。
[0134] 従って、 bivalent scFv型では 3つのリンカ一部位のうちいずれ力 1つのリンカ一部位 を切断した場合、 4つの可変領域を含む生成物と 2つの可変領域を含む生成物の 2 種類が生成される力 single chain diabody型では 3つのリンカ一部位のうちいずれ力 1 つのリンカ一部位を切断した場合、 4つの可変領域を含む生成物のみが生成される。
[0135] 以上のように、 sc(Fv)のリンカ一部位のうちの 1つを酵素などで切断し、切断後の生 成物を比較することにより、 sc(Fv)2が single chain diabody型、 bivalent scFv型のいず れであるかを調べることが可能である。従って、本発明は、 sc(Fv)のリンカ一部位を切 断する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体の型を分析する方法を提供する
[0136] 具体的には、
(a) sc(Fv)2組成物中の sc(Fv)のリンカ一部位を切断する工程、
(b)切断後の生成物の分子量または構造を測定する工程、
を含む方法である。
[0137] 一般に sc(Fv)2のリンカ一部分は、高次構造を取っていないため、プロテアーゼ等 の分解を受けやすいことが知られている（Hoedemaeker et al、 J Biol Chem. 1997; 27 2： 29784-29789) oリンカ一を切断する方法は特に限定されないが、酵素による切断 が好ましぐ特にプロテアーゼによる切断が好ましい。使用されるプロテアーゼは特に 限定されず、ェキソぺプチダーゼ、エンドべプチダーゼのいずれでもよいが、リンカ 一を切断するという目的からエンドべプチダーゼが好ましい。エンドべプチダーゼは 、セリンプロテアーゼ、チォーノレべプチダーゼ、酸'性プロテアーゼ、メタ口プロテア一 ゼなど如何なるものでもよぐ当業者であれば、リンカ一の種類やアミノ酸配列に応じ て適宜選択することが可能である。例えば、セリンプロテアーゼとして、 Arg, Lys残基 の C末端側を特異的に加水分解するトリプシンやタンパク質 'ペプチドを非特異的に 加水分解するサブチリシンなどが挙げられる。また、チオールプロテアーゼとして、タ ンパク質'ペプチドの N末端の pGlu残基を特異的に加水分解するピログルタメートアミ ノぺプチダーゼやタンパク質 ·ペプチドを非特異的に加水分解するパパインなどが挙 げられる。
[0138] 切断されるリンカ一の数は限定されるものではないが、 1つであることが好ましい。リ ンカーを 1つ切断する場合の条件は当業者に公知の方法で決定することができる。
[0139] 又、切断後の生成物の分子量または構造の測定は、可変領域間の非共有結合を 維持したまま測定することが好ましぐ例えば、 native pageやゲルろ過などを用いるこ とが可能である。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0140] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
[0141] 〔実施例 1〕VB22B sc(Fv)2の構造異性体の分離、構造決定、および活性評価
1-1. 抗ヒト Mpl抗体 VB22B sc(Fv)2の作製
抗ヒト Mpl抗体 VB22B sc(Fv)2は、 PCT/JP2004/18506 (国際公開 WO2005/56604) に示す通りに作製した。具体的には、抗ヒト Mpl抗体を産生するマウスハイプリドーマ VB22Bの抗体可変領域 cDNAをクローユングし、リンカ一配列 (GlyGlyGlyGlySer)x3 ( 配列番号： 1)をコードする塩基配列および FLAG配列（AspTyrLysAspAspAspAspLys ) (配列番号： 2)をコードする塩基配列を用いて、 VH リンカ一配列 VL リンカ一 配列 VH リンカ一配列 VL— Flagタグ配列で構成される塩基配列（配列番号： 3 )を持つような DNAを作製した。この DNA断片を発現ベクター pCXND3にクロー-ング して VB22B sc(Fv)2発現ベクターを構築し、 CHO-DG44細胞に遺伝子導入すること で、安定発現細胞株を作製した。具体的には、発現ベクター (25 μ g)と PBSに懸濁し た CHO- DG44細胞（1 X 107細胞/ mL)の 0.75mLを混合したものを氷上で 10分間冷却 し、キュベットに移した後に Gene Pulserll (BioRad)を用いて 1.5kV、 25 μ FDの容量に てパルスを与えた。室温にて 10分間の回復期間の後、エレクト口ポレーシヨン処理さ れた細胞を、 g/mL Geneticin (Invitrogen)を含む CHO- S- SFMII培地（Invitroge n)に加えて選抜し、 VB22B sc(Fv)2産生 CHO細胞株を榭立した。
[0142] 続 、て、この細胞株より培養上清を 20mMリン酸緩衝液 (pH6.8)で平衡ィ匕した Macr 0- Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I (Bio- Rad)カラムにかけ、 250mMリン酸緩衝 液 (PH6.8)で段階的に溶出した。溶出画分は、限外ろ過膜を用いて濃縮後、 HiLoad 26/60 Superdex200pgカラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、分子量が約 70kD〜40kDに相当する画分を分取した。この画分を、 50mM Tris- HCl(pH7.4), 150 mM NaCl, 0.05% Tween20で平衡化した Anti- Flag M2 Affinity Gel (SIGMA- ALDRIC H)カラムに吸着させ、 100 mM Glycine-HCl(pH 3.5)で溶出させた。溶出画分は、直 ちに 1M Tris-HCl (pH8.0)で中和を行い、 HiLoad 26/60 Superdex200pg (Amersham- Bioscience)カラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマトグラ フィ一のバッファ一は、 20 mM酢酸（pH6.0), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 80を使用し た。
[0143] 1-2. VB22B sc(Fv)2の構造異性体の分離
VB22B sc(Fv)2は VH -linker- VL -linker- VH -linker- VLの配列を有する sc(Fv)2で
1 2 3 4
あることから、 Fv(VH,VL間で非共有結合した分子)の組み合わせにより、構造は VH
1 と VL、 VHと VLがそれぞれ Fvを开成する bivalent scFv型と、 VHと VL、 VHと VLが
2 3 4 1 4 2 3 それぞれ Fvを形成する single chain diabody型の 2種類の構造異性体が存在すると考 えられる（図 1)。 VB22B sc(Fv)2の構造異性体の分離を検討した結果、下記の溶離 条件下で陰イオン交換クロマトグラフィー MONO Q (Amersham Bioscience)を用いる ことにより VB22B sc(Fv)2の各種構造異性体の分離に成功した。
く溶離条件〉
移動相 A： 20mM Tris-HCl, pH8.0
移動相 B： 20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH8.0
流速： 1.0mlノ min
グラジェント： B0%→B35%(30min)
[0144] 上記条件により、 VB22B sc(Fv)2は 4つのピークに分離した。図 2に示すようなクロマ トグラムが得られ、保持時間の短いピークからそれぞれ、 pre peakl、 pre peak2、 peak 1、 peak2と命名した。
[0145] peakl及び peak2に関して、 Q- TOF型質量分析計 (Q Tof Ultima, Micro Mass)に、 In fosionにて試料溶液を導入し得られた多価イオンスペクトル (+)を付属ソフト (MassLynx )を用いたデコンボリューシヨンを行った結果、それぞれの分子量は peakl ;54115Da、 p eak2;54112Daであったことから、 peaklと peak2は同一の分子量を有することが分かつ た。
[0146] VB22B sc(Fv)2は糖鎖付カ卩がないこと、また peaklと peak2は同一のアミノ酸一次配 列を持ち、且つ、イオン交換クロマトグラフィーで分離される互いに異なる立体構造を 有することから、 peaklと peak2は構造異性体 (conformational isomer)であることが示唆 された。公知文献では、構造異性体の存在は示唆されていた力 本検討により初め て構造異性体を分離することが可能になった。
[0147] 1-3. VB22B sc(Fv)2の構造異性体の構造決定
VB22B sc(Fv)2は VH -linker- VL -linker- VH -linker- VLの配列を有する sc(Fv)2で
1 2 3 4
あることから、 Fv(VH,VL間で非共有結合した分子)の組み合わせにより、 VHと VL、 V
1 2
Hと VLがそれぞれ Fvを形成する bivalent scFv型、 VHと VL、 VHと VLがそれぞれ F
3 4 1 4 2 3
vを形成する single chain diabody型の 2種類の構造異性体が存在すると予想されるこ とから、 peaklと peak2はこれらの構造異性体であると考えられた。
[0148] 本検討により 2種類の構造異性体を同定する分析法として、プロテアーゼ限定分解 法を見出した。 sc(Fv)2のリンカ一部分は、比較的自由な構造を取っていると考えられ 、プロテアーゼに対する耐性が低いと考えられ、プロテアーゼの一種である subtilisin Aを用いて、以下の条件で peakl及び peak2及び VB22B bulk (peakl： peak2〜 1： 3) と反応させた。
く反応条件〉
20mM sodium citrate, 150mM NaCl, pH7.5
VB22B sc(Fv)2 peakl or peak2： 0.14mg/mL
Subtilisin A： lug/mL
37°C, 30min
[0149] 上記の反応後、 TrisGlycine SDS gel 12%を用いて、還元 SDS- PAGEを行った。その 結果、 VB22B bulk (構造異性体分離前）、 peakl、 peak2はいずれも同様のバンドパタ ーンを示した（図 3)。 VB22B sc(Fv)2の 3箇所のリンカ一部分の切断によると思われる 各断片の特異的なバンドが得られたことから、上記反応条件を用いることで、 VB22B sc(Fv)2のリンカ一部分を部分的且つ限定的に分解できることが判明した。
