WO2004019966A1 - タンパク質溶液製剤の安定化方法 - Google Patents

タンパク質溶液製剤の安定化方法 Download PDF

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WO2004019966A1
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solution
magnetic field
preparation
antibody
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Masahiko Tanikawa
Takeshi Omura
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation

Definitions

  • the present invention relates to a method for stabilizing a protein solution preparation and a container for storing the protein solution preparation. More specifically, the present invention relates to a method for stabilizing a physiologically active protein preparation by storing the protein solution preparation under magnetic field lines, and a storage container for the protein solution preparation provided with a magnetic field generator. The method and the container of the present invention suppress the association of bioactive proteins and are particularly useful for stabilizing protein solution preparations. Background art
  • bioactive protein preparations have been provided in a stable supply. Many of these bioactive proteins are known to associate in aqueous solutions, which is a major factor in reducing the stability of formulations. Therefore, in order to ensure the stability of these preparations, they are provided as freeze-dried preparations or in the form of protein solution preparations to which various additives for improving the stability are added.
  • a stabilizing effect has been found by adding polymers such as human serum albumin or purified gelatin as a stabilizer, or high molecules such as polyols, and low molecules such as amino acids and surfactants.
  • polymers such as human serum albumin or purified gelatin as a stabilizer, or high molecules such as polyols, and low molecules such as amino acids and surfactants.
  • adding a biologically-derived polymer such as a protein as a stabilizing agent requires a very complicated process to remove contaminants such as viruses derived from the stabilizing agent. There was a problem.
  • heat stress may cause further problems such as aggregation and aggregation.
  • An object of the present invention is to provide a method for suppressing the formation of an aggregate in a solution state of a protein having a physiological activity such as an antibody, an enzyme, a hormone, or a cytokin, and improving the stability of a protein solution preparation. is there. Disclosure of the invention
  • the present invention provides the following:
  • a method for stabilizing a protein solution preparation comprising storing the protein solution preparation under magnetic field lines.
  • physiologically active protein is selected from an antibody, an enzyme, a cytokin, and a hormone.
  • hematopoietic factor is erythropoietin or granulocyte colony stimulating factor.
  • a storage container for a protein solution preparation equipped with a magnetic field generator (9) A storage container for a protein solution preparation equipped with a magnetic field generator.
  • a method for stabilizing a protein-containing solution comprising storing the protein-containing solution under magnetic field lines.
  • a stabilized protein preparation prepared from a protein bulk production solution stored under magnetic field lines.
  • a protein solution preparation comprising storing a protein solution preparation under magnetic field lines A method for suppressing the formation of aggregates of an agent.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an acceleration test of an EPO injection preparation under magnetic field lines.
  • FIG. 2 shows one embodiment of storing a solution preparation by the method of the present invention. a is a side view and b is a top view.
  • FIG. 3 is a side view of one embodiment of storing a solution preparation by the method of the present invention.
  • FIG. 4 shows one embodiment in which the G—C S F solution is stored under magnetic field lines.
  • the protein in the present invention is preferably, but not limited to, a bioactive protein.
  • the protein solution of the present invention provides a method for stabilizing not only pharmaceuticals but also all protein-containing solutions that require stabilization of proteins contained in foods, cosmetics and the like.
  • Bioactive proteins include, but are not limited to, antibodies, enzymes, cytokins, and hormones.
  • hematopoietic factors such as granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), erythropoietin (EP II), tropopoetin, interferon, IL-11 and IL-1 6 cytochromes, immunoglobulins such as monoclonal and humanized antibodies, tissue plasminogen activator (TPA), perokinase, serum albumin, blood coagulation factor VIII, lebutin, insulin, stem cell growth factor ( SCF), but is not limited to these.
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • EP II erythropoietin
  • TPA tissue plasminogen activator
  • perokinase serum albumin
  • blood coagulation factor VIII blood coagulation factor VIII
  • lebutin insulin
  • SCF stem cell growth factor
  • the physiologically active proteins hematopoietic factors such as EP ⁇ , G-CSF, GM-CSF, and thrompopoetin are preferable, and EP ⁇ and G-CSF are more preferable.
  • immunoglobulin is preferable as the physiologically active protein, and a monoclonal antibody and a humanized antibody are more preferable.
  • the bioactive protein used in the stabilizing method of the present invention is a protein having substantially the same biological activity as that of a mammal, particularly a human bioactive protein, and is obtained from a naturally-occurring protein or a recombinant gene. Preferred are those obtained by the gene recombination method.
  • Bioactive protein by genetic recombination The quality is produced by bacteria such as Escherichia coli; yeast; cultured cells derived from animals such as Chinese hams evening ovary (CH ⁇ ) cells, C127 cells, COS cells, etc., extracted and separated and purified by various methods. Used. Proteins obtained by the genetic recombination method include those having the same amino acid sequence as the natural protein, or those having one or more of the amino acid sequences deleted, substituted, or added and having the biological activity described above. Including. Furthermore, proteins include those chemically modified with PEG and the like.
  • physiologically active protein examples include a protein having a sugar chain.
  • the origin of the sugar chain is not particularly limited, but a sugar chain added to mammalian cells is preferred.
  • Mammalian cells include, for example, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), BHK cells, COS cells, human-derived cells, etc. Among them, CH2 cells are most preferred.
  • any G-CSF can be used as long as it is highly purified G-CSF.
  • the G-CSF in the present invention may be produced by any method, such as those obtained by culturing a cell line of human tumor cells and extracting and separating and purifying it from various cells, or E. coli by genetic engineering techniques. Yeast bacteria; Chinese hamster ovary (CH ⁇ ) cells; cultured cells derived from animals such as C127 cells, COS cells, etc .; and extracted and separated and purified by various methods.
  • it is produced using Escherichia coli, yeast or CHO cells using a genetic recombination method.
  • it is produced by a CHO cell using a genetic recombination method.
  • G-CSF chemically modified with PEG or the like is included (see International Patent Application Publication No. WO 90/12874).
