WO2006132352A1 - sc(Fv)2を含有する医薬組成物 - Google Patents

sc(Fv)2を含有する医薬組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2006132352A1
WO2006132352A1 PCT/JP2006/311600 JP2006311600W WO2006132352A1 WO 2006132352 A1 WO2006132352 A1 WO 2006132352A1 JP 2006311600 W JP2006311600 W JP 2006311600W WO 2006132352 A1 WO2006132352 A1 WO 2006132352A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
composition
pharmaceutical composition
amino acid
linker
salt
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/311600
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tomoyuki Igawa
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/JP2006/306800 external-priority patent/WO2006106903A1/ja
Application filed by Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha filed Critical Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority to JP2007520179A priority Critical patent/JP5085322B2/ja
Priority to KR1020087000694A priority patent/KR101360671B1/ko
Priority to US11/916,979 priority patent/US9241994B2/en
Priority to CN200680029639.6A priority patent/CN101262885B/zh
Priority to EP06766512.5A priority patent/EP1925319B1/en
Priority to CA2611726A priority patent/CA2611726C/en
Priority to AU2006256030A priority patent/AU2006256030B2/en
Publication of WO2006132352A1 publication Critical patent/WO2006132352A1/ja
Priority to HK08113584.7A priority patent/HK1122494A1/xx
Priority to US14/967,475 priority patent/US9777066B2/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing sc (Fv) 2 and a method for producing the same. More particularly, the present invention relates to a pharmaceutical composition containing sc (Fv) 2 in which isomerization reaction is suppressed and a method for producing the same.
  • sc (Fv) 2 is an antibody in which four variable regions of two light chain variable regions (VL) and two heavy chain variable regions (VH) are combined into a single chain by using a linker or the like ( Hudson et al, J Immunol. Metho ds 1999; 231: 177-189).
  • single chain antibodies having the sequences VHl-linker-VL2-linker-VH3-linker-VL4 and VL2-linker-VHl-linker-VL4-linker_VH3 are known.
  • the structure of sc (Fv) 2 is based on the combination of Fv (a molecule that is non-covalently bound between VH and VL), and VH1 and VL2, and VH3 and VL4 form Fv, respectively.
  • sc (Fv) 2 and VH1 There are two structural isomers of sc (Fv) 2 in which VL4, VH3 and VL2 each form Fv.
  • Bispecific sc (Fv) 2 is a sequence of VHl-linker-VL2-linker-VH3-linker-VL4 !, V HI and VL4, and VH3 and VL2 (or VHl and VL2, and VH3 and VL4) are sc (Fv) 2s having variable regions derived from different monoclonal antibodies.
  • VH1 and VL4, or VH3 and VL2 are derived from the same monoclonal antibody, so the efficiency of forming Fv is increased. Therefore, the appearance of structural isomers is thought to be suppressed to some extent.
  • Non-patent Document 5 it has been reported that the activity does not change even if bi-specific sc (Fv) 2 having a linker length of 15-5-15 and 15-15-15 is prepared (Non-patent Document 5). Therefore, in the case of Bispecific sc (Fv) 2, there is often no detailed mention regarding structural isomers.
  • Non-Patent Documents 3, 4, 8, and 9 show that the correct combination of Fv exists by confirming bispecific binding activity. There is no description on the abundance ratio of the combination or quantitative evaluation of the abundance ratio of the two.
  • Non-Patent Document 6 confirms structural conversion of monomer and dimer by changing the length of the linker of Bispecific sc (Fv) 2 (modification of the length of the linker at both ends or the center).
  • the structural isomers of sc (Fv) 2 are only debated in the prediction of the molecular structure model, and there is no description regarding the abundance ratio of structural isomers in the actual sample and the identification of the structure.
  • Non-Patent Document 10 it is predicted that the length of the linker is set to 5-15-5 or 15-5-15 to take the structure of single chain diabody or bivalent scFv, respectively. This is because it has been reported that when the linker length in scFv is 12 or less, generally adjacent VH and VL are unlikely to form Fv (that is, it is difficult to form monomer).
  • Non-Patent Document 2 it is reported that a monomer is formed although the linker length is small even at Fv of 10 or 5, and the length of the linker in Non-Patent Document 10 is 5 Even in the case of -15-5 or 15-5-15, the obtained sc (Fv) 2 is not necessarily 100% single chain diabody or bival ent scFv structure.
  • Non-Patent Document 1 Protein Engineering, 1993, 6 (8), 989-995
  • Non-Patent Document 2 Protein Engineering, 1994, 7 (8), 1027-1033
  • Non-Patent Document 5 PNAS, 1995, 92, 7021-7025
  • Non-Patent Document 6 Journal of Molecular Biology, 1999, 293, 41-56
  • Non-Patent Document 7 Protein Engineering, 2001, 14 (10), 815-823
  • Non-Patent Literature 8 Journal of Molecular Biology, 2003, 330, 99-111
  • Non-Patent Document 9 Protein Eng Des Sel. 2004 Apr; 17 (4): 357-66
  • Non-Patent Document 10 Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281
  • Non-Patent Document 11 Int. J. Cancer, 1998, 77, 763-772
  • Non-Patent Document 12 Blood, 2005, 105, 562-566
  • sc (Fv) 2 which can take two types of structural isomers, as a pharmaceutical
  • the target structural isomer needs to be stably present in the drug substance and the drug product.
  • protein degradation pathways are associated with the physical association of protein molecules such as the formation of soluble multimers and the formation of precipitates (Int. J. Pharm. 2005, 289, 1-30).
  • a degradation pathway (Int. J. Pharm. 1999, 185, 129-188) by chemical modification such as hydrolysis 'deamidation reaction' or methionic acid reaction is known.
  • Methods for minimizing such degradation pathways include optimizing the solution pH, buffer type salt type and concentration, and stabilizer type and concentration.
  • the present inventors have carried out a structural transformation (isomerization) between two kinds of structural isomers to sc (Fv) 2, which can take two kinds of structural isomers, that is, from bivalent scFv type. It was found that a structure conversion reaction (isomerization reaction) to a single chain diabo dy type and a structure conversion reaction (isomerization reaction) from a single chain diabody type to a bivalent sc Fv type occurred (Fig. 1). Monomer / dimer equilibrium reaction between protein molecules has already been reported, and in the IgG molecule of antibody, monomer and dimer exist in a reversible equilibrium state in Biochemistry, 1999, 38, 13960-13967.
  • bivalent scFv type when the activity differs between bivalent scFv type and single chain diabody type (for example, humanized anti-human Mpl antibody hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 or mouse anti-human Mpl antibody mVB22B sc (Fv) 2
  • bivalent scFv type has a very low activity compared to the single chain diabody type (PCT / JP06 / 306800), and the isomerization reaction during storage of the formulation means a change in activity.
  • Fv) 2 in addition to the degradation pathways due to the association and chemical modification described above, it became clear that there was a degradation pathway due to isomeric reactions not reported in conventional proteins.
  • the progress of the isomerization reaction during storage of the formulation means that the content ratio of structural isomers before and after storage changes, It is not preferable.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a stabilized preparation containing sc (Fv) 2 in which an isomerization reaction is suppressed.
  • the present invention provides the following [1] to [43].
  • Salt power At least selected from the group consisting of sodium salt and salt power
  • pH adjuster is at least one pH adjuster selected from the group consisting of sodium citrate buffer and histidine hydrochloride.
  • a method for producing a pharmaceutical composition containing sc (Fv) 2 comprising the following steps:
  • a method for producing a pharmaceutical composition containing sc (Fv) 2 comprising the following steps:
  • pH adjuster is at least one pH adjuster selected from the group consisting of sodium citrate buffer and histidine hydrochloride.
  • a method for producing a pharmaceutical composition containing sc (Fv) 2 comprising the following steps:
  • a method for producing a pharmaceutical composition containing sc (Fv) 2 comprising the following steps:
  • a method for producing a pharmaceutical composition containing sc (Fv) 2 comprising the following steps:
  • a method for producing a pharmaceutical composition containing sc (Fv) 2 comprising the following steps:
  • step (c) A step of stabilizing the single chain diabody-type sc (Fv) 2 composition obtained in step (b).
  • step (c) A step of stabilizing the single chain diabody-type sc (Fv) 2 composition obtained in step (b).
  • step (c) A step of stabilizing the bivalent scFv type sc (Fv) 2 composition obtained in step (b).
  • step (c) A step of stabilizing the bivalent scFv type sc (Fv) 2 composition obtained in step (b).
  • a method for suppressing isomerization of an active ingredient in a pharmaceutical composition comprising the step of adding at least one substance selected from the group consisting of a salt, an amino sugar, a sugar alcohol, an amino acid, and a pH adjuster .
  • pH adjuster is at least one pH adjuster selected from the group consisting of sodium citrate buffer and histidine hydrochloride.
  • a method for suppressing isomerization of an active ingredient in a pharmaceutical composition comprising a step of adjusting the pH to 4.5 to 9.0.
  • a method for suppressing isomerization of an active ingredient in a pharmaceutical composition comprising a step of adjusting the pH to 6.0 to 9.0.
  • a method for suppressing the differentiation of an active ingredient in a pharmaceutical composition comprising a step of adjusting the salt concentration to 50 mM to 1 OOOmM.
  • a method for suppressing isomerization of an active ingredient in a pharmaceutical composition comprising a step of freeze-drying.
  • Stable to be used for inhibiting sc (Fv) 2 isomerism reaction containing at least one substance selected from the group consisting of salts, amino sugars, sugar alcohols, amino acids, and pH adjusters ⁇ ⁇ .
  • the stabilizer according to [37], wherein the salt is at least one salt selected from the group consisting of sodium salt and sodium salt strength.
  • the amino sugar is medamine.
  • pH adjuster is at least one pH adjuster selected from the group consisting of sodium citrate buffer and histidine hydrochloride.
  • a screening method for substances that suppress the sc (Fv) 2 isomeric reaction including the following steps:
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an isomeric reaction of sc (Fv) 2.
  • FIG. 2 A graph showing the ratio of peakl after 25 ° C-6weeks when starting from peak 91.4%.
  • FIG. 3 is a graph showing the ratio of peak 2 after 25 ° C-6 weeks when peak 2 starts at 99.6%.
  • FIG. 4 A graph showing the ratio of peakl after 25 ° C-5days when peakl starts at 91.4%.
  • FIG. 5 is a graph showing the ratio of peak 2 after 25 ° C-5 days when peak 2 starts at 99.6%.
  • FIG. 6 A graph showing the ratio of peak 1 after 25 ° C-20days under peak 2 conditions.
  • FIG. 7 is a graph showing the ratio of peak 2 after 25 ° C.-5 days in each solution condition, starting from peak 1 to 99%.
  • FIG. 8 shows the ratio of bivalent scFv after intial and 40 ° C-lweek.
  • FIG. 9A is a diagram showing isomerization to peak2 by incubating peakl at 25 ° C. under various conditions.
  • FIG. 9B is a graph showing the initial ratio of humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 and the bivalent scFv type abundance ratio after 50 ° C.-10 days. It was shown that the isomeric reaction can be suppressed at pH 5.5 and above.
  • FIG. 10 shows the VH1-linker-VL1-linker-VH2-linker-VL2 structure of VB22B sc (Fv) 2.
  • (b) shows two structural isomers of the VH1-linker-VL1-linker-VH2-linker-VL2 structure.
  • a bivalent scFv structure in which VH1 / VL1 and VH2 / VL2 are associated with each other (left) and a single chain diabody structure in which VH1 / VL2 and VH2 / VL1 are associated with each other (right) are shown.
  • FIG. L l shows the result of separation of peakl and peak2 by anion exchange chromatography
  • FIG. 12 shows photographs and figures showing the results of reducing SDS-PAGE before and after subtilisin treatment of peakl, peak2, and VB22B sc (Fv) 2. The estimated structure of the obtained band is shown on the right.
  • FIG. 13 is a diagram showing the difference in the degradation pattern after subtilisin limited digestion caused by the difference in structure between bivalent scFv and single chain antibody.
  • Bivalent scFv structure a low molecular weight fragment surrounded by a dotted line is generated.
  • FIG. 14 shows the results of gel filtration chromatography after limited degradation of peakl, peak2, and VB22B sc (Fv) 2 by Subtilisin.
  • the elution position of the low molecular weight peak is indicated by an arrow.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of TPO-like antigen activity evaluation of VB22B sc (Fv) 2 structural isomers.
  • FIG. 16 is a diagram showing the results of separation of peakl and peak2 by cation exchange chromatography.
  • FIG. 17 shows peakl and peak2 peptide mapping separated by cation exchange chromatography.
  • FIG. 18 shows photographs and figures showing the results of reduced SDS-PAGE after subtilisin treatment of peak1, peak2, and hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2. The structure of the obtained band is shown on the right.
  • FIG. 19 shows the results of gel filtration chromatography after limited decomposition of peakl, peak2, and hVB22Bu2-wz4 sc (Fv) 2 by Subtilisin.
  • the arrow indicates the elution position of the low molecular weight peak.
  • FIG. 20 shows the results of evaluation of TPO-like antigen activity of hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 structural isomers. It is a figure.
  • FIG. 21 is a diagram showing a construct of each linker variant.
  • Gxx has a central linker length of XX, and Lxx has a linker length of XX at both ends.
  • Each of them is a construct using (GGGGS (SEQ ID NO: 7)) n sequence as a linker.
  • Pxx is a construct that uses the (GGPGS (SEQ ID NO: 13)) n sequence as the linker and uses the middle linker length as XX.
  • FIG. 22 is a graph showing the results of anion exchange chromatography analysis of each modified linker and the obtained abundance ratio of structural isomers. Indicated by percent of bivalent scFv type structure.
  • FIG. 23 is a diagram showing the results of gel filtration chromatography analysis of a chromatogram of a hydroxyapatite column and a purified fraction.
  • FIG. 24 is a diagram showing the analysis result of a chromatogram of a SOURCE 15S column.
  • FIG. 25 is a diagram showing an analysis result of cation exchange chromatography.
  • FIG. 26 is a photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of hVB22B u2- wz4 sc (Fv) 2 peakl and hVB22B u2- wz4 sc (Fv) 2 peak2 which were purified in large quantities.
  • FIG. 27 shows the results of gel filtration analysis of hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 peak1 and hVB22B u2- wz4 sc (Fv) 2 peak2 which were purified in large quantities.
  • FIG. 28 is a diagram showing the results of gel filtration chromatography of u2-wz4, variant vl, and variant v3.
  • FIG. 29 is a diagram showing the results of cation exchange chromatography on u2-wz4, variant vl, and variant v3.
  • FIG. 30 is a photograph and drawing showing the results of isoelectric focusing of u2-wz4, u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, variant vl, and variant v3.
  • FIG. 31 is a diagram showing the results of gel filtration chromatography analysis after limited digestion of proteases of u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, modified vl, and modified v3.
  • FIG. 32 shows the results of evaluation of TPO-like agonist activity of u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, variant vl, and variant v3.
  • FIG. 33 is a diagram showing the results of DSC analysis of u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, variant vl, and variant v3.
  • FIG.34 Thermal acceleration test of u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, variant vl, variant v3 It is a figure which shows the result of the gel filtration chromatography analysis in it.
  • FIG. 35 shows the results of cation exchange chromatography analysis in a thermal acceleration test of u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, modified vl, and modified v3.
  • FIG. 36 shows the results of separation of humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 by peakl and peak2 cation exchange chromatography.
  • FIG. 37 is a diagram showing the results of analysis by cation exchange chromatography of peak 1 and peak 2 of purified human anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2;
  • FIG. 38 is a photograph showing the results of reduced SDS-PAGE of humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 after peakl and peak2 subtilisin treatment. The estimated structure of the obtained band is shown on the right.
  • FIG. 39 is a diagram showing the results of gel filtration chromatography after limited decomposition of peakl and peak2 of humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 by Subtilisin.
  • the arrow indicates the elution position of the low molecular weight peak.
  • FIG. 40 shows the results of evaluating IL-6 neutralization activity of humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 peakl and peak2 in BaF3 / gpl30.
  • FIG.41 Anion-exchange chromatography analysis of a sample of VB22B sc (Fv) 2 peakl incubated at 20 mM sodium acetate, 150 mM NaCl, pH 6.0, 40 ° C shows that pea k2 increases over time.
  • FIG. 41 Anion-exchange chromatography analysis of a sample of VB22B sc (Fv) 2 peakl incubated at 20 mM sodium acetate, 150 mM NaCl, pH 6.0, 40 ° C shows that pea k2 increases over time.
  • FIG.41 Anion-exchange chromatography analysis of a sample of VB22B sc (Fv) 2 peakl incubated at 20 mM sodium acetate, 150 mM NaCl, pH 6.0, 40 ° C shows that pea k2 increases over time.
  • FIG.41 Anion-exchange chromatography analysis of a sample of VB22B sc (Fv) 2 peakl
  • FIG. 43 shows the isomerism of peak 2 by incubating hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 peakl at 25 ° C for 10 days under various conditions.
  • the present invention is selected from the group consisting of salts, amino sugars, sugar alcohols, amino acids, and pH adjusters.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a stabilized preparation in which the desired structural isomer is stably present and isomerization to other structural isomers is minimized, and is very useful in the pharmaceutical field. is there.
  • sc (Fv) 2 is a low molecular weight antibody in which four or more antibody variable regions are linked to each other with a linker or the like to form a single chain.
  • sc (Fv) 2 is usually an antibody in which four variable regions of two VLs and two VHs are combined with a linker to form a single chain (Hudson et al, J Immunol. Methods). 1999; 231: 177-189).
  • the two VH and VL may be derived from different monoclonal antibodies.
  • bispecific sc (Fv) 2 that recognizes two types of antigens or two types of epitopes as disclosed in Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374 .
  • sc (Fv) 2 can be prepared by a method known to those skilled in the art.
  • sc (Fv) 2 can be prepared by linking scFv with a linker.
  • the scFv contains the VH and VL of the antibody, and these regions are present in a single polypeptide chain (for a review of scFv, see Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibomes JVol.l lj (Rosenburg and Moore ed (Springer Verlag, New York) pp.269-315, 1994)).
  • sc (Fv) 2 of the present invention includes two VH and two VL forces.
  • the VH, VL, VH, VL ([VH] linker [ VL] Linker 1 [VH] Linker 1 [VL])
  • the antibody is characterized by being arranged in the order of 2 VH and 2 VL
  • the order of the 2 VH and 2 VL is not particularly limited to the above arrangement, and any order It may be arranged in. For example, the following arrangement can also be mentioned.
  • the sc (Fv) 2 of the present invention may contain an amino acid sequence other than the antibody variable region and the linker.
  • variable region of the antibody used in the present invention may be the full length of the variable region, or may be a partial sequence of the variable region as long as the binding activity to the antigen is maintained.
  • the amino acid sequence in the variable region may be substituted, deleted, added, inserted or the like.
  • chimerism may be humanized.
  • the sc (Fv) 2 of the present invention may be fused with another protein such as the Fc portion of IgG at its N-terminus or C-terminus (Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281).
  • a protein to be fused can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the sc (Fv) 2 of the present invention may be conjugated with a carrier polymer such as PEG or an organic compound such as an anticancer agent.
  • a sugar chain addition sequence may be inserted to add a sugar chain.
  • any peptide linker that can be introduced by genetic engineering, or a synthetic compound linker see, for example, Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996)
  • a peptide linker is preferable.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose. However, the preferred length is 5 amino acids or more (the upper limit is not particularly limited, but usually 30 amino acids or less, Preferably it is 20 amino acids or less), particularly preferably 15 amino acids.
  • sc (Fv) 2 contains three peptide linkers, the same length peptide linkers may be used, or different length peptide linkers may be used.
  • n is an integer of 1 or more.
  • the length and sequence of the peptide linker can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose.
  • Synthetic chemical linkers are commonly used for cross-linking peptides such as N-hydroxysuccinimide (NHS), disuccinimidyl suberate (DSS), bismuth. (Sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP), dithiopis (sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP), ethylene glycol bis (Succinimidyl succinate) (EGS), ethylene glycol bis (sulfosuccinimidyl succinate) (sulfo EGS), disuccinimidyl tartrate (DST), disulfosuccinimidyl tartrate ( Sulfo-DST), bis [2- (succinimidoxycarboxyl) ethyl] sulfone (BSOCOES), bis [2- (sulfosuccinimidoxycarboxyl) ethyl]
  • the pharmaceutical composition is a composition containing sc (Fv) 2, which is a pharmaceutical composition intended to be administered to humans for the treatment or prevention of diseases. Means a thing.
  • sc (Fv) 2 containing structural isomers as pharmaceuticals
  • the target structural isomers are separated and purified with high purity, and the drug substance containing the separated and purified structural isomers with high purity is produced.
  • the purity of one structural isomer can be increased by incubating a mixture of two structural isomers under specific buffer conditions and temperature. It is. Also, as shown in PCT / JP06 / 306800, the length of one linker of sc (Fv) 2 can be adjusted, or one of the structures of VH / VL interface modified sc (Fv) 2 can be prepared. It is possible to increase the purity of the isomer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention containing one structural isomer with high purity preferably contains sc (Fv) 2 in which the isomerization reaction is suppressed.
  • the "isomerism reaction” refers to the intramolecular structure conversion reaction of sc (Fv) 2, that is, 1) the structure conversion reaction from a bivalent scFv type force to a single chain diabody type, 2 ) Structure conversion reaction from single chain dia body type to bivalent scFv type, and 3) Neural structure conversion reaction from bivalent scFv type to single chain diabody type and single chain diabody type force to bivalent scFv type Isomerization reaction) (Fig. 1).
  • inhibittion of the present invention includes “incomplete suppression” in addition to “complete suppression” of the heterosexual reaction.
  • Suppression of the sc (Fv) 2 isomerism reaction can be confirmed by methods well known to those skilled in the art. For example, by analyzing the content ratio of structural isomers after storage of sc (Fv) 2 for a certain period under a certain condition using the method described later or the method described in the examples, the isomerism of the structural isomer under the condition is analyzed. It is possible to evaluate whether or not the isomeric reaction is suppressed under the conditions.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be produced by mixing an sc (Fv) 2 composition with at least one substance selected from the group consisting of a salt, an amino sugar, a sugar alcohol, an amino acid, and a pH adjuster. .
  • a salt for example, it can be produced by adding the substance to the sc (Fv) 2 composition and by adding the sc (Fv) 2 composition to the substance.
  • the salt of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include sodium chloride sodium, calcium salt calcium, calcium gluconate, magnesium chloride, and magnesium darconate.
  • amino sugar of the present invention is not limited to the power that can be exemplified by medlumine (note that medalmin is also classified as a sugar alcohol).
  • “medalmine” is also known as N-methyldalkamine, chemical formula 1-Deoxy-l-methylamino-D-glucitol, and a compound represented by the following chemical formula.
  • “medalmin” includes medalmin derivatives, medalmin salts, and the like.
  • Medalmine derivatives and medalmin salts include amidodolizate medalmine, sodium amidorizoate medalmine, cadpentetate medalmine, gadoteric acid medalmin, iotalamic acid megnolemine, iotrotas acid medalmin, gadobenic acid medalmin, odoxamic acid medalmin, flunixin medalmin, meglumine Examples include antimonate and gastrografin (medalmine sulfate), but are not limited thereto.
  • the medalmine of the present invention also includes those in which the hydroxyl group, amino group, etc. of meglumine are chemically modified.
  • the sugar alcohol of the present invention is not limited to these, for example, mannitol, sorbitol, xylitol, pentaerythritol, inositol, and medalmine.
  • the amino acids of the present invention can be exemplified as follows, but are not limited thereto.
  • the basic amino acid can be, for example, arginine, lysine, histidine, orthine, etc., and the amino acid is preferably in the form of its inorganic salt (preferably hydrochloride, phosphate, ie, phosphate amino acid). As used in).
  • the preferred pH value is determined by the addition of suitable physiologically acceptable buffer substances such as inorganic acids, especially hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, acetic acid, formic acid or their salts. Adjusted.
  • suitable physiologically acceptable buffer substances such as inorganic acids, especially hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, acetic acid, formic acid or their salts. Adjusted.
  • phosphate is particularly advantageous in that a particularly stable lyophilizate is obtained.
  • the preparation is substantially free of organic acids such as malic acid, tartaric acid, succinic acid, succinic acid, fumaric acid, etc. or the corresponding anion (malate ion, tartaric acid ion, succinic acid ion, succinic acid ion, fumaric acid This is particularly advantageous in the absence of acid ions.
  • Preferred amino acids are arginine, lysine or ortin.
  • Examples of acidic amino acids include glutamic acid and aspartic acid, and their salt forms (preferably sodium salts).
  • neutral amino acids include isoleucine, leucine, alanine, glycine, serine, threonine, Norin, methionine, and cysteine, and aromatic amino acids include, for example, ferrolanine, tyrosine or tryptophan, N-acetyl. A tribute fan can also be used.
  • the pH adjuster of the present invention means a buffer substance or a buffer solution for appropriately adjusting the pH changed by an acid or alkali.
  • Examples of the pH adjuster of the present invention include phosphoric acid, citrate buffer (for example, sodium citrate buffer), histidine hydrochloride, acetic acid, malic acid, tartaric acid, succinic acid, fumaric acid and other organic acids, or the like.
  • Tris buffer eg, Tris HCl buffer
  • histidine buffer imidazole buffer
  • carbonate buffer lactic acid, potassium phosphate, sodium phosphate, dalconic acid, strong prillic acid, deoxycholic acid, salicylic acid
  • concentration of the buffer is generally 1 to 500 mM, preferably 5 to 100 mM, and more preferably 10 to 20 mM.
  • the concentration of the salt of the present invention in the pharmaceutical composition of the present invention should be in the range of 50 mM to 1000 mM. More preferably, it is preferably in the range of 150 mM to 300 mM, but is not limited thereto.
  • the pH value is preferably in the range of 4.5 to 9.0, more preferably in the range of 6.0 to 9.0, but is not limited thereto.
  • the final amino sugar, sugar alcohol, and amino acid in the pharmaceutical composition of the present invention Although there is no restriction
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier include sterilized water and physiological saline, stabilizers, excipients, preservatives, surfactants, chelating agents (EDTA, etc.), binders and the like.
  • examples of the surfactant include nonionic surfactants, such as sorbitan fatty acid esters such as sorbitan monocaprylate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate; Glycerin fatty acid esters such as caprylate, glycerin monomylate, glycerin monostearate; polyglycerin fatty acid esters such as decaglyceryl monostearate, decaglyceryl distearate, decaglyceryl monolinoleate; polyoxyethylene sorbitan Monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan trioleate, polyoxygen Polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as lensorbitan tristearate; Polyoxyethylene sorbite fatty acid esters such as polyoxyethylene sorbite tetrastearate and polyoxyethylene
  • the surfactant examples include an anionic surfactant, for example, an alkyl sulfate having an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms such as sodium cetyl sulfate, sodium lauryl sulfate, sodium oleyl sulfate; Polyoxyethylene alkyl ether sulfates such as sodium polyoxyethylene lauryl sulfate having an average addition mole number of ethylene oxide of 2 to 4 and an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms; such as ester sodium lauryl sulfosuccinate Alkyl sulfosuccinic acid ester salts having 8 to 18 carbon atoms in the alkyl group; natural surfactants such as lecithin and glycine phospholipids; sphingophospholipids such as sphingomyelin; fatty acid having 12 to 18 carbon atoms Typical examples include sucrose fatty acid esters.
  • surfactants may be added in combination to the pharmaceutical composition of the present invention.
  • Preferred surfactants for use in the pharmaceutical composition of the present invention are polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as polysorbate 20, 40, 60 or 80, with polysorbates 20 and 80 being particularly preferred.
  • polyoxyethylene polyoxypropylene glycol represented by poloxamer such as Pluronic F-68 (registered trademark) is also preferable.
  • the amount of surfactant added varies depending on the type of surfactant used. In the case of polysorbate 20 or polysorbate 80, it is generally 0.001 to 100 mg / mL, preferably 0.003 to 50 mg / mL, and more preferably 0.005. ⁇ 2mg / mL.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain other low molecular weight polypeptides, serum albumin, proteins such as gelatin and immunoglobulin, saccharides such as polysaccharides and monosaccharides, and carbohydrates.
  • saccharides and carbohydrates such as polysaccharides and monosaccharides include dextran, gnolecose, fructose, ratatose, xylose, mannose, manolethose, sucrose, trehalose, and raffinose.
  • an isotonic solution such as glucose
  • suitable solubilizers such as alcohol (ethanol etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG etc.), nonionic It may be used in combination with a surfactant (polysorbate 80, HCO-50). If desired, it may contain further diluents, solubilizers, soothing agents, sulfur-containing reducing agents, antioxidants and the like.
  • examples of the sulfur-containing reducing agent include N-acetyl cysteine, N-acetyl homocystine, thiotate, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycolic acid and the like.
  • examples thereof include salts, sodium thiosulfate, glutathione, and those having a sulfhydryl group such as thioalkanoic acid having 1 to 7 carbon atoms.
  • examples of the antioxidative agent include erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyl-sol, -tocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and salts thereof, L- Chelating agents such as ascorbyl palmitate, L-ascorbyl stearate, sodium bisulfite, sodium sulfite, triamyl gallate, propyl gallate or disodium ethylenediammine tetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate, sodium metaphosphate Can be mentioned.
  • L- Chelating agents such as ascorbyl palmitate, L-ascorbyl stearate, sodium bisulfite, sodium sulfite, triamyl gallate, propyl gallate or disodium ethylenediammine tetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate, sodium metaphosphate Can be mentioned.
  • microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, and poly (methacrylic acid)
  • colloid drug delivery systems ribosomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles, and nanoparticles.
  • a method of making a drug a sustained-release drug is also known and can be applied to the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; U.S. Patent 3,773,919; European Patent Application Publication (EP) 58,481; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556; EP ⁇ 133,988 ⁇ -) 0
  • the form (dosage form) of the pharmaceutical composition of the present invention includes, but is not limited to, injection dosage forms, lyophilized dosage forms, solution dosage forms and the like.
  • Administration to a patient is possible with either oral or parenteral administration.
  • it is parenteral administration.
  • injection administration is possible.
  • injection administration it can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, or subcutaneous injection.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dosage may range from O.OOOlmg to lOOOmg per kg of body weight It is possible to select with.
  • the dose can be selected within the range of 0.001 to 100,000 mg / body per patient.
  • the present invention is not limited to these dosages and administration methods.
  • sc (Fv) 2 can be formulated by freeze-drying formulation or spray drying to produce a pharmaceutical composition containing sc (Fv) 2 with suppressed isomerization reaction. That is, the present invention also provides the above-mentioned pharmaceutical composition (hereinafter referred to as lyophilized formulation), wherein the dosage form is a lyophilized formulation or a spray-dried formulation.
  • Lyophilization can be carried out by methods well known to those skilled in the art (Pharm Biotechnol, 2002, 1 3, 109-33, Int J Pharm. 2000, 203 (1-2), 1-60, Pharm Res. 1997 , 14 (8), 969-75).
  • a container such as a vial used for freeze-drying, and it is carried out in a freezer, a freeze-dryer, or immersed in a refrigerant such as acetone Z dry ice or liquid nitrogen.
  • a refrigerant such as acetone Z dry ice or liquid nitrogen.
  • spray-dry formulation can be performed by methods well known to those skilled in the art (J Pharm Sci. 1 998 Nov; 87 (l l): 1406-1 l) o
  • the freeze-dried preparation or spray-dried preparation of the present invention can be made into a solution preparation before use.
  • the present invention also provides a kit comprising the lyophilized formulation or spray-dried formulation of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is not limited as long as it can form a lyophilized preparation or spray-dried preparation of the present invention as a solution preparation, but is not limited in terms of the type of carrier, the presence or absence of combination, etc., but is pharmaceutically acceptable.
  • the sc (Fv) 2 composition means a composition containing one structural isomer of sc (Fv) 2, or a plurality of structural isomers of sc (Fv) 2. Refers to a composition (a mixture of structural isomers).
  • the sc (Fv) 2 composition can be prepared by methods well known to those skilled in the art. For example, by introducing a vector into which a DNA encoding sc (Fv) 2 is inserted into a host cell, expressing sc (Fv) 2, and collecting the expression product, sc that can take two or more structural isomers sc (Fv) 2 can be produced.
  • the vector is not particularly limited as long as it stably holds the inserted DNA.
  • E. coli is used as the host, the pBluescript vector (Stratagene) is preferred as the cloning vector! /, But various commercially available vectors can be used.
  • An expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of producing the sc (Fv) 2 of the present invention.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses sc (Fv) 2 in vitro, in E. coli, in cultured cells, or in an individual organism.
  • pBEST vector Promega
  • PET vector manufactured by Invitrogen for Escherichia coli
  • pME18S-FL3 vector GenBank Accession No. AB009864
  • pME18S vector Mol Cell Biol. 8: 466-47 for individual organisms 2 (1988)
  • the insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons, section 1 1.4-11.11).
  • host cell There are no particular limitations on the host cell, and various host cells may be used depending on the purpose.
  • examples of cells for expressing sc (Fv) 2 include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus), insects Examples include cells (eg, Drosophila S2, Spodoptera SF9), animal cells (eg, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells) and plant cells.
  • bacterial cells eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis
  • fungal cells eg, yeast, Aspergillus
  • insects include cells (eg, Drosophila S2, Spodoptera SF9), animal cells (eg, CHO, COS, HeLa, C127
  • Vector introduction into host cells can be carried out by, for example, calcium phosphate precipitation method, Nores method (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al., 1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), Lipofuctamine method (GIBCO -Manufactured by BRL Co., Ltd.) and a known method such as a microinjection method.
  • calcium phosphate precipitation method Nores method (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al., 1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9)
  • Lipofuctamine method GIBCO -Manufactured by BRL Co., Ltd.
  • a known method such as a microinjection method.
  • the sc (Fv) 2 composition can be collected by collecting the medium when the sc (Fv) 2 of the present invention is secreted into the medium.
  • sc (Fv) 2 is produced intracellularly, the cell is first lysed, and then the sc (Fv) 2 composition is recovered.
  • the sc (Fv) 2 composition of the present invention may be in any state as long as it is a composition containing one or more sc (Fv) 2 structural isomers.
  • a composition in a crude state such as a product, a composition in a refined state, etc., are not limited to these! /. What is the ratio of existing structural isomers? However, it is preferably obtained (isolated) by the method described later.
  • the structural isomer refers to proteins having the same amino acid sequence but different steric structures (secondary structure or tertiary structure). Usually, structural isomers differ in at least one of chemical, biological, or physical properties.
  • single chain diabody type means that sc (Fv) 2 is [variable region 1] (linker 1) [variable region 2] (linker 1) [variable region 3] (linker 1 )
  • sc (Fv) 2 is [variable region 1] (linker 1) [variable region 2] (linker 1) [variable region 3] (linker 1 )
  • sc (Fv) 2 having a structure in which variable region 1 and variable region 4 are associated, and variable region 2 and variable region 3 are associated.
  • the bivalent scFv type refers to sc (Fv) 2 having a structure in which variable region 1 and variable region 2 are associated and powerful variable region 3 and variable region 4 are associated.
  • Examples of the single chain diabody type and bivalent scFv type include sc (Fv) 2 having the structure shown in FIG.
  • the structural isomerism of sc (Fv) 2 It can be confirmed by the identification method of structural isomers described later whether it has a structure of the ngle chain diabody type or bivalent scFv type. It can also be identified by NMR analysis and crystal structure analysis.
  • the sc ( Fv ) 2 composition used for the production of the pharmaceutical composition preferably has a specific structural isomer content ratio higher than that of other structural isomers.
  • specific structural isomer means single chain diabody type or bivalent scFv type
  • other structural isomer means bivalent when the specific structural isomer is single chain diabody type.
  • scFv type when a specific structural isomer is bivalent scFv type, it means single chain diabody type.
  • a method for obtaining a specific structural isomer from an sc (Fv) 2 composition can be carried out by methods well known to those skilled in the art. For example, structural isomers in the sc (Fv) 2 composition are separated, and specific structural isomers are obtained from the separated structural isomers. sand In other words, the present invention also provides a method comprising the following steps and a pharmaceutical composition produced by the method.
  • step (c) Step of mixing the specific structural isomer and salt obtained in step (b), at least one substance selected from the group consisting of amino sugar, sugar alcohol, amino acid, and pH adjuster power
  • the purity of a specific structural isomer obtained (isolated) is 80% or more, 90% or more, 95% or more, 100% or close to 100%. Nearly 100%, the upper limit depends on the purification and analysis techniques of those skilled in the art, but for example, 99.999%, 99.99%, 99.9%, 99%, etc.
  • purity means the ratio of a specific structural isomer to all obtained structural isomers.
  • Separation and acquisition (purification) of structural isomers in sc (Fv) 2 composition can be achieved, for example, by applying sc (Fv) 2 composition to an ion exchange column or Hydroxyapatite column to obtain or remove specific structural isomers.
  • sc (Fv) 2 composition to an ion exchange column or Hydroxyapatite column to obtain or remove specific structural isomers.
  • the present invention is not limited to this, and various chromatographic abilities, filters, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, etc. It can be carried out by methods known to those skilled in the art, such as electrophoretic electrophoresis, chiral isoelectric focusing, permeation, and recrystallization.
  • chromatography examples include ion exchange chromatography, adsorption chromatography, isoelectric focusing, gel filtration, reverse phase chromatography, hydrophobic chromatography, and affinity chromatography (Strategies). for Protein Puri fication ana Characterization: A Laboratory and ourse Manual. ti, d Daniel R. Marshak et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Chromatography can be performed using liquid chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC or FPLC.
  • the type of ion exchange column used is not particularly limited, and either a cation exchange column or an anion exchange column can be used, depending on the target antibody, structural isomer, etc. Can be determined.
  • SP ion exchange ram, Q ion exchange ram, etc. can be used. It is not limited to.
  • Adsorption chromatography is not limited to the power that can be exemplified by Hydroxyapatite chromatography.
  • a purified product of a specific structural isomer can be obtained using these purification methods.
  • the activity of the structural isomer of sc (Fv) 2 is compared to obtain a highly active structural isomer.
  • the structural isomerism in the sc (Fv) 2 composition can be separated and obtained.
  • the length of the linker is adjusted so that the ratio of the structural isomers in the sc (Fv) 2 composition becomes a preferable value by the method described later.
  • the sc (Fv) 2 composition having the determined linker length can be prepared.
  • sc (Fv) 2 compositions having different linker lengths are prepared, and the structural isomer ratio analysis method described later is used.
  • the ratio of structural isomers is analyzed by sc (Fv) 2, and the ratio of structural isomers in the composition is preferred, and sc (Fv) 2 having a valued linker is selected, and the selected sc (Fv) 2 Sc (Fv) 2 compositions can also be made.
  • the present invention also provides a method according to any one of the following (1) to (3) and a pharmaceutical composition produced by the method.
  • step (c) Step of obtaining a highly active structural isomer determined by step (a)
  • step (b) A step of producing an sc (Fv) 2 composition having the length of the linker determined in step (a)
  • step (e) Step of mixing the specific structural isomer and salt obtained in step (d), at least one substance selected from the group consisting of amino sugar, sugar alcohol, amino acid, and pH adjuster power
  • step (f) Step of mixing the specific structural isomer and salt obtained in step (e), at least one substance selected from the group consisting of amino sugar, sugar alcohol, amino acid, and pH adjuster power
  • a highly active structural isomer refers to a structural isomer having a high activity, preferably a structural isomer having the highest activity, when there is a difference in activity between the structural isomers.
  • the structural isomer with higher activity corresponds to the highly active structural isomer referred to in the present invention.
  • a highly active structural isomer can be determined by a method known to those skilled in the art, for example, by isolating each structural isomer and measuring the desired activity under the same conditions. Structural isomers can be determined.
  • the activity is not particularly limited and may be any activity such as binding activity, neutralizing activity, cytotoxic activity, agonist activity, antagonist activity, enzyme activity, etc. It is preferable to have an activity that causes a quantitative and Z or qualitative change or influence on cells, proteins, DNA, RNA, etc. Particularly, an agonist activity is preferable.
  • the antigenic activity is an activity that induces a change in physiological activity by binding a signal to an antigen such as a receptor, whereby a signal is transmitted into a cell.
  • physiological activities include proliferation activity, survival activity, differentiation activity, transcription activity, membrane transport activity, binding activity, proteolytic activity, phosphate ⁇ Z dephosphate ⁇ activity, redox activity, transfer.
  • Powers that can include activity, nucleolytic activity, dehydration activity, cell death inducing activity, apoptosis inducing activity, and the like, but are not limited to these.
  • the antigen is not particularly limited, and any antigen can be used!
  • antigens include receptors, cancer antigens, MHC antigens, differentiation antigens, and the like.
  • receptors include, for example, hematopoietic factor receptor family, cytoforce-in receptor family, tyrosine kinase type receptor family, serine Z threonine kinase type receptor family, TNF receptor family, G protein coupled receptor Examples include receptors belonging to the receptor family such as family, GPI-anchored receptor family, tyrosine phosphatase-type receptor family, adhesion factor family, and hormone receptor family. Numerous references exist regarding receptors belonging to these receptor families and their characteristics.
  • Specific receptors belonging to the above receptor family include, for example, human or mouse erythropoietin (EPO) receptor, human or mouse granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) receptor, human or mouse thrombopoi Etine (TPO) receptor, human or mouse insulin receptor, human or mouse Flt-3 ligand receptor, human or mouse platelet derived growth factor (PDGF) receptor, human or mouse interferon (IFN)-a, j8 receptor , Human or mouse leptin receptor, human or mouse growth hormone (GH) receptor, human or mouse interleukin (IL) -10 receptor, human or mouse insulin-like growth factor (IGF) -I receptor, human or mouse Examples include leukemia inhibitory factor (LIF) receptor and human or mouse ciliary neurotrophic factor (CNTF) receptor (hEPOR: Simon, S.
  • EPO erythropoietin
  • G-CSF granulocyte colony-stimulating factor
  • TPO thrombopoi E
  • hlnsR Ullrich, A. et al. (1985) Nature 313, 756-761 .
  • hFlt-3 Small, D. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 91, 459-463 .
  • hPD GFR Gronwald, RGK. Et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3435-3439 .
  • hi FN a / j8 R Uze, G et al. (1990) Cell 60, 225—234. and Novick, D. et al. (1994) Cell 77, 391-400.) o
  • Cancer antigens are antigens that are expressed as cells become malignant, and are also called tumor-specific antigens.
  • abnormal sugar chains appearing on the cell surface and protein molecules when cells become cancerous also become cancer antigens, and are particularly called cancer sugar chain antigens.
  • cancer antigens include CA19-9, CA 15-3, serial SSEA-1 (SLX), and the like.
  • MHC antigens are roughly classified into MHC class I antigens and MHC class II antigens, and MHC class I antigens include HLA-,- ⁇ , -C, - ⁇ , -F, -G, -H.
  • MHC class II antigens include HLA-DR, -DQ, and -DP.
  • Anti-antigens include CDl, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CDlla, CDllb, CDllc, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21 , CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126, CDwl30, etc. are included.
  • the detection index used for measuring the change in activity can be used as long as quantitative and Z or qualitative changes can be measured.
  • a cell-free (cell free assay) index a cell-based (ceU-based assay) index, a thread and woven index, and a biological index can be used.
  • enzymatic reactions and quantitative and Z or qualitative changes in proteins, DNA, and RNA can be used.
  • enzyme reaction for example, amino acid transfer reaction, glycosyl transfer reaction, dehydration reaction, dehydrogenation reaction, substrate cleavage reaction and the like can be used.
  • Protein phosphorylation, dephosphorylation, dimerization, multimerization, degradation, dissociation, and DNA, RNA amplification, cleavage, and extension can be used.
  • a phosphate of a protein existing downstream in the signal transduction pathway can be used as a detection index.
  • Cell line indicators include changes in cell phenotype, such as quantitative and Z or qualitative changes in product, changes in proliferative activity, changes in cell number, changes in morphology, changes in characteristics, etc. Can be used. As production substances, secreted proteins, surface antigens, intracellular proteins, mRNA, and the like can be used. Changes in morphology include protrusion formation and change in the number of Z or protrusions, change in flatness, change in elongation, change in Z aspect ratio, change in cell size, change in internal structure, and deformity as a cell population Z uniformity, changes in cell density, etc. can be used. These morphological changes can be confirmed by microscopic observation.
  • Cell motility includes cell invasion activity and cell migration activity.
  • changes in intracellular substances include enzyme activity, mRNA levels, intracellular signaling substances such as Ca2 + and cAMP, and intracellular protein levels.
  • changes in cell proliferation activity induced by receptor stimulation can be used as an index.
  • tissue index a change in function according to the tissue used can be used as a detection index.
  • Biological indicators include tissue weight changes, blood system changes such as changes in blood cell count, protein content, enzyme activity, changes in electrolysis mass, and changes in the circulatory system such as blood pressure and heart rate. Or the like can be used.
  • Methods for measuring these detection indexes include, but are not limited to, absorption, luminescence, color development, fluorescence, radioactivity, fluorescence polarization, surface plasmon resonance signal, time-resolved fluorescence, mass, absorption spectrum, light scattering, fluorescence Resonant energy transfer, etc. can be used. These measurement methods are well known to those skilled in the art, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the absorption spectrum can be measured with a commonly used photometer or plate reader, the emitted light can be measured with a luminometer, and the fluorescence can be measured with a fluorometer.
  • Mass can be measured using a mass analyzer. Radioactivity depends on the type of radiation Using a measuring instrument such as a sensor, the degree of fluorescence polarization can be measured by BEACON (Takara Shuzo), the surface plasmon resonance signal by BIACORE, time-resolved fluorescence, fluorescence resonance energy transfer, etc. by ARVO.
  • a flow cytometer or the like can also be used for measurement.
  • more measurement methods can be used by measuring two or more types simultaneously and Z or continuously. It is also possible to measure the detection index. For example, fluorescence and fluorescence resonance energy transfer can be measured simultaneously with a fluorometer.
  • the agonist activity can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, as described in the examples, determination can be made by a method of measuring the agonist activity using cell proliferation as an index. More specifically, an antibody whose agonist activity is to be measured is added to cells that exhibit agonist-dependent growth and cultured. Then, it is possible to measure the absorbance by adding a reagent that exhibits a color reaction at a specific wavelength according to the number of living cells such as WST-8, and measure the agonist activity using the obtained absorbance as an index. .
  • Cells exhibiting antigen-dependent growth can also be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • the receptor is used.
  • An expressing cell may be used.
  • the antigen is a receptor that does not emit a cell proliferation signal
  • a chimeric receptor consisting of an intracellular region of a receptor that emits a cell proliferation signal and an extracellular region of a ⁇ receptor that does not emit a cell proliferation signal. Create and express the chimeric receptor in cells!
  • Examples of receptors that emit cell proliferation signals include G-CSF receptor, mpl, neu, GM-CSF receptor, EPO receptor, c-kit, FLT-3 and the like.
  • Examples of cells that express the receptor include BaF3, NFS60, FDCP-1, FDCP-2, CTLL-2, DA-1, and KT-3.
  • the content ratio of the specific structural isomer is higher than the content ratio of the other structural isomers!
  • the content ratio of the specific structural isomer is 80% or more, preferably Can be exemplified by sc (Fv) 2 compositions of 90% or more, particularly preferably 95% or more. More specifically, the content ratio of the single chai diabody type is 80% or more, preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, or the content ratio of the bivalent scFv type is 80%.
  • the sc (Fv) 2 composition may be mentioned above, preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more.
  • the content ratio of a specific structural isomer is 80% means that the ratio of the specific structural isomer to all the structural isomers contained in the sc (Fv) 2 composition is 80%. It means that there is.
  • the content ratio of single chain diabody type is 80%. This means that the ratio force of bivalent scFv type is 0:20.
  • the upper limit of the content ratio of 80% or more, 90% or more, or 95% or more is not particularly limited, but is preferably 100% or close to 100%.
  • the upper limit is close to 100%, and depends on the purification technique and analysis technique of those skilled in the art, for example, 99.999%, 99.99%, 99.9%, 99%, etc.
  • the content ratio of structural isomers can be measured by separating the structural isomers using, for example, ion exchange chromatography, isoelectric focusing, or chiral isoelectric focusing.
  • the sc (Fv) 2 composition When the sc (Fv) 2 composition is used as a pharmaceutical composition, it is usually preferable to have a high activity. Therefore, sc (Fv) 2 having a high content of structural isomers of 80% or more is preferable. It is preferable to contain the composition as an active ingredient.
  • the anti-Mpl antibody has a higher antigen activity in the single chain diabo dy type, so when sc (Fv) 2 against Mpl is used as the antigen, the content ratio of the single chain diabody type A pharmaceutical composition comprising an sc (Fv) 2 composition having an 80% or more as an active ingredient is preferable.
  • An sc (Fv) 2 composition in which the content ratio of a specific structural isomer is higher than the content ratio of other structural isomers is, for example, a specific structural isomer in the sc (Fv) 2 composition described above. It can be produced by using the separation and acquisition method and by increasing the content ratio of a specific structural isomer in the sc (Fv) 2 composition relative to the content ratio of other structural isomers.