[0150] 2種類の構造異性体において、 3箇所のリンカ一の中で 1箇所の切断が起こった場 合、図 4に示すように、未変性状態では VHと VLの間の非共有的な結合により single c hain diabody型の構造においては、 3箇所のリンカ一の中でどのリンカ一に切断が起 こっても見かけの分子量には変化が見られないが、 bivalent scFv型においては、中 央のリンカ一に切断が起こった場合、半分の分子量の分子種が生成する。そこで、上 記反応条件により部分的にリンカ一を切断した、 VB22B sc(Fv)2 bulk, peakl、 peak2 を TSK Super2000(TOSOH)を用いてゲルろ過クロマトグラフィー分析を行った。ゲル ろ過クロマトグラフィーは以下の条件で行った。
移動相： DPBS (-) pH7.4
流速： 0.2ml/min
その結果、図 5に示すように、 peak2では低分子量のピークが全く確認されな力つたの に対して、 peaklは低分子量 (約半分の分子量）のピークが確認された。 peaklと peak2 の混合物である VB22B sc(Fv)2 bulkは、 peaklの存在比に相当する量の低分子量の ピークが確認された。よって、 peaklは bivalent scFv型、 peak2は single chain diabody 型であると同定された。
[0151] 一連の手法により、 VB22B sc(Fv)2に含有する構造異性体を分離し、その構造を同 定することが可能となった。公知文献では、構造異性体の構造はモデル予測にて推 定していたが、本検討により分離された構造異性体の構造を同定する方法を見出し た。またイオン交換クロマトグラフィーのピーク面積から、 VB22B sc(Fv)2に含有する bi valent scFv構造と single chain diabody構造の構造異性体の存在比を定量的に評価 することが可能となった。
[0152] 1-4. VB22B sc(Fv)2の構造異性体の生物活性評価
抗ヒト Mpl抗体 VB22B sc(Fv)2は、文献（Blood 2005;105:562-566)において TPO様 ァゴ-スト活性を示すことが報告されている。そこで、 TPO依存性増殖を示す BaF3-h uman Mpほたは BaF3-monkey Mplを用いて分離した構造異性体の TPO様ァゴ-スト 活性を評価した。
[0153] 各細胞を 1% Fetal Bovine
Figure imgf000042_0001
(Invitrogen)で 2回洗 浄した後、 4xl05cells/mLとなるように 10% Fetal Bovine Serumを含む RPMI 1640に懸濁 し、 60 μ L/wellで 96well plateに分注した。 rhTPO (R&D)または構造異性体サンプル の濃度を振り、各 wellに 40 Lカ卩え、 37°C、 5%CO条件下で、 24時間培養した。 10 L
2
/wellで WST-8試薬（Cell Count Reagent SF、ナカライテスク）を加え、直後に Benchm ark Plusを用いて 450nmの吸光度 (対照 655nm)を測定し、 2時間培養後に、再度 450 n mの吸光度 (対照 655nm)を測定した。 WST-8試薬は生細胞数に応じて 450nmの発色 反応を呈することから、 2時間の吸光度変化を指標に TPO様ァゴニスト活性を評価し た。
[0154] 精製した VB22B sc(Fv)2の構造異性体を用いて、 BaF3-human Mpl、 BaF3-monkey Mplにおける TPO様ァゴ-スト活性を評価した結果をそれぞれ図 6に示す。 peaklと pe ak2の構造異性体のァゴ-スト活性を比較すると、 peak2の方が著しく高 、活性を示 すことが明らかになった。このことから、抗 Mpl抗体 sc(Fv)2が TPO様ァゴ-スト活性を 発揮するためには、 single chain diabodyの構造を取る必要があることが示唆された。
[0155] 〔実施例 2〕 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体の分離、構造決定、および活性評 価
2-1. ヒト化抗ヒト Mpl抗体 hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2の作製
実施例 1で作製した VB22B sc(Fv)2の可変領域のフレームワーク領域 (以下、 FR)に 相補性抗原決定領域 (以下、 CDR)を移植したヒト化抗体を作製した。具体的には、リ ンカー配列 (GlyGlyGlyGlySer)x3 (配列番号： 1)をコードする塩基配列をコードする塩 基配列を用いて、 VH リンカー配列 VL リンカー配列 VH リンカー配列 VL で構成される塩基配列（配列番号: 4)を持つような遺伝子になるように、 50base程度 の合成オリゴ DNAを約 20base程度ハイブリダィズするように設計し、これらの合成オリ ゴ DNAを PCR法によりアッセンプリさせて各可変領域をコードする遺伝子を作製した。 得られた遺伝子を動物細胞で発現するように、実施例 1-1の方法と同様に発現べクタ 一構築、定常発現 CHO-DG44細胞株の作製を行い、培養上清を回収した。ヒト化抗 体 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2は Flagタグを付カ卩していないことから、培養上清からの精 製は、 VB22B sc(Fv)2が認識するェピトープである MG10 (ヒト Mplアミノ酸配列の Gln21 3から Ala231)と GST融合蛋白質を利用して行った。 MG10と GST融合蛋白質の精製は 、 Glutathione Sepharose 4B (Amersham Biosciences社製) 用 ヽて、メーカーのプロ トコールに従って精製した。さらに、精製した MG10と GST融合蛋白質をメーカーのプ ロトコールに従って、 HiTrap NHS- activated HP (Amersham Biosciences社製）に固定 化し、ァフィ-ティカラムを作製した。ヒト化抗体 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2発現 CHO細 胞の培養上清を MG10-GST融合蛋白質固定ィ匕カラムに流し、ヒト化抗体 hVB22B u2 -wz4 sc(Fv)2を吸着させ、 lOOmM Glycine- HCl(pH3.5),0.01% Tween80で溶出させた 。溶出画分は直ちに 1M Tris- HCl(pH7.4)で中和を行い、 HiLoad 16/60 Superdex200 pg (Amersham Biosciences社製）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲル ろ過クロマトグラフィーの緩衝液は、 20mMクェン酸緩衝液（pH7.5) , 300mM NaCl, 0. 01% Tween 80を使用した。
[0156] 2-2. hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2の構造異性体の分離、精製
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2は VH -linker- VL -linker- VH -linker- VLの配列を有す
1 2 3 4
る sc(Fv)2であることから、 VB22B sc(Fv)2と同様に構造は Fv(VH,VL間で非共有結合 した分子）の組み合わせにより、 VHと VL、 VHと VLがそれぞれ Fvを形成する bivale
1 2 3 4
nt scFv型と、 VHと VLゝ VHと VLがそれぞれ Fvを形成する single chain diabody型の
1 4 2 3
2種類の構造異性体が存在すると考えられる（図 1)。
[0157] hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体の分離を検討した結果、陽イオン交換クロマ トグラフィー BioAssist S(TOSOH)を用いて、下記の溶離条件により hVB22B u2- wz4 s c(Fv)2の各種成分の分離できることが示唆された。
移動相 A： 20mM sodium phosphate, pH7.5
移動相 B： 20mM sodium phosphate, 500mM NaCl, pH7.5
流速： 0.8ml/min
グラジェント： B0%→B35%(30min)
[0158] 上記条件により、 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2は 2つのピークに分離した。図 7に示すよ うなクロマトグラムが得られ、保持時間の短いピーク力 それぞれ、 peakl、 peak2と命 名した。
[0159] peakl及び peak2に関して、 Q- TOF型質量分析計 (Q Tof Ultima, Micro Mass)を用 いて分子量の測定を行った。 Q-TOFに infosionにて試料溶液を導入し、得られた多 価イオンスペクトル (+)を、付属ソフト (MassLynx)を用いたデコンボリューシヨンを行った 結果、 peaklの分子量として 53768Da、 peak2の分子量とし 53769Daを得た。このこと力 ら、 peaklと peak2は同一の分子量を有することが分かった。
[0160] peakl及び peak2に関して、ペプチドマッピングを行った。還元変性、 carboxymethyl 化後、トリプシンを用いてペプチド断片に分解し、逆相クロマトグラフィー (YMC- Pack -ODS)によりペプチドマップを得た。 Peaklと peak2のペプチドマップを比較したところ 、図 8に示すように peaklと peak2のマッピングのパターンは同一であったことから、アミ ノ酸一次構造は同一であることが分力つた。
[0161] hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2は糖鎖付カ卩がなぐ peaklと peak2は TOF- MASS測定による 分子量が同一であること、 peaklと peak2はマッピングのパターンが同一であることから 、 peaklと peak2は互いに異なる立体構造を有する構造異性体 (conformational isomer )であることが分力つた。
[0162] hVB22B u2— wz4 sc(Fv)2は VH—linker— VL -linker- VH—linker— VLの配列を有す