  • EPO When the physiologically active protein is EPO, EPO may be produced by any method, extracted from human urine by various methods, separated and purified, genetic engineering techniques (for example, -No. 12288), which are produced in Chinese hamster ovary cells (CH B), BHK cells, COS cells, human-derived cells, etc., and extracted and separated and purified by various methods. Furthermore, it includes EPO chemically modified with PEG etc. (International Patent Application Publication No. 8 7 4). In addition, EPO without sugar chain is also chemically modified with PEG or the like.
  • EPO analogs that have been modified to increase the number of one or more glycosylation sites at the N-linked carbohydrate chain binding site or the O-linked carbohydrate chain binding site in the amino acid sequence of EPO (e.g., Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 08-151, 398, and Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 8-520603).
  • the amount of sugar chains may be increased by increasing the content of sialic acid or the like without changing the number of sugar chain binding sites.
  • the monoclonal antibody may be produced by any method.
  • a monoclonal antibody is basically immunized with a sensitizing antigen according to a usual immunization method using a known technique, and the obtained immunocytes are fused with a known parent cell by a usual cell fusion method to give a normal screen. It can be prepared by screening monoclonal antibody-producing cells by the screening method.
  • a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma, integrating it into an appropriate vector, introducing this into a host, and using a gene recombination technique can be used (for example, Carl, AK Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • cDNA for the variable region (V region) of the antibody is synthesized from the hybridoma mRNA using reverse transcriptase.
  • DNA encoding the V region of the desired antibody is obtained, it is ligated to the DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and inserted into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing the DNA of the C region of the antibody.
  • An expression control region for example, an enhancer, is incorporated into an expression vector so that expression is performed under the control of a promoter.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • a recombinant antibody artificially modified for the purpose of, for example, reducing the antigenicity to humans such as a chimeric antibody and a humanized antibody
  • modified antibodies use known methods Can be manufactured.
  • a chimeric antibody is an antibody composed of a heavy chain and light chain variable region of a mouse antibody and a heavy chain and light chain constant region of a human antibody, and encodes a mouse antibody variable region. It can be obtained by ligating DNA to DNA encoding the constant region of a human antibody, inserting this into an expression vector, and introducing into a host to produce.
  • the humanized antibody is also called a reshaped human antibody, and the complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal, such as a mouse antibody, is transferred to the complementarity determining region of a human antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • This method is also known for its general gene recombination technique. Specifically, a DNA sequence designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody was prepared by constructing a DNA sequence having an overlapping portion at the end. It is synthesized by PCR from individual oligonucleotides. The obtained DNA is ligated to DNA encoding the constant region of a human antibody, then incorporated into an expression vector, and introduced into a host to produce it (European Patent Application Publication No.
  • a preferred example of such a reshaped humanized antibody is a humanized anti-IL-6 receptor antibody (hPM-1) (see International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • hPM-1 humanized anti-IL-6 receptor antibody
  • a humanized anti-HM1.24 antigen monoclonal antibody see International Patent Application Publication No. WO98-145580
  • anti-PTH r P antibody see International Patent Application Publication No. W ⁇ 98-138338
  • humanized anti-tissue factor antibody see International Patent Application Publication No. WO99-51734
  • a method for obtaining a human antibody is known.
  • a human lymphocyte is sensitized in vitro with a desired antigen or a cell expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocyte is fused with a human myeloma cell such as U266 to obtain a desired human having an antigen-binding activity.
  • Antibodies can also be obtained (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having the entire repertoire of human antibody genes with an antigen (International Patent Application Publication Nos.
  • a technique for obtaining a human antibody by panning using a human antibody library is also known.
  • a phage that binds to an antigen can be selected by expressing the variable region of a human antibody as a single-chain isomer (scFv) on the surface of a phage by the phage display method.
  • scFv single-chain isomer
  • a suitable expression vector can be prepared based on the sequence to obtain a human antibody.
  • These methods are already well known and can be referred to WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388. .
  • antibodies produced by transgenic animals or the like are also preferred.
  • antibodies include antibody fragments such as Fab, (Fab ') 2 , Fc, Fc', and Fd, and reconstituted antibodies such as monovalent or bivalent or more single-chain antibodies (scFV).
  • the biologically active protein-containing sample may be any protein-containing sample, regardless of whether it is a biologically-derived protein or a recombinant protein.
  • This refers to a culture medium for mammalian cells such as CHO cells containing active proteins, or a medium that has been subjected to a certain treatment such as partial purification.
  • the bioactive protein solution formulation may further contain, if desired, a surfactant, a stabilizer such as an amino acid, a diluent, a solubilizing agent, an excipient, a pH adjuster, a soothing agent, a buffer, in addition to the bioactive protein Agents, sulfur-containing reducing agents, antioxidants and the like. It is produced by dissolving these components in a commonly used buffer solution.
  • a surfactant such as an amino acid, a diluent, a solubilizing agent, an excipient, a pH adjuster, a soothing agent, a buffer, in addition to the bioactive protein Agents, sulfur-containing reducing agents, antioxidants and the like. It is produced by dissolving these components in a commonly used buffer solution.
  • Bioactive protein solution formulations are usually supplied in sealed, sterile plastic or glass vials, ampules, containers of defined volume such as syringes, and large volume containers such as bottles.
  • the stabilization method of the present invention can be used for solution preparations in any of these container shapes. Preferred is a prefilled syringe It is a solution preparation of.
  • pial is also preferably exemplified.
  • a solution preparation of a physiologically active protein is stored under magnetic field lines.
  • the magnetic field generator include, but are not limited to, a magnet, a magnetic head manufactured by a semiconductor process, and an arrangement of minute coils to flow electricity. It is preferable to store the magnet by placing it around the solution preparation container because it is inexpensive and simple.
  • One embodiment of the present invention is shown in FIG.
  • the form and arrangement direction of the magnet are not particularly limited, but a sheet-like magnet is preferable in consideration of the packaging form.
  • a syringe may be arranged on one sheet magnet, or a syringe may be arranged between two sheet magnets as shown in FIG.
  • a vial may be arranged on a sheet-like magnet.
  • the arrangement of the bioactive protein solution preparation and the magnet may be any arrangement as long as the solution preparation is stored under the magnetic field lines.
  • the direction of magnetization of the magnet may be any direction as long as the solution preparation is stored under the magnetic field lines.
  • the upper surface of the magnet can be an N pole
  • the lower surface can be an S pole
  • the upper surface can be an S pole and the lower surface can be an N pole.