  • the activity of the single chain diabody type is higher than that of the bivalent scFv type.
  • the sc (Fv) 2 composition by increasing the content ratio of the single chain diabody type in the sc (Fv) 2 composition, the sc (Fv) 2 composition The activity can be increased, and by increasing the content ratio of bivalent scFv type, two sets of sc (Fv) The activity of the composition can be reduced.
  • the activity of the bivalent scFv type is higher than that of the angle chain diabody type
  • the activity of the sc (Fv) 2 composition can be increased by increasing the content ratio of the bivalent scFv type in the sc (Fv) 2 composition.
  • the activity of the sc (Fv) 2 composition can be reduced by increasing the content ratio of the single chain diabody type. Whether a single chain diabody type or a bivalent scFv type is highly active depends on the target activity, but those skilled in the art can easily determine by a known method.
  • the method of increasing the content ratio of a specific structural isomer in the sc (Fv) 2 composition more than the content ratio of other structural isomers!] can be performed by any method, for example, the sc (Fv) 2 composition
  • the content ratio of the specific structural isomer may be increased, or the DNA encoding sc (Fv) 2 may be designed so that the content ratio of the specific structural isomer is increased. .
  • a specific method for increasing the content ratio of a specific structural isomer after obtaining the sc (Fv) 2 composition is, for example, the target structural isomer from the obtained sc (Fv) 2 composition. Can be isolated (or not intended !, removing structural isomers). Isolation of the target structural isomer can be performed by methods for separating and obtaining proteins known to those skilled in the art as described above.
  • the content ratio of a specific structural isomer can be increased tl by incubating the sc (Fv) 2 composition in a heated state. It is also possible to increase the content of specific structural isomers by incubating sc (Fv) 2 compositions at low pH and Z or low salt concentrations. That is, the present invention provides a method comprising the following steps and a pharmaceutical composition produced by the method.
  • step (b) mixing the sc (Fv) 2 composition produced in step (a) and at least one substance selected from the group consisting of a salt, an amino sugar, a sugar alcohol, an amino acid, and a pH adjuster;
  • the present inventors are a mixture of sc (Fv) 2 composition power bivalent scFv type and single chain diabody type, and when containing a lot of bivalent scFv type, the sc (Fv) 2 composition is incubated at a constant temperature. By doing this, it has been found that the content ratio of the single chain diabody type can be increased by isomerizing the bivalent scFv type into a single chain diabody type.
  • sc (Fv) 2 composition power is a mixture of bivalent scFv type and single chain diabody type, and when it contains a lot of biv alent scFv type, sc (Fv) 2 composition is pH 3-6, preferably pH 4-4.5, By incubating in this manner, the content ratio of the single chain diabody type can be increased by isomerizing the bivalent scFv type into the single chain diabody type.
  • the salt concentration depends on the pH, but the salt concentration force during incubation is preferably from S0 mM to 500 mM, more preferably from 0 mM to 150 mM (Fig. 9A).
  • the sc (Fv) 2 composition in which the content ratio of the single chain diabody type is increased by incubation can be purified to a high purity by the method shown in PCT / JP06 / 306800.
  • the salt concentration is preferably in the range of 50 mM to 1000 mM, more preferably. It is preferable to be in the range of 150 mM to 300 mM.
  • the pH value is preferably in the range of 4.5 to 9.0, more preferably in the range of 6.0 to 9.0.
  • the sc (Fv) 2 composition is a mixture of a bivalent scFv type and a single chain diabody type and contains many single chain diabody types
  • the sc (Fv) 2 composition is incubated at a constant temperature.
  • this invention provides the method of including the following processes as one aspect
  • (a) sc (Fv) 2 composition at 15 ° C to 50 ° C, preferably 20 ° C to 40 ° C, particularly preferably 25 ° C to 35 ° C. C and Z or pH 3.0 to 6.0, and Z or a salt concentration of 500 mM or less, so that the content ratio of single chain diabody type is higher than the content ratio of bivalent scFv type sc (Fv) 2 Process for producing the composition
  • step (c) Step of stabilizing the single chain diabody type sc (Fv) 2 composition obtained in step (b)
  • the pH value the range of 4.5 to 9.0, more preferably admixing step and salt adjusted in a range of 6.0 to 9.0, amino sugar, sugar alcohol, amino acid, at least one substance selected from the group consisting of P H modifier
  • the soot includes a process combining these processes.
  • a stabilized bivalent scFv type sc (Fv) 2 composition can be produced.
  • variable regions of sc (Fv) 2 By controlling the association of the variable regions of sc (Fv) 2, it is possible to increase the content ratio of a specific structural isomer in the sc (Fv) 2 composition. Specifically, the DNA encoding sc (Fv) 2 should be modified to change the amino acid residue that forms the interface of the variable region of sc (Fv) 2.
  • association refers to a state in which the variable regions of sc (Fv) 2 interact, for example.
  • controlling the association means controlling so as to achieve a desired association state, and more specifically, so that an undesirable association is not formed in sc (Fv) 2.
  • the “interface” usually refers to an association surface at the time of association / interaction), and the amino acid residue forming the interface is usually the variable region of sc (Fv) 2 used for the association.
  • the amino acid residue is one or more amino acid residues contained in the group, and more preferably an amino acid residue that is approached during the association and participates in the interaction.
  • the interaction includes a case where amino acid residues approaching at the time of association form a hydrogen bond, an electrostatic interaction, a salt bridge, and the like.
  • amino acid residues forming the interface in the present invention, if specifically, S C (Fv) 2 variable regions Nio constituting the surface Te, refers to the amino acid residues contained in the variable region.
  • Modification of an amino acid residue in the method of the present invention specifically refers to substitution of the original amino acid residue (before modification) with another amino acid residue, or the original amino acid residue. Deletion, addition of a new amino acid residue, and the like. Preferably, it refers to substitution of the original amino acid residue with another amino acid residue.
  • modifying DNA refers to modifying DNA so as to correspond to the amino acid residue introduced by “modification” in the present invention. More specifically, it means that the DNA encoding the original amino acid residue is modified to DNA encoding the amino acid residue introduced by the modification. Usually, it means genetic manipulation or mutagenesis that inserts, deletes, or substitutes at least one base into the original DNA so that it becomes a codon encoding the target amino acid residue. That is, the codon encoding the original amino acid residue is replaced by a codon encoding the amino acid residue introduced by the modification.
  • DNA modification can be appropriately performed by those skilled in the art using known techniques such as site-specific mutagenesis, PCR mutagenesis, and the like.
  • two or more amino acid residues that form the interface of the variable region of sc (Fv) 2 are attached to the interface such that they have the same kind of charge. Introduce amino acid residue mutations. It is considered that the association of these amino acid residues is inhibited by the repulsive force of the charge by modifying two or more amino acid residues involved in the association at the interface so that they have the same kind of charge. Therefore, in the above method, the amino acid residue to be modified is preferably two or more amino acid residues which are close to each other during association between the variable regions of sc (Fv) 2 forming the interface.
  • amino acid residues that approach at the time of association are analyzed, for example, by analyzing the three-dimensional structure of sc (Fv) 2 and examining the amino acid sequence of the variable region that forms the interface during the association of sc (Fv) 2. Can be found. Amino acid residues that are close to each other at the interface are preferred targets for “modification” in the method of the present invention.
  • amino acids charged amino acids are known.
  • lysine arginine (R), and histidine (H) are known as positively charged amino acids (positively charged amino acids).
  • Aspartic acid (D), glutamic acid (E), and the like are known as negatively charged amino acids (negatively charged amino acids). Therefore, preferably, in the present invention, the same type of charged amino acids means amino acids having positive charges or amino acids having negative charges.
  • the same amino acid is more preferable.
  • the modified amino acid residues may be lysine and arginine, but two lysines, more preferably two arginines! / ,.
  • these amino acid residues may have a small number of amino acid residues without charge.
  • the number of amino acid residues subjected to modification in the method of the present invention is not particularly limited, but it is preferable to modify as few amino acid residues as possible in order not to reduce the binding activity to the antigen.
  • the “small number” represents, for example, 1 to: about LO number, preferably about 1 to 5, more preferably about 1 to 3, most preferably 1 or 2.
  • the amino acid residue (X) that forms the interface is already charged or has formed a hydrogen bond, it is in close proximity to the amino acid residue at the time of association. It is also a preferred embodiment of the present invention that the amino acid residue is modified so that it is the same amino acid residue (or the same type of charged amino acid residue) as the amino acid residue (X). In this embodiment, it is only necessary to modify one of the amino acid residues forming the interface.
  • the amino acid residue that forms the hydrophobic core present at the interface is modified by modification of the amino acid residue that forms the interface of the variable region of sc (Fv) 2. Mutation of the amino acid residue is introduced into the interface so that the residue becomes a charged amino acid residue.
  • a “hydrophobic core” refers to a portion formed by aggregation of hydrophobic amino acid side chains inside an associated polypeptide. Examples of hydrophobic amino acids include alanine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanin, proline, tryptophan, and norin.
  • hydrophobic core may involve amino acid residues other than hydrophobic amino acids (eg tyrosine).
  • This hydrophobic core serves as a driving force for advancing the association of water-soluble polypeptides together with the hydrophilic surface where the side chains of hydrophilic amino acids are exposed to the outside.
  • Hydrophobic amino acids of two different domains are present on the surface of the molecule, and exposure to water molecules increases entropy and free energy.
  • the two domains associate with each other to reduce and stabilize the free energy, and the hydrophobic amino acid at the interface is buried inside the molecule, forming a hydrophobic core.
  • the formation of the hydrophobic core is inhibited by changing the amino acid residue forming the formed hydrophobic core to a polar amino acid having a charge. It is thought that peptide association is inhibited.
  • the polypeptide sc (Fv) 2 also forms a hydrophobic core by association of variable regions. Thus, substitution of the amino acid residue of the hydrophobic core with an amino acid having a charge is considered to be an easy way to control the association of the variable regions.
  • knobs-into-holes special table 2001-523971
  • k nobs-into-holes allows specific and complementary interactions at the interface between the first polypeptide and the second polypeptide to promote heteromultimer formation and inhibit homomultimer formation.
  • a free chelate-containing residue at the interface of the first polypeptide so that a non-natural disulfide bond is formed between the first polypeptide and the second polypeptide.
  • variable region is usually composed of three CDR regions and four FR regions.
  • the amino acid residue subjected to “modification” can be appropriately selected from, for example, amino acid residues located in the CDR region or the FR region.
  • modification of amino acid residues in the CDR region may reduce the ability to bind to an antigen. Therefore, the amino acid residues to be used for “modification” in the present invention are not particularly limited! /, But it is preferable to appropriately select the intermediate forces of amino acid residues located in the FR region.
  • a leucine (L) at position 45 (FR2) on VH and a proline (P) at position 44 (FR2) on VL can be preferably exemplified.
  • L leucine
  • P proline
  • variable region 1 and variable region 3 when a structural isomer having a structure in which variable region 1 and variable region 3 are associated and variable region 2 and variable region 4 are associated is formed, the association is suppressed.
  • an amino acid that forms the interface of the variable region so as not to suppress (or promote) the association of variable region 1 and variable region 4 and the association of variable region 2 and variable region 3 Introduce a substitution mutation in the residue.
  • [Variable region 1] (Linker 1) [Variable region 2] (Linker 1) [Variable region 3] (Linker 1) 3 [Variable region 4] ) 2 exemplifies a method for increasing the content ratio of the bivalent scFv type.
  • the sc (Fv) 2 has a structure in which variable region 2 and variable region 4 are associated with each other. If isomers occur, suppress this association and do not suppress (or promote) the association of variable region 1 and variable region 2 and the association of variable region 3 and variable region 4. Substitution mutations are introduced into amino acid residues that form the interface of the variable region.
  • the ratio of bivalent scFv type is decreased and the ratio of single chain diabody type
  • an amino acid residue forming the interface between VH1 and VL2 is replaced with an amino acid residue having the same type of charge, and an amino acid residue that forms an interface between VH3 and VL4 is increased.
  • Substitution is made with amino acid residues having the same kind of charge that have a charge (preferably an affinity charge) that does not repel amino acid residues introduced into VH1 and VL2.
  • the amino acid side chain forming the interface between VH1 and VL2 is replaced with a larger side chain (knob), and the amino acid side chain forming the interface between VH3 and VL4 is replaced with a smaller side chain. Replace with (hole).
  • the association between VH1 and VL2 and the association between VH3 and VL4 can be suppressed, and the association between VH1 and VL4 and the association between VL2 and VH3 can be controlled (or promoted).
  • [VH1] linker [VL2] linker [VH3] linker [VL4] are arranged in this order! /,
  • sc (Fv) 2 the ratio of single chain diabody type is decreased
  • the amino acid residue forming the interface between VH1 and VL4 is replaced with an amino acid residue having the same kind of charge, and the interface between VH3 and VL2 is formed.
  • the amino acid residue is replaced with an amino acid residue having the same kind of charge and having a charge (preferably an affinity charge) that does not repel the amino acid residue introduced into VH1 and VL4.
  • the amino acid side chain forming the interface between VH1 and VL4 is replaced with a larger side chain (knob), and the amino acid side chain forming the interface between VH3 and VL2 is replaced with the smaller side chain.
  • sc (Fv) is substituted by substituting the following amino acid residues (1) and (2) or (3) and (4) with amino acid residues having the same kind of charge. 2 specific in the composition It is possible to increase the content ratio of structural isomers.
  • any one of the following amino acid residues (1) and (2), or any one of the amino acid residues (3) and (4) is an amino acid having a charge.
  • a residue By substituting with a residue, it is possible to increase the content ratio of a specific structural isomer in the sc (Fv) 2 composition.
  • the amino acid residues described in (1) to (4) above are usually (1) glutamine (Q), (2) glutamine (Q), (3) in humans and mice, respectively.
  • leucine (L) and (4) proline (P) they are not necessarily limited to this amino acid residue, and may be other amino acids corresponding to this amino acid.
  • the amino acid corresponding to position 38 in the amino acid sequence on VL may be histidine (H), for example.
  • H histidine
  • a person skilled in the art knows the kind of amino acid residue corresponding to an arbitrary position by referring to known literatures (for example, J. Mol. Recognit. 2003; 16: 113-120). It is possible.
  • the present invention provides a method according to any one of the following (1) to (4) and a pharmaceutical composition produced by the method.
  • step (b) mixing the sc (Fv) 2 composition produced in step (a) and at least one substance selected from the group consisting of a salt, an amino sugar, a sugar alcohol, an amino acid, and a pH adjuster;
  • step (b) mixing the sc (Fv) 2 composition produced in step (a) and at least one substance selected from the group consisting of a salt, an amino sugar, a sugar alcohol, an amino acid, and a pH adjuster;
  • step (b) mixing the sc (Fv) 2 composition produced in step (a) and at least one substance selected from the group consisting of a salt, an amino sugar, a sugar alcohol, an amino acid, and a pH adjuster; (4) A method including the following steps.
  • step (b) mixing the sc (Fv) 2 composition produced in step (a) and at least one substance selected from the group consisting of a salt, an amino sugar, a sugar alcohol, an amino acid, and a pH adjuster;
  • the present invention provides a method comprising the following steps and a pharmaceutical composition produced by the method.
  • step (b) mixing the sc (Fv) 2 composition produced in step (a) and at least one substance selected from the group consisting of a salt, an amino sugar, a sugar alcohol, an amino acid, and a pH adjuster;
  • sc (Fv) 2 is defined as [variable region 1] (linker 1) [variable region 2] (linker 1) [variable region 3] (linker 1) [linker 1 at both ends]
  • Linker 1 and Linker 1 are the linkers at both ends, and Linker 1 is the center linker.
  • the ratio of single chain diabody type in the sc (Fv) 2 composition can be increased by setting the linkers at both ends to 0 to 12 amino acids and the central linker to 10 to 30 amino acids. It is possible to increase the ratio of bivalent scFv type in the sc (Fv) 2 composition by setting the linkers at both ends to 12-30 amino acids and the central linker to 0-10 amino acids. Become
  • an sc (Fv) 2 composition having a single chain diabody type content ratio of 80% or more is obtained.
  • Sc (Fv) 2 composition with a bivalent scFv-type content ratio of 80% or more by making the linkers at both ends 12-30 amino acids and the central linker 0-10 amino acids. Can be manufactured.
  • the present invention provides a method according to any one of the following (1) to (3), and a pharmaceutical composition produced by the method.
  • step (b) mixing the sc (Fv) 2 composition produced in step (a) and at least one substance selected from the group consisting of a salt, an amino sugar, a sugar alcohol, an amino acid, and a pH adjuster;
  • step (b) mixing the sc (Fv) 2 composition produced in step (a) and at least one substance selected from the group consisting of a salt, an amino sugar, a sugar alcohol, an amino acid, and a pH adjuster;
  • step (b) mixing the sc (Fv) 2 composition produced in step (a) and at least one substance selected from the group consisting of a salt, an amino sugar, a sugar alcohol, an amino acid, and a pH adjuster;
  • an sc (Fv) 2 composition is an sc (Fv) 2 composition in which the content ratio of a specific structural isomer is higher than the content ratio of other structural isomers is determined by those skilled in the art. Identification can be performed by a well-known method such as analysis using NMR, crystal structure analysis, or the like. It can also be confirmed by a method for identifying the structure of the structural isomer in the sc (Fv) 2 composition, comprising a step of cleaving the linker site of sc (Fv) 2.
  • the partial position of the linker refers to a site including the linker and the vicinity of the linker.
  • a linker-near region refers to a region having a 20 amino acid force up to the 20th amino acid on the variable region side from the amino acid chain adjacent to the linker. Therefore, the partial position of the linker is a site where a region of about 20 amino acids is added to both ends of the linker.
  • the method of identifying the structure of the structural isomer in the sc (Fv) 2 composition including the step of cleaving the sc (Fv) 2 linker, is performed by single chain diabody type or bivalent s cFv type by chromatography or the like. It is a simpler method than the analysis method. Chromatography does not identify the structure of the separated sc (Fv) 2 even if the structural heterogeneity can be separated. By this method, it is possible to identify the structure of structural isomers separated by chromatography or the like.
  • sc (Fv) 2 is arranged in the order of [variable region 1] (linker 1) [variable region 2] (linker 1) [variable region 3] (linker 1) [variable region 4].
  • linker 1 when the linker is cleaved at 1 or 3 sites, the four variable regions are covalently or non-covalently bound, so it is not possible to separate them into two scFvs.
  • linker 1 when it is cleaved at the site of linker 1, it is separated into two scFvs, scFv consisting of variable regions 1 and 2 and scFv consisting of variable regions 3 and 4.
  • sc (Fv) 2 is a single chain diabody type, bivalent scFv by cleaving one of the sc (Fv) linker sites with an enzyme and comparing the products after cleavage. It is possible to check which type it is.
  • the method for identifying the structure of the structural isomer in the sc (Fv) 2 composition comprising the step of cleaving the linker site of sc (Fv) 2 includes (a) sc (Fv) 2 composition
  • An example is a method comprising the step of cleaving the linker site of sc (Fv) therein, and (b) measuring the molecular weight or structure of the product after cleavage.
  • the sc (Fv) 2 linker moiety does not have a higher-order structure and is therefore susceptible to protease degradation (Hoedemaeker et al, J Biol Chem. 1997; 27 2: 29784-29789)
  • the method for cleaving the linker is not particularly limited, but cleavage with an enzyme is preferred, and cleavage with a protease is particularly preferred.
  • the protease to be used is not particularly limited and may be either an exopeptidase or an endopeptidase, but endopeptidase is preferable for the purpose of cleaving the linker.
  • the endopeptidase can be any one such as serine protease, thiorebeptidase, acid 'protease, meta-protease, etc., and can be appropriately selected according to the type of linker and amino acid sequence. It is.
  • serine proteases include trypsin that specifically hydrolyzes the C-terminal side of Arg and Lys residues, and subtilisin that hydrolyzes protein non-specifically.
  • thiol proteases include pyroglutamate aminopeptidase, which specifically hydrolyzes the pGlu residue at the N-terminal of protein 'peptide, and papain, which hydrolyzes protein / peptide nonspecifically.
  • the number of linkers to be cut is not limited, but is preferably one.
  • the conditions for cutting one linker can be determined by methods known to those skilled in the art.
  • the present invention includes a step of adding at least one substance selected from the group consisting of a salt, an amino sugar, a sugar alcohol, an amino acid, and a pH adjuster to sc (Fv) 2, sc (Fv) 2 It provides a method for suppressing the opposite sex. Since the specific structural isomer of sc (Fv) 2 can be stabilized by the method of the present invention, the method of the present invention can be used for analysis of a specific structural isomer of sc (Fv) 2. [0115] In addition, in the pharmaceutical composition containing sc (Fv) 2, the substance of the present invention preserves the abundance ratio of a plurality of structural isomers so that a specific structural isomer exists stably.
  • the present invention includes the step of adding at least one substance selected from the group consisting of a salt, an amino sugar, a sugar alcohol, an amino acid, and a pH adjuster. There is also provided a method of inhibiting the above. Furthermore, the suppression of sc (Fv) 2 isomerism can also be carried out by lyophilizing the sc (Fv) 2.
  • the present invention suppresses the isomeric reaction of sc (Fv) 2 containing at least one substance selected from the group consisting of a salt, an amino sugar, a sugar alcohol, an amino acid, and a pH adjuster. It provides a stabilizer used for the purpose and a method of using the same. Further, in the production of the stabilizer of the present invention, the use of a salt, amino sugar, amino acid, or pH adjuster, or a salt, amino sugar, amino acid for suppressing the sc (Fv) 2 heterogeneous reaction Or the use of pH adjusters. That is, the present invention provides a novel use of a salt, amino sugar, amino acid, or pH adjuster.
  • the stabilizer of the present invention can be prepared by methods well known to those skilled in the art. Manufacturers and distributors of substances contained in the stabilizer of the present invention are well known to those skilled in the art.
  • the present invention also provides a screening method for a substance that suppresses the sc (Fv) 2 isomerism reaction.
  • the screened substance can be used as a stabilizer used to suppress the sc (Fv) 2 isomerism reaction.
  • test substance in the method of the present invention is not particularly limited, for example, known pharmaceutically acceptable carriers, single compounds such as natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, peptides, and compounds. Library, gene library expression product, cell extract, cell culture supernatant, fermented microorganism product, marine organism extract, plant extract, prokaryotic cell extract, eukaryotic single cell extract or animal cell extract, etc. Can be mentioned.
  • contact is performed by adding a test substance to the sc (Fv) 2 composition or by adding the sc (Fv) 2 composition to the test substance.
  • Example 1 Humanized anti-human Mpl antibody hVB22B Examination of stabilizer for isomerization reaction of sc (Fv) 2 As shown in Fig. 1, sc (Fv) 2 is between two structural isomers. Are mutually structurally converted (isomerized).
  • Mobile phase A 20 mM sodium phosphate, pH 7.0
  • Mobile phase B 20 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH 7.0
  • Figure 2 shows the ratio of peakl after 25 ° C-6weeks when starting with peakl 91.4%. The peakl percentage was sufficiently high at peakl peak area / (peakl + peak2 pea area) * 100.
  • Figure 3 also shows that peak2 percentage after 25 ° C-6weeks when peak2 starts at 99.6% o peak2 percentage is based on peak2 peak area / (peakl + peak2 peak area node * 100 Calculated.
  • the ratio of peak2 after 25 ° C-6weeks decreased to about 95%, and about 5% isomerized to peakl.
  • the isomerization reaction was greatly suppressed, and the ratio of peak 2 after 25 ° C-6 weeks was 98% or more.
  • the addition of meglumine showed the highest effect of suppressing the isomerism.
  • mannitol was added, only a slight isomerism suppressing effect was confirmed, and sucrose showed almost no stabilizing effect.
  • Mobile phase A 20 mM sodium phosphate, pH 7.0
  • Mobile phase B 20 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH 7.0
  • Fig. 4 shows the ratio of peakl after 5 days at 25 ° C, starting from peak 91.4%.
  • Figure 5 shows the percentage of peak2 after 5 days at 25 ° C, starting from peak2 99.6%.
  • the calculation method of peakl percentage and peak2 percentage is the same as in Example 1.
  • the structural isomer abundance ratio of was measured.
  • the elution conditions for cation exchange chromatography are as follows.
  • Mobile phase A 20 mM sodium phosphate, pH 7.0
  • Mobile phase B 20 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH 7.0
  • FIG. 6 shows the ratio of peak 1 after 25 ° C-20 days at peak 2 99.6%. peakl percenta
  • the calculation method of ge is the same as that in the first embodiment.
  • bivalent scFv is used to suppress bivalent scFv peakl force and single chain diabody peak2 peak.
  • the ratio of structural isomers was measured using anion exchange chromatography after intial and 40 ° C-2, 4, 8 days.
  • the elution conditions for anion exchange chromatography are as follows.
  • Mobile phase A 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
  • Mobile phase B 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8.0
  • Fig. 7 shows the ratio of peak2 produced by isomerization after stability test at 40 ° C-2,4,8days for peakl in each solution condition.
  • the calculation method of peak2 percentage is the same as in Example 1.
  • a freeze-dried preparation and a solution preparation were prepared under the above conditions.
  • the freeze-dried preparation was loaded in a freeze-dryer (KYOWAC Triomaster IV-04, Kyowa Vacuum) pre-frozen at -50 ° C in advance and left for 1 hour. After confirming that the product temperature was ⁇ 40 ° C. or lower and evacuating to 0.1 Torr or lower, primary drying was performed at ⁇ 20 ° C., and secondary drying was performed at 30 ° C.
  • Mobile phase A 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
  • Mobile phase B 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8.0
  • Figure 8 shows the ratio of bivalent scFv after intial and 40 ° C-lweek.
  • peakl to peak2 It was investigated whether peakl to peak2 can be promoted using peakl (91.4% peakl) which is a structural isomer of hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 purified to high purity.
  • hVB22B sc (Fv) 2 is secreted from expressing cells as a mixture of peakl and peak2 During the production process, if peakl can be isomerized to peak2, the yield of peak2 can be improved. Therefore, isomerization from peak 1 to peak 2 was studied at the pH and NaCl concentrations shown below.
  • Mobile phase A 20 mM sodium phosphate, pH 7.0
  • Mobile phase B 20 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH 7.0
  • the mixture power of peakl and peak2 produced by cells is also isomerized from pea kl to peak2, thereby obtaining peak2 which is a single chain diabody with high yield. It is possible.
  • FIG. 9B shows the structural isomer abundance ratio (bivalent scFv type abundance ratio) after initial and 50 ° C.-10 days.
  • the humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 undergoes an isomerization reaction from a single chain diabody type to a bivalent scFv type structure at 50 ° C-10days pH4.5, and the abundance ratio of the bivalent scFv type increased.
  • hVB22B sc (Fv) 2 has undergone an isomerization reaction from bivalent scFv type to single chain diabody type, whereas human chain anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 has single chain diabody type strength.
  • the isomerization reaction proceeded to a bivalent scFv type structure.
  • the isomeric reaction of humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 is suppressed at pH 5.5 and above, indicating that humanized anti-human IL-6 receptor It was revealed that the isomeric reaction of the antibody sc (Fv) 2 can be suppressed by pH.
  • the mouse anti-human Mpl antibody mVB22B sc (Fv) 2 (hereinafter referred to as VB22B sc (Fv) 2) was prepared as shown in Blood, 2005, 105, 562-566. Specifically, the antibody variable region cDNA of mouse hyperpridoma VB22B that produces anti-human Mpl antibody is cloned, and the nucleotide sequence encoding the linker sequence (Gly GlyGlyGlySer) x3 (SEQ ID NO: 1) and the FLAG sequence (AspTyrLys) AspAspAspAspLys) (SEQ ID NO: 2), using a base sequence that encodes a VH linker sequence VL linker sequence VH linker sequence VL—flag tag sequence (SEQ ID NO: 3) was made.
  • This DNA fragment was cloned into the expression vector pCX ND3 to construct a VB22B sc (Fv) 2 expression vector, and the gene was introduced into CHO-DG44 cells to produce a stable expression cell line.
  • the expression vector 25 g
  • 0.75 mL of CHO-DG44 cells (1 X 107 cells / mL) suspended in PBS were cooled on ice for 10 minutes, transferred to a cuvette, and then 1.5 kV using Gene Pulserll (BioRad). The pulse was given with a capacity of 25 ⁇ FD.
  • the cells treated with electoporation were selected by adding them to CHO-S-S FMII medium (Invitrogen) containing 500 ⁇ g / mL Geneticin (Invitrogen), and VB22B sc ( Established Fv) 2 producing CHO cell line
  • the culture supernatant from this cell line was applied to a Macr 0-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I (Bio-Rad) column equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 6.8), and 250 mM phosphate buffer was applied. Elute stepwise with liquid (PH6.8).
  • the elution fraction was concentrated using an ultrafiltration membrane and then subjected to gel filtration chromatography using a HiLoad 26/60 Superdex200pg column, and a fraction corresponding to a molecular weight of about 70 kD to 40 kD was collected.
  • This fraction was adsorbed onto an Anti-Flag M2 Affinity Gel (SIGMA-ALDRIC H) column equilibrated with 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, and 100 mM Glycine-HCl (pH Eluted in 3.5).
  • the eluted fraction was immediately neutralized with 1M Tris-HCl (pH 8.0) and subjected to gel filtration chromatography using a HiLoad 26/60 Superdex200pg (Amersham-Bioscience) column.
  • As the buffer for the gel filtration chromatography 20 mM acetic acid (pH 6.0), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 80 was used.
  • VB22B sc (Fv) 2 is sc (Fv) 2 having the sequence of VH1-linker-VL2-linker-VH3-linker-VL4, the combination of Fv (molecule non-covalently bound between VH and VL)
  • Fv molecule non-covalently bound between VH and VL
  • VB22B sc (Fv) 2 was separated into four peaks.
  • the chromatograms shown in Fig. 11 were obtained, and the peaks with short retention times were named pre peakl, pre peak2, peak and peak2, respectively.
  • VB22B sc (Fv) 2 does not have sugar chains, and peakl and peak2 have the same primary amino acid sequence and have different three-dimensional structures separated by ion exchange chromatography. These results suggest that peakl and peak2 are conformational isomers. In the public literature, the existence of structural isomers was suggested. This study made it possible to separate structural isomers for the first time.
  • VB22B sc (Fv) 2 is sc (Fv) 2 having the sequence of VH1-linker-VL2-linker-VH3-linker-VL4, the combination of Fv (molecule non-covalently bound between VH and VL) VH1 and VL 2 and VH3 and VL4 are expected to have two structural isomers: bivalent scFv, each of which forms Fv, and VH1, VL4, VH2, and VL3 each form Fv. Therefore, peakl and peak2 were considered to be these structural isomers.
  • protease-limited degradation method was found as an analytical method for identifying two types of structural isomers.
  • the linker part of sc (Fv) 2 is considered to have a relatively free structure, and is considered to have low resistance to protease.
  • Subtilisin A a kind of protease, is used under the following conditions, peakl and peak2 And VB22B bulk (peakl: peak2 to 1: 3).
  • peak 2 had no low molecular weight peak, whereas peak had a low molecular weight (about half molecular weight) peak.
  • peakl was identified as bivalent scFv type and peak2 as single chain diabody type.
  • the anti-human Mpl antibody VB22B sc (Fv) 2 is TPO-like in the literature (Blood 2005; 105: 562-566) It has been reported to exhibit antigenic activity. Therefore, we evaluated the TPO-like agonist activity of structural isomers isolated using BaF3-human Mp or BaF3-monkey Mpl, which show TPO-dependent growth.
  • Each cell was washed twice with RPMI1640 (Invitrogen) containing 1% Fetal Bovine Serum (Invitrogen), and then suspended in RPMI 1640 containing 10% Fetal Bovine Serum so that the concentration was 4xl05cells / mL. Dispensed into a 96-well plate at L / well. The concentration of rhTPO (R & D) or structural isomer sample was varied, and 40 L was added to each well and cultured at 37 ° C and 5% C02 for 24 hours. Add WST-8 reagent (Cell Count Reagent SF, Nacalai Tester) at 10 ⁇ L / well.
  • Fig. 15 shows the results of evaluation of TPO-like antigen activity in BaF3-human Mpl and BaF3-monkey Mpl using the purified structural isomer of VB22B sc (Fv) 2. Comparing the agonist activities of the structural isomers of peakl and peak2, it was found that peak2 showed significantly higher activity. This suggests that the anti-Mpl antibody sc (Fv) 2 must have a single chain diabody structure in order to exhibit TPO-like antigen activity.
  • a humanized antibody was prepared by grafting a complementary antigen determining region (hereinafter referred to as CDR) into the variable region framework region (hereinafter referred to as FR) of VB22B sc (Fv) 2 prepared in Reference Example 1.
  • CDR complementary antigen determining region
  • FR variable region framework region
  • FR variable region framework region
  • the expression vector is expressed in the same manner as in Reference Example 1-1 so that the obtained gene is expressed in animal cells.
  • One Construction, Constant Expression A CHO-DG44 cell line was prepared and the culture supernatant was collected. Since the humanized antibody hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 is not tagged with a Flag tag, purification from the culture supernatant was performed using MG10 (human), an epitope recognized by VB22B sc (Fv) 2. Mpl amino acid sequence Gln213 to Ala231) and GST fusion protein were used. The MG10 and GST fusion protein was purified using Glutathione Sepharose 4B (Amersham Biosciences) according to the manufacturer's protocol.
  • MG10 and GST fusion protein was immobilized on HiTrap NHS-activated HP (Amersham Biosciences) according to the manufacturer's protocol to produce an affinity column.
  • the humanized antibody hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 expressing CHO cell culture supernatant is applied to the MG10-GST fusion protein-fixed column, and the humanized antibody hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 is adsorbed to the lOOmM Elute with Glycine-HCl (pH 3.5), 0.01% Tween80.
  • the eluted fraction was immediately neutralized with 1M Tris-HCl (pH 7.4) and subjected to gel filtration chromatography using HiLoad 16/60 Superdex200 pg (Amersham Biosciences).
  • As a buffer for gel filtration chromatography 20 mM citrate buffer (pH 7.5), 300 mM NaCl, 0.01% Tween 80 was used.
  • hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 is sc (Fv) 2 with the sequence of VHl-linker-VL2-linker-VH3-linker-VL4, the structure is Fv, similar to VB22B sc (Fv) 2.
  • VH1 and VL2, VH3 and VL4 form Fv, VHl and VL4, and VH2 and VL3 form Fv, respectively.
  • Mobile phase A 20 mM sodium phosphate, pH 7.5
  • Mobile phase B 20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH 7.5
  • Peptide mapping was performed for peakl and peak2. After reductive denaturation and carboxymethylation, it was decomposed into peptide fragments using trypsin, and a peptide map was obtained by reverse phase chromatography (YMC-Pack-ODS). When the peptide maps of peakl and peak2 were compared, the mapping patterns of peakl and peak2 were the same as shown in FIG. 17, indicating that the amino acid primary structure was the same.
  • hVB22B u2- wz4 sc (Fv) 2 has a sugar chain and peakl and peak2 have the same molecular weight according to TOF-MASS measurement, and peakl and peak2 have the same mapping pattern. It was found that peakl and peak2 are conformational isomers having different steric structures.
  • hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 is sc (Fv) 2 having the sequence of VH1-linker-VL2-linker-VH3-linker-VL4, the structure is Fv as shown in FIG. VH1 and VL2, VH3 and VL4 form Fv, respectively, and VH1 and VL4, VH2 and VL3 form Fv, respectively.
  • protease limited degradation method As an analytical method for identifying two types of structural isomers, a protease limited degradation method was found.
  • the linker part of sc (Fv) 2 has a relatively free structure and is considered to have low resistance to protease.
  • subtilisin A a kind of protease, peakl and It was reacted with peak2 and hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 (peakl: peak2 to 1: 4).
  • the binding rate constant (ka) 'dissociation rate constant (kd) was calculated using BIAevaluation ver.3.1 software (Biacore) and applying the bivalent analyte model.
  • the dissociation constants (KD) of hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 bulk, peak, and peak2 are 1.02x10-8 M, 1.24x10-8 M, 9.92 xlO-9 M, respectively. It was found that almost two structural isomers have almost the same binding activity.
  • hVB22Bu2-wz4 sc (Fv) 2 it was possible to separate structural isomers contained in hVB22Bu2-wz4 sc (Fv) 2 and identify the structure. Furthermore, the abundance ratio of the structural isomers of the bivalent scFv structure and the single chain diabody structure contained in hV B22B u2-wz4 sc (Fv) 2 can be quantitatively analyzed by the peak area of the chromatography. In hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2, bivalent scFv structure and single chain diabody structure are markedly different in agonist activity, and hVB22B u containing structural isomers with markedly different activities. In order to develop 2-wz4 sc (Fv) 2 as a pharmaceutical product, a standard test that determines the properties of two structural isomers and quantitatively analyzes the content ratio of each structural isomer is indispensable.
  • VB22B sc (Fv) 2 is sc (Fv) 2 having the sequence of VH1-linker-VL2-linker-VH3-linker-VL4, the structure is Fv (molecule non-covalently linked between VH and VL).
  • Fv molecule non-covalently linked between VH and VL.
  • there are two types of structural isomers bivalent scFv, in which V HI and VL2, VH3 and VL4 each form Fv, and single chain diabody, in which VH1 and VL4, VH2 and VL3 each form Fv. It is exempted.
  • Mobile phase B 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8.0
  • two structural isomers can be separated by the analysis method shown in Reference Example 2 using a linker having an arbitrary length, and the content ratio of structural isomers is determined. I was able to measure. It turns out that the ratio of the bivalent scFv type to the single chain diabody type can be controlled by the length of the linker, and by using this analysis method, an appropriate linker that can obtain the desired structural isomer ratio can be obtained. It became possible to design a chief.
  • the culture supernatant of the CHO cells expressing hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 used in Reference Example 2-1 was purified.
  • the culture supernatant was diluted 3-fold with purified water and then adjusted to pH 6.0 with 1 M acetic acid. Then, it is applied to a 20 mM sodium acetate buffer, SP Sepharose Fast Flow column (Amersham Biosciences) equilibrated with pH 6.0, the column is washed with the same buffer, and then 0 M NaCl in the same buffer up to 0.5 M is added.
  • the polypeptide adsorbed on the column was eluted with a linear concentration gradient (first step).
  • the obtained fractions were analyzed by reducing SDS-PAGE using TrisGlycine SDS gel 12%, and fractions containing hVB22B u2-wz4 were collected.
  • hVB22B u2- wz4 sc (Fv) 2 fraction in the first step was applied to a hydroxyapatite column, type I, 20 m (BIO-RAD) equilibrated with 10 mM phosphate buffer, pH 6.8. After addition, the column was washed with the same buffer, and the phosphate buffer solution at pH 6.8 was linearly increased to 160 mM to elute the polypeptide adsorbed on the force ram (Fig. 23). A small peak eluted after the main peak, and SDS-PAGE analysis confirmed that both were hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2. As shown on the right of Fig.
  • the main peak is mostly hVB 22B u2-wz4 sc (Fv) 2 monomer by analytical gel filtration using Superdex 200 PC 3.2 / 30 column (Amersham Biosciences).
  • the back peak was found to be an aggregate fraction of more than one dimer of hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2. From the above, it was found that the monomer fraction of hVB22B u 2-wz4 sc (Fv) 2 can be separated in this step.
  • the monomer fraction of hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 obtained in the second step was diluted 5-fold with purified water and then equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0. Apply to SOURCE 15S column (Amersham Biosciences), wash the column with the same buffer, and then add 0 mM in the same buffer. After applying a linear concentration gradient of NaCl to 36 mM, the concentration of NaCl was fixed at 36 mM in order to separate and elute the two peaks to the maximum. As shown in Fig.
  • Peak- and peak2 of purified hVB22B u2- wz4 sc (Fv) 2 were subjected to SDS-PAGE analysis using the above-mentioned SDS gel under both reducing and non-reducing conditions, and both had a molecular weight of approximately 55 kDa. A single band was observed at the position (Fig. 26).
  • pea kl and peak2 of hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 were both subjected to gel filtration chromatography using the TSK Super2000 column shown in 1-3, and both showed an apparent molecular weight of about 50 kDa as a single peak. (Figure 27).
  • the amino acid described in the 39th position of VH (SEQ ID NO: 289 of WO2005 / 56604), which is the amino acid that forms the VH / VL interface of hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 (hereinafter referred to as u2-wz4) prepared in Reference Example 2.
  • u2-wz4 amino acid that forms the VH / VL interface of hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2
  • u2-wz4 is linked by the amino acid linker sequence (GlyGlyGlyGlySer) x3 (SEQ ID NO: 1) in the order of [VH1] linker [VL2] linker [VH3] linker [VL4] and described in SEQ ID NO: 4. Transcribed and translated with the base sequence.
  • VH1 (gene codon CAG) is changed to Glu (gene codon GA G), 38th Gin of VL2 (gene codon CAG) to Lys (gene codon AAG), 39th Gin of VH3 (gene codon CAG) to Lys (gene codon AAG), 38th Gin of VL4
  • the gene hVB22B u2-wz4 (v3) sc (Fv) 2 in which (gene codon CAG) is modified to Glu (gene codon GAG) (hereinafter v3, the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 16 and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 17) ) was produced.
  • a point mutation was introduced using QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (manufactured by STRATAG ENE) according to the manufacturer's protocol. After confirming the base sequence of each gene, the DNA fragment was cloned into the expression vector pCXND3 to construct an expression vector, and the gene was introduced into CHO-DG44 cells to produce a stable expression cell line. Specifically, 0.75 mL of CHO-DG44 cells (1 X 107 cells / mL) suspended in PBS mixed with an expression vector (20 / zg) was cooled on ice for 10 minutes and transferred to a cuvette.
  • Pulses were applied using Gene Pulser Xcell (BioRad) at a capacity of 1.5 kV and 25 ⁇ FD. After a recovery period of 10 minutes at room temperature, the cells treated with electoporation were selected by adding to CHO-S-SFMII medium (Invitrogen) containing 500 g / mL Geneticin (Invitrogen), and the vl-producing CHO cell line And a v3 producing CHO cell line was established.
  • CHO-S-SFMII medium Invitrogen
  • Geneticin Invitrogen
  • the VH / VL interface modified sc (Fv) 2 has a Flag tag attached! /, which means that purification from the culture supernatant is an epitope recognized by VB22B sc (Fv) 2.
  • GST fusion protein was used.
  • the MG10 and GST fusion protein was purified using Glutathione Sepharose 4B (Amersham Biosciences) according to the manufacturer's protocol.
  • purified MG10 and GST fusion protein was immobilized on HiTrap NHS-activated HP (Amersham Biosciences) according to the manufacturer's protocol to produce an affinity column.
  • the culture supernatant of vl expressing CHO cell line or v3 expressing CHO cell line is applied to MG10-GST fusion protein fixed column, adsorbed vl or v3, and eluted with lOOmM Glycine-HCl (pH3.5), 0.01% Tween80 I let you.
  • the eluted fraction was immediately neutralized with 1M Tris-HCl (pH 7.4) and subjected to gel filtration chromatography using HiLoad 16/60 Superdex200pg (Amersham Biosciences) to purify the monomer molecule.
  • the structural heterogeneity ratios of the obtained VH / VL interface variants vl and v3 and the unmodified u2-wz4 were analyzed by cation exchange chromatography and isoelectric focusing. Moreover, the structure identification by the protease limited decomposition method was implemented.
  • Isoelectric focusing was performed as follows. PhastGel Dry IEF gel (Amersham Biosciences) was swollen with the following gel swelling solution for 30 minutes or more. The sample was added to the previously swollen gel and electrophoresed by PhastSystem under the following electrophoresis conditions. After electrophoresis, the sample was immersed in a 20% TCA solution for 30 minutes, then washed with milli-Q water for 5 minutes x 3 times or more, and stained with Komashi or silver depending on the protein concentration of the sample. For Kumashi Staining, 0.1% CuSO as the staining solution Dye with 0.02% CBB containing (w / v) and decolorize with 30% methanol containing 10% acetic acid.
  • Silver stain kit Protein (Amersham Biosciences) was used, and staining was performed according to the standard protocol attached to the kit.
  • Step 1 2000V 2.5mA 3.5W 15 ° C 75Vh
  • Step 2 200V 2.5mA 3.5W 15 ° C 15Vh
  • reaction solution was analyzed by gel filtration chromatography under the following conditions.
  • modified v3 shows a low molecular weight peak similar to u2-wz4 purified peakl, and modified vl has a low molecular weight similar to u2-wz4 purified peak2.
  • the modified vl was expressed as a single chain diabody structural isomer, and the modified v3 was expressed as a bivalent scFv structural isomer. .
  • the agonist activity of VH / VL interface variants vl and v3 was evaluated.
  • the peak activity of the sinval chain diabody structure is very high, whereas the peak activity of the bivalent scFv structure is different.
  • the activity is extremely reduced.
  • variant vl showed activity equivalent to peak 2
  • variant v3 showed activity almost equivalent to peakl. From the above, it was confirmed that in the biological activity, the variant vl formed a single chain diabody structure and the variant v3 formed a bivalent s cFv structure.
  • Tm value intermediate denaturation temperature
  • Solution conditions 20 mM sodium citrate, 300 mM NaCl, pH 7.0
  • Solution conditions 20 mM sodium citrate, pH 6.0
  • VH / VL interface modification applied to vl and v3, it can be expressed in the state where only one of the two structural isomers exists. I found it.
  • a VH / VL interface control to obtain a single-chain antibody of the desired structure, a method of controlling the structure of the bispecific diabody using knobs-into-hole technology (Protein Sci 1997 Apr; 6 (4): 781-8, Remodeling domain interfaces to enhance heterodimer forma tion., Zhu Z, Presta LG, Zapata G, Carter P.).
  • the formation rate of the target heterodimer structure increased from 72% to 92% by modifying a total of 4 amino acids per VH / VL interface.
  • the present invention modifies 4 amino acids (2 amino acids per VH / VL interface) to achieve 100% of the target structure without degrading thermostability and structural isomer stability. Successfully acquired at the ratio of
  • the vector obtained by inserting the mouse cytomegaloinores (mCMV) enhancer and promoter and the late polyadul site of simian virus-40 (SV40) into the pUC19 vector was named pMC.
  • mCMV mouse cytomegaloinores
  • SV40 late polyadul site of simian virus-40
  • pMCDN An expression vector in which the DHFR gene expression site of pCHOI and the Neomycin metagene expression site of the restriction enzyme of pCXN (Niwa et al., Gene 1991; 108: 193-200) were inserted into the pMC vector was named pMCDN.
  • the constructed humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 expression vector was linearized with restriction enzymes, and then introduced into CHO-DG44 cells to establish an antibody-expressing cell line.
  • the stable expression cell line was prepared as follows. The gene was introduced into the cells by the electopore position method using GenePulserXcell (Bio-Rad). Mix 0.75 mL of each antibody expression vector and CHO cells (1 X 10 7 cells / mL) suspended in PBS with ice. It was cooled for 10 minutes above, transferred to a cuvette, and then pulsed with a capacity of 1.5 kV and 25 ⁇ FD. After a recovery period of 10 minutes at room temperature, the cells treated with electopore suspension were suspended in 40 mL of CHO-S-SFMII medium (Invitrogen) containing HT supplement (Invitrogen) at a 1-fold concentration. A 10-50-fold diluted solution was prepared with the same medium and dispensed at 100 L / well onto a 96-well culture plate. After incubation for 24 hours in a CO incubator (5% CO 2), Geneticin (Invitro)
  • Human ⁇ anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 is a VH—linker—VL—linker—VH—linker—VL
  • peakl was a single chain diabody type and peak2 was a bivalent scFv type.
  • the human ⁇ anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 has a higher peak2 content than peakl.
  • the bivalent scFv type is the main component, and the single chain diabody type is the minor component.
  • a BaF3 cell line expressing human gpl30 was established as shown below.
  • a human gpl30-expressing BaF3 cell line (hereinafter referred to as “Human interleukin-6 (R & D)”, lOOng / mL human interleukin-6 soluble receptor (R & D systems) and RPMI1640 medium containing 10% FBS were selected. BaF3 / gpl30) was established.
  • IL-6 neutralizing activity was evaluated using BaF3 / gpl30, which shows IL-6-dependent proliferation.
  • the structural isomer of the purified humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 was diluted to 10 g / mL in RPMI1640 containing 10% FBS. Using this solution, a dilution series with a dilution ratio of 3 and a total of 6 series was prepared, and 50 ⁇ L was dispensed into each well of a 96weU-plate (FALCON).
  • the structural isomers (peakl, peak2) of the humanized anti-human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 were neutralized with the purified product (bulk) before fractionation.
  • the activity was comparable.
  • VB2 2B sc (Fv) 2 in Reference Example 1 and hVB22B sc (Fv) 2 in Reference Example 2 there was a large difference in activity between the two structural isomers.
  • the human IL-6 receptor antibody sc (Fv) 2 showed no difference in neutralizing activity.
  • the difference in the activity of the two structural isomers of sc (Fv) 2 may differ depending on the target antigen type and the amino acid sequence of the sc (Fv) 2 molecule.
  • each structural isomer may undergo an isomerization reaction during storage. From the point of view of the quality specifications of the sc (F v) 2 preparation, structural isomer separation and structural identification and Control of structural isomers is considered important.
  • peakl is significantly more active than peak2 which is a single chain diabody. Due to its low nature, peakl, a bivalent scFv, undergoes structural transformation to peak2, a highly active single chain diabody, when incubated at 20 mM sodium acetate, 150 mM NaCl, pH 6.0, 40 ° C (structural isomer It ’s the opposite.
  • Bivalent scFv (peakl) purified from hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 in Reference Example 4 was added to 20 mM sodium citrate, 0 mM / 150 mM / 300 mM NaCl, pH 3.0 / 3.5 / 4.0 / 4.5 / 5.0 / 5.5 / 6.0 / It was incubated at 25 ° C for 10 days under a total of 30 conditions of 6.5 / 7.0 / 7.5. As a result of measuring the peak1 and peak2 ratios by the cation exchange chromatography method shown in Reference Example 1, as shown in FIG. 43, the peak2 abundance ratio was increased compared to before incubation.
  • Stabilizer of the present invention The stability of sc (Fv) 2 can be suppressed by applying the stability condition or lyophilized formulation. That is, it suppresses the mutual isomerism reaction between the two structural isomers in the sc (Fv) 2 composition, allows one of the structural isomers to exist stably, and sc (Fv) It was possible to suppress the isomerization reaction of a specific structural isomer obtained from the two compositions and to allow the heterogeneous substance to exist stably.