1 2 3 4
る sc(Fv)2であることから、図 1に示すとおり、構造は Fv(VH,VL間で非共有結合した分 子）の組み合わせにより、 VHと VL、 VHと VLがそれぞれ Fvを开成する bivalent scFv
1 2 3 4
型と、 VHと VL、 VHと VLがそれぞれ Fvを开成する single chain diabody型の 2種類
1 4 2 3
の構造異性体が存在し、 peaklと peak2はそれぞれ bivalent scFv型と single chain diab ody型のどちらかの構造であると考えられた。
[0163] 2種類の構造異性体を同定する分析法として、プロテアーゼ限定分解法を見出した 。 sc(Fv)2のリンカ一部分は、比較的自由な構造を取っているためプロテア一ゼに対 する耐性が低いと考えられ、プロテアーゼの一種である subtilisin Aを用いて、以下の 条件で peakl及び peak2及び hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2 (peakl： peak2〜 1： 4)と反応 させた。
20mM sodium citrate, 150mM NaCl, pH7.5
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peakl or peak2： 0.15mg/mL
Subtilisin A： lOug/mL
37°C, 30min
[0164] 反応後、 Phastgel Homogeneous 12.5%を用いて、還元 SDS-PAGEを行った。その結 果、図 9に示すとおり、 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 bulk, peakl、 peak2いずれも同様の バンドパターンを示した。 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の 3箇所のリンカ一部分の切断によ ると思われる各断片の特異的なバンドが得られたことから、上記反応条件を用いるこ とで、 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のリンカ一部分を部分的且つ限定的に分解できること が分かった。
[0165] bivalent scFv型と single chain diabody型の構造において、 3つのうちのリンカ一の一 箇所の切断が起こった場合、図 4に示すように、未変性状態では、 VHと VLの間の非 共有的な結合により single chain diabody型の構造においては、 3つのうちのどのリン カーに切断が起こっても見かけの分子量には変化が見られないが、 bivalent scFv型 においては、中央のリンカ一に切断が起こった場合、半分の分子量の分子種が生成 する。そこで、上記反応条件により部分的にリンカ一を切断した、 WB22B u2-wz4 sc( Fv)2 bulk, peakl、 peak2を TSK SuperSW2000(TOSOH)を用いてゲルろ過クロマトグラ フィー分析を行った。ゲルろ過クロマトグラフィーは以下の条件で行った。
移動相： DPBS (-) pH7.4
流速： 0.2ml/min
その結果、図 10に示すように、 peak2においては低分子量のピークが全く確認されな かったのに対して、 peaklにお 、ては低分子量 (約半分の分子量）のピークが確認さ れた。 peaklと peak2の混合物である hVB22B sc(Fv)2 u2- wz4 bulkは、 peaklの存在比 に相当する量の低分子量のピークが確認された。よって、本結果より、 peaklが bivale nt scFv型であり、 peak2が single chain diabody型であると同定された。
[0166] 2-3. hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体の結合活性評価
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2より分離した peakl、 peak2及び hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2の 結合活性の評価を以下のとおり行った。 Biacore 3000(Biacore社製)に Sensor Chip C M5(Biacore社製)を装着し、ァミンカップリング法にて 2-1で示した MG10 (ヒト Mplの Gin 213から Ala231と GST融合蛋白質）を固定ィ匕した。測定のランニングバッファ一は HBS -EP Buffer(Biacore社製)を使用し、流速は 20 L/minとした。 HBS- EP Bufferにより、 およそ 5 nMから 150 nM程度の 6点の濃度になるように、ヒト化 VB22B u2-wz4 sc(Fv)2 bulk, peakl, peak2を調製し、前述の MG10固定化セルに、これらのサンプルをそれ ぞれ、 2分間添加して結合領域を得た後に、解離領域を 2分間測定した。 MG10-GST 融合蛋白質に結合した VB22B sc(Fv)2は、 20mM HC1を 1分間添カ卩して除去し、固定 化セルを再生した。得られたセンサーグラムより、 BIAevaluation ver.3.1ソフトウェア (Bi acore社製)を用いて、 Bivalent analyte modelを適用し、結合速度定数 (ka) '解離速度 定数 (kd)を算出した。その結果、表 1に示すとおり、 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 bulk, pe akl, peak2の解離定数 (KD)は、それぞれ 1.02x10— 8 M, 1.24x10— 8 M, 9.92 xlO— 9 Mで あり、ほぼ 2つの構造異性体はほぼ同等の結合活性を持つことが分力つた。
[表 1]
Figure imgf000047_0001
[0168] 2-4. hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2の構造異性体のァゴ-スト活性評価
peakl及び peak2及び hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2のァゴ-スト活性の評価を行った。図 11に示すように、ァゴ-スト活性は構造異性体間で大きく異なり、 single chain diabod y構造の peak2が非常に高いァゴ-スト活性を示したのに対して、 bivalent scFv構造 の peaklの活性は極めて小さ力つた。 2つの構造異性体は、結合活性はほぼ同程度 であったのに対して、ァゴニスト活性は著しく異なった。公知文献においては構造異 性体の分離'同定が行われていな力つたため、本検討で初めて 2種類の構造異性体 の間で生物学的な活性が異なることが見出された。
[0169] 本実施例にお!、て、 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2に含有する構造異性体を分離し、そ の構造を同定することが可能となった。またクロマトグラフィーのピーク面積により、 hV B22B u2-wz4 sc(Fv)2に含有する bivalent scFv構造と single chain diabody構造の構 造異性体の存在比を定量的に分析することが可能となった。 hVB22B u2-wz4 sc(Fv) 2においては bivalent scFv構造と single chain diabody構造ではァゴ-スト活性に著し い違いがあることが分かり、これらの活性の著しく異なる構造異性体を含む hVB22B u 2-wz4 sc(Fv)2を医薬品として開発するためには、 2種類の構造異性体の性質を決定 し、各構造異性体の含有比率を定量的に分析する規格試験は必要不可欠である。
[0170] 〔実施例 3〕VB22B sc(Fv)2リンカ一改変体の構造異性体存在比の分析および構造異 性体比の制御
VB22B sc(Fv)2は VH -linker- VL -linker- VH -linker- VLの配列を有する sc(Fv)2
1 2 3 4
であることから、構造は Fv(VH,VL間で非共有結合した分子）の組み合わせにより、 V Hと VL、 VHと VLがそれぞれ Fvを形成する bivalent scFv型と、 VHと VL、 VHと VL
1 2 3 4 1 4 2 3 がそれぞれ Fvを形成する single chain diabody型の 2種類の構造異性体が存在すると 考えられる。
[0171] 中央のリンカ一を middle linkerとし、両端のリンカ一を edge linkerとし、図 12に示す ような middle linkerあるいは edge linkerの長さの異なる各種 VB22B sc(Fv)2を作製し、 それらの構造異性体存在比の定量的な分析を以下の条件で行った。
カフム： MONO Q (Amershambioscience)
移動相 A： 20mM Tris-HCl, pH8.0
移動相 B： 20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH8.0
流速： 1.0mlノ min
グラジェント： B0%→B35%(30min)
[0172] その結果、図 13に示すように、任意の長さのリンカ一において実施例 2に示した分 析法により 2つの構造異性体を分離することができ、構造異性体存在含有比率を測 定することが出来た。リンカ一の長さによって、 bivalent scFv型と single chain diabody 型の比を制御することが可能であることが分かり、本分析法を用いることにより目的の 構造異性体比を得ることが出来る適切なリンカ一長を設計することが可能となった。
[0173] 公知文献では、 2つの構造異性体の構造同定法、及び、定量的な分析法が見出さ れていな力つたため、このようなリンカ一の長さと構造異性体の存在比を定量的に評 価することは出来なかった。 Protein Engineering, 1993, 6(8), 989- 995や Protein Engi neering, 1994, 7(8), 1027- 1033等においてリンカ一の長さが 12以下の場合は、近接 する VHと VL同士は Fvを形成しにくいことが一般的に報告されていた力 本検討によ り、 G5や G10においては、近接する VHと VL同士が Fvを形成した single chain diabody 型の構造が少量ながら存在することが分力つた。すなわち、いかなるリンカ一におい ても 2つの構造 (すなわち構造異性体)が存在する可能性が考えられた。そのため医 薬品として sc(Fv)2型の分子を開発するためには、いかなるリンカ一においても構造 異性体の存在比率を定量的に分析する必要があると考えられ、このことから構造異 性体の存在比率を定量的に分析可能且つ分離生成可能な本分離分析法は、 sc(Fv) 2型の医薬品分子を開発するにあたって極めて有用である。 [0174] 〔実施例 4〕陽イオン交換クロマトグラフィー（SOURCE 15S)による構造異性体の大量 精製