  • the surface in contact with the syringe or vial may be the north pole or the south pole.
  • one of the two faces that contact the syringe can be the north pole, the other can be the south pole, or both can be the same pole.
  • the magnetic flux density is 1 mT or more, preferably 1 to 450 mT, and more preferably 1 to 150 mT.
  • the present invention further provides a container for storing a bioactive protein solution preparation, which is provided with a magnetic field generator.
  • a storage container is provided with the above-described device for generating magnetic field lines and a storage portion for the solution preparation.
  • the storage container may be a storage box, a refrigerator, a container, or the like.
  • the present invention further provides a method for stabilizing a bulk protein solution which comprises storing the bulk protein solution under magnetic field lines.
  • a stabilized protein preparation can be prepared from a protein bulk solution stored under magnetic field lines.
  • the stabilized protein preparation may be a solution preparation or a lyophilized preparation.
  • physiologically active protein solution solution stored by the method of the present invention suppressed the formation of aggregates even after long-term storage.
  • purity test of erythropoietin (EPO) injection 750IU
  • non-magnetic field 40 ° C for 2 weeks and 1 month
  • the present inventors are not bound by a particular theory, but consider the mechanism of action of the present invention as follows. That is, in general, the association of proteins occurs when the hydrophobic site of the protein molecule appears on the surface of the three-dimensional structure of the protein molecule due to some effect such as heat or collision with the container surface, and the hydrophobic sites are bonded to each other. It is thought to be caused by fitting. Therefore, if the protein in the aqueous solution can be restrained by some force, it is thought that random collision of protein molecules can be suppressed.
  • the method and the storage container of the present invention are based on a technical idea completely different from the idea of adding a conventional stabilizer to stabilize a bioactive protein preparation, and can be obtained by a simple method. Long-term storage is possible by suppressing the formation of coalescence. By using the method and the storage container of the present invention, the amount of additives used can be reduced.
  • a magnet (approximately 100 mT) was attached to the EPO injection preparation (750 IU) (see Fig. 1) and stored in a 40 ° C constant-temperature bath for 2 weeks and 1 month before evaluation.
  • the upper surface of the sheet-shaped magnet is an N-pole, and the lower surface is an S-pole.
  • Each sample described above is used as a sample solution. Take exactly 60 PL of the sample solution, add exactly 20 pL of the non-reducing sample buffer * 1 , and heat in a 50 ° C water bath for 15 minutes. After heating, add exactly 4.0 pL of the BPB solution * 2 to make a sample for electrophoresis.
  • Electrophoresis device Electrophoresis device manufactured by TEFCO
  • Electrophoresis gel Slab gel [Gradient 8% -16%, 15Well, 1.5mm thickness, TEFCO Electrophoresis current: 25mA / sheet constant current
  • Electrophoresis Buffer electrophoresis buffer * 4 3-1-2) Western blot
  • Transfer condition current 65 ⁇ 2mA, transfer time 120 minutes
  • Non-reducing sample buffer Dissolve 74.48 mg of ethylenediaminetetraacetate sodium and 5.0 g of sodium lauryl sulfate in 50 mL of Tris'HCl solution.
  • BPB solution Mix 0.625 mL of Tris-HCl solution, 3.5 mL of concentrated glycerin and 5 mg of bromophenol blue solution. Store refrigerated at 4 ° C.
  • Buffer for electrophoresis 3.0 g of trishydroxymethylaminoaminomethane and 14.4 g of dalysine are added to 600 mL of water, and sodium lauryl sulfate l.Og is added thereto to dissolve, and then water is added to make 100 mL. .
  • Problot membrane polyvinylidene difluoride membrane filter (8cm x 8cm, manufactured by Applied Biosystems) or equivalent.
  • Tris-HCl solution Tris hydrid xymethylaminomethane 3.0 in 30 mL of water After adjusting the pH to 6.8 by adding lmol / L hydrochloric acid TS, make up to 100 mL with water and store at 4 ° C in a refrigerator.
  • UV absorption photometer (measurement wavelength: 214mn)
  • Mobile phase Perform a mixed gradient of two solutions using the following two solutions.
  • Solution A Water, acetonitrile, trifluoroacetic acid mixture (400: 100: 1)
  • Solution B Mixed solution of acetonitrile, water and trifluoroacetic acid (400: 100: 1)
  • Gradient operation After equilibrating the column with a solution B concentration of 35%, inject the sample solution and standard solution. After maintaining the B solution concentration at 35% for 5 minutes, perform a linear gradient so that the B solution concentration becomes 100% in 15 minutes. Then hold it for 2 minutes.
  • Tables 1 and 2 show the results of liquid chromatogram evaluation of the formulation for injection of EP II (750 IU) accelerated under magnetic field lines at 40 ° C for 2 weeks and 1 month.
  • G-CSF solution (G-CSF concentration: about 0.5 mg / mL) was filtered with a disposable filter, and a 5-mL glass vial filled with lmL was used as a test sample.
  • test samples were stored in a thermostat at 30 ° C in the presence of magnetic field lines (about 100 mT * 8 ) and under the non-magnetic field lines * 9 (see Fig. 4).
  • magnetic field lines about 100 mT * 8
  • non-magnetic field lines * 9 see Fig. 4
  • the surface of the sheet magnet in contact with the vial was the N pole, and the opposite surface was the S pole.