Abstract

　本発明者らは、 sc(Fv)2の異性化反応を抑制する安定化剤・安定化条件を見出した。また、凍結乾燥製剤化することで上記異性化反応を抑制できることを見出した。すなわち、見出された安定化剤・安定化条件、または凍結乾燥製剤化を適用することで、sc(Fv)2型分子のbivalent scFv型からsingle chain diabody型への異性化反応、および/あるいは、single chain diabody型からbivalent scFv型への異性化反応の両方向あるいは一方向の異性化反応を抑制することが可能であることを明らかにした。

Description

明 細 書
sc(Fv)2を含有する医薬組成物
技術分野
[0001] 本発明は、 sc(Fv)2を含有する医薬組成物およびその製造方法に関する。さらに詳 しくは異性化反応が抑制された sc(Fv)2を含有する医薬組成物およびその製造方法 に関する。
背景技術
[0002] sc(Fv)2は 2つの軽鎖可変領域 (VL)と 2つの重鎖可変領域 (VH)の 4つの可変領域 をリンカ一などで結合して一本鎖にした抗体である（Hudson et al、 J Immunol. Metho ds 1999 ; 231 : 177-189)。
[0003] 例えば、 VHl- linker- VL2- linker- VH3- linker- VL4や VL2- linker- VHl- linker- VL4 - linker_VH3の配列を有する一本鎖抗体が知られている。 sc(Fv)2の構造は、 Fv(VH, VL間で非共有結合した分子）の組み合わせにより、 VH1と VL2、 VH3と VL4がそれぞ れ Fvを形成する sc(Fv)2と、 VH1と VL4、 VH3と VL2がそれぞれ Fvを形成する sc(Fv)2 の 2種類の構造異性体が存在すると考えられる。
しかしながら、これまで、 sc(Fv)2の研究は Bispecific sc(Fv)2に関するものが多かつ た為、 sc(Fv)2の構造異性体にっ ヽてはほとんど報告がな!、。
[0004] Bispecific sc(Fv)2は、 VHl- linker- VL2- linker- VH3- linker- VL4の配列にお!、て、 V HIと VL4、および、 VH3と VL2 (あるいは VHlと VL2、および、 VH3と VL4)が異なるモノ クローナル抗体由来の可変領域をもつ sc(Fv)2である。 Bispecific sc(Fv)2の場合には 、 VH1と VL4、または、 VH3と VL2 (あるいは VH1と VL2、または、 VH3と VL4)が同じモ ノクローナル抗体由来であることから Fvを形成する効率が高くなり、構造異性体の出 現はある程度抑制されると考えられる。実際に、リンカ一長を 15-5-15と 15-15-15の bi specific sc(Fv)2を作製しても、活性は変らないことが報告されている (非特許文献 5) 。従って、 Bispecific sc(Fv)2の場合は構造異性体に関しては詳細な言及がされてい ないことが多い。例えば、非特許文献 3、 4、 8、 9は、 bispecificな結合活性を確認する ことにより正しい組み合わせの Fvが存在することは示している力 正しくない Fvの組 み合わせの存在比率や両者の存在比の定量的な評価に関する記載はな 、。また、 非特許文献 6は、 Bispecific sc(Fv)2のリンカ一の長さを変化させること（両端あるいは 中央のリンカ一の長さの改変）〖こより、 monomer, dimerの構造変換を確認しているが 、 sc(Fv)2の構造異性体にっ 、ては分子構造モデル予測での議論に留まっており、 実際の試料における構造異性体の存在比率や構造の同定に関する記載はない。
[0005] また、 sc(FV)2の構造異性体にっ 、て着目されて 、な力つたので、構造異性体の制 御についても詳細な検討はなされていない。非特許文献 10においても、リンカ一の 長さを 5-15-5あるいは 15-5-15にすることで、それぞれ single chain diabodyあるいは b ivalent scFvの構造を取ることを予測している。これは、 scFvにおいてリンカ一の長さ が 12以下の場合、一般的に隣り合う VHと VLは Fvを形成しにくい（つまり monomerを形 成しにくい）ことが報告されているためである。し力しながら、非特許文献 2において、 リンカ一の長さが 10あるいは 5の Fvにおいても少量だが monomerが形成することが報 告されており、非特許文献 10におけるリンカ一の長さを 5-15-5あるいは 15- 5-15の場 合においても、得られた sc(Fv)2は必ずしも 100%の single chain diabodyあるいは bival ent scFvの構造であるとは限らない。
[0006] これまでの報告では構造異性体に関しては Fvの組み合わせとリンカ一の長さから の構造予測のみで、構造異性体の含有比率の定量的分析や得られた構造が目的の 構造であるかどうかの確認'証明は行われておらず、構造異性体が十分に評価およ び制御されているとは言えない。すなわち、いかなるリンカ一の長さの sc(Fv)2におい ても、 Fvの組み合わせとリンカ一の長さからは構造異性体の存在比を予測することは 極めて困難であり、 2組の VH、 VLを有する sc(Fv)2型分子においては 2つの構造異性 体の存在は考えなければならない問題である。
[0007] 低分子化合物に関しては、光学異性体や幾何異性体の分離方法は多数知られて いるが、これまでにタンパク質の異性体を分離する方法は報告されていない。タンパ ク質の 1アミノ酸の違いを分離するような方法はすでに多数報告されている力 完全 に同一なアミノ酸一次配列を有する 2つの構造的な異性体を分離する方法はこれま でに報告がない。 sc(Fv)2の構造異性体に関しても同様で、従来技術では sc(Fv)2の 2 種類の構造異性体の分離分析法、確認方法はこれまでに存在しなカゝつた。 [0008] これまでに sc(Fv)2の構造異性体の分離方法が存在しな力つたことから、 2種類の構 造異性体の間での活性の違いに着目した報告はない。 Bispecific sc(Fv)2においては 、構造異性体により正し 、Fvの組み合わせと正しくな 、Fvの組み合わせの間で活性 が大きく異なることは当然予想される力 Monospecific sc(Fv)2においては、同じ 2価 である構造異性体間で活性の違いに関しては予想し難 、。非特許文献 10にお 、て は、 2つの構造異性体間で活性が異なる可能性は考えず、活性 (結合活性)は構造 異性体の混合物で測定して!/、る。これは sc(Fv)2の構造異性体の分離精製の困難さ から、それぞれの構造異性体を高純度に調製し活性を厳密に比較することができな かったためである。
[0009] リンカ一の長さを改変した sc(Fv)2においても、リンカ一の長さ力も想定される 2つの 構造異性体をそれぞれモデル予測ではなぐ同定"し、その構造異性体の含有比率 を定量的に評価することはこれまで不可能であった。そのため、 sc(Fv)2のリンカ一の 長さと構造異性体の含有比率の関係を明らかにした定量的な検討はこれまで実施さ れておらず、実質的にリンカ一の長さにより構造異性体の含有比率をコントロールし た報告はない。
[0010] リンカ一の長さを変化させることは sc(Fv)2の 2つの抗原結合部位間の距離を変える ことになることから、リンカ一の長さはその生物活性 (特にレセプターを二量体ィ匕する ようなァゴ-スト活性）に影響する可能性がある。そのため抗原の種類により、 2つの 抗原結合部位間距離はリンカ一の長さによって任意に調節可能であることが望まし い。また、リンカ一の長さは安定性に大きく影響を及ぼすことが報告されており（非特 許文献 1、非特許文献 2)、 scFvでは一般にリンカ一が短いほど安定性が低いことが 知られている。 sc(Fv)2においても同様に考えられ、中央のリンカ一を短くすることによ つて、会合体 (dimer)が生成しやすくなることが報告されており（非特許文献 6)、安定 性の高い sc(Fv)2を作製するためにはリンカ一の長さは任意に調節可能であることが 望ましい。このようなこと力ら、 sc(Fv)2を医薬品として開発する場合、任意のリンカ一 の長さにおいて目的の構造異性体を単離できることが望ましいと考えられる。しかし ながら、これまで任意のリンカ一長を持つ sc(Fv)2において、 bivalent scFvと single cha in diabodyの 2種類の構造異性体をそれぞれ単離した報告はな ヽ。 [0011] すでに、抗ヒト Mpl抗体の sc(Fv)2が TPO様ァゴ-スト活性を示すことが報告され、 sc( Fv)2が医薬品になりうることが明らかになつている (非特許文献 12)。構造異性体を含 む sc(Fv)2を医薬品として開発するためには、目的の構造異性体のみを分離精製し、 構造異性体の一方のみを含む原薬を製造すること、あるいは、原薬が構造異性体混 合物の場合には、 2種類の構造異性体の性質を決定し、各構造異性体の含有比率 を定量的に分析する規格試験を実施することが必要となる。しカゝしながら、これまで (Fv)2の構造異性体の分離精製，定量的分析'構造同定する方法は知られていない
[0012] また、リンカ一の長さによる scFvの monomer/dimer/trimer/tetramerの存在比率を制 御する方法が報告されている力 sc(Fv)2の構造異性体に関しては、上述のとおり、 構造異性体の定量的分析法が見出されていないため、リンカ一の長さによる構造異 性体存在比率の制御方法はこれまでに報告されて！ヽな ヽ。
[0013] 非特許文献 1： Protein Engineering, 1993, 6(8), 989-995
非特許文献 2 : Protein Engineering, 1994, 7(8), 1027-1033
非特許文献 3 Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374
非特許文献 4 Journal of Immunology, 1995, 154, 4576-4582
非特許文献 5 : PNAS, 1995, 92, 7021-7025
非特許文献 6 Journal of Molecular Biology, 1999, 293, 41-56
非特許文献 7 : Protein Engineering, 2001, 14(10), 815-823
非特許文献 8 Journal of Molecular Biology, 2003, 330, 99-111
非特許文献 9 : Protein Eng Des Sel. 2004 Apr;17(4):357- 66
非特許文献 10 : Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281
非特許文献 11 : Int. J. Cancer, 1998, 77, 763-772
非特許文献 12 : Blood, 2005, 105, 562-566
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0014] PCT/JP06/306800にお!/、て、 sc(Fv)2組成物中の 2種の構造異性体である bivalent scFvと single chain diabodyを分離取得する方法、分離された 2種の構造異性体の構 造を同定する方法、及び、 2種の構造異性体を定量的に分析する方法が提供された 。またリンカ一長を調節することにより sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の割合 を増加させる方法が提供された。これらの方法を利用することにより、 sc(Fv)2の特定 の構造異性体を有効成分として含有する医薬組成物を製造することができ、従来と 比較して高活性の医薬組成物を提供することが可能となった。また、医薬品としての 開発に必要な規格試験により、構造が同定された構造異性体の含有比率を規定し た sc(Fv)2を医薬品組成物として提供することが可能となった。
[0015] 一方、 2種類の構造異性体を取りうる sc(Fv)2を医薬品として開発するにあたっては、 目的の構造異性体が、医薬品原薬および製剤において安定に存在する必要がある 。一般にタンパク質の劣化経路としては、可溶性の多量体の形成や沈殿'不溶物の 生成等のタンパク質分子の物理的会合ィ匕に伴う劣化経路 (Int. J. Pharm. 2005, 289, 1-30)と、加水分解'脱アミドィ匕反応'メチォニン酸ィ匕反応等による化学的修飾による 劣化経路（Int. J. Pharm. 1999, 185, 129-188)が知られている。医薬品としてタンパク 質を開発するにあたっては、これら両方の劣化経路を最小限に抑え、保存中にその タンパク質の生物学的活性の低下が起こらな ヽ製剤を提供する必要がある。このよう な劣化経路を最小限に抑制する方法として、溶液 pHの最適化、緩衝液'塩の種類と 濃度、安定化剤の種類と濃度の最適化が行われる。
[0016] 本発明者らは、 2種類の構造異性体を取りうる sc(Fv)2に 2種類の構造異性体の間で 相互に構造変換（異性化）すること、すなわち、 bivalent scFv型から single chain diabo dy型への構造変換反応（異性化反応）、及び、 single chain diabody型から bivalent sc Fv型への構造変換反応 (異性ィ匕反応)が起こることを見出した (図 1)。タンパク質 2分 子間の monomer/dimerの平衡反応はすでに報告されており、抗体の IgG分子では Bio chemistry, 1999, 38, 13960- 13967において monomerと dimerが可逆的な平衡状態と して存在していることが報告されている。単分子内の平衡反応としては、 Science. 200 3, 299(5611), 1362-7において抗体の IgG分子の CDR領域において 2種類の CDRル ープ構造が可逆的な平衡状態として存在して 、ることが報告されて 、る。これは抗体 の全体構造のうちの CDR部位の局所的な異性ィ匕反応であり、この 2種類の異性体を 溶液中で安定に分離することはできない。また、 Biochemistry, 1996, 35, 1897-1903 において抗体の IgG分子のァスパラギン酸残基力 ソァスパラギン酸残基に異性ィ匕 することが報告されている。これは抗体中の 1アミノ酸の化学的な異性ィ匕反応であり、 この異性ィ匕反応はタンパク質の一次配列の変化を伴う。このような異性ィ匕反応とは異 なり、本発明者らが見出した sc(Fv)2型分子のこのようなタンパク質単分子の全体的な 立体構造変化を伴う相互異性ィ匕反応はこれまでに報告がなぐ従来のタンパク質で は見られなかった sc(Fv)2特有の反応であると考えられた。この異性化反応を抑制す ることは、 sc(Fv)2の製剤化における非常に重要な課題である。
[0017] すなわち、 bivalent scFv型と single chain diabody型で活性が異なる場合（例えば、ヒ ト化抗ヒト Mpl抗体 hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2やマウス抗ヒト Mpl抗体 mVB22B sc(Fv)2に おいては single chain diabody型に比べて bivalent scFv型のァゴ-スト活性が極めて 低 ヽ： PCT/JP06/306800)、製剤保存中の異性化反応は活性の変化を意味すること から、 sc(Fv)2においては上述の会合化と化学修飾による劣化経路に加えて、従来の タンパク質では報告されていない異性ィ匕反応による劣化経路が存在することが明ら 力となった。また、 bivalent scFv型と single chain diabody型で活性が同等である場合 にも、製剤保存中に異性化反応が進行することは保存前後で含有する構造異性体 含有比率が変化することを意味し、好ましくない。
[0018] 本発明者らが見出した sc(Fv)2型分子の構造異性体間の相互異性ィ匕反応は、全て の sc(Fv)2型分子で起こりうると考えられ、そのため sc(Fv)2型分子を医薬品として開発 するためには、この異性ィ匕反応を抑制することが必須である。し力しながら、これまで このような異性ィ匕反応を抑制する方法は報告されて 、な 、。
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、異性化反応が 抑制された sc(Fv)2を含有する安定化製剤等を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0019] 本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、 sc(Fv)2の異 性ィ匕反応を抑制する安定化剤，安定ィ匕条件を見出した。また、凍結乾燥製剤化する ことで上記異性ィ匕反応を抑制できることを見出した。すなわち、見出された安定化剤 '安定化条件、または凍結乾燥製剤化を適用することで、 sc(Fv)2型分子の bivalent s cFv型から single chain diabody型への異性化反応、および/あるいは、 single chain di abody型力 bivalent scFv型への異性化反応の両方向あるいは一方向の異性化反 応を抑制することが可能であることを明らかにした。
本発明は、以下の〔1〕〜〔43〕を提供するものである。
〔1〕塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、 pH調整剤からなる群より選択される少なく とも 1つの物質を添加した、 sc(Fv)2を含有する医薬組成物。
〔2〕塩力 塩ィ匕ナトリウムおよび塩ィ匕マグネシウム力もなる群より選択される少なくとも
1つの塩である、〔1〕に記載の医薬組成物。
〔3〕アミノ糖力 メダルミンである、〔1〕に記載の医薬組成物。
〔4〕糖アルコール力 マン-トールである、〔1〕に記載の医薬組成物。
〔5〕アミノ酸力 リジンである、〔1〕に記載の医薬組成物。
〔6〕 pH調整剤が、クェン酸ナトリウム緩衝液およびヒスチジン塩酸塩カゝらなる群より選 択される少なくとも 1つの pH調整剤である、〔1〕に記載の医薬組成物。
〔7〕 !"1が4.5〜9.0でぁることを特徴とする、3(^ 2を含有する医薬組成物。
〔8〕 !"1が6.0〜9.0でぁることを特徴とする、3(^ 2を含有する医薬組成物。
〔9〕塩濃度が 50mM〜1000mMであることを特徴とする、 sc(Fv)2を含有する医薬組成 物。
〔10〕剤形が凍結乾燥製剤であることを特徴とする、〔1〕〜〔9〕のいずれかに記載の 医薬組成物。
〔11〕剤形が凍結乾燥製剤であることを特徴とする、 sc(Fv)2を含有する医薬組成物。
[12] single chain diabody型 sc(Fv)2、または bivalent scFv型 sc(Fv)2を高純度で含む、
〔1〕〜〔11〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔13〕以下の工程を含む sc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
(0 sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii)調製された sc(Fv)2組成物の異性ィ匕反応を抑制する工程。
〔14〕以下の工程を含む sc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
(0 sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii)調製された sc(Fv)2組成物に、塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、 PH調整剤か らなる群より選択される少なくとも 1つの物質を添加する工程。 〔15〕塩が、塩ィ匕ナトリウムおよび塩ィ匕マグネシウム力もなる群より選択される少なくと も 1つの塩である、〔14〕に記載の方法。
〔16〕アミノ糖力 メダルミンである、〔14〕に記載の方法。
〔17〕糖アルコール力 マン-トールである、〔14〕に記載の方法。
〔18〕アミノ酸が、リジンである、〔14〕に記載の方法。
〔19〕 pH調整剤が、クェン酸ナトリウム緩衝液およびヒスチジン塩酸塩力もなる群より 選択される少なくとも 1つの pH調整剤である、〔14〕に記載の方法。
〔20〕以下の工程を含む sc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
(0 sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii)調製された sc(Fv)2組成物の pHを 4.5〜9.0にする工程。
〔21〕以下の工程を含む sc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
(0 sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii)調製された sc(Fv)2組成物の pHを 6.0〜9.0にする工程。
〔22〕以下の工程を含む sc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
(0 sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii)調製された sc(Fv)2組成物の塩濃度を 50mM〜1000mMにする工程。
〔23〕以下の工程を含む sc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
(a) sc(Fv)2組成物を 15°C〜50°C、並びに Zまたは、 pH3.0〜6.0、および Zもしくは、 塩濃度が 500mM以下にてインキュベートすることによって、 single chain diabody型の 含有比率力 bivalent scFv型の含有比率より高 、sc(Fv)2組成物を製造する工程
(b)生成した single chain diabody型の sc(Fv)2を取得する工程
(c)工程 (b)で取得した single chain diabody型 sc(Fv)2組成物を安定化させる工程。 〔24〕以下の工程を含む sc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
(a) sc(Fv)2組成物を 15°C〜50°C、並びに Zまたは、 pH3.0〜6.0、および Zもしくは、 塩濃度が 500mM以下にてインキュベートすることによって、 bivalent scFv型の含有比 率が single chain diabody型の含有比率より高い sc(Fv)2組成物を製造する工程
(b)生成した bivalent scFv型の sc(Fv)2を取得する工程
(c)工程 (b)で取得した bivalent scFv型 sc(Fv)2組成物を安定ィ匕させる工程。 〔25〕以下の工程を含む sc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
(0 sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii)調製された sc(Fv)2組成物を凍結乾燥する工程。
〔26〕塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、 pH調整剤からなる群より選択される少な くとも 1つの物質を添加する工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制 する方法。
〔27〕塩が、塩ィ匕ナトリウムおよび塩ィ匕マグネシウム力もなる群より選択される少なくと も 1つの塩である、〔26〕に記載の方法。
〔28〕アミノ糖力 メダルミンである、〔26〕に記載の方法。
〔29〕糖アルコール力 マン-トールである、〔26〕に記載の方法。
〔30〕アミノ酸力 リジンである、〔26〕に記載の方法。
〔31〕 pH調整剤が、クェン酸ナトリウム緩衝液およびヒスチジン塩酸塩カゝらなる群より 選択される少なくとも 1つの pH調整剤である、〔26〕に記載の方法。
〔32〕pHを 4.5〜9.0にする工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制す る方法。
〔33〕pHを 6.0〜9.0にする工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制す る方法。
〔 34〕塩濃度を 50mM〜 1 OOOmMにする工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異 性化を抑制する方法。
〔35〕凍結乾燥する工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制する方 法。
〔36〕医薬組成物中の有効成分力 c(Fv)2である、〔26〕〜〔35〕のいずれかに記載の 方法。
〔37〕塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、 pH調整剤からなる群より選択される少な くとも 1つの物質を含有する、 sc(Fv)2の異性ィ匕反応を抑制するために用いる安定ィ匕 剤。
〔38〕塩が、塩ィ匕ナトリウムおよび塩ィ匕マグネシウム力もなる群より選択される少なくと も 1つの塩である、〔37〕に記載の安定化剤。 〔39〕ァミノ糖が、メダルミンである、〔37〕に記載の安定化剤。
〔40〕糖アルコール力 マン-トールである、〔37〕に記載の安定化剤。
〔41〕アミノ酸が、リジンである、〔37〕に記載の安定化剤。
〔42〕 pH調整剤が、クェン酸ナトリウム緩衝液およびヒスチジン塩酸塩力もなる群より 選択される少なくとも 1つの pH調整剤である、〔37〕に記載の安定化剤。
〔43〕以下の工程を含む、 sc(Fv)2の異性ィ匕反応を抑制する物質のスクリーニング方 法
(0 sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii)調製された sc(Fv)2組成物に被検物質を接触させる工程、
(iii)被検物質の接触させた sc(Fv)2組成物において、 sc(Fv)2の異性ィ匕反応の抑制の 有無を測定する工程、
(iv) sc(Fv)2の異性化反応を抑制する物質を選択する工程。
図面の簡単な説明
[図 l]sc(Fv)2の異性ィ匕反応を示す模式図である。
[図 2]peakl 91.4%から開始した場合における、 25°C-6weeks後の peaklの割合を示す 図である。
[図 3]peak2 99.6%から開始した場合における、 25°C-6weeks後の peak2の割合を示す 図である。
[図 4]peakl 91.4%から開始した場合における、 25°C- 5days後の peaklの割合を示す図 である。
[図 5]peak2 99.6%から開始した場合における、 25°C- 5days後の peak2の割合を示す図 である。
[図 6]peak2を各条件で 25°C-20days後の peaklの割合を示す図である。
[図 7]peakl〜99%から開始し、各溶液条件における 25°C- 5days後の peak2の割合を 示す図である。
[図 8]intialおよび 40°C-lweek後の bivalent scFvの割合を示す図である。
[図 9A]peaklを 25°C各条件下でインキュベートすることによる peak2への異性化を示す 図である。 [図 9B]ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の initialと、 50°C-10days後の bivalent scFv 型存在比率を示す図である。 PH5.5以上で異性ィ匕反応が抑制可能であることが示さ れた。
[図 10](a) VB22B sc(Fv)2の VH1- linker- VL1- linker- VH2- linker- VL2構造を示す図 である。 (b) VH1- linker- VL1- linker- VH2- linker- VL2構造の 2種類の構造異性体を 示す図である。 VH1/VL1と VH2/VL2がそれぞれ会合した bivalent scFv構造（左）と、 VH1/VL2と VH2/VL1がそれぞれ会合した single chain diabody構造（右）を示す。
[図 l l]peaklと peak2の陰イオン交換クロマトグラフィーよる分離の結果を示す図である
[図 12]peakl、 peak2、 VB22B sc(Fv)2の subtilisin処理前後の還元 SDS- PAGEの結果 を示す写真および図である。得られたバンドの推定構造を右に示した。
[図 13]bivalent scFvと single chain antibodyの構造の違いにより生じる subtilisin限定分 解後の分解パターンの違いを示す図である。 Bivalent scFv構造の場合、点線で囲つ た低分子量断片が生じる。
[図 14]Subtilisinによる peakl、 peak2、 VB22B sc(Fv)2の限定分解後のゲルろ過クロマ トグラフィ一の結果を示す図である。矢印により低分子量ピークの溶出位置を示した。
[図 15]VB22B sc(Fv)2構造異性体の TPO様ァゴ-スト活性評価の結果を示す図であ る。
[図 16]peaklと peak2の陽イオン交換クロマトグラフィーよる分離の結果を示す図である
[図 17]陽イオン交換クロマトグラフィーより分離した peaklと peak2のペプチドマッピング を示す図である。
[図 18]peakl、 peak2、 hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2の subtilisin処理後の還元 SDS- PAGE の結果を示す写真および図である。得られたバンドの構造を右に示した。
[図 19]Subtilisinによる peakl、 peak2、 hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2の限定分解後のゲルろ 過クロマトグラフィーの結果を示す図である。矢印により低分子量ピークの溶出位置 を示した。
[図 20]hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2構造異性体の TPO様ァゴ-スト活性評価の結果を示 す図である。
[図 21]各リンカ一改変体のコンストラクトを示す図である。 Gxxは中央のリンカ一長が X Xであり、 Lxxは両端のリンカ一長が XXであり、それぞれリンカ一として (GGGGS (配列 番号： 7) )n配列を用いたコンストラクトである。 Pxxはリンカ一として (GGPGS (配列番号 : 13))n配列を用いて中央のリンカ一長を XXにしたコンストラクトである。
圆 22]各リンカ一改変体の陰イオン交換クロマトグラフィー分析結果と構造異性体の 得られた存在比率を示す図である。 bivalent scFv型構造のパーセントにより示した。
[図 23]hydroxyapatiteカラムのクロマトグラムと精製画分のゲルろ過クロマトグラフィー 分析の結果を示す図である。
[図 24]SOURCE 15Sカラムのクロマトグラムの分析結果を示す図である。
圆 25]陽イオン交換クロマトグラフィーの分析結果を示す図である。
[図 26]大量精製した hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2 peaklと hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2 peak2 の SDS-PAGEの分析結果を示す写真である。
[図 27]大量精製した hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2 peaklと hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2 peak2 のゲルろ過分析結果を示す図である。
[図 28]u2-wz4、改変体 vl、改変体 v3のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す図で ある。
[図 29]u2-wz4、改変体 vl、改変体 v3の陽イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す 図である。
[図 30]u2- wz4、 u2-wz4精製 peakl、 u2- wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3の等電 点電気泳動の結果を示す写真および図である。
[図 31]u2-wz4精製 peakl、 u2-wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3のプロテアーゼ 限定分解後のゲルろ過クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。
[図 32]u2- wz4精製 peakl、 u2- wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3の TPO様ァゴニ スト活性評価の結果を示す図である。
[図 33]u2-wz4精製 peakl、 u2-wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3の DSC分析の結 果を示す図である。
[図 34]u2-wz4精製 peakl、 u2-wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3の熱加速試験に おけるゲルろ過クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。
[図 35]u2-wz4精製 peakl、 u2-wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3の熱加速試験に おける陽イオン交換クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。
[図 36]ヒト化抗ヒト IL- 6受容体抗体 sc(Fv)2の peaklと peak2の陽イオン交換クロマトグ ラフィーよる分離の結果を示す図である。
[図 37]精製したヒトイ匕抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の peaklと peak2の陽イオン交換 クロマトグラフィーよる分析結果を示す図である。
[図 38]ヒト化抗ヒト IL- 6受容体抗体 sc(Fv)2の peaklと peak2の subtilisin処理後の還元 SDS-PAGEの結果を示す写真である。得られたバンドの推定構造を右に示した。
[図 39]Subtilisinによるヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の peaklと peak2の限定分 解後のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す図である。矢印により低分子量ピー クの溶出位置を示した。
[図 40]ヒト化抗ヒト IL- 6受容体抗体 sc(Fv)2の peaklと peak2の BaF3/gpl30における IL -6中和活性評価の結果を示す図である。
[図 41]VB22B sc(Fv)2の peaklを 20mM sodium acetate, 150mM NaCl, pH6.0, 40°Cで インキュベートした試料の陰イオン交換クロマトグラフィー分析し経時的に peak2が増 加することを示した図である。
[図 42]VB22B sc(Fv)2の peakl、 peak2、及び、 40°Cで 6日間 incubateした試料のァゴ- スト活性を評価し、 peaklが peak2に異性ィ匕することによって活性が増加することを確 認した図である。
[図 43]hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の peaklを 25°Cで 10日間、各条件下で incubateするこ とによる peak2への異性ィ匕を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、 sc(Fv)2の構造異性体を解析する過程で、 2種の構造異性体である b ivalent scFvと single chain diabodyが相互に構造変換 (異性化）することを見出した（ 図 1)。さらに、この構造異性体間の相互異性ィ匕反応を抑制する安定化剤を見出した 。本発明は、これら知見に基づくものである。
本発明は、塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、および pH調整剤からなる群より選 択される少なくとも 1つの物質を添加した、 sc(Fv)2を含有する医薬組成物を提供する
[0023] 本発明の医薬組成物は、目的の構造異性体を安定に存在させ、他の構造異性体 への異性化を最小限に抑制した安定化製剤であり、医薬分野において、大変有用 である。
本発明にお 、て sc(Fv)2は、 4つ以上の抗体可変領域をリンカ一等で結合して一本 鎖にした低分子化抗体である。例えば、 [可変領域 1] (リンカ一 1) [可変領域 2] (リンカ 一 2) [可変領域 3] (リンカ一 3) [可変領域 4]の順に並んでいることを特徴とする抗体が 挙げられる。
[0024] また、通常、 sc(Fv)2は 2つの VLと 2つの VHの 4つの可変領域をリンカ一などで結合 して一本鎖にした抗体である（Hudson et al、 J Immunol. Methods 1999 ; 231 : 177-189 )。この 2つの VHと VLは異なるモノクローナル抗体由来であってもよい。例えば、 Jour nal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374に開示されるような 2種類の抗原、あるい は 2種類のェピトープを認識する二重特異性 (bispecific) sc(Fv)2が挙げられる。
sc(Fv)2は、当業者に公知の方法で作製することができ、例えば、 scFvをリンカ一で 結ぶことによって作製できる。 scFvには、抗体の VHおよび VLが含まれ、これらの領域 は単一のポリペプチド鎖中に存在する（scFvの総説については、 Pluckthun『The Pha rmacology of Monoclonal AntibomesJVol.l lj (Rosenburg and Moore ed (Springer Ve rlag, New York) pp.269-315, 1994)を参照）。
[0025] また、本発明の sc(Fv)2としては、 2つの VH及び 2つの VL力 一本鎖ポリペプチドの N末端側を基点として VH、 VL、 VH、 VL ( [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [V L] )の順に並んでいることを特徴とする抗体が挙げられる力 2つの VHと 2つの VLの 順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば 以下のような、配置も挙げることができる。
[VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]
[VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]
[VH]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VL]
[VL]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VH] [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]
本発明の sc(Fv)2は抗体可変領域、リンカ一以外のアミノ酸配列を含んで 、てもよ!/ヽ
[0026] 本発明で用いられる抗体の可変領域は、可変領域の全長でもよいが、抗原への結 合活性を維持する限り可変領域の部分配列でもよい。又、可変領域中のアミノ酸配 列は置換、欠失、付加、挿入などがされていてもよい。例えば、抗原性を低下させる ために、キメラ化ゃヒト化されていてもよい。
また本発明の sc(Fv)2は、その N末端あるいは C末端に IgGの Fc部分等の別のタンパ ク質を融合してもよい（Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281)。融合するタ ンパク質は当業者が適宜選択することができる。また本発明の sc(Fv)2は、 PEG等の キャリアー高分子ゃ抗がん剤等の有機化合物をコンジュゲートしてもよい。また糖鎖 付加配列を挿入し、糖鎖を付加してもよい。
[0027] 抗体の可変領域を結合するリンカ一としては、遺伝子工学により導入し得る任意の ペプチドリンカ一、又は合成化合物リンカ一（例えば、 Protein Engineering, 9(3), 299 -305, 1996参照）に開示されるリンカ一等を用いることができる力 本発明においては ペプチドリンカ一が好ましい。ペプチドリンカ一の長さは特に限定されず、 目的に応じ て当業者が適宜選択することが可能であるが、好ましい長さは 5アミノ酸以上 (上限は 特に限定されないが、通常、 30アミノ酸以下、好ましくは 20アミノ酸以下)であり、特に 好ましくは 15アミノ酸である。 sc(Fv)2に 3つのペプチドリンカ一が含まれる場合には、 全て同じ長さのペプチドリンカ一を用いてもよいし、異なる長さのペプチドリンカ一を もちいてもよい。
[0028] 例えば、ペプチドリンカ一の場合：
Ser
Gly Ser
Gly Gly Ser
Sef uly uly
Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号： 5)
Ser · Gly · Gly · Gly (配列番号： 6) Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号： 7)
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号： 8)
Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号： 9)
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号： 10)
Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号：11)
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号： 12)
(Gly Gly Gly Gly Ser (配列番号： 7) )n
(Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号： 8) )n
[nは 1以上の整数である]等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカ一の長さや 配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
[0029] 合成化学物リンカ一 (ィ匕学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋 剤、例えば N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS)、ジスクシンイミジルスべレート（DSS)、ビ ス（スルホスクシンィミジル)スべレート（BS3)、ジチォビス（スクシンィミジルプロビオネ ート）（DSP)、ジチオピス（スルホスクシンィミジルプロピオネート）（DTSSP)、エチレン グリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS)、エチレングリコールビス（スルホ スクシンイミジルスクシネート）（スルホー EGS)、ジスクシンィミジル酒石酸塩（DST)、 ジスルホスクシンィミジル酒石酸塩 (スルホー DST)、ビス [2- (スクシンイミドォキシカ ルポ-ルォキシ）ェチル]スルホン（BSOCOES)、ビス [2- (スルホスクシンイミドォキシ カルボ-ルォキシ）ェチル]スルホン (スルホ- BSOCOES)などであり、これらの架橋剤 は市販されている。
4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、 3つのリンカ一が必要となる力 全 て同じリンカ一を用いてもょ 、し、異なるリンカ一を用いてもょ 、。
[0030] 本発明にお 、て医薬組成物とは、 sc(Fv)2を含有する組成物であって、疾患の治療 •予防などの為にヒトに投与されることを目的とした医薬品組成物を意味する。構造異 性体を含む sc(Fv)2を医薬品として開発するためには、目的の構造異性体を高純度 で分離精製し、分離精製された構造異性体を高純度に含む原薬を製造すること、ま た、目的の構造異性体の割合を高めることで、該構造異性体を高純度に含む原薬を 製造することが望ま U、。一方の構造異性体を高純度に含む sc(Fv)2を取得する方法 として、 PCT/JP06/306800において、 sc(Fv)2組成物中の 2種の構造異性体である biv alent scFvと single chain diabodyを分離取得する方法、分離された 2種の構造異性体 の構造を同定する方法、及び、 2種の構造異性体を定量的に分析する方法が提供さ れた。具体的には、 PCT/JP06/306800に示されたとおり、 2種の構造異性体の混合 物からイオン交換クロマトグラフィー等を用いることにより、一方の構造異性体を高純 度に精製する方法がある。一方の構造異性体が高純度に精製された力どうかは、ィ オン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、および、プロテアーゼによる限定分解 により確認可能である。あるいは PCT/JP06/306800に示されたとおり、 2種の構造異 性体の混合物を特定の緩衝液条件 ·温度にぉ 、てインキュベートすることで、一方の 構造異性体の純度を高めることが可能である。また、 PCT/JP06/306800に示されたと おり、 sc(Fv)2のリンカ一の長さを調節したり、 VH/VL界面改変型 sc(Fv)2を作製するこ とにより、一方の構造異性体の純度を高めることが可能である。一方の構造異性体を 高純度に含む本発明の医薬組成物は、異性化反応が抑制された sc(Fv)2を含有する ことが好ましい。