実施例 2-1で使用した hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2発現 CHO細胞の培養上清力も精製 を行った。培養上清は、精製水で 3倍に希釈した後、 1 M酢酸で pHを 6.0に調整した。 この後、 20 mM酢酸ナトリウム緩衝液、 pH 6.0で平衡化した SP Sepharose Fast Flow column(Amersham Biosciences社製)にかけ、同緩衝液でカラムを洗浄後、同緩衝液 中 0 M力 0.5 Mまでの NaClの直線濃度勾配で、カラムに吸着したポリペプチドを溶 出した（第一工程）。得られた画分を TrisGlycine SDS gel 12%を用いた還元 SDS-PAG Eで分析し、 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2を含む画分を集めた。
[0175] 第一工程の hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2画分は、 10 mMリン酸緩衝液、 pH 6.8で平衡 化したハイドロキシアパタイトカラム，タイプ I, 20 m (BIO- RAD社製)に添カ卩し、同緩 衝液でカラムを洗浄後、 pH 6.8のリン酸緩衝液濃度を 160 mMまで直線的に上げ、力 ラムに吸着したポリペプチドを溶出した（図 14)。メインピークの後に、小さなピークが 溶出したが、 SDS-PAGE分析の結果、これらはいずれも hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2であ ることが確認された。図 14右に示したように、 Superdex 200 PC 3.2/30 column(Amers ham Biosciences社製)を使用した分析ゲルろ過により、メインピークはほとんどが hVB 22B u2-wz4 sc(Fv)2のモノマーであり、後ろのピークは hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2のダ イマ一以上のァグリゲート画分であることがわかった。以上より、この工程で hVB22B u 2-wz4 sc(Fv)2のモノマー画分を分離できることがわかった。
[0176] 第二工程で得られた hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のモノマー画分は、精製水で 5倍に希 釈した後、 20 mMリン酸ナトリウム緩衝液、 pH 7.0で平衡化した SOURCE 15S column (Amersham Biosciences社製)にかけ、同緩衝液でカラムを洗浄後、同緩衝液中 0 mM 力も 36 mMまでの NaClの直線濃度勾配をかけたのち、 2つのピークを最大限に分離 して溶出させるため、ー且 36 mMで NaClの濃度を固定した。図 15に示すように、 2つ の hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のピークが溶出されたのち、再び NaClの濃度を上げて、さ らに強くカラムに吸着したポリペプチドを溶出しカラムを洗浄した。これら 2つのピーク は、 2-2で示した BioAssist Sカラムによる分析で、先に溶出するメインピークが peak2 で、後力も溶出するのが peaklであることが判明した (図 16)。 [0177] 精製した hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の peaklと peak2は、前述の SDS gelを用いて還元 と非還元両条件で SDS-PAGE分析をおこなったところ、いずれも分子量約 55 kDaの 位置にシングルバンドとして観察された (図 17)。さらに hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の pea klと peak2は、 1-3で示した TSK Super2000カラムによるゲルろ過クロマトグラフィー分 祈で、いずれもシングルピークで見かけ上の分子量約 50 kDaを示した (図 18)。
[0178] 以上より、 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の目的とする構造異性体のモノマーのみを、大 量精製に不向きなゲルろ過クロマトグラフィーを使用せずに精製する方法の開発に 成功した。
[0179] 〔実施例 5〕VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の作製、構造異性体分析および同定
5-1. VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の作製
実施例 2で作製した hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 (以下、 u2-wz4)の VH/VL界面を形成 するアミノ酸である VHの 39番目（WO2005/56604の配列番号： 289に記載のアミノ酸 配列における 39位）の Ginと VLの 38番目（WO2005/56604の配列番号： 291に記載の アミノ酸配列における 43位）の Ginを以下のようにして改変した。 u2-wz4は [VH1]リン カー [VL2]リンカ一 [VH3]リンカ一 [VL4]の順にアミノ酸リンカ一配列 (GlyGlyGlyGlyS er)x3 (配列番号：1)で連結されており、配列番号 4で記載した塩基配列で転写、翻 訳される。はじめに、 VH1の 39番目の Gin (遺伝子コドン C AG)を Glu (遺伝子コドン GA G)に、 VL2の 38番目の Gin (遺伝子コドン C AG)を Glu (遺伝子コドン GAG)に、 VH3の 39番目の Gin (遺伝子コドン CAG)を Lys (遺伝子コドン AAG)に、 VL4の 38番目の Gin ( 遺伝子コドン CAG)を Lys (遺伝子コドン AAG)に改変した遺伝子 hVB22B u2-wz4(vl) sc(Fv)2 (以下 vl、塩基配列を配列番号： 5に、アミノ酸配列を配列番号: 6に示す)を 作製した。さらに、 VH1の 39番目の Gin (遺伝子コドン CAG)を Glu (遺伝子コドン GAG) に、 VL2の 38番目の Gin (遺伝子コドン CAG)を Lys (遺伝子コドン AAG)に、 VH3の 39 番目の Gin (遺伝子コドン CAG)を Lys (遺伝子コドン AAG)に、 VL4の 38番目の Gin (遺 伝子コドン CAG)を Glu (遺伝子コドン GAG)に改変した遺伝子 hVB22B u2-wz4(v3) sc (Fv)2 (以下 v3、塩基配列を配列番号： 7に、アミノ酸配列を配列番号: 8に示す)を作 製した。遺伝子の改変は QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE 社製)を用いてメーカーのプロトコールに従い、点突然変異を導入した。各遺伝子の 塩基配列を確認した後、 DNA断片を発現ベクター pCXND3にクローニングして発現 ベクターを構築し、 CHO-DG44細胞に遺伝子導入することで、安定発現細胞株を作 製した。具体的には、発現ベクター (20 μ g)と PBSに懸濁した CHO-DG44細胞（1 X 1 07細胞/ mL)の 0.75mLを混合したものを氷上で 10分間冷却し、キュベットに移した後 に Gene Pulser Xcell (BioRad)を用いて 1.5kV、 25 μ FDの容量にてパルスを与えた。 室温にて 10分間の回復期間の後、エレクト口ポレーシヨン処理された細胞を、 500 g /mL Geneticin (Invitrogen)を含む CHO- S- SFMII培地 (Invitrogen)に加えて選抜し、 vl産生 CHO細胞株および v3産生 CHO細胞株を榭立した。
[0180] VH/VL界面改変型 sc(Fv)2は Flagタグを付カ卩して!/ヽな 、こと力ら、培養上清からの 精製は、 VB22B sc(Fv)2が認識するェピトープである MG10 (ヒト Mplアミノ酸配列の Gin 213から Ala231)と GST融合蛋白質を利用して行った。 MG10と GST融合蛋白質の精製 は、 Glutathione Sepharose 4B (Amersham Biosciences社製)を用いて、メーカーのプ ロトコールに従って精製した。さらに、精製した MG10と GST融合蛋白質をメーカーの プロトコールに従って、 HiTrap NHS- activated HP (Amersham Biosciences社製）に固 定化し、ァフィ二ティカラムを作製した。 vl発現 CHO細胞株または v3発現 CHO細胞 株の培養上清を MG10-GST融合蛋白質固定ィ匕カラムに流し、 vlまたは v3を吸着させ 、 lOOmM Glycine-HCl(pH3.5),0.01% Tween80で溶出させた。溶出画分は直ちに 1M Tris— HCl(pH7.4)で中和を行い、 HiLoad 16/60 Superdex200pg (Amersham Bioscienc es社製)を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、モノマー分子を精製した。ゲル ろ過クロマトグラフィーの緩衝液は、 20mMクェン酸緩衝液（pH7.5) , 300mM NaCl, 0. 01% Tween 80を使用した。図 19に示したゲルろ過クロマトグラフィーの結果から、改 変体 vl, v3は培養上清中でダイマー以上の凝集体が低下し、モノマー比率は改変 前の u2-wz4の 59%と比較して、 vlが 89%、 v3が 77%と上昇していることが明らかになった 。改変体 vl, v3は VH/VL界面のアミノ酸を改変することにより、電荷的な反発により好 ましくない会合を阻害し、好ましい会合を促進したことが推測される。以上のことからこ の会合制御により、効率的なモノマー分子の発現に成功した。
[0181] 5-2.VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の構造異性体分析および同定