  • Table 3 shows the G—CSF aggregate content after storage at 30 ° C. for 2 weeks. Table 3 Shadows of magnetic field lines on G-CSF aggregate formation behavior

Abstract

　課題：抗体、酵素、ホルモン、サイトカイン等の生理活性を有するタンパク質の溶液状態における会合体の生成を抑制し、タンパク質溶液製剤の安定性を向上させる方法を提供する。　解決手段：磁力線下にタンパク質溶液製剤を保存することを含むタンパク質溶液製剤の安定化方法及び磁力線発生装置を備えたタンパク質溶液製剤の収納容器。

Description

夕ンパク質溶液製剤の安定化方法
技術分野
本発明は、 夕ンパク質溶液製剤の安定化方法及び夕ンパク質溶液製剤の収納容 器に関する。 さらに詳しくは、 磁力線下にタンパク質溶液製剤を保存することに より生理活性夕ンパク質製剤を安定化する方法及び磁力線発生装置を備えた夕ン パク質溶液製剤の収納容器に関する。 本発明の方法及び収納容器は生理活性夕ン パク質の会合を抑制し、 タンパク質溶液製剤の安定化に特に有用である。 背景技術
遺伝子組換え技術の発達によって、 種々の生理活性タンパク質製剤が安定した 供給量で提供されるようになった。 これらの生理活性タンパク質の多くは水溶液 中で会合することが知られており、 これが製剤の安定性低下の主たる要因になつ ている。そこで、これらの製剤の安定性を確保するため、凍結乾燥製剤とするか、 あるいは安定性を向上させるための各種添加剤を加えたタンパク質溶液製剤の形 で提供されている。
たとえば、 安定化剤としてヒト血清アルブミンあるいは精製ゼラチンなどの夕 ンパク質といつた高分子類或いはポリオール類、 ァミノ酸及び界面活性剤等とい つた低分子類を添加することによる安定化効果が見出されている。しかしながら、 タンパク質のような生体由来の高分子を安定化剤として添加することは、 その安 定化剤に由来するウィルス等のコンタミを除去するために非常に煩雑な工程を必 要とするなどの問題があった。 また、 ウィルスの不活性化を目的として加熱処理 を行うときに、 熱ストレスによりさらに会合、 凝集などの問題を生じることがあ つた
そこで、 添加する安定化剤をなるベく少なくし、 かつ簡便な処理によりタンパ ク質分子の会合を抑制できるタンパク質溶液製剤の安定化方法が求められている。 本発明の目的は、 抗体、 酵素、 ホルモン、 サイト力イン等の生理活性を有する タンパク質などの溶液状態における会合体の生成を抑制し、 タンパク質溶液製剤 の安定性を向上させる方法を提供することである。 発明の開示
上記目的を達成するために鋭意研究した結果、 本発明者らは、 意外にもタンパ ク質溶液製剤を磁力線下におくことにより二量体などの会合体の生成を顕著に抑 制できることを発見して本発明を完成した。
すなわち、 本発明は以下のものを提供する：
( 1 ) 磁力線下に夕ンパク質溶液製剤を保存することを含むタンパク質溶液製剤 の安定化方法。
(2) 磁束密度が 1ミリテスラ以上である前記 （1) 記載の方法。
(3)タンパク質が生理活性タンパク質である前記（1)又は（2)記載の方法。
(4) 生理活性タンパク質が、 抗体、 酵素、 サイト力イン、 ホルモンから選択さ れる前記 （3) 記載の方法。
(5) 生理活性タンパク質が造血因子である前記 （4) 記載の方法。
(6)造血因子がエリスロポエチン又は顆粒球コロニー刺激因子である前記（5) 記載の方法。
(7) 生理活性タンパク質が抗体である前記 （4) 記載の方法。
(8) タンパク質溶液製剤がプレフィルドシリンジである前記 （1) 記載の安定 化方法。
( 9 ) 磁力線発生装置を備えたタンパク質溶液製剤の収納容器。
(10) 磁力線発生装置が磁石である前記 （9) 記載の収納容器。
(11) 磁力線下にタンパク質含有溶液を保存することを含むタンパク質含有溶 液の安定化方法。
(12) タンパク質含有溶液がタンパク質製造バルク溶液である前記 （11) 記 載の方法。
(13) 磁力線下に保存したタンパク質バルク製造溶液から調製した安定化タン パク質製剤。
(1 ) 安定化タンパク質製剤が溶液製剤である前記 （13) 記載の製剤。
(15) 安定化タンパク質製剤が凍結乾燥製剤である前記 （13) 記載の製剤。
(16) 磁力線下にタンパク質溶液製剤を保存することを含むタンパク質溶液製 剤の会合体生成抑制方法。
( 1 7 ) タンパク質溶液製剤の安定化のための磁力線発生装置の使用。 図面の簡単な説明
図 1は、 磁力線下における E P 0注射製剤の加速試験を示す模式図である。 図 2は、 本発明の方法で溶液製剤を保存する 1態様である。 aは側面図、 bは 上面図である。
図 3は、 本発明の方法で溶液製剤を保存する 1態様の側面図である。
図 4は、 磁力線下にて G—C S F溶液を保存する 1態様である。 発明を実施するための最良の形態
本発明におけるタンパク質としては生理活性タンパク質が好ましいがこれに限 定されない。 本発明のタンパク質溶液は医薬品に限らず、 食品、 化粧品などに含 有されるタンパク質の安定化が求められる全てのタンパク質含有溶液の安定化方 法を提供する。 生理活性タンパク質は、 抗体、 酵素、 サイト力イン、 ホルモンを 含むがこれに限定されない。具体的には、顆粒球コロニー刺激因子（G— C S F)、 顆粒球マクロファ一ジコロニ一刺激因子 (GM— C S F)、 エリスロポェチン (E P 〇)、 トロンポポェチン等の造血因子、 インターフェロン、 I L一 1や I L一 6等 のサイト力イン、 モノクローナル抗体やヒト型化抗体等の免疫グロブリン、 組織 プラスミノーゲン活性化因子 (T P A)、 ゥロキナーゼ、 血清アルブミン、 血液凝 固第 V I I I因子、 レブチン、 インシュリン、 幹細胞成長因子 (S C F)などを含 むが、 これらに限定されない。 生理活性タンパク質の中でも、 E P〇、 G - C S F、 GM— C S F、 トロンポポェチン等の造血因子が好ましく、 さらに好ましく は E P〇、 G— C S Fである。 また、 生理活性タンパク質としては免疫グロプリ ンが好ましく、 さらに好ましくはモノクローナル抗体、 ヒト型化抗体である。 本発明の安定化方法に用いる生理活性タンパク質とは、 哺乳動物、 特にヒトの 生理活性タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、 天然由来 のもの、 および遺伝子組換え法により得られたものを含むが、 好ましいのは遺伝 子組換え法により得られたものである。 遺伝子組換え法による生理活性タンパク 質は、大腸菌などの細菌類；イースト菌；チャイニーズハムス夕一卵巣（CH〇） 細胞、 C127細胞、 COS細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、 種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。 遺伝子組換え法によって得 られるタンパク質には天然タンパク質とアミノ酸配列が同じであるもの、 あるい は該アミノ酸配列の 1又は複数を欠失、 置換、 付加したもので前記生物学的活性 を有するものを含む。 さらには、 タンパク質は PEG等により化学修飾されたも のも含む。