[0031] 本発明における「異性ィ匕反応」とは、 sc(Fv)2の分子内の構造変換反応、すなわち、 1) bivalent scFv型力ら single chain diabody型への構造変換反 J心、 2) single chain dia body型から bivalent scFv型への構造変換反応、並びに、 3) bivalent scFv型から singl e chain diabody型、および single chain diabody型力ら bivalent scFv型へのネ目互構造 変換反応 (相互異性化反応)を意味する（図 1)。
[0032] また、本発明の「抑制」には、異性ィ匕反応の「完全な抑制」だけでなぐ「不完全な抑 制」も含まれる。
sc(Fv)2の異性ィ匕反応の抑制は、当業者に周知の方法によって確認することができ る。例えば、 sc(Fv)2をある条件で一定期間保存後の構造異性体含有比率を、後述 の方法や実施例に記載の方法を用いて分析することでその条件における構造異性 体の異性ィ匕を評価することができ、その条件下において異性ィ匕反応が抑制されたか どうかを確認することができる。
[0033] 本発明の医薬組成物は、塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、 pH調整剤からなる 群より選択される少なくとも 1つの物質と sc(Fv)2組成物を混合することで製造できる。 例えば、 sc(Fv)2組成物に該物質を添加することによって、また該物質に sc(Fv)2組成 物を添加することによって製造することができる。
本発明の塩としては、特に制限はなぐ例えば、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カルシウム、グ ルコン酸カルシウム、塩化マグネシウム、ダルコン酸マグネシウムが挙げられる。
[0034] また、本発明のアミノ糖としては、メダルミン (meglumine)が例示できる力 これに限 定されな 、（なお、メダルミンは糖アルコールにも分類される）。
本発明において、「メダルミン」とは、別名 N-メチルダルカミン、化学式 1-Deoxy-l- methylamino-D-glucitolおよび、以下の化学式で示される化合物である。
[0035] [化 1]
Figure imgf000019_0001
1 -デォキシ- 1 -メチルァミノ- D-グルシ I ル
[0036] 本発明にお 、て「メダルミン」には、メダルミン誘導体やメダルミンの塩等が含まれる 。メダルミン誘導体やメダルミンの塩としては、アミドドリゾ酸メダルミン、アミドドリゾ酸 ナトリウムメダルミン、カドペンテト酸メダルミン、ガドテル酸メダルミン、ィオタラム酸メ グノレミン、ィォトロタス酸メダルミン、ガドベン酸メダルミン、ョードキサム酸メダルミン、 フルニキシンメダルミン、メグルミンアンチモネート、ガストログラフイン (メダルミン硫酸 塩)等を挙げることが出来るがこれらに限定されるものではない。また、上記のメグルミ ンの水酸基、アミノ基等が、化学的に修飾を受けたものも、本発明のメダルミンに含ま れる。
[0037] また、本発明の糖アルコールとしては、例えばマン-トール、ソルビトール、キシリト ール、ペンタエリスリトール、イノシトール、メダルミンが挙げられる力 これらに制限さ れるものではない。また、本発明のアミノ酸は、以下を例示できるが、これらに限定さ れるものではない。塩基性アミノ酸としては、例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン、 オル-チン等であることができ、アミノ酸は好ましくはその無機塩の形 (好ましくは、塩 酸塩、リン酸塩の形、すなわちリン酸アミノ酸として）で使用される。 [0038] 遊離アミノ酸が使用される場合、好ましい pH値は、適当な生理的に許容される緩衝 物質、例えば無機酸、特に塩酸、リン酸、硫酸、酢酸、蟻酸又はこれらの塩の添加に より調整される。この場合、リン酸塩の使用は、特に安定な凍結乾燥物が得られる点 で特に有利である。調製物が有機酸、例えばリンゴ酸、酒石酸、クェン酸、コハク酸、 フマル酸等を実質的に含有しない場合あるいは対応する陰イオン（リンゴ酸イオン、 酒石酸イオン、クェン酸イオン、コハク酸イオン、フマル酸イオン等）が存在しない場 合に、特に有利である。 好ましいアミノ酸はアルギニン、リジン又はオル-チンである
[0039] また、酸性アミノ酸としては、グルタミン酸及びァスパラギン酸、及びその塩の形 (好 ましくはナトリウム塩）が例示できる。また、中性アミノ酸としては、例えばイソロイシン、 ロイシン、ァラニン、グリシン、セリン、スレオ-ン、ノ リン、メチォニン、及びシスティン 、芳香族アミノ酸としては、例えばフエ-ルァラニン、チロシン又はトリプトファン、 N-ァ セチルトリブトファンを使用することもできる。
[0040] また、本発明の pH調整剤は、酸またはアルカリによって変化させた pHを適切に調 整するための緩衝物質または緩衝液を意味する。本発明の pH調整剤としては、リン 酸、クェン酸緩衝液 (例えばクェン酸ナトリウム緩衝液など）、ヒスチジン塩酸塩、酢酸 、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸等 他の有機酸等、あるいは、トリス緩衝液（ 例えばトリス塩酸緩衝液など）、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液、炭酸緩衝液 、乳酸、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、ダルコン酸、力プリル酸、デォキシコール酸 、サリチル酸、トリエタノールァミン緩衝液などの溶液製剤の分野で公知の水性緩衝 液が例示できる力 これらに制限されるものではない。緩衝液の濃度は一般には 1〜 500mMであり、好ましくは 5〜100mMであり、さらに好ましくは 10〜20mMである。 本発明の医薬組成物中の sc(Fv)2の異性ィ匕を抑制し安定に保存するためには、本 発明の医薬組成物中における本発明の塩の濃度は 50mM〜1000mMの範囲であるこ と力 子ましく、より好ましくは 150mM〜300mMの範囲であることが好ましいが、これに 限定されるものではない。 pH値は 4.5〜9.0の範囲であることが好ましぐより好ましく は 6.0〜9.0の範囲であることが好ましいが、これに限定されない。
また、本発明の医薬組成物におけるアミノ糖、糖アルコール、およびアミノ酸の最終 濃度としては、特に制限はないが、それぞれ、 lmM〜500mM、 lmM〜500mM、 ImM 〜500mMの範囲が挙げられる。
[0041] 本発明の医薬組成物には、上記物質以外に、薬学的に許容される担体が含まれて もよい。薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、 賦形剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤 (EDTA等)、結合剤等を挙げることができる
[0042] 本発明にお 、て、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例 えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート 等のソルビタン脂肪酸エステル;グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、 グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル;デカグリセリルモノステアレ ート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂 肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソル ビタンモノォレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシェチ レンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキ シエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステ ル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテト ラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレング リセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレ ングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシェ チレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシェチレ ンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピル エーテノレ、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチノレエーテノレ等のポリオキシェ チレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシェチェレンノニルフエニル エーテル等のポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマ シ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオ キシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシェチ レンミツロウ誘導体;ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体 ；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等の HLB 6〜 18を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。
[0043] また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチル 硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ォレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数 10〜 18のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム 等の、エチレンォキシドの平均付加モル数が 2〜4でアルキル基の炭素原子数が 10 〜 18であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エス テルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が 8〜18のアルキルスルホコハク酸ェ ステル塩;天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセ口リン脂質;スフインゴミエリ ン等のスフインゴリン脂質;炭素原子数 12〜18の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等 を典型的例として挙げることができる。
[0044] 本発明の医薬組成物には、これらの界面活性剤の 1種または 2種以上を組み合わ せて添加することができる。本発明の医薬組成物で使用する好ま ヽ界面活性剤は 、ポリソルベート 20, 40, 60又は 80などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エス テルであり、ポリソルベート 20及び 80力特に好ましい。また、ポロキサマー（プルロニ ック F— 68 (登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレング リコールも好ましい。
界面活性剤の添加量は使用する界面活性剤の種類により異なる力 ポリソルベート 20又はポリソルベート 80の場合では、一般には 0.001〜100mg/mLであり、好ましくは 0.003〜50mg/mLであり、さらに好ましくは 0.005〜2mg/mLである。
また、本発明の医薬組成物は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン 、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物を含ん でいてもよい。
本発明において、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン 、グノレコース、フラクトース、ラタトース、キシロース、マンノース、マノレトース、スクロー ス，トレハロース、ラフイノース等を挙げることができる。
[0045] 注射用の水溶液とする場合には、例えばブドウ糖等の等張液が挙げられ、適当な 溶解補助剤、例えばアルコール (エタノール等)、ポリアルコール (プロピレングリコール 、 PEG等)、非イオン性界面活性剤 (ポリソルベート 80、 HCO- 50)等と併用してもよい。 所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を 含有してちょい。
本発明において、含硫還元剤としては、例えば、 N—ァセチルシスティン、 N—ァセ チルホモシスティン、チォタト酸、チォジグリコール、チォエタノールァミン、チォグリ セロール、チォソルビトール、チォグリコール酸及びその塩、チォ硫酸ナトリウム、グ ルタチオン、並びに炭素原子数 1〜7のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有す るもの等を挙げることができる。
[0046] また、本発明にお 、て酸ィ匕防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒド ロキシトルエン、ブチルヒドロキシァ-ソール、 —トコフエロール、酢酸トコフエロール 、 L—ァスコルビン酸及びその塩、 L—ァスコルビン酸パルミテート、 L—ァスコルビン 酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリァミル、没食 子酸プロピルあるいはエチレンジァミン四酢酸ニナトリウム（EDTA)、ピロリン酸ナトリ ゥム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤を挙げることが出来る。
また、必要に応じ、マイクロカプセル (ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ^ チルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシス テム (リボソーム、アルブミンミクロスフエア、マイクロエマルジヨン、ナノ粒子及びナノ力 プセノレ等)とすることもできる ( Remington s Pharmaceutical science loth edition , Osl o Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明 に適用し得る (Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167—277; Langer, Chem . Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第 3,773,919号;欧州特許出願公開 (EP)第 58,481 号； Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556;EP^133,988^-)0
[0047] 本発明の医薬組成物の形態 (剤形)としては、注射剤形、凍結乾燥剤形、溶液剤形 などが例示できる力 これらに限定されるものではない。
患者への投与は経口、非経口投与のいずれでも可能である力 好ましくは非経口 投与であり、例えば、注射投与が可能である。注射投与の例としては、例えば、静脈 内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与す ることができる。また、患者の年齢、症状によって適宜投与方法を選択することができ る。投与量としては、例えば、一回につき体重 lkgあたり O.OOOlmgから lOOOmgの範囲 で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり 0.001〜100000mg/bodyの範 囲で投与量を選ぶことができる。し力しながら、本発明はこれらの投与量および投与 方法等に制限されるものではな 、。
また、 sc(Fv)2を凍結乾燥製剤化やスプレードライによって製剤化することで、異性 化反応が抑制された sc(Fv)2を含有する医薬組成物を製造することもできる。すなわ ち、本発明は、剤形が凍結乾燥製剤やスプレードライ製剤であることを特徴とする上 記医薬組成物 (以下、凍結乾燥製剤と称す)もまた提供する。
[0048] 凍結乾燥は、当業者に周知の方法によって実施できる（Pharm Biotechnol, 2002, 1 3, 109-33、 Int J Pharm. 2000, 203(1-2), 1-60、 Pharm Res. 1997, 14(8), 969-75)。 例えば、溶液を凍結乾燥に用いるバイアル等の容器に適当量分注し、凍結庫または 凍結乾燥庫中にて行なうか、またはアセトン Zドライアイス、液体窒素などの冷媒中 に浸漬して行なう。また、実施例に記載の方法によって凍結乾燥することもできる。ま た、スプレードライ製剤化は当業者に周知の方法によって実施できる (J Pharm Sci. 1 998 Nov;87(l l): 1406-1 l) o
本発明の凍結乾燥製剤またはスプレードライ製剤は、使用前に、溶液製剤とするこ とができる。従って、本発明は、本発明の凍結乾燥製剤またはスプレードライ製剤、 および薬学的に許容される担体を含むキットもまた提供する。薬学的に許容される担 体は、本発明の凍結乾燥製剤またはスプレードライ製剤を溶液製剤化できるもので あれば、担体の種類、組み合わせの有無等に制限はないが、薬学的に許容される担 体として、またその一部として、塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、 pH調整剤から なる群より選択される少なくとも 1つの物質を用いることで、溶液製剤中での sc(Fv)2の 異性ィ匕反応を抑制することができる。
[0049] 本発明にお ヽて sc(Fv)2組成物とは、 sc(Fv)2の構造異性体を 1つ含有する組成物、 または sc(Fv)2の構造異性体を複数含有する組成物 (構造異性体混合物)を指す。 sc(Fv)2組成物は、当業者に周知の方法で作製することができる。例えば、 sc(Fv)2 をコードする DNAを挿入したベクターを宿主細胞へ導入し、 sc(Fv)2を発現させ、発現 産物を回収することで、 2種類以上の構造異性体を取りうる sc(Fv)2を作製できる。
[0050] 該ベクターとしては、挿入した DNAを安定に保持するものであれば特に制限されず 、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローユング用ベクターとしては pBluesc riptベクター (Stratagene社製）などが好まし!/、が、巿販の種々のベクターを利用するこ とができる。本発明の sc(Fv)2を生産する目的においてベクターを用いる場合には、 特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養 細胞内、生物個体内で sc(Fv)2を発現するベクターであれば特に制限されないが、例 えば、試験管内発現であれば pBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であれば pET ベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であれば pME18S- FL3ベクター（GenBank Acce ssion No. AB009864)、生物個体であれば pME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-47 2(1988))などが好ましい。ベクターへの本発明の DNAの挿入は、常法により、例えば 、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons, section 1 1.4-11.11)。
[0051] 上記宿主細胞としては特に制限はなぐ 目的に応じて種々の宿主細胞が用いられ る。 sc(Fv)2を発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例:ストレプトコッカ ス、スタフイロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞 (例:酵母、ァス ペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフイラ S2、スポドプテラ SF9)、動物細胞（例： CHO、 COS, HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 HEK293、 Bowesメラノーマ細胞）および植物細胞を 例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿 法、 ノヽノレス し法 (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.、 1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9)、リポフエクタミン法（GIBCO- BR L社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
[0052] sc(Fv)2組成物の回収は、本発明の sc(Fv)2が培地に分泌される場合は、培地を回 収することで実施できる。また、 sc(Fv)2が細胞内に産生される場合は、その細胞をま ず溶解し、その後に sc(Fv)2組成物を回収する。
本発明の sc(Fv)2組成物は、 sc(Fv)2の構造異性体を 1または複数含有する組成物 である限り、どのような状態であってもよぐ例えば、糸且換え細胞培養物等のクルード な状態の組成物、精製された状態の組成物等が例示できるが、これら〖こ制限されるも のではな!/、。また存在する複数の構造異性体の存在比率はどのような比率であって も良いが、好ましくは、後述の方法で取得 (単離)されたものであることが望ましい。
[0053] 本発明において構造異性体とは、アミノ酸配列は同一であるが、立体構造 (二次構 造あるいは三次構造)が異なるタンパク質同士のことをいう。通常、構造異性体同士 では化学的、生物学的、又は物理的性質のうち少なくとも 1つは異なる。
sc(Fv)2における構造異性体としては、例えば、 single chain diabody型と bivalent scF v型の構造異性体が存在する。
[0054] 本発明において single chain diabody型とは、 sc(Fv)2が、 [可変領域 1] (リンカ一 1) [可 変領域 2] (リンカ一 2) [可変領域 3] (リンカ一 3) [可変領域 4]の順で並んで 、る場合、可 変領域 1と可変領域 4が会合し、かつ可変領域 2と可変領域 3が会合した状態の構造 を有する sc(Fv)2をいう。
また、本発明において bivalent scFv型とは、可変領域 1と可変領域 2が会合し、力 つ可変領域 3と可変領域 4が会合した状態の構造を有する sc(Fv)2のことをいう。
[0055] single chain diabody型、 bivalent scFv型としては、例えば図 1に記載の構造を有す る sc(Fv)2が挙げられる。 sc(Fv)2の構造異性体力 ngle chain diabody型または bivalen t scFv型のどちらの構造を有しているかは、後述される構造異性体の同定方法によつ て確認することができる。また、 NMRを用いた解析、結晶構造解析などにより同定す ることがでさる。
医薬組成物の製造に使用する sc(Fv)2組成物は、特定の構造異性体の含有比率が 他の構造異性体の含有比率より高いものが好ましく、 1 ) sc(Fv)2組成物力 取得され た特定の構造異性体、および、 2)特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体 の含有比率より高い sc(Fv)2組成物が例示できる。
上記「特定の構造異性体」とは、 single chain diabody型または bivalent scFv型を意 味し、「他の構造異性体」とは、特定の構造異性体が single chain diabody型であると きは bivalent scFv型、特定の構造異性体が bivalent scFv型であるときは single chain diabody型を意味する。
[0056] 本発明にお 、て、 sc(Fv)2組成物から特定の構造異性体を取得する方法は、当業 者に周知の方法によって実施することができる。例えば、 sc(Fv)2組成物中の構造異 性体を分離し、分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する。すな わち、本発明は、以下の工程を含む方法、および該方法によって製造される医薬組 成物もまた提供するものである。
(a) SC(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(b)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程
(c)工程 (b)で取得された特定の構造異性体および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミ ノ酸、 pH調整剤力もなる群より選択される少なくとも 1つの物質を混合する工程
[0057] 取得 (単離)された特定の構造異性体の純度は、 80%以上、 90%以上、 95%以上、 100%若しくは 100%に近 、ことが好ま U、。 100%に近 、上限は当業者の精製技術 や分析技術に依存するが、例えば、 99.999%、 99.99%、 99.9%、 99%などである。こ こで、純度とは、取得された全ての構造異性体に対する特定の構造異性体の割合を 意味する。
sc(Fv)2組成物中の構造異性体の分離および取得 (精製）は、例えば、 sc(Fv)2組成 物をイオン交換カラムや Hydroxyapatiteカラムにかけ、特定の構造異性体を取得ある いは除去することで行うことができるが、これに制限されず、各種クロマトグラフィー力 ラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリ アクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、キヤビラリ一等電点電気泳動、透 析、再結晶等の当業者に公知の方法により行うことが可能である。
[0058] クロマトグラフィーとしては、例えばイオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフ ィー、等電点クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、疎水性クロマトグ ラフィー、ァフィ-ティークロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Puri fication ana Characterization: A Laboratoryし ourse Manual. ti,d Daniel R. Marshak e t al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。クロマトグラフィーは、液ネ目クロマ トグラフィー、例えば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができ る。
イオン交換クロマトグラフィーを用いる場合、使用されるイオン交換カラムの種類は 特に制限されず、陽イオン交換カラム、陰イオン交換カラムのいずれも使用すること ができ、 目的の抗体や構造異性体などにより適宜決定することができる。例えば、 SP イオン交換体力ラム、 Qイオン交換体力ラムなどを用いることが可能であるが、これら に限定されるものではない。吸着クロマトグラフィーとしては、 Hydroxyapatiteクロマト グラフィ一が例示できる力 これに限定されるものではない。
本発明により、これらの精製方法を用い、特定の構造異性体の精製品を取得するこ とちでさる。
[0059] また、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体間で活性に差が生じる場合に、 sc(Fv)2の構 造異性体の活性を比較して高活性の構造異性体をあら力じめ決定し、 sc(Fv)2組成 物中の構造異性体力 高活性の構造異性体を分離取得することができる。さらに、 sc (Fv)2組成物中の構造異性体を分離する前に、後述の方法により、 sc(Fv)2組成物中 の構造異性体の比率が好ましい値になるようにリンカ一の長さを決定し、決定された リンカ一長を有する sc(Fv)2組成物を作製することもできる。また、 sc(Fv)2組成物中の 構造異性体を分離する前に、リンカ一の長さが異なる複数の sc(Fv)2組成物を作製し 、後述される構造異性体比率の分析法によって構造異性体比率を分析し、 sc(Fv)2 組成物中の構造異性体の比率が好ま 、値となるリンカ一を有する sc(Fv)2を選択し 、選択された sc(Fv)2の sc(Fv)2組成物を作製することもできる。
[0060] すなわち、本発明は、以下の（1)〜（3)のいずれかに記載の方法、および該方法 によって製造される医薬組成物もまた提供するものである。
(1)以下の工程を含む方法。
(a) SC(Fv)2の構造異性体の活性を比較して高活性の構造異性体をあらかじめ決定 する工程
(b) sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(c)工程 (a)により決定された高活性の構造異性体を取得する工程
(d)工程 (c)で取得された高活性の構造異性体および塩、アミノ糖、糖アルコール、 アミノ酸、 pH調整剤力もなる群より選択される少なくとも 1つの物質を混合する工程
(2)以下の工程を含む方法。
(a) sc(Fv)2組成物中の構造異性体の比率が好ましい値になるようにリンカ一の長さを 決定する工程
(b)工程 (a)で決定されたリンカ一の長さを有する sc(Fv)2組成物を作製する工程
(c)作製された sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程 (d)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程
(e)工程 (d)で取得された特定の構造異性体および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミ ノ酸、 pH調整剤力もなる群より選択される少なくとも 1つの物質を混合する工程
(3)以下の工程を含む方法。
(a)リンカ一の長さが異なる複数の sc(Fv)2組成物を作製する工程
(b) sc(Fv)2組成物中の構造異性体の比率が好まし 、値となるリンカ一を有する sc(Fv )2を選択する工程
(c)工程 (b)で選択された sc(Fv)2のリンカ一と同じ長さのリンカ一を有する sc(Fv)2組 成物を作製する工程
(d)作製された sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(e)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程
(f)工程 (e)で取得された特定の構造異性体および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミ ノ酸、 pH調整剤力もなる群より選択される少なくとも 1つの物質を混合する工程
[0061] 本発明にお 、て高活性の構造異性体とは、構造異性体間で活性に差が生じる場 合、活性が高い構造異性体、好ましくは最も活性の高い構造異性体のことをいう。例 えば、 2種類の構造異性体が存在する場合、活性の高い方の構造異性体が本発明 でいう高活性の構造異性体に該当する。
高活性の構造異性体の決定は当業者に公知の方法で行うことができ、例えば、そ れぞれの構造異性体を単離し、同一の条件下で目的の活性を測定することにより高 活性の構造異性体を決定することができる。
[0062] 本発明にお ヽて活性は、結合活性、中和活性、細胞傷害活性、ァゴニスト活性、ァ ンタゴ-スト活性、酵素活性など、いかなる活性でもよぐ特に限定されないが、生体 、組織、細胞、タンパク質、 DNA、 RNA等に量的及び Z又は質的な変化、影響をもた らす活性であることが好ましぐ特にァゴニスト活性が好ま 、。
ァゴ-スト活性とは、受容体などの抗原に抗体が結合することにより、細胞内にシグ ナルが伝達される等して、何らかの生理的活性の変化を誘導する活性である。生理 的活性としては、例えば、増殖活性、生存活性、分化活性、転写活性、膜輸送活性、 結合活性、タンパク質分解活性、リン酸ィ匕 Z脱リン酸ィ匕活性、酸化還元活性、転移 活性、核酸分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性、アポトーシス誘導活性、などを 挙げることができる力 これらに限定されるわけではない。
[0063] 本発明にお ヽて抗原は特に限定されず、どのような抗原でもよ!/ヽ。抗原の例として は、例えば、受容体、癌抗原、 MHC抗原、分化抗原、などを挙げることができる。受 容体の例としては、例えば、造血因子受容体ファミリー、サイト力イン受容体ファミリー 、チロシンキナーゼ型受容体ファミリー、セリン Zスレオニンキナーゼ型受容体ファミリ 一、 TNF受容体ファミリー、 Gタンパク質共役型受容体ファミリー、 GPIアンカー型受容 体ファミリー、チロシンホスファターゼ型受容体ファミリー、接着因子ファミリー、ホルモ ン受容体ファミリー、等の受容体ファミリーに属する受容体などを挙げることができる。 これら受容体ファミリーに属する受容体、及びその特徴に関しては多数の文献が存 在し、 f列 は、 Cooke BA., King RJB., van aer Molen HJ. ed. Newし omprehesive Bio chemistry V0I.I8B "Hormones and their Actions Part Ii pp.1- 46 (1988) Elsevier Sci ence Publishers BV., New York, USA, Patthy L. (1990) Cell, 61: 13-14.、 Ullrich A., et al. (1990) Cell, 61: 203— 212.、 Massagul J. (1992) Cell, 69: 1067— 1070.、 Miyajima A., et al. (1992) Annu. Rev. Immunol, 10: 295- 331.、 Taga T. and Kishimoto T. (19 92) FASEB J., 7: 3387—3396.、 Fantl WL, et al. (1993) Annu. Rev. Biochem., 62: 45 3-481., Smith CA., et al. (1994) Cell, 76: 959—962.、 Flower DR. (1999) Biochim. Bi ophys. Acta, 1422: 207-234.、宫坂昌之監修，細胞工学別冊ハンドブックシリーズ「 接着因子ハンドブック」 (1994) (秀潤社,東京， 日本)等が挙げられる。
[0064] 上記受容体ファミリーに属する具体的な受容体としては、例えば、ヒト又はマウスェ リスロポェチン (EPO)受容体、ヒト又はマウス顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)受容 体、ヒト又はマウストロンボポイエチン (TPO)受容体、ヒト又はマウスインスリン受容体、 ヒト又はマウス Flt-3リガンド受容体、ヒト又はマウス血小板由来増殖因子 (PDGF)受 容体、ヒト又はマウスインターフェロン（IFN) - a、 j8受容体、ヒト又はマウスレプチン受 容体、ヒト又はマウス成長ホルモン (GH)受容体、ヒト又はマウスインターロイキン (IL) -10受容体、ヒト又はマウスインスリン様増殖因子 (IGF) -I受容体、ヒト又はマウス白血 病抑制因子 (LIF)受容体、ヒト又はマウス毛様体神経栄養因子 (CNTF)受容体等を 例示することができる（hEPOR: Simon, S. et al. (1990) Blood 76, 31-35.; mEPOR: D' Andrea, AD. Et al. (1989) Cell 57, 277-285.; hG- CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 8702— 8706.； mG— CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Cell 61, 341-350.； hTPOR: Vigon, I. et al. (1992) 89, 5640-5644. ; mTPOR: Skoda, RC. Et al. (1993) 12, 2645-2653.; hlnsR: Ullrich, A. et al. (1985) Nature 313, 756- 761. ; hFlt-3: Small, D. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 459-463.; hPD GFR: Gronwald, RGK. Et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3435-3439.; hi FN a / j8 R: Uze, G. et al. (1990) Cell 60, 225— 234.及び Novick, D. et al. (1994) C ell 77, 391-400.) o
[0065] 癌抗原は細胞の悪性化に伴って発現する抗原であり、腫瘍特異性抗原とも呼ばれ る。又、細胞が癌化した際に細胞表面やタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も癌 抗原となり、特に癌糖鎖抗原と呼ばれる。癌抗原の例としては、例えば、 CA19-9、 CA 15-3、シリアル SSEA-l(SLX)などを挙げることができる。
MHC抗原には、 MHC class I抗原と MHC class II抗原に大別され、 MHC class I抗 原には、 HLA- Α,- Β,- C，- Ε,- F，- G，- Hが含まれ、 MHC class II抗原には、 HLA- DR,- DQ，- DPが含まれる。
[0066] 分ィ匕抗原には、 CDl,CD2,CD3,CD4,CD5,CD6,CD7,CD8,CD10,CDlla,CDllb,C Dllc,CD13,CD14,CD15s,CD16,CD18,CD19,CD20,CD21,CD23,CD25,CD28,CD29 ,CD30,CD32,CD33,CD34,CD35,CD38,CD40,CD41a,CD41b,CD42a,CD42b,CD43, CD44,CD45,CD45RO,CD48,CD49a,CD49b,CD49c,CD49d,CD49e,CD49f,CD51,C D54,CD55,CD56,CD57,CD58,CD61,CD62E,CD62L,CD62P,CD64,CD69,CD71,CD 73,CD95,CD102,CD106,CD122,CD126,CDwl30などが含まれる。
[0067] 活性の変化を測定する為に用いる検出指標としては、量的及び Z又は質的な変化 が測定可能である限り使用することができる。例えば、無細胞系 (cell free assay)の指 標、細胞系 (ceU-based assay)の指標、糸且織系の指標、生体系の指標を用いることが できる。
無細胞系の指標としては、酵素反応やタンパク質、 DNA、 RNAの量的及び Z又は 質的な変化を用いることができる。酵素反応としては、例えば、アミノ酸転移反応、糖 転移反応、脱水反応、脱水素反応、基質切断反応等を用いることができる。また、タ ンパク質のリン酸化、脱リン酸化、二量化、多量化、分解、乖離等や、 DNA、 RNAの 増幅、切断、伸長を用いることができる。例えばシグナル伝達経路の下流に存在する タンパク質のリン酸ィ匕を検出指標とすることができる。
[0068] 細胞系の指標としては、細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的及び Z又 は質的変化、増殖活性の変化、細胞数の変化、形態の変化、特性の変化等を用い ることができる。産生物質としては、分泌タンパク質、表面抗原、細胞内タンパク質、 m RNA等を用いることができる。形態の変化としては、突起形成及び Z又は突起の数の 変化、偏平度の変化、伸長度 Z縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変 ィ匕、細胞集団としての異形性 Z均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。こ れらの形態の変化は検鏡下での観察で確認することができる。特性の変化としては、 足場依存性、サイト力イン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細 胞遊走活性、拍動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性として は、細胞浸潤活性、細胞遊走活性がある。また、細胞内物質の変化としては例えば、 酵素活性、 mRNA量、 Ca2+や cAMP等の細胞内情報伝達物質量、細胞内タンパク質 量等を用いることができる。また、細胞膜受容体の場合には、受容体の刺激によって 誘導される細胞の増殖活性の変化を指標とすることができる。
[0069] 組織系の指標としては、使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることがで きる。生体系の指標としては組織重量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変 ィ匕、タンパク質量や、酵素活性、電解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、 血圧、心拍数の変化等を用いることができる。
これらの検出指標を測定する方法としては、特に制限はなぐ吸光、発光、発色、蛍 光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量 、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動、等を用いることができる。これ らの測定方法は当業者にとっては周知であり、 目的に応じて、適宜選択することがで きる。
[0070] 例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータやプレートリーダ等、発 光はルミノメータ等、蛍光はフルォロメータ等で測定することができる。質量は質量分 析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマカウ ンターなどの測定機器を用いて、蛍光偏光度は BEACON (宝酒造）、表面プラズモン 共鳴シグナルは BIACORE、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動などは ARVO などにより測定できる。さらに、フローサイトメータなども測定に用いることができる。こ れらの測定方法は、一つの測定方法で 2種以上の検出指標を測定しても良ぐ簡便 であれば、 2種以上の測定を同時及び Z又は連続して測定することによりさらに多数 の検出指標を測定することも可能である。例えば、蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を 同時にフルォロメータで測定することができる。
[0071] 本発明において、ァゴニスト活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可 能である。例えば、実施例に記載のように細胞増殖を指標にァゴ-スト活性を測定す る方法により判定することが可能である。より具体的には、ァゴニスト依存性増殖を示 す細胞に、ァゴニスト活性を測定したい抗体を添加し、培養する。その後、 WST-8の ような生細胞数に応じて特定の波長において発色反応を呈する試薬を添加して吸光 度を測定し、得られた吸光度を指標にァゴニスト活性を測定することが可能である。