得られた VH/VL界面改変体である vl、 v3および未改変体である u2-wz4の構造異 性体存在比を陽イオン交換クロマトグライフィーおよび等電点電気泳動により分析し た。また、プロテアーゼ限定分解法による構造同定を実施した。
陽イオン交換クロマトグラフィーは以下のとおり実施した。
カラム： TSK— gel Bioassist S, 4.6 mm X 50 mm (TOSOH社製）
流速： 0.8mL/min
検出波長： 220nm
溶出条件：
Eluent A : 20 mmol/L Phosphate buffer (pH 7.0)
Eluent B : 20 mmol/L Phosphate buffer I 500 mmol/L NaCl (pH7.0) グラジェント:
Time(min) B%
0 0
5 0
25 30
25.1 100
35 100
35.1 0
等電点電気泳動は以下のとおり実施した。 PhastGel Dry IEFゲル (Amersham Biosci ences社製)を以下のゲル膨潤液にて 30分以上膨潤した。試料を先に膨潤させたゲル に添加し、 PhastSystemにより以下の泳動条件で電気泳動した。泳動後、 20%TCA溶 液に 30分間浸した後、ミリ Q水で 5分間 X 3回以上洗浄し、試料のタンパク質濃度に 応じてクマシ一染色、または銀染色した。クマシ一染色では、染色液として 0.1%CuSO (w/v)を含む 0.02%CBBを用い、染色を行い、 10%酢酸を含む 30%メタノールで脱色し
4
た。銀染色では、 Silver stain kit, Protein (Amersham Biosciences社製）を用い、キット に添付された標準プロトコールにより染色を行った。
くゲル膨潤液〉
Pharmalyte 8.5-10 80 ^ L
Biolyte 7—9 lO ^ L Biolyte 3-9 lO ^ L
20% Glycerol 2.0mL
〈電気泳動プログラム〉
SAMPLE APPLICATION DOWN AT step2 OVh
SAMPLE APPLICATION UP AT step3 OVh
Step 1 2000V 2.5mA 3.5W 15°C 75Vh
Step 2 200V 2.5mA 3.5W 15°C 15Vh
Step 3 2000V 2.5mA 3.5W 15°C 410Vh
[0183] プロテアーゼ限定分解法による構造同定は以下の条件で実施した。 subtilisin Aを 用いて、以下の条件で u2-wz4精製 peaklと u2-wz4精製 peak2、及び、改変体 vlと改 変体 v3を反応させた。
20mM sodium citrate, 150mM NaCl, pH7.5
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peakl or peak2： 0.15mg/mL
Subtilisin A： lOug/mL
37°C, 30min
[0184] 得られた反応液をゲルろ過クロマトグラフィーにより以下の条件で分析した。
Column： TSKgel Super2000sw (TOSOH)
Eluent： 50mM sodium phosphate, 300mM KC1, pH7.0
Flow rate： 0.2ml/min
Detection： 220nm
[0185] 図 20および図 21に示した陽イオン交換クロマトグラフィーと等電点電気泳動による 構造異性体の分析結果から、 u2- wz4は 24%力 bivalent scFv型、 76%が single chain dia body型として両構造異性体の混合物として発現しているのに対して、改変体 vlは 100 y ngle chain diabody型の構造異性体として発現しており、改変体 v3は 100%が bival ent scFv型の構造異性体として発現していることが分力つた。また図 22に示すとおり 、プロテアーゼ限定分解の結果からも、改変体 v3は u2-wz4精製 peaklと同様に低分 子のピークが見られ、改変体 vlは u2-wz4精製 peak2と同様に低分子のピークが見ら れなかったことから、改変体 vlは single chain diabody型の構造異性体として発現して おり、改変体 v3は bivalent scFv型の構造異性体として発現していることが示された。
[0186] 〔実施例 6〕 VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の活性評価および安定性評価
6-1. VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の生物活性評価
実施例 1に示す方法に従って、 VH/VL界面改変体 vlおよび v3のァゴニスト活性の 評価を行った。ァゴ-スト活性は構造異性体間で大きく異なり図 11に示すように、 sin gle chain diabody構造の peak2が非常に高いァゴ-スト活性を示すのに対して、 bivale nt scFv構造の peaklの活性は極めて低下する。図 23に示すとおり、改変体 vlは peak 2と同等の活性を示し、改変体 v3は peaklとほぼ同等の活性を示した。以上のことから 生物活性においても、改変体 vlが single chain diabody構造を、改変体 v3が bivalent s cFv構造を形成して 、ることが確認された。
[0187] 6-2. VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の安定性評価
u2-wz4精製 peaklと u2-wz4精製 peak2、および、改変体 vlと改変体 v3の安定性評 価として、示走査型熱量測定（Differential Scanning Calorimetry)を用いて変性中間 温度 (Tm値)の測定を以下の条件下で行った。
DSC： N-DSCII (Applied Thermodynamics社製）
溶液条件： 20mM sodium citrate, 300mM NaCl, pH7.0
タンパク質濃度: O.lmg/mL
スキャニング速度：1°C/分
[0188] 各 DSC測定の結果を図 24に示した。 u2-wz4精製 peak2と改変体 vlの Tm値は未改 変体とほぼ同等であり、安定性は同等であることが分力つた。 u2-wz4精製 peaklと改 変体 v3とでは、若干改変体 v3のほうが低い安定性を示した。 knobs-into-hole技術を 用いた方法による界面制御においては、例えば IgGの CH3ドメインのヘテロ会合にお いて、未改変 CH3ドメインの Tm値が 80.4°Cであったのに対して、改変 CH3ドメインの T m値は 69.4°Cであり、大幅に Tm値が低下し安定性が低下してしまうことが報告されて いる（Acta Pharmacologica Sinica, 2005, 26, 649-658)。それに対して、本発明にお いては安定性を低下させること無く会合を制御できることが確認された。
[0189] 続いて、 u2-wz4精製 peaklと u2-wz4精製 peak2および VH/VL界面改変体である改 変体 vlと改変体 v3の安定性評価として、以下の条件における熱加速試験による安定 性評価を実施した。
く熱加速条件〉
溶液条件： 20mM sodium citrate, pH6.0
タンパク質濃度: 0.25mg/mL
加速条件： 40°C-6day, 12day
熱加速サンプルは、ゲルろ過クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィ 一により以下の条件で分析した。
[0190] 図 25に示すとおり、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分析の結果、 u2-wz4精製 peak 2と改変体 vlのモノマー残存率はほぼ同等であり、会合ィヒに対する安定性はほぼ同 等であることが確認された。また、 u2-wz4精製 peaklと改変体 v3のモノマー残存率も モノマー残存率はほぼ同等であり、両構造異性体において会合ィヒに対する安定性 はほぼ同等であることが分かった。
[0191] 図 26に示すとおり、陽イオン交換クロマトグラフィーによる分析の結果、未改変体の 精製 peaklは異性化反応により peak2に異性化し、未改変体精製 peak2は異性化反応 により peaklに異性ィ匕したのに対して、 VH/VL界面改変体 vlと v3は熱加速後も異性 化反応は起こさな力つた。 VH/VL界面の改変を適用することによって、 2種類の構造 異性体のうち一方のみの構造異性体が 100%の状態で発現できることにカ卩えて、得ら れた各構造異性体は異性化反応を起こさず安定に保存可能であることが分かった。
[0192] 本実施例において、 vlおよび v3に適用した VH/VL界面改変を用いることによって、 2種類の構造異性体のうち一方のみの構造異性体が 100%存在する状態で発現でき ることを見出した。目的の構造の一本鎖抗体を得るための VH/VL界面制御としては、 knobs- into- hole技術を用いて Bispecific diabodyの構造を制御する方法（Protein Sci . 1997 Apr;6(4):78丄- 8, Remodeling domain interfaces to enhance heterodimer forma tion., Zhu Z, Presta LG, Zapata G, Carter P.)が知られている。この方法では、 VH/ VL界面あたり合計 4箇所のアミノ酸を改変することにより目的のへテロダイマー構造 の形成率が 72%から 92%まで上昇したことを報告している。それに対して、本発明は 4 箇所のアミノ酸 (VH/VL界面あたりでは 2箇所のアミノ酸)を改変することにより、熱安 定性および構造異性体の安定性を低下させることなぐ目的の構造を 100%の比率で 取得することに成功した。
[0193] 〔実施例 6〕ヒト化抗ヒ HL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の分離、構造決定
6-1. ヒトイヒ抗ヒ HL-6受容体抗体 sc(Fv)2の作製