生理活性タンパク質としては、 例えば糖鎖を有するタンパク質が挙げられる。 糖鎖の由来としては、 特に制限はないが、 哺乳動物細胞に付加される糖鎖が好ま しい。 哺乳動物細胞には、 例えば、 チャイニーズハムスター卵巣細胞 （CHO細 胞） 、 BHK細胞、 COS細胞、 ヒト由来の細胞等があるが、 この中でも、 CH 〇細胞が最も好ましい。
例えば、 生理活性タンパク質が G— CSFである場合には、 G—CSFは高純 度に精製された G— CSFであれば全て使用できる。 本発明における G— CSF は、 いかなる方法で製造されたものでもよく、 ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、 これから種々の方法で抽出し分離精製したもの、 あるいは遺伝子工学的手法によ り大腸菌などの細菌類；イースト菌；チャイニーズハムスター卵巣 （CH〇） 細 胞、 C 127細胞、 COS細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々 の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。 好ましくは大腸菌、 イースト菌 又は CHO細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。 最も好 ましくは CHO細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。 さ らには、 PEG等により化学修飾された G— CSFも含む （国際特許出願公開番 号 WO 90/12874参照） 。
また、 生理活性タンパク質が EPOである場合には、 EPOはいかなる方法で 製造されたものでもよく、 ヒト尿より種々の方法で抽出し、 分離精製したもの、 遺伝子工学的手法 （例えば特開昭 61— 12288号） によりチャイニーズハム スター卵巣細胞 （CH〇） 、 BHK細胞、 COS細胞、 ヒト由来の細胞などに産 生せしめ、 種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。 さらには、 PE G等により化学修飾された EPOも含む （国際特許出願公開番号 W〇 90/12 8 7 4参照） 。 さらに、 糖鎖のついていない E P Oを P E G等により化学修飾し たものも含む。 また、 E P Oのアミノ酸配列中の N—結合炭水化物鎖結合部位も しくは O—結合炭水化物鎖結合部位において、 1以上のグリコシル化部位の数を 増加させるように改変した E P O類似体も含む （例えば、 特開平 8— 1 5 1 3 9 8号、 特表平 8— 5 0 6 0 2 3号参照） 。 さらには、 糖鎖結合部位の数は変化さ せずに、 シアル酸等の含量を増加させることにより糖鎖の量を増加させたもので あってもよい。
生理活性夕ンパク質がモノクローナル抗体である場合には、 モノク口一ナル抗 体はいかなる方法で製造されたものでもよい。 モノクローナル抗体は、 基本的に は公知技術を使用し、 感作抗原を通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる 免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常のスクリ一 ニング法により、 モノクローナルな抗体産生細胞をスクリ一エングすることによ つて作成できる。
また、 抗体遺伝子をハイプリドーマからクローニングし、 適当なベクタ一に組 み込んで、 これを宿主に導入し、 遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組 換え型抗体を用いることができる （例えば、 Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照） 。 具体的 には、 ハイプリドーマの mRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域 （V領 域） の cDNAを合成する。 目的とする抗体の V領域をコ一ドする DNAが得ら れれば、 これを所望の抗体定常領域 （C領域） をコードする DNA と連結し、 こ れを発現ベクターへ組み込む。 または、 抗体の V領域をコードする DNA を、 抗体 C領域の DNA を含む発現べクタ一へ組み込んでもよい。 発現制御領域、 例えば、 ェンハンサ一、 プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクター に組み込む。 次に、 この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現 させることができる。
本発明では、 ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的 に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメラ （Chimeric) 抗体、 ヒト型化 (Humanized ) 抗体などを使用できる。 これらの改変抗体は、 既知の方法を用 いて製造することができる。 キメラ抗体は、 ヒト以外の哺乳動物、 例えば、 マウ ス抗体の重鎖、 軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、 軽鎖の定常領域からなる抗体 であり、 マウス抗体の可変領域をコードする DNA をヒト抗体の定常領域をコ一 ドする DNA と連結し、 これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させ ることにより得ることができる。