[0072] ァゴ-スト依存性増殖を示す細胞も当業者に公知の方法により作製することが可能 であり、例えば、抗原が細胞増殖シグナルを発する受容体である場合には、該受容 体を発現している細胞を用いればよい。又、抗原が細胞増殖シグナルを出さない受 容体である場合には、細胞増殖シグナルを発する受容体の細胞内領域と、細胞増殖 シグナルを出さな ヽ受容体の細胞外領域からなるキメラ受容体を作製し、該キメラ受 容体を細胞で発現させればよ!ヽ。細胞増殖シグナルを発する受容体の例としては、 例えば、 G- CSF受容体、 mpl、 neu、 GM- CSF受容体、 EPO受容体、 c-kit、 FLT-3等を 挙げることができる。受容体を発現させる細胞としては、例えば、 BaF3、 NFS60、 FDC P-l、 FDCP-2、 CTLL-2、 DA-1、 KT-3等を挙げることができる。
[0073] また、特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体の含有比率より高!、sc(Fv) 2組成物としては、特定の構造異性体の含有比率が 80%以上、好ましくは 90%以上、 特に好ましくは 95%以上の sc(Fv)2組成物が例示できる。より具体的には、 single chai n diabody型の含有比率が 80%以上、好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上 の sc(Fv)2組成物、又は bivalent scFv型の含有比率が 80%以上、好ましくは 90%以上 、特に好ましくは 95%以上の sc(Fv)2組成物を挙げることができる。 [0074] 本発明にお 、て特定の構造異性体の含有比率が 80%とは、 sc(Fv)2組成物に含ま れる全ての構造異性体に対する特定の構造異性体の割合が 80%であることを意味 する。例えば、 sc(Fv)2組成物中に single chain diabody型と bivalent scFv型の 2種類の 構造異性体が存在する場合、 single chain diabody型の含有比率が 80%とは、 sngle c hain diabody型と bivalent scFv型の比率力 0 : 20であることを意味する。
本発明において 80%以上、 90%以上、 95%以上の含有比率の上限は特に限定さ れな 、が、 100%若しくは 100%に近 、ことが好まし 、。 100%に近 、上限は当業者の 精製技術や分析技術に依存するが、例えば、 99.999%、 99.99%、 99.9%、 99%など である。構造異性体の含有比率は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電 気泳動、キヤビラリ一等電点電気泳動等を用いて構造異性体を分離することにより、 測定することが可能である。
[0075] sc(Fv)2組成物を医薬組成物として使用する場合、通常、活性は高 、方が好ま ヽ ので、高活性の構造異性体の含有比率が 80%以上の sc(Fv)2組成物を有効成分とし て含有することが好ましい。例えば、抗 Mpl抗体のァゴ-スト活性は single chain diabo dy型の方が高いので、 Mplに対する sc(Fv)2をァゴ-ストとして使用する場合には、 sin gle chain diabody型の含有比率が 80%以上である sc(Fv)2組成物を有効成分として含 有する、医薬組成物であることが好ましい。
[0076] 特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体の含有比率より高い sc(Fv)2組成 物は、例えば、上述した sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体を分離取得する方法 を使用することによって、また、 sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有比率を 他の構造異性体の含有比率より増加させることによって製造できる。
例えば、 sc(Fv)2組成物中の高活性の構造異性体の割合を高くすることにより、活性 が高い sc(Fv)2組成物を製造することが可能であり、逆に、 sc(Fv)2組成物中の高活性 の構造異性体の割合を低くすることにより、活性を抑えた sc(Fv)2組成物を製造するこ とが可能である。
[0077] single chain diabody型の活性力 bivalent scFv型よりも高!、場合、 sc(Fv)2組成物中 の single chain diabody型の含有比率を増加させることにより、 sc(Fv)2組成物の活性を 増加させることができ、 bivalent scFv型の含有比率を増加させることにより、 sc(Fv)2組 成物の活性を低下させることができる。逆に、 bivalent scFv型の活性力 ngle chain di abody型よりも高い場合、 sc(Fv)2組成物中の bivalent scFv型の含有比率を増加させ ることにより、 sc(Fv)2組成物の活性を増加させることができ、 single chain diabody型の 含有比率を増加させることにより、 sc(Fv)2組成物の活性を低下させることができる。 si ngle chain diabody型と bivalent scFv型のどちらが高活性であるかは、目的とする活性 に依存するが、当業者は公知の方法により容易に測定することが可能である。
[0078] sc(Fv)2を医薬組成物として使用する場合、通常、活性は高！、方が好ま 、ことが多 V、ので、 sc(Fv)2組成物中に含まれる特定の構造異性体の割合を変化させることによ り、医薬組成物の活性を増加させることが可能である。
sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有比率を他の構造異性体の含有比率 より増力!]させる方法は如何なる方法により行われてもよぐ例えば、 sc(Fv)2組成物を 得た後に特定の構造異性体の含有比率を高くしてもよいし、特定の構造異性体の含 有比率が高くなるように sc(Fv)2をコードする DNAを設計してもよい。
[0079] sc(Fv)2組成物を得た後に特定の構造異性体の含有比率を高くする具体的な方法 としては、例えば、得られた sc(Fv)2組成物から目的の構造異性体を単離 (あるいは目 的でな!、構造異性体を除去)する方法を挙げることができる。目的の構造異性体の 単離は、上記のように当業者に公知のタンパク質の分離取得方法により行うことが可 能である。
例えば、 sc(Fv)2組成物を加熱した状態でインキュベートすることにより、特定の構造 異性体の含有比率を増力 tlさせることもできる。また、 sc(Fv)2組成物を低 pHおよび Zま たは低塩濃度でインキュベートすることにより、特定の構造異性体の含有比率を増加 させることもできる。すなわち、本発明は、以下の工程を含む方法、および該方法に よって製造される医薬組成物を提供する。
(a) sc(Fv)2組成物を加熱した状態、低 pHおよび Zまたは低塩濃度でインキュベート することによって、特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体の含有比率より 高 ヽ sc(Fv)2組成物を製造する工程
(b)工程 (a)で製造された sc(Fv)2組成物および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸 、pH調整剤カゝらなる群より選択される少なくとも 1つの物質を混合する工程 本発明者らは、 sc(Fv)2組成物力 bivalent scFv型と single chain diabody型の混合物 であり、 bivalent scFv型を多く含有する場合、 sc(Fv)2組成物を一定温度でインキュべ ートすることにより、 bivalent scFv型を single chain diabody型に異性化させることで sin gle chain diabody型の含有比率を増加させることが可能であることを見出している。 sc (Fv)2組成物を 15°C〜50°C、好ましくは 20°C〜40°C、特に好ましくは 25°C〜35°Cにて インキュベートすることにより、 single chain diabody型の含有比率を増加させることが 可能である。インキュベートされた sc(Fv)2組成物は、その後、元の温度に戻しても、 増加した single chain diabody型の含有比率は維持される。
また、 sc(Fv)2組成物力 bivalent scFv型と single chain diabody型の混合物であり、 biv alent scFv型を多く含有する場合、 sc(Fv)2組成物を pH3〜6、好ましくは pH4〜4.5、に てインキュベートすることにより、 bivalent scFv型を single chain diabody型に異性化さ せることで single chain diabody型の含有比率を増加させることが可能である。なお、 sc (Fv)2組成物をインキュベートする場合、塩濃度は pHに依存するが、インキュベート時 の塩濃度力 S0mM〜500mMであることが好ましぐより好ましくは 0mM〜150mMが好ま しい（図 9A)。インキュベートにより single chain diabody型の含有比率を増加させた sc (Fv)2組成物を PCT/JP06/306800に示された方法により single chain diabody型を高 純度に精製することが可能である。これより得られた高純度の single chain diabody型 の sc(Fv)2の異性化を抑制し安定に保存するためには、塩濃度は 50mM〜1000mMの 範囲であることが好ましぐより好ましくは 150mM〜300mMの範囲であることが好まし い。 pH値は 4.5〜9.0の範囲であることが好ましぐより好ましくは 6.0〜9.0の範囲であ ることが好ましい。
また、同様にして、 sc(Fv)2組成物が bivalent scFv型と single chain diabody型の混合 物であり、 single chain diabody型を多く含有する場合、 sc(Fv)2組成物を一定温度で インキュベートすることにより、 single chain diabody型を bivalent scFv型に異性化させ ることで bivalent scFv型の含有比率を増加させることも可能であることを見出している このように、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体異性体の存在状態を平衡状態に戻すこ とにより、低含量 (マイナー成分側）の構造異性体の量を増やすことができる。その後 、一方の構造異性体を取得して、該構造異性体を安定ィ匕することにより、目的の医薬 組成物を製造することができる。
すなわち、本発明は、一つの様態として、以下の工程を含む方法、および該方法に よって製造される医薬組成物を提供する。
(a) sc(Fv)2組成物を 15°C〜50°C、好ましくは 20°C〜40°C、特に好ましくは 25°C〜35 。C、並びに Zまたは、 pH3.0〜6.0、および Zもしくは、塩濃度が 500mM以下にてイン キュベートすることによって、 single chain diabody型の含有比率力 bivalent scFv型の 含有比率より高 ヽ sc(Fv)2組成物を製造する工程
(b)生成した single chain diabody型の sc(Fv)2を取得（精製）する工程
(c)工程 (b)で取得した single chain diabody型 sc(Fv)2組成物を安定化させる工程 single chain diabody型 sc(Fv)2組成物を安定化させる具体的な工程としては、 pH値 を 4.5〜9.0の範囲、より好ましくは 6.0〜9.0の範囲で調整する工程および塩、アミノ糖 、糖アルコール、アミノ酸、 PH調整剤からなる群より選択される少なくとも 1つの物質を 混合する工程ある ヽはこれらの工程を組み合わせた工程があげられる。
また、同様にして、安定ィ匕された bivalent scFv型 sc(Fv)2組成物を製造することがで きる。
[0081] 特定の構造異性体の含有比率が高くなるように sc(Fv)2をコードする DNAを設計す る方法としては、例えば、上述のように適切なリンカ一の長さになるようように DNAを設 計する方法が挙げられる。
さらに、 sc(Fv)2の可変領域の会合を制御することで、 sc(Fv)2組成物中の特定の構 造異性体の含有比率を増加させることも可能である。具体的には、 sc(Fv)2の可変領 域の界面を形成して ヽるアミノ酸残基を改変すベぐ sc(Fv)2をコードする DNAを改変 する。
[0082] 本発明における「会合」とは、例えば、 sc(Fv)2の可変領域が相互作用する状態を指 すちのと換言することができる。
本発明にお 、て「会合を制御する」とは、所望の会合状態になるように制御すること を言い、より具体的には、 sc(Fv)2内において望ましくない会合が形成されないように 制御することを言う。 本発明における「界面」とは、通常、会合湘互作用）する際の会合面を指し、界面 を形成するアミノ酸残基とは、通常、その会合に供される sc(Fv)2の可変領域に含まれ る 1もしくは複数のアミノ酸残基であって、より好ましくは、会合の際に接近し相互作用 に関与するアミノ酸残基を言う。該相互作用には、具体的には、会合の際に接近する アミノ酸残基同士が水素結合、静電的相互作用、塩橋を形成している場合等が含ま れる。
本発明における「界面を形成するアミノ酸残基」とは、詳述すれば、界面を構成する SC(Fv)2の可変領域にぉ 、て、該可変領域に含まれるアミノ酸残基を言う。
[0083] 本発明の方法におけるアミノ酸残基の「改変」とは、具体的には、元（改変前）のアミ ノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換すること、元のアミノ酸残基を欠失させること、新 たなアミノ酸残基を付加すること等を指すが、好ましくは、元のアミノ酸残基を他のアミ ノ酸残基へ置換することを指す。
本発明の上記方法において「DNAを改変する」とは、本発明における「改変」によつ て導入されるアミノ酸残基に対応するように DNAを改変することを言う。より具体的に は、元のアミノ酸残基をコードする DNAについて、改変によって導入されるアミノ酸残 基をコードする DNAへ改変することを言う。通常、目的のアミノ酸残基をコードするコ ドンとなるよう〖こ、元の DNAに対して、少なくとも 1塩基を挿入、欠失または置換するよ うな遺伝子操作もしくは変異処理を行うことを意味する。即ち、元のアミノ酸残基をコ ードするコドンは、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードするコドンによって置 換される。このような DNAの改変は、当業者においては公知の技術、例えば、部位特 異的変異誘発法、 PCR変異導入法等を用いて、適宜実施することが可能である。
[0084] 本発明の好ま 、態様にぉ 、ては、例えば、 sc(Fv)2の可変領域の界面を形成する 2残基以上のアミノ酸残基が、同種の電荷となるように該界面にアミノ酸残基の変異 を導入する。界面において会合に関与する 2以上のアミノ酸残基が互いに同種の電 荷となるように改変されることにより、その電荷の反発力によって、これらアミノ酸残基 の会合が阻害されるものと考えられる。従って、上記方法において、改変されるァミノ 酸残基は、界面を形成する sc(Fv)2の可変領域間において、会合の際に互いに接近 した 2以上のアミノ酸残基であることが好ま 、。 会合の際に接近するアミノ酸残基は、例えば、 sc(Fv)2の立体構造を解析し、該 sc(F v)2の会合の際に界面を形成する可変領域のアミノ酸配列を調べることにより見出す ことができる。界面において互いに接近したアミノ酸残基は、本発明の方法における「 改変」の好まし ヽターゲットとなる。
[0085] アミノ酸の中には、電荷を帯びたアミノ酸が知られている。一般的に正の電荷を帯 びたアミノ酸（正電荷アミノ酸）としては、リジン )、アルギニン (R)、ヒスチジン (H)が知 られている。負の電荷を帯びたアミノ酸 (負電荷アミノ酸）としては、ァスパラギン酸 (D) 、グルタミン酸 (E)等が知られている。従って、好ましくは、本発明において同種の電 荷のアミノ酸とは、正の電荷同士のアミノ酸、あるいは負の電荷同士のアミノ酸を言う
[0086] 本発明においては、界面を形成するアミノ酸残基が同種の電荷となるように改変さ れることが好ましぐ同種のアミノ酸の中でも、同一のアミノ酸であればさらに好ましい 。例えば、改変後のアミノ酸残基は、リジンとアルギニンであってもよいが、 2つのリジ ン、ある 、は 2つのアルギニンであることがより好まし!/、。
また、改変によって導入されるアミノ酸残基が複数の場合、これらアミノ酸残基の中 に電荷を持たな 、アミノ酸残基が少数程度含まれて 、てもよ 、。
[0087] 本発明の方法において改変に供されるアミノ酸残基の数は、特に制限されないが、 抗原との結合活性を低下させないために、なるべく少数のアミノ酸残基を改変するこ とが好ましい。上記「少数」とは、例えば、 1〜： LO個程度の数、好ましくは、 1〜5程度 の数、より好ましくは 1〜3程度の数、最も好ましくは 1または 2を表す。
なお、元の sc(Fv)2において、界面を形成するアミノ酸残基 (X)が既に電荷を有する 場合、あるいは水素結合を形成している場合、会合の際に該アミノ酸残基と近接し相 対するアミノ酸残基を、該アミノ酸残基 (X)と同一のアミノ酸残基 (もしくは同種の電荷 のアミノ酸残基）となるように改変することも本発明の好ましい態様の一つである。この 態様にお 1ヽては、界面を形成するアミノ酸残基の一方を改変すればょ ヽ。
[0088] また、本発明の好ま 、態様にぉ 、ては、 sc(Fv)2の可変領域の界面を形成するァ ミノ酸残基の改変が、界面に存在する疎水性コアを形成するアミノ酸残基が電荷を有 するアミノ酸残基となるように、該界面にアミノ酸残基の変異を導入する。 一般的に、「疎水性コア（hydrophobic core)」は、会合したポリペプチドの内側に疎 水性アミノ酸の側鎖が集合して形成する部分を指す。疎水性アミノ酸は、例えばァラ ニン、イソロイシン、ロイシン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン、トリプトファン、 ノリンなどが含まれる。また、疎水性コアの形成には、疎水性アミノ酸以外のアミノ酸 残基 (例えばチロシン）が関わることもある。この疎水性コアは、親水性アミノ酸の側鎖 が外側に露出する親水性表面とともに、水溶性のポリペプチドの会合を進める駆動 力となる。異なる 2つのドメインの疎水性アミノ酸が分子表面に存在し、水分子に暴露 されるとエントロピーが増大し自由エネルギーが増大してしまう。よって、 2つのドメイン は自由エネルギーを減少させ、安定化するために、互いに会合し、界面の疎水性ァ ミノ酸は分子内部に埋もれ、疎水性コアを形成することになる。
[0089] ポリペプチドの会合の際に、形成された疎水性コアを形成するアミノ酸残基から電 荷を持つ極性アミノ酸へ改変することにより、疎水性コアの形成が阻害され、その結 果、ポリペプチドの会合が阻害されるものと考えられる。ポリペプチドである sc(Fv)2も 同様に、可変領域の会合により疎水性コアが形成される。よって、この疎水性コアの アミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸に置換することにより、可変領域の会合を制御 でさるちのと考免られる。
当業者においては、所望の sc(Fv)2についてアミノ酸配列を解析することにより、疎 水コアの存在の有無、および形成部位 (領域)等を知ることが可能である。
[0090] また、可変領域の界面を形成して 、るアミノ酸残基にぉ 、て、望ま 、会合を促進 するために knobs-into-holes (特表 2001-523971)技術を利用することも考えられる。 k nobs-into-holesは、ヘテロマルチマー形成を促進し、ホモマルチマー形成を抑制す るように、第一のポリペプチドの界面と第二のポリペプチドの界面で特異的かつ相補 的な相互作用を導入する (例えば、非天然のジスルフイド結合が第一のポリペプチド と第二のポリペプチド間に形成されるように、第一のポリペプチドの界面に遊離チォ ール含有残基を、第二のポリペプチドの界面中に相当する遊離チオール含有残基 を導入する)方法である力 本発明に利用することができる。 knobs-into-holesは当業 者に公知の技術であり、当業者は適宜、 sc(Fv)2に導入することが可能である。さらに 、上記技術を組み合わせて利用することもできる。 [0091] 可変領域は、通常 3つの CDR領域と 4つの FR領域によって構成されて 、る。本発明 の好ましい態様において「改変」に供するアミノ酸残基としては、例えば、 CDR領域あ るいは FR領域に位置するアミノ酸残基の中から適宜選択することができる。一般的に CDR領域のアミノ酸残基の改変は、抗原に対する結合能を低下させる場合がある。 従って、本発明において「改変」に供するアミノ酸残基としては、特に限定されるもの ではな!/、が、 FR領域に位置するアミノ酸残基の中力も適宜選択することが好ま U、。
[0092] 当業者であれば、本発明の方法によって会合を制御したい所望の sc(Fv)2について 、会合した際の FRの界面にぉ 、て接近するアミノ酸残基の種類を適宜知ることが可 能である。
例えば、会合した際の FRの界面において接近するアミノ酸残基の具体例として、 V H上の 39位 (FR2領域)のグルタミン (Q)と、相対 (接触）する VL上の 38位の (FR2領域） のグルタミン (Q)を挙げることができる。さらに、 VH上の 45位 (FR2)のロイシン (L)と、相 対する VL上の 44位の (FR2)のプロリン (P)を好適に例示することができる。なお、これら 部位のナンバーリングについては、 Kabatらの方法 (Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH) 参考にし飞いる。
[0093] これらアミノ酸残基は、ヒトおよびマウスにおいて高度に保存されていることが知られ ている 0. Mol. Recognit. 2003; 16: 113-120)ことから、実施例に示す sc(Fv)2以外の s c(Fv)2についても、上記アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を改変することによって 、 sc(Fv)2の可変領域の会合を制御することができる。
[可変領域 1] (リンカ一 1) [可変領域 2] (リンカ一 2) [可変領域 3] (リンカ一 3) [可変領域 4]の順で並んでいる sc(Fv)2において、 single chain diabody型の含有比率を増加させ る方法を例示する。
[0094] 該 sc(Fv)2にお!/、て、 bivalent scFv型が生じる場合は、可変領域 1と可変領域 2の会 合および可変領域 3と可変領域 4の会合を抑制し、かつ、可変領域 1と可変領域 4の 会合および可変領域 2と可変領域 3の会合を抑制しな 、ように (あるいは促進するよう に）、可変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。
該 sc(Fv)2において、可変領域 1と可変領域 3が会合し、かつ可変領域 2と可変領域 4が会合した状態の構造を有する構造異性体が生じる場合は、これらの会合を抑制 し、かつ、可変領域 1と可変領域 4の会合および可変領域 2と可変領域 3の会合を抑 制しな 、ように（あるいは促進するように）、可変領域の界面を形成して 、るアミノ酸残 基に置換変異を導入する。
[0095] 該 sc(Fv)2において、可変領域 1と可変領域 3が会合した状態の構造を有する構造 異性体が生じる場合は、この会合を抑制し、かつ、可変領域 1と可変領域 4の会合お よび可変領域 2と可変領域 3の会合を抑制しな 、ように (あるいは促進するように）、可 変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。
該 sc(Fv)2において、可変領域 2と可変領域 4が会合した状態の構造を有する構造 異性体が生じる場合は、この会合を抑制し、かつ、可変領域 1と可変領域 4の会合お よび可変領域 2と可変領域 3の会合を抑制しな 、ように (あるいは促進するように）、可 変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。
[0096] また、 [可変領域 1] (リンカ一 1) [可変領域 2] (リンカ一 2) [可変領域 3] (リンカ一 3) [可 変領域 4]の順で並んでいる sc(Fv)2において、 bivalent scFv型の含有比率を増加さ せる方法を例示する。
該 sc(Fv)2において、 single chain diabody型が生じる場合は、可変領域 1と可変領域 4の会合および可変領域 2と可変領域 3の会合を抑制し、かつ、可変領域 1と可変領 域 2の会合および可変領域 3と可変領域 4の会合を抑制しな 、ように (ある 、は促進 するように）、可変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。 該 sc(Fv)2において、可変領域 1と可変領域 3が会合し、かつ可変領域 2と可変領域 4が会合した状態の構造を有する構造異性体が生じる場合は、これらの会合を抑制 し、かつ、可変領域 1と可変領域 2の会合および可変領域 3と可変領域 4の会合を抑 制しな 、ように（あるいは促進するように）、可変領域の界面を形成して 、るアミノ酸残 基に置換変異を導入する。
[0097] 該 sc(Fv)2において、可変領域 1と可変領域 3が会合した状態の構造を有する構造 異性体が生じる場合は、この会合を抑制し、かつ、可変領域 1と可変領域 2の会合お よび可変領域 3と可変領域 4の会合を抑制しな 、ように (あるいは促進するように）、可 変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。
該 sc(Fv)2において、可変領域 2と可変領域 4が会合した状態の構造を有する構造 異性体が生じる場合は、この会合を抑制し、かつ、可変領域 1と可変領域 2の会合お よび可変領域 3と可変領域 4の会合を抑制しな 、ように (あるいは促進するように）、可 変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。
[0098] 以下に、より詳細な例を示す力 これに限定されるものではない。
例えば、 [ VH 1 ]リンカ一 [ VL2 ]リンカ一 [ VH3 ]リンカ一 [ VL4]の順に並んでいる sc(F v)2において、 bivalent scFv型の割合を減少させて、 single chain diabody型の割合を 増加させるには、例えば、 VH1と VL2の界面を形成しているアミノ酸残基を同種の電 荷を有するアミノ酸残基に置換し、 VH3と VL4の界面を形成して ヽるアミノ酸残基を同 種の電荷を有するアミノ酸残基であって、 VH1と VL2に導入したアミノ酸残基と反発し ない電荷 (好ましくは親和性のある電荷)を有するアミノ酸残基に置換する。また、例 えば、 VH1と VL2の界面を形成しているアミノ酸側鎖をより大きい側鎖 (knob;突起)に 置換し、 VH3と VL4の界面を形成しているアミノ酸側鎖をより小さい側鎖 (hole;空隙） に置換する。このような置換により、 VH1と VL2の会合および VH3と VL4の会合を抑制 し、かつ、 VH1と VL4の会合および VL2と VH3の会合を抑制しないように（あるいは促 進するように）制御できる。
[0099] また、 [VH1]リンカ一 [VL2]リンカ一 [VH3]リンカ一 [VL4]の順に並んで!/、る sc(Fv) 2において、 single chain diabody型の割合を減少させて、 bivalent scFv型の割合を増 カロさせるには、例えば、 VH1と VL4の界面を形成しているアミノ酸残基を同種の電荷 を有するアミノ酸残基に置換し、 VH3と VL2の界面を形成して ヽるアミノ酸残基を同種 の電荷を有するアミノ酸残基であって、 VH1と VL4に導入したアミノ酸残基と反発しな い電荷 (好ましくは親和性のある電荷)を有するアミノ酸残基に置換する。また、例え ば、 VH1と VL4の界面を形成しているアミノ酸側鎖をより大きい側鎖 (knob;突起)に置 換し、 VH3と VL2の界面を形成しているアミノ酸側鎖をより小さい側鎖 (hole;空隙)に 置換する。このような置換により、 VH1と VL4の会合および VH3と VL2の会合を抑制し 、かつ、 VH1と VL2の会合および VH3と VL4の会合を抑制しないように（あるいは促進 するように）制御できる。
[0100] 本発明においては、以下の（1)および（2)、または（3)および (4)のアミノ酸残基を 、同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換することにより、 sc(Fv)2組成物中の特定の 構造異性体の含有比率を増加させることが可能である。
(1) sc(Fv)2の VHに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における 39位 に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の VLに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における 38位 に相当するアミノ酸残基
(3) sc(Fv)2の VHに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における 45位 に相当するアミノ酸残基
(4) sc(Fv)2の VLに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における 44位 に相当するアミノ酸残基
[0101] さらに本発明においては、以下の（1)および（2)のいずれか一方のアミノ酸残基、 または（3)および (4)の 、ずれか一方のアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基 に置換することにより、 sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有比率を増加させ ることが可能である。
(1) sc(Fv)2の VHに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における 39位 に相当するアミノ酸残基
(2) sc(Fv)2の VLに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における 38位 に相当するアミノ酸残基
(3) sc(Fv)2の VHに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における 45位 に相当するアミノ酸残基
(4) sc(Fv)2の VLに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における 44位 に相当するアミノ酸残基
[0102] 上記（1)〜（4)に記載のアミノ酸残基は、通常、ヒトおよびマウスにおいては、それ ぞれ、（1)グルタミン (Q)、 （2)グルタミン (Q)、 （3)ロイシン (L)、 （4)プロリン (P)であるが 、必ずしもこのアミノ酸残基に限定されず、このアミノ酸に相当する他のアミノ酸であつ てもよい。例えば、 VL上のアミノ酸配列における 38位に相当するアミノ酸として、ヒトの 場合、例えば、ヒスチジン (H)であってもよい。当業者においては、公知文献等 (例え ば、 J. Mol. Recognit. 2003; 16: 113-120)を参照することにより、任意の位置につい て、その位置に相当するアミノ酸残基の種類を知ることが可能である。 本発明は、以下の（1)〜 (4)のいずれかに記載の方法、および該方法によって製 造される医薬組成物を提供するものである。
(1)以下の工程を含む方法。
(a) sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成して 、るアミノ酸残基を、 電荷を有するアミノ酸残基に置換することによって、特定の構造異性体の含有比率 が他の構造異性体の含有比率より高い sc(Fv)2組成物を製造する工程
(b)工程 (a)で製造された sc(Fv)2組成物および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸 、pH調整剤カゝらなる群より選択される少なくとも 1つの物質を混合する工程
(2)以下の工程を含む方法。
(a)以下の (i)および (ii)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基 に置換することによって、特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体の含有 比率より高 ヽ sc(Fv)2組成物を製造する工程
(i) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域の 39位 に相当するアミノ酸残基
(ii) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 38位に相当するアミノ酸残基
(b)工程 (a)で製造された sc(Fv)2組成物および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸 、pH調整剤カゝらなる群より選択される少なくとも 1つの物質を混合する工程
(3)以下の工程を含む方法。
(a)以下の (i)および (ii)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基 に置換することによって、特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体の含有 比率より高 ヽ sc(Fv)2組成物を製造する工程
(i) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のァミノ 酸配列における 45位に相当するアミノ酸残基
(ii) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 44位に相当するアミノ酸残基
(b)工程 (a)で製造された sc(Fv)2組成物および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸 、pH調整剤カゝらなる群より選択される少なくとも 1つの物質を混合する工程 (4)以下の工程を含む方法。
(a)以下の (i)および (ii)の 、ずれか一方のアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残 基に置換することによって、特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体の含 有比率より高 ヽ sc(Fv)2組成物を製造する工程
(i) sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のァミノ 酸配列における 45位に相当するアミノ酸残基
(ii) sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のァミノ 酸配列における 44位に相当するアミノ酸残基
(b)工程 (a)で製造された sc(Fv)2組成物および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸 、pH調整剤カゝらなる群より選択される少なくとも 1つの物質を混合する工程
また、 sc(Fv)2の両端のリンカ一又は Z及び中央のリンカ一の長さを調節することに より、 sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有比率を増加させることも可能であ る。すなわち、本発明は、以下の工程を含む方法、および該方法によって製造される 医薬組成物を提供する。
(a) sc(Fv)2のリンカ一の長さを調節することによって、特定の構造異性体の含有比率 が他の構造異性体の含有比率より高い sc(Fv)2組成物を製造する工程
(b)工程 (a)で製造された sc(Fv)2組成物および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸 、pH調整剤カゝらなる群より選択される少なくとも 1つの物質を混合する工程
[0104] 本発明において両端のリンカ一とは、 sc(Fv)2が [可変領域 1] (リンカ一 1) [可変領域 2 ] (リンカ一 2) [可変領域 3] (リンカ一 3) [可変領域 4]の順で並んでいる場合、リンカ一 1と リンカ一 3が両端のリンカ一となり、リンカ一 2が中央のリンカ一となる。
具体的には、両端のリンカ一を 0〜12アミノ酸とし、中央のリンカ一を 10〜30アミノ酸 とすることにより、 sc(Fv)2組成物中の single chain diabody型の比率を増加することが 可能となり、両端のリンカ一を 12〜30アミノ酸とし、中央のリンカ一を 0〜10アミノ酸とす ることにより、 sc(Fv)2組成物中の bivalent scFv型の比率を増加させることが可能となる
[0105] また、両端のリンカ一を 0〜12アミノ酸とし、中央のリンカ一を 0〜10アミノ酸とすること により、 single chain diabody型の含有比率が 80%以上の sc(Fv)2組成物を製造するこ とが可能であり、両端のリンカ一を 12〜30アミノ酸とし、中央のリンカ一を 0〜10アミノ 酸とすることにより、 bivalent scFv型の含有比率が 80%以上の sc(Fv)2組成物を製造 することが可能となる。
[0106] すなわち、本発明は、以下の（1)〜（3)のいずれかに記載の方法、および該方法 によって製造される医薬組成物を提供する。
(1)以下の工程を含む方法。
(a) sc(Fv)2の両端のリンカ一を 0〜12アミノ酸、中央のリンカ一を 10〜30アミノ酸に調 節すること〖こよって、 single chain diabody型の含有比率が bivalent scFv型の含有比 率より高!ヽ sc(Fv)2組成物を製造する工程
(b)工程 (a)で製造された sc(Fv)2組成物および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸 、pH調整剤カゝらなる群より選択される少なくとも 1つの物質を混合する工程
(2)以下の工程を含む方法。
(a) sc(Fv)2の両端のリンカ一を 0〜12アミノ酸、中央のリンカ一を 0〜10アミノ酸に調節 することによって、 single chain diabody型の含有比率が bivalent scFv型の含有比率よ り高 ヽ sc(Fv)2組成物を製造する工程
(b)工程 (a)で製造された sc(Fv)2組成物および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸 、pH調整剤カゝらなる群より選択される少なくとも 1つの物質を混合する工程
(3)以下の工程を含む方法。
(a) sc(Fv)2の両端のリンカ一を 12〜30アミノ酸、中央のリンカ一を 0〜10アミノ酸に調 節することによって、 bivalent scFv型の含有比率力 ngle chain diabody型の含有比 率より高!ヽ sc(Fv)2組成物を製造する工程
(b)工程 (a)で製造された sc(Fv)2組成物および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸 、pH調整剤カゝらなる群より選択される少なくとも 1つの物質を混合する工程
[0107] ある sc(Fv)2組成物が、特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体の含有比 率より高い sc(Fv)2組成物であるか否かは、当業者に周知の方法、例えば NMRを用 いた解析、結晶構造解析などにより同定することができる。また、 sc(Fv)2のリンカ一部 位を切断する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体の構造を同定する方法に よっても確認することができる。 [0108] 本発明においてリンカ一部位とは、リンカ一およびリンカ一近傍領域を含んだ部位 のことをいう。リンカ一近傍領域とは、リンカ一に隣接したアミノ酸カゝら可変領域側に 2 0番目のアミノ酸までの 20アミノ酸力もなる領域のことをいう。従って、リンカ一部位は、 リンカ一の両端にそれぞれ 20アミノ酸カゝらなる領域が付加された部位となる。
sc(Fv)2のリンカ一部位を切断する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体の 構造を同定する方法は、クロマトグラフィー等による single chain diabody型、 bivalent s cFv型の解析方法に比較して、より簡便な方法である。クロマトグラフィーでは構造異 性体の分離が出来ても、分離された sc(Fv)2の構造の同定を行うことは出来ない。この 方法によりクロマトグラフィー等で分離された構造異性体の構造を同定することが可 能である。
[0109] single chain diabody型と bivalent scFv型で立体構造が違うことから、酵素などにより 3つのリンカ一部位のうちいずれ力 1つのリンカ一部位が切断された場合、 single chai n diabody型と bivalent scFv型では切断後の生成物に違いがでる。
具体的には、 sc(Fv)2が [可変領域 1] (リンカ一 1) [可変領域 2] (リンカ一 2) [可変領域 3 ] (リンカ一 3) [可変領域 4]の順で並んでいる場合、 bivalent scFv型では、リンカ一 1ま たは 3の部位で切断されると、 4つの可変領域は共有結合又は非共有結合で結合し ているので、 2つの scFvに分離することはないが、リンカ一 2の部位で切断された場合 、可変領域 1と 2からなる scFvと可変領域 3と 4からなる scFvの 2つの scFvに分離される 。 single chain diabody型ではリンカ一 1、 2または 3のいずれのリンカ一部位で切断さ れた場合でも 4つの可変領域は共有結合又は非共有結合に結合して 、るので、 2つ の scFvに分離することはな!/、（図 13)。
[0110] 従って、 bivalent scFv型では 3つのリンカ一部位のうちいずれ力 1つのリンカ一部位 を切断した場合、 4つの可変領域を含む生成物と 2つの可変領域を含む生成物の 2 種類が生成される力 single chain diabody型では 3つのリンカ一部位のうちいずれ力 1 つのリンカ一部位を切断した場合、 4つの可変領域を含む生成物のみが生成される。 以上のように、 sc(Fv)のリンカ一部位のうちの 1つを酵素などで切断し、切断後の生 成物を比較することにより、 sc(Fv)2が single chain diabody型、 bivalent scFv型のいず れであるかを調べることが可能である。 [0111] sc(Fv)2のリンカ一部位を切断する工程を含む、 sc(Fv)2組成物中の構造異性体の 構造を同定する方法としては、（a) sc(Fv)2組成物中の sc(Fv)のリンカ一部位を切断す る工程、（b)切断後の生成物の分子量または構造を測定する工程を含む方法が例 示できる。
[0112] 一般に sc(Fv)2のリンカ一部分は、高次構造を取っていないため、プロテアーゼ等 の分解を受けやすいことが知られている（Hoedemaeker et al、 J Biol Chem. 1997; 27 2： 29784-29789) oリンカ一を切断する方法は特に限定されないが、酵素による切断 が好ましぐ特にプロテアーゼによる切断が好ましい。使用されるプロテアーゼは特に 限定されず、ェキソぺプチダーゼ、エンドべプチダーゼのいずれでもよいが、リンカ 一を切断するという目的からエンドべプチダーゼが好ましい。エンドべプチダーゼは 、セリンプロテアーゼ、チォーノレべプチダーゼ、酸'性プロテアーゼ、メタ口プロテア一 ゼなど如何なるものでもよぐ当業者であれば、リンカ一の種類やアミノ酸配列に応じ て適宜選択することが可能である。例えば、セリンプロテアーゼとして、 Arg, Lys残基 の C末端側を特異的に加水分解するトリプシンやタンパク質 'ペプチドを非特異的に 加水分解するサブチリシンなどが挙げられる。また、チオールプロテアーゼとして、タ ンパク質'ペプチドの N末端の pGlu残基を特異的に加水分解するピログルタメートアミ ノぺプチダーゼやタンパク質 ·ペプチドを非特異的に加水分解するパパインなどが挙 げられる。
[0113] 切断されるリンカ一の数は限定されるものではないが、 1つであることが好ましい。リ ンカーを 1つ切断する場合の条件は当業者に公知の方法で決定することができる。 又、切断後の生成物の分子量または構造の測定は、可変領域間の非共有結合を 維持したまま測定することが好ましぐ例えば、 native pageやゲルろ過などを用いるこ とが可能である。
[0114] 本発明は、 sc(Fv)2に、塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、 pH調整剤からなる群 より選択される少なくとも 1つの物質を添加する工程を含む、 sc(Fv)2の異性ィ匕を抑制 する方法を提供する。本発明の方法によって、 sc(Fv)2の特定の構造異性体を安定 化することができるので、本発明の方法は、 sc(Fv)2の特定の構造異性体の分析等に 利用できる。 [0115] また、 sc(Fv)2を含有する医薬組成物において、本発明の物質は、特定の構造異性 体を安定に存在させるために、また存在する複数の構造異性体の存在比を保存中 一定に保っために有用であり、医薬品原薬や製剤の保存時の安定化剤として利用 できる。すなわち、本発明は、塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、 pH調整剤からな る群より選択される少なくとも 1つの物質を添加する工程を含む、医薬組成物中の有 効成分の異性ィ匕を抑制する方法もまた提供するものである。また、 sc(Fv)2の異性ィ匕 の抑制は、該 sc(Fv)2を凍結乾燥することによつても実施することができる。