Sato K.ら（Cancer Research 1993;53:851-856)により報告されているヒト化抗ヒト IL- 6受容体抗体の VHと VLを用いて、リンカ一配列 (GlyGlyGlyGlySer)x3 (配列番号： 1) をコ一ドする遺伝子を用いて、 VH リンカー配列 VL リンカー配列 VH リンカ 一配列— VLで構成されるように連結した sc(Fv)2遺伝子 (アミノ酸配列；配列番号： 18 、塩基配列;配列番号： 19)を作製した。得られた遺伝子を動物細胞で発現するよう に、発現ベクター pMCDNに挿入した。本ベクター pMCDNの構築の流れについて、 以下に述べる。 pUC19ベクターにマウスサイトメガロウイノレス (mCMV)ェンハンサ一お よびプロモーター、シミアンウィルス- 40(SV40)の後期ポリアデュル部位を挿入したベ クタ一を pMCと命名した。次に、 DHFR- A E-rVH- PMl-f(W092/ 19759参照）の抗 体 H鎖遺伝子とベクターを分割するために、制限酵素 EcoRI, Smal部位で消化し、ベ クタ一側のみ回収した後に、 EcoRI- Notl-BamHI adaptor (宝酒造）をクローユングし た。このベクターを pCHOIと命名した。 pCHOIの DHFR遺伝子発現部位と pCXN (Niwa ら、 Gene 1991； 108 : 193-200)の制限酵素の Neomycin而性遺伝子発現部位を pMC ベクターに挿入した発現ベクターを pMCDNと命名した。構築したヒト化抗ヒト IL-6受 容体抗体 sc(Fv)2発現ベクターを制限酵素で直鎖上にしたのちに、 CHO-DG44細 胞に遺伝子導入して抗体発現細胞株を榭立した。
[0194] 安定発現細胞株の作製は次に示すようにして行った。細胞への遺伝子導入は、 Ge nePulserXcell (Bio-Rad)を用いたエレクト口ポレーシヨン法により行った。各抗体発現 ベクターと PBSに懸濁した CHO細胞（1 X 107細胞/ mL)の 0.75mLを混合したものを氷 上で 10分間冷却し、キュベットに移した後に 1.5kV、 25 μ FDの容量にてパルスを与え た。室温にて 10分間の回復期間の後、エレクト口ポレーシヨン処理された細胞を、 HT supplement (Invitrogen)を 1倍濃度で含む CHO- S- SFMII培地 (Invitrogen) 40mLに懸 濁した。同様の培地で 10-50倍希釈液を作製し、 96ゥエル培養用プレートに 100 L/ wellで分注した。 COインキュベーター（5% CO )で 24時間培養後、 Geneticin (Invitro
2 2
gen)を 0.5mg/mLになるように添加して、 2週間培養した。薬剤耐性を示す形質転換 細胞のコロニーを順次拡大培養し、榭立した高産生細胞株を用いて大量培養を行 ヽ 、培養上清を得た。
[0195] ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体の L鎖が Protein Lに結合することを利用して、ヒト化抗 ヒト IL- 6受容体抗体 sc(Fv)2発現 CHO細胞の培養上清を Protein L (Actigen社製） を充填したカラムに流し、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2を吸着させ、 lOOmM Glycine-HCl(pH2.7)で溶出させた。溶出画分は直ちに 1M Tris-HCl(pH8.5)で中和を 行い、 HiLoad 26/60 Superdex200pg (Amersham Biosciences社製）を用いてゲノレろ過 クロマトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマトグラフィーの緩衝液は、ダルベッコ PBS を使用した。
[0196] 6-2. ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の分離、精製
ヒトイ匕抗ヒト IL— 6受容体抗体 sc(Fv)2は VH—linker— VL—linker— VH—linker— VLの
1 2 3 4 配列を有する sc(Fv)2であることから、実施例 1の VB22B、実施例 2の hVB22Bと同様に Fv(VH,VL間で非共有結合した分子)の組み合わせにより、構造は VHと VL、 VHと V
1 2 3
Lがそれぞれ Fvを形成する bivalent scFv型と、 VHと VL、 VHと VLがそれぞれ Fvを
4 1 4 2 3
形成する single chain diabody型の 2種類の構造異性体が存在すると考えられる（図 1 )。ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の分離を検討した結果、下記 の溶離条件下で陽イオン交換クロマトグラフィー BioAssist S (TOSOH)を用いることに よりヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の分離に成功した。
く溶離条件〉
移動相： 20mM Tris-HCl pH8.5, 75 mM NaCl
流速： 0.8ml/min
グラジェント：イソクラティック (グラジェント無し）
上記条件により、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2は 2つのピークに分離した。 図 27に示すようなクロマトグラムが得られ、保持時間の短いピークを peakl、長いピー クを peak2と命名した。同方法により Peaklと peak2を精製することができた。精製後の p eaklと peak2の陽イオン交換クロマトグラフィー分析の結果を図 28に示した。
[0197] 6-3. ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の同定
分取したヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の peaklと peak2は構造異性体と考え られたためで、 2種類の構造異性体を同定する分析法として、実施例 2、 3で実施 したプロテアーゼ限定分解法を用いた。以下の条件でヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の peaklおよび peak2と反応させた。
PBS (pH7.4)
ヒトイ匕抗ヒト IL— 6受容体抗体 sc(Fv)2 peakl or peak2： 0.05mg/mL
Subtilisin A： 0.5ug/mL
37。し, 60min
上記反応後、 Phastgel Homogeneous 12.5%を用いて、還元 SDS-PAGEを行った。そ の結果、図 29に示すとおり、 peakl、 peak2いずれも同様のバンドパターンを示した。 上記反応条件により部分的にリンカ一を切断した、 peakl、 peak2を以下の条件で TSK
SuperSW2000(TOSOH)を用いてゲルろ過クロマトグラフィー分析を行った。 移動相： 50mM sodium phosphate, 300mM KC1, pH7.0
流速： 0.2ml/min
[0198] その結果、図 30に示すように、 peaklにおいては低分子量のピークがほとんど確認 されなかったのに対して、 peak2においては低分子量 (約半分の分子量）のピークが 確認された。よって、本結果より、 peaklが single chain diabody型であり、 peak2が bival ent scFv型であると同定された。図 27よりヒトイ匕抗ヒト IL- 6受容体抗体 sc(Fv)2にお いては peaklよりも peak2の含量が多いことから、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2 においては bivalent scFv型が主成分であり、 single chain diabody型はマイナー成分 であることが分かった。実施例 1における VB22B sc(Fv)2、および実施例 2における hV B22B u2-wz4 sc(Fv)2においては、 single chain diabody型が主成分であったことから 、 sc(Fv)2の可変領域配列の違いにより、構造異性体の含有率が大きく変化すること が分力つた。構造異性体含有率が sc(Fv)2の可変領域配列により大きく変化すること から、 sc(Fv)2を医薬品として開発するにあたっては、構造異性体の分離と構造同定 は重要であると考えられる。
[0199] 〔実施例 7〕ヒト化抗ヒ HL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の活性評価
7-1.ヒト gpl30発現 BaF3細胞株、ヒト gpl30/ヒト IL-6受容体共発現 BaF3細胞株の榭 IL-6依存増殖性を示す細胞株を得るために、以下に示すとおり、ヒト gpl30を発現し た BaF3細胞株の榭立を行った。
全長ヒト gpl30 cDNA (Hibiら、 Cell 1990 ;63 : 1149- 1157 (GenBank # NM— 002184》 を PCRにより増幅し、 pCHOI (Hirataら、 FEBS Letter 1994 ;356 : 244- 248)の DHFR遺 伝子発現部位を除去し、 Zeodn耐性遺伝子発現部位を挿入した発現ベクター pCOS 2Zeoにクローユングし、 pCOS2Zeo/gpl30を構築した。
10 gの pCOS2Zeo/gpl30を PBSに懸濁した BaF3細胞 (0.8xl07cells)に混合し、 Gen e Pulser (Bio- Rad)を用いて 0.33kV, 950 FDの容量でパルスを加えた。エレクトロポ 一レーシヨン処理により遺伝子導入した BaF3細胞を 0.2ng/mLの mouse interleukin- 3 (Peprotech)、 10% Fetal Bovine Serum (以下 FBSゝ HyClone)を含む RPMI1640培地（I nvitrogen)で一昼夜培養し、 100ng/mLの human interleukin- 6(R&D)、 lOOng/mLの h uman interleukin- 6 soluble receptor (R&D systems)および 10%FBSを含む RPMI1640 培地をカ卩えて選抜し、ヒト gpl30発現 BaF3細胞株（以下、 BaF3/gpl30)を榭立した。 7-2.ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体のヒ HL-6中和活性評価