ヒト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒト抗体とも称され、 ヒト以外の哺乳動 物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region) をヒ卜抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その一般的な遺伝 子組換え手法も知られている。 具体的には、 マウス抗体の CDR とヒト抗体のフ レームワーク領域（framework region； FR) を連結するように設計した DNA配 列を、 末端部にオーバ一ラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌ クレオチドから PCR法により合成する。 得られた DNAをヒト抗体定常領域を コードする DNA と連結し、 次いで発現べクタ一に組み込んで、 これを宿主に導 入し産生させることにより得られる （欧州特許出願公開番号 EP 239400、 国際 特許出願公開番号 WO 96/02576参照） 。 CDR を介して連結されるヒトぉ体の FRは、 相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。 必 要に応じ、 再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するよ うに抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい （Sato, et al" Cancer Res. (1993) 53, 851-856) 。
このような再構成ヒト型化抗体としてヒト型化抗 I L— 6レセプター抗体 ( h P M- 1 ) が好ましく例示される （国際特許出願公開番号 WO 9 2— 1 9 7 5 9 を参照） 。 また、 ヒト型化抗 HM 1 . 2 4抗原モノクローナル抗体 （国際特許出 願公開番号 WO 9 8 - 1 4 5 8 0を参照） 、 ヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連べ プチド抗体 （抗 P TH r P抗体） （国際特許出願公開番号 W〇 9 8 - 1 3 3 8 8 を参照） 、 ヒト型化抗組織因子抗体 （国際特許出願公開番号 WO 9 9 - 5 1 7 4 3を参照） なども本発明で使用する好ましい抗体である。
また、 ヒト抗体の取得方法も知られている。 例えば、 ヒトリンパ球を in vitro で所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、 感作リンパ球をヒトミ エローマ細胞、 例えば U266と融合させ、 抗原への結合活性を有する所望のヒト 抗体を得ることもできる （特公平 1-59878参照） 。 また、 ヒト抗体遺伝子の全て のレパートリーを有するトランスジエニック動物を抗原で免疫することで所望の ヒト抗体を取得することができる （国際特許出願公開番号 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096， WO 96/33735参照） 。 さらに、 ヒト抗体ライブラリーを用いて、 パンニングによりヒト抗体を取得する 技術も知られている。 例えば、 ヒト抗体の可変領域を一本鎖钪体 (scFv) として ファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、 抗原に結合するファ ージを選択することができる。 選択されたファージの遺伝子を解析すれば、 抗原 に結合するヒ卜抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定することができる。 抗原に結合する scFvの DNA配列が明らかになれば、当該配列に基づいて適当な 発現べクタ一を作製し、 ヒト抗体を取得することができる。 これらの方法は既に 衆知であり、 WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213， WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。
さらに、 トランスジエニック動物等によって作製されたヒト抗体も好ましい。 さらに、 抗体には Fab，（Fab')2， Fc， Fc'， Fdなどの抗体断片や、 1価又は 2価以 上の一本鎖抗体 (scFV) などの再構成したものも含む。
本発明では、生理活性タンパク質含有試料とは、生体由来タンパク質であるか、 あるいは組換えタンパク質であるかを問わず、 いかなるタンパク質を含む試料で あってもよく、 好ましくは、 培養により得られた生理活性タンパク質を含む C H O細胞などの哺乳動物細胞の培養培地、 あるいはこれに部分的精製などの一定の 処理を施したものをいう。
生理活性タンパク質溶液製剤は、 生理活性タンパク質の他に、 所望によりさら に界面活性剤、 アミノ酸などの安定化剤、 希釈剤、 溶解補助剤、 賦形剤、 P H調 整剤、 無痛化剤、 緩衝剤、 含硫還元剤、 酸化防止剤等を含有してもよい。 これら の成分を通常使用される緩衝液中に溶解して製造される。
生理活性タンパク質溶液製剤は、 通常密封、 滅菌されたプラスチック又はガラ ス製のバイアル、 アンプル、 注射器のような規定容量の形状の容器、 ならびに瓶 のような大容量の形状の容器で供給される。 本発明の安定化方法は、 これらのい ずれの容器形状の溶液製剤にも使用できる。 好ましいのはプレフィルドシリンジ の溶液製剤である。
その他には、 パイアルも好ましく例示される。
本発明では、 生理活性タンパク質の溶液製剤を磁力線下に保存する。 磁力線の 発生装置は磁石、 半導体プロセスで製造される磁気ヘッド、 微小コイルを配列し て電気を流す、 などが挙げられるが、 これに限定されない。 安価で簡便であるこ とから、 磁石を溶液製剤の容器の周囲に配置して保存するのが好ましい。 本発明 の実施の 1態様を図 1に示す。 磁石の形態や配置方向については特に限定されな いが、 包装形態を考慮するとシート状の磁石が好ましい。 また、 磁力線の強さが 磁石表面からの距離に依存すること、 シリンジ内の薬液ができるだけ均一になる ようにということを考えると、 シリンジ縦軸方向に直交して SNを配置するのが 好ましい （図 2参照） 。 磁力線発生装置は収納する生理活性タンパク質溶液製剤 が磁力線下におかれるように 1又は複数配置する。 図 2に示すように、 1つのシ ート状磁石上にシリンジを配置してもよいし、 あるいは図 3に示すように 2つの シート状磁石の間にシリンジを配置してもよい。
あるいはまた、 図 4に示すように、 シ一ト状の磁石上にパイアルを配置しても よい。
生理活性タンパク質溶液製剤及び磁石の配置は、 溶液製剤が磁力線下に保存さ れるものであれば何れの配置であってもよい。 磁石の磁化の向きは、 溶液製剤が 磁力線下に保存されるものであれば何れの向きであってもよい。例えば図 1では、 磁石の上面を N極、 下面を S極とすることもでき、 上面を S極、 下面を N極とす ることもできる。 図 2及び 4では、 シリンジ又はバイアルに接する面を N極とし てもよく、 S極としてもよい。 図 3では、 シリンジに接する 2つの面の一方を N 極、 もう一方を S極とすることもでき、 両方を同じ極にすることもできる。
磁束密度 （磁力線の強度） は、 1ミリテスラ以上、 好ましくは 1〜4 5 0ミリ テスラ、 さらに好ましくは 1〜1 5 0ミリテスラである。