[0116] さらに、本発明は、塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、 pH調整剤からなる群より 選択される少なくとも 1つの物質を含有する、 sc(Fv)2の異性ィ匕反応を抑制するために 用いる安定化剤、その使用方法を提供するものである。また、本発明の安定化剤の 製造における、塩、アミノ糖、アミノ酸、または、 pH調整剤の使用、または sc(Fv)2の異 性ィ匕反応を抑制するための塩、アミノ糖、アミノ酸、または、 pH調整剤の使用も提供 する。すなわち、本発明は、塩、アミノ糖、アミノ酸、または、 pH調整剤の新規な用途 を提供するものである。本発明の安定化剤は、当業者に周知の方法で調製すること ができる。本発明の安定化剤に含まれる物質の製造元、販売元は、当業者に周知で ある。
また、本発明は、 sc(Fv)2の異性ィ匕反応を抑制する物質のスクリーニング方法を提 供する。スクリーニングされた物質は、 sc(Fv)2の異性ィ匕反応を抑制するために用いる 安定化剤として使用できる。
[0117] 該方法では、まず、調製された sc(Fv)2組成物に被検物質を接触させる。本発明の 方法における「被検物質」としては、特に制限はなぐ例えば、公知の薬学的に許容 される担体、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一 化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、 細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出 物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。また、本発 明において「接触」は、 sc(Fv)2組成物に被検物質を添加することにより、あるいは被 検物質に sc(Fv)2組成物を添加することにより行う。
[0118] 該方法では、次いで、 sc(Fv)2の異性ィ匕反応の抑制の有無を測定し、 sc(Fv)2の異 性化反応を抑制する物質を選択する。 sc(Fv)2の異性化反応の抑制は、上述のとおり 、当業者であれば周知の方法によって測定することができる。
なお本明細書において引用されたすベての先行技術文献は、参照として本明細書 に組み入れられる。
実施例
[0119] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
[0120] 〔実施例 1〕ヒト化抗ヒト Mpl抗体 hVB22B sc(Fv)2の異性化反応の安定化剤の検討 図 1に示すように、 sc(Fv)2は 2種類の構造異性体間を相互に構造変換 (異性化)す る。 sc(Fv)2の相互異性ィ匕反応を抑制するために、高純度に精製した hVB22B u2-wz 4 sc(Fv)2の 2種類の構造異性体である peakl(91.4% peakl),及び、 peak2(99.6% peak 2)を用いて、それぞれの構造異性体（bivalent scFv型である peaklあるいは single chai n diabody型である peak2)の異性化反応を抑制する安定化剤の検討を試みた。
[0121] 具体的には、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、下記条件における反応後 の構造異性体存在比を測定した。
く安定性試験条件〉
20mM sodium citrate, pH6.5, + following additives
Additives: none, 10% sucrose, 10% mannitol, 10% meglumine, 50mM magnesium chlor ide, lOOmM lysine hydrochloride
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peakl: 62ug/mL
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peak2: 62ug/mL
25。C- 3weeks
[0122] 上記条件で反応後、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、 25°C- 6weeks後の構 造異性体存在比を測定した。陽イオン交換クロマトグラフィーの溶離条件は下記の通 りである。
く溶離条件〉
カラム： Bioassist S (TOSOH)
移動相 A： 20mM sodium phosphate, pH7.0 移動相 B ： 20mM sodium phosphate, 500mM KC1, pH7.0
Flow rate ： 0.8ml/min
Detection ： 220nm
[0123] 図 2に、 peakl 91.4%から開始した場合における、 25°C-6weeks後の peaklの割合を し 7こ。 peakl percentageは、 peakl peak area/ (peakl +peak2 pea area)*100に り 十异した。
安定化剤非存在下 (none)にお!/、ては、 25°C-6weeks後の peaklの割合が 45%程度ま で減少し、半分以上が peak2へ異性化した。それに対して、 NaCl、 meglumine, MgC12 、 lysineを添カ卩した条件においては、大幅に異性化反応が抑制され、 25°C- 6weeks後 の peaklの割合は 80%程度であった。 mannitolを添カ卩した場合は若干の異性化抑制 効果のみ確認され、 sucroseではほとんど安定ィ匕効果が認められな力つた。
[0124] また図 3に、 peak2 99.6%から開始した場合における、 25°C-6weeks後の peak2の割 合 不した o peak2 percentageは peak2 peak area/ (peakl +peak2 peak areaノ *100によ り計算した。
安定化剤非存在下 (none)にお!/、ては、 25°C-6weeks後の peak2の割合が 95%程度ま で減少し、 5%程度が peaklへ異性化した。それに対して、 NaCl、 meglumine, MgC12、 1 ysineを添加した条件したにおいては、大幅に異性化反応が抑制され、 25°C- 6weeks 後の peak2の割合は 98%以上であった。特に meglumineを添加した際の異性ィ匕抑制効 果が最も高カゝつた。 mannitolを添加した場合は若干の異性ィ匕抑制効果のみ確認され 、 sucroseではほとんど安定化効果が認められなかった。
[0125] 以上より、 hVB22B sc(Fv)2の構造異性体の相互異性化反応を抑制する安定化剤 が明らかとなった。安定化剤としては、 NaCl、 meglumine, MgC12、 lysineに大きな効果 が見られたことから、 NaClのような塩類、 meglumineのようなァミノ糖、 MgC12のような 2 価の塩、 lysineのようなアミノ酸を添加することによって、異性ィ匕反応が抑制可能であ ることが判明した。
[0126] 〔実施例 2〕hVB22B sc(Fv)2の異性ィ匕反応の pH依存性および NaCl濃度依存性
次に、高純度に精製した hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の 2種類の構造異性体である pea kl(91.4% peakl),及び、 peak2(99.6% peak2)を用いて、それぞれの構造異性体（peak 1あるいは peak2)の異性ィ匕反応を抑制することができる pHおよび NaCl濃度の検討を 行った。
[0127] 具体的には、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、下記条件における反応後 の構造異性体存在比を測定した。
く安定性試験条件〉
20mM sodium citrate,
0 / 150 / 300mM NaCl,
pH 3.0 I 3.5 I 4.0 I 4.5 I 5.0 I 5.5 I 6.0 I 6.5 I 7.0 I 7.5
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peakl： 0.2mg/mL
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peak2： 0.2mg/mL
25。C- 5days
[0128] 上記条件で反応後、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、 25°C- 5days後の構 造異性体存在比を測定した。陽イオン交換クロマトグラフィーの溶離条件は下記の通 りである。
く溶離条件〉
カラム： Bioassist S (TOSOH)
移動相 A： 20mM sodium phosphate, pH7.0
移動相 B： 20mM sodium phosphate, 500mM KC1, pH7.0
Flow rate： 0.8ml/min
Detection： 220nm
[0129] 図 4に、 peakl 91.4%から開始した場合における、 25°C- 5days後の peaklの割合を示 した。また図 5に、 peak2 99.6%から開始した場合における、 25°C- 5days後の peak2の 割合を示した。 peakl percentageおよび peak2 percentageの計算方法は、実施例 1と 同様である。
これらより peaklから peak2への異性化反応、 peak2から peaklへの異性化反応は共 に、大きな pH依存性、 NaCl濃度依存性を示した。 pHが低いほど、また NaCl濃度が低 いほど、異性ィ匕が促進されることが明ら力となった。通常の IgGは pH5.5〜6.0付近で 安定であり、塩濃度は会合ィ匕に対して大きな影響は与えない（Pharm. Res. 1994, 11( 5), 764-771)ことが知られていることから、 sc(Fv)2の異性ィ匕反応は IgGの会合ィ匕とは 全く異なるプロファイルを示した。
[0130] これまでにタンパク質のこのような異性ィ匕反応を報告されておらず、本研究によって 、 hVB22B sc(Fv)2における異性ィ匕反応は pHや NaCl濃度により抑制できることを初め て見出した。
[0131] 〔実施例 3〕 hVB22B sc(Fv)2 single chain diabody型の異性化反応の緩衝液 ·ρΗ依存 性および NaCl濃度依存性
高純度に精製した hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体である peak2(99.6% peak2
)を用いて、 single chain diabodyである peak2力ら bivalent scFvでめる peaklへの異'性 化反応を抑制することができる pHおよび NaCl濃度の検討を 2種類の緩衝液種を用い て行った。特に NaCl濃度に関して詳細な検討を行った。
[0132] 具体的には、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、下記条件における反応後 の構造異性体存在比を測定した。
く安定性試験条件〉
Buffer： 20mM sodium citrate I 20mM histidine HC1
NaCl： OmM I 35mM I 75mM I lOOmM I 150mM I 300mM
pH： 6.0 I 6.5 I 7.0
25°C-20days
[0133] 上記条件で反応後、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、 25°C-5days後
の構造異性体存在比を測定した。陽イオン交換クロマトグラフィーの溶離条件は下記 の通りである。
く溶離条件〉
カラム： Bioassist S (TOSOH)
移動相 A： 20mM sodium phosphate, pH7.0
移動相 B： 20mM sodium phosphate, 500mM KC1, pH7.0
Flow rate： 0.8ml/min
Detection： 220nm
[0134] また図 6に、 peak2 99.6%の 25°C- 20days後の peaklの割合を示した。 peakl percenta geの計算方法は、実施例 1と同様である。
これらより peak2から peaklへの異性ィ匕反応は共に、大きな pH依存性、 NaCl濃度依 存性を示した。 pHに関しては実施例 2と同様の傾向が見られた。 NaCl濃度に関して はより詳細な検討を行った結果、異性化反応は NaCl濃度が増加するに従って抑制さ れることが分かり、特に NaCl濃度約 50mM以上で抑制効果が大きくなるが分力つた。 この傾向は、いずれの pH、及び、緩衝液種においても確認された。このことから、 sc(F v)2の製剤に NaClを添加することによって異性ィ匕反応を抑制できることが分力つた。
[0135] 〔実施例 4〕マウス抗ヒト Mpl抗体 mVB22B sc(Fv)2 bivalent scFv型の異性化反応の pH 依存性および NaCl濃度依存性
高純度に精製した mVB22B sc(Fv)2の 2種類の構造異性体のうち bivalent scFvを用 いて、 bivalent scFvである peakl力ら single chain diabodyである peak2への異'性ィ匕反 応を抑制することができる pHおよび NaCl濃度の検討を試みた。
[0136] 具体的には、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、下記条件における反応後 の構造異性体存在比を測定した。
く安定性試験条件〉
20mM sodium citrate,
0 / 150 / 300mM NaCl,
pH 5.0 I 5.5 I 6.0 I 6.5 I 7.0 I 7.5
mVB22B sc(Fv)2 peakl： O.lmg/mL
40°C-2,4,8days
[0137] 上記条件で反応後、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、 intialおよび 40°C-2, 4,8days後の構造異性体存在比を測定した。陰イオン交換クロマトグラフィーの溶離 条件は下記の通りである。
く溶離条件〉
カフム： MONO Q (Amershambioscience)
移動相 A： 50mM Tris-HCl, pH8.0
移動相 B： 50mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH8.0
Flow rate： l.Oml/min Detection： 220nm
[0138] 図 7に、各溶液条件における peaklの 40°C-2,4,8daysの安定性試験後の異性化に よって生成した peak2の割合を示した。 peak2 percentageの計算方法は、実施例 1と同 様である。
これらより peaklから peak2への異性ィ匕反応は大きな pH依存性、 NaCl濃度依存性を 示した。 pHが低いほど、また NaCl濃度が低いほど、異性化が促進されることが明らか となった。通常の IgGは pH5.5〜6.0付近で安定であり、塩濃度は会合化に対して大き な影響は与えない（Pharm. Res. 1994, 11(5), 764- 771)ことが知られていることから、 s c(Fv)2の異性ィ匕反応は IgGの会合化とは全く異なるプロファイルを示した。
[0139] これまでにタンパク質のこのような異性ィ匕反応を報告されておらず、本研究によって 、 mVB22B sc(Fv)2における異性ィ匕反応は pHや NaCl濃度により抑制できることを初め て見出した。
[0140] 〔実施例 5〕異性化反応の凍結乾燥製剤下による安定ィ匕
異性化反応の抑制法として凍結乾燥製剤化の有効性を検討した。そこで、 mVB22 B sc(Fv)2の 2種類の構造異性体の混合物を凍結乾燥製剤化することで異性ィ匕反応 が抑制可能か検討を試みた。
く凍結乾燥製剤および溶液製剤の調製条件〉
20mM sodium citrate, 150mM NaCl, 5% sucrose,
〜％ polysorbate 80, pH7.0
VB22B sc(Fv)2： 0.2, 1.0, 5.0 mg/mL
Scale： 500uL
[0141] 上記条件で凍結乾燥製剤、および、溶液製剤を調製した。凍結乾燥製剤は、予め - 50°Cに予備凍結した凍結乾燥機（KYOWAC Triomaster ΠΑ-04、協和真空）にサン プルをローデイングし、 1時間放置した。品温が- 40°C以下になったことを確認し、 0.1 Torr以下に真空引きした後、 -20°Cで一次乾燥、 30°Cで二次乾燥を実施した。
[0142] 上記条件で intialおよび 40°C-lweek後、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、 構造異性体存在比を測定した (peak2 percentageの計算方法は、実施例 1と同様で ある)。陰イオン交換クロマトグラフィーの溶離条件は以下の通りである。 く溶離条件〉
カラム： MONO Q (Amershambioscience)
移動相 A： 50mM Tris-HCl, pH8.0
移動相 B： 50mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH8.0
Flow rate： l.Oml/min
Detection： 220nm
[0143] 図 8に intialおよび 40°C-lweek後の bivalent scFvの割合を示した。
溶液条件では、実施例 4に示したように bivalent scFvは single chain diabodyへの異 性ィ匕したのに対して、凍結乾燥状態では異性ィ匕は抑制された。これより、 sc(Fv)2を凍 結乾燥製剤化することによって異性ィ匕反応を抑制することを見出した。 2分子間の反 応である会合ィ匕ゃ水分子が関与する脱アミド化反応に関しては、凍結乾燥製剤化す ることはこれまでに報告されている。しかしながら、これまでにタンパク質のこのような 異性化反応を報告されておらず、本研究によって異性化反応は凍結乾燥製剤化す ることで抑制できることを初めて見出した。
[0144] これまでにタンパク質のこのような異性ィ匕反応を報告されておらず、本研究によって 、sc(Fv)2における異性ィ匕反応は凍結乾燥製剤化することで抑制できることを初めて 見出した。
[0145] 〔実施例 6〕 bivalent scFvあるいは single chain diabodyを高収率で得る方法
高純度に精製した hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体である peakl(91.4% peakl )を用いて、 peaklから peak2への異性ィ匕反応を促進することができるかどうか検討した 。 hVB22B sc(Fv)2は peaklと peak2の混合物として発現細胞から分泌される力 製造 工程中において、 peaklを peak2に異性化することが出来れば、 peak2の収率を向上 することができる。そこで以下に示す pHおよび NaCl濃度で peaklから peak2への異性 化の検討を行った。
[0146] 具体的には、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、下記条件における反応後 の構造異性体存在比を測定した。
く peakl→peak2異性化試験条件〉
20mM sodium citrate 0mM/150mM/300mM NaCl
PH3.0/3.5/4.0/4.5/5.0/5.5/6.0/6.5/7.0/7.5
25。C- 5days
[0147] 上記条件で反応後、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、 25°C- 5days後の構 造異性体存在比を測定した。陽イオン交換クロマトグラフィーの溶離条件は下記の通 りである。 peakl percentageの計算方法は、実施例 1と同様である。
く溶離条件〉
カラム： Bioassist S (TOSOH)
移動相 A： 20mM sodium phosphate, pH7.0
移動相 B： 20mM sodium phosphate, 500mM KC1, pH7.0
Flow rate： 0.8ml/min
Detection： 220nm
[0148] 実施例 1に示した陽イオン交換クロマトグラフィーの方法で peaklと peak2比を測定し た結果、図 9Aに示すように、 peaklのピークエリアが減少し、それに代わって、 peak2 のピークエリアが増大した。これより hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2においても、 bivalent scF vである peaklは、 single chain diabodyである peak2に構造変換することを見出した。そ の異性化速度は、低 pH及び低塩濃度ほど早いことを見出した。 peaklから peak2に異 性ィ匕させる本方法を用いることで、細胞より産生された peaklと peak2の混合物力も pea klを peak2に異性化させることによって、高収率で single chain diabodyである peak2を 得ることが可能である。
〔実施例 7〕ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の異性化反応の pH依存性
参考例 7に示された方法で得られたヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の異性ィ匕 反応を抑制することができる pHの検討を行った。
く安定性試験条件〉
20mM sodium citrate, 150mM NaCl, pH 4.5 I 5.5 I 6.5 I 7.5
ヒト化抗ヒト IL- 6受容体抗体 sc(Fv)2： 0.1mg/mL
50°C-10days
上記条件で反応後、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて、 50°C-10days後の構造異 性体存在比率を測定した。参考例 7に示されているとおり、、ゲルろ過クロマトグラフィ 一において、 bivalent scFv型力 ngle chain diabody型よりも早く溶出することを用い て両者の存在比率を測定した。ゲルろ過クロマトグラフィーの溶離条件は下記の通り である。
く溶離条件〉
カラム： TSKgel SuperSW2000 (TOSOH)
移動相： 50mM sodium phosphate, 300mM KC1, pH7.0
Flow rate： 0.2ml/min
図 9Bに、 initialと 50°C-10days後の構造異性体存在比率（bivalent scFv型存在比率 )を示した。ヒト化抗ヒト IL- 6受容体抗体 sc(Fv)2は、 50°C-10days pH4.5において singl e chain diabody型から bivalent scFv型の構造へ異性化反応が進行し bivalent scFv型 の存在比率が増加した。 hVB22B sc(Fv)2は bivalent scFv型から single chain diabody 型へ異性化反応が進行したのに対して、ヒトイ匕抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2におい ては single chain diabody型力も bivalent scFv型の構造へ異性化反応が進行した。図 9Bに示されたとおり、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の異性ィ匕反応は pH5.5以 上で抑制されることから、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の異性ィ匕反応は pHによ り抑制できることが明らかになった。
〔参考例 1〕VB22B sc(Fv)2の構造異性体の分離、構造決定、および活性評価
1-1. マウス抗ヒト Mpl抗体 mVB22B sc(Fv)2の作製
マウス抗ヒト Mpl抗体 mVB22B sc(Fv)2 (以下、 VB22B sc(Fv)2と称する）は、 Blood, 2 005, 105, 562-566に示す通りに作製した。具体的には、抗ヒト Mpl抗体を産生するマ ウスハイプリドーマ VB22Bの抗体可変領域 cDNAをクローユングし、リンカ一配列 (Gly GlyGlyGlySer)x3 (配列番号： 1)をコードする塩基配列および FLAG配列（AspTyrLys AspAspAspAspLys) (配列番号： 2)をコードする塩基配列を用いて、 VH リンカ一配 列 VL リンカー配列 VH リンカー配列 VL— Flagタグ配列で構成される塩基 配列（配列番号： 3)を持つような DNAを作製した。この DNA断片を発現ベクター pCX ND3にクローユングして VB22B sc(Fv)2発現ベクターを構築し、 CHO- DG44細胞に遺 伝子導入することで、安定発現細胞株を作製した。具体的には、発現ベクター (25 g)と PBSに懸濁した CHO- DG44細胞（1 X 107細胞/ mL)の 0.75mLを混合したものを 氷上で 10分間冷却し、キュベットに移した後に Gene Pulserll (BioRad)を用いて 1.5kV 、 25 μ FDの容量にてパルスを与えた。室温にて 10分間の回復期間の後、エレクト口 ポレーシヨン処理された細胞を、 500 μ g/mL Geneticin (Invitrogen)を含む CHO- S- S FMII培地（Invitrogen)に加えて選抜し、 VB22B sc(Fv)2産生 CHO細胞株を榭立した
[0150] 続 、て、この細胞株より培養上清を 20mMリン酸緩衝液 (pH6.8)で平衡ィ匕した Macr 0- Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I (Bio- Rad)カラムにかけ、 250mMリン酸緩衝 液 (PH6.8)で段階的に溶出した。溶出画分は、限外ろ過膜を用いて濃縮後、 HiLoad 26/60 Superdex200pgカラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、分子量が約 70kD〜40kDに相当する画分を分取した。この画分を、 50mM Tris-HCl(pH7.4), 150 mM NaCl, 0.05% Tween20で平衡化した Anti- Flag M2 Affinity Gel (SIGMA- ALDRIC H)カラムに吸着させ、 100 mM Glycine-HCl(pH 3.5)で溶出させた。溶出画分は、直 ちに 1M Tris-HCl (pH8.0)で中和を行い、 HiLoad 26/60 Superdex200pg (Amersham- Bioscience)カラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマトグラ フィ一のバッファ一は、 20 mM酢酸（pH6.0), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 80を使用し た。
[0151] 1-2. VB22B sc(Fv)2の構造異性体の分離
VB22B sc(Fv)2は VH1- linker- VL2- linker- VH3- linker- VL4の配列を有する sc(Fv)2 であることから、 Fv(VH,VL間で非共有結合した分子)の組み合わせにより、構造は V HIと VL2、 VH3と VL4がそれぞれ Fvを形成する bivalent scFv型と、 VH1と VL4、 VH2と VL3がそれぞれ Fvを形成する single chain diabody型の 2種類の構造異性体が存在す ると考えられる（図 10)。 VB22B sc(Fv)2の構造異性体の分離を検討した結果、下記 の溶離条件下で陰イオン交換クロマトグラフィー MONO Q (Amersham Bioscience)を 用いることにより VB22B sc(Fv)2の各種構造異性体の分離に成功した。
く溶離条件〉
移動相 A： 20mM Tris-HCl, pH8.0
移動相 B： 20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH8.0 流速： l.Oml/min
グラジェント： B0%→B35%(30min)
[0152] 上記条件により、 VB22B sc(Fv)2は 4つのピークに分離した。図 11に示すようなクロ マトグラムが得られ、保持時間の短いピークからそれぞれ、 pre peakl, pre peak2、 pe akl、 peak2と命名した。
[0153] peakl及び peak2に関して、 Q- TOF型質量分析計 (Q Tof Ultima, Micro Mass)に、 In fosionにて試料溶液を導入し得られた多価イオンスペクトル (+)を付属ソフト (MassLynx )を用いたデコンボリューシヨンを行った結果、それぞれの分子量は peakl ;54115Da、 p eak2;54112Daであったことから、 peaklと peak2は同一の分子量を有することが分かつ た。
[0154] VB22B sc(Fv)2は糖鎖付カ卩がないこと、また peaklと peak2は同一のアミノ酸一次配 列を持ち、且つ、イオン交換クロマトグラフィーで分離される互いに異なる立体構造を 有することから、 peaklと peak2は構造異性体 (conformational isomer)であることが示唆 された。公知文献では、構造異性体の存在は示唆されていた力 本検討により初め て構造異性体を分離することが可能になった。
[0155] 1-3. VB22B sc(Fv)2の構造異性体の構造決定
VB22B sc(Fv)2は VH1- linker- VL2- linker- VH3- linker- VL4の配列を有する sc(Fv)2 であることから、 Fv(VH,VL間で非共有結合した分子)の組み合わせにより、 VH1と VL 2、 VH3と VL4がそれぞれ Fvを形成する bivalent scFv型、 VH1と VL4、 VH2と VL3がそ れぞれ Fvを形成する single chain diabody型の 2種類の構造異性体が存在すると予想 されることから、 peaklと peak2はこれらの構造異性体であると考えられた。
[0156] 本検討により 2種類の構造異性体を同定する分析法として、プロテアーゼ限定分解 法を見出した。 sc(Fv)2のリンカ一部分は、比較的自由な構造を取っていると考えられ 、プロテアーゼに対する耐性が低いと考えられ、プロテアーゼの一種である subtilisin Aを用いて、以下の条件で peakl及び peak2及び VB22B bulk (peakl： peak2〜 1： 3) と反応させた。
く反応条件〉
20mM sodium citrate, 150mM NaCl, pH7.5 VB22B sc(Fv)2 peakl or peak2： 0.14mg/mL
Subtilisin A： lug/mL
37°C, 30min
[0157] 上記の反応後、 TrisGlycine SDS gel 12%を用いて、還元 SDS- PAGEを行った。その 結果、 VB22B bulk (構造異性体分離前）、 peakl、 peak2はいずれも同様のバンドパタ ーンを示した（図 12)。 VB22B sc(Fv)2の 3箇所のリンカ一部分の切断によると思われ る各断片の特異的なバンドが得られたことから、上記反応条件を用いることで、 VB22 B sc(Fv)2のリンカ一部分を部分的且つ限定的に分解できることが判明した。
[0158] 2種類の構造異性体において、 3箇所のリンカ一の中で 1箇所の切断が起こった場 合、図 13に示すように、未変性状態では VHと VLの間の非共有的な結合により single chain diabody型の構造においては、 3箇所のリンカ一の中でどのリンカ一に切断が起 こっても見かけの分子量には変化が見られないが、 bivalent scFv型においては、中 央のリンカ一に切断が起こった場合、半分の分子量の分子種が生成する。そこで、上 記反応条件により部分的にリンカ一を切断した、 VB22B bulk, peakl, peak2を TSK Su per2000(TOSOH)を用いてゲルろ過クロマトグラフィー分析を行った。その結果、図 1 4に示すように、 peak2では低分子量のピークが全く確認されなかったのに対して、 pe aklは低分子量 (約半分の分子量）のピークが確認された。 peaklと peak2の混合物で ある VB22B bulkは、 peaklの存在比に相当する量の低分子量のピークが確認された 。よって、 peaklは bivalent scFv型、 peak2は single chain diabody型であると同定され た。
[0159] 一連の手法により、 VB22B sc(Fv)2に含有する構造異性体を分離し、その構造を同 定することが可能となった。公知文献では、構造異性体の構造はモデル予測にて推 定していたが、本検討により分離された構造異性体の構造を同定する方法を見出し た。またイオン交換クロマトグラフィーのピーク面積から、 VB22B sc(Fv)2に含有する bi valent scFv構造と single chain diabody構造の構造異性体の存在比を定量的に評価 することが可能となった。
[0160] 1-4. VB22B sc(Fv)2の構造異性体の生物活性評価
抗ヒト Mpl抗体 VB22B sc(Fv)2は、文献（Blood 2005;105:562-566)において TPO様 ァゴ-スト活性を示すことが報告されている。そこで、 TPO依存性増殖を示す BaF3-h uman Mpほたは BaF3-monkey Mplを用いて分離した構造異性体の TPO様ァゴ-スト 活性を評価した。
[0161] 各細胞を 1% Fetal Bovine Serum(Invitrogen)を含む RPMI1640 (Invitrogen)で 2回洗 浄した後、 4xl05cells/mLとなるように 10% Fetal Bovine Serumを含む RPMI 1640に懸 濁し、 60 μ L/wellで 96well plateに分注した。 rhTPO (R&D)または構造異性体サンプ ルの濃度を振り、各 wellに 40 Lカ卩え、 37°C、 5%C02条件下で、 24時間培養した。 10 μ L/wellで WST- 8試薬（Cell Count Reagent SF、ナカライテスタ）を加え、直後に Ben chmark Plusを用いて 450nmの吸光度 (対照 655nm)を測定し、 2時間培養後に、再度 4 50 nmの吸光度 (対照 655nm)を測定した。 WST-8試薬は生細胞数に応じて 450nmの 発色反応を呈することから、 2時間の吸光度変化を指標に TPO様ァゴニスト活性を評 価し 7こ。
[0162] 精製した VB22B sc(Fv)2の構造異性体を用いて、 BaF3-human Mpl、 BaF3-monkey Mplにおける TPO様ァゴ-スト活性を評価した結果をそれぞれ図 15に示す。 peaklと p eak2の構造異性体のァゴニスト活性を比較すると、 peak2の方が著しく高 、活性を示 すことが明らかになった。このことから、抗 Mpl抗体 sc(Fv)2が TPO様ァゴ-スト活性を 発揮するためには、 single chain diabodyの構造を取る必要があることが示唆された。
[0163] 〔参考例 2〕 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体の分離、構造決定、および活性評 価
2-1. ヒト化抗ヒト Mpl抗体 hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2の作製
参考例 1で作製した VB22B sc(Fv)2の可変領域のフレームワーク領域 (以下、 FR)に 相補性抗原決定領域 (以下、 CDR)を移植したヒト化抗体を作製した。具体的には、リ ンカー配列 (GlyGlyGlyGlySer)x3 (配列番号： 1)をコードする塩基配列をコードする塩 基配列を用いて、 VH リンカー配列 VL リンカー配列 VH リンカー配列 VL で構成される塩基配列（配列番号: 4)を持つような遺伝子になるように、 50base程度 の合成オリゴ DNAを約 20base程度ハイブリダィズするように設計し、これらの合成オリ ゴ DNAを PCR法によりアッセンプリさせて各可変領域をコードする遺伝子を作製した。 得られた遺伝子を動物細胞で発現するように、参考例 1-1の方法と同様に発現べクタ 一構築、定常発現 CHO-DG44細胞株の作製を行い、培養上清を回収した。ヒト化抗 体 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2は Flagタグを付カ卩していないことから、培養上清からの精 製は、 VB22B sc(Fv)2が認識するェピトープである MG10 (ヒト Mplアミノ酸配列の Gln21 3から Ala231)と GST融合蛋白質を利用して行った。 MG10と GST融合蛋白質の精製は 、 Glutathione Sepharose 4B (Amersham Biosciences社製) 用 ヽて、メーカーのプロ トコールに従って精製した。さらに、精製した MG10と GST融合蛋白質をメーカーのプ ロトコールに従って、 HiTrap NHS- activated HP (Amersham Biosciences社製）に固定 化し、ァフィ-ティカラムを作製した。ヒト化抗体 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2発現 CHO細 胞の培養上清を MG10-GST融合蛋白質固定ィ匕カラムに流し、ヒト化抗体 hVB22B u2 -wz4 sc(Fv)2を吸着させ、 lOOmM Glycine- HCl(pH3.5),0.01% Tween80で溶出させた 。溶出画分は直ちに 1M Tris- HCl(pH7.4)で中和を行い、 HiLoad 16/60 Superdex200 pg (Amersham Biosciences社製）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲル ろ過クロマトグラフィーの緩衝液は、 20mMクェン酸緩衝液（pH7.5) , 300mM NaCl, 0. 01% Tween 80を使用した。
[0164] 2-2. hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体の分離、精製
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2は VHl- linker- VL2- linker- VH3- linker- VL4の配列を有 する sc(Fv)2であることから、 VB22B sc(Fv)2と同様に構造は Fv(VH,VL間で非共有結 合した分子）の組み合わせにより、 VH1と VL2、 VH3と VL4がそれぞれ Fvを形成する bi valent scFv型と、 VHlと VL4、 VH2と VL3がそれぞれ Fvを形成する single chain diabod y型の 2種類の構造異性体が存在すると考えられる（図 10)。
[0165] hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体の分離を検討した結果、陽イオン交換クロマ トグラフィー BioAssist S(TOSOH)を用いて、下記の溶離条件により hVB22B u2- wz4 s c(Fv)2の各種成分の分離できることが示唆された。
移動相 A： 20mM sodium phosphate, pH7.5
移動相 B： 20mM sodium phosphate, 500mM NaCl, pH7.5
流速： 0.8ml/min
グラジェント： B0%→B35%(30min)
上記条件により、 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2は 2つのピークに分離した。図 16に示す ようなクロマトグラムが得られ、保持時間の短いピーク力もそれぞれ、 peakl、 peak2と 命名した。
[0166] peakl及び peak2に関して、 Q- TOF型質量分析計 (Q Tof Ultima, Micro Mass)を用 いて分子量の測定を行った。 Q-TOFに infosionにて試料溶液を導入し、得られた多 価イオンスペクトル (+)を、付属ソフト (MassLynx)を用いたデコンボリューシヨンを行った 結果、 peaklの分子量として 53768Da、 peak2の分子量とし 53769Daを得た。このこと力 ら、 peaklと peak2は同一の分子量を有することが分かった。
[0167] peakl及び peak2に関して、ペプチドマッピングを行った。還元変性、 carboxymethyl 化後、トリプシンを用いてペプチド断片に分解し、逆相クロマトグラフィー (YMC- Pack -ODS)によりペプチドマップを得た。 peaklと peak2のペプチドマップを比較したところ 、図 17に示すように peaklと peak2のマッピングのパターンは同一であったことから、ァ ミノ酸一次構造は同一であることが分かった。
[0168] hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2は糖鎖付カ卩がなぐ peaklと peak2は TOF- MASS測定による 分子量が同一であること、 peaklと peak2はマッピングのパターンが同一であることから 、 peaklと peak2は互いに異なる立体構造を有する構造異性体 (conformational isomer )であることが分力つた。
[0169] hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2は VH1- linker- VL2- linker- VH3- linker- VL4の配列を有 する sc(Fv)2であることから、図 10に示すとおり、構造は Fv(VH,VL間で非共有結合し た分子）の組み合わせにより、 VH1と VL2、 VH3と VL4がそれぞれ Fvを形成する bivale nt scFv型と、 VH1と VL4、 VH2と VL3がそれぞれ Fvを形成する single chain diabody型 の 2種類の構造異性体が存在し、 peaklと peak2はそれぞれ bivalent scFv型と single ch ain diabody型のどちらかの構造であると考えられた。
[0170] 2種類の構造異性体を同定する分析法として、プロテアーゼ限定分解法を見出した 。 sc(Fv)2のリンカ一部分は、比較的自由な構造を取っているためプロテア一ゼに対 する耐性が低いと考えられ、プロテアーゼの一種である subtilisin Aを用いて、以下の 条件で peakl及び peak2及び hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2 (peakl： peak2〜 1： 4)と反応 させた。
20mM sodium citrate, 150mM NaCl, pH7.5 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peakl or peak2： 0.15mg/mL
Subtilisin A： lOug/mL
37°C, 30min
[0171] 反応後、 Phastgel Homogeneous 12.5%を用いて、還元 SDS-PAGEを行った。その結 果、図 18に示すとおり、 hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2 bulk, peakl、 peak2いずれも同様の バンドパターンを示した。 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の 3箇所のリンカ一部分の切断によ ると思われる各断片の特異的なバンドが得られたことから、上記反応条件を用いるこ とで、 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のリンカ一部分を部分的且つ限定的に分解できること が分かった。
[0172] bivalent scFv型と single chain diabody型の構造において、 3つのうちのリンカ一の一 箇所の切断が起こった場合、図 13に示すように、未変性状態では、 VHと VLの間の 非共有的な結合により single chain diabody型の構造においては、 3つのうちのどのリ ンカーに切断が起こっても見かけの分子量には変化が見られないが、 bivalent scFv 型においては、中央のリンカ一に切断が起こった場合、半分の分子量の分子種が生 成する。そこで、上記反応条件により部分的にリンカ一を切断した、 WB22B u2-wz4 sc(Fv)2 bulk, peakl, peak2を TSK SuperSW2000(TOSOH)を用いてゲルろ過クロマト グラフィー分析を行った。その結果、図 19に示すように、 peak2においては低分子量 のピークが全く確認されなかったのに対して、 peaklにお!/、ては低分子量 (約半分の 分子量）のピークが確認された。 peaklと peak2の混合物である hVB22B sc(Fv)2 u2-w z4 bulkは、 peaklの存在比に相当する量の低分子量のピークが確認された。よって、 本結果より、 peaklが bivalent scFv型であり、 peak2が single chain diabody型であると 同定された。