IL-6依存性増殖を示す BaF3/gpl30を用いて、以下に示すとおり、 IL-6中和活性を 評価した。精製したヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体を 10 /z g/mL になるように 10% FBSを含む RPMI1640に希釈した。この溶液を用いて希釈公比 3、合 計 6系列の希釈液を調製し、 96weU- plate(FALCON)の各 wellに 50 μ Lずつ分注した。 次に、 BaF3/gpl30を 10% FBS (HyClone)を含む RPMI 1640培地で 3回洗浄した後に、 5xl04cells/mLとなるよつに 60ng/mLの human interleukin— 6 (R&D systems) ^ 60ng/mL の可溶性ヒ HL-6受容体（自社調製品）および 10% FBSを含む RPMI1640培地に懸濁 し、抗体サンプルを分注した wellに 50 /z Lずつ混合した。ヒト可溶性 IL_6受容体は以 下に示す方法で調製した。ヒト可溶性 IL-6受容体 (Yamasakiら、 Science 1988 ;241 : 82 5-828 (GenBank # X12830))の 1番目から 344番目のアミノ酸をコードする遺伝子を CH 0細胞に導入後に培養上清力 精製して調製した。
37°C、 5%CO条件下で、 72時間培養し、 PBSで 2倍に希釈した WST-8試薬（Cell Co
2
unting Kit- 8、株式会社同仁化学研究所）を 20 μ L/wellでカ卩え、直後に SUNRISE CL ASSIC(TECAN)を用いて 450nmの吸光度 (参照波長 620nm)を測定した。 2時間培養し た後に、再度 450 nmの吸光度 (参照波長 620nm)を測定し、 2時間の吸光度変化を指 標に IL-6中和活性を評価した。
[0201] その結果、図 31に示すとおり、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体 (peakl, peak2)は、分画前の精製品 (bulk)と中和活性が同等であった。実施例 1の VB 22B sc(Fv)2および実施例 2の hVB22B sc(Fv)2においては、 2つの構造異性体の間 で活性に大きな違いが見られたが、本実施例のヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv) 2にお!/、ては中和活性に違 、が見られなかった。このように sc(Fv)2の 2つの構造異性 体の活性の差は、ターゲットとなる抗原の種類や sc(Fv)2分子のアミノ酸配列によって 異なることが考えられ、 sc(Fv)2分子を医薬品として開発するにあたっては、構造異性 体の分離と構造同定および構造異性体の制御は重要であると考えられる。また実施 例 6で示されるように各構造異性体は保存中に異性化反応が起きる可能性があり、 sc (Fv)2製剤の品質規格の点からも構造異性体の分離と構造同定および構造異性体の 制御は重要であると考えられる。
[0202] 〔実施例 8〕VB22B sc(Fv)2の single chain diabodyを高収率で得る方法
VB22B sc(Fv)2より精製した single chain diabody (peak2)と bivalent scFv (peakl)をそ れぞれ、 20mM sodium acetate, 150mM NaCl, pH6.0の条件下、 40°Cにおいてインキ ュペートした。実施例 1に示した陰イオン交換クロマトグラフィーの方法で peaklと peak 2比を測定した結果、図 32に示したように、 peaklのピークエリアが減少し、それに代 わって、 peak2のピークエリアが増大した。そこで、 peaklを同条件下で 6日間インキュ ペートしたサンプルを実施例 1に示した方法でァゴ-スト活性を評価したところ、図 33 に示したように incubateする前のサンプルに比べて大幅にァゴ-スト活性が増大した 。実施例 1に示したとおり peaklは single chain diabodyである peak2に比べて著しく活 性が低いことから、 bivalent scFvである peaklは、 20mM sodium acetate, 150mM NaCl , pH6.0, 40°Cでインキュベートすることによって、高活性の single chain diabodyである peak2に構造変換する (構造異性体が異性ィ匕する)ことが分力つた。すなわち、これに より bivalent scFvと single chain diabodyの混合物を適当な条件下に暴露することによ つて、 bivalent scFvである peak丄 single cnain diabodyで fcopeak2に変換す こと力 可能であり、 peak2の含有率を増加させることが可能であることが示された。 peaklから peak2に異性ィ匕させる本方法を用いることで、細胞より産生された peaklと peak2の混 合物から peaklを peak2に異性化させることによって、高収率で single chain diabodyで ある peak2を得ることが可能である。
[0203] 〔実施例 9〕 hVB22B sc(Fv)2の single chain diabody型を高収率で得る方法
実施例 4において hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2より精製した bivalent scFv (peakl)を 20mM sodium citrate, 0mM/150mM/300mM NaCl, pH3.0/3.5/4.0/4.5/5.0/5.5/6.0/6.5/7 .0/7.5の計 30条件下、 25°Cにおいて 10日間インキュベートした。実施例 1に示した陽 イオン交換クロマトグラフィーの方法で peaklと peak2比を測定した結果、図 34に示し たように、 インキュベート前に比べて peak2存在比が増大した。これより hVB22B u2-w z4 sc(Fvノ 2【こお ヽても、 bivalent scFvT"¾)¾peakl ¾^ single chain diabodyである peak 2に構造変換することを見出した。その異性ィ匕速度は、低 pH及び低塩濃度ほど早い ことを見出した。 Peaklから peak2に異性ィ匕させる本方法を用いることで、細胞より産生 された peaklと peak2の混合物力も peaklを peak2に異性化させることによって、高収率 で single chain diabodyである peak2を得ることが可會である。
産業上の利用可能性
[0204] 本発明により、 sc(Fv)2組成物中の 2種の構造異性体を分離取得する方法、分離さ れた 2種の構造異性体の構造を同定する方法、及び、 2種の構造異性体を定量的に 分析する方法が提供された。またリンカ一長を調節することにより sc(Fv)2組成物中の 特定の構造異性体の割合を増加させる方法が提供された。さらに可変領域内のアミ ノ酸を改変することにより構造異性体の生成を制御する方法が提供された。これらの 方法を利用することにより、 sc(Fv)2の特定の構造異性体を有効成分として含有する 医薬組成物を製造することができ、従来と比較して高活性の医薬組成物を提供する ことが可能となった。また、医薬品としての開発に必要な規格試験により、構造が同 定された構造異性体の含有比率を規定した sc(Fv)2を医薬品組成物として提供する ことが可能となった。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の工程を含む sc(Fv)2医薬組成物の製造方法。
(a) SC(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(b)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程
[2] 以下の工程を含む sc(Fv)2医薬組成物の製造方法。
(a) SC(Fv)2の構造異性体の活性を比較して高活性の構造異性体をあらかじめ決定 する工程
(b) sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(c)工程 (a)により決定された高活性の構造異性体を取得する工程
[3] 以下の工程を含む sc(Fv)2医薬組成物の製造方法。
(a) sc(Fv)2組成物中の構造異性体の比率が好ましい値になるようにリンカ一の長さを 決定する工程
(b)工程 (a)で決定されたリンカ一の長さを有する sc(Fv)2組成物を作製する工程
(c)作製された sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(d)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程
[4] 以下の工程を含む sc(Fv)2医薬組成物の製造方法。
(a)リンカ一の長さが異なる複数の sc(Fv)2組成物を作製する工程
(b) sc(Fv)2組成物中の構造異性体の比率が好まし 、値となるリンカ一を有する sc(Fv )2を選択する工程
(c)工程 (b)で選択された sc(Fv)2のリンカ一と同じ長さのリンカ一を有する sc(Fv)2組 成物を作製する工程
(d)作製された sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(e)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程
[5] 構造異性体力 ngle chain diabody型又は bivalent scFv型である請求項 1〜4の!ヽず れかに記載の方法。
[6] 構造異性体がァゴニスト活性を有することを特徴とする請求項 1〜5のいずれかに記 載の製造方法。
[7] sc(Fv)2のリンカ一が 15アミノ酸であることを特徴とする請求項 1〜6のいずれかに記載 の製造方法。
[8] 請求項 1〜7のいずれかに記載の製造方法により作製された医薬組成物。
[9] sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の割合が 80%以上であることを特徴とする医 薬組成物。
[10] 構造異性体力 ngle chain diabody型又は bivalent scFv型である請求項 9に記載の医 薬組成物。
[11] 構造異性体が受容体に結合することを特徴とする請求項 9または 10に記載の医薬組 成物。
[12] 構造異性体がァゴニスト活性を有することを特徴とする請求項 9〜11のいずれかに 記載の医薬組成物。
[13] sc(Fv)2のリンカ一が 15アミノ酸である請求項 9〜12のいずれかに記載の医薬組成物
[14] sc(Fv)2組成物中の構造異性体の割合を変化させる工程を含む、 sc(Fv)2組成物の活 性を調節する方法。
[15] sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の割合を増力！]させる工程を含む、 sc(Fv)2組成 物の活性を増加させる方法。
[16] 以下の工程を含む sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(a) SC(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(b)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程