本発明はさらに、 磁力線発生装置を備えた生理活性夕ンパク質溶液製剤の収納 容器を提供する。 本発明の収納容器の形状、 材質は特に限定されないが、 内部に 上述した磁力線の発生装置並びに溶液製剤の収納部位を備えている。 収納容器は 収納ボックス、 冷蔵庫、 コンテナ一などであってよい。 本発明はさらに、 磁力線下に夕ンパク質バルク溶液を保存することを含む夕ン パク質バルク溶液の安定化方法を提供する。 また、 磁力線下に保存したタンパク 質バルク溶液から安定化夕ンパク質製剤を調製することができる。 安定化夕ンパ ク質製剤は溶液製剤であつても、 凍結乾燥製剤であつてもよい。
本発明の方法で保存した生理活性夕ンパク質溶液製剤は長期保存後も会合体の 生成を抑制することが確認された。 例えば、 非磁力線下で 40°C-2週間及び 1力 月間加速したエリスロポエチン （E P O) 注射剤 （750IU) について純度試験
(SDS-PAGE 法） 及び定量試験 (液体クロマトグラフ法) にて評価した結果、 純度試験において二量体の増加を認め、 定量試験において E P〇含量の低下が確 認された。 一方、 約 100ミリテスラの磁力線下で 40°C -2週間及び 1力月間加速 した E P O注射剤 (750IU)にっき、純度試験（SDS-PAGE法）及び定量試験（液 体クロマトグラフ法) にて評価した結果、 40°C-1力月加速品の純度試験において 僅かな二量体の増加を認めたものの、 その他はいずれの評価項目においても、 未 加速品と比べて変化を認めなかった。
本発明者らは特定の理論に拘束されるものではないが、 本発明の作用機構を以 下のように考えている。 すなわち、 一般的にタンパク質の会合化は、 タンパク質 分子の疎水性部位が、 熱や容器表面への衝突等の何らかの影響によってタンパク 質分子の立体構造の表面に出現し、 疎水性部位が互いに結合し合うことにより起 こると考えられている。 従って、 何らかの力で水溶液中のタンパク質を拘束でき ればタンパク質分子のランダムな衝突を抑制できると考えられる。 本発明では、 水溶液中の夕ンパク質分子が強磁場の下で規則的に配列することにより、 分子が 拘束され、 ランダムな衝突が抑制され、 その結果疎水性部位の結合による会合化 が抑制されたものと考えられる。
従って、 本発明の方法及び収納容器は、 従来の安定化剤を添加して生理活性夕 ンパク質製剤を安定化させるという発想とは全く異なる技術的思想に基づくもの であり、 簡便な方法で会合体の生成を抑制して長期保存が可能となる。 本発明の 方法及び収納容器を使用することにより、 添加剤の使用量を少なくすることがで きる。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、 本発明の範囲はこれ に限定されない。 本発明の記載に基づき種々の変更、 修飾が当業者には可能であ り、 これらの変更、 修飾も本発明に含まれる。 ' 実施例
実施例 1 ： EPO製剤における効果
1) 試料
E P〇注射用製剤（750IU) (シリンジ製剤、 E P〇濃度 1500IU/mL、容量 0.5 mL:中外製薬製） を用いた。
2) 試験方法
EPO注射用製剤 （750IU) に磁石 （約 100ミリテスラ） を取り付け （図 1参 照） 、 40°C恒温槽に 2週間及び 1力月間保存した後に、 評価を行った。 図 1にお いて、 シート状磁石の上面を N極とし、 下面を S極とした。
また、 非磁力線下 （<1ミリテスラ） において 40°C-2週間及び 1力月間加速を 行った試料及び未加速の試料を同時に評価し、 未加速品に対する EPO含量の変 化、 二量体及びその他の類縁物質の含量変化を評価の指標とした。
3 ) 評価方法
3-1) 純度試験 （SDS-ゲル電気泳動法）
上述した各試料を試料溶液とする。 試料溶液の 60PLを正確に取り、 非還元系 Sample Buffer*1を正確に 20pL加え、 50°Cの温浴で 15分間加熱する。 加熱後、 BPB溶液 *2を正確に 4.0pL加え、 泳動用試料とする。
泳動用試料および分子量マーカー *3のそれぞれ 7.5 pLにっき、次の条件で電気 泳動法により試験を行い、 ウエスタンブロット法により検出する。
3- 1-1) 電気泳動法
泳動装置： TEFCO社製電気泳動装置
泳動ゲル：スラブゲル〔グラジェント 8%— 16%、 15Well、厚さ 1.5mm、 TEFCO 泳動電流： 25mA/枚の一定電流
泳動時間：約 1.5時間
泳動 Buffer：電気泳動用緩衝液 *4 3 - 1 - 2 ) ウェスタンブロット法
泳動後、 Transfer緩衝液 *510mLにゲルを浸し、 30分間平衡化する。次いで、 転写装置の陽電極側に Transfer緩衝液で浸したスポンジおよびろ紙 1枚 (ファー ストトランスファーフィルターぺ一パ一（20cmxl0cm、 フアルマシア製） を順に のせ、その上にあらかじめメタノールに約 30秒間浸し、更に Transfer緩衝液に 5 分間浸しておいたプロプロット膜 *6をのせる。 更にその上にゲルを重ね、 Transfer緩衝液に浸したろ紙 1枚およびスポンジをのせ、膜側を陽電極、ゲル側 を陰電極にセットする。 次の条件により、 プロプロット膜への転写を行い、 転写 後抗 E P Oゥサギ血清を用いてプロブロット膜を発色させる。
転写温度： 25°C付近の一定温度
転写条件：電流 65±2mA、 転写時間 120分間
* 1 非還元系 Sample Buffer：エチレンジァミン四酢酸ニナトリゥム 74.48mg及びラウリル硫酸ナトリゥム 5.0gを Tris'HCl 溶液 50mLに溶かす。
* 2 BPB溶液： Tris-HCl溶液 0.625mL、 濃グリセリン 3.5mL及びブロム フエノールブルー溶液 5mgを混和する。 4°Cで冷蔵保存する。
* 3分子量マーカー溶液： Prestained SDS-PAGE標準溶液 （バイオラッ ド製又はこれに相当するもの） 〔Lysozyme (分子量： 20900)、 Soybean trypsin inhibitor, (同： 29100)Carbonic anhydrase (同： 35500) 、 Ovalbumin (同： 50600)、 Bovine serum albumin (同： 83000)及び jPhosnhorylase B (同： 101000) を含む〕
* 4電気泳動用緩衝液：トリスヒドロキシメチルァミノメタン 3.0g及びダリ シン 14.4gを水 600mLに加え、 これにラウリル硫酸ナトリゥム l.Ogを加えて溶 解した後、 水を加えて lOOOmLとする。
* 5 Transfer緩衝液： トリスヒドロキシメチルァミノメタン 6.0g及びグリ シン 28.8gを水 600mLに加え、 これにメタノール 400niLを加えて溶解した後、 水を加えて 2000mLとする。