[0173] 2-3. hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体の結合活性評価
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2より分離した peakl、 peak2及び hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2の 結合活性の評価を以下のとおり行った。 Biacore 3000(Biacore社製)に Sensor Chip C M5(Biacore社製)を装着し、ァミンカップリング法にて 2-1で示した MG10 (ヒト Mplの Gin 213から Ala231と GST融合蛋白質）を固定ィ匕した。測定のランニングバッファ一は HBS -EP Buffer(Biacore社製)を使用し、流速は 20 L/minとした。 HBS- EP Bufferにより、 およそ 5 nMから 150 nM程度の 6点の濃度になるように、ヒト化 VB22B u2-wz4 sc(Fv)2 bulk, peakl, peak2を調製し、前述の MG10固定化セルに、これらのサンプルをそれ ぞれ、 2分間添加して結合領域を得た後に、解離領域を 2分間測定した。 MG10-GST 融合蛋白質に結合した VB22B sc(Fv)2は、 20mM HC1を 1分間添カ卩して除去し、固定 化セルを再生した。得られたセンサーグラムより、 BIAevaluation ver.3.1ソフトウェア (Bi acore社製)を用いて、 Bivalent analyte modelを適用し、結合速度定数 (ka) '解離速度 定数 (kd)を算出した。その結果、表 1に示すとおり、 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 bulk, pe akl, peak2の解離定数 (KD)は、それぞれ 1.02x10-8 M, 1.24x10-8 M, 9.92 xlO-9 M であり、ほぼ 2つの構造異性体はほぼ同等の結合活性を持つことが分力つた。
[0174] [表 1]
Figure imgf000067_0001
[0175] 2-4. hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体のァゴ-スト活性評価
peakl及び peak2及び hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2のァゴ-スト活性の評価を行った。図 20に示すように、ァゴ-スト活性は構造異性体間で大きく異なり、 single chain diabod y構造の peak2が非常に高いァゴ-スト活性を示したのに対して、 bivalent scFv構造 の peaklの活性は極めて小さ力つた。 2つの構造異性体は、結合活性はほぼ同程度 であったのに対して、ァゴニスト活性は著しく異なった。公知文献においては構造異 性体の分離'同定が行われていな力つたため、本検討で初めて 2種類の構造異性体 の間で生物学的な活性が異なることが見出された。
[0176] 本参考例にぉ 、て、 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2に含有する構造異性体を分離し、そ の構造を同定することが可能となった。またクロマトグラフィーのピーク面積により、 hV B22B u2-wz4 sc(Fv)2に含有する bivalent scFv構造と single chain diabody構造の構 造異性体の存在比を定量的に分析することが可能となった。 hVB22B u2-wz4 sc(Fv) 2においては bivalent scFv構造と single chain diabody構造ではァゴ-スト活性に著し い違いがあることが分かり、これらの活性の著しく異なる構造異性体を含む hVB22B u 2-wz4 sc(Fv)2を医薬品として開発するためには、 2種類の構造異性体の性質を決定 し、各構造異性体の含有比率を定量的に分析する規格試験は必要不可欠である。
[0177] 〔参考例 3〕VB22B sc(Fv)2リンカ一改変体の構造異性体存在比の分析および構造異 性体比の制御
VB22B sc(Fv)2は VH1- linker- VL2- linker- VH3- linker- VL4の配列を有する sc(Fv) 2であることから、構造は Fv(VH,VL間で非共有結合した分子）の組み合わせにより、 V HIと VL2、 VH3と VL4がそれぞれ Fvを形成する bivalent scFv型と、 VH1と VL4、 VH2と VL3がそれぞれ Fvを形成する single chain diabody型の 2種類の構造異性体が存在す ると考免られる。
[0178] 中央のリンカ一を middle linkerとし、両端のリンカ一を edge linkerとし、図 21に示す ような middle linkerあるいは edge linkerの長さの異なる各種 VB22B sc(Fv)2を作製し、 それらの構造異性体存在比の定量的な分析を以下の条件で行った。
カフム： MONO Q (Amershambioscience)
移動相 A： 20mM Tris-HCl, pH8.0
移動相 B： 20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH8.0
流速： 1.0mlノ min
グラジェント： B0%→B35%(30min)
[0179] その結果、図 22に示すように、任意の長さのリンカ一において参考例 2に示した分 析法により 2つの構造異性体を分離することができ、構造異性体存在含有比率を測 定することが出来た。リンカ一の長さによって、 bivalent scFv型と single chain diabody 型の比を制御することが可能であることが分かり、本分析法を用いることにより目的の 構造異性体比を得ることが出来る適切なリンカ一長を設計することが可能となった。
[0180] 公知文献では、 2つの構造異性体の構造同定法、及び、定量的な分析法が見出さ れていな力つたため、このようなリンカ一の長さと構造異性体の存在比を定量的に評 価することは出来なかった。 Protein Engineering, 1993, 6(8), 989- 995や Protein Engi neering, 1994, 7(8), 1027- 1033等においてリンカ一の長さが 12以下の場合は、近接 する VHと VL同士は Fvを形成しにくいことが一般的に報告されていた力 本検討によ り、 G5や G10においては、近接する VHと VL同士が Fvを形成した single chain diabody 型の構造が少量ながら存在することが分力つた。すなわち、いかなるリンカ一におい ても 2つの構造 (すなわち構造異性体)が存在する可能性が考えられた。そのため医 薬品として sc(Fv)2型の分子を開発するためには、いかなるリンカ一においても構造 異性体の存在比率を定量的に分析する必要があると考えられ、このことから構造異 性体の存在比率を定量的に分析可能且つ分離生成可能な本分離分析法は、 sc(Fv) 2型の医薬品分子を開発するにあたって極めて有用である。
[0181] 〔参考例 4〕陽イオン交換クロマトグラフィー（SOURCE 15S)による構造異性体の大量 精製
参考例 2-1で使用した hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2発現 CHO細胞の培養上清力 精製 を行った。培養上清は、精製水で 3倍に希釈した後、 1 M酢酸で pHを 6.0に調整した。 この後、 20 mM酢酸ナトリウム緩衝液、 pH 6.0で平衡化した SP Sepharose Fast Flow column(Amersham Biosciences社製)にかけ、同緩衝液でカラムを洗浄後、同緩衝液 中 0 M力 0.5 Mまでの NaClの直線濃度勾配で、カラムに吸着したポリペプチドを溶 出した（第一工程）。得られた画分を TrisGlycine SDS gel 12%を用いた還元 SDS-PAG Eで分析し、 hVB22B u2-wz4を含む画分を集めた。
[0182] 第一工程の hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2画分は、 10 mMリン酸緩衝液、 pH 6.8で平衡 化したハイドロキシアパタイトカラム，タイプ I, 20 m (BIO- RAD社製)に添カ卩し、同緩 衝液でカラムを洗浄後、 pH 6.8のリン酸緩衝液濃度を 160 mMまで直線的に上げ、力 ラムに吸着したポリペプチドを溶出した（図 23)。メインピークの後に、小さなピークが 溶出したが、 SDS-PAGE分析の結果、これらはいずれも hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2であ ることが確認された。図 23右に示したように、 Superdex 200 PC 3.2/30 column(Amers ham Biosciences社製)を使用した分析ゲルろ過により、メインピークはほとんどが hVB 22B u2-wz4 sc(Fv)2のモノマーであり、後ろのピークは hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2のダ イマ一以上のァグリゲート画分であることがわかった。以上より、この工程で hVB22B u 2-wz4 sc(Fv)2のモノマー画分を分離できることがわかった。
[0183] 第二工程で得られた hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のモノマー画分は、精製水で 5倍に希 釈した後、 20 mMリン酸ナトリウム緩衝液、 pH 7.0で平衡化した SOURCE 15S column (Amersham Biosciences社製)にかけ、同緩衝液でカラムを洗浄後、同緩衝液中 0 mM 力も 36 mMまでの NaClの直線濃度勾配をかけたのち、 2つのピークを最大限に分離 して溶出させるため、ー且 36 mMで NaClの濃度を固定した。図 24に示すように、 2つ の hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のピークが溶出されたのち、再び NaClの濃度を上げて、さ らに強くカラムに吸着したポリペプチドを溶出しカラムを洗浄した。これら 2つのピーク は、 2-2で示した BioAssist Sカラムによる分析で、先に溶出するメインピークが peak2 で、後力も溶出するのが peaklであることが判明した (図 25)。
[0184] 精製した hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2の peaklと peak2は、前述の SDS gelを用いて還元 と非還元両条件で SDS-PAGE分析をおこなったところ、いずれも分子量約 55 kDaの 位置にシングルバンドとして観察された (図 26)。さらに hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の pea klと peak2は、 1-3で示した TSK Super2000カラムによるゲルろ過クロマトグラフィー分 祈で、いずれもシングルピークで見かけ上の分子量約 50 kDaを示した (図 27)。
以上より、 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の目的とする構造異性体のモノマーのみを、大 量精製に不向きなゲルろ過クロマトグラフィーを使用せずに精製する方法の開発に 成功した。
[0185] 〔参考例 5〕VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の作製、構造異性体分析および同定
5-1. VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の作製
参考例 2で作製した hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 (以下、 u2- wz4)の VH/VL界面を形成 するアミノ酸である VHの 39番目（WO2005/56604の配列番号： 289に記載のアミノ酸 配列における 39位）の Ginと VLの 38番目（WO2005/56604の配列番号： 291に記載の アミノ酸配列における 43位）の Ginを以下のようにして改変した。 u2-wz4は [VH1]リン カー [VL2]リンカ一 [VH3]リンカ一 [VL4]の順にアミノ酸リンカ一配列 (GlyGlyGlyGlyS er)x3 (配列番号：1)で連結されており、配列番号 4で記載した塩基配列で転写、翻 訳される。はじめに、 VH1の 39番目の Gin (遺伝子コドン C AG)を Glu (遺伝子コドン GA G)に、 VL2の 38番目の Gin (遺伝子コドン C AG)を Glu (遺伝子コドン GAG)に、 VH3の 39番目の Gin (遺伝子コドン CAG)を Lys (遺伝子コドン AAG)に、 VL4の 38番目の Gin ( 遺伝子コドン CAG)を Lys (遺伝子コドン AAG)に改変した遺伝子 hVB22B u2-wz4(vl) sc(Fv)2 (以下 vl、塩基配列を配列番号： 14に、アミノ酸配列を配列番号： 15に示す） を作製した。さらに、 VH1の 39番目の Gin (遺伝子コドン CAG)を Glu (遺伝子コドン GA G)に、 VL2の 38番目の Gin (遺伝子コドン CAG)を Lys (遺伝子コドン AAG)に、 VH3の 39番目の Gin (遺伝子コドン CAG)を Lys (遺伝子コドン AAG)に、 VL4の 38番目の Gin ( 遺伝子コドン CAG)を Glu (遺伝子コドン GAG)に改変した遺伝子 hVB22B u2-wz4(v3) sc(Fv)2 (以下 v3、塩基配列を配列番号： 16に、アミノ酸配列を配列番号： 17に示す） を作製した。遺伝子の改変は QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATAG ENE社製)を用いてメーカーのプロトコールに従い、点突然変異を導入した。各遺伝 子の塩基配列を確認した後、 DNA断片を発現ベクター pCXND3にクローユングして 発現ベクターを構築し、 CHO-DG44細胞に遺伝子導入することで、安定発現細胞株 を作製した。具体的には、発現ベクター（20 /z g)と PBSに懸濁した CHO-DG44細胞（1 X 107細胞/ mL)の 0.75mLを混合したものを氷上で 10分間冷却し、キュベットに移した 後に Gene Pulser Xcell (BioRad)を用いて 1.5kV、 25 μ FDの容量にてパルスを与えた 。室温にて 10分間の回復期間の後、エレクト口ポレーシヨン処理された細胞を、 500 g/mL Geneticin (Invitrogen)を含む CHO- S- SFMII培地（Invitrogen)に加えて選抜し 、 vl産生 CHO細胞株および v3産生 CHO細胞株を榭立した。
VH/VL界面改変型 sc(Fv)2は Flagタグを付カ卩して!/ヽな 、こと力ら、培養上清からの 精製は、 VB22B sc(Fv)2が認識するェピトープである MG10 (ヒト Mplアミノ酸配列の Gin 213から Ala231)と GST融合蛋白質を利用して行った。 MG10と GST融合蛋白質の精製 は、 Glutathione Sepharose 4B (Amersham Biosciences社製)を用いて、メーカーのプ ロトコールに従って精製した。さらに、精製した MG10と GST融合蛋白質をメーカーの プロトコールに従って、 HiTrap NHS- activated HP (Amersham Biosciences社製）に固 定化し、ァフィ二ティカラムを作製した。 vl発現 CHO細胞株または v3発現 CHO細胞 株の培養上清を MG10-GST融合蛋白質固定ィ匕カラムに流し、 vlまたは v3を吸着させ 、 lOOmM Glycine-HCl(pH3.5),0.01% Tween80で溶出させた。溶出画分は直ちに 1M Tris— HCl(pH7.4)で中和を行い、 HiLoad 16/60 Superdex200pg (Amersham Bioscienc es社製)を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、モノマー分子を精製した。ゲル ろ過クロマトグラフィーの緩衝液は、 20mMクェン酸緩衝液（pH7.5) , 300mM NaCl, 0. 01% Tween 80を使用した。図 28に示したゲルろ過クロマトグラフィーの結果から、改 変体 vl, v3は培養上清中でダイマー以上の凝集体が低下し、モノマー比率は改変 前の u2-wz4の 59%と比較して、 vlが 89%、 v3が 77%と上昇していることが明らかになった 。改変体 vl, v3は VH/VL界面のアミノ酸を改変することにより、電荷的な反発により好 ましくない会合を阻害し、好ましい会合を促進したことが推測される。以上のことからこ の会合制御により、効率的なモノマー分子の発現に成功した。
[0187] 5-2.VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の構造異性体分析および同定
得られた VH/VL界面改変体である vl、 v3および未改変体である u2-wz4の構造異 性体存在比を陽イオン交換クロマトグライフィーおよび等電点電気泳動により分析し た。また、プロテアーゼ限定分解法による構造同定を実施した。
陽イオン交換クロマトグラフィーは以下のとおり実施した。
カラム： TSK— gel Bioassist S, 4.6 mm X 50 mm (TOSOH社製） 流速： 0.8mL/min
検出波長： 220nm
溶出条件：
Eluent A : 20 mmol/L Phosphate buffer (pH 7.0)
Eluent B : 20 mmol/L Phosphate buffer I 500 mmol/L NaCl (pH7.0) グラジェント：
Time(min) B%
0 0
5 0
25 30
25.1 100
35 100
35.1 0
[0188] 等電点電気泳動は以下のとおり実施した。 PhastGel Dry IEFゲル (Amersham Biosci ences社製)を以下のゲル膨潤液にて 30分以上膨潤した。試料を先に膨潤させたゲル に添加し、 PhastSystemにより以下の泳動条件で電気泳動した。泳動後、 20%TCA溶 液に 30分間浸した後、ミリ Q水で 5分間 X 3回以上洗浄し、試料のタンパク質濃度に 応じてクマシ一染色、または銀染色した。クマシ一染色では、染色液として 0.1%CuSO (w/v)を含む 0.02%CBBを用い、染色を行い、 10%酢酸を含む 30%メタノールで脱色し
4
た。銀染色では、 Silver stain kit, Protein (Amersham Biosciences社製）を用い、キット に添付された標準プロトコールにより染色を行った。
くゲル膨潤液〉
Pharmalyte 8.5-10 80 ^ L
Biolyte 7-9 lO ^ L
Biolyte 3-9 lO ^ L
20% Glycerol 2.0mL
〈電気泳動プログラム〉
SAMPLE APPLICATION DOWN AT step2 OVh
SAMPLE APPLICATION UP AT step3 OVh
Step 1 2000V 2.5mA 3.5W 15°C 75Vh
Step 2 200V 2.5mA 3.5W 15°C 15Vh
Step 3 2000V 2.5mA 3.5W 15°C 410Vh
[0189] プロテアーゼ限定分解法による構造同定は以下の条件で実施した。 subtilisin Aを 用いて、以下の条件で u2-wz4精製 peaklと u2-wz4精製 peak2、及び、改変体 vlと改 変体 v3を反応させた。
20mM sodium citrate, 150mM NaCl, pH7.5
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peakl or peak2： 0.15mg/mL
Subtilisin A： lOug/mL
37°C, 30min
[0190] 得られた反応液をゲルろ過クロマトグラフィーにより以下の条件で分析した。
Column： TSKgel Super2000sw (TOSOH)
Eluent： 50mM sodium phosphate, 300mM KC1, pH7.0
Flow rate： 0.2ml/min
Detection： 220nm
[0191] 図 29および図 30に示した陽イオン交換クロマトグラフィーと等電点電気泳動による 構造異性体の分析結果から、 u2- wz4は 24%力 bivalent scFv型、 76%が single chain dia body型として両構造異性体の混合物として発現しているのに対して、改変体 vlは 100 y ngle chain diabody型の構造異性体として発現しており、改変体 v3は 100%が bival ent scFv型の構造異性体として発現していることが分力つた。また図 31に示すとおり 、プロテアーゼ限定分解の結果からも、改変体 v3は u2-wz4精製 peaklと同様に低分 子のピークが見られ、改変体 vlは u2-wz4精製 peak2と同様に低分子のピークが見ら れなかったことから、改変体 vlは single chain diabody型の構造異性体として発現して おり、改変体 v3は bivalent scFv型の構造異性体として発現していることが示された。
[0192] 〔参考例 6〕 VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の活性評価および安定性評価
6-1. VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の生物活性評価
参考例 1に示す方法に従って、 VH/VL界面改変体 vlおよび v3のァゴニスト活性の 評価を行った。ァゴ-スト活性は構造異性体間で大きく異なり図 20に示すように、 sin gle chain diabody構造の peak2が非常に高いァゴ-スト活性を示すのに対して、 bivale nt scFv構造の peaklの活性は極めて低下する。図 32に示すとおり、改変体 vlは peak 2と同等の活性を示し、改変体 v3は peaklとほぼ同等の活性を示した。以上のことから 生物活性においても、改変体 vlが single chain diabody構造を、改変体 v3が bivalent s cFv構造を形成して 、ることが確認された。
[0193] 6-2. VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の安定性評価
u2-wz4精製 peaklと u2-wz4精製 peak2、および、改変体 vlと改変体 v3の安定性評 価として、示走査型熱量測定（Differential Scanning Calorimetry)を用いて変性中間 温度 (Tm値)の測定を以下の条件下で行った。
DSC： N-DSCII (Applied Thermodynamics社製）
溶液条件： 20mM sodium citrate, 300mM NaCl, pH7.0
タンパク質濃度: O.lmg/mL
スキャニング速度：1°C/分
[0194] 各 DSC測定の結果を図 33に示した。 u2-wz4精製 peak2と改変体 vlの Tm値は未改 変体とほぼ同等であり、安定性は同等であることが分力つた。 u2-wz4精製 peaklと改 変体 v3とでは、若干改変体 v3のほうが低い安定性を示した。 knobs-into-hole技術を 用いた方法による界面制御においては、例えば IgGの CH3ドメインのヘテロ会合にお いて、未改変 CH3ドメインの Tm値が 80.4°Cであったのに対して、改変 CH3ドメインの T m値は 69.4°Cであり、大幅に Tm値が低下し安定性が低下してしまうことが報告されて いる（Acta Pharmacologica Sinica, 2005, 26, 649-658)。それに対して、本発明にお いては安定性を低下させること無く会合を制御できることが確認された。
[0195] 続いて、 u2-wz4精製 peaklと u2-wz4精製 peak2および VH/VL界面改変体である改 変体 vlと改変体 v3の安定性評価として、以下の条件における熱加速試験による安定 性評価を実施した。
く熱加速条件〉
溶液条件： 20mM sodium citrate, pH6.0
タンパク質濃度: 0.25mg/mL
加速条件： 40°C-6day, 12day
熱加速サンプルは、ゲルろ過クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィ 一により以下の条件で分析した。
[0196] 図 34に示すとおり、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分析の結果、 u2-wz4精製 peak 2と改変体 vlのモノマー残存率はほぼ同等であり、会合ィヒに対する安定性はほぼ同 等であることが確認された。また、 u2-wz4精製 peaklと改変体 v3のモノマー残存率も モノマー残存率はほぼ同等であり、両構造異性体において会合ィヒに対する安定性 はほぼ同等であることが分かった。
[0197] 図 35に示すとおり、陽イオン交換クロマトグラフィーによる分析の結果、未改変体の 精製 peaklは異性化反応により peak2に異性化し、未改変体精製 peak2は異性化反応 により peaklに異性ィ匕したのに対して、 VH/VL界面改変体 vlと v3は熱加速後も異性 化反応は起こさな力つた。 VH/VL界面の改変を適用することによって、 2種類の構造 異性体のうち一方のみの構造異性体が 100%の状態で発現できることにカ卩えて、得ら れた各構造異性体は異性化反応を起こさず安定に保存可能であることが分かった。
[0198] 本参考例において、 vlおよび v3に適用した VH/VL界面改変を用いることによって、 2種類の構造異性体のうち一方のみの構造異性体が 100%存在する状態で発現でき ることを見出した。目的の構造の一本鎖抗体を得るための VH/VL界面制御としては、 knobs- into- hole技術を用いて Bispecific diabodyの構造を制御する方法（Protein Sci . 1997 Apr;6(4):781- 8, Remodeling domain interfaces to enhance heterodimer forma tion., Zhu Z, Presta LG, Zapata G, Carter P.)が知られている。この方法では、 VH/ VL界面あたり合計 4箇所のアミノ酸を改変することにより目的のへテロダイマー構造 の形成率が 72%から 92%まで上昇したことを報告している。それに対して、本発明は 4 箇所のアミノ酸 (VH/VL界面あたりでは 2箇所のアミノ酸)を改変することにより、熱安 定性および構造異性体の安定性を低下させることなぐ 目的の構造を 100%の比率で 取得することに成功した。
[0199] 〔参考例 7〕ヒト化抗ヒ HL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の分離、構造決定
6-1. ヒトイヒ抗ヒ HL-6受容体抗体 sc(Fv)2の作製
Sato K.ら（Cancer Research 1993;53:851-856)により報告されているヒト化抗ヒト IL- 6受容体抗体の VHと VLを用いて、リンカ一配列 (GlyGlyGlyGlySer)x3 (配列番号： 1) をコ一ドする遺伝子を用いて、 VH リンカー配列 VL リンカー配列 VH リンカ 一配列— VLで構成されるように連結した sc(Fv)2遺伝子 (アミノ酸配列；配列番号： 18 、塩基配列;配列番号： 19)を作製した。得られた遺伝子を動物細胞で発現するよう に、発現ベクター pMCDNに挿入した。本ベクター pMCDNの構築の流れについて、 以下に述べる。 pUC19ベクターにマウスサイトメガロウイノレス (mCMV)ェンハンサ一お よびプロモーター、シミアンウィルス- 40(SV40)の後期ポリアデュル部位を挿入したベ クタ一を pMCと命名した。次に、 DHFR- A E-rVH- PMl-f(W092/ 19759参照）の抗 体 H鎖遺伝子とベクターを分割するために、制限酵素 EcoRI, Smal部位で消化し、ベ クタ一側のみ回収した後に、 EcoRI- Notl-BamHI adaptor (宝酒造）をクローユングし た。このベクターを pCHOIと命名した。 pCHOIの DHFR遺伝子発現部位と pCXN (Niwa ら、 Gene 1991； 108 : 193-200)の制限酵素の Neomycin而性遺伝子発現部位を pMC ベクターに挿入した発現ベクターを pMCDNと命名した。構築したヒト化抗ヒト IL-6受 容体抗体 sc(Fv)2発現ベクターを制限酵素で直鎖上にしたのちに、 CHO-DG44細胞 に遺伝子導入して抗体発現細胞株を榭立した。
[0200] 安定発現細胞株の作製は次に示すようにして行った。細胞への遺伝子導入は、 Ge nePulserXcell (Bio-Rad)を用いたエレクト口ポレーシヨン法により行った。各抗体発現 ベクターと PBSに懸濁した CHO細胞（1 X 107細胞/ mL)の 0.75mLを混合したものを氷 上で 10分間冷却し、キュベットに移した後に 1.5kV、 25 μ FDの容量にてパルスを与え た。室温にて 10分間の回復期間の後、エレクト口ポレーシヨン処理された細胞を、 HT supplement (Invitrogen)を 1倍濃度で含む CHO- S- SFMII培地 (Invitrogen) 40mLに懸 濁した。同様の培地で 10-50倍希釈液を作製し、 96ゥエル培養用プレートに 100 L/ wellで分注した。 COインキュベーター（5% CO )で 24時間培養後、 Geneticin (Invitro
2 2
gen)を 0.5mg/mLになるように添加して、 2週間培養した。薬剤耐性を示す形質転換 細胞のコロニーを順次拡大培養し、榭立した高産生細胞株を用いて大量培養を行 ヽ 、培養上清を得た。
[0201] ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体の L鎖が Protein Lに結合することを利用して、ヒト化抗 ヒト IL- 6受容体抗体 sc(Fv)2発現 CHO細胞の培養上清を Protein L (Actigen社製）を 充填したカラムに流し、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2を吸着させ、 lOOmM Gly cine-HCl(pH2.7)で溶出させた。溶出画分は直ちに 1M Tris- HCl(pH8.5)で中和を行 い、 HiLoad 26/60 Superdex200pg (Amersham Biosciences社製）を用いてゲルろ過ク 口マトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマトグラフィーの緩衝液は、ダルベッコ PBSを 使用した。
[0202] 6-2. ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の分離、精製
ヒトイ匕抗ヒト IL— 6受容体抗体 sc(Fv)2は VH—linker— VL—linker— VH—linker— VLの
1 2 3 4 配列を有する sc(Fv)2であることから、参考例 1の VB22B、参考例 2の hVB22Bと同様に Fv(VH,VL間で非共有結合した分子)の組み合わせにより、構造は VHと VL、 VHと V
1 2 3
Lがそれぞれ Fvを形成する bivalent scFv型と、 VHと VL、 VHと VLがそれぞれ Fvを
4 1 4 2 3
形成する single chain diabody型の 2種類の構造異性体が存在すると考えられる（図 1 0)。ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の分離を検討した結果、下記 の溶離条件下で陽イオン交換クロマトグラフィー BioAssist S (TOSOH)を用いることに よりヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の分離に成功した。
く溶離条件〉
移動相： 20mM Tris-HCl pH8.5, 75 mM NaCl
流速： 0.8ml/min
グラジェント：イソクラティック (グラジェント無し） 上記条件により、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2は 2つのピークに分離した。 図 36に示すようなクロマトグラムが得られ、保持時間の短いピークを peakl、長いピー クを peak2と命名した。同方法により Peaklと peak2を精製することができた。精製後の p eaklと peak2の陽イオン交換クロマトグラフィー分析の結果を図 37に示した。
6-3. ヒトイ匕抗ヒ ML-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の同定
分取したヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の peaklと peak2は構造異性体と考え られたためで、 2種類の構造異性体を同定する分析法として、参考例 1、 2、 3で実施 したプロテアーゼ限定分解法を用いた。以下の条件でヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 s c(Fv)2の peaklおよび peak2と反応させた。
PBS (pH7.4)
ヒトイ匕抗ヒト IL— 6受容体抗体 sc(Fv)2 peakl or peak2： 0.05mg/mL
Subtilisin A： 0.5ug/mL
37°C, 60min
上記反応後、 Phastgel Homogeneous 12.5%を用いて、還元 SDS-PAGEを行った。そ の結果、図 38に示すとおり、 peakl , peak2いずれも同様のバンドパターンを示した。 上記反応条件により部分的にリンカ一を切断した、 peakl、 peak2を以下の条件で TSK
SuperSW2000(TOSOH)を用いてゲルろ過クロマトグラフィー分析を行った。
移動相： 50mM sodium phosphate, 300mM KC1, pH7.0
流速： 0.2ml/min
その結果、図 39に示すように、 peaklにおいては低分子量のピークがほとんど確認 されなかったのに対して、 peak2においては低分子量 (約半分の分子量）のピークが 確認された。よって、本結果より、 peaklが single chain diabody型であり、 peak2が bival ent scFv型であると同定された。図 36よりヒトイ匕抗ヒト IL- 6受容体抗体 sc(Fv)2におい ては peaklよりも peak2の含量が多いことから、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2に おいては bivalent scFv型が主成分であり、 single chain diabody型はマイナー成分で あることが分かった。参考例 1における VB22B sc(Fv)2、および参考例 2における hVB 22B u2-wz4 sc(Fv)2においては、 single chain diabody型が主成分であったことから、 s c(Fv)2の可変領域配列の違いにより、構造異性体の含有率が大きく変化することが 分力つた。構造異性体含有率が sc(Fv)2の可変領域配列により大きく変化することか ら、 sc(Fv)2を医薬品として開発するにあたっては、構造異性体の分離と構造同定は 重要であると考えられる。
[0205] 〔参考例 8〕ヒト化抗ヒ HL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の活性評価
7-1.ヒト gpl30発現 BaF3細胞株、ヒト gpl30/ヒト IL-6受容体共発現 BaF3細胞株の榭
IL-6依存増殖性を示す細胞株を得るために、以下に示すとおり、ヒト gpl30を発現し た BaF3細胞株の榭立を行った。
全長ヒト gpl30 cDNA (Hibiら、 Cell 1990 ; 63 : 1149- 1157 (GenBank # NM— 002184》 を PCRにより増幅し、 pCHOI (Hirataら、 FEBS Letter 1994 ; 356 : 244- 248)の DHFR遺 伝子発現部位を除去し、 Zeodn耐性遺伝子発現部位を挿入した発現ベクター pCOS 2Zeoにクローユングし、 pCOS2Zeo/gpl30を構築した。
10 gの pCOS2Zeo/gpl30を PBSに懸濁した BaF3細胞 (0.8xl07cells)に混合し、 Gen e Pulser (Bio- Rad)を用いて 0.33kV, 950 FDの容量でパルスを加えた。エレクトロポ 一レーシヨン処理により遺伝子導入した BaF3細胞を 0.2ng/mLの mouse interleukin- 3 (Peprotech)、 10% Fetal Bovine Serum (以下 FBSゝ HyClone)を含む RPMI1640培地（I nvitrogen)で一昼夜培養し、 100ng/mLの human interleukin- 6(R&D)、 lOOng/mLの h uman interleukin- 6 soluble receptor (R&D systems)および 10%FBSを含む RPMI1640 培地をカ卩えて選抜し、ヒト gpl30発現 BaF3細胞株（以下、 BaF3/gpl30)を榭立した。
[0206] 7-2.ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体のヒ HL-6中和活性評価
IL-6依存性増殖を示す BaF3/gpl30を用いて、以下に示すとおり、 IL-6中和活性を 評価した。精製したヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体を 10 g/mL になるように 10% FBSを含む RPMI1640に希釈した。この溶液を用いて希釈公比 3、合 計 6系列の希釈液を調製し、 96weU- plate(FALCON)の各 wellに 50 μ Lずつ分注した。 次に、 BaF3/gpl30を 10% FBS (HyClone)を含む RPMI 1640培地で 3回洗浄した後に、 5x10 cells/mLとなるよつに 60ng/mLの human interleukin— 6 (R&D systems) ^ 60ng/mL の可溶性ヒ HL-6受容体（自社調製品）および 10% FBSを含む RPMI1640培地に懸濁 し、抗体サンプルを分注した wellに 50 /z Lずつ混合した。ヒト可溶性 IL_6受容体は以 下に示す方法で調製した。ヒト可溶性 IL-6受容体 (Yamasakiら、 Science 1988 ; 241 : 82 5-828 (GenBank # X12830))の 1番目から 344番目のアミノ酸をコードする遺伝子を CH 0細胞に導入後に培養上清力 精製して調製した。
37°C、 5%CO条件下で、 72時間培養し、 PBSで 2倍に希釈した WST-8試薬（Cell Co
2
unting Kit- 8、株式会社同仁化学研究所）を 20 μ L/wellでカ卩え、直後に SUNRISE CL ASSIC(TECAN)を用いて 450nmの吸光度 (参照波長 620nm)を測定した。 2時間培養し た後に、再度 450 nmの吸光度 (参照波長 620nm)を測定し、 2時間の吸光度変化を指 標に IL-6中和活性を評価した。
[0207] その結果、図 40に示すとおり、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体（ peakl, peak2)は、分画前の精製品 (bulk)と中和活性が同等であった。参考例 1の VB2 2B sc(Fv)2および参考例 2の hVB22B sc(Fv)2においては、 2つの構造異性体の間で 活性に大きな違いが見られたが、本参考例のヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2〖こ お!ヽては中和活性に違 、が見られな力つた。このように sc(Fv)2の 2つの構造異性体 の活性の差は、ターゲットとなる抗原の種類や sc(Fv)2分子のアミノ酸配列によって異 なることが考えられ、 sc(Fv)2分子を医薬品として開発するにあたっては、構造異性体 の分離と構造同定および構造異性体の制御は重要であると考えられる。また参考例 6で示されるように各構造異性体は保存中に異性化反応が起きる可能性があり、 sc(F v)2製剤の品質規格の点からも構造異性体の分離と構造同定および構造異性体の 制御は重要であると考えられる。
[0208] 〔参考例 9〕VB22B sc(Fv)2の single chain diabodyを高収率で得る方法
VB22B sc(Fv)2より精製した single chain diabody (peak2)と bivalent scFv (peakl)をそ れぞれ、 20mM sodium acetate, 150mM NaCl, pH6.0の条件下、 40°Cにおいてインキ ュペートした。参考例 1に示した陰イオン交換クロマトグラフィーの方法で peaklと peak 2比を測定した結果、図 41に示したように、 peaklのピークエリアが減少し、それに代 わって、 peak2のピークエリアが増大した。そこで、 peaklを同条件下で 6日間インキュ ペートしたサンプルを参考例 1に示した方法でァゴ-スト活性を評価したところ、図 42 に示したように incubateする前のサンプルに比べて大幅にァゴ-スト活性が増大した 。参考例 1に示したとおり peaklは single chain diabodyである peak2に比べて著しく活 性が低いことから、 bivalent scFvである peaklは、 20mM sodium acetate, 150mM NaCl , pH6.0, 40°Cでインキュベートすることによって、高活性の single chain diabodyである peak2に構造変換する (構造異性体が異性ィ匕する)ことが分力つた。すなわち、これに より bivalent scFvと single chain diabodyの混合物を適当な条件下に暴露することによ つて、 bivalent scFvである peak丄 single cnain diabodyで fcopeak2に変換す こと力 可能であり、 peak2の含有率を増加させることが可能であることが示された。 peaklから peak2に異性ィ匕させる本方法を用いることで、細胞より産生された peaklと peak2の混 合物から peaklを peak2に異性化させることによって、高収率で single chain diabodyで ある peak2を得ることが可能である。
[0209] 〔参考例 10〕 hVB22B sc(Fv)2の single chain diabody型を高収率で得る方法
参考例 4において hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2より精製した bivalent scFv (peakl)を 20m M sodium citrate, 0mM/150mM/300mM NaCl, pH3.0/3.5/4.0/4.5/5.0/5.5/6.0/6.5 /7.0/7.5の計 30条件下、 25°Cにおいて 10日間インキュベートした。参考例 1に示した 陽イオン交換クロマトグラフィーの方法で peaklと peak2比を測定した結果、図 43に示 したように、 インキュベート前に比べて peak2存在比が増大した。これより hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2【こお ヽ ¾、 bivalent scFv" ¾)¾peakl ¾^ single chain diaboayである pea k2に構造変換することを見出した。その異性ィ匕速度は、低 pH及び低塩濃度ほど早い ことを見出した。 Peaklから peak2に異性ィ匕させる本方法を用いることで、細胞より産生 された peaklと peak2の混合物力も peaklを peak2に異性化させることによって、高収率 で single chain diabodyである peak2を得ることが可會である。
産業上の利用可能性
[0210] 本発明の安定化剤 ·安定ィ匕条件、または凍結乾燥製剤化を適用することで、 sc(Fv) 2の異性ィ匕反応を抑制できる。すなわち、 sc(Fv)2組成物中の 2種の構造異性体間の 相互異性ィ匕反応を抑制し、どちらか一方の構造異性体を安定に存在させること、およ び、 sc(Fv)2組成物から取得された特定の構造異性体の異性化反応を抑制し、該異 性体を安定に存在させることが可能となった。
[0211] sc(Fv)2を医薬品として開発するためには、目的物質であるどちらか一方の構造異 性体を安定に存在させ、製剤保存中に他方の構造異性体への異性化を最小限に抑 制することが必要である。あるいは製剤中の構造異性体存在比を規格された構造異 性体の含有比率内にコントロールする必要がある。本発明の安定化剤'安定化条件 、または凍結乾燥製剤化を sc(Fv)2製剤に適用することで、規格された構造異性体の 含有率を確保した安定な製剤を提供することが可能となった。