[17] 以下の工程を含む sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(a) SC(Fv)2の構造異性体の活性を比較して高活性の構造異性体をあらかじめ決定 する工程
(b) sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(c)工程 (a)により決定された高活性の構造異性体を取得する工程
[18] 以下の工程を含む sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(a) sc(Fv)2組成物をイオン交換カラムにかける工程
(b)特定の構造異性体を除去する工程
[19] 構造異性体力 ngle chain diabody型又は bivalent scFv型である請求項 14〜18の!ヽ ずれかに記載の方法。
[20] sc(Fv)2組成物を加熱する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含 有割合を増加させる方法。
[21] 構造異性体力 ngle chain diabody型又は bivalent scFv型である請求項 20に記載の 方法。
[22] sc(Fv)2組成物を 15°C〜50°Cでインキュベートする工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の single chain diabody型の含有割合を増加させる方法。
[23] sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成して 、るアミノ酸残基を、電荷 を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体 の含有割合を増加させる方法。
[24] 以下の（1)および（2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に 置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有割合を増加させ る方法。
(1) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域の 39位 に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 38位に相当するアミノ酸残基
[25] 以下の（1)および（2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に 置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有割合を増加させ る方法。
(1) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のァミノ 酸配列における 45位に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 44位に相当するアミノ酸残基
[26] 以下の（1)および（2)のいずれか一方のアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基 に置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有割合を増加さ せる方法。
(1) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のァミノ 酸配列における 45位に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 44位に相当するアミノ酸残基
[27] sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成して 、るアミノ酸残基を、電荷 を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法
[28] 以下の（1)および（2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に 置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(1) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域の 39位 に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 38位に相当するアミノ酸残基
[29] 以下の（1)および（2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に 置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の活性を増加させる方法。
(1) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のァミノ 酸配列における 45位に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 44位に相当するアミノ酸残基
[30] 以下の（1)および（2)のいずれか一方のアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基 に置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(1) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のァミノ 酸配列における 45位に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 44位に相当するアミノ酸残基
[31] sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成して 、るアミノ酸残基を、電荷 を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む sc(Fv)2組成物中の構造異性体の異性 化反応を抑制する方法。
[32] 以下の（1)および（2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に 置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体の異性化反応を抑制する方法
(1) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域の 39位 に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 38位に相当するアミノ酸残基
[33] 以下の（1)および（2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に 置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体の異性化反応を抑制する方法
(1) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のァミノ 酸配列における 45位に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 44位に相当するアミノ酸残基
[34] 以下の（1)および（2)のいずれか一方のアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基 に置換する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体の異性化反応を抑制する方 法。
(1) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のァミノ 酸配列における 45位に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 44位に相当するアミノ酸残基
[35] sc(Fv)2のリンカ一の長さを調節する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体の 割合を調節する方法。
[36] 構造異性体力 ngle chain diabody型又は bivalent scFv型である請求項 35に記載の 方法。
[37] sc(Fv)2の両端のリンカ一を 0〜12アミノ酸、中央のリンカ一を 10〜30アミノ酸に調節す る工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の single chain diabody型の割合を増加させる方法。
[38] sc(Fv)2の両端のリンカ一を 12〜30アミノ酸、中央のリンカ一を 0〜10アミノ酸に調節す る工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の bivalent scFv型の割合を増加させる方法。
[39] sc(Fv)2の両端のリンカ一を 0〜12アミノ酸、中央のリンカ一を 0〜10アミノ酸に調節す る工程を含む、 single chain diabody型の含有割合が 80%以上である sc(Fv)2組成物 を製造する方法。
[40] sc(Fv)2の両端のリンカ一を 12〜30アミノ酸、中央のリンカ一を 0〜10アミノ酸に調節す る工程を含む、 bivalent scFv型の含有割合が 80%以上である sc(Fv)2組成物を製造 する方法。
[41] sc(Fv)2のリンカ一又はリンカ一近傍領域を切断する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の 構造異性体を分析する方法。
[42] 酵素で処理することによりリンカ一又はリンカ一近傍領域を切断することを特徴とする 請求項 41に記載の方法。
[43] 構造異性体力 ngle chain diabody型又は bivalent scFv型である請求項 41または 42 に記載の方法。
[44] 以下の工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分析する方法。
(a) sc(Fv)2組成物を酵素で処理する工程
(b)処理後の生成物の分子量または構造を測定する工程
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