* 6 プロブロット膜：ポリビニリデンジフルオリドメンブランフィルター (8cmx8cm、 アプライドバイオシステム製） 又はこれに相当するもの。
* 7 Tris-HCl溶液： トリスヒド口キシメチルァミノメタン 3.0 を水 30mL に溶かし、 lmol/L塩酸試液を加えて pH6.8に調整した後、 水を加えて lOOmL とする 4°Cで冷蔵保存する。
3- 2) 定量法 （液体クロマトグラフ法）
本品を試料溶液とし、 EPO標準品に 0.05%ポリソルベート 20水溶液を加え て 1500IU/mLとしたものを標準溶液とする。
試料溶液及び標準溶液各 lOOpLを正確に量り、次の条件で液体ク口マトグラフ 法により試験を行い、 それぞれの EPOのピーク面積 AT及び ASを測定する。 次 式により本品の E P〇含量 （濃度： mg/mL) を求める。
EPO含量 （mg/mL) = E P O標準品の E P Oポリぺプチド相当量（mg/mL) X
AT:試料溶液の EPOのピーク面積
As:標準溶液の EPOのピーク面積
液体クロマトグラフの操作条件
検出器：紫外吸光光度計 （測定波長： 214mn)
カラム：内径 5 長さ 25cmのステンレス管にブチルシリル化した約 5μαι のシリカゲルを充填する。 （VYDAC 214ΤΡ54、 セパレ一シヨンズグループ製） カラム温度：室温
移動相：次の Α液及び Β液を用い、 2液の混合グラジェントを行う。
A液：水 ·ァセトニトリル · トリフルォロ酢酸混液 （400： 100： 1)
B液：ァセトニトリル ·水 · トリフルォロ酢酸混液 （400： 100： 1) グラジェント操作： B液濃度 35%でカラムを平衡化した後、 試料溶液及び標 準溶液を注入する。 5分間 B液濃度 35%に保った後、 15分間で B液濃度 100% になるように線形グラジェントを行う。 その後、 2分間これを保持する。
流量： EPOの保持時間が約 18分になるように調整する。 4) 結果
4- 1) 純度試験 （SDS-PAGE法） 磁力線下で 40 - 2週間及び 1力月間加速した E P O注射用製剤（750IU) につ き、 SDS-PAGE法にて評価した。
その結果、 非磁力線下における 40 _2週間加速品では二量体の増加が認めら れたのに対し、 磁力線下における 40°C-2週間加速品では未加速品と比較して、 ' 変化は認められなかった。
また、 40°C-1力月間加速品については、磁力線下及び非磁力線下ともに僅かな 二量体の増加を認めたものの、 目視による量的な多少については判断することは 困難であった。
4 - 2 ) 定量法 （液体クロマトグラフ法）
磁力線下で 40°C-2週間及び 1力月間加速した E P〇注射用製剤（750IU)につ き、 液体クロマトグラム法にて評価した結果を表 1及び表 2に示す。
E P O含量を未加速品と比較した場合、 非磁力線下における 40°C-2週間加速 品では含量低下を認め、残存率が 96%となった。 また、非磁力線下における 40°C -1力月間加速品では顕著な含量低下を認め、 残存率が 93%となった。
一方、 磁力線下 40°C-2週間加速品では含量の変化はほとんど認めず、 40°C-1 力月間加速品においても、 残存率 97%となり、 試験法の精度 （併行精度 C.V.=1.6%) を考慮した時、 何れの加速期間においても含量の変化は認められな かった。 表 1 40°C- 2週間加速品の E P O残存率
磁束密度 EPO濃度 （of label) 残存率 (%) 未加速品 <1 mT 93.8% 100.0%
40°C— 2週間 <1 mT 89.7% 95.6%
40°C— 2週間 100mT 93.7% 99.9% 表 2 40°C-1力月間加速品のェポェチン ベータ残存率
磁束密度 EPO濃度 （of label) 残存率 (%) 未加速品 <1 mT 93.9% 100.0% 40°C— 1ヶ月 <1mT 87.5% 93.1%
40°C— 1ヶ月 100mT 91.4% 97.3% 実施例 2 ： G— CSF溶液における効果
1 ) 試料調製
G— CSF溶液 （G— CSF濃度 約 0.5mg/mL) をディスポ一サブルフィル ターにてろ過し、 5mLガラスバイアルに lmLずつ充填したものを被験試料とし た。
2 ) 保存条件
被験試料を 30°C恒温槽内にて磁力線存在下 （約 100ミリテスラ *8) 及び非磁 力線下 *9に保存した （図 4参照） 。 図 4において、 シート状磁石のバイアルと接 する面を N極とし、 反対の面を S極とした。
* 8 テスラ （T) ：磁束密度単位、 1テスラ =10，000ガウス （G)
* 9 非磁力線下： 自然界における磁束密度 （通常 1ミリテスラ未満） とした。
3) 評価方法
被験試料を 30°C恒温槽にて 2週間保存後、 ゲルろ過クロマトグラフ法 (n=3) にて G— C S F会合体含量を測定した。
4) 結果
30°C2週間保存後の G— C S F会合体含量を表 3に示す。 表 3 G-CS F会合体生成挙動に与える磁力線の影
Figure imgf000015_0001
上記の結果の通り、 磁力線には G—C S F溶液の保存時における会合体の生成 を抑制する効果が認められた。

Claims

請求の範囲
I . 磁力線下に夕ンパク質溶液製剤を保存することを含むタンパク質溶液製剤 の安定化方法。
2 . 磁束密度が 1ミリテスラ以上である請求項 1記載の方法。
3 . 夕ンパク質が生理活性夕ンパク質である請求項 1又は 2記載の方法。
4. 生理活性タンパク質が、 抗体、 酵素、 サイト力イン、 ホルモンから選択さ れる請求項 3記載の方法。
5 . 生理活性タンパク質が造血因子である請求項 4記載の方法。
6 . 造血因子がエリスロポエチン又は顆粒球コロニー刺激因子である請求項 5 記載の方法。
7 . 生理活性夕ンパク質が抗体である請求項 4記載の方法。
8 . タンパク質溶液製剤がプレフィルドシリンジである請求項 1記載の方法。
9 . 磁力線発生装置を備えたタンパク質溶液製剤の収納容器。
1 0 . 磁力線発生装置が磁石である請求項 9記載の収納容器。
I I . 磁力線下にタンパク質含有溶液を保存することを含むタンパク質含有溶 液の安定化方法。
1 2 . タンパク質含有溶液がタンパク質製造バルク溶液である請求項 1 1記載 の方法。
1 3 . 磁力線下に保存したタンパク質バルク製造溶液から調製した安定化タン パク質製剤。
1 4. 安定化タンパク質製剤が溶液製剤である請求項 1 3記載の製剤。
1 5 . 安定化タンパク質製剤が凍結乾燥製剤である請求項 1 3記載の製剤。
1 6 . 磁力線下にタンパク質溶液製剤を保存することを含むタンパク質溶液製 剤の会合体生成抑制方法。
1 7 . タンパク質溶液製剤の安定化のための磁力線発生装置の使用。
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