Claims

請求の範囲
[I] 塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、 pH調整剤力もなる群より選択される少なくとも 1 つの物質を添加した、 sc(Fv)2を含有する医薬組成物。
[2] 塩力 塩ィ匕ナトリウムおよび塩ィ匕マグネシウム力 なる群より選択される少なくとも 1つ の塩である、請求項 1に記載の医薬組成物。
[3] ァミノ糖が、メダルミンである、請求項 1に記載の医薬組成物。
[4] 糖アルコール力 マン-トールである、請求項 1に記載の医薬組成物。
[5] アミノ酸が、リジンである、請求項 1に記載の医薬組成物。
[6] pH調整剤が、クェン酸ナトリウム緩衝液およびヒスチジン塩酸塩力もなる群より選択さ れる少なくとも 1つの pH調整剤である、請求項 1に記載の医薬組成物。
[7] pHが 4.5〜9.0であることを特徴とする、 sc(Fv)2を含有する医薬組成物。
[8] pHが 6.0〜9.0であることを特徴とする、 sc(Fv)2を含有する医薬組成物。
[9] 塩濃度が 50mM〜1000mMであることを特徴とする、 sc(Fv)2を含有する医薬組成物。
[10] 剤形が凍結乾燥製剤であることを特徴とする、請求項 1〜9のいずれかに記載の医 薬組成物。
[I I] 剤形が凍結乾燥製剤であることを特徴とする、 sc(Fv)2を含有する医薬組成物。
[12] single chain diabody型 sc(Fv)2、または bivalent scFv型 sc(Fv)2を高純度で含む、請求 項 1〜： L 1のいずれかに記載の医薬組成物。
[13] 以下の工程を含む sc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
(0 sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii)調製された sc(Fv)2組成物の異性ィ匕反応を抑制する工程。
[14] 以下の工程を含む sc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
(0 sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii)調製された sc(Fv)2組成物に、塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、 PH調整剤か らなる群より選択される少なくとも 1つの物質を添加する工程。
[15] 塩力 塩ィ匕ナトリウムおよび塩ィ匕マグネシウム力 なる群より選択される少なくとも 1つ の塩である、請求項 14に記載の方法。
[16] ァミノ糖が、メダルミンである、請求項 14に記載の方法。
[17] 糖アルコール力 マン-トールである、請求項 14に記載の方法。
[18] アミノ酸が、リジンである、請求項 14に記載の方法。
[19] pH調整剤が、クェン酸ナトリウム緩衝液およびヒスチジン塩酸塩力もなる群より選択さ れる少なくとも 1つの pH調整剤である、請求項 14に記載の方法。
[20] 以下の工程を含む sc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
(0 sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii)調製された sc(Fv)2組成物の pHを 4.5〜9.0にする工程。
[21] 以下の工程を含む sc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
(0 sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii)調製された sc(Fv)2組成物の pHを 6.0〜9.0にする工程。
[22] 以下の工程を含む sc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
(0 sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii)調製された sc(Fv)2組成物の塩濃度を 50mM〜1000mMにする工程。
[23] 以下の工程を含む sc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
(a) sc(Fv)2組成物を 15°C〜50°C、並びに Zまたは、 pH3.0〜6.0、および Zもしくは、 塩濃度が 500mM以下にてインキュベートすることによって、 single chain diabody型の 含有比率力 bivalent scFv型の含有比率より高 、sc(Fv)2組成物を製造する工程
(b)生成した single chain diabody型の sc(Fv)2を取得する工程
(c)工程 (b)で取得した single chain diabody型 sc(Fv)2組成物を安定化させる工程。
[24] 以下の工程を含む sc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
(a) sc(Fv)2組成物を 15°C〜50°C、並びに Zまたは、 pH3.0〜6.0、および Zもしくは、 塩濃度が 500mM以下にてインキュベートすることによって、 bivalent scFv型の含有比 率が single chain diabody型の含有比率より高い sc(Fv)2組成物を製造する工程
(b)生成した bivalent scFv型の sc(Fv)2を取得する工程
(c)工程 (b)で取得した bivalent scFv型 sc(Fv)2組成物を安定ィ匕させる工程。
[25] 以下の工程を含む sc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
(0 sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii)調製された sc(Fv)2組成物を凍結乾燥する工程。
[26] 塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、 pH調整剤力 なる群より選択される少なくとも 1 つの物質を添加する工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制する方 法。
[27] 塩力 塩ィ匕ナトリウムおよび塩ィ匕マグネシウム力 なる群より選択される少なくとも 1つ の塩である、請求項 26に記載の方法。
[28] ァミノ糖が、メダルミンである、請求項 26に記載の方法。
[29] 糖アルコール力 マン-トールである、請求項 26に記載の方法。
[30] アミノ酸が、リジンである、請求項 26に記載の方法。
[31] pH調整剤が、クェン酸ナトリウム緩衝液およびヒスチジン塩酸塩力もなる群より選択さ れる少なくとも 1つの pH調整剤である、請求項 26に記載の方法。
[32] pHを 4.5〜9.0にする工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制する方 法。
[33] pHを 6.0〜9.0にする工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制する方 法。
[34] 塩濃度を 50mM〜1000mMにする工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を 抑制する方法。
[35] 凍結乾燥する工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制する方法。
[36] 医薬組成物中の有効成分が sc(Fv)2である、請求項 26〜35のいずれかに記載の方 法。
[37] 塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、 pH調整剤力もなる群より選択される少なくとも 1 つの物質を含有する、 sc(Fv)2の異性ィ匕反応を抑制するために用いる安定化剤。
[38] 塩力 塩ィ匕ナトリウムおよび塩ィ匕マグネシウム力 なる群より選択される少なくとも 1つ の塩である、請求項 37に記載の安定化剤。
[39] ァミノ糖が、メダルミンである、請求項 37に記載の安定化剤。
[40] 糖アルコール力 マン-トールである、請求項 37に記載の安定化剤。
[41] アミノ酸が、リジンである、請求項 37に記載の安定化剤。
[42] pH調整剤が、クェン酸ナトリウム緩衝液およびヒスチジン塩酸塩力もなる群より選択さ れる少なくとも 1つの pH調整剤である、請求項 37に記載の安定化剤。 以下の工程を含む、 sc(Fv)2の異性ィ匕反応を抑制する物質のスクリーニング方法 (0 sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii)調製された sc(Fv)2組成物に被検物質を接触させる工程、
(iii)被検物質の接触させた sc(Fv)2組成物において、 sc(Fv)2の異性ィ匕反応の抑制の 有無を測定する工程、
(iv) sc(Fv)2の異性化反応を抑制する物質を選択する工程。
PCT/JP2006/311600 2005-06-10 2006-06-09 sc(Fv)2を含有する医薬組成物 WO2006132352A1 (ja)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007520179A JP5085322B2 (ja) 2005-06-10 2006-06-09 ｓｃ（Ｆｖ）２を含有する医薬組成物
KR1020087000694A KR101360671B1 (ko) 2005-06-10 2006-06-09 ｓｃ（Ｆｖ）２를 함유하는 의약조성물
US11/916,979 US9241994B2 (en) 2005-06-10 2006-06-09 Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2
CN200680029639.6A CN101262885B (zh) 2005-06-10 2006-06-09 含有sc(Fv)2的药物组合物
EP06766512.5A EP1925319B1 (en) 2005-06-10 2006-06-09 Pharmaceutical compositions containing sc(fv)2
CA2611726A CA2611726C (en) 2005-06-10 2006-06-09 Pharmaceutical compositions containing sc(fv)2
AU2006256030A AU2006256030B2 (en) 2005-06-10 2006-06-09 Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2
HK08113584.7A HK1122494A1 (en) 2005-06-10 2008-12-15 Pharmaceutical compositions containing sc(fv)2 sc(fv)2
US14/967,475 US9777066B2 (en) 2005-06-10 2015-12-14 Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005-171375 2005-06-10
JP2005171375 2005-06-10
PCT/JP2006/306800 WO2006106903A1 (ja) 2005-03-31 2006-03-31 sc(Fv)2構造異性体
JPPCT/JP2006/306800 2006-03-31

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US11/916,979 A-371-Of-International US9241994B2 (en) 2005-06-10 2006-06-09 Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2
US14/967,475 Division US9777066B2 (en) 2005-06-10 2015-12-14 Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006132352A1 true WO2006132352A1 (ja) 2006-12-14

Family

ID=37498546

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/311600 WO2006132352A1 (ja) 2005-06-10 2006-06-09 sc(Fv)2を含有する医薬組成物

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1925319B1 (ja)
AU (1) AU2006256030B2 (ja)
CA (1) CA2611726C (ja)
WO (1) WO2006132352A1 (ja)

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012073985A1 (ja) 2010-11-30 2012-06-07 中外製薬株式会社 細胞傷害誘導治療剤
WO2015068847A1 (ja) 2013-11-11 2015-05-14 中外製薬株式会社 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子
US9493569B2 (en) 2005-03-31 2016-11-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Structural isomers of sc(Fv)2
WO2017086419A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 液性免疫応答の増強方法
WO2017086367A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
WO2017159287A1 (ja) 2016-03-14 2017-09-21 中外製薬株式会社 癌の治療に用いるための細胞傷害誘導治療剤
US9777066B2 (en) 2005-06-10 2017-10-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2
US10138293B2 (en) 2007-12-21 2018-11-27 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US10323099B2 (en) 2013-10-11 2019-06-18 Hoffmann-La Roche Inc. Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
WO2019131988A1 (en) 2017-12-28 2019-07-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
US10611825B2 (en) 2011-02-28 2020-04-07 Hoffmann La-Roche Inc. Monovalent antigen binding proteins
US10793621B2 (en) 2011-02-28 2020-10-06 Hoffmann-La Roche Inc. Nucleic acid encoding dual Fc antigen binding proteins
WO2020246563A1 (ja) 2019-06-05 2020-12-10 中外製薬株式会社 抗体切断部位結合分子
WO2021006328A1 (en) 2019-07-10 2021-01-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Claudin-6 binding molecules and uses thereof
WO2021201087A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing multispecific antigen-binding molecules
WO2022025220A1 (ja) 2020-07-31 2022-02-03 中外製薬株式会社 キメラ受容体を発現する細胞を含む医薬組成物

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101367544B1 (ko) 2005-06-10 2014-02-26 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 메글루민을 함유하는 단백질 제제의 안정화제, 및 그의이용
US8796206B2 (en) * 2007-11-15 2014-08-05 Amgen Inc. Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stabilised by antioxidants for parenteral administration

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002543822A (ja) * 1999-05-18 2002-12-24 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション ヒトモノクローナル抗体
JP2003515323A (ja) * 1999-11-18 2003-05-07 オックスフォード バイオメディカ（ユーケイ）リミテッド 抗 体
WO2004019966A1 (ja) * 2002-08-27 2004-03-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha タンパク質溶液製剤の安定化方法
WO2005107784A1 (ja) * 2004-05-11 2005-11-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 血小板減少症治療剤

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002210917B2 (en) * 2000-10-20 2006-05-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Degraded TPO agonist antibody

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002543822A (ja) * 1999-05-18 2002-12-24 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション ヒトモノクローナル抗体
JP2003515323A (ja) * 1999-11-18 2003-05-07 オックスフォード バイオメディカ（ユーケイ）リミテッド 抗 体
WO2004019966A1 (ja) * 2002-08-27 2004-03-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha タンパク質溶液製剤の安定化方法
WO2005107784A1 (ja) * 2004-05-11 2005-11-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 血小板減少症治療剤

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COCHLOVIUS B.E. ET AL.: "Treatment of human B cell lymphoma xenografts with a CD3 x CD19 diabody and T cells", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 165, no. 2, 2000, pages 888 - 895, XP002230402 *
JAGER M.: "Folding and Assembly of an Antibody Fv Fragment, a Heterodimer Stabilized by Antigen", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 285, no. 5, 1999, pages 2005 - 2019, XP004464311 *
KIPRIYANOV S.M. ET AL.: "Effect of Domain Order on the Activity of Bacterially Produced Bispecific Single-chain Fv Antibodies", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 330, no. 1, 2003, pages 99 - 111, XP004445110 *
KIPRIYANOV S.M.: "Bispecific tandem antibody for tumor therapy with improved antigen binding and pharmacokinetics", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 293, no. 1, 1999, pages 41 - 56, XP002131382 *
KORN T.: "Recombinant bispecific antibodies for the targeting of adenoviruses to CEA-expressing tumour cells: a comparative analysis of bacterially expressed single-chain diabody and tandem scFv", JOURNAL OF GENE MEDICINE, vol. 6, no. 6, 2004, pages 642 - 651, XP003005521 *
MENG R.: "The evaluation of recombinant, chimeric, tetravalent antihuman CD22 antibodies", CLINICAL CANCER RESEARCH, vol. 10, no. 4, 2004, pages 1274 - 1281, XP003005520 *
VOELKEL T.: "Optimized linker sequences for the expression of monomeric and dimeric bispecific single-chain diabodies", PROTEIN ENGINEERING, vol. 14, no. 10, 2001, pages 815 - 823, XP002185481 *

Cited By (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9493569B2 (en) 2005-03-31 2016-11-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Structural isomers of sc(Fv)2
US9777066B2 (en) 2005-06-10 2017-10-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2
US10927163B2 (en) 2007-12-21 2021-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US10138293B2 (en) 2007-12-21 2018-11-27 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US11673945B2 (en) 2009-06-16 2023-06-13 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antigen binding proteins
US10640555B2 (en) 2009-06-16 2020-05-05 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antigen binding proteins
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
EP4303237A2 (en) 2010-11-30 2024-01-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
WO2012073985A1 (ja) 2010-11-30 2012-06-07 中外製薬株式会社 細胞傷害誘導治療剤
EP3434767A1 (en) 2010-11-30 2019-01-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
EP4303236A2 (en) 2010-11-30 2024-01-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
EP4279512A2 (en) 2010-11-30 2023-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
EP4279511A2 (en) 2010-11-30 2023-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
EP4279513A2 (en) 2010-11-30 2023-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
US10611825B2 (en) 2011-02-28 2020-04-07 Hoffmann La-Roche Inc. Monovalent antigen binding proteins
US10793621B2 (en) 2011-02-28 2020-10-06 Hoffmann-La Roche Inc. Nucleic acid encoding dual Fc antigen binding proteins
US10323099B2 (en) 2013-10-11 2019-06-18 Hoffmann-La Roche Inc. Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
WO2015068847A1 (ja) 2013-11-11 2015-05-14 中外製薬株式会社 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子
WO2017086367A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
WO2017086419A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 液性免疫応答の増強方法
WO2017159287A1 (ja) 2016-03-14 2017-09-21 中外製薬株式会社 癌の治療に用いるための細胞傷害誘導治療剤
WO2019131988A1 (en) 2017-12-28 2019-07-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
WO2020246563A1 (ja) 2019-06-05 2020-12-10 中外製薬株式会社 抗体切断部位結合分子
WO2021006328A1 (en) 2019-07-10 2021-01-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Claudin-6 binding molecules and uses thereof
WO2021201087A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing multispecific antigen-binding molecules
WO2022025220A1 (ja) 2020-07-31 2022-02-03 中外製薬株式会社 キメラ受容体を発現する細胞を含む医薬組成物

Also Published As

Publication number Publication date
EP1925319B1 (en) 2018-03-07
CA2611726C (en) 2017-07-11
EP1925319A1 (en) 2008-05-28
AU2006256030A1 (en) 2006-12-14
AU2006256030B2 (en) 2012-06-21
CA2611726A1 (en) 2006-12-14
EP1925319A4 (en) 2010-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5085322B2 (ja) ｓｃ（Ｆｖ）２を含有する医薬組成物
WO2006132352A1 (ja) sc(Fv)2を含有する医薬組成物
JP5057967B2 (ja) ｓｃ（Ｆｖ）２構造異性体
KR102168733B1 (ko) 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자
TWI544076B (zh) A method of manufacturing a polypeptide that controls assembly
CA2819530C (en) Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
JP5224580B2 (ja) ｓｃ（Ｆｖ）２部位特異的変異体
KR20220020879A (ko) 새로운 il-15 프로드럭 및 이를 사용하는 방법
KR20210042117A (ko) Cldn18.2 및 cd3에 대한 항체 작제물
JP2008540684A (ja) 抗体の安定性を増加させるための組成物および方法
KR20220121850A (ko) 항-cd73 항체 및 이의 용도
CN110650973B (zh) 抗体细胞因子移植蛋白和用于免疫相关障碍的方法
EP3954711A1 (en) Bispecific antibody specifically binding to gpnmb and cd3, and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200680029639.6

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007520179

Country of ref document: JP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2611726

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 9530/DELNP/2007

Country of ref document: IN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006256030

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006766512

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020087000694

Country of ref document: KR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2006256030

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20060609

Kind code of ref document: A

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2006256030

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11916979

Country of ref document